亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响 47页

密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响EffectoftheSublethalDosesofImidaclopridontheBacterialDiversityintheMidgutofApismelliferaligustica硕士研究生：贾慧茹指导教师：周婷研究员申请学位类别：农业推广硕士专业领域名称：养殖培养单位：中国农业科学院蜜蜂研究所研究生院2015年5月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名髮荔时间：年s月^n关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：管髮时间：yis年■&月日 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表t文题目亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响t文作者贾慧茹专业养殖研究方向蜜蜂病理学^导教师周婷研究员培养单位（研宄所）蜜蜂研宄所硕（博）姓名职称单位专业签名导师硕导口曾志将教授江西农业大学特种经济动物饲养博导0m硕导口周冰峰教授福建农林大学特种经济动物饲养博导0答荦主窝北京市农林科学院植硕导口张芝利研究员物保护环境保护研宂昆虫学博导0所硕导口中国科学院动物研宄张润志研宄员昆虫学博导0所硕导口中国农业大学农学与尚希武教授昆虫学博导H生物技术学院筌硕导口中国农业大学农学与彩万志教授昆虫学博导0生物技术学院辩硕导口中国农业大学农学与秦玉川教授昆虫学，卢博导0生物技术学院委硕导口博导口员硕导口博导口硕导口博导口会议记录（秘书）杨晶论文答辩时间地点2015年5月22号蜜蜂所会议室 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响EffectoftheSublethalDosesofImidaclopridontheBacterialDiversityintheMidgutofApismelliferaligustica硕士研究生：贾慧茹指导教师：周婷研究员申请学位类别：农业推广硕士专业领域名称：养殖培养单位：中国农业科学院蜜蜂研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationEffectoftheSublethalDosesofImidaclopridontheBacterialDiversityintheMidgutofApismelliferaligusticaM.S.Candidate：JiaHuiruSupervisor：ZhouTingDegree：MasterofAgriculturalExtensionSpecialty:RearingMay2015 摘要蜜蜂是全球范围内数量最大的授粉昆虫，在农业生产中扮演着重要角色，也是常用农药的非靶标生物。杀虫剂对蜜蜂的安全性评估，一直是人们关注的焦点问题。大量研究表明，蜜蜂肠道内栖息着大量微生物，这些微生物具有提供营养、抵抗病原菌侵袭等多种功能，与蜂群健康密切相关。因而，本文以出房1-2h内的意大利蜜蜂为研究对象，在实验室条件下，探究了亚致死剂量吡虫啉对其中肠细菌群落的影响，以期为杀虫剂的安全性评价体系提供理论依据。在实验室内分别用三种不同浓度的吡虫啉蔗糖溶液（45ppb,15ppb，5ppb）、含丙酮（0.03%）糖水空白对照饲喂出房1-2h内的意大利蜜蜂，每个处理组三个重复，分别在饲喂3,6,9,12,15d时采集样品。提取各组采集的蜜蜂样品的中肠细菌基因组DNA，扩增细菌16SrDNAV3区序列，对所得扩增产物进行纯化和胶回收得到测序文库，采用下一代高通量测序技术对中肠细菌群落进行检测分析。结果如下：1.在IlluminaHiSeq2500测序平台上测得的60份样品的16SrDNAV3区双端测序结果经过初步整理后，明确得到的序列为27,673,383条，每个样本的平均序列数为461,223条（所测样品的最小序列数为356,486条，最大序列数为529,077条）。2.经质量控制后，我们将得到的15,102,475条16SrRNA高质量序列，在QIIME平台上分成不同的操作单元。通过与数据库RDP、Greengene和SSU在内的多个数据库中的已知序列进行比对，获得了每个样品的菌群分类信息及其相对丰度信息。在门的生物分类学水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是主要菌属。3.为探究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂中肠菌群组成是否存在剂量效应，分别在处理3，6，9，12和15d时收集样品，分析相同时间点其主要肠道菌属数量。通过T-检验表明，同一时间内各处理组间主要细菌数量差异不显著（p>0.05）。4.为探究亚致死剂量吡虫啉是否会影响蜜蜂中肠菌群结构，对同一采样时间点的不同组间的Shannon，chao1以及ACE等多样性指数进行T-检验，结果显示，菌群落多样性指数差异也不显著（p>0.05）。以上结果表明，在实验室条件下，亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落结构影响不显著。关键词：意大利蜜蜂；吡虫啉；亚致死剂量；肠道菌群；下一代测序I AbstractHoneybeesarethemostimportantpollinatorsinnaturalecosystemsworld-wide,andplayanimportantroleinbiodiversitymaintenanceandecosystemfunction.They,therefore,havebeenwidelyconsideredasanimportantinsectinthebiosafetyassessmentofinsecticides.Anumberoffindingsarerevealingthatthatgutbacteriaofhoneybeesplayamajorroleinneutralizationofdietarytoxins,nutrition,andindefenseagainstpathogensandthereisastrictinterconnectionbetweentheintestinalmicrobiotabalanceandthehealthstatusofthehoneybees.Inthisstudy,thepotentialsideeffectsofthesublethaldosesofimidaclopridonthemidgutbacteriaoftheworkerbeesofApismelliferaligusticawasinvestigatedunderlaboratoryconditionssoastoprovideatheoreticalbasisforthebiosafetyassessmentofpesticides.Newlyemergedbeeswerefedwithdifferentsublethaldosesofimidaclopridsyrups（0.045mg/L,0.015mg/Land0.005mg/L）andpuresugarsyrupwith0.3%acetone,andsampleswerecollectedafter3,6,9,12and15drespectively.Everytreatmentabovewassampled3times.Thepopulationstructureofbacterialinthemidgutofhoneybeesinthefourtreatmentgroupswasanalyzedusingnext-generationsequencingafterthegenomicDNAwasgainedfromintestinalbacteria.Theresultsareasfollows:1.ThepartialbacterialV3regionof16SrRNAgenesequencesofPCRproductsweresequencedbytheIlluminaHiSeq2500.Atotalof27673383ofV316SrRNAsequencesreadsfromthe60sampleswithanaverageof461223sequencesreadsforeachsample(theminimumofonesamplewas356486andthemaximumwas529077)wereusedforthisproject.2.Followingqualityfiltering,wegeneratedadatasetconsistingof15102475high-qualityandclassifiable16SrRNAgenesequencesforfurtheranalysis.TheywereclassifiedintodifferenttaxonomyusingQIIME.Thetaxonabundanceofeachsamplewasgeneratedintophylum,class,order,family,andgeneralevelsusingmainlydatabaseofRDP,aidedbyGreengenedatabases.Atthephylumlevel,ProteobacteriaandFirmicuteswerethemostdominantbacterialphyla,whichconsistentlyoccurredinbacterialcommunityofhoneybees3.Inordertoexplorehowthesublethaldosesofimidaclopridaffectthecompositionofmidgutbacteria,thecompositionofdominantmidgutbacterialgenerawereanalyzedforstatisticalsignificanceamongthefourtreatmentsinthesameperiodbyperformingaT-test,andnosignificantdifferenceswereobserved(P>0.05).4.Inordertoexplorehowthesublethaldosesofimidaclopridaffectthestructureofmidgutbacteria,therichnessestimators,includingShannon,chao1,andACE,wereanalyzedforstatisticalsignificanceamongthefourtreatmentsinthesameperiodbyperformingaT-test,andnosignificantdifferenceswereobserved(P>0.05).Theresultsshowedthatthesublethaldosesofimidaclopriddidnotinducesignificantchangesofthehoneybeegutbacterialcommunitycompositionunderlaboratoryconditions.Keywords：Apismelliferaligustica;Imidacloprid;sublethaleffect;intestinalcommunity;Next-generationsequencingII 目录第一章引言.......................................................................................................................11.1蜜蜂肠道微生物研究概况.......................................................................................11.1.1蜜蜂肠道结构....................................................................................................11.1.2蜜蜂肠道微生物种类........................................................................................21.1.3影响蜜蜂肠道微生物组成的因素....................................................................21.1.4蜜蜂肠道微生物的应用....................................................................................41.1.5蜜蜂肠道微生物的分类鉴定方法....................................................................51.2研究的目的和意义...................................................................................................71.3研究内容...................................................................................................................81.3.1构建中毒模型....................................................................................................81.3.2构建16SrDNA基因组文库的以及上机测序..................................................81.3.3数据分析............................................................................................................8第二章构建中毒模型.......................................................................................................92.1材料与方法...............................................................................................................92.1.1实验材料..........................................................................................................92.1.2实验方法............................................................................................................92.2结果与分析.............................................................................................................102.3讨论.........................................................................................................................10第三章基因文库的构建和测序.....................................................................................123.1材料与方法.............................................................................................................123.1.1实验材料..........................................................................................................123.1.2实验方法..........................................................................................................133.2结果与分析.............................................................................................................163.2.1DNA的质量检测............................................................................................163.2.2意大利蜜蜂中肠菌群16SrDNAV3区基因的PCR扩增.............................163.2.3测序数据..........................................................................................................17III 3.3讨论.........................................................................................................................17第四章数据分析.............................................................................................................194.1材料与方法.............................................................................................................194.1.1实验材料..........................................................................................................194.1.2实验方法..........................................................................................................194.2结果与分析.............................................................................................................194.2.1测序基本数据..................................................................................................194.2.2蜜蜂中肠菌群组成..........................................................................................224.2.3亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群组成的影响..............................224.2.4吡虫啉亚致死剂量对意大利蜜蜂中肠细菌结构的影响..............................234.3讨论.........................................................................................................................27第五章全文结论.............................................................................................................29参考文献.............................................................................................................................30致谢.............................................................................................................................37作者简历.............................................................................................................................38IV 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1蜜蜂肠道微生物研究概况蜜蜂是全球范围内数量最多的授粉昆虫，其在农业系统的增产以及经济创收方面具有重要作用。有调查显示，全球接近1/3的农作物产量依赖于授粉动物，且每年全球直接源于昆虫授粉创造的经济价值大约有150亿美元，占全球整个农业生产经济收入的9.5%(Kleinetal.,2007;Gallaietal.,2009;vanEngelsdorpandMeixner,2010)。近十年世界蜂群数量急剧下降，许多国家地区出现了不同程度的授粉危机，给农业生产造成了巨大损失。蜂群丢失是多种因素共同作用的结果，蜂病的频发是重要的诱因之一(Cox-Fosteretal.,2007;Kleinetal.,2007;vanEngelsdorpandMeixner,2010)。动物肠道内栖息着大量微生物，通过不断进化，最终形成复杂而动态平衡的微生物区系（DillonandChamley,2002）。许多研究表明，这些消化道内的微生物区系对宿主的健康具有非常重要的意义，如果微生态平衡失调，机体正常的生理功能便会紊乱，以致出现病态。因此，肠道微生物的研究成为近年研究的热点（Crottietal.,2013）。近年许多研究表明，蜜蜂肠道微生物不仅在营养物质的消化吸收方面有重要作用，而且在抵抗某些病原菌的侵袭以及增强机体免疫力等方面也具有一定的作用（Dillonetal.,2005;FrauneandBosch,2010;Philippetal.,2012）。蜜蜂肠道微生物功能的多样性尤其是其在抗病方面的作用，为蜂病的防治提供了一种新思路，即利用自身的微生物防治病虫害，这对于养蜂业的积极发展具有重要意义。与此同时，蜜蜂肠道微生物还作为被应用于评价各种转基因作物的安全性。转基因作物的安全性一直是公众关注的焦点之一，由于蜜蜂自身的生物学特性，使它成为评价转基因作物安全性的一个重要的非靶标生物，而肠道微生物与宿主健康的紧密相关性使得其成为评价转基因作物安全性重要的评价指标之一(Hails,2000;EPPO,2001)。1.1.1蜜蜂肠道结构肠道微生物栖息于肠道中，因此肠道结构对肠道微生物的组成，增殖等方面会有一定程度是影响。因而，我们先对蜜蜂肠道结构作简单介绍（贾慧茹等，2014）：根据蜜蜂的消化系统器官的起源和功能，可将蜜蜂成虫的消化道分为前肠、中肠和后肠(Snodgrass,1910;Chapman,1998)。蜜蜂的前肠由咽、食管、蜜囊和前胃组成，在胚胎期由外胚层的前端内陷形成的，摄食作用由它担负,在该肠道中栖息的微生物较少；中肠又称胃，是胚胎期由内胚层形成的，与一般昆虫相比，蜜蜂的中肠相当发达，位于腹腔的前中部，呈―S‖型，是蜜蜂消化食物和吸收营养的主要器官，中肠肠壁细胞可分泌含有酶的消化液，促使食物中大分子营养物质的分解(JimenezandGilliam,1996;Terraetal.,1996)，在该肠段栖息着大量的微生物；后肠由小肠和直肠组成，在胚胎期由外胚层的后端内陷形成的，是吸收水分、贮存和排出消化后的废物，蜜蜂在越冬期间产生的粪便,都集中贮存在直肠中，有相当数量的微生物在直肠中栖息。经研究发6现，大约有10个微生物，其与直肠肠腺分泌的物质共同作用防止粪便发酵腐败，这对蜜蜂安全越冬具有重大意义（SnodgrassandErickson,1992）。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.2蜜蜂肠道微生物种类蜜蜂携带的微生物种类繁多，包括有益的内生菌、病原微生物和从外界环境获取的过路菌，而体内微生物大多数栖息于肠道中(SnowdonaandCliver,1996;Cazemieretal.,1997;Wemegreen，2002)。1.1.2.1蜜蜂肠道正常微生物种群Gilliam等(1974a,1974b)应用传统分离培养的方法研究意大利蜜蜂工蜂肠道微生物组成，结果表明，从健康的意大利蜜蜂工蜂肠道分离到8株不同种的细菌，鉴定出5株，3株未鉴定。已鉴定出来的5株菌分别为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、志贺氏菌(Shigella)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella)，在蜜蜂肠道没有分离到假单胞菌科和欧文氏菌属细菌；从蜜蜂肠道分离到的真菌有7种，分别为极细链格孢(Alternariatenuissima)、芽枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)、平脐蠕孢属（Bipolaris）、弯孢属(Curvularia)、赭绿青霉(Penicilliumochrochloron)、荨麻青霉(Penicilliumurticae)和少根根霉(Rhizopusarrizus)，从蜜蜂肠道分离到7个属的酵母菌，其中木兰球拟酵母(Torulopsismagnoliae)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)和球拟酵母属(Torulopsissp.)分离率最高。后来Rada等(1997)也对蜜蜂肠道微生物组成进行研究，结果表明蜜蜂肠道内的菌落组成主要为乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌。随着分子生物学技术的发展，使应用分子技术对蜜蜂肠道微生物组成与结构进行研究成为可能。现阶段，通过各种分子生物学方法已确定意大利蜜蜂肠道菌群的多样性较低，只存在某些特定的菌群（Jeyaprakashetal,2003;MohrandTebbe,2006），即α-、β-、γ-变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌类（Actinobacteria）（GilliamandPrest,1987;Babendreieretal.,2007;YoshiyamaandKimura,2009）。1.1.2.2健康蜜蜂肠道中的病原微生物蜜蜂的肠道内存在相当量的病原菌，其中细菌性的病原菌主要包括拟幼虫芽胞杆菌、蜂房球菌、蜂房芽孢杆菌、尤瑞狄斯杆菌、粪链球菌、蜜蜂假单孢菌、尘埃芽胞杆菌、蜂房哈夫尼菌等。在这些病原微生物中，有些微生物对世界养蜂生产的打击是致命性的，例如，由拟幼虫芽胞杆菌引起的美洲幼虫腐臭病和由蜂房球菌引起的欧洲幼虫腐臭病，这两种病在各养蜂国都存在，是两种一经发生便会对幼虫造成毁灭性打击的疾病（HansenandBrodsgaord,1999;Shinzato,2007）。但这些病原菌只有在某些外界因素的诱发下才有可能引起疾病，正常情况下不会导致疾病。1.1.3影响蜜蜂肠道微生物组成的因素肠道内的微生物区系形成后并非一成不变，正常生理状态下，肠道微生物的组成和结构处于一种动态的平衡状态。调查显示，宿主的肠道结构、内环境、饮食、年龄、地区以及季节等多种因素都会影响微生物区系的稳态，以下分别对这些因素做一个简单的介绍：2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.3.1肠道结构肠道微生物栖息于肠道中，肠道结构不可避免的会影响微生物群落组成。复杂的肠道结构可以构建一系列有差异的微环境，从而引起不同肠道部位定殖有不同的微生物菌群。Martinson等（2012）利用高通量测序的方法，探究了蜜蜂前肠、中肠、后肠三个部位的肠道微生物的组成以及数量，结果表明不同部位具有不同的微生物区系。1.1.3.2肠道内环境肠道内环境包括肠道内pH氧化还原势能等，能够与定殖于肠道内的微生物直接发生作用。Brune等（2000）应用多种方法研究了白蚁的肠道微生态环境对肠道菌群的影响，结果显示，二者之间存在紧密的联系，即宿主肠道内的微环境会直接影响肠道内菌群的定殖。而对于蜜蜂而言，有调查显示，蜜蜂前肠、中肠、后肠三个部位的pH不同（蜜蜂前肠的pH一般接近8，中肠的pH可达到10以上，后肠的pH则接近7），是造成不同肠段的菌群结构不同的一个重要因素(Lemke,2003)。1.1.3.3发育阶段Martinson等（2012）利用qPCR以及454深度测序的方法研究了蜜蜂不同发育阶段（幼虫，新出房的蜜蜂以及成年蜜蜂）的不同时间段，肠道菌群的分布和丰度的变化，结果显示幼蜂和新出房的工蜂的肠道内定殖的菌群很少，而不同年龄的成年工蜂，其肠道微生物组成也存在显著差异。一些研究表明，蜜蜂不同发育阶段菌群组成的这种差异性，可能与其在不同阶段所食的食料不同有关(Gilliam,1997)。1.1.3.4抗生素Gilliam等（1974）在实验室条件下采用传统方法对与蜂群相关的真菌进行了分离、鉴定，并比较了饲喂土霉素和黄曲霉素等抗生素和未饲喂抗生素的蜂群之间的所含的真菌的变化，结果表明，抗生素会使蜂群中真菌的含量发生变化，与未饲喂抗生素的蜜蜂相比，饲喂抗生素的组所含真菌种类少一些。2012年，Tian等又应用qPCR以及基因组测序等方法，对美国某些长期食用土霉素和四环素等抗生素的蜂群与很少食用饲喂这些抗生素的其他地区蜂群的肠道菌群栖息进行了比较，研究显示，长期食用某一种抗生素会使蜜蜂肠道菌群产生抗性基因，同时他们还推断那段时期美国某些地区的蜂农使用新的抗生素使得蜜蜂肠道菌群失调是导致美国发生蜂群丢失的一个原因。1.1.3.5季节有调查表明，蜜蜂的肠道微生物的组成有因季节的变化而所不同。Rada等（1997）分别在冬天和夏天两个不同季节从同一蜂群中采集了蜜蜂样品，然后利用传统分离培养的方法对这两组蜂中肠和直肠内的主要菌群进行了比较、分析，结果显示，厌氧菌和好氧菌、大肠杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、乳酸菌以及酵母菌等主要菌群在冬天和夏天蜜蜂样品中均能检测到，但两组蜜蜂的中3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言肠内的厌氧菌和酵母菌的含量存在显著差异，与夏季采集的蜜蜂样品相比，在冬季采集的蜜蜂的中肠含有更多的厌氧菌和酵母菌。1.1.3.6地区2012年，美国耶鲁大学的Moran等从两个不同州的各四个不同蜂群中采集了40只蜜蜂，利用454测序平台对其肠道菌群的16SrRNAV6–V8区序列扩增产物进行深度测序，研究了不同蜂群、不同地域的意大利蜜蜂中肠菌群的组成和分布，结果显示，不同地区之间的蜂群肠道微生物的组成具有差异性。1.1.4蜜蜂肠道微生物的应用1.1.4.1抗病研究方面蜜蜂是一种重要的经济昆虫，在农业生产中发挥着重要的作用，但近十年蜂群数量急剧下降，其中最重要的一个原因就是蜂病的频发(Cox-Fosteretal.,2007;Kleinetal.,2007;vanEngelsdorpandMeixner,2010)。大量研究表明，肠道微生物与宿主的健康紧密相关(Dillonetal.,2002;Dillonetal.,2005;MohrandTebbe,2006)。因此，许多学者开始着眼于探究利用蜜蜂自身的肠道微生物对蜂群中高发的疾病进行防治。白垩病和美洲幼虫腐臭病对蜂群而言都是有毁灭性打击的疾病，Gilliam(1997)在研究非致病性微生物对机体的影响时，发现和蜜蜂相关的最普通的霉菌之一曲霉属真菌对蜂群中高发的白垩病有抑制作用，且工蜂肠道中还有如毛霉菌和根霉属菌等许多菌群都对该病具有抑制作用；乳酸菌是蜜蜂肠道中主要菌种之一，Evans等（2006）在实验室条件下探究益生菌对蜜蜂免疫系统影响时，发现能促进蜜蜂自身的免疫反应以及抵抗病原菌的入侵；Evans和Armstrong（2006）研究蜜蜂体内的共生菌群对蜜蜂健康的影响时，发现某些共生菌对能引起的美洲幼虫腐臭病的病原菌——拟幼虫芽孢杆菌具有抑制效应，并且这些共生菌可能对大多数的病原体有自然的拮抗作用。蜂群衰竭失调病症(CCD)是一种新的病理现象，自2006年报道以来，全世界的养蜂业都遭受重创。Cox-Forster等（2007）利用高通量测序的方法，对感染CCD和未感染CCD的蜂群的肠道菌群组成进行了比较，研究发现，二者之间的菌群组成存一些差异，感染CCD的蜜蜂体内主要的寄生菌是α-变形菌门和厚壁菌门，未感染CCD的健康蜜蜂体内包含的主要菌类是是γ-变形菌门，他们推测肠道菌群的失调可能是导致CCD发生的其中一个因素。后续又有许多学者研究了CCD发生同蜜蜂菌群之间的关系（Ribiereetal.,2008;Johnsonetal.,2009;Runckeletal.,2011），这些发现为于今后CCD的深入研究提供了一定的理论基础。1.1.4.2作为评价转基因作物安全性的指标1996年转基因作物商业化以来，转基因作物给人们带来了巨大的经济效益的同时，其安全性一直饱受争议(Hails,2000)。因此，转基因作物的安全性评价成为全球研究的热点之一。蜜蜂是很多农作物和野生植物的传粉者，在农业生产中扮演着重要的角色，因此，许多学者将其作为实验对象来评价转基因作物的安全性(USEPA,1996;EPPO,2001)。转基因作物对蜜蜂的影响已经做4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言了大量的研究，其中一部分就是以蜜蜂肠道微生物变化作为评价安全性的指标（贾慧茹等，2014）。玉米、棉花、油菜是目前阶段世界范围内种植较广的转基因作物，它们对蜜蜂肠道微生物的影响均有探究。Babendreier等（2005）通过T-RFLP技术研究转cry1Ab基因玉米MON810花粉或其表达产物对意大利蜜蜂肠道细菌群落的变化，结果表明转基因玉米花粉不会对蜜蜂肠道菌落组成产生影响；Geng等（2013）则利用PCR-DGGE的方法，在实验室条件下探究了转cry1Ah基因玉米对意大利蜜蜂中肠菌群的影响，检测结果与Babendreier等的研究结果一致；姜玮瑜等（2010）也用PCR-DGGE方法，在实验室条件下研究转Bt-cry1Ac基因棉花SGK321对中华蜜蜂肠道微生物群落的影响，检测结果与前人研究结果一致——肠道微生物群落组成无差异，同时应用PCR检测显示，未发生外源基因的横向转移；Mohr等（2007）应用田间实验研究了转pat基因的抗除草剂油菜花粉对卡尼鄂拉蜂，熊蜂以及独栖蜜蜂三种蜜蜂肠道微生物群落组成的影响，并用PCR方法检测外源基因的横向转移情况，研究结果显示，转pat基因油菜对三种蜜蜂的肠道菌群组成无影响，同时他们也没有检测到外源基因的横向转移。我国是一个转基因作物的种植大国，同时又是一个消费大国，因而转基因作物安全性的评价对我国而言显的尤为重要，而这些研究能够对转基因作物进一步商业化生产提供一定的科学依据。因此，对蜜蜂肠道微生物的进一步深入研究意义重大。1.1.5蜜蜂肠道微生物的分类鉴定方法1.1.5.1传统分类鉴定方法传统的微生物分离鉴定方法，其主要是以微生物形态特征和生理生化性状为依据，采取的主要方法是先通过选择性培养基对微生物进行纯培养，然后再通过对纯培养物进行形态观察、生理生化反应以及免疫学反应，最后通过综合这些特性依据各种鉴定微生物的手册如鉴定细菌常用的《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌鉴定手册》、鉴定真菌使用《真菌鉴定手册》、《半知菌属图解》等对其进行鉴定加以分类（Gilliam，1978；姜远良，1995）。该方法分离出菌体纯度较高，但近几十年来的分子生物学研究表明，绝大多数微生物无法进行体外的纯培养（Amanneta1.,1995），还有一些因素，如在分离稀释的过程中可能会出现菌群丢失的情况等，使分离到的肠道微生物菌群不能全面反映肠道微生物多样性，实验的准确性低。因而，该方法在现今的应用中愈来愈少。1.1.5.2分子生物方法自20世纪60年代起，分子遗传学和生物技术高速发展，微生物研究也逐渐步入分子生物学时代。在蜜蜂肠道微生物的研究中，应用最为广泛的分子生物学技术是变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）。因此，我们对该方法作详细介绍：PCR-DGGE技术是Muyzer(1993)最先将其应用于微生物多样性的研究，该方法也已应用于一些昆虫肠道微生物多样性的研究中（Patel，2001）。主要原理是通过变性梯度凝胶分离大小相近序列组成不同的DNA片段。其基本流程是：首先对采集的样品进行处理，提取其肠内容物，进而再提取微生物总DNA，或者先分离肠道中的微生物，再提取其总DNA，两种提取微生物的方5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言法适合于不同的研究目的，第一种方法混有很多非微生物的DNA，但是需要调查微生物类群时应采用这一方法，因为该方法提取的微生物较全面，而第二种方法获得的DNA主要来源于中肠微生物，特异性较强（卓凤萍等，2001）；然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增所提取总DNA中的特定序列，再利用DGGE分离其扩增产物；最后，对DGGE带进行测序并用QuantityOne软件进行序列分析，或者被印渍在尼龙膜上与标记的专一性寡核苷酸探针进行杂交以鉴定其群落组成。整个过程中样品中总DNA的提取和纯化，引物设计及其PCR是影响实验成功的重要因素（宋业颖等，2006）。PCR-DGGE技术具有分辨率高，结果精确可靠，重复性好，加样量小以及可与多种方法相结合等优点。同时分子生物学技术也存在一定的不足，比如提取微生物总DNA不具代表性、PCR扩增偏向性及操作技术上的原因等，都会影响到结果的可信度。因此，现今多将传统的分离培养技术和分子生物学技术结合使用，以便更准确、全面的反映肠道环境中微生物群落的多样性。1.1.5.3宏基因组技术宏基因组学技术是一种既能研究可培养的微生物又能对未培养微生物进行研究的新型技术，它不依赖于传统的实验室微生物的纯培养和分离（Riesenfeldeta1.,2004;SchlossandHandelsman,2003）。现今，已逐渐成为研究特种微生物菌群的主要方法研究，该技术的研究策略大致相同，包括以下四个部分：1.总DNA的提取及基因或基因组的富集总DNA提取提取方法主要有直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，使其释放DNA，继而抽提纯化(金晶等，2007)。直接抽提法操作简单，提取率高，但所得DNA片段较小(1～50kb)且杂质较多。间接提取法是首先去除杂质，通过不同的离心速度从样品中分离出细胞，然后对细胞进行抽提，片段较大(20～500kb)，纯度高，但操作繁琐，有些微生物在分离过程中会丢失。对于DNA的富集最常用的是富含GC碱基的基因的富集，可以直接从样品中提取，然后利用超速离心富集高GC含量的DNA(Bekeleta1.,2009)。另一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术，这一方法是利用比较稳定的同位素标记底物并结合密度梯度离心技术来对大分子DNA和RNA进行分离(SchlossandHandelsman,2003)。2.宏基因组文库的构建比较常规的构建基因组文库的方法是载体克隆文库法，该方法是通过酶切或超声波处理等方法使获得的DNA片段化，然后选择适当的载体并与之连接，继而将重组体转入合适的宿主细胞使特定的DNA片段增殖，即完成宏基因组文库的构建。文库的构建需要适宜的克隆载体和寄主菌株。根据克隆的目的片段的大小，选择适宜的载体，如,目的片段小于15kb时，可选择质粒载体；目的片段比较大时（15～40kb），可选择柯斯质粒；而当插入的目的片段超过40kb时应当选用细菌人工染色体等等(Bejaeta1.,2002;Angeloveta1.,2009)，还要注意选择的载体要有利于目的基因的扩增、表达及在筛选细胞中目标物质表达量的调控等。选择宿主菌株时主要考虑重组载体在宿主细胞中的稳定性、转化效率、宏基因的表达、目标性状的筛选等因素(Lammleeta1.,2007)。对于大多数宏基因组来源的基因来说，大肠杆菌依6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言然是最理想的克隆和表达宿主。3.文库筛选构建的基因组文库中包含有大量的不必要的信息，为获得有效DNA序列，需要对文库进行筛选。目前用于宏基因组文库的筛选方法主要有基于功能筛选、基于序列筛选、化合物结构筛选和底物诱导基因表达筛选等方法。基于功能筛选是基于克隆子产生的新的生物活性进行筛选，如抗菌活性、酶活性及溶血性，该方法工作量大，效率低；基于序列筛选是利用已知相关功能基因的序列设计探针或PCR引物,根据保守序列鉴定出已知基因的同源物进而从文库中筛选出目的基因的方法，该方法无法筛选基因文库中的未知基因(Piel,2002)；化合物结构筛选则基于不同物质的不同结构有不同吸收峰的化合物结构筛选，此方法工作量大，费用高且该方法筛选的物质未必具有活性；底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选，该方法对筛选抗体基因和生物活性物质十分有效(Yunetal.,2004;Uchiyamaetal.,2005)。1.2研究的目的和意义现阶段，使用农药依然是防治各种病虫害的主要途径（韩文素等，2011），为提高农作物产量，造成在农业生产过程中农药的大量使用，而这些药物却不能被完全分解，最终会残留于植物中。当蜜蜂采集花粉、花蜜时，会摄入残留的药物。近年蜂群数量急剧下降(Biesmeijeretal.,2006;Goulsonetal.,2008;BrownandPaxton,2009;Cameronetal.,2011)，已有研究显示，农药的大量使用是诱发蜂群数量下降的一个重要因素（Blacquiereetal.,2012;VanderSluijsetal.,2013）。因此，国内外学者就农药对蜜蜂的安全性评价方面作了大量研究工作。目前，新烟碱类杀虫剂是世界范围内使用最广泛的一类杀虫剂，在全球占有25%以上的市场份额（VanderSluijsetal.,2013）。吡虫啉是新烟碱类农药的代表，在全球农药市场中位居第二位（2008），同时它也是世界范围内销售额居所有杀虫剂之首的杀虫剂（张一宾等，2007）。2013年5月，欧盟发布了对吡虫啉在内的三种农药在能吸引蜜蜂授粉的植物上禁用两年的决议，并要求在这两年内对吡虫啉的安全性重新进行评估（LauraMaximandGerardArnold,2013）。农药对蜜蜂的安全性评估中很重要的一方面就是亚致死效应的研究（Desneuxetal.,2007;宋怀磊等，2011）。各个国家的学者就吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应的研究，主要集中在对蜜蜂采集行为(Decourtyeetal.,2010)、学习记忆能力(Decourtyeetal.,2011)、运动协调能力（Lambinetal.,2001）、嗅觉能力(Hassanietal.,2005)等方面的影响。近年吡虫啉对蜜蜂生理生化方面如对蜜蜂大脑内乙酰胆碱受体分布（周婷等，2013）、体内乙酰胆碱酯酶活性（孟丽峰，2013）等的影响也进行了一些研究。许多研究表明，蜜蜂肠道内栖息的大量微生物，具有包括提供营养、抵抗病原菌侵袭等多种功能，与蜂群健康密切相关（OlofssonandVasquez,2008;Martinsonetal.,2011;KochandSchmid-Hempel,2011）。探究亚致死剂量吡虫啉是否会对蜜蜂中肠菌群结构造成影响，对于吡虫啉的安全性评估具有重要意义，但吡虫啉对蜜蜂肠道菌群的影响还未见报道。因此，本研究在实验室条件下，以新出房的意大利蜜蜂为研究对象，选用三种不同浓度的亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂进行处理，并分别选用不同的时间点采集各组样品，应用下一代高通量测序的方法探究吡虫啉对7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言意大利蜜蜂中肠菌群的亚致死效应。选用不同浓度的亚致死剂量吡虫啉，目的在于了解当农药暴露时间相同时，随着剂量的变化，肠道菌群的组成是否会随之发生变化？而选用不同的处理时间，是为阐明在相同的亚致死剂量浓度下，随着时间的变化，肠道菌肠是否会有不同？相信本研究的结果能进一步丰富农药的安全性评估体系并为后期研究提供一定的理论依据。1.3研究内容在实验室条件下，研究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落的影响，以期为农药的生物安全性评价体系提供理论依据。具体内容如下：1.3.1构建中毒模型分别用3种不同浓度（0.005,0.015和0.045mg/L）的吡虫啉蔗糖溶液以及含丙酮（0.03%）的糖水(空白对照)在实验室条件下饲喂刚出房1-2h的意大利蜜蜂，饲喂3,6,9,12和15d时分别取样；1.3.2构建16SrDNA基因组文库的以及上机测序提取中肠细菌基因组DNA，利用带有接头序列的长引物扩增细菌16SrDNAV3区序列，对所得扩增产物进行纯化和胶回收得到测序文库，对得到的文库进行定量后，在IlluminaHiSeq2500平台上进行PE150测序；1.3.3数据分析测序数据进行基本整理后，用生物信息学知识分析测得的序列，经过质量控制，删除某些不符合条件的序列，进而利用最终得到的有效序列聚类成分类操作逻辑单元（operationaltaxonomicunit，OTU）进行操作，分析不同处理时间，不同浓度的亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群组成以及多样性的影响。8 中国农业科学院硕士学位论文第二章构建中毒模型第二章构建中毒模型杀虫剂对蜜蜂亚致死效应的研究是现今杀虫剂研究的热点领域之一，而吡虫啉是田间应用最广的杀虫剂之一，近年来，吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应的研究较为广泛。本章以新出房的成年意大利蜜蜂工蜂为实验对象，在实验室条件下分别用3种不同浓度（0.005,0.015和0.045mg/L）的吡虫啉蔗糖溶液以及含丙酮（0.03%）的糖水(空白对照)饲喂新出房的成年意大利蜜蜂工蜂，饲喂3,6,9,12和15d时分别取样，为后续实验提供基础。2.1材料与方法2.1.1实验材料2.1.1.1供试蜜蜂出房1-2h的成年意大利蜜蜂工蜂，取自中国农业科学院蜜蜂所蜜蜂保护和生物安全研究室实验蜂场。2.1.1.2试剂99.99%吡虫啉原粉（37894），购自德国Sigma-Aldrich公司；丙酮，北京化学试剂公司。2.1.1.3主要仪器RXZ-380C型人工气候培养箱，宁波江南仪器厂；实验用蜂笼（长×宽×高=10cm×7cm×8cm），实验室自制；电子天平（JA2003），上海越平科学仪器有限公司；电冰箱（BCD-215YD），青岛海尔公司。2.1.2实验方法2.1.2.1意大利蜜蜂的饲养选择数张即将出房的封盖子脾,将其置于培养箱(30℃,相对湿度（RH）70%,黑暗)内培养。待新蜂出房后，1-2h内随机选取1200头刚羽化出房的工蜂放入蜂笼(长×宽×高=10cm×7cm×8cm)中,每笼100头,笼内放入一次性食槽（吴艳艳等，2014），分别装有花粉0.5g、50%糖水(w/v)2000L和无菌蒸馏水300L置于温度29±1℃、相对湿度为65%±5%的恒温培养箱中，进行适应性培养。2.1.2.2制备不同浓度吡虫啉蔗糖溶液将99.99%吡虫啉溶于丙酮，制成一定浓度的原液，然后用丙酮逐步稀释成不同的浓度梯度。吸取一定量的吡虫啉丙酮溶液于50%的糖水配制成相应浓度药液（0.005,0.015和0.045mg/L），9 中国农业科学院硕士学位论文第二章构建中毒模型待充分混匀后，置于4℃冰箱中备用。每次使用时，提前从冰箱中取出，每次使用时，提前从冰箱中取出，室温放置一段时间，在这一过程中为了能使析出的蔗糖再次溶解，轻微晃动配制的蔗糖溶液，然后再饲喂蜜蜂。2.1.2.3药物处理从第8天开始饲喂特定剂量的药物糖水将12笼蜜蜂随机分为4组，每组3个重复。四组处理分别是：第一组：饲喂含（0.03%）丙酮的糖水(50%糖水)，作为空白对照；第二到第四组分别依次饲喂0.005mg/L,0.015mg/L和0.045mg/L三种浓度的吡虫啉蔗糖溶液。让其自由采食和饮水，分别在饲养第3，6，9，12和15d后，依次从每个处理组中各取10只蜜蜂。图2.1实验用蜂笼Fig2.1laboratorybeecage2.2结果与分析在实验室条件下，采用饲喂法使得意大利蜜蜂暴露于3种不同浓度的亚致死剂量的吡虫啉（0.005,0.015和0.045mg/L），暴露3,6,9,12和15d时成功取样，3个处理，1个对照，各三个重复，分别在5个不同时间点采集样品，共获得60份样品用于后续的研究。2.3讨论吡虫啉是一种新型的硝基亚甲基类杀虫剂，对刺吸式口器害虫及鞘翅目害虫均具有良好的防治效果。由于吡虫啉具有广谱、高效、有效期长、安全性好和不易产生耐药性等众多优点，目前已在超过90个国家的60多种作物上得到广泛使用，成为世界范围内使用的主要农药之一（Elbertetal.,2008）。随着吡虫啉的广泛使用，国内外学者针对吡虫啉对非靶标生物的毒性及其安全性评价方面作了大量研究工作，而蜜蜂作为一种重要的授粉昆虫，不可避免的会接触到环境中的农药，使其成为对农药进行安全性评价的一个非常重要的非靶标物种。2013年5月，欧盟发布了对吡虫啉在内的三种农药在能吸引蜜蜂授粉的植物上禁用两年的决议，要求两年内对吡虫啉的安全性进行再次评估，使得吡虫啉对蜜蜂的安全性评估再度升温（LauraMaximandGerardArnold,2014）。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章构建中毒模型杀虫剂对蜜蜂的安全性评估中很重要的一方面就是亚致死效应的研究。研究表明，杀虫剂在环境中的毒力会随着时间和状态的变化慢慢递减，当递减到一定水平时，其毒力即转变成亚致死剂量（Laurinoetal.,2011）。自然界中杀虫剂对蜜蜂的暴露量是亚致死剂量（Henryetal.,2012），且杀虫剂对蜜蜂造成的亚致死效应由于其不易察觉因而对蜂群造成的危害并不亚于急性中毒，对杀虫剂亚急性效应的研究对于杀虫剂的合理应用有重要意义。许多学者就吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应进行了广泛的研究，主要集中在对蜜蜂运动协调能力（Lambinetal.,2001）、嗅觉能力(Hassanietal.,2005)、采集行为(Decourtyeetal.,2010)、学习记忆能力(Decourtyeetal.,2011)等生物学方面的影响，研究表明亚致死剂量吡虫啉对在这些方面都会产生不同程度的影响。近年在对蜜蜂生理生化方面如对蜜蜂脑神经细胞凋亡作用的影响（吴艳艳等，2014）、大脑内乙酰胆碱受体分布的影响（周婷等，2013）、体内乙酰胆碱酯酶活性的影响（孟丽峰，2013）等方面也进行了一些研究。研究表明，蜜蜂肠道内栖息的大量微生物，具有包括提供营养、抵抗病原菌侵袭等多种功能，与蜂群健康密切相关（OlofssonandVasquez,2008;Martinsonetal.,2011;KochandSchmid-Hempel,2011）。探究亚致死剂量吡虫啉是否会对蜜蜂中肠菌群结构造成影响，对于吡虫啉的安全性评估以及具有重要意义，但吡虫啉对蜜蜂肠道菌群的影响还未见报道。在本研究中，我们选用新出房意大利蜜蜂为实验对象，来探究吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应。如引言1.1.3中所述，蜜蜂肠道微生物的组成受宿主的肠道结构、内环境、饮食以及年龄等多种因素的影响。因而，我们选用同一蜂群中的新出房（1-2h）意大利蜜蜂为实验对象，能够使实验处于同一参考水平，避免各种环境因素对实验结果的干扰，从而确保实验结果的可靠性和准确度。在实验过程中，我们先将蜜蜂适应性饲养7天后，才使实验蜜蜂暴露于亚致死剂量吡虫啉环境条件下。主要依据是：Martinson等（2012）利用qPCR的方法研究了蜜蜂不同发育阶段的不同时间段，肠道菌群的分布和丰度的变化，结果显示幼蜂的肠道内定殖的菌群很少。因而，在实验过程中我们参照相关文献，先将蜜蜂适应性饲养7天后，再用亚致死剂量吡虫啉处理实验蜜蜂，以增加实验的准确性（Daietal.,2012a;Ramirez-Romeroetal.,2008）。构建中毒模型过程中，本研究中选用饲喂法使意大利蜜蜂暴露于亚致死剂量吡虫啉的环境下。因相同药剂的不同作用方式会呈现不同的毒性作用，而常用的作用方式有药膜法、背板点滴法以及饲喂法这三种（赵学平等，2009），饲喂法相比其他两种方法而言，操作相对简单、方便、易行，直观性也更强一些。因而，在进行杀虫剂的常规研究中，应用也就相应更广一些。目前，引起杀虫剂的亚致死剂量还没有相对严格、统一的界定，通常把不引起实验对象死亡，但对其正常的生长发育或生理代谢造成干扰的剂量称之为亚致死剂量（Desneuxetal.,2007）。虽然不同的研究所使用的亚致死剂量值不同，但从应用的角度出发，亚致死剂量的取值不宜脱离目标杀虫剂在环境中的实际残留量(韩文素等，2011)。本研究中采用的吡虫啉的亚致死剂量，是建立在本实验室开展了许多有关吡虫啉对蜜蜂亚致死效应方面的试验基础上而确定的。本实验室做了许多有关杀虫剂对蜜蜂亚致死效应方面的试验，主要包括亚致死剂量值的确定，学习行为，嗅觉敏感性，蜜蜂脑中烟碱型乙酰胆碱受体的表达与分布以及脑神经细胞的凋亡作用等方面的影响，结果表明亚致死剂量吡虫啉在这些方面都会产生不同程度的影响（代平礼等,2007；宋怀磊，2010；代平礼等，2013；周婷等，2013；吴艳艳等，2014）。11 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序第三章基因文库的构建和测序本章以三章中提取的各组样品的DNA为研究对象，参照有关文献，省去构建上机库的步骤，而是利用带有接头序列的长引物扩增细菌16SrDNAV3区序列，对所得扩增产物进行纯化和胶回收得到测序文库（Caporasoetal.，2011）。利用分光光度计（Nandrop）和荧光光度计（Qubit2.0）对文库进行定量后，选用现今应用较为广泛的IlluminaHiSeq2500平台，进行PE150测序，并对数据进行初步处理。3.1材料与方法3.1.1实验材料3.1.1.1供试材料以第二章所述，实验室中培养的蜜蜂作为实验对象。3.1.1.2主要试剂无水乙醇，北京化学试剂公司；QIAamp肠道微生物DNA提取试剂盒，购自德国QIAGEN公司；2×TaqPCRMasterMix，DNAMaker等生化试剂，购自北京博迈德科技有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒（AP-GX-50，Axygen）；西班牙琼脂糖，购自上海艾研生物科技有限公司；引物，由北京华大基因科技有限公司合成。3.1.1.3主要仪器雪花制冰机（FM50），北京长流科学仪器有限公司；5417R冷冻离心机,德国Eppendorf公司；迷你离心机（LX-200），江苏省南海市其林贝尔仪器制造有限公司；G50组织研磨器，卡尤迪生物科技（北京）有限公司；电热恒温水浴锅（HH.S11-Ni1），北京长安永创科学仪器有限公司；涡旋仪（G-560E），基因有限公司；移液枪，德国Eppendorf公司；高压灭菌锅（SX-500），基因有限公司；MDF-U73V型-70℃超低温冰箱，日本SANYO公司；电热鼓风干燥箱（101-2AB），天津市泰斯特仪器有限公司；电冰箱（BCD-215YD），青岛海尔公司；金属浴（GL150），江苏省南海市其林贝尔仪器制造有限公司；超纯水仪Milli-Q，美国Milli-Q公司；12 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序生物分光光度计（RS232G），德国Eppendorf公司；MastercyclergradientPCR仪，德国Eppendorf公司；电泳仪（DYY-6C），北京市六一仪器厂；水平电泳槽（DYCP-33A），北京六一仪器厂；FR-200A型凝胶成像系统，上海复日科技有限公司；荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司；IlluminaHiSeqDNA测序系统，美国Illumina公司。3.1.2实验方法3.1.2.1蜜蜂中肠解剖在每个取样时间点，12笼蜜蜂，各取10只蜜蜂，进行解剖，提取其中肠，用于后续研究分析。具体操作步骤如下所述：（1）从蜂笼中取出试验蜜蜂；（2）放入-20℃冷处理10s左右；（3）将蜜蜂腹部剪下，置于冰袋上；（4）蜜蜂腹部表面用75%酒精消毒；（5）挑起尾部，用无菌镊子将中肠拉出；（6）放入一个灭菌的1.5mL离心管，称重；（7）贮存于-70°C冰箱备用。3.1.2.2蜜蜂中肠混合基因组DNA的提取蜜蜂中肠混合基因组DNA采用QIAamp肠道微生物DNA提取试剂盒(QIAampDNAStoolminikit)进行抽提,并对抽提的DNA进行检测。（1）提取DNA前应先进行一些准备，具体包括以下几部分：1.确认AW1，AW2已根据说明书稀释；2.使用前确保Buffer混合均匀；3.若ASL，AL中有沉淀存在，可在70℃温浴直至沉淀消失；4.准备水浴锅；5.所有离心步骤均为室温（15-25℃），20000g。（2）提取DNA的具体操作步骤：1.称取180-220mg样品于2ml离心管中，然后将离心管置于冰上；2.加入1.4mlASL后，用组织匀浆研磨器研磨蜜蜂的中肠样品，涡旋振荡1min使其充分混合均匀；3.在70℃水浴锅中将悬浮液加热5min;4.涡旋15s，然后离心1min;5.离心后从管中吸取1.2ml的上清液于1个新的2ml的离心管中；13 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序6.加入一片InhibitEx,立即、持续涡旋1min,直至药片完全悬浮。在室温下将悬浮液温浴1min,使得将抑制粒子被完全吸附；7.将样品置于离心机中离心3min；8.吸取上清液于1个新的1.5ml离心管中，然后离心3min;9.吸取15ul蛋白酶K于一个新的1.5ml离心管中；10.从第八步所得上清液中吸取200ul上清液于加有蛋白酶K的离心管中；11再加入200ulAL（使用前观察，若AL中有沉淀存在，可在70℃温育直至沉淀消失），涡旋15s；12.70℃温浴10min;13.加入200ul乙醇（96%-100%）于裂解液中，涡旋振荡混匀；14.将一个新的QIAamp的吸附柱放入2ml收集管中，小心地将第13步中的裂解液加入吸附柱中（不要洒到边缘），然后于离心机中离心1min,再将吸附柱放入一个新的收集管中；15.小心地打开吸附柱盖子向其内加入500ulAW1，离心1min,再将吸附柱放入一个新的收集管中；16.打开吸附柱的盖子加入500ulAW2，盖上盖子，离心3min。将吸附柱放入新收集管中，再一次将离心柱放入离心机中，离心1min;17.最后将吸附柱转移到1个新的1.5ml离心管中，打开盖子，向QIAamp吸附柱薄膜的中心位置上滴加50ulAE，盖上盖子于室温孵育1-5min，然后离心1min，使提取的DNA洗脱下来。（3）DNA质量检测用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并用Nandrop2000测定DNA的浓度和纯度（A260/A280），然后保存到-20℃，备用。配制1.2%的琼脂糖凝胶电泳为例叙述其具体步骤：1.称取0.6g琼脂糖放入锥形瓶中，加入50ml的1×TAE缓冲液，摇匀，然后将锥形瓶放入微波炉中加热4-5min，待室温下放置锥形瓶底部不烫时，加入2ul的染色剂（EB或goldenview），摇匀；2.将琼脂糖凝胶倒入制胶模具中，待30-50min左右，琼脂糖凝胶完全凝固后拔出梳板；3.将制好的胶放在装有1×TAE缓冲液的电泳槽，凝胶应放置在电泳槽的―—‖极，缓冲液应没过制得的胶为宜；4.将5ulDNA溶液与2uLloadingbuffer混合加入点样孔，并在胶的一侧加入5uLDNAmarker；5.电泳，设置电压120，时间为30min，跑胶（待黄色条带跑到接近2/3即可，一般15分钟便会达到）；6.从制胶槽中取出琼脂板，用全自动紫外与可见分析装置拍摄照片。3.1.2.3扩增细菌16SrDNAV3区（1）引物设计扩增16SrDNAV3区所用引物参照Nakatsu等（2000）设计的序列，由北京华大基因科技有限公司合成，然后按照说明书将引物稀释。具体步骤如下：534r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)和343f(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)14 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序①先将干粉4℃,10000rpm离心10min;②加灭菌水（量数等于nmol数乘以10），稀释至100u的保存浓度，稀释过程中，管壁管底都要稀释到，通过涡旋使其混合均匀；③4℃,10000rpm离心5min；④吸取10uL,加水90uL，稀释10倍，至10uu，为工作浓度；⑤涡旋，离心，保存至-20℃备用。（2）以提取的蜜蜂肠道微生物的DNA为材料，使用上述引物进行PCR扩增（20uL体系）：dNTPMixture1Taq酶(5U/uL)0.52+10PCRBuffer（Mg）3引物FMix1引物RMix1DNA1ddH2Ox各试剂按照上述体系加入离心管中混匀后，置于PCR仪中，设置程序：95°C3min95°C30s35cycles50°C30s72°C90s72°C10min4°C∞扩增完成后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。3.1.2.4PCR扩增产物的回收纯化扩增得到的16SrDNAV3区的PCR产物进行回收纯化，具体实验步骤参照DNA胶回收纯化试剂盒（Axygen）说明书进行（赵乐乐，2013），完成建库。3.1.2.5上机测序验证构建的文库，明确构建的文库是否符合上机测序的要求，若验证合格则均一化并混合文库，然后将样品置于测序平台，进行测序。整个测序工作是在北京市计算机中心完成的。具体过程如下所述：（1）利用微量分光光度计的方法（Nandrop）检测胶回收后的样本量是否够上机测序；利用荧光分光光度计方法(Qubit2.0)对文库进行准确定量；（2）均一化多样品DNA文库，至2ng/μL后再等体积混合；（3）应用荧光定量PCR的方法，对混合好的文库（2ng/μL）进行文库定量，（4）根据文库定量的结果，逐步稀释至4~5pM，再将其置于测序平台上测序，本研究选用的是北京市计算机中心的IlluminaHiSeq2500测序系统。15 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序3.2结果与分析3.2.1DNA的质量检测1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的样品的DNA的质量（图1），用NandropND-2000测得60份样品的DNA浓度均大于150ng/uL，A260/A280：大于1.70，符合进行下一步PCR反应的要求。图3.1部分样品的DNA电泳结果Fig.3.1TheelectrophoresesresultofDNA3.2.2意大利蜜蜂中肠菌群16SrDNAV3区基因的PCR扩增通过带有接头序列的长引物直接扩增细菌16SrDNAV3区序列，对所得扩增产物进行纯化和胶回收，构建基因文库。16 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序图3.2部分样品16SrDNAV3区基因扩增结果Fig.3.2PCRamplifiedproductsof16SrDNAV3geneintheseveralbeesamples注：M：100bpDNAmarker;泳道1-24:部分样品16SrDNAV3区基因扩增结果M：100bpmolecularmarker;Lane1-24:PCRamplifiedproductsof16SrDNAV3geneintheseveralbeesamples3.2.3测序数据将测得的序列经简单整理后，进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra，上传至NCBI的SRA，获得登录号SRP047113。3.3讨论在很长一段时间里，人们对微生物的研究都依赖于实验室的纯培养技术，但有研究表明自然环境中超过99%的微生物不能通过纯培养技术获得(Amannetal.,1995)，这成为了微生物研究和利用的瓶颈。随着分子生物学和生物技术的发展，诞生了一门既可研究可培养的微生物又可研究未培养微生物的新型科学——宏基因组学（Riesenfeldetal.,2004;SchlossandHandelsman,2003）。这种新的研究方法避免了对微生物进行纯培养和分离这一繁琐的步骤，却能够得到比依赖于纯培养技术的传统方法更为丰富的菌群信息，除此之外还能够以较低的成本，快速、方便、全面、准确地反映微生物菌群的组成以及变化规律（Mardis,2008;RothbergandLeamon,2008），为特定微生物菌群的研究提供了一个方便的平台。宏基因组测序技术是宏基因组学的研究的基础。Maxam和Gilbert建立的化学降解测序法（1977）和Sanger等发明的Sanger测序法（1977）统称为第一代测序法（侯涛，2013）。第一代测序法具有较高的准确率（99.999%），能够测取1000bp左右的DNA片段等优点。与此同时，第一代测序法也具有操作复杂、速度慢、成本高、且测序通量太低等不足之处，逐渐不能满足大规模测序的需求（ShendureandJi,2008），因而逐渐发展出了新一代的测序技术，如Roche公司开发的454测序法（Marguliesetal.,2005），Illumina公司开发的Solexa测序法（Fedurcoetal.,2006），ABI公司推出的SOLiD测序技术等，上述新型测序技术与第一代测序相比，具有高通量、操作简单方便、速度快、效率高和成本低等优点，在第一代测序技术的基础上有了很大的提升和发展，因而，被统称为第二代测序技术(next-generationsequencing)，与此同时，由于其具有高通量的特征，也常常被人们称之为高通量测序技术((High-throughputsequencing))。该些技术在测序17 中国农业科学院硕士学位论文第三章基因文库的构建和测序时，存在读长较短的不足，但它们能够实现深度测序，在一定程度上可以弥补读长较短所带来的问题，仍有利于物种多样性的分析。因而，已成为宏基因组的研究应用最广泛的测序技术。自2003，Jeyaprakash等首次利用第一代宏基因组测序法技术即Sanger测序法，通过测定意大利蜜蜂肠道菌群的全长的16SrRNA序列，对意大利蜜蜂肠道细菌群落的多样性进行分析以来，宏基因组技术逐渐应用于越来越多的有关蜜蜂肠道菌群中有的研究中。2012年，美国亚利桑那大学的Martinson等采集不同发育阶段的意大利蜜蜂（幼虫，新出房的蜜蜂，成年蜜蜂），利用454测序平台测定了其前肠，中肠，直肠的菌群分布，比较了不同发育阶段的蜜蜂肠道菌群的组成并弄清了肠道结构对蜜蜂肠道菌群组成的影响；同年，美国耶鲁大学的Moran等从两个不同州的各四个不同蜂群中采集了40只蜜蜂，同样利用454测序平台对其肠道菌群的16SrRNAV6–V8区序列扩增产物进行深度测序，研究了不同蜂群、不同地域的意大利蜜蜂中肠菌群的组成和分布；美国耶鲁大学的Engel等（2012）则利用Illumina测序平台，对位于意大利蜜蜂中肠中的特定菌群进行了研究，分析了其在维持蜂群健康以及营养物质的消化吸收方面发挥的具体作用。16SrRNAPCR扩增子测序是高通量测序技术中用于宏基因组研究最常用的其中一种方法，该方法能够以较短的时间、较低的花费获得大量的信息（Anderssonetal.，2008；Murphyetal.，2010；赵乐乐，2013）。能够通过该方法对菌种进行鉴定，是基于以下几方面原因：首先，16SrRNA普遍存在于原核生物中，在漫长的生物进化过程中基本保持不变，被看作生物演变的分子钟（Woese，1987）；其次，16SrRNA约含有1550个核苷酸，分子大小适中，便于序列分析（Spiegelmanetal.，2005）；再次，是建立在16SrRNA的基因结构基础上，16SrRNA既含有高度保守的恒定区序列也含有可变区，不同菌种的可变区序列是不同的，因而我们可应用其保守区序列设计引物，使16SrRNA基因片段扩增出来，进而进行不同菌属、菌种之间的系统进化分析（Pace，1997）；最后一方面原因是，宏基因组含有庞大的数据量，需要依托于高效的数据处理能力，而在16SrRNA文库进行基因信息筛选时，拥有一些广泛使用的数据库RDP、Greengene和SSU等，这些数据库还自带分类工具，如RDP数据库的RDPclassifier等（Coleetal.,2009），使分析过程得以简化（刘莉扬等，2013）。如上文所述，第一代测序技术可检测的序列的读长长，能够对16SrRNA的整个基因组进行测序，而第二代高通量测序技术，由于读长较短，一般只能针对16SrRNA中的某一个或某几个高变区进行研究和分析（Lazarevicetal.,2009;Turnbaughetal.,2009;Roeschetal.,2007;Jiangetal.,2012）。在本研究，我们在IlluminaHiseq2500平台上就是通过测定研究意大利蜜蜂中肠菌群时常用的16SrRNAV3区序列进行研究和分析，以实现对意大利蜜蜂中肠菌群进行研究的目的。18 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析第四章数据分析用生物信息学知识分析得到的序列，由于高通量测序技术所测得的序列中包含许多短序列片段，首先使用序列拼接软件，对这些短序列进行拼接，得到能够用以分析的较长的序列片段。然后对所得序列进行质量控制，删除低质量序列，进而利用最终得到的有效序列聚类成分类操作逻辑单元（operationaltaxonomicunit，OTU），与各种数据库里的已知序列进行比对，分析估计物种多样性和丰度。通过统计分析学知识，分析菌群的组成以及各组之间菌群之间是否存在差异。4.1材料与方法4.1.1实验材料北京市计算机中心测得的60份样品16SrDNAV3的序列。4.1.2实验方法4.1.2.1原始数据处理60份样品在IlluminaHiSeq2500平台经双端（pair-end）测序之后，首先使用FastQC软件对原始数据进行质量控制(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)，通过QIIME1.8平台去除原始序列中的低质量序列(Caporasoetal.,2010)，各个不同样品的序列根据在建库过程中添加的标签序列区分开，而在PCR过程中形成的嵌合体可利用USEARCHv6.1软件去除(Edgar,2010)。利用软件FLASHv1.2.7(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对通过质量控制的序列的相应两端进行连接(MagočandSalzberg,2011)，用NGSQCToolkits2.3舍弃无法连接的一些短序列（<150bp）(PatelandJain,2012)。之后，对连接上的序列进行过滤，获得最终用于分析的有效序列，进行下一步的分析。4.1.2.2数据进一步统计分析以97%相似度将分类操作单元（operationaltaxonomicunits，OTUs）进行划分，然后用UCLUSTv1.2.22软件对获得的高质量序列进行聚类。以80%置信水平通过RDPClassifier分别从门、纲、目、科、属、种水平鉴定OTU代表性序列的微生物分类地位(Wangetal.,2007)。在QIIME平台进行稀释曲线的评价以及Goods覆盖度、Chao1和Shannon多样性指数的计算，然后用R语言的T-test进行差异分析。4.2结果与分析4.2.1测序基本数据在IlluminaHiSeq2500测序平台上测得的60份样品的16SrDNAV3区双端测序结果经过初步整理后，得到27,673,383条序列，每个样本的平均序列数为461,223条（所测样品的最小序列数为356,486条，最大序列数为529,077条）（具体测序数据结果见表4.1），平均序列长度为131bp。19 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析表4.160份蜜蜂样品测序数据结果Table4.1readssequencedinthe60beesamplesSampleIDSequenceCountOTUsCountC1.A48959199C1.B243375270C1.C214517222C1.D324948268C1.E250453206C2.A118748235C2.B233118194C2.C235406241C2.D335080287C2.E284463215C3.A235821252C3.B344772228C3.C261702252C3.D285180290C3.E295152218P15.1.A256733271P15.1.B414197208P15.1.C204006213P15.1.D218100183P15.1.E256236230P15.2.A169949258P15.2.B197500223P15.2.C250536237P15.2.D196733232P15.2.E242683304P15.3.A296821265P15.3.B324279324P15.3.C110790184P15.3.D306489214P15.3.E270027269P45.1.A18372320420 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析表4.1（续表）SampleIDSequenceCountOTUsCountP45.1.B353393277P45.1.C280425300P45.1.D181719229P45.1.E248718185P45.2.A118453179P45.2.B118483213P45.2.C221800235P45.2.D243714237P45.2.E220607228P45.3.A42061160P45.3.B207005198P45.3.C308796274P45.3.D363742200P45.3.E118304244P5.1.A257303233P5.1.B311823255P5.1.C355849228P5.1.D284943181P5.1.E305813240P5.2.A334958390P5.2.B295728323P5.2.C257536203P5.2.D316954238P5.2.E278272204P5.3.A193082285P5.3.B336438241P5.3.C313894221P5.3.D287332233P5.3.E319510305TotalSequence15,087,151注：AE:Exposedtoimidaclopridfor3,6,9,12,and15d,respectively.Ck:Puresugarsyrupwith0.03%acetone;P5:0.005mg/Lofimidaclopridsyrups;P15:0.015mg/Lofimidaclopridsyrups;P45:0.045mg/Lofimidaclopridsyrups21 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析4.2.2蜜蜂中肠菌群组成经质量控制后，我们将得到的15,102,475条16SrRNA高质量序列，在QIIME平台上分成不同的操作单元。通过与数据库RDP、Greengene和SSU在内的多个数据库中的已知序列进行比对，从门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）等不同生物分类水平上，获得了每个样品的菌群分类信息及其相对丰度信息。在门的生物分类学水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是主要菌属，这与前人有关蜜蜂肠道微生物的组成研究结果一致(Disayathanoowatetal.,2012;Gengetal.,2013)。在属的生物分类学水平上，β-变形菌门中的金氏杆菌属含量最高，其次是乳酸杆菌属（见图4.1）。4.2.3亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群组成的影响本研究中的四个处理分别为：饲喂含（0.03%）丙酮的糖水(50%糖水)，作为空白对照；第二到第四组分别依次饲喂0.005mg/L,0.015mg/L和0.045mg/L三种浓度的吡虫啉蔗糖溶液。为探究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂中肠菌群组成是否存在剂量效应，分别在处理3，6，9，12和15d时收集样品，分析相同时间点其主要肠道菌属数量。结果图4为每个取样时间点不同处理下的蜜蜂主要的中肠菌群直方图。通过T-检验表明，各处理组间在相同时间点主要菌属的数量无显著差异(P>0.05)。这一结果表明，亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂中肠菌群组成影响不显著。图4.1在属水平上的蜜蜂中肠菌群组成Fig.4.1RelativeabundanceofthedominantbacterialgenerainthemidgutofApismelliferaligusticaadultsAE:Exposedtoimidaclopridfor3,6,9,12,and15d,respectively;Ck:Puresugarsyrupwith0.03%acetone;P5:0.005mg/Lofimidaclopridsyrups;P15:0.015mg/Lofimidaclopridsyrups;P45:0.045mg/Lofimidaclopridsyrups.22 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析4.2.4吡虫啉亚致死剂量对意大利蜜蜂中肠细菌结构的影响以97%相似度将分类操作单元（operationaltaxonomicunits，OTUs）进行划分后，用UCLUSTv1.2.22软件对经过质量控制后得到的高质量序列进行聚类。在QIIME平台完成Goods覆盖度、Chao1、ACE和Shannon等多样性指数的计算（表4.2）。Shannon指数是最常用的表示微生物菌群的多样性指数之一，图6为不同采样时间点Shannon指数的直方图。对同一时间点不同组间的Shannon，chao1以及ACE等多样性指数进行T-检验，结果显示，各处理组间的多样性指数无显著差异(P>0.05)。这一结果表明，吡虫啉亚致死剂量对中肠细菌的结构影响不显著。表4.260份蜜蜂样品物种多样性指数Table4.2richnessestimatorsinthe60beesamplesSampleIDACESimpsonShannonchao1observedspeciesC1.A399.97947690.6698291462.5445755067.69449350.5C2.A389.59931260.80103322.9660046416.88754366.3235294C3.A461.25290720.7314577452.3362046927.53167429.6C1.B478.46288490.7055355422.3078506337.06193438.8372093C2.B280.5089290.4210651841.5087030096.17637265.0909091C3.B360.85481750.7430920482.536623255.83098353.15625C1.C367.35715290.746433312.4507151266.61527319.3488372C2.C371.86753730.3500832661.3380361077.012359.3170732C3.C423.89379750.621925312.1262293576.55017402.0857143C1.D466.29227540.5810922351.9034028987.46081431.5789474C2.D510.44348590.7368592332.4382486397.96242516.3333333C3.D549.53635450.7894323672.6343932998.18686486.9375C1.E331.33569070.6424450822.3497034876.14021323.3448276C2.E327.16576060.341071241.3355585236.26659333.6071429C3.E387.12548730.7723309882.6935098166.71072354.59375P5.1.A362.94083660.6694997742.2704463725.96251411.1428571P5.2.A561.8069490.8059707323.1559258988.57862558.1320755P5.3.A494.19458920.7081503612.5424849078.59271421.4181818P5.1.B371.21233230.8166036862.8896009566.66662365.1578947P5.2.B536.99322030.7476364142.7500156127.75899489.357142923 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析表4.2（续表）SampleIDACESimpsonShannonchao1observedspeciesP5.3.B407.46384420.6327059372.0081147596.36498391P5.1.C348.55086450.6094732241.8902040546.14167345.9032258P5.2.C410.20876880.7094242062.3396953755.22382.0769231P5.3.C333.9326230.6827962762.2831788375.68194342.5357143P5.1.D347.66507670.4655237221.641275355.73295355.7894737P5.2.D402.49750.6964564962.6760710576.18195356.3170732P5.3.D389.66717140.6805417652.3988312276.62607392.4642857P5.1.E386.83814370.5782409551.839589327.80455324.0576923P5.2.E337.38352890.7263507182.4738622766.25297318.21875P5.3.E412.35493370.7563461922.7686877367.48038398.2884615P15.1.A374.27306020.578324782.1420694917.09541364.7179487P15.2.A416.21601140.7250327842.5491881657.75266390.0769231P15.3.A450.36929170.7007792252.2706400096.90277414.2368421P15.1.B363.58042090.7591196352.4746538075.27489371.8P15.2.B305.23916140.6410782272.1467781925.49843304.6176471P15.3.B551.68067230.7305605772.5037929857.55082545.1363636P15.1.C338.40422120.6601465332.3848117136.1578311.1538462P15.2.C362.35374830.4619392561.7220288556.05076334.5P15.3.C352.57070430.7661994662.826289935.35277362.5P15.1.D284.20774650.6608199372.3773465425.11119282.4P15.2.D369.31823680.4692659381.7965180976.38443382.1935484P15.3.D372.2909860.7379693852.3764350656.55483333.6P15.1.E387.08723470.791512642.904637196.49795398.3333333P15.2.E488.22958520.6749882662.5505347678.22074503.4864865P15.3.E443.12188070.6896471942.4817293817.55632445.1290323P45.1.A345.63475490.6902193432.2302865296.07257342.5555556P45.2.A312.4480280.7128457492.5237371775.63074325.7142857P45.3.A311.92015550.6582657942.3429433545.78223280.1224 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析表4.2（续表）SampleIDACESimpsonShannonchao1observedspeciesP45.1.B411.25200780.7439679682.412764816.29924382.6222222P45.2.B393.90588020.663071822.4122374286.38283369.483871P45.3.B324.82804540.562732051.7954230765.40283319.8333333P45.1.C525.16975960.718567832.6424010947.98682493.7173913P45.2.C376.73456990.5737413561.9537862986.26096380.5P45.3.C385.46067840.6190239712.1554954535.99515344P45.1.D353.68897210.7206940352.2583213896.5713324.7P45.2.D314.31869670.7405632712.6485781717.3227296.7272727P45.3.D318.22695520.6284396791.8028367995.50786323.2425 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析图4.2不同处理时间下各组的意大利蜜蜂中肠菌群主要菌属的组成Fig.4.2RelativeabundanceofthedominantmidgutbacterialgenerainthemidgutofApismelliferaligusticaadultsafterexposedtoimidaclopridfordifferenttimeAE:Exposedtoimidaclopridfor3,6,9,12,and15d,respectively.Ck:Puresugarsyrupwith0.03%acetone;P5:0.005mg/Lofimidaclopridsyrups;P15:0.015mg/Lofimidaclopridsyrups;P45:0.045mg/Lofimidaclopridsyrups.26 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析图4.3不同处理时间下各组的意大利蜜蜂中肠菌群的Shannon指数Fig.4.3ShannonindexofbacterialdiversityinthemidgutofApismelliferaligusticaadultsafterexposedtoimidaclopridfordifferenttimecalculatedusingQIIMEtoolkitAE:Exposedtoimidaclopridfor3,6,9,12,and15d,respectively.Ck:Puresugarsyrupwith0.03%acetone;P5:0.005mg/LofimidaclopridsyrupsP15:0.015mg/LofimidaclopridsyrupsP45:0.045mg/Lofimidaclopridsyrups.4.3讨论对菌群组成的宏基因组研究是一个复杂的过程，会受到如实验样品的选择，提取的DNA的质量，测序方法以及最后的数据分析方法等，各种外部因素的干扰，在研究过程中，本实验采取多种手段来规避各种实验误差，确保最终实验结果的可信度。首先，如第二章所述，我们在同一27 中国农业科学院硕士学位论文第四章数据分析时间选取新出房的意大利蜜蜂作为实验对象，屏蔽饮食、环境等外界因素对实验结果的影响，使实验处于同一参考水平；其次，通过查阅有关DNA提取的相关文献，发现德国QIAGEN公司的QIAamp肠道微生物DNA提取试剂盒能提取微量菌群的DNA，而且提取的DNA纯度高，最终确定选用该试剂盒提取样品的DNA（Alexandraetal.,2002;Meietal.,2003），并对提取的DNA进行定性和定量检测；再次，在应用PCR扩增16SrRNAV3区基因时，为减少系统误差，我们使60份样品在同一台PCR仪上完成，并对最终得到的文库进行检测；最后，选用是比较先进的IlluminaHiSeq2500测序平台进行测序，对测序得到的序列进行生物信息学分析时，为保证能够全面反映检测到的菌群的多样性，采用多个数据库同时进行序列比对来确定菌群的组成和多样性信息。因而，本实验基本确保了检测到的意大利蜜蜂中肠菌群组成的真实性。在IlluminaHiseq2500测序平台上，利用16SrRNA测序方法得到的中肠菌群序列经分析后，发现意大利蜜蜂中肠中的主要菌属为β-,γ-变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），这与前人有关意大利蜜蜂中肠菌群的研究结果基本一致(Martinsonetal.,2011;Disayathanoowatetal.,2012;Gengetal.,2013)。这一结果支持了Martinson等（2011）提出的蜜蜂体内的共生菌仅是某些特定的菌群，即菌群多样性较低这一观点。本研究结与他人的研究成果相比，也存在一些差异性。首先，菌群多样性低一些(Babendreieretal.,2007;Gengetal.,2013)，有研究表明，食物的多样性会影响蜜蜂肠道菌群的多样性（Ament,2008），因而，导致这种差异性的原因可能是本研究中使用的蜜蜂长期食用糖水，蜜蜂无法从环境中获得细菌，从而使其肠道菌群的多样性降低。乳酸菌是公认的对人类以及动物健康有益的益生菌。在蜜蜂方面，越来越多的研究证实，乳酸菌属对维持蜜蜂健康、增强机体免疫力方面有重要作用。Olofsson和Vásquez（2008）以各种类型的蜂蜜为研究对象，应用16SrRNA测序的方法探究了蜜蜂体内的菌群与蜂蜜形成之间的关系，研究表明乳酸菌属在蜂蜜形成过程中发挥着重要作用；Vásquez等（2012）的报道也指出，在饲养蜜蜂的过程补充含有乳酸菌属制剂的饲料，能够增强蜂群对病原体的抵抗力，还能够缓解蜂群感染CCD的风险。在本研究中，我们发现在意大利蜜蜂的中肠中也含有大量的乳酸菌属的菌种，这与前人的相关研究结果一致(Olofssonetal.,2011;Vásquezetal.,2009)。探究亚致死剂量吡虫啉是否会对蜜蜂中肠菌群结构造成影响，对于丰富农药的安全性评估体系，从而为实际生产中农药的合理运用提供参考具有重要意义。本研究以新出房的意大利蜜蜂为实验对象，首次在实验室条件下探究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响，为明确吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应是否存在剂量效应，我们选用了3种不同的亚致死剂量浓度（0.005,0.015mg/L,and0.045mg/L）并以混有0.03%的丙酮的蔗糖溶液作为空白对照，与此同时，为弄清其是否存在时间效应，我们选用了5个不同的采样时间点(3,6,9,12,和15d)，对不同组间的主要菌属以及代表菌群多样性的指数进行生物统计学分析，结果显示亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落的组成以及结构影响均不显著（p>0.05）。许多研究表明，蜜蜂肠道内栖息的微生物，具有包括提供营养、抵抗病原菌侵袭、增强机体免疫力等多种功能，与蜂群健康密切相关（OlofssonandVasquez,2008;Martinsonetal.,2011;KochandSchmid-Hempel,2011）。基于肠道菌群与蜜蜂健康之间的密切关系，Crotti等（2013）已开始探究将肠道菌群作为评价蜂群健康的一个指标的可能性。本研究结果表明，亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落结构影响不显著。因而，将意大利蜜蜂的中肠菌群结构的变化作为评价农药对蜜蜂亚致死效应的指标需要进行进一步的探究。28 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论研究表明，蜜蜂肠道内栖息的大量微生物，具有包括提供营养、抵抗病原菌侵袭等多种功能，与蜂群健康密切相关。探究亚致死剂量吡虫啉是否会对蜜蜂中肠菌群结构造成影响，对于吡虫啉的安全性评估具有重要意义，但吡虫啉对蜜蜂肠道菌群的影响还未见报道。因此，本研究在实验室条件下，以出房1-2h的意大利蜜蜂为研究对象，研究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica中肠细菌群落的影响，以期为杀虫剂的生物安全性评价体系提供理论依据。分别用3种不同浓度（0.005,0.015和0.045mg/L）的吡虫啉蔗糖溶液以及含丙酮（0.03%）的糖水(空白对照)在实验室内饲喂刚出房的意大利蜜蜂，在饲喂3,6,9,12和15d时分别取样。提取中肠细菌基因组DNA，采用下一代高通量测序技术对4个处理组蜜蜂中肠细菌群落进行检测分析。细菌序列分析表明，意大利蜜蜂中肠细菌主要属于变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），同一时间内各组间主要细菌数量差异不显著（P>0.05），同时细菌群落多样性指数差异也不显著（P>0.05）。以上结果表明，在实验室条件下亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落结构影响不显著。29 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光匆匆，在中国农业科学院蜜蜂所的三年硕士求学之路转瞬而过，回首走过的三年，自己从一个懵懂无知的小女生，蜕变为一个有所担当的成年人。在此我想对所有帮助、支持过我的师长、同学以及家人致以我最衷心的感谢，谢谢你们！首先我要感谢我的导师周婷研究员，这三年来，导师不仅在课题设计、实验基本操作、论文撰写等学习方面，给予了悉心的指导，而且在平常生活中也对我照顾有加，在为人处事、生活态度等方面，对我也是谆谆教导。导师渊博的知识，严谨、实事求是的治学态度，勤奋认真、不知疲倦的丰献精神，以及对科研事业的热爱、执着追求，使我获益匪浅，感激至深。我非常庆幸自己能师从周老师，在此，向恩师致以最诚挚的感谢与最高的敬意！感谢中国农业科学院蜜蜂研究所蜜蜂保护和生物学研究室的王强老师、代平礼老师、吴艳艳老师、徐书法老师、褚艳娜老师、实验员李贵荣师傅等对我的支持和帮助，在此对他们表示由衷的感谢！感谢代平礼老师在平常工作、学习中对我的关心和照顾，代平礼老师为人谦和，无论是对待咨询问题的蜂农，还是向他请教问题的其他老师或者学生，他都耐心倾听，并给予好的建议，代平礼老师在作科研方面更是踏实谨慎，不急不躁，这些都是我今后应一直坚持的东西，谢谢您一直以来对我的照顾！感谢徐书法老师在做分子实验时提供实验仪器，并给予了许多重要建议，徐老师为人正直，谈吐幽默，学识渊博，这些都是我学习的榜样。非常感谢两年多以来给予妈妈般温暖的科室李贵荣师傅在实验以及日常生活中对我的支持、照顾和鼓励，谢谢您！此外，尤其感谢两年多以来朝夕相处的吴艳艳老师对我的照顾和帮助，吴艳艳老师不仅在整个实验过程中给予了我许多指导和帮助，在生活中对我也是照顾有加，处处为我设想，在我失意，困难时予以悉心开导，谢谢您！本论文的顺利完成离不开大家的帮助，谢谢你们！感谢同窗张建燕、郭伟华、靳三省、盖琴宝、魏月、吴招斌、任佳淼、孙春丽在学习和生活中对我的关心和支持，这三年的共同学习生涯中的点点滴滴都是我生命中的最最美好的回忆，在这个集体中度过的时光我会铭记于心；感谢李薇师姐和薛菲师妹在实验和生活上对我的很多支持和帮助，谢谢你们！感谢我最最亲爱的父母以及所有亲人，一直以来对我的默默付出和无私关怀，在我失意无助时给了我最大的支持与鼓励，你们一直都是我奋发前进的动力，没有你们的关心和鼓励，我很难坚持至今，谢谢你们，我爱你们！最后，再次向所有关心我、支持我、鼓励我的老师、同学、朋友和亲人献上我最真诚的谢意和最美好的祝愿！贾慧茹2015年3月于蜜蜂所37 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：贾慧茹民族：汉族性别：女出生年月：1989年5月籍贯：山西省主要经历2008.09-2012.07西北民族大学动物医学专业，获农学学士学位；2012.09-2015.07中国农业科学院蜜蜂研究所攻读硕士学位。所获荣誉本科期间2008.9-2009.6学年荣获国家励志奖学金；2009.9-2010.6学年荣获国家励志奖学金；2010.9-2011.6学年荣获国家励志奖学金；2011.9-2012.6学年荣获西北民族大学优秀毕业生；硕士研究生期间2012.9-2013.6学年荣获中国农业科学院优秀学习成绩奖；2012.9-2013.6学年荣获中国农业科学院大连―三仪‖助学金。发表文章(第一作者)1.贾慧茹，吴艳艳，代平礼，王强，周婷.亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠细菌群落的影响（英文），昆虫学报，2015,58(2):139-146.2.贾慧茹，周婷，高夫超.一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对蜜蜂病毒诊断研究的比较，应用昆虫学报，2015,52（2）：351-355.3.贾慧茹，刘进祖，王星，吴艳艳，周婷.北京地区六种蜜蜂病毒病的流行病学研究，应用昆虫学报，2014,51(3):772-780.4.贾慧茹，王星，周婷.蜜蜂肠道微生物研究概况，动物医学进展，2014,35(4):116-121.5.贾慧茹，吴艳艳，周婷.杀虫剂与蜜蜂，中国蜂业，2014,65(2):65.参编书籍蜜蜂医学概论.北京：中国农业科学技术出版社，2014.38