三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩增方法的建立 70页

＼＇，（＼分类号：Ｓ８９１１０３８９单位代码：密级：学号：１１２０７４４０１２福建农林大学硕士学位论文－、Ｉ■ｉ三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩增方法的建立＿学科门类：农学一级学科名称：畜牧学二级学科名称：特种经济动物词养研究方向：蜜蜂饲养与繁育研究生姓名：庄明亮指导教师：梁勤教授二—０兒成时间：五年四月？？：广；＿－Ｖ Ｓ８９１单位代码１０３８９分类号：：密级：学号：１１２０７４４０１２福建农林大学领士学位论文三种常见蜜蜂病毒环介导等温扩堪方法的建立学科门类：农学一级学科名称：畜牧学二级学科名称：特种经济动物饲养研究方向：蜜蜂饲养与繁育研究生姓名：庄明亮指导教师：梁勤教授二—完成时间：０五年四月 ＇ＴｈｅＴｈｅｓｉｓｏｆＦＡＦＵｓＭａｓｔｅｒＳｔｕｄｅｎｔＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｒｅｅｃｏｍｍｏｎｂｅｅｖｉｒｕｓ－ｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｐｐＤｅｒｅｅｃａｔｅｏｒ：ＡｒｏｎｏｍｇｇｙｇｙＴｈｅｎａｍｅｏｆｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ：ＺｏｏｔｅｃｈｎｙＴｈｅｎａｍｅｏｆｍａｏｒ：ＳｅｃｉａｌＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌＲａｉｓｉｎｊｐｇＲｅｓｅａｒｃｈｆｉｅｌｄ：ＢｅｅＲａｉｓｉｎｇａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇＳｔｕｄｅｎｔｎａｍｅ：ＺｈｕａｎｇＭｉｎｇｌｉａｎｇＳｕｅｒｖｉｓｏｒ：Ｄｒ．ＬｉａｎｉｎＰｒｏｆｅｓｓｏｒｐｇＱ，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｉｍｅ：Ａｒｉｌ２０１５ｐ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＦＡＦＵ） 独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答激的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果一。与我同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。＞（４学位毕业＞论文作者亲笔签名：期：２０丨５／之今＜美戶；卑乂式论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印。、缩印或其他复制手段保存论文保密，在年后解密可适用本授权书。口不保密，本论文属于不保密。学位（￥４ｋ）论文作者亲笔签名：么日期：Ｚ０Ｉ５０＾＾４４指导教师亲笔签名曰期：（Ａ 目录ＩｍｍＡｂｓｔｒａｃｔＩｌｌ１脂１１１２．蜜蜂三种病毒研究进展１．１．１蜜峰病害２１．１．２蜜蜂病毒的分类及其分子生物学２１．１．３蜜蜂三种病毒的危害和发病特征５１．１．４三种病毒的传播７１．１．５三种病毒病的诊断方法９１．２环介导等温扩增技术１０１１ＬＡＭＰ．２．技术原理１１１２２ＡＭＰ１．．Ｌ反应特点１１２３ＬＡＭＰ１１．．的应用１１２．３本研究的目的和意义２材料和方法１３２．１１３２１１．．１供试材料３２１．１．２主要试剂与配制３２１．３主要仪器１５．２．２试验方法１６２．２．１引物设计与合成１６２．２．２蜜蜂ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成１７２．２．３ＬＡＭＰ检测蜜蜂三种病毒方法的建立１８２．２．４ＬＡＭＰ体系优化１９１２．２．５扩增区域的克隆测序２４２．２．６敏感性和特异性试验验证２２．２．７临床样本的检测２４３２４３．１应用ＬＡＭＰ检测ＢＱＣＶ的研究结果２４ Ｖ－３．１．１ＢＱＣＬＡＭＰ反应体系的优化２４－３．１．２ＢＱＣＶＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应与鉴定２５３．１．３ＬＡＭＰ与ＰＣＲ的敏感性对比试验２７３．１．４可视化ＬＡＭＰ的特异性试验２８３．１．５临床样本的检测２９３．２应用ＬＡＭＰ检测ＳＢＶ的研究结果３２－３．ＬＡＭＰ反应．２１ＳＢＶ体系的优化３２－３ＳＬＡＭＰＰＣＲ反３．２．２ＢＶ外引物的应与鉴定４３．２．３ＬＡＭＰ与ＰＣＲ的敏感性对比试验３５３．２．４可视化ＬＡＭＰ的特异性试验３６３．２．５临床样本的检测３７３．３应用ＬＡＭＰ检测ＤＷＶ的研究结果３９－３．３．１ＤＷＶＬＡＭＰ反应体系的优化３９Ｖ－３．３．２ＤＷＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应与鉴定４１Ｐ３．３．３ＬＡＭ与ＰＣＲ的敏感性对比试验４２３．３．４可视化ＬＡＭＰ的特异性试验４３３．３．５临床样本的检测４４４舰４６４．１关于ＬＡＭＰ引物设计的讨论４６４．２关于ＬＡＭＰ体系优化４７４．３关于ＬＡＭＰ产物验证４８４．４关于ＬＡＭＰ结果观察４８４５－－－ＢＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ．ＱＣＶＬＡＭＰ、ＳＢＶ体系的优势４９４．６本研究的展望４９５１ｍ．ｍ６０ 摘要蜜蜂是重要的授粉昆虫，对整个自然生态系统有着不可取代的作用。蜜蜂黑蜂王台病毒（ｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓＢＣＶ）、ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｍｓ，ＤＷＶ）、ｑ，Ｑ蜜蜂残翅病病毒（ｇ蜜蜂囊状幼虫病毒（ｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓＳＢＶ）是常见并且对蜜蜂危害严重的蜜蜂病毒。，常用的检测方法有分子生物学、症状、免疫学等。但这些方法在仪器、技术等方面有特别的要求一，实用性不强。因此针对ＢＱＣＶ、ＤＷＶ、ＳＢＶ建立种快速、敏感性高、特ｌ－ｍｅｄ异性强、无需专用设备的实用性检测方法是有必要的。环介导等温扩增技（ｏｏｐｉａｔｅｄｓｏ一ｔｅｒｔＬＡＭＰｉｈｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｉｏｎ在等温条件下，仅需要个水浴锅在１ｈ内就可完成反＾）应，通过突光染料即可观察结果，具有快捷、简便的特点。－－ＶＬＡＭＰ、ＤＷＶ－ＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ本研究建立并优化了ＢＱＣ，验证特异性并与常规ＰＣＲ技术对比验证敏感性，并分析其与ＰＣＲ检测临床样本的差异。主要研究结果：立并优化了－－－－１）建ＢＱＣＶＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ，优化后的ＢＱＣＶＬＡＭＰ２＋体系外、内引物比为１：３，甜菜碱浓度为０．８ｉｍｎｏｌ／Ｌ，Ｍｇ浓度为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，在６３°Ｃ４－ＬＡＭＰ条件下反应５ｍｉｎＳＢＶ１：２，０．６ｍｍｏｌ／；体系外、内引物比为甜菜碱浓度为Ｌ，２＋°浓度为２５－ＬＡＭＰＭ．０ｍｍｏｌ／Ｌ在６３Ｃ条件下反应４ｍｉｎ；ＤＷＶｇ，体系外、内引物比２＋°为１：４，甜菜碱浓度为０．６ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ浓度为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，在６３Ｃ条件下反应６０ｍｉｎ。－－２）Ｂ－ＬＡＭＰＢＣＶ、ＤＷＶＱＣＶ、ＤＷＶＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ均只有对Ｑ、ＳＢＶ出现多梯形条带－ＬＡＭＰ的，特异性好。ＢＱＣＶ灵敏度可达８６ｆｇ的ＲＮＡ模板，常规ＰＣＲ８．６－－ＲＮＡ模板ＶＬＡＭＰ的灵敏度比ＢＶ－１００ＬＡＭＰｐｇ的，说明ＢＱＣＰＣＲ的要高倍ＳＢＶＱＣ；３ｆＡ－的灵敏度可达９的ＲＮ模板．９３ＮＡＢＶＬＡＭＰｇ，常规ＰＣＲ０ｐｇ的Ｒ模板，说明Ｓ－ＰＣＲ的要高－ＮＡ的灵敏度比ＳＢＶ１０倍；ＤＷＶＬＡＭＰ的灵敏度可达８．９ｆｇ的Ｒ模板，ＰＣＲ９ＲＮＡ模板ＤＷＶ－－ＰＣＲ常规８．ｐｇ的，说明ＬＡＭＰ的灵敏度比ＤＷＶ的要高１００倍．３）Ｖ－ＬＡＭＰ临床检测：用ＢＱＣ方法检测中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本各２０份，其中阳性数量分别为５和１５，阳性检测率分别为２５％和７５％；ＰＣＲ方法检测同样中华蜜蜂和意大利蜜蜂样本，阳性数量分别为３和１１，阳性检测率分别为１５％和５５％。Ｉ －ＬＡＭＰＳＢＶ方法检测２０１２６０％份中华蜜蜂样本，阳性数量分别为，阳性检测率分别为；ＰＣＲ检测同样２０份中华蜜蜂样本，阳性数量分别为９，阳性检测率分别为４５％。－ＬＡＭＰ方法检测２０份意大利蜜蜂样本ＤＷＶ１１，阳性数量分别为，阳性检测率分别为５５－ＰＣＲ方法检测同样２０份意大利蜜蜂样本％；ＤＷＶ，阳性数量分别为７，阳性检测－ＬＡＭＰ－－率分别为３５％。ＢＱＣＶ、ＤＷＶＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ三种检测方法均比相应的常规ＰＣＲ方法检测率高。关键词：黑蜂王台病毒；囊状幼虫病毒残翅病毒介导等温扩增检测；；环；ＩＩ ｌ－ＴｈｔｉｈｍｅｎｔｂｉｉｉｈｅｒｍａｌａｍｉｅｅｓａｂｓｏｆｔｉｉｒｅｅｏｎｅｅｖｒｕｓｌｍｅｄａｔｅｄｓｔｌｆｉｃａｔｉｏｎｔｈｃｏｍｍｏｏｐｏｐｍｅｏｄＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｂｅｅｓａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｏｌｌｉｎａｔｏｒｓｉｎｎａｔｕｒａｌｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌａｃｋｑｕｅｅｎｂｅｅｖｉｒｕｓｅｓ（ＢＱＣＶ），ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｇｖｉｒｕｓＤＷＶａｎｄｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓＳＢＶａｒｅｃｏｍｍｏｎａｔｈｏｅｎｓａｎｄｈａｒｍｆｕｌｔｏｈｏｎｅ（），（）ｐｇｙｂｅｅ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎｍｅｔｈｏｄｓｓｕｃｈａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｓｍｔｏｍｓ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｅｄｇｙ，ｙｐｇｐｔｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｅｓｅｖｉｒｕｓ．ＢｕｔｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｓｏｍｅｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓｕｃｈａｓｓｐｅｃｉａｌｒｅｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｎｑｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｔｅｃｈｎｈｔｉＴｈｅｔｌｉｉｉｏｌｏｇｙｔｅｄｅｔｅｃｏｎｓｅｃｉｆｉｃｉｔｙｗａｓｎｏｔｉｄｅａ．．ｅｒｅｆｏｒｅｓａｂｓｈｎｒａｄ，ａｎｄｐ，ｇａｐ，ｈｉｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｓｔｒｏｎｓｅｃｉｆｉｃｉｔｎｄｗｉｔｈｏｕｔｓｅｃｉａｌｅｑｕｉｍｅｎｔａｒｅｄｅｓｒａｔｌｎｅｅｄｅｄｆｏｒｒｔｉｌｇｙ，ｇｐｙ，ａｐｐｐｅｅｙａｃｃａｐ－ｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｅｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｕｅｓｃａｎｂｅｅｒｆｏｒｍｅｄｐｑｐ－ｗｕｎｄｅｒｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｃｏｎｄｉｔｎｔｒｂａｈｗａｉｔｈｈｅｔｉｌｔｂｉｍｉｏ，ｓｕｃｈａｓｉｎｗａｅｔｔｅｒ，ｔｐｏｔｅｎａｏｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｂｅｅｖｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｄｅｓｔｉｎｅｄｔｏｓｅｔｕｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒｓｐｅｃｉａｌｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｅＢＱＣＶ，ＤＷＶａｎｄＳＢＶｉｎｈｏｎｅｙｂｅｅ，ａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＬＡＭＰｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．Ｌａｓｔｌｙ，ｔｈｅｐｒａｃｔｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｃｏｍａｒｉｎｗｉｔｈｃｏｍｍｏｎＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．ｐｇＴｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：－－－ｗｅｒｅ１ＴｈｅＢＱＣＶＬＡＭＰＤＷＶＬＡＭＰＳＢＶＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｓｓｔｅｍｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄ），，ｙｙｏｍｚｅｄｚｅｄａｒａｒＢＣＶ－ｗｅｒｗｕｎｎｅｒｒｓｐｔｉｉ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｐｍｅｔｅｒｆｏＱＬＡＭＰｅａｓｆｏｌｌｏｓｔｈｅｏｔｅｒａｎｄｉｐｒｉｍｅｒａｔｉｏｉｌｉｉ１３ｂｔｒｉｓ０．８ｍ／Ｌｎｅｕｍｃｏｎｎｔｒａｔ．０ｍｍｌ／Ｌｗａｓ：，ｅｔａｎｅｃｏｎｃｅｎａｔｏｎｗａｍｏ，ｍａｇｓｃｅｏｎｗａｓ２ｏ，ａｎｄｔｈｅ＂ｒｅａｈｅＢＶ－ＬＡＭＰｃｔｉｏｎｗａｓｋｅｐｔａｔ６３Ｃｆｏｒ４５ｍｉｎＴｏｔｉｍｉｚｅｄａｒａｍｅｔｅｒｆｏｒＳｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｔｈｅｏｕｔｅｒ；ｐｐａｎｄｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒｓｗａｓ１：２，ｂｅｔａｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ２．０＂ｗＷＶ－ａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｏｎ６ｏｒ４５ＡＭＰｗｒｍｍｏｌ／Ｌｉａｓｋｅｐｔａｔ３Ｃｆｍｉｎ．ＴｈｅｏｔｉｍｉｚｅｄａｒａｍｅｔｅｒｆｏｒＤＬｅｅ，ｐｐａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｔｈｅｏｕｔｅｒａｎｄｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒｓｒａｔｉｏｗａｓ１：４，ｂｅｔａｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ。．ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ２ｌ／Ｌｅａｃｔｉｏｎｗａｋｔ６３Ｃｆｏｒｉ．０ｍｍｏａｎｄｔｈｅｒｓｅ６０ｍｎ，ｐ－－２ＴｈｅｄｅｅｃｏｅｄＬＡＭＰＤＷＶ－ＬＡＭＰＶｒ）ｔｅｃｔｉｏｎｓｐｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｐＢＱＣＶ，，ＳＢＬＡＭＰｗｅｅ－ｃｅｒｔｉｆ．ＦｕｒｔｈｒｍｏｒｅｔｈｓｉｏｆＢｕｌｄｄｔｌｆＲｉｃａｔｅｄｅｅｅｎｓｉｔｉｖｔＬＡＭＰｃｏｅｔｅｃａｓｏｗａｓ８６ｏｆＮＡｔｅｍｌａｔｅ，ｙＱＣＶｇｐ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲｗａｓ８．６ｐｇｏｆＲＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ，ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆ－－ｉｓ１００ｉｍｅｓｈ－ｃｏｍｍｏｎＰｍｅｓＢＶＢＱＣＶＬＡＭＰｔｉｈｅｒｔｈａｎＣＲｔｈｏｄＴｈｅｓｅｎｉｔｉｖｉｔｏｆＳＬＡＭＰｌｄｇ；ｙｃｏｕｄｅｔｅｃｔａｓｌｏｗａｓ９３ｆｇｏｆＲＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲｗａｓ０．９３ｐｇｏｆＲＮＡＩＩＩ 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福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究１引言授粉昆虫是农业和自然生态系统中的关键因子，昆虫的授粉行为对于维护植物多样⑴性和农业生产种植都是必不可少的环节。对于维护地球上粮食生产也有有着至关重要２［］的作用，有关数据表明全球３５％的食物来自于授粉昆虫作用的作物，２００５年因授粉昆３［］虫增值的农产品估价１５３０亿欧元。蜜蜂是自然界最为重要的授粉昆虫，在长期的适应性进化中发展了独特的外部结构，如覆盖整个躯干的绒毛、特化后足的花粉筐。一蜜蜂同其他动物样会受到寄生虫、真菌、细菌、病毒等多种病害的侵袭，由于现如今国际间蜜蜂及产品贸易往来的频繁，使得原来区域性的蜜蜂病害迅速扩展成全球性病害，威胁着蜜蜂的安全生产。在蜜蜂的多种病害中，病毒病虽然发现较早，而近年才４［］Ｃｏ弓。ｌｏｎＣｏｌｌａｐｓｅＤｉｓｏｒｄｅｒ丨起人们的重视在２００６年欧洲和北美爆发蜂群崩溃症（ｙ，ＣＣＤ），随着研究人员不断深入研究，发现蜜蜂病毒病可能作为其发生的重要因素，蜜蜂病毒病至此才被重视。ｔ５】、蜜蜂病毒可以侵染任何级型和发育阶段的蜜蜂个体，并且可以在蜜蜂巢脾食物６［］和蜂群寄生虫中检出。少数病毒侵染蜜蜂个体会表现出典型症状，多数情况下病毒长７８［，］期以隐性侵染方式存在于蜂群中。在特定的条件刺激下，蜜蜂病毒可能被激活，迅速复制表现出极强的致病性，给养蜂生产带来极大危害。９２［］到目前为止从蜜蜂个体分离并鉴定出０种蜜蜂病毒。在ＧｅｎＢａｎｋ有全基因组序列公布的有蜜蜂囊状幼虫病毒（ｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓＳＢＶ）、蜜蜂急性麻搏病毒（ａｃｕｔｅｂｅｅ，ａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓＡＢＰＶ）、蜜蜂黑蜂王台病毒（ｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓＢＱＣＶ）、蜜蜂残翅ｐ，ｑ，病病毒（ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｍｓＤＷＶ）、蜜蜂克什米尔病毒（ＫａｓｈｍｉｒｂｅｅｖｉｒｕｓＫＢＶ）、ｇ，，（ｃｈｒｏｎｉｃｂｅｅａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓＣＢＰＶ）。无论中山大学还是中国农科院蜜蜂慢性麻痹病毒，ｐｙ蜜蜂研究所做的局部地区蜜蜂病毒的普查工作均显示ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ对蜂群的感染率都较高。可以推测在全国范围内这三种病毒也是蜂群中主要感染的病毒。ＢＱＣＶ和微孢子虫联合（Ｎｏｓｅｍａｓｐ．）侵染时会表现出极强的致病性；囊状幼虫病是中华蜜蜂一ｉＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａ）饲养中危害最强最为主要的病害，旦大面积爆发会导致整个蜂场毁灭，随；残翅病往往与瓦螨共同流行爆发着瓦螨的流行残翅病依然成为烈性传染性疾病。。所以本研究选择这３种病毒作为研究对象１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究（ｏ－ｍｅｄｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｃａｏｎＬＡＭＰ环介导等温扩增技术ｌｏｐｉａｔｅｄｉｓｐｉｆｉｔｉ）是日本学者，Ｎｏｔｏｍｉ等于２０００年研发的全新等温核酸扩增方法该技术可以在恒温条件下完成自动循环的链置换反应〗，小时以内复制大量的紀基因序列。具有操作方便、灵敏度高、、仪器要求简单等优点在疾病的诊断和预防、特异性强、转基因产品的检测动物胚胎性别的鉴定和核酸的研究等得到了广泛的应用。１１三种病毒的研究进展．蜜蜂１．１．１蜜蜂病害蜜蜂的传染性病源病毒、细菌、真菌、微生物、螨类等。由病原微生物引起的病害１５［］叫传染病，由原生动物或寄生动物引起的病害叫寄生虫病。１．１．１．１蜜蜂细菌性病害从细菌的外观来说它的基本形态包括球菌、杆菌、螺旋菌三大类。有些细菌长有鞭一般具有较强的运行性、两端丛生鞭毛，。鞭毛生长位置分为单生鞭毛、单端丛生鞭毛毛、两端生鞭毛和周生鞭毛细菌的革兰氏染色可以作为防治病害选择抗菌药物的依据。美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病对蜂群的危害最严重。？欧洲幼虫腐臭病侵染小于２日龄的小幼虫，使病虫在３５日龄大量死亡。我国在上１７［］个世纪５０年代初最先在广东发现随后蔓延至全国。中华蜜蜂的受侵害程度比较严重。表现的主要症状为患病幼虫体色由珍珠白慢慢变色直至黑褐色，最后在巢房底部腐烂干“”枯变成无粘性的虫尸，腐烂的过程会有难闻的酸臭味。严重时巢脾会出现花子现象，同时出现只见卵却不见幼虫的情形。欧洲幼虫腐臭病同样是针对蜜蜂幼虫的病害，被感染的幼虫平均在１２．５天体色发生变化，同样由珍珠白直至黑褐色最后变成鳞片状物附与巢房底。１１１．．．２蜜蜂真菌性病害真菌是有细胞器和细胞核，没有叶绿素的真核生物，进行无性和有性繁殖，抱子和ｉｓｌ】菌丝是其基本形态。细胞壁含有纤维素和甲壳质，对抗外界逆性因素有很强抵抗能力，Ｘ射线和紫外线均不能将其杀死，但在ｌｏｃｒｃ条件下短时间可以杀死大部分孢子和真菌。常见的蜜蜂真菌性病害有蜜蜂白至病、蜜蜂黄曲酶病、蜂王黑变病、微抱子虫等。２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术Ｐ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究（ＬＡＭ（蜜蜂白里病是由蜜蜂球囊菌＾Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）引起的最为常见的真菌性病害蜂群９１］内通过孢子来进行传播［丝体也可以直接感染幼虫孢子的在花粉中存活可以，菌达到一１年之久，在蜂箱中存活时间更长。发病流行期般在多雨潮湿温度变化大的春季，通气不良，边脾受冻都会促进病害的发生。蜜峰幼虫吃进孢子及初夏，蜂箱水分过大，１天内孢子就会萌发，菌丝生长过程中吸收幼虫体内营养并不断分泌毒素，造成蜜蜂幼虫组织和细胞解体，最终死亡。死亡的幼虫尸体会呈现白色粉笔样物体或深褐色的干尸两种状态，蜂群中的雄蜂幼虫比工蜂幼虫更容易受到侵害。在重病蜂群摇动巢脾会发出Ｐ２］响声。１．１．１．３蜜蜂病毒性病害病毒不具有有细胞核、核糖体细胞质和细胞膜等结构，无核糖体，无酵系统，并且一ＤＮＡ大多数病毒只具有种核酸（ＲＮＡ或）和蛋白质衣壳，其增值完全依靠寄主。１．１２蜜蜂病毒的分类．及其分子生物学特性９２０丨］到目前为止从蜜蜂个体分离并鉴定出种蜜蜂病毒。蜜蜂病毒只有虹彩病毒（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）和丝状病毒（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｖｉｒｕｓ，ＡｍＦＶ）是ＤＮＡ２３．２４［］病毒，其余均是单链ＲＮＡ病毒。ＳＢＶ、ＤＷＶ属于传染性软腐病毒属（Ｉｆｌａｖｉｍｓ）；ＢＱＶ、ＩＡＰＶ、ＡＢＰＶ、ＫＢＶ属于双顺反子病毒科（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）。现在分离鉴定的Ｃ＇一１）５蜜蜂病毒具有以下特征：ＲＮＡ的端以共价键的形似连接个病毒蛋白，会产生激活病毒复制的引物２ＲＮＡ的＇）包裹在蛋白质衣壳的单链ＲＮＡ３）３端连接有腺；；４＇苦酸残基构成的长尾结构）ＲＮＡ的５端有非翻译区含有十字交叉的二级结构５）；；＇ＲＮＡ的一个颈环结构３端进行复制时可以形成。１１２１．．．传染性软腐病毒科ＩＣＴＶ２００５ＳＢＶ在最新的第八次报告（年）中给出了最新的病毒分类，以为代表２５创立了新属传染性软腐病毒属［】（Ｉｆｌａｖｉｍｓ）到目前为止明确的有ＳＢＶ、家香传染２６［］性软化病（ＢｏｍｂｙｘｍｒｉｏｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｆｌａｃｈｅｒｉｅｖｉｒｕｓＢｍｌＦＭ）、ＲＮＡ病毒，榕透翅毒蛾小２７２８［］［］ｅ－（ＰｒｉｎａｎｕｄａｉｃｏｍａｌｅｖｉｒｕｓＰｎＰＶ。、ｐｉｋ）除此之外还有很多潜在的病毒，ＤＷＶ，［２９１Ｖａ－ｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒｖｉｍｓＶＤＶ１）、Ｋａｋｕｏ（Ｋ：Ｖ）甘蓝崎虫狄斯瓦螨病毒（病毒，ｇ３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检測常见三种蜜蜂病毒的研究病毒（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅｂｒａｓｓｉｃａｓｅｖｉｒｕｓ，ＢＲＢＶ）根据保守区域进行进化树分析，得出了３１】Ｄ［ｉｄｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｆｌａｖｉｍｓ、ｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ病毒间的进化关系（图Ｉ）。ｐ？Ｂ＾ｆｉＶＶｃＰＶＨＰ．ｒＨ６？ＫＶｆ１１［ａｗ？－Ｖ０Ｖ．１？４「Ｌ，１１．ＩＦＶ．．－ｆｉＬＩ辦ｐ鄉ＰＶｒｉａＬ相ＰｉＭａＭＭＨｗＳｉｍｍＷｒｙｉＱ＾＾ｉａｌｐｖＤｋ＾＾ｖｉｒｋｉＭＢＬｓｓｊＩＤＣＶ？ｍ．ＰＶ１９０１ｗ｜卿，，？ｖ＾ｓｉＩＰｉａｅｍｔａｍｉｃ＾ｍ“■丨＾ｅｓｆｉｖｔｅｆ傑ＶＴ２｜ｌ＾ＥＭＣＶｍ热ｆＩ』ｉｉＰＶ—＝？ｖ图１Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｆｌａｖｉｍｓ、Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ病毒的ＲｄＲｐ序列进化树分析（Ｅｕｅｎｅ，２００７）ｇＦｉｕｒｅ１ＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅＲｄＲｏｆｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、ＩｆｌａｖｉｍｓａｎｄＰｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（Ｅｕｅｎｅ２００７）ｇｙｇｙｐｇ，３２［］一其结构和小ＲＮＡ病毒科非常相似，Ａ都是单链ＲＮ，为单顺反子基因组，具有＇个大的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓＯＲＦ），两侧是ＮＣＲ，编码多聚蛋白。从５，＇端到３端分别是解旋酶（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、蛋白酶（ｐｒｏｔｅａｓｅ）和聚合酶（ＲｄＲｐ）的排列顺３３＇［］序的非结构蛋白。通过５端先合成聚合蛋白单元，然后再被水解成多个功能蛋白单一一元。大约半功能蛋白用来合成病毒衣壳蛋白，而另半水解蛋白则参与病毒基因的复制，因其不具有帽子结构，所以它的翻译机制与小ＲＮＡ病毒基本相似。１．１．２．２双顺反子病毒科４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ｅｔａｒａ－双顺反子病毒科最初因螺摔麻瘦样病毒（ＣｒｉｃｋｌｓｉｓｌｉｋｅｖｉｍｓｅＣｒＰＶ）而被大ｐｙ，家所知一，在２００２年得到国际病毒分类委员会的认可。作为无脊椎动物病毒家族的员同属单链ＲＮＡ病毒。其拥有两个被ＩＧＲ隔开的互不重叠的ＯＲＦ区别于其他的小ＲＮＡ３４３５，［】目下的病毒科。双顺反子病毒科包括急性麻搏病毒属（Ａｐａｒａｖｉｍｓ）、總摔麻痹病毒属（Ｃｒｉａｖｉｍｓ）ｐ３６［］。Ｃｒｉｐａｖｉｍｓ包含Ｂ、ＣｒＰＶ、姆虫致死麻瘦病毒（ＡｐｈｉｄｌｅｔｈａｌｐａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓＡＬＰＶ）、ＱＣＶｙ，斯氏拍蝽肠病毒（Ｐｌａｕｔｉａｓｔａｌｉｉｎｔｅｓｔｉｎｅｖｉｒｕｓ，ＰＳＩＶ）、果蝇Ｃ病毒（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＣｖｉｒｕｓ，ＤＣＶ）、禾谷缢管姆病毒（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍｐａｄｉｖｉｍｓ，ＲｈＰＶ）、褐飞虱（双顺反子病毒（ＨｉｍｅｔｏｂｉＰｖｉｒｕｓ，ＨｉＰＶ）、锥畴病毒（Ｔｒｉａｔｏｍａｖｉｍｓ，ＴｒＶ）。Ａｐａｒａｖｉｍｓ包含ＩＡＰＶ、－ＡＢＰＶ、ＫＢＶ、红火蚁病毒（Ｓｏ－Ｍｕｄｌｅｎｏｐｓｉｓｉｎｖｉｃｔａｖｉｒｕｓ１ＳＩＮＶ１）、青蟹双顺反子病毒（，一ｃｒａ－ｂｖｉｒｕｓＭＣＤＶ１）、桃拉综合征病毒（ＴａｕｒａｓｎｄｒｏｍｅｖｉｍｓＴＳＶ。有个没有被分类，ｙ，）３６］［的该科病毒罗氏沼奸双顺反子病毒（Ｍｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＭｒＤＶ）ｏ２５？二十面体对称结构且无囊三个病毒蛋白ＶＰ双顺反子病毒是直径３０ｎｍ膜，１、ＶＰ２一、ＶＰ３组成Ｔ字结构的壳粒。些双顺反子病毒还有ＶＰ４结构，与ＶＰ３的Ｎ端融一合再被切割，最后形成个桶装结构作为病毒衣壳内表面病毒粒子在ＣｓＣ丨的浮３５？Ｌ力密度１．３７ｇ／ｎｉｌ，在强酸和强碱的环境中均能稳定存在。双顺反子病毒翻译起始方式是内部核糖体进到位点（ＩＲＥＳ）开始翻译，ＩＲＥＳ最先在脑心肌炎病毒（Ｅｎｓｅｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）和小儿麻搏病毒（Ｐｏｌｉｏｖｉｍｓ）发现它是ｐｍＲＮＡ非编码区上特殊区域，起翻译调控顺式和影响蛋白质的表现。有研究表明，ＩＲＥＳ具有二级或三级结构，活性与结构有很大关系ＩＲＥＳ结构可以形成假结体ｄｏｋｎｏ一（ｐｓｅｕｔ），从ＣＡＡ起始翻译合成病毒衣壳蛋白，第个氨基酸是谷氨酰胺不是常见的甲硫氨酸。ＩＲＥＳ位置并没有十分固定的地方，它的长度也同样没有确定的范围，一差异极大，受调控的基因不定是同源基因。１１３．．蜜蜂三种病毒的危害和发病特征１．１．３．１黑蜂王台病毒（ｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓ，ＢＶ）ｑＱＣ…１９７７年首次从患病的封盖蛹和蜂王幼虫中分离鉴定出ＢＱＣＶ，如今在亚洲、欧洲、非洲、美洲等世界各地均有发现已在全球范围内广泛分布。无论工蜂还是雄５ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＢＱＣＶ感染一峰均可以被，发病期是在蛹的封盖巢房时期，开始蛹显淡黄色，外表有层坚硬的囊状皮。ＢＱＣＶ侵染蜜蜂的卵、，最后王台巢房壁由暗棕色变化为黑色幼虫、蛹、一成蜂的任何发育时期。，并且广泛的存在于不同蜂种中通常以种无病症的隐性状态存在于蜂群中，当受温度、湿度、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂寄生虫等外界因素刺激时，就会表现出极强的致病性。尤其在培育蜂王的蜂群，因为王台集中而大量存在所以ＢＱＣＶ发病４８ＢＣＶ］率极高。虽然在瓦螨身上也检测出Ｑ，但现在还没有研究证明两者有着必然的联［系。１．１．３．２囊状幼虫病毒（ｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓＳＢＶ），４９［］ＳＢＶ由Ｗｈｉｔｅ于１９１３年首次分离并鉴定以来，已然成为了全球分布最广的病毒，５＂］［在世界各地的西方蜂群中均可以检出。ＳＢＶ并不会对西方蜜蜂造成严重的威胁，而？真正的威胁的是东方蜜蜂。１９７２１９７４年中华蜜蜂囊状幼虫病在我国大面积爆发，据统５〗［］计全国的２００多万蜂群损失过半，给当时的中国养蜂业带来了巨大的挑战。２０００年－３６月．３％，中华蜜蜂囊状幼虫病侵袭贵州锦屏县，使４２个蜂场中的５７蜂群遭受侵染５２５３［，］。，造成了极大地损失近些年在广西省东部大面积流行，许多蜂场遭受侵害，至今在重庆、四川的中蜂饲养区扔造成较大的损失。ＳＢＶ可以３日龄前的小幼虫为易感虫龄，侵染蜜蜂的幼虫和成蜂，因进食被病毒污一染的蜂王衆而感染。到封盖期，被ＳＢＶ侵染的幼虫无法进行最后次脱皮，无法进入一到蛹期，个黄色的囊袋。春季是蜜蜂囊状幼虫病，鋭皮液累积救表皮内慢慢表皮变成５４［］发病的最为主要季节。因为气温不稳定且较低，蜂群正处于新老蜂交替，群势较弱，。而此时子圈较大，蜂群维持群温能力不足，幼虫受冻后病害易爆发１．１．３．３（ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｇｖｉｒｕｓＤＷＶ）蜜蜂残翅病毒，５５］［１９９１年在日本的蜜蜂病例上被分离鉴定，现如今除了大洋洲外其他地方均发现５６［］ＶａＤＷＶ。在瓦螨（ｔｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｆ）没有扩散到西方蜜蜂前，ＤＷＶ对西方蜜蜂构成不了足够的危害。有研究表明残翅病毒病的流行与爆发于群内瓦螨的数量有着密切的关５６［］系。蜂群瓦螨数量多时往往工蜂体内伴随着有高浓度的ＤＷＶ，蜂群进行治螨后，工蜂体内的ＤＷＶ浓度大福下降。说明蜜蜂残翅病毒的流行与爆发是ＤＷＶ与瓦螨共同作用的结果。６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究５７１］蜜蜂残翅病是少数几种会表现典型症状的病毒病。发病的成年蜜蜂翅膀卷曲，身，逐渐失去飞行能力，体缩小，体色变暗变黑，只能在地上爬行几日后便会死亡。ＤＷＶ一可以侵染卵，，、幼虫、蛹的任发育时期在蛹期不表现症状，羽化出房出现翅膀残缺５８［］数曰后迅速死亡。隐性感染的成年蜜蜂则被认为会因ＤＷＶ的存在而缩短其寿命。１１４三种病毒的传播途径．．现在蜜蜂病毒的传播方式被证明主要有两种，即水平传播和垂直传播水平传播主要指病毒在蜜蜂同一主要指病毒通过蜂王产卵在个世代个体互相进行传播；垂直传播４８［］不同世代之间传播（图２）。＞交配传播？錄王－９雄歸Ｉ？１１＼！Ｉ＼３＾虫媒传播？？：１＼＞食物源传播ｉｉ＼泄物接■传播．１ｉ＼Ｍ，ｌＵ＼传ｆＭＶ＼１释Ｗ＞＂＾Ｉｉ？｜書灌＿污染传檑赫ｆ＾ｒｔ＃？奮Ｉ水平传插—图２蜜蜂病毒传播途径示意图（张弦，２０１２）Ｆｉｇ２Ｒｏｕｔｅｏｆｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｉｎｈｏｎｅｙｂｅｓｓ（Ｚｈｕａｎｇｘｕａｎ，２０１２）１４．１．．１水平传播（１）食物－肠道传播７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究蜜蜂取食被病毒污染的花粉、蜂蜜、蜂王架，再经肠道消化排泄携带病毒的粪便，内勤蜂清理都会接触到一，这样个过程发生经食物传染为水平传播。蜂群是个社会性极高的群体，个体之间互相频繁的接触、哺育、清理等行为都会增加病毒随食物来进行水平传播病毒的机会一。在蜂巢内储存的食物、中肠和獎便中都发现高浓度病毒证实了这１＿］途径的广泛存在。有研究发现在花粉中发现ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ、ＡＢＰＶ、ＣＢＰＶ、ＫＢＶ等６种蜜蜂病毒，从蜂蜜中也检测出ＤＷＶ和ＢＱＣＶ等２种病毒，在蜂王装中并６２］［没有检测到病毒。蜜蜂肠道内的病毒数量要远远高于其他组织部位。蜜蜂粪便检测病６２】ＤＷＶ９０％ＢＱＣＶ［毒，检测样品中检出率为，检出率为〗００％。（２）虫媒传播近年蜜蜂病毒病的频发有一个很重要的原因就是原来在以东方蜜蜂为寄主的瓦螨、传播到西方蜜蜂上，并在全世界范围内扩散，给蜜蜂养殖生产带来沉痛的打击。有研究表明ＢＱＣＶ、ＤＷＶ、ＫＢＶ、ＳＢＶ、ＡＢＰＶ、ＣＢＰＶ等病毒的流行与爆发与瓦螨的侵染６３￣＾［］程度有密切关系。瓦螨在蜜蜂传播中起媒介的作用，有研究以ＤＷＶ为例用血淸方法证实了瓦螨从病蜂上获得ＤＷＶ并把它传播给未感染的蜜蜂，使得表现出ＤＷＶ典型６７【］的症状。适时的控制瓦螨的数量可明显的抑制蜜蜂体内病毒的浓度。（３）性传播性传播是指病毒寄主在交尾的过程中相互传播，是典型的水平传播。许多传播的细６８６９６２节尚在研究当中过在精液［］［］［】、、，不成年雄峰蜂王的受精囊中均检测出病毒，可作为病毒可以通过性传播的证据。（４）体表传播７０］［当蜜蜂外表皮受到伤害破损时，蜜蜂病毒可以通过伤口进入到蜜蜂体内。特别是在转地长途运输中蜜蜂体表极容易受到创伤加大了这种传播方式的发生几率。１１．．４．２垂直传播垂直传播是病毒传播的另外一种机制，有三个关键的环节：生殖配子带毒、交配感［６９染】、受精卵污染。在蜜蜂的卵、幼虫、踊、成蜂上各个发育时期均可以检测到。所以推测病毒感染蜂王，病毒通过垂直传播方式传递到卵，并且有研究证明蜂王的确被病毒８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究７１一［］感染。检测蜂王装没有发现病毒，排除幼虫因进食食物而感染的可能性。为了进步证明这种传播方式的存在，Ｃｈｅｎ等对卵和蜂王卵巢表面进行消毒处理，结果卵里依旧６２［１检测出病毒，排除了通过卵表面传播病毒的可能性。说明病毒是蜂王通过垂直传播将病毒传给后代。１三种病毒病的诊断方法．１．５１．１．５．１根据典型症状一通过临床症状来判定蜜蜂病毒病是种简单、廉价且快速的方法，但是此方法具有明显的弊端，蜂群表现出明显的症状往往随后就是此病害的大面积流行与爆发，错过了。生产实践中前期最佳的防控阶段，具有滞后性１．１．５．２电子显微镜检测电子显微镜可以精确的看到蜜蜂病毒的外形、大小和侵染位置，但是蜜蜂病毒具有一［４８］相似的外形，仅靠病毒形态无法进步区分病毒种类。而且电子显微镜设备昂贵、技术复杂难以用于常规检测。１．１．５．３免疫学检测７２７３，］［免疫学检测的关键在于获得病毒衣壳的特异性抗体，目前多用酶联免疫法来实一现，使得用这方法特异性极差。。由于蜜蜂病毒间具有高度的基因同源性１１５４．．．基于核酸序列的检测随着２１世纪生物技术突飞猛进的发展，核酸序列的检测已然成为病毒检测的主流（ｒｔｔｌｔｉ方法，目前有反转录聚合晦链式反应技术ｅｖｅｒｓｅｒａｎｓｃｒｉｐｉｏｎｏｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｏｎｐｙ，ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒ（ｔｔｅ－）定量逆转录ｕａｎｉｔａｉｖｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎＰＣＲＲＴＰＣＲ）、多重ＰＣｑｐ，ｑＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）等。上述方法不仅可以定性检测病毒，有的还可以定量、有的还可以同时检测多种病毒一。但这些技术都必需个特定的温度循环变控制装置，所需的仪一器设备较为复杂、昂贵，检测操作需专业技术人员熟练的操作技术，在生产基层单位。般由于缺乏仪器、设备和专业技术人员，无法方便的应用１．２环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）９ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究１．２．１ＬＡＭＰ技术原理－等温扩增反应（ｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＬＡＭＰ）ｏｔｏｍｉｐｐ，是日本学者Ｎ等于２０００年开发的全新的等温核酸扩增方法该技术可以在恒温条件下完成自动循环的链置换反应，１小时以内复制大量的範基因序列对目的基因的六个特异性区域设°？计４条引物，应用链置换活性的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶在恒温条件下（６０６５Ｃ）催化新链合７４＿７７［］成，让目的基因成倍扩增图３。（）．？持状合成於Ｉ筷梗段ｐｉｃＦ２ｃＦ３ｄｙ１（）＼＾ｃＷｌｃ．Ｆ３ｃ‘￣ｊＢ３Ｈ２ＢＴＦ！ｃｒ２ｃＦ３ｃＪＩＶＭｔｒｒ＊￣５ＣＢ２ｃＢ１ＣＴＴｆＴＴＳＥＴｃＳｃＴｉｃ＾Ｉ１Ｂ３Ｂ：ＢｌＦｌｃＦ２ｃＦｌＢ３＜Ｂ：ＢＩｃＦｉｆ２Ｆｉｃｃ册？．念ＢＢ１ＦＦｋｔ（）卞２ｃ＾ｎ＿？＾段Ｆ＇Ｌ」Ｉ）１ｔＢ１ＦｋＯｉ－ＦｋＦ２ｃｎ（＊＾＂－（９）－ｉ￡ｉＵｗ２５（１５）少＾＾Ｖ＼ＢＩＰＨｐｉＢｋＢ２ｍＦｉｃ…，－命？．ｃ＾‘德４、图３ＬＡＭＰ原理图（匡燕云，２００７）Ｆｉｇ３ＬＡＭＰｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍ（ＫｕａｎｇＹａｎｙｕｎ，２００７）ＬＡＭＰ反应过程包括视铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段７８７９一［’］。最后的扩增产物是系列反向重复的ＩＥ序列构成的莲环结构和多环花椰菜样结构［＾］的ＤＮＡ片段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带组成的阶段式图谱。ＬＡＭＰ１０ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究８〗［］反应中会产生大量的焦隣酸根离子与镁离子结合，会有白色沉淀产生。在实际检测中沉淀不易分辨经常采用离心产物方法来观察是否有沉淀或者是在反应前加焚光染料有反应发生会有绿色荧光。１．２．２ＬＡＭＰ反应特点１．２．２．１特异性强ＬＡＭＰ引物是针对目的基因的６个特异性区域设计４条引物包括两条外引物和两８３８４条内引物［，］一，反应过程中准确结合，６个区域任区域与引物匹配不合反应就不能发生，因此反应可以获得比ＰＣＲ更髙的特异性。１．２．２．２设备简单－？温度里就可ＢｓｔＤＮＡ聚合酶最适宜的反应温度在６０６５Ｃ，反应只需要在平衡的一，ＰＣＲ仪以发生，只需要个简单的恒温水浴锅不需要昂贵的，操作简单，易于在基层饲养单位中推广应用。１．２．２．３产物检测便捷８１反应中有大量的焦憐酸离子与镁离子结合会有沉淀产生［］，可根据是否有沉淀来判断反应是否发生，，可；或在反应前加入焚光染料根据反应结束是否出现绿色焚光以判定反应是否发生。１．２．２．４反应时间短ＬＡＭＰ在恒温条件下反应？，没有在循环温度变化过程中的时间损失３０６０ｍｉｎ即一一可完成反应。而且在反应体系加上对环引物，使整个反应时间在原来基础上縮短８５８６，【］半即３０ｍｉｎ以内，可以满足临床样本快速检测的要求。１ＬＡＭＰ．２．３的应用１２．．１．３病毒的检测病毒的检测ＬＡＭＰ无论是针对ＲＮＡ病毒还是ＤＮＡ病毒都能做到快速检测。Ｐａｒｉｄａ８７’］［－等利用ＲＴＬＡＭＰ检测登革热病毒。针对４种血清型病毒基因的３端非编码区分别－设计６条引物。较ＲＴＰＣＲ灵敏度高出１００倍，且高于巢式ＰＣＲ，对阳性标本的灵敏１１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究８８［］－度可达１００％，而ＲＴＰＣＲ的病毒鉴定的灵敏度只有８７％。检测同种属其他病毒特异性也很好。对国内３０例乙型肝炎病毒ＤＮＡ阳性标本及１０例阴性标本利用实时荧８９［］光定量ＬＡＭＰ法检测ｏ１．２．３．２细菌的检测用细菌培养及血清血方法来检查百日咳杆菌都比较费时费力。利用ＬＡＭＰ针对ＢｆＮＡ－ＰＣＲ型百日咳杆菌进行检可以检测１０ｇ水平的Ｄ。而ＩＳ４８１和ＰＴｐｌ／ｐ２ＰＣＲ只能检测出１Ｐｇ和１００Ｐｇ水平的ＤＮＡ，且ＬＡＭＰ的特异性等同于这两种方法。在对－１１２证明ＬＡＭＰ的灵敏度高于ＩＳ４８１ＰＣＲ。临床例咽试纸的检测中，同样１．２．３．３支原体的检测肺炎支原体感染导致非典型肺炎，为了能早期确诊指导治疗，传统的培养及血清血９１一］［方法不能满足此需求。ＬＡＭＰ对肺炎支原体检测同实时定量ＰＣＲ为对照同检测，９２［］。在对７０例患者及２５例正常人咽试纸检测中１００％且。敏感性相当，阳性率无假阳性１２４．．３．胚胎的检测鉴定并控制胚胎的性别在畜牧养殖中具有十分重要的意义，对Ｙ染色体异序列进９３［］ＬＡＭＰＤＮＡ行的检测进行性别的断定。检测牛胚胎的性别与显微切割胚胎活检提取一一分同时进行。管检测雄性特有的Ｙ染色体上特异序列，管检测雌雄共有的特异序列一。最后结果两管均为阳性则判定胚胎为雄性，只有雌雄共有序列管阳性则判定为９４？［］雌性，均为阴性，其性别鉴定准确率达８８．９９４．４％。１．３本研究的目的和意义蜜蜂是非常重要的授粉昆虫，在自然生态系统平衡中起着至关重要的作用，而且它的各种产品也是人们健康生活的良品一养蜂生。蜜蜂的病毒病是蜜蜂最主要病害之，给产带来巨大的困扰。尤其以ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ为代表，ＢＱＣＶ和微孢子虫联合（Ｍｗｅｍａｓｐ）侵染时会表现出极强的致病性；囊状幼虫病是中华蜜蜂词养中危害最强最为主要的一，旦大面积爆发会导致整个蜂场毁灭残翅病往往与瓦螨共同流行爆发病害，留着瓦；螨的流行残翅病依然成为烈性传染性疾病。而且随着蜂产品中抗生素等各个指标的出，基层养蜂人员能用的药越来越少甚至到了无药可用的地步现，这就要求对待蜜蜂病害１２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究不是治疗而是防控一。虽然蜜蜂的病毒流行病学还在进步研究当中，但可以确定的是，一早期发现、提前预防是防控病害非常关键的步。简单、灵敏、快速的病毒检测技术对于防控病害的意义十分重大。目前生产基层判一、、断黑蜂王台病囊状幼虫病残翅病基本依靠发病症状来判断，而病毒病发生，旦出现明显的症状，往往是病害发生的严重时期，此时采取防控措施往往事倍功半，甚至无法挽救蜂群一。所以生产实践中需要种在病毒增值的初期，蜂群还未表现出症状时，就能检测出病毒的存在，并随时检测病毒的增值情况的准确、灵媒、快速、简便的检测技，以便早期防控病害术。针对检测ＢＱＣＶＶ的Ｒ一、ＳＢＶ、ＤＷ现在最常用的ＰＣ方法有定局限。因此本研ＬＡＭＰ方法一究为实现对这三种病毒的快速检测和监控建立了相应的。该方法只需要°Ｃ恒温的环境一个简单的水浴锅，，在６３中反应个小时左右，即可直接观察结果集快速简便于一身。这种方法的建立使野外实验和基层生产单位对这三种常见蜜蜂病毒检测成为可能，具有十分广阔的应用前景。２材料和方法２１．材料２．１．１供试材料本试验所用中华蜜蜂（却／？？ｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａ）蜂群均由福州闽侯桃田中华蜜蜂蜂场提。ＢＳＢＶＤＷＶ供，意大利蜜蜂来自闽侯蜂场和福建农林大学蜂学学院教学蜂场ＱＣＶ、、来自蜂学学院分子生物学实验室保存。２．１．２主要试剂与配制本试验所用试剂主要有：ＴＲｌｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ购自Ａｍｂｉｏｎ公司；Ｔａｇ酶、脱氧核糖三磷酸（ｄＮＴＰ）等购自Ｔｈｅｒｍｏ公司；（甜菜喊（Ｂｅｔａｉｎｅ）、硫酸镁ＭｇＳ０４）购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；（ＥＢ）和琼脂糖粉购自上海生工生物公司溴化乙淀；１３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＤＮＡ聚合酶（ＢｓｔＤＰｏｌｍｅｒａｓｅ）、ｌＯｘＴｈｅｒｍｏｏｌＢｕｆｆｅｒＮＥＢＮＡｙｐ购自公司弼黄绿素（Ｃａｌｃｅｉｎ）、氯化镁（Ｍｎｃｌ２）购自Ｓｉｇｍａ公司氯仿、氯化钠、异丙醇、乙醇购自国药化学试剂有限公司；Ｅａｓｕｒｅｕｔｒｔｔ－ＴｌｎＫｙＰＱｉｃｋＧｅｌＥｘａｃｉｏｎＫｉ试剂盒、ＰｅａｓｙＣｌｏｉｎｇｉｔ试剂盒、ＴｒａｎｓＴａ？ｑＦｅ－ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＨｉｇｈｉｄｌｉｔｙ试剂盒、ＰＥＡＳＹＴｌＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ购自北京全式金生物技术有限公司；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＣＸＲＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ、ｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ、ＧｏＳｃｒｉｐｔＴＭＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ生物公司；ＤｒｅａｍＴａｐＧｒｅｅｎＰＧＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（２ｘ）购自Ｔｈｅｒｍｏ公司２０００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ、Ｔｒａｎｓｐｌｕｓ１１ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，购自Ｔａｋａｒａ公司；ＰＧＲ引物由上海生工生物公司合成。主要试剂配制：°（１）ＤＥＰＣ水：ＩｍｌＤＥＰＣ与９９９１１１１的１１０１４２０按照１％）比例充分混合，１２１Ｃ灭°菌１５ｍｉｎ，冷却后４Ｃ冰箱里保存备用；（２）７５％乙醇溶液：用量筒量取７５０ｍｌ的乙醇，再量取已经制备好的ＤＥＰＣＨｚＯｍ－２５０ｍｌ（，把两者充分混匀定容至１０００ｌ，２ｒＣ保存备用；（３）ＴＥ缓冲液：１０ｍｍ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ８．０），１ｍｍ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；（４）５０ＸＴＡＥ缓冲液：称取５７．１ｍｌ冰醋酸，加上２４２ｇＴｒｉｓ碱和１００ｍｌ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤ°ＴＡ（ｐＨ８．０），充分混勾４Ｃ保存备用；（５）氨节青霉素储存液：用ＲＯＨ２Ｏ配成浓度为ｌＯＯｍ／ｍｌ的溶液ｇ，并用滤膜过－２滤，放于（ｒｃ保存备用；（６）１０ｍｍ／ＬＢｅｔａｉｎｅ溶液：称０．５８５６Ｂｅｔａｉｎｅ，加入０．５ｍｌ的ＲＯＨ２Ｏ，充分混ｇ５－２勻后分装成管，于（ｒｃ保存备用；（７）００ｍＬＭ入ｍ－２０１ｍ／的Ｓ０４溶液：称０．０１２ｇＭＳ０４加１ｌＲＯＨ２Ｏ充分溶解，ｇｇ１４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究°ｃ保存备用；（８）ＬＢ培养基．１、１ａＣ入灭菌水９５ｍｌ：０５ｇ酵母提取物、ｇ蛋白脎ｇＮｌ，加，°ＰＨ７．４，最后定容至１００ｍｌ，灭菌、冷却，４Ｃ保存备用；２．１．３主要仪器本试验所需主要仪器有：ＰＣＲ仪ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司；一ＤＹＹ－６Ｃ电泳仪仪器厂北京六；ＤＫ８Ｄ恒温水槽精宏实验设备有限公司；自动恒温制冷系统青岛海尔股份有限公司；ＤＨＧ．９０７０Ａ型电热恒温鼓风干燥箱上海景宏实验设备有限公司；普通冰箱青岛海尔股份有限公司；°超低温－８６Ｃ储存冰箱中科美菱科技有限公司；ＺＥＡＬＷＡＹ－Ｇ１５４ＤＳ高压灭菌锅厦门致微仪器有限公司；－Ｊ－ＳＷＣ１Ｇ型净化工作台苏州净化设备有限公司；阿修罗超纯水机重庆阿修罗科技发展有限公司；９０－２恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司；紫外可见分光光度仪北京瑞利分析仪器公司；－Ｋ５４４ＮＮ１ＪＦ松下微波炉上海松下微波炉有限公司；Ｂ型精密电子天平福州科迪电子技术有限公司；ＣＨＢ－１００恒温金属浴杭州博日科技有限公司；ＴＧｅａｒ微型离心机天根生化科技有限公司；ＪＳ－６８０Ｄ成像系统上海培清有限公司；１５ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１８离心机艾本德中国有限公司；制胶器北京六一仪器厂；５４１８离心机美国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；２２．试验方法２１．２．引物设计与合成在ＮＣＢＩ基因库查询全基因序列，通过ＮＣＢＩＢｌａｓｔ软件对比得到同源性９５％以上－，ＰｒｉｍｅｒＥｘＶ４ｈｔｔｌ．／ｍａｎｕａｌｉ．ｈ的保守基因序列利用ｐｌｏｒｅｒ（ｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｏｒｅｒｅ／ｖ４／ｎｄｅｘｔｍＬｊｐ）在线软件设计ＬＡＭＰ引物Ｅ基因６个特异区域即Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆｌｃ和Ｂｌ、Ｂ２、，首先找到ＩＢ３４条引物－，外引物为Ｆ３和Ｂ３ＦＩＰＢＩＰ（４）。其中ＢＶＦＩＰ；再设计，内引物为和图ＱＣ－ＦｌｃＦ２序２－－包含和列，即ＦＣＦＢＱＣＶＢＩＰ包含Ｂｌｃ和Ｂ２序列ＢｌｃＢ２。１；内引物，即－－－ＳＢＶＦＩＰ包Ｆ１Ｃ和Ｆ２Ｆ丨Ｆ２ＳＢＶＢＩＰ包－含序列，即Ｃｃ和Ｂ２，即Ｂ１ｃＢ２。；内引物含Ｂ１序列ＤＷＶ－Ｆ－－ＩＰ包含ＦｌｃＦ２序Ｆ１Ｆ２ＢＩＰＢｌＢ２和列，即Ｃ内引物ＤＷＶ包含ｃ和序列，即；Ｂ－１ＣＢ２。具体引物序列见表１。引物均由上海生工生物科技有限公司合成，将引物用去°００ｕｍ／Ｌ－离子水稀释１，放于２０Ｃ保存备用。ＦＩＰＩＦｌｓ，．Ａ／￥３ｔａｒｅｔｅｎｅｓ＼７ＦＦＦｉ紀基因ｇｇＦ．．‘＾？＿？，．￣￣３１ｈ｜丨丨丨■丨丨１：：巷，，ｎＦ３Ｆ：ＦＢ２ｃＢｆｃ１Ｂ３Ｂ２ＢｋｍｍｍｗＢＩＰ图４粑基因６个保守区域及引物的设计Ｆｉ４Ｓｏｆｉｘｒｅｉｏｎｓｔａｒｅｔｅｎｅｓａｎｄｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｇｇｇｐｇｎ１６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究表１ＬＡＭＰ引物Ｔａｂ．１ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒＬＡＭＰ，‘ｒｉｍｅ５－ｅｎｃｅＧ＋Ｃ引物ｐｒ序列（３）ｐｒｉｍｅｒｓｅｕ／％ｑＢＱＣＶ－Ｆ３ＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＡＣＡＡ４０．０％－Ｂ３ＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＣＣ４２ＢＱＣＶ．９％－ＢＱＣＶ－Ｆ５％ＩＰＧＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＡＧ４５．ＢＱＣＶ－Ｂ－４ＩＰＡＴＡＧＴＴＣＡＧＧＴＣＧＧＡＡＴＡＡＴＣＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡ４．２％ＣＳＢＶ－Ｆ３ＡＣＡＴＴＴＧＤＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴ３６３％．ＣＳＢＶ－Ｂ３ＴＣＴＧＡＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧ４２．９％ＣＳＢＶ－ＦＧＧＡＣＡＴＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ丁４ＩＰＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴ３．２％－ＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡ４２ＣＳＢＶＢＩＰＣＧ．２％ＤＷＶ－Ｆ３ＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＣＡＧＴＴ３３．３％－ＤＷＶＢ３ＴＣＡＣ３ＣＡＴＴＡＡＧＴＣＧＴＧＣＡ４４．４％－－ＦＰＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＣ３６ＤＷＶＩＡＣＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧ．２％－Ｂ－４４ＤＷＶＩＰＡＡＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＣＴＣＧＡＴＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＡＡＧＴＣ４．％２．２．２蜜蜂ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成？１）取８０１００ｍｇ去除翅和足得蜜蜂成年工蜂躯干，加４００＾ｉＬ的Ｔｒｉｚｏｌ用研磨棒在冰上进行充分研磨，直到见不到成块的几丁质外壳，转移到１．５ｍＬ的离心管中再加６００ＨＬ的Ｔｒｉｚｏｌ，振荡器充分混匀，室温静置５ｍｉｎ。°２）１００００ｒ／ｍｉｎ，４Ｃ离心ｌＯｍｉｎ，吸取上清８００＾ｉＬ。３）加０．２ｉｎＬ的氯仿，用力震荡３０ｓ，室温静置３ｍｉｎ。°４）１００００ｒ／ｍｉｎ，４Ｃ离心ｌＯｍｉｎ，吸取上清６００ｔｉＬ，尽量避免吸取沉淀残澄。使用１ｍＬＴｒｉｚｏｌ加入０．５ｍＬ的异丙醇，颠倒混匀，室温孵育１０ｍｉｎ。°５）１００００ｒ／ｍｉｎ，４Ｃ离心ｌＯｍｉｎ，去上清，这时候会在管底和侧壁发现白色点状沉１７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检測常见三种蜜蜂病毒的研究°－。／ｍｉｔｉ４Ｃ淀。加２（ｒＣ冷藏的ｌｍＬ７５％乙醇，剧烈游祸７５００ｒ，离心５ｍｉｎ。去除上清，金属浴５（ｒＣ保留１０Ｓ至半千或室温晾晒５ｍｉｎ？￣６３０５０１－）沉淀溶于＾＾无酶水中，用微量移液器吸吹混勾，８（ｒＣ保存备用。７）使用Ｐｒｏｍｅａ反转录试剂盒合成ｃＤＮＡ，建立２０反应体系包括：５ｘｂｕｆｅｒ、ｇＭｇｃｌ２、随机引物、ＰＣＲＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＭｉｘ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｔｅ，具体体系如下（表２）：表２ｃＤＮＡ合成体系Ｔａｂ．２ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃＤＮＡｓｙｓｔｅｍ成份ｅｌｅｍｅｎｔ使用量ａｍｏｕｎｔｉＬ（ｆ）Ｘ５ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｅｒ４．０ＯｌｉｏｄｔＰｒｉｉｎｅｒ５００／ｍｌ０．５ｇ（）］５（ｎｇ）ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒｓ（５００ｘ／ｍｌ）０．５ｉｇＭｇｄ（２５ｍｍ／Ｌ）４．０２ＰＣＲＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＭｉｘｌ０ｍｍ／Ｌ）１．０（？ＲｎａｓｉｎＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ０．４ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１．０模板ｔｅｍｐｌａｔｅ２．０ｄｄＨＯａ补至２０。将所配体系轻轻摇匀，瞬时离心至管底，４２Ｃ水浴１５ｍｉｎ延伸反应，７０１１５ｍｉｎ的反转录酶灭活－（ｒＣ。所得到的产物作为ＬＡＭＰ反应模板，２保存备用。２．２．３ＬＡＭＰ检测蜜蜂三种病毒方法的建立ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ均采用配制２５＾＾Ｌ的ＬＡＭＰ初始反应体系，主要成分和使用ｔ、２Ｉ量如下：８ＵＢｓＤＮＡ聚合酶、８ｍＭＭｇＳ０４、０．８Ｍ甜菜碱．０ｍＭ内引物ＦＰ和ＢＩＰ、０１Ｌ的ｃＤＮＡ．４ｍＭ外引物Ｆ３和Ｂ３、加入ｉ作为反应模板，补水至２５＾ｉＬ。体系见表３：ｊ１８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究表３病毒ＬＡＭＰ体系建立Ｔａｂ．３ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｓｔｅｍｏｆＬＡＭＰｆｏｒｖｉｒｕｓｙ成份ｅｔＬｌｅｍｅｎ使用量ａｍｏｕｎｔｉ（｜）ｘｌＯＴｈｅｒｍｏｐｏｌＢｕｆｆｅｒ２．５ＢｓｔＤＮＡＰｏｌｍｅｒａｓｅ（８０００Ｕ／ｍＬ１．０ｙ）ｄＮＴＰ１０ｍｍ／Ｌ１０，（）ＭＳＯ４１００ｍｍ／Ｌ２．０ｇ（）Ｂｅｔａｉｎｅ（１０ｍｍ／Ｌ）２．０Ｂ３Ｆ３１０ｍｍ／Ｌ０．５，（）Ｆ１ＰＢＩＰ４０ｍｍ／Ｌ０．５，（）模板ｔｅｍｐｌａｔｅ１．０ｄｄＨＯ补至ｊ２５°将体系各成分加入０．２ｍｌ的离心管中，轻轻混勻，放于６３Ｃ反应１ｈ，反应结束后，采用１．５％琼脂糖凝胶电泳观察条带清晰和明亮程度。影响ＬＡＭＰ反应效果的因素有时间、温度、内外引物比、甜菜碱含量、ＭＳ０４浓ｇ度等，本研究针对ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ的ＬＡＭＰ分别对其进行优化。２．２．４ＬＡＭＰ体系优化２．２．４．１ＬＡＭＰ体系中最佳反应时间和温度的确定°°°°为获得ＬＡＭＰ扩增的最优体系和条件，依次对反应温度６１Ｃ、６２Ｃ、６３Ｃ、６４Ｃ、°－６５ＢＱＣＶ－ＬＡＭＰＳＢＶＬＡＭＰ３０ｉｉｎｉＣ进行梯度优化。反应时间和以ｍｎ、４５ｍ、６０ｍｎ梯度优化ＤＷＶ－ＬＡＭＰ以３０１ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７５ｍｉｎ梯度优化。反应产物．５％；。琼脂糖凝胶电泳观察，根据所得条带清晰和明亮程度来确定最佳反应时间和温度２２ＬＡＭＰ体．．４．２系中最佳外引物与内引物比例的确定确定外引物浓度调整内引物的浓度：２、１：３、１：、１：５、１：６、，使外、内引物比达到１４－？－？１－ＡＬＭＰ：７、１：８（ＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ１２１１２１用：：７ＳＢＶ：：８其中ＱＣ；用），固定，ＬＡＭＰ１５％琼脂糖凝胶电泳体系其他条件进行反应，反应结束后再进行．，根据扩增９１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检測常见三种蜜蜂病毒的研究条带清晰及明亮程度确定最终的内外引物比例反应。体系中引物量与对应内外引物浓度对比见表４。表４反应体系中引物加入量与对应的内外引物浓度对比Ｔａｂ．４ＴｈｅｕａｎｔｉｔｏｆｅａｃｈｒｉｍｅｒａｎｄｔｈｅｃｏｓｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｔｈｅｉｎｎｅｒａｎｄｏｔｅｉｉｎＬｒｒｅｏｎｄｎｕｒｒｍｅｒｓＡＭＰｑｙｐｐｇｐｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅ１１．６ｍｍ／ＬＦＩＰ溶液．６ｍｍ／ＬＦＩＰ溶液０．４ｍｍ／ＬＦ３溶液０．４ｍｍ／ＬＢ３溶液内外引物比ｍｍｗ（ｐＬ）０：１．２５０．２５０．５０．５２０．１．７５０．７５０５０．５３：１．００１．０００．５０．５４１：１１．２０．．２５５５０．５５：１１．５０１．５００．５０．５６：１１．７５０．５５１．７５０．７：１２．００２．０００．５０．５８：１２．２．４．３ＬＡＭＰ体系中最佳Ｂｅｔａｉｎｅ浓度的确定－Ｖ－ＬＡＭＰＢＶＬＡＭＰ－ＬＡＭＰ选择之前确定最佳的内外引物比，ＢＱＣ、Ｓ、ＤＷＶ均以甜菜减终浓度以０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｏ、．６ｍｍｌ／Ｌ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ分别进行优化固定体系其他条件，进行ＬＡＭＰ反应根据扩增，条带清晰及明亮程度确定最终的最佳Ｂｅｔａｉｎｅ浓度。Ｂｅｔａｉｎｅ浓度与Ｂｅｔａｉｎｅ（８ｍｍ／Ｌ）加入量的对比详见表５表５反应体系中Ｂｅｔａｉｎｅ浓度与Ｂｅｔａｉｎｅ加入量的对比Ｔａｂ．５ＴｈｅｕａｎｔｉｔｏｆｂｅｔａｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｂｅｔａｉｎｅｉｎＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｑｙｐｇＢｅｔａｉｎｅ浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）００．４０．６０．８１１．２１．６２．０Ｂｅ１５０２４ｔａｉｎｅ８ｍｍ／Ｌ加入量（Ｌ）００．５．２．，５３．０．０．］ｉ５０（）２．２．４．４ＬＡＭＰ体系中最佳ＭＳ０４浓度的确定ｇ２０ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究２＋ｎｅ浓度－选择之前确定最佳的内外引物比和Ｂｅｔａｉ，ＢＱＣＶＬＡＭＰ调整Ｍｇ终浓度以０ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ、８ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１８ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ；－ＳＢＶ－ＬＡＭＰＤＷＶＬＡＭＰｌＬ２ｍｍｏＬ４１０和均以０ｍｍｏ／、ｌ／＞ｍｍｏｌ／Ｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ、ｍｍｏｌ／Ｌ、１８ｍｍｏｌ／Ｌ梯度优化固定体系其他条件，进行ＬＡＭＰ反应，根据扩增条带清晰及明亮程２＋度确定最终的最佳ＭＳ０４浓度。Ｍ浓度与ＭＳ０４１００ｍｍ／Ｌ）中加入量的对比详见表６。ｇｇｇ（＋表６反应体系中Ｍ／浓度与ＭｇＳ０４（１００ｍｍ／Ｌ）中加入量的对比２＋Ｔａｂ．６ＴｈｅｕａｎｔｉｔｏｆＭａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＳ０ｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎＬＡＭＰｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅ４ｑｙｇｐｇｇ浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）０２４６８１０１８２０ＭＳ０４１００ｍｍ／Ｌ加入量（ｉＬ）００．５１．０１．５２．０２．５４．５５０ｇ（）．ｊ２．２．５扩增区域的克隆测序２２５１．．．建立外引物Ｆ３、Ｂ３的ＰＣＲ反应为验证扩增区域的正确性，利用ＬＡＭＰ外引物Ｆ３、Ｂ３建立ＰＣＲ反应扩增目标区域。建立如下ＰＣＲ反应体系（表７）：２１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究表７外引物Ｆ３、Ｂ３的ＰＣＲ反应建立Ｔａｂ．７ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｓｔｅｍｏｆＬＡＭＰｆｏｒＢＱＣＶｙ成份ｄｅｍｅｎｔ使用量ａｍｏｕｎｔＬ（＾）ｘｌＯＨｉＦｉＢｕｆｅｒ５．０ＢｓＡＰｏｌｍｅｒａｓｅ８０００Ｕ／ｍＬ１．０ｔＤＮｙ（）ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍ／Ｌ）４．０ＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｍｅｒａｓｅ１ｙ．０ＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０Ｂ３１０ｍｍ／Ｌ）０，５（Ｆ３１０ｍｍ／Ｌ）０．５（模板ｔｅｍｐｌａｔｅ２．０ｄｄＨｊＯ补至５０°°°°ＢＱＣＶ的ＰＣＲ反应程序是：９４Ｃ预变性５ｍｉｎ；９４Ｃ３０ｓ，５５Ｃ３０ｓ，７２Ｃ４５ｓ，°°°共计３０个循环；７２Ｃ延伸〗０ｍｉｎ。ＳＢＶ的ＰＣＲ反应程序是：９４Ｃ预变性５ｍｉｎ；９４Ｃ°Ｃ＇°３０ｓ，５４３０ｓ，１２Ｃ４５ｓ，共计３０个循环；７２Ｃ延伸１０ｍｉｎ。ＤＷＶ的ＰＣＲ反应程°°°。°：９４０预变性５１１１丨１１４Ｃ３０ｓ４Ｃｓ７２Ｃｓ７２Ｃ序是；９，５３０，４５，共计３０个循环；延伸ｍ＝＝１０ｉｎ。反应结束后使用１．０％琼脂糖凝胶，电场强度１００ｖ／２３ｃｍ４．３５ｖ／ｃｍ，时间３５ｍｉｎ。，观察是否出现目的条带２．２．５．２琼脂糖凝胶电泳纯化回收一￣１）切取含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖（１００２００ｍｇ），尽量切得小些，用吸头揭碎°Ｃ￣ｍｎ？。按重量比加入ＧＳＢ，于５５水浴溶解６１０ｉ，轻轻混合２３ｍｉｎ，使胶块完全融化２）待融化的溶液温度降至室温时，加到离心柱内静置１ｍｉｎ，离心机１００００ｒ／ｍｉｎ离心Ｉｍｉｎ，倒掉管底液体。３）加入６５０｜ａＬ溶液ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，倒掉管底液体。００￣４）放入离心机１００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ，去除残留的ＷａｓｈＢｕｆｅｒ。５）将离心柱放到干净的离心管中，开盖Ｉｍｉｎ，使剩余的乙醇彻底挥发干净。在离２２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究°￣３０￣５０Ｌ经６０７０Ｃ预热的去离子水或ＥｔｏｎＢｕｆ心柱的中央加入ｎ过ｌｕｉｅｒ，置室温环境？１２ｍｉｎｏ６）放入离心机１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，管底即是纯化后的ＤＮＡ。将纯化后的ＤＮＡ。置－２０Ｃ保存。２．２．５．３目的片段的连接目的片段的连接受到多个因素的影响，比如目的片段长度、反应体系体积、回收ＥＡＳＹ－ＴＤＮＡ浓度、连接酶的活性等。本试验采用全式金公司ｌＣｌｏｎｉｎＫｉｔ试剂盒ｐｇ，ＰＣＲ－Ｔ反应体系如下：物：２ＳＹｌＣｌｏｎｉｎＶｅｃｔｏｒ：！ｘＬ去离子水：３Ｌ。轻产ｎＬ；ｐＥＡｇｊ；ｎ°？Ｃ５轻混勾，室温（２０３７）反应ｍｉｎ。待反应结束，将反应体系放于冰浴中。２．２．５．４重组质粒的转化－￣５０ＬＴｍｎｌ１）把连接产物加于３０ｉ刚刚解冻的感受态细胞ｓＴｌ，慢，冰ｊ中慢混勾２０－３０ｍ浴ｉｎ。°立即放在冰上２）４２Ｃ热激３０ｓ，２ｍｉｎ。°３）加入２５０ＬＬＢ３７Ｃ２００转孵育１ｈ。ｈ平衡至室温的，４）４０Ｌ２０ｍ－取的／ｍｌＸａｌ与８Ｌ的５００ｍｍ／ＬＩＰＴＧ混合，均匀的涂在平板上，ｎｇｇｐ°７ＣｎＸ－ａ放置于３环境３０ｍｉ，让ｇｌ与ＩＰＴＧ完全吸收。５）取２００＾１１＾、１００ｎＬ、５０ｉＬ菌液铺于平板上，培养过夜。ｊ２２５Ｐ．．５．ＣＲ方法鉴定阳性重组子及测序１）挑取白色克隆放于１０ｎＬ无菌水中，混合均勾。２）２５）ｉＬ反应体系中取１＾１１＾混合液作为？０１反应的模板，用Ｍ１３正向和反向引物鉴定重组子。°°°°３）ＰＣＲ反应：９４Ｃ预变性ｌＯｍｉｎ；９４Ｃ３０ｓ，５５Ｃ３０ｓ，７２Ｃ４５ｓ，共计３０个循°环；７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ。确认包含重组子的的克隆，扩大培养，用Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ引物测序。２３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究４）将鉴定为阳性的菌液送至上海华大基因生物公司进行自带引物或Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ测序，测定结果用特定软件分析并在ＮＣＢＩ中ＢＬＡＳＴ进行对比分析。２．２．６敏感性和特异性试验验证用紫外分光光度仪检测样品ＲＮＡ浓度，然后依次稀释１０倍，建立浓度梯度。用优一－－ＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶ－般的ＰＣＲ法同时进行检测化好的ＢＱＣＶＡＬＡＭＰ方法和。反应结束取扩增产物，琼脂糖电泳，成像仪观察结果。用可视化ＬＡＭＰ方法分别对ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ进行扩增，即在原体系加入螯合好的１ｉＬ耗黄绿素染料，观察颜色变化情况并用常规ＬＡＭＰ法电泳对比扩增反应结果［，验证此ＬＡＭＰ方法的特异性和可视化ＬＡＭＰ的可行性。２．２．７临床样本的检测０？４于２１４年３月份间，前往福州郊区蜂场，现场采集中华蜜蜂、意大利蜜蜂各２０－－－份成年工蜂本，用已经建立好的ＢＱＣＶＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ方法进行临。床检测，样本同时进行ＰＣＲ鉴定作为对照同时比较两种方法的阳性检测率与灵敏度。３实验结果３．１应用ＬＡＭＰ检测ＢＱＣＶ的研究结果３－．１．１ＢＱＣＶＬＡＭＰ反应体系的优化？６５１根据反应原理在６１：进行温度优化，多次重复梯度条带没有明显区别（图５：Ａ），°最后选择中间温度６３Ｃ作为最终反应温度。泳道２与泳道３差别不大，选择时间短的泳道２作为最终反应时间４５ｍｉｎ（图５：Ｂ）。根据条带清晰、明亮程度选择泳道２作为外－－－ＦＢｍｏＶ－ＦＩＰ、ＢＶ１２内引物比即ＢＱＣＶ３、ＢＱＣＶ３为０．４ｌ／Ｌ，ＢＢＩＰ为．ｍｏｌ／ＬｎＱＣＱＣｎ＋（图５：Ｃ）第４条泳道Ｍ浓度２ｍｎｉｏｌ／Ｌ（图５：Ｄ）２ｅｔａｉｎｅ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ；／；第条泳道Ｂ（图５：Ｅ）ｏ２４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＭＩ２３４５ＭＩ２３２２０００００００００１０００７５０７５０■５００５００ｍｍｊ２５０２５０Ｈｉ１００１００ｍｍｎｎＡＢＭ１２３４５６Ｍ１２３４５６７８ＭＩ２３４５６７８上上１Ｋ９１０００Ｍ０００ｉＩｉ１ＩｎＩＩ■ｉＭｌ醫ＫｉｌｌＣＤＥ图５黑蜂王台病毒ＬＡＭＰ体系优化Ｆ．ＬＡＭＰｒＢｉｇ５ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｏＱＣＶ。。。？５ｒＣ？泳道Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准Ａ：１６、６２Ｃ、６３Ｃ、６４Ｃ、６５ＶＢ：１３；泳道为反应温度；？３０ｎｉ：：泳道为反应时间ｉｎ４５ｍｉｎ０ｍｎＣ：１６Ｐ１２１３、．６ｉ；泳道为ＬＡＭ外引物与内引物比例、、？１：４、：：：１几．１／．．１５、１６、１７Ｄ：１８０１１１１１１０、０４０１１１１０１、０６０１１１１０１／１、０８１１１０１０１／１、；泳道为甜菜碱终浓度２＋ｍｍｏ？ｌＩ／Ｌ１２ｍｍｏ、１．ｌＬ：１８道为０ｍｍｏｌ／ｌ／．Ｏ、．ｌ／Ｌ６ｍｍｏ／Ｌ＞２．０ｍｍｏｌ／ＥＭＬ、２ｍｍｏＬ、；泳ｇ终浓度４ｍｍｏＬｍｍｏｌ／ＬｍｍｏｌＬ、１０ｍｍｏＬ１８ｍｍｏＬ２０ｍｍｏ／ｌ／、６、８／ｌ／、ｌ／、ｌＬ。。。。。－Ｌａｎｅ－Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＡ：Ｌａｎｅ１ｔｅｅａｔｕＶＣ６２Ｃ６３Ｃ６４Ｃ６５ＣＢ：Ｌａｎｅ１３ｔｉｍｅ０ｍｉｎ４５ｉ６０ｍｉｎ；５ｍｐｒｒｅ６；３ｍｎＣ：，，，，，，；－Ｌａｎｅ：：？１６ｒａｔｉｏｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｏｔｈｅｅｘｒｌｒ１２ｔｏ１Ｄ：Ｌａｎｅ１８ｅｔａｉｎｅｌ．／Ｌ．ｔｅｎａｐｉｍｅｒｓｆｏｒｍ７；Ｂ：０ｍｍｏ／Ｌ，０４ｍｍｏｌ，０６２＋－０．８ｍｍｏ．．Ｌ１．Ｌ１Ｌｍｍｏｌ／Ｌｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ１２ｍｍｏｌ／６ｍｍｏｌ／Ｅ：Ｌａｎｅ８Ｍ：０ｍｍｏｌ／Ｌ２ｍｍｏｌ／，４ｍｍｏｌ／Ｌ，６ｍｍｏｌ／Ｌ，，，；ｇ，，８ｍｍｏ／１．ｌＬ０ｍｍｏｌ／Ｌ，１８ｍｍｏｌ／Ｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ，３－１２．．ＢＱＣＶＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应与鉴定３１２－．．．１ＢＱＣＶＬＡＭＰ夕卜引物的ＰＣＲ反应１５％，，１７ｂ．琼脂糖凝胶电泳检测阳性扩增可见清晰明亮的条带大小片段与预期２ｐ相吻合（图６）。２５ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４Ｌｂｐ２００００００７５０５００２５０００１图６ＰＣＲ检测黑蜂王台病毒结果Ｆ．ｈｅＰＣＲｒｉｇ６ＴｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｏＢＱＣＶ：ＢＭ：ＤＮＡ分子质量标准；Ｉ阴性对照；２：ＱＣＶＬＡＭＰ外引物；３：Ｙｕｒｉｋｏ已发表；４：内参１５０ｂｐ。－ｒｋｅｒｖｅＴＰＹｌ４．Ｍ：ＤＮＡｍａ１：Ｎｅｔｉｃｏｎｔｒｏｌ２：ｈｅｆｏｒｍｅｒｒｉｍｅｒｏｆＬＡＭｆｏｒＢ３：ｕｒｉｋｏｕｂｉｓｈｅｄ：ａｃｔｉｎ１５０ｂ；ｇａ；ＱＣＶ；；ｐｐｐｐ３－１２２ＢＣＶＬＡＭＰ．．．Ｑ外引物的克隆测序与鉴定所得阳性菌液委托上海华大基因生物公司测序，利用Ｒｅｓｅａｒｃｈ序列处理软件确定引物序列，得到目的基因片段，将该序列Ｂｌａｓｔ与ＧｅｎＢａｎｋ收录ＪＮ１８５９３２．１的全序列对比覆盖范围９５％，同源率达到１００％（图７、图８），证明该序列为ＢＱＣＶ特有的序列，说明此ＬＡＭＰ的外引物可以用于ＰＣＲ检测蜜蜂黑蜂王台病的分子标记。根据ＬＭＡＰ的反应原理可得出此ＢＱＣＶ的内、外引物用于ＬＡＭＰ检测蜜蜂黑蜂王台病的分子标计。Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ１００ＢｌａｓｔＨｉｔｓｏｎｔｈｅＱｕｅｉｙＳｅｑｕｅｎｃｅ－ｔｄｅｆｌＭｏｕｓｅｏｖｅｒｏｓｈｏｗｉｎｅａｎｄｓｃｏｒｅｓｃｌｉｃｋｔｏｓｈｏｗａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ［Ｃｏｌｏｒｋｅｙｆｏｒａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｃｏｒｅｓ■ｇｓ—ｍｐＱｕｅｒｙＩＩＩＩＩＩＩ１３０６０９０１２０１５０１８０图７ＢＱＣＶ－ＬＡＭＰ外引物测序片段与数据库比对结果Ｆ－ｉ．７ｌｉｎｍｅｎｌｔｏｆＢＶＬＡＭＰｏｕｔｒｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｇＴｈｅａｇｔｒｅｓｕＱＣｅｐｑ２６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｂ－ｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅＢＱＣＶＣＸ２ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｏｌｒｏｔｅｉｎｅｎｅａｒｔｉａｌｃｄｓｑｐｙｐｇｐＳｅ：ｂ１ｑｕｅｎｃｅＩＤｇＵＮ１３５９３２Ｌｗｇｔｈ：１ＮｕｍｂｅｒｏｆＭａｔｃｈｅｓ：１１７０Ｒａｎｇｅ１：１６７ｔｏ３４７ＧｅｎＢａｎｋＧｒａｐｈｉｃｓｔ＂丄ｒ森ｉＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓＧａｐｓＳｔｒａｎｄ３３５ｂ－ｉｔｓ（１８１ｌｅ８８１８１／１８１（１００％０／１８１０％Ｐｌｕｓ／Ｍｉｎｕｓ））（）ｉｉｉｍｍｍｉｍｉｍｉｍｍｍｉｉｍｉｍｉｉｉｍｉｍｍｉｉｍｍＳｂｊｃｔ３４７ＣＣＴＡＣＣＯＣＡＴＡＡＴＡＯＣＧＡＴＴＯＡＴＯＧＡＴＯＳＸＣ＾ＴａＡＡＯＴＯＳＣＴＸＴＡＴＣＧＡｔｊＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡ？ｒ６９ＣＣＴＧＡＰＪＡＧＴＡＡＴＧｉｎＣＣＯ＾ＪＪ＾ＧＡＡｔ＾ＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＯＪＣＡ２８ｌｕ？ｙＡＣＴＵＭＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡ１ｉｍｉｉｍｍｉｍｍｉｉｉｉｉｍｉｉｍｉｉｉｍｍｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｍｍｉＳｂｔ７－ｊｃ２８ＣＣＴＣＡＡＣＴｍＯＴＵＡＡＴＯＴＴＴＣＣＯＡＡＴＴＣＣＣＴＣＴＡＡＡＣ＾ＡＡＯＡＴＯＡＣｉｉＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡ２２８＇Ｑｕ＜ｒｙ２９ＴＡＧＴＡＣ（ＴＡＴＴＴＧ＜；ＡＡＣＴＧ＇Ａ１８８１ＷａＣＧＡＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＡＧ＜ｎＡＴＴＴ０ＴＴＣＴＡＴＴ０ＣＣＡＡＡ３ＧｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌＭＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＭＩＩＩＩＩＩＩＩＩＭＩＩＩＭＩＩＩＩＩＩｉＩＩＩｃｔ＇＇Ｓｂ２２７ＴＡＯＴＡＣＯ＇＇＾Ａ１６８ｊ：？ＴＡＴＴＴ＾＾ｄｙＣＴＣＴ３ＣＧＡＣＴＣＣＣＴＴＴＭＡ＞？ＴＡＴｎＯＴＴＣＴＡＴＴＯＣＣＵＡＣｈｗｒｙ１８９Ｃ１８９Ｓｂｊｃｔ１６７Ｇ１６７８ＢＶ－ＬＡＭＰＧｅｎＢａｎｋ８５９３２图ＱＣ外引物测序片段与中ＪＮ１比对结果Ｆ－．ＴｉｎｍＢＶＬＡＭＰｒｒｒｕＪＮ１８５９３２ｉｎＧｅｎＢａｎｋｉｇ８ｈｅａｌｇｅｎｔｏｆＱＣｏｕｔｅｉｍｅｓｅｑｅｎｃｅａｎｄｐ３１３Ｌ．．ＡＭＰ与ＰＣＲ的敏感性对比试验用己完成优化反应的ＢＱＣＶ－ＬＡＭＰ体系进行对比检测ＢＣＶ－ＬＡＭＰ灵敏度结，Ｑ果－－显示可达８６ｆ９Ａ）．的ＲＮＡ模板（图，常规ＰＣＲ灵敏度为８６的ＲＮＡ模板（图９Ｂ）ｇｐｇ，说明ＢＣＶ－ＬＡＭＰ的灵敏度比本研究建立的ＢＱＣＶ－ＰＣＲ灵敏度要高１００倍Ｑ。２７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５６７８１２３４５６７８ＭｂｉＨ４ｉｐｉ８０００ＩＩ５０００ｂＩＩｐ３０００Ｉ；Ｉ２０００２０００Ｉｉ＿１０００Ｉｉ７５０ｉ７５０５００１２１７ｂｏ１００１００睡＿＿ＡＢ图９ＰＣＲ（Ａ）与ＬＡＭＰ（Ｂ）敏感性对比图Ｆ．ｈｅｎｓｖＲａｎｉ９ＴｓｅｉｔｉｉｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＰＣｄＬＡＭＰｇｙＭＮＡＡ０ＣＶＰＣＲ？１８：８６：Ｄ分子质量标准：１，ｎ、；依次稀释倍ＢＱ模板的琼脂糖凝胶电泳结果ｇ８．６ｎ＞０．８６ｎ、８６、８．６、０８６、８６ｆ、８．６ｆＢ：依次稀释１０ＢＱＣＶＬＡＭＰ琼ｇｇ．；倍模板的ｐｇｐｇｐｇｇｇｌ￣０８６ｆ８脂糖凝胶电泳结果，８：８６ｎｇ、８．６ｎｇ、．ｎｇ、８６、８．６、０．８６、８６、．６ｆ？ｐｇｐｇｐｇｇｇＭ－－：ＤＮＡｍａｒｋＡａｒｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｒｏｉｏｆＰｄｕｃｔｓｕ０ｆｏｌｄＣＶ１ｎ．．８ｅｒ：Ａ：ｇｒｅｓｓＣＲｒｏｓｉｎ１ｄｉｌｕｔｉｏｎＢ，８：８６，８６ｎｇ，０６ｎｇｐｈｏｐｇＱｇｇ，？－８６．．．ｒｒｒＡＭ１ｌｌＢｇ，８６，０８６，８６ｆｇ８６ｆＢ：ＡａｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｏｈｏｅｓｉｓｏｆＬＰｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎ０ｆｏｄｄｉｕｔｉｏｎ１８：８６ｐｐｇｐｇ，ｇ；ｇＱＣＶ，ｇｐｐｇｎ８．．６ｎ０．８６ｎ８６８６０．８６８６ｆ．６ｆ．ｇ，ｇ，ｇｐ，，，ｇ，８，ｇｐｇｐｇｇ３．１４可视化ＬＡＭＰ．的特异性试验使用已完成优化反应的ＢＣＶ－ＬＡＭＰＱ体系进行检测，最终电泳结果表明只有ＢＱＣＶ的ｃＤＮＡ反应有梯形条带呈阳性，对照的ＤＷＶ、ＳＢＶ的ｃＤＮＡ没有多梯形条带出现（图０－Ａ）。劳光可视化结果显示ＢＶ有绿色焚光ＤＷＶ、ＳＢＶ和１只有ＱＣ，其他的０－Ｂ阴性对照呈橘色（图１）。２８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４Ｉ２３４ｍｉＪｉＨＡＢ图１０ＢＱＣＶＬＡＭＰ反应特异性扩增结果Ｆ．ＡＭＰｕｃＢＶｉ１０ＬｓｅｃｉｆｉｃａｍｌｉｆｉｅｄｒｏｄｔｓｏｆｇｐｐｐＱＣＭ：ＤＮＡ分子质量标准；Ａ：ＢＱＣＶＬＡＭＰ反应特异性电泳图，１：ＢＱＣＶ，２：ＳＢＶ，３：ＤＷＶ，４：阴性对照Ｂ：，１：ＢＣＶ，２：ＳＢＶ，３：ＤＷＶ，４：。；可视化观察特异性Ｑ阴性对照ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒＡ：ＬＡＭＰｓｅｃｉｆｉｃａｍｌｉｆｉｅｄｒｏｄｕｃｔｓｆＢ１；ＢＣＶ２；ＳＢＶ３：ＤＷＶ４；Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ：．ｐｐｐｏＱＣＶ，Ｑ，，ｉＴｈｅ，ｇ；ＢｖｉｓｕａｌｏｂｓｅｒｖａｉｕｃｏＢＶｌ．ＢＢＶ：ＤＷＶ：Ｎｒ．ｔｏｎｏｆｓｅｃｉｆｉｃａｍｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｔｓｆＱＣ，ＱＣＶ２：Ｓ，３４ｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｏｌｐｐ，，３１５．．临床样本的检测对疑似感染ＢＱＣＶ的中华蜜蜂和意大利蜂群各取２０份样本同时用ＬＡＭＰ和ＰＣＲ检测。分别用１１％．５％和琼脂糖凝胶电泳观察结果，ＬＡＭＰ检测中华蜜蜂样本３、６、７、１０、１５、１７、１８泳道为阳性其余为阴性（图１１），ＰＣＲ检测中华蜜蜂样本６、７、１０、１５、１７为２１７ｂｐ条带呈阳性其余为阴性（图１２）；ＬＡＭＰ检测意大利蜜蜂样本１、４、５、６７９１２１３１５１１１８１９２０、、８、、、、、６、７、、、泳道为阳性其余为阴性（图１３），ＰＣＲ５８１２１３１５、１６１７１８１９２１７检测意大利蜜蜂样本４、、、９、、、、、、泳道，呈ｂｐ条带阳性其余为阴性（图１４）。２９ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５６７８９Ｋ）１１１２Ｂ１４１５１６１７１８１９３３７５０－图１１ＢＱＣＶＬＡＭＰ对中华蜜蜂临床样本检测结果－Ｆ．ＲＶｉｇＩＩｅｓｕｌｔｓｏｆＢＱＣＬＡＭＰｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓＭＡ１：ＤＮ分子质量标准３、６、７１０、１５、１７８，；、、泳道为阳性其余为阴性Ｍ；ＤＮＡｍａｒｋｅｒＬａｎｅ３６７１０１５１７１８ａｒｅｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｎｅａｔｉｖｅ；，，，，，，ｐｇＭ１２３４５６７８９１０１２１２Ｄ１４１５１６１７１８１９２０１０００５００２５０１００图１２ＰＣＲ对中华蜜蜂临床样本检测结果Ｆｉ．１２ＲｅｓｕｆｒｉｌｌｅｓｇｌｔｓｏｆＰＣＲｏｃｌｉｎｃａｓａｍｐＭ：ＤＮＡ７１１１７２１７分子质量标准；６、、０、５、泳道为ｂｐ条带呈阳性，其余为阴性ＭＮＡＬ１１７，：Ｄｍａｒｋｅｒａｎｅ６７０１５ａｒｅｏｓｉｔｉｖｅｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｎｅａｔｉｖｅ；，，，，ｐｇ３０ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５６７８９１Ｑ１１１２１３１４１５１６１７１Ｓ１９２）－图１３ＢＱＣＶＬＡＭＰ对意大利蜜蜂临床样本检测结果－Ｆ．１ＲｅｌｆＢＶＬＡＭＰｆｒｉｉｌｉｇ３ｓｕｔｓｏＱＣｏｃｌｎｃａｌｓａｍｐｅｓＭ：ＤＮＡ子质量标准１、４５、６、７、８１２１３１５１１７１１分、、９、、、、６、、８、９、２０，；泳道为阳性其余为阴性Ｌａｎｅ１１Ｍ；ＤＮＡｍａｒｋｅｒ１，４，５，６＞７，８，９，１２，３，１５，１６，１７，８，１９，２０ａｒｅｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｎｅｇａｔｉｖｅ；ｐＭ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０图１４ＰＣＲ对意大利蜜蜂临床样本检测结果Ｆｉ．１４ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｌｅｓｇｐＭ：ＤＮＡ分子质量标准；４、５、８、９、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９泳道为２１７ｂｐ条带呈阳性，其余为阴性Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ４，５，８，９，１２，１３，１５，１６，１７，１８，１９ａｒｅｎｅｇａｔｉｖｅ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅ３１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＬＡＭＰ检测中华蜜蜂和意大利蜜蜂阳性数量分别为５和１５，阳性检测率分别为２５％和７５％；ＰＣＲ检测中华蜜蜂和意大利蜜蜂阳性数量分别为３和１１，阳性检测率分别为５５ＬＡＭＰ１５％和％（表８）。可见无论意大利蜜蜂还是中华蜜蜂阳性检测率均明显高于ＰＣＲ一致检出率，与敏感性试验结果。表８ＬＡＭＰ和ＰＣＲ对临床样本检测结果比较Ｔａｂｌｅ８ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＬＡＭＰａｎｄＰＣＲｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｌｅｓｐ＂＂“ｉｉ样品数阳性检测数阳性率ＶａｒｉｅｔｙＭｅｔｈｏｄｓＳａｍｐｌｅｓＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｕｎｔｓＰｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅ中华蜜蜂ＬＡＭＰ２０５２５％ＡｉｓＣＲ２０１５ｐｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａＰ３％意大利蜜蜂ＬＡＭＰ２０１５７５％ＡｐｉｓｉｅｒａｉｔｃａＰＣＲ２０１１５５ｍｅｌｌｆｌｇｕｓｉ％３．２应用ＬＡＭＰ检测ＳＢＶ的研究结果－３．２．１ＳＢＶＬＡＭＰ反应体系的优化°ＬＡＭＰ￣根据反应原理在６１６５Ｃ进行温度优化，多次重复梯度条带没有明显区别（图°－ＬＡＭＰ２１５：Ａ）间温度６３Ｃ作为ＳＢＶ１、３，最后选择中最终反应温度。第条泳道比第一５条泳道清晰明亮些，选择第２条泳道代表的时间作为最终反应时间，即４ｍｉｎ（图１５：Ｂ）。泳道３、４、５、６比较模糊，１、２泳道清晰明亮程度较为相近，选择第１条泳－１ＢＶ－－ＢＢＶ－ＦＩＰ、ＳＢＶＢＩＰ道作为最终外内引物比：２，即ＳＦ３、ＳＢＶ３为０．４Ｓ为０．８ｎｍｏｌ／Ｌ（图１５：Ｃ）。根据明亮、清晰程度选择第３条泳道作最终Ｂｅｔａｉｎｅ浓度，即２＋０．６ｍｍｏｌ／Ｌ（图１５：Ｄ）。第２条泳道作为最终Ｍ浓度，即２ｍｍｏｌ／Ｌ（图１５：Ｅ）。ｇ３２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５Ｍｌ２３ｂｐ漏ＩＫｖｉＩ‘１０００Ｉ－ｉ２５０ＩＩ■１００ＤｍＨＨＨＨＡＢＭ１２３４５６７Ｍ１２３４５６７８Ｍ１２３４５６ＶｖｎＨＥＫｏＳ＾ＩＢＨＥＳＨｉＢＢＥＳＩＢＳＩｊｌ＾＾ｌ．５＾００ｂＶ冒誦ｂｐｉｍｂｐ■Ｍ２０００２０００ＷＨＭ二■■Ｉ’＆。■２＿ｓ１０００ＭＭｍ誦１０００７５０１０００ＢｉｌＢｌ■■：ｍＭｉ９ＩＥｍＩＣＤＥ图１５囊状幼虫病病毒ＬＡＭＰ体系优化Ｆ．ｉｍｎｉｇ１５ＴｈｅｏｐｔｉｚａｔｉｏｏｆＬＡＭＰｆｏｒＳＢＶ°°°°Ｍ？：ＤＮＡ分子Ａ：１５６ｒ６２６３６４６５：泳道质量标准；泳道分别为反应温度Ｃ、Ｃ、Ｃ、Ｃ、Ｃ；Ｂ－￣－１３３０ｍｉ泳道为反应时间ｉｎ、４５ｍｉｎ＞６０ｍｎＣ：１７ＳＢＶＬＡＭＰ外引物与内引物比例１；泳道为Ｃ￣：２、：：：：：：ｌ／．ｌ／１３、１４、１５、１６、１７、１８Ｄ：１８道为甜菜碱终浓度０ｍｍｏＬ、０４ｍｍｏＬ、；泳２＋０？Ｍ．６ｍｍｏＬ、１０ｍｍｏＬ１２ｍｍｏＬ１６ｍｍｏｌＬ２．０ｍｍｏｌＬ１６ｌ／０．８ｍｍｏｌ／Ｌ＞．ｌ／、．ｌ／、．／＞／Ｅ：；泳道为ｇ终浓度０ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ＞４ｍｍｏｌ／Ｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１８ｍｍｏｌ／Ｌ。°°＂＂＂ａｎｅ－－ＬＭ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ：ｎｅｔｅｍｅｒａｔｕｒｅＣＣＣＣ５Ｃ：ａｎｅ１ｔｍｅｍｎ５ｍｎｉｎ：；ＡＬａ１５６１６２６３６４６；ＢＬ３ｉ３０ｉ４ｉ，６０ｍＣｐ，，，，，；Ｌ－：：－ＢＬａｎｅ１７ｒａ．．ｔｉｏｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｏｔｈｅｅｘｔｅｒｎａｌｒｉｍｅｒｓｆｏｒｍ１２ｔｏ１８Ｄ：Ｌａｎｅ１８ｅｔａｉｎｅ：０ｍｍｏｌ／０４ｍｍｏｌ／Ｌ０６ｐ；，，＾＋－０．８ｍｍｏ．．Ｌ．．ｍｍｏｌ／Ｌｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ，１２ｍｍｏｌ／，１６ｍｍｏｌ／Ｌ’２０ｍｍｏｌ／ＬＥ：Ｌａｎｅ１６Ｍｇ：０ｍｍｏｌ／Ｌ２ｍｍｏｌ／Ｌ，４ｍｍｏｌ／Ｌ，，；，６ｍｍｏｌ／Ｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ１８ｍｍｏｌ／Ｌ．，，３３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究３－．２．２ＳＢＶＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应与鉴定３２２－１ＬＡＭＰ外ＰＣＲ反应．．．ＳＢＶ引物的１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示泳道１为阴性对照呈阴性，泳道２为阳性扩２１２ｂ３１５０增可见清晰明亮的条带，大小片段与预期ｐ相吻合，泳道为ｂｐ的内参（图１６）。Ｍ１２３２０００１０００７５０５００２５０１００图１６ＰＣＲ检测ＳＢＶ囊状幼虫病毒结果Ｆｉ．１６ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｆｏｒＳＢＶｇＭ１２ＳＢ：ＤＮＡ分子质量标准：：ＶＬＡＭＰ外引物３：１５０ｂ。；阴性对照；；内参ｐＴ－ｍａｒｋｅｒｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２：ｆｒｍｅｒｒｉｍｅｒｏｆＬＡＰｆｏｒＳＢＶ３：ａｃｔｉｎ１５０．Ｍ：ＤＮＡ；１：Ｎｅｇａ；ｈｅｏＭｐｂｐ；ｐ３２２２ＳＢＶ－ＬＡＭＰ外．．．引物的克隆测序与鉴定所得阳性菌液委托上海华大基因生物公司测序，利用Ｒｅｓｅａｒｃｈ序列处理软件找到引物序列，ｌａｓｔｅｎＢａｎｋ４９５２６７，得到目的基因片段将该序列Ｂ与Ｇ收录ＫＭ的全序列对比覆盖范围９３％，同源率达到９８％（图１７、图１８），证明该序列为ＳＢＶ特有的序列，说明此ＬＡＭＰ的外引物可以用于ＰＣＲ检测中华蜜蜂囊状幼虫病的分子标记。根据ＬＭＡＰ的反应原理可得出此ＳＢＶ的内、外引物可以用于ＬＡＭＰ检测中华蜜蜂囊状幼虫病的分子标记。３４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｃＨｉｅｒｆ７７ＳａｓｔＨｉｔｓｏｎｔｉｈｅＱｉ＾ｒｙＳｅｑｕｅｎｃｅ＃ｆ＾ｏ－ｕｓｅｏｖｅｒｔｏｄｅｆｉｎｅａｎｄｓｃｏｒｅｓｃｉｔｃｋｔｏｓｈｏｗａｌｉｎｍｅｎｔｓ｜ｇＣｏｌｏｒｋｅｙｆｏｒａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｃｏｒｅｓＩＩＩＩＩＩＩ１３０６０９０１２０１５０１８０图７－ＬＡＭＰ外引物测序片段与数据库比对结果１ＳＢＶＦ－．１７ＴｔｒｅｓｕＢＶＬＡＰｒｉｇｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｌｔｏｆＳＭｏｕｔｅｒｒｉｍｅｓｅｕｅｎｃｅｐｑＳａｃｂｒｏｏｄｖ－ｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅＣＳＢＶＦＺｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅ，ｐｇＳｅｑｕｅｎｃｅＤ：ｂｉＫＭ４９５２６７ＩＩＬｅｎ：ｉｍ）ｆＩｑｇｔｈ８８００ｆａｌｅ丨ｏＭａｔｃｈｅｓ：１？‘Ｒａｔ５７４ＧｅｎＢａｎｋＧｒ？ｒｎｇｅ１ｉ？ｒｒｈ”：４０１ｏａｐｈｃｓＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓＧａｐｓＳｔｒａｎｄ。３００ｂ－ｉｔｓ１６２５ｅ７８１７０１７４（９８％）０１７４（０／。）ＰｌｕｓＰｌｕｓ（）／／／Ｑｕ＾ｒｙ１３ＡＴＧＯＴＴＧＯＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＯＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＴＯ７２ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ＾Ｓｂｊｃｔ４０１ＡＴＣＣＴＩＧＯＳＴｎａＣＯＵＴＧＴＡＤ＾ｎＡＡＣＵＧＡＡＤＪＴＣＣＡＣＵＴＡＣＣＧＡＡＡＫＴＣＣＡＯＴＧ４６０Ｑｕｅｒｙ７３ＡＴＣＡＧＡＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＯＧＡＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＯＴＴＭＯＡＣＣＧＣＡＧＡＡＯ１３２ｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｆｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｃｍ＇Ｓ２０Ｓｂｊｔ４６１ＡＴＯＧＴ（３０ＡｊＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＯＯｊＵＴＯＴＴＡ＾ＡＣＯＴＣＣＡＯＴＧＴＣＡＧＴＴＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＡＡＧＱｕｅｒｙ１３３（ＪＡＡＣＴＡＴＡｃ＾ＴＸＧＴＵＴ１ＭＪＣＣＧＡｍＴＡＣＣＴＣＴＴＡＣＡＧ口８６ｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｍｉｍｍｍｍｉｍｍｉｍｉｉｉｉｉｉｔＡＡＥＡｍＧＡＴａＧ５２ＪｗｎｉＳｂｊｃ１ＧＣＵＴＡＪＴＡＴＯａＧＴＴ丁ＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＣＡＡＡＧＵＧａＴ５７４－图１８ＳＢＶＬＡＭＰ外引物测序片段与ＧｅｎＢａｎｋ中ＫＭ４９５２６７比对结果Ｆ－．１ＴＶＬＡＭＰｏｕＫＭｉｇ８ｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＳＢｔｅｒｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅａｎｄ４９５２６７ｉｎＧｅｎＢａｎｋｐｑ３．２．３ＬＡＭＰ与ＰＣＲ的敏感性对比实验ＳＢＶ－ＬＡＭＰ体系与常规ＰＣＲ用已完成优化的同等条件下进行检测，灵敏度结果显－－－示ＳＢＶＬＡＭＰ体系可达９３ｆ的ＲＮＡ模板（图９Ａ）、ＳＢＶＰＣＲ体系可达０．９３ｇ１ｐｇ的ＲＮＡ模板９－０（图１Ｂ），说明ＬＡＭＰ的灵敏度比本研究建立的ＰＣＲ反应髙１倍。３５ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５６Ｍ１２３４５６－Ａ５图１９ＬＡＭＰ（Ａ）与ＰＣＲ（Ｂ）敏感性对比图Ｆｉ．ｈｃｏｍａｒｏＬＡＭＰｎｄＰＣＲｇ１９ＴｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｉｓｏｎｆａｐＭ￣：ＤＮＡ分子质Ａ：依次稀１ＢＶ模板的ＬＡＭＰ琼脂糖凝胶电泳结果，１６：０９３ｎ量标准；释０倍Ｓ．ｇ、９３ｐｇ、９．３ｐｇ，０．９３ｐｇ、９３ｆｇ、９．３ｆｇ；Ｂ：依次稀释１０倍ＳＢＶ模板的ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳结果，？１：０＿９３ｎ、９３０９３９３ｆ６ｇ９３ｐｇ、．ｐｇ、．９３ｐｇ、ｆｇ、．ｇ。－－ｒｋｅＡＡｌｒｒＡＭｕＢＶ１．９．Ｍ：ＤＮＡｍａｒ：ａｒｏｓｅｅｌｅｅｃｔｏｈｏｅｓｉｓｏｆＬＰｒｏｄｕｃｔｓｓｉｎ１０ｆｏｌｄｄｉｌｕｔｉｏｎＳ，６：０３ｎ，９３，９３，；ｇｇｐｐｇｇｐｇｐｇ－－０．９３．ＢＡｒｒＰｔ１ｌｔｉＳＢＶ１６．．，９３ｆ，９３ｆ；ａｒｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｏｐｈｏｅｓｉｓｏｆＣＲｒｏｄｕｃｓｕｓｉｎ０ｆｏｌｄｄｉｕｏｎ，：０９３ｎｇ，９３９３ｐｇｇｇ；ｇｐ，，ｇｇｐｇｐｇ０．９３９３ｆ９．３ｆ．，ｐｇ，ｇｇ３．２．４可视化ＬＡＭＰ的特异性试验用已完成优化反应的ＳＢＶ－ＬＡＭＰ检测ＢＶ的ｃＤＮＡ反应呈多，最终结果显示只有ＳＣＶ－梯形条带出现，对照的ＢＱ、ＤＷＶ的ｃＤＮＡ和阴性对照没有多梯形条带（图２０Ａ）。焚光可视化结果只有ＳＢＶ试管显绿色荧光，其他阴性对照和ＢＱＣＶ、ＤＷＶ试管显橘色（－Ｂ图２０）。３６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍｌ２３４１２３４２：１０００、５。。Ｈ：；奮偏、１１ｊ＾＾＾醫冒Ｗ２５０魅１００，．：＾｜ＡＢ图２０ＳＢＶＬＡＭＰ反应特异性扩增结果Ｆｉ．２０ＬＡＭＰｓｅｃｉｆｉｃａｍｌｉｆｉｅｄｒｏｄｕｃｔｓｏｆＳＢＶｇｐｐｐＭＤＮＡＡＳＢＶ－ＬＡＭＰ１２ＢＱＣＶ：分子质量标准：，：阴，：，；反应特异性琼脂糖凝胶电泳图性对照３：ＤＷＶ４：ＳＢＶＢ：１：２：ＢＣＶ３：ＤＷＶ４：ＳＢＶ。，；突光可视化特异性试验，阴性对照，Ｑ，，Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＡ：ＬＡＭＰｓｅｃｉｆｉｃａｍｌｉｆｉｅｄｒｏｄｕｃｔｓｏｆＳＢＶ，１：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２：ＢＣＶ３：ＤＷＶ４：ＳＢＶＢｉＴｈｃｖｉｓｕａｌ，ｐｐｐ，Ｑ，，；ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＢＱＣＶ１：ｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２：ＢＱＣＶ３：ＤＷＶ４：ＳＢＶ．Ｎ，，，，ｇ３２５．．临床样本的检测对釆自福州闽侯蜂场的中华蜜蜂成蜂２０份样品同时用ＬＡＭＰ和ＰＣＲ进行检测。分ｉ１５％另，ＬＡＭＰ７ｊ用．和１．０％琼脂糖凝胶电泳观察结果检测中华蜜蜂样本１、３、４、、８、１０、１２、１３、１４、１５、１９、２０泳道为阳性其余为阴性（图２１），ＰＣＲ检测中华蜜蜂样本１、４、７、８、１０、１２、１４、１９、２０泳道为２１２ｂｐ条带呈阳性其余为阴性（图２２）。３７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４５６７８９１０Ｕ１２１３１４１５１６１７１８１９２０；ＩＭＴ＾Ｗ量邏：ｌ—ＭｉＭ＾２－图１ＳＢＶＬＡＭＰ对中华蜜蜂临床样本检测结果－Ｆ．１ＢＶｉｇ２ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＳＬＡＭＰｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１、３、４、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１９、２０泳道为阳性，其余为阴性Ｌａｎｅ１１１５ｒｅ，ｒＭ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ１３４７８０１２１３４１９２０ａｏｓｉｔｉｖｅｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｅｎｅｇａｔｉｖｅ；，，，，，，，，，，，ｐＭ１２３４５６７８９１０Ｕ１２１３Ｍ１５１６１７１８１９２０１０００图２２ＰＣＲ对中华蜜蜂临床样本检测结果Ｆｉｇ．２２ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｌｅｓｐ：ＤＮＡ分子质量标准１、、８、１１２、４１９、１ｂＭ；４、７０、１、２０泳道为２２ｐ条带呈阳性，其余为阴性Ｍｒ７：ＤＮＡｍａｋｅｒＬａｎｅ１４，８，１０１２，１４，１９，２０ａｒｅｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｎｅａｔｉｖｅ；，，，ｐｇ３８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＬＡＭＰ检测中华蜜蜂阳性数量分别为１２，阳性检测率分别为６０％；ＰＣＲ检测中华－蜜蜂阳性数量分别为９，阳性检测率分别为４５％（表９）。可见针对中华蜜蜂ＳＢＶＬＡＭＰＰＣＲ检一。阳性检测率均明显高于常规出率，与敏感性试验结果致表９ＬＡＭＰ和ＰＣＲ对临床样本检测结果比较Ｔａｂｌｅ９ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＬＡＭＰａｎｄＰＣＲｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ品种方法样品数阳性检测数阳性率ＶａｒｉｅｔｙＭｅｔｈｏｄｓＳａｍｐｌｅｓＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｕｎｔｓＰｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅ中华蜜蜂ＬＡＭＰ２０１２６０％ＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａＰＣＲ２０９４５％、３．３应用ＬＡＭＰ检测ＤＷＶ的研究结果３１－ＬＡＭＰ．３．ＤＷＶ反应体系的优化°ＬＡＭＰ￣根据反应原理在６１６５Ｃ进行温（度优化，多次重复梯度条带没有明显区别图°２３６３Ｃ作为ＤＷＶ－。：Ａ），最后选择中间温度ＬＡＭＰ最终反应温度第３与４条泳道清一晰明亮些，出于简便快速完成反应的考虑选择第３条泳道代表的，但没有明显的区别时间作为最终反应时间：３，即６０ｍｈｉ（图２３Ｂ）。泳道１、２没有反应，第泳道最为清－－晰明亮程度３１：４ＤＷＶＦ３、ＤＷＶＢ，故选择第条泳道作为最终外内引物比，即３为０．４－－Ｈｍｏｌ／Ｌ，ＤＷＶＦＩＰ、ＤＷＶＢＩＰ为１．６ｐｍｏｌ／Ｌ（图２３：Ｃ）。根据明亮、清晰程度选择第２＋１条泳道作最终Ｂｅｔａｉｎｅ浓度，即０ｍｍｏｌ／Ｌ（图２３：Ｄ）。第２条泳道作为最终Ｍ浓度，ｇ即２ｍｍｏｌ／Ｌ（图２３：Ｅ）。３９ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４１４１２５．２０３０ｎＤＡＢＭｌ２３４５６Ｍｌ２３４５６７ＳＭ１２３４５６ｍ？－■ｍｍｉＤ■■ｔｌｏｏｏＩ棚‘Ｉ■ｉｉｓ１７５０ｍｈ：Ｊ７５０：ｎ驪Ｉ；ｊｇｇ｜｜９＂＂ｈＩｎｎ＾ＫＭｙｌｌｉｉｉＢｉａＣＤＥ图２３残翅病毒ＬＡＭＰ体系优化Ｆ．２３ＴｉｚｉＬＡＭＰｉｇｈｅｏｐｔｉｍａｔｏｎｏｆｆｏｒＤＷＶ°°°°Ｍ？：ＤＮＡ分Ａ：１５ｒＣ、６２６３６４：泳道子质量标准；泳道分别为反应温度６Ｃ、Ｃ、Ｃ、６５Ｃ；Ｂ－－－１３３０ｍｎ４５ｍｎ６０ｍｉｎ７５ｍｉｎＣ：１６ＬＡＭＰ外引物与内泳道为反应时间ｉ、ｉ、、；泳道为ＤＷＶ引物：？比例１：２、１３、１：４、１：５、１：６、：１道为甜菜碱终浓度０ｍｍｏＬ０４ｍｍｏ１７Ｄ：８ｌ／、．ｌ／Ｌ＞；泳＋２￣０．６ｌ／Ｌ０ｍｏＬ１．０ｍｍ／］２ｍｍｏｌＬ、１６ｌ／Ｌ２．０ｌ／Ｌ１６道为Ｍｍｍｏ、．８ｍ】／、ｏｌＬ＞．／．ｒｎｍｏ、ｍｍｏＥ：；泳ｇ终浓度０ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１８ｍｍｏｌ／Ｌ。。。。。。ｅＡ－－ＬａｎＭ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒｎｅｔｒｔｕＣＣＣ６４ＣＣａｎｅ１ｔｉｉｎ４５ｍｉｎｉ７０：Ｌａ１５ｅｍｐｅａｒｅ６１６２６３，６５Ｂ；Ｌ３ｍｅ３０ｍ６０ｍｎ；，，，；，，，＊ｎ－－Ｃ１ｒｍ■ｌＬｍｉｎ；Ｌａｅ６ｒａｔｉｏｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｏｔｈｅｅｘｔｅｒｎａｌｒｉｍｅｒｓｆｏ２ｔｏ１７Ｄ：Ｌａｎｅ１８Ｂｅｔａｉｎｅ：０ｍｍｏ／，０．４ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐ１；，２＋Ｌ－ｍｏ．０．８ｍｍｏ．１．．Ｌ．ＥＬＬｌ０６ｍｍｏｌ／ｌ／Ｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ２ｍｍｏｌ／Ｌ１６ｍｍｏｌ／２０ｍｍｏｌ／Ｌ：ａｎｅ１６Ｍ：０ｍｌ／２ｍｍｏ／Ｌ４，，，，，；ｇ，，ｍｍｏｌ／Ｌ６ｍｍｏｌ／Ｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ１８ｍｍｏｌ／Ｌ．，，，４０ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究３ＤＷＶ－ＬＡＭＰＰＣＲ．３．２外引物的反应与鉴定３－．３．２．１ＤＷＶＬＡＭＰ外引物的ＰＣＲ反应１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示泳道１对照组呈阴性，泳道２为阳性扩增可见清晰明亮的条带，大小片段与预期２１６ｂｐ相吻合，泳道３为１５０ｂｐ的内参（图２４）。Ｍ１２３■７５。ｉｏ８图２４ＰＣＲ检测ＤＷＶ囊状幼虫病毒结果Ｆ．ｔｔｉｏｌｓＰｆｏｒＤＷＶｉｇ２４ＴｈｅｄｅｅｃｎｒｅｓｕｔｏｆＣＲ－Ｍ：ＤＮＡ分１：２：ＤＷＶＬＡＭＰ外引物３：１５０ｂ。子质量标准；阴性对照；；内参ｐｒｍｒＬＡＭＰ－ＭＤ．：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ１：Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２：ＴｈｅｆｏｅｒｉｍｅｒｏｆｆｏｒＷＶ３：ａｃｔｉｎ１５０ｂ；ｇ；；ｐｐｐ３３２２ＤＷＶ－ＬＡＭＰ外引物的克隆测序与鉴定．．．所得阳性菌液委托上海华大基因生物公司测序，利用Ｒｅｓｅａｒｃｈ序列处理软件找到ｌＧＢ４８９７４４弓，ａｓｔｅｎａｎｋ丨物序列，得到目的基因片段将该序列Ｂ与收录ＡＪ的全序列对比覆盖范围８６％，同源率达到９６％（图２５、图２６），证明该序列为ＤＷＶ特有的序列，说明此ＬＡＭＰ的外引物可以用于ＰＣＲ检测蜜蜂的残翅病的分子标记。根据ＬＭＡＰ的反应原理可得出此ＤＷＶ的内、外引物可以用于ＬＡＭＰ检测蜜蜂残翅病的分子标记。４１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温ｙ增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｏｉｓｍｌｘｊｔｋｘｉｏｆ１（Ｘ｝ＢｌａｓｔＨｒｔｓｏｎｔｈｅＱｕｅｒｙＳｅｑｕｅｎｃｅ咬Ｍｏｕｓｅ－ｏｖｅｒｔｏｓｈｏｗｄｅｆｎｅａｎｄｓｃｏｅｓｃｃｋｔｏｓｈｏｗａｎｍｅｎｔｓｌｉｒｌｉｌｉｇＣｏｌｏｒｋｅｆｏｒａｌｉ＿ｅｎｔｓｃａｒｅｓｙｓｍｅｅ—＾ＩＩＩＩＩＩＩ１３０６０９０１２０１５０１８０图２５ＤＷＶ－ＬＡＭＰ外引物测序片段与数据库比对结果Ｆ２５－ｍｅｒＴｈｅａｎｍｅｎｒｅｓｕｏＤＷＶＬＡＭＰｏｕｅｒｒｅｕｅｎｃｅｉｇ．ｌｉｇｔｌｔｆｔｉｓｐｑＤｅｆｏｒｍｅｄＷｉｎｇＶｉｒｕｓｇｅｎｅｆｏｒｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ，ｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅＩＰ：ｅｍｂ｜ＡＪ４８９７４４２１Ｌｅｎｇｔｈ：１０１４０ＮｕｍｂｅｒｏｆＭａｔｃｈｅｓ：１Ｒａｎｇｅ１：８７９８ｔｏ８９７０ＧｅｎＢａｎｋＧｒａｐｈｉｃｓ，ＭａＰｉＳｃｏｒｅＥｘｐｅｃｔＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓＧａｐｓＳｔｒａｎｄ２７９－％。ｂｉｔｓ１５１８ｅ７２１６６７３９６２７３１／。Ｐｌｕｓ／Ｐｌｕｓ（）／１）／１）（（—Ａ－＂ＡＴＡＣＴＴＧ８Ｑｕｅｒｙ２７ＣＣＴＣＡＣ）ＣＵＴＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＯＴＴＴＧＷＧＴＴＴ＜；ＣＣＴＧＴＧＯｍＭＴＧＴＡＧＡ４ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｍＳｂｊｃｌ８７９８ＣＣＴＣＡＣＡＣＴＡＴＡＴＴＣＡＣＧＣＡＴＴＯＴｎＧＡＵＯＡＴＡＣＴＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＯＴＡＧＡ８８５７Ｑｕｅｒｙ８５ＡＴＡＣＣＴＧＯＴＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＡＡＧＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＡ１４４ｍｉｍｍｉｉｉｉｉｍｉｍｉｉｉｉｉｍｉｉｍｉｉｍｍｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＳｂｊｃｌ８８５８ＡＴＡＣＣＴＧＯＴＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＡＡＧＴＣＣＧＯＴＡＣＡＧＴＴｒＡＣＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＣＧＡ８９１７Ｑｕｅｒｙ１４５ＣＡＯＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＴＧＯＣＡＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡ１９７ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌＭＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｌＳｂｊｃｔ８９１８ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡＣＴＴＴＡＴＧＯＣＡＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＡＣＴＴＭＴＯＣＴＧＡ８９７０图２６ＤＷＶ－ＬＡＭＰ外引物测序片段与ＧｅｎＢａｎｋ中Ａ４８９７４４比Ｊ对结果－Ｆｉ．２６ＴｈｅａｌｉｎｍｅｎｕｅｎｃＡＪ７４４ＢｇｇｔｏｆＤＷＶＬＡＭＰｏｕｔｅｒｒｉｍｅｒｓｅｅａｎｄ４８９ｉｎＧｅｎａｎｋｐｑ３．３．３ＬＡＭＰ与ＰＣＲ的敏感性对比实验ＤＷＶ－ＬＡＭＰ体系与常规ＰＣＲ用已完成优化的同等条件下进行检测，灵敏度结果－ＬＡＭＰ０８９ＲＮＡ（２７－Ａ）－显示ＤＷＶ体系可达．的模板图、ＤＷＶＰＣＲ体系可达８９ｐｇｐｇ的ＲＮＡ模板２７－Ｂ）ＤＷＶ－ＬＡＭＰ的灵敏度比本ＤＷＶ－ＰＣＲ灵敏（图，说明研究建立的度高１００倍。４２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病逛的研究Ｍｌ２３４５６７Ｍ１２３４５６７ｉｌ：：：ｉｌＭＡＢ图２７ＬＡＭＰ（Ａ）与ＰＣＲ（Ｂ）敏感性对比图Ｆｉ．２７ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＬＡＭＰａｎｄＰＣＲｇＡ－Ｍ：ＤＮＡ１０ＤＷＶＬＡＭＰ１７：８．９ｎ分子质量标准；：依次稀释倍模板的琼脂糖凝胶电泳结果，ｇ＾０８９ｎ８９８９０８９８９ｆ８９ｆＢ：依次稀释１０ＣＳＢＶＰＣＲ．ｇ、ｐｇ、．ｐｇ、．ｐｇ、ｇ、．ｇ；倍模板的琼脂糖凝胶￣８电泳结果７．９ｎ０．８９ｎ８９８．９０．８９８９８９，１：ｇ、ｇ、ｐｇ、ｐｇ、ｐｇ、ｆｇ、．ｆｇ。－Ｍ－：ＤＮＡＡＡｎｆｏｌｄｉｉ．．ｍａｒｋｅｒ：ａｒｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｏｆＬＡＭＰｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉ１０ｄｌｕｔｏｎＤＷＶ１７：８９ｎ，０８９ｎｇ８９，；ｇ，，ｇｐｐｇｇｐｇ－－８．９０．８９．ｒｒ１ｌｉｌ１．．，８９ｆ，８９ｆＢ：ＡｒｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｏｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎｇ０ｆｏｄｄｕｔｉｏｎＤＷＶ７：８９ｎ０８９ｐｇ，ｐｇｇｇ；ｇａｇｐｐ，ｇ，ｎ８９．０．８９８９ｆ８．９ｆｇ８９，，，ｐｇ，ｐｇｐｇｇ，ｇ３３４可ＤＷＶ－ＬＡＭＰ的特异性试验．．视化ＤＷＶ－ＬＡＭＰＤＷＶ的ＤＮＡ反用已完成优化反应的检测，最终结果显示只有ｃ应呈ＣＶ－多梯形条带出现，对照的ＢＱ、ＳＢＶ的ｃＤＮＡ和阴性对照没有多梯形条带（图２８Ａ）。荣光可视化结果只有ＤＷＶ试管显绿色劳光，其他阴性对照和ＢＱＣＶ、ＳＢＶ试管显橘色－（图２８Ｂ）。４３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ｌａｍｐ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究Ｍ１２３４１２３４“：ｉｔ’＾＜ｆ參ｍＡＢ图２８ＤＷＶＬＡＭＰ反应特异性扩增结果Ｆｉｇ．２８ＬＡＭＰｓｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＤＷＶｐＡＤＷＶ－ＬＡＭＰ反Ｍ：ＤＮＡ１ＤＷＶ２ＢＱＣＶ：分子质量标准：，：，：，３；应特异性琼脂糖凝胶电泳图ＳＢＶ，４：阴性对照；Ｂ：焚光可视化特异性试验，１：ＤＷＶ，２：ＢＱＣＶ，３：ＳＢＶ，４：阴性对照。Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．Ａ：ＬＡＭＰｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｏｄｕｃｔｓｏｆＤＷＶ？１：ＤＷＶ，２：Ｂ３：ＳＢＶ４：ＮｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＢ：ＴｈｅｐＱＣＶ，，ｇ；ｖｌｏｅｒｖａｃｉｍＶ１ＶＶＮｅｒ．ｉｓｕａｂｓｔｉｏｎｏｆｓｅｉｆｃａｐｌｉｆｉｅｄｒｏｄｕｃｔｓｏｆＢ，：ＤＷ２：Ｂ，３：ＳＢ４：ａｔｉｖｅｃｏｎｔｏｌｐｐＱＣ，ＱＣＶ，ｇ３．３．５临床样本的检测对采自福州闽侯蜂场的意大利蜜蜂成蜂２０份样品同时用ＬＡＭＰ和ＰＣＲ进行检测。分别用１．５％和１．０％琼脂糖凝胶电泳观察结果，ＬＡＭＰ检测意大利蜜蜂样本１、３、４、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１９、２０泳道为阳性其余为阴性（图２９），ＰＣＲ检测意大利蜜蜂样本１、４、７、８、１０、１２、１４、１９、２０泳道为２１６ｂ条带呈阳性其余为阴性（图３０）。ｐ４４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜峰病母的研究Ｍ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０５００：：：ｔ漏■＇■■■ｌｉｌＨｌ图２９ＤＷＶ－ＬＡＭＰ对意大利蜜蜂临床样本检测结果－ｍＦｌｉｇ．２９ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＤＷＶＬＡＭＰｆｏｒｃｉｎｉｃａｌｓａｐｌｅｓＭ：ＤＮＡ１５１１２１３１５、１１８、１９，分子质量标准；、４、、８、０、、、７、泳道为阳性其余为阴性Ｍ１１ｔｔｉｖｅ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１４５８０２１３１５１７１８１９ａｒｅｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅｏｈｅｒｓａｒｅｎｅｇａ；，，，，，，，，，，ｐＭ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０图３０ＰＣＲ对意大利蜜蜂临床样本检测结果Ｆ．Ｒｌｉｌｌｉｇ３０ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣｆｏｒｃｎｉｃａｓａｍｐｅｓＭ：ＤＮＡ分子１、４、９、１２、１５、１８、１９２１６ｂ，质量标准；泳道为ｐ条带呈阳性其余为阴性ｖｅｍａｒＬ２１ｒｅｅｏｅｒｓａｒｅｎｅａＭ：ＤＮＡｒｋｅａｎｅ１４，９１１５１８９ａｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｔｈｔｉ；，，，，，ｐｇ４５ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究ＬＡＭＰ检测意大利蜜蜂阳性数量分别为］１，阳性检测率分别为５５％；ＰＣＲ检测意大利蜜蜂阳性数量分别为７，阳性检测率分别为３５％（表１０）。可见针对意大利蜜蜂一ＤＷＶ－ＬＡＭＰＣＲ阳性检测率均明显高于常规Ｐ检出率，与敏感性试验结果致。表１０ＬＡＭＰ和ＰＣＲ对临床样本检测结果比较Ｔａｂｌｅ１０ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＬＡＭＰａｎｄＰＣＲｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ品种方法样品数阳性检测数阳性率ＶａｒｉｅｔｙＭｅｔｈｏｄｓＳａｍｐｌｅｓＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｕｎｔｓＰｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｌａｍｐ２０１１５５％意大利蜜蜂Ａｉｓｍｅｌｌｌｔｉｐｉｆｅｒａｉｇｕｓｃａ２０７３５％４讨论４１．关于ＬＡＭＰ引物设计ＬＡＭＰ的引物设计工作在整个实验中起十分关键的作用。由于ＬＭＡＰ设计要针对勒基因序列６个区域设计４条引物，要求紀基因序列的保守性较高。首先通过ＮＣＢＩ找到ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ同属其他病毒基因的全序列，通过ＤＮＡｍａｎ软件进行序列对比，找到同源性高的区域，这是在长期进化变异过程中保守的部分对照ＢＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ；Ｑ在国内的不同亚型，发现这三种亚型基因序列上差异不大，找到的大约８００ｂｐ的序列。而且可以设计２？３对引物，通过引物蹄选设计成功率比较高。具体的ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ弓丨物设计过程需要注意如下几步：＇１）５端Ｆ２区域到Ｂ２区域之间的距离控制在１２（Ｍ８０ｂｐ，Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３和Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３各个区域间距？在１８２０ｂｐ。°２Ｔｍ值和ＧＣＴ片段５？６？）引物含量：富含Ａ５（ｒＣ，富含ＧＣ片段６０６５Ｃ物；引＇４０？６０％ＧＣ含量在。但这并不是绝对的，最好在此区间。在引物３端避免二级结构。３）人工筛选：通过人工蹄选可以大大提高引物设计的成功率，６个区域的ＴＭ值满足：Ｆ２＞Ｆ３、Ｂ３；Ｂ２＜Ｆ１、Ｂｌ；Ｆ２＜Ｂ２。引物合成后的蹄选，可以通过外引物Ｆ３和Ｂ３作常规ＰＣＲ试验，以免因为ＬＡＭＰ体系的原因造成对引物的误判。４６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究４．２关于ＬＡＭＰ体系优化２＋在ＬＭＡＰ反应体系中，时间、外内引物、比温度、Ｂｅｔａｉｎｅ浓度和Ｍｇ浓度都会对Ｂ－ＬＡＭＰ－ＬＡＭＰＤＷＶ－ＬＡＭＰ都对上述条件优化扩增有影响。所以ＱＣＶ、ＳＢＶ和，最终确定各个反应的最佳体系。°一￣６５ｔ６０？６５ＢｓｔＤＮＡ酶在６０：条件下进行等温循环扩增，本试验分别Ｃ对同体系－－、－ＬＡＭＰ进行多次重复反应，发现温度ＢＱＣＶＬＡＭＰＳＢＶＬＡＭＰ和ＤＷＶ反应差异很°９５一Ｃ［小３。与杨素等研究结果保持致１，最后选择中间温度６作为反应温度一３０？６０ＬＡＭＰ反应快速，般在ｍｉｎ即可完成反应。本试验设置３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、Ｖ－ＬＡＭＰ－６０ｍｉｎ、７０ｍｉｎ进行优化。发现ＢＱＣ、ＳＢＶＬＡＭＰ在反应４５ｍｉｎ即可出现清－ＬＡＭＰ－晰明亮的条带，且到６０ｍｉｎ效果没有更好，固ＢＱＣＶ、ＳＢＶＬＡＭＰ时间优化结＇－ＬＡＭＰ７０果选择４５ｍｉｎ；ＤＷＶ在６０ｍｉｎ出现清晰明亮条带且到ｍｉｎ没有更加清晰明ＤＷＶ－ＬＡＭＰ。ＡＭＰ亮，固时间优化结果选择６０ｍｉｎ通过上述结果可以发现Ｌ反应时间与引物本身有很大关系，可以把时间缩短。而且有研究表明在引物设计时加入环引物９６］［在３０ｍｉｎ内。９ＡＭＰ［、ＬＡＭＰ反应扩增中夕卜内引物比和浓度是体系中对Ｌ影响最大的因素２，条外引物识别勒基因序列另外两条内引物起循环及延伸作用，所以外引物浓度要适宜，过高会抑制内引物与祀基因的结合，过低会破坏反应的完整性。固本试验固定外引０１／物浓度．４１１１１０１＾优化内引物浓度。试验发现内引物适当增加会提高多条带的量，当到＾一－－．定程度会抑制整个反应。ＢＱＣＶＬＡＭＰ外内引物比１：３时结果最好，ＳＢＶＬＡＭＰ外内Ｍ２＋ＡＭ引物比１：２结果最好，ＤＷＶ－ＡＬＭＰ外内引物比１：４结果最好。ｇ在ＬＰ反应中与焦憐酸根离子反应影响着ＬＡＭＰ反应的结果。同时还影响ＤＮＡ酶活性和模板与引９８２＋［］－－ＶＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶ－物的结合。最终Ｍ优化结果ＢＱＣＬＡＭＰ均为２ｇｍｍｏｌ／Ｌｏｅａ一Ｂｔｉｎｅ可以减少碱基堆积在起使Ｂｓｔ聚合酶更容易作用于範序列，从而提高－－ＬＡＭＰＢＶ－ｅｔａｎ的反应效率。ＱＣＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ均表现出Ｂｉｅ不同浓９９Ｂ［］ｔａＬＡＭＰ的必需成度间清晰和明亮程度相差不大。有研究表明ｅｉｎｅ并不是份。这恰－－ＬＡＭＰＤＷＶ－ＬＡＭＰ中Ｂｅｔａ恰解释了ＢＱＣＶＬＡＭＰ、ＳＢＶ＞ｉｎｅ不同浓度最后结果差别４７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温ｆ增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究较小。由于它对提高反应的特异性和反应效率有帮助，所以本试验的体系中有Ｂｅｔａｉｎｅ－ｎｅ－成份。ＢＶＬＡＭＰ的Ｂｅｔａｉ浓度．８ｍｍｏｌ／Ｌ．ＳＢＶＬＡＭＰ的Ｂｅｔａｉｎｅ浓度０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、ＱＣ０ＤＷＶ－ＬＡＭＰａｎｅｉｍｎｏ。的Ｂｅｔｉ浓度０．６ｌ／Ｌ４．３关于ＬＡＭＰ产物验证ＬＡＭＰ引物区别于ＰＣＲ技术具有４条引物，所以它比ＰＣＲ技术具有更佳的特异性，一但出于对实验严谨性的考虑对ＬＡＭＰ产物般具有两种验证方法：１）酶切验证，在引物设计时加入酶切位点，得到的阳性产物经过酶切反应验证，琼脂糖凝胶电泳观察是否出现预期设计的条带。但此方法无疑给引物设计工作增添了很大麻烦一，而且些引物无法设计酶切位点。２）利用外引物ＰＣＲ和克隆实验，这正是本试验采取的方法。此种方法减轻了引物设计的工作，增加了后续的克隆实验，鉴于克隆实验是分子生物实验室基本操作易于掌握一。而且此方法还有个好处，就是外引物ＰＣＲ反应可以作为ＬＡＭＰ引物蹄选依据，也为减少体系成份对引物的干扰，为后续试验带来便利。４．４关于ＬＡＭＰ结果观察ＬＡＭＰ的结果观察有直接观察法、琼脂糖电泳法、焚光目测法、实时突光定量法和油度测定法。因为仪器等原因本试验建立了前三种观察方法。２＋因为Ｍ与焦憐酸根离子反应会产生沉淀，所以当ＬＡＭＰ反应结束把离心管放到ｇ离心机６０００ｒ／ｍｉｎ３０ｓ，观察管底是否出现白色沉淀来判断是否是阳性。实际操作，当产物较少时沉淀不明显。突光目测法有开盖和不开盖两种，由于开盖会增加假阳性的可能，本试验采用不开盖的方法即整合的韩黄绿素和氯化猛，阳性显示绿色焚光，阴性？显示橙色。配置．５２．０％４．３／ｃｍ４０ｍｉｎ电泳观１的琼脂糖，在电场强度为５ｖ情况下察多条带是否出现。此种方法因为可以观察条带的清晰和明亮程度，所以特别适合优化体系是使用。。实时池度仪不仅可以实时观察反应进行到何种程度，而且还可以进行定量有研究与焚光定量ＰＣＲ进行对比实验一致而且，两种方法检测的基因表达变化趋势基本实时独度仪体积较小携带方便，不像突光定量ＰＣＲ仪那样体积较大，有利于现场的实４８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温护增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究。。时检测实时独度仪的价格有些偏贵，这是限制它推广的主要原因－４ＢＶ－ＬＡＭＰＶ－．５ＱＣ、ＳＢＬＡＭＰ、ＤＷＶＬＡＭＰ体系的优势一一蜜蜂病毒病直都是蜜蜂最为重要的病害之，给养蜂生产实践带来很大困扰。蜜蜂的流行病学还在进一还并不知道什么数量浓度的病毒和什么具步研究当中，虽然现在。体条件激发病毒导致病害发生但是蜜蜂病毒病主因是病毒是可以确定的，如果常规抽、检发现蜂群大部分蜜蜂含有病毒，便可采取隔离保温等相应措施防止病害大面积集体的爆发。根据国内几份关于蜜蜂病毒的调查报告显示ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ都是分布最一为广泛的。因此有必要建立种高效、快速、简便和低成本的针对ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ的检测方法。一随着生物技术的飞速发展，ＰＣＲ技术得到广泛的推广，是种很好的核酸扩增方法。但是由于需要专门的扩增的仪器和繁琐的步骤一些基层养蜂单位甚至野外坏境，使得在使用受到限制。现在基层养蜂技术人员基本还是根据病害的典型症状来判断病害的发生，但同时具有具有滞后性。又因为蜂产品中抗生素的检测使得蜂，具有十分的可靠性群物药可用，即使发现病害也往往没有办法治疗，又可能面临着蜂场集体大面积爆发的局面。于是针对这种情况提出对蜜蜂病毒病进行防控，这就要求提早发现，才有进行防控的时间。从２０００年ＬＡＭＰ技术发明以来，便以简便、快捷、灵敏、特异、设备要求低等优点引起关注。而且该技术应用到细菌、病毒、微生物、胚胎性别鉴定、肿瘤检测等领域－。ＶＬＡＭＰ、ＳＢＶ－ＬＡＭＰ－ＬＡＭＰ检具有十分广泛的应用前景本研究建立ＢＱＣ、ＤＷＶ测体系，对ＢＱＣＶ、ＳＢＶ、ＤＷＶ基因保守序列进行引物设计，并经过多次重复试验对体系中主要成分进行优化。经过特异性和敏感性试验。反应结果可以通过直接观察法、琼脂糖凝胶电泳法、焚光染料法来判定。其中直接观察法和焚光染料法方便快捷适合在野外实验和条件简陋的基层单位。－Ｖ－ＬＡＭＰ－最后优化后的ＢＱＣ、ＳＢＶＬＡＭＰ、Ｄ胃ＬＡＭＰ检测体系具有其简便、快捷、灵敏、特异、设备要求低的优点，而且和ＰＣＲ技术同时进行临床检测对比实验，阳性检测率均高于ＰＣＲ与验证了其高灵敏性，帮助黑蜂王台病、囊状幼虫病、残翅病４９ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究的提早发现一，才能采取相应的防控措施。ＬＡＭＰ技术可以作为种检测技术在缺失仪器条件简陋的基层单位推广使用。４．６本研究的展望－－ＬＡＭＰ、ＳＢＶＬＡＭＰ、ＤＷＶ－ＬＡＭＰ的反应时间分别是５ｉｎｉｎ、４５ｍｉｎ、本试验ＢＱＣＶ４６０ｍｍ，如果在引物设计时加入环引物可以把时间缩短在３０ｉｎｉｎ左右。由于本试验研究的是病毒的检测，ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ具有易保存方便于优化试验，但是如果建立一ＲＴ－ＬＡＭＰ可以省咯反转录这步，使操作更为简便，更便于在生产实践中应用。ＬＡＭＰ技术已经在病毒检测方面有着广泛的应用，但是应用于蜜蜂病毒的检测才是一刚刚开始，真正达到野外条件检测还有定距离。首先实现样品的前处理简单化，经过。简单处理即可使ＲＮＡ裸露，可以让没有任何生物学基础的人员操作制成ＬＡＭＰ试剂一管盒，含有引物、优化的体系（混成）、荧光染料，通过绿色突光即可观察是否为阳。性实时独度仪的国产化，这样可以降低其成本，利于它的推广，甚至可以取代昂贵笨Ｒ一。ＬＡＭＰ重的突光定量ＰＣ仪还有蜜蜂流行病学的进步研究，结合的检测，可以在病毒发生的初期就采取措施对病毒进行防控，以提高防控效果。５０ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究参考文献１ＡＧＵＩＬＡＲＲＡＳＨＷＯＲＴＨＬＧＡＬＥＴＴＯＬｅｔａ．Ｐａｎｔｒｅｏｄｕｃｌｉｔｔｏｌｌｒｔｉｖｅｓｕｓｃｅｔｉｂｉｈａｂｉｔａｔ［，，，ｐ］ｐｙ－－ｆｍｅｎｔａｔｉｉＪ．ＥｌＬ２００６８９８０ｒａｉｏｎｒｅｖｅｗａｎｄｓｎｔｈｅｓｉｓｔｈｒｏｕｈａｍｅｔａａｎａｌｓｓｃｏｅｔｔ９：９６８．ｇｙｇｙ［］，，（）２ＫＬＥＥＪＢＥＳＡＮＡＡＭｅａｌ．ＷｉｄｅｒｅａｄｄｉｓｅｒａｌｏｆｈｅｍｉｃｒｏｓｏｒａｎＮｏｓｅｍａｒａｎａｅａｎｔｓｓｔｉｄｉＣｅ［］，，ｐｐｐＪＩＰ２００７９６１】－０ｅｍｅｒｅｎｔａｔｈｏｅｎｏｆ．ｔｈｅｗｅｓｔｅｒｎｈｏｎｅｂｅｅ．ｎｖｅｒｔａｔｈｏｌ：１ｇ，，（ｐｇｙ［］）３ＫＬＥＩＮＡＭＶＡＩＳＳＩＥＲＥＢＥＣＡＮＥＪＨｅａｌ．Ｉｍｏｒａｎｃｅｆｌｌｉｎａｔｒｎｃｈａｎｎｌｓｒ［，ｔｔｏｏｏｓｉｉａｎｄｓｃａｐｅｆｏ］，，ｐｐｇｇ－ｓＪ．ＰｒｏＢｉＳｃｉｅｎｃｅ２００７２７４ｗｏｒｌｄｃｒｏｏ１６０８３０３３１３．ｐ，，（：［］）４ＧＥＮＥＲＳＣＨＥＡＮＮＥＴＴＥＳＨＡＮＮＥＳＫｅｔａ．ＴＧｅｒｍａｎｅｅｍｏｎｔｒｎｒ：ｏｎｅｒｍｌｈｅｂｉｏｉｏｅｃｔａｌｔ［］，，，ｇｐｊｇｓｔｕｄｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｅｒｉｏｄｉｃａｌｌｈｉｈｗｉｎｔｅｒｌｏｓｓｅｓｏｆｈｏｎｅｂｅｅｃｏｌｏｎｉｅｓＪ．Ａｉｄｏｌｏｉｅ２０１０４１３：ｙｐｙｇｙ［］ｐｇ，，（）－ＪＪＺＪｊｉ．５ＢＯＥＣＫ－ＩＮＧＯＧＥＮＥＲＳＣＨＥ．ＶａｒｒｏｏｓｉｓｔｈｅｏｎｏｉｎｃｒｉｓｉｓｉｎｂｅｅｋｅｅｉｎＪ．ＶｅｒｂｒＬｅｂｅｎｓｍ２００８［，ｇｇｐｇ［，，］］３２－：２２１２２８（）．ｌｌｌｈｉｂｌｉ６ＥＹＥＲＭＣＨＥＮＹＰＳＣＨＡＦＥＲＭＯｅｔａ．Ｓｍａｖｅｅｅｔｅａｓａｏｔｅｎｔａｌｂｉｏｌｏｉｃａｌｖｅｃｔｏｒｏｆ［，］，，ｐｇ－ｈｏｎｅｂｅｅｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ａｉｄｏｌｏｉ２００９４０４ｅ：４１９４２８．ｙ，，［］ｐｇ（）７ＨＡＩＬＳＲＳＢＡＬＬＢＶＧＥＮＥＲＳＣＨＥＩｎｆｅｃｔｓｒａｅｅｓｏｆｎｓｅｃｖｉｒｕｓｅｓＭ．Ｅｕｒｏｅａｎ．ｉｏｎｔｔｉｉｔ，，ｇｐ［］［］－Ｃｏｍｍｉｌ．ｉｓｓｉｏｎ：ＶｒｏｏａｎｄｔｈｅＨｏｎｅＢｅｅ２００８：２５５２７６ｇｙ，ｙ８ＯＮＧＵＳＪＲＰＥＴＥＲＳＤＢＯＮＭＡＴ－ＩＪＭｅｔａｌｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆａｉｃｏｍａｌｉｋｅｖｉｒｕｏｔｈｅｅｎｕｓ［．Ｃｏｌｅｔｓｆ］，，，ｐｑｐｇｌｉｆｌａｖｉｒｕｓｒｅｐｉｃａｔｉｎｇｉｎｔｈｅｍｉｔｅｖａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ２００４［］ｇｙ，，８５２－：３３７５５（１）７４７９ＢＲＯＭＥＮＪＪＨＥＮＤＥＲＳＯＮＣＢＷＩＣＫＣＨｅｔａｌ．Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓａｎｄｍｉｃｒｏｓｏｒｉｄｉａｎｌｉｎｋｅｄｔｏｈｏｎｅｂｅｅ［］，，，ｐｙｃｏ．ｌｏｎｄｅｃｌｉｎｅＪＰｌｏｓＯｎｅ２０１０５１０：ｅｌ３１８１．ｙ，，（［］）１０ＳＴＥＥＮＬＮＭＯＧＥＮＳＮＰＥＲＫＲＹＧＥＲ．Ｉｎｃｅｎｃｅｏｆａｃｕｔｅｂｅｅａｒａｓｓｖｒｕｓｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｉｄｌｉｉｌｌ，，ｙ，［］ｐｑｖｉｉｒｕｓｃｈｒｏｎｉｃｂｅｅａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｒｕｓＫａｓｈｍｉｒｂｅｅｖｉｒｕｓａｎｄｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｍｓｉｎｈｏｎｅ，ｐｙ，ｇ，ｙｋ－ｂｅｅｓｅｒａ．ｉｄｏｌｉ（ｍｅｌｌｉｉｎＤｅｎｍａｒＪＡｏｇｅ２００８３９３：３１０３１４．冲ｆ，，（））［］ｐ５１ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究［１１］贾慧苑，刘进祖，王星等．北京地区六种蜜蜂病毒病的流行病学研究［Ｊ］．应用昆虫学报，２０－１４５１３：７７２７８０．，（）－１２ＮＯＴＯＭＩＴＯＫＡＹＡＭＡＨ，ＭＡＳＵＢＵＣＨＩＨ，ｅｔａｌ．Ｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ］，ｐｐ［ＤＮＡ－ＪｉｉＲ１２：５［］．ＮｕｃｌｅｃＡｃｄｓｅｓ，２０００２８６３６．，（）－ｎＭ１３ＮＯＴＯＭＩＴＮＩＰＰＯＮＲＬｏｏｍｅｄｉａｔｉｓｏｔｈｅｒｌｍｌｉｆｉｃａｔｉＪ．ＪＪＣｌｉｎ６５５：，．ｅｄｍａａｏｎ．ｅｄ，２００７（［］ｐｐ［］ｐ，）－９６９５７１．［１４Ｅ燕云，李思光，罗玉萍．环介导等温扩增核酸技术及其应用［Ｊ］．微生物学通报，２００７３４３：５５７］，（）－５６１．１５１．蜜．北京：中国农业出版社２００９：２６．［］梁勤，陈大福蜂保护学［Ｍ］，－．１６周捧，冯峰，董秉义中华蜜蜂的欧洲幼虫腐臭病病原研究Ｊ．昆虫学报２０００Ｓ１：１０４１０８．［］［］，（）［１７］ＬＵＹ，ＬＩＯＵＹＨ，ＣＨＥＮＳ，ｅｔａｌ．ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｓｆｆｅｃｔｓｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｇａｉｎｓｔＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｒｖａｅ，ＴｈｅｃａｕｓｅｏｆＡｍｅｒｉｃａｎｆｏｕｌｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅ．ｌｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｎＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＧｌｏｂａｌＣｈａｎｅＮａｔｕａｌＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈ／８ｔｈＪｏｉｎｔＭｅｅｔｉｎｏｆｇ，ｇＡＦＥＲＰ，ＡＳＰ，ＧＡ，ＰＳＥａｎｄＳＩＦ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２０１２．［１８］ＯＬＩＶＩＥＲＶ，ＢｌａｎｃｈａｒｄＰ，ＣｈａｏｕｃｈＳｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｙｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ，ｐｇｈｒｏｎ？ｉｃｂｅｅｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓａｈｏｎｅｙｂｅｅｉｒＪｉｒｕＲ２００８３２１９８ｐａｙｖｕｓ．Ｖｓｅｓ１：５６，［］，，（）１ｒＪＢｅＷｏｒ１－９ＨＥＡＴＨ：１ＬＡ．ＣｈａｌｋｂｏｏｄＰａｔｈｏｅｎｓ：ａｒｅｖｉｅｗ．ｅｄ９８２３６３３０１３５．［］ｇ［］，，（）２０ＨＡＬＥＰＪＭＥＮＡＰＡＣＥＤＭ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｉｍｅａｎｄｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｆＡｓｃｏｓｈａｅｒａａｉｓｓＪ．［］，ｐｙｏｐｐ［］Ｊ－ＩｒＰａ１４ｎｖｅｔｅｂｒａｔｅｔｈｏｌ９８０３６：４２９３０，（）２１ＣＡＲＲＥＲＡＰＳＯＭＭＡＲＡＧＵＡＡＶＡＩＬＩＴＩＧＴｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｏｆＡｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｉｓＪ．ＪＡｉｃｕｌＲｅｓ［］，，ｐｐ［］ｐ，１ｌ－９８７２６：５９６３．，（）２２－梁勤陈大福．蜜蜂白垩病的研究进展（连载二）Ｊ．蜜蜂杂志２００１２：１０１３．［］，［］，（）２３ＭＩＲＡＮＤＡＪＲ，ＤＡＩＮＡＴＢ，ＬＯＣＫＥＢｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｓｌｏｗｂｅｅａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓｏｆ，ｐ［］ｈｅ－ｈｏｎｅｂｅｅＪＧｅｎｉｌ２０：２ｔｙＪ］．Ｖｒｏ，１０，９１１０）５２４２５３０．［（２４ＤＥ－ＣＨＥＮＹＰＲ．ＨＢｅｅＶｉｒｓｓＪ．ＡｄｖｉｕｓＲｅ２００７［］，ＳＩＥｏｎｅｙｕｅＶｒｓ７０：３３８０．［］，，５２ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究２５ＬＡＷＡＨＡＡＮＯＳＡＨＡＲＡＫｅａＡｎａｓｓｔ－ＳＳＳｔｉｉｎｆｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｅｃｔｉｃｅｌ．ｌｉｏｆｅｎｅｃｏｏｆａｎｏｍａｌｉｋ，，，ｙｇ［］ｐｖｉｒｕｓ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓＦｌａｃｈｅｒｉｅｖｉｒｕｓｏｆｓｉｌｋｗｏｒｍ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｍｏｎｇｉｎｓｅｃｔ，－－ｉａｎａｎｄｌａｎｔｌｉｋｉｈＶｉｌ１９９８４３ｌ１２７４３ｍａｍｍａｌｉｃｏｍａ（ｅ）ｖｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＡｒｃｒｏＩ：１．ｐｐ，，（）Ｗｌｉｄ２６ＧＨＯＳＨＲＣＢＡＩＬＢＶＩＩＬＣＯＣＫＳＭＭｅｔａｌ．Ｔｈｅｎｕｃｅｏｔｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓｏｆｔｈｅ［］，，，ｑ－ｈ－ｋｅＪｂｅｅ．ＧＶｉｌ１２１５４１１５４９．ｏｎｅｙ：ａｎｉｎｓｅｃｔｉｃｏｒｒｉａｌｉｖｉｒｕｓｅｎｒｏ９９９８０：，，（）ｐ［］２７ＷＵＹＬＯＣＦＨＵＡＮＧ－ＣＣＪｅｔａｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆＰｅＹｉｎａｎｕｄａｉｃｏｍａｌｉｋｅｌ．Ｔｈｅｃｏｍｐ［］，，，ｇｑｐ－ｉＲＮＡｅｎｏｍｅｏｒａｎａｖｉｉｍｌａｈａｌｉｒｕｓｎｉｎｔｎｆｅｃｔｉｎｖｉｒｕｓｗｉｔｈａｉｚｔｏｎｓｉｒｔｏｔｔｏｆｔｈｅｍａｍｍａｉａｎ，ａｓｅｃｇｇｇＪ－Ｖｉｌ２００２２９４１：３１２３２３．ｉｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．ｒｏｏｇｐ，，（［］ｙ）２８ＧＡＥＴＡＮＡＬＭＩＲＡＮＤＡＪＲ，ＭＡＲＩＡＢＢ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ［］，ｇｎＶ－ｒｕｓｏＨｓｌｅｒａＪＪｒｎａｏｆＶｒｏｏ２００６１：４５００ＤｅｆｏｒｍｅｄＷｉｇｉｆｏｎｅｙｂｅｅ（？／＼ｓｍｅｌｉ．ｏｕｌｉｌ８００９９８９．［ｇｙ，，（）々ｆ）］－２９ＯＮＧＵＳＪＲＰＥＴＥＲＳＤＢＯＮＭＡＴＩＮＪＭｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｉｃｏｍａｌｉｋｅｖｉｒｕｓｏｆｔｈｅ，，，ｐｐ［］－ＧｅｎｕｓｉｌｉｉｉｔｈｉｔｅａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏＪ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ２００４８５１２：３７４３８．ＩｆｌａｖｎｕｓｒｅｃａｔｎｎｅｍＶ［］７７４ｐｇ，，（）－３ＦＵＪｉｌｉｋｉ０ＩＹＵＫＩ丁ＴＡＫＥＵＣＨＩＨＯＮＯＭｅｔａｌ．Ｎｏｖｅｌｉｎｓｅｃｔｃｏｍａｅｖｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｓｏｆ’，，ｐ［］－ａｒｅｓｓｉｖｅｈｂＪ．Ｖｌ２００４７８３１０９３１１００ｗｏｒｋｅｒｏｎｅｅｅｓｉｒｏ：．ｇｇｙ，，（［］）３１ＥＵＧＥＮＥＶＲＡｎｌｖｉｒｕｉｏｌａｅｄｆｒｏｍｈｅａｈｉｄＢｒｉｃｂｒａｓｓｉｃａｅｗｉｈｓｉｍｉｌａｒｉ．ｏｖｅｓｓｔｔｐｅｖｏｙｎｅｔｔｙｔｏ［］－－Ｈｍｅｎｉｌｉｋｉｉｌ２００７８８３２０２５９．ｔｅｒａｃｏｍａｅｖｒｕｓｅｓＪ．ＧｅｎＶｒｏ；５９５ｙｐｐｐ［］，，（）３２景天忠王志英．ＩＣＴＶ报告ｖｍ以来昆虫病毒分类上的变化［Ｊ］．中国生物防治学报董瀛谦，］，，［２０２６５－１１２７２：２６８，（）３３ＬｅａＯＣｒ－ｉｓａＰＦａｕｕｅＭｅａ．Ｐｉｉｒａｌｅｓ，ｒｏｏｓｅｄｏｒｄｅｒｏｆｉｉｖｓｅｎｓｅｓｎｅＧｌｌｈｔｉｔＣｔｌｃｏｍａｖａｓｔｅｉｌ，，ｑ，ｐｐｐｏｇ［］＝－－ｓｒａｎｄＲＮＡｖｈＴ３ｉｈｉｔｅｃｒｅＪ．ＡｈＶｒｌ２００８１５３４７１５ｔｅｄｉｒｕｓｅｓｗｉｔａｓｅｕｄｏｖｒｉｏｎａｒｃｔｕ［ｒｃｉｏ：ｐ，，］（）７２７．３４ＭａＭＡ．ＡｓｕｍｍａｒｏｆａｘｏｎｏｍｉｃｃｈａｎｅｓｒｅｃｅｎｔｌａｒｏｖｅｄｂＩＣＴＶＪ．ＡｒｃｈＶｉｒｌ２００２１４７８ｙｏｙｔｇｙｐｐｙ［ｏ：，，（［］］）－１６５５１６６３．３５ＣＨＥＮＹＰＮＡＫＡＳＨＩＭＡＮＣＨＲＩＳＴＩＡＮＰＤｅｔａｌ．ＶｉｒｕｓＴａｘｏｍｏｎｙ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ［］，，，ＮｏｎｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＶｉｒｕｓＣ．ＮｉｎｔｈＲｅｏｒｔｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＴａｘｏｎｏｍｏｆＶｉｒｕｓｅｓ［］ｐｙ，ｄｅｍ－ＥｉｃＵＳＡ２００５８４０４５ｌｓｅｖｉｅｒＡｃａＰｒｅｓｓＳａｎＤｉｅｏ８．，ｇ，，，５３ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等湿扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究３６ＮＡＫＡＳＨＩＭＡ．ｌｕｃｌｉｉｉｉｕ］Ｎ，ＵＣＨＩＵＭＩＴＦｕｎｃｔｉｏｎａａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｒｔｕｒａｍｏｔｉｆｓｎｄｃｓｔｒｏｖｒｕｓｅｓＪ．Ｗｓ［［］－Ｒｅｓ２００９１３９２：１３７１４７．，’（）ＭＩＬＬＥＲＷＡｉ３７ＢＲＹＯＮＹＣＢ．ＨｏｎｅｂｅｅｖｒｕｓｅｓｉｎＵｒｕｕａＪ．ＡｍｕＲｅｖＥｎｔｏｍｏｌ２０１０５５３：１２９［］，ｙｇｙ［］，，（）－５１０．３８ＢＲＹＯＮＹＣＢ．ＴｈｅＤｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ａｎ．ＥｍｅｒｇｉｎｇＦａｍｉｌｙｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＶｉｒｕｓｅｓＪ．ＶｌｒＳｉｎｉｃａ［］［］，２００９２４５－４２７：４１５，，（）［３９］ＴＡＴＥＪ，ＬＩＬＪＡＳＬ，ＳＣＯＴＴＩＰ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｒｉｃｋｅｔｐａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓ：ｔｈｅｆｉｒｓｔｖｉｅｗｏｆａ－ｎｅｗｖｉｍｓｆａｍｉｌｙＪ］．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ，１９９９，６（８）：７６５７７４．［［４０］ＫＯＭＡＲＡＡ，ＲＡＴＺＯＧＬＯＵＭ．ＩｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｍＲＮＡｓ：ｍｙｓｔｅｒｙｏｆｈｅｎｃｅ－ｔｉｒｅｘｉｓｔｅＪ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５：２２．［］，２００５，２８０）３４２５３４２８（４１ＸＩＡＸＨＨＯＬＣＩＫＭ．ＳｔｒｏｎｅｕｋａｉｏｔｉｃＩＲＥＳｈａｖｅｗｅａｋｓｅｃｏｎｄａｒｓｔｒｕｓｔｕｒｅＪ．ＰｌｏｓＯｎｅ２００９［］，ｇｙｙ［］，，－４１：４１３６４１４０．（）４２ＭＣＭＩＮＮＰＣ．Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ［］ｐｓＦ９１－１ｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅＪ．ｅｒｎｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ２００２２６１：０７．，，［］（）ｈ－４３ＳＡＳＡＫＩＪＮａｋａｓｈｉｍａｉｉｆ］Ｎ．Ｍｅｔｉｏｎｎｅｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｉｎｔｉａｔｉｏｎｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃａｓｉｄｒｏｔｅｉｎｏｆａｎ［，ｐｐｐｎ－ＲｖｒｕｓＮ１５１２５１５ｉｓｅｃｔＮＡｉＪ．ａｓｐ２０００９７４：１．［］，，（）［４４］ＢＡＩＬＥＹＬ，ＷＯＯＤＳＲＤ．ＴｗｏｍｏｒｅｓｍａｌｌＲＮＡｖｉｒｕｓｅｓｆｒｏｍｈｏｎｅｙｂｅｅｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｎ－－ｓｒｎ１ｓａｃｂｒｏｏｄａｎａｃｕｔｅｂｅｅａｒａｌｙｉｓｖｉｕｓｅｓＪ．ＧｅＶｉｒｏｌ９７７３７１：１７５１８２．ｐ［］，，（）４５ＺＨＡＮＧＸＨＥＳＹＥＶＡＮＳＪＤ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｒｕｓａｎｄｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌ［］，，ｇｑｖ－－ｉｒｕｓａｒｅｍｕｌｔｉｈｏｓｔａｔｈｏｎｓＪ．Ｉｎｖｅｒｔａｔｈｏｌ．２０１２１０１６１．ｐｇｅ［］Ｐ，９（）：Ｉ５５９４６ＥＬＬＪｗＪＢ８－ＩＳＤＭＵＮＮＰＡ．Ｔｈｅｗｏｒｌｄｉｄｅｈｅａｌｔｈｓｔａｔｓｏｆｈｏｎｅｂｅｅｓ．Ｗｏｒｌｄ２００５６４：８［］，ｕｙ［］ｅｅ，８，（）１０１．［４７］ＲＩＢＩＥＲＥＭ，ＢＡＬＬＢＶ，ＡＵＢＥＲＴＭ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒａｌｈｉｓｔｏｒｙａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｖｉｒｕｓｅｓ／／ＡＵＢＥＲＴＭ，ＢＡＬＬＢＶ，ＦＲＩＥＳＩ，ｅｔａｌ．ＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅＨｏｎｅｙＢｅｅＭ．Ｅｕｒｏｅａｎ，［］ｐＣ－ｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓＬｕｘｅｍｂｏｕｒ１ｇ，２００８：５８４．５４ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究－４８．Ｊ２０１２４９张弦．５：１０９５１１１６．，陈彦平，和绍禹蜜蜂病毒学研究进展［应用昆虫学报，，（［］］）ＷＯＯＬＭＥＪ－４９ＧＯＷＴＡＧＥＳＥＩＡＳ．ＨｏｓｔｒａｎｇｅａｎｄｅｍｅｒｉｎａｎｄｒｅｅｍｅｒｉｎｔｈｏｎｓＪ．］，ＱＵＥＲｇｇｇｇｐａｇｅ［［］Ｅｍｆ？ｅｒＩｎｅｃｔＤｉｓ２００５，１１１２：１８４２１８４７．ｇ，（）［５０］ＥＬＶＩＲＡＧ，ＷＯＬＦＧＡＮＧＲ，ＭＩＣＨＡＥＬＪ，ｅｔａｌ．ＳａｃｂｒｏｏｄＶｉｒｕｓｏｆｔｈｅＨｏｎｅｙｂｅｅ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）：Ｒａ－ｉｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｎａｎｄＰｈｌＡｎａｓｉｎＲｅｖｅｒａｎｓｃｒｉｔｉＰＣＲＪｎＶａｃｃｎｅｐｉｏｙｏｇｅｎｅｔｉｃｌｙｉｓＵｓｇｓｅＴｒｐｏｎ．Ｃｌｉｉ［］－Ｉ２００１８１１０４．ｍｍｕｎｏｌ：９３，，（）一二５１徐祖萌，张麟，刘以明，等．中蜂囊状幼虫病发病规律及抗感品系杂交、代对其抗性的观察．［］－Ｊ１９８７５１５．．贵州农业科学：，，［］５２Ｊ２００２２２－２３．刘长滔．．蜜１．：［］，徐祖荫，张久胜中蜂囊状幼虫病暴发后的调查与分析［］蜂杂志，５３Ｊ－李紫伦，２００６２２６：２７６２７７．，欧霞胡军军．中蜂囊状幼虫病的调查与防治．广西畜牧兽医，，（）［］［］５４Ｊ２００８－ｌｓｌ１３０丨３７．张国之．．Ｏ：，韩日畴蜜蜂囊状幼虫病研究进展［中国生物防治，，［］］（）５５ＡＬＬＥＮＭＢＡＬＬＢＷｈｉｔｅＲＦｅｔａｌ．ＴｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｗｏｒｌｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｂｅｅｖｉｒｕｓｅＪ［］，，，ｙｓ［．］Ｂｅｅ－Ｗｏｒｄ１９９６７７３：１４１１６２．，，（）ＭＡＲＴＩＮＳＪＢＡＬＬＢＶＣＡＲＲＥＣＫｌｆｄｅｆｏｒｍｅｄ５６ＮＬ．Ｐｒｅｖａｅｎｃｅａｎｄｅｒｓｉｓｔａｎｃｅｏｗｉｎｖｉｒｕｓ［］，，ｐｇ－ＤＷＶｉｎｕｎｒｅａｔｅｄｏｒａｃａｒｉｃｉｄｅｔｒｅａｔｅｄＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒｆｅｓｅｄｈｏｎｅｂｅｅｉｎｔｓＡｉｓｍｅｌｌｉｅｒａｔｙｆ（）（ｐ）ｃｏｏｎ－ｉｅｓＪ．ｉ４９１２．ｌ．ＡｃＲｅｓ２０１０：７７９，，（［］ｐ）５７ＢＡＩＬＥＹＬｉｒｕｓｅｓｆｒｏｍｈｏｎｅｂｅｅｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｏｂｓｅｒｖａｔＷＯＯＤＳＲＤ．ＴｗｏｍｏｒｅｓｍａｌｌＲＮＡｖｉｏｎｓｏｎ［］，ｙ－－ｓａｃｂｒｏｏｄａｎａｃｕｔｅｂｅｅａｒａｓｓｖｉｒｓ．ＧｅｎＶｒｏ１３７４：１７５１８２．ｌｉｕｓｅ［Ｊ］ｉｌ９７７ｐｙ，，（）５８ＧＥＮＥＲＳＣＨ－ＭＩＲＡＮＤＡＪＲＥＤｅｆｏｒｍｅｖｒｕｓＪＩｎｖｅｒＰａｏｌ２０１０１０３：４８６１．ｄｗｉｎｇｉ．ｔｔｈ．［］，［］，，５９ＣＨＥＮＹＰＰＥＮＩＳＪＳＣＯＬＬＩＮＳＡｅｔａｌ．ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｈｏｎｅｂｅｅＪ．ＡｌＥｎｖｉｒｏｎ［，，，ｐｐ］ｙ［］Ｍｃｒｏｂ－ｉｏ２００６１７２１：６０６６１１ｉ．，，（）６０ＣＨＥＮＹＰＥＶＡＮＳＪ．ＨｏｒｉｚｏｍａｌａｎｄｖｅｒｔｉｃａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓＩｎｔｈｅｈｏｎｅｂｅｅＡｉｓｍｅｌｈｆｅｒａ，［］ｙｐ－Ｊ．ＪＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌ２００６９２２．；５２５９，，（）［］６１ＳＨＥＮＭＣＵＩＬＷＳＴＩＧＵＹＮＩｎｉｃａｅｒａｎｓｍｉｓｓｏｎｒｏｕｓｎｄｉｎｅｒａｃｔｉｏｎｓｅｗｅｅｎ．ｔｒｔｔｉｔｅａｔｂｔ［Ｑ，，Ｑ］－ｉｃｏｍａｌｉｋｅｖｒｕｓｅｓＫｓｈｍｉｒｂｅｅｉｒｕａｎｄｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｗｉｔｈｔｈｅｈｏｎｅｂｅｅｏｓａｎｄｔｅａｒａｐｉ（ａｖｓｕｓｙｈｔｈｐｓｉｔｉｃ）５５ 福建农林大学硕士学位论文（ＬＡＭＰ应用环介导等温扩增技术）检测常见三种蜜蜂病毒的研究－ＶａｒｒｏａｍｔｅＪ．ＧｅｎｉＪＶｉｒｏｌ２００５８６８：２２８１２２８９．，［］（）６２ＣＨＥＮＹＰＰＥＴＴＩＳＪＳＣＯＬＬＩＮＳＡｅｔａｌ．ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｈｏｎｅｂｅｅｖｉｒｕＪ．［ｓｅｓ，，，ｙ［］］Ａ－ｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２００６７２１：６０６６１１．ｐｐ，，（）［６３］ＢＡＬＬＢＶ，ＡＬＬＥＮＭＰ．Ｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｈｏｎｅｙｂｅｅｃｏｌｏｎｉｃｓｉｎｆｅｓｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍ－ｐａｒａｓｉｔｉｃｉｔｅＶａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎｉＪ．ＡｎｎＡｐｐｌＢｉｏｌ１９８８１１３３：２３７２４４．，，（ｊ［］）６４ＭＡＲＴＩＮＳＪ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶａｒｒｏａａｎｄｖｉｒａｌａｔｈｏｅｎｓｉｎｔｈｅｃｏｌｌａｓｅｏｆｈｏｎｅｂｅｅｃｏｌｏｎｉｅｉｉｎ［］ｐｇｐｙｓａｍｏｄｅｌｇｒｏａｃｈ？ａｐｐＪ．ＡｌＥｃ２００１３８５：１０８２１０９３．［，，）］ｐｐ（６５ＡＬＬＥＮＭＦＢＡＬＬＢＶ．ＴｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｗｒｌｄｄｉｓｔｒｉｔｉｏｎｆｔｈｅｈｏｎｅｅｅｖｉｒｕｓｅｓＪＢｅＷｒ［］，ｏｂｕｏｙｂ［］．ｅｏｌｄ，－１９９６７７３：１４１１６２．，（）６６ＴＥＮＴＣＨＥＶＡＤＧＡＵＴＨＩＥＲＬＺＡＰＰＵＬＬＡＮｅａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｖａａｔｉｏｎｏｆｓｘ，，，ｔｒｉｓｉｂｅｅ［］ｖｉＡｉｓｌｌｉｆＬＶｉｒｕｓｅｓｎｍｅｅｒａａｎｄａｒｒｏａｄｅｓｔｍｃｔｏｒｉｔｏｕｌａｉｉＪＡｌＥｎｖｉｒｏｎｐｍｅｐｐｔｏｎｓｎＦｒａｎｃｅ［］．ｐｐＭ－ｉｃｒｏｂｉｏｌ２００４７０１２：７１８５７１９１．，，（）－ｌｋｉ．ｈｉｉｉｖ［６７］ＢｏｗｅｎＷａｅｒＰＬＭａｒｔｎＳＪＧａｎｎＡＴｅｔｒａｎｓｍｓｓｏｎｏｆｄｅｆｏｒｍｅｄｗｎｉｒｕｓｂｅｔｗｅｅｎｈｏｎｅ，，ｇｙｂｅｅｓＡｉ｛ｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｂｔｈｅｅｃｔｏａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅＶａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎＯｕｄＪ．ＪＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌ１９９９）ｙｐｊ［］，，７３３－：１０１１０６．（）ｒｒ６８ＹｕｅＣＳｃｈ６ｄｅＭＢｉｅｎｅｆｅｌｄＫｅｌａ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆｖｉｒａｌｕｅｎｃｅｓｎｓｅｍｅｎｏｆｈｏｎｅｅｅＡ［］，，，ｔｏｓｅｉｉｓｑｙｂ（ｐｉｎｅｌｅ：ＥｖｅｎｃｅｏｒｖｅｒｔｃａｌｉｉｉｈＪＪＩｈｏｌｉｆ）ｉｄｆｉｔｒａｎｓｍｓｓｏｎｏｆｖｒｕｓｅｓｔｒｏｕｈｄｒｏｎｅｓ．ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｌ２００６ｇ，［］，９２２－：１０５１０８．（）６９ＣＨＥＮＹＰＨＩＧＧＩＮＪ－－ＡＦＥＬＤＬＡＭＦ．ｉｌｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒＳＵＦＥＲｕａｎｔｉｔａｖｉｉＰＣＲ，，Ｑｔｅｒｅａｔｔｏｎ［］ｐａｎａｓｓｏｒｍｅｄｗｎｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｉｏｎｉｎｔｈｅｈｏｎｅｅｅ＾ｌｌ］．ＡｌＥｉＭｂｌｌｙｉｆｄｅｆｏｉｇｔｙｂ？／５ｍｅｉｅｒａｎｖｒｏｎｉｃｒｏｉ（／ｆ＾］ｐｐｏ，２００５７－１：４３４４１１６．，（）７０ＡＮＤＥＲＳＯＮＤＬＴＲＵＥＭＡＮＪＷＶｉ．ａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎｉｓｍｏｒｅｔｈａｎｎｅｓｅｃｉｅｓＪＥｘＡｌＡｃａｒｌ［］，ｏ．ｏｊｐ［］ｐｐｐ，２０００２４３－：１６５１８９．，（）７１ＣＨＥＮＹＰ，ＰＥＴＴＩＳＪＳ，ＦＥＬＤＬＡＵＦＥＲＭＦ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｌｅｖｉｒｕｓｅｓｉｎｕｅｅｎｓｏｆｔｈｅｈｏｎｅｙｐｑ［］－ｌＬＪ．ＪＩｈｌｂｅｅＡｉｓｍｅｌｉｆｅｒａｎｖｅｒｔＰａ２００５９０２：１１８１２１．ｔｏ，，（ｐ［］）５６ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究７２ＭＩＲＡＮＤＡＪＲＦＲＩＥＳＩ．Ｖｅｎｅｒｅａａｎｄｖｅｒｉｃａｒａｎｓｉｓｉｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｒｕｓｉｎｈｏｎｅｂｅｅｓｌｔｌｔｍｓｏｎｏｆ］，ｇｙ［－ＡｐｓｍｅｌｉｅｒａＪＪＩｎｖｅｒｔＰ．ｉｌｌ２００８９８２：１８４１８９（）．ａｔｈｏｆ［］，，（）ＭＬＯＣＫＥＢｅａ．Ｇｅｎｅｈａｒａｃｔｅｒｓａｏｎｏｗｅｅａｒａｓｓｖｒｕｓｏ７３ＩＲＡＮＤＡＪＲＤＡＴＮＡＴＢｔｌｔｉｃｃｉｔｉｏｆｓｌｂｌｉｉｆ，，，ｐｙ［］－２．ｔｈｅｈｏｎｅｅｅＡｉｓｍｅｌｌｅｒａＪ．ＧｅｎＶｒｏ２０１０１１０：２５２４５３０ｙｂ（ｐｉ）ｉｌ９ｆ，，（）［］－Ｄ２０１３７４上海：上海海洋大学．张迪１．［．青蟹双顺反子病毒快速检测方法的建立及初步应用［，］］－ｅａＤｅｖｅ７５ＫＡＭＡＥＨｌｌｕｉｏｎＩＫＴＯＹＯＩＺＵＭＩＡＪＩＳＡＫＡＨＴＯＤＡＫ，ｔｌ．ｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｖａａｔｏｆ，，［］－ｆｍｅｄｉｉｉｎｏｓｓｏＢｒｌａｒｕｓＭｓｎｆｅｃｉＪａｏｏｉａｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｉｃａｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｄｄａｇｉｆｏｄｅｔｅｌｉｔｏｎ．ｌｐｔｐｔｐｐｅ［］Ｊ－ＣｌＭｉ２００６４４５：１１９０２ｉｎｉｅｒｏｂｏｌ８９９．，，（）－．１９９８２１６：５５５７６孙逸武焦新福．解旋酶的结构功能与人类疾病ｍ国外医学遗传学分册０．，，（）［］，－７７ＫＡＭＡＥＨＩＫＴＯＹＯＩＺＵＭＩＡＪＩＳＡＫＡＨＴＯＤＡＫｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ，，［］，ｐ－ａｏｏｌｆｉｉｉｄｄｉａｎｏｓｉｓｏｆＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｅｒｕｓＭｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪｉａｄｉｈｅｒｍａｌａｍｉｔｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａ．ｌｐｍｅｄｔｅｓｏｔｐｃａｐｇｐ［］一ＪＣｌｉｎＭｉｌ２００６４４５：１８９９１９０２．ｉｅｒｏｂｏ，，（）－．ｌｍｅｎｅｌａｔｉｏｎｏｆａｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄ７８ＳＡＩＴＯＲＭＩＳＡＷＡＹＭＯＲＩＹＡＫｅｔａｌＤｅｖｅｏｔａｎｄｖａｕ，，［］］，ｐｐｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＪ．ＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，［］－５４：０３７４１．（１１１１０）７９何选民，邹国秋，张得玉等．猪圆环病毒２型环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法的研究［Ｊ］．中国兽［］－２医杂志２００９４５．１２：７１，，（）ＬＡＭＰＪ．８０．快速检测牛巴贝斯焦虫方法的建立［中国预防兽医学报李群，［］，王素华，周前进等］０－２０１０３２１：７８１７８４．，（）８１江Ｊ．畜牧与兽医２００９李月梅其木格等．弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立［］，，［］，薛书，４－１１１：３０３２．（）ＡＭＰ８２庄明亮．（Ｌ）检测蜜蜂黑蜂王台病毒的研究［Ｊ］．，李江红，梁勤等应用环介导等温扩增技术［］２０１４５－应用昆虫学报１６：１６１２１６１９．，，（）８３ＢｉｉｉｌｌｈｅＩＲＤＬＥＢＲＡＮＮＩＧＡＮＪＡＳＵＢＲＡＭＡＮＹＡＨＳ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｓａｔｏｎｏｆＢａｃｕｓｓｔｅａｒｏｔｒｍｏｈｉｌｕｓ［］，，ｐｍｅｈａｎＪ．ＮＡＲ９９８２６ＰｃｒＡｈｅｃａｓｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅａａｎｓａｎｃｔｉｖｅｒｏｌｌｉｎｃｉｓｍｕｃｌｅｉｃｃｉｄｓｅｓ１１１：ｌｉｉｔａ］，，（ｇｇ［）５７ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究２６８６＿３２６９．８４－ＬＡＭＰ技术Ｃｏｘｓａｃｋ［陈惠玲．应用ＲＴｉｅｖｉｒｕｓＡ６的研Ｄ．湖北：华中科技大学，］检测肠道病毒究［］２０１３．８５ＨＡＬＬＭＣ，ＪＯＲＤＡＮＪＲ，ＭＡＴＳＯＮＳＷ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｈｓｉｃａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ［］ｐｙＥｓｃｈｅｒｌｉｍｅｔｈｄｉｉｉｉｃｈｉａｃｏｒｅｃｔｅｄｍｓｍａｔｃｈｒｅａｒｒｏｔｅｉｎｓＭｕｔｌａｎｄＵｖｒｄＪ．ＪＢａｃｔｅｒｉｄ１９９８ｙｐ，，ｐ［］－１７５：１５３５１５４１．（）［８６］朱引结．猪弓形虫病环介导等温扩增检测技术的建立与评价［Ｄ］．北京：中国农业大学，２００６．ＮＯＴＯＭ－８７ＩＴ，ＯＫＡＹＡＭＡＨＭＡＳＵＢＵＣＨＩＨｅｔａｌ．Ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ［］，，ｐＤＮＡＪＮｕｃｌｅｉＡｉｄｓＲ２０００２８１２：－６８［］．ｃｃｅｓ，６３，（）［８８］丁宁．主血凝性脑脊髓炎病毒ＬＡＭＰ检测方法的建立及其临床初步应用［Ｄ］．吉林：吉林大学，２０１３．８９ＹＡＮＧＺＨＡＮＧＨ－ＪＬＳＬＩＵＺＨｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ［］，，，ｐｐａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｃｙｔｏｍｅａｌｏｖｉｒｕｓｕｎｄｅｒｆｉｅｌｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓＪ，Ｊｐｇ［］－ＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２０１２２９９３２１３３０．，，（）：９０－ＲｎａｎＩＬＩＲＡＹＡＭＡＨＫＡＧＥＹＡＭＡＳＭＯＲＩＹＡＳＵＳｅｔａｌ．ａｉｄｓｅｘｉｏｆｂｏｖｉｎｅｒｅｉｍｌｔａｔｉｏｎ［］，，，ｐｇｐｐｅｍｂｒｓｏｍｅｄｒｍａ－ｉｎＪＴ２００４ｙｏｕｓｉｎｇｌｏｐｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｌａｎｌｉｆｉｃａｔｉｏ．ｈｅｒｉｏｅｎｏｌｏ，，６２（５：８８７８９６．ｐ［］ｇｇｙ）９１ＮＡＧＡＭＩＮＥＫＨＡＳＥＴＮＯＴＯＭＩＴｅｔａｌ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｂｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ［］，，，ｙｐ■ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｒｉｉｎｒＭｒｏ７ｐｉｏｎｕｓｎｌｏｏｅｓＪ］．ｏｌＣｅｌｌＰｂｅｓ２００２１６２：２２３２２．ｇｐｐ［，，（）９２唐毕峰Ｊ２２７２－３［．环介导等温扩增技术的应用和发展．实用医学杂志２００８２４：３９９７７．，，（］［］）［９３］ＭＡＲＵＹＡＭＡＦ，ＫＥＮＺＡＫＡＴ，ＹＡＭＡＧＵＥＨＩＮ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｃａｒｒｙｉｎｇｔｈｅｓＵ２ｇｅｎｅｂ－－ｉｎｓｉｔｕｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｃａｔｉｏｎｌＥｎｉＭｉｃｏｂｉｏｌｙｐｐｉ［Ｊ］．Ａｖｒｏｎｒ２００３６９８：５０２３ｐｐ，，（）５０２８．［９４］ＭＡＲＫＡＬＬＥＮ，ＢＲＥＮＤＡＢＡＬＬ．Ｂｅｅｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｓｐｒｅａｄｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ［Ｊ．Ｂｅｅ］－Ｗｏｒｌｄ，１９９６，９５５：５１３５２８．（）－９５．猪繁殖与呼吸综合征ＲＴＬＡＭＰ检测方法研究Ｊ．中国畜牧兽医，２０１杨素，沙才华，赵美玉等１［］［］，５８ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究３８６－：１３６１４１（）．９６ＤＥＮＳＣＨＬＡＧＣＶＯＧＥＬＲＦＮＩＥＳＳＥＮＬＨｄ５－ｂａｓｅｄｄｅｅｃｉｏｎｏｆｈｅｍａｒ．ｅｎｅｔｔｔｏ］，，ｙｇ［ｊｓ－ｕｃｎＦｕｓａｒｕｍ－ｇｕｈｉｎｇｉｎｄｉｇｉｓｐｐ．ｉｎａｌｏｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｉｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰａｓｓａＪ．ＩｎｔＪｐ）ｙ［］ＦｏｏｄＭｃ－ｒｏｂｌ２０１２１５３：１８９１ｉｉｏ６９６．，，（）９７莫正平．利用环介导等温扩增技术探究褐菖鈾（Ｓｅｂａｓｔｉｓｃｕｓｍａｒｍｏｒａｔｕｓ肝ＣＹＰ１Ａ对海洋污］［）．２０１４染的响应．［Ｄ］福建：厦门大学，９８ＳＡ－ｍａｔＩＫＪＲＫＧＥＬＦＡＮＤＤＨＳＴＦＦＥＬＳｅｔａｌ．ＰｒｉｍｅｒｄｉｒｅｃｔｅｄｎｚｃａｍｌｉｆｉｃａｉｏｎｏＤＭＡ，Ｏｅｉｔｆ，，ｙｐ［］ｉｈ－ｌ９９ｗｔａｔｈｅｍｏｓｔａｂｌｅＤＭＡｐｏｙｍｅｒａｓｅＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８２３９４８３９：４８７４９１．［］，（）９９ＬＡＭＰＪ燕勇．）．，曹家穗，高￥洁等利用环介导等温核酸技术（快速检测霍乱弧菌［中国卫生［］］２０－检验杂志］１２１５：１８１１６２．１５，，（）５９ 福建农林大学硕士学位论文应用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测常见三种蜜蜂病毒的研究致谢时间飞逝，三年的研究生涯即将结束，在这三年中，在老师、同学、朋友和亲人的关心与支持下！，使我顺利地完成学业，特向他们表示感谢本课题的研究和论文的撰写是在导师梁勤教授的精心指导下完成的，从论文的资料准备、试验设计、试验开展以及论文的修改都得到了导师的精心指导。三年中，导师在学习和生活中给予了我很多无微不至的关怀，使学生能顺利地完成学业。导师实事求是的科学作风和严谨务实的治学态度是我学习的榜样，让我终生受益，谨此，致以最衷心的感谢！同时，衷心地感谢福建农林大学的李江红老师和陈大福老师，本论文的方案设计和。实施，试验过程中，结果分析以及论文撰写，都给予我热忱的帮助和鼓励此外，感谢蜂学学院各位老师传授我蜂学专业的知识，感谢蜂学学院全体老师以及实验室同学对我思想！、学习、生活等方面的帮助。在此，对他们致以最诚挚的谢意本论文的研究工作是在福建农林大学蜂学学院所完成的，感谢蜂学学院给我提供了良好的试验条件和技术平台！，让我的试验能够顺利地开展感谢赵红霞、尹伟轩、董晓、王丽丽师姐、张国栋师兄、同学王庭云、师弟席伟军、师妹杨文静和李晓燕对我试验过程中的帮助，在此向帮助过我的师长和同学致以最诚挚的，还有蜂场师傅的帮助和支持谢意！此外，还有感谢我的家人、亲人以及朋友，这么多年以来，在背后给予我的关心、支持和鼓励！，在此，致以最诚挚的谢意最后，感谢参加本论文评阅以及答辩委员会的全体专家，感谢您们在百忙中对我论文的审阅！、指导，在此，向您们致以最诚挚的谢意６０