蜜炙黄芪化学成分分析及作用于脾气虚大鼠的药效学评价 64页

广东药学院硕士研究生学位论文题目：蜜炙黄芪化学成分分析及作用于脾气虚大鼠的药效学评价姓名：肖满珊学号：2111248045院系：中药学院专业：中药学导师姓名：陈宏远二○一五年五月 分类号：___________密级:__________UDC:___________蜜炙黄芪化学成分分析及作用于脾气虚大鼠的药效学评价Chemicalcompositionanalysisofhoney-processedAstragalusanditseffectsonspleenqideficiencyrats姓名：肖满珊学号：2111248045院系：中药学院专业：中药学研究方向：中药活性成分研究与新药研发导师姓名：陈宏远论文提交日期：2015年3月13日论文答辩日期：2015年5月18日学位授予单位：广东药学院二○一五年五月 广东药学院学位论文原创性声明本人郑重声明厂本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的导下进行研究工作所取得的成果。除文中己特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构己经发表或撰写过的研究成果。对本研究做出贡献的其它个人和集体，均己在文中明确翻和致谢。本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。学位论文作者签名：玲為价日期：％《年1月<日学位论文使用授权的声明本人完全了解广东药学院有关保留和使用学位论文的规定，学有权保留和向有关部门或机构送交本论文的乂11千和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以米用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编:保密论文在解密后适用本声明。本学位论文。论文作者签名：论文导_签名：^H軋丨n?日 广东药学院硕士研究生学位论文目录中文摘要.........................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................................II引言................................................................................................................................1第一章文献综述..........................................................................................................31.1黄芪化学成分研究进展...................................................................................31.2黄芪药理作用研究进展...................................................................................41.2.1对免疫系统的影响.................................................................................41.2.2对心脏系统的影响.................................................................................51.2.3对缺血性脑损伤的保护作用.................................................................61.2.4对血管和血液系统的作用.....................................................................61.3本研究的目的意义...........................................................................................6第二章蜜炙黄芪UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱的建立及蜜炙前后化学成分的分析........................................................................................................................................82.1引言...................................................................................................................82.2实验材料...........................................................................................................92.2.1实验药品及试剂.....................................................................................92.2.2仪器和设备.............................................................................................92.3实验方法...........................................................................................................92.3.1溶液的配制与样品的制备.....................................................................92.3.2UPLC/Q-TOFMS分析........................................................................102.3.3数据预处理及模式识别分析..............................................................122.4实验结果.........................................................................................................122.4.1精密度、重复性和稳定性实验结果...................................................122.4.2UPLC/Q-TOFMS分析获得的总离子流图........................................132.4.3黄芪及蜜炙黄芪水提物的质谱鉴定结果...........................................152.4.4黄芪和蜜炙黄芪水提物中化学成分的半定量分析...........................202.4.5黄芪蜜炙前后化学成分的多元统计分析...........................................212.5结果讨论.........................................................................................................24 广东药学院硕士研究生学位论文2.5.1色谱条件的优化...................................................................................242.5.2质谱参数的选择...................................................................................242.5.3色谱柱的选择.......................................................................................242.5.4黄酮类的鉴定.......................................................................................252.5.5皂苷类的鉴定.......................................................................................262.5.6蜜炙后化学成分变化的分析...............................................................272.6本章小结.........................................................................................................28第三章黄芪及蜜炙黄芪水提物对脾气虚大鼠的干预作用....................................293.1引言................................................................................................................293.2实验材料........................................................................................................303.2.1实验药品及试剂..................................................................................303.2.2仪器和设备..........................................................................................303.2.3实验动物..............................................................................................303.2.4试剂的配制..........................................................................................313.3实验方法........................................................................................................313.3.1脾气虚大鼠模型的建立......................................................................313.3.2黄芪及蜜炙黄芪水提物对脾气虚大鼠的干预..................................323.3.3观测指标及检测方法...........................................................................323.3.4统计学方法..........................................................................................333.4实验结果.........................................................................................................333.4.1给药剂量的确定...................................................................................333.4.2造模实验结果及分析...........................................................................333.4.3药物干预实验结果及分析...................................................................363.5结果讨论.........................................................................................................403.5.1脾气虚模型建模方法的选择...............................................................403.5.2脾气虚模型的评价...............................................................................403.5.3蜜炙黄芪对脾气虚证的药效学评价...................................................403.6本章小结.........................................................................................................42第四章结论、创新点与展望....................................................................................43 广东药学院硕士研究生学位论文4.1结论.................................................................................................................434.3展望.................................................................................................................44参考文献......................................................................................................................45攻读硕士期间发表的论文..........................................................................................54致谢..............................................................................................................................55 广东药学院硕士研究生学位论文中文摘要黄芪是我国传统中医药常用滋补中药材，其蜜炙品较生品的补中益气作用显著提高，临床常用蜜炙黄芪替代黄芪生品以提高其补气疗效。但蜜炙黄芪有效化学成分及对应的药效学关系尚不明确。本研究旨在考察黄芪蜜炙前后的化学成分的变化，并对其水提物作用于脾气虚大鼠模型的药效学作用进行分析与评价。实验运用UPLC/Q-TOFMS技术对黄芪蜜炙前后的化学成分进行分析与鉴定；采用多元统计方法，包括PCA、PLS-DA对蜜炙前后化学成分进行模式识别分析，通过VIP值筛选出具有蜜炙前后差异性的化学成分；采用疲劳加限制饮食的方法建立中医脾气虚大鼠模型，考察黄芪蜜炙品和生品水提物对该大鼠模型白细胞数、淋巴细胞数和相关细胞因子等生理生化指标的影响。蜜炙黄芪的UPLC/Q-TOFMS分析共鉴定出35个化合物，包括黄酮类17个，皂苷类13个；多元统计分析筛选出9个蜜炙前后差异性化学成分，其中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6’’-O-丙二酰酯含量显著减少，而毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量有所提高；建立的脾气虚模型大鼠的体重、血清D-木糖吸收量、白细胞数和淋巴细胞数显著减少。黄芪蜜炙品、生品水提物干预后模型组大鼠的体重、白细胞数和淋巴细胞数得以恢复，且蜜炙品效果优于生品；黄芪生品、蜜炙品水提物能使模型组大鼠的IL-1、IL-2、IL-6、和TNF-α降低，而IL-4、IL-10显著升高。黄芪蜜炙后主要是化学成分的含量发生了变化，总皂苷类的含量有所升高，提示黄芪蜜炙有利于其皂苷类成分的溶出，加热过程可能造成某些基团的丢失而产生一些化合物含量的变化。筛选得到的9个蜜炙前后差异性化学成分，可能是蜜炙黄芪补中益气作用的药效物质基础。黄芪蜜炙品较生品能更好地改善脾气虚大鼠的相关生理生化及免疫学指标，推测蜜炙黄芪发挥药效作用与其调节脾气虚大鼠的相关细胞因子的表达及提高免疫力相关。关键词：蜜炙黄芪，UPLC/Q-TOFMS，药效作用，脾气虚I 广东药学院硕士研究生学位论文Chemicalcompositionanalysisofhoney-processedAstragalusanditseffectsonspleenqideficiencyratsAuthor:ManshanXiao（traditionalChinesepharmacology）Supervisor:HongyuanChenWenRuiAbstractAstragalusmembranaceusisacommonlyusedtonicchineseherbalmedicineintraditionalchinesemedicine.Theeffectsofinvigoratingspleen-stomachandreplenishingqiofhoney-processedAstragalusweresignificantlyimproved.Honey-processedAstragalusisemployedinsteadofRadixAstragalitoachieveimprovedefficacyintonifyingqiinclinical.However,theactivechemicalcomponentsandcorrespondingpharmacodynamicrelationshipofhoney-processedAstragaluswasundefined.ThisstudyaimedtoinvestigatethechangesinthechemicalcompositionsofRadixAstragaliandhoney-processedAstragalus,andevaluatethepharmacodynamicseffectsofaqueousextractsofRadixAstragaliandhoney-processedAstragalusonratswithspleenqideficiency.UPLC/Q-TOFMStechnologywasperformedtothechemicalcompositionanalysis.Multivariatestatisticalanalysisincludingprincipalcomponentsanalysis(PCA),partialleast-squaresdiscriminantanalysis(PLS-DA)wereexertedtoexplorethechemicalprofileanddiscoverdifferentiatingchemicalmarkersbetweenrawandhoney-processedRadixAstragalibasedontheUPLC/Q-TOF-MSdata.SpleenqideficiencyratmodelwereestablishedbyfatigueandrestricteddietfortheefficacyresearchesofRadixAstragaliandhoney-processedAstragalus.TheeffectsofaqueousextractsofRadixAstragaliandhoney-processedAstragalusonthebodyweight,serumD-xyloseuptake,whitebloodcellcount,lymphocytecountandrelatedcytokinesinratswithspleenqideficiencywereinvestigated.35compoundswereidentifiedbyUPLC/Q-TOFMSanalysis,whichincluded17flavonoidsand13saponins.9chemicalmarkerswereselectedbymultivariatestatisticalanalysisandtheirchangetendencywasalsoobserved.Thecontentofcalycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonatewassignificantlyreducedafterhoneyII 广东药学院硕士研究生学位论文process.Whilethecontentofcalycosin-7-O-β-D-glucosidewasincreased.Thebodyweight,serumD-xyloseuptake,whitebloodcellcount,andlymphocytecountweresignificantlyreducedinmodelgrouprats.AlltheindicatorsinRadixAstragaliandhoney-processedAstragalustreatmentgroupratswereimproved,whichrecoveredtothenormalgroupandtheeffectofhoney-processedAstragalustreatmentgroupwasbetterthanRadixAstragali.RadixAstragaliandhoney-processedAstragalusaqueousextractsdecreaseIL-1,IL-2,IL-6,andTNF-α,whilemakeIL-4,IL-10significantlyincreasedinmodelgrouprats.Thecontentofthechemicalcompositionwaschangedafterhoneyprocessed.Thecontentoftotalsaponinsincreasedinhoney-processedAstragalus,whichsuggestingthathoneyprocessfacilitatedissolutionoftotalsaponins.Honey-processingisaheatingprocedure,whichincreasestheeliminationofsomegroups,andresultinchangesinthecontentofchemicalcomposition.The9chemicalmarkersselectedbymultivariatestatisticalanalysissupposedtobethematerialbasisfortonicefficacyofRadixAstragaliafterhoney-processing.Honey-processedAstragalusregulatephysiologicalandbiochemicalandimmunologicalparametersinspleenqideficiencyrats,itshowsthattherapeuticeffectsofhoney-processedAstragalusarerelatedtoitsregulationoftheexpressionofcytokinesandimmunityenhancementforspleenqideficiencyrats.Keywords:honey-processedAstragalus,UPLC/Q-TOFMS,Pharmacodynamiceffects,spleenqideficiencyIII 广东药学院硕士研究生学位论文引言中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmemeranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。是我国著名的常用滋补中药材，迄今已有2000多年的临床应用历史，疗效显著，在国内外均享有盛誉。黄芪始载于《神农本草经》，被列为上品。黄芪按炮制方法的不同可分为黄芪、炙黄芪等。黄芪的炮制方法历代均有记载，方法种类较多，现在一般都沿用蜜炙法，其他方法几无沿袭，现行《中华人民共和国药典》(2010年版)收载有黄芪饮片、蜜炙黄芪两项。目前国内中医临床普遍使用的多为黄芪及蜜炙黄芪。黄芪和蜜炙黄芪均有补气的功效，其中黄芪生用偏于益卫固表，利尿退肿，托毒生肌；蜜炙黄芪甘温而偏润，长于益气补中，治一切气衰血虚之证[1]。虽然黄芪及其蜜炙品的临床疗效确切，目前对黄芪生品的化学成分和药理作用的研究较为广泛和深入，但对黄芪炮制品的化学成分和药理作用的相关研究相对较少。有研究表明，黄芪蜜炙之后的补气作用要高于生品[2]。两者临床药理作用的差异，炮制后有效成分是否改变、有效成分的含量差异及药理作用的改变到目前还没有系统的阐述。黄芪及其炮制品的功效与其有效成分存在密切关系，因此，研究蜜炙黄芪炮制前后化学成分的变化及其作用于机体后内源性代谢物的变化对于阐明其药效物质基础及作用机制研究具有十分重要的意义。目前对蜜炙黄芪的研究主要从药材炮制前后化学成分性质和含量的变化和炮制前后药效变化两方面入手研究。对于药材炮制前后化学成分性质和含量的变化，利用传统的研究方法包括采用各种色谱分离手段及四大谱可以解析具体的化学成分变化；含量变化方面的研究多采用液相色谱（HPLC）、紫外光谱（UV）等技术对药材的某一类成分或几个指标成分进行简单的定性定量分析。如黄云娟[3]通过紫外比色法测定蜜炙黄芪葡萄糖含量进行炮制过程中加蜜量质量控制方面的研究。杨俊[4]等人应用高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷含量，可作为黄芪药材质量控制的一种手段。随着现代仪器分析技术的发展，尤其是色谱/质谱联用技术，可以实现中药复杂成分的在线分离和鉴定，其高效的分离效率及检测的高灵敏度可应用于药材炮制前后的化学成分变化的分析。炮制前后药效变化，可通过建立合适的中医病理模型和检测相关生化指标，在有效化学成分不清的情1 广东药学院硕士研究生学位论文况下，通过实验药理学的方法来研究炮制前后的药理活性变化。由于黄芪蜜炙品补气作用及增强免疫功能比生品有所增强，因此建立合适的中医病理模型筛选和分析其药效物质基础，并结合药物干预后临床检测指标和免疫药理相关生化指标来阐明其药效机制，将有利于黄芪及其蜜炙品的临床合理应用。本课题采用UPLC/Q-TOFMS对黄芪蜜炙前后的化学成分进行快速全面分析，并对各成分的含量差异情况进行分析。利用多元统计分析对蜜炙前后化学成分进行全谱PCA(主成分分析)模式识别分析，表征黄芪蜜炙前后化学成分的差异。进而采用PLS-DA(偏最小二乘法-判别分析)模式识别分析中的VIP(变量投影重要性)值法筛选出具有差异性的化学成分。为蜜炙黄芪药效物质基础的研究提供线索。根据黄芪“归脾经”理论建立脾气虚动物模型，研究黄芪蜜炙前后水提部分有效成分对脾气虚大鼠模型的药效作用，通过检测免疫相关的生化指标，对蜜炙黄芪炮制前后药效学进行评价。2 广东药学院硕士研究生学位论文第一章文献综述1.1黄芪化学成分研究进展中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmemeranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，性温味甘，归肺、脾经；具有补中益气，升阳，固表，托毒敛疮，利水退肿的功效，用于治疗气虚乏力、中气下陷、食少便溏、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、内热消竭、血虚萎黄、半身不遂、痹痛麻木、痈疽难溃、久溃不敛等症[5]。黄芪历代炮制的方法有蒸制、炒制、蜜炙、盐制、姜汁炙、酒制、麸制、米泔制等，临床以蜜炙品最为常用[6]。中医理论认为黄芪蜜炙可增强其补中益气、升阳的作用，从而用于脾肺气虚、中气下陷之证[7]。植化研究表明黄芪的主要化学成分有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等；黄酮类主要为黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷，皂苷类化合物多为三萜皂苷类[8]。黄芪的多糖成分主要有葡聚糖和杂多糖。黄芪中的杂多糖多为水溶性由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖组成的杂多糖，并含有少量糖醛酸，有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成[9]。马晓丰等[10]从蒙古黄芪的干燥根中分离得到30个黄酮类化合物。目前已从黄芪中分离得到的黄酮类化合物主要有：汉黄芪素、山奈酚、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖苷[10,11]、异鼠李素、鼠李柠檬素及其-3-葡萄糖苷[12]、沙苑子苷[13]、熊竹素、山奈黄素、山奈素-4’-甲醚-3-葡萄糖苷[11]、芦丁、槲皮黄苷、异槲皮素、异槲皮苷、芹黄素、金丝桃苷、刺槐素、檀黄素、染料木苷、柑橘黄素、5,7-二羟基黄酮、异甘草素[14]；异黄酮类有：芒柄花苷及其6"-O-乙酸酯[15,16]、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷[17]、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-malonate（丙二酸酯、乙酸酯）[13]、(3R)2’,3’-二羟基-7,4-二甲氧基异黄酮、2’,4’-二羟基-5,6-二甲氧基二氢异黄酮[18]、3’-羟基-4’-甲氧基异黄酮及其-7-O-β-D-葡萄糖苷[10,11]、8,3’-二羟基-7,4’-二甲氧基异黄酮[11,15]、6,4’-二甲氧基异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7-二羟基-4’-甲氧基-8-异戊烯基异黄酮、芳香膜菊素及其葡萄糖苷、红车轴草素、红车轴草异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7-二羟基-3-甲氧基异黄酮、3’-二羟基-8,4’-二甲氧基异黄酮；紫檀烷类主要有：(6aR,11aR)-10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷[19]、3-羟基-9-甲氧基紫檀烷、3,9,10-三甲氧基紫檀烷[18]、（6aR,11aR）-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫3 广东药学院硕士研究生学位论文檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷[20]、LicoagrosideD[21]、(6aR,11aR)-Vesticarpan[21]，Astrapterocarpanglucoside6""-O-malonate[22-24]。异黄烷类有：2’-羟基-7,3’,4’-三甲氧基异黄烷[18]、7,2’-羟基-3,4’-二甲氧基异黄烷、7-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷[11]、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷[14]、Astraisoflavanglucoside6""-O-malonate[22]。从蒙古黄芪中分离出的皂类苷，大多数都是以环阿尔廷型的四环三萜为苷元，少数以大豆皂苷元(soyasapogenol)B为苷元[13]。皂苷类[21-31]：芪皂苷(astragaloside)Ⅰ~Ⅷ、乙酰黄芪皂苷、异黄芪皂苷(isoastragalosid)I、Ⅱ和IV、大豆皂苷、环黄芪苷E、F、G、agroastragalosideI~Ⅳ。并且随着各种分离提纯技术的发展，还不断有新的化学成分被发现。刘巍[32]等对蜜炙黄芪70%乙醇提取物进行了化学成分的研究，经反复的分离纯化得到了16个化合物，并通过理化性质及红外（IR）、紫外（UV）、质谱（MS）、核磁（NMR）等波谱数据鉴定了这些化合物的结构，分离得到的化合物分别为2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-4-醇-7-O-β-D-葡萄糖苷、芳香膜菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、大豆皂苷Ⅰ甲酯、毛蕊异黄酮、2,-羟基-3’,4,-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷I、黄芪皂苷Ⅱ、β-谷甾醇、β-胡萝卜苷、黄芪皂苷Ⅲ、异黄芪皂苷Ⅱ。1.2黄芪药理作用研究进展现代药理实验对黄芪中的生物活性物质进行了系统的药理实验研究，发现了黄芪及其蜜炙品更加广泛的药理作用，其主要药理作用为提高免疫功能，保护心脑血管，保护肝脏、肾脏和肺脏，保护脑细胞免受氧化应激损伤、提高记忆力，舒张血管平滑肌，激素样作用，抗菌及抗病毒作用，调节血脂、血糖，减少糖尿病并发症等；临床上黄芪广泛用于治疗循环系统、呼吸系统、消化系统、神经系统、内分泌和血液系统疾病；尤其是在心脑血管系统、免疫系统等方面的作用引起了人们的极大的重视。1.2.1对免疫系统的影响黄芪中的黄酮类成分能增强机体非特异性免疫及特异性体液免疫，提高免疫功能低小鼠T细胞总数，促进脾淋巴细胞的增殖[33,34]。黄芪多糖能够增强细胞免疫和非特异性免疫功能，显著提高免疫抑制狗的CD4+、CD8+、T淋巴细胞、4 广东药学院硕士研究生学位论文INF-γ和IL-2的含量[35,36]，增加小鼠腹腔内巨噬细胞的数量，增强其吞噬功能[37]。黄芪皂苷能促进淋巴细胞的增殖和抗体的增加，促进细胞的免疫应答并具有显著的抗炎作用[38,39]。黄芪皂苷甲能促进B细胞增殖，促进浆细胞合成抗体[40]。黄芪水煎剂能够提高大鼠局部移植物的排斥反应[41]。在体内和体外试验中黄芪多糖协同白细胞介素-2可刺激NK细胞增殖，使NK细胞活性增强，这种协同作用明显强于白细胞介素-2单独使用的效果[42,43]。黄芪煎剂可提高白细胞诱生干扰素的能力[44]。黄芪中的一种组分F[45]2具有较强的免疫抑制作用。1.2.2对心脏系统的影响1.2.2.1对心肌的正性肌力作用许多研究表明，黄芪皂苷类对心肌细胞有正性肌力作用[46]，有实验表明，黄芪对离体豚鼠乳头肌标本产生正性肌力作用[47]，其作用机理可能是通过抑制钙调蛋白（CaM）的活性，促进内钙释放，兴奋心肌细胞，增强心肌收缩力[48]。黄芪总皂苷对心肌的作用，呈现一定的剂量依赖关系，低剂量呈现出负性肌力作用，高剂量呈现出正性肌力作用，且不会增加心肌的耗氧量，可改善心功能[49]。现已证明，黄芪发挥正性肌力作用的有效活性成分是黄芪甲苷[50]。1.2.2.2保护缺血缺氧心肌黄芪总黄酮中的成分对大鼠心肌缺血-再灌注引起的损害具有保护作用[51]。大量研究表明[52,53]，黄芪总黄酮能减少大鼠心肌缺血-再灌注模型中缺血心肌中自由基的产生，可以减轻自由基对心肌细胞的氧化性损伤，从而对缺血心肌细胞产生保护作用，而这种保护作用可能与黄酮类物质的抗氧化活性有关。黄芪发挥其正性肌力作用，加强心肌收缩力，增强缺血心肌的血液供应，保护缺血的心肌细胞[54]。对心肌的这种保护作用，与黄芪的浓度有关，但不呈现正相关的关系。黄芪还有稳定细胞膜的作用，通过提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，从而保护心肌细胞免受氧化自由基的损伤[55]。黄芪皂苷对缺血、缺氧的细胞损伤也有一定的保护作用，能明显改善大鼠缺血-再灌注导致的细胞损伤[56]。1.2.2.3对感染病毒心肌的保护作用研究表明，预先用黄芪干预心肌细胞，可降低心肌细胞对柯萨奇病毒感染的敏感性[57]。黄芪可抑制感染细胞中病毒核酸的复制[58]，从而抑制病毒的增殖，保护受感染的细胞。黄芪增强免疫系统的功能，诱生干扰素的作用也能发挥抗病5 广东药学院硕士研究生学位论文毒作用。1.2.3对缺血性脑损伤的保护作用当脑组织发生缺血再灌注时易发生过氧化反应，使得机体过氧化物的含量明显增加，神经元易受到损伤[59]。黄芪清除自由基和抗脂质过氧化的作用在局灶性脑缺血再灌注模型中，能提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，保护脑细胞免受损伤[60]。1.2.4对血管和血液系统的作用黄芪对机体有降压作用，黄芪能扩张外周阻力血管，对冠状动脉血管有直接的扩张作用[61,62]。相关的研究报道，黄芪可通过利尿作用达到降血压的作用。黄芪对血压呈现双向调节的作用[63]，降压作用与其扩张血管的作用有关，而升血压的效果是由于其能增强心肌收缩力，增加每搏输出量。对血压的调节作用与剂量存在一定的关系。双向调节血压动物实验证实，黄芪水煎液能使自发性高血压大鼠的血压得到控制，黄芪可使降至休克水平的动物血压稍上升且保持稳定[64]。黄芪应激小鼠血小板内cAMP含量有提高作用，可抑制血小板聚集而在抗血栓形成方面发挥重要作用[65]。其抗血栓形成的作用，表明黄芪对动脉粥样硬化的预防及治疗有一定的作用。黄芪能保护和促进造血系统，黄芪多糖对人骨髓的生长具有促进作用[66]。癌症治疗中合用黄芪可改善癌症患者化疗药物引起的骨髓抑制现象，提高癌症患者治疗的顺应性。黄芪总黄酮及其两个单体毛蕊异黄酮和2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷对内皮细胞通透性增加有改善作用，这两个单体可通过抑制Fas蛋白表达减轻血管紧张肽Ⅱ(AngⅡ)所致内皮细胞凋亡来保护血管内皮细胞[67,68]。此外黄芪还有抑菌、抗病毒[69-72]、抗衰老[73-76]、调节血糖[77-80]和血脂[81-83]；保护肝脏[84,85]和肾脏[86,87]的作用。1.3本研究的目的意义虽然黄芪及其蜜炙品的临床疗效确切，目前对黄芪生品的化学成分和药理作用的研究较为广泛和深入，但对于黄芪炮制品的相关研究相对较少。生品和蜜炙黄芪均有补气的功效，黄芪生品偏于益卫固表、托毒生肌、利尿退肿；蜜炙黄芪甘温而偏润，长于益气补中，两者药理作用存在一定差异。但到目前为止，黄芪6 广东药学院硕士研究生学位论文炮制后有效成分的变化、有效成分含量的变化及药理作用的改变还没有系统的阐述。黄芪及其炮制品的功效与其成分存在着密切关系，因此，研究蜜炙黄芪炮制前后化学成分的变化对于阐明其药效物质基础具有十分重要的意义。本课题应用超高效液相色谱/四级杆串联飞行时间高分辨质谱（UPLC/Q-TOF-MS）技术建立一种全面快速分析中药复杂成分的分析方法，对黄芪蜜炙前后的化学成分进行系统分析，并对各成分的含量变化差异进行研究。该分析结果，将为其进一步的药理作用提供可靠的物质基础。根据高分辨质谱元素组成分析和二级质谱等信息并结合主成分分析（PCA）方法对黄芪生品及其蜜炙品化学成分进行模式识别分析，并根据PLS-DA模式识别分析的VIP值筛选出炮制前后变化差异大的化合物，筛选出来的这些化学成分可能为黄芪及其蜜炙品在临床应用上产生药效差异的物质基础。根据中医归经理论，黄芪归肺、脾经，味甘微温，根据性味归经，甘入脾。因此采用疲劳加限制饮食的方法建立的中医脾气虚模型作为黄芪蜜炙前后药效作用差异研究的病理模型。根据黄芪生品、蜜炙品水提物干预治疗后大鼠的免疫相关生化指标，对黄芪蜜炙前后的药效学进行评价。7 广东药学院硕士研究生学位论文第二章蜜炙黄芪UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱的建立及蜜炙前后化学成分的分析2.1引言植化研究表明黄芪的主要化学成分有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等；其中黄酮类化合物有黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷四大类，皂苷类化合物多为三萜皂苷类。目前对黄芪生品的化学成分的研究较为广泛和深入，而对蜜炙黄芪的化学成分的研究相对较少。到目前为止，对黄芪蜜炙前后化学成分性质和含量的变化还没有系统的阐述。现有的分析黄芪和蜜炙黄芪化学成分的方法主要依赖于传统的柱色谱分析、光谱分析和液相色谱紫外检测分析。然而，这些方法费时，需要很大的溶剂消耗，所需样品量也大。随着现代仪器技术的发展，UPLC/Q-TOF-MS，一种在线的分析技术，在传统中药研究领域展现出明显的优势。这种技术集液相色谱的高效分离能力和质谱的高分辨率能力于一身。UPLC/Q-TOF-MS的高灵敏度有助于那些用常规的分离方法无法获得的微量成分的分析。另外，高分辨率质谱能提供化合物的精确分子量，这些质谱信息能用于色谱峰的鉴别和结构鉴定。由于其灵敏度高、速度快、样品需求量低、省时，溶剂消耗少而成为中药提取物中复杂化学成分分析的强有力的分析工具。本实验室前期采用C18色谱柱的UPLC/Q-TOF-MS方法表明极性化合物在BEHC18色谱柱上的分离效果不是很好，共洗脱峰的存在给分析工作带来了很大的不便[22]。因此有必要进一步改善这些问题。HSST3色谱柱采用Waters创新的专有T3键合技术，采用三键C18烷基相配体密度键合，T3键合技术能够促进极性化合物保留和水相兼容性。本课题采用基于HSST3色谱柱的UPLC/Q-TOFMS分析方法对黄芪蜜炙前后的化学成分进行快速全面分析，并通过定量分析对各成分的含量差异情况进行分析。通过UPLC/Q-TOFMS得到的样品的化学成分图谱，利用MarkerLynx4.1软件对原始数据进行峰匹配和峰检测处理，得到原始数据的保留时间、质荷比和峰面积组成的数据矩阵，并对数据进行归一化处理。对数据矩阵进行滤噪和去除干扰等数据后，采用SIMCA-P12.0Demo分别对样品进行主成分分析（PCA），根8 广东药学院硕士研究生学位论文据得分矩阵图(ScoresPlot)和载荷矩阵图(LoadingPlot)可以直观的反应样的分型效果，进一步根据偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的VIP值，筛选出对分型贡献大的变量作为化学标志物。对筛选出的变量的相对峰面积进一步做显著性检验，筛选出P<0.05的变量，得到蜜炙前后显著变化的化学成分。并且可以利用多元统计分析对蜜炙前后化学标志物的变化趋势进行表征。2.2实验材料2.2.1实验药品及试剂色谱纯的乙腈、甲醇和异丙醇购自德国Merck公司，色谱纯的甲酸购于德国CNW，超纯水水为超纯水器所制(Sartorius公司，德国)，其他试剂为分析纯。毛蕊异黄酮苷对照品（批号：111920-201203纯度>97.3%）、黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613纯度>98%）均购自广东省食品药品检验所。亮氨酸-脑啡肽（标准品，Sigma公司）。黄芪药材购自清平药材市场，经广东药学院中药学院刘基柱教授鉴定为豆科蒙古黄芪Astragalusmemdranaceus（Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。样品标本保留在广东药学院中心实验室。2.2.2仪器和设备仪器设备及型号生产厂家UPLC/Q-TOFMS（ESI离子源）Waters公司AcquityUPLCTMBEHC18柱(2.1×50mm，1.7μm)Waters公司AcquityUPLCTMHSST3柱(2.1×50mm，1.7μm)Waters公司低温高速离心机Thermo公司AUW220D分析天平SHIMADZU公司KQ-250B型超声波清洗器昆山市超声波仪器厂Arium611UV纯水器德国赛多利斯公司2.3实验方法2.3.1溶液的配制与样品的制备对照品溶液：分别精密称取毛蕊异黄酮苷对照品和黄芪甲苷对照品5.0mg，甲醇溶解于10ml容量瓶中，定容至刻度，制备成混合对照品液的储备液，于4℃9 广东药学院硕士研究生学位论文冰箱中保存备用。黄芪蜜炙品的制备：黄芪蜜炙品参照2010版《中华人民共和国药典》收载的标准实验室自制。供试品1：参照2010版《中华人民共和国药典》黄芪含量测定项下黄芪甲苷的测定中供试品溶液的制备方法制备供试品1待液质分析。供试品2：准确称取黄芪药材及其蜜炙品2.0g，粉碎，分别置于250ml的圆底烧瓶中，加蒸馏水回流提取三次，每次1h，过滤，合并三次滤液，将提取液浓缩至干，干燥物加水复溶至0.25g/ml(相当于生药量)，12000r/min离心10min，取上层澄清液作为样品液，分别取1ml样品液装入进样瓶中进行液质分析。亮氨酸-脑啡肽：称取本品适量，用含有1%甲酸的甲醇水溶液（v:v，1:1）定容至500ng/mL。2.3.2UPLC/Q-TOFMS分析2.3.2.1液相色谱条件色谱系统：WatersAcquityUPLC/Q-TOFMicroMS；色谱柱：AcquityUPLCHSST3柱2.1×50mm1.7μm；预柱为WatersAQUITYUPLCHSST3VanGuardPre-Column（2.1mm×5mm1.8μm，Waters公司)；进样量：2μL；流速：0.3mL/min；柱温：25℃。流动相：流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱；所得梯度条件如下：时间（min）A(0.1%甲酸水)%B(乙腈)%09553802078020185050190100200100215952359510 广东药学院硕士研究生学位论文2.3.2.2质谱条件质谱条件采用ESI离子源，在正离子模式与负离子模式下分别采集数据，数据采集范围m/z100～1500。离子源参数:Capillary：3kV，Samplecone：30V，SourceTemp：100℃，DesolvationTemp：350℃，雾化气(N2)流速50L·h-1，脱溶剂气(N2)流速500L·h-1；碰撞能量(CE)：10～40eV。LockMass为脑啡肽，实时校正的质量数正离子模式[M+H]+为m/z556.2771，负离子模式[M-H]-为m/z554.2615。流速为0.01ml/min，Lockspray的频率为10s。用Masslynx4.1软件进行所有数据的采集和处理。2.3.2.3UPLC方法学考察精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6次，以此来评价该方法的精密度和准确度。稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，6，8h进样检测。重复性试验取同一批黄芪药材及其蜜炙品，按“2.2.1”项下供试品2的制备方法各分别制备供试品溶液5份，分别进样检测。分别计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值来评价该方法的精密度、准确度、稳定性和重复性。2.3.2.4二级质谱参数进行二级质谱检测分析时，主要考察了碰撞能量（CollisionEnergy）对各个化学成分的碎片离子峰的影响。根据每个化合物的电离情况，确立二级质谱的碰撞电压范围为15-45eV。2.3.2.5UPLC/Q-TOFMS成分鉴定方法黄芪和蜜炙黄芪的化学成分采用ESI电离源进行UPLC/Q-TOF-MS进行快速分析。得到各物质的保留时间、精确的质量数及二级碎片信息。ESI源作为一种软电离技术通常产生分子离子和加合离子很少产生碎片离子，为确定分子离子峰提供了便利。通过MassLynx4.1软件进行处理，得到化合物可能的元素组成并给出质量误差，只有当质量误差在5mDa以内，化合物的元素组成分析才被接受。通过这些信息再与对照品和文献中报道过的天然产物的相对保留时间和质谱数据结合，推测化合物可能的结构及各峰对应物质的归属。11 广东药学院硕士研究生学位论文2.3.3数据预处理及模式识别分析将UPLC/Q-TOFMS分析获得的血清样品的原始图谱数据采用Masslynx4.1软件进行峰检测和峰匹配，编辑一个样品数据导出的方法，将数据导出，导出得到的数据是保留时间、质荷比、峰面积组成的数据矩阵。得到的数据经过滤噪、缺失值的修正及归一化处理后导入SIMCA-P12.0DIMO软件进行PCA、PLS-DA及OPLS-DA多元统计分析，数据经模式识别后，可以达到降维的目的。根据模式识别分析所得的得分矩阵图可以直观的反映各组数据的分型信息；载荷矩阵图反映每个变量对样品分型的贡献，变量离载荷矩阵图中心距离越远，表明变量对样品分型的贡献越大。因此可根据各变量的VIP值对两组间差异性较大的变量进行筛选，筛选出的变量即作为候选标志物。本实验选定VIP值大于1的变量作为候选标志物，这些变量需经显著性检验，本实验采用SPSS17.0统计软件对候选标志物进行两个独立样本的非参数检验，只有P<0.05的变量才能成为可信的潜在标志物。2.4实验结果2.4.1精密度、重复性和稳定性实验结果以色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD作为方法学验证的标准。混合对照品溶液连续进样六次用来判定日内精密度，两个对照品的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.26%和4.20%。选定峰面积值大于200的14个化合物来考察稳定性和重复性，这些选定化合物的重复性的RSD小于8.07%，稳定性的RSD小于7.78%。结果表明该方法有较好的精密度、重复性和稳定性。结果如表2-1，表2-2所示。表2-1对照品六次连续进样的统计结果对照品六次连续进样检测的化合物相对保留时间(RSD,%)相对峰面积(RSD,%)Calycosin-7-O-β-D-glucoside0.264.20AstragalosideIV0.064.2012 广东药学院硕士研究生学位论文表2-2方法学验证中所选化合物的统计结果5个不同的溶液6个不同的时间点检测的化合物相对保留时相对峰面积相对保留时相对峰面积间(RSD,%)(RSD,%)间(RSD,%)(RSD,%)Calycosin-7-O-β-D-glucoside02.3202.32Pratensein-7-O-glucoside0.195.710.295.71Calycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonate0.086.900.496.90Ononin0.060.430.120.439,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-2’-0.194.550.104.55O-β-D-xylopyranosyl9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-2’-0.134.120.094.12O-β-D-xylopyranosylisomer9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside0.233.200.083.202"-hydroxy-3",4"-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-gluc0.146.950.096.95osideFormononetin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonate0.097.900.087.90(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy0.131.890.051.89pterocarpan-3-O-β-D-glucoside-6""-O-malonateAstragalosideIV0.128.070.108.07AstragalosideⅡ0.107.960.187.96AstragalosideI0.094.110.064.11IsoastragalosideI0.107.250.087.252.4.2UPLC/Q-TOFMS分析获得的总离子流图根据上述方法学考察之后的色谱、质谱条件，采集得到混合对照品、黄芪及蜜炙黄芪水提物样品的总离子流图，如图2-1，2-2。图2-1混合对照品TIC图（A为正离子模式；B为负离子模式）13 广东药学院硕士研究生学位论文图2-2黄芪水提物BPI图(A)正离子模式(B)负离子模式和蜜炙黄芪水提物BPI图(C)正离子模式(D)负离子模式14 广东药学院硕士研究生学位论文2.4.3黄芪及蜜炙黄芪水提物的质谱鉴定结果正负离子模式下黄芪和蜜炙黄芪的BPI图如图2-2所示。在样品分析之前，先监测分析对照品以获得相对保留时间和特征的裂解规律。通过比较对照品和文献中的相对保留时间和质谱数据来鉴定待分析的化合物。每个峰的鉴定大致为：根据精确分子量，用Masslynx软件分析得出可能的元素组成及质量误差，将得到的可能的化学式在scifinder中检索，筛选出可能的化学成分。黄芪和蜜炙黄芪水提物中化合物的相对保留时间、质谱数据和单个峰的阐释如表2-3所列。黄芪和蜜炙黄芪中鉴定的化合物的化学结构如图2-3所示。R2OOR2OOOR1R1OCH3R3OOCH3OCH3Calycosin-7-O-β-D-glucoside:R1=OH,R2=β-D-glc,R3=HIsomucronulatol-7,2"-di-O-glucoside:R1=β-D-glc,R2=β-D-glcCalycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonate:R1=OH,R2=6""-O-2"-hydroxy-3",4"-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucoside:malonyl-β-D-glc,R3=HR1=H,R2=β-D-glcCalycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-acetate:R1=OH,R2=6""-O-acetyl-7,2"-dihydroxy-3",4"-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucoside-β-D-glc,R3=H6""-O-malonate:R1=H,R2=6""-O-malonyl-β-D-glcCalycosin:R1=OH,R2=,R3=HOR3Ononin:R1=H,R2=β-D-gl,R3=HFormononetin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonate:R1=H,R2=6""-O-malonyl-β-D-glc,R3=HFormononetin:R1=H,R2=,R3=HOPratensein-7-O-glucoside:R1=OH,R2=β-D-glc,R3=OHOHR1OOOR1OOCH3OR2OR2LicoagrosideD:R1=β-D-glc,R2=HAstragalosideIV:R1=β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=H9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-2"-O-β-D-AstragalosideII:R1=2"-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=Hxylopyranosyl:R1=2"-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-glc,R2=CH3AstragalosideI:R1=2",3"-di-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=H9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside:R1=β-D-IsoastragalosideI:R1=2",4"-di-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=Hglc,R2=CH3Acetylastragaloside:R1=2",3",4"-tri-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=H(6aR,11aR)-3-hydroxy-9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-AgroastragalosideIII:R1=2",3"-di-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=β-D-glcglucoside-6""-O-malonate:R1=6""-O-malonyl-β-D-glc,R2=CH3AgroastragalosideIV:R1=2"-O-Ac-β-D-xyl,R2=β-D-glc,R3=β-D-glc图2-3黄芪及蜜炙黄芪水提物中鉴定的化合物的结构式15 广东药学院硕士研究生学位论文表2-3黄芪和蜜炙黄芪水提物中化学成分的相对保留时间和质谱数据tR测量值no.加合离子计算值(m/z)误差(mDa)碎片离子化学式化合物(min)(m/z)10.51[M+Na]+365.1055365.1060-0.5145C12H22O11NaSucrose[M-H]-341.1044341.1084-4179C12H21O1120.89[M+H]+268.1006268.1046-4136,119C10H14N5O4Adenosine31.05[M+H]+284.1036284.09954.1152C10H14N5O5Guanosine[M-H]-282.0817282.0838-2.1150,133C10H12N5O541.57[M+Na]+457.1327457.13220.5C18H26O12NaMarkhamiosideF[M-H]-433.1312433.1346-3.4301,139C18H25O1251.65[M+Na]+455.1161455.1165-0.4C18H24O12NaAsperulosidicacid[M-H]-431.1197431.1190.7C18H23O1262.26[M+H]+625.1757625.1769-1.2463,301C28H33O16Complanatuside[M-H]-623.1639623.16122.7461C28H31O1674.04[M+H]+447.1277447.1291-1.4285,270,253,225,137,C22H23O10Calycosin-7-O-β-D-glucoside*[M+COOH]-491.1151491.119-3.9283,239C23H23O1284.99[M+Na]+649.2134649.21082.6303C29H38O15NaIsomucronulatol-7,2’-di-O-glucoside[M-H]-625.2127625.2132-0.5301,463C29H37O1595.56[M+H]+463.1212463.124-2.8301,286C22H23O11Pratensein-7-O-β-D-[M+COOH]-507.1129507.1139-1299;284Cglucoside23H23O13105.7[M+Na]+471.1293471.12672.6287C22H24O10NaLicoagrosideD[M-H]-447.1281447.1291-1285C22H23O10115.84[M+H]+533.1309533.12951.4285,270;253;225C25H25O13Calycosin-7-O-β-D-[2M-H]-1063.24011063.23564.5283,268Cglucoside-6"-O-malonate50H47O26127.56[M+H]+431.1316431.1342-2.6269,226,C22H23O9Ononin16 广东药学院硕士研究生学位论文tR测量值no.加合离子计算值(m/z)误差(mDa)碎片离子化学式化合物(min)(m/z)198,137[M+COOH]-475.1238475.124-0.2267,252C23H23O11137.98[M+H]+489.1417489.13972285,270,268,225C24H25O11Calycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-a[M+COOH]-533.1343533.12954.8283,Ccetate25H25O13148.53[M+Na]+617.187617.18462.4463,301C28H34O14Na(6aR,11aR)9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-2’-O-β-D-xylop[M-H]-593.1876593.1870.6299C28H33O14yranosyl158.78[M+Na]+617.1877617.18463.1301C28H34O14Na(6aR,11aR)9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-2’-O-β-D-xylop[M-H]-593.1863593.187-0.7299C28H33O14yranosylisomer169.22[M+Na]+485.1436485.14241.2301C23H26O10Na(6aR,11aR)9,10-dimethoxypterocarpa[M+COOH]-507.1502507.1503-0.1299Cn-3-O-β-D-glucoside24H27O12179.88[M+Na]+487.1591487.1581.1303C23H28O10Na7,2"-dihydroxy-3",4"-dimethoxyisoflav[M-H]-463.1613463.16040.9301Can-7-O-β-D-glucoside23H27O101810.06[M+H]+285.0745285.0763-1.8270,253,241,225,214,137,185,C16H13O5Calycosin[M-H]-283.0608283.06060.2268,239,212,C16H11O5Formononetin-7-O-β-D-glucoside-6"-1910.51[M+H]+517.1323517.1346-2.3269,267C25H25O12O-malonate2010.99[M+Na]+571.1438571.14281301C26H28O13Na(6aR,11aR)9,10-dimethoxypterocarpa[2M-H]-1095.3021095.2983.7299Cn-3-O-β-D-glucoside-6""-O-malonate52H55O262111.45[M+Na]+573.1591573.15840.7C26H30O13Na2"-hydroxy-3",4"dimethoxyisoflavan-7-1099.3271099.33-2.4301C[M-H]52H59O26-O-β-D-glucoside-6""-O-malonate2211.77[M+H]+947.5251947.52163.5785,653,473,455,437,C47H79O19Astragaloside-991.5161991.51144.7C[M+COOH]48H79O21V/VI/VII17 广东药学院硕士研究生学位论文tR测量值no.加合离子计算值(m/z)误差(mDa)碎片离子化学式化合物(min)(m/z)2312.67[M+H]+989.5339989.53211.8457,439,C49H81O20AgroastragalosideIV[M+COOH]-1033.5261033.5223.8C50H81O222413.45[M+Na]+807.4521807.45071.4605,587,473,455,437,419C41H68O14NaAstragalosideIV*[M+COOH]-829.4623829.45863.7C42H69O162513.71[M+H]+269.081269.0814-0.4254,225,197,137C16H13O4Formononetin[M-H]-267.0653267.0657-0.4252,223,195,135C16H11O42614.42[M+H]+1031.5421031.543-0.7825,651,633,871,695C51H83O21AgroastragalosideIII[M+COOH]-1075.53251075.53250C52H83O232714.65[M+Na]+849.4622849.46121647,629,611,473,455,437,419C43H70O15NaAstragalosideⅡ[M+COOH]-871.4686871.4691-0.5C44H71O172814.93[M+H]+943.5277943.52661.1797,781,763,635,617,599,C48H79O18SoyasaponinI[M-H]-941.5063941.511-4.7C48H77O182915.33[M+Na]+849.4569849.4612-4.3647,629,611,473,455,437,419C43H70O15NaIsoastragalosidesII[M+COOH]-871.4686871.4691-0.5C44H71O17809,647,629,611,3015.85[M+Na]+849.4569849.4612-4.3C43H70O15Na473,455,437,419AstragalosideⅡisomer[M+COOH]-871.4704871.46911.3C44H71O17851,833,689,671,653,473,3116.86[M+Na]+891.4721891.47180.3C45H72O16Na455,437,419AstragalosideI[M+COOH]-913.4798913.47970.1C46H73O18851,833,689,671,3217.47[M+Na]+891.4761891.47184.3C45H72O16Na653,455,437,419IsoastragalosideI[M+COOH]-913.4817913.47972C46H73O183317.94[M+Na]+977.4759977.47223.7775,757,739C48H74O19NaMalonylastragalosidesI18 广东药学院硕士研究生学位论文tR测量值no.加合离子计算值(m/z)误差(mDa)碎片离子化学式化合物(min)(m/z)[M-H]-953.4776953.47463C48H73O19851,689,671,653,635,617,3418.32[M+Na]+891.4739891.47182.1C45H72O16Na473,455437,419AstragalosideIisomer[M+COOH]-913.4798913.47970.1C46H73O18893,731,713,695,677,455,3519.22[M+Na]+933.4854933.48243C47H74O17Na437,419Acetylastragaloside[M+COOH]-955.4871955.4903-3.2C48H75O19注：*为对照品19 广东药学院硕士研究生学位论文2.4.4黄芪和蜜炙黄芪水提物中化学成分的半定量分析用相对峰面积作为标准来进行化合物的定量分析。相对峰面积为单一化合物的峰面积与所有35个化合物的峰面积总和的比值，以此来反应每个化合物的相对含量。所有化合物的相对峰面积的值如表2-4所示。表2-4正离子模式下黄芪和蜜炙黄芪中化合物的相对峰面积相对峰面积峰号分子式化合物分类黄芪蜜炙黄芪1C12H22O11Sucrose0.0120.0212C10H13N5OAdenosine0.0250.0423C10H13N5OGuanosine0.0100.0264C18H26O12MarkhamiosideF0.0030.0035C18H24O12Asperulosidicacid0.0020.0026C28H32O16Complanatusideisoflavone0.0080.0097C22H22O10Calycosin-7-O-β-D-glucosideisoflavone0.2980.3798C29H38O15Isomucronulatol-7,2’-di-O-glucosideisoflavan0.0050.0079C22H22O11Pratensein-7-O-glucosideisoflavone0.0180.01410C22H24O10LicoagrosideDpterocarpan0.0040.00511C25H24O13Calycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonateisoflavone0.1870.00912C22H22O9Ononinisoflavone0.0760.10213C24H24O11Calycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-acetateisoflavone0.0530.0519,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-14C28H34O14pterocarpan0.0140.0212’-O-β-D-xylopyranosyl9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside-15C28H34O14pterocarpan0.0050.0052’-O-β-D-xylopyranosylisomer16C23H26O109,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucosidepterocarpan0.0360.0482"-hydroxy-3",4"-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-17C23H28O10isoflavan0.0170.021glucoside18C16H12O5Calycosinisoflavone0.0910.08819C25H24O12Formononetin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonateisoflavone0.0430.032(6aR,11aR)-3-hydroxy-9,10-dimethoxypterocarpa20C26H28O13pterocarpan0.0140.014n-3-O-β-D-glucoside-6""-O-malonate7,2"-dihydroxy-3",4"dimethoxyisoflavan-7-O-β-D21C26H30O13isoflavan0.0070.006-glucoside-6""-O-malonate22C47H78O19AstragalosideV/VI/VIIsaponin0.0110.01923C49H80O20AgroastragalosideIVsaponin0.0020.00324C41H68O14AstragalosideIVsaponin0.0030.00425C16H12O4Formononetinisoflavone0.0150.02026C51H82O21AgroastragalosideIIIsaponin0.0010.00127C43H70O15AstragalosideⅡsaponin0.0050.00628C48H78O18SoyasaponinIsaponin0.0100.01129C43H70O15IsoastragalosidesIIsaponin0.0020.00330C43H70O15AstragalosideⅡisomersaponin0.0020.00220 广东药学院硕士研究生学位论文31C45H72O16AstragalosideIsaponin0.0060.00932C45H72O16IsoastragalosideIsaponin0.0080.01033C48H74O19MalonylastragalosidesIsaponin0.0010.00034C45H72O16AstragalosideIisomersaponin0.0030.00435C47H74O17Acetylastragalosidesaponin0.0020.003totalsaponins0.0560.076totalisoflavonoids0.7900.703totalisoflavan0.0290.034比较蜜炙前后每个化合物的相对峰面积的变化，来表示蜜炙前后化合物的含量变化。结果显示蜜炙后总黄酮的含量下降，而葡萄糖，紫檀烷，异黄烷和总皂苷的含量有略微的增加。其中黄芪蜜炙品中的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酸酯的含量锐减，而毛蕊异黄酮苷的含量有所增加。蜜炙黄芪中MalonylastragalosidesI的含量较生品中降低。2.4.5黄芪蜜炙前后化学成分的多元统计分析本研究应用UPLC/Q-TOF-MS联用分析技术，对黄芪生品及蜜炙品水提部分化学成分进行全谱分析，采用MarkerLynx软件对正、负离子模式下采集得到的黄芪及蜜炙黄芪原始数据进行预处理，将处理后的数据导入SIMCA-P12.0软件中进行PCA模式识别分析。比较各样品正、负离子模式下PCA分析的得分图（图2-4）可以看出两组样品能明显区分开来，说明黄芪生品和蜜炙品之间存在明显差异。通过正、负离子模式下的PCA分析的载荷矩阵图（图2-5）进一步对黄芪药材蜜炙前后的化学成分进行比较、分析。载荷矩阵图中的点表示保留时间-质荷比(RT-m/z)的变量，每个点代表一个变量，其与中心点距离的远近表示该变量对样品组分型贡献的大小，离中心点距离越远，表明其对两组样品的分型贡献越大，其在两组样品中的变化差异越大。黄芪生品组与炙品组成分变化+.M1(PCA-X)生品组黄芪生品组与炙品组成分变化-.M1(PCA-X)生品组炙品组炙品组4010000205000[2]t0t[2]0-5000-20-10000-40-40000-2000002000040000-80-60-40-20020406080t[1]t[1]SIMCA-P+12-2015-05-0414:25:19(UTC+8)SIMCA-P+12-2015-03-0303:50:13(UTC+8)图2-4黄芪蜜炙前后PCA分析得分图（左：正离子；右：负离子）21 广东药学院硕士研究生学位论文黄芪生品组与炙品组成分变化+.M1(PCA-X)黄芪生品组与炙品组成分变化-.M1(PCA-X)0.80.40.60.20.4[2][2]p-0.0p0.2-0.20.0-0.4-0.2-0.5-0.4-0.3-0.2-0.1-0.00.10.20.30.4-0.30-0.20-0.10-0.000.100.200.300.40p[1]p[1]SIMCA-P+12-2015-03-0403:11:45(UTC+8)SIMCA-P+12-2015-03-0403:14:27(UTC+8)图2-5黄芪蜜炙前后PCA分析载荷图（左：正离子；右：负离子）黄芪生品组与炙品组成分变化+.M1(PLS-DA)生品组黄芪生品组与炙品组成分变化-.M1(PLS-DA)生品组炙品组炙品组600060040040002002000[2]t0[2]t0-200-2000-400-4000-600-6000-1200-1000-800-600-400-200020040060080010001200-50000-40000-30000-20000-1000001000020000300004000050000t[1]t[1]SIMCA-P+12-2015-05-0414:31:10(UTC+8)SIMCA-P+12-2015-05-0414:16:12(UTC+8)图2-6黄芪蜜炙前后PLS-DA分析得分图（左：正离子；右：负离子）为了进一步的表征黄芪蜜炙前后化学成分的变化，采用PLS-DA进行进一步的分析，这是一种识别能力更强的有监督的多元统计方法。这种方法能使PCA分析中两组样品的分型效果更好。PLS-DA的得分图显示根据化学组成的差异，两组样品能明显的分成两簇（图2-6）。分析结果表明黄芪蜜炙后化学成分或化学成分的含量有显著的变化。研究中利用VIP值衡量各化学成分对样品分型的贡献，筛选过程中将VIP值大于1的变量定义为“Important”变量，即对数据分型有重要贡献的变量，对选出的变量进行显著性检验，筛选出P<0.05的变量确定为潜在标记物。最终得到9个与蜜炙前后化学成分变化相关(t检验P<0.05)的化学成分。通过与之前质谱鉴定部分化合物的保留时间和质谱信息比较对这9个化合物进行了鉴定。这些化合物的鉴定结果和含量变化趋势如表2-5所示。22 广东药学院硕士研究生学位论文表2-5黄芪蜜炙前后化学成分变化相关化合物的鉴定结果和含量变化趋势tRMeasuredNo.AdductionFormulaTendencyIdentificationClassification(min)value(m/z)14.04[M+H]+447.1277C22H23O10↑*Calycosin-7-O-β-D-glucosideisoflavone[M+COOH]-491.1151C23H23O12↑*25.84[M+H]+533.1309C*25H25O13↓Calycosin-7-O-β-D-glucoside-6"-O-malonateisoflavone[2M-H]-1063.2401C50H47O26↓**37.56[M+H]+431.1316C**22H23O9↑Ononinisoflavone[M+COOH]-475.1238C**23H23O11↑49.22[M+Na]+485.1436C**23H26O10Na↑(6aR,11aR)9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-pterocarpan[M+COOH]-507.1502C24H27O12↑**glucoside510.06[M+H]+285.0745C**16H13O5↓Calycosinisoflavone613.45[M+Na]+807.4521C**41H68O14Na↑AstragalosideIV*saponin[M+COOH]-829.4623C**42H69O16↑716.86[M+COOH]-913.4798C**46H73O18↑AstragalosideIsaponin817.47[M+COOH]-913.4817C**46H73O18↑IsoastragalosideIsaponin918.32[M+COOH]-913.4798C**46H73O18↑AstragalosideIisomersaponin*:P<0.05,**:P<0.0123 广东药学院硕士研究生学位论文2.5结果讨论2.5.1色谱条件的优化本课题对黄芪及蜜炙黄芪化学成分分析的色谱条件的优化进行了一系列的预实验，考察了不同流动相的组成对分离效果的影响，其中包括乙腈/水，甲醇/水，乙腈/0.1%甲酸水，甲醇/0.1%甲酸水和乙腈-异丙醇/水。结果表明含有少量酸的流动相更有利于待测物质的离子化，改善峰形、减少色谱峰的分裂，提高信号的响应强度，增加检测的灵敏度。甲醇体系所得的色谱峰的基线不平，乙腈体系所得的色谱峰的峰形好且稳定，主要色谱峰的响应强度高，因此最终的流动相体系确定为乙腈/0.1%甲酸水，洗脱方式为梯度洗脱。2.5.2质谱参数的选择在进行质谱数据采集时，根据分析样品的不同，可适当调节毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度、脱溶剂气体流速、锥孔气体流速、碰撞能量等参数。而一些参数也要根据液相条件来调节，脱溶剂温度、脱溶剂气体流速、锥孔气体流速可根据液相流速来调节。最终确定SourceTemp：100℃，DesolvationTemp：350℃，ConeGas:50L·h-1，DesolvationGas:500L·h-1。碰撞能量要根据待测样品的性质而定，而且正负离子模式下同样的碰撞能量产生的碎片信息有时也会有很大的差异。2.5.3色谱柱的选择本实验前期采用C18色谱柱的UPLC/Q-TOF-MS方法分析黄芪及蜜炙黄芪水提物中化学成分的实验结果表明极性化合物在BEHC18色谱柱上的分离效果不是很好，共洗脱峰的存在给分析工作带来了很大的不便。因此有必要进一步改善水溶性成分在C18色谱柱上的分离效果。HSST3色谱柱采用Waters创新的专有T3键合技术，采用三键C18烷基相配体密度键合，T3键合技术能够促进极性化合物保留和水相兼容性。从采用两种色谱柱分析得到的总离子流图来比较，HSST3色谱柱获得的图谱分离效果更好。BEHC18和HSST3色谱柱获得的色谱图的对比图如图2-7所示。24 广东药学院硕士研究生学位论文图2-7C18和T3色谱柱获得的色谱图的对比图（A、B为C18正负离子模式；C、D为T3正负离子模式）2.5.4黄酮类的鉴定黄酮类的质谱特征已经得到了广泛研究。黄酮类化合物通常包含O-葡萄糖苷和甲基酚基团。黄酮类的碎片离子通常为失去一个葡萄糖基（162Da）或丙二酰葡萄糖基（248Da）或乙酰葡萄糖基（204Da）的残基化合物。在其质谱信息中还能发现丢失一些中性碎片如CH3(15Da)、CO(28Da)、H2O(18Da)、CO2(44Da)。几乎所有检测到的黄酮类均发生了狄尔斯–阿尔德反应的裂解规律。通过与对照品的保留时间和质谱信息比较，化合物7被鉴定为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，其一级质谱信息见图2-8。正离子模式下m/z285(C16H13O5)产物离子相当于化合物7失去一个己糖残基。碎片离子m/z270和m/z253分别失去一个CH3(15Da)和CO(28Da)。同理，在正离子模式下化合物11的分子离子峰为m/z533，失去一个丙二酰基葡萄糖苷残基（248Da），得到产物离子m/z285(C16H13O5)，一级质谱信息见图2-9。m/z285(C16H13O5)产生的碎片离子与毛蕊异黄酮的产物离子一致。因此将化合物11鉴定为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酰酯。化合物13呈现出类似的质谱信息，因此被鉴定为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-乙酸酯。25 广东药学院硕士研究生学位论文UPLC/MS+285.0723100447.1288%286.0782448.1334149.0198284.8133322.0594549.0919689.1593747.2889915.26190283.0568100491.1170%481.0919492.1213284.0582588.0181729.1878891.2397174.9526927.21560m/z1002003004005006007008009001000图2-8毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的一级质谱信息（上为正离子模式，下为负离子模式）UPLC/MS+533.1241100%534.1328285.0743286.0806535.1365759.19901065.29081137.31771315.49300283.0859100%187.1120284.09331063.3386325.1030487.1657995.61911065.35380m/z200400600800100012001400图2-9毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酰酯的一级质谱信息（上为正离子模式，下为负离子模式）2.5.5皂苷类的鉴定黄芪和蜜炙黄芪中的皂苷类大部分为含有一个环黄芪醇骨架的三萜皂苷类。一个皂苷通常包含不止一个糖分子。在负离子模式下，几乎所有的皂苷都会产生26 广东药学院硕士研究生学位论文典型的相应强度很高的[M-H+HCOOH]-或[M-H]-加合离子，即使在45eV的碰撞电压下也不会裂解。而在正离子模式下，在15eV碰撞电压下就会产生大量的特征碎片离子。因此采用正离子模式下的碎片离子信息鉴定皂苷类。由于含有相同的骨架，皂苷类表现出特征的碎片离子，m/z473,455,437,419的残基离子是由于同时失去一个木糖，一个己糖和连续失去几个水分子而产生的[25,88]。利用对照品和文献中的各类化合物的质谱数据信息和裂解规律，分别鉴定了其他的皂苷类。以化合物24为例解释皂苷类的鉴定过程。与对照品的信息对比，将化合物24鉴定为黄芪甲苷，其一级质谱信息见图2-10。m/z807和m/z829分别为正负离子模式下化合物24的加钠和加甲酸根的加合离子峰。经元素组成分析其化学式为C41H68O14。正离子模式下的碎片离子m/z473，455，437和419分别为失去一个五碳糖、一个己糖和连续失去几个水分子而产生的。UPLC/MS+455.3540100437.3427473.3668143.1046587.4024%419.3300807.4540301.1424767.4565823.41671197.20961320.65390829.4570100830.4660%831.4709819.4326174.9526242.9379401.0811959.42431202.66080m/z200400600800100012001400图2-10黄芪甲苷的一级质谱信息（上为正离子模式，下为负离子模式）2.5.6蜜炙后化学成分变化的分析对黄芪蜜炙前后化学成分的半定量分析，主要反映了各类化合物的整体变化。进一步的多元统计分析筛选出的化学标志物，即为蜜炙前后含量变化有显著性差异的化学成分。其中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酸酯的含量显著降低，而毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量有所升高。由于蜜炙是一个加热27 广东药学院硕士研究生学位论文过程，易发生不稳定基团的消除反应，导致含有不稳定基团的化合物产生裂解，而使其含量的下降。如丙二酰基受热易发生消除，蜜炙后会导致含有这些基团的化合物如毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酸酯和MalonylastragalosidesI含量的减少和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量的增加。同时一些不稳定的糖苷键受热后也会发生消除，导致其蜜炙后含量下降。半定量分析与多元统计分析结果表明总皂苷类成分的含量蜜炙后整体升高，其中黄芪甲苷、黄芪皂苷I和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷等成分（见表2-5）蜜炙后发生显著性升高变化。因此根据实验结果推测蜜炙后黄芪补气作用的增强可能与蜜炙后上述具有显著性差异的化学成分变化有关。2.6本章小结在中医临床上，黄芪及蜜炙黄芪多以水煎剂供临床使用，故本实验主要研究黄芪及蜜炙黄芪水提物中的化学成分。本试验建立了一种快速全面分析黄芪药材及其蜜炙品水提物中复杂成分的UPLC/ESI-Q-TOF-MS分析方法。应用该方法初步鉴定了35个主要成分，包括黄酮类17个，皂苷类13个。应用PCA、PLS-DA模式识别分析方法，筛选并鉴定出9个蜜炙前后变化差异较大的化合物。并进一步分析了这些化合物蜜炙前后的含量变化趋势。筛选出的变化差异较大的化学成分可能为黄芪及其蜜炙品临床应用中药效差异的物质基础。相关文献报导黄芪中的皂苷类能增强巨噬细胞的免疫功能，而且这种增强作用呈现一定的量效关系[89]。黄芪蜜炙后皂苷含量的增加可以提高免疫刺激活性。传统中医理论认为，补气作用与免疫增强作用有关，包括提高机体黏膜的免疫力，影响免疫增强或双向调节固有免疫效应细胞及T、B淋巴细胞的作用[6]。因此推测黄芪蜜炙后补气作用的增强可能与蜜炙后皂苷含量的增加有关。本实验结果进一步确认了传统古方中黄芪和蜜炙黄芪临床应用的科学性。这将为其进一步的药效学研究提供坚实的基础。28 广东药学院硕士研究生学位论文第三章黄芪及蜜炙黄芪水提物对脾气虚大鼠的干预作用3.1引言黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，作为补益药已在祖国医药中使用了上千年[90]。黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效[22]。蜜炙黄芪是黄芪经传统的蜜炙方法炮制而成的一种制品，中医理论认为黄芪蜜炙可增强其补中益气、升阳的作用，从而用于脾肺气虚、中气下陷之证。因此在一些传统古方中，蜜炙黄芪由于有更好的补气功能和更少的副作用而取代黄芪使用。虽然黄芪及其蜜炙品的临床疗效确切，但目前对黄芪生品的化学成分和药理作用的研究较为广泛和深入，而对蜜炙黄芪的药效研究相对较少。对黄芪及蜜炙黄芪补中益气药效作用差异的显得更为缺乏。对于中药药效的研究，通常要选择合适的中医病理模型。根据黄芪的性味归经，及功能主治，据其“归脾经”理论建立脾气虚动物模型。目前脾气虚动物模型建立的常用方法主要有以下几种：1）苦寒泻下法[91-93]，根据李时珍及李杲对大黄“其性苦寒，能伤元气、耗阴血”、“大忌苦寒之药损其脾胃”的论述，成为苦寒泻下法建立脾气虚动物模型的理论依据。已有很多的文献采用苦寒泻下法来复制脾气虚动物模型。2）饮食失节法[94,95]，《黄帝内经》曰：“安谷则昌，绝谷则亡。”《景岳全书》云：“凡失饥伤饱，损及脾胃，则胸肠痞闷，不能消化，或神体困倦，此皆脾气受伤，中虚而然”为饮食失节建立脾气虚模型提供理论基础。3）限制日摄食量法[96-98]，《灵枢·五味篇》：“谷不入半日则气衰，以日则气少矣。”因此限制摄食量复制气虚动物模型符合中医理论。4）耗气破气法[99,100]，《本草经疏》曰：“脾虚忌下、降泄、破气”，故临床有长期灌胃青皮或厚朴三物汤等耗气破气之品复制脾气虚证模型的例子。阚甸嘉等用厚朴三物汤连续灌胃大鼠复制脾气虚模型。5）偏食五味法[101-103]，中医理论认为，五味入五脏，偏食五味，损伤五脏。脾气虚证动物模型复制常采用的有偏食醋法、偏食酒、偏食酒和偏食苦味法。6）劳倦伤脾法[104-108]，张介宾《景岳全书·杂证谟》中载有：“脾胃之伤于外者，唯劳倦最能伤脾”故劳倦可使脾脏虚损。而劳倦最常采用的两种方式是：游泳力竭和跑步力竭，两种方式中又以游泳法较为多用，因为所需仪器设备简单，29 广东药学院硕士研究生学位论文实验操作简单方便。7）西医理化因素造模法[109-111]，主要包括：利血平注射法，秋水仙碱喂饲法和X射线照射法。临床患者腹部照射X线后可产生类似脾气虚证的症状，因此有人采用大鼠腹外照射X线的方法建立脾气虚证动物模型。8）复合因素造模法[112-117]，主要是采用单一因素累加的办法，即采用两种及两种以上方法造模。复合因素造模法中主要的几种方法：苦寒泻下加饮食失节法；苦寒泻下加劳倦过度法；耗气破气法复合饮食失节法；劳倦过度加饮食失节法；控制食量法加劳倦过度法；苦寒泻下、饮食失节复合劳倦过度法；水杨酸复合饮食失节、劳倦过度法。为了避免泻下法等造模方法引入的其他药物对体内代谢产物造成影响，本实验采用疲劳加限制饮食的方法建立中医脾气虚动物模型。通过检测相关的指标对所建模型进行评价。测定正常对照组、脾气虚模型组及黄芪生品、蜜炙品水提物干预治疗后大鼠的免疫相关生化指标，并对蜜炙黄芪炮制前后药效学进行评价。3.2实验材料3.2.1实验药品及试剂乙醚、间三苯酚、冰醋酸、浓盐酸、D-木糖；2mlEDTA抗凝管（广州，瑞舒生物）、大鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α酶联免疫试剂盒（南京，森贝伽）。3.2.2仪器和设备仪器设备生产厂家DU8000核酸蛋白分析仪Beckmancoulter公司HHS型电热恒温水浴锅上海博迅实业有限公司低温高速离心机Thermo公司AUW220D分析天平SHIMADZU公司TT5000电子天平常熟市双杰测试仪器厂MindrayBC-5800血液细胞分析仪深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司3.2.3实验动物SPF级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，体重200±20g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2013-0020)。实验动物分笼饲养，30 广东药学院硕士研究生学位论文每笼8只，置于室温22±1℃，湿度50±5%，光照12h和黑暗12h的环境下饲养。3.2.4试剂的配制D-木糖溶液的配制：取D-木糖适量，精密称定，加水制成5%的溶液，即得。间苯三酚显色剂的配制：由0.5克间苯三酚，100毫升冰醋酸和10毫升的浓盐酸组成，避光保存，常温避光能保存4天，因此最好现用现配。黄芪及蜜炙黄芪水提物的制备：称取黄芪及蜜炙黄芪粉末适量，加10倍量的蒸馏水浸泡30min，煎煮1h，纱布过滤，滤渣加入8倍量的蒸馏水，煎煮1h，纱布过滤，滤渣加入6倍量的蒸馏水，煎煮1h，纱布过滤，合并三次滤液，将滤液置于沸水浴中浓缩至一定体积，分别制成每毫升含有生药量2.4g的浸膏，4℃保存备用。3.3实验方法3.3.1脾气虚大鼠模型的建立通过饮食失节法加劳倦伤脾法建立脾气虚大鼠模型，方法如下：实验动物：健康雌性SD大鼠64只，体重200±20g，适应性喂养7天。实验分组：将64只大鼠随机分成正常组和模型组，其中正常组1组，共8只，模型组56只，随机分成7组进行造模操作，分别对每只大鼠进行编号。对模型组大鼠施与的造模条件为单日禁食，自由进水；双日按75g/kg·bw给食，饮水自由，置于25±1℃的温水中游泳至力竭。力竭的判定标准为大鼠鼻部没入水下，身体下沉不能上浮，动作明显失调，力竭后将大鼠取出，将其擦干身上的水。正常组常规饲养，自由饮水、给食，连续14天。每天对各组大鼠称重，观察记录每只大鼠的体征变化，包括：毛色、尾巴颜色、有无拱背、运动状况、饮食状况、大便颜色和形状、有无眯眼等现象。造模第14天晚禁食过夜，第15天上午对正常组和模型组分别称重，并从模型组中的56只大鼠中随机挑选出12只，对正常组和从模型组随机挑选出的这12只大鼠经乙醚麻醉后眼眦静脉采血，取血1ml置于EDTA抗凝的采血管中，另取1.5ml血样室温自然凝血。EDTA抗凝血用血细胞分析仪进行大鼠血液常规分析，检测指标包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数、红细胞压积和淋巴细胞数量等。将自然凝固的血样离心分离得到血清，-20℃保存备用。根据相应检测指标的分析结果，判定脾气虚模型是否建成。31 广东药学院硕士研究生学位论文3.3.2黄芪及蜜炙黄芪水提物对脾气虚大鼠的干预根据相关的检测指标判定模型组大鼠的模型建立成功后，将模型组的56只大鼠随机分成7组即：模型对照组（8只），生品高剂量组（8只），生品中剂量组（8只），生品低剂量组（8只），炙品高剂量组（8只），炙品中剂量组（8只），炙品低剂量组（8只）。生品和炙品高、中、低剂量组分别给予18g/kg·bw、12g/kg·bw和6g/kg·bw水提物，并继续施以造模时的外在条件。各给药组每天根据大鼠体重灌胃相应的黄芪生品和蜜炙品水提物。以1mL/100g体重进行灌胃给药，正常组和模型对照组灌胃等量蒸馏水，每天一次，连续给药15天。每天对各组大鼠称重，观察记录每只大鼠的体征变化，包括：毛色、尾巴颜色、有无拱背、运动状况、饮食状况、大便颜色和形状等。给药第15天晚各组大鼠均禁食，给药后第16天，分别对各组大鼠称重，之后眼眦静脉取血1ml置于EDTA抗凝的采血管中，另取足够量的血样自然凝血。EDTA抗凝血用于大鼠血液常规分析，检测指标包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数、红细胞压积和淋巴细胞数量等。将自然凝固的血样离心分离得到血清，取一部分经过处理后进行液质分析；另一部分用于测定大鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的含量，检测方法均采用酶联免疫(ELISA)试剂盒进行测定，血清样品均于-20℃保存。3.3.3观测指标及检测方法3.3.3.1一般的体征观察观察模型建立过程和药物干预过程中各组大鼠体重变化，观察记录各组大鼠神态、毛色、尾巴颜色、有无拱背、运动状况、饮食状况、大便颜色和形状、有无眯眼等现象。3.3.3.2血常规的测定采用血细胞分析仪分别测定模型建立结束后及药物干预结束后各组大鼠的空腹眼眦静脉EDTA抗凝血的血液指标。包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数、红细胞压积和淋巴细胞数量等。3.3.3.3D-木糖吸收实验造模第15天，对正常组大鼠和随机挑选出的模型组的大鼠分别灌胃5%的D-木糖溶液，按1ml/kg体重进行灌胃。灌胃1h后，经乙醚麻醉眼眦静脉采血。采集的血样室温放置30min，3500r/min离心10min，取上清液得血清样品。各取32 广东药学院硕士研究生学位论文血清、D-木糖标准溶液和蒸馏水50μL置于试管中，加入5ml的间苯三酚显色剂，沸水浴中加热5min，取出至冷水中冷却。554nm处测定吸光度值，测得各大鼠血清中的木糖含量，测定之前以蒸馏水的空白管校零。3.3.3.4大鼠细胞因子的测定药物干预后各组大鼠血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α含量的检测方法均采用酶联免疫(ELISA)试剂盒进行测定。具体的操作步骤按试剂盒的操作说明进行。3.3.4统计学方法所有数据的统计分析均采用SPSS17.0统计软件进行分析，数据的统计结果以平均数±标准差（（x±s））表示。两组间的比较采用独立样本t检验；P<0.05有统计学意义。3.4实验结果3.4.1给药剂量的确定黄芪及蜜炙黄芪水提物给药剂量参照《中华人民共和国药典》2010版中黄芪药材的临床成人使用量为9-30g，根据人与大鼠的等效剂量换算成大鼠的剂量为0.9-3.0g/kg体重。使用最高推荐剂量的两倍作为低剂量组的给药剂量即6.0g/kg，中剂量组的给药剂量为12g/kg，高剂量组的给药剂量为18g/kg。3.4.2造模实验结果及分析随着造模时间的延长，模型组大鼠的体征开始出现一些变化，毛发变得直立稀松、无光泽；与正常组大鼠比较模型组大鼠的尾巴细瘦、鼠尾淡白、少有血色；体型瘦削，两侧腹部凹陷，背部微弓，摸之触骨，后期大鼠粪便松软，甚至不成形。3.4.2.1体重变化表3-1造模第15天空白组和模型组大鼠体重（x±s）组别n体重(g)空白组8213.8±6.37模型组32163.8±8.91**注：**表示与正常组比较P<0.0133 广东药学院硕士研究生学位论文图3-1脾气虚动物模型建立过程中大鼠体重变化在整个造模过程中，正常组大鼠的体重持续增加，模型组大鼠的体重持续下降，在造模第十五天模型组大鼠体重与正常组相比呈现显著性差异（P<0.01）。3.4.2.2血常规结果图3-2建模第15天模型组与正常组大鼠血常规结果(**为P<0.01，*为P<0.05)统计结果表明，经过造模因素刺激后模型组与正常组的白细胞数量及淋巴细胞数之间存在显著性差异。模型建立后，大鼠的白细胞数和淋巴细胞数与正常组相比显著减少。34 广东药学院硕士研究生学位论文3.4.2.3D-木糖吸收实验结果图3-3建模第15天两组大鼠血清D-木糖吸收量（**表示与正常组比较P<0.01.）统计结果表明，造模15天后模型组与正常组大鼠的血清D-木糖吸收量有统计学意义。表明施加造模条件后，模型组大鼠对D-木糖吸收的显著下降，表明模型组大鼠的胃肠吸收功能降低。3.4.2.4脾气虚大鼠模型成模的鉴定模型能否建立成功，是后续药效实验成败的关键。脾气虚中医临床的的诊断标准分为两部分：脾虚与气虚两部分。脾虚主症：胃纳减少（食欲减少）、大便异常、食后腹胀。气虚主症：舌淡、苔薄白、脉细弱、体倦乏力、神疲懒言。但是人与动物的临床症状的表现会有一些差异。对于脾气虚动物模型的评估标准主要有：1.泄泻，严重时甚至脱肛；2.食少纳呆；3.形体消瘦、体重减轻；4.精神倦怠、四肢不收、毛色枯槁；5.蜷缩扎堆；6.易疲劳。脾虚与消化系统密切相关，脾虚证是以消化吸收功能低下为主的多器官、多系统功能减弱的综合性病理变化。反应肠道吸收功能的D-木糖吸收试验与脾气虚证相关性，而且经临床重复验证，D-木糖吸收实验是一个反映肠道吸收功能的灵敏指标，已被公认为一个相对特异性和敏感性的诊断脾气虚的参考指标。根据上述脾气虚证动物模型诊断标准观察动物的相关症状，造模过程中模型组大鼠毛发变得直立稀松、无光泽；与正常组大鼠比较模型组大鼠的尾巴细瘦、鼠尾淡白、少有血色；体型瘦削，两侧腹部凹陷，背部微弓，摸之触骨，后期大鼠粪便松软，甚至不成形。模型组大鼠的体重减少，且与正常组比较具有显著性差异。模型组大鼠的白细胞数及淋巴细胞数均与正常组有显著性差异，表明模型35 广东药学院硕士研究生学位论文组大鼠的免疫功能与正常组比较发生了明显的降低。灌胃1h候后的血清中D-木糖含量结果表明，模型组大鼠的小肠吸收功能较正常组大鼠弱。综合大鼠的一般体征变化、体重的变化、血常规的结果和D-木糖吸收实验结果判定模型建立成功。3.4.3药物干预实验结果及分析模型建立成功后，随机将模型组分组，并按相应的给药剂量对各组大鼠进行药物干预，检测相应的指标，各指标的检测结果如下：3.4.3.1体重变化图3-4药物干预过程各组大鼠的体重变化（K：正常组，M：模型对照组，ZH：炙品高剂量组，ZM：炙品中剂量组，ZL：炙品低剂量组，SH：生品高剂量组，SM：生品中剂量组，SL：生品低剂量组。）图3-5药物干预后第15天各组大鼠的体重（**表示与空白组比较，P<0.01，△△表示模型组比较，P<0.01.）36 广东药学院硕士研究生学位论文药物干预后，各给药大鼠体重较给药之前有所增加，且与模型对照组大鼠体重比较有显著差异。3.4.3.2血常规结果图3-6药物干预第15天各组大鼠血常规（*表示与空白组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.05.）药物干预后，各组大鼠的血常规结果中，白细胞数和淋巴细胞数两项指标呈现出有规律的变化（图3-6）。对于大鼠血液中的白细胞数，各组与空白组比较，生品中剂量组、生品低剂量组和模型组与空白组有显著性差异，其余各组均无显著性差异，说明其余各组药物干预之后，使原本低下的白细胞数得到升高，且已回升至正常水平；炙品高剂量组、炙品低剂量组和正常组与模型组之间有显著性差异。药物干预之后，使原本降低的白细胞数得到升高。与空白组有显著性差异而与模型组无显著性差异的给药组，这些组的大鼠的白细胞数量比空白组的低，而比模型组的高，呈现出升高白细胞数量的趋势。淋巴细胞数与白细胞数的统计结果变化一致，与白细胞数呈现现出同样的变化趋势。从生品与炙品给药组的数3737 广东药学院硕士研究生学位论文据结果来看，炙品组的整体药效效果要优于生品组的效果。3.4.3.3细胞因子测定结果将大鼠乙醚麻醉后，眼眶取血，室温自然凝固10-20min，3500r/min离心10min，仔细收集上清液，放至-80℃低温保存。血清上清液取出后，按ELISA试剂盒说明操作，测量各细胞因子的含量。38 广东药学院硕士研究生学位论文图3-7药物干预后第15天各组大鼠血清细胞因子含量（**表示与空白组比较，△△P<0.01，表示模型组比较，P<0.01.）模型对照组和空白组所有检测的细胞因子之间存在显著性差异，模型对照组大鼠IL-1、IL-2、IL-6、和TNF-α显著升高，IL-4、IL-10显著降低。所有给药组与模型对照组和空白组之间都有显著性差异，黄芪生品、蜜炙品水提物能使模型组大鼠升高的IL-1、IL-2、IL-6、和TNF-α降低，使降低的IL-4、IL-10得到升高。39 广东药学院硕士研究生学位论文3.5结果讨论3.5.1脾气虚模型建模方法的选择鉴于脾气虚模型的建模方法较多，一些方法虽然符合中医理论，但是与实际的病因产生不相符，因此不予采纳。一些建模方法由于对实验过程的操作较为严格，不利于实际操作，从实验操作的可行性考虑也不予采纳。如泻下法，一般都是灌胃苦寒药物所致，其对大鼠体内的代谢产物是否有影响，对之后药效试验中的药效指标是否有影响，这些都还不明确，因此为了避免泻下法等造模方法引入的其他药物对体内代谢产物造成影响，本实验采用的是饮食失节加限制饮食加劳倦伤脾的复合因素造模法。单一的造模方法，造模时间稍长，症状也较不明显，复合因素造模，可缩短造模时间，成模症状更加明显，利于症状的观察，有利于确保模型的成功率。3.5.2脾气虚模型的评价脾脏的主要生理功能主要体现在对营养物质的消化、吸收和布散。脾气健运则机体的消化吸收功能正常，才能为化生气、血、津液等提供足够的养料，使全身脏腑组织得到充分的营养，以维持正常的生理活动。脾在体合肌肉、主四肢，脾脏功能正常，则四肢营养充足，肌肉发达，四肢有力。脾脏功能失调，机体的消化吸收功能失常，会出现腹胀、便溏、食欲不振以至倦怠、消瘦等现象。脾有生血和统摄的血液的功能，脾气健运，水谷运化正常，则气血旺盛，血液充足。脾失健运，生血物质缺乏，则血液亏虚，面、唇、舌、爪甲淡白等血虚征象。发为血之余，血液亏虚，发失濡养，因此毛发枯槁无泽。脾脏是人体最大的免疫器官，对机体的免疫功能起重要的调节作用，若脾脏的功能受到影响，则机体的免疫功能必然会受到影响。血液中的白细胞数和淋巴细胞数能直观的反应的机体的免疫功能，因此本实验采用测定血常规的方法测定血液中的白细胞数和淋巴细胞数，来判断大鼠免疫功能的异常。根据中医有关脾脏理论的指导及预实验的结果，最终确定了模型建立成功的判定指标：一般的体征变化，包括：毛发、大便情况、耳尾颜色、有无拱背、形体消瘦、体重减轻；血液血常规检测；血清D-木糖吸收率。模型建立过程中，根据以上这些检测指标判定模型是否建立成功。3.5.3蜜炙黄芪对脾气虚证的药效学评价黄芪补中益气的功效，能提高人体的免疫功能。现代药理研究认为，黄芪能40 广东药学院硕士研究生学位论文作为一种免疫调节剂，增强机体免疫功能。而本实验选择的药效指标与机体的免疫功能密切相关。IL-1是由活化的巨噬细胞所产生的在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，能刺激参与免疫反应的细胞的增殖、分化并提高相应免疫细胞的功能。IL-2是T细胞生长因子，能促进T细胞增殖活化，能增强T细胞的杀伤活性。IL-4能刺激活化B细胞，促进T细胞分化。IL-6可由多种免疫细胞产生，能诱导B细胞分化；促进T细胞增殖；促进骨髓造血干细胞增殖；增强血细胞分化。IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，它可以调节免疫细胞的生长与分化，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。TNF-α具有杀伤和抑制肿瘤细胞的作用，促进中性粒细胞吞噬，促进巨噬细胞分化，促进细胞增殖和分化，与某些自身免疫病有关，是重要的炎症因子。许多疾病的发生与发展与机体内的细胞因子的表达失调密切相关。药效实验结果中，模型组大鼠的IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α的含量要显著高于正常组，而IL-4、IL-10的含量显著低于正常组。有研究[118]发现脾虚患者IL-6升高，sIL-6R增多，IL-6mRNA呈高表达水平。许多研究报告IL-6在某些疾病中是关键的炎症因子，IL-6基因的异常表达和某些疾病的发病有关。IL-6mRNA在脾虚患者外周血单个细胞中的高水平表达可能反映IL-6与脾虚证的发病有关。IL-6的膜受体可以向体液中廓清形成sIL-6R，并与膜受体竞争结合IL-6，抑制IL-6R介导的生物学效应，也可保护IL-6不被降解，并进一步与膜上信号转导蛋白结合。研究证实IL-6具有免疫损伤作用，而IL-6本身诱导B细胞的增殖和分化，IL-6的升高可能会引起组织损伤。另有研究表明，脾虚证血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)水平明显高于正常人[119]。由于血清中sIL-2R与膜IL-2R竞争结合体液中的IL-2，从而抑制已活化T细胞的增殖和功能，从而影响机体正常免疫功能的发挥。sIL-2R与IL-2的结合可延长IL-2的t1/2，因此血清中的IL-2的含量可能会有一定的升高。脾气虚证涉及消化系统的黏膜吸收、分泌运动和屏障功能，能量代谢，胃肠道激素，神经介质，细胞因子以及免疫反应等多个方面。有研究表明口服黄芪提取物能使肠炎患者异常升高的TNF-α、IL-1和异常降低的IL-10得到恢复[120]。脾气虚证的消化吸收功能产生异常，而异常升高的TNF-α、IL-1可能会对肠道黏膜造成损伤，使肠道的吸收功能减弱，而IL-10能抑制促炎因子的释放，IL-10的异常降低，会削弱这种抑制作用，进而可能加重肠道黏膜的损伤，从而影响脾气虚41 广东药学院硕士研究生学位论文患者的胃肠吸收功能。IL-2为Th1细胞因子，IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α为Th2细胞因子，当机体正常时，Th1/Th2细胞功能处于动态平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能；当机体受到刺激时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高，另一亚群功能降低，Th1/Th2细胞功能的平衡被打破，即Th1/Th2漂移，机体正常的免疫功能会发生紊乱。模型组大鼠的IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α的含量显著高于正常组，而IL-4、IL-10的含量显著低于正常组，产生Th1/Th2漂移，表明模型组大鼠的免疫功能已经发生了紊乱，而经药物干预之后，各细胞因子的表达都得到恢复，Th1/Th2细胞功能重新恢复至动态平衡状态，机体的免疫功能亦恢复至正常状态。模型组大鼠白细胞数减少，表明模型鼠的非特异性免疫功能减弱。从细胞免疫来看，淋巴细胞数量减少，转化或增殖能力下降，T细胞亚群的平衡状态遭到破坏，导致了细胞免疫功能的紊乱。而在药物干预之后，大鼠的白细胞数和淋巴细胞数都得到回升，表明药物干预能恢复模型鼠紊乱的免疫功能。本实验脾气虚造模过程中，大鼠体内的细胞因子表达异常，白细胞和淋巴细胞数显著下降，表明机体的免疫系统发生了紊乱。《黄帝内经》云：“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”。明确指出了“气”与机体免疫功能的内在联系。中医的“脾”与机体的免疫功能有密切的关系,研究发现脾虚证患者及动物模型均存在不同程度的非特异性免疫、细胞免疫功能低下,体液免疫功能紊乱,消化道局部免疫功能下降等异常。而药物干预后的统计结果表明，药物干预后，大鼠体内异常表达的细胞因子的含量得到了有效的调节，使得这种异常表达趋于正常。且炙品组与生品组的整体的药效比较，炙品组的效果优于生品组。药物干预后对于脾气虚证产生的免疫功能紊乱有明显的调节作用，且炙品组的调节作用优于生品组。3.6本章小结本研究采用限制饮食加饮食失节加劳倦伤脾法建立脾气虚大鼠模型。与正常组大鼠相比，模型组大鼠体重明显减少，体征变化与正常组差异明显，血液常规检查结果中白细胞数与淋巴细胞数显著降低，D-木糖吸收率显著降低。以上结果表明模型组大鼠出现脾气虚的相关症状，提示脾气虚模型建立成功。黄芪蜜炙品、生品水提物干预后模型组大鼠的体重、白细胞数和淋巴细胞数得以恢复，且蜜炙品效果优于生品。42 广东药学院硕士研究生学位论文模型组大鼠IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α的含量要显著高于正常组，而IL-4、IL-10的含量显著低于正常组。黄芪生品、蜜炙品水提物能使模型组大鼠的IL-1、IL-2、IL-6、和TNF-α降低，而IL-4、IL-10显著升高，且炙品组的整体药效优于生品组。黄芪蜜炙品较生品能更好地改善脾气虚大鼠的相关生理生化及免疫学指标，推测蜜炙黄芪发挥药效作用与其调节脾气虚大鼠的相关细胞因子的表达及提高免疫力相关。第四章结论、创新点与展望4.1结论本课题采用UPLC/Q-TOFMS对黄芪蜜炙前后水提物中的化学成分进行快速全面分析，并对各成分蜜炙前后的含量差异情况进行分析。成分分析共鉴定了化合物35个，其中黄酮类17个，包括3个异黄烷类和5个紫檀烷类；皂苷类13个。利用多元统计分析筛选出9个蜜炙前后具有显著变化的差异性化学成分。黄芪蜜炙后主要是化学成分的含量发生了变化，总皂苷类的含量升高，提示黄芪蜜炙有利于其皂苷类成分的溶出，加热过程可能造成某些基团的丢失而产生一些化合物含量的变化。筛选得到的9个蜜炙前后差异性化学成分，可能是蜜炙黄芪补中益气作用的药效物质基础。脾气虚动物模型研究结果显示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠体重显著降低，白细胞数和淋巴细胞数均显著减少，血清中D-木糖吸收量显著降低，并出现毛发枯槁、形体消瘦、弓背、鼠尾无血色等一系列脾气虚证症状。经黄芪蜜炙品、生品水提物干预后，模型组大鼠的体重、白细胞数和淋巴细胞数得以恢复，且蜜炙品效果优于生品。在细胞因子的测定结果中，黄芪生品、蜜炙品水提物能使模型组大鼠的IL-1、IL-2、IL-6、和TNF-α降低，而IL-4、IL-10显著升高，能回调模型组大鼠中异常表达的细胞因子，调节脾气虚大鼠的免疫功能，且黄芪蜜炙品较生品能更好地改善脾气虚大鼠的相关生理生化及免疫学指标。因此推测蜜炙黄芪对脾气虚大鼠药效作用的发挥与其调节相关细胞因子的表达及提高免疫力相关。4.2创新点1.首次采用HSST3色谱柱对蜜炙黄芪水提物的化学成分进行快速全面的43 广东药学院硕士研究生学位论文UPLC/Q-TOFMS分析，运用代谢组学模式识别方法比较了蜜炙黄芪炮制前后化学成分的变化，初步筛选了蜜炙前后的差异性化学成分。2.首次结合免疫相关生化指标评价蜜炙黄芪干预脾气虚大鼠模型的药效作用，揭示蜜炙黄芪补中益气的作用机制。4.3展望后续试验拟进一步应用UPLC/Q-TOF-MS技术和化学计量学手段，研究黄芪蜜炙前后有效成分作用于脾气虚模型的吸收、代谢情况，黄芪及蜜炙黄芪水提物干预脾气虚大鼠血清中内源性代谢物的变化规律，建立炮制前后引起体内变化的代谢物和免疫相关生化指标的关系，研究药物干预后的药效结果与代谢标志物之间的联系，进一步揭示黄芪蜜炙前后的药效作用差异。44 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广东药学院硕士研究生学位论文致谢在本课题完成之际，衷心感谢我的导师陈宏远、芮雯老师对我学习和生活的精心指导和谆谆教诲。感谢中心实验室冯毅凡教授、孟青老师、郭晓玲老师、石忠峰老师、吴霞老师、梁汉明老师和钟艳梅老师对我三年学习生活的悉心指导和热情帮助！感谢皮娟娟、赵丽芳、佘琴、彭海博、杨世添和田旭岩等同学给予的真诚帮助和关心！感谢师妹张彩云、曾平燕，符吴萸、阮碧波、佘玉奇、廖婧竹、廖双叶、黄晶和张国改，师弟郑起帆、周朋君在实验过程中给予的帮助！感谢中心实验室所有给予我帮助的老师和同学！感谢所有给予我指导、帮助和关心的朋友们！感谢室友三年来对我的包容与谅解！最后，深深感谢我的家人在我多年求学中对我的鼓励、支持和理解！55