交变磁场对内蒙古河套蜜瓜生理生化特性的影响 77页

分类号：TS219密级：公开UDC：学校代码：10127硕士学位论文论文题目：交变磁场对内蒙古河套蜜瓜生理生化特性的影响英文题目：EffectofthealternatingmagneticfieldonphysiologyandbiochemicalcharacteristicsinCucumismeloL.cvHetao学位类别：理学硕士研究生姓名：王秀娟学号：201202210学科(领域)名称：微生物学指导教师：王国泽职称：教授协助指导教师：职称：2015年6月6日 内蒙古科技大学硕士学位论文I 内蒙古科技大学硕士学位论文摘要河套蜜瓜是内蒙古河套地区重要的经济作物之一，具有很高的营养价值，已受到区内外的普遍欢迎。但是由于其属于典型的呼吸跃变型果实，采收之后很容易发生腐烂变质，因而不易贮藏，限制了其大规模性的生产。因此，河套蜜瓜的保鲜技术正逐步引起人们的关注。目前所研究出来的保鲜技术或多或少存在一定的缺陷，不利于其保鲜。交变磁场在人们的生活中很常见，但作为保鲜技术的应用却较少。同时由于磁场处理具有简单易行，无毒无害，对环境污染小，没有化学残留等优点，因而具有广泛的应用前景。磷脂酶D（phospholipaseD，PLD），作为植物细胞膜中水解磷脂的主要酶类，不仅对细胞膜的结构及功能等有一定的作用，而且在细胞信号转导中也扮演着重要的角色。近年来，PLD的抗逆特性已成为研究热点。本研究采用不同强度及时间的磁场对内蒙古河套蜜瓜进行处理，测定其相关生理生化指标，以确定磁场处理的最佳强度和时间，为应用于其它果蔬提供一些理论依据。同时，通过荧光定量PCR技术，测定了河套蜜瓜在不同时间磁场处理后PLD基因表达量的变化，从分子生物学角度探究磁场处理的保鲜机理。主要结论如下：（1）采用不同强度的交变磁场对内蒙古河套蜜瓜进行处理，得出磁场处理可以有效的降低其腐烂率、失重率及呼吸强度，使可滴定酸含量变化平缓，同时对延缓果实软化和提高可溶性固形物的含量也有一定的作用，尤以180V的磁场强度为最佳，此时河套蜜瓜的保鲜效果最好。（2）采用不同时间的交变磁场对内蒙古河套蜜瓜进行处理，得出磁场处理可以有效的降低其腐烂率、呼吸强度及膜渗透率，使可滴定酸含量变化平缓，同时对延缓果实软化和提高可溶性固形物的含量也有一定的作用，尤以磁场处理15min的效果最佳，此时河套蜜瓜的保鲜效果最好。（3）利用荧光定量PCR技术，得出当磁场处理时间为15min时，河套蜜瓜PLD基因的表达量变化最低，此时河套蜜瓜的保鲜效果最好。综上所述，使用180V的交变磁场，对河套蜜瓜处理15min时，河套蜜瓜的保鲜效果最好。关键词：交变磁场；河套蜜瓜；生理生化特性；磷脂酶D（PLD）；荧光定量PCRII 内蒙古科技大学硕士学位论文AbstractCucumismeloL.cvHetaoisoneofthemostsignificanteconomiccropswithhighnutritionalvalueinInnerMongoliaHetaoArea,whichhaswonpopularityinsideandoutsidethearea.However,asatypicalclimactericfruit,itiseasytodeteriorateanddecayafterharvest,thuslimitsitslarge-scaleproduction.ThecurrentpreservationtechnologyofCucumismeloL.cvHetaohasacertaindefectandthisproblemhasarousedwideconcern.Alternatingmagneticfieldisverycommonindailylife,butrarelyusedinpreservationtechnology.Magneticfieldtreatmentisanattractivetechnologyforeasy-operate,non-toxic,low-pollutionandnon-chemicalresidues,therefore,ithasbroadapplicationprospects.PhospholipaseD(PLD)isakeyenzymeintheprocessofphospholipidhydrolysisinplantcellmembrane,whichplaysanimportantroleinthestructureandfunctionofcellmembrane,butalsoincellularsignaltransduction.Inrecentyears,theadverse-resistantcharacteristicsofPLDhasbecometheresearchhotspot.Inthisstudy,theintensityandtimeofalternatingmagneticfieldtreatmentofCucumismeloL.cvHetaowereregardedastheindex.Thephysiologicalandbiochemicalindicatorsweredeterminedsoastoobtaintheoptimalcondition.Atthesametime,quantitativePCRwasusedtomeasurethechangeofPLDexpression.Themainresultswereasfollows:(1)Firstly,differentintensityofthealternatingmagneticfieldwasusedtothetreatmentofCucumismeloL.cvHetao.Comparedwithuntreatedsamples,thealternatingmagneticfieldwithintensityof180Vresultedinreducedrespirationratesanddelayeddecomposition,slowedtheflowoftitratableacid,whileimprovingthefrimnessandsolublesolidscontent.Itcouldbefoundthatthemagneticfieldwithstrengthof180VwasthebestformaintaininggoodqualityofCucumismeloL.cvHetao.(2)Secondly,differenttimeofthealternatingmagneticfieldwasusedtothetreatmentofCucumismeloL.cvHetao.Comparedwithuntreatedsamples,thealternatingmagneticIII 内蒙古科技大学硕士学位论文fieldwithtreatingfor15minresultedinreducedrespirationrates,lowerelectrolyteleakage,delayedsofteninganddecomposition,slowedtheflowoftitratableacid,andreducedflowsofsolublesolids.Theresultsshowedthatthemagneticfieldwithtreatingfor15minwasthebestformaintaininggoodqualityofCucumismeloL.cvHetao.(3)Thirdly,thequantitativePCRtechniquewasusedtodetectthechangeofexpressionofPLDgeneinCucumismeloL.cvHetao,whichwastreatedbythedifferenttimeofthealternatingmagneticfield.Theresultsshowedthatwhenthetreatingtimewas15min,theexpressionofPLDgenewasthelowest.Underthiscondition,theCucumismeloL.cvHetaocouldmaitainagoodquality.Tosumup,applicationofthealternatingmagneticfieldpriortostorage,especiallywhenthetreatingintensityof180V,treatingtimefor15min,showedbeneficialeffectsonreducingnegativeresponsesanddelayingripeninginCucumismeloL.cvHetao.KeyWords:Alternatingmagneticfield;CucumismeloL.cvHetao;Physiologyandbiochemicalcharacteristics;PhospholipaseD(PLD);QuantitativePCRtechniqueIV 内蒙古科技大学硕士学位论文目录摘要............................................................................................................................................IABSTRACT.........................................................................................................................................III引言...........................................................................................................................................11文献综述.......................................................................................................................................21.1河套蜜瓜................................................................................................................................21.1.1河套蜜瓜概述................................................................................................................21.1.2河套蜜瓜的采后生理机制...........................................................................................21.2磁场的生物效应....................................................................................................................31.2.1磁场概述........................................................................................................................31.2.2生物磁现象及生物磁效应...........................................................................................31.2.3生物电磁学的应用现状...............................................................................................41.3果蔬的贮藏保鲜....................................................................................................................51.3.1热处理保鲜技术............................................................................................................51.3.2气调贮藏保鲜技术.......................................................................................................51.3.3涂膜保鲜技术................................................................................................................61.3.4臭氧贮藏保鲜技术.......................................................................................................71.3.5河套蜜瓜的贮藏保鲜方法...........................................................................................71.4磁场处理在果蔬贮藏保鲜中的应用..................................................................................91.4.1磁场处理对凤尾菇生长效应的影响..........................................................................91.4.2磁场处理对草莓保鲜效果的影响..............................................................................91.4.3交变磁场处理对莲藕切片保鲜效果的影响..............................................................91.4.4交变磁场对葡萄贮藏保鲜效果的影响....................................................................101.5磷脂酶D..............................................................................................................................101.5.1磷脂酶D概况.............................................................................................................101.5.2PLD在抗逆反应中的作用.........................................................................................111.5.3PLD基因全长的克隆技术........................................................................................121.6选题目的..............................................................................................................................131.7研究内容..............................................................................................................................132不同强度磁场处理对河套蜜瓜采后生理特性的影响..........................................................15 内蒙古科技大学硕士学位论文2.1实验技术路线......................................................................................................................152.2实验材料与方法..................................................................................................................152.2.1实验材料准备..............................................................................................................152.2.2实验方法......................................................................................................................182.2.3数据处理......................................................................................................................212.2.4结果与分析..................................................................................................................212.3小结......................................................................................................................................263不同时间磁场处理对河套蜜瓜采后生理特性的影响..........................................................273.1实验技术路线......................................................................................................................273.2实验材料与方法..................................................................................................................273.2.1实验材料准备..............................................................................................................273.2.2实验方法......................................................................................................................273.2.3实验数据处理..............................................................................................................283.2.4结果与分析..................................................................................................................293.3小结......................................................................................................................................324不同时间磁场处理对鲜切河套蜜瓜PLD基因表达量的影响............................................334.1实验路线图..........................................................................................................................334.2河套蜜瓜PLD引物的确定...............................................................................................334.2.1实验材料与仪器..........................................................................................................334.2.2试剂的配制..................................................................................................................334.2.3实验方法......................................................................................................................354.2.4实验结果......................................................................................................................374.3荧光定量PCR反应............................................................................................................404.3.1实验材料与仪器..........................................................................................................404.3.2实验方法......................................................................................................................404.3.3结果..............................................................................................................................424.4小结......................................................................................................................................515讨论.............................................................................................................................................525.1磁场处理对河套蜜瓜外观品质的影响............................................................................525.2磁场处理对河套蜜瓜失重率的影响................................................................................52 内蒙古科技大学硕士学位论文5.3磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响............................................................................525.4磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响............................................................................535.5磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响....................................................................................535.6磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响...........................................................545.7磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响....................................................................545.8磁场处理对鲜切河套蜜瓜腐烂率的影响........................................................................545.9磁场处理对内蒙古河套蜜瓜PLD基因表达量的影响.................................................55结论.........................................................................................................................................56展望.........................................................................................................................................57参考文献.........................................................................................................................................58附录A常用实验仪器与药品......................................................................................................66在学研究成果.................................................................................................................................67致谢.........................................................................................................................................69 内蒙古科技大学硕士学位论文引言河套蜜瓜（CucumismeloL.cvHetao），是内蒙古河套地区一种优质的甜瓜品种。由于该地区独特的环境条件，使生产出的河套蜜瓜口味独特，甜度较高，散发出诱人的香味，同时还可以消暑、解渴、消炎等，可谓是瓜中珍品，且是内蒙古地区一种非常重要的经济作物。然而，由于河套蜜瓜是呼吸跃变型果实，采收时，正值高温时期，成熟期比较短，采后生理代谢极快，尤其是软化速度，因此，采摘后的河套蜜瓜品质迅速下降，不耐贮藏，严重阻碍了其大规模性的种植与销售。因此，如何延长河套蜜瓜的贮藏保鲜时间已成为普遍关注的焦点。目前，用于河套蜜瓜保鲜的技术有抗菌剂涂膜保鲜、1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）处理保鲜、臭氧处理保鲜等，但是由于这些处理方法自身所具有的弊端和河套蜜瓜所特有的成熟、软化机制及采后生理特性等使得其在河套蜜瓜保鲜贮藏中的应用效果不是很理想。生物磁学，是探讨磁场与物质在生物学特性方面相互关联的一门新型学科，目前已在许多领域得到了广泛的应用。磁场保鲜不仅有着自己独特的优点，而且其操作简便，经济实用，不会产生有毒有害物质，对处理后的果蔬和环境没有污染，具有广泛的市场应用前景。近年来，虽有研究已将磁场处理应用于草莓、莲藕、葡萄等的保鲜贮藏，但是将其作为一种新型的食品保鲜技术加以研究却并不多见，且还没有从分子生物学角度研究其保鲜机理，因此对磁场处理后河套蜜瓜生理生化特性的研究，不仅可以完善河套蜜瓜的磁场保鲜方法，同时对其它果蔬的磁场保鲜研究也有一定的理论指导意义。本研究以内蒙古河套蜜瓜为研究材料，采用不同强度及时间的磁场对其进行处理，通过测定一系列生理指标，得出最佳的磁场处理强度和时间，为其它果蔬的保鲜贮藏奠定理论基础。同时，采用荧光定量PCR技术，从分子生物学角度探究不同时间磁场处理对内蒙古河套蜜瓜PLD基因表达量的影响，从而更进一步的研究磁场处理的保鲜机理。-1- 内蒙古科技大学硕士学位论文1文献综述1.1河套蜜瓜1.1.1河套蜜瓜概述河套蜜瓜（CucumismeloL.cvHetao），俗名为华莱士，属葫芦科甜瓜属厚皮[1]甜瓜亚属，被广泛种植在内蒙古河套地区。由于该地区白天光照时间较长，干燥且雨量较少，温差较大，是蜜瓜类果实积累糖分的必要条件，所以产出的河套蜜瓜含有较高的糖分，同时也含有大量的维生素和矿物质，其中Fe、维生素A和β-胡萝[2,3]卜素的比例在各类水果中均名列前茅（表1.1），成为了该地区主要的经济作物，已受到区内外很多地方的欢迎。表1.1河套蜜瓜的营养成分营养成分含量水分（%）88.82糖类化合物（%）7.671蛋白质（%）0.632粗纤维（%）0.677总酸度（%）0.0774Ca（mg/100g）8.67维生素C（mg/100g）11.721.1.2河套蜜瓜的采后生理机制河套蜜瓜作为一种呼吸跃变型果实，在呼吸跃变出现时或出现之前，果实内部乙烯的形成量急剧增高，其出现了果实成熟、软化，呼吸强度增加，腐败加速，不耐贮藏等情况。-2- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.1.2.1河套蜜瓜的成熟机制乙烯的产生与果实的成熟和衰老密切相关，是呼吸发生跃变的先导，即在呼吸高峰和乙烯产生高峰之前，果实内部促进其成熟的一系列生理生化反应已经开始启[4][5]动。河套蜜瓜的生长曲线类型属于典型的单“S”型。韩育梅等的研究表明：在呼吸跃变之前，内源乙烯就已经产生，并逐渐上升，同时在呼吸跃变过程中发生了明显的跃变趋势，果实逐渐的走向成熟与衰老。1.1.2.2河套蜜瓜采后软化机制[6]果实的软化机制是由于其在成熟过程当中体内发生了许多生理反应。骆蒙等的研究结果表明：果实发生软化现象，是由于体内果胶酶和纤维素酶的作用所引起的。当对河套蜜瓜进行口味品质评定时，是否紧实是直接决定果实销售量的因素，但在高温条件下其软化速率更为明显，且硬度有明显的下降。一般认为河套蜜瓜软化的因素是细胞壁[5]上果胶层被破坏所致。1.2磁场的生物效应1.2.1磁场概述任何物质及空间都是具有磁性和磁场的，只是其磁性与磁场随着物质及空间的[7][8]不同而不同。磁场可分为两类：静磁场与变磁场。磁场能使机体内产生一定的生理作用，但由于产生静磁场和变磁场的机制不同，所以其产生的生物学效应也有所[9]不同。1.2.2生物磁现象及生物磁效应生物磁效应，即生物在整个生命过程都会形成微弱的磁场，从而使其带有一定[7]的弱磁性。近年来，生物磁现象作为一种高新技术，已受到人们的普遍关注。磁场的生物效应，即在物质周边产生的一些磁场，对生物体的细胞组织及其它生命活[10]动产生一定的作用。-3- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.2.2.1磁场对生物体遗传因子的影响DNA或RNA的三维构造主要是由氢键和其它的次级键结合而成，而氢键和次级键的作用较弱，容易被外界环境所干扰。当生物体长期生存于磁场条件下，DNA[9][11]序列会发生变化。MooreRL的研究发现：DNA区段经过磁场作用一段时间后，其内部会有新的序列产生，致使DNA位点发生突变。1.2.2.2磁场对组织细胞的影响生物膜在运输离子的过程中，使细胞产生兴奋，兴奋是一些生物体新陈代谢及[12]能量转换所必不可少的条件。生物细胞膜上离子的转运过程及通透性变化等都会受到电磁场的洛仑兹力影响，从而进一步影响细胞的正常生理活动，同时使其发生[13][14]变化。有研究发现：当植物被磁场处理后，其细胞内线粒体数目等会明显增加，因此可以为细胞提供更多的呼吸场所，释放出大量能量，为细胞的分裂等生命活动提供一定的条件。1.2.2.3磁场对生物大分子的影响磁场除了对磁性物质有一定的功能外，对氨基酸等物质含量的变化也能起到一[9]定的影响。细胞内所含有的大分子物质（蛋白质、酶等），其或所含的基团带有不同电荷，或含有过渡金属离子，酶的活性中心大多在这些部分，进而发生了变[15][16]化，使细胞的正常生理活动受到一定的影响。刘鸿宇的试验表明：当小鼠被置于0.5mT的交变磁场下一段时间后，小鼠伤后转移酶的活性明显增加，从而有效地促进了其摄取氨基酸和合成蛋白质。1.2.3生物电磁学的应用现状目前绝大多数的研究，都只局限于静电场的影响。而在植物生理等方面，大多[17]都是关于电磁环境对植物体生长发育等方面的影响。近些年来，生物电磁学已被[18,19]用于生活中的许多地方，且在全世界已有了大量的研究，但是将其用于食品保[20]鲜贮藏等方面却少见报道。由于磁场装置操作起来比较简便、对环境没有污染、[21]对人体没有不良症状等，所以，使用磁场处理来对果蔬进行保鲜这一举措在近几年获得了越来越多的关注。-4- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.3果蔬的贮藏保鲜果蔬贮藏与保鲜，即在果蔬采收之后，通过技术手段，使其保持新鲜度，延长果蔬的上市时间，尽可能的做到全年供应，保护其中的营养成分尽量少的流失，进而使其保持最佳的食用品质及经济效益。贮藏保鲜的实质，即通过人为因素，改变果蔬贮藏的外部环境，控制果蔬表面及内部的微生物数量，限制其活动范围及繁衍[22,23]后代，进而降低果蔬的腐败率，推迟成熟，保持其新鲜度和食用品质。1.3.1热处理保鲜技术1.3.1.1热处理的贮藏保鲜原理热处理保鲜技术，是一种利用特定范围的温度来处理采后果蔬，以使病原菌被杀死或使其生命活动受到限制，进而使酶的活性发生变化，使果蔬抵抗逆境的能力[24]增强，达到延长贮藏期的方法。经过热处理后的果蔬产品，呼吸作用减弱，呼吸高峰推迟，抑制乙烯的生成从而有效的延长了果蔬的贮藏时间，同时适当的热处理[25]可以使酶失活，因此能保持果实良好的色泽和外观。1.3.1.2热处理对果蔬贮藏品质的影响经过适宜温度热处理后的果蔬可以有效保持其良好的组织形态及果蔬的外观色[26,27]泽，防止果蔬组织软化，保持果蔬良好的食用品质。热处理可通过阻碍病原菌及微生物的生命活动，而调控其生理代谢反应，从而有效的防治其采后微生物污染[28,29][30]，同时，热处理具有杀虫、杀菌和无化学残留等优点。但是，不恰当的热处理方式则会造成果蔬的热伤害，影响其食用品质及营养价值，同时对其外观颜色及[31]硬度也会造成不良影响。1.3.2气调贮藏保鲜技术1.3.2.1气调贮藏保鲜原理气调贮藏，是一种通过人工控制食品在贮藏环境中空气成分及各比例的一种新型保鲜方法，达到延长贮藏期的效果。根据控制方式的不同，气调保鲜有自然性的降低氧气浓度，即自发气调贮藏（modifiedatmospherestorage，MA）、通过人工手-5- 内蒙古科技大学硕士学位论文段以快速降低氧气浓度，即机械气调库贮藏（controlledatmospherestorage，CA）两种。MA是指不经过人为手段，仅靠果蔬自身呼吸所释放的气体以达到改变其贮藏环境中O2与CO2含量的比例。CA指人工操作气调库，通过一系列仪器，从而使得[32]贮藏环境中的空气成分控制在适合果蔬贮藏的范围之内。同时气调库可以与其他[33]的贮藏方法同时使用从而达到更好的保鲜效果。1.3.2.2气调贮藏保鲜对果蔬贮藏品质的影响气调贮藏可以有效的推迟果蔬等的成熟期、降低其腐烂率，对比目前所利用的贮藏保鲜技术，果蔬经过气调保鲜方法贮藏保鲜之后，其生理指标等与未处理前相比基本保持不变；其中蔬菜仍然保持嫩绿色，水分较大，营养价值基本保持平衡，而且果蔬在经过一定时间气调保鲜后，当上市时，仍会受到人们的普遍欢迎，货架[34]期延长。但不同的果蔬对于CO2与O2的配比浓度耐受度不同，因此气体浓度配[35]比控制不当也会导致果蔬出现异味及病变。1.3.3涂膜保鲜技术1.3.3.1涂膜贮藏保鲜原理[36]涂膜保鲜技术，是用分子量很高的一层液态膜涂抹在果蔬的外表面，当这层膜干燥后就会均匀的分布在果蔬上，从而将果实与外界环境隔离开来，阻止因为气体交换而进行呼吸作用，降低果实营养成分的消耗，延缓果实软化，防止微生物污染，同时对其腐烂率的降低也有一定的效果。1.3.3.2涂膜保鲜对果蔬贮藏品质的影响涂膜后，果蔬外表面生成的薄膜有效降低了果蔬的蒸腾作用，进而保持采后果蔬的水分含量，减少了水分散失和果蔬的失重率，避免了贮藏过程中因水分蒸发而[37]导致的果蔬品质下降。在正常生理条件下，大多数果蔬采后，Vc、糖和可滴定酸[38]含量呈下降趋势，涂膜保鲜可以延缓这一变化过程，能保持果蔬原有的营养。-6- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.3.4臭氧贮藏保鲜技术1.3.4.1臭氧贮藏保鲜原理（1）臭氧的强杀菌能力臭氧具有一定的杀菌能力，即自身分解释放出其它形态的氧，扩散到空气中，这种新型的氧能进入到微生物细胞中，使其细胞结构受到损伤，同时，当其进入到[39]细胞组织内时，会使细胞的生理代谢等生命过程失调。（2）臭氧的降解作用果蔬在成熟过程中会释放一定数量的乙烯，当用臭氧处理后，乙烯等气体被氧[40]化分解，从而延缓了其成熟和腐烂。（3）臭氧的诱导作用果蔬表面的气孔在臭氧的作用下会缩小，水分的蒸发作用减慢，养分消耗量降[41]低，代谢作用受到抑制，同时抑制果蔬体内的呼吸作用，从而延长其贮藏期限。1.3.4.2臭氧对果蔬贮藏品质的影响臭氧保鲜技术的杀毒抗菌等特性，较之普通的化学消毒剂更具有特殊的优点。臭氧可以自发的进行分解，并且其分解之后产生的氧气对环境没有污染，没有残留，扩散特性很好，价格低廉。但是臭氧保鲜技术也有一定的缺点，容易被氧化，[42,43]不利于贮藏。因此，臭氧贮藏技术仍需要进一步的研究和探讨。1.3.5河套蜜瓜的贮藏保鲜方法河套蜜瓜由于其特殊的成熟、软化和采后的一系列生理特性，导致通常用于大多果蔬的贮藏保鲜技术往往不适用于河套蜜瓜。目前河套蜜瓜的贮藏保鲜技术应用较成熟的主要有下面几种方法，但是并不能最大限度的延长其贮藏期限。1.3.5.1瓠瓜抗菌剂涂膜保鲜从瓠瓜中提取广谱、高效的天然抑菌物质，并作为天然防腐剂应用于河套蜜瓜[44]的涂膜保鲜，相关研究表明：将壳聚糖与吐温20涂膜于华莱士上，可以有效的延长其保质期。当用于河套蜜瓜涂膜液中的壳聚糖、瓠瓜抗菌剂与吐温20的最佳浓度分别为1.5%、0.05%、0.05%时，此条件下河套蜜瓜贮藏到第10d后，其软化速率及-7- 内蒙古科技大学硕士学位论文可溶性固形物的含量降低均平缓，没有外来微生物的侵害。从而使河套蜜瓜的保鲜期有效延长。1.3.5.21-MCP处理保鲜1-MCP能够阻碍乙烯受体的作用，与乙烯分子有一定的拮抗作用，因而使乙烯的作用达到最低化，同时降低乙烯的敏感性，使其不能与活性受体结合，因此，可[45]以控制内源乙烯的合成速率及外源乙烯对其的诱导，抑制乙烯的作用。韩育梅[46][47]、徐莉莉等的研究结果表明：使用一定浓度的1-MCP对河套蜜瓜进行处理，其在8℃下贮藏后，河套蜜瓜的乙烯排出量减少，呼吸作用和乙烯生成量达到最高峰的时间点延迟，降低跃变高峰，抑制硬度和质量的下降，同时对果实变黄和腐烂率均能起到一定程度的延缓作用。另外，当用1-MCP处理河套蜜瓜一段时间后，其呼吸跃变发生时间推迟，呼吸强度降低，成熟缓慢，且保持了其营养价值，因此使河套蜜瓜的贮藏期得以有效延长。1.3.5.3不同浓度臭氧处理保鲜臭氧是一种强氧化剂，对微生物细胞的表面特征有一定的破坏作用，从而起到较强的杀菌作用。乙烯是植物体内产生的一种气体激素，特别在成熟的果实中更多。它可以促进河套蜜瓜的成熟，且少量乙烯就能促进其严重衰老，使其失去食用及商品价值。臭氧作为一种强氧化剂，能将乙烯迅速分解成二氧化碳和水，使果蔬[39][48]的成熟期延迟，抑制其品质下降。赵丽芹等的研究结果表明：臭氧气体处理可以有效的防止Vc损失，同时能够减少河套蜜瓜重量减轻及腐烂程度加重。所以，当臭氧气体浓度适宜时，河套蜜瓜货架期得以延长。1.3.5.4其他贮藏保鲜技术随着市场需求的增加，果蔬的贮藏保鲜正在逐渐被人们所重视，除了比较成熟[49][50]的贮藏保鲜技术，新的技术也在不断出现，如化学结合物理技术、冰温技术、[51]薄膜包装技术等，多种贮藏方法同时使用也正在逐步的研究开发。但在新技术应用的同时，很多弊端也逐渐被人们所发现，贮藏保鲜技术的成熟应用仍需不断探索和研究。-8- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.4磁场处理在果蔬贮藏保鲜中的应用作为一种物理技术，近些年磁场处理逐步被应用于生物、化学、医学等各个学科领域，其在果蔬贮藏保鲜方面的作用也逐步被应用于实际生产操作中。磁场处理通过影响采后果蔬内部的生理生化反应，从而延缓其衰老、腐烂过程。1.4.1磁场处理对凤尾菇生长效应的影响凤尾菇为真菌类食物，营养成分丰富，同时含有多种维生素及矿物质。由于其含有大量生理活性物质，使干扰素的合成量增加，进而使人体免疫力提高。鉴于其[52]丰富的营养物质及功效，凤尾菇正在被越来越多的人所青睐。ZouK等的研究结果表明：当将凤尾菇置于一定强度的磁场下时，其生长作用得以加强，其原因为磁化水使得矿质离子等的溶解度增加，同时也可以促进氧气的溶解，从而促进凤尾菇的生长。1.4.2磁场处理对草莓保鲜效果的影响草莓属于非呼吸跃变型果实，水分含量比较高，容易腐烂，而且由于其属浆果类水果，采后特别不方便贮运，一般情况下，采后不久颜色就会发生变化、腐烂率[53][54]增高。金江涛等的研究表明：在较高的磁场强度作用下，草莓的钝酶、抑菌作用总体上会有所增强。当将草莓置于交变磁场的各种强度下时，其各项生理指标均会有所差异，贮藏效果也各异。在4.22A/m电磁场下放置的草莓，其腐烂率和质量减轻程度明显好于未处理过的草莓，其贮藏的效果明显高于未处理的草莓，VC含量也比未经处理的[55]大，从而明显增加了草莓的保鲜时间，增强了草莓的保鲜效果。1.4.3交变磁场处理对莲藕切片保鲜效果的影响莲藕作为多年生水生植物的典范，水分含量极高，外皮比较薄，特别容易受到外界损伤，由于其适宜生长在水里，所以收获后，生存环境的改变使得其内部生理作用发生巨大的变化，在采摘出水后放置5d，表皮就会发生一定程度的褐变、萎蔫，严重时内部可食部分也出现褐变，组织纤维化程度加重，品质受到严重的影响[56][18]。使用磁场对莲藕进行处理，可有效增加鲜切莲藕的贮藏时间。高梦祥等的研-9- 内蒙古科技大学硕士学位论文究结果表明：使用不同强度的交变磁场对莲藕进行处理后，其各项指标均会发生变化，贮藏效果也各异。1.4.4交变磁场对葡萄贮藏保鲜效果的影响葡萄果皮比较薄，果浆含量较丰富，水分较大，因此采摘后失水严重，在常温下放置较短时间，其果柄就会有萎蔫，褐变，果实腐烂等，极不利于葡萄的品质保持。[17]高梦祥等通过研究发现：当用一定磁感应强度的磁场处理葡萄后，可以有效的降低其腐烂率等，品相也较好，且可溶性固形物及可滴定酸的含量变化量较平缓，同时离子渗透率也有一定程度的降低；多酚氧化酶活性受到抑制，进而有效的延长了葡萄的贮藏时间。同时，交变磁场结合气调包装同时使用，可以促进葡萄的贮藏，最大限度的延[57]长其保质期，相关研究表明：采用地磁与气调保鲜相结合的办法对葡萄进行保鲜处理，其生理指标均优于未经处理的样品，同时，若各自单独处理后，磁场的作用均很明显，说明磁场可以对葡萄内部的生理变化产生一定的作用，尤以1A电流产生的磁场结合气调保鲜的作用效果最突出。1.5磷脂酶D1.5.1磷脂酶D概况磷脂酶D（PhospholipaseD，PLD）即磷脂酰胆碱磷脂水解酶，是磷脂酶的一种，用来催化水解磷脂末端的磷酸二酯键形成磷脂酸（Phosphatidicacid，PA）和亲[58]水性的胆碱等，其催化水解作用广泛存在于萌发种子、衰老器官、逆境胁迫及胞[59]内信号转导中等。PLD属于多基因家族，具有多分子异质性，通过对拟南芥PLD基因进行序列相似性和生物特性的分析，将其分成了6种类型12个成员，即α[60,61]（3），β（2），γ（3），δ，ε，和ζ（2），同理将大米的PLD基因分成了6[62]种类型17个成员，即α（8），β（2），δ（3），ζ（2），κ和ψ。PLD作为降解磷脂类物质的主要酶系，其在各种细胞反应中扮演着重要的角[63]色，包括细胞转移、受体的内吞作用、细胞分泌、细胞骨架重组等，同时也在生活生产中得到广泛应用，比如在医药方面，PLD可以作为一种药物用于微生物感染-10- 内蒙古科技大学硕士学位论文的诊断，在化妆品领域，用于皮肤保湿以及假牙清洗，在工业方面，用于油脂精炼[64]（去除粘脂质、脱胶）、磷脂改性等。总之，PLD已经越来越得到人们的普遍关注。1.5.2PLD在抗逆反应中的作用植物在低温干旱、机械损伤、病原等逆境的胁迫下，可通过信号转导迅速启动[65]响应机制来调节自身的生理状态，以产生适应性或抗逆性。研究发现，许多逆境下的信号转导过程都与植物体内PLD的激活有关，当一些危害如病原菌，微生物等侵染植物时，植物中的PLD的调节活动明显增强。近年来，磷脂酶在干旱、低温、[66]机械损伤等逆境条件下的反应机理已逐渐被发现。1.5.2.1低温逆境植物与外界环境接触的首要部位即为细胞膜，细胞膜是由磷脂双分子层构成，蛋白质穿插在其中，磷脂作为细胞膜的主要成分，维持着细胞的结构和功能。当植物受到低温胁迫时，其细胞膜中的磷脂含量会随着低温胁迫的严重程度而发生变化，以适应外界环境的变化。磷脂酶作为降解磷脂的主要酶，其活性直接影响了细[67]胞膜磷脂的含量，进而间接的影响植物对低温的抵抗作用。[68]WeltiR等的试验表明，经过低温处理后PLD基因缺失型植株膜离子渗漏率与野生型植株明显不同，而膜离子渗漏率是反映膜稳定性的重要指标，同时发现低[69]温处理后的两种植株的膜成分均发生了明显的变化。曾正兵等的试验同样证明在-8℃至-16℃的冻害胁迫下，PLDα缺失型植株的离子渗漏率不同于野生型，可见PLD基因主要通过影响膜的稳定性来抵抗低温环境。1.5.2.2干旱胁迫当植物处于干旱状态时，为了维持体内的水分充足，由脱落酸（AbscisicAcid，ABA）诱导气孔关闭的敏感性将会升高，从而气孔关闭，蒸腾作用会减弱，进而减少水分的流失。同时通过大量的实验研究发现，PLD参与ABA介导的信号转导途径，因此，当在干旱条件下时，PLD的活性增强，进而促使ABA诱导气孔关闭，降低植株内的水分的流失，抗旱能力增强。-11- 内蒙古科技大学硕士学位论文[70]SangYM等的试验表明了PLD基因抑制型植株叶片的蒸腾失水率显著高于[67]野生型，孙磊的试验表明，当PLD的活性增强时，植物的气孔导度显著下降，水分丧失明显减少，抗旱能力有所提高。由此可见，PLD基因主要通过参与水分胁迫条件下的气孔调节作用来影响植物的抗旱性。1.5.2.3机械损伤PA既是磷脂酶水解磷脂的产物，同时也作为第二信使参与信号转导，在许多细胞反应种发挥作用。植物中的PA不仅可以激活一些激酶来共同参与信号转导，[71]也可以作为中间体来参与其他脂质体的合成。当植物受到机械损伤时，PLD活性增强，PA含量显著增加，诱导细胞的信号反应，同时膜上的钙离子的含量也调节了PLD的含量，从而影响PA含量。[72]2+RyuSB等发现，Ca会引起与膜结合PLD的增加，表明植物在干旱条件下2+[73]2+Ca参与PLD的调控，赵宇瑛的试验表明，植物在干旱条件下，细胞膜Ca含量减少，黄瓜PLD酶活性增强，进而PA含量显著增加。由此可见，植物通过膜2+上Ca的浓度变化来影响PLD的活性和PA的含量，以达到抗旱效果。1.5.2.4其他植物在受到其他逆境胁迫时，如病原微生物，植物激素等也会发生一系列的抗逆反应，如当植物遭受病原微生物的侵害时，PLD会集中于微生物与质膜的接触部[74]位，发生活性和定位的改变，以抵御病原的感染。当植物遇到植物激素如乙烯时，部分植物激素激发PLD的生成，继而使PA的含量增加，共同作用来延缓植物的衰老过程。1.5.3PLD基因全长的克隆技术1.5.3.1RACE技术RACE技术，即C末端快速扩增技术（RapidamplificationofcDNAend，RACE），该技术通过与PCR技术相结合，由已知的cDNA片段快速的获得完整的[75]基因序列，以其从3’或5’端来获得序列的方式分为3’-RACE和5’-RACE。-12- 内蒙古科技大学硕士学位论文[76]SongYP等利用RACE技术从黄瓜中克隆到了全长为2756bp的PLD基因序列，其中包含有2427bp的开放阅读框，808bp的氨基酸编码序列。1.5.3.2电子克隆技术电子克隆技术，即以计算机为媒介，以现有的基因序列表达序列及其他的生物信息数据库为材料，进而发掘新基因，并对其进行编码序列和功能验证的克隆方法[77][78]。目前，电子克隆技术已广泛应用于生物学的各个领域。万嗣宝等利用电子克隆技术与RT-PCR相结合的方法，首次从桃果实中获得了全长为2859bp的PLDα序列。同时证明其所编码处的氨基酸序列属于PLDα家族，与草莓、番茄等有高度的相似性。1.5.3.3其他克隆技术目前，由于RACE技术所具有的价廉、简单和快速等特点而被人们广泛的应用[79]于PLD基因的克隆，但是同时，还存在其它的克隆技术，如图位克隆技术、SSH[80]技术等，在实际应用中，应根据具体的实验条件及所针对的不同物种而选择合适的克隆技术。1.6选题目的磁场作为一种新技术，目前已在许多领域得到广泛应用。近年来，对磁场的研究已经逐渐深入到植物生理生化效应方面。虽然国内外已有大量关于生物磁学的报道，但是将其作为食品保鲜技术加以研究却并不多见。由于磁场贮藏保鲜技术操作比较简便，经济实惠，没有毒害作用，同时比较环保，因而具有着广泛的市场应用前景。但是交变磁场对河套蜜瓜保鲜效果及机理目前仍不清楚，并且尚未从分子角度进行研究。因此，研究交变磁场对内蒙古河套蜜瓜保鲜效果，在理论和实际应用上都有广泛的意义。1.7研究内容本研究通过测定不同强度及时间交变磁场处理后河套蜜瓜的一系列生理指标，得出其最佳的磁场处理强度与时间；同时，利用荧光定量PCR技术，探究不同时间-13- 内蒙古科技大学硕士学位论文磁场处理条件下的河套蜜瓜PLD基因表达量的变化，从分子生物学角度研究磁场处理对河套蜜瓜的保鲜机理。-14- 内蒙古科技大学硕士学位论文2不同强度磁场处理对河套蜜瓜采后生理特性的影响2.1实验技术路线外观品质对照组：不经过呼吸强度河磁场处理套失重率蜜每隔3d取样瓜常温下贮硬度处理组：采用不藏15d同强度的交变磁生理指标检测膜渗透率场对其进行处理可溶性固形15min物可滴定酸2.2实验材料与方法表2.1实验材料磁场处理仪食品科学与工程实验室自制河套蜜瓜（华莱士）购自内蒙古巴盟市实验仪器及常用药品见附录A2.2.1实验材料准备2.2.1.1果蔬磁场处理仪的制作（1）果蔬磁场处理仪的设计处理仪主要利用亥姆霍兹线圈的相关特性，使得仪器在线圈中轴线上可以产生相对均匀的磁场，并且此磁场的性质和强度可以随着所接入电源的变化而变化，从而可以研究不同果蔬的最优处理条件。本装置包括：第一线圈（3）、第二线圈（4）、3和4之间的距离等于3或4的半径，3和4串联并通过导线，变压器（2）与外接可调输出电压或可调输出电流的电源（1）连接。处理果蔬时，只须根据不同的研究需求改变电源的输出电流或电压，并将果蔬放置于载物台上处理一段时间即可达到相应效果。-15- 内蒙古科技大学硕士学位论文本装置的结构如图2.1所示：图2.1磁场处理仪结构图（2）果蔬磁场处理仪的制作为了适应实验需求，本实验小组分别开发了三代果蔬磁场处理仪。①、第一代果蔬磁场处理仪：线圈直径为20cm，所采用的漆包线线径为30.3mm，其匀强磁场区域为785cm。受其磁场区域和漆包线线径所限，只能处理较小体积的果蔬，所通电压最高只到160V，所能得到的磁场强度较小，没有很明显的处理效果。图2.2第一代果蔬磁场处理仪②、第二代果蔬磁场处理仪：线圈直径为30cm，所采用的漆包线线径为30.7mm，其匀强磁场区域为1533cm。其磁场区域较大，可以对整个河套蜜瓜进行处理，所通电压可达到240V，基本达到研究需求。-16- 内蒙古科技大学硕士学位论文图2.3第二代果蔬磁场处理仪③、第三代果蔬磁场处理仪：线圈直径为40cm，所采用的漆包线线径为30.7mm，其匀强磁场区域为6280cm。为达到批量处理的目的，实验室又制作了处理区域更大的处理仪，可以更加均匀的处理不同批次的实验对象，第三代仪器可以接通380V电压，所达到的磁场强度约为3.3mT。为保护操作人员，实验室又制作了简易的电磁屏蔽罩，降低对周围环境的电磁辐射。（a）（b）图2.4第三代果蔬磁场处理仪（a）及其电磁屏蔽罩（b）2.2.1.2实验试剂配制0.1mol/LNaOH溶液：量取1gNaOH固体颗粒放在烧杯中，溶解后定容至250mL待用。0.4mol/LNaOH溶液：量取4gNaOH固体颗粒放在烧杯中，溶解后定容至250mL待用。-17- 内蒙古科技大学硕士学位论文0.4mol/LH2C2O4溶液：量取9gH2C2O4固体颗粒放在烧杯中，溶解后定容至250mL待用。饱和BaCl2溶液：量取90gBaCl2固体颗粒放在烧杯中，溶解后定容至250mL待用。酚酞指示剂：称取0.5g酚酞粉末放在烧杯中，加入100mL95%的乙醇，搅拌至完全溶解，转移至试剂瓶中，贴上标签放置待用。2.2.2实验方法2.2.2.1实验材料处理选取一定数量的大小、重量、成熟度相近的河套蜜瓜作为实验材料，对其进行称重，且记录重量后待用。同时，将河套蜜瓜进行如下磁场处理：（1）用240V（1.54mT）、220V（1.40mT）、200V（1.28mT）、180V（1.18mT）、160V（1.07mT）的磁场强度处理每组河套蜜瓜15min作为处理组，以未经磁场处理的河套蜜瓜作为对照组。（2）将处理组与对照组的河套蜜瓜按其标号分组装箱后，在室温（20±2℃）下放置15d，每隔3d检测各项生理指标的变化情况。2.2.2.2外观品质的变化将处理组与对照组的河套蜜瓜放置于室温（20±2℃）下，每隔3d观察河套蜜瓜外观品质的变化，并作记录。2.2.2.3呼吸强度的测定[81]根据AlvesJA等的实验方法，采用静置法测定河套蜜瓜的呼吸强度。取20mL0.4mol/L的NaOH于单层培养皿中，后置于干燥器底层，放置隔板，将河套蜜瓜放入，密封1h后开盖。将培养皿中的碱液转移至150mL锥形瓶中，加入5mL饱和BaCl2溶液和2-3滴酚酞指示剂。用0.4mol/LH2C2O4溶液滴定，至颜色散去，静置30s不变色即为反应终点，记录所使用的草酸量V2。同时，同样的条件下重复一次空白实验进行滴定，记录此时消耗的草酸量V1。-18- 内蒙古科技大学硕士学位论文11呼吸强度（COmgkgh）44C（VV）（/WT）（式2.1）212式中：V1—空白实验组滴定所使用的草酸量（mL）；V2—河套蜜瓜实验组滴定所使用的草酸量（mL）；C—草酸的浓度（mol/L）；W—河套蜜瓜的重量（kg）；T—呼吸时间（h）。2.2.2.4失重率的测定选取准备贮藏15d的河套蜜瓜组作为实验对象测定其失重率。每隔3d测定一次每颗瓜的重量。实验采用台秤称量，记录数据后计算。失重率（%）=（采收时重量-贮藏后重量）/采收时重量×100%（式2.2）2.2.2.5硬度的测定采用QTS-25质构仪（Brookfield，USA）测定河套蜜瓜的硬度。在每组三颗瓜上均匀的选取三个点进行测定，最后取其硬度的平均值。设定条件如表2.2。表2.2质构仪的设定条件实验参数设定值TargettestCompressionTargetunitDistanceTriggerpoint5gTargetvalue5mm/min2.2.2.6膜渗透率的测定[82]采用MaoLC等的实验方法并略做修改，用直径为0.5cm的打孔器在每组河套蜜瓜上取五个均匀的柱体，置于培养皿中，用刀片切取10个4mm厚度的河套蜜-19- 内蒙古科技大学硕士学位论文瓜小柱体，放入250mL锥形瓶中，用蒸馏水冲洗三次，每次2-3min，加入50mL去离子水后，称量锥形瓶，河套蜜瓜柱体、蒸馏水的总重M，在摇床中震荡15min后，用DDS-Ⅱ型数字式电导率仪测定柱体浸泡液的电导率R1。将测定完的样品放在电炉上煮沸15min后，冷却至室温，补充蒸馏水至总重为M，测其电导率为R2，计算膜渗透率即相对电导率R。R%（）R/R100%（式2.3）12式中：R—河套蜜瓜的相对电导率；R1—浸泡液的电导率；R2—总电导率。2.2.2.7可溶性固形物的测定[83]参照任亚琳等的实验方法并适当修改，可溶性固形物的含量使用手持糖度计进行测定，将手持糖度计用蒸馏水调零后待用，用水果刀切取河套蜜瓜的果肉部分，用纱布挤取其汁液大约25mL于100mL小烧杯中，每个试样平行测定三次，取平均值。注意每次测定完成后，都要将手持糖度计擦拭干净后方可进行下次测定。每颗瓜平行测量三次，每组三颗瓜，最后计算九个数据的平均值。2.2.2.8可滴定酸含量的测定[84]根据XieLJ等的实验方法测定。称取上述实验步骤挤取的河套蜜瓜汁液20g，加入一定量的蒸馏水进行稀释后，转移至250mL容量瓶中，将烧杯中残余液体洗净，一起转入，加入蒸馏水至刻度线，定容，摇匀。移液管移取25mL溶液至锥形瓶中，加入2-3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH溶液进行滴定，至微粉色且30s颜色不散去为滴定终点，记录所使用的氢氧化钠量。可滴定酸含量（%）=CVMV/(WV)（式2.4）21式中：C—滴定用NaOH溶液的浓度（mol/L）；V2—滴定消耗的NaOH溶液量（mL）；-20- 内蒙古科技大学硕士学位论文M—NaOH的质量分数（g/mol）；V—样品液总体积（mL）；W—样品液重量（g）；V1—吸取的样品液体积（mL）。2.2.3数据处理采用MicrosoftExcel软件进行数据分析和图表的制作，得出延长河套蜜瓜贮藏期的最佳磁场强度值。2.2.4结果与分析2.2.4.1不同强度磁场处理对河套蜜瓜外观品质的影响[85]根据成善汉等对甜瓜所做的等级分类，我们对处理组和对照组的河套蜜瓜进行外观品质测定，观察，制定出不同磁场强度处理后贮藏不同天数的河套蜜瓜的外观品质变化分级表，如表2.3所示。表2.3不同强度磁场处理后河套蜜瓜外观品质变化贮藏时间（d）电压值（V）03691215果肉软化，果肉软化，果肉松软，果肉松软，4级，瓜表4级，瓜表3级，有瓜3级，有瓜新鲜，新鲜，面出现褐色面出现褐色240表面出现斑表面出现斑1级1级斑点，根部斑点，根部点，根部有点，根部有有烂斑点出有烂斑点出烂斑点出烂斑点出现现现新鲜，新鲜，新鲜，比较新鲜，比较新鲜，果肉松软，2201级1级1级2级2级3级果肉软化，果肉松软，果肉松软，果肉松软，4级，全部新鲜，新鲜，3级，有瓜3级，有瓜3级，瓜根瓜表面出现2001级1级根部有烂斑根部有烂斑部烂斑点扩斑点，部分点出现点出现大瓜根部出现腐烂果肉松软，新鲜，新鲜，新鲜，比较新鲜，果肉松软，1803级，表面1级1级1级2级3级无凹陷出现-21- 内蒙古科技大学硕士学位论文果肉松软，新鲜，新鲜，新鲜，比较新鲜，果肉松软，1603级，表面1级1级1级2级3级无凹陷出现果肉软化，果肉软化，新鲜，新鲜，比较新鲜，果肉松软，4级，部分4级，全部01级1级2级3级瓜表面有凹瓜表面有凹陷出现陷出现通过表2.3可看出，在贮藏期到6d时，与对照组的2级相比，200V和240V处理组外观品质达到3级，在河套蜜瓜表面出现斑点，有开始腐烂的迹象，而160V、180V、220V处理组则继续保持在1级，果实仍然比较新鲜。当贮藏到第9d，200V、240V处理组较对照组均达到了3级，部分河套蜜瓜内部开始有腐烂出现，外表呈现为褐色斑点，而160V、180V、220V处理组外观品质则达到2级，河套蜜瓜果肉开始变软，无腐烂和斑点出现。在贮藏期达到15d时，200V、240V处理组与对照组外观品质均达到4级，内部腐烂情况严重，外观出现大量褐斑，160V、180V、220V处理组则达到3级，外观品质较良好。综上所述，160V、180V、220V电压所产生的磁场强度对河套蜜瓜外观品质变化影响较小。2.2.4.2不同强度磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响240V220V200V180V160V0V2018）1-h161-g14kg12m2O10C（8度6强吸4呼2003691215天数（d）图2.5不同强度磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响-22- 内蒙古科技大学硕士学位论文由图2.5可看出，在0-3d贮藏过程中，各处理组呼吸强度均呈下降趋势，而对照组则急剧上升，第3-6d时，磁场处理组呼吸强度均呈上升趋势，而对照组呼吸强度呈下降趋势，虽然，200V处理组的呼吸强度在贮藏一段时间内达到最低值，但是在贮藏后期出现上升的趋势。而180V处理组在贮藏后期的呼吸强度呈下降趋势，并且在15d时达到最低。因此，确定180V电压所产生的磁场强度为最佳处理值。2.2.4.3不同强度磁场处理对河套蜜瓜失重率的影响240V220V200V180V160V0V1210）8%（6率重4失2003691215天数（d）图2.6不同强度磁场处理对河套蜜瓜失重率的影响由图2.6可知，在贮藏期内，各组的失重率呈持续增加的趋势，9d时各组失重率出现明显差异，且160V、180V处理组失重率始终低于对照组，220V处理组失重率基本与对照组相同，160V处理组失重率最低，所以确定160V-180V电压所产生的磁场强度为最佳处理值。2.2.4.4不同强度磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响-23- 内蒙古科技大学硕士学位论文240V220V200V180V160V0V800700600）2-m500cg（400度300硬200100003691215天数（d）图2.7不同强度磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响由图2.7可看出，在贮藏后期，各组河套蜜瓜的硬度较贮藏初期均呈下降趋势；且在第15d时，只有240V处理组河套蜜瓜硬度小于对照组，其余处理组则均大于对照组。整体而言，180V处理组在整个贮藏期内硬度均处于最大值。因此，确定180V电压所产生的磁场强度可以有效防止河套蜜瓜软化，是最佳处理值。2.2.4.5不同强度磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响240V220V200V180V160V0V7060）%50（率透40渗膜302003691215天数（d）图2.8不同强度磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响由图2.8可以看出，在贮藏期内，各处理组膜渗透率均呈上升趋势，且均小于对照组。整体而言，在贮藏后期，180V处理组的膜渗透率最低。因此，确定180V电压所产生的磁场强度为最佳处理值。-24- 内蒙古科技大学硕士学位论文2.2.4.6不同强度磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响240V220V200V180V160V0V15.014.0）13.0%（12.0物11.0形固10.0性9.0溶可8.07.06.003691215天数（d）图2.9不同强度磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响由图2.9可看出，各实验组可溶性固形物含量均呈波动趋势。在贮藏9d时，200V、220V处理组可溶性固形物含量值最大，但在第12d时急剧下降；160V处理组变化趋势与对照组基本相同；180V处理组曲线变化较平缓，无大幅度升降变化，但在贮藏后期达到最大值。因此，确定180V电压所产生的磁场强度为最佳处理值。2.2.4.7不同强度磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响240V220V200V180V160V0V1.401.20）1.00%（0.80酸定0.60滴可0.400.200.0003691215天数（d）图2.10不同强度磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响-25- 内蒙古科技大学硕士学位论文由图2.10可知，180V处理组在贮藏期内曲线变化平缓，可滴定酸含量变化不大，其余各组可滴定酸含量曲线的变化趋势均呈大幅度波动，且均在9d时出现高峰。因此，确定180V电压所产生的磁场强度为最佳处理值。2.3小结本研究中，采用不同强度的磁场处理河套蜜瓜，测定了其腐烂率、失重率、呼吸强度、硬度、可溶性固形物含量等生理指标。研究结果表明：用180V电压对应的交变磁场处理河套蜜瓜，可以有效的降低河套蜜瓜的腐烂率、失重率及呼吸强度，使可滴定酸含量变化平缓，同时对延缓果实软化及提高可溶性固形物的含量也有一定的作用，此时河套蜜瓜的保鲜效果最好。综上所述，我们确定180V对应的磁场强度为河套蜜瓜的最佳磁场处理强度值。-26- 内蒙古科技大学硕士学位论文3不同时间磁场处理对河套蜜瓜采后生理特性的影响3.1实验技术路线对照组：不经腐烂率过磁场处理的河鲜切河套蜜瓜呼吸强度套蜜常温（25每天取样硬度瓜℃）下贮膜渗透率藏5d生理指标检测处理组：采用可溶性固形180V电压产生的物磁场处理不同时间后的鲜切河套可滴定酸蜜瓜3.2实验材料与方法表3.1实验材料果蔬磁场处理仪食品科学与工程实验室自制河套蜜瓜购自内蒙古巴盟市实验仪器与常用药品见附录A3.2.1实验材料准备磁场处理仪采用2.2.1.1所制作的，实验试剂的配置过程同2.2.1.2。3.2.2实验方法3.2.2.1实验材料处理选取一定数量的大小、重量、成熟度相近的河套蜜瓜作为实验材料，将其进行如下磁场处理：-27- 内蒙古科技大学硕士学位论文（1）用180V（1.18mT）的磁场强度处理每组河套蜜瓜5min、10min、15min、20min、25min作为处理组，未经磁场处理的河套蜜瓜作为对照组。（2）将处理组和对照组的河套蜜瓜均匀的切成六份，用保鲜膜包好，贴上标签，放入温度为25℃，湿度为30%的恒温箱中贮藏，每天测定其生理指标变化。同时，用液氮将处理组与对照组的河套蜜瓜速冻一部分，用于后续分子实验。3.2.2.2腐烂率将处理组与对照组的鲜切河套蜜瓜放置于恒温箱中，每天观察，记录其腐烂的个数，腐烂率为腐烂的个数除以总的鲜切河套蜜瓜的个数。3.2.2.3呼吸强度呼吸强度的测定方法同2.2.2.3。3.2.2.4硬度硬度的测定方法同2.2.2.5。3.2.2.5膜渗透率膜渗透率的测定方法同2.2.2.6。3.2.2.6可溶性固形物含量可溶性固形物含量的测定方法同2.2.2.7。3.2.2.7可滴定酸含量可滴定酸含量的测定方法同2.2.2.8。3.2.3实验数据处理采用MicrosoftExcel软件进行数据分析和图表的制作，得出延长河套蜜瓜贮藏期的最佳磁场处理时间。-28- 内蒙古科技大学硕士学位论文3.2.4结果与分析3.2.4.1不同时间磁场处理对河套蜜瓜腐烂率的影响0min5min10min15min20min25min0.8）%0.6（率0.4烂腐0.201234天数（d）图3.1不同时间磁场处理对河套蜜瓜腐烂率的影响由图3.1可以看出，随着贮藏时间的增加，所有鲜切河套蜜瓜腐烂率呈不断上升的趋势。在整个贮藏期间，处理组河套蜜瓜的腐烂率均低于对照组，且当处理时间为15min时，河套蜜瓜的腐烂率明显低于其它处理组，因此，确定磁场处理时间为15min，可以有效的降低河套蜜瓜的腐烂率。3.2.4.2不同时间磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响0min5min10min15min20min25min430)1-380h1-gk330gm2280OC(230度强180吸呼130801234天数（d）图3.2不同时间磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响-29- 内蒙古科技大学硕士学位论文由图3.2可以看出，随着贮藏时间的增加，磁场处理后河套蜜瓜呼吸强度呈先上升后下降趋势。其中，5min、10min、20min处理组的呼吸强度在整个贮藏期内均高于对照组，25min处理组的呼吸强度与对照组基本相同。而磁场处理15min时，河套蜜瓜的呼吸强度始终处于最低。因此，我们确定磁场处理15min可以有效降低河套蜜瓜的呼吸强度。3.2.4.3不同时间磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响0min5min10min15min20min25min12002）1000-mc800g（度600硬40020001234天数（d）图3.3不同时间磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响由图3.3可以看出，用交变磁场处理后的河套蜜瓜其硬度均明显高于对照组，且当磁场处理时间为15min时，河套蜜瓜的硬度明显高于其他处理组，虽然在贮藏4d时，其硬度也有所下降。综上可得，磁场处理对河套蜜瓜硬度的保持有一定的意义，且处理时间为15min时更能有效的抵抗河套蜜瓜表皮软化。3.2.4.4不同时间磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响-30- 内蒙古科技大学硕士学位论文0min5min10min15min20min25min6560）%55（50率透45渗40膜35301234天数（d）图3.4不同时间磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响由图3.4可得，随着贮藏时间的增加，磁场处理后的鲜切河套蜜瓜膜渗透率呈现整体上升趋势，表示河套蜜瓜细胞膜逐渐发生破损。虽然在贮藏后期，20min处理组其电导率大于对照组，但是在整个贮藏期，大部分处理组的电导率均明显低于对照组，尤以15min突出，其在整个过程均处于最低的状态。因此可以得出，磁场处理可以明显降低河套蜜瓜细胞膜的破损程度，且当其处理时间为15min时，效果达到最佳。3.2.4.5不同时间磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响0min5min10min15min20min25min19）%17（物15形固13性溶11可91234天数（d）图3.5不同时间磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响由图3.5可以看出，随着贮藏时间的增加，交变磁场处理后的河套蜜瓜可溶性固形物含量均呈现逐渐下降的趋势。在贮藏后期，5min、10min处理组的可溶性固形物含量低于对照组，20min、25min处理组与对照组基本相同。而15min处理组其-31- 内蒙古科技大学硕士学位论文可溶性固形物含量明显高于对照组，且在整个贮藏期内均处于最高。因此，当磁场处理时间为15min时，更有益于河套蜜瓜可溶性固形物含量的保持。3.2.4.6不同时间磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响0min5min10min15min20min25min1.81.6）1.4%（1.2酸1定滴0.8可0.60.40.201234天数（d）图3.6不同时间磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响由图3.6可以看出，尽管当磁场处理时间为5min，10min时，河套蜜瓜的可滴定酸含量较低，但是其变化幅度比较大，不适于人们的口感食用，同样的情况，在处理时间为20min、25min及对照组中也时有发生。整体来看，在贮藏期内，处理15min的河套蜜瓜可滴定酸的变化幅度最小，口感更能维持稳定，因此确定当磁场处理时间为15min时，更有利于保持河套蜜瓜的口感。3.3小结本研究中，采用不同时间的磁场处理河套蜜瓜，测定了其腐烂率、呼吸强度、硬度、膜渗透率、可溶性固形物及可滴定酸含量等生理指标。研究结果表明：用交变磁场处理河套蜜瓜15min，可以有效的降低河套蜜瓜的腐烂率、呼吸强度及膜渗透率，使可滴定酸含量的变化平缓，同时对延缓果实软化和提高可溶性固形物的含量也有一定的作用，此时的河套蜜瓜的保鲜效果最好。综上所述，我们确定磁场时间为15min，为河套蜜瓜的最佳磁场处理时间。-32- 内蒙古科技大学硕士学位论文4不同时间磁场处理对鲜切河套蜜瓜PLD基因表达量的影响4.1实验路线图新鲜河套蜜瓜PCR验证引物是否合适河套蜜对照组：未经磁瓜场处理的鲜切河套蜜瓜荧光定量PCR探讨PLD基因的表达量变化情况处理组：采用180V电压产生的磁场强度处理不同时间的鲜切河套蜜瓜4.2河套蜜瓜PLD引物的确定4.2.1实验材料与仪器4.2.1.1实验材料实验选用的新鲜河套蜜瓜，购自内蒙古巴盟市。选择新鲜刚采摘下来，瓜果饱满，无机械损伤的河套蜜瓜为实验材料，购置后马上运至实验室用液氮速冻，贮藏于-80℃的环境下，用于总RNA的提取。4.2.1.2实验仪器实验主要仪器见附录A。4.2.2试剂的配制（1）0.1%DEPC水：-33- 内蒙古科技大学硕士学位论文1000mL蒸馏水中加入1mL的DEPC配制成0.1%DEPC水，室温放置24h，121℃灭菌20min，冷却后4℃保存。（2）1mol/LTris•HCl：称量12.11gTris碱于100mL烧杯中，加约80mL的去离子水溶解，加入约4.2mL浓HCl，冷却室温后调pH至8.0，定容至100mL，121℃灭菌20min，冷却后4℃保存。（3）5mol/LKAc：称取29.44gKAc和31.94mL36%冰乙酸，加水溶解定容至100mL，121℃灭菌20min后4℃保存。（4）5mol/LLiCl•H2O：称取15.1gLiCl•H2O加0.1%DEPC水溶解，定容至50mL，高压灭菌后4℃保存。（5）0.5mol/LEDTA：称取4.00gNaOH加去离子水溶解，称取14.61gEDTA加入到NaOH溶液中，加水约80mL搅拌均匀，调pH至8.0，定容至100mL，121℃灭菌20min后4℃保存。（6）SDS提取缓冲液：称取1.461gNaCl用0.1%DEPC水溶解；取5mL1mol/LTris•HCl、5mL0.5mol/LEDTA于烧杯中，充分溶解后定容至50mL，121℃灭菌20min后，4℃保存。（7）10%SDS：称取10gSDS加入到0.1%DEPC水中溶解，加浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存，无需灭菌。（8）75%乙醇（V/V）：称取75mL无水乙醇和25mL0.1%DEPC水，混合均匀后4℃保存，无需灭菌。（9）50×TAE电泳缓冲液（100mL）：称取24.2gTris、3.72gEDTANa•2H2O于100mL的烧杯中加0.1%DEPC水溶解，量取5.7mL冰乙酸于烧杯中混匀，定容至100mL，121℃灭菌20min后4℃保存。-34- 内蒙古科技大学硕士学位论文4.2.3实验方法4.2.3.1河套蜜瓜总RNA的提取（1）在2mL离心管中，加入1mLSDS提取缓冲液、140μL10%SDS、30μLβ-巯基乙醇；（2）将新鲜的河套蜜瓜样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，快速研磨组织，直至成细小的粉末状，分装于12支离心管中；震荡混匀；（3）65℃水浴20min后在4℃，12,000rpm下离心15min；（4）小心吸取上清600μL，加入1/3体积乙酸钾，冰浴30min；（5）4℃，12,000rpm离心20min；（6）小心吸取上清400μL置新的离心管中，加1/2体积预冷的无水乙醇和4/5体积5mol/L的LiCl，过夜沉淀；（7）4℃，12,000rpm离心20min；（8）小心去除上清，加入75%的乙醇1mL，12,000rpm4℃离心5min，之后小心的将乙醇吸出，重复上述操作两次；（9）将离心管的管盖打开室温干燥2min，去除残留的乙醇，加入20μL的0.1%DEPC水溶解，-20℃保存备用。4.2.3.2RNA检测吸取上面所制的RNA提取液1-2μL，在紫外可见分光光度计上测定RNA的浓度、OD260/OD280和OD260/OD230，根据这三个参考指标来判断提取的RNA的质量。OD260/OD280=1.8-2.2、OD260/OD230>2.0时质量良好。4.2.3.3琼脂糖凝胶电泳（1）将制胶板用DEPC水冲洗一遍，备用。（2）制胶：称取0.25g琼脂糖粉末，加入放有25mL的1×TAE电泳缓冲液的锥形瓶中，配制成1%的琼脂糖凝胶，加热使琼脂糖完全溶解。倒于胶槽中冷却凝固待用。（3）加样：将1μL6×LoadingBuffer、5μLRNA提取液混匀，加样于凝胶点样孔内。-35- 内蒙古科技大学硕士学位论文（4）电泳：使用100V电压进行电泳操作，约半小时后将胶块放入EB染液中染色，后在凝胶成像系统上观察RNA电泳结果。4.2.3.4cDNA第一条链的合成cDNA第一条链的合成是以mRNA为模板，反转录形成cDNA的过程。实验采用TaKaRa公司PrimeScript®RTMasterMix（Code：DRR036A）试剂盒中的操作步骤进行cDNA第一条链的合成。在DEPC处理过的0.2mL离心管中，加入下列试剂，轻轻混匀，进行反转录反应。表4.1RT-PCR反应体系试剂使用量RNaseFreedH2O5μL5×PrimeScript®RTMasterMix2μLTotalRNA3μL反转录反应条件如下：（1）37℃恒温水浴15min；（2）85℃水浴5sec；（3）4℃保存备用。4.2.3.5PCR扩增（1）引物设计根据在NCBI上找到河套蜜瓜同属的甜瓜PLDα基因序列，采用GeneTool软件设计目的基因引物如下：Forwardprimer:5’-AGGGGTCAGGGTTCTTATGC-3’Reverseprimer:5’-GGGCTATCCACCACCACAA-3’（2）PCR反应PCR反应体如下表4.2：-36- 内蒙古科技大学硕士学位论文表4.2PCR反应体系试剂使用量RNaseFreedH2O15.75μL2+10×PCRBuffer（Mg）2.5μLdNTP2.5μL上游引物（10μmol/L）1μL下游引物（10μmol/L）1μL反转录cDNA模板2μLTaqDNA聚合酶0.25μL反应条件如下：预变性：95℃5min变性：95℃30sec退火：54℃45sec30个循环延伸：72℃80sec复性：72℃10min4℃保存采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。4.2.3.6引物验证为了证明PCR结果的准确性，防止外来条带污染，将4.2.3.5所得的PCR产物送去上海生工进行测序，验证引物是否合适。4.2.4实验结果4.2.4.1河套蜜瓜RNA的提取-37- 内蒙古科技大学硕士学位论文图4.1河套蜜瓜总RNA1%琼脂糖凝胶电泳示意图表4.3河套蜜瓜总RNA的OD值编号OD260/OD280OD260/OD230浓度（ng/μL）12.011.61211.522.001.58315.631.961.40382.842.061.51250.452.061.71404.762.071.0996.6本方法提取出的RNA经凝胶电泳检测（图4.1）可以看出RNA带型清晰、28S和18SRNA的条带良好、重复性好、脱尾与弥散不严重，28S明显比18S的条带亮；测得的OD260/OD280＝1.8-2.2（表4.3），这说明所提取出来的RNA中蛋白质等有机物的污染程度很小，但是测出的OD260/OD230<2.0，这说明RNA中无机离子的含量比较高；从测得的RNA浓度可以看出RNA的浓度偏低。整体来看，所提取出来的河套蜜瓜总RNA的纯度和完整性都达到了后续试验的要求。4.2.4.2PCR产物结果图-38- 内蒙古科技大学硕士学位论文图4.2PCR结果图由图4.2可以看出，PCR产物在250bp左右有明显的条带，初步证明提取的PCR是我们需要的目标产物。4.2.4.3序列分析结果图根据上海生工的测序结果，河套蜜瓜PLD基因的部分序列为：TGGGCTATCCACCACCACAATCTTCTGGTGATGAGTGAACATGGTAGAGATTTGTAGATCTTGAACAATGCTTCCACCATCATCGGGATTACGAGGGCACAACACACAGTGCACGTCAGTATCTTGGAAGTAACGTTCAGTTTCTTCATCGTGAGTAGCCATCAAACCATCTTTTTTAAGTAAACCGACTGATGTTCTGTCATCCCAGACAAGCATAAGAACCCTGACCCCT在NCBI上进行Blast，得：-39- 内蒙古科技大学硕士学位论文Blast结果显示：实验所得部分PLD基因序列为232bp，且与甜瓜PLDα序列相似度为99%，证明所得序列即为河套蜜瓜PLD部分序列，证明引物设计合理，适合做后续荧光定量PCR反应，以期监测PLD基因的表达量。4.3荧光定量PCR反应4.3.1实验材料与仪器4.3.1.1实验材料选用3.2.2.1中用液氮速冻的处理组和对照组的河套蜜瓜作为实验材料。4.3.1.2实验仪器实验仪器见附录。4.3.2实验方法4.3.2.1RNA的提取RNA的提取方法同4.2.3.1。-40- 内蒙古科技大学硕士学位论文4.3.2.2反转录反应反转录方案采用TaKaRa公司PrimeScriptRTReagentKit(PerfectRealTime)进行。cDNA第一条链的合成是以mRNA为模板，反转录形成cDNA的过程。试验按表4.4的反应体系，将所需试剂加入到用DEPC水处理过的0.2mL离心管中。表4.4RT-PCR反应体系试剂使用量RNaseFreedH2O4.5μL5×PrimeScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMix0.5μLOligodtPrimer0.5μLRandom6mers0.5μLTotalRNA2μLRNaseFreedH2O4.5μL反转录反应条件如下：①37℃恒温水浴15min；②85℃水浴5sec；③4℃保存备用。4.3.2.3荧光定量PCR反应（1）引物设计：[86]根据牛鹏辉的研究结果，确认河套蜜瓜所用的内参引物为：Actin（GenBackaccessionno.AB046952）：Forwardprimer:5’-CCTGGTATCGCTGACCGTAT-3’Reverseprimer:5’-TACTGAGCGATGCAAGGATG-3’目的引物采用4.2.3.6所采用的引物。4.3.2.4PCR反应：荧光定量PCR反应体系如下表4.5：-41- 内蒙古科技大学硕士学位论文表4.5PCR反应体系试剂使用量RNaseFreedH2O6μLSYBRPremixExTagⅡ2.5μL上游引物（10μmol/L）0.8μL下游引物（10μmol/L）0.8μL反转录cDNA模板2.0μLRoxPreferenceDyeⅡ0.25μL使用实时荧光定量PCR扩增仪，按如下程序进行扩增反应。第一步：荧光定量PCR仪内95℃预变性30sec；第二步：95℃变性5sec，60℃退火34sec，该过程进行40个循环；第三步：95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec。反应结束后查看其溶解曲线，导出数据，保存试验结果。4.3.3结果4.3.3.1内参基因及PLD的融解曲线0d0minactin0d0minPLD0d5minactin0d5minPLD-42- 内蒙古科技大学硕士学位论文0d10minactin0d10minPLD0d15minactin0d15minPLD0d20minactin0d20minPLD1d0minactin1d0minPLD-43- 内蒙古科技大学硕士学位论文1d5minactin1d5minPLD1d10minactin1d10minPLD1d15minactin1d15minPLD1d20minactin1d20minPLD-44- 内蒙古科技大学硕士学位论文2d0minactin2d0minPLD2d5minactin2d5minPLD2d10minactin2d10minPLD2d15minactin2d15minPLD-45- 内蒙古科技大学硕士学位论文2d20minactin2d20minPLD3d0minactin3d0minPLD3d5minactin3d5minPLD3d10minactin3d10minPLD-46- 内蒙古科技大学硕士学位论文3d15minactin3d15minPLD3d20minactin3d20minPLD4d0minactin4d0minPLD4d5minactin4d5minPLD-47- 内蒙古科技大学硕士学位论文4d10minactin4d10minPLD4d15minactin4d15minPLD4d20minactin4d20minPLD5d0minactin5d0minPLD-48- 内蒙古科技大学硕士学位论文5d5minactin5d5minPLD5d10minactin5d10minPLD5d15minactin5d15minPLD5d20minactin5d20minPLD图4.3PLD和actin的融解曲线根据图4.3的融解曲线可以看出，内参基因及PLD基因均有单一峰，并且无细小的杂峰，证明荧光定量的实验结果是有效的。-49- 内蒙古科技大学硕士学位论文4.3.3.2PLD的相对表达量0d1d1.2211.5量0.8量达达表0.6表1对对相0.4相0.50.200空白5min10min15min20min空白5min10min15min20min时间/min时间/min2d3d2.51.61.421.2量量1达1.5达表表0.8对1对0.6相相0.40.50.200空白5min10min15min20min空白5min10min15min20min时间/min时间/min4d5d1.21.211量0.8量0.8达达表0.6表0.6对对相0.4相0.40.20.200空白5min10min15min20min空白5min10min15min20min时间/min时间/min图4.4PLD相对表达量对不同时间磁场处理后的河套蜜瓜目标基因PLD和内参基因actin进行荧光定-△△Ct量PCR分析，分别得到目标基因PLD和内参基因actin的Ct值，根据公式2分别求出河套蜜瓜在磁场中不同处理时间下PLD基因相对表达量。从图4.4中可以看出，在贮藏初期，只有磁场处理10min的河套蜜瓜其PLD表达量高于对照组，其它处理组均低于对照组。整体而言，在整个贮藏期间，河套蜜瓜在磁场中处理15minPLD相对表达量最低。-50- 内蒙古科技大学硕士学位论文4.4小结（1）通过对内蒙古河套蜜瓜引物的验证过程，我们初步获得了232bp长度的河套蜜瓜PLD保守序列。（2）对获得的片段与PLDα基因Blast比对，发现其同源性很高，所以初步预测河套蜜瓜中PLD基因属于PLDα家族。（3）通过荧光定量PCR反应，我们得出磁场处理15min时的PLD基因表达量最低，对细胞膜的损害最低。-51- 内蒙古科技大学硕士学位论文5讨论5.1磁场处理对河套蜜瓜外观品质的影响[87]周慧吉等的研究结果表明，外磁场会对果蔬体内存在的微磁场产生一定的作用，从而影响果蔬细胞膜的作用机制，进而影响其电极的分布，降低细胞程序性死亡老化的进程，从而达到果蔬保鲜的效果。而果蔬保鲜效果最直接的体现即为果蔬[85]的外观品质，这与成善汉等的研究结果相似，证明外观品质可以直接反映甜瓜的贮藏特性。研究中我们采用交变磁场处理河套蜜瓜，发现不同强度磁场处理确实对河套蜜瓜外观品质产生的影响也不同，随着贮藏时间的延长，不同处理组之间的外观品质等级有较大的差异。5.2磁场处理对河套蜜瓜失重率的影响在果蔬贮运过程中水分容易挥发并导致重量减轻，从而对果蔬的品相产生了影响。失重原因有很多，包括内外因素的影响：内因主要包括其种属、呼吸作用等；外因主要是温度的影响。我们通过实验发现，虽然各组的失重率均呈上升趋势，但是采用磁场处理后的河套蜜瓜失重率明显降低的较缓慢，且以180V为最，这与高[55]梦祥等的研究结果相符，即交变磁场处理过的草莓，重量减轻幅度均低于对照组，说明电磁场处理的方法可以有效降低草莓的水分减少率，从而降低其失重率。5.3磁场处理对河套蜜瓜呼吸强度的影响呼吸作用，即果蔬在采摘之后，细胞内进行的一系列生物氧化反应，把光合作用中积累的有机物分解成CO2和H2O，伴随着能量释放的过程，以维持采后体内正[88]常生理活动的过程。果蔬的呼吸强度，是探究果蔬耐贮性的重要指标。果蔬采收后，光合作用停止，植物体主要进行呼吸作用分解有机物，进而影响各种生理生化过程及其耐贮性和抗病性。果蔬呼吸越明显说明其各种生理生化反应越迅速，果蔬呼吸强度越高耐贮性越差，呼吸强度越低耐贮性越好。因此，在果蔬贮藏期间，随着时间的延长，呼吸强度会逐渐增加，进而促进果蔬的成熟与衰老，加速果实内部生理生化反应的进行。实验中采用不同强度及时间的交变磁场处理河套蜜瓜后，其呼吸强度虽然受到一定程度的抑制，但各处理组呼-52- 内蒙古科技大学硕士学位论文吸强度曲线均有较大程度的波动，并无较大规律性，其原因可能是各处理组河套蜜瓜成熟度不一致，并且腐烂等原因也可能导致河套蜜瓜的细胞出现程序性死亡，进而降低其呼吸强度。5.4磁场处理对河套蜜瓜膜渗透率的影响膜渗透率是体现植物膜系统状况的表征。当果蔬处于逆境条件下时，最先受到损伤的即为细胞膜，当细胞膜受到伤害时，细胞内的胞液容易外渗，导致膜渗透率[89]升高，它能直观反映出果蔬产品的耐贮性和贮藏状况。果蔬膜渗透率越高说明果蔬耐贮性越差，膜渗透率越低说明果蔬耐贮性越好。[90]GerasopoulosD等研究表明，当果蔬处于逆境条件下，细胞的膜系统最先受到伤害，其次内部生理反应加速。由于细胞膜受到自由基的氧化作用，使得膜损伤，引起离子向外渗透，所以把膜渗透率作为果蔬内部生理生化反应的表征。本研究中，不同强度磁场处理后，随着贮藏期的增加，虽然所有处理组的膜渗透率均呈上升状态，但是不同的处理强度其趋势波动不同，且采用不同的时间处理，使得处理组的膜渗透率有下降的趋势，而对照组的则一直保持上升的趋势，这表明不同的磁场强度处理会对河套蜜瓜的细胞膜渗透率产生一定程度的影响，且降低其膜渗透[91]率，这与刘剑虹等的研究相似，即：果蔬在交变磁场强度为1.7mT左右时处理2d，会降低果蔬细胞膜的通透性。5.5磁场处理对河套蜜瓜硬度的影响果蔬的硬度是判断果蔬果肉质地、果实老化和保鲜时间的表征。一般水果都会[92]因为成熟和腐败而硬度降低。所以贮藏过程中，能够保持果蔬的硬度，对于控制果蔬的成熟和衰老是非常必要的。果蔬的硬度越小耐贮性越差，硬度越大耐贮性越好。[93]相关研究表明，果实在贮藏时间内硬度会呈持续下降趋势，有效延缓果实的软化，即减慢硬度下降的速度，可以有效的延长果实的贮藏时间。本实验中，使用磁场处理后的河套蜜瓜，虽然其硬度有时也呈下降趋势，但是较之与未处理组，下降的较为缓慢，这说明磁场处理可以延缓河套蜜瓜的软化速率，提高其贮藏保鲜效[94]果。王良艳等在用各种处理方法对甜瓜贮藏保鲜效果的研究中发现，甜瓜在贮藏过程中的硬度是逐渐变小的，而在我们的实验中，鲜切河套蜜瓜的硬度没有出现逐-53- 内蒙古科技大学硕士学位论文渐变软的趋势，反而是小幅度变硬和波动的趋势，可能原因是磁场处理能降低了果胶酶类的活性。5.6磁场处理对河套蜜瓜可溶性固形物含量的影响[95]固形物反应着果蔬中糖类化合物等的含量，分为可溶性和不可溶性两类，它反映河套蜜瓜口感和风味，对河套蜜瓜的感官特性十分重要，同时又能间接的反映出河套蜜瓜的耐贮性和营养品质，决定着果蔬在食用过程中的口感。果蔬在贮藏过程中，由于细胞膜受损，腐烂率逐渐上升，从而使得可溶性固形[96]物外渗而逐步升高，口感下降。庄晓虹等的研究表明：水果在成熟与衰老过程中逐渐变软常常归因于细胞壁上的酶失活，致使细胞壁破裂，细胞散开。当果实发生酶促褐变时，会使可溶性固形物含量稍有减少，但不是很明显。本实验中，磁场处理的河套蜜瓜可溶性固形物的变化稍微减少，但是差异不大，可能由于贮藏时间较短所引起的，另外，腐烂也会导致可溶性固形物的含量降低。5.7磁场处理对河套蜜瓜可滴定酸含量的影响可滴定酸是标定果蔬品质的重要表征，是影响果蔬质量和决定果蔬口味的一个[97][98]决定因素。李娜等的研究结果表明：甜瓜采前使用水杨酸处理后，随着果实采后的不断成熟，果实可滴定酸含量可持续保持不变，可以有效保持果实的风味。本研究中，经过磁场处理的河套蜜瓜其可滴定酸含量变化幅度较小，并且变化缓慢，但在第9d时，出现最高峰，可能是由于果实腐烂和后期成熟造成的。5.8磁场处理对鲜切河套蜜瓜腐烂率的影响腐烂率是反映果蔬腐烂情况的指标，能够最直观的表现果蔬贮藏期间的保鲜效[99]果和耐贮性。果蔬腐烂率越高说明果蔬的贮藏期越短，腐烂率越低说明其贮藏期越长。本研究中，用不同时间的磁场处理河套蜜瓜，随着保鲜时间的增加，其腐烂率都呈下降的趋势，而各个处理组的腐烂率都比对照组小，说明短时间磁场处理对[55]河套蜜瓜确实有保鲜作用，这与高梦祥等的研究结果相似，即在交变磁场对草莓保鲜效果的影响中，发现用交变磁场处理后的水果，其保质期显著增加。-54- 内蒙古科技大学硕士学位论文5.9磁场处理对内蒙古河套蜜瓜PLD基因表达量的影响PLD作为细胞膜上主要的磷脂水解酶，通过水解细胞膜中的磷脂而影响膜的结[100]构，MahajanS的研究发现，有效的降低PLD活性，可以提高玉米、大豆和棉花[101]的抗逆境能力，降低其机械损伤。SunJ等的研究发现，正丁醇处理后的荔枝果皮细胞PLD的活性明显降低，从而间接保持了细胞膜的完整性，延缓了果皮的衰老。本研究中，磁场处理后河套蜜瓜PLD基因表达量较对照组明显降低，而15min处理组PLD表达量在贮藏到第1d时高于对照组，可能原因为河套蜜瓜在逆境的作[102]用下，膜上PLD基因表达量增加从而刺激细胞膜对逆境的应激作用。整体而言，磁场处理时可以降低河套蜜瓜细胞膜上PLD基因的表达。-55- 内蒙古科技大学硕士学位论文结论本研究以河套蜜瓜为实验材料，采用不同强度及时间的磁场对其进行处理，从生理生化角度研究河套蜜瓜的保鲜特性，得出的主要研究结果如下：（1）研发出了新型果蔬磁场处理仪，既可以方便的对河套蜜瓜进行保鲜处理，同时，也可将其应用于生活中的其它果蔬。（2）采用不同强度的磁场处理河套蜜瓜，测定了其腐烂率、失重率、呼吸强度、硬度及可溶性固形物等生理指标。得出：180V电压所对应的磁场强度是河套蜜瓜的最佳磁场处理强度。（3）采用不同时间的磁场处理河套蜜瓜，测定了其腐烂率、呼吸强度、硬度、膜渗透率、可溶性固形物及可滴定酸含量等生理指标。得出：磁场处理时间为15min，是河套蜜瓜的最佳磁场处理时间。（4）运用荧光定量PCR技术，从分子生物学角度研究不同时间磁场处理后河套蜜瓜PLD基因表达量的变化。得出：当磁场处理时间为15min时，河套蜜瓜PLD基因的表达量最低，同时获得了232bp长度的河套蜜瓜PLD保守序列，确定其为PLDα家族。综上所述，采用180V电压对应的磁场强度，处理15min时，河套蜜瓜的保鲜效果最明显，且可以将磁场处理作为一种新型保鲜方法应用于其它果蔬中。-56- 内蒙古科技大学硕士学位论文展望本文对磁场处理后河套蜜瓜的保鲜效果进行了研究，得出当磁场处理强度为180V，处理时间为15min时，保鲜效果最好，同时也对河套蜜瓜PLD基因表达量进行了测定，然而由于时间的关系，仍有许多问题没有涉及到，有待继续进一步研究：（1）细胞膜上主要的酶即为PLD，但是仍然存在其他的一系列酶影响着植物的生命活动，如过氧化物酶（peroxidase，POD），过氧化氢酶（Catalase，CAT）等，因此可以继续深入的研究磁场处理条件下，这些酶的变化情况，为磁场对河套蜜瓜的保鲜提供进一步的理论依据。（2）实验室目前设计的果蔬磁场处理仪，用于处理实验中小数量的河套蜜瓜尚且可以，但是如果将其用于数量较大的果蔬保鲜时，则费时费人，因此仍需进一步的探讨，研究出适合批量处理果蔬保鲜的磁场处理仪。（3）建议根据5’-Race和3’-Race进一步的获得河套蜜瓜的PLD基因的全长，从基因内部的结构了解磁场处理对河套蜜瓜的保鲜机理。-57- 内蒙古科技大学硕士学位论文参考文献[1]张德虎.河套蜜瓜品质可见近红外光谱检测研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.[2]张中霞，刘艳，白立华，等.河套蜜瓜果实发育过程中主要营养成分的变化[J].内蒙古农业大学学报，2011，32（3）：171-174.[3]杨晓清.河套蜜瓜流变特性及储运损伤控制的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2006.[4]HuangCH,ZongL,BuonannoM,etal.Impactofsalinewaterirrigationonyieldandqualityofmelon(Cucumismelocv.Huanghemi)innorthwestChina[J].EuropeanJournalofAgronomy,2012,43,68-76.[5]韩育梅，赵丽芹，张曦，等.河套蜜瓜采后生理与保鲜技术研究进展[J].保鲜与加工，2006，（3）：16-18.[6]骆蒙，方天祺，张治中，等.甜瓜成熟期间多聚半乳糖醛酸酶与乙烯的变化和果实软化的关系（简报）[J].植物生理学通讯，1996，（5）：338-341.[7]付梅.生物磁现象和磁效应及其应用[J].现代物理知识，2004，16（1）：15-16.[8]杨贞，沃兴德.磁生物学效应的研究进展[J].现代生物医学进展，2006，6（9）：86-89.[9]朱杰.磁场的生物学效应及其机理的研究[J].生物磁学，2005，5（1）：26-29.[10]PillaAA,MarkovMS.Bioeffectsofweakelectromagneticfields[J].ReviewEnvironmentHealth,1994,10:155-169.[11]MooreRL.Biologicaleffectsofmagneticfields:studieswithmicroorganisms[J].CanadianJournalofMicrobiology,1979,25:1145-1151.[12]杨丽，乔晓艳，董有尔.磁场生物效应的研究现状与展望[J].中国医学物理学杂志，2009，26（1）：1022-1024，1037.[13]陈文芳，何蓉，齐浩.磁场的生物学效应[J].陕西师范大学学报(自然科学版)，2004，32：77-80.[14]RadhakrishnanR,KumariBDR.Pulsedmagneticfield:Acontemporaryapproachofferstoenhanceplantgrowthandyieldofsoybean[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2012,51:139-144.-58- 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内蒙古科技大学硕士学位论文附录A常用实验仪器与药品1试剂药品厂家草酸天津市风船化学试剂科技有限公司氢氧化钠天津市永大化学试剂有限公司氯化钡天津市风船化学试剂科技有限公司酚酞天津市风船化学试剂科技有限公司DEPC北京化工厂Tris碱Amresco,America浓HCl北京化工厂乙酸天津市凯通化学试剂有限公司LiCl天津市永大化学试剂有限公司EDTA天津市化学试剂三厂NaCl天津市永大化学试剂有限公司SDSSigma乙醇天津市永大化学试剂有限公司2仪器仪器厂家高速台式冷冻离心机Eppendorf电泳仪北京市六一仪器厂数显恒温水浴锅国华电器有限公司紫外可见分光光度计NanoDrop凝胶成像系统美国电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司制冰机宁波格兰特有限公司高压灭菌锅TOMYPCR仪基因有限公司荧光定量PCR仪ABI公司-66- 内蒙古科技大学硕士学位论文在学研究成果1公开发表的论文（1）JiaJin,WangXiujuan,LvJunli,GaoShan,WangGuoze.AlternatingmagneticfieldpriortocuttingreduceswoundresponsesandmaintainsfruitqualityofcutCucumismelo.ExpetimentalandClinicalSciences,inpress.(SCI).（2）王秀娟，高山，王国泽.磷脂酶D的抗逆特性及其活性检测研究[J].湖北农业科学，2014，53（5）：998-1000.（3）王秀娟，高山，崔颖，游新勇，王国泽.笮菛调味油的研制[J].中国调味品，2014，10（10）：109-111.（4）王秀娟，汪磊，崔颖，游新勇，王国泽.凉菜调味油的研究进展[J].农产品加工（学刊），2014，（6）：58-61.（5）王秀娟，高山，崔颖，汪磊，王国泽.孜然调味油的研制[J].内蒙古科技大学学报，2014，33（3）：306-310.（6）WangGuoze,GaoShan,WangXiujuan,LiJun,JiaJin.PhysiologicalCharacteristics,FunctionalComponents,DevelopmentandUtilizationofAlliumMongolicumRegel[J].Medicalplant,2014,5(1):67-69+72.（7）高山，李昊虬，王秀娟，王国泽.莜麦麸皮不溶性膳食纤维碱法改性工艺优化[J].广东农业科学，2012，（23）：92-93+100.（8）王国泽，高山，李昊虬，王秀娟.沙葱的生理特性、功能性成分及开发利用[J].湖北农业科学，2013，52（15）：3482-3484.（9）高山，王秀娟，王国泽.磁场处理在果蔬贮藏保鲜中的应用[J].食品研究与开发，已录用.（10）崔颖，王秀娟，高山，王国泽.实时荧光定量PCR在植物中的应用[J].湖北农业科学，已录用.2申请的专利（1）王国泽，高山，齐国成，李昊虬，王崇阁，王秀娟.可调节流量醋油瓶[P]．中国专利：ZL201320003518.1，2013-06-19.（2）王国泽，高山，晋伟，王秀娟．一种果蔬处理保鲜器[P].中国专利：ZL201320553952.7，2014-03-12.-67- 内蒙古科技大学硕士学位论文（3）李雅丽，高山，王秀娟，魏永洋．曾荣鹏.微生物发酵罐辅助接种灭菌罩[P].中国专利：ZL201320554530.1，2014-03-12．（4）李雅丽，高山，王秀娟，彭燕玲，王钰玺.植物细胞发酵罐接种辅助装置[P].中国专利：ZL201320553951.2，2014-03-12.-68- 内蒙古科技大学硕士学位论文致谢三年的研究生生活犹如白驹过隙般即将结束了。在刚刚过去的三年里，我很幸运的成为内蒙古科技大学食品科学与工程系的一员，进行科研，收获成果。本论文是在王国泽教授的悉心指导下完成的。在这里，感谢王老师，不仅从论文的选题，研究，撰写及后期的修改过程给予帮助，同时也在生活中给予了我无尽的关怀，使我能够顺利的完成学业，王老师一丝不苟，严谨治学的精神，对我现在乃至以后的人生都是极大的帮助。同时，也感谢贾晋老师和李珺老师给予的实验技术帮助，晋伟老师给予的磁场设计方面的帮助及北京农业科学院给予的实验室条件帮助。另外，也感谢我的高山师兄、崔颖师妹，在实验与生活中帮助我；也感谢其它实验小组给予的帮助。是大家的无私帮助，教会了我很多，谢谢。感谢国家自然科学基金（NNSFC-31260406）的大力支持！毕业将即，请允许我再次对帮助过我的人道声谢谢，同时也祝王老师桃李满园，内蒙古科技大学发展越来越好！！！王秀娟2015年5月于内蒙古科技大学-69-