蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制的初步研究 66页

分类号：___________密级:__________UDC:___________蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制的初步研究Theprotectiveeffectsofhoneyongastricmucosainjuryinacutealcoholismratsanditsmechanism姓名：梁璐璐学号：2111243012院系：基础学院专业：病原生物学研究方向：药用生物活性物质研究导师姓名：金小宝教授论文提交日期：2015.03.20论文答辩日期：2015.05.07学位授予单位：广东药学院二0一五年五月 广东药学院学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中己特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构己经发表或撰写过的研宄成果。对本研究做出贡献的其它个人和集体，均己在文中明确说明和致谢。本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。学位论文作者签名:聲被祕日期：3〇|乂年夕月P日学位论文使用授权的声明本人完全了解广东药学院有关保留和使用学位论文的规定，学校有权保留和向有关部门或机构送交本论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以釆用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编本学位论文。保密论文在解密后适用本声明。 广东药学院硕士毕业论文目录摘要.................................................................................................................................iiiAbstract................................................................................................................................vii第一章序言...........................................................................................................................11.1急性酒精中毒及酒精关键代谢酶............................................................................11.2急性酒精性胃黏膜损伤及防治................................................................................11.3我国具有解酒功能的食品概述................................................................................21.4蜂蜜的药理作用及应用............................................................................................51.5急性酒精中毒及急性酒精性胃黏膜损伤动物模型................................................6第二章蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用............................................92.1前言...........................................................................................................................92.2实验材料...................................................................................................................92.3实验方法.................................................................................................................102.4实验结果.................................................................................................................122.4.1大鼠灌酒前后一般形态表现.....................................................................122.4.2各组大鼠胃黏膜损伤大体形态及损伤指数.............................................132.4.3各组大鼠胃组织病理形态学结果.............................................................152.5讨论.........................................................................................................................16第三章蜂蜜保护急性酒精中毒大鼠胃黏膜作用机制的初步探讨..............................173.1前言.........................................................................................................................173.2实验材料.................................................................................................................183.3实验方法.................................................................................................................193.4实验结果.................................................................................................................213.4.1各组大鼠胃组织抗氧化相关因子SOD活性、MDA含量的变化........213.4.2各组大鼠胃黏膜致损伤因子ET-1、TNF-α、IL-8含量的变化.............223.4.3各组大鼠胃黏膜保护因子PGE2、SS、EGF含量的变化.....................243.4.4各组大鼠血清乙醇浓度、酒精关键代谢酶活性水平的变化.................273.5讨论.........................................................................................................................30第四章蜂蜜对急性酒精中毒大鼠血清ALT、AST活性水平及肝脏病理形态学的影i 广东药学院硕士毕业论文响...........................................................................................................................................354.1前言.........................................................................................................................354.2实验材料.................................................................................................................354.3实验方法.................................................................................................................364.4实验结果.................................................................................................................374.4.1各组大鼠血清ALT、AST的活性水平....................................................374.4.2各组大鼠肝组织病理形态学结果.............................................................384.5讨论.........................................................................................................................39第五章全文总结及研究展望...........................................................................................415.1全文总结..................................................................................................................415.2研究展望..................................................................................................................41参考文献...............................................................................................................................43附录1英文缩写语........................................................................................................51附录2攻读学位期间科研情况及所受奖励.................................................................52致谢.......................................................................................................................................53ii 广东药学院硕士毕业论文蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制的初步研究硕士研究生：梁璐璐专业：病原生物学导师：金小宝教授摘要急性酒精中毒，俗称醉酒，是指一次饮入过量乙醇，乙醇在体内的吸收大于代谢，被吸收的乙醇进入血液循环，通过血脑屏障入脑而引起的机体机能异常以及中枢神经抑制的状态[1]。酒精中毒可以不同程度的引起多器官的功能异常及脏器损伤，其中以胃和肝的损伤最为常见。文献报道称高浓度乙醇可直接侵蚀胃黏膜，引起急性胃黏膜炎症，黏膜出现水肿、充血、糜烂、出血甚至溃疡等[2]，此外，吸收入体内的乙醇及其代谢产物乙醛等也可引起急性肝组织损伤[3]。近年来，随着生活水平的提高以及膳食结构的改变，酒类产量及饮酒人数逐年上升，酒精中毒所引发的相关疾病的发病率也呈逐年增长的趋势[4]。据世界卫生组织统计，全球每年因为饮酒原因造成死亡人数约250万，是仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大公共卫生问题。因此，寻找并研发天然、无毒、有效的具有解酒保肝护胃的药物有着重要的现实意义。蜂蜜是糖的过饱和溶液，是蜜蜂采集开花植物的花蜜或昆虫分泌的甘露，混以自身消化道的分泌物，在体内经过多种转化酶的作用充分酿造，最后贮藏在蜂巢内的甜味物质[5]。蜂蜜成分复杂，含有碳水化合物、维生素、蛋白质、矿物质、有机酸、黄酮、酚酸、酶等200多种化学物质，其中75%以上的成分是糖类，以单糖为主，总糖的90%左右是果糖和葡萄糖[6]。文献报道[7-9]，蜂蜜具有解毒、抑菌、抗氧化和抗炎等活性，对治疗肝炎、胃炎、胃溃疡、烧伤、烫伤、便秘等疾病具有一定的疗效。目的本论文以伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠为实验对象，探讨蜂蜜对急性酒精iii 广东药学院硕士毕业论文性胃黏膜损伤的保护作用，并对其机制进行初步探讨，为蜂蜜的深入研究和开发应用提供科学依据和参考资料。方法用一次性灌胃法构建伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型，实验设正常大鼠组、急性酒精中毒大鼠模型组、蜂蜜高浓度（20%）组、蜂蜜中浓度（10%）组、蜂蜜低浓度（5%）组、阳性药物对照组（鼎久解酒护肝护胃口服液）6个组。除正常组外，其余各组均以75%乙醇按10ml/kg灌胃大鼠，30min后，分别给各治疗组大鼠灌胃给药，急性酒精中毒大鼠模型组灌服等体积生理盐水。各处理组大鼠给药2.5h后腹主动脉取血并处死大鼠，立即剖取肝脏和胃，观察各组大鼠组织大体形态并取材，以备检测。1.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃损伤的保护作用。观察各组大鼠胃黏膜的大体形态及病理形态学变化，比较各组大鼠胃黏膜损伤指数、损伤抑制率以及组织病理学差异，评价蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用。2.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护机制。2.1检测各组大鼠胃组织超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）活性、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量，观察蜂蜜是否通过增强胃黏膜的抗氧化能力保护胃黏膜。2.2检测各组大鼠胃组织内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）含量、白细胞介素-8（Interle-ukin-8,IL-8）含量、肿瘤生长因子α（TumorNecrosisFactor-alpha,TNF-α）含量，观察蜂蜜是否通过降低胃黏膜攻击因子含量保护胃黏膜。2.3检测各组大鼠胃组织前列腺素E2（ProstaglandinE2,PGE2）含量、生长抑素（Soma-tostatin,SS）含量、表皮生长因子（EpidermalGrowthFactor,EGF）含量，观察蜂蜜是否通过提高胃黏膜保护因子含量保护胃黏膜。2.4检测各组大鼠血清乙醇浓度（BloodAlcoholConcentration,BAC）、肝组织中的乙醇脱氢酶（AlcoholDehydrogenase,ADH）和乙醛脱氢酶（AcetaldehydeDehydroge-nase,ALDH）活性以及胃组织中的ADH和ALDH活性水平，鉴定蜂蜜是否通过加快酒精代谢保护胃黏膜。3.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠肝组织的影响。iv 广东药学院硕士毕业论文通过检测各组大鼠血清谷丙转氨酶（AlanineAminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（AspartateAminotransferase,AST）活性水平以及观察各组大鼠肝脏病理形态学变化，评价75%乙醇10ml/kg一次性灌胃大鼠是否造成肝脏的急性损伤以及蜂蜜是否对肝脏有保护作用。结果1.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃损伤的保护作用。与正常组大鼠相比，模型组大鼠胃黏膜损伤指数极显著升高（P<0.01）；蜂蜜能极显著降低模型组大鼠胃黏膜损伤指数（P<0.01）、减少胃黏膜的充血水肿、出血及炎性浸润。2.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护机制。2.1与模型组相比，蜂蜜高浓度组显著提高胃SOD活性（P<0.05），蜂蜜各浓度组极显著降低胃黏膜MDA(P<0.01)含量。2.2蜂蜜能极显著降低模型组大鼠胃黏膜ET-1含量（P<0.01），极显著降低模型组大鼠胃组织IL-8含量（P<0.01），显著降低模型组大鼠胃组织TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）。2.3蜂蜜能不同程度的提高模型组大鼠胃组织PGE2含量（P<0.05）和SS含量（P<0.01）；各组大鼠胃组织EGF含量无统计学意义（P＞0.05）。2.4与正常组大鼠相比，血清乙醇浓度在模型组大鼠中极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，蜂蜜低、中浓度组大鼠血清乙醇浓度均显著降低（P<0.05），蜂蜜高浓度组大鼠血清乙醇浓度极显著降低（P<0.01）；蜂蜜中、高浓度组极显著提高大鼠肝ADH和胃ALDH活性（P<0.01），蜂蜜各浓度组可显著提高胃ADH和肝ALDH活性（P<0.05或P<0.01）。3.探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠肝组织的影响。模型组大鼠血清ALT、AST活性水平较正常组升高，蜂蜜各浓度组血清ALT、AST活性水平较模型组减低，但均无统计学差异（P>0.05）。病理切片观察表明模型组肝脏损伤较轻，肝细胞以广泛轻度变性水肿为主，胞浆疏松淡染，肝窦受压变窄，肝细胞轻微坏死，未见炎细胞浸润。阳性药物组及蜂蜜各浓度组肝脏病理水肿变性程度较模型组有所改善。v 广东药学院硕士毕业论文结论1.成功建立了伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型，蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤具有良好的保护作用。2.蜂蜜保护急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的机制主要有以下几个方面：1）提高胃黏膜SOD活性、降低胃黏膜MDA含量，通过调节和改善自由基代谢、抑制脂质过氧化反应的途径减轻急性胃黏膜的损伤。2）蜂蜜能降低胃黏膜致损伤因子ET-1、IL-8、TNF-α的含量，通过减轻胃黏膜的局部缺血、减少炎性介质、减轻炎性反应的途径保护胃黏膜。3）蜂蜜能提高胃黏膜防御和修复因子PGE2、SS的含量，通过加强胃黏膜的屏障和修复功能保护胃黏膜；蜂蜜保护急性酒精性胃黏膜途径与EGF无密切关联。4）蜂蜜可以通过提高肝组织和胃组织中ADH和ALDH活性从而降低急性酒精中毒大鼠血清乙醇浓度，通过加快酒精代谢保护胃黏膜。3.采用75%乙醇10ml/kg一次性灌胃大鼠3h尚不能造成明显的肝急性损伤，但蜂蜜对急性酒精中毒大鼠肝脏有潜在的保护作用。关键词：蜂蜜；急性酒精中毒；胃黏膜损伤；大鼠；酒精代谢酶；胃黏膜因子vi 广东药学院硕士毕业论文TheprotectiveeffectsofhoneyongastricmucosainjuryinacutealcoholismratsanditsmechanismGraduate:Liang-LuluMajor:PathogenBiologySupervisor:ProfessorJin-XiaobaoAbstractIntroductionAcutealcoholintoxicationiscommonlyknownasdrunk.One-timeexcessivealcoholintakecanleadtobodyfunctionabnormalandeventheinhibitorystateofcentralnervoussystem.Whenalcoholabsorptionrateishigherthanthemetabolicrate,alcoholcanpassthroughthe"blood-brain"barrier,gointothebrainandcauseacutealcoholicintoxication.Alcoholintoxicationcancausedifferentdegreeofmultipleorgandisfunctionandorganinjury.Themostcommondamagecausedbyalcoholaregastricmucosainjuryandliverinjury.Manystudieshaveconfirmedthathighconcentrationsofethanolcancorrodegastricmucosadirectly,Inducedacutegastricmucosalinflammation,causecongestion,edema,bleeding,erosionandulcerofgastricmucosal.Besides,alcoholanditsmetabolitesmaycauseliverinjuryofdifferentdegree.Inrecentyears,withtheimprovementoflifelevelandthechangeofdietarystructure,drinkingliquorproductionandthenumberofpeopledrinkingarerised,therelateddiseasescausedbyalcoholpoisoningincreasedyearbyyear.WHOhadreportedthatnearly2500000peoplediedofalcoholdrinkingeveryyear,itbecomethethirdlargestpublichealthproblemsaftercancerandcardiovasculardisease.Therefore,findingnatural,non-toxic,effectivehangoverdrinksandprotectingliverandstomachmedicinehasimportantpracticalsignificance.Honeyisasupersaturatedsolutionofsugar,itisthenaturesweetsubstancepro-ducedbyhoneybeesfromnectarofblossomsorfromsecretionsofinsects,whichvii 广东药学院硕士毕业论文honeybeescollect,transformandcombinewithitsowndigestivetractsecretions,Thenbrewitcompletelybyavarietyofconvertingenzymeandthenstorageinthehive.Thecomponentofhoneyisverycomplicated,ItContainscarbohydrates,protein,mine-rals,vitamins,organicacids,flavonoids,phenolicacids,enzymesandother200kindsofchemicalsubstances.Sugaristhemainingredientinhoney,and85%~95%oftotalsugararefructoseandglucose.Honeyhavetheactivityofdetoxification,antibacterial,antioxidantandanti-inflammatory.Ithascurativeeffectonhepatitis,gastritis,gastriculcer,burn,scald,constipationandotherdisease.ObjectiveThethesisisbasedontheestablishmentofacutealcoholismratmodelsaccompaniedwithgastricmucosalinjury,throughtheanimalexperiment,Toexploretheprotectiveeffectsofhoneyongastricmucosainjuryinacutealcoholismratsanditsmechanism,providingreferencesandscientificbasisforcomprehensivedevelopmentandutilizationofhoneyrelatedproducts.MethodsTheacutealcoholismaccompaniedwithgastricmucosalinjurymodelofratswereinducedbysinglegavageusinganhydrousethanol.Takethenormalgroupasnegativecontrol,takehangoverdrinkDingjiuliquid(acommercialproduct)aspositivedrugcontrolgroup.Thenhigh,moderateandlowconcentrationofhoneyweregiventoaboveformedintoxicatedratstoinvestigateitsstomach-protectiveeffectsanditsrelatedmechanism.75%ethanol10ml/kgweregiventoeachgroupsbysinglegavageexcepedfornormalgroup.After30min,Theneachtreatmentgroupsweregivenmedicinethroughthemeansofwateringstomachforonetime.Themodelgroupwasfedupwithequalvolumeofsaline.Thenaftergivendrugsfor2.5hours,alltreatmentgroupratsweretakingbloodfromabdominalaorta.Afterkilledrats,takingoutliverandstomachwerequickly.Examinethegrossmorphologicalandcollectliverandstomachtissuefornextdetection.1.ToinvestigatetheprotectiveeffectsofhoneyongastricmucosainjuryinacutealcoholismratsGrossmorphologyandpathologicalchangesingastricmucosawereobserved,gastricviii 广东药学院硕士毕业论文mucosalinjuryindexandinhibitionratioofratsamonggroupswerecomparedtoevaluatetheprotectiveeffectofhoneyongastricmucosa.2.Toexplorethemechanismofhoney’sprotectiveeffectsofgastricmucosainjuryinacutealcoholismrats2.1TheactivityofSODandthecontentofMDAinstomachtissueweretested,toidentifywhetherhoneyprotectivegastricmucosalthroughantioxidantways.2.2thecontentofgastricmucosalinjuryfactor(ET-1、IL-8、TNF-α)weredetected,toidentifywhetherhoneyprotectivegastricmucosalthroughwaysofreducingthecontentofgastricmucosalinjuryfactor.2.3thecontentofgastricmucosaldefenseandrepairfactor(PGE2、SS、EGF)inratsgastrictissueamonggroupsweretested,toidentifywhetherhoneyprotectivegastricmucosalthroughwaysofincreasingthecontentofgastricmucosaldefenseandrepairfactors.2.4Usingthealcoholconcentrationinbloodserum,theactivityofADHandALDHinliverandstomachtissueofacutealcoholismratsasindexestoexploretheanti-alcoholismeffectsofhoneyanditseffectsonalcoholmetabolizingenzyme.Toidentifywhetherhoneyprotectivegastricmucosalthroughwaysofpromotingalcoholmetabolism.3.ToinvestigatetheeffectsofhoneyonliverinacutealcoholismratsTheactivityofALTandASTinbloodserumandliverhistopathologyofratsweremeasuredtodeterminewhethersuccessfullysettingupacuteliverinjurybysinglegavageusing75%ethanol10ml/kg.Thenonthebasisofthis,judgewhetherhoneyhasliver-protectiveeffectsofacuteliverinjuryrats.Results1.ToinvestigatetheprotectiveeffectsofhoneyongastricmucosainjuryinacutealcoholismratsTheindexofgastriclesionandgastricmucosalhyperemiaedema,hemorrhageandinflammatorycellinfiltrationwereobviouslyreducedbyhoneycomparedwithmodelgrouprats.2.Toexplorethemechanismofhoney’sprotectiveeffectsofgastricmucosainjuryinacutealcoholismratsix 广东药学院硕士毕业论文2.1Comparedwithmodelgroup,ThehighconcentrationofhoneygroupscansignificantlyincreasedtheactivityofgastricmucosalSOD(P<0.05)whileallhoneygroupscanverysignificantlydecreasedthecontentofMDA(P<0.01)ingastricmucosa.2.2Comparedwithmodelgroup,HoneycanveryremarkblydecreasedthecontentofET-1,IL-8,TNF-α(P<0.05orP<0.01)instomachtissue.2.3Comparedwithmodelgroup,ThecontentofPGE2andSSingastricmucosaofhoneygroupratswereevidentlyimproved(P<0.05orP<0.01)．ThecontentofEGFinallgroupshadnostatisticaldifferences.2.4Comparedwithnormalgroup,theconcentrationofalcoholinbloodseruminmodelgroupwasverysignificantlyhigher.Comparedwithmodelcontrolgroup,theconcentrationofalcoholinbloodseruminlowandmoderateconcentrationofhoneygroupsweresignificantlylower(P<0.05)whileinhighgroupwasverysignificantlylower(P<0.01);theactivityofADHinliverandALDHinstomachtissueofmoderateandhighconcentrationofhoneygroupswereverysignificantlyincreased(P<0.01),theactivityofADHinstomachandALDHinlivertissueofallhoneygroupsweresignificantlyincreased(P<0.05orP<0.01).3.Toexplorethemechanismofhoney’sprotectiveeffectsofgastricmucosainjuryinacutealcoholismratsTheactivityofALTandASTinbloodseruminmodelgroupswerehigherthaninnormalgroup.ALTandASTinhoneygroupswerelowerthaninmodelgroup,butamongallgroupshavenostatisticaldifference(P>0.05).Pathologicalobservationshowedthatnohistologiealdamagewasobservedinlivertissueofnormalgroup.Anditonlycauselightliverinjuryinmodelgroup,Specificperformanceislivercelldegenerationandedemamildlyandwidely.Palestainingcytoplasmosteoporosis.Hepaticsinuscompressionnarrows.necrosisoflivercellsslightly.Noinflammatorycellfound.ThedegreeoflivercelldegenerationandedemainPositivedrugcontrolgroupandhoneygroupswerebetterthanmodelgroup.Conclusion1.Theacutealcoholismaccompaniedwithgastricmucosalinjurymodelofratswerex 广东药学院硕士毕业论文sucessfullyestablished.Honeyhadtheprotectiveeffectagainst75%ethanol10ml/kginducedacutegastricmucosainjury.2.Honey’sstomach-protectivemechanismsarerelatedtoThefollowingaspects.1).BymeansofimprovingtheactivityofSODandreducethecontentofMDAinstomachmucosa,throughthewayofregulatingandimprovingthemetabolismoffreeradical,inhibitinglipidperoxidationagainstacutealcoholinducedgastricmucosalinjury.2).HoneycanreducethecontentoftheinjuryfactorET-1,IL-8,TNF-α，Throughthewaysofalleviatinglocalischemiaofgastricmucosal,reducinggastricmucosalinflammatorymediatorsandinflammationtoprotectgastricmucosal.3).HoneycanimprovethecontentofgastricmucosaldefenseandrepairfactorPGE2andSS,throughthestrengtheningofthegastricmucosalbarrierfunctionandrepairfunctiontoprotectgastricmucosal.AnditsprotectiveeffectshadnocloserelationshipwithEGF.4).HoneycaneffectivelyalleviatedhangoveranddecreasedalcoholcontentinbloodserumbyincreasedtheactivityofADHandALDHinliverandstomachtissueofacutealcoholismrats.Bythewaysofpromotingalcoholmetabolismtoprotectgastricmucosal.3.Therehadnosevereliverinjuryinacutealcoholismratsbysinglegavageusing75%ethanol10ml/kgafter3h.Buttheresultsindicatedthathoneyhasthepotentialprotectiveeffectofethanol-inducedliverinjuryinrats.Keywords:Honey;Acutealcoholdetoxication;Gastricmucosalinjury;Rat;Alcoholmetabolizingenzyme;Gastricmucosalfactorxi 广东药学院硕士毕业论文第一章序言1.1急性酒精中毒及酒精关键代谢酶乙醇是酒类饮料的主要成分，一次性大量饮用乙醇而造成机体机能的损害甚至中枢神经处于抑制状态即为醉酒，也称急性酒精中毒。乙醇的代谢从口腔开始进入胃肠，经过胃肠酒精代谢酶的首过代谢效应（FirstPassMetabolism,FPM），而后由下腔静脉输送至肝脏，约90%的乙醇在肝脏中被氧化代谢。乙醇在肝脏中的代谢是由多种酶系统参与的，如：过氧化氢氧化酶系统、微粒体乙醇氧化酶系统、乙醇脱氢酶氧化系统等，其中，乙醇脱氢酶系统参与体内约80%的酒精代谢。进入体内的酒精大部分由ADH氧化为乙醛,乙醛由ALDH转化为乙酸，其反应式为CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+；CH3CHO+NAD++H2O→CH3COOH+NADH+H+。最后进入三羧酸循环分解成CO2和H2O排出体外。在此反应系统中，主要存在于肝和胃中的ADH和ALDH是酒精代谢的关键酶。ADH是一种含锌金属酶，广泛存在于人和哺乳动物肝脏，是催化乙醇发生生物氧化的主要酶类，主要将体内的乙醇氧化成乙醛[10]。ADH具有基因多态性，目前发现有7个基因型，ADH1～ADH7等7种，其分布广泛，主要分布在肝、胃和肠。由于酶的活性表达在不同个体基因中有所差异，因而机体对乙醇的敏感性和耐受性也不尽相同[11]。ADH活性水平直接影响机体内乙醇或乙醛的浓度。ALDH是催化乙醛形成乙酸的主要酶类，可将对生物体有害的乙醛转化[12]。ALDH具有基因多态性，目前人们发现已经有19种基因类型，主要有ALDH1～ALDH4这4种，其中ALDH2因其对乙醛的低Km值而参与约60%以上的乙醛代谢，由此被认为是体内催化乙醛氧化活性最强的关键酶[13]。ALDH在解酒过程中显得尤为重要，饮酒后的一系列酒精中毒症状如脸红、躁动、心跳加速、兴奋等主要是由于血液中乙醛浓度的升高而非乙醇浓度的升高。乙醛有强烈的细胞毒性，与急性肝损伤和急性胃损伤密切相关[14]。解酒的重点在于抑制吸收、加速代谢，增强乙醇代谢关键酶，加快乙醇及代谢产物乙醛的分解，使之分解为可以排除体外的CO2和H2O，而在此过程中最为重要的是增强催化乙醛的乙醛脱氢酶活性。1.2急性酒精性胃黏膜损伤及防治急性酒精性胃黏膜损伤，是急性酒精中毒的常见伴随症状，是指短时间内大量饮1 广东药学院硕士毕业论文入乙醇，导致胃黏膜急性损伤，表现为不同程度的水肿、充血、糜烂、出血、溃疡等症状。进入消化道的乙醇首先通过胃肠道的首过代谢效应转化为乙醛，即使酒精在胃肠中的代谢量相比于在肝脏中少很多[15]，因乙醇具有亲脂性和脂溶性，高浓度乙醇可以直接侵蚀胃组织，破坏胃黏膜表面黏液屏障和生理环境，造成胃黏膜的水肿、糜烂、出血、炎症等。高浓度乙醇导致急性胃黏膜损伤的因素主要包括以下几个方面：1)乙醇直接侵蚀胃黏膜，破坏胃黏膜屏障；2)胃黏膜受乙醇刺激，产生大量氧自由基，引起胃黏膜损伤及血液循环障碍；3)损伤的血管内皮及黏膜上皮产生致损伤介质如：ET-1、TNF-α、IL-8等，加重胃黏膜损伤。近年来，随着饮酒人数的增加，因急性酒精中毒而导致的急性胃黏膜损伤的发病率日渐增高。因此，预防和治疗急性酒精性胃黏膜损伤变得尤为重要。临床上治疗急性酒精性胃黏膜损伤常用铝碳酸镁、硫糖铝等黏膜保护剂类药物,这类药物可以作为保护层覆盖于胃黏膜表面，中和胃酸，促进出血、糜烂、溃疡的黏膜修复。近些年，酒精中毒引起广泛重视，研究保护急性酒精性胃黏膜损伤的学者众多。TamotsuMatsuhashi[15]等通过大鼠实验发现水稻提取物可以通过保护胃黏膜细胞以及改善创面修复的作用保护乙醇引起的急性胃黏膜损伤，其保护机制不依赖于减少胃酸的分泌、提高胃黏膜保护因子PGE2和热休克蛋白72（HeatShockProtein,HSP72）的表达。Sindhu等[16]研究发现，叶黄素可以降低大鼠胃溃疡指数，升高使大鼠体内SOD及过氧化氢酶活性水平，通过抗氧化作用保护乙醇诱导的急性胃黏膜损伤。Alimi等[17]研究发现，漆树根提取物可以缓解乙醇诱导的胃损伤，与其富含黄酮、酚、酸及多糖等抗氧化物质密切相关。施纯礼等[18]通过小鼠实验发现枣花蜜能提高血液SOD活性，通过抗氧化作用而对急性酒精性胃黏膜损伤发挥预防作用。甘典辉等[19]研究白子菜总黄酮对无水乙醇诱导的急性酒精性胃黏膜损伤的保护作用，结果发现白子菜总黄酮能显著降低大鼠胃黏膜损伤指数，通过促进氧自由基清除和抑制脂质过氧化作用的途径减轻胃黏膜损伤程度。王帅等[20]以无水乙醇诱导的急性胃黏膜损伤大鼠为实验对象，发现柴胡皂苷可以有效降低模型组大鼠胃黏膜损伤程度，通过测定大鼠血清PGE2含量、血清SOD活性以及血清MDA含量探讨其保护机制，结果显示柴胡皂苷通过提高胃黏膜抗氧化能力、增强胃黏膜防御因子起到保护胃黏膜的作用。1.3我国具有解酒功能的食品概述我国解酒产品种类繁多，从西药到中草药，从保健品到食品，选择范围很广。西2 广东药学院硕士毕业论文药纳洛酮是临床上治疗急性酒精中毒患者的首选药物，纳洛酮是阿片受体拮抗剂，能起到快速促醒、恢复中枢神经正常功能的作用[21]。国产解酒制品主要原料大多来源于具有醒酒功能的中草药，如葛根、葛花、枳椇子等，口感差及长期服用可能的毒副作用是影响推广的主要原因。解酒保健品在市场上出售的种类繁多，如凯镛清悦解酒口服液（国食健字G20130144）、海王金樽牌牡蛎大豆肽肉碱解酒口服液（国食健字G20110347）等。随着人们经济水平的提高以及人们保健意识的增强，具有解酒功能的天然食品倍受青睐。总结近几年以来文献报道的具有解酒作用的食品，大致可以分为一下几类。1.3.1水果类在我国本草著作中有记载多种水果具有解酒功能，现代的学者根据记载通过实验做了相关的验证，并在此基础上有所创新。李时珍《本草纲目》记载“食用金柑能醒酒疏肝”。陈则夷[22]对金柑的解酒功效做了验证，他研究发现从金柑中提取的金柑总黄酮对急性酒精中毒小鼠具有显著解酒促醒作用，其通过提高肝脏ADH活性促进乙醇代谢，通过调节自由基代谢、抗氧化损伤保护肝脏。《本草纲目》也记载“饮桑椹汁能解酒毒”。高丽辉等[23]通过小鼠预防和治疗试验证实桑椹果饮具有一定的防醉解酒作用，该解酒作用与其增强肝组织中ADH的活性密切相关。类似的水果如橙子、黄皮果、橄榄等经实验证明均有良好的解酒功效。也有学者将多种水果汁混合研究其醒酒功效，华景清等[24]研发出一种对小鼠和人都有明显解酒作用的混合果汁，主要配方原料为：25%番茄汁，25%梨汁，20%柚子汁。黄超群等[25]以橘子、葡萄和西瓜为原料，发现具有最好的醒酒作用的混合果汁配方为：20%西瓜汁、25%橘子汁、25%葡萄汁。目前我国的解酒产品的主要成分大多是经试验证实有确切醒酒功能的中草药，如葛根、葛花、枳椇子等。为了改善解酒产品的风味，近年来许多学者将水果与中草药配伍研制解酒饮品，不仅风味大大改善，经实验证明也有较好的醒酒效果。王岚等人[26]以猕猴桃和葛根为主要原材料研制解酒保肝液，在每1ml浓缩的红阳猕猴桃果汁中兑入50mg葛根提取物，动物实验结果表明此配方液不仅能快速解酒,而且能通过抗氧化作用保护酒精性肝损伤。杨梅酸甜可口，富含有机酸,黄国清等[27]在每升杨梅汁中加入葛根95g，葛花10g，菊花7g，甘草11g以此配得的醒酒饮料口感良好，通过乙醇消耗实验测得此饮料能消耗31%乙醇，动物实验和人体试验结果均表明此醒酒饮3 广东药学院硕士毕业论文料醒酒和防醉效果良好。1.3.2豆制品类大豆是我国的传统食物，营养丰富，研究表明，与醒酒保肝功能密切相关的是大豆异黄酮、大豆卵磷脂以及大豆多肽。葛如振等[28]将黑豆经酶催化水解成蛋白肽，他将黑豆蛋白肽混合液70%，蜂蜜4g/150mL，白砂糖11g/150mL调配成黑豆醒酒饮料，测得此饮料对ADH的激活率达到了31.98%，通过升高ADH促进酒精代谢。纳豆是小黄豆的发酵食品，实验研究发现纳豆冻干粉可以有效延长小鼠醉酒耐受时间，缩短小鼠醒酒时间，不仅解酒防醉效果显著，还能预防与保护酒精性肝损伤[29]。1.3.3玉米醒酒肽类醒酒肽是从植物中提取的具有醒酒功能的多肽。玉米肽是以玉米为原料，水解玉米蛋白获得的产物，郭辉等[30]以醉酒小鼠为研究对象探讨玉米肽的醒酒作用，结果显示玉米肽有激活肝脏中酒精关键代谢酶ADH的作用，能极显著降低小鼠血清中的乙醇浓度。王真真等[31]以富硒玉米为原料，从中提取蛋白质，进而制备富硒玉米肽，结果证明富硒玉米肽的醒酒活性显著优于普通玉米肽。1.3.4酸奶酸奶能保护胃黏膜，延缓酒精吸收，李银花等[32]将葛根与酸奶以1∶2比例混合发酵制成葛根酸奶，能有效防止小鼠醉酒，对醉酒小鼠有显著地促醒作用，抑制乙醇胃肠吸收的同时加速乙醇降解代谢，解酒效果好于单纯用葛根提取液。杜鹏等[33]以酸乳为主要原料，辅以中草药葛根、葛花、枳椇子、蜂蜜等制作解酒酸乳饮料。用此饮料灌胃醉酒小鼠后的醒酒时间与对照组相比显著缩短，该产品解酒功效极显著，但预防醉酒效果不佳，适合饮酒后服用。1.3.5动物肉类牡蛎和马氏珠母贝肉均含丰富的糖原、蛋白质、牛磺酸等生物活性成分，其中主要的醒酒成分是牛磺酸和糖原，动物实验发现牡蛎和马氏珠母贝肉均有良好的醒酒效果[34,35]。生长在我国广东等沿海城市的企鹅珍珠贝，经测定其含有大量醒酒功能因子，如牛磺酸、甜菜碱、糖原等，经研究发现水解度为19.8%的企鹅珍珠贝酶解产物能降低血液中32.4%酒精含量[36]。综上所述可知，经实验证实有醒酒功能的食品种类繁多，但这些食品确切的功效成分以及醒酒机制尚报道的少，还需进一步深入研究。4 广东药学院硕士毕业论文1.4蜂蜜的药理作用及应用蜂蜜味甘性平，自古就被作为药食同源的食品，其具有保护肝脏、胃肠道、心血管系统以及抗菌消炎、润肺祛痰、保护创面、抗肿瘤等作用。其主要的药理作用有以下几个方面：1.4.1蜂蜜的抗菌消炎及抗氧化性优质蜂蜜具有很好的抗菌特性，可以自然存放数年不变质，这一特性一方面是由于蜂蜜的酸性环境（低PH值）和高渗透性，另一方面与其含有黄酮、苯酸、酚类以及过氧化氢等具有抗菌功能的物质密不可分。蜂蜜能有效抑制多种细菌的生长，Wilkinson等[37]发现蜂蜜能显著抑制铜绿假单胞菌和大肠杆菌的生长。此外，蜂蜜对葡萄球菌属、杆菌属、链球菌属、沙门菌属、志贺氏菌属等均有一定程度的抑制作用[38]。蜂蜜因其良好的抗菌消炎作用，在临床蜂蜜敷料已成为干预体表创面的有效措施。耿爱香等[39]在临床用蜂蜜敷料护理因浅表脓肿而切开引流的患者，结果发现应用蜂蜜敷料处理患者伤口，能使伤口愈合更快，换药及敷药造成的疼痛程度更轻，相比于传统方法效果更好。Moghazy等[40]在临床发现蜂蜜可以应用于治疗糖尿病足。而且临床观察发现，蜂蜜对烫伤、烧伤患者皮肤愈合效果显著且不留疤痕[41]。1.4.2促进消化、通便润肠，保护胃肠道蜂蜜富含果糖，能改善便秘，可调节胃酸分泌，保护胃肠道。潘虹等[42]以便秘小鼠为动物模型，观察蜂蜜的润肠通便作用，结果发现蜂蜜中、高剂量组均可明显促进小鼠小肠运动功能，小鼠排便总量增加，有较好的通便润肠作用。黄东萍等[43]体外实验发现蜂蜜可显著抑制幽门螺旋杆菌（HelicobacterPylori,HP）的生长。在临床上，肖锡湘长期观察发现，每天早晚空腹服用蜂蜜50g，对调节胃肠道功能以及治疗消化不良、慢性胃炎胃溃疡等均有疗效[44]。1.4.3润肺止咳在我国，蜂蜜常用于缓解儿童咳嗽，将枇杷、白萝卜、百合搭配蜂蜜熬成糖浆或者喝纯蜂蜜水，都可以有效缓解儿童咳嗽[45]。同时，在临床上也证实了蜂蜜的这一作用。Paul等[46]在临床研究中发现，睡前联合服用荞麦蜜和右美沙芬（Dextromethor-phan,DM）给那些有睡眠困难和夜间咳嗽的儿童，其咳嗽症状的改善要比单纯给予DM治疗的好。Shadkam等[47]通过对139名患上呼吸道感染的儿童观察也发现，在睡5 广东药学院硕士毕业论文觉前给儿童服用2.5ml蜂蜜，能够显著缓解咳嗽症状，且能显著改善儿童的睡眠质量。1.4.4保护心血管系统蜂蜜富含果糖和维生素等营养物质，具有降血压和保护心血管的作用。临床实验表明，蜂蜜具有扩张冠状动脉、调节心脏功能、改善心肌代谢、双相降脂降血糖的作用[48]。漆平强等[49]研究发现蜂蜜能有效预防和治疗大鼠粥样动脉硬化。1.4.5蜂蜜的护肝作用肝脏是重要的代谢器官，卢珂[50]通过小鼠实验，观察了批把蜜和荆条蜜对小鼠肝脏脂质过氧化的抑制作用，结果显示，这两种蜂蜜都能够显著降低模型组小鼠肝组织匀浆的MDA含量，对肝脂质过氧化的抑制率分别为55.79%、60.13%，且呈一定量效关系，研究还发现，蜂蜜能够通过降低线粒体膜脂质过氧化程度的方式起到保护肝脏作用。蜂蜜中含有酚类化合物、黄酮类物质、维生素及抗氧化酶等多种天然抗氧化剂，在体内外均有显著的抗氧化活性，又因其绿色天然、营养味美，使得蜂蜜广泛应用于饮食、医药、化妆品等行业，深受消费者青睐。在食品方面，蜂蜜既可以单独食用，也可以作为一种辅料添加剂，如蜂蜜饮料，蜂蜜蛋糕等。在临床医学上，常用于治疗创伤和烧伤、防止感染、表面坏死性溃疡、慢性溃疡等。用蜂蜜水漱口杀菌消炎润喉，对治疗咽喉和口腔疾病有较好的作用，同时蜂蜜对治疗儿童慢性便秘、佝偻病等效果显著。在药品生产中，蜂蜜是甜味剂，也是很好的抗氧化剂和黏合剂，而且加入蜂蜜本身的功效，如健胃止痛的仲景胃灵丸、化痰止咳的川贝枇杷膏等。蜂蜜天然无毒，营养成分丰富，渗透性强，保湿性好，直接使用或者提取应用都能较好的润滑和柔嫩肌肤；蜂蜜中所含的抑菌和杀菌成分可以预防皮肤细菌滋生，保持皮肤的健康；此外，蜂蜜含有防止或减缓衰老的抗氧化成分，如酮类、酚类等。以上特点使蜂蜜越来越多的被添加和应用到各种化妆品中，深受消费者喜爱。有文献报道，蜂蜜能促进酒精分解代谢，减轻饮酒原因造成的头痛症状，其所含的果糖是主要功效成分[51]，而且枣花蜜能通过抗氧化的作用预防性的降低无水乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤程度[18]。鉴于蜂蜜的诸多可探讨性，本文将通过大鼠实验研究百花蜜的解酒作用及对急性酒精性胃黏膜的保护作用，并初步探讨其可能的机制。1.5急性酒精中毒及急性酒精性胃黏膜损伤动物模型急性酒精中毒动物模型的构建，根据耐受性和相似性，首选大鼠，重点是将乙醇6 广东药学院硕士毕业论文导入大鼠体内，乙醇经吸收进入血液循环，从而发生醉酒。将酒精注入大鼠体内的主要方式有腹腔注射和灌胃，陈小彬等[52]将浓度为50%乙醇按剂量10.6ml/kg以腹腔注射的方法成功构建了急性酒精中毒小鼠模型。王林元等[53]将浓度为50%乙醇按剂量15ml/Kg灌胃小鼠成功构建了急性酒精中毒动物模型。为了模拟人饮酒的方式，保证酒精的吸收且操作简单容易，在本实验中采取一次性灌胃的方式建立急性酒精中毒模型。在实际操作中，为了减少大鼠体内其他物质可能对酒精代谢的影响，大鼠乙醇灌胃前13小时开始均禁食不禁水。构建急性胃损伤的动物模型有多种方法，而乙醇法是常用的造模方法之一[54]。乙醇，化学式为CH3CH2OH，其水溶液气味芬香，但刺激性强，经胃肠吸收，对胃黏膜有直接的损伤作用，高浓度乙醇可直接腐蚀胃黏膜组织，浓度大于14%的乙醇接触胃黏膜后即可直接破坏胃黏液屏障，引起胃黏膜的急性炎症。高浓度乙醇灌胃法建立大鼠急性胃黏膜损伤模型，已然普遍应用于探讨治疗急性胃黏膜损伤的药效评估、药理机制等。在众多研究报道中，致使胃黏膜的急性损伤使用的一次性灌胃乙醇浓度多在75%~100%之间，夏敏等[55]报道，以小鼠为实验对象，用浓度为75％或95％的乙醇每只灌胃1ml，1h后解剖胃发现胃已经出现明显的损伤，病理可见胃黏膜上皮细胞出现严重的变性、坏死以及间质血管瘀血等。甘典辉等[19]用直接用无水乙醇按剂量10ml/kg灌胃大鼠也成功建立急性胃损伤模型。王志聪等[56]用浓度为80%的乙醇给每只大鼠一次性灌胃1ml的方法成功构建了急性胃损伤动物模型。在本课题中，动物模型是伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒的大鼠。根据相关文献，在预实验中，选择了56°红星二锅头、75%乙醇、90%乙醇这三种乙醇浓度一次性灌胃大鼠的方法进行动物造模。结果用56°红星二锅头造模的大鼠死亡率为零，15min后相继出现急性酒精中毒状态，3h后解剖大鼠胃组织肉眼观察大鼠胃黏膜损伤程度极轻；用90%乙醇造模的大鼠精神状态极差，容易导致大鼠死亡，而且3h后解剖胃组织，肉眼观察胃黏膜损害程度极其严重；用75%乙醇造模的大鼠，灌酒后5min开始均相继出现急性酒精中毒症状，动物3h内均无死亡，3h后解剖胃组织，胃黏膜损伤严重，此条件下造模成功率最高。从造模的成功率、操作难易程度、大鼠耐受程度等方面考虑，本课题选择75%乙醇一次性灌胃进行造模。7 广东药学院硕士毕业论文8 广东药学院硕士毕业论文第二章蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用2.1前言急性酒精中毒能引起消化、神经、心血管等系统的组织器官损伤，其中以消化系统的损伤最为常见。在临床，以急性酒精中毒导致胃黏膜的出血溃疡最为常见，患者表现为胃部不适、恶心呕吐、腹部疼痛等症状，严重者出现呕血、胃穿孔甚至死亡。近年来，随着生活方式的改变和生活压力的提高，饮酒已然成为消遣和社交的方式，由于饮酒而引发的急性酒精中毒及胃黏膜损伤屡见不鲜。急性酒精中毒引起的急性胃黏膜损伤具有可预见性，因此，研发具有预防或保护因急性酒精中毒所致胃黏膜损伤的药物有重要的现实意义。评价胃黏膜损伤程度的常用指标主要有胃黏膜损伤指数、损伤抑制率以及胃组织病理形态学等。本部分实验用75%乙醇10ml/kg一次性灌胃大鼠建立伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型，通过肉眼观察胃黏膜大体形态、计算并比较各组大鼠胃黏膜损伤指数、光镜下观察胃黏膜组织病理形态学这几方面来评价蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用。2.2实验材料2.2.1蜂蜜的配制及阳性药物2.2.1.1蜂蜜冠生园纯净蜜：批号：170508M1，上海冠生园食品有限公司生产，主要配料为油菜蜂蜜、荆条蜂蜜、洋槐蜂蜜。购买的蜂蜜浓度视为100%，分别用双蒸水按照一定比例稀释成高（20%）、中（10%）、低（5%）浓度组备用。2.2.1.2阳性药物鼎久解酒口服液：批号：20130120，北京维卫康科技有限公司生产；功能：解酒护胃护肝；主要成分：葛根、白及、枳实、三七、甘草、白芍；标志性成分及含量：每100ml含总皂苷65mg、总黄酮15mg；使用剂量：每日2次，每次1瓶（60ml）。根据人与动物药物剂量换算公式以及中药有效成分含量算得大鼠灌服鼎久解酒9 广东药学院硕士毕业论文口服液的剂量为12.5ml/kg。2.2.2实验动物SPF级SD大鼠，36只，雄性，质量为190～210g，购买于广州中医药大学（大学城）实验动物中心，合格证号SCXK（粤）2013-0020。屏障系统动物房，每笼放养4只，每天接受12h黑暗/12h光照，光照时间段为8:30～20:30，纯净用水和标准饲料高压备用并由动物自行摄取。实验室室温控制在(21±4)℃，相对湿度为45%～75%。2.2.3主要试剂食用级无水乙醇、0.9%生理盐水广州文睿科学仪器有限公司；纯净百花蜜上海冠生园食品有限公司，批号170508M1；鼎久解酒口服液北京维卫康科技有限公司，批号20130120；戊巴比妥钠、甲醛溶液广州威佳科技有限公司。2.2.4主要仪器设备名称型号产地显微镜及照相系统CKX41SF日本Olympus公司超纯水纯化系统PROG00002美国Millipore制冰机LQP-B-4上海安亭高压灭菌锅LaboAutoclave日本SANYO2.3实验方法2.3.1动物分组SPF级SD大鼠，36只，雄性，质量为190～210g，由广州中医药大学（大学城）实验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2013-0020。屏障系统动物房，每笼放养4只，每天接受12h黑暗/12h光照，光照时间段为8:30～20:30,纯净水和标准饲料高压备足由动物自行摄取。实验室室温控制在(22±4)℃，相对湿度为45%～75%。实验动物的操作严格遵守国际伦理学规范。大鼠适应性喂养3天后均禁食不禁水13h，随机分为6组:正常组(不做任何处理)、模型组(灌服生理盐水15ml/kg)、蜂蜜低浓度组(灌服5%蜂蜜15ml/kg)、蜂蜜中浓度组(灌服10%蜂蜜15ml/kg)、蜂蜜高浓度组(灌服20%蜂蜜15ml/kg)、阳性药物对照组(灌服鼎久解酒口服液12.5ml/kg)，每组6只。10 广东药学院硕士毕业论文2.3.2动物模型构建及给药本研究参考酒精中毒大鼠模型构建的方法并加以改进，将食用级无水乙醇稀释成浓度为75%的溶液,采用75%乙醇按10ml/kg一次性灌胃法构建急性酒精中毒大鼠模型。除正常组不做任何处理之外,其余各组均以75%乙醇按剂量10ml/kg一次性灌胃大鼠，乙醇灌胃30min后，模型组大鼠灌胃15ml/kg生理盐水，蜂蜜及阳性药物组分别按剂量一次性灌胃给药。2.3.3动物取材及标本处理各处理组大鼠给药2.5h后，用1%戊巴比妥钠3.5ml/kg腹腔注射将大鼠麻醉，切开腹腔，立即剖取并分离胃，沿胃大弯剪开胃腔，胃去内容物后在装有预冷生理盐水的烧杯中反复漂洗直到干净为止，先在冰面上铺开固定，肉眼观察胃黏膜损伤的大体情况，以直尺刻度为参照，相机拍照，再剪取损伤最严重的大小约1.0×0.5cm的胃组织，放入10%的甲醛溶液固定，24小时后送广东药学院基础学院病理科制作胃组织病理切片。2.3.4检测指标及方法2.3.4.1各组大鼠胃黏膜损伤指数评定肉眼观察各组大鼠胃黏膜完整度、表面光滑度、色泽及出血等异常情况，按GUTH[57]计分标准改良，根据胃黏膜出血点的大小、数目积分：出血灶长度≤1mm（包括点状出血）为1分；1mm＜出血灶长度≤2mm为2分；2mm＜出血灶长度≤3mm为3分；3mm＜出血灶长度≤4mm为4分；出血灶长度＞4mm为5分；条状损伤宽度＞2mm者，分值×2，每只大鼠全胃所有出血点全部相加的总分值即为该动物的损伤指数。大鼠胃损伤抑制率=（模型组平均损伤指数－药物组平均损伤指数）÷模型组平均损伤指数×100%2.3.4.2各组大鼠胃黏膜组织病理学观察制作好的病理切片在病理教研室老师指导下，光镜下观察病理影像并拍照。胃黏膜病理组织学检查参考有关文献[58]，结合本实验将损伤程度分为五级。评分方法：以胃黏膜充血、出血、黏膜上皮细胞及腺体变性坏死在整个黏膜层的累及程度分级分别计分,以此评分从病理学角度计算损伤指数:11 广东药学院硕士毕业论文胃黏膜病理评分标准分级评分评分参考标准0级0分胃壁全层未见明显病变1级1分黏膜层上皮细胞变性、坏死、脱落2级2分黏膜浅表层小血管充血，不超过黏膜层深度的1/23级3分黏膜层内血管充血或出血，深度达到或超过1/24级4分黏膜层内腺体溶解坏死，深度不超过1/25级5分黏膜层内腺体溶解坏死，深度达到或超过1/22.3.5统计学分析各组实验数据均以平均数与标准差（X±SD）表示，应用SPSS19.0统计学软件，多组间比较进行单因素方差分析（one-wayANOVA），若方差齐用LSD法比较，若方差不齐用DunnettT3法比较。以P<0.05为统计学显著性差异，P<0.01为统计学极显著性差异。2.4实验结果2.4.1大鼠灌酒前后一般形态表现图2.1正常大鼠与急性酒精中毒大鼠的一般形态表现（A：正常大鼠；B：急性酒精中毒大鼠）Fig.2.1Thegeneralbehaviorofratsamongnormalandacutealcoholismgroups(A：Normalrat;B：Acutealcoholismrat)在本部分实验中，如图2.1所示：正常组大鼠行动灵敏，精神状态极好，大便正12 广东药学院硕士毕业论文常，行为稳定、无嗜睡等现象。除正常组外的各实验组大鼠灌酒5min后均相继出现精神萎靡、狂躁、排稀便、后腹拖地、共济失调（步态不稳，困倦感，动作不协调）、尿失禁、侧卧、翻正反射消失等急性酒精中毒症状。2.4.2各组大鼠胃黏膜损伤大体形态及损伤指数图2.2各组大鼠胃黏膜损伤大体形态A:正常组,B:模型组,C:阳性药物对照组,D:蜂蜜低浓度组,E:蜂蜜中浓度组,F:蜂蜜高浓度组Fig.2.2GrossmorphologyofacutegastricmucosalinjuryinratsA:Normalgroup,B:Modelgroup,C:Positivedrugcontrolgroup,D:Low-concentrationhoneygroup,E:Moderate-concentrationhoneygroup,F:High-concentrationhoneygroup.如图2.2所示：正常组大鼠胃黏膜完整，黏液丰富，形态及色泽正常，黏膜光滑，未见出血、溃疡、糜烂等异常；模型组大鼠胃黏膜尚完整，明显充血水肿，表面不光滑，可见片状出血、糜烂、溃疡，呈花斑样改变；阳性药物对照组胃黏膜尚完整，充13 广东药学院硕士毕业论文血水肿，表面欠光滑，可见散在点、线状出血点、糜烂、溃疡；蜂蜜低浓度组大鼠胃黏膜充血水肿，表面欠光滑，可见散在点、片状出血、糜烂、溃疡；蜂蜜中浓度组大鼠胃黏膜充血水肿，表面欠光滑，可见散在点线状出血、糜烂。蜂蜜高浓度组大鼠胃黏膜充血水肿，表面欠光滑，可见少许散在点、线状出血。表2.1各组大鼠胃组织损伤指数及损伤抑制率(X±S，n=6)Table.2.1gastricmucosalinjuryindexandinhibitionratioofratsamonggroups(X±S，n=6)组别数量胃损伤指数抑制率正常组60100%模型组664.33±6.08-阳性药物对照组619.16±9.34**70.20%蜂蜜低浓度组628.00±4.19**56.40%蜂蜜中浓度组624.83±4.49**61.40%蜂蜜高浓度组616.33±6.17**74.60%注释：与模型组相比,**P<0.01Note:comparedwithmodelgroup,**P<0.01.图2.3各组大鼠胃组织损伤指数Fig2.3gastricmucosalinjuryindexofratsamonggroups表2.1显示，与正常组大鼠相比较，模型组大鼠的胃黏膜损伤指数极显著提高（P<0.01）；蜂蜜各浓度组与模型组相比较，均能极显著降低大鼠胃黏膜损伤指数（P<0.01）。蜂蜜水对大鼠胃黏膜损伤抑制率呈剂量依赖性趋势，其中蜂蜜高浓度组损伤抑制率高达74.60%。以上各组大鼠胃黏膜大体形态及损伤指数结果共同提示模14 广东药学院硕士毕业论文型组大鼠胃黏膜损伤极为明显，胃损伤模型构建成功，而蜂蜜可以减轻乙醇所致的胃黏膜损伤程度，对胃黏膜具有保护作用，且与阳性药物对照组的保护作用相当。2.4.3各组大鼠胃组织病理形态学结果图2.4各组大鼠胃组织病理形态学A：正常组HE×100，a:正常组HE×200；B：模型组HE×100，b:模型组HE×200；C：阳性药物HE×100，c:阳性药物组HE×200；D：蜂蜜低浓度组HE×100，d:蜂蜜低浓度组HE×200；E：蜂蜜中浓度组HE×100，e:蜂蜜中浓度组HE×200；F：蜂蜜高浓度组HE×100，f:蜂蜜高浓度组组HE×200；Fig.2.4GastrichistopathologyofratsamonggroupsA：NormalgroupHE×100，a:NormalgroupHE×200;B：ModelgroupHE×100，b:Modelgroup：HE×200;C：ControlgroupHE×100，c:ControlgroupHE×200;D：Low-concentrationhoneygroupHE×100，d:Low-concentrationhoneygroupHE×200;E：moderate-concentrationhoneygroupHE×100，e:moderate-concentrationhoneygroupHE×200;F：High-concentrationhoneygroupHE×100，f:High-concentrationhoneygroupHE×200;结果如图2.4所示：正常组大鼠胃组织各层结构完整清晰，腺体排列规则,未见组织缺损、出血、炎症等异常病变，计0分；模型组大鼠胃黏膜上皮细胞及腺体广泛溶解坏死，深度超过全层1/2，黏膜全层弥漫性出血，在黏膜下层有明显的水肿，并且可见大量炎细胞浸润，计5分。阳性药物对照组少量胃黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜浅层小血管充血，计2分；蜂蜜低浓度组胃黏膜表面少量上皮细胞脱落，黏膜中下层小15 广东药学院硕士毕业论文血管充血，计3分。蜂蜜中浓度组胃黏膜上皮细胞完整，黏膜浅层小血管充血，计2分；蜂蜜高浓度组部分胃黏膜上皮细胞脱落，黏膜中下层少量小血管充血，计2分。病理学结果显示模型组胃黏膜损伤严重，蜂蜜各浓度组大鼠胃黏膜水肿、充血、炎性浸润、黏膜上皮细胞及腺体变性坏死程度均较模型组轻。2.5讨论急性酒精中毒主要以神经精神状态为主要症状，初始症状为兴奋状态，接着体态不稳、共济失调，最后进入昏睡期，即翻正反射消失（大鼠乙醇灌胃后，将其背部向下放入鼠笼，若大鼠能保持背部向下的姿势不动达到30s以上，则判定为翻正反射消失，即急性酒精中毒），是大鼠处于昏睡期时的特征性表现，常作为判定急性酒精中毒的可靠指标。在本部分实验中，除正常组外的各实验组大鼠灌酒5min后均相继出现翻正反射消失等醉酒症状。此结果说明用75%乙醇10ml/kg灌胃大鼠建立急性酒精中毒模型成立。无水乙醇灌胃会导致大鼠胃黏膜发生不同程度的损伤，损伤率为100%，本实验结果表明：肉眼观察下可见模型组大鼠胃黏膜明显充血水肿，花斑样改变，点、片状出血、糜烂、溃疡，光镜下可见胃黏膜上皮细胞及腺体广泛溶解坏死，深度超过全层1/2，黏膜全层弥漫性出血，黏膜下层明显水肿，大量炎症细胞浸润，按病理评分标准计5分，大鼠胃黏膜出现了明显的急性损伤，结合上文共同说明伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型建立成功。而蜂蜜各浓度处理组胃损伤指数均显著低于模型组（P<0.01），肉眼观察下可见其胃黏膜出血、水肿、溃疡程度均轻于模型组,光镜下其胃黏膜上皮完整性、腺体排列整齐度等方面均优于模型组，由此说明蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤有较好的保护作用。16 广东药学院硕士毕业论文第三章蜂蜜保护急性酒精中毒大鼠胃黏膜的作用机制的初步探讨3.1前言胃黏膜本身拥有完整的修复和防御体系，处于胃黏膜保护因子和致损伤因子的相对动态平衡之中。乙醇对胃的伤害，是由多种因素造成的，总的来讲是由于胃黏膜致损伤因素强于胃黏膜保护因素的结果，而炎性反应和氧自由基损伤贯穿于整个胃组织急性受损的过程。保护胃黏膜的核心是清除氧自由基、抑制炎症反应、减弱胃黏膜攻击因子、增强黏膜防御修复因子、加快酒精代谢等。胃黏膜在无水乙醇等化学物质的刺激下会产生大量的氧自由基（OxygenDerivedFreeRadical,OFR），氧自由基是致使胃黏膜损伤的重要因素，无论在细胞水平还是在整体水平都能导致胃组织细胞发生脂质过氧化反应，诱发胃黏膜损伤。SOD是机体清除氧自由基的天然物质，不仅作为抗氧自由基的第一道防线，而且其具有修复受损细胞的功能。MDA是胃黏膜攻击因子之一，是反应机体脂质过氧化程度的常用指标，其含量的多少可直接反映胃组织过氧化损伤程度。胃黏膜致损伤因子阻碍胃黏膜上皮细胞的分泌，诱导炎症反应，影响胃组织血液循环，导致黏膜屏障功能降低，胃黏膜出现急性炎症、缺血、坏死甚至溃疡等。胃黏膜攻击因子中，IL-8和TNF-α是胃黏膜损伤的炎性介质，通过引发和诱导炎症反应损伤胃黏膜。ET-1具有强烈的缩血管功能，是调节局部器官血流和血管内皮舒缩平衡的重要因子，胃黏膜内ET-1含量增加可导致局部缺血。胃黏膜的防御因子在致损伤因子存在的情况下能更好的发挥作用，通过保护胃血管内皮、扩张血管、改善胃黏膜局部缺血、维护胃上皮细胞分泌与更新的功能等作用保护胃黏膜。这些因子主要有PGE2、EGF、SS等。加速体内酒精的代谢，减少体内乙醇浓度也是保护胃黏膜的途径之一。乙醇通过胃肠道吸收，完全吸收进入血液只需短短30-90min。人体饮用乙醇后仅数分钟即可在外周血中测得乙醇存在，血液乙醇浓度在半小时到2小时之间达到峰值，随着酒精代谢，8小时到10小时后血液中不能检测到乙醇[59]。血液乙醇浓度高低可以反应体内酒精量及醉酒的程度。进入体内的酒精大部分由ADH氧化为乙醛,乙醛由ALDH转化为乙酸，再经三羧酸循环，最后氧化成CO[60]2和H2O排出体外。ADH和ALDH主要17 广东药学院硕士毕业论文分布在肝脏和胃中，是酒精代谢的关键酶[61,62]。本部分实验通过检测各组大鼠胃组织匀浆中SOD活性、MDA含量、胃黏膜攻击因子（ET-1、IL-8、TNF-α）含量、胃黏膜防御修复因子（PGE2、EGF、SS）含量、血清乙醇浓度、肝ADH和ALDH活性、胃ADH和ALDH活性水平来探讨蜂蜜保护胃黏膜可能的作用机制。3.2实验材料3.2.1蜂蜜的配制及阳性药物3.2.1.1蜂蜜冠生园纯净蜜：批号：170508M1，上海冠生园食品有限公司生产，主要配料为油菜蜂蜜、荆条蜂蜜、洋槐蜂蜜。购买的蜂蜜浓度视为100%，分别用双蒸水按照一定比例稀释成高（20%）、中（10%）、低（5%）浓度组备用。3.2.1.2阳性药物鼎久解酒口服液：批号：20130120，北京维卫康科技有限公司生产；功能：解酒护胃护肝；主要成分：葛根、白及、枳实、三七、甘草、白芍；标志性成分及含量：每100ml含总皂苷65mg、总黄酮15mg；使用剂量：每日2次，每次1瓶（60ml）。根据人与动物药物剂量换算公式以及中药有效成分含量算得大鼠灌服鼎久解酒口服液的剂量为12.5ml/kg。3.2.2实验动物同上一章。3.2.3主要试剂食用级无水乙醇、0.9%生理盐水广州文睿科学仪器有限公司；纯净百花蜜上海冠生园食品有限公司，批号170508M1；鼎久解酒口服液北京维卫康科技有限公司，批号20130120；戊巴比妥钠、甲醛溶液广州威佳科技有限公司；胃组织SOD、MDA、总蛋白试剂盒南京建成生物公司，批号分别为20140418、20140417、20140915；胃组织TNF-α、ET-1、PGE2、EGF、IL-8、SSELISA试剂盒北京安迪基因，批号分别为HTBL009、HTBL025、HTBL004、HTBL014、HTBL014、HTBL003；乙醇检测试剂盒BioAssaySystems，USA；肝组织ADH试剂盒、总蛋白试剂盒南18 广东药学院硕士毕业论文京建成生物公司，批号分别为20140417、20140417；ALDH试剂盒北京安迪基因，批号HTBX030；戊巴比妥钠、甲醛溶液广州威佳科技有限公司。3.2.4主要仪器设备名称型号产地高速冷冻离心机5810R德国Eppendorf自动组织匀浆机IKA-T10德国IKA公司超纯水纯化系统PROG00002美国Millipore电热恒温水箱HH-3A金坛市精达仪器分光光度计U-2900日本HITACHI公司电子分析天平BSA223SSARTORIUS制冰机LQP-B-4上海安亭高压灭菌锅LaboAutoclave日本SANYO显微镜CKX41SF日本Olympus酶标仪ELX808450nm美国BioTek公司超低温冰箱Ultralow日本SANYO灌胃针、解剖器材16号型广州文睿科技公司3.3实验方法3.3.1动物分组同上一章。3.3.2动物模型构建及给药同上一章。3.3.3动物取材及标本处理各处理组大鼠给药2.5h后，用1%戊巴比妥钠按3.5ml/kg剂量腹腔注射将大鼠麻醉，然后切开腹腔，进行腹主动脉取血，而后立即剖取肝脏并分离胃。将肝脏包膜去除，放入装有预冷生理盐水的烧杯中反复漂洗直到干净为止，用干净的滤纸吸干水分并精确称重，冰浴下按1：9比例加入预冷的生理盐水，用自动组织匀浆机制成10%肝组织匀浆。取出胃后，沿胃大弯剪开胃腔，去掉胃内容物后，在装有预冷生理盐水19 广东药学院硕士毕业论文的烧杯中反复漂洗直到干净为止，冰面上平铺干净滤纸，将胃组织铺开于滤纸上固定，以标尺为参照，肉眼观察胃黏膜损伤的大体情况并拍照，再剪取损伤最严重的大小约1.0×0.5cm的胃组织，放入10%的甲醛溶液固定，24小时后送广东药学院基础学院病理科制作病理切片。另剪取剩余胃组织约0.5～1.0g，称重，冰浴下按1：9加入预冷的生理盐水，用自动组织匀浆机制成10%的胃组织匀浆。收集的全血静置1h后2500r/min低温离心15min，取上清，保存于-20℃冰箱，留作血清乙醇浓度检测。将制备好的10%肝组织匀浆以转速3000r/min低温离心15min，取上清，分装并保存于-20℃冰箱备用，留作肝ADH、ALDH、总蛋白含量检测。将上述制备好的10%胃组织匀浆按转速3000r/min低温离心15min，取上清，分装并保存于-20℃冰箱备用，留作胃组织ADH、ALDH、MDA、SOD、总蛋白含量、TNF-α、ET-1、PGE2、EGF、IL-8、SS等相关因子的检测。3.3.4检测指标及方法胃SOD活性、MDA含量、胃组织TNF-α、ET-1、PGE2、EGF、IL-8、SS含量：根据各试剂盒说明书严格按照操作步骤完成检测，测定的结果用胃组织总蛋白含量加以校正；大鼠血清乙醇浓度，根据试剂盒说明书严格按照操作步骤完成检测；肝ADH和ALDH活性，根据各试剂盒说明书严格按照操作步骤完成检测，测定的结果用肝组织总蛋白含量加以校正；胃ADH和ALDH活性，根据各试剂盒说明书严格按照操作步骤完成检测，测定的结果用胃组织总蛋白含量加以校正。3.3.5统计学分析各组实验数据均以平均数与标准差（X±SD）表示，应用SPSS19.0统计学软件，多组间比较进行单因素方差分析（one-wayANOVA），若方差齐用LSD法比较，若方差不齐用DunnettT3法比较。以P<0.05为统计学显著性差异，P<0.01为统计学极显著性差异。20 广东药学院硕士毕业论文3.4实验结果3.4.1各组大鼠胃组织抗氧化相关因子SOD活性、MDA含量的变化表3.1各组大鼠胃组织SOD活性、MDA含量(X±S，n=6)Table.3.1TheactivityofSODandthecontentofMDAinstomachtissue(X±S，n=6)组别数量胃SOD活性（U/mgprot）胃MDA含量（nmol/mgprot）正常组644.34±6.040.50±0.10*模型组640.51±7.640.64±0.11阳性药物对照组666.00±11.03**0.26±0.11**蜂蜜低浓度组647.23±3.71△△0.34±0.13**蜂蜜中浓度组649.31±8.80△△0.23±0.43**蜂蜜高浓度组650.40±6.33*△△0.38±0.17**注释：与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01，与阳性药物对照组相比：△P<0.05,△△P<0.01。Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05,**P<0.01；ComparedwithpositivedrugControlgroup，△P<0.05,△△P<0.01.图3.1各组大鼠胃组织SOD活性和MDA含量Fig.3.1TheactivityofSODandthecontentofMDAinstomachtissue结果如表3.1所示：模型组较正常组SOD活性降低，MDA含量升高。与模型组大鼠相比较，蜂蜜高浓度组显著提高胃组织SOD活性（P<0.05），蜂蜜中、低浓度组胃组织SOD活性水平较模型组无统计学差异（P>0.05）。蜂蜜各浓度组可极显著降低模型组大鼠胃组织MDA含量（P<0.01）。阳性药物对照组提高胃黏膜SOD活性的水平极显著高于蜂蜜高浓度组（P<0.01），降低MDA含量的水平与蜂蜜各浓度组无显著21 广东药学院硕士毕业论文性差异（P>0.05）。3.4.2各组大鼠胃黏膜致损伤因子ET-1、TNF-α、IL-8含量的变化3.4.2.1各组大鼠ET-1含量表3.2各组大鼠胃组织ET-1含量（X±S，n=6）Table.3.2thecontentofET-1instomachtissue（X±S，n=6）组别数量ET-1含量（ng/gprot）正常组610.64±0.90**模型组619.71±3.14阳性药物对照组613.92±1.35**蜂蜜低浓度组614.49±3.73**蜂蜜中浓度组613.72±3.81**蜂蜜高浓度组612.61±2.22**注释：与模型组相比：**P<0.01Note：Comparedwithmodelgroup，**P<0.01；图3.2各组大鼠胃组织ET-1含量Fig.3.2thecontentofET-1instomachtissue结果如表3.2所示：模型组大鼠胃组织ET-1含量较正常组极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组胃组织ET-1含量均极显著低于模型组（P<0.01）；而胃组织ET-1含量在蜂蜜各浓度组与阳性药物对照组大鼠之间相比较无显著性差异（P>0.05）。提示蜂蜜能降低大鼠胃黏膜ET-1含量，且与阳性药物对照组作用相当。22 广东药学院硕士毕业论文3.4.2.2各组大鼠TNF-α含量表3.3大鼠胃组织TNF-α含量（X±S，n=6）Table.3.3thecontentofTNF-αinstomachtissue（X±S，n=6）组别数量TNF-α含量（ng/gprot）正常组655.68±9.47**模型组697.54±18.37阳性药物对照组678.58±13.71*蜂蜜低浓度组679.78±20.17蜂蜜中浓度组669.93±17.43**蜂蜜高浓度组664.91±6.16**注释：与模型组相比：*P<0.05，**P<0.01Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05，**P<0.01；图3.3大鼠胃组织TNF-α含量Fig.3.3thecontentofTNF-αinstomachtissue结果如表3.3所示，与正常组比较，模型组大鼠胃组织TNF-α含量极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，蜂蜜中、高浓度组胃组织TNF-α含量均极显著低于模型组（P<0.01），阳性药物对照组较模型组显著降低（P<0.05）；与阳性药物对照组相比较，蜂蜜中、高浓度组大鼠胃组织TNF-α含量虽有所降低，但无统计学意义（P>0.05）。23 广东药学院硕士毕业论文3.4.2.3各组大鼠IL-8含量表3.4各组大鼠胃组织IL-8含量（X±S，n=6）Table.3.4thecontentofIL-8instomachtissue（X±S，n=6）组别数量IL-8含量（ng/gprot）正常组684.14±9.32**模型组6137.88±27.01阳性药物对照组695.21±21.88**蜂蜜低浓度组6111.38±30.34**蜂蜜中浓度组697.55±26.43**蜂蜜高浓度组691.36±9.06**注释：与模型组相比：**P<0.01Note：Comparedwithmodelgroup，**P<0.01；图3.4各组大鼠胃组织IL-8含量Fig.3.4thecontentofIL-8instomachtissue结果如表3.4显示，与正常组比较，模型组大鼠胃组织IL-8含量极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组胃组织IL-8含量均极显著低于模型组（P<0.01）；蜂蜜各浓度组大鼠胃组织IL-8含量与阳性药物对照组相比较无显著性差异（P>0.05）。3.4.3各组大鼠胃黏膜保护因子PGE2、SS、EGF含量的变化24 广东药学院硕士毕业论文3.4.3.1各组大鼠PGE2含量表3.5各组大鼠胃组织PGE2含量（X±S，n=6）Table.3.5thecontentofPGE2instomachtissue（X±S，n=6）组别数量PGE2含量（ng/gprot）正常组689.45±16.06**模型组653.84±7.35阳性药物对照组671.55±11.54*蜂蜜低浓度组660.74±14.29蜂蜜中浓度组674.73±24.03*蜂蜜高浓度组676.51±8.16*注释：与模型组相比：*P<0.05，**P<0.01Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05，**P<0.01；图3.5各组大鼠胃组织PGE2含量Fig.3.5thecontentofPGE2instomachtissue结果如表3.5所示：与正常组相比，模型组大鼠胃组织PGE2含量极显著下降（P<0.01）；与模型组比较，蜂蜜中、高浓度组显著提高大鼠胃组织PGE2含量（P<0.05）；蜂蜜中、高浓度组胃组织PGE2含量较阳性药物对照组稍高，但无显著性差异（P＞0.05）。提示蜂蜜能通过提高胃黏膜PGE2含量保护胃黏膜。25 广东药学院硕士毕业论文3.4.3.2各组大鼠SS含量表3.6各组大鼠胃组织SS含量（X±S，n=6）Table.3.6thecontentofSSinstomachtissue（X±S，n=6）组别数量SS含量（ng/gprot）正常组652.11±11.29**模型组638.42±7.37阳性药物对照组650.66±3.79*蜂蜜低浓度组643.89±5.24蜂蜜中浓度组643.77±7.42蜂蜜高浓度组651.40±10.12**注释：与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05,**P<0.01；图3.6各组大鼠胃组织SS含量Fig.3.6thecontentofSSinstomachtissue结果如表3.6示：与正常组相比，模型组大鼠胃组织SS含量极显著下降（P<0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠胃组织SS含量均升高，其中，阳性药物组显著升高（P<0.05）,蜂蜜高浓度组极显著升高（P<0.01）。与阳性药物对照组相比，蜂蜜高浓度组大鼠胃组织SS含量略高，但无统计学意义（P>0.05）。26 广东药学院硕士毕业论文3.4.3.3各组大鼠EGF含量表3.7各组大鼠胃组织EGF含量（X±S，n=6）Table.3.7thecontentofEGFinstomachtissue（X±S，n=6）组别数量EGF含量（ng/gprot）正常组6506.07±67.58模型组6503.86±37.71阳性药物对照组6460.09±94.90蜂蜜低浓度组6474.89±116.20蜂蜜中浓度组6470.72±133.24蜂蜜高浓度组6501.93±56.61表3.7显示，正常组大鼠胃组织EGF含量最高，蜂蜜各浓度组较模型组均有所降低，但无统计学差异（P>0.05）。3.4.4各组大鼠血清乙醇浓度、酒精关键代谢酶活性水平的变化3.4.4.1各组大鼠血清乙醇浓度表3.8大鼠血清乙醇浓度（X±S，n=6）Table.3.8Theethanolconcentrationinbloodserum（X±S，n=6）组别数量乙醇浓度（mg/ml）正常组646.89±12.32**模型组61109.75±92.10阳性药物对照组6493.31±130.64**蜂蜜低浓度组6902.30±175.00*△△蜂蜜中浓度组6899.93±199.00*△△蜂蜜高浓度组6843.11±224.13**△△注释：与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01；与阳性药物对照组相比：△△P<0.01。Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05,**P<0.01；ComparedwithpositivedrugControlgroup，△△P<0.01.27 广东药学院硕士毕业论文表3.8大鼠血清乙醇浓度Table.3.8Theethanolconcentrationinbloodserum结果如表3.8所示：与正常组相比，模型组大鼠血清乙醇浓度极显著升高（P<0.01），说明急性酒精中毒大鼠造模成功。与模型组比较，蜂蜜低、中浓度组大鼠血清乙醇浓度均显著降低(P<0.05)，蜂蜜高浓度组大鼠血清乙醇浓度极显著降低（P<0.01）。与阳性药物对照组相比，蜂蜜各处理组大鼠血清乙醇浓度明显升高（P<0.01）。此结果表明蜂蜜可降低急性酒精中毒大鼠血清中的乙醇含量，但效果不及阳性药物对照组。3.4.4.2各组大鼠肝、胃组织中的ADH活性水平表3.9大鼠肝、胃组织ADH活性（X±S，n=6）Table.3.9TheactivityofADHinliverandstomachtissue（X±S，n=6）组别数量肝ADH活性（U/mgprot）胃ADH活性（U/mgprot）正常组65.31±0.930.43±0.15模型组69.07±2.250.57±0.10阳性药物对照组629.86±7.09**1.20±0.10**蜂蜜低浓度组612.58±4.16△0.73±0.16*△△蜂蜜中浓度组623.88±2.56**0.80±0.12**△△蜂蜜高浓度组625.99±3.99**0.95±0.13**△△注释：与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01；与阳性药物对照组相比：△P<0.05,△△P<0.01。Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05,**P<0.01；ComparedwithpositivedrugControlgroup，△P<0.05,△△P<0.01.28 广东药学院硕士毕业论文表3.9大鼠肝、胃组织ADH活性Fig.3.9TheactivityofADHinliverandstomachtissue结果如表3.9所示：与模型组比较，蜂蜜中、高浓度组大鼠肝组织ADH活性极显著升高（P<0.01），蜂蜜低浓度组大鼠胃组织ADH活性显著升高（P<0.05），蜂蜜中、高浓度组大鼠胃组织ADH活性极显著升高（P<0.01）。与阳性药物对照组相比，蜂蜜低浓度组大鼠肝组织ADH活性显著降低（P<0.05），蜂蜜中、高浓度组大鼠肝组织ADH活性降低，但无统计学差异（P>0.05）。蜂蜜各浓度组胃ADH活性均极显著减低（P<0.01）。此结果提示蜂蜜能升高急性酒精中毒大鼠肝组织和胃组织ADH活性水平，但升高的水平不及阳性药物对照组。3.4.4.3各组大鼠肝、胃组织中的ALDH活性水平表3.10大鼠肝、胃ALDH活性(X±S，n=6)Table.3.10TheactivityofALDHinliverandstomachtissue(X±S，n=6)组别数量肝ALDH活性（U/gprot）胃ALDH活性（U/gprot）正常组65.73±0.630.60±0.10模型组65.20±0.360.53±0.09阳性药物对照组66.97±0.93**0.76±0.10**蜂蜜低浓度组66.15±0.60*0.52±0.08△△蜂蜜中浓度组66.63.±0.88**0.90±0.19**蜂蜜高浓度组66.88±0.88**0.91±0.20**注释：与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01；与阳性药物对照组相比：△△P<0.01。Note：Comparedwithmodelgroup，*P<0.05,**P<0.01；ComparedwithpositivedrugControlgroup，△△P<0.01.29 广东药学院硕士毕业论文表3.10大鼠肝、胃ALDH活性Fig.3.10TheactivityofALDHinliverandstomachtissue结果如表3.10所示：与模型组比较，蜂蜜各浓度组肝组织ALDH活性显著升高（P<0.05或P<0.01），蜂蜜中、高浓度组肝组织和胃组织ALDH活性极显著升高（P<0.01）。与阳性药物对照组相比，蜂蜜各浓度组大鼠肝ALDH活性降低，但无统计学差异（P>0.05），蜂蜜低浓度组大鼠胃ALDH活性极显著降低（P<0.01），蜂蜜中、高浓度组大鼠胃ALDH活性升高，但无统计学差异（P>0.05）。此结果提示蜂蜜能升高急性酒精中毒大鼠肝组织和胃组织ALDH活性水平,但部分浓度的蜂蜜组升高水平不及阳性药物对照组。3.5讨论正常情况下，胃黏膜可以通过表面的黏液/碳酸氢盐屏障、黏膜屏障、生长因子等避免损伤因子对胃黏膜的侵蚀或促进胃黏膜损伤后的修复。胃黏膜致损伤因素与防御保护因素之间的平衡是保证胃组织完整性的先决条件。当这种平衡被破坏，即致损伤因素强于黏膜保护因素，使细胞的修复增值能力下降时就易造成胃损伤。本文上一章实验结果显示蜂蜜从整体水平和病理水平都显著改善胃黏膜损伤的程度，对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤有很好的保护作用，本部分实验通过检测各组大鼠胃黏膜抗氧化相关因子（SOD活性、MDA含量）、胃黏膜致损伤因子（TNF-α、IL-8、ET-1）含量、胃黏膜保护因子（PGE2、SS、EGF）含量以及肝胃组织中的乙醇关键代谢酶这几个方面来探讨其可能的保护途径，结果分析如下：3.5.1蜂蜜能升高胃组织SOD活性、抑制MDA含量，通过清除氧自由基，减轻脂质过氧化来保护胃黏膜。30 广东药学院硕士毕业论文近年来研究发现：氧自由基是无水乙醇引起急性胃黏膜损伤过程中的一个重要的致病因子，它能引起胃黏膜或黏膜细胞的脂质过氧化，导致局部血流障碍，引发组织损伤[63]。SOD是胃黏膜的保护酶，能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢，它能消除自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，其活性高低间接反映了机体清除氧自由基和抗氧化的能力。MDA是脂质过氧化物的最终代谢产物，脂质过氧化物及其代谢物MDA可以破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀坏死，MDA含量的高低间接反映了机体受氧自由基攻击的程度[64]，本部分实验通过测定胃组织匀浆SOD活性和MDA含量的变化，来分别反映体内抗氧自由基的功能和胃黏膜受自由基攻击的严重程度。本部分实验结果显示，所有实验组中，胃黏膜损伤以模型组大鼠最为严重，炎症浸润和出血程度均最高，MDA在胃组织中的含量显著升高，SOD活性水平显著下降，这些都充分表明在乙醇致大鼠胃黏膜损伤的病理过程中，有氧自由基和脂质过氧化物的参与，与LEE[65]所报道的乙醇致胃黏膜损伤的病理机制相符。而蜂蜜能提高胃组织SOD的活性水平，降低大鼠胃黏膜中脂质过氧化物产物MDA的含量，通过抗氧化作用保护胃黏膜，此结果与枣花蜜[18]保护乙醇诱导的胃黏膜损伤一致，这与蜂蜜本身具有消除自由基、抑制活性氧自由基活性、抗氧化应激等作用密不可分[66]。3.5.2蜂蜜能显著降低模型组大鼠胃黏膜TNF-α、IL-8、ET-1含量，改善胃黏膜微循环，减轻胃黏膜的炎性损伤。乙醇对胃黏膜的的损伤，主要是由于炎症引发而迅速形成的，炎症反应在胃黏膜损伤机制中有重要作用[67]。TNF-α和IL-8是致胃黏膜损伤的炎性介质，常被作为重要的炎性反应指标来判断胃黏膜的炎症程度，在临床上常用测定IL-8和TNF-α这2种常见的炎性细胞因子水平来判定胃炎的程度。TNF因其能诱导肿瘤出血和坏死而得名，TNF-α是TNF中的一种，主要由单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等产生。TNF-α除了具有杀伤肿瘤细胞的功能，还是重要的促炎症因子，主要由巨噬细胞和单核细胞产生，能聚集中性粒细胞，促进中性粒细胞和巨噬细胞的增生、成熟、活化，并促进其黏附、游走和脱颗粒，进而刺激血管内皮细胞、单核细胞等产生炎性细胞因子(如IL-8)，如同炎性放大器一样产生级联反应，最终导致组织的炎症损伤[68]。TNF-α是致炎的最强的介质之一,还能刺激其他炎性因子释放,对其他炎性细胞因子的作用起增强作用[69]。IL-8是一种致炎因子，也是炎症趋化因子，可使嗜碱粒细胞、T细胞、中性粒细31 广东药学院硕士毕业论文胞向局部炎症位置聚集并发生脱颗粒，加重炎症反应。IL-8与胃炎关系密切，在乙醇致胃黏膜损伤的过程中作为炎性介质参与其中。杨牧祥等[70]通过小鼠动物实验观察到，在胃黏膜明显损伤的模型组中，IL-8含量较正常组极显著升高，提示IL-8可能参与了胃黏膜急性损伤的过程。本试验结果显示模型组大鼠胃组织TNF-α和IL-8含量明显增加，说明TNF-α、IL-8作为炎性介质与胃黏膜的损伤密切相关。而蜂蜜能够显著降低胃组织中TNF-α和IL-8的含量,提示蜂蜜可以通过减少TNF-α和IL-8等炎症介质的产生而保护胃黏膜。ET-1是调节血管内皮舒缩平衡、局部器官血流的重要因子，主要来源于血管内皮，是由21个氨基酸残基组成的内源性血管活性因子，是已知的最强的缩血管物质之一。它不仅在血管内皮分泌，在胃肠黏膜上皮细胞也有分泌，其与急性酒精性胃黏膜损伤密切相关，主要通过降低胃黏膜血流量而导致胃黏膜缺血坏死损伤[71]。已有动物实验表明[72]，将外源性ET从大鼠胃左动脉灌注可引起局部微血管收缩，黏膜内ET-1含量增加，胃黏膜局部血流量减少，胃组织局部缺血缺氧而致胃急性损伤。李春艳等[73]用60%酒精灌胃大鼠制备急性胃黏膜损伤模型，实验结果表明，在急性酒精性胃黏膜损伤过程中，ET-1含量与氧自由基生成的增加是造成胃黏膜有损伤的相关因素。高浓度乙醇引起黏膜血流量明显降低，胃黏膜血流量越低，黏膜损伤程度就越高。本部分实验结果显示模型组大鼠胃组织ET-1含量较正常组明显增加，说明ET-1可能参与诱导了乙醇对胃黏膜的损伤，与EIJIMASUDA[58]的实验结果一致。而蜂蜜各浓度组大鼠胃组织ET-1含量较模型组均极显著降低，说明蜂蜜能通过降低胃黏膜ET-1含量，改善胃黏膜局部微循环障碍，从而保护胃黏膜。综上所述，TNF-α、IL-8、ET-1与乙醇致胃黏膜损伤密切相关，蜂蜜能显著降低模型组大鼠胃黏膜TNF-α、IL-8、ET-1含量，通过降低胃黏膜炎性介质、减轻胃黏膜的炎性损伤、改善胃黏膜局部缺血而保护胃黏膜。3.5.3蜂蜜能显著增加模型组大鼠胃组织PGE2、SS含量，增强胃黏膜的防御和修复功能以保护胃黏膜。胃黏膜的保护是修复和抗损伤的共同作用，内源性保护因子PGE2、SS、EGF等多种物质参与其中。PGE2是胃黏膜的主要保护因子之一，是前列腺素的其中一种，对保护和修复损伤的胃黏膜有重要作用[74]，主要通过促进胃黏液生成、抑制胃酸分泌[75]、减轻炎症反32 广东药学院硕士毕业论文应、改善胃黏膜血液循环、刺激胃黏膜保护性生长因子的生成[76]这几个方面来增强胃黏膜防护能力。实验结果显示，模型组大鼠胃组织PGE2含量较正常组极显著下降（P<0.01），说明乙醇导致大鼠胃组织中PGE2含量下降，胃黏膜保护屏障被破坏，此结果与孙晓艳等的研究[77]不谋而合。生长抑素SS，全称生长激素释放抑制激素，是一种调节性抑制肽，对生物体内活性物质有抑制作用，在胰、脑、神经细胞和胃黏膜内都有分布。SS在胃内的合成和分泌主要由胃体和胃底的D细胞来完成的，在胃黏膜内通过抑制胃酸分泌、抑制胃蛋白酶、胃动素、胃泌素等胃肠激素的释放而保护修复胃黏膜，促进胃损伤的愈合[78-80]。同时，SS还参与胃黏膜的局部防御机制，增加细胞内还原型谷胱甘肽含量，提高胃黏膜清除氧自由基及脂质过氧化物的能力，减轻胃黏膜损伤[81]。近年来，SS及其类似物在临床广泛应用，不仅可以用于内分泌肿瘤的治疗，而且对胃肠道肿瘤及胃肠出血等疾病都有较好的治疗效果，是胃肠黏膜屏障和胃黏膜细胞重要的保护性因素[79]。实验结果显示模型组大鼠胃组织SS含量较正常组极显著下降（P<0.01），说明急性酒精性胃黏膜的损伤可导致大鼠胃组织中SS含量下降，此结果与李世芬等[82]的研究结果不谋而合。表皮生长因子（EGF）：EGF是由53个氨基组成的活性物质，广泛存在于消化道的细胞分裂刺激物，主要由颌下腺分泌，能促进上皮组织的增殖分化，以新生的细胞代替衰老或坏死的细胞，能加速黏膜愈合，对多种刺激引起的胃、十二指肠黏膜损伤具有保护和修复作用，对维持胃黏膜的完整性起着重要的作用，能通过抑制胃酸分泌、促进胃黏膜细胞的增值、增强胃黏膜血流、增强胃黏液分泌等途径保护胃黏膜[83]。研究称[84]外源性EGF参于早期黏膜的修复，研究者分别检测患者胃溃疡发病期与溃疡愈合后胃液EGF含量水平，结果显示胃溃疡患者胃液EGF含量明显低于正常人，而在患者溃疡愈合后，胃液EGF含量较愈合前明显增高，这说明EGF与胃溃疡的病理生理过程密切相关，有促进溃疡愈合的作用[85]。本实验中，各组大鼠胃组织EGF含量无统计学差异，提示蜂蜜保护胃黏膜的途径与升高EGF水平无密切关系。此部分结果显示蜂蜜能显著增加模型组大鼠胃组织PGE2、SS含量，增强胃黏膜的防御和修复功能以保护胃黏膜，其保护机制与胃组织中的EGF含量无密切关联。33 广东药学院硕士毕业论文3.5.4蜂蜜能通过提高肝、胃组织中的ADH和ALDH活性水平降低血清乙醇浓度，保护胃黏膜。通过加快乙醇代谢、减缓乙醇吸收、降低机体中乙醇及其代谢产物乙醛的含量，减轻毒性产物对各组织器官的损伤是解酒药物发挥作用的核心。ADH和ALDH是酒精代谢的关键酶，其活性直接影响血液中乙醇及代谢物乙醛的含量。乙醛具有细胞毒性，乙醇及其代谢物乙醛与胃损伤密切相关。本文的实验结果表明：蜂蜜可以通过提高肝组织和胃组织中ADH和ALDH活性从而使急性酒精中毒大鼠血清乙醇浓度降低，其具有较好的解酒功能。同时，胃组织中ALDH活性升高，相应的乙醛在胃组织中的量减少。胃组织中乙醇和乙醛浓度降低，胃损伤减轻，蜂蜜通过解酒作用、加速酒精代谢、减少乙醇及其代谢产物的浓度来保护胃黏膜。蜂蜜成分复杂，营养丰富，众多研究发现，蜂蜜中的糖类、黄酮类和酚酸类化学物质是其主要起作用的生物活性成分[86]。目前已知我国传统解酒草药葛根和葛花中的主要解酒有效成分为黄酮类物质[87]，但尚不知道蜂蜜中的何种有效生物活性成分导致这种解酒作用。因此，蜂蜜中的有效解酒成分需要进一步研究。34 广东药学院硕士毕业论文第四章蜂蜜对急性酒精中毒大鼠血清ALT、AST活性水平及肝脏病理形态学的影响4.1前言酒精性肝病是肝脏的常见疾病，威胁着世界各地人们健康问题。在我国，近些年人们生活节奏加快，生活压力增大，饮酒人数剧增，调查显示酒精性肝损伤已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[88]。在美国及欧洲的西北部，酒精性肝病造成约5%~6%的死亡率[89]。因此，预防及治疗酒精中毒引起的肝损伤有重要的现实意义。在评价肝损伤的指标中，肝功能及肝脏病理形态学变化是最常规的检测手段。ALT，即谷丙转氨酶，主要存在于肝细胞浆内，是目前最常用、最敏感的肝功能指标，肝细胞受损的程度与ALT升高的程度相一致[90]。AST，即谷草转氨酶，肝脏发生严重坏死时，细胞膜的通透性增加，AST释放入血，血清AST水平升高。因此，检测血清ALT、AST活性水平以及观察肝脏病理形态学变化是评价肝损伤程度的最直接方法。在本部分试验中，采用75%乙醇10ml/kg一次性灌胃大鼠，3小时后取血及肝组织，测定各组大鼠血清ALT、AST以及肝组织病理学变化，观察此条件下的急性酒精中毒大鼠肝损伤情况。4.2实验材料4.2.1蜂蜜的配制及阳性药物4.2.1.1蜂蜜冠生园纯净蜜：批号：170508M1，上海冠生园食品有限公司生产，主要配料为油菜蜂蜜、荆条蜂蜜、洋槐蜂蜜。购买的蜂蜜浓度视为100%，分别用双蒸水按照一定比例稀释成高（20%）、中（10%）、低（5%）浓度组备用。4.2.1.2阳性药物鼎久解酒口服液：批号：20130120，北京维卫康科技有限公司生产；功能：解酒护胃护肝；主要成分：葛根、白及、枳实、三七、甘草、白芍；标志性成分及含量：35 广东药学院硕士毕业论文每100ml含总皂苷65mg、总黄酮15mg；使用剂量：每日2次，每次1瓶（60ml）。根据人与动物药物剂量换算公式以及中药有效成分含量算得大鼠灌服鼎久解酒口服液的剂量为12.5ml/kg。4.2.2实验动物同上一章4.2.3主要试剂食用级无水乙醇、0.9%生理盐水广州文睿科学仪器有限公司；纯净百花蜜上海冠生园食品有限公司，批号170508M1；鼎久解酒口服液北京维卫康科技有限公司，批号20130120。4.2.4主要仪器设备名称型号产地高速冷冻离心机5810R德国Eppendorf显微镜及照相系统CKX41SF日本Olympus公司超纯水纯化系统PROG00002美国Millipore制冰机LQP-B-4上海安亭高压灭菌锅LaboAutoclave日本SANYO4.3实验方法4.3.1动物分组同上一章4.3.2动物模型构建及给药同上一章4.3.3动物取材及标本处理各处理组大鼠给药2.5h后，用1%戊巴比妥钠按3.5ml/kg剂量腹腔注射将大鼠麻醉，然后切开腹腔，进行腹主动脉取血，立即剖取肝脏，将肝脏包膜去除，放在装有预冷生理盐水的烧杯中反复漂洗干净，用干净的滤纸吸干，分别取各组大鼠肝左叶放入10%的甲醛溶液固定，固定24小时后送至广东药学院基础学院病理科制作病理切片。收集的全血静置1h后，以转速2500r/min低温离心15min，取上清液，存放于-20℃冰箱保存，留作血清ALT、AST活性检测。36 广东药学院硕士毕业论文4.3.4检测指标及方法将收集好的各组大鼠血清及时送由广东省中医院二沙岛分院检验科检测ALT、AST活性；将制作好的病理片经病理科教研室老师的指导，在光镜下观察各组大鼠肝脏组织病理学变化并拍照。4.3.5统计学分析同上一章4.4实验结果4.4.1各组大鼠血清ALT、AST的活性水平表4.1各组大鼠血清ALT、AST活性(X±S，n=6)Table.4.1TheactivityofALT、ASTinbloodserum(X±S，n=6)组别数量ALT活性（U/L）AST活性（U/L）正常组637.83±6.40102.16±26.34模型组648.16±7.27138.50±13.17阳性药物对照组638.83±8.56118.33±17.40蜂蜜低浓度组641.33±3.66119.50±29.76蜂蜜中浓度组639.83±12.32106.16±42.76蜂蜜高浓度组643.33±6.40122.33±16.69注释：与模型组相比：P>0.05；与阳性药物对照组相比：P>0.05Note：Comparedwithmodelgroup,P>0.05;ComparedwithpositivedrugControlgroup,P>0.05.图4.1大鼠血清ALT、AST活性Fig.4.1TheactivityofALT/ASTinblood如上表4.1显示，模型组大鼠血清ALT、AST活性较正常组升高，但无显著性差37 广东药学院硕士毕业论文异（P>0.05）。各治疗组大鼠血清ALT、AST活性水平较模型组有所降低，但均无统计学差异（P>0.05）。4.4.2各组大鼠肝组织病理形态学结果图4.2各组大鼠肝组织病理形态学A：正常组HE×100，a:正常组：HE×200；B：模型组HE×100，b:模型组：HE×200；C：阳性药物HE×100，c:阳性药物组：HE×200；D：蜂蜜低浓度组HE×100，d:蜂蜜低浓度组：HE×200；E：蜂蜜中浓度组HE×100，a:蜂蜜中浓度组：HE×200；e：蜂蜜高浓度组HE×100，a:蜂蜜高浓度组组：HE×200；Fig.4.2LiverhistopathologyofratsamonggroupsA：NormalgroupHE×100，a:NormalgroupHE×200；B：ModelgroupHE×100，b:Modelgroup：HE×200；C：ControlgroupHE×100，c:ControlgroupHE×200；D：Low-concentrationhoneygroupHE×100，d:Low-concentrationhoneygroupHE×200；E：moderate-concentrationhoneygroupHE×100，e:moderate-concentrationhoneygroupHE×200；F：High-concentrationhoneygroupHE×100，f:High-concentrationhoneygroupHE×200；如图4.2所示：正常组大鼠肝小叶结构完整，布局清晰，肝细胞核大而圆，以中央静脉为中心放射性向四周排列，未见充血及炎性细胞浸润等异常影像。模型组肝小叶结构尚清晰，肝细胞广泛轻度变性水肿，胞浆疏松淡染，肝窦受压变窄，肝细胞轻微坏死，未见炎细胞浸润。阳性药物对照组肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，以中38 广东药学院硕士毕业论文央静脉放射性向四周排列，未见明显异常病变。蜂蜜低浓度组肝小叶结构尚清晰，肝细胞广泛轻度变性水肿，胞浆疏松淡染，肝窦受压变窄，肝细胞坏死轻微，未见炎细胞浸润。蜂蜜中浓度组肝小叶结构清晰，肝细胞胞浆染色淡，轻度变性水肿，未见坏死，未见炎细胞浸润。蜂蜜高浓度大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞胞浆丰富红染，排列整齐，以中央静脉为中心放射性向四周排列，未见明显病变。4.5讨论ALT、AST是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，肝细胞因为炎症等因素受损伤，细胞肿胀坏死，增加细胞膜的通透性，直接导致ALT、AST释放进入血液，因此肝细胞损伤的程度可通过检测大鼠血清ALT、AST活性来反映，ALT、AST活性升高为肝细胞受损的敏感性指标，具有特异性。此外，肝脏组织病理学检查也是直观表现肝损伤的一个重要指标。因此，常通过测定血清ALT、AST及观察肝脏病理学改变等指标来评价肝损伤程度。本部分实验从血清学水平发现与正常组大鼠相比较，模型组大鼠血清ALT、AST活性升高，但无显著差异；从病理形态学观察，模型组大鼠肝脏肝小叶结构尚清晰，肝细胞广泛轻度变性水肿，胞浆疏松淡染，肝窦受压变窄，肝细胞坏死轻微，未见炎细胞浸润，损伤较轻，这都说明75%乙醇10ml/kg灌胃大鼠3h后肝脏并没有造成明显的肝脏急性损伤。而各治疗组大鼠血清ALT、AST活性水平较模型组有所降低，但均无统计学差异（P>0.05），各治疗组肝脏病理所体现的变性、水肿、坏死较模型组程度轻，蜂蜜高浓度组大鼠肝脏病理结果近似正常，这提示蜂蜜对肝脏有潜在的保护作用。急性酒精性肝损伤一般是由于一次性摄入大量高浓度乙醇导致的[91]。有关急性酒精性肝损伤的动物模型，大多采用一日多次或多日多次灌胃乙醇的方法建立，而一次性灌胃致急性肝损伤的大鼠模型也能建立成功，赵敏等[92]用50%乙醇12ml/kg一次性灌胃大鼠后，结果发现大鼠灌酒后16h后模型组大鼠血清中甘油三酯含量显著升高，病理结果显示肝组织脂肪变性程度明显加重。丁宁等[93]用浓度为47.5%的酒精15g/kg一次性灌胃大鼠，48小时后建立了急性酒精性肝损伤模型。在本实验中一次性灌胃10ml/kg的75%乙醇后仅3小时取材，从肝功能及肝脏病理这两方面观察均未见严重的损伤，可能由于时间太短的原因，尚没有造成严重的急性肝损伤，无法作为模型参照对象研究蜂蜜保肝功能。39 广东药学院硕士毕业论文乙醇的主要代谢器官是肝脏，乙醇及其代谢物乙醛主要在肝脏中富集，具有肝细胞毒性，导致肝细胞膜脂质过氧化反应，炎性细胞因子及炎性介质等因素可共同导致肝细胞损伤，表现为肝细胞空泡变性，是导致醉酒不适以及肝损伤的主要物质[94]。蜂蜜本身具有良好的抗氧化作用，研究显示蜂蜜通过抗氧化的作用保护肝脏，而在本文上一章提到，蜂蜜能提高肝脏中的ALDH活性，ALDH的活性升高直接导致乙醛在肝脏中的量减少，由此，乙醇导致的肝损伤程度相应的减低，这些都说明蜂蜜具有潜在的护肝功效。因此，蜂蜜可以作为研发解酒护肝产品的原材料进一步研究。40 广东药学院硕士毕业论文第五章全文总结及研究展望5.1全文总结本论文以伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型为研究对象，探讨蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨，主要结论如下：1.成功建立了伴有胃黏膜损伤的急性酒精中毒大鼠模型，通过动物实验证明，蜂蜜能显著减轻急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤程度，具有较好的保护胃黏膜的作用。2.蜂蜜保护急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的机制主要有以下几个方面：1）提高胃黏膜SOD活性、降低胃黏膜MDA含量，通过调节和改善自由基代谢、抑制脂质过氧化反应的途径减轻急性酒精性胃黏膜的损伤。2）蜂蜜能降低胃黏膜致损伤因子ET-1、IL-8、TNF-α的含量，通过改善胃黏膜的局部缺血、减少炎性介质、减轻炎性反应的途径保护胃黏膜。3）蜂蜜能提高胃黏膜防御和修复因子PGE2、SS的含量，通过加强胃黏膜的屏障和修复功能保护胃黏膜；蜂蜜保护急性酒精性胃黏膜途径与EGF无密切关联。4）蜂蜜可以通过提高肝组织和胃组织中ADH和ALDH活性从而降低急性酒精中毒大鼠血清乙醇浓度，通过解酒作用保护胃黏膜。3.75%乙醇10ml/kg一次性灌胃大鼠3h尚不能造成明显的肝急性损伤，但蜂蜜对急性酒精中毒大鼠肝脏有潜在的保护作用。5.2研究展望饮酒是我国源远流长的传统饮食文化，据流行病学调查统计，我国酒精性相关疾病的发病率呈现逐年上升趋势，研发解酒护胃产品应用前景广阔。目前，我国市场上的解酒产品多以中草药为主要原料，护胃产品主要以奥美拉唑、硫糖铝、雷尼替丁等西药为主，口感差、长期使用产生或多或少的毒副作用等大大影响了其市场推广，鉴于这种情况，食品来源的解酒护胃产品具有良好的市场前景。蜂蜜以其良好的口感和多样化的药理作用被广泛研究和应用，目前，蜂蜜应用于治疗创伤、胃炎、胃溃疡、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病都已成为研究热点。蜂蜜作为一种日常生活中缓解急性酒精中毒、保护急性酒精性胃黏膜损伤的天然食品有重要的现实意义，这为解酒护胃产品的开发提供新思路的同时，也为开发蜂蜜为主要原料的保健品有所启发。41 广东药学院硕士毕业论文本论文实验结果提示蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤有较好的保护作用，解酒作用尚可，但蜂蜜确切的功效成分以及作用机制尚未完全明确，还有待进一步深入研究。1.蜂蜜有单花蜜与混合花蜜之分，单花蜜是指蜜蜂采集单一开花植物的花蜜酿制而成的。混合花蜜是蜜蜂采集数多种开花植物的花蜜酿制而成的，也称百花蜜。在本实验中，蜂蜜原料是百花蜜，属于复合成分，主要是由油菜蜂蜜、荆条蜂蜜、洋槐蜂蜜这三种单花蜜混合而成的。问题是油菜蜂蜜、荆条蜂蜜、洋槐蜂蜜这三种单花蜜是否都具有解酒护胃的功效呢？蜂蜜中的何种成分具有解酒作用及保护胃黏膜的作用呢？这些问题都有待进一步实验证明。2.在文中第四章实验结果提示蜂蜜对急性酒精中毒大鼠的肝脏有潜在的保护作用，因此为了明确蜂蜜是否对急性酒精性肝脏具有保护作用，下一步需要构建急性酒精性肝损伤动物模型进行观察探讨。3.利用实时荧光定量PCR（Real-timequantitativePCR,RT-PCR）技术检测急性酒精性胃损伤大鼠胃组织EGF、SS、TNF-α等基因表达情况，进一步具体深入的探讨蜂蜜保护胃黏膜的分子作用机制。42 广东药学院硕士毕业论文参考文献[1]温丽民.急性酒精中毒急诊应用醒脑静辅助治疗的临床研究[J].中国现代药物应用,2015,9(01):135-136.[2]何绍珍.乙醇性胃黏膜损伤中氧自由基与线粒体DNAATPase6,8基因表达关系的研究[D].福建医科大学,2007.[3]TestinoG.Alcoholicdiseasesinhepato-gastroenterology:apointofview[J].Hepatogastroenterology,2008,55(82-83):371-377.[4]Hiruma-LimaCA,BatistaCA,deAlmeidaAB,etal.AntiulcerogenicactionofethanolicextractoftheresinfromVirolasurinamensisWarb.(Myristicaceae)[J].JEthnopharmacol,2009,122(2):406-409.[5]Viuda-MartosM,Ruiz-NavajasY,Fernández-LópezJ,etal.Functionalpropertiesofhoney,propolis,androyaljelly[J].JFoodSci,2008,73(9):R117-124.[6]赵立夫,徐云友,董蕊,等.单花蜜的化学成分研究进展[J].食品科学,2013,34(07):330-334.[7]RakhaMK,ZINabil,AAHussein,etal.Cardioactiveandvasoactiveeffectsofnaturalwildhoneyagainstcardiacmalperformanceinducedbyhyperadrenergicactivity[J].JMedFood,2008,11(1):91-98.[8]Al-WailiNS.Effectsofdailyconsumptionofhoneysolutiononhematologicalindicesandbloodlevelsofmineralsandenzymesinnormalindividuals[J].JMedFood,2003,6(2):135-140.[9]Abdul-GhaniAS,DabdoubN,MuhammadR,etal.EffectofPalestinianhoneyonspermatogenesisinrats[J].JMedFood,2008,11(4):799-802.[10]LeeSL,ChauGY,YaoCT,etal.Functionalassessmentofhumanalcoholdehydrogenasefamilyinethanolmetabolism:significanceoffirst-passmetabolism[J].AlcoholClinExpRes,2006,30(7):1132-1142.[11]冯志鹏,赵言顺,王静,等.ADH活性对绞窄性肠梗阻大鼠早期肠缺血预测作用[J].青岛大学医学院学报,2014,50(05):421-423+426.43 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广东药学院硕士毕业论文附录2攻读学位期间科研情况及所受奖励发表的科研论文[1]梁璐璐，王影姣，金小宝*.蜂蜜对急性酒精中毒大鼠的解酒作用研究[J].中国食物与营养,2015,21(2):73-76.[2]Xiao-baoJin,Ying-jiaoWang,Lu-luLiang.CecropinsuppresseshumanhepatocellularcarcinomaBEL-7402cellgrowthandsurvivalinvivowithoutside-toxicity.AsianPacJCancerPrev.2014,15(13):p.5433-6.课题参与情况[1]家蝇抗菌肽cecropin抗人肝癌BEL-7402的作用机制（国家自然科学基金项目，编号：31340039，经费15万）。[2]在导师指导下设计了自选课题：蜂蜜对急性酒精中毒大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制的初步研究。52 广东药学院硕士毕业论文致谢光阴似箭，岁月如梭，我三年的硕士研究生时光即将画下句点。回首三年的学习和生活，我得到了许多人的帮助和关心，在此聊表数笔以表达我最深切的敬意和谢意。首先向我的导师金小宝教授表示崇高的敬意！正是在导师悉心的关怀与指导下，我能顺利地开展学位课题的研究，并顺利完成毕业论文。作为长者，导师在生活上也给予我无微不至的照顾，其谆谆教诲，终生难忘。严谨的科研作风、坚持不懈的精神、积极乐观的态度，都是导师惠赠给我的宝贵精神财富。衷心感谢校长朱家勇教授三年来在生活上和学习上给予的关怀和帮助！感谢病理教研室的周晓明老师对我的悉心指导。感谢我们实验室的王伟章、卢雪梅、李小波、沈娟、褚夫江、刘涛、毛建文、尹辉、吴立蓉、马艳、梅寒芳、刘文彬等老师在日常生活和学习上给予的帮助和关心。感谢广东药学院研究生院全体老师的关心与帮助。感谢广东药学院基础学院各位领导在生活、学习方面给予我很多的指导和无私帮助。三年里，我与我的同学鲍冬梅、吴慧、杨梅以及倪倩结成了深厚的友谊，在此衷心地向她们表示祝福！感谢实验室的师姐许银叶、黄演婷、蒲俏虹、吴玉萍、汪洁，师兄吴舜彬，师妹王影姣、陈至里、方霞、王玉娇、冯盼盼、曾文婷，师弟吴清清、胡文龙、周录泳等在实验过程中的无私帮助和大力协作，我的每一次进步都离不开你们的支持。感谢广东药学院2012级全体研究生同学。三年来，你们在生活、学习上都给予了我许多无私的帮助！感谢我的家人以及所有关心我的朋友，正是你们给予的支持与鼓励才使我坚持完成了三年的研究生学习，是你们给了我面对困难与挫折的勇气！梁璐璐2015年5月53