杀虫剂对中华蜜蜂解毒酶的影响 65页

密级:论文编号:中囯农业科学院立论文杀虫剂对中华蜜蜂解毒酶的影响TheEffectsofPesticidesonActivityofDetoxificationEnzymesinApisceranacerana硕士研究生：靳三省指导教师：刁青云研究员申请学位类规农学硕士专业.•特种经济动物饲养研究方向：蜜蜂毒理学培养单位；中国农业科学院蜜蜂研究所中国农业科学院研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheEffectsofPesticidesonActivityofDetoxificationEnzymesinApisceranaceranaM.S.Candidate：JinSanshengSupervisor：Prof.DiaoQingyunMajor：SpecialEconomicAnimalRearingSpecialty:HoneybeeToxicologyMay2015 本研究由以下项目资助：1、国家科技支撑项目“蜜蜂、蚕、毛皮动物等特种经济动物资源高效利用技术研究与示范”（项目编号：2011BAD33B04）2、国家自然科学基金项目“化学农药对蜜蜂生长发育和解毒酶系的亚致死效应研究”（项目编号：31101772）资助。 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：t时间：年6月/曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名时间：>«士年（月/日导师签名:时间：^士年&月丨曰 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目杀虫剂对中华蜜蜂解毒酶的影响特种经济论文作者靳三省专业研宄方向蜜蜂毒理学动物饲养指导教师刁青云研宄员培养单位（研宄所）蜜蜂研宄所硕（博）姓名职称单位专业导师评阅人答辩主席硕导口北京市农林科学院植物张芝利研宄员昆虫学博导Q保护环境保护研宄所硕导口张润志研究员中国科学院动物研宄所昆虫学博导0硕导口中国农业大学高希武教授昆虫学博导曰农学与生物技术学院答硕导□中国农业大学彩万志教授昆虫学博导0农学与生物技术学院辩硕导口中国农业大学秦玉川教授昆虫学博导0农学与生物技术学院委员会议记录（秘书）杨磊论文答辩时间地点2015年5月22号蜜蜂所会议室 摘要吡虫啉和氟胺氰菊酯是农业生产中常用农药，亚致死剂量的农药影响意大利蜜蜂（意蜂）的识别行为、采集行为和生长发育。中华蜜蜂（中蜂）比意大利蜜蜂对农药更加敏感，但有关中蜂的毒理学特性研究较少，本论文研究了不同时间和剂量的吡虫啉和氟胺氰菊酯作用下，中蜂解毒酶的活性变化，以及亚致死剂量的吡虫啉对中蜂转录组表达的影响。在实验室条件下，采用饲喂法和药膜法，测定吡虫啉对中蜂的LC5为3.044mg/L和0.683mg/L，氟胺氰菊酯对中蜂的LC50分别为177.314mg/L和7.024mg/L。LC5浓度的吡虫啉处理，不同作用方式之间差别较大，中蜂体内解毒酶活性都呈现波动性变化。饲喂处理可诱导细胞色素P450（P450）和羧酸酯酶（CarE）活性升高，在4h达到最高值，分别为对照的1.44和1.27倍；谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）在12h达到最大值，为对照的1.21倍。药膜法处理后，P450和GSTs均被抑制，在4h和12h酶活性最低，达到对照的0.59倍；CarE激活明显，在16h最大，为对照的1.4倍。饲喂高剂量的吡虫啉抑制解毒酶活性，高浓度的吡虫啉药膜激活解毒酶活性。LC5浓度氟胺氰菊酯处理，饲喂法作用下，P450活性显著降低，然后逐渐提高，在16h最高，为对照的1.28倍；CarE活性随着时间延长逐渐降低，在24h最低，为对照的0.78倍；GSTs活性变化幅度不大，始终高于对照。药膜法处理后解毒酶活性受到抑制，P450活性在12h时最低，为对照的0.5倍；CarE和GSTs酶活性在20h最低，为对照的0.7倍。高剂量的氟胺氰菊酯药膜激活三大解毒酶活性，饲喂高剂量的氟胺氰菊酯对解毒酶的影响不大。作为蜜蜂神经系统中的一个重要酶，乙酰胆碱酯酶（AChE）对神经系统信息传递至关重要。杀虫剂可以改变AChE的活性。LC5浓度的吡虫啉和氟胺氰菊酯处理中蜂后，在24h内AChE活性呈现下降-上升的趋势。饲喂低剂量的吡虫啉激活AChE活性，LC20以上的高剂量不改变AChE活性，而高剂量的氟胺氰菊酯抑制AChE活性。药膜法作用后，低剂量吡虫啉对AChE没有影响，LC30浓度时酶活性显著提高，但是LC10低浓度的氟胺氰菊酯激活AChE活性，随着剂量变大，活性逐渐降低。相同浓度的杀虫剂，使用不同的作用方式，对中蜂三大解毒酶和AChE的影响不同。药膜法的毒性高于饲喂法，蜜蜂取食含有杀虫剂的糖水后，经过中肠内多种解毒酶的解毒代谢作用，降低了杀虫剂的毒性。饲喂LC5浓度的吡虫啉，可以明显改变中蜂转录组的表达，随着时间的延长，转录组的表达受到的影响逐渐变大。这些表达量发生改变的基因主要富集于氨基酸代谢、脂类代谢、核酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、多糖合成与代谢系统、免疫系统、外源性化合物代谢系统等，这些系统多与增强蜜蜂代谢和抗性能力有关。本文从酶活性和转录组表达水平全面分析了农药对中蜂的影响，为以后深入研究中蜂的农药代谢机理，阐述杀虫剂对中蜂的影响奠定基础。关键词：中华蜜蜂，吡虫啉，氟胺氰菊酯，解毒酶，转录组I AbstractAsthetypicalexampleofneonicotineandpyrethroid，imidaclopridandfluvalinateaffectedtherecognitionbehavior,pollinationbehavior,growthanddevelopment.ApisceranaceranawasmoresensitivetopesticidethanApismellifera,whiletherewaslittleresearchaboutApisceranaceranatoxicologicalcharacteristic.Theenzymaticactivitieswhenthebeefedorcontactedwithdifferentconcentrationofimidaclopridandfluvalinatewereresearchedinthisarticle.Thehoneybeetranscriptomexpressionat1h、8hand16hafterfeedingLC5doseofimidaclopridwasalsodemonstratedinthepaper.Underlaboratorycondition,thefeedingandresidualfilmmethodwereusedtodeterminethetoxicityofimidaclopridandandfluvalinateontoApisceranacerana.ThevalueofLC50was3.044ppmand0.683ppm,177.314ppmand7.024ppmseparately.Withthesameconcentration,thereweresignificantdifferencesbetweenfeedingandresidualfilmmethods.TheenzymaticactivityofP450/CarE/GSTsfluctuatedwhenhoneybeeweretreatedwithLC5doseofimidacloprid.P450andCarEgotapeakactivityat4h(1.44and1.27timesasCK),meanwhileGSTsachievedthehighestactivityat12h(1.21timesasCK)withfeedingmethod;P450andGSTswereinhibitedwithanadiractivityat4hand12h(all0.59timesasCK),butCarEwasinducedat16h(1.4timesasCK).WhenhoneybeeateLC5doseoffluvalinate,activityofP450reducedsignificantly,thenincreased,gotapeakpointat16h(1.28timesasCK).TheactivityofCarEgraduallyreducedastimeextending,whichwasverylowat24h(0.78timesasCK).TheactivityofGSTswhichwasalittlehigherthanCK,hadnosignificanteffect.AllthethreedetoxificationenzymeswereinhibitedafterhoneybeecontactedLC5dosepesticidewithresidualfilmmethod.P450gottheminimumat12h(0.5timesasCK),whileCarEandGSTsgotthelowestactivityat20h(0.7timesasCK).Withhighdoseoffluvalinate,contactinghadmoreobviouseffectonenzymaticactivitythanfeeding.Asakeyenzymeinhoneybeenervoussystem,itiscrucialtoneuralinformationtransfer.AChEcanbeaffectedbypesticide.TheactivityofAChEchangedin24hafterLC5doseofimidaclopridandfluvalinateused.Inthefeedingmethod,lowdoseofimidaclopridreducedAChE,buthigherthanLC20doseofimidaclopridhadnosignificanteffectonAChEactivity.Onthecontary,highdoseoffluvalinateinhibitedAChE.Intheresidualfilmmethod,lowdoseofimidaclopridhadnoeffectontheactivityofAChEexceptLC30whichinhibitedAChE.LC10doseoffluvalinatesignificantlyincreasedactivityofAChE.Thenwiththedoseoffluvalinateincreased,theactivitydecreasedgradually.FeedingwithLC5doseofimidacloprid,honeybeehadsignificantchangesonthetranscriptomexpression.Withtheextensionoftime,theeffectofimidaclopridonhoneybeetranscriptomexpressionreducedgradually.Thischangedgenesweremainlyenrichedinaminoacidmetabolism,lipidmetabolism,nucleicacidmetabolism,carbohydratemetabolism,energymetabolism,metabolismofcofactorsandvitamin,polysaccharidesynthesisandmetabolism,immunesystem,exogenouscompoundsmetabolism,etc.Thischangedmetabolismsystemsweremainlyusedtostrengthenthemetabolismandresistanceability.II Withthesamedose,differentpesticidehavedifferenteffectontheactivityofdetoxificationenzymes.Thetoxicityofresidualfilmmethodwerehigherthanfeedingmethod.Thereasonwasthatpesticidecanbemoreeasydegradedbythedetoxificationenzymeinmidgutwhenitwaseatenbyhoneybee,Thisarticlegivesacomprehensiveanalysisoftheeffectofpesticideonhoneybeefromenzymaticactivitytotranscriptomexpression.Itlaythefoundationforfurtherstudyinghoneybeepesticidemetabolismmechanismandclarifyingtheeffectofpesiticide.Keyword:Apisceranacerana,imidacloprid,fluvalinate,detoxificationenzyme,transcriptomIII 目录第一章引言.......................................................................................................................11.1杀虫剂的现状...........................................................................................................11.2杀虫剂简介...............................................................................................................11.2.1吡虫啉................................................................................................................11.2.2氟胺氰菊酯........................................................................................................31.3杀虫剂的残留...........................................................................................................41.3.1农业生产中吡虫啉的残留................................................................................41.3.2蜂产品中氟胺氰菊酯的残留............................................................................41.4蜜蜂的重要性及其现状...........................................................................................51.5农药对蜜蜂的危害...................................................................................................61.5.1农药对蜜蜂生理行为的影响............................................................................61.5.2农药对蜜蜂解毒代谢酶系统的影响................................................................61.6课题研究的目的和意义...........................................................................................7第二章杀虫剂对中华蜜蜂的毒力测定...........................................................................82.1材料与方法...............................................................................................................82.1.1实验蜜蜂............................................................................................................82.1.2实验材料............................................................................................................82.1.3实验方法............................................................................................................82.1.4数据分析............................................................................................................92.2结果与分析...............................................................................................................92.3讨论...........................................................................................................................9第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响.....................................................................113.1材料与方法.............................................................................................................113.1.1实验蜜蜂..........................................................................................................113.1.2实验材料..........................................................................................................11IV 3.1.3生物处理..........................................................................................................123.1.4酶液的制备......................................................................................................123.1.5细胞色素P450O-脱乙基活性的测定............................................................123.1.6CarE活力测定.................................................................................................133.1.7GSTs活性测定................................................................................................133.1.8数据分析..........................................................................................................133.2结果与分析.............................................................................................................133.2.1亚致死剂量的吡虫啉对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的时间效应...........133.2.2吡虫啉对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的浓度效应...................................153.3讨论.........................................................................................................................17第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响.............................................................194.1材料与方法.............................................................................................................194.1.1实验蜜蜂..........................................................................................................194.1.2实验材料..........................................................................................................194.1.3实验方法..........................................................................................................194.1.4数据分析..........................................................................................................194.2结果与分析.............................................................................................................204.2.1氟胺氰菊酯对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的时间效应...........................204.2.2氟胺氰菊酯对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的浓度效应...........................224.3讨论.........................................................................................................................23第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响.........................................................255.1材料与方法.............................................................................................................255.1.1实验蜜蜂..........................................................................................................255.1.2实验材料..........................................................................................................255.1.3实验方法..........................................................................................................255.1.4酶液制备..........................................................................................................26V 5.1.5AChE活性测定...............................................................................................265.1.6数据分析..........................................................................................................265.2结果与分析.............................................................................................................265.2.1吡虫啉对中华蜜蜂AChE的影响..................................................................265.2.2氟胺氰菊酯对中华蜜蜂AChE的影响..........................................................285.3讨论.........................................................................................................................29第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响..................................................316.1材料与方法.............................................................................................................316.1.1实验蜜蜂..........................................................................................................316.1.2生物处理..........................................................................................................316.1.3主要仪器..........................................................................................................316.1.4TotalRNA提取和纯化....................................................................................316.1.5cDNA文库构建...............................................................................................316.1.6测序..................................................................................................................326.2结果与分析.............................................................................................................326.2.1Illumina测序....................................................................................................326.2.2GO功能基因注解...........................................................................................336.2.3KEGG信号通路分析......................................................................................356.3讨论.........................................................................................................................38第七章全文总结.............................................................................................................407.1研究总结.................................................................................................................407.2研究展望.................................................................................................................40参考文献.............................................................................................................................42致谢.............................................................................................................................51作者简历.............................................................................................................................52VI 图表目录图1.1吡虫啉化学结构式.................................................................................................2图1.2突触信息传递过程和胆碱受体基本结构.............................................................2图1.3氟胺氰菊酯化学结构式.........................................................................................3图1.4蜂巢中蜜蜂和蜂蜡残留的氟胺氰菊酯与农药总量的关系.................................5图3.1饲喂法作用下LC5剂量吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应...............14图3.2药膜法作用下LC5剂量吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应...............15图3.3饲喂法作用下吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应...............................16图3.4药膜法作用下吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应...............................16图4.1饲喂法作用下LC5剂量氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应.......20图4.2药膜法作用下LC5剂量氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应.......21图4.3饲喂法作用下氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应.......................22图4.4药膜法作用下氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应.......................23图5.1LC5剂量的吡虫啉对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的时间效应........................27图5.2吡虫啉对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的浓度效应...........................................27图5.3LC5剂量的氟胺氰菊酯对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的时间效应................27图5.4氟胺氰菊酯对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的浓度效应...................................29图6.1饲喂LC5剂量吡虫啉，中华蜜蜂头部差异表达基因GO功能分析...............33图6.2饲喂LC5剂量吡虫啉，中华蜜蜂腹部差异表达基因GO功能分析...............34图6.3Unigene的KEGG分析，头部富集的KEGG通路.....................................35图6.4Unigene的KEGG分析，腹部富集的KEGG通路.....................................37VII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AChAcetylcholine乙酰胆碱ATchAcetylthiocholineiodide碘化硫代乙酰胆碱CDNB1-chloro-2,4-dinitrobezene1-氯-2,4-二硝基苯DEF1,2,4-Tributylphosphorotrithioate1,2,4-三丁基三硫磷酸酯DEMDiethylmaleate对马来酸二乙酯DTTDithiothreitol二硫苏糖醇DTNB5,5-Dithiobis-（2-nitrobenzoicacid）5-5-二硫双硝基苯甲酸ECOD7-EthoxycoumarinO-deethylation7-乙氧基香豆素氧脱乙基酶EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸GSHGlutathione谷胱甘肽NADPHTriphosphopyridinenucleotide还原型辅酶ⅡnAChRNicotinicacetylcholinereceptor乙酰胆碱酯酶受体ODOpticaldensity光密度SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠P450CytochromeP450细胞色素P450AChEAcetylcholinesterase乙酰胆碱酯酶CarEAcarboxylesterase羧酸酯酶GSTsGlutathione-S-transferases谷胱甘肽硫转移酶LC50Medianlethalconcentration致死中浓度LD50Medianlethaldose致死中剂量VIII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1杀虫剂的现状在二十世纪七十年代，除虫菊酯的发现和拟除虫菊酯类农药的合成，推动了化学农药新的发展，给杀虫剂市场带来了新变化和新标准（CasidaandQuistad,1998）。在吡虫啉的研究出现以前，拟除虫菊酯类农药占据杀虫剂市场的主导地位，九十年代以后吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂开始大范围出现，由于它具有高效、广谱，药效持续时间长，针对性强，对哺乳动物危害小等特点，被应用于防治农业生产中的刺吸式害虫。拟除虫菊酯和新烟碱类农药是维系近半个世纪的主要杀虫剂类型，占据杀虫剂市场三分之一份额。2005年新烟碱类农药占杀虫剂总销售量的16.3%，拟除虫菊酯类农药占杀虫剂总量的14.2%。2008年新烟碱类占23.7%市场份额（Jeschkeetal.,2010），在拌种剂市场新烟碱类占了77%（Elbertetal.,2008）。氟胺氰菊酯是20世纪80年代注册并广泛应用，具有高效、低毒、对非靶标生物安全，蜂业生产中用于防治蜂群中常见寄生虫-大蜂螨。随着全球粮食需求的不断增加，农药作为一种重要的农业生产资料，在控制病虫害发生、增加粮食产量方面发挥了重要的作用。各种农药的使用使全球粮食总产量增长约五分之一，特别在一些主要粮食作物、蔬菜和水果中，农药的使用更加频繁（OerkeandDehne,2004）。在农药市场快速发展带来巨大经济效益的同时，它们所带来的环境问题和健康问题也日益突出，受到人们的高度重视。随着使用时间的延长和剂量的增加，药液残留毒害经常发生（Pimenteletal.,1992），农药残留问题一直是危害我国农产品质量安全的重要因素，威胁人和动物的健康。有关害虫抗药性的报道频繁出现，致使农药防治效果降低，为增加防治效果，杀虫剂的使用剂量不断增加，给一些敏感性的非靶标生物造成影响，生存受到严重威胁。例如天敌昆虫数量和种类减少，作为重要的授粉昆虫，近些年种群数量不断减少，蜜蜂在采集过程中接触高剂量的残留农药会对其造成严重影响，可能是导致蜜蜂消失的原因之一。随着人民生活水平的不断提高，可用农业耕地和单位粮食产量面临瓶颈，农药在防治病虫害的发生、稳定粮食产量仍将占有一定地位。加强对杀虫剂的研究，指导杀虫剂的合理利用，是杀虫剂市场未来发展的一个重要问题。1.2杀虫剂简介1.2.1吡虫啉吡虫啉（imidacloprid），化学名为1-（6-氯吡啶-3-吡啶基甲基）-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，属于新型的硝基亚甲基类的内吸杀虫剂，由日本特殊农药株式会社和德国拜耳公司共同开发，1992年开始商品化生产。吡虫啉具有触杀和胃毒作用，由于其具有高效、广谱、药效持续时间长等特点，因此应用广泛，如今已经在60多个作物上得到应用（张咏梅和李今越,2004）。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.1吡虫啉化学结构式Fig.1.1Chemicalstructuralformulaofimidacloprid作为新烟碱类农药的典型代表，吡虫啉的主要杀虫机制是选择性地抑制昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的拮抗剂，它的竞争结合能力比乙酰胆碱要高，优先结合乙酰胆碱受体，进而阻断昆虫中枢神经系统的正常信号传导，引起信号通路阻塞，同时乙酰胆碱的大量积累，导致昆虫异常兴奋，麻痹而死（闫文等,2003）。与其他杀虫剂不同的是，吡虫啉也能够引起突触后电位增强和后续突触传递的可逆性阻断，这也是其毒性高于其他农药的重要原因（刘贤进等,1992）。图1.2突触信息传递过程和胆碱受体基本结构（HuibertDetal.,2009;EdsonXetal.,2009）Fig.1.2Theprocessofsynaptictransmissionandstructureofnicotinicacetylcholinereceptor2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2.1.1吡虫啉毒性根据“农药管理条例”的规定和“化学农药环境安全评价试验准则”的要求，研究人员进行吡虫啉对家蚕、蜜蜂毒性的安全性评价。实验测得，吡虫啉对2日龄家蚕的LC50（48h）为0.36mg/kg桑叶；吡虫啉对蜜蜂的胃毒毒性为LC50为66.7mg/L，但吡虫啉在农田正常有效用药量为100mg/L，蜜蜂取食后即可导致死亡；吡虫啉对蜜蜂的触杀毒性范围0.0001～1.0µg/只蜂，LD50为0.03µg/只蜂（龚瑞忠等,1990）。根据国家农药毒性与风险等级划分标准，吡虫啉对蜜蜂的接触剂量LD50（µg/只蜂）为0.001～1.99µg属于高毒级别。以吡虫啉为代表的多数新烟碱类农药，对蜜蜂属于高毒级别农药（苍涛等,2012）。1.2.2氟胺氰菊酯图1.3氟胺氰菊酯化学结构式Fig.1.3ChemicalstructuralformulaofTau-fluvalinate氟胺氰菊酯（tau-fluavlinate），化学名为（RS）-α-氰基-3-苯氧基苄基N-（2-氯-4-三氟甲基苯基）-D-氨基异戊酸酯，属于拟除虫菊酯类杀虫剂，具有胃毒和触杀作用，广谱高效，防治效果明显，对鸟类和哺乳动物低毒。自1988年以来，氟胺氰菊酯在蜂业生产中得到广泛地应用，以氟胺氰菊酯为主要成分的杀虫剂种类不断增加，使用量持续加大（Tsigourietal.,2001）。作为重要的菊酯类合成农药，氟胺氰菊酯首先作用于昆虫的神经系统，改变细胞膜的钠离子电压门控通道。也可作用于突触前端神经末梢的突触传递，影响神经递质的释放（SoderlundandBloomquist,1989）。1.2.2.1氟胺氰菊酯毒性氟胺氰菊酯最初来源于菊科植物的提取物，毒性较低，Santiago利用点滴法测得氟胺氰菊酯对意大利蜜蜂的致死中剂量LD50为0.88～0.97µg/蜂，对大蜂螨的致死中剂量LD50为15.42pg/螨（Santiagoetal.,2000）。加拿大NAESI报道，按照饲喂法处理，氟胺氰菊酯对意大利蜜蜂的致死中浓度LC50为65.8µg/g（O’Reillyetal.,2014）。但是氟胺氰菊酯对蜂螨的毒性随着地方和季节发生变化，毒性差异很大。根据相关研究报道，大蜂螨对氟胺氰菊酯的抗药性逐渐增强，耐药能力增加，氟胺氰菊酯的防治效果降低（Milani,1995）。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.3杀虫剂的残留1.3.1农业生产中吡虫啉的残留作为常用的杀虫剂的吡虫啉，使用范围较为广泛，仅2011年我国生产了1.1万吨含有吡虫啉的农药产品，用于防治农业害虫（Yuetal.,2014）。全世界范围内已经检测到土壤、植物、动物中都存在一定程度的吡虫啉残留（Ahnetal.,2013）。喷洒吡虫啉的金银花田地中，花朵中吡虫啉的原始含量为10mg/kg，半衰期为3d；土壤中的含量虽低于花中含量，也高达0.37mg/kg～3.2mg/kg，但半衰期较长，大约19d。吡虫啉的降解物在土壤中存在的时间更长，作用更久，虽然毒性稍低于吡虫啉，但对蜜蜂和家蚕等敏感昆虫仍属于中等毒性药物（Phugareetal.,2013）。播种用吡虫啉拌种过的玉米，当天即可以在种子周围的野生植被和土壤中检测到吡虫啉残留，4d后能够检测到玉米地周边杂草和花中残留的吡虫啉，一些植物甚至可以积累这些拌种剂释放的活性成分（Greattietal.,2006）。最近研究发现，植物叶片吐水中含有的农药残留更大，拌种过的玉米种子，其叶片吐水中吡虫啉含量为47±9.96mg/kg，有时同样的实验中，吡虫啉含量竟高达100mg/kg以上（Girolamietal.,2009）。在蜂场周围的河流中，同样可以检测到吡虫啉的残留，浓度在7～131µg/L（JohnsonandPettis,2014）。不管在饲喂还是接触情况下，吡虫啉对蜜蜂和熊蜂都属于高毒性农药（Sanchez-BayoandGoka,2014），同时土壤中残留的吡虫啉降解物同样对蜜蜂危害较大。1.3.2蜂产品中氟胺氰菊酯的残留氟胺氰菊酯主要用于防治大蜂螨，属于蜂群内部用药，在各种蜂产品中的残留量较大，在蜜蜂体内也可以检测到氟胺氰菊酯的存在。在法国五个地区收集到的125个样品的蜂蜡中，有61.9%检测到氟胺氰菊酯的存在，含量最高可达422µg/kg，平均浓度为196.4µg/kg（ChauzatandFaucon,2007），花粉中的氟胺氰菊酯含量可达334µg/kg，花蜜中的含量为44.7µg/kg（Chauzatetal.,2009）。在北美地区开展的蜂产品农药残留量检测中，发现在259份巢蜡中，有254份含有氟胺氰菊酯，最高含量为204ppm，平均含量为7.47mg/kg。同样在花粉样品的检出率为88.3%，含量相对较低，最高浓度为2.670µg/kg，平均浓度为95µg/kg。在21份巢础样品中全部检测到氟胺氰菊酯的存在，虽然浓度比巢蜡中的浓度低了许多，但最高浓度达到1012µg/kg；在140份蜜蜂个体样品中有83.65%检测出氟胺氰菊酯，含量较大，最大浓度为5.86mg/kg，平均浓度为357µg/kg（Mullinetal.,2010）。在西班牙的蜜蜂个体检测中，96.8%的样品中含有氟胺氰菊酯，含量996.49～2.384µg/kg（Orantes-Bermejoetal.,2010）。陈兰珍等对我国蜂蜜进行调查，124个样品中有7个被检测出含有氟胺氰菊酯（陈兰珍等,2004）。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.4蜂巢中蜜蜂和蜂蜡残留的氟胺氰菊酯与农药总量的关系（Mullinetal.,2010）Fig.1.4Correlationsofbeeandwaxfluvalinateresidues（ppb）withtotalpesticidecontentsinpairedcolony1.4蜜蜂的重要性及其现状蜜蜂作为生态系统中重要的媒介昆虫（苏松坤和陈盛禄,2009），是现代农业生产模式下作物增产的重要因素，同时也可以明显提高农作物产品质量（Bartomeusetal.,2014;Garrattetal.,2014）。作为人类的朋友，蜜蜂不仅带来了丰富的蜂蜜等蜂产品，而且它的授粉行为所带来经济价值和社会效益更加重要（Allen-Wardelletal.,1998）。全美国养殖蜜蜂所产生的经济效益约1400万美元（vanEngelsdorpetal.,2008），社会效益每年增加16-57亿美元（SouthwickandSouthwick,1992;LoseyandVaughan,2006）。我国是传统的农业大国，农作物种类繁多，种植面积较大，蜜蜂授粉对中国粮食生产同样占有重要地位。蜜蜂授粉不仅提高粮食产量，还可以提高水果和蔬菜品质（Garrattetal.,2014）。2006-2008年间，我国主要农作物因蜜蜂授粉而增加的价值达3042.20亿元，远高于我国蜂业总产值40亿元，相当于占我国农业总产值的12.30％（刘朋飞等,2011）。巨大的效益背后面临着严重危机，2006年以来，美国和欧洲相继报道蜜蜂异常消失现象，称为蜂群崩溃失调症（Oldroyd,2007）。半个世纪以来，蜜蜂在北美和欧洲范围内都不断减少（vanEngelsdorpandMeixner,2010），在美国全境，2008-2009年的冬季里，蜜蜂蜂群总数减少29%，显著高于之前每年的消失数（vanEngelsdorpetal.,2010）。每一个生物体周围都是一个复杂的环境，都会受到化学物质和环境压力的双重作用（Holmstrupetal.,2010），对于蜂群崩溃失调症的原因解释，到目前为止，养蜂界还没有形成具体的共识，但可以肯定，它是多种原因综合作用产生的结果（Bekicetal.,2014），例如一些病害和微孢子虫的联合作用，降低蜜蜂的抵抗力；蜜蜂麻痹病毒和残翅病毒大规模发生（Joachimetal.,2009）；农业环境气候的改变，以及农业的大规模单一5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言化种植等（vanEngelsdorpandMeixner,2010）；蜜蜂生活区域的环境不断恶化更容易使蜜蜂受到外源性物质的危害（Bromenshenketal.,2010）。其中一个重要原因就是田间用药和蜂群用药大量使用，破坏蜜蜂的生物学习性，导致蜜蜂蜂群的衰弱，进而崩溃消失（Committee,2010;Pottsetal.,2010）。1.5农药对蜜蜂的危害1.5.1农药对蜜蜂生理行为的影响从2006年报道蜜蜂种群崩溃失调症以来，蜜蜂消失的现象在北美、欧洲和日本都有报道，虽然在中国没有相关的报道，但是由于环境的改变和外源性有害物质过量积累，也给我国养蜂业发展带来一定的影响（ChunshengandXuefeng,2011）。饲喂一定量的吡虫啉，对熊蜂个体发育影响不大，但可以明显降低熊蜂的生殖能力（Laycocketal.,2012）。吡虫啉影响意大利蜜蜂头部乙酰胆碱受体的分布（周婷等,2013），也改变蜜蜂的取食行为和学习行为（代平礼等,2013）。农药的存在也会间接地影响蜜蜂，饲喂低剂量的吡虫啉可以明显增加蜜蜂中肠内微孢子虫的生长（Pettisetal.,2012）。意大利蜜蜂对单个农药比较敏感，但是对于所有的农药综合评价，蜜蜂与其他的一些昆虫相比不属于最敏感物种（HardstoneandScott,2010）。中华蜜蜂具有不同于意大利蜜蜂的独特习性，针对于农药对中华蜜蜂的影响研究较少。吡虫啉影响中华蜜蜂的进食量，随着浓度增加，取食量逐渐降低（王钰冲等,2013）。蜂产品中残留的杀螨剂可以显著降低外出采集蜂的数量，一些杀虫剂的存在可以降低与中华蜜蜂认巢记忆相关酶系统的表达活性（杨爽和谭垦,2011）。农药使用后的代谢物和残留物对蜜蜂具有同样重要的影响，应该给予重视。吡虫啉属于蜜蜂的高毒药物，例如吡虫啉代谢后的一些烯烃物质和7-羟基吡虫啉，它们对蜜蜂属于高毒性物质（Suchailetal.,2001），破坏蜜蜂生理行为。1.5.2农药对蜜蜂解毒代谢酶系统的影响蜜蜂体内有超过1000个蛋白编码基因，其中有许多的解毒代谢酶系统，例如微粒体氧化酶、谷胱甘肽硫转移酶、细胞色素氧化酶、酯酶等，它们共同组建了蜜蜂的防御体系，维持正常的生理活动（Yuetal.,1984;Claudianosetal.,2006）。多数的解毒代谢基因分属于三大酶类：细胞色素P450单加氧酶（P450）、谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）、酯酶（CCE）。蜜蜂的三大代谢酶数量显著低于黑腹果蝇和冈比亚疟蚊，这可能是蜜蜂对农药等外源性物质较为敏感的原因（Claudianosetal.,2006）。蜜蜂体内细胞色素P450单加氧酶可以降低菊酯类农药对蜜蜂的毒性，尤其是P450中CYP3家族参与氟胺氰菊酯的代谢，也是多数田间害虫产生抗拟除虫菊酯类农药的关键酶（Johnsonetal.,2006）。氟胺氰菊酯可以诱导CYP9Q3的转录，但另一个拟除虫菊酯类农药（联苯菊酯）可以抑制CYP9Q3的转录，诱导CYP9Q1和CYP9Q2过表达（Maoetal.,2011）。吡虫啉的存在能够促进P450家族的表达，下调与糖酵解和糖代谢途径相关基因表达（Dereckaetal.,2013）。一些自然存在的物质，也可以影响蜜蜂解毒代谢酶的活性，槲皮素和蜂花粉的存在，明显降低了氟胺氰菊酯对蜜蜂的毒性；蜂胶和蜂花粉可以增强P450中CYP6AS亚家族的表达，提高蜜蜂的解毒能力6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言（Johnsonetal.,2012;靳三省和刁青云,2014）。GSTs在蜜蜂面对氧化压力的时候具有重要作用，其中GSTO1家族起着保护机体免受氧化破坏的作用（Jiaetal.,2014）。蜜蜂的一些解毒酶活性与其所处的条件有关，例如蜂群周围环境、不同发育阶段（Sogorbetal.,1988）、取食种类等。蜜蜂饲喂高果糖浆饲料后，蜜蜂中肠内的一些酶活性发生改变，但是整体差异不显著（孟丽峰等,2013）。1.6课题研究的目的和意义蜜蜂在农业生态系统中占据着至关重要的一个环节，也是农业增产和农民增收的重要载体。蜜蜂是群居性社会昆虫，受外界环境影响小于其他昆虫，但以化学农药为代表的外源性有害物质在环境中滥用和大量残留，已经给蜜蜂的生存造成威胁（李志勇等,2014）。野生授粉昆虫的减少降低了生态系统的生物多样性（Biesmeijeretal.,2006）。中华蜜蜂是我国本土物种，与意大利蜜蜂相比，其利用零星蜜源的能力较强，更适合我国的种植模式（杨冠煌,2009），保护中华蜜蜂，提高授粉效益是缓解当前蜂业生产中面临问题的有效措施之一。解毒代谢酶主要参与了化合物生物降解的第一阶段和第二阶段，也是外源性物质进入生物体内降解的关键代谢步骤，酶活性的改变直接影响着生物的解毒代谢能力和耐药能力。蜜蜂处在具有氧化压力的环境中，解毒代谢酶的基因表达和活性都发生着变化，蜜蜂生理和行为也随之变化。了解这些解毒代谢酶特性，掌握蜜蜂的代谢机理，是保护蜜蜂免受外源性化合物危害的基础性工作。意大利蜜蜂是全球性品种，研究相对较多，但是有关我国传统中华蜜蜂的研究较少。本论文选用田间应用较为广泛的吡虫啉和蜂业生产中常用的氟胺氰菊酯，研究它们对中华蜜蜂的影响，了解中华蜜蜂对两种农药的毒理学特性和相关解毒代谢酶表达水平，为进一步掌握外源性物质对中华蜜蜂的影响奠定基础，为化学农药的合理使用提供技术支持。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章杀虫剂对中华蜜蜂的毒力测定第二章杀虫剂对中华蜜蜂的毒力测定吡虫啉属于新烟碱类杀虫剂的典型代表，对意大利蜜蜂高毒。氟胺氰菊酯属于拟除虫菊酯类杀虫剂，对大蜂螨具有较高的防治效果，在意大利蜂群中应用较多农药毒力大小随着时间、地点、蜂群状态和蜜蜂日龄的不同，呈现不同的变化（Husainetal.,2014）。本章根据两种农药的胃毒和触杀作用，同时参照田间农药的使用方式，选择饲喂法和药膜法，测定吡虫啉和氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的毒性，计算毒力回归曲线，为以后实验提供参考。2.1材料与方法2.1.1实验蜜蜂中华蜜蜂取自云南农业大学东方蜜蜂研究所养蜂试验场（北纬22°42′30，东经100°56′01海拔1890m）健康蜂群的一日龄成年工蜂。挑选即将出房的子脾，放入人工气候箱里（相对湿度70±10%，温度33±1℃），待出房后，选取一日龄成年工蜂，进行实验测定。2.1.2实验材料吡虫啉（95%）购自美国杜邦公司；氟胺氰菊酯（纯度94%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；丙酮、血清瓶（100mL）购自国药集团化学试剂北京有限公司；人工气候箱（GSP-9080MBE）购自上海博迈实业有限公司医疗设备厂。2.1.3实验方法2.1.3.1药膜制作与生物测定用丙酮将吡虫啉原药配置成20000mg/L的母液，再用丙酮稀释成不同浓度的所需药液。吸取1mL不同浓度梯度的药液，加入100mL血清瓶中，将装有药液的血清瓶放倒在水平桌面上，缓慢来回滚动，使药液均匀涂在瓶子内壁面上，无液体存在时，放在阴凉干燥处待用。用纯丙酮作为对照组。取一日龄的成年工蜂，每个浓度处理10头蜜蜂，每个处理三次重复。在瓶底部放入含足量蜂蜜水的棉球，然后用两层细窗纱封口，放入人工气候箱，气候箱设置条件：黑暗，温度33±1℃，相对湿度60±10%，观察中华蜜蜂24h的死亡率。2.1.3.2饲喂法生物测定选一日龄的成年工蜂用于实验。在5ml小烧杯中放有0.1g的棉花团，加入用蔗糖水稀释的不同浓度的吡虫啉溶液，使棉花团充分浸泡，但不能自然滴下液体，放在蜂笼顶面上，用小烧杯倒扣在棉花团上，防止液体过快蒸发，让蜂笼内蜜蜂网笼取食。将处理好的蜂笼放在人工气候箱中，条件同2.1.3.1。随时观察棉花团上糖药混合液含量，及时添加，保证蜜蜂可以正常取食，每个处理20头蜜蜂，三次重复。饲喂同浓度蔗糖水为对照，观察记录中华蜜蜂24h的死亡率。8 中国农业科学院硕士学位论文第二章杀虫剂对中华蜜蜂的毒力测定2.1.4数据分析生物测定数据用PoloPuls2.0（Leorasoftware.MenloPark,USA）统计分析，计算LC50和回归方程。2.2结果与分析表2.1结果显示，药膜法作用方式下，吡虫啉对中华蜜蜂的致死中浓度LC50为0.683mg/L2（LD50=4.5ng/cm）；饲喂法作用方式下，吡虫啉对中华蜜蜂的致死中浓度LC50为3.044mg/L，饲喂法的致死中浓度较高。表2.1吡虫啉对中华蜜蜂的毒力回归曲线（24h）Table2.1Dose-lethalityrelationofimidaclopridonApisceranacerana（24h）处理方法回归方程95%置信限致死中浓度（mg/L）自由度卡方值MethodY=aX+b95%CLLC50nchi-square2药膜法Y=6.431X+1.0650.478～0.8960.683（4.5ng/㎝）30.907饲喂法Y=6.013X-2.9072.219～3.9243.04451.203注：Y=死亡率机率值，X=药剂浓度对数值，a=截距，b=斜率Note：Y=Mortalityprobabilityvalue,X=dose（Lg）,a=intercept,b=slope由表2.2结果可得，氟胺氰菊酯的毒性较弱，药膜法作用方式下，氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的2致死中浓度LC50为7.024mg/L（LD50=46ng/cm）；饲喂法作用方式下，氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的致死中浓度为LC50为177.314mg/L。蜜蜂处在药膜环境中的危害远大于直接饲喂同浓度的吡虫啉药液对蜜蜂产生的危害。表2.2氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的毒力回归曲线（24h）Table2.2Dose-lethalityrelationoftau-fluvalinateonApisceranacerana（24h）处理方法回归方程95%置信限致死中浓度（mg/L）自由度卡方值MethodY=aX+b95%CLLC50nchi-square2药膜法Y=8.085X-6.8455.280～9.1937.024（46ng/㎝）30.106饲喂法Y=10.208X-22.955150.313～207.402177.31451.649注：Y=死亡率机率值，X=药剂浓度对数值，a=截距，b=斜率Note：Y=Mortalityprobabilityvalue,X=dose（Lg）,a=intercept,b=slope2.3讨论吡虫啉是一种广谱性杀虫剂，具有叶面喷洒、种子拌药或在土壤中使用等多种使用方式，且均可高效防治多数害虫，但也给许多的有益昆虫带来影响。正常田间施药量给瓢虫的生长发育带来影响（Yuetal.,2014）。饲喂20-40µg/L的吡虫啉溶液，明显降低了中华蜜蜂的识别回巢能力，9 中国农业科学院硕士学位论文第二章杀虫剂对中华蜜蜂的毒力测定中华蜜蜂对有害物质的识别能力降低，更增加了外源性物质对蜜蜂的毒害（Tanetal.,2014）。我们测得两种作用方式下，吡虫啉对蜜蜂的亚致死浓度较低，有的田间吡虫啉残留量已经高于这个浓度，势必对蜜蜂的正常生命活动造成影响。氟胺氰菊酯属于拟除虫菊酯类农药，毒性显著低于新烟碱类杀虫剂吡虫啉的毒性，多数蜂产品中的残留量也低于其致死中浓度，由于拟除虫菊酯属于见光易降解类农药，降解较快，所以氟胺氰菊酯对蜜蜂的影响相对较小。生物测定结果与选择材料和环境有关。所选蜜蜂的状态和蜂群不同，生物测定结果相差较大。同一个蜂群，取出蜜蜂的时间不同，可能影响生物测定的实验结果。因此，我们取蜜蜂样品的时候，选择群势相同，强弱一致的蜜蜂，取蜂时间尽量控制在每一天的同一时间点，减少实验误差。实验测定结果显示，中华蜜蜂处在药膜覆盖的环境，对蜜蜂的毒性更大。因此在生产中，要避免蜜蜂直接接触到农药，以降低农药对蜜蜂的危害。在利用蜜蜂授粉的温室中，尽可能避免授粉期使用农药，以保护蜜蜂的授粉活动正常进行。10 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响昆虫体内有三大解毒酶系，包括细胞色素P450单加氧酶（P450）、谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）（Claudianosetal.,2006）。这些酶直接影响着昆虫的解毒代谢能力，参与了昆虫抗药性的形成过程（Enayatietal.,2005;Feyereisen,2005;Oakeshottetal.,2005）。蜜蜂体内同样具有这些解毒代谢酶，参与对外源性化合物的代谢，降低对蜜蜂自身的损害（Suchailetal.,2004）。P450和CarEs不仅具有解毒能力，还具有生物合成和信息传递的功能。外源性有害物质对这些解毒酶具有诱导效应，也具有抑制效应。不同的化学物质对蜜蜂解毒酶的影响也不尽相同，作用后的时间点不同，酶活性的表达效应也不同，农药的浓度也可以影响解毒酶的活性。本章选择新烟碱类和拟除虫菊酯类农药的代表药剂吡虫啉和氟胺氰菊酯，模拟了蜜蜂在采集过程中接触农药的两种方式（饲喂法和药膜法），确定两种农药对中华蜜蜂体内三大解毒酶的时间效应和剂量效应。3.1材料与方法3.1.1实验蜜蜂同2.1.1。3.1.2实验材料3.1.2.1试剂二硫苏糖醇（DTT，≥99%），还原型辅酶Ⅱ四钠盐（NADPH）为Biomol公司生产；苯甲基磺酰氟（PMSF，≥99%），为德国Merck公司产品；Tris-base购买于美国Promega公司；盐酸、氢氧化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸（EDTA）、三氯乙酸（TCA）、甘氨酸（Gly）、甘油、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、95%乙醇、无水乙醇均为分析纯，购买于北京化学试剂公司；7-乙氧基香豆素（98%）和7-羟基香豆素（98%）、α-乙酸萘酯（α-NA）、毒扁豆碱、1,1-二氯-2,4-二硝基苯（CDNB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、谷胱甘肽（GSH）、均购自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）购自北京同正生物公司；固蓝B盐购买于Fluka公司；考马斯亮蓝G250购买于Sigma公司；氟胺氰菊酯（94%），购购买于德国Dr.Ehrenstorfer公司；吡虫啉（95%），购购买于美国杜邦公司。3.1.2.2主要仪器血清瓶（100mL）购买于国药集团化学试剂北京有限公司；SPH-100B型恒温振荡器（上海世平实验设备公司）、人工气候箱（GSP-9080MBE，上海博迈实业有限公司医疗设备厂）、5417R型高速离心机（德国eppendoff公司）、LambdaBio-45LS55型荧光分光光度计和紫外-可见分光光度计（美国PerkinElmer公司）、UV2200紫外可见分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）。11 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响3.1.3生物处理根据第二章所测得的毒力曲线分别计算出饲喂法和药膜法作用方式下LC5、LC10、LC20、LC30、LC40、LC50的浓度，分别用上述剂量处理一日龄成年工蜂，生物测定方法同2.1.3。剂量效应：分别选取吡虫啉和氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的LC5、LC10、LC20、LC30、LC40、LC50的浓度，用饲喂法和药膜法两种方法处理中华蜜蜂，24h后将蜜蜂放入-20℃冰箱片刻麻痹。（1）取出解剖获取中肠，用玻璃棒将中肠排泄物除去，15%的氯化钾溶液漂洗后，立即用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，用于P450活性的测定。（2）截取整个腹部，用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，用于羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的活性测定。时间效应：选取LC5亚致死剂量的吡虫啉和氟胺氰菊酯，分别采用饲喂法和药膜法作用于中华蜜蜂，在1h、2h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h时间点，取存活的蜜蜂放入-20℃冰箱麻痹。（1）取出解剖获取中肠，用玻璃棒将中肠排泄物除去，15%的氯化钾溶液漂洗后，立即用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，用于P450活性的测定。（2）截取整个腹部，用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，用于羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的活性测定。3.1.4酶液的制备参考于彩虹和高希武（2005）制备细胞色素P450酶液的方法：在研磨中肠时加入预冷的pH7.5，1mol/L的磷酸缓冲液（含50mmol/L的DDT，50mmol/L的PMSF，1mmol/L的EDTA，10%甘油）冰浴匀浆，离心（4℃10800rpm10min）,抽滤得到上清液，用于P450活性和蛋白含量的测定；取处理过的蜜蜂腹部加入预冷的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液为0.04mol/L，测GSTs时，pH为6.5；测CarEs时，pH为7.0）充分研磨，离心（4℃10800rpm20min），抽滤得到上清液，用于酶活性和蛋白含量的测定。3.1.5细胞色素P450O-脱乙基活性的测定参考（HungandSun,1989）的方法，以7-乙氧基香豆素为底物，用荧光分光光度计测定细胞色素P450单加氧酶对7-乙氧基香豆素的脱乙基活性，通过其产物7-羟基香豆素的荧光变化值来确定酶活性。实验反应体系参照唐晓伟和孟丽峰（2013）的实验方法，反应体系为1mL，0.1mol/L的Tris-HCl、底物7-乙氧基香豆素、还原剂10mmol/L的NADPH和原酶液，37℃，220rpm恒温振荡器反应15min后，加入15%三氯乙酸（TCA）终止反应，离心（10800rpm，1min）。吸取1mL反应液注入比色皿，加入450µL甘氨酸-氢氧化钠（Gly-NaOH），缓慢摇匀，在34℃条件下测定荧光值。测定条件：发射波长λ=456nm狭缝宽度d=5nm，激发波长λ=368nm狭缝宽度d=5nm。细胞色素P450单加氧酶比活力的计算公式：酶比活力（pmol/min/mgPro）=产物7-羟基香豆素的生成量（pmol）/min/mgPro注：min为反应时间，mgPro为酶蛋白质量，产物7-羟基香豆素的生成量根据测定样品的荧光值和底物7-羟基香豆素的标准曲线确定。12 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响3.1.6CarE活力测定-4参照Hama等（1983）的比色皿测定法：酶促反应体系3.2mL，以α-乙酸萘酯（3×10mol/L）-4为底物，加入毒扁豆碱（3×10mol/L），两者混合比例1:1共1.8mL。加入0.04mol/LpH为7.0磷酸缓冲液和羧酸酯酶粗酶液适量，水浴（30℃，15min），反应完成后加入显色剂（1%固蓝B盐和5%SDS以2:5混合）900µL，终止反应，15min后测定反应体系在600nm下的吸光度值。羧酸酯酶（CarE）活力单位计算公式：酶比活力（mmol/min/mgPro）=（∆OD600×V×T）/（ε×min×mgPro×v）（公式2）注：∆OD600为600nm下的吸光度值，V为酶促反应体系的体积，T为酶液稀释倍数，ε=25.4，min为反应时间，mgPro为酶蛋白质量，v为加入酶液的体积。3.1.7GSTs活性测定参照Habig等（1976）方法，酶促反应体系225µL，pH为6.5的磷酸缓冲液，30mmol/LGSH，30mmol/LCDNB，反应所需酶液适量，程序设置为：温度25℃，波长340nm，时间2min，每隔15s记录一次，自动记录反应体系吸光度值的变化情况。GSTs活力单位（mmol/min/mgPro）=（∆OD340×V）/（9.6×mgPro×v）注：式中∆OD340为2min吸光度的变化值，V为酶液反应总体积，mgPro酶蛋白质量，v为加入酶液的体积。3.1.8数据分析所有数据都用SPSS软件进行分析，用单因素方差分析法（One-WayAVOVA），并比较差异显著性（p≤0.05）。3.2结果与分析3.2.1亚致死剂量的吡虫啉对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的时间效应3.2.1.1饲喂法饲喂LC5浓度的吡虫啉后，蜜蜂体内三大解毒酶活性随着时间呈现升高-降低-升高的波动性变化。刚接触吡虫啉后，中肠内P450活性并没有发生显著变化，在2h后逐渐提高，在4h时达到极显著提高水平，为对照的1.44倍，4h之后逐渐降低，在12h后达到最低值，为对照的0.73倍，接着酶活性又呈现升高的趋势，和对照无明显差异，在24h时为对照活性的1.24倍。蜜蜂腹部羧酸酯酶（CarE）的活性没有被抑制，但呈现波动性升高的过程。在4h出现一个活性高峰，和对照相比极显著提高，为对照的1.27倍，之后又恢复到正常值，但在16h和20h时处于显著激活的状态，分别为对照的1.13和1.19倍。蜜蜂取食吡虫啉后，GSTs活性迅速降低为对照的0.83倍，接着酶活性显著提高，在2h和4h分别为对照的1.4和1.21倍，之后处于正常水平，和对照无明显差异。13 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响图3.1饲喂法作用下LC5剂量吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应Fig.3.1ThetimeeffectofLC5doseofimidaclopridwithfeedingmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）3.2.1.2药膜法选用LC5浓度的吡虫啉药膜法处理后，测定了中华蜜蜂体内三大解毒酶的变化趋势（图3.2）。解毒酶P450活性变化不大，多处于抑制状态，在第4h时显著降低，为对照的0.59倍，在8h酶活性恢复到正常水平，但在12h又明显被抑制，达到酶活性的最低值，为对照的0.56倍，之后酶活性逐步提高，但与对照相没有显著性差异。CarE的酶活性在24h内都处于激活状态，蜜蜂接触吡虫啉后，酶活性逐渐提高，在4h达到显著提高的水平，为对照的1.16倍，之后4～20h酶活性都处于微激活状态（为对照值的1.1～1.4倍），酶活性最大值出现在16h，为对照的1.4倍。GSTs酶活性变化情况和CarE刚好相反，在24h内多处于酶活性被抑制水平。饲喂LC5浓度的吡虫啉后，在4h以后酶活性为显著抑制状态（为对照的0.5～0.86倍），之后抑制现象更加明显；在12h时酶活性达到最低值，为对照的0.59倍；但在16h时酶活性提高，恢复到正常水平；接着在20h酶活性又迅速降低，处于显著抑制水平。14 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响图3.2药膜法作用下LC5剂量吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应Fig.3.2ThetimeeffectofLC5doseofimidaclopridwithresidualfilmmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）3.2.2吡虫啉对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的浓度效应3.2.2.1饲喂法根据农药生物测定结果，分别选取了LC10、LC20、LC30、LC40、LC50浓度的吡虫啉饲喂中华蜜蜂，体内三大解毒酶的活性呈现不同的变化情况（图3.3）。在不同浓度的作用下，P450的活性变化较大，CarE始终处于激活状态，GSTs处于抑制状态。饲喂中华蜜蜂LC20浓度的吡虫啉24h时，P450酶活性显著提高，为对照的1.4倍，随着浓度增加酶活性开始下降，在LC40浓度时达到最低点，为对照的0.76倍。CarE活性随着浓度增加而增加，但在LC10～LC40之间，差异不显著，在LC50时，与对照组相比活性显著提高，为对照的1.23倍。GSTs活性在LC20以后处于抑制水平，酶活性为对照的0.88～0.73倍之间，在LC30浓度时，酶活性最低，为对照的0.73倍。15 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响图3.3饲喂法作用下吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应Fig.3.3ThedoseeffectofimidaclopridwithfeedingmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）3.2.2.2药膜法中华蜜蜂接触不同浓度的吡虫啉药膜后，体内三大解毒酶均被激活，酶活性提高。在蜜蜂接触LC10浓度吡虫啉药膜24h后，P450酶活性急剧升高，为对照的1.77倍，之后随着浓度的升高，活性降低，但仍然高于对照。在LC40浓度时，恢复到正常水平，和对照没有显著差异。CarE接触低浓度的吡虫啉药膜，酶活性并没有发生变化，但是在LC40的浓度以后，酶活性显著升高，最高为对照的1.71倍，虽然之后有所降低，但显著高于对照组酶活水平。GSTs的酶活性一直高于对照，低浓度时酶活性升高较慢，变化不大，随着吡虫啉药膜浓度的提高，酶活性增加的幅度变大，在LC30浓度时，酶活性最高，达到对照组活性的1.35倍，接着酶活性逐渐降低，但仍高于对照，在LC50浓度时酶活性是对照组的1.23倍。图3.4药膜法作用下吡虫啉对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应Fig.3.4ThedoseeffectofimidaclopridwithresidualfilmmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）16 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响3.3讨论相对其他昆虫来说，蜜蜂对吡虫啉较为敏感，体内的三大解毒酶提供了蜜蜂最基本的防御体系。P450参与昆虫蜕皮素和保幼激素的合成，以及解毒代谢等功能，是多数昆虫产生抗药性的原因之一，同时也参与了昆虫的生长发育繁殖等各个环节（Scottetal.,1998）。意大利蜜蜂含有的P450基因数目较少，推测具有46个P450基因，但目前只有13个可以被合成表达出来，主要分布在线粒体P450、CYP2、CYP3和CYP4四大家族之中。P450可以催化多种反应，可以将毒性较高的外源性物质转化成低毒或者无毒的物质，减轻对生物机体本身的危害（Guengerich,2001），其主要作用机理：++substrate（S）+（NADPH+H）+O2→S（O）+NADP+H2O（Bergéetal.,1998）只有在药膜法作用方式下，微剂量的处理降低了酶活性，饲喂LC50浓度以下的吡虫啉反而提高了P450的活性，这和其他昆虫的研究结果相一致，吡虫啉处理后提高烟粉虱CYP6CM1的过量表达（Karunkeretal.,2008;Puineanetal.,2010）。一定量的槲皮素处理，同样可以提高蜜蜂的CYP6AS亚家族的基因表达和酶活性（Maoetal.,2009）。从结果可以看出饲喂微剂量的吡虫啉后，可以适度诱导P450的活性，但高浓度抑制了酶活性，长时间地接触微剂量吡虫啉，由于其具有累积效应，危害可能加深，因此吡虫啉对蜜蜂的长期效应还需要进一步研究。相对于其他昆虫，蜜蜂的基因组中含有较少的谷胱甘肽硫转移酶基因，推测共拥有十个GSTs的功能基因，它们参与一些外源性化合物的代谢，在蜜蜂抵抗环境压力的过程中起着重要的作用。吡虫啉和啶虫脒是分月扇舟蛾GSTs的中等抑制剂，槲皮素和单宁酸是它的高度抑制剂（Tangetal.,2012），吡虫啉也可以提高棉叶蝉GSTs的活性，提高降解能力，增强抗药性（Kshirsagaretal.,2012）。微剂量的吡虫啉在饲喂法和药膜法作用下，中华蜜蜂GSTs的酶活性波动较大，抑制效果明显，饲喂高浓度的吡虫啉对中华蜜蜂腹部GSTs活性的抑制作用较强，危害较大。接触LC5剂量的药膜，酶活性在4-20h的时间段内，抑制效果明显，波动较大，此时间段可能吡虫啉对蜜蜂体内的次级代谢影响最大。羧酸酯酶是蜜蜂重要的解毒酶，存在于头部和中肠内，同时也是一些脂肪酸的合成酶，是参与昆虫抗药性的一个重要解毒酶。CarE共有八个亚家族，其中保幼激素酯酶、α和β酯酶是羧酸酯酶的主要催化酶（Ransonetal.,2002），参与整个代谢过程的第二阶段，主要作用就是催化水解进入体内的外源性物质（SatohandHosokawa,2006）。在中华蜜蜂体内，CarE是唯一一个没有吡虫啉抑制的解毒酶，在致死中浓度以下，羧酸酯酶的活性都呈现激活状态，而且饲喂中华蜜蜂的吡虫啉浓度越高，诱导效应越明显。昆虫体内的各种解毒酶不是单独存在发挥功能作用，它们和其他的免疫机制共同作用，构筑了昆虫个体的防御体系，对外表现出个体耐药性增加或抗性增强。在棉蚜对吡虫啉的抗性品系中，羧酸酯酶和谷胱甘肽硫转移酶的活性明显高于敏感品系（Panetal.,2003）。每一个酶都具有一个庞大的亚家族系统，因此当有外源性化合物存在或者是机体存在氧化压力时，各种抗氧化酶和解毒代谢酶之间表达也各不相同，所起的作用也不同，最终目的都是保护生物体免受氧化损伤（Chaitanyaetal.,2014）。蜜蜂幼虫接触低剂量的二嗪农后，多功能氧化酶和谷胱甘肽硫转移酶活性迅速增加，提高对这些有害物质的耐受性（Smirle,1990），外出采集的蜂体内多功能氧化酶和谷胱甘肽硫转移酶活性明显高于巢内的哺育蜂，这也可能是蜜蜂应对外界有毒物质的一种保护机17 中国农业科学院硕士学位论文第三章吡虫啉对中华蜜蜂解毒酶的影响制，也有可能是接触外源性化合物的诱导作用，这些酶活性的变化最终改变了蜜蜂的一些生理行为（Smirle,1988;SmirleandRobinson,1989;Smirle1993）。一些农药激活某种酶的同时，却抑制了另外一种酶，例如马拉硫磷诱导GSTs的酶活性增加，但是抑制了羧酸酯酶的活性（Yuetal.,1984）。成虫期一日龄的中华蜜蜂工蜂，还没有外出采集的能力，在接触微剂量吡虫啉后，可以诱导P450和CarE的表达，提高了代谢吡虫啉的能力，但对GSTs的影响较大，不同时间段酶活性波动较大。蜜蜂的解毒代谢是在三大解毒酶的综合作用的结果，但在不同阶段，起着主要作用的酶各不相同。吡虫啉在昆虫体内半衰期是4h，在土壤中的半衰期是15d，吡虫啉的初级代谢物主要有亚硝胺、氯烟酸和5-羟基吡虫啉等（SharmaandSingh,2014;Sharmaetal.,2014），其中5-羟基吡虫啉对蜜蜂和家蚕的毒性稍低于吡虫啉，但对于蜜蜂等敏感昆虫仍然属于高毒性物质。因此蜜蜂长时间处在含有吡虫啉的环境中，需要综合考虑这些次级代谢物和蜜源植物的次生代谢物质对蜜蜂所产生的影响，这样才能正确评价吡虫啉对蜜蜂的亚致死效应。18 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响氟胺氰菊酯属于拟除虫菊酯类农药，是蜂业生产中防治蜂螨的主要用药，对蜜蜂低毒。随着氟胺氰菊酯的大面积使用，它在蜂巢和蜂产品中残留量也不断变大，蜜蜂世代不断接触到残留药物，因此氟胺氰菊酯对蜜蜂的影响越来越受到关注。低浓度的氟胺氰菊酯影响蜜蜂的短期学习、长期记忆能力和取食行为等（Frostetal.,2013）。随着拟除虫菊酯类农药长期高剂量的使用，大蜂螨已经对其产生抗性，抗性品系蜂螨中发现了钙离子通道中相关基因突变（Hubertetal.,2014）。蜜蜂接触高浓度氟胺氰菊酯后，表现出异常兴奋，肌肉组织发生改变，最终导致麻痹或者死亡（Stefan,2006）。本章选用饲喂和药膜两种处理方法，研究LC5浓度氟胺氰菊酯处理中华蜜蜂，24h内三大解毒酶的活性变化，以及不同浓度氟胺氰菊酯对三大解毒酶活性的影响，为研究以氟胺氰菊酯为代表的拟除虫菊酯类农药对中华蜜蜂的影响奠定基础。4.1材料与方法4.1.1实验蜜蜂同2.1.14.1.2实验材料4.1.2.1试剂氟胺氰菊酯（tau-fluvalinate，94%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；其他同3.1.2.14.1.2.2主要仪器同3.1.2.24.1.3实验方法生物处理和酶活性测定方法同3.1.34.1.4数据分析同3.1.819 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响4.2结果与分析4.2.1氟胺氰菊酯对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的时间效应4.2.1.1饲喂法图4.1饲喂法作用下LC5剂量氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应Fig.4.1ThetimeeffectofLC5doseoftau-fluvalinatewithfeedingmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）在实验室条件下，饲喂中华蜜蜂含有LC5浓度吡虫啉的蔗糖水，蜜蜂体内三大解毒酶酶活性变化趋势见图4.1。中华蜜蜂取食氟胺氰菊酯药液后，P450即被显著地抑制，1h时酶活性为对照的0.59倍，随后酶活性逐步提高，4h后达到与对照无明显差异的水平，接着酶活性继续提高，在16h时酶活性达到最大值，为对照的1.28倍。CarE在24h内，处于不同程度的抑制状态，变化幅度较小。在12h时达到差异显著水平（p≤0.05），为对照组活性的0.85倍，在24h时，抑制效果最明显，为对照组的0.78倍。GSTs相比于CarE，酶活性变化正好相反，酶活性随着时间增加而呈现不同的变化，始终处于激活水平，但激活水平不高。和对照组相比，蜜蜂在取食氟胺氰20 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响菊酯后，立即诱导GSTs活性升高，在1h时差异显著，接着酶活性缓慢变化，分别在4h、12h处于显著激活水平，在24h时激活效应最大，为对照组的1.2倍。4.2.1.2药膜法中华蜜蜂接触LC5浓度的氟胺氰菊酯药膜后，体内三大解毒酶活性在24h内呈现不同的变化（图4.2）。蜜蜂刚接触药膜后，P450酶活性没有发生变化，随后逐渐降低，在12h时，为对照的0.5倍，接着又逐渐升高，16h时为对照的0.75倍，最后恢复到正常水平。药膜处理后，CarE活性没有发生显著性变化，在2h时，酶活性被显著抑制，为对照的0.76倍，接着活性升高，恢复到正常水平，在20h时，酶活性被重新抑制，为对照的0.74倍，在24h时，酶活性为对照组的0.85倍。GSTs的活性基本稳定，蜜蜂接触药膜后，酶活性轻度被抑制，变化基本稳定，和对照无明显差异，除了在16h时，GSTs被显著抑制，酶活性极显著降低，为对照的0.69倍。图4.2药膜法作用下LC5剂量氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的时间效应Fig.4.2ThetimeeffectofLC5doseoftau-fluvalinatewithresidualfilmmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）21 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响4.2.2氟胺氰菊酯对中华蜜蜂P450、CarE、GSTs的浓度效应4.2.2.1饲喂法中华蜜蜂取食含有不同浓度氟胺氰菊酯的糖药混合液后，体内三大解毒酶的活性变化也各不相同。P450酶活性变化较为稳定，受到的影响较小，只有在LC50浓度时，酶活性呈现显著抑制水平，为对照的0.65倍。蜜蜂在接触氟胺氰菊酯后，CarE酶活性呈现逐渐升高的趋势，随着浓度的增加，酶活性提高明显，在LC40和LC50的浓度时，酶活性达到显著差异水平，分别为对照的1.15和1.13倍。取食不同浓度的氟胺氰菊酯糖溶液，GSTs的活性均处于抑制状态，但抑制效果各不相同，LC10抑制效果较强，高浓度时抑制效果有所减弱，在LC50的浓度时酶活性急剧降低，抑制效果最明显，为对照的0.68倍。图4.3饲喂法作用下氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应Fig.4.3Thedoseeffectoftau-fluvalinatewithfeedingmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）4.2.2.2药膜法蜜蜂接触不同浓度的氟胺氰菊酯药膜24h内，三大解毒酶的活性变化如图4.4所示。P450的酶活性始终处于激活水平，且随着药膜浓度的增加，酶活性呈现出先上升后下降的趋势。如接触浓度较低的LC10药膜24h时，P450酶活性显著提高，为对照的1.18倍。在LC30和LC40浓度时，酶活性达到最高值，为对照的1.74倍，接着又渐渐降低。蜜蜂接触不同浓度药膜环境中，酶活性均达到对照组的1.18倍以上。CarE活性比较特殊，随着浓度的增加，酶活性基本稳定，在LC10～LC40浓度之间，酶活性没有变化，只有在LC50的浓度时，酶活性才迅速增加，达到对照组酶活性的1.43倍。GSTs只有在蜜蜂接触LC10药膜的时候，酶活性升高，为对照的1.16倍，接着又降低，恢复到正常水平，随着浓度地增加，酶活性有所波动，但始终与对照无显著差异。22 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响图4.4药膜法作用下氟胺氰菊酯对中华蜜蜂三大解毒酶的浓度效应Fig.4.4Thedoseeffectoftau-fluvalinatewithresidualfilmmethodonthethreedetoxifyenzymesofApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）4.3讨论氟胺氰菊酯主要用于防治大蜂螨，意大利蜜蜂蜂群中大蜂螨的危害比较严重，中华蜜蜂本身具有对大蜂螨的清除行为，很少有大蜂螨在中华蜜蜂身体上长期寄生，造成严重危害的情况发生。虽然以氟胺氰菊酯为主要成分的杀螨剂在中华蜜蜂蜂群用应用较少，但本章研究氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的三大解毒酶的影响，主要是观察以氟胺氰菊酯为代表的拟除虫菊酯类农药对中华蜜蜂影响，同时与意大利蜜蜂对比，深入了解中华蜜蜂和意大利蜜蜂在解毒代谢以及耐药性方面的差异，为更好地指导农业生产中合理使用菊酯类化学农药并保护中华蜜蜂提供支持。氟胺氰菊酯对蜜蜂低毒，亚致死剂量的药液对蜜蜂解毒酶的影响也较低，多处于无影响或微激活水平，偶尔有抑制现象发生。用LC5浓度氟胺氰菊酯处理中华蜜蜂24h，不改变P450的活性；饲喂LC50浓度的氟胺氰菊酯，24h时P450酶活性受到抑制；中华蜜蜂处在LC10～LC50浓度的药膜环境中，P450被显著激活。结果表明氟胺氰菊酯的不同的作用方式，对中华蜜蜂解毒酶影响不同。细胞色素P450单加氧酶参与了多数昆虫对拟除虫菊酯农药的抗性，氟胺氰菊酯诱导CYP9Q3的表达，参与对氟胺氰菊酯的代谢（Maoetal.,2011）。在冈比亚疟蚊抗拟除虫菊酯品系中，都检测到CYP6M7和CYP6P9诱导表达以及酶活性的提升（Riveronetal.,2014），同样在棉铃虫的抗拟除虫菊酯品种中检测到CYP6B7的过量表达（El-Latifetal.,2014）。许多昆虫抗性品系检测中都发现了与P450相关的抗性机制，中华蜜蜂在氟胺氰菊酯的药膜环境中，P450活性提高，可能也是应对环境压力的一种表现，增强对外源性化合物的代谢能力。GSTs主要作用在化合物代谢的第二阶段，种类复杂，参与多种外源性物质的代谢，可以被一百多种外源性物质诱导表达（HayesandPulford,1995）。饲喂中华蜜蜂低浓度的氟胺氰菊酯可以诱导GSTs的过量表达和酶活性提升，增强机体的耐药性，减轻了外界物质对机体的伤害，但是接触高剂量的氟胺氰菊酯后，蜜蜂腹部GSTs活性反而被抑制，这可能主要是高剂量氟胺氰菊酯破坏了解毒代谢的结构和功能，而且这种破坏不可以恢复，影响了其正常生命活动。GSTs对23 中国农业科学院硕士学位论文第四章氟胺氰菊酯对中华蜜蜂解毒酶的影响它的抑制物较为敏感，因此低剂量处理可以增加表达，提高活性，降低因吸收拟除虫菊酯而产生的氧化损伤（Vontasetal.,2001）。羧酸酯酶作为水解外源性物质的一个重要酶，在桃蚜抗性和敏感品系中，CarE水解活性的不同，主要是由于基因的过量表达和氨基酸的替换，改变了对农药的代谢活性（Zhangetal.,2010）。不管是饲喂法还是药膜法，LC5剂量的氟胺氰菊酯处理，短时间内中华蜜蜂的酶活性没有发生显著性变化，但在24h时均抑制了CarE的活性，且随着浓度的增加，抑制现象逐渐减弱，在LC40、LC50的浓度时，CarE的活性反而呈现激活状态，这种现象和P450s解毒酶相反，这与解毒酶在代谢系统中的不同作用相关。中华蜜蜂在应对外源性化合物时，体内有多种解毒代谢酶共同参与相关代谢过程。当有拟除虫菊酯类农药存在时，P450和GSTs活性都会提升，共同降解化合物，降低对自身的损伤。同一类型的物质对解毒酶的诱导效应也不一样，氟胺氰菊酯可以诱导CYP9Q3的过量表达，但是联苯菊酯抑制CYP9Q3的表达，诱导CYP9Q2和CYP9Q1的表达（Maoetal.,2011）。本章中饲喂LC5浓度的氟胺氰菊酯24h后，GSTs的活性显著提升，但是CarE的活性被明显抑制。拟除虫菊酯类农药是使用最为广泛的一类低毒农药，具有在光照条件下易于降解，在土壤中不易流动等特点，容易造成长时间的药剂积累，这会对蜜蜂的学习、记忆、归巢、取食能力造成破坏（StaigerandQuistad,1983;Frostetal.,2013）。氟胺氰菊酯的存在可以明显抑制蜜蜂脑神经元细胞钠离子通道钠离子流，破坏神经系统的信息传递（Zhouetal.,2011）。在不同的温度和湿度等天气条件下，氟胺氰菊酯的降解速度不一样，酶活性的变化因此不同，对生物的毒性也相差较大（Sogorbetal.,1988）。所以研究氟胺氰菊酯对蜜蜂的安全性评价，需要根据蜜蜂所处不同环境条件进行具体研究，才能更加准确地评价氟胺氰菊酯的影响。24 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响乙酰胆碱酯酶属于丝氨酸水解酶，主要位于神经中枢系统突触前膜，降解神经递质乙酰胆碱，终止信号对突触后膜的刺激，以维持正常信号传递。在神经系统以外部位也研究发现AChE存在，这些酶分子主要参与调控突触的形成和轴突的生长，与细胞的迁移、粘附和凋亡过程有关（SoreqandSeidman,2001）。乙酰胆碱酯酶作为有机磷和氨基甲酸脂类农药的靶标酶，常用来作为检测环境污染的生物标记（SoreqandSeidman,2001;SoreqandSeidman,2001;ParveenandKumar,2005）。有机磷和氨基甲酸脂类农药可以影响乙酰胆碱酯酶的活性，同时竞争性地结合乙酰胆碱受体，从而导致乙酰胆碱与受体不能有效结合，干扰昆虫神经信息的正常传递而死亡（SurendraNathandSurendraKumar,1999）。本章选择吡虫啉和氟胺氰菊酯两种杀虫剂，研究对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响，为进一步确定这两类农药对中华蜜蜂的影响奠定基础。5.1材料与方法5.1.1实验蜜蜂同2.1.15.1.2实验材料5.1.2.1试剂吡虫啉（95%）购自美国杜邦公司；氟胺氰菊酯（94%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；5-5-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）、碘化硫代乙酰胆碱（ATch）购自Sigma公司；曲拉通（TritoX-100）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、丙酮、95%乙醇（分析纯）生产于北京化学试剂公司。5.1.2.2主要仪器5417R型高速离心机（德国eppendoff公司）、UV2200紫外可见分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）；SPH-100B型恒温振荡器（上海世平实验设备公司）；100mL血清瓶；人工气候箱（GSP-9080MBE，上海博迈实业有限公司医疗设备厂）5.1.3实验方法实验方法同第三章3.1.3，进行生物处理后，取蜜蜂头部，10头一组，三次重复，在液氮中速冻，迅速放在-80℃冰箱保存。25 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响5.1.4酶液制备取处理好的中华蜜蜂头部，放在匀浆器中，加入pH为7.5的磷酸缓冲液（含TritoX-1000.1%）1mL冰浴充分匀浆，离心（10800rpm，10min），抽滤获得上清液，用于酶活性和蛋白含量的测定。5.1.5AChE活性测定按照高希武的乙酰胆碱酯酶活性测定方法：碘化硫代乙酰胆碱ATch（10mmol/L）为底物，粗酶液适量，在30℃条件下反应15min，加入3.6mL显色剂终止液（12.4mgDTNB、50mL磷酸缓冲液、75mL蒸馏水、125mL乙醇）终止反应。在412nm下测定反应液的吸光度值。AChE活力单位（mmol/min/mgPro）=（∆OD412×V×T）/（13.6×t×mgPro×v）注：式中∆OD412为412nm光波下的吸光度值，V为反应总体积，T为粗酶液稀释倍数，mgPro为酶蛋白质量，t为反应时间，v为加入粗酶液的体积。5.1.6数据分析同3.1.85.2结果与分析5.2.1吡虫啉对中华蜜蜂AChE的影响5.2.1.1时间效应饲喂中华蜜蜂含有LC5浓度吡虫啉的的蔗糖水溶液，测定头部乙酰胆碱酯酶活性变化（图5.1）。蜜蜂取食微量吡虫啉后，AChE活性逐步降低，但在前4h，与对照组没有显著性差异，在8h时活性降低明显，为对照的0.83倍，随后进一步降低，12h时达到最低值，为对照的0.65倍。虽然之后有一定程度地恢复，但仍然低于对照水平，在24h抑制效果进一步加强，与对照具有显著差异。药膜法作用下，中华蜜蜂接触吡虫啉药膜后，酶活性立即开始下降，并逐步降低，在4h达到一个低值为对照的0.79倍，接着酶活性出现升高-下降的趋势，在20h时达到第二个抑制低值，为对照的0.75倍。两种作用方式下，24h时酶活性都与对照组酶活性没有显著性差异。26 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响图5.1LC5剂量的吡虫啉对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的时间效应Fig.5.1ThetimeeffectofLC5doseofimidaclopridontheactivityofacetylcholinesteraseinApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）5.2.1.2浓度效应不同浓度的吡虫啉作用于中华蜜蜂，头部AChE的活性变化较大。饲喂LC10浓度的吡虫啉溶液后，蜜蜂乙酰胆碱酯酶被诱导，活性提升明显，为对照组的1.25倍，随着吡虫啉浓度提升，酶活性降低。取食LC20以上浓度的吡虫啉，随着浓度增加，AChE活性无显著变化。中华蜜蜂接触LC10、LC20浓度的药膜后，AChE活性变化不明显，在LC30浓度时酶活性被显著诱导，为对照的1.24倍，之后又逐渐降低，在LC50浓度时，酶活性与对照组无显著性差异。图5.2吡虫啉对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的浓度效应Fig.5.2ThedoseeffectofimidaclopridontheactivityofacetylcholinesteraseinApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）27 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响5.2.2氟胺氰菊酯对中华蜜蜂AChE的影响5.2.2.1时间效应中华蜜蜂取食LC5浓度的氟胺氰菊酯后，AChE活性呈现下降-升高-下降的趋势。取食后即被明显抑制，在1h时，酶活性迅速降低为对照的0.73倍，随后活性逐渐升高，在12h达到最大值，为对照的1.2倍，随后开始下降，在16h以后恢复正常或低于对照组酶活性值。蜜蜂接触LC5浓度的药膜后，AChE活性呈现出被抑制的现象，但在不同时间点酶活性抑制水平各不相同。随着作用时间的增加，酶活性逐渐减低，在1～4h，为对照组酶活性的0.85倍，在12h时，酶活性为对照的0.7倍，20h时抑制效果进一步加强，为对照的0.63倍。图5.3LC5剂量的氟胺氰菊酯对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的时间效应Fig.5.3ThetimeeffectofLC5doseoftau-fluvalinateontheactivityofacetylcholinesteraseinApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）5.2.2.2浓度效应不同浓度的氟胺氰菊酯作用于中华蜜蜂后，其胃毒和触杀方式对乙酰胆碱酯酶影响不同（图5.4），饲喂法作用下酶活性整体表现出被抑制，而药膜法在多个浓度下被激活。饲喂不同浓度氟胺氰菊酯24h时，在LC20和LC40浓度下，酶活性处于显著被抑制状态，分别为对照的0.83和0.78倍，其他浓度下和对照组酶活性没有显著性差异。中华蜜蜂接触不同浓度药膜后，AChE活性均高于对照，但在LC10浓度下24h时，酶活性激活表达，达到显著差异水平，为对照的1.28倍。随着浓度升高，酶活性逐步下降，但高于对照组酶活性，没有达到显著差异水平。28 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响图5.4氟胺氰菊酯对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性的浓度效应Fig.5.4Thedoseeffectoftau-fluvalinateontheactivityofacetylcholinesteraseinApisceranacerana注：图中*表示差异显著性（p≤0.05）Note：*（p≤0.05）5.3讨论中华蜜蜂接触亚致死剂量的药物后，AChE的活性随着时间的变化总体呈现下降-升高-下降的趋势，说明它们存在一定的时间效应。吡虫啉或者氟胺氰菊酯的存在，改变了靶标酶的活性，说明吡虫啉不仅竞争结合乙酰胆碱受体，同时影响着乙酰胆碱的代谢，进而影响信号传递的正常进行。蜜蜂体内乙酰胆碱酯酶所表现出的时间效应，与农药在代谢降解过程中所产生的次级代谢物有关。饲喂LC5剂量的氟胺氰菊酯和吡虫啉，对靶标酶产生不同的影响，这说明不同种类的农药，除了在毒性大小方面有区别，对蜜蜂生理行为的影响也不相同。蜜蜂接触亚致死剂量的吡虫啉后完全抑制AChE的活性，但是作用方式不同产生的抑制效果也不一样，饲喂法作用后，对AChE的影响相对较小。这表明因此农药毒性大小与施药方式有关，不同的施药方式对非靶标生物的影响不同。乙酰胆碱酯酶作为神经递质的代谢酶，在神经系统信息运输过程中发挥重要作用，类胆碱农药的存在不仅会抑制AChE的活性，同时也会改变与结合位点的亲和力（KreisslandBicker,1989;TomizawaandYamamoto,1992）。有机磷和氨基甲酸酯类农药可以明显降低AChE活性，可以作为检测环境中有毒物质的生物标记（Thompson,1999;Stepurskaetal.,2015），但是还有其他物质同样可以诱导AChE，例如溴氰菊酯，蜜蜂体内的AChE活性可以作为蜜蜂是否接触溴氰菊酯的标志。但是我们的研究结果表明，两类农药对AChE的影响具有差异，但仅仅从酶活性的角度鉴定蜜蜂所接触的农药种类，结果缺少可信度，需要从多个方面综合考虑。拟除虫菊酯类农药的毒性机理是破坏神经细胞膜上的钠离子通道，改变细胞内外膜之间的离子平衡，影响电子的正常传递，进而导致蜜蜂死亡。但也有研究，这类农药也可作用于乙酰胆碱系统，改变AChE的活性（Badiouetal.,2008）。氟胺氰菊酯属于拟除虫菊酯类农药，但是和其他29 中国农业科学院硕士学位论文第五章杀虫剂对中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶的影响的拟除虫菊酯类相比，氟胺氰菊酯又有许多不同的特性，对蜜蜂的毒性也低于多数常用的拟除虫菊酯类农药。因此研究菊酯类农药的对蜜蜂的影响，还需要选择多种拟除虫菊酯类农药，结合田间实际情况进行综合测定。30 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响饲喂中华蜜蜂亚致死剂量的吡虫啉后，几种解毒代谢相关的酶活性发生变化的同时，体内更多的相关基因随之发生变化，单独使用吡虫啉或者是氟虫腈，不会改变意大利蜜蜂的解毒基因，但是会抑制蜜蜂中肠免疫系统相关基因的表达（Aufauvreetal.,2014），有关农药对中华蜜蜂分子层面的影响研究较少。本文利用RNA-seq技术，分别对中华蜜蜂取食LC5浓度的吡虫啉1h、8h和16h后的头部与腹部进行转录组测序，分析蜜蜂头部和腹部在转录组水平上的变化，为后续从分子水平进一步研究吡虫啉对中华蜜蜂的影响奠定基础。6.1材料与方法6.1.1实验蜜蜂同2.1.16.1.2生物处理根据第二章生物测定的实验结果，选取LC5剂量的吡虫啉溶液，饲喂中华蜜蜂，对照组饲喂不含吡虫啉的糖水溶液。分别将对照和取食吡虫啉1h、8h、16h后的中华蜜蜂迅速放在液氮中速冻，然后储存在-80℃超低温冰箱中保存。6.1.3主要仪器RNeasyMinEluteCleanupKit（QIAGEN，德国）、TruSeqPEClusterKit（illumina，美国）、IlluminaHiseqTM2500（illumina，美国）等6.1.4TotalRNA提取和纯化分别从蜜蜂的头部和腹部中提取总RNA。使用2100Bioanalyzer对TotalRNA进行质检。从合格总RNA中取10μg用5U的DNaseI（Takara，日本）在37℃消化30min，然后用RNeasyMinEluteCleanupKit（QIAGEN，德国）纯化，用15uLRNase-freewater洗脱。6.1.5cDNA文库构建取100ng的总RNA，用RNA-SeqLibraryPreparationKitforWholeTranscriptomeDiscovery（Gnomegen，美国）构建文库：加入RandomPrimers（带3端接头）和FirstStrandSynthesisReactionBuffer（5X）打断mRNA，（95℃，15min），迅速置冰上；加入LigationEnzymeSupplement，ATP（10mM）和Ligationbuffer（10x）做RNA末端补平；然后加入Ligationbuffer（10x），LigationEnzymeMix，RNaseOut，5’adaptor，ATP（10mM）做5端接头的连接；加入31 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响100mM，DTT10mMdNTP，RNaseOut，RTbuffer（5x）和ReverseTranscriptase进行cDNA第一链合成，反应程序：25°C10min、42°C40min、70°C20min；随后进行PCR扩增，扩增引物为RNASeqPCRPrimerF和RNASeqPCRPrimerR，PCR反应条件：98°C预变性45Sec、98°C变性15Sec、65°C退火30Sec、72°C延伸30Sec；最后用切胶回收所需的片段，得到可供测序的文库。构建完成后，进行三重检验，确保文库质量。6.1.6测序取10ng的文库，用TruSeqPEClusterKit（illumina，美国）进行clustergeneration，然后在IlluminaHiseqTM2500中进行双向测序（以上三项均由上海人类基因组研究中心基因测序部完成）。6.2结果与分析6.2.1Illumina测序中华蜜蜂取食LC5剂量的吡虫啉药液后，提取蜜蜂头部和腹部的全部RNA，然后利用illuminaHiseq2500进行高通量测序。RNA-seq测序过滤过得到的片段平均长度为100bp，小片段GC含量较低，为38%，可以定位到基因组上功能基因约为10000个。饲喂中华蜜蜂LC5剂量的foldchange吡虫啉作用后（表6.1），头部基因表达变化较少（︱log2︳≥1,p＜0.0001），1h后有12个基因下调表达，41个基因上调表达；处理8h后，有110个基因下调表达，75个基因上调表达；而在处理16h后，有102个基因下调表达，仍是75个基因上调表达。明显变化的基因主要分布在腹部，这些差异化表达基因中，处理1h后有1555个基因上调表达，540个基因下调表达；处理8h后有1459个基因上调表达，573个基因下调表达；处理16h，上调基因达到1891个，下调基因为494个。表6.1饲喂LC5剂量吡虫啉，不同时间点蜜蜂转录组表达情况Table6.1thetranscriptomexpressionatdifferenttimesafterfeedingLC5doseofimidacloprid样品均长GC功能基差异下调基因（对上调基因（对原始序列过滤序列Q30名称（bp）含量因基因比CK）比CK）头部CK116349091015106910080.07%38%9876头部1h145886541290916610081.77%38%9922531241头部8h140909721252035910082.10%38%990918511075头部16h155838181373928610081.07%38%992617710275腹部CK125864361185107210084.37%38%9713腹部1h127736211108602610079.50%38%969320955401555腹部8h140931491244734310081.24%38%975120325731459腹部16h127416371124787010081.40%38%99262385494189132 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响6.2.2GO功能基因注解根据测得的中华蜜蜂头部转录组数据，利用GO数据库对差异基因功能富集分析。GO总共分为三大功能分类：生物学过程（biologicalprocess）、细胞组分（cellularcomponent）和分子功能（melocularfunction）转录组总共得到30979个unigene，将这些数据对比GO数据库进行注解分析。6.2.2.1中华蜜蜂头部转录组GO功能分析饲喂中华蜜蜂LC5浓度的吡虫啉溶液1h后（图6.1），表达量发生明显改变的基因分布在72大基因簇中，分属于三大功能类别中的24个亚功能类别，其中生物学过程7个，细胞组分中的6个，分子功能中的11个。取食后8h，蜜蜂头部有283个相关基因簇得到注解，差异基因主要分布在39个亚功能类别中，13个属于生物学过程，8个属于细胞组分，19个属于分子功能分类。饲喂处理后16h，这些表达量发生显著改变的基因位于362个基因簇中，定位在41个亚功能类中，他们分别有15个属于生物学过程，9个属于细胞组分，17个属于分子功能分类。这些差异化表达基因，主要分布在细胞、细胞加工、大分子代谢、结合力、催化活性和水解活性几个功能类别中，且主要属于细胞组分和分子功能两个分类中。图6.1饲喂LC5剂量吡虫啉，中华蜜蜂头部差异表达基因GO功能分析Fig.6.1GOannotationofDEGsinApisceranaceranaheadwithfeedingLC5doseofimidacloprid注:横坐标轴表示GO功能分类;竖坐标表示注释基因簇所占百分比Note:horizontalaxis:SubgroupsofmolecularfunctionsfromGOclassification;Verticalaxis:Percentageofthematchedunigeneclusters33 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响6.2.2.2中华蜜蜂腹部转录组GO功能分析中华蜜蜂取食LC5剂量吡虫啉，对其腹部差异表达基因进行GO功能注解分析，这些差异基因涉及了56个功能分类中。吡虫啉处理1h后，有6453个显著差异表达基因簇，定位到GO数据库中的56个功能分类，其中生物过程功能中有20个，细胞组分中有11个，分子功能中有25个；处理8h后，有5843个基因簇得到注解，涉及生物过程中的21个亚功能分类，细胞组分中10个亚功能分类，分子功能中的25个亚功能分类；处理16h后，有6502个基因簇得到注解，这些变化基因仍然在三个功能分类中的56小功能类群中，但是基因表达量差异较大。这些差异化表达基因主要属于细胞组分和分子功能两大功能分类中。例如细胞组份中的细胞、细胞内、细胞加工和细胞质亚功能类别中，分子功能分类中的蛋白连接、结合，催化活性、大分子代谢和分解代谢几个小功能类群中。图6.2饲喂LC5剂量吡虫啉，中华蜜蜂腹部差异表达基因GO功能分析Fig.6.2GOannotationofDEGsinApisceranaceranaabdomenwithfeedingLC5doseofimidacloprid注:横坐标轴表示GO功能分类;竖坐标表示注释基因所占百分比Note:thehorizontalaxisrepresentthesubgroupsofmolecularfunctionsfromGOclassification,theverticalaxisrepresentpercentageofthematchedunigeneclusters34 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响6.2.3KEGG信号通路分析通过KEGG信号通路分析，我们进一步了解这些差异基因的功能特性。利用KEGG数据库信息，总共有2445个差异化表达的unigene，但是不同处理时间点，涉及到基因簇不同，归属的信号通路也各不相同。6.2.3.1中华蜜蜂头部转录组数据分析蜜蜂取食LC5浓度的吡虫啉后，对头部转录组测序结果进行KEGG通路分析，吡虫啉作用1h后，这些具有明显差异表达的基因（图6.4），它们分布于七大基因簇中，涉及到五个KEGG类别；处理8h后，发生改变的基因簇数量增加到35个，被归类于16个KEGG通路中；作用延长图6.3Unigene的KEGG分析，头部富集的KEGG通路Fig6.3KEGGClassificationofunigenes,theabundantKEGGpathwaysinApisceranaceranahead注:水平坐标表示KEGG分类,垂直坐标表示匹配的基因簇数量Note:ThehorizontalaxisshowspathwaysfromKEGGclassification,theverticalaxisshowsthenumberofthematchedunigenecluster35 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响到16h后，有43个基因簇发生明显改变，分别归属于19个信号通路。饲喂吡虫啉1h后，表达发生改变的基因数较少，发生改变的基因主要属于消化系统、辅酶和维生素代谢、碳水化合物和能量代谢。随着时间延长，这些通路基因发生改变的数目变多，同时也出现一些新的通路，如氨基酸代谢、脂类代谢、核苷酸代谢、转录和翻译都发生改变，这时与一些次生代谢物质和外源性物质代谢相关基因大量上调，参与吡虫啉的代谢。在作用到16h时，一些初期作用的通路相关基因表达降低，但与代谢通路相关基因的表达得到明显提高，如蛋白质加工、运输和代谢、外源性物质降解等。36 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响6.2.3.2中华蜜蜂腹部转录组数据分析图6.4Unigene的KEGG分析，腹部富集的KEGG通路Fig6.4KEGGClassificationofunigenes,theabundantKEGGpathwaysinApisceranaceranaabdomen注:水平坐标表示KEGG分类,垂直坐标表示匹配的基因数量Note:ThehorizontalaxisshowspathwaysfromKEGGclassification,theverticalaxisshowsthenumberofthematchedunigenecluster中华蜜蜂取食吡虫啉处理1h后，对腹部表达基因进行KEGG信号通路分析，在总2445个注释unigene中，分布在607个基因簇，分别属于31个KEGG功能分类中。处理8h主要分布546个基因簇中。16h后，涉及到的变化主要分布在651个基因簇。图6.4显示了所涉及到的相37 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响关KEGG通路，这些基因所富集的代谢系统，主要有氨基酸代谢、脂类代谢、核酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、以及多糖的合成与代谢，这些基因表达量都显著提升。与蛋白输出，细胞内折叠，内质网上加工等相关基因也上调表达。与外源性化合物代谢的相关的基因虽然在数量上没有发生变化，但表达水平都显著提升，尤其是细胞色素P450酶和谷胱甘肽硫转移酶表达量上调明显。与翻译相关的基因上调表达，但是个别转录因子相关基因明显下调。免疫系统中很多功能集团如T细胞、热激蛋白、互作蛋白等基因明显上调，神经系统的多巴胺受体基因上调表达，但是突触小泡循环系统中的个别相关基因被抑制。6.3讨论高通量测序一次性可以产生大量的数据，方便我们对样本进行深度分析，因此高通量测序分析也称深度分析（Marguliesetal.,2005）。用的测序平台有454GSFLX、HiSeq2500、SOLiDv4、Sanger373（Liuetal.,2012），本实验采用illuminahiSeq2500进行测序，所有的片段经过筛选，并进行拼接得到10182个unigene。转录组数据包含了蜜蜂所有的RNA信息，通过分析，我们可以从整体水平上了解蜜蜂在遭受吡虫啉危害情况下，基因的应答机制和转录调控机制，这比之前单个基因的研究相比更能系统掌握吡虫啉的代谢机理，结合解毒代谢酶的活性表达，评价体系更加合理。GO、KEGG注解分析对于了解相关表达基因的功能，具有重要作用，利用GO数据库，对获得的unigene进行功能注解（ConesaandGötz,2008）。分析时利用意大利蜜蜂的基因数据库比对，有30979个unigene，10182被注解，大约占32.87%。吡虫啉作用后有6502个基因发生显著的上调或下调变化，一个GO亚功能分类中，有几十个基因涉及其中，说明这些亚功能类别受到吡虫啉的影响最大。KEGG主要基于基因组数据进行分析，定位这些基因的功能和所在信号通路（Ogataetal.,1999;KanehisaandGoto,2000）。吡虫啉作用后，这些变化基因多属于免疫通路、代谢通路和降解通路，说明吡虫啉存在时，机体可以有效调节相应机制，增加能量生成，提高解毒酶活性，提高代谢能力等，以降低吡虫啉的危害程度。但是这些效应机制是如何诱导表达，这些机制如何协同进行，还需要进一步研究。通过转录组数据，我们发现多种与外源性化合物降解相关基因上调表达，例如醛脱氢酶、NADPH脱氢酶、肽酶、蛋白激酶和蛋白磷酸化酶，这些都是代谢系统必需酶，说明吡虫啉诱导相关代谢系统的表达。细胞色素P450和谷胱甘肽硫转移酶基因是两个显著上调的酶基因，这和我们前面的酶活性测定结果相一致，从而进一步证实P450和GSTs参与外源性化合物的代谢过程。吡虫啉作用后，几丁质和表皮蛋白基因都过量表达，这和意大利蜜蜂的表达效应一致（Aufauvreetal.,2014）。同时也有一个酯酶基因上调表达，相比P450和GSTs，参与的酯酶基因总数较少，也说明P450和GSTs在代谢解毒过程中占主要作用。吡虫啉作用后，中华蜜蜂头部和腹部转录组数据差异较大，饲喂1h后，腹部发生改变的607个基因明显高于头部7个基因，这可能主要与吡虫啉的作用时间和方式有关。随着作用时间的延长，腹部发生改变的基因总数比较稳定，头部发生表达改变的基因总数进一步扩大，作用8h后，共有35个发生改变，16h后，共有43个发生改变，同时影响程度也进一步加深，在8h以后的时间段，脂肪和氨基酸代谢系统相关基因也逐步发生变化，这主要和作用时间有关。因此，吡虫38 中国农业科学院硕士学位论文第六章LC5浓度的吡虫啉对中华蜜蜂转录组的影响啉对蜜蜂的长期效应和短期效应机制各不相同，本文研究的是24h内的亚致死效应，有关吡虫啉对中华蜜蜂的长期效应还需要进一步研究。39 中国农业科学院硕士学位论文第七章全文总结第七章全文总结7.1研究总结本论文选择吡虫啉和氟胺氰菊酯为代表药剂，采用饲喂法和药膜法，研究了两种农药对中华蜜蜂三大解毒酶和乙酰胆碱酶的亚致死效应，以及对吡虫啉饲喂处理后的蜜蜂进行转录组测序，从基因表达水平上研究吡虫啉对蜜蜂的影响。1、生物测定结果表明，吡虫啉对蜜蜂属于高毒性农药，药膜法的致死中浓度较低，生产中应避免让蜜蜂直接接触吡虫啉，减少在蜜蜂活动区域内使用吡虫啉。氟胺氰菊酯对中华蜜蜂的毒性较低，但中华蜜蜂的敏感性高于意大利蜜蜂，蜂业生产中，应避免中华蜜蜂接触氟胺氰菊酯污染的意大利蜜蜂产品，防止氟胺氰菊酯的累积效应所造成的危害。2、细胞色素P450、谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）是蜜蜂体内重要的三大解毒酶系。在24h内，饲喂LC5浓度吡虫啉诱导P450和GSTs酶活性水平显著提升，对羧酸酯酶也有一定的诱导作用，但高剂量吡虫啉对三大解毒酶活性没有诱导作用，甚至抑制酶活性。药膜法方式下，亚致死剂量吡虫啉提高了细胞色素P450和CarE活性，抑制GSTs活性，在LC50的高浓度时，提高了CarE和GSTs的酶活性水平。3、饲喂LC5浓度氟胺氰菊酯，开始阶段抑制P450酶活性，之后缓慢提升，对CarE活性抑制程度较大，但在24h内，均诱导GSTs活性的升高。饲喂LC50的高浓度氟胺氰菊酯，显著提高CarE的活性，但抑制了P450和GSTs的活性，在24h时酶活性显著降低。药膜法作用，中华蜜蜂三大解毒酶也呈现不同的变化情况，整体上影响较小，但是高剂量的吡虫啉对P450的诱导效应明显，极显著提高了不同时间点的酶活性水平。4、亚致死剂量的两种农药对乙酰胆碱酯酶（AChE）在24h内呈现先降低后升高的趋势，药膜法比饲喂法对AChE的影响大，对氟胺氰菊酯的抑制作用更强。饲喂LC10浓度的吡虫啉或者接触LC30的药膜均提高酶活性水平，但饲喂高剂量的氟胺氰菊酯显著抑制了AChE活性。5、通过转录组数据分析，发现LC5浓度的吡虫啉处理后，不同时间点，基因表达调控不同，腹部发生变化的基因多于头部。在LC5吡虫啉的胁迫下，中华蜜蜂发生改变的基因主要是消化系统、能量代谢系统、碳水化合物代谢、氨基酸代谢系统、脂类代谢系统、氨基酸代谢系统、基因转录和翻译、蛋白的加工和降解、运输和代谢、外源性物质的降解和代谢、还有一些辅酶因子相关的基因。在8h和16h时，中华蜜蜂免疫系统基因发生改变，如分子伴侣、热激蛋白、吞噬细胞、蛋白磷酸化酶、肌球蛋白等基因上调表达，提高蜜蜂的免疫活性，增强了对吡虫啉的抗性。7.2研究展望1、蜜蜂属于社会群居性昆虫，它们之间分工明确，紧密协作，共同构成一个大家庭。蜂群中数量繁多，个体差异较大，工蜂的个体测定数据，不能全面反映蜂群中不同分工个体的生理指标，因此不能排除群势强弱和个体差异对实验结果的影响。40 中国农业科学院硕士学位论文第七章全文总结2、酶活性只是影响外源性物质降解代谢过程中的一个因子，从酶活性大小可以初步判断蜜蜂对农药耐药性。蜜蜂降解外源性化合物是一个复杂和多种调控共同作用的过程，全面评价吡虫啉和氟胺氰菊酯对蜜蜂的亚致死效应，还需要从多方面综合考虑，如生长发育、繁殖能力、种群特性、群体抗性等。因此，全面评价吡虫啉对蜜蜂的影响，还要进一步系统而全面的研究。3、通过转录组数据，我们只是发现了相关代谢通路上的功能基因表达情况，在一定程度上解析了蜜蜂应对吡虫啉的分子调控机制，为研究蜜蜂的抗性机理奠定基础。我们分析到了很多的pathway参与到吡虫啉的代谢和抗性过程，但是吡虫啉是如何诱导这些pathway中关键基因的改变、基因之间是如何相互调控以及关键的调控因子等问题还不清楚，因此还需要对转录组数据进行深入分析并验证。41 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.苍涛,王彦华,俞瑞鲜,吴长兴,陈丽萍和吴声敢.蜜源植物常用农药对蜜蜂急性毒性及风险评价.浙江农业学报,2012,24(5):853-859.2.陈兰珍,赵静,张扬,薛晓锋和黄京平.蜂蜜中氟胺氰菊酯残留量抽样调查.农药科学与管理,2004,25(2):8-9.3.代平礼,周婷,王强,吴艳艳,耿文龙和宋怀磊.吡虫啉对意大利蜜蜂学习行为的影响.2013中国养蜂学会专业委员会学术会议论文集.2013,乌鲁木齐:1-6.4.龚瑞忠,陈锐和陈良燕.吡虫啉对环境生物的毒性与安全性评价.农药管理与科学,1990,20(3):12-16.5.靳三省和刁青云.环境中的外源性物质对意大利蜜蜂细胞色素P450的诱导作用.中国蜂业中旬刊（学术）,2014,65(2):25-29.6.李志勇,王志,牛庆生,薛运波和迟永娟.农药与蜜蜂生态安全.中国蜂业,2014,65(2):26-27.7.刘朋飞,吴杰,李海燕和林素文.中国农业蜜蜂授粉的经济价值评估.中国农业科学,2011,44(24):5117-5123.8.刘贤进,王萌长,赵勇和刘安西.吡虫啉、杀虫双对美洲蜚蠊中枢神经的电生理影响.1992,2(38):129-132.9.孟丽峰,靳三省和刁青云.饲喂果葡糖浆对意大利蜜蜂解毒酶的影响.江西农业大学学报,2013,35(3):574-578.10.苏松坤和陈盛禄.养蜂业与生态业.蜜蜂杂志,2009,29(1):8-10.11.王钰冲,陈伟文,董诗浩,刘晰文和谭垦.吡虫啉对东方蜜蜂的毒性研究.第十届海峡两岸蜜蜂与蜂产品学术研讨会暨首届全国蜂产业高峰论坛论文集.2013,扬州:148-151.12.闫文,张忠彬,胡俊峰和夏昭林.吡虫啉毒性研究进展与瞻望.环境与职业医学,2003,6(20):431-432,435.13.杨冠煌.中华蜜蜂在我国生态位中的作用及保护.中国蜂业,2009,60.14.杨爽和谭垦.杀螨剂残留对蜜蜂生理和行为的影响.蜜蜂杂志,2011,30(2):7-8.15.于彩虹和高希武.棉铃虫细胞色素P450CO差光谱的测定.昆虫学报,2005,48(2):301-304.16.张咏梅和李今越.吡虫啉的应用及其安全性研究进展.医学动物防治,2004,20(12):728-730.17.周婷,宋怀磊,王强,代平礼,吴艳艳和孙继虎.吡虫啉对意大利蜜蜂脑乙酰胆碱受体分布的影响.昆虫学报,2013,56(11):1258-1266.18.AhnKi-Su,YoonChangmann,KimKi-Hyun,NamSang-Young,OhMan-GyunandKimGil-Hah.EvaluationofAcuteandResidualToxicityofInsecticidesRegisteredonStrawberryagainstHoneybee(Apismellifera).TheKoreanJournalofPesticideScience,2013,17(3):185-192.42 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢三年时光荏苒过，又是一年毕业季，三年的科研生活，如白驹过隙，成为了昨天美好的回忆。回首三年前初次来到蜜蜂所，深深地着迷于那雕梁绣柱的建筑和缤纷秀丽的美景，自此远离喧嚣，甘于寂寞，开始了我个人人生三年的成长之旅。润物细无声，源头活水来，回忆过往之天真，抚思昔日之韶华，这里拥有了太多的感动和热情，关心和互助。谨以此为契机，表达我真诚的谢意和美好祝愿。享其实者思其树，饮其流者怀其源，学其成者念吾师。三年光阴，刁老师在其中付出了大量的心血。刁老师在繁重的工作压力下，悉心指导，帮忙解决科研过程中的问题和困难；热忱交流，悉心查找个人的缺点和不足；淳淳教导，锻炼提升自身的科研能力和综合素质。一丝不苟的作风改变我，严谨求实的态度影响我，博览干练的风范感染我。谢谢您的关心和培养，使我在科研能力上得以提高，视野角度得以拓宽，综合素质得以提升。笔短恩长，凝于一句，谢谢您，刁老师！感谢中国农业大学昆虫毒理学实验室高希武教授给我提供的优越实验条件，您悉心的指导和温暖的关怀，使我实验顺利进行的保障；您渊博的学识，大师的风范，是我永远学习的榜样。同时也感谢实验室宋敦伦老师、史雪岩老师和梁沛老师在实验过程给予的无私帮助和热情指导。感谢云南农业大学东方蜜蜂研究所和绍禹教授在实验取样过程中给予的全力支持和指导，因为有您，使我在遥远的昆明也感觉到自己像在母校一般，同时也感谢张炫老师、周丹银老师、谭垦老师和董坤老师，有你们的帮助，我的实验才得以顺利进行。感谢中国农业科学院蜜蜂研究所周婷老师、徐书法老师在实验操作和技术上给予的指导和支持，同时谢谢霍伟老师和姚军老师在养蜂过程中给予的帮助和指导。感谢中国农业科学院蜜蜂研究所和中国农业科学院研究生院的各位领导和老师，谢谢您们给我提供了稳定而又舒适的学习环境，你们孜孜不倦、严谨的态度深深影响着我，是我学习的榜样，谆谆教诲，悠悠师情，深留留在我心中。感谢师姐孟丽峰和师妹李贝贝在生活上给予的关心和谅解，在实验上给予的无私帮助和支持，感谢我的研究生同学张建燕、郭伟华、贾慧茹、盖琴宝、吴招斌、魏月、孙春丽、任佳淼，在生活和学习中给予各种帮助，有你们在一起，从来没有孤单过，有的是欢声和笑语。感谢中国农业科学院农产品加工研究所的同学谢小雷、余树玺、弓威、李金寒、刘亚男等，感谢你们在生活中的陪伴，有你们在一起，生活变得更加丰富多彩。感谢中国农业大学昆虫毒理学实验室的范银君、甄从爱、辛娟娟、梁彦、李芬、汤秋玲、马康生等师兄师姐，王志超、牛志远、康志娇、孙志强等各位同学，你们的帮助是我实验顺利进行的保障，你们的陪伴是我生活充实的源泉。感谢我的家人，在学业上的支持、生活上的关怀，你们是我学习和生活的基础，也是动力源泉。在未来的时光中，我一定好好工作，不辜负你们的期盼和付出，以更好的成绩回报这份恩情，谢谢您们。念不完的是真情，牵不完的是亲情，感不完的友情，谢不完的是师情，情情相随。有您们的相伴，让我度过了人生中重要的三年美好时光，快乐成长，收获知识，增长才干。靳三省2015年5月于北京植物园51 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：靳三省性别：男民族：汉族出生日期：1990年7月7日出生籍贯：河南省南阳市南召县学习经历：2008.9-2012.7河南农业大学植物保护学院植物保护专业本科2012.9-2015.7中国农业科学院蜜蜂研究所特种经济动物饲养硕士发表文章：1、靳三省,孟丽峰,刁青云.吡虫啉对意大利蜜蜂乙酰胆碱酯酶的亚致死效应.应用昆虫学报,2015,52（2）:315～323.2、靳三省,刁青云.环境中的外源性物质对意大利蜜蜂细胞色素p450的诱导作用.中国蜂业,2014,65（2）；25～29.3、孟丽峰,靳三省,刁青云.饲喂果葡糖浆对意大利蜜蜂解毒酶的影响.江西农业大学学报,2013,35（3）:574～578.52