蜜柚类胡萝卜素代谢相关基因的分离及功能分析 57页

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分类号％６６．３密级々去？住讼Ａ蜜袖类胡萝、Ｉ轰代谢相关基因的分离及功能分祈指导教师姓名、职称杨莉副教授单位地址浙江省金华市迎宾大道６８８号申请学位级别硕±专业牛物化学与分子生物学论义提巧时间２０１５年３月论文答辩时间２０１５年５月学位授予单位和日期浙江师范大学２０１５年６月答辩委员会主席田生科论文评阅人２０１５年５月 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃ１：ｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａ化ｄｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｕｍｍｅｌｏｐＢｙＸｉａｏｉｎＪｉｎｑ乂ＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＺｈｅｊｉａｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦｏｒ化ｅＤｒｅｅｏｆ巧ＭａｓｔｅｒｏｆＳｃｉｅｎｃｅＳｕｅｒｖｉｓｅｄｂｐｙ乂ｓｓｏｃｉａｔｅＰｒｏｆｅｓｓｏｒＬｉＹａｎｇＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒ＆ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ？ＺｈｅｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ？ｙｊｇｙＪｉｎｈｕａ，３２１００４，ＣｈｉｎａＭａｒｃｈ，２０１５ 蜜袖类胡萝、Ｉ素代谢相关基因的分离及功能分析摘要类胡萝ｈ素是存在于自然界的天然色素之一，还，除能够赋予植物各种色彩之外－Ａ有丰富的营养价值。其中番茄红素具有抗癌作用，Ｐ胡萝ｈ素含有两个维生素１的环结构，能够高效转化为维生素Ａ，补充生物体维生素Ａ含量。因此，研究类朗萝ｈ素代谢机制对于提商植物天然类胡萝ｈ素含量，尤其是可食用部位类胡萝ｈ素含量十分重要。类胡萝＇［素主要的代谢途径涉及ＰＳＹ，ＰＤＳ，ＺＤＳ，ＺＩＳＯ，ＣｒｔｌＳＯ，ＬＹＣＢ，ＬＹＣＥ及ＢＣＨ。除了ＣＷ货０与公Ｃ／／这２个基因外６，其余个基因全长均从红肉蜜抽及巧溪蜜抽中毎分离，并比较分析了这些基因在果实发育过程中的基因表达模式。结果发红肉蜜袖果实汁胞中番茄红素与－．，现Ｐ胡萝ｈ素含量较洁溪蜜抽高，但上述基因所编码的氨基酸仅存在个别氨基酸差异或无差异。此外，我们再次分析了红肉蜜抽与洁溪蜜袖果实汁胞中番茄红素代谢相关基因的表达。除Ｃ扣／济？外，其他番茄红素合成的上游基因（Ｃｇ戶Ｓｒ、ＣｇＰＺ识与ＣｇＺＤＳ）基本都随着蜜抽果实的成熟表达量升高，下游基因（Ｃ站化方与ＣｇｚｒｃＥ）则相反，随着蜜袖果实的成熟表达量反而降低。但是Ｃｇｚ／ｓｏ作为番茄红素合成的上游基因一，其表达量的趋势总体上与两个下游基因表达模式致，与其他Ｈ个上游基因表达模式相反。利用酵母双杂交技术，对番茄红素代谢过程中主要的六个酶进行互作研究，结果一与实验室前期ＢｉＦＣ致ＤＳ、ＣＺＤＳ、ＣＬＹＣＢ结果基本。ＣｇＰＳＹ能够与ＣｇＰｇｇ发生相互作用（ＣｇＬＹＣＥ未能同时转进薛母，所Ｗ其互作情况尚未知）；ＣｇＺＤＳ和ＣｇＰＤＳ能够与ＣｇＰＳＹ、ＣｇＺＩＳＯ、ＣｇＬＹＣＢ与ＣｇＬＹＣＥ这几个酶之间发生相互作用，ＣｇＺＤＳ与ＰＤＳ两者之间也有互作关系；ＣｇＺＩＳＯ比较特殊，只与ＣｇＰＤＳ和ＺＣｇＤＳ这两个脱氨酶发生相互作用；ＣｇＬＹＣＢ与ＣｇＬＹＣＥ类似，都能够与ＣｇＰＳＹ、ＣｇＰＤＳ、ＣｇＺＤＳ发生互作，ＣｇＬＹＣＢ与ＣＬＹＣＥ之间也具有相互作用ｇ。＇一二化ＷＧ－庶２ｅｒ（化瞄）基因从红肉蜜抽与措溪蜜抽中分别分离出个诉巧每，者ＤＮＡ序列无差异，属于Ｃ３拟Ｃ３型ＲＩＮＧＥ３连接酶家族成员。扣ＦＣ分析衰明无论是红肉蜜抽还是洁溪蜜抽，ＣｇＲＨＦ能不同程度的与ＣＰＳＹ、ＣＺＤＳ、ＣＬＹＣＢ和ＣＬＹＣＥｇｇｇｇＩ ＾相互作用；与红肉蜜袖ＣｇＰＤＳ存在较弱的相互作用，与洁溪蜜袖ＣｇＰＤＳ无互作。同时，我们在番茄果实中沉默Ｃ如好Ｆ基因的非保守片段，发现成熟沉默番茄果实颜色较对照浅－，果实中类胡萝ｈ素含量，特别是番茄红素与Ｐ胡萝ｈ素含量有所减少，推测Ｃ＇基因与类胡萝素代谢有关ｇ化册，可能参与调控类胡萝ｈ素的合成代谢。对蜜袖进行分离与ｑＰＣＲ分化结果所分离的每基因隶属于ＣＹＰ８６Ａ８家族，主要参与脂肪酸的代谢，并且该基因随着蜜抽果实的发育及番茄红素的积累，其表达逐渐降低。ＢｉＦＣ分析发现所分离的ＣＹＰ４５０与类胡萝ｈ素代谢相关酶无任何互作。此外，沉默ＣｇＣ巧乂５０基因片段后仅影响了沉默植株茎组织的发生。关键词：类胡萝ｈ素代谢；蛋白互作；泛素连接酶；细胞色素Ｐ４５０ＩＩ 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目录摘要ＩＡＢＳＴＲＡＣＴＩｌｌＶＩＩ第一章文献综述１、１．类胡夢Ｉ素代谢的研究进展１２．蛋白互作的研究进展２３．本课题研究意义３第二章ＣｇＺ货０的分离与表达５１．材料骑法５１．１植物材料５１．２试剂与仪器５Ａ的－１链的合成．３总ＲＮ提取及ｃＤＮＡ６１．４ＣｇＺ／ＳＯ的分离与表达６２．７结果与分析２．１ＣｇＺ抵０基因的分离７２．２Ｃ掉拟０基因在果实不同时期的表达８３．難９第Ｈ章类胡萝、Ｉ素代谢相关基因的互作分析１１１１１．材料＾方＾￡１．１质粒与菌株１１．１２双杂载体构建ＩＩ．１１３薛母菌感受态制备与转化１２．２结果与分析１、２．１类胡夢１２Ｉ素代谢相关酶分析、２．２类胡萝Ｉ素代谢巧关基因的互作结果１５３■城１６Ｃ＇第四章ｇＴ？／／／的功能初探１８１．材料与方法１９１．１植物欄１９１．２质粒与菌株１９１．３试剂与仪器１９－、ＡＣ呂ＲＨＦＮＣＤ树分离１９－１ＴＺ）．５Ｃｇ／ｆ／ｆＦＡＣ的ＶＩＧＳ沉默载体构建１９１．６农巧菌侵染１９．７１沉獻果实的ＨＰＬＣ分析２０．２结果与分析２１２．１标准曲线的建立；．．．．．．．２１２．２沉默果实的ＶＩＧＳ表型分析２１２．３沉默果实的ＨＰＬＣ分析２１３■讨论２２Ｖ 第一章文献综述第五章Ｃ、素代谢相关醋的互作分析２４ｇＲＨＦ与类胡萝Ｉ１．材料与方法２４１．１植物材料２４１．２质粒与菌株２４１．３试剂与仪器２４１．４的ＢｉＦＣ截体构建２５ｉ１．５农杆菌侵染与ＢＦＣ巧光观察２５么结果与分析２５２．１Ｃ客／ｙ／ｆ的ＢｉＦＣ载体构建２５、．２２ＣＲＨＦ与幻：肉蜜袖类胡萝２５ｇＩ素代谢相关蛋白的互作、２．３ＣＨＦｌ与填溪蜜袖类胡萝。ｇＲＩ素代谢相关蛋白的互作３．讨论２８第六章注肉蜜袖Ｗ如的分离及功能初探３０１．材料輔？＊３１１．１植物欄３１１．２试剂与仪器３１．分离与表达１３Ｃ４５０的３奸１１．４的亚细胞定位载体构建３１１．５（：蛛知０的亚细胞定位３２＞１６０．每／知的ＶＩＧＳ沉默载体构建３２２．结果与分析３２２．１Ｃ外知０的生物信息学分析３２．公０在幻２２Ｃ班：肉蜜抽中的表达分析３４２．３ＣＰ４５０的亚细贿定位３５ｇ２．４Ｃ户的沉默结３５ｇ果？３讨论３５参考；６３７；献邮录４１魏４４攻读硕壬学位期间发表的学术论文目录４５ＶＩ 第一章文献综述缩略词－缩写全称中文名ＡＢＡＡｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ脱落酸ＡｂＡＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ短梗霉素ＡＤＡｃｔｉｖｉａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ转录激活域ＡｍｐＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ氨节青霉素铜ＢＣＨ－－ｐｃａｒｏｔｅｎｅｈｄｒｏｘｌａｓｅＰ胡萝ｈ素环授化酶ｙｙＤＮＡ－ＢＤＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎＤＮＡ结合域ＢｉＦＣｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｌｅｍｅ打ｔａｔｋｍ双分子焚光互幸ｈｐ－ＣＢＬｃａｌｃｉｒｉｎＢｅＢ亚基蛋白ｎｅｕｌｉｋｒｏｔｅｉｎ类钩调麟酸酶ｐＣＨＹＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｈｄｒｏｘｌａｓｅ胡萝ｈ素环化酶ｙｙＣＩＰＫＣＢ＾ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣＢＬ互作蛋白激酶ｐ－－ＣＯＩＰＣｏＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ免疫共沉淀ＣｒｔｌＳＯＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｉｓｏｍｅｒａｓｅ明萝ｈ素异构酶ＣＹＰ４５０ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０细胞色素Ｐ４５０ＤＡＦＤａｓａｆｔｅｒｆｌｏｗｅｒｉｎ盛花期后ｙｇＤＭＡＰＰＤｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ二甲基丙婦焦鱗酸－－－－－ＤＸＰＤｅｏｘＤ－Ｄ５ｙｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｈｏｓｈａｔｅ脱氧木爾穗麟酸ｐｐＤＸＳＤＸＰｓｎｔｈａｓｅＤＸＰ合成酶ｙＧＧＰＰＧｅｒａｎｌｅｒａｎｌ出ｈｏｓｈａｔｅ雜牛儿基魄牛儿基焦磯酸ｙｇｙｐｐＨＰＬＣＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ高效液相色谱法ＩＰＰＩｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ异戊婦焦鱗酸ＫａｎａＫａｎａｍｙｃｉｎ卡那霉素－－ＬＹＣＢＬ－ｃｏｅｎｅｃｃｌａｓｅ番茄红素３环化酶ｙｐＰｙ｜ＬＹＣＥＬｃｏ－－－环化酶ｅｎｅｌ红素ｓｙｐｅｃｙｃａｓｅ番茄ＭＥＰＭｅ－ｅｔｈｌｉｙｔｈｒｉｔｏｌ４ｈｏｓｈａｔｅ甲基赤薛糖醇ｙｐｐ－ＭＴＢＥｍｅｔｈｙｌｔｅｒｔｂｕｔｙｌｅｔｈｅｒ甲基叔Ｔ基酸ＭＶＡＭｅｖａｌｏｎｉｃａｃｉｄ甲藉戊酸ＰＤＳＰｈｙｔｏｅｎｅｄｅｓａｔｅｒａｓｅ八氮番茄红素脱氮酶ＰＳＹＰｈｙｔｏｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ八氨番茄红素合成酶ＰＴＧＳｏｓ－因沉默ｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅ转录后的基ｐｇＴＲＹＴｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓ烟草脆裂病毒ＵＡＳｕｐｓｔｒｅａｍａｃｔｉｖａｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ上游激活序列ＶＩＧＳＶｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎ毒介导的基因沉默ｇｇ病－ＺＤＳｃａｔ－ｒｏｅｎｅｄｅｓａｔｅｒａｓｅ葫萝ｈ素脱氯酶＾；Ｓ－ＺＩＯ＾ｃａｒｏｔｅｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ＾胡萝ｈ素异构酶ＶＩＩ 第一章文献综述、１．类胡萝Ｉ素代谢的研究进展一，作为种天然的异戊二婦类色素类胡萝ｈ素，不仅能够赋予植物各种色彩，还能够作为辅助色素参与植物的光合作用过程与光保护过程，最重要的是具有较髙的营养价值一症。番茄红素，目前所发现的自然界桂物中最强的抗氧化剂之，能够预防癌１－］Ａ的发生，增强人体免疫办，，；Ｐ胡萝ｈ素作为维生素Ａ原能够合成大量维生素预－Ｐ４防夜盲症的发生此外适量的胡萝ｈ素还能够促进紫黄质达到正常值，保护视力。；Ｐ由于化学合成的类胡萝ｈ素无防癌抗癌作用，且动物体自身无法合成类胡萝ｈ素，因Ｗ此对类胡萝ｈ素营养的补充只能摄于植物中。类巧萝ｈ素主要由ＩＰＰ与ＤＭＡＰＰ两种异戊二烁异构物衍生而来。其中ＩＰＰ在植Ｗ］物中的合成主要有两种途径：ＭＶＡ途径Ｗ及ＭＥＰ途径。ＭＶＡ送径主要发生在胞质Ｗ及内质网中，Ｗ立醜辅酶Ａ作为起始物质；ＭＥＰ途径主要存在于质体中，是高等植－物１？？合成的主要途径。的６？途径＾３，０乂８的１憐酸甘油膳与丙砸酸作为为原料在８－＂［］催化下生成ＤＸＰ，最后生成类胡萝ｈ素合成的起始物质ＧＧＰＰ。目前认为，植物类萝ｈ素的合成主要发生于质体中，ＷＧＧＰＰ作为合成起始物质，一通过种合成酶（ＰＳＹ）、两种脱氨酶（ＰＤＳ与ＺＤＳ）Ｗ及两种异构酶（ＺＩＳＯ与ＣｒｔｌＳＯ）等五种酶的催化下合成番茄纪素。番茄红素作为重要的中间产物，其下游主要能够形成两个分支－－－，其中，分支形成的物质是胡萝ｈ素，ｅＰＰＰ，最终形成玉米黄素；而Ｐ分８，１２，１３－［ａ１支形成的物质则是胡萝ｈ素，最终形成叶黄素。具体过程如下（图＾１）：ＢＣＨ下山牡主…？？…■—？－？玉米黄素，０－胡萝ｈ素ｐ隐黄质＾ｌｙｃｂ／２ＧＧＰＰ八氨番茄红素胡萝ｈ素品番茄红素＼＊ＬＶＣＥｘ…－＾＞…’？８？＇胡萝？叶黄素胡萝ｔ素ｔ素了－困１１植巧类巧萝ｈ素代谢途径示意图Ｆ－ｎ化ｉｇ．１１化ｅｐａ化ｗａｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｉｏｓｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｙｙ。目前的研究表明，影响植物类胡萝ｈ素合成的主要因素是遗传因素对番茄果实ｐｓｒ基因进行沉默后，会引起番茄红素的合成受阻而导致果实显澄黄色表型；番茄果实ＰＤＳ沉默后类胡萝ｈ素总含量较野生型降低５０Ｓ－％左右；ＺＤＳ的沉默会引起大量１ 第一章文献综述１４［］胡萝ｈ素的积累，因此遗传因素是调控植物类胡萝ｈ素合成的主要因素。此外在番茄果实的成熟过程中，合成番茄红素的上游基因Ｐ５Ｔ、ＡＣ议表达量上升，而下游基因－ＬＹＣＢ、ＬＹＣＥ的表达量则下降甚至不再表达，避免番茄红素分解代谢过快，加速Ｐ胡ｔｗｑ萝ｈ素的合成。因此对类胡萝ｈ素代谢基因的转录调控是果实成熟过程中合成并１［＾积累类胡萝ｈ素的主要调控方式。此外类胡萝ｈ素合成还受到环境Ｗ及化学物质等一多种因素的影响。例如，ＰＳＹ作为最为关键的个限速酶ＢＡ、，其转录受到Ａ光照强１８［］弱及光照时间、温度、湿度等多种环境因素的影响。２．蛋白互作的研究进展蛋白质作为生命历程的执行者，其相互作用与生命健康息息相关，能够调节细胞生理－，帮助适应外界环境刺激。其中ＢｉＦＣ技术、酵母双杂交技术Ｗ及ＣｏＩＰ技术等均为目前研究蛋白质相互作用最为常见的几种方法。ＢｉＦＣ技术作为研究蛋白互作的体内方法，主要是将英光蛋白分割成不能发萊光的［ＷＮ端与Ｃ端两个独立的部分，各自均与铅蛋白相连接。若两个範蛋白之间能够发生互作，那么Ｎ端与Ｃ端会拉近空间距离，重新形成巧光蛋白，发出巧光，其中黄色焚光蛋ＰＷ白是蛋白互作实验中最常用的巧光蛋白。由于ＢｉＦＣ实验过程操作较为简便且无染料染色，并能在最接近活细胞生理状态的条件下，于巧光显微镜中直接观察到目标蛋白的互作情况，因此是在活体细胞中观察蛋白互作最为简便的方法虽然ＢｉＦＣ具有很多优点，但是显微镜观察过程中主观判断较强，而且具有较高的假阳性，需要与其他方法共同验证。酵母双杂交技术作为一种经典方法，在模式生物酵母中进行，对活细胞内的蛋白质相互作用进行研究。酵母菌中，半乳糖代谢所需的基因主要由ＧＡＬ４与ＧＡＬ８０这两个调节蛋白所控制。当外界环境存在半乳糖时，ＧＡＬ４蛋白与其ＵＡＳ上游基因中的效应元件相结合后，激活转录；若半乳糖不存在时，ＧＡＬ８０与ＧＡＬ４相结合，阻遏转录２２［］－－。酵母菌的转录因子ＧＡＬ４由ＤＮＡＢＤ与ＡＤ两部分结构域组成，ＤＮＡＢＤ与ＡＤ２３一［］结构上可分开，功能上相互独立。：诱巧蛋白因此该系统般由Ｈ部分组成，即与ＢＤ融合的蛋白一，；铅蛋白与ＡＤ融合的蛋白化及带有个甚至多个报告基因的宿主菌一。株若是诱巧蛋白与觸蛋白之间具有相互作用，那么ＢＤ与ＡＤ能够重新连接成个整体，与ＵＡＳ相互结合后转录因子活性激活，启动转录，下游报道基因得Ｗ表法；若２ 第一章文献综述无相互作用，ＢＤ与ＡＤ之间无法重新连接，继而表达报道基因脚。与扣ＦＣ相比，酵一母双杂交虽然没有ＢｉＦＣ简便，但无需提取纯化蛋白，因此也属于种较为简捷的方法。一尽管这方法具有较大优势，但是在实验过程中不可避免的是假阳性的存在，此外还应注意鞭蛋白自身存在自激活的可能性。一与Ｂ－ｉＦＣ、酵母双杂交技术不同ＣｏＩＰ，技术为种体外研究蛋白质之间相互作用一的种比较经典且常用的方法－。ＣｏＩＰ技术主要是利用抗体沉淀相应特定分子的同时，也会沉淀其他能够与该分子特异性结合分子的技术。其原理是；细胞在非变性条件下裂解时，能够保留细胞内存在的许多蛋白质之间的相互作用，简而言之，即用抗体Ｂ２４［］免疫沉淀蛋白质Ａ，那么也能沉淀在体内与Ａ结合的蛋白质Ｃ。虽然送种方法能够用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，但是关键在于找到适合的抗体，此外还需将免疫复合物进行洗脱、收集并分离蛋白，因此与ＢｉＦＣ、酵巧双杂技术相比比较麻烦。虽然目前对类胡萝ｈ素代谢途径中ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＩＳＯ、ＺＤＳ、ＣｒｔｌＳＯ、ＬＹＣＢ与ＬＹＣＥ这儿个酶的研究比较多，特别是ＰＳＹ与ＰＤＳ，但是对它们么间相互作用的研究却甚少。３．本课题研究意义１９９８年，福建省农科院果树所研究人员在平和县小溪镇语溪蜜袖园发现果肉呈红２５［］色的芽变单株，命名为红肉蜜抽。红肉蜜袖与巧溪蜜袖两个品种果实汁胞中番茄红－素与－Ｐ朗萝ｈ素的含量差异较大，其中红肉蜜袖果实汁胞富含番茄红素与胡萝ｈ素，Ｐ有较高的营养价值和商业价值。将两种蜜袖果实汁胞提取物处理癌细胞，发现红肉蜜袖果实汁胞较巧溪蜜抽有更强的抑制癌细胞生长作用。此外，类胡萝ｈ素本身能够作。，为维生素Ａ原，生成维生素Ａ，预防夜盲症但是人类自身无法合成类胡萝ｈ素只能依靠对外界植物的摄取，因此对类胡萝ｈ素生物合成及代谢途径的研究对实际生产具有重要意义。２６］２＾１目前【［，王梨媛与李伟明分析了红肉蜜袖与洁溪蜜抽果实发育过程中类胡萝ｈ２８２９素的含量及种类［］［］；刘顺枝等与伍洋分别应用抑制差减杂交技术与蛋白质双向电泳技术分离出多个与招溪蜜抽、Ｈ红蜜抽表达存在差异的蛋白质，Ｗ期解析纽肉蜜抽果－实汁胞积累番茄红素与Ｐ胡萝ｈ素的生理与分子机制。虽然目前有关植物类胡萝ｈ素代谢途径研究较多，但其调控机制知之甚少。正如３ 第一章文献综述红肉蜜抽与语溪蜜抽两种果实０５天左右番茄红素已经，虽然红肉蜜袖盛花后１开始积累ＰＳＹ、ＣＤＳ、ＣＺＩＳＯ、，但其积累的原因尚不清楚。类胡萝ｈ素的积累，纯粹只是由ＣｇｇＰｇＣｇＺＤＳ、ＧｇＣｒｔｌＳＯ、ＣｇＬＹＣＢ＂及ＣｇＬＹＣＥ等几个酶决定，还是这些酶相互作用所引起一，或者是由于其他些基因调控这些基因的表达所引起，送些问题都尚未知。因此即使对类胡萝一ｈ素代谢相关的关键酶研究较多，但是对这代谢途径的研究仍然具有较大意义。４ 第二章ＣｇＺ化０的分离与表达一类胡萝ｈ素作为天然色素之，，，能够防癌增强免疫力具有较高的营养价值。由于动物体自身不能合成类胡萝ｈ素，只能从外界中摄取，因此对类胡萝ｈ素代谢的研究十分重要。植物类規萝ｈ素代谢过程中，主要由ＰＳＹ，ＰＤＳ、ＺＤＳ、ＺＩＳＯ、ＣｒｔｌＳＯ、３［气由ＬＹＣＢ、ＬＹＣＥ及ＢＣＨ等，经过脱氨，缩合，环化，哲化等多个过程共同完成一次脱氨反应后都会形成各种顺式异构体于毎，而环化酶的底物为全反式番茄红素，８一［］需要在ＺＩＳＯ与ＣｒｔｌＳＯ两种异构酶的催化下形成。此外红肉蜜抽作为谊溪蜜抽的个芽变单株－，其果实汁胞主要积累番茄紅素与Ｐ胡萝ｈ素，是研究蜜抽类胡萝ｈ素代谢途径较好的一种实验材料。在前期研究中，实验室已成功分离出红肉蜜抽与语溪蜜抽类胡萝ｈ素代谢相关的５个基因（每化ｙ，Ｃｇｆｉ松，Ｃｇｚ凸Ｓ，Ｃ站ｒｃ及，Ｃ站化五）。ＺＩＳＯ作为植物类胡萝ｈ素代’一’９－－谢过程中主要的异构酶之，在该过程中主要是将１５９Ｈ顺式胡萝ｈ素转变为’９９－二－顺式ｙ月萝ｈ。应用ＶＩＧＳ技术，在番茄果实中沉默２７化？基因，导致果实中番茄红素的含量减少，八氨番茄红素、六氨番茄红素Ｗ及胡萝ｈ素含量发生补偿性増加，引起果实呈现粉色表型因此对Ｚ货０基因的研究能够对类胡萝ｈ素合成过程中异构酶的作用具有重要意义。１．材料与方法１．１植物材料本部分实验所用的植物材料为福建省平和县小溪镇盛锦公司育种基地１０年生语溪蜜袖打Ｖｒｗ巧（Ｌ．）Ｏｓｂｅｃｋ及其红肉早熟突变体红肉蜜袖。于２０１２年采集的［］°５－盛花后１０、１３５、１６５、巧５ｄ的果实汁胞，样品采集后用液氮速冻后于８０Ｃ胆存备用。１．２试剂与仪器ｅｗｎｓｏｎａ高保真酶ＮＥＢ（ＮＥｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）ｐｈｕｉＴｑＤＮＡ聚合酶购自上海基因科ｇｄＮＴＰｓＭ－ｉｘ、限制、、ａｒｋｅｒ、８、技有限公司，性内切酶Ｔ４ＤＮＡ连接酶ＤＮＡＭｐＭＤ１Ｔ５ 第二章ＣｇＺ／Ｗ基因的分离与表达？ＤＮｏｙｅｌ等购自ＴａｋａＲａ公司（大连），ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＣｄｎａＳｙｎｔｈｅｓｉｓ拙、ＲＴ－ＰＣ民试ＧｏＴａＰＣＲＭａｓｔＭｉ）ａｑ剂（ｑｃｅｒｘ与参比焚光染料ＣＸＲ购自Ｐｒｏｍｅ，ｉｇ－ＰＣＲ８ｑＲＴ所用连管与管盖购自ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ公司，引物由上海英潍捷基有限。公司合成，其余常规试剂分别购自北京科百奧生物有限公司与金华医药公司？－（ＰＣＲ仪购自ＡｌｉｅｄＢｉｏｓｓｔｅｍ公司，普通ＰＣ民仪为助０ＲＡＤＭＣｃｌｅｒ。ｊｐｐｙｙｙ－１．３总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ链的合成蜜袖果实汁胞总ＲＮＡ的提取参照徐昌杰等Ｗ改良的Ｂｕｏｓ法ＬｉＣｌｇ，使用去除果实汁胞中的糖含量。经过ＤＮｆｌ础［处理基因组ＤＮＡ后使用ＴｈｅｒｍｏＮａｎｏｄｒｏｐ２０００紫外分光光度计与２％（ｍ／ｖ）琼脂糖凝胶电泳对所提取的ＲＮＡ进行浓度与质量检测。ＴＭ取１．５ａ所提取的果实汁胞总ＲＮＡ，参照Ｐｒｏｍｅａ公司ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｓｔＳｔｒａｎｄ｜ｇｇｃｅ—ＤＮＡＳｙｎｔｈｓｉｓ拉ｔ的使用说明进行逆转录，合成ｃＤＮＡ链。１４Ｃ．ｇＺ化０的分离与表达根据ＮＣＢＩ数据库２７说？基因序列登录号（ＸＭ００６４７８８３０．１）设计引物。其中上＿游引物序列为；ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＣＴ（带下划线碱基为ＥｃｏＲＩ酶切位点）：ＣＴＣＧＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧ（带；下游引物序列为下划线碱一时期的果实汁胞ｃＤＮＡ二链作为模板基为Ｘ＆ｏｌ酶切位点）。ＷＤＡＦ１９５ｄ这，采用ｈｕｓｉｏｎＴａＤＮＡ聚合酶进行ＰＣ民扩増。ＰＣＲ体系（２０ｌＬ）：１０ｘＰＣ民ｂｕｆｅ＾２ｉＬ，ｐｑ＾为｜ｄＮＴＰｓＭｉｘ（２．５ｍＭ）０．仙Ｌ，上游引物与下游引物各０．４阵，ｃＤＮＡ二链１咕，Ｔａｑ’’ＤＮＡ聚合酶０．４咕，ｄｄＨ２〇补充至２０咕。反应程序为９４Ｃ预变性４ｍｉｎ；９４Ｃ变性’°‘３０ｓ说，５０Ｃ退火３０ｓｅｃ，７２Ｃ延伸４０ｓｅｃ，３０次循环；最后７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ。ＰＣＲ产ＴＡ连－ＴＴＧＭＤ１８１盛白斑筛选、物通过接克隆至Ｐ载体后转化至感受态细胞，经过ＰＣＲ验证及酶切验证后所获得的阳性克隆送至英潍捷基（上海）有限公司进行测序。参照实时巧光定量ＰＣＲ引物设计原则，Ｗ所扩增获得的ＣｇＺ／ＳＯ为模板，应用Ｐｒｉｍｅｒｒｅｍｉｅｒｓ。Ｐ软件设计引物其中上游引物序列为ＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡ；下游引物序列为：ＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＴＧＡＴＴＣ。ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系（２０曲）为：２ｘＧｏＴａｑｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０，１０Ｖ［上游引物０．４，１０Ｍ下游引物０．４，ｌＯＯｘＣＸＲ０．２阵山沁ｎ阵—一ｃ３－６库，ＤＮＡ链（稀释１０倍）１曲，ｄ細２〇补充至２０阵。每个样品重复次，’°－３ＲＴＰＣＲ反应条件为？个生物学重复。；％Ｃ预５ｍｉｎＳ５Ｃ变性３ｓｅｃ共ｑ变性，，６ 第二章Ｃ＆Ｚ化０基因的分离与表达退火及延伸４５ｓｅｃ，进行４０次循环。反应结束后进行巧解曲线分析，检测引物特异－４４＾－性。采用２法分析机口（：民（＞１１７．０９数据，应用牺软件对数据作图。２．结果与分析２．１基因的分离采用改良的Ｂｕｇｏｓ法所提取的蜜袖果实总ＲＮＡ主要有２８ＳｒＲＮＡ与１８ＳｒＲＮＡ两条条带，并且２８ＳｒＲＮＡ浓度比１８ＳｒＲＮＡ高。红肉蜜袖语溪蜜抽—花后天数一－－－－—￣——￣Ｔ一￣－２：ＤＡＴ＂＇＞２８ＳｒＲＮＡ２－图１蜜抽果实不同发育时期汁胞的总ＲＮＡ－Ｆｉ．２１ＴｏｔａＡｉｍｅｎｔｇｌＲＮｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｕｉｃｅｓａｃｓｏｆｕｍｍｅｌｏｔｈｒｏｕｈｏｕｔｆｒｕｔｄｅｖｅｌｏｊｐｇｐ采用同源克隆法红肉蜜抽与语溪蜜抽ＤＡＦ１９５ｃＤＮＡ中，分别从时期果实汁胞分离出长约１１２５ｂｐ的片段，通过测序，发现红肉蜜抽中存在２条相似的Ｃ掉做９序列，分别记为Ｃ如Ｚ／託）与Ｃ沙Ｚ／Ｓ０２ｎＤＮＡｍａｎ比对发现红肉蜜袖与语溪蜜抽Ｃ狂化０Ｚ／ＳＯ一基因片段（公小ＣＺ／筑９２则较Ｃ？Ｚ拟（９多出）大致且无任何碱基有所差异；棘封２５ｂｐ碱基。ａ＇通过在线软件ＰｒｏｔＰｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｉｇ）可知，ＣｇＺＩＳＯ属于疏水性蛋白３７４１１：／／ｗｗｗｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／），由个氨基酸组成。经Ｃｈｌｏｒｏｐ．（ｈｔｐ．Ｐ一与ｒｏｔＰａｒａｍ在线预测软件分析可知ＺＩＳＯ前６７个氨基酸序列为信号化，其理论分子量约４１．３０ＫＤａ，等电点为９．２８。经ＴＭＨＭＭ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄＵｉ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）在线预测得知ＺＩＳ０含五个跨膜结构域，其Ｎ■－端在膜内２２。ｉ？Ｚ／化＞２基因由于多出２５ｂ，，Ｃ端位于膜外（图）ｐ导致翻译提前终止其蛋白质由２０７个氨基酸组成，理论分子量约２２．１９ＫＤａ，含有Ｈ个跨膜结构域（图２－３）。７ 第二章ＣｇＺ／Ｓ６＞基因的分离与表达ＺＩＳＯ的跨膜区分析■■．■＇■１．２．．Ｉｉ—ｎｒｎｉｉｒｕｎｔ圓＿ｌｌＩＵＩｉｌｌｌＪｉ謹ｉｉ．ｌｌｌ０１．助１卵１５日２０日２５０如日３５０—跨藤区藤内—膜外图２－２ＣｇＺＩＳＯ蛋白的巧膜分析Ｆ－ｒｓ－ｍｅｍｂｒａｎｅｈｅＺＩＳＯｌｃｅｓｒｅｉｉｏｎｆｉ．２２ｔａｎｉｐｄ幻ｏＣｇｇｎｓ〇２的跨購区分析ｎｎ５０１５０２００１００跨藤区猿巧膜外２－Ｚ图３ＣｇＩＳ０２蛋白的踩膜分析－－ＺｌＦ．２ｎｓｅｍｂｒａｎｅｒｅｄｉｃｉｏｎｏｆＣＳ０２ｉ３ｔｒａｍｈｅｌｉｃｅｓｔｇｐｇ２．２ＣｇＺ／ＳＯ基因在果实不同时期的表达口２］Ｃ紙化６佩为内参基因，对每Ｚ／Ｗ不同发育时则堪因表达进行ｑＰＣＲ分析－（图２４）。红肉蜜袖果实汁胞中ＣｇＺ议０基因表达量随着果实的成熟，基因表达水平下降缓慢１Ｗ）略有上升巧溪蜜袖果实汁胞中ＣｇＺ议０，在果实成熟采摘期（ＤＡＦ；一基因在ＤＡＦ７５、ＤＡＦ１０５与ＤＡＦ１３５Ｈ个时期表达丰度基本致，而在果实发育后期表达水平开始下降，红肉蜜袖基因表达丰度均高于语溪蜜。除了成熟采摘期袖，尤其是在果实发育初期（ＤＡＦ７５），二者间存在具有极显著差异。８ 第二章ＣｇＺ／ＳＯ基因的分离与表达Ｃ锅紛阵咨巧Ｒｅｄ－ｆｌｅｓｈｅｄｏｍｍｅｌｏｐＧｕａｎｘｉｏｍｍｅｌｏｐ－１．２？＊－１，０．ｒｔｌｉｉ．ＤＡＦ７５ＤＡＦ１０５ＤＡＦ１３５ＤＡＦＪ６５ＤＡＦＩ９５图２－４红肉蜜抽与琼溪蜜柏不同发育时期ＣｇＺ／ＳＯ的相对表达量－－ＦｉＺ放０呂．２４ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｉｎｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆ民ｅｄｆｌｅｓｈｅｄｕｍｍｅｌｏａｎｄＧｕａｎｘｉｇｐｐｕｍｍｅｌｏｐ．＊＊＊＜Ｐ＜Ｐ＜０１１．０５．０；０．００３．讨论’’一－幻ＳＯ作为类胡萝ｈ素代谢过程中最重要的异构９Ｈ－酶之，主要催化１５９顺式’－－胡萝ｈ素生成９９二ａｎＣ顺式ｙ月萝ｈ素。Ｆｔｉｎｉ等沉默番茄果实Ｚ／Ｗ基因后，沉默果－实呈现淡红色，果实中番茄红素含量降低，而六氨番茄红素、八氨番茄红素Ｗ及（胡萝１４ｈ［１素等出现代偿性的增加。红肉蜜抽与拒溪蜜袖中ＣｇＺＺＳ口基因在碱基序列无差异，表明该基因并非两种蜜抽色素含量产生差异的主要调控基因。结合实验室前期红肉蜜袖与洁溪蜜抽色素的ＨＰＬＣ分析结果，发现红肉蜜抽果实汁胞中，果实发育初期（ＤＡＦ７５与ＤＡＦ１０５期）汁胞中番茄红素含量很低或检测不到，在ＤＡＦ１３５期番茄红素开始出现并快速积累，到ＤＡＦ１６５期化到最高值ＡＦ１Ｗ期。，，并在Ｄ下降南溪蜜抽果实汁胞中除了成熟采摘期可Ｗ检测到少量番茄红素外，其他时期番茄红素含量极低，甚至检测不到。Ｚ／ＳＯ基因的ＰＣ民一ｑ结果也反映了送趋势，Ｃ胤９基因在红肉蜜袖中ＤＡＦ１３５期表达丰度最低掉，在馆溪蜜抽ＤＡＦ１９５期表达丰度最低，表明番茄红素对ＣｇＺ／ＳＯ基因存在反馈调控作用。虽然红肉蜜抽中分离出度Ｚ胤９７与欠Ｚ货０２两条序列，但是Ｚ／Ｗ２因多出２５ｂｐ而发生提前终止，因此后续实验内容只是针对货０／。此外，ｑＰＣ反分析基因表达中未能将与各自的表达丰度进行分析一。故在后期实验中、，可进步的确认证实Ｗ及对各自的表达丰度进行比较。９ 第二章Ｃ１０基因的分离与表法ｇＺ拉结合前期对红肉蜜袖Ｗ及萌溪蜜袖类胡萝ｈ素代谢过程中ｆｓｙ、ｆｚｗ、ＺＤＳ、ｚｙｃ公一与ｉｒＣＥ的ｑＰＣＲ结果，发现虽然Ｚ货Ｏ这基因属于番茄红素合成过程中的上游基因，但其表达模式与ＡＳＴ、ｆ公Ｓ、ＺＤＳ相反，并非随着蜜抽果实成熟而上升；而与番茄红素一合成下游基因ｉｒｃ公和１化五则类似，，这，即随着果实的成熟其表达反而下降结果３一３［］ｎｎｏｍａｈ－Ｄｗａｍｅｎａｖ等基与Ａｐ在苹果研究结果致，表明类胡萝ｈ素合成代谢相关因在不同植物中具有相似的功能。１０ 第Ｈ章类胡萝、Ｉ素代谢相关基因的互作分析一项基本的生理蛋白质作为生物生命活动的执行者，蛋白质之间的相互作用也是活动。蛋白互作可Ｗ发生于各亚细胞结构中，对其进行研究，能够对生物体各种生理一口４］活动机理的研究提供定的依据。目前研究蛋白互作的方法很多，其中酵母双杂交是最经典方法。酵母双杂交系统能够在体内检测蛋白质之间的相互作用情况，具有高度敏感性。由。它最主要的特点是能够快速、直接分析己知蛋白之间的相互作用关系一于酵母双杂交系统在活细胞内进行检测，因此在定程度上可｛＾＾戈表细胞内的真实倩况。此外，由于作用信号发生于融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用所给一出，因此省去了纯化蛋白质该繁琐歩骤。在植物类胡萝ｈ素合成与代谢过程中、ＺＩＳＯ、ＬＹＣＢＬＹＣＥ，ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ与是关键的六个酶一。对这六个关键酶进行蛋白互作分析，在定程度上能够帮助了解类胡萝ｈ素代谢的调节机制。由于实验室在前期过程中对上述六个酶己经进行过ＢｉＦＣ的一巧光观察，为进步进行确定，我们将其构建至酵母双杂交载体进行再次验证，分析蜜袖中类胡萝ｈ素代谢过程相关六个酶之间的相互作用。１．材料与方法１．１质粒与菌株－ＧＡＤＴ７－质粒主要有Ｐ（ＡＤ）、ＰＧＢＫＴ７（ＢＤ）、ｐＧＢＫＴ７Ｌａｍ、ＰＧＢＫＴ７５３，菌株主要有大肠杆菌菌种ＴＧ１与酿酒酵母菌种Ｙ２Ｈ。１．２双杂载体构建针对酵母双杂交表法载体ｐＧＡＤＴ７与ｐＧＢＫＴ７设计引物，重新分离出红肉蜜抽与靖溪蜜抽类胡萝ｈ素代谢过程中的６对基因（化ｙ、的巧、２７Ｘ０、ＺＤＳ、Ｉ化：公与Ｉ化龙），所分离出的阳性克隆进行测序并通过相应的限制性内切酶构建至双杂载体ＰＧＡＤＴ７与ＧＢＫＴ７，转至大肠杆菌ＴＧ１后进行菌种保存。Ｐ１．３醇母菌感受态制备与转化、选择现制现用。与大肠杆菌农杆菌不同，酵母菌的感受态不宜长期冻存，而应感受态制备结束后应在两小时Ｗ内进行转化，避免转化失败。酵母菌感受态的制备方１１ 第三章类胡萝ｈ素代谢相关基因的互作分析法主要是采用了ＴＡＫＡＲＡ公司所提供的使用手册：首先将酵母菌菌株Ｙ２Ｈ，具体如下’接种至ＹＰＤ（Ａ）培养基，２８Ｃ培养箱培养三天至３ｍｍ左右时，挑选健康；待单菌落’的单菌落接种至ＹＰＤ（Ａ）液体培养基中，并在２８Ｃ、２５０ｒｐｍ条件下过夜培养；过夜培养的菌液取５ｐＬ至２５ｍＬＹＰＤ（Ａ）液体培养基中进行扩大培养，直至细胞浓度０〇６〇〇＾０．１５；将菌液在７００ｇ条件下离也５ｍｉｎ，菌液收集后重悬于ｌＯＯｍＬＹＰＤ（Ａ）液‘＝Ｃｍ条件下继续培养至０〇－体培养基，２８、２５０ｒ６〇〇〇．４０．６至两个５０ｍｌｐ；将茜液分装无菌离也管中，常温条件下，７００ｇ离也５ｍｉｎ，再用无菌水进行重悬；７００ｇ离也５ｍｉｎｘｘ后用１．５ｌｌｌＴＥ／ＬｉＡＣ重悬１５ｓｅｃ０．６ｍｌｌ．ｌＴＥ／ＬｉＡＣ重悬ｍ．并最高速离也；弃上清后用，所获得的茜液即酵母菌感受态，应在２ｈ之内用于转化。酵母菌转化的方法主要使用的是ＰＥＧ／ＬｉＡＣ化学转化法。首先取无菌的１．５ｍｌ离也管若干管，做上标记后加入待转化的重组质粒１００ｎｇＷ及鱼精ＤＮＡ（１０＾ｉｇ４ｉＬ）５咕，其中鱼精ＤＮＡ在使用之前应进行沸水浴；然后加入脖母菌感受态细胞５０阵，混匀后加５００冲ＰＥＧ／ＬｉＡＣ，锅旋混匀，应注意的是ＰＥＧ／ＬｉＡＣ溶液需要现配现化避免降低ＥＧ‘／ＬｉＡＣ后８Ｃ０ＤＭＳＯ转化率：加入Ｐ，２条件下培养半个小时作化恢复培养后加２曲，’Ｃ混匀后４２水浴１５ｍｉｎ从水浴锅中取出离也管后最高速离也１５ｓｅｃ，ＩｍＬ；弃上清后用的＾了５溶液重悬；同样条件下再次离必后用６００ｌＬ的レＴＥ溶液重悬；取１００＾１１＾菌＾’液在无菌工作台中徐布至相应的ＳＤ缺陷型培养基８Ｃ３－５ｄ，最后２倒置培养。后挑选’－８０Ｃ所生长出的单菌落，经ＰＣＲ验证后保存菌种并冻存于。２．结果与分析２、．１类胡夢Ｉ素代谢相关酶分析２．１．ＩＣｇＰＳＹ通过在线软件ＰｒｏｔＰａｒａｍ与Ｃｈｌｏｒｏｐ１．１分析可知，ＰＳＹ由４３８个氨基酸组成，分一子量约为４９．８９ＫＤ。，是含有信号肤的亲水性蛋白质通过ＤＮＡＭＡＮ比对得知，在红肉蜜袖果实汁胞与巧溪蜜袖果实汁胞中分离出的ＣｇＰＳＹ么间无太大差异。通过一ＴＭＨＭＭ预测发？跨膜螺旋结构现成熟的ＣｇＰＳＹ第２６２２８４位氨基酸有，是膜结合一位点，是Ｎ端与Ｃ端均在膜外的跨膜结合蛋白。１２ 第ｓ章类胡萝ｈ素代谢相关基因的互作分析２．１．２ＣｇＰＤＳ与ＣｇＺＤＳＣｇＰＤＳ由５巧个氨基酸组成，我们从两种蜜抽果实中所分离出ＣｇＰＤＳ之间有两个氨基酸有所差异。其中第２８５位氨基酸在红肉蜜袖中为赖氨酸，而巧溪蜜抽中为谷氨酸；第４３３位氨基酸在红肉蜜抽中为苏氨酸，而巧溪蜜抽中为丙氨酸。ＣｇＰＤＳ的分子量大约为６１．８ＫＤａ，无信号狀也不含跨膜区，属于亲水性蛋白质。目前，对ＣｇＰＤＳ这一酶的研究较为成熟，在多种植株中沉默该基因能使新生叶片出现白化症状，因此常ＰＳＶＩＧＳ基因沉］做为默操作中的阳性对照。ＣｇＺＤＳ由５７０个氨基酸组成，两种蜜抽果实之间仅第４１位氨基酸有所差异，纽肉蜜抽为丝氨酸而洁溪蜜袖中为异亮氨酸。ＣｇＺＤＳ的分子量约为６３．０ＫＤａ，同样不存在信号化及跨膜区，属于亲水性膜外蛋白质。２．１．３ＣｇＬＹＣＢ与ＣｇＬＹＣＥＣｇＬＹＣＢ由５０４个氨基酸组成，分子量约为５６ＫＤａ，无信号肋及跨膜医，属于亲水性蛋白质ＹＣＥ由４３０ＫＤ？４０５。ＣｇＬ８个氨基酸组成，分子量约４９．，第３８３位氨基酸为一跨膜螺旋结构，是膜结合位点。蜜抽果实中ＬＹＣＢ的分离主要是根据ＮＣＢＩ登录号ＡＹ２１７１０３进行引物设计，使用高保真ｐｈｕｓｉｏｎＴａｑＤＮＡ聚合酶对红肉蜜抽与洁溪蜜抽果实进行同源克隆。成功分离后将阳性克隆送至英潍捷基一（上海）生物有限公司进行测序，根据测序结果，共获得六条序列，其中红肉蜜抽基因序列Ｈ条，记为ＲＬＹＣＢ１、ＲＬＹＣＢ２与ＲＬＹＣＢ３；巧溪蜜抽所获得的基因序列也三条，分别记为ＢＬＹＣＢ１、ＢＬＹＣＢ２与ＢＬＹＣＢ３。将这六条口６］口７序列对照之前王伟杰等与Ｚｈａｎｇ等】分别所分离出的两条公基因序列置于ＭＥＧＡ－，构建系统进化树（图３１）。结果显示王伟杰等与张建成等所分离出的两条基因序列均源于巧接，同源性较高，而我们从蜜袖中所分离的六条序列亲缘关系相对较。远，红肉蜜袖中所分离出的Ｈ条序列３其中，ＲＬＹＣＢ１与ＲＬＹＣＢ之间的亲缘性比ＲＬＹＣＢ２高；而语溪蜜袖ＢＬＹＣＢ１与ＢＬＹＣＢ２之间的亲缘性比ＢＬＹＣＢ３高。应用ＤＮＡＭＡＮ对这六条ｉｒＣ公基因序列所编码的氨基酸进行同源性比对，结果发现这六个－基因的氨基酸序列－。，特别是番茄红素Ｐ环化酶的功能区基本无任何氨基酸差异（表３１）因此推测在两种蜜袖中所分离出的６条１化：及基因序列虽然有所差异，但并不影巧它们之间所编码的蛋白酶活性。正因为如化仅选择了Ｃ化ｙｅｗ与Ｃ化ｒｃｗ进行后ｇｇ续实验。１３ 第Ｈ章类胡萝ｈ素代谢相关基因的互作分析ＢＬＹＣＢ２ｎｍ＾ｔａｒｕｓｔｇ８１化＾ＲＬＹＣＢ３ＣｉｔｒｕｓｒａｎｔｓｇＩＫＬＹＣＢ２ＣｉｔｒｕｓｒａｎｄｉｓｇｆｎｉＢＬＶＣＢ３ＯｒｓｒｔｍＵｓｇＣｍＬＹＣＢＣ！＆ＡＹ２１７１０３￡ｉｃ＾ｊＲａｒｌｍｔ７Ｉ８８ＣｓＬＹＣＢａｌＣＷｕｓｓｔｎａ＾ｉｓＤＱ４９６２２１．１Ｉ８０ＩＣｓＬＹＣＢｌＣｈＰＪ８５Ｉ３０７ｉｔｎｔｓｓｔｍｓｉｓＥＬＹ邸ｎｍ化１０＾５ｊｆ６７ＩＬ—，，＾ＹＣＢ２ＣｉｔｒｕｓＣａ２Ｏｈｍｓ＾Ｄ４９６２２２．１＾ＹＣＢｔｒｍｓｔＱＩ７？＾Ｃ＾ＹＣ３２ｔｘＣｉｒｘＥＳｊｓｎｅｎｓａＥ＾５１３＜Ｋ图３－１蜜袖ＬＹＣＢ所编码的氨基酸序列系统进化树注１．分支上的数值为１０００次建树中该位置出现的置信度值Ｆ－１Ｐｉｌｉｄ化ｔｆｉｇ．３ｈｙｌｏｇｅｎｅｔｃａｎａｙｓｉｓｏｆｄｅｄｕｃｅｄａｍｉ打〇ａｃｑｕｅｎｃｅｓｏｆＬＹＣＢｉｓｏｌａｅｄｒｏｍＣｉｔｒｕｓ．Ｎｏｔｅ１．ＢｏｏｔｓｔｒａｐｐｉｎｇｗａｓｄｏｎｅｂｙＫｓａｍｐｌｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｄａｔａ１０００ｔｉｍ巧．表３－１查袖所分巧的ＬＹＣ化基康序列比对－Ｆｉ．３１ＤｅｄｕｃｅｄａｍｕｅｎｃｅＣＢｓｉｓｌａｔｅｄｆｒｏｍｕｍｍｅｌｏｇｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｓｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＬＹｏｐ位置ＲＬＹＣＢｌＲＬＹＣＢ２ＲＬＹＣＢ３ＢＬＹＣＢｌＢＬＹＣＢ２ＢＬＹＣＢ３５８ＳＳ民ＳＳＳ１０７ＧＧＧＥＥＥ２３１ＱＱＱＱ民Ｑ２５２ＱＱＱＥＥＥ２５７ＩＬＬＬＬＬ２７５ＱＱＱＥＥＥ２７７ＫＫＫＫＴＫ３０１ＥＥＥ丘ＥＧＶＥＥＥＥＥ３８６ＶＩＶＩＩＩ＇３９５ＳＳＳＳＳＱ４１８民民ＲＲＳ民４巧ＬＳＬＬＬＬ４６７ＦＦＦＩＩＦ１４ 第兰章类胡萝ｈ素代谢相关基因的互作分析、２．２类胡萝素代谢相关基因的互作结果Ｉ类胡萝ｈ素代谢相关的主要酶（ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、ＺＩＳＯ、ＬＹＣＢ与ＬＹＣＥ）分别构建至酵母双杂载体ｐＧＡＤＴ７（ＡＤ）与ｐＧＢＫＴ７（ＢＤ）后将质粒共转至酵母菌ＧｏｌｄＹ２Ｈ。将其涂布至含Ａｍｐａｎａ－－－Ａｄ－陆Ｓ）、ＫＷ及ＡｂＡ抗生素的四缺（ＳＤ／ＴｒｐＬｅｕｅ平板中，＂７－Ｌａｍ作为阴性对照－２ＷｐＧＢＫＴ，畑ＫＴ７５３作为阳性对照，倒置８Ｃ培养箱培养Ｐ，３ｄ后观察其生长状况。一类胡萝ｈ素代谢过程中控制类胡萝ｈ素合成的主要的六个酶，ＰＳＹ与ＬＹＣＥ这对蛋白未能成功转化至酵母菌，因此未知其互作情况。Ｗ而ＰＳＹ能够与ＰＤＳ、ＺＤＳ与一ＬＹＣＢ运Ｈ－个酶发生相互作用，在缺陷型培养基中生长出；而ＰＳＹＺＩＳＯ这对成功转ＰＳＹ至酵母菌后却未能在四缺的培养基中生长，因此没有相互作用。ＰＤＳ能够与、ＺＤＳ、ＺＩＳＯ、ＬＹＣＢ及ＬＹＣＥ这五个酶发生相互作用，因此ＰＤＳ与类胡萝ｈ素代谢过程中主要的几个关键酶都有互作。ＺＤＳ与ＰＤＳ类似，同样能够与ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＩＳＯ、ＬＹＣＢ与ＬＹＣＥ这五个酶都发生相互作用。与其他几个酶不同，ＺＩＳＯ只能与ＰＤＳＷ及ＺＤＳ一两个脱氨酶具有相互作巧，与ＰＳＹ这合成酶、ＬＹＣＢ及ＬＹＣＥ这两个环化酶之间则均无相互作用。ＬＹＣＢ则能够与ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳＷ及ＬＹＣＥ这四个酶有相互作用，ＬＹＣＥ与ＬＹＣＢ类似，同样能够与ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳＷ及ＬＹＣＢ这四个酶互作。结果３－３具体见图。圓國ＭＭ、图３－３Ｙ２Ｈ分析类胡萝Ｉ素代谢过程中关键酶乏间的相互作用－－．：ｍｅｓｗｈ巧ｇ３３ｒｏｔｅｉｎｒｏｔｅｉｎｉｎ化Ｆａｃｔｉｏｎａｎａｌｓｉｓｏｆｅｎｚｉｃｈｃａｔａｌｚｅｃａｒｏｔｅｎｉｏｄｂｉｏｓｎ化ｅｓｉｓｐｐｙｙｙｙ１５ 第Ｈ章类胡萝素代谢相关基因的互作分析３．讨论真核生物转录激活因子通常由ＡＤ与ＢＤ这两部分结构域组成，其中ＡＤ为转录激。活域，，功能也当ＡＤ与ＢＤ，ＢＤ为ＤＮＡ结合域两部分结构可Ｗ分开是相互独立重新组合成转录因子时，能够启动下游报道基因的转录表达。酵母双杂交技术正是基一于这原理而形成。我们在实验过程中所选择的酵母菌菌株为酿酒酵母ＧｏｌｄＹ２Ｈ，它－Ｃ含有ＷＷ、好做，＾脂封及施王７这四个报道基因。其中所编码的肌醇磯酸神经廝胺合成酶得Ｗ表达后能够增强酿酒酵母对ＡｂＡ的抗性；好拟５能够合成组氨－－半乳糖脊酶－ａａｌ乂则能够合成腺嘿岭Ｍ妨Ｊ编码的ａ，能够在含有ＸＧ的酸，；而培养基中显蓝色。因此，ＢＤ融合的诱巧蛋白与ＡＤ融合的靴蛋白之间有相互作用时，－ａ－Ｇａ能够在无组氨酸、无腺嘿岭的缺陷型培养基中生长，并且含有ＡｂＡ抗性，加入Ｘｌ后能够发生显色反应。由于ｐＧＢＫＴ７巧０）载体本身含有色氨酸编码基因，ｐＧＡＤＴ７、ＡＤ载体含有亮氨酸编码基因，因此与ＢＤ融合的蛋白分别的能够在不含色氨酸与亮氨酸的缺陷型培养基中生长。但是在做双杂么间需要注意的是，应对蛋白自身是否具有激活作用进行检测。酵母菌的转化主要有ＰＥＧ／ＬｉＡＣ化学转化方法与电转化，我们在本次实验过程中一所选择的是ＰＥＧ／ＬｉＡＣ转化方法。在转化过程中所使用的鱼精ＤＮＡ，方面可Ｗ提高一３８３９［，１。转化率，另方面可Ｗ保护目的ＤＮＡ，避免其降解在使用鱼精ＤＮＡ之前应将其在沸水浴中沸腾十分钟，再置于冰中备用。此外，在转化过程中所使用的ＰＥＧ／ＬｉＡＣ应现配现用，否则将引起转化率的降低，甚至转化失败。ＰＣＲ一与大肠杆茵Ｗ及农杆菌不同，在做酵母菌的验证时应注意破壁这过程。若单菌落新鲜，可选择直接ＰＣＲ；若单菌落不新鲜，必须进行破壁。破壁的方法很多，可Ｗ选择用酶处理，也可进行沸水浴。但是多次实验结果表明，不管选择哪种破壁方法，效果并没有挑选新鲜的单菌落直接做ＰＣＲ佳。ＰＳＹ、阳Ｓ、ＺＤＳ、幻ＳＯ、ＬＹＣＢ与ＬＹＣＥ是调控类胡萝ｈ素代谢过程中主要的六个酶。其中ＰＳＹ作为类葫萝ｈ素积累合成的限速酶，主要负责催化两分子ＧＧＰＰ合成一。个八氨番茄红素，八氨番茄红素无色ＰＤＳ与ＺＤＳ是类胡萝ｈ素代谢过程中的两种脱氨酶。其中ＰＤＳ主要是催化八氨番茄红素生成胡萝ｈ素，胡萝ｈ素呈现粉色；－而ＺＤＳ催化胡萝ｈ素生成番茄红素；ＬＹＣＢ（，番茄红素则是显深红色与ＬＹＣＥ是类。２ＬＹＣＢ胡萝ｈ素代谢过程中的两种环化酶番茄红素的下游产物能够形成个分支，１６ 第Ｈ章类巧萝ｈ素代谢相关基因的互作分析－能够催化番茄红素生成－胡萝ｈ素而ＬＹＣＥ能够催化番茄红素生成Ｓ，显澄色Ｐ；胡萝ｈ’’’一－－－１：素，显黄色。ＺＩＳＯ作为异构酶之９１５９９：，能够将三顺式胡萝ｈ素转变为９顺式－胡萝Ｋ对红肉蜜抽与语溪蜜抽两种蜜袖果实中分窝出上述几个酶的基因后对它（们进行序列分析，结果发现这六个酶在红肉蜜抽与语溪蜜袖之间并没有太大的差异，特别是在功能结构域部分，基本无差。因此在进行酵母双杂交实验过程时，并没有进行红肉蜜袖与溝溪蜜袖之间的区别－。这六个酶相互之间所组成的几对诱巧蛋白祀蛋白ＣＰＳＹＣＬＹＣＥ这一之间，除了ｇ与ｇ对蛋白未能成功转化至酵母菌之外，其余几对之间均有不同的相互作用。特别是ＣｇＰＳＹ、ＣｇＰＤＳ、ＣｇＺＤＳ、ＣｇＬＹＣＢ与ＣｇＬＹＣＥ之间，一一都能发生互作，这与前期实验室使用ＢｉＦＣ逸方法所观察到的实验结果致。而ＣＺ一ＩＳＯ这ｇ异构酶，之前并未进行ＢｉＦＣ巧光显微观察，但是在我们这次实验过程中发现它仅与ＣｇＰＤＳ、ＣｇＺＤＳ这两个脱氨酶有相互作用。１７ 第四章Ｃ知？的功能初探真核生物中，２化泛素蛋白酶体途径是己知的主要的蛋白质降解途径，通过对、功能蛋白的调节及异常蛋白的降解，Ｗ调节多种细胞生命过程，例如信号转导ＷＷ细胞分裂与分化Ｗ及胁迫反应等。２６Ｓ泛素蛋白酶体特异性降解蛋白质的过趕一具体主要涉及下几个过程：首先，ＡＴＰ提供能量，泛素激活酶Ｅ１激活泛素；其－次，泛素与泛素结合酶Ｅ２的活性位点半脱氨酸（Ｃｙｓ）相连接，形成Ｅ２泛素复合物；最后，泛素蛋白连接酶Ｅ３识别靴蛋白后，Ｗ直接或者间接的方式将泛素从Ｅ２中转移至靴蛋白一２能，待靴蛋白的泛素化达到定程度时即转运至蛋白酶体进行降４３心］解。在泛素介导的选择性蛋白降解过程中，由于Ｅ３连接酶主要起识别作用，４４］［因此在整个过程中至关重要，决定了反应的特异性。目前所发现的Ｅ３连接酶主要有ＨＥＣＴ结构域家族－、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ结构域家族Ｗ及Ｕｂｏｘ结构域家族这三大类。一其中ＲＩＮＧｆｍｇｅｒ结构域家族为蛋白大家族，其环指结构是其具有Ｅ３连接酶功能２＋的重要结构域，并根据ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ蛋白中Ｚｎ结合残基Ｃｙｓ与Ｈｉｓ的数量与位置，－－ＲＩＮＧＨＣ－－－－－分为、ＲＩＮＧＨ２、ＲＩＮＧＶ、ＲＩＮＧＣ２、ＲＩＮＧＤ、ＲＩＮＧＳ／Ｔ、ＲＩＮＧＧ、４ｗ－＾－［］ＲＩＮＧｌＨ２和ＲＩＮＧｍＨＣ９大亚类。ＲＩＮＧｆｍｇｅ＾结构域家族在植物中除了作为Ｅ３连接酶参与２化泛素蛋白酶体降解途径之外，对植物气孔开放、植物耐旱性４＾Ｗ及植物种子活性等生理方面均具有重要作用［气实验室前期对红肉蜜抽与语溪蜜抽成熟果实汁胞进行基因芯片分析，结果发现好２巧ｎｇｅｒ（Ｃｇｉ？片Ｆ）基因在红肉蜜袖果实汁胞中的表达丰度显著高于招溪蜜抽。一分析发现该基因在两种蜜抽中序列完全致。ＰＣＲ分析发现在ＤＡＦ１６５与ＤＡＨＷ期，ｑＣ好Ｆ１３姆在红肉蜜袖中的表达显著商于语溪蜜抽，而ＤＡＦ５时期则显著低于猜溪蜜袖２６［］５。此外，随着果实的成熟，每的表达不断上升并在ＤＡＦ１９期达到最高。Ｃｇｉ組Ｆ在红肉蜜抽与巧溪蜜抽表法丰度上的差异，可能与红肉蜜抽番茄红素的大量积累密切相关。因此分离该基因部分序列（Ｃｇ化战ＷＶＣ公），利用ＶＩＧＳ技术初步探讨该基因与类葫萝ｈ素代谢的关系。１８ 第四章的功能初探１．材料与方法１．１植物材科０天左右Ｍｒｏ－Ｔｏｍ本部分实验所用植物材料为实验室所培养的盛花后４番茄果实ｉｃ（Ｓｏｌａｒｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）１２．质粒与菌株ｐＴＲＶｌ与ｐＴＲＶ２的质粒，大豚杆菌菌株ＴＧ１与农根癌农杆菌菌株ＧＶ３１０１。１．３试剂与仪器ＴａＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓＭｉｘ、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ等ｑ购自ＴａｋａＲａ公司（大连），其余常规试剂购自金华医药公司。－标准样品Ｐ锅萝ｈ素购自美国Ｓｉｇｍａ公司，番茄红素购自北京绿百草科技发展有限公司；叶黄素购自中国标准中也；色谱级ＭＴＢＥ购自成都格雷西亚化学技术有限公司；其余常规试剂购自金华医药，其中液相所需试剂要求色谱级别。ＨＰＬＣ所使用的仪器为Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０型高效液相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ紫外检测器（Ｇ１３１６Ａ）自美国Ａｉｌｅｎｔ，购ｇ公司。－１．４ＣｇＫＩｆＦＮＣＤ的分离根据所分离的Ｃｇｉ？好Ｆ序列设计引物。其中上游引物巧列为：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＣＴＡＧＴＡＴＧＣ（ＢａｍＨＩ）下游引物序列为：；ＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＴＴＧＡＴＴＧ（Ｘ／ｗｌＩ）。引物合成由上海英駿生物技术有限公司完成。１．５每化的ＶＩＧＳ沉默载体构建／／Ｆ－ＷＣ公经限制性内切酶（度ａｗＨＩ分离成功的Ｃ如、ＸＡｏｌＩ）酶切后回收纯化，构Ｓ沉ＧＶ１０１ＰＣＲ建至ＶＩＧ默载体ｐＴＲＶ２，先后转至ＴＧ１与３，验证及酶切验证后进行菌种保存。１６．农杆菌侵染ＶＩＧＳ基因沉默的农杆菌侵染过程与么前ＢｉＦＣ的实验过程较为类似，主要是参照王长春的博±毕业论文并略为改变。具体过程如下：首先将活化好的农杆茜接种至１９ 第四章Ｃｇｊｇ／ｆＦ的功能初探‘Ｃ－液体培养基ＹＦＰ中，２８、２０化条件下培养２４％小时农杆菌菌液；其次将培养好的Ｅ’与Ｙｂｉ按照１：５０的比例扩大培养，直至ＯＤ６００达到０．５左右，４Ｃ、４０００ｒ条件下离也’１０去上清ＭＭＡｉ进４ＯＤ２５Ｃ、分钟；，对所收集的茜液使用行重悬，使农杆菌细胞至６００，￣－６０ｒ条２小时ＣＲＨＦ－ＮＣＤＲＶ２的菌液与ＴＲＶ件下恢复培养１；最后将含ｇｐＴ１菌液按：１混合后ＴＲＶ照１作为实验组，１菌液自身作为阴性对照，采用针筒浸润的方法注射盛２口］花后４０天左右的番茄果实进行实验。１．７沉默果实的ＨＰＬＣ分析５３］ｕ［ＣＪ：液相条件与样品制备的方法主要参照Ｘ等，具体如下液相条件：类胡萝ｈ素的ＨＰＬＣ分析所使用的色谱柱为ＹＭＣＣｓｏ，其规格为ｘ４，．６ｍｍ２５０ｍｍ直径为５ｌｍ。ＨＰＬＣＡ液为，柱子＾分析过程使用的流动相主要有Ｈ种纯甲醇、Ｂ液为含０．２％己酸钱的８０％甲醇溶液化及Ｃ液为ＭＴＢＥ溶液，Ｓ种流动相６０ｍ－的混合溶液进行浓度梯度洗脱。每个样品的洗脱过程大约ｉｎ，其中０６ｉｎｉｔｉ由９５％Ａ溶液与５％Ｂ溶液组成，至７ｍｉｎ时梯度改变为８０％Ａ溶液、５％Ｂ溶液化及１５％Ｃ溶液组成，１２ｎ＾ｉｎ起至３２ｍｉｎ梯度改变为３０％Ａ溶液、５％Ｂ溶液Ｗ及６５％Ｃ溶液，４８ｍｉｎ起至５０ｍｉｎ梯度恢复为％％Ａ溶液与５％Ｂ溶液，维持该浓度至液相结束。ＨＰＬＣ分析°过程中的流速为１１１１１／１１山１２５（：２０ｌＬ４５〇１？。，柱温维持于，样品的进样量＾，检测波长Ｈ次实验。每个样品重复，结果使用Ｏｒｉｇｉｎ７．０软件作图；左右液氮环境下研磨后的果肉粉末置于２ｍｌ离也管样品制备称取化２ｍｇ，分别混匀？加入甲醇：氯仿：水０：２：１）溶液后进巧充分ｌＯＯＯＯｉ，条件下离也ｌＯｍｉｎ，收集氯仿层；多次进行氯仿层收集后将氯仿层溶液进行抽真空离也机蒸干；蒸干后在离必管中加入适量的乙酸溶液，溶解后加入与上述甲醇等量的６％ＫＯＨ轿液（甲醇溶），在６（ＴＣ条件下进行皂化反应约３０ｍｉｎ：皂化结束室温冷却后加入氯仿：水（２：１）的混合’－－２次抽提２０Ｃ保存。液进行１；经抽提后获得的氯仿层经过抽真空离也机蒸干后在ＨＰＬＣ液相分析样品前，对蒸干后的色素中加入适量乙酸艺酷溶液，待完全溶解后．２２ｉｍ，用０＾尼龙过滤膜对溶液进行过滤，滤液取２〇１１１＾作为样品进样。２０ 第四章Ｃｇ／？／／Ｆ的功能初探２．结果与分析．２．１标准曲线的建立－２精密称取叶黄素、番茄红素与Ｐ胡萝ｈ素标准样品各．０ｍｇ，溶于２ｍｌ云酸乙醋，配制成Ｉｍ／ｍｌ。对母液进行稀释，分别配制成２００ｘ／ｉｎｌ，１０〇／ｍｌｇ母液并避光冷藏，｜ｇｎｇ－５０ｉ／ｍｌ５ｌ／ｍｌ五．６３ｆｇ，＾ｇ个浓度的标准溶液。按照１节的色谱条件测定胡萝ｈ（１（Ｃ／ｍ素与番茄红素的峰面积。＾质量浓度，４ｇｌ）作为横坐标，峰面积（Ａ）作为纵坐一＝２－＝．标，作峰面积关于浓度的标准曲线。获得叶黄素线性方程为Ａ４３．９６Ｃ３７．２８Ｒ０９９９，；２－＝－＝红素的线性方程为Ｐ胡萝ｈ素线性方程为Ａ２２．１５Ｃ２．９１１，民０．９９９；番茄２＝－＝－Ａ１２８１．．５Ｃ３８．８，民０９９９、，说明叶黄素Ｐ胡萝ｈ素与番茄红素的浓度及其峰面积间均具有较好的线性关系。２．２沉默果实的ＶＩＧＳ表型分析一＾对番茄果实进行Ｃ如掛ＷＶＣＤ的沉默处理，结果发现，周后Ｃｇ化班沉默果实与阴性对照相比－１）。，番茄呈现澄色（图４ＬｍＪ４－图１沉默番茄表型Ｆ－－．４１ｉｉｏｌｏｆＣＲＨＦｌｅｎｃｅｄｉｉＴｉｇＰｈｅｙｐｅｓｇｓｉｎＭｃｒｏｏｍ２．３沉默果实的ＨＰＬＣ分析一经ＨＰＬＣ分析／／－，Ｃ姊Ｆ沉默周左右果实的叶黄素、ｐ胡萝ｈ素与番茄红素的含－量与ＣＫ相比，均有所下降，特别是番茄红素（表４１），存在极显著差异。由于只对番茄红素－、Ｐ胡萝ｈ素与叶黄素的标准品进行分析，因此果实中其他成分并未能进行确认。２１ 第四章Ｃ知？ＫＦ的功能初探－＾、４１Ｃ沉默７ｄ后果实与ＣＫ类胡萝／．表ｇ及战Ｉ素含量（帖ｇＦＷ）．Ｔａｂ－ｌｅ４１ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｒｕｉｔｓｔｈａｔｓｉｌｅｎｃｅｄＣ＾ＲＨＦｅｎｅｇ色素ＴＲＶＣｇＲＨＦ＊叶黄素１７．５２±０．２９１１．９６±１．２７＊－±０±２Ｐ明萝ｈ素３６．４５．１１１９．０８．７９＂番茄组素１１４．６９±１．５１８±０．６３．６６■／：Ｃ巧，番茄红素在番茄果实中的含量与阴性对照相比均具有极盈著羞异注骑沉默后；其中叶黄素与－胡萝＇ＰＩ素在番茄果实中的含量具有显著差异Ｎｏｔｅ：ｃｏｍａｒｅｄＷ她ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｌｃｏｅｎｅｃｏｎｔｅｎｔｈａｄａｓｉｎｉｆｉｃａｎｔ出ｆｅｒｅｎｃｅａｎｄ山ｔｅｉｎａｎｄｐｇ，ｙｐｇ－ｔｃｏｔｔｓｈａｄ－ｃａｒｏｅｎｅｎｅｎａｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎＣＨＦｓｉｌｅｎｃｅｄＭｉｃｒｏＴｏｍ｛Ｓｏｌａｒｉｕｍｌｃｏｅｒｓｉｃｕｍａｎｄ）ＰｇＲｙｐｌｙｃｏｐｅｎｅ＊＊＊Ｐ＜０．０１；０．０ＫＰ＜０．０５５天左右时－沉默２，果实所含叶黄素、ｐ明萝ｈ素与番茄紅素与ＴＲＶ阴性＇－对照相比，置著降低。（表４２）。－、表４２Ｃ各ｉＷＦ沉获２５ｄ果实与ＣＫ中类胡萝Ｉ素的含量（ｎｇ／ｇ．ＦＷ）－－Ｔａｂｌｅ４２ｃａｒｏｔｅｎｏＴｏｍｉｎ２５ｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｏｆＣＫａｎｄＣｇＲＨＦｓｉｌｅｎｃｅｄＭｉｃｒｏｄａｙｓ．色素ＣｇＲＨＦ＂叶黄素５．２２±０．０９３．９７±０．２８＂－ｈ±±Ｐ胡萝素１８．７４０．８８９．７９０．６６＊＊番茄红素１３８．２６±０．９７１０．６８±１．４３＇＇－－注：Ｃ／巧Ｍ７Ｚ）沉默２５ｄ后，叶、胡萝骑黄素ｐ［素与番茄红素在番茄果实中的含量与阴性对照相比具有极显著差择。Ｎｏ－－－ｔｅ：ｗｈｅｎＣｇＲＨＦＮＣＤｗａｓｓｉｌｅｎｃｅｄ２５ｄａｓｉｎＭｉｃｒｏＴｏｍｌｕｔｅｉｎｃａｒｏｔｅｎｅａｎｄｌｃｏｅｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓｙ，，ＰｙｐｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＰ＜０．０１好Ｆ。综上所述，Ｃ蘇基因沉默后，番茄果实呈现澄色与正常果实相比，所含叶－１．５倍左右．８１３。黄素降低，Ｐ胡萝ｈ素降低１倍左右，而番茄红素则降低将近倍３．讨论ＶＩＧＳ技术是指利用携带植物功能基因ｃＤＮＡ的病毒载体侵染植物，引起植物发生Ｐ５］基因沉默，植物表型观察Ｗ及生理指标变化的检测来鉴定所沉默基因的功能。由于一其见效较快、成本较低、重复性较高且操作较为简便，因此是研究基因功能较好的种手段，而对番茄果实的ＶＩＧＳ基因沉默更是初步鉴定植物基因在果实发育方面功能一一Ｐｑ的种技术，番茄果实更是种较好的研究果实发育的模式植物。但是ＶＩＧＳ技术２２ 第四章ｑｇ／？／／Ｆ的功能初探的局限性也比较明显，例如针对不同的植物体，其病毒载体也不尽相同。注射ＴＲＶ自身作为阴性对照，Ｗ避免由病毒自身所引起的表型干扰。一由于ＶＩＧＳ基因沉默技术是ＰＴＧＳ机制的种，所Ｗ外源基因片段与植株自身基因片段同源性越高沉默效率越稳定。根据ＮＣ朗比对结果，发现从蜜袖中所分离出的基因与番茄所含的胃基因片段的相似度并非十分高，因此一？沉默效果并非十分稳定，只可作为种参考。对番茄沉默基因之后，？番茄红素－基因的沉默、Ｐ胡萝ｈ素与叶黄素的含量都下降。因此推测，－能够影响番茄红素合成上游基因的表达，导致番茄红素合成受抑制，引起下游产物Ｐ胡萝ｈ素与叶黄素的含量都相应减少－。由于只对番茄红素、Ｐ胡萝ｈ素Ｗ及叶黄素Ｈ种类胡萝ｈ素标准样品进行ＨＰＬＣ分析，因此只能确定这Ｈ种物质在沉默果实与阴性一对照之间的含量差异，其他中间产物却无法确定。因此，为进步确定化各ｅｒ－基因在果实发育过程中对类讲萝ｈ素代谢的影响，首先需要从番茄ＭｉｃｒｏＴｏｍ果实中分离该基因，并对实验结果进行确认；其次根据ＨＰＬＣ分析过程中回收得到的液体进行紫外分光光度计全波长扫描，确定类胡萝ｈ素成分后再进行标准品分析；最后对泛抑巧ｅｒ沉默番茄果实提取总ＲＮＡ，并分析类胡萝ｂ素代谢过程中各关键酶基因的表达丰度与阴性对照果实之间的差异。２３ 第五章ＲＨＦ与类胡萝、ＣＩ素代谢相关酶的互作分析ｇ一Ｒ一ＩＮＧｆｉｎｇｅｒ结构域家族作为Ｅ３连接酶主要成员之，方面，与２６Ｓ泛素蛋白一酶体途径相关，；另方面可能能够通过与其他蛋白质相互作用影响类胡萝ｈ素的合口４］ｎ成。Ｗｅｌｓｃｈ等在拟南巧中发现含有ＲＩＮＧｆｉｇｅｒ结构域的蛋白ＳＩＮＡＴ２（ＳＥＶＥＮＩＮＡＢＳＥＮＴＩＡＯＦＡＲＡＢＩＤ０ＰＳＩＳ２）能够与转录因子ＲＡＰ２．２互作，共同调控拟南芥类胡口５ｃａ－ＰａｓｃｕａｆｉｎｅｒｒＡ萝ｈ素的含量；Ｌｏｒｌ等堪真菌中发现含有ＲＩＮＧｇ结构域的蛋白质Ｃｇｐｑ能够抑制黑暗条件下类胡萝ｈ素的形成，而Ｓｉｌｖａ等更是认为ＣｒｇＡ可能是通过ＭＣＷＣ－化影响类胡萝ｈ素的形成。尽管植物与真菌中均有发现泛素连接酶ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ结构域家族蛋白能够影响类胡萝ｈ素的形成，但是，是否存在其他Ｅ３连接酶参与调控类胡萝ｈ素的生物合成与代谢尚未清楚。一一ｉＷＦＲＴ－结合实验室前期Ｃｇ的ｑＰＣＲ结果Ｗ及上章的ＶＩＧＳ结果可知，方面，一随着果实的成熟，Ｃ斜化Ｗ的表达不断上升并在ＤＡＦ巧５达到最高；另方面，沉默番ｅｒ－茄仍ｗｇ基因能够引起番茄红素、胡萝ｈ素与叶黄素含量的降低，番茄果Ｐ实呈澄色。。因此推测，基因的沉默能够影响类胡萝ｈ素的代谢途径本研究主要运用ＢｉＦＣ技术观察Ｃ约姐Ｆ与类胡萝ｈ素代谢相关基因的互作，说明ＣｇｉＷＦ在类明萝ｈ素代谢过程中的作用。１．材料与方法１．１植物材料－本次实验所用植物材料为实验室所培养的１５２０叶期的本氏烟（Ｍｃｏ说ｉｎａｂｅｒＵｈｃｉｍｉａｎ幻）钥庵。１．２质粒与菌株－－－ＬｅＣＩＰＫ８ｃＥＹＦＰ－ＧＶ３１０ｃＧＶ）、１（阳性对照）、ＬｅＣＢＬｌＥＹＦＰ３１０１（阳性对照－－ＣＥＹＦＰＧＶ３－－－－红肉蜜抽与巧溪蜜抽ＰＳＹ１０１、ＰＤＳｃＥＹＦＰＧＶ３１０１、ＺＤＳｃＥＹＦＰＧＶ３１０１、－－ＬＹＣＢｃＥＹＦＰ－ＧＶ３－－、１０１、ＬＹＣＥＣＥＹＦＰＧＶ３１０１与Ｐ１９菌液。ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ｎＥＹ巧－－ＣＲＨＦＳＵＲＥ－ＴＴＧｌ的质粒Ｗ及ＧＶ３１０１。ｇｐ根癌农杆菌感受态细胞１．３试剂与仪器２４ 第五章ＣｇＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢相关酶的互作分析ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓＭｘ、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ等购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司（大连），其余常规试剂购自金华医药公司。本实验所使用的激光共聚焦显微镜为ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５ＩＩ。１４ＷＦＪ的ＢｉＦＣ．待ｉ载体构建通过同源克隆法从蜜袖果实中分离出的Ｃ蛛／巧７经过相应的限制性内切酶（Ｓ知Ｉ－－证ＹＦＰ和公ａ／ｗＨＩ）酶切后，通过回收试剂盒纯化１３０１，构建至ＢｉＦＣ载体ｐＣＡＭＢＩＡ并转至ＧＶ３１０１。１．５农杆菌侵染与臥ＦＣ蒙光观察植物的ＢｉＦＣ互作观察主要包括菌种活化、菌液培养、菌液重悬、农杆菌侵染Ｗ及巧光显微镜观察等过程。具体如下：对要进行ＢｉＦＣ巧光观察的菌种划板至培养基，放°°置２８Ｃ培养箱培养３ｄ左右，进行活化；挑选健康的单菌落，接种至ＹＦＰ培养基，２８Ｃ、２００ｒ２４－３６ｈ过夜的农杆菌菌液用ＹＥＢ＂Ｋ条件下培养；培养ｉ（ＹＥＢ中加入１００ｍｇａｎａ、－－－－０ｍ．ｉ．，ｅｎｄａｍｏ．ｉ．ｉ５ｇＬＲｉｆ、４０ｍｇＬＧ、ｌｌＬＭＳ〇４与ｌＯｉｍｎｏｌＬＭＥＳ）按１：５０扩大培ｇ’￣ＭＭＡ０８Ｃ４０００ｒ１０ｉ比；养至０〇６〇〇为０．６．左右，４、条件下离也分钟；去上清，用（－ｉＭＥＳ．Ｍｓ盐５Ｉ．９５２〇５．６２〇ｍｏｌＬ乙醜Ｔ香醜ｇ，ｇ，薦糖ｇ，调妍至，并加入ｎ）重悬‘＇至４ＯＤ？化６００并在２５Ｃ、６０ｒ条１Ｃ册件下恢复培养；最后将含如的Ｎ盒菌、含类胡萝ｈ素代谢相关基因的Ｃ盒菌Ｗ及Ｐ１９（１：１：１）混合后采用针筒浸润的方法注射本氏’烟叶片Ｃ－５ｄ，农杆菌侵染结束。将本氏烟植株置于２８培养箱培养３后剪取叶片注射区制作临时装片，进行焚光观察。２．结果与分析２．１２饼＾ＢｉＦＣ＜：知的载体构建将构建至ＢｉＦＣ载体的重组质粒经过ＰＣＲ与酶切两种方式验证后保存菌种，转至’ＧＶ３－１０１后再次进行ＰＣＲ及８０Ｃ。酶切验证，经过验证的菌种冻存至２、．２ＣＲＨＦ与註肉蜜袖类胡萝ｇＩ素代谢相关蛋白的互作一５７５８［，ＣＢＬ蛋白１家族为类独特的巧传感蛋白，能够与激酶ＣＩＰＫｓ发生相互作用，一－－因此在实验过程中Ｓ－ＥＹＦＰ－３ＬｌＣ３ＷＬｅＣＩＰＫＣＧＶ１０１与ＬｅＣＢＥＹＦＰＧＶ１０１这组合作为阳性对照。对红肉蜜抽类胡萝ｈ素代谢关键酶之间组成的６对组合各进行３次重２５ 第五章ＣｇＲＨＦ与类胡萝素代谢相关酶的互作分析－复实验，结果如表４１。其中在红肉蜜抽中，ＣｇＲＨＦ与ＰＳＹ、ＰＤＳ之间的互作较弱，ＣｇＲＨＦ与ＺＤＳＬＹＣＢ之间没有相互作用，而与ＺＤＳ和ＬＹＣＥ的相互作用较强（ｉ加与图－５１）。、表５－１ＣｇＲＨＦ与紅肉蜜抽类胡萝Ｉ素代谢相关蛋白的互作关系Ｔ－－ａｂｌｅ５１ＩｎｔｅｒａｃｔｏｎｂｅｗｅｅｎＲＨＦａｏｉｎｌｒｏｅｎｏｄｍｅａｂｏｌｉｉｆｌｅｓｈｅｄｉｓｔＣｇｎｄｐｒｔｅｓｒｅａｔｅｄｔｏｃａｔｉｔｓｍｎｒｅｄｐｕｍｍｅｌｏ编号Ｎ盒菌Ｃ盒菌互作ＡＣＰＳＹ－ｃＥＹＦＰ－ＧＶ３１０１弱ｇＢＣＰＤＳ－ＣＥＹＦＰ－ＧＶ３１０１弱ｇＣＣ－ＣＥＹＦＰ－ＧＶ３１０ｇＺＤＳｉ５ｋｂ１无ＣＲＨＦ－ｎＥＹＦＰ－ＧＶ３ｇ１０１ＤＣ－－ｇＺＤＳＣＥＹＦＰＧＶ３１０１互作巨ＣＹＣＢ－沈ＹＦＰ－ＧＶ３ｇＬ１０１无－ＦＣＬＹＣＥＣＥＹＦＰ－ＧＶ３ｇ１０１互作ｍｍｍ■Ｈｉ■■■２６ 第五章ＣｇＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢相关酶的互作分析ｒ，—齒—．＾■■■、图５－ＵＣＲＨＦ与红巧蜜抽类胡萝ｇ１素代谢相关蛋白的互作现察＊－Ｆ．５１Ｉｎ化ｆａｃｉｉｇｔｉｏｎｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎＣ民ＨＦａｎｄｒｏｔｅｉｎｓｉｅｌａｔｅｄ化ｃａｒｏ化ｎｏｉｄｍｅ巧ｂｏｌｉｓｍｎｇｐｒ－ｆｅｄｌｅｓｈｅｄｕｍｍｅｌｏｐ左：：暗视巧：明、暗视巧的组合：中：右明视野Ｌｅｆｔ：ｏｖｅｒｌａｐ；Ｍｉｄｄｌｅ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄａｒｋｆｉｅｌｄ；民ｉｇｈｔ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｌｉｇｈｔｆｉｅｌｄ２、．３ＣＲＨＦｌ与宿溪蜜袖类胡萝轰代谢相关蛋白的互作ｇＩＬｅＣ－ｃＥＹＦＰ－ｅ－－同样ＷＩＰＫ８ＧＶ３１０１与ＬＣＢＬｌ祀ＹＦＰＧＶ３１０１作为阳性对照，对巧５３－２溪蜜抽的对组合进行次重复实验，结果如表４。其中在洁溪蜜抽中，ＣｇＲＨＦｌ与ＰＳＹ、ＺＤＳ之间的相互作用比较弱，与ＰＤＳ之间没有相互作用，而与ＬＹＣＢ和ＬＹＣＥ的相互作用较强（图２）。、表５－２ＲＨＦ与巧溪蜜袖类胡萝ＣｇＩ素代谢相关蛋白的互作关系Ｔ－ｗｅｅｎａｂＩｎｒａｃｎａｎｄｎｏｌｅ５２化ｔｉｏｓｂｅｔＣｇＲＨＦｒｏ化ｉｓｒｅｌａｔｅｄ化ｃａｒ化ｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｕａｎｘｉｕｍｍｅｌｏｐｇｐ编号Ｎ盒菌Ｃ盒菌互作结果’ＡＣＰＳＹ－ｃＥＹＦＰ－ＧＶ３１０１弱ｇＢＣＤＳ－ＣＥＹＦＰ－ＧＶ３ｇＰ１０１无ＣＣＲＨＦ－－－－ｇｎＥＹＦＰＧＶ３１０１ＣｇＺＤＳｃＥＹＦＰＧＶ３１０１无或弱ＤＣＬＹＣＢ－ＣＥＹＦＰ－ＧＶ３１０１互作ｇＥＣＬＹＣＥ－－ＣＥＹＦＰＧＶ３１０１互作ｇ■２７、 第五章ＣＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢相关酶的互作分析ｇ￣一—－ＰＨＩ■■＇＇！＾（Ａ）ｒ．％ｒ￥３ｉ■——■■？，ｎ、图５－２ＣＲＨＦ与巧溪蜜袖类胡萝Ｉ素代谢相关蛋白的互作观察ｇ－２ｗｅｅ打ｌＦｉ．５ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｅｔＣＲＨＦａｎｄｒｏｔｅｉｎｓｒｅａ化ｄｔｏｃａｒｏ化ｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｕａｎｘｉｇｇｐｇｕｍｍｅｌｏｐ左：：：明、暗视野的组合；中暗视野：若明视野Ｌｅ行：ｏｖｅｒｌａｐ；Ｍｉｄｄｌｅ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄａｒｋｆｉｅｌｄ；Ｒｉｇｈｔ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｌｉｇｈｔｆｉｅｌｄ因此，ＣｇＲＨＦ能够与类胡萝ｈ素代谢过程中的ＰＳＹ、ＺＤＳ和ＬＹＣＥ真有不同程度的相互作用。对于ＰＤＳ，在红肉蜜抽中具有较弱的相互作用，而巧溪蜜抽中则未发现ＬＹＣＢ，相互作用，则相反在红肉蜜抽中未发现相互作用，而巧溪蜜抽中则具有；对于相互作用。３．讨论ＢｉＦＣ技术主要是将巧光蛋白分子分割成不能发出巧光的Ｎ端与Ｃ端两个独立的部２８ 第五章ＣｇＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢相关酶的互作分析ｔＷ分，这两部分各自均与靴蛋白相连接。我们在本次实验过程中所使用的巧光分子为黄色巧光蛋白ＹＦＰ，将ＹＦＰ分割成Ｎ端与Ｃ端两个部分后，将Ｃ端部分与类胡萝ｈ素代谢相关的几个酶相连接，Ｎ端部分与Ｃｇｉ？好Ｆ相连接。当Ｃ抑好Ｆ与酶之间发生相互作用时，Ｃ端与Ｎ端能够拉近空间距离，重新组合成完整的ＹＦＰ分子，发出黄色巧义邸＇与酶之间没有相互作用，光，那么完整的ＹＦＰ无法形成也就无法发出；若当Ｃｇ黄色炎光。无论是红肉蜜袖还是靖溪蜜袖，ＣｇＲＨＦ均能够与ＰＳＹ、ＺＤＳ和ＬＹＣＥ这四ＰＤＳ这一ＣＲＨＦ具有种酶发生不同程度的相互作用。对于脱氨酶，在红肉蜜抽中与ｇ较弱的相互作用，洁溪蜜袖中则未发现相互作用；而ＬＹＣＢ则与ＰＤＳ的互作情况相反，一，在红肉蜜抽中没有发现互作，洁溪蜜抽中有相互作用说明Ｃ如／／Ｆ这基因或许能够ｗｔｉ调节蜜抽的类胡萝ｈ素代谢过程。此外Ｗｅｌｓｃｈ等发现包含ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ结构域的ＳＩＮＡＴ２能够与转录因子ＡｔＲＡＰ２．２共同调控拟南芥类朗萝ｈ素含量，前期实验室对Ｃ－ＰＣＲ实验沙片Ｆ进行ｑＲＴ，结果发现在蜜袖果实的发育过程中，其表达丰度随着蜜抽果实的成熟而不断上升，并于ＤＡＦ１％达到最高值。这说明Ｃｇ化ＨＦ与果实成熟过程中一色素的积累有定关系－。对Ｃ如ｉＷ进行沉默后，番茄果实呈澄色，且番茄红素、Ｐ胡萝ｈ素与叶黄素等类胡萝ｈ素的含量急剧下降，更是说明该基因与类胡萝ｈ素代谢之间的相关性。结合这Ｈ个实验的结果，推测所分离的Ｃ钟好ｆ能够影响植物的类胡萝ｈ素代谢。ＢｉＦＣ过程渉及蛋白质编码，因此在构建之前，对Ｃ知？片Ｆ基因序列前添加适合的酶切位点Ｗ确保蛋白质翻译过程不会发生移码。此外利用ＹＬＯＣｈ－（ｔｔｐ：＂ｆｕ纯ｉｎｅｉ／ｃ沈ｉ．ｉｎ．ｕｎｉｔｇｅｎ．ｄ／Ｓｅｒｖｃｅｓ／ＹＬｏｃｗｅｂｌｏｃｘｇｉ）在线预测软件得知ＣｇＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢过程中几个关键曠均定位于叶绿体，而保卫细胞所含叶绿体较集中且在无ＤＡＰＩ染核、无紫外的条ｆＦ较易得Ｗ观察，因此在对ＣｇＲＨＦ的ＢｉＦＣ观察主要是对保卫细胞中叶绿体的观察。ＣｇＲＨＦ与类胡萝ｈ素代谢过程中多个关键酶均具有相互作用一。，表明其与蜜袖类胡萝ｈ素的代谢具有定的关系２９ 第六章幻：肉蜜袖卢巧０的分离及功能初探一细胞色素Ｐ４５０亚铁血红素－（ＣＹＰ４５０）是硫醇盐结合蛋白组成的超大家族。作一为，是高等植物最大的酶蛋白家族种含血红素的单加氧酶，其名称来源于还原性５９ＣＹＰ４［］５０与Ｃ０结合后在４５０ｎｍ波长处具有最大吸收峰。ＣＹＰ４５０在植物中能够参与６０６１［，１包括赤霉素、脱落酸、类胡萝ｈ素等多种荫类物质的生物合成。例如ＣＹＰ５ＫＣＹＰ７４、ＣＹＰ９７、ＣＹＰ７１０、ＣＹＰ７１７、ＣＹＰ７２７等家族参与脂质、酱醇Ｗ及类胡萝ｈ素等物质生物代谢与信号转导等过程ＣＹＰ８５家族参与略类物质生物合成、ＣＹＰ８６家族参与脂肪；６２６３＾，］］酸代谢等［此外ＣＹＰ４５０［；，在植物体中具有抗虫性，涉及药物代谢，能够将农药等外源性物质变成非毒性产物；最近也有研究表明，ＣＹＰ４５０与植物的向地性信号传导６５［１有关系。ＣＹＰ９７家族只存在与植物中，而参与类胡萝ｈ素的代谢过程Ｗ及信号转导过程的主要为ＣＹＰ９７Ａ、ＣＹＰ９７ＢＷ及ＣＹＰ９７Ｃ这Ｈ个亚家族。类胡萝ｈ素的代谢过程主要可分为胡萝ｈ素与叶黄素这两部分，ＣＨＹ起重要作ＣＨＹ其中叶黄素代谢过程中，用，而主要能分为ＢＣＨ与ＣＹＰ９７两个家族岡。所ＣＹＰ９７家族主要影响的是叶黄素代谢送一部分，即番茄红素下游过程。６７［］植物细胞色素Ｐ４５０的ＣＹＰ９７家族在类祸萝ｈ素代谢过程中主要起环径化作用。－－ＣＹＰ９７Ａ３ＣＹＰＣ－其中与１能够对（Ｘ胡萝ｈ素的Ｓ环与ａ胡萝ｈ素及Ｐ胡萝ｈ素的环进Ｐ６８６９，ｌ－ｔ行鞋基化，而ＣＹＰ９７Ｂ３也能对ａ胡萝ｈ素进行修饰。若是对巧南芥ＣＹＰ９７Ａ３、ＣＹＰ９７Ｂ３Ｗ及ＣＹＰＣ１逸几个胡萝ｈ素环化酶进行超表达，结果能够积累类胡萝ｈ素６９［］。ＣＹＰ９７家族对类胡萝ｈ素的环径化作用能够将维生素Ａ原的胡萝ｈ素转变为叶黄６［＾素，因此Ｐ４５０对植物的类胡萝ｈ素代谢过程具有重要影响。一实验室前期进行基因芯片分析，发现戶知０这基因在红肉蜜抽果实汁胞中的表达丰度显著高于洁溪蜜抽，因此对纪肉蜜抽护进行分离并探讨其与类胡萝ｈ素代谢之间是否存在关系。３０ 第六章红肉蜜抽八ＣＯ的分离及功能初探１．材料与方法１．１植物材料本部分内容的植物材料为福建省平和县小溪镇盛锦公司育种基地１０年生语溪蜜抽’的红肉早熟突变体红肉蜜袖Ｗ及实验室所培养的６叶期本氏烟（Ｍｃｏ加ｗｆｌＡｅｗ抓ｗｍａｗａ）幼苗。１２．试剂与仪器主要试剂与仪器参见第二章与第四章１．３Ｃ知Ｗ５０的分离与表达根据ＮＣＢＩ数据库戶公０基因序列（ＸＭ００６４３９４６３．１）（表１），Ｗ红肉＿设计引物蜜袖ＤＡＦ１９５果实汁胞ｃＤＮＡ二链为模板扩増Ｃ封乂５０，ＰＣＲ产物通过ＴＡ克隆连接至－Ｔ载ＴＧ１细胞ＭＤ１８体。经ＰＣＲＰ，转至大肠杆菌感受态与酶切验证么后的阳性克隆送至上海英潍捷基有限公司进行测序并进行菌种保存。根据所分离的ＣｇｉＶＪＯ碱基序列，参照实时巧光定量ＰＣＲ引物设计原则，应用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒｓ软件设计引物（表１）。根据所分离的碱基序列，根据基因沉默载体ＰＴＲＶ２的要求，选取适合片段设计用于基因沉默引物。６－表１（去户似０分离及表达引物Ｔａｂ－ｅｒｔｌｅ６１Ｐｒｉｍｓｕｓｅｄ化Ｃｇｊ乂？。ｉｓｏｌａｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ’’物用途引物序列－（５３）扩增长度（ｂ＾￣．Ｆ；ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＧＴ（舖）＾某悬巧囚分离罔民．ｏｇａｔｃｃｔｔａａｇｃｃａｃａｃｔａｇｃｔａｃｃ細ｍ（）甘圧、Ｆ：ＣＧＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧ１＾七２基因表达１２民：ＡＴＴＴＣＡＴＣＣＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＯ、尸贴Ｆ；ＧＣＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡ付田。。。基因沉默２００Ｒ；ＡＡＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴ１．４的亚细胞定位载体构建将分离成功的Ｃｇｉ乂Ｊ０通过相应的限制性内切酶（ＳＷＩ和及ａｗＨＩ）酶切，之后进行ＧＰＴＶ－１－回收纯化并且构建至亚细胞定位载体ｐ１ＧＦＰ，经ＰＣＲ验证及酶切验证后将重组质粒从大肠杆菌ＴＧ１中转至根癌农杆菌ＧＶ３１０１。３１ 第六章红肉蜜袖户知０的分离及功能初探１．５的亚细胞定位对ＣｇｉＷＯ的亚细胞定位主要使用的是瞬时表达的方法，因此操作过程与ＢｉＦＣ农杆菌侵染过程类似，同样分为菌液培养、扩大培养、ＭＭＡｉ重悬、农杆菌侵染Ｗ及费一一光显微镜观察等五个步骤。与ＢｉＦＣ过程唯不同的过程在于农杆菌侵染这步，Ｃ－－Ｐ传的亚细胞定位只要将含ｇＰ４５０：ＧＰＴＶ１１ＧＦＰ的农杆菌菌１９（１：１）混ｐ液与合后就可Ｗ采用针筒浸润的方法注射本氏烟叶片。１．６的ＶＩＧＳ沉默载体构建对Ｃ沙如０全长进行测序后，选取其中２１２ｂｐ基因片段进行分离，构建至Ｔ载体后转至大肠杆菌感受态ＴＧ１。通过双酶切对片段进行回收纯化后将其构建至ＶＩＧＳ沉默载体ｐＴＲＶ２。最后转至ＧＶ３１０１，经过ＰＣＲ验证Ｗ及酶切验证的菌种进行７０％甘油‘－８０Ｃ保存并冻存于。２．结果与分析２１ＣＶ５０的生物．知信息学分析一从红肉蜜袖ＤＡＦ巧５送时期分离出（：：如０１６２３ｂ碱基、５４１个氨基酸组成，肿，由ｐ一一分子量约６１．３９ＫＤ，是亲水性的膜外蛋白。ＣＹＰ４５０的Ｃ端有保守血红素结构域一７１ＦｘｘＧｘＲｘＣｘＧ［％］－（），这结构域通常作为鉴定Ｐ４５０家族的主要特征（图６１）。其Ｎ一？巧位氨基酸为一跨膜螺旋结构端有疏水区为跨膜信号Ｐ４５０第５。经，成熟的ＣｈｌｏｒｏｐＵ在线预测发现所分离的ＣＹＰ４５０无信号肤。此外，在Ｐ４５０的Ｋ螺旋区有另一Ｗ］ＭＥＧＡ６保守域（ＥｘｘＲ）在Ｐ４５０蛋白折叠过程中有重要作巧。．０利用，根据相邻连接法绘制进化树，结果显示ＣｇＰ４５０与甜捲ＣＹＰ８６Ａ８（ＸＰ＿００６４７６５４５．１）亲缘性最为－２接近（图６）。３２ 第六章红肉蜜抽尸似０的分离及功能初探ＣＰ４５０ＥＴＴＡＬＭＬＳＡＴＶＬＬＦＢＦＭＣＳＬＳ民ＢＳＬＪｇＷｉｇＬＦＣ厢巧ＩＢｉｇｇＳ．巧ｇ函．．＼ｌｙ５！ＳｉＳｌＲＡＣｄｇｉＢｉｉ广７７记！反油讯用（ｊｌＷＨｉｆｌ＊出Ｉ．ＣＳＰ４５０ｇＳＡＳ－ＫｋｅＣＴＳ了！书ＢＴＡＵＩＬＳＡＴＶ．ａＢｌｌＥｆＫＦＫＳＣＳＬＳＲ．，．＼巳１１＾〔、５：巧似Ｅ质！５＾！５唯瓦巧田航申目却巧（１田田哑禪］巧巧ＭｎＰ４ＷｊｔＡＳＴ化乂ＬＳＡ、ＡａｍｐｉｌＬＩＳＣＳ？＾Ｋ－Ｗ．．．＼！ｉＬＶ佛Ｓ！Ａ巧ＲＴｆＸ５！（［（ＳｊｒｆＡＲｌ－ｇ＜ｌｗＣＴＳ５ＳｌＪｇ＾極＾ｇ＾ｇｉｆｉ逼名巧＾５ｇＰＰ４巧５巧口．｜ｔ細化化《ＳＴＡＳｙＬＴＡＶＹｔＢｌ！ｌＣＦＪ５化｝＾瓦．ｘＳａＬＰｌｇＳｌｓＨＬＩＷ．Ｓ，ｃｚＲＫＣ＜〇、ＲＥ巧省ｆｌＡ．４過５ＪＳ８ＥＨｉ面日Ｌ０！巧遺田ＢＨｆｌ－Ｐｎ’柏１巧ｉＰ４５０８６Ａ８ｔＹＳＴＡＬＭＬＳＡＦＡ／ＬＬ＼垃５ｊＳｇｆＫｌＬＬＢＳＸＮｇｊＲ．．１＿＼ＬＩＣＫ４遍地ｌｌｆｌＡｌｆｌａｗｒｃｔｇ巧巧ＣＴＳ＠；田ＰｆｌＵｓ冷ＲＨＷｉｌｈＨＷ出ｉＲｃＰ巧０ＮＬ：巧ＭＰＷＬＬＡＩＶ巧．ＦｌＥ醫！ｓ巧Ｌｔ－Ｒ．．．ｌｌ＼ＵＥＭ：？＞ｒＡ０ＳｓｄＳｃｆ（ＴＪ砸ＳＳＥＥ＾？Ｊ５Ｊ？Ｗ＾ＳＨＲＭｌ｛ＭＡＯｒｆｌＢＳＷＳｇｌｄ４０ＳＣＡＳ－ｅＰＩ扣Ｍ５ＨｋＥＡＳＭＬＭＬＳＡｆＫＭＳＲＳＭＲ．＇ｖＢ！５ｖ＼ｌｇｎＢＢＬＩＣ、ＹＡＲＡＨ巧ｇｇｉ广了ｆＳ！师ｇｇ＾Ｊ雨邻巧师巧ＣＰ－ａａ４５０８６Ａ：－Ｈｋｅ麻ｆｌＨｅＡＳＴ．ＡＦＭＬＳ．ｙＡ．ＭＬＩＥｋＳＦＩＴＲＳＬＫｆｉｓ．．．＼ｆｌＳｕ历ＩＲｌｖＯＲＡｒｆｌ．ＡｉＲＡＣｃＳａ巧＼反通４９成ｆｌＷＷｆｉｆｌｊ［ｌＱｊ．Ｆ、？Ｗ８６Ａ２－ＫｅｋＨＥＡＦＴＡＬＴＶＬＴＶＬ／＾也．！ｆ。ＬＴＲＳＭｉＥ？Ｒ．．＼０５ＬＦ＾ｊｇｖｉＥＮＳ＃化巧ｄ８！田ｆＢＵｃ旅度田ＢＷＢＭＧＰ４５０ＣＶＴ８６Ａ？ｉｒ２４ＥＡＳＴＡＬＭＬＳＡＩＡ．Ｌ！ｆＴＦＶＴＫＳＬＫＫ．＇．＼Ｗ５Ｌ？ｆＭｉｉｇ＜ＬｌＨＡ？ＡＲＣＣ１１Ｑ巧ＡＣ远４Ｒ目看｜＾ＪＨＨＨ２１Ｈｇ亞愚乐巧通通通私Ｓ例５０８６Ａ２．ｉｋｃＳｅＬＳＴＣＶＭＶＡＩＶＡ．ＬＬＦＫＳＩＩＫＳ＾ｋＫＯＰＫＩＩ乂（ｉ＾ｆｉＳｓＲＶＣｃｉＪｎＳｆＢＡ．ＲｆｊｉｃｌＢＨＢＳＢＳＩＢ＆也也巧Ａ远＾＾ｇ＇Ｓ〇ＳＴＣ＇，ＩＰ４５０Ｓ６Ａ２．ｉＨｋｅ＼ＭＶＡＩＶ＼．ＢＬＬ５ＦＫＳＩＴＫＳＫＫＫＧＰＫｌｌ、ＬＬＥＡＲＹＣＴＣ！Ｃ［ｐＡＲ成Ｅ乂Ｑ巧昆ｊ（ｊ５５５５Ｓ｜ｇｊｊｇ｜泣匹卷征巧砸ＣｍＷ巧Ｓ６Ａ？ＣＡＴＹＶＦＡＶＡ４Ｉ＿＼Ａ。ｆＬＭＫＲ目ＢＳＬＳ田Ｒ．．．ＫＮＳＶ画ＲＳＴ（。（Ｓ咱店巧＾＾＾面ＭｔＰ４５０ＢＥ．４ＳＮＡＬＭＬＴＡＩＡ．笔ＵｐｓｎＴＲＳＬＫ民．．ｘＢＳｌＬＳＬ！册ＡＡＲＡＣ＜。ｄ９＼坛巧扇ｇｇｊ＾＾齊也召湿＾＾§ｊ麻，历Ｉｂ４５０ｅ＂口、－、－！、Ａ！ＶＡＬｌｆＫＳＩＴＫＢＢＳＢｕＰＰＢ＾ＪＳＸｋｋＧＰＴＶ‘￡乂也准巧Ａ远ＲＡ〔巧＾８。ｃｌ！田油…成ｍＣＭＢＳ’ＣＰ－１５０、Ａｇ画］壓個幽ｉ．口＂ａｓｐｋＣＨ４．ｊＥＢＬＦ：！＜ＰｇｆｌＢ５ＪｌＭ５ｉｎｒａＭｇ泣吸匆扭狙项幽边巧比化曲＂＂１４化巧ＢＭＨＡＤｆ：＼ｇＩ征ｊＢ’－ＣｓＰ４５０Ｓ６Ａ８－ｅ、ｌａＳ湿ｊ技质娜抱ｆｉｊｇｇＡ■述趾ＳｃＳａＳＷｆＰ击ＬＦＷ糾狀ＷＳｄｉＡｌＡｉｉ础化ａＩ冠Ｓｐ５１ｋ＞？ｄ８ｂ＾ＬＥＡＫＰｂｒｆｉＬ５ｌ５＼ＭＳ５２ｖｆｏ？４巧Ｓ６Ａ：ｌ、ａａａｆｌｉ！－ｖ‘ａ＾ｉａｒ５＾５ｍＢｖｙ．ＡｓｉＫｉ！ｅｒｅａｋｒＳ亟５团ｕ西？巧ＳＷＢＷｇｕｒｍＴＯＰｌＳ３ｊＢｔｌＩＳＩ而ｐ。！历ｆｌＢＢｉＭＳｌＢＰｆＰ４５０雨拥ＢＡＥＢｒＫＨｉｌ抑；减＂巧ＢＨｇｌｊｇ｛＾ｇＦＴｆＴＦ巧巧历巧面５方｜｜〇巧｜ｉｓ反ＣＣＡＫＰ日痛庙！紐病Ｉ日ＰｍＰ４，５０８６Ａ８ＬＳｇ画巧懼‘ｕｊａｉｌｆｉ畑逝ＭＩＬ任巧Ｌ？【，ａ，脉，＂，＂＊？？？化＼１３巧；測＾成加ｇＥＴｇＢＮＥＡＫＰＢｎｉＢｉＬｇｌｇｌＪｉａｇａＳＲｃＰ４５ｌ１！Ｓ＼ｌＨＤＴＢｌＦａａＭ？ＢＡＮｃＫＲ０Ｒ皿］。細些巧ｌＣＴｆｉｍ＾＾＾＾＾＾Ｂ！ｌｌＳａｉｎ砸通８ＬＣＡＱ？ＤＩＬ８Ｂ￥ＬｑＢ？＾Ｈ！８Ｍｄ－ｌｉ扣Ｐ４５０８６Ａ８ｋｅ区ＬｊＳｉ巧通化１８１）ｉ５ｌｆ《化，■ａｗｉｗ痛ＷＳＨｓ巧ｌＥＬＣＴＳｄＳＥａｋｐＢｓｌＢＢＵ化脚＾巧ｇ乂《倒屈迟胡娩：ｌＷＳｌ＾＾ａ．ＨＣａＰ４５０Ｓ６Ａ：ｋｅｖｌｉＳｉＨ留ＬＦＡ；ｔＥ＞＞ＰＤｉＭＢｌＪｉＭＢｇ埋您迈巧巧！＠ＦｖＰ４５０８６Ａ：－ｋ＾ＨｅＩＩ糾共材Ｊｌ巧雨Ｓ＾ＳＡｊ＾ＳｐｆｉｉＥｌＥＮＥＧＫＰｎｉｌｉｌｌＪＥＥｔ＾ＭＢ！函区巧巧远团巧屈ＧＰｉｎ４５０ＣＶＰ８６Ａ２４ＳＳｄｉＳｌＦＡＭＮｌ巧巧面巧巧窃ｇＷＥＢｌｆｌｏＡｉｋＥＮ：ＫＳ！迎Ｅ证堪巧！｛Ｋ适迪臣亞田目＇．４５０－ｃ；．、１４＼８口＆＾８地ＭＡＪｌｉｋ８面１。西＾些豐而＾查巧細＾＾！３巧面历＾＾＾１８１＾８（＾？＾＞；而＾麻而１？．＼１８＼「倘成＾１１８１历断＾＾８１Ｓ阶巧Ｓ６Ａ２．＾ｌｉｋｔＢＬｖｌＴＡ＼ＥＤｌｇ：１８ｄ５ＣＴＣＴＮ（＾！［Ｓｌｉｌ５ｆｉｌｉａａａｉｔＳｉＳ！ｉ＾ｉＥＳＩ＾Ｓｋ＜ＬｒＷ？ａｆｃ１；ｗａ？？ｉ？Ｗ？？；＼ＴＫｉ＾ｉａｌＦ＼ＥｒＧＫＰｇＦ７ＨＴｆｌｎＢｒＳＳｉａ｜｜ｐｇＣｍＰ４５０８６Ａ？，ｉＷ獨Ａ［巧垣＾巧ＢＲｎＩＥｌＦ苗Ｓｆｌ！ｌｌＢＳ＾ＳＲＳＡｓｐＫＳｄ￡ｓＲＲＧｌ；ＰＤ麻！｜Ｍ８｜ｊｊｊｇ側４５０＼ｎｆｉＥａｔｏＤｇＦｐ＾ａ？％ＬｃｍａｔｅｅｋｎｐｉｒａｗｌｉＪＢＥｉｉＨｎＢ｜ｊＱｐＰ４５〇ＢＵ盈取西ａａＫＭ－ｆａｉａＴＢＭＢＩＩｉ＾Ｂｇｉ｜？ｔｇａｗｉｏＥｎＴｉＦＢ＾ＨＳＷＢｉｒｏＷｒｏｄｌＥＮＥＢＩｋ＞ｉ８ＳｃＢＩ｛￡ＪＢ＼ｃｇｋｐＢｓｉ１ＳＢｉｊＩＲｔＷＷｆｌＭＭｓ巧ｉｉｓｖ．ＡＦｆＬＬＧＡｌＬＲＫＣＬＲＬＹＳ、ＣＰ化Ｋ排的ｇ？ＪＳＩ－邸ｇｇｇｇ＾＾＾巧ｇ［．ＳＩ：ＩＳｉ！ＡＳＲＤＢＲＣＧＦＡＡＴＴＴＰｌｇＢａｇ＠巧匯ｇｊｇＣｓＰ４巧８６Ａ８－ｆｉｋＥｅ乂［ＳＶＦＬＬ４宜電巧臣Ｑ！应ＬＲＫＣＬＲ＾ｌｇｖＳＶＣＰ化｝；排ＤＥ＾ＬＳ口ＳＴｔ＾ＬｆａｉＡＳＲＤＲＥＣＧＥＡＡＴＴＴＰｔＪＳＢＲ！遲遲巧您赴巧化渾ＶｆａＰＪ试Ｓ６Ａ２因远．Ｋｓ化见通Ｉｌ邑Ｉ挑化（４ＳＬＳＲＳＬ細ＶＣ一ＳＳＩＥｔｌｌＳＡＳＣＡＴＴｍ！ＳＳｄｉｌ＾田通ＦＳＣ钟Ｇ．．．．ＩＩ祖拓３姐击ＳＳＳＪＰｔＰ４巧４ｔＳＬＥ｝ｃ＂ｉｇｊ２｛ＦＩＬ。ｖＬＲＫＳＬＥ－ＮＭＬＳ＾ｌＥＨ！Ｅ／ＬＳｎＮ］Ｌ＼ＮＣＱＫＧＣＮＥＮＰｌＳｉｅＭｊｇｇｊｇＪ｜｜＾［ｇｇｇＪｊ｛＾｛｜ｇｇ§＾｜２２ｊｇＪｇＰＰ４ＡＳＡ－ｍ５０田逐ＫＬＧｌＳｆＳｌＳｈＳ亞ＦＩｌａＩＩＦＲＫＶＬＹＳＬＳＱＳＬ御ＳＴ］？巧玄Ｅ雨省Ｅ也ＮＮＫＥ犯．．．ＳＮＣＶＰｈＳｈＢＥ亟谓Ｌ强＞．ＲＣＰ４５０Ｓｆ；Ｉ：ｎ田巧巧鸣苗哑＼Ｓ亞巧迈西遷ｉ邑ＥＶ＼巧ＬＫＫＷ哑－＼｜ＶＲＬＳＱＳＬ过《Ｅｊ＾Ｉ＿ＳＧＮｌｇｇＬＬＮＣＫ＞ＧＶ．．．口ＣＫＰｌｇｎｉｌＳ３巧函ＭｄＰ４５０ＭＡＳ？旺ｅＩ．ＡＰＧ！！】，ｓｉ！ｆｌＦＫＫ化ＳＬＮＨＳＬ拙ＩＥｌｌＳＩＥ巧哑巧Ｊ征也－ＡＣ履ｉ＿ＳＣ．．．Ｃ．ＮＣＴＰＪｊｇ哑ｇＪ西ＱＣＧＬ巧田Ｊ－ＣａＰ４５０Ｓ６Ａ２Ｋｃ■（ＶＧｌ］ｉｌＳ］ＩＢＢｌＫＫ化巧Ｓｋ因证独ｊｊｊＡＢ巧ｊｇ亞巧巧巧麻ａＩ．ＫＬＩＥＴＳＶＬＣＣＳＣＡＴ．Ｔｌｔ郝巧Ｃ原面Ｃ＾ＦＰ４５０的Ａ２－Ｈｋ＼＇ｖｅＳ？ＧＬＩ：］．ＡｐｉＬｎｉｌＵＦＫＲ化Ｋ：ｖＮＬ沈ＮＬＫＨＶＤｒＬＳ口＾ｌＳ．巧巧巧ｊ巧Ｊ＾§ｇ＾ｆｇｊ＾２ｉｒＱｊＬ团Ａ＾ＣＧ．．．ＳＤＣＴＰＪｆｉｊＳ（ｇｇ泛ＪｇＧｉｎＰ４５ｆｌＯＴ８６Ａ２４曲逐独ｃＳ１ａＶＧＬ｛ＳｉＣ．ａ｜ＳｌＳ面逆逗Ｆ！到ＬＬＫ跳Ｉ？准ＹＬＳＲＳＬ拙Ｉ一ＫＫ＞＿ＣＴＣＳｈＪＭｙ遷ＵＪ＾ＳＤ＃Ｓ？迅ＩＮＳｔＰ４５０８６Ａ２．Ｈｋｃ巧ＧＩ？ＩＳＦＩ１ＥＦＩＬＫＫ、ＬＳＬＳＲＳＬＫＣＬＥＴＥ！田巧逊巧召雷西巧田嗦自巧巧承續ＫＮ观Ｌ田ＮＮＫＱＷ…广ｆｆｉＳｌｌＳ￣Ｓ．．１Ｐ４５０Ｓ６Ａ：ｉｃＢ证巧脚巧化ｌｋＳ西、祖。巧ｐｆｌＥｆｌ也１１Ｅ日Ｆ、ｆｌＳｕＣＫＮｌｃｊＢ＼｜ｌＹＳ；ＬＳＲＳＬＫＱＬＩ：＞ｇ、ｍＮ掘Ｉ西ＮＮＫＨＫＧＣＰＣｈ历ＭＣ；ＡＰＥｓＣｆＩ－ｍＰ４５０Ｓ６Ａ７０ＬＴＦＶ１＿１０（。１ＴＩＴＣＳＬｎｎＴＮＫ谭画逗谭ｇ醉屬ｇｇ田化Ｊｇ迈＿逐也ｘＳＬＮｌ＾巧ＪＳＮＣＱ〔Ｖ．．ＴＮＣＴＰｌ坛巧么蛇扣０■＜（ｓＶＧＬＩＩ：ｌｓ｝＾：．）Ｆ］Ｌ］￡Ｉ＼ＬＫＫＶＦｊ＾５ＳＳＪｇｇｊｇ＿Ｅ＾＾＾ｇｇ巧．Ｒ＾＾５＼化巧ＳＬ紐ＩＨ＾ＬＳＭ。｛巧］３｜巧ＣＳＣＡＬ＞ｇＳＪＰｈＰ４５０５＾１＞田履巧３巧巧迪巧趣５亞１泣迈曲扣１Ｎ５＾＼？ＬＫＫＭ＿ｃｆｉｌＢ、ＳＬ？ＷＬＫＱＶＩ：＞Ｂ；ｖｎ、Ｎｌｌ＿Ｌ＾ＱＭ３巧Ｃ沾历历｛｜Ｓ５！３巧巧［ｕｃＣＰ＂０Ｎ．ＫＥＳ、Ｃ订ｆｌｇＭＷＭｇ巧！ＶＩＴＶＬＥＴＲＤ＼Ｓ本ＶＥｄｇｌｖｇａＳｖｇＲｉｌＴ奴加ｄｔＩＡＷ。目巧百巧因２＾巧ｃ唯巧｜巧巧脚ＣｓＩＷ）８６Ａ８－ＨｋｃｖｉＴｖＬＥｌｒＥＶＳ化ＩＫ＼ｙＳ迅雨航５６娜ＲＩＢＣＴＳＭＩＢＷＢＢｎｇｇＪＶｆａＰ巧８６巧４Ａ２於巧省征通Ｌｌ！Ｔ＼［ＦＳＤＴＫｖＦａＢ巧＼拓亦ＲＢＢＳＫｆｍａＢＭｇＦｆ召项艰巧Ｉ巧Ｐ４５０、ＫＫ、ｃ巧￡１Ｕ！Ｔｖ、￡ｊ妊巧姐巧巧ＳｌｉＳｆａｔｉＷ！Ｗ宜巧ｇ巧由巧山巡ｇ｜巧Ｃ准巧｜§ｊｇ｛｜：＼ＲＴｓｉｉｗａａＭｔ３ｏ扣例巧Ｓ６Ａ８目、巧相巧’！ｐＢｆｌｆｌ冊庙、．ｉ３ｌｆｌ３５Ｂ｛ｌｆｌｆｌｒｏＢＢＭＢＳＢＦ＼唯巧Ｆ＆Ｉ．Ａ＼Ｔ＼ＮＦ！ＳＤＴＳｋＦ＼ｖＲＴ＇ＲｃＰ４５０ｌＫ５ＫＥ￥ｓｉＤｔ＾；ＦｆｌｆｅａＭｌｔｆｔＬｇＭｌｔ？％ｆａｌＢＭ？＼＾ＶＳＣＮｉｌＫｉＳ５ＥＢｌＬ？Ｉ！＼击、ＥｌｔＴＮＥＩ〔近Ｉ．Ｅ胡ｌ＼丽５＼ＳｒＨ細Ｍ＂ｊｄ曲丈城｜ｔ；０叫’￣‘、垃Ｐ４’５０Ｓ６Ａ８地ｅ、－ＶＳ巧、，ＩＬ．ｓｓ■Ｋ〔ＳＩｒ、以ＴＴｒＦ＼ｉ目巧召省巧Ｊｊ啦证ｊ｝ｊｊｊｊ巧巧巧巧ＣａＰＷ）Ｓ６Ａ２－ｌｉｋｅ、化５、￡￡＾、。ＫＫｍ．ＳｎＥＩＳ远１Ｆ滿ａ５责Ｖ抗ＳｖＢＩ扇坛巧危目屬這＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾巧化化＾巧也巧ｇＦｖＰ４５０Ｓ６Ａ＾－Ｈ：ｃＴ（？（Ｓ巧；；＞？ｅＢｖＬＳ！１５Ｋ；Ｔｉｆｌ历ＢＢＢＣＴＳｆＨＳｆＳ。；屯项怖神ＧｍＰ４＇＇５０ＣＹＰ８６Ａ２４、巧Ｋｆ－ｉＬｓ－ｋＦｉ！：！）］ＳＴ下＼拓８＼８亦ｆＢＨＷＨＳｎＥ巧也面证ＢＢＢＣＴｉ｜Ｓ屯ＣＨＥ＆－－Ｓ－ＭＫＭＫＭ＼－ｔＰ４５０８６Ａ２ｉｉｋｅｈ（Ｋ￡Ｓ＼ＥＰｎＵａＨ？ＸＩＩＭＶＳＬ９５￡ｌＴ．３ｌｇＳ；－＾＞ｐｌ＼ｉｖＥｒＮＣＴＳＫＳｌＦＦ＼ｇ５＼ｒｆｌＡＢｉｉａｉｆｉＨ５＾＞４ＭＡＭＪ？＾ｇ＾ｊｊ￡＾ｇｇ＾ｊｇ２＾§｜’’Ｓ－＾１Ｐ４巧Ｓ６Ａ２Ｈｋ￡、化Ｓ、Ｄｉ！、、ｖ油ｔ件ｉｗａ＂顧而＾方历Ｂ＼々ＶＳＬ？＾雨ｆＢ！Ｌ．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第六章红肉蜜袖八的分离及功能初探ｒａｎＰ４５０ａｔＵｓ口ＣＣ８ＡＡＣ＾ｇＩＩｓ－ｆｒｕｓＰ４５日ＩｉｆｃｃｊｉＢＷｉｓｉｒ４７６５．１１１Ｃ８６Ａ８ＯＸＰ００６５４—＂＊Ｌ．—－ｎｗ？ｃａｃａｏ１．ＴｃＰ４Ｓ０＆ｉｉｌ８６ｓｕｂｆｋｘａｉｌＡ巧ｗｏｋｏＸＰ００７０５７７５１ａｙｙ＿＾４ｔ４ｃｔｏｄｕｏｍｅＦ４５０ｆａｍｉｌＰｏ／ｗＸＰ００２３０５〇２１５０ｙｙｐ＿ＲｃＰ４Ｓ０＞ｉｒｏＸＤｅ４ｉｃｉｍｔｆｃ〇ｆｍｐｉｕｎｉ；ＸＰ０９Ｓ２．ｃｔｏ＾ＰＳ０Ｊｉ０２５００１３＿Ｉ４０ｃｍｅ＾ＧｎｉＰ４５０ＣＹＰ８６Ａ２４ＧｆｙｍａｘＡＢＣ６８３．１，３ａ２￣ＣＰ４５０ＳｆｔＡｌｉｋｃＯｆＭｒａｒｉ加ｎｎｗＸＰＪＸＭＳＯｒｍｉ．ｌＭｔＰ４５０Ｐ４巧色ｍｉｌＭ巧〇Ｍ＜ｎｃａＡ＜／ａｌＣＥＨ２化巧．１８３ｙｄ２ＭｏｔａＷｉｓＭＰ４５０ＥＸＢ３Ｔ３３４．１巧始ＡＩ＇ｖ－ｃＭｆｆｆｌｖａＫＭ０ＦＰ４５０Ｓ６Ａ２ＸＰ．ｌｉｆｃＦａ００４２９Ｂ８：！ｇ—內ｎＰ４５０８６Ａ８ＡｗｉｉｔｓｍｕｉｆｗＸＰ００８２３８９巧■１＿＞ｏｍｅｓＭｄＰ４５０１＾ＭｕｉａｉＸＰ００８３７３９９４．１Ｓ６Ａ８ａ／ｓｄｔ＿ＩＩ－１００ＦｈＰ４５０色ｔａｃｉｄｏｉａａｊ＾ｄｒｏｘｉａｓｅ＜Ｉ虹，ＡＺ３９６－］ｔｙ＾Ｐ幻扣Ａ４２巧ｙｙ－Ｕｋ？ＳｔＰ４５０ＳｃｌａｍｉｍｔＡｅｒｏｓｕｍＸＰ００６３４３９６７．１Ｓ６Ａ２＿Ｉ－ＳｌｉｋｅｏｌａｎｕｍｌｃｏｅｒｓｉｃｖｍＰ００４２４．ＩＰ４５０８６Ａ２ＳｙｐＸ＿５５９３１１加ＩｍＰ４＾Ｃ５０ＸＰ００８４３７２９４．１８６Ａ７Ｃｕｃｕｍｉｓｍｄｏ＾——￣８６Ａ２Ｒ化ｖｒｏＸＰＶｖＰｉｎ００２２巧＂５－１４５０诉＿ｐｏ＾ＡｆｅｍｉｌｓｉｉｂｆｉｏｉｌＡ－ｌｔｉｄｃ如？１〇備１。１２１．ｔＰ４５０６，ｗ＆１ｙ６ｙｐｙｐ＾＿ｉ－ＳＰ４５０ｌｉｋＳ＆ａｒｉａｉｔａｉｉｅａＸＰ００４９７６４８５．１Ｓ６Ａ２ｃ＿＾＇－ａｌｉｋｃｈａｃｈｏ＾ｕＸＰ６６５２６．（％Ｐ４５０８６Ａ４Ｏｒｓｆｔｔ００３５Ｘｙｙ＿ｍＰ４ＣＹＰＭＫ１叫Ｚ５０８６Ａ３５Ｚ＾？ＡＣＧ％ＷＡ！＾＞ｊｄＰ４５０－ｏｄ＜Ｓ６Ａ２ｌｉｋｅＢｒａｔ＾ｉａｎｄｓｔａｃｌｆＸＰ！Ｋ）３５７００７４．１５。Ｂｙｐｉｉ＾Ｏｒｔ＿Ｉ品■诚孤ｍＴａＰ４５０ｃｔｏｌｅ〇？》？血処Ｐ４５０ｒ５如ＡＰｎ３６１０９ｙ—图６－２编码的氨基酸序列系统进化树注：分支上的数值为１０００次建树中该位置出现的置信度值－巧呂．６２Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｅｄｕｃｅｄａｍｉ打０ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｇ户４５０ｗｉｔｈｏｔｈｅｒｂｒａｎｃｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓＮｏｔｅ：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｐｉｎｇｗａｓｄｏｎｅｂｙｒｅｓａｍｐｌｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｄａｔａ１，０００ｔｉｍｅｓ．２．２Ｃ知Ｖ５０在过肉蜜袖中的表达分析在红肉蜜抽的发育过程中。７５这，Ｃｇ户如０在蜜袖果实中的表达逐渐降低在ＤＡＦ一一１９５阶段，在蜜抽果实汁胞中的表达量最高，而ＤＡＦ这阶段表达量达到最－３低（图６）。因此在红肉蜜抽果实汁胞从无色转至紅色的过程，ＣｇｉＷ５０表达量下降。ＣｇＰ４５０１－．２ｇ．－ｇ１．０＼Ｉ．＼Ｉ４＼■Ｉ＼。。－ＩＯＪＯ－０－．０５＼ｔ任胞－１．．，１１１１ＤＡＦ７５ＤＡＦ１０５ＤＡＦ１３５ＤＡＦ１６５ＤＡＦｌ巧图６－３红肉蜜抽不同发育时期Ｃ知乂５０的相对表达量－＇Ｆｉｉｉｆｉｄｌｔｄｆｌｅｓｈｅｄｌｏｇ．６３ＥｘｐｒｅｓｓｏｎａｎａｌｙｓｓｏｆＣｇＰ４５０ｉｎｈｉｔｅｖｅｏｐｍｅｎｏｆｒｅｕｍｍｅ．ｐ３４ 第六章红肉蜜袖尸公口的分离及功能初探２．３ＣＰ４５０的亚细胞定位ｇ－Ｐ４５０－通过对Ｃ：ＧＰＴＶ１１Ｇ评融合蛋白在本氏烟中进行的瞬时表达过激光共ｇｐ，经－聚焦显微镜观察后，发现ＣｇＰ４５０在本氏烟细胞中定位于细胞膜Ｆｉｇ．６４。（）图６－４ＣＰ４５０在本氏烟中的细胞定位ｇ左：明、暗视野的组合：中：暗视野；右：明视野？－Ｆｉ．６４Ｓｕｂｃｅ］ｌｃａｚａｏｆＰ４５０ｎｃｏｎ幻打ａｅ＂ｆ／ｚ幻ｗＺ幻ｎ幻ｇｌ山ａｒｏｌｉｔｉｏｎＣｇｉＭ６．Ｌｅｆｔｍｉｆｌｄｉｈｂｒｉｈｆｉｌｄ：ｏｖｅｒｌａｄｄｌｅ：ｄａｒｋｉｅｒｔ：ｔｅｐ；；ｇｇ２．４Ｃｇ／Ｗ０的沉默结果在本氏烟中—，对Ｐ知０进行沉默实验，ＷＴＲＶｌ作为阴性对照。结果发现沉默植株在１１天之内与阴性对照相比其茎发生显著性差异，沉默植株茎的生长速度显著高于阴－２）性对照（表６。这种差异从沉默后第５天即出现并且随着时间的推移，差异逐渐变小，沉默植株茎的生长速度与阴性对照逐渐相近。表６－２沉默后本氏烟相对茎粗Ｔａｂ－ｌｅ６２ＴｈｅｒｅｌａｉｄｉａｍｅｔｅｒａｆｔｅｒｉｎｅｃｔｉｎｔｖｅＳ化ｍｊｇ相对直径（ｍｍ）ＣＫＰ４５０＊＊注射后５ｄ０．３６±０．０３０．５９±０．０２＂８ｄ０±０．±注射后．６７．０４０８３０．０４注射后ｌｉｄ０．０４０．８７±０．０３．８化０注４５０ｌｉ：与ＣＫ相比沉默植株茎的相对直径在ｄ之，Ｃｇ户内具有显著性差异－’Ｎｖｍ＂ｏｔｅ：ｃｏｍｐａｒｅｄ化ＣＫｒｅｌａｔｉｅｓｔｅｄｉａｍｅｔｅｒＡ７ｃｏｄａ？ａ灼化如口？口ｎ口ｗｈｉｃｈｓｉｌｅｎｃｅｄＣ尸＾５０ｈａｄａ，ｇｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｉｎ１１ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｎｇ＊＜．巧００１义讨论仁知０在红肉蜜袖中的－、班表达随着果实的成熟而降低，说明其与番茄红素Ｐ胡萝一ｈ素的积累可能存在定的相关性。为了说明我们所分离的细胞色素Ｐ４５０片段与类胡萝ｈ素代谢之间的关系，在做ＶＩＧＳ沉默之前，我们将红肉蜜袖中所分离出的Ｃｇｉ乂５０通过双酶切并经过回收纯化后构建至ＢｉＦＣ载体中，与类胡萝ｈ素代谢相关基因进行３５ 第六章红肉蜜抽护ＣＯ的分离及功能初探ＢｉＦＣ互作研究。结果发现所分离的ＣＰ４５０与ＣＰＳＹ、ＣＰＤＳ、ＣＺＤＳ、ＣＬＹＣＢ与ｇｇｇｇｇＣＬＹＣＥ０这一ｇ等类胡萝ｈ素代谢相关酶之间并无发生任何互作，因此推测虽然八巧基红肉蜜抽番茄红素－因在红肉蜜抽与箱溪蜜抽之间表达量相差较大、，但是与Ｐ胡萝ｈ素积累之间的关系并非千分密切。在进行细胞定位实验之前，我们使用ＹＬＯＣ在线预测软件对进行细胞定位预测，发现其定位于叶绿体，但是对Ｃｇ护Ｃ０的亚细胞定位做了简单的瞬时表达后，初步判定Ｐ４５０定位于细胞膜中。由于瞬时表达只是对叶片注射区直接观察，因此叶片的质量较为重要，但是本次实验过程中，叶片有所缩水并且叶片较厚，因此并未能观察到细胞器。此外也未对烟草细胞的细胞核进行染色，所Ｗ只能是做出初步判断。若要进一步确认，对瞬时表达后的叶片还需进行纤维素酶与果胶酶处理，制作原生质体，７２］ＤＡＰ［并利用Ｉ染核，在紫外条件下激光共聚焦显微镜中进行观察区其定位。从上面氨基酸比对结果与进化树结果中可知所分离的ＣｇｉＷＯ应该隶属于ＣＹＰ８６Ａ９７沿ａｏ家族而不属于ＣＹＰ家族，ＣＹＰ８６Ａ亚家族成员主要能够参与脂肪酸的代谢等刷用巧南芥ＣＹＰ８６Ａ２缺失突变体进行实验，发现ＣＹＰ８６Ａ２对角质层等相关的脂肪酸生物合成具有重要作用。经过多次重复实验进行的数据统计说明户４５０沉默植株在一短期内生长较阴性对照更粗壮，这表型可能是由于ｃｙｐｗｏ基因沉默后，影响植株激素含量所引起一，因此后续可Ｗ再对沉默植株与阴性对照的这时期进行激素含量的测定。随着时间的推移，这种优势逐渐消失，可能是由于其他基因的代偿性作用所引起。但是未对沉默植株做切片分析，因此无法确定护／州沉默植株与阴性对照相比，茎组织发生何种改变。３６ 参考文献ｍＭ吐．ｌｌ．２０１２ＴａｎａｋａＴＳｈｎｉｚｕＭｉＣ孤化ｒｍｏｒｅｖｅｉｏｔｅｎｏｉｄｓＪＭｏｅｓ，ｉｏｒｉｗａｋ油ｅｎｔｎｂｙ］挑ｕ川，ｐｃａｒｏｌ＾；－１７３：３２０２３２４２（）．Ｃａｚｚｏｎｅ出Ｃｌ．ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎｎａｔｕｒｅｉｎｓｉｈｔｓｆｒｏｍｌａｎｔｓａｎｄｂｅＦｉｍｃｔｉｏｎａｌ巧抑ｔＢｉｏｌｏ．口］：ｇｐｙｏｎｄ町ｇｙ２０－１３１１３８１：８３８４７．；（）＇＇３张建成，陶能国全铸等．红肉厮澄八氨番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达［Ｊ．中国农［］，］０－业科学．２００８）３２００３２０７．：；。４ＫｈｏｏＨＥＰｒａｓａｄＫＮＫ切心．Ｃａｒｏｔｅｉｒ：ＣｏｌｏｒｉｍｅｎｓｎＦｒｕｉａｎｄ［］ＫＷｉｄｓａｎｄＴｈＩｓｏｍｅｒｓＰｔｉｔｓ，，ｏｎｇ，ｅｎｏｇＶｓ－ｅｇｅｔａｂｌｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｋ．２０１１１６２：１７１０１巧８．阴；（）５Ｊ业科学．２００３［陶俊．ｈ．中国农，张上隆，输建国等巧橘果实主要类胡萝素成分及含量分析［；］］〇２０２－Ｇ１１２０．）：８６ＶａＥＣｏｍａｎＤＧｍｉｓｓｅｍＷｒｕｃｕｒｅａｎｄｄｎａｍｋｓｏｆ化６ｉｓｏｒｅｎｉｄａｔｈｗａｎｅｔｗｏｒｋ．］ｒａｎｏｖ，，．Ｓｔｔｏｐ口］［ｙｐｙ－ＭｏｌＰａｎ．２０１２５２３３．ｌｔ（）：１８３；３；７ＬｏｈｒＭＳｃｈｗｅｎｄｅｒＪＰｏｌｌｅＪＥＷ．Ｉｓｏｒｅｎｏｉｄｂｉｏｓｎｆｌｉｅｓｉｓｉｎｅｕｋａｒｏｔｉｃｏｔｏｔｒｏｓ：Ａｓｏｔｌｉｈｔｏｎ［］，，ｐｙｙ如ｐｈｐｇａ－ｌｇ化口］？ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１２１８５：９２２．；Ｗ＇ｍＣｕｔｒｉ巧ＡＪＣａｚｚｏｎｅｌｌｉＣｌ公幻／？ＣａｒｏｔｅｎｏＢｉｓｏｆＶｉｎｉｎ巧ａｎ：ｒｔｚｅｌＥｌｉｄｓ．ｏｓｎｔｈｅｓｉｔａｉｓ化閒，，ｕ，机ｙ－ＶａｍｓＢｌ２Ｂ３Ｐ．１３６．ｉｔｉｎ年ＢＢ５ｔＡ２０１１５８：，，，，；Ｒｏ－ｄｒｉｕｅｚＣｏｎｃｅｃｉｃｍＭＳｕｌｏｆｒｅｃｕｒｓｏｒｓｆｏｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｅｉｎａｎＪ．Ａｒｃｈ［刘ｇｐｐｐｙｐｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓｐｌｔｓ［］－ＢｉｏｃｈｅｍＢ０１０５０４１：１１８１．ｉｏｈｙｓ．２２２ｐ；（）［１０］张建成．红肉厮澄类胡萝ｈ素合成酶基因（ＣｓＰＳＹ、ＣｓＬＣＹｂ）功能分析与ｃｒｔＢ转基因对巧橘类２００９胡萝ｈ素生物合成的影响［Ｄ．．］华中农业大学博±；－纽１１ＬｏｉｓＬＭ民ｏｄｒｉｚＣｏｎｃｅｃｉｏｎＭＧａｌｌｅＦ口Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｉｏｓｎｔｈ的ｉｓｄｕｒｉｎｔｏｍａｔｏｆｒｕｉｔ［，ｇｕｅ，ｇｏ，ｙｇ］ｐ－－－ｄｅｖｅｍ－ｌｏｅｎｔ：ｒｅｕｌａｔｏｒｒｏｌｅｏｆＩｄｅｏｘＤｘｌｕｓｅ５ｈｏｓｅｓｎｅＰｌａｎＪ２０００２２：ｇｙｙｙｌｏｐｐｈａｔｙｔｈａｓ口］？ｔ．ｐ；巧）５０３－５１３．ＦａｒｒｅＧＳａｎａｈｕａＧＮａｉａ／化ｃａｒｏｔｅｓｌ．ａｎｔ．Ｔａｖｅｖｉ说ｏｎｔｈｅｒｏａｄｎｏｉｄｉｎａｎｔｓ巧。巧，Ｓｒｌａｄｐｊ，ｑｖ，口］－Ｓｃ２１－４８ｉｅｎｃｅ．０１０７９１２２８．；（）：１３ＫａｔｏＭ．Ｍｅｃｈ抑ｉｓｍｏｆＣａｒｏｔｅｎｏｉｄＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ虹ＣｉｔｒｕｓＦｒｕｉｔ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅＳｏｃｉｅｔ［］［巧ｙｆｏｒ－ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ２０１２８１３２１９２３３．：！．；（）ＦｎｉｎｉＥＦｉｈｒａｔｌｃｏＦｎｉｓｃｉａｎｅＳｅｆ幻Ｄｉｉｍａｔｏｅｎｅｔｈｅｓｉｔ，ａ打ｅＧｔ／？ｓｓｅｃｔｏｎｏｆｔｏｌｃｏｂｏｓｙｎｓｏｕｇｈ，，ｙｐｖ－８６－ｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｅｎｅｉｌｃｉｎＰｌｓｉｌ．３１６３９９９８ｓ畑．ａｎｔＰｈｙｏ２０１：．ｇｇ阴；口）ＦｒａｓｅｒＰＤ，ＴｒｕｅｓｄａｌｅＭＲ＾ＢｉｒｄＣ氏知口／．Ｃａｒｏｔｅ打ｏｉｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｄｕｒｉｎｇＴｏｍａｔｏＦｒｕｉｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＂ｖ－ｒｅｓＴｉｕｅＳｅｄｅｎｅＥｘａｎＰｓｉｏｌ１９９４１０５４０５４１３ｉｄｅｎｃｅｆｏｒｓｓｆｉｃＧｓｉｏｎ？Ｗｔｈ．：．巧ｐｐ）…ｙ；＾）＂６民ｏｎｅ打ＧＣｏｈｅｎＭＺａｍｉｒＤ巧。Ｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅ打ｏｉｄｂｉｏｓｔｈｅｓｉｓｄｕｒｉｎｇｔｏｍａｔｏｆｒｕｉｔ］，，，ｇｙｎ－ｄｅｖｍｅｎ－ｗｎｅｌｏｔ：ｅｘｒｅｓｓｎｏｆｈｅｅｎｅｆｏｒｃｏｅｎｅｅｉｃａｅｉｒｅｕｄｄｕｉｎｒｉｉｎｐｐｉｏｔｇｌｙｐｐｓｌｏｎｃｙｌｓｓｄｏｇｌａｔｅｒｇｐｅｎｇ－ｉｓｌｖａｅｄｉｎｈｅｍｕａｎｌａＪＰｌＪ１９９１４：４１３５１．孤ｄｅｅｔｔｔｔＤｅｔ．ａｎｔ．９７３［］；（）ｎＬｕＳＬｒｅ抑ｄｂ．ＪＢ．２０ｉＬ．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｍｅｔａｂｄｉｓｍ：ｂｉｏｓｎｔｈｅｓｉｓｕｌａｔｉｏｎｏｎｄＩｎｔｅｒＰｌａｎｔｉｏｌ０８［］，ｙ；，ｇ，巧阴ｇ５０７－：７７８７８５．（）１８ＣｌｌｉＣｌＰｏｓｏｎＢＪＳｏｕｒｃｅｎｋ：ｒｅｕａｏｎｏｆｒｉｉｎＩｓＪ．Ｔｒｎｄｓ［ａｚｚｏｎｅ．ｔｏｓｉｌｔｉｃａｏｔｅｎｏｉｄｂｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｔｅ］，ｇｇｐ］［Ｐ－ｌａｎｔＳｃｉ．２０１０１５：２６６２７４．；巧）１９ＷｌｔｅｒＭＣｈＣＳＫ／Ｖｓｕａｌｉｚａｔ打ｏｆｒｏｉｎｉｎｅｒａｃｉｏｎｓｉｎｌｉｖｉｎｌａｎｃｅｌｌｉｎ］ａ，ａｂａｎｃｈｕｔｚｅ６ａ／．ｉｉｏｔｅｔｔｔｓｕｓ［，，ｐｇｇｐ￣．２２８４３８ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅ日ｃｅｃｏｍｌｅｍｅ打ｔａｔｉｏｎ．ＰｌａｎｔＪ００４４０４．口：ｐ］；。）３７ 参考文献２０ＢＲＡＬｈａｅＴＰｎｕａＲＴｈｅｖ－ｈａｔａａｓｔｒｉｉｓｕａｚａｏｎｏｆｒｏｅｎｒｏｅ［］．ｉｓｂｌｅｔｏｕｃｈ：ｎｐｌａｎｔａｖｉｌｉｔｉｔｉｔｉｎ，ｙ，ｇｐｐ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｆｌｕｏｒｏｈｏｒｅｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓＰＭ．２２：１２．ｙｐ…．ｌａｎｔｅｔｈｏｄｓ００６；２１ＣｉｔｏｖｓｋＶＬｅｅＬＹ＼ａｓＳｅＺ诚Ｓｕｂｃｅｉｚｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｒｏｔｅｉｎｓｂｂｉｍｏｌｅｃｕｌ扣［，，，ｌＭ扣ｌｏｃａｌａｇｐｙ］ｙ＾－ｆｌｕｏｒｅｓｃ班ｃｅｃｏｍｌｅｍｅｎｔａｔ２１１２０１１．ｉｏｎｉｎｌａｎｔａＪ．ＪＭｏｌ聞ｏｌ．２００６％５：１３ｐ；）ｐ［］（－２２ＦｉｅｌｄｓＳＳｏｎＯＡｎｏｖｅｌｅｎｅｉｒｉｎｉｎｔｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｎ１９８９［．ｔｃｓｙｓｔｅｍｔｏｄｅｔｅｃｔｒｏｔｅｉｎｏｔｅｃａｔｕｒｅ．］，ｇｇｐｐ＾］；－３４０（６２３０：２４５２４６．）２３ＦＳ－－ｌｍｄｉｅｌｄｓＳｔｅｍａｎｚ民．Ｔｈｅｔｗｏｈｂｒｉｄｓｔ：ａｎａｓａｆｏｒｒｏｔｅｉｎｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ打ｓＪ．Ｔｒｅｎｓ［］，ｇｙｙｓｅｓｙｐｐ［］－Ｇｅｎｅｔ．１９９４１０８：２８６２９２．；（）２４郭纯免疫共沉淀技术的硏究进展化中医药导报２００７２８６－８９［．．：］；ｙ）２５黄新忠明等．２００６０４［．红肉蜜抽与语溪蜜抽亲缘关系初探阴．亚热带植物科学：］，陆修闽，陈小；（）２８－３１．２６王梨嫣－Ｄ江师范大学．紅肉蜜袖果肉积累番茄红素和ｅ［．浙］胡萝ｈ素的生理与分子机制辄探［］；２０１３．２７李伟明．Ｄ２０１３［．福．］袖果实生长发育过程中类胡萝ｈ素的分离及其积累研究［］建农林大学硕±；２８忠．ＳＳＨ［］刘顺枝，黄，胡位莱等靖溪蜜袖及其早熟红肉突变体成熟果实文库的构建及顿步分析－Ｊ．园艺学报２０１３０７：１３１３６８．［］．巧；（）＜’＇＇？２９红肉蜜抽．０［伍洋．与红绵蜜袖汁胞差异蛋白质绝学研究［巧福建农林大学硕七２！３．］口０］ＩｓａａｃｓｏｎＴ，民ｏｎｅｎＣ，ＺａｍｉｒＤ，ｅｆ如Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔ姐ｉｅｒｉｎｅｆｒｏｍｔｏｍａｔｏｒｅｖｅａｌｓａｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｉｓｏｍｅｒａｓｅｇ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔａｎｄｘａｎｏｌａｎ．ＰｌａｎＣｅｌｌ．２００２１４２：ｉｏ打ｏｆｂｅｔａｃａｒｏｔｅｎｅｔｈｈｙｌｌｓｉｎｐｔｓ口］ｔｐ；（）３３３－３４２．２００４２－１：１３６１４０即．巧．］徐昌杰，陈尾松，张波等橘绝织ＲＮＡ提取方法硏究化果树学报；口）＇’３２ＰＣＲ内参基因的Ｊ．１王梨媛．．果２０１３０：，潘永娟，杨莉等猜溪蜜抽焚光定量筛选［树学报；［］］（）４８－５４．３ｎｎ－ＡｏｍａｈＤｗａｍｅｎａＣＤｅｎｏｒｔＳＬｅｗｉｓＤ巧幻ａｂｏｌｉｃａｎｄｅｅｘｓｓｏｎｎａｌｓｆａｌｅ．Ｍｅ知ｒｅｉａｉｓｏ口］ｐ，ｊａ／ｔｐ，，ｇｐｙｐｐ－Ｍａｌｕｓ２４４９７４５１１ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ｃａｒｏｔｅｎｏｎｅｓｉｓＪ．ＪＥｘＢｏｔ２０１２６３１）：．（ｇｅ［］ｐ；（ＢＰｒｏｖａｒＪ－－ｒａｄＭｔＮ．Ｗｅｂｕｅｒａｂｌｅｒｄａｅｓｒｅｓ口句ｙＳｌａｓｃａｌｅｔａｓｔｆｏｈｙｐｏｔｈｉｓｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｌａｎｔ，ｑｙｇｅｇｐＪＰｎ－ｂｉｏＩｏｇｙ［．ｌａｔＣｅｌｌ２００９２１４；１０３４１０５１．］；（）－３５ＢａｕｌｃＤ．ＶｉｒｕｓｅｓａｎｄｅｎｅｉｉｌＬ９９９．］ｏｍｂｅｓｌｅｎｃｉｎｌＡｒｃＶｒｏＳｕ１１５１８９２０１ｉｎｇａｎｔｓ机．ｈ：［ｇｐｐｐ；＇［３句王伟杰．相枯果实色泽与类胡萝Ｉ素积累的关系研究［Ｄ］．浙江大学硕±；２００６．－７ＺｈａｎｇＪＣＺｈｏｕＷＪＸｕａ．ＴｗＬｃｏｎｅＣｃｌａｓｅｓＧ畑巧ｗｅＯｒＣｉｕｓ口，知／ｏｅｂｅｔａｆｒｏｍＳｅｔａｎｇｅｔｒ］，，Ｑｙｐｙ（ｓｉｎｅ打ｓｉｓＬ．Ｏ洗ｅｃｋ）ＥｎｃｏｄｅＥｎｚｙｍｅｓＷｉｔｈＤｉｆｅｒｅｎｔＦ畑ｃｔｉｏｎａｌＥｆｉｃｉｅｎｃｙＤｕｒｉｎｇｔｈｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆ－ｃｏｅｎｅ－－ｉＬｔｏＰｒｏｖｔａｍ．２０２０１７１ｙｐｉｎＡＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｔｒＡｕｌｔｕｒｅ１３１１：３１７４７．［］ｎｅｇａｔｉｖｅｇｒｉｃ；（）３Ｗｏｏ－ｉＲＤｓＲＡｅｎ地ｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｓ．２００１３０４：８１６８２０巧Ｇｅｔｚｄ．Ｇｉｏ打ｏｆｅａｓｔ．ｉｕｅ，；（），［ｙｙ］ｑ－８８２２１６８２８ａｓｓｉｍ．，ｐ３ｃｈｉｅｓｌＲＨＧｉＲＤＨｌｉｌｎｄ［句Ｓｔｅｔｚｉｃｎｃｒｓｒｍａｉｎａｃｅａｓｃｅｌｓｕｓｎｓｉｎｅｓｒａｅｄ．ｈｅｆｉｉｅｔａｎｆｏｔｉｏｎｏｆｔｔｔｔ，ｇｙｙｇｇ－－ｎｕｃｉｉ４６ｌｅｉｃａｃｄｓａｓａｒｒＪ．ＣｕｒｒＧ１９８９１６５：３３９．ｃａｅｒ［］ｅｎ巧．６３；（）４０ＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒＭ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ化ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ口］．ＣｈｅｍＲｅｖ．２００９；１０９（４）：［］ｐ４７９－１１４８０．４ａｖｏｎＡＣｉｅｈａｎｏｖ灯Ａ．Ｔｈｅ２６Ｓｒｅｃｈａｎｉｓｍｓ化ｄｒｕｔａｒｅｔｉｎ？ＪＢｉｏｌ［。Ｎ，ｃｐｏｔｅａｓｏｍｅ：ｆｒｏｍｂａｓｉｃｍｇｇｇ口］－Ｃｈｅｍ．２００９２８４４９：３３７１３３３７１８；（）．４２－ｍＭｏｏｎＪＰａｒｒＧＥｓｔｅｌｌｅＭ．Ｔｈｅｕｂｉｕｉｔｉｎｒｏｔｅａｓｏｍｅａｔｈｗａｙａｎｄｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｅｎｔ？巧抑ｔＣｅｌｌ．［］，ｙ，ｑｐｐｐｐ＾］２００４－１６１２３１８１３１９５：．；（）４３ＦＤＸＷａｎｕｂ－ｗａ［］Ｗａｎｅｎｇｉｕｉｎｒｅａｓｏｍｅａａｎｉｓｒｏｅｉｎｉｒｅｌｌｉｎｓｉｎａｌｉ打．Ｃｅｌｌｇ．巧ｔｔｉｏｔｔｈｄｔｌｂｂｅ，ｑｐｐｙｇｇｇ饥－Ｒｅｓ２０１２９．．１１（）１２８６１２９４：；３８ 参考文献［４４］ＢｕｄｈｉｄａｎｎｏＮａｋａｔａｎｌ乂Ｄ巧ＣＬ．ＲＩＮＧＳｈｏｌｄ化ｅｋｅｙ化ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｔｒａｎｓｆｅｒ机？Ｔｒｅｎｄｓ巧ｏｃｈｅｍＳｃｉ．２０－１２３７２：５８６５．；（）４ＬＧ－ｅｃｋｅｒＳＨｏｌｄｂｅｒＡＬｒａｄａｔｂｂｉｉｉｉＭｉｔｃｈＷＥ．Ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｉｏｎ化ｅｕｕｔｎｒｏｔｅａｓｏｍｅａｔｈｗａｙｎ［別，ｇ，ｇｙｑｐｐｒ－ｎｏｌ孤ｄｄｉｓｅａｓｅｓｔａｔｅｓ？Ｊｈ１１８０７１ｍａＡｍＳｏｃＮｅｒｏｌ．２００６７７：８１９．阴ｐ；（）－Ｍ４６ＬｉＹＷｕＢＹｉＹ．ｗｉｄｅａｎａｌｉｌＧｅｎｉｗ／Ｇｏｆ化ｅＲＩＮＧｆｉｎｒｅｎｅｆｅｍｉｉｎａｌｅ．ｏｌｅｔ［］，，ａｅｎｏｍｅｓｓｅ，ｙｇｙ阴ｇｐｐｎｏｍ－Ｇｅｉｃｓ２０１１２８６：９４．引．；ｙ）［４７］ＭｅｔｚｇｅｒＭＢ，ＨｒｉｓｔｏｖａＶＡ，ＷｅｉｓｓｍａｎＡＭ．ＨＥＣ了ａｎｄＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒｆａｍｉｌｉ妨ｏｆ巧ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓａｔ－ａｌａｎｃｅ？ＪＣｅｌｌＳｃｉ２０１２１２５Ｐ３：５３１５：３７．ｔ．ｇ阴；（）４ＢｕｅｓｏＥ，ＩｂａｎｅｚＣ，ＳａｓＥ饼ａ／．ＡｆｏｒｗａｒｄｅｎｅｔｉｃａｒｏａｃｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａＨａｎａｉｄｅｎｄｆｉｅｓａ［巧ｙａ，ｇｐｐ－－ＲＩＮＧｔｕｂｉｕｉｔ．１ｙｐｅｉｎｌｉａｓｅａｓａｎｏｖｅｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｓ巧ｄｌｏｎｅｖｉｔｙ．ＷａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ２０１４２１５２６：ｑｇｇ闲；－１１０１１６．４９ＨＫＨＬｕＣＣｔａｌＥｘｒｅｓｓｎｃ－［］ｓｕＷｕｉｅｎｅｅｎｃｏｄｒｃｅＲＩＮＧｚｎｅｒｒｏｔｅｉｎｉＳＪｅ．ｏｎｏｆａｉｎａｉｉｆｉ，，，ｐｇｇｇｐ，Ｏｈ－ＲＺＦＰ３４ｅｎｎｃ的ｓｏｍａｎ－ｓ．ｏｌ巧ｏ２０１４８６１２：１２５１３７．，ａｔｔａｏｉ巧抑ｔＭｌ．ｐｅｎｇ…；（）［５０］ＭｉｎＪＨ，化ＨＷ，ＹａｎｇＫＹ．封ａ／．ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｏｕｒｄＥ３地ｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｇｅｎｅＬｓＲＺＦｌｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓｔｈｅｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａＩｉａｎａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．－２０１４７７：７１４．；－王长泰番茄ＣＭ和Ｃｆ９基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究网．浙江大学博±２００５．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－ＯｒｚａｅＤＧＵｍ口引Ｍｏｒｅ打０巧ｚｒａｎｅＡ．ＶＩＧＳ：泣ｔｏｏｌ化ｓｔｕｄｙｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｅｎｔｉｎＳｏｌａｎｕｍ，ｐｃｏｅｒｓ－ｉｃｕｉｎＪＭｅｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ２１：１８３１９６ｌｙｐ［］．ｔ．０３９７５．；口引Ｘｕ。，ＦｒａｓｅｒＰＤ，ＷａｎｇＷＪ，ｅ／幻／．Ｄｉｆｅｒｅｎｃ巧ｉｎ化ｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｏｒｄｉｎａｒｙｃｉｔｒｕｓａｎｄ－－ｌｃｏｐ谢ｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｍｕｔａｎｔｓＪ．ＪＡｒｉｃＦｏｏｄ２００６５４１５：５４７４５４８１．ｙｇ］ｇＣｈｅｍ．；（）ｆｅｌｓｃｈＲＭａａｓｓＤＶｏｅｅｌＴｅｆ／ＴｒａｎｓｃｒｉｔｉｆａｃｔｏｒＲＡＰ２２ｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎａｒｔｎｅｒＳＩＮＡＴ２：口句Ｗｊ口．ｏｎ．抑ｄ，ｇ，ｐｇｐｓｔａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｅａｖｅｓ阴．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．２００７；１４５（３）：－１０７３１０８５．－－ｏｒｃａＰｓｃｕａＭ－化口引ＬａｌＪＭｕｒｃｉａＦｌｏｒｅｓａｒｒｅ乂巧＜３／．ＴｈｅＲＩＮＧｆｉｎｅｒｄｏｍａｉｎｏｆｅｆａｎｌｒｅｒｅｓｓｏｒ，ｋＧｇｇａｐｃｒｇＡｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒａｃｃｕｒａｔｅｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４；５２（５）：－１４６３１４７４．５ＳａＮｒｏＰＡ－［巧ｉｌｖＦａｖａｒＥｅｎａｒａｎｄａｅｆ如．ＡＲＩＮＧｆｉｎｅｒｒｏｔｅｉｎｒｅｕｌａｔｅｓｃａｒｏｔｎｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａ，，，ｇｐｇｅ－－－Ｍｌｉｄｅ进ｄｅｎｔｕｂＪｒｏｔｅｏｙｓｓｉｎｉｕｉｔｌａｔｉ抑ｏｆａｗｈｉｔｅｃｏｌｌａｒｌＩｉｋｅａｃｔｉｖａｔｏｒ．ｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ｐｐｑｙ［］；４－７０：１０２６１０％（）．７ＢｉｓｔｉＯａｄ－ｉａｔｃＷａｔＳｔｅｉｎｈｏ分ａ．ＢＬｅｄｉａｅｔｒｅｉｎｏｆＣＩＰＫｓｆａｌｉａｓ化ｅｄ说ｏｄｉｎｆ口］，氏ｒｓｔＬ／Ｃｍｔｄａｇｔｇｃｔｔｅｇｏ＊ｃａｈｉ－ｋｔｎｓｎａｓｉｄｉｌ０６２１１２２２．ｉｇｌｅｍａｎａｔｎｇ６０讯ｓｔｉｎｃｔ说ｌｕｌａｒｓｔｏｒ说■ＰｌａｎｔＬ２０１１（２）：口］；－ＫｉｍＫＮＣＹＨＧ．虹ｔｅｒａｃｔｏｃｉｎｉｋｅｃｕｍｈｅｏｎｕｐｔａ纽加ｉｃ巧ｄｔｏｆＡｒａｂｉｄｓｉｓａｌｃｅｕｒｉｎＢｌｃａｌｉ，ｇ，ｏｎｓｐｅｐ口糾良ｙ－ｓｅｎｓｏｒｓ細ｄｔｉｎ．Ｐ００１２４４１８４４１ｈｅｒｔａｒｇｅｔｋｉａｓ巧ｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．２０（）：８巧．…；－５９余小林４．：［］，曹家树梅等．植物细胞色素Ｐ５０．细胞２００４０６１７２２．，崔辉阴生物学杂蟲；（）［６０Ｄｕ抑ＨＳｃｈｕｌｅｒＭＡ？口ｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｓｉｓＣＹＰ８６Ａｓｕｂｆａｍｉｌ．］，ｐｐｙ…Ｐ－ｌａｎｔＰｈｓｉｏｌ２００５１ｙ；１３７（３）；１０６７０８１．［６Ｕ贺丽虹，赵淑娟，胡之璧．植物细胞色素Ｐ４５０基因与功能研究进展阴．药物生物技术．２００８；（０巧：１４２－１４７．６２ＢＳＢｓＦＢｉｓｔＣｍｅ４５０ＪＡｉｓＢ２０１１９０１４４．［］ａｋ，ｅｉｓｏｎｈｏｐＧｅａｌｔｏｃｈｒｏｓ．ｒａｂｉｄｏｓｏｏｋ．：ｅ，，ｙｐ［］ｐ；－－６；３ＮｅｌｓｏｎＤＷｅｒｃｋＲｅｉｃｈｈａｒｔＤＡＰ４５０ｒｅｉｅｎｖｏｕｎＪ．巧Ｊ．２〇ｎ６６１：．ｃｅ打ｔｉｖｗｏｆｌａｔｅＩｔｉｏａｎｔ［］，ｐ［］；（）１９４－２１１．［６４］ＺａｎｇｅｒＵＭ，ＳｃｈｗａｂＭ．ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｅｎｚｙｍｅｓｉｎｄｒｕｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｅｇｇｇ３９ 参考文献ｅｘｒｅ巧ｉｏｎ，ｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，地ｄｉｍａｃｔｏｆ細ｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏ打［Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｎ２０１３；１３８（１）：ｐｙｐｇ］－１０３１４１．［６引ＷｉｔｈｅｒｓＪ。ＳｈｉｐｐＭＪ，ＲｕｐａｓｉｎｇｈｅＳＧ，ｅｆａ／．ＧｒａｖｉｔｙＰｅｒｓｉｓｔｅｎｔＳｉｇｎａｌ１（ＧＰＳ１）ｒｅｖｅａｌｓｎｏｖｅｌｃｏｃｈｒｏｍｅ－ｙｔＰ４５０ｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒａｖｉｔｒｏｉｓｍ机．ＡｍＪ良ｏｔ．２０１３１００１：１８３１９３．ｇｐ；（）６ｉＨＹｕＸＷａｎ幻／？Ｅｖｏｌｕｔｉｏ打ａｉｙｏｒｉｉｎｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎａｎｄｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ［巧Ｑｉ，，ｇ乂巧ｇ，ｇｐｌ４４５７ｈｄｒｏｘａｓｅｓｉｎｅｕｋａｒｏｔｉｃｈｏｔｏｓｙｎ出ｅｔａａｅＪ．ＢｃＧｅｎｏｉｃ．２０１３１．ｙｙｉｃｊ讯ｍｓ：ｙ；ｐｇ［］６７ｕｉｎｌａｎＲＦＪａｒａｄａｔＸＴｌＥＴ．ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｌｆｉｏｎａｌｉｏｎｏｌＱＷｕｒｔｚｉａｓ过ｔｒｍｆｒｆｕｎｃｔｅｘｒｅｓｓｆａｎｔ，，ｅａｃｏＵａｏｏ［］ｐｐｐ－Ｐ４５０ｃａｒｏｔｅｎｅｈｒｏｘｌａｓｅｓＪ．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍｏｈ００７４５８２１４６１５７．ｙｄｙ［］执ｙｓ．２：ｐ；（）６＊ｉＤｅｌａＰｅｎｎａＤＤｅｒｒｏｕｅｅｎｓｉｌｔｓｈｅｉｌｒａｂｉｄｏｉ［巧ＫｍＪｌ．ｅｆｉｎｉｎｇｔｈｉｍａｒｔｆｏｒｌｕｔｉ化ｅｓｓｉｎａｎ：ｔｏｅｏｆＡｓｓ，ｐｙｎｙｐｐ－－ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｅｔａｒｉｎｈｄｒｏｘｌａｓｅＣＹＰ９７Ａ３Ｊ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００６１０３（９：３４７４３４７９．ｇｙｙ［］；）６９－ｌＫｉｍＪＥＣｈｅｎＣｒａｆｔｉｉ［ＭＮＥｔａＯｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｉｈａｃａｒｏｔｅｎｄｈｄｒｏｘｌ］，ｇＫ，ｅｌｓｓｔａｎａｏａｓｅｓ，ｐｐｙｙ－ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｄｉｉｉｄｅｓｉｎｉｎｏｉｎｖｙａｎｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｏｎｗｔｈａｂｅｔａｃａｒｏｔｅｎｅｋｅｔｏｌａｓｅｐｒｏｖｓｉｇｈｔｔｉｖｏｏｃｈｅｍｓ１－－ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ…．Ｐｈｙｔｉｔｒｙ．２０１０７２３：１６８１７８．；（）７０ＣｈｅｎＳＺｈｏｕＤ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓｏｆａｒｏｍａｔａｓｅｃｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｃｏｍａｒａｔｉｖｅ［］，ｙｐｆ－ｉｍｅｎｔａｎａｌｙｓ故ｏａｍｉｎｏａｃｉｄ化ｑｕｅｕｅ巧抑ｄｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｄｂｙｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅ打的ｉｓｅｘｐｅｒｓ．Ｊ口］Ｂ－ｉｏｉＣｈｅｍ．１９９２２６７１：２２５８７２２５９４．；口）２０－３７９３８７．口叫解敏乾粪达平．烟４５０的０３：，李凤霞等草细胞色素Ｐ基因姐学分析町遗佑化（）－７２ＺｈａｎＪＴＷＨｕＹ／ｏｗｎ－ＤｌｋｅｎｅＯｓＩＧｌａｎｇａｎｇｌｒｒｅｏｆ［］ｇ巧幻？ＤｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆａＬＢｉｅｅａｄｓ化ｏｃｃｕｎｃｅ，，，ｇｇ，，ｕｎｕｓｕａｌｄｏｕｂｅｌｌｏｍｅｎｌａｒａｌｉｅｏｆｖｒｉｏｕｓｆｌｏｒａｌｏｒａｎｓｌｏｖｕｅｓａｎｄｄｅｖｅｐｔａｂｎｏｍｉｔｓａｇａｎｄｍｅ－ａａｍｅｔｏｈｔｅｉｎｒｉｃｅＪ．ＪＥＢｏｔ２０１５６６１：９９１１２．ｇｇｐｙ．［］邱；（）７３Ｈ－Ｊ＾ｌ巧如Ｈｈ０Ｃ８６Ａ２２ｓｆａａｃＣＡ］ａｎＣｅｍｅ打ｔＪＭＬｉｉｅｃｒＰ４５ＹＰｉ过ｔｔｌｏ［，，义ｙｔｏｃｏｍｅｙｙ－ｏｍｅｇａｈｄｒｏｘｍａＢ．ｙｙｌａｓｅｅｓｓｅ打ｔｉａｌｆｏｒＥｓｔｏｌｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｓｔｉｇｏｆＰｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄ过口．ＪｉｏｌＣｈｅｍ］２０－１０２８５：３９８６３９％．；巧）７４巧ａｏＦＧｏｏｄｗｉｎＳＭＸｉａｏＹ巧ａ／．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣＹＰ８６Ａ２ｒｅｒｅｓｓｅｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｔｙｅｉｎ［］，，，ｐｐｅ打ｅｎｄ－ｇｓａｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｃ她ｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？ＥＭＢＯＪ．２００４２３１４：２９０３２９１３．口］；（）４０ 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致谢来浙江师范大学复试仿佛还在昨天，转眼Ｈ年的研究生生活已经接近尾声。回首运Ｈ年的研究生生活，有很多收获，也有许多要感谢的人。我的学位论文是在导师杨莉副教授精也指导下完成。杨老师对于科硏严谨的态度Ｗ及精益求精的作风对我影响尤其大。让我学习到在学习、生活及后的工作中需要对自己更加严格要求。杨老师除了在实验及学习中给予我指导和帮助，也在生活中给予了很多关也和教导。在本论文完成之际，谨向我的导师杨莉副教授致Ｗ最诚擎的谢意和最衷也的祝福。在这Ｈ年也得到许多老师和同学的帮助。首先感谢课题组所有老师：郭卫东老师，孙梅好老师，陈文荣老师，徐丽珊老师，王芳老师，，廖芳蕾老师路梅老师，李永强老师等在实验过程中给予的指导和帮助。其次感谢王长春老师在实验和生活中的帮助。还要感谢实验室所有的兄弟姐妹们：感谢师姐王梨嫣和潘永娟，师妹刘伟娜及师弟。叶强感谢实验室的全体本科生；已经毕业的张洋洋、王梦雅、杨振国、冯正鹏、吕栋等；还在实验室的张歳、周嘉翔、康振、韩凤琴、仲经亚等。感谢你们这Ｓ年的陪伴，让我在实验室生活中得到很多的快乐。感谢我同学肉康康、陈雅彬、张弘等，感谢帮助过我的每一个人。最后感谢亲爱的家人对于我学业上的理解与支持切及生活上无私的爱！４４ 攻读硕±学位期间发表的学术论文目录．ＤＡＤ研究．潘永娟，金晓琴，刘伟娜，徐玲玲，杨莉抗细胞调亡蛋白进展浙江师范大学学报．胡海涛，金晓琴，成死平，杨莉，陈建华，番汝昌，杨玲密花胡顽子果实主要类胡萝ｈ素组分及含量分析．中国农业科学金晓琴－监，康振，刘伟娜，潘永娟，王莉媛，郭卫东，杨親蜜袖泛素蛋白连接酶ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ基因的克隆与表达分析．园艺学报４５ 浙江师范大学学位论文诚信承诺书我承诺自觉遵守《浙江师范大学研究生学术道德规范管理条例》。我的学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明并详细列出有关文献的名称、作者、年份、刊物名称和出版文献的出版机构、出版地和版次等内容。论文中未注明的內容为本人的研究成果。如有递反…，本人接受处罚并承担切责任。承诺人（研究生）；／多論指导教航王４６ 浙江师范大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文嵩我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究巧果，不包含其他入或其他巧构己经发？论文中除了特别加Ｗ标注和致谢的地方外巧或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的爲度和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并衰示了谢意。。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担作者签名滿日期：Ｉ巧Ｊ月＞０学位絶文使话授权声巧本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：举校有权保留并和借阅，可！＾＾向圍家有关机关或机构送交论文的夏印件和电子文挡，允许论文被查阅采巧影印、痛印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江沛范大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发衰，、传播论文的全部或部分内容保密的学位论文在解密后邀守此协议。作者签名导师签名期：Ｋ年巧诚谦蔡（呼４７