野生蜜环菌属jz-10菌和齿菌属wj-1菌遗传学鉴定及jz-10菌初步育种研究 74页

Ｉ密敏文賓户／拿瑪硕ｄｒ研究生学位论文－■－：＼－野生蜜环菌属ＪＺ－１０菌和齿菌属ＷＪ１菌逸传学鉴定及ＪＺ－１０菌初步育种研究％申请人：王化梅学号：２１２１２４７培养单位：生命科学学院鄉专业：巧传学：微生物猎资幽研究方向Ｉ焉蘇扭．Ｐ＾指导教师：金涛教授１完成日期；２０５年３月２８日 独初性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黒龙江大学或其他教育。祝构的学位或证书而使用过的材料．学位论文作者签名：签字日期；文年月８曰学位论文版权使巧授权书本人完全了解黑龙江大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权显龙在么室可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。学位论文作者签名：导师签名：＾＂签字曰期－：从（月屋曰签宇曰期：Ｚｏｄ年（＾月參曰 分类号UDC密级硕士研究生学位论文野生蜜环菌属JZ-10菌和齿菌属WJ-1菌遗传学鉴定及JZ-10菌初步育种研究申请人:王世梅学号:2121247培养单位:生命科学学院学科专业:遗传学研究方向:微生物指导教师:金涛教授完成日期:2015年3月28日 中文摘要我国野生真菌资源丰富多样，不仅风味独特、营养丰富，其次级代谢产物结构多样、种类繁多，具有十分重要的降糖、抗氧化等药理功效。本文研究对象是采自黑龙江省穆棱林区(JZ-10)和四川九寨沟地区(WJ-1)的两株野生真菌，通过生物学方法和分子生物学技术相结合对两株野生真菌进行研究，并对JZ-10菌株紫外初步育种进行了探讨。结合WJ-1菌株的形态学特征和分子生物学鉴定结果，确定该菌株为环纹亚齿菌。次级代谢产物分析中，成功分离鉴定了8个化合物，包括2个新化合物。同时，对所分离化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性评价，其中新化合物1表现良好的降糖和抗氧化活性。对采自穆棱林区的菌株成功人工培养，获得菌株JZ-10，结合形态学特征及分子生物学鉴定结果，确定该菌为蜜环菌属真菌。此外，对JZ-10菌株进行紫外初步育种研究，通过显著性差异分析方法，获得一株优质的突变菌株。关键词：野生真菌；育种研究；鉴定I AbstractInourcountry,therearevarietyofwildfungusresources.Theynotonlyhaveuniqueflavor,butalsoareeutrophy,andwhosesecondarymetaboliteshaveawidevarietyofstructuresandfunctionssuchashypoglycemic,antioxidantandmanyotherpharmacologicalactivities.Inthispaper,theresearchobjectiscollectedfromMulengforestregioninHeilongjiangprovince(JZ-10)andJiuzhaigouinSichuanprovince(WJ-1).Combiningwiththemolecularbiologytechniques,weusebiologicalmerhodtoresearchthetwowildfungus,andwealsodiscussedtheultravioletpreliminarybreedingoftheJZ-10strains.CombinewiththeresultofmorphologicalfeaturesandmolecularbiologyidentificationoftheWJ-1strains,thestrainwasidentifiedringedinHydnellumconcrescens(Pers.)Banker.Duringtheanalysisofsecondarymetabolites,wesuccessfullyisolatedandidentifiedeightcompounds,includingtwonewcompounds.Atthesametime,weevaluatetheα-glucosidaseinhibitoryandantioxidantactivityofthecompoundsweseparated.Duringtheprocessofassessment,thenewcompounds1showsthebesthypoglycemicandantioxidantactivity.ThroughthesuccessfulartificialcultivationofstrainswhichcollectedfromMulengforest,weobtainedstrainsJZ-10.Combiningwiththemorphologicalcharacteristicsandmolecularbiologyidentificationresults,weidentifiedthestrainasArmillariasp.Moreover,weresearchedtheJZ-10strains’ultravioletpreliminarybreeding,andwealsoobtainedahighqualityofmutantstrainthroughthesignificantdifferencesanalysismethods.Keyword:Wildfungus;Studyonbreeding;AppraisalII 目录中文摘要IAbstractII第1章绪论11.1研究背景与立题依据11.1.1研究背景11.1.2立题依据11.2野生真菌鉴定方法11.2.1传统鉴定方法概述21.2.2分子生物学鉴定方法概述31.3常用育种方法51.3.1自然随机选择育种51.3.2杂交育种51.3.3诱变育种61.3.4原生质体融合育种71.3.5基因工程育种81.4本研究目的意义与研究内容81.4.1研究目的意义81.4.2研究内容9第2章WJ-1菌株鉴定102.1概述102.2菌种与设备102.2.1原材料102.2.2培养基及配方112.2.3主要试剂112.2.4主要仪器122.3实验方法122.3.1形态学观察122.3.2分子生物学鉴定13III 2.3.3次级代谢产物特征及活性142.4结果与分析162.4.1形态学观察结果162.4.2分子生物学鉴定结果162.4.3次级代谢产物特征及活性结果172.5本章小结28第3章JZ-10菌株鉴定293.1概述293.2实验材料与设备293.2.1原材料293.2.2培养基与配方303.2.3主要试剂303.2.4主要仪器303.3实验方法303.3.1人工培养303.3.2形态学观察303.3.3分子生物学鉴定303.4结果与分析313.4.1人工培养结果313.4.2形态学观察结果323.4.3分子生物学鉴定结果323.5本章小结34第4章JZ-10菌株初步育种研究354.1实验材料与设备354.1.1菌种354.1.2主要试剂354.1.3主要仪器354.2实验方法354.2.1菌株培养35IV 4.2.2诱变剂量选择354.2.3紫外诱变364.2.4突变株筛选364.2.5遗传稳定性测定364.3结果与分析374.3.1诱变剂量选择374.3.2突变株筛选384.3.3遗传稳定性测定384.4本章小结40结论41参考文献42附录50致谢65攻读学位期间发表的论文66独创性声明67V 第1章绪论1.1研究背景与立题依据1.1.1研究背景通常人们在野外采集的蘑菇是一类肉眼可见、用手可采集、有明显子实体[1]特征的大型野生真菌。据统计，全世界大约有野生真菌14万种，人类已知地[2]仅占10%。我国地域辽阔，地貌多样，拥有森林、荒漠、草原、湿地等多种生态类型，是世界公认的物种最为丰富多样的国家，野生真菌资源也是最多的，[3]目前，已知野生真菌约有3700多种。对野生真菌的认识和利用在我国历代的医药书籍中都曾有记载，如东汉时的《神农本草经》、唐代时的《药性论》等，[4]对多种野生真菌的药效和功能都有不同程度的记载。野生真菌作为一种纯天然、绿色、无污染真菌资源，其味道鲜美、香味独特，含有多种营养成分，如[5]维生素、蛋白质、矿质元素等。野生真菌的物种多样性决定其化学成分多样性，包括甾体、脂肪酸、萜类（倍半萜、二萜、三萜）、色素、生物碱、环肽等，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、增强免疫力、保护肝脏、防衰抗老、抗[6-9]胃溃疡等多种药理活性。野生真菌对药物的发展、维护人类健康等方面发挥[10]着非常重要的作用。1.1.2立题依据我国对野生真菌利用有悠久历史，《中国史稿》中郭沫若先生提到我们祖先在六七千年前就以采集到的野生真菌为食。近年来野生真菌越来越多的受到[11]人们关注，不仅味道鲜美、清香浓郁，而且其自身营养价值高。野生真菌凭借其低脂肪、高蛋白、多种维生素、微量元素、矿物质、几丁质和粗纤维等特[12]性，成为一种健康、有营养的食物。我国学者对16种野生真菌菌株进行化学成分分析，结果显示其菌株中含有必需大量元素Ca、Mg等和非必需微量元素[13][14]Zn、Fe等。在对野生牛肝菌的成分分析中，结果显示其含有较高的铷和钾。野生真菌除了风味独特、营养丰富以外，还有极其珍贵药理功效，如《本草纲目》中记载的冬虫夏草、茯苓等野生真菌的药用价值。野生真菌物种的多-1- 样性决定了次级代谢产物结构类型多样性，进而表现出多种多样的生物活性。从田蘑中(Agrocybesp.)分离的drimane型骨架倍半萜类化合物Agroeybolaeton可[15]以抑制革兰氏阳性菌。从牛舌菌(Fistulinahepatica(Schaeff.)With)子实体中分[16]离的三炔类化合物CinnatriaeetinA和CinnatriacetinB具有抗细菌活性。从猴头菌(Hericiumerinaceum(Bull.)Pers.)中分离的二萜类化合物erinacineA、erinacineB、erinacineC、erinacineK等能够促进神经生长因子的合成，神经生长[17]因子的合成对帕金森病等神经系统疾病有治疗作用。从桑黄菌(Phellinuslinteus(Berk.&M.A.Curtis)Teng)中分离的苯基丙烷衍生物hispidin是脯酰肽内[18]切酶和β-分泌酶抑制剂，可以治疗老年痴呆等疾病。从黑虎掌(Sarcodon[19]aspratumBerk.)中分离的脑苷酯类化合物cerebrosideB有免疫调节的功能。1.2野生真菌鉴定方法现广泛应用的野生真菌鉴定方法主要有两种：传统的形态学鉴定方法和分子水平的鉴定方法。传统的鉴定方法主要依据菌株的形态学和解剖学的特征以[20]及生理特点进行分类鉴定，只能依靠宏观和光学显微能达到观察水平为止。随着生物学技术发展，分子水平分类鉴定方法可以对各个发育时期生物个体、组织器官等做检测，这种方法有受环境影响小，稳定性好，特异性强，结果可[21]靠等特点，越来越多的应用在野生真菌的分类鉴定中。1.2.1传统鉴定方法概述传统的鉴定方法是相对于现代的鉴定方法而言的，主要根据野生真菌菌株[22]的生长特性、形态特征、生理生化指标等进行的分类鉴定。对于野生真菌来说，通常是根据子实体的形态特征，如大小、质地、形状、颜色等进行的分类鉴定，具体来说就是根据子实体的大小、形状；菌肉的颜色、气味；菌盖的颜色、形状；菌柄的长度、粗细、着生方式；菌褶的颜色、形态以及与菌柄的着[23]生关系；菌托、菌环的有无；孢子印等特点进行的分类鉴定。根据传统的鉴定方法对野生真菌进行分类鉴定的著作有邓叔群的《中国真菌分类》、黄年来的《中国大型真菌原色图鉴》、魏景超的《真菌鉴定手册》等。传统的鉴定方法可以直观的对菌株做出鉴定，是最基本地鉴定方法，在野生真菌的分类鉴定-2- 上有着不可替代的地位。许多菌株在采集过程中由于多种原因致使子实体信息缺失或变化，此时传统的鉴定方法并不准确，人为的主观判断对鉴定结果的影[24]响也很大，需要探讨新的方法。1.2.2分子生物学鉴定方法概述随着真菌分类学发展，野生真菌鉴定采用传统形态学方法和现代分子生物学方法结合手段，分子生物学鉴定对待鉴定菌的核酸序列分析，其遗传物质DNA[25]能直接的反映出野生真菌的进化和系统发育。1.2.2.1DNA样品中(G+C)mol%测定的鉴定方法(G+C)mol%的测定，是分子生物学技术中应用较早的真菌分类方法，(G+C)mol%=(G+C)/(G+C+A+T)×100，研究表明，DNA的(G+C)mol%在细菌中为24~78%，在脊椎动物中为35%~[20]45%，在真菌中为20~60%。热变性法是测定DNA(G+C)mol%的常用方法，DNA在热变性时，伴随着双链解开，紫外吸收值在260nm处随着温度升高而变大，DNA的双链全部解开时，有最大的紫外吸收值，此过程为增色效应，根据(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44得出G+C值，Tm是增色效应到一半时的温度；在真菌的分类鉴定中(G+C)mol%可作为真菌种属界定和真菌属间亲缘关系判定[26,27]参考标准。NohaM，WeiLi等通过对核酸G+C含量测定，对病毒和原核生物的核酸序列进行了研究。1.2.2.2限制性酶切片段长度多态性分析技术限制性酶切片段长度多态性分析(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)是限制性核酸内切酶专一识别DNA链中特异序列，通过内切方式使核酸断裂，产生的DNA片段长度不等。生物进化过程中，DNA的碱基序列因插入、易位、缺失、突变、倒位、转座等因素发生改变，从而导致限制性核酸内切酶识别位点改变，使DNA片段的长度[28]发生变化，在凝胶电泳时表现为电泳的迁移率不同，对其进行比较分析。通[29]过PCR-RFLP方法对可食用和药用的海参进行了鉴定，开发了新的鉴定方法。1.2.2.3随机扩增多态性DNA分析技术随机扩增多态性DNA分析(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)是利用人工合成的单个核苷酸序列做引物(8-10bp)，通过PCR反应非定点的扩增靶细胞DNA片段，用1%琼脂糖凝胶电-3- 泳分离不同引物产生的不同长度的DNA片段，对DNA片段的大小和数量进行[30][31]多态性分析，比较菌株之间的基因差异。S.Shweta等通过RAPD分析了从[32]不同地方和宿主分离到的黄曲霉的遗传多样性。XuelingWu等通过RAPD等方法对从不同环境分离到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌进行了分子生物学特征分析。1.2.2.4核酸分子杂交技术核酸分子杂交是以一条变性后标记的单链DNA分子当探针，在合适条件下依据碱基互补配对原则与另一条DNA分子杂交，获得其杂交的百分率，以此判断菌株的亲缘关系。若杂交百分率小于20%，则基本为无关菌系；若在20%~25%之间，则很难判断，可采用其他方法；若在65%~80%之间，则可判断为同属不同种；若两株菌杂交百分率差异在30%~35%以内，则[21]为同种不同株。实验方法是：受体DNA为固定在滤膜上的核苷酸链，固定目的是防止单链自身的同源区配对折叠，供体DNA是用放射性同位素标记的单链核苷酸，混合受体与供体DNA，将没有依据氢键结合起来的非同源片段洗掉，对留下的放射性片段用闪烁计数器计数，计算杂交百分率，并确定其亲缘关系[20][33]。赵运转等应用核酸杂交技术对阴道炎的主要致病菌念珠菌进行了检测，确定其为白色念珠菌，此结果与镜检结果一致。1.2.2.5真菌核糖体脱氧核糖核酸序列分析核糖体的基因组序列含有非常丰富的遗传变异信息，真菌核糖体的rRNA有5S、5.8S、18S、28S四种，rRNA基因组的一个重复单位从5’到3’方向依次是：①NTS(NonTranscribedSequence)：非转录区；②ETS(ExternalTranscribedSpacer)：外转录间隔区；③18SrDNA：18SrRNA基因；④ITS1(InternalTranscribedSpacer1)：内转录间隔区1；⑤5.8SrDNA：5.8SrRNA基因；⑥ITS2(InternalTranscribedSpacer2)：内转录间隔区2；⑦28SrDNA：28SrRNA基因；⑧5SrDNA：5SrRNA基因，在rDNA的NTS内。基因间隔区IGS(IntergenicSpacer)是NTS和ETS的合称，它将两个相邻的[34]重复单位分隔开，在转录过程中的作用是启动和识别。实验过程是：以供试菌的基因组DNA为模板，加入相应已知DNA序列的引物，PCR扩增，将扩增[21]后的DNA序列测序，测序后的结果与数据库中资料比较，并分析其遗传关系。[35]Kumar等通过对真菌性角膜炎(mycotickeratitis)致病菌ITS序列的研究，结果证明，此方法可用于由烟曲霉(AspergillusfumigatusFresen.)引起的真菌性角膜溃-4- [36]疡和真菌性角膜炎患者的诊断。苏春丽等对中国的栽培灵芝进行了ITS序列分析发现，其分布在五个聚类组。1.3常用的育种方法微生物与生物制品工业、食品工业等产业的关系密切，其产品的好坏与菌株的优良有直接的关系，也对人们的生活质量产生一定的影响，因此通过育种手段培育出高产、优质的菌株具有十分重要的意义。其育种目的是引导菌株生物合成的代谢途径向希望的方向发展，并能够过量的积累某些代谢产物，或促使细胞中的基因发生重新组合对遗传性状进行优化，以期获得人们需要的优质、[37]低耗、高产的菌株。1.3.1自然随机选择育种自然随机选择育种是生物体在自然条件下可产生自发的突变，选择优质菌落同时对衰退的菌落进行分离筛选排除的育种方法。通过去劣存优选育新品种的手段是最简单、最古老的育种方法，也是其他育种方法的基础。可根据自发突变后菌种的性状变化来选育优良菌种，利用此方法分离的高产菌种可以用于[38][39]生产。周建林等对江山白菇进行自然随机选择育种，获得了优质、高产、抗逆性强的金针菇(Flammulinavelutipes(Fr)Sing.)新品种。微生物有很低的自发-8-6突变率，约是10~10，正突变更低，所以用自然选育高产、优质等菌株的效率不高，效果也不明显。1.3.2杂交育种杂交育种是菌株新品种选育中收效显著、应用广的育种方法。杂交育种的是通过种内不同的品种杂交，以实现遗传基因重组，并从杂交的后代中筛选具有双亲的优良性状的新品种，这种方法目的性和方向性都较明确，杂交育种分为多孢杂交、双单杂交、单单杂交，多孢杂交是使多孢快速杂交并尽量是在同一时间内，快速选育出杂交的新品种的育种方法；双单杂交是用一个双核的菌丝体单方面把一个单核的菌丝体双核化，此方法适用于将菌株的优良性状进一-5- [38][40]步改良。徐珍等对金针菇F3-31和FM-83进行单单杂交育种，选育出适合工厂化栽培的优良菌株G1。1.3.3诱变育种诱变育种是在一定的条件下利用物理诱变剂（如紫外线、激光、电离辐射等）、化学诱变剂（如烷化剂、碱基类似物等）等处理出发菌株，诱发其基因突变，通过合适的筛选方法，从变异体中选择出少数符合诱变育种目的的突变[41]株，以供科学试验或生产实践的一项工作。1.3.3.1物理诱变根据诱变条件不同主要包括紫外诱变、激光诱变、离子束诱变、电离辐射诱变、空间诱变等。(1)紫外诱变紫外线作为物理诱变中的非电离辐射诱变因子，是致使微生物突变较为简单有效的常用育种手段。紫外诱变的机理是DNA经过紫外线的照射，其相邻的两个嘧啶之间通过共价连接形成嘧啶二聚体，使双键间氢键作用减弱，引起DNA双链结构的扭曲和变形，从而使碱基的正常配对受到阻碍，导致生物体突变或者死亡。此外，嘧啶二聚体的形成，能影响DNA双链解开，从[37]而妨碍DNA的转录和复制。紫外线的照射剂量要仔细控制，若过多会导致细胞的大量死亡，若过少则不能得到较好的诱变结果，紫外诱变的诱变剂剂量与照射时间、灯和生物体的距离、灯的功率相关，另外，经紫外线照射后微生物是可修复的，若经紫外线照射后的微生物暴露在可见光下，在光复合酶作用下，使DNA损伤得到修复，导致微生物的死亡率降低，因此在紫外诱变时，需要在[42]红光或黑暗条件下操作。紫外诱变技术因危险性小、操作方法简单、效果好、经济实惠、正突变概率高等优点被人们广泛使用，并且大部分实验室都可以达到此条件。紫外诱变方法是筛选优良菌株常规的诱变育种技术。WalidALotfy[43]等对柠檬酸产生菌黑曲霉(Aspergillusniger
Tiegh.)进行紫外线照射，获得的[44]变异菌株产品收率为60.25%
。刘研国等通过紫外诱变育种提高了侧耳菌的[45]纤维降解能力，用于提高处理秸秆饲料效率。王丽宁等对香菇的原生质体进行紫外诱变，选育了一株耐高温菌株。-6- (2)激光诱变激光诱变通过激光辐射产生压力、光、电磁场、热效应地综合作用，直接或间接作用于生物体，引起细胞质粒、染色体、RNA或DNA畸变效应，细胞代谢活动和细胞分裂改变，酶的钝化或激活，使生物体的细胞学和遗传特性发生改变，从而达到诱变效果，激光诱变因其操作简单、高效、使用安全稳定、低回复突变率、低辐射损伤、无污染、选择性高等优点在微生物[46]的育种研究中取得广泛应用。(3)离子束诱变利用离子注入设备将高能的离子束注入到生物有机体中，生物分子吸收其能量，通过各种活性自由基中间体，导致生物分子化学和物理上的复杂变化和损伤，引起质粒DNA断裂、染色体突变、细胞DNA断裂等改[47]变，从中选育出优良的突变菌株。近年来，微生物育种中该技术逐渐引入，但因一般实验室难以达到离子束诱变育种条件，目前应用相对较少。(4)电离辐射诱变电离辐射包括γ射线、β射线等射线，γ射线是电离辐射诱变中应用较多的一种射线，是具有高能量的电磁波，能产生电离作用，其[37]突变率和射线的剂量呈直接关系，能间接或者直接对DNA的结构进行改变。[48]60NamkyuSun等通过对产类胡萝卜素的Phaffiarhodozyma用Coγ
射线处理，相对于原始菌株其突变株的产量提高了50%。电离辐射诱变有一定程度的局限性和危险性，常用在不能选择其他诱变方法的诱变育种技术。1.3.3.2化学诱变化学诱变是诱变剂能和DNA相互作用，使DNA的结构发生改变，最后导致DNA变异，化学诱变剂包括碱基的类似物、移码突变剂、烷化剂[38]等。因诱变剂不同其诱变的效果也不相同，在实验操作中要看具体需求选择适当的诱变剂和剂量。烷化剂活性烷基有一个或者多个，可以将生物体DNA中的活泼氢原子代替，烷化DNA的碱基，导致复制的DNA分子碱基错配，使生物体发生变异而遗传突变，烷化剂包括甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate，EMS)、亚硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)、硫酸二乙酯(diethylsulfate，DES)等；碱基的类似物是与天然的DNA碱基分子结构相似的一类物质，在生物体处于繁殖或者新陈代谢旺盛的时候进入到DNA分子里，使DNA分子复制产生错误配对，导致转录紊乱、蛋白重组等突变效应，碱基类似物包括5-溴尿嘧啶(5-BU)、8-[49]氮鸟嘌呤(8-NG)、6-巯基嘌呤(6-MP)等。-7- 1.3.4原生质体融合育种原生质体融合技术是通过酶法、非酶法、机械法等手段除去微生物细胞的细胞壁，在将遗传类型不同的微生物细胞原生质体通过聚乙二醇等化学方法或者激光诱导融合等物理方法人工进行诱导融合，使细胞的基因组重组与交换而得到融合子，并通过标记营养缺陷型、抗药性等方法筛选融合子，以期获得具[50]有双亲形状的新品种的育种方法。Xu等对产普纳霉素的始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)亲本原生质体融合，获得高产的普纳霉素优良菌[51]株，产量约0.89g/L。Khattab等将黑曲霉(A.niger
Tiegh.)突变株进行原生质[52]体融合，得到的菌株胞外产葡萄糖氧化酶(GOD)活性显著提高。Hou等将酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeMeyen)突变株原生质体融合后，筛选出的菌株[53]乙醇产量和耐受性分别提升到13%和15%。Jin等将刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)原生质体融合，筛选获得的菌株产多杀菌素达547[54]mg/L。李居宁等将高浓酵母与青岛啤酒酵母的原生质体融合，选育的高浓酿造菌株在还原双乙酰快、降糖等方面存在优势。1.3.5基因工程育种基因工程育种是将需要的基因DNA分子从供体生物体中获得，在体外条件下DNA片段经过修饰或者酶切后和载体DNA片段连接起来，将连接后的基因片段一起转入受体细胞中，使目的基因复制表达，从而培育出新的品种的一种[54]育种方法。John等对产淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和德氏乳杆菌的突变株为亲本菌株，基因组重组后，其菌株乳酸发酵和淀粉转[55]化率分别是40g/L和96%。Masahide等将糙皮侧耳用基因枪法将转化子质粒DNA分子成功的与基因组DNA分子连接。1.4研究的目的和意义1.4.1研究目的意义通过对目标野生真菌生物学特性进行初步研究，并用分子生物学方法鉴定目标野生真菌菌种的种属归属，学习野生真菌的科学鉴定方法。综合利用色谱学分离技术(如正相硅胶色谱、凝胶SephadexLH-20柱色谱、高效液相色谱、薄层色谱等)和现代波谱方法(如NMR、MS等)分离鉴定目标野生真菌的生物活性-8- 产物，筛选有活性的单体化合物，以期发现具有生产价值的候选物质，为后续的化学及生物学等研究提供基础。此外，对目标野生真菌进行紫外诱变育种，以期筛选出性状良好、次级代谢产物丰富的的诱变菌株作为生产的候选菌株。野生真菌是微生物的重要类群之一，其代谢产物种类丰富、结构类型独特，使其成为天然有机活性小分子的主要来源（占微生物来源的50%以上）。野生真菌的准确鉴定有利于保护其物种多样性、维护我国野生真菌知识产权、维持生态系统平衡等。野生真菌在物种及代谢的变化方面具有极为广泛的潜力可以挖掘，真菌的代谢产物是可重复利用的资源，可以通过菌株的变异，介质的变化及培养条件的改变来大规模生产这些代谢产物。对创新药物的研究和资源开发具有重要的实用价值和现实意义。1.4.2研究内容1.WJ-1菌株鉴定：通过观察WJ-1菌株子实体特征，结合分子生物学鉴定方法对WJ-1菌株进行鉴定，通过波谱学、色谱学等方法分离鉴定次级代谢产物，并对其生物活性进行评价。2.JZ-10菌株鉴定：对野生菌株进行人工培养，分离纯化。通过菌株形态学特征并结合分子生物学方法来对JZ-10菌株进行鉴定。3.JZ-10菌株初步育种研究：对JZ-10菌株进行初步紫外育种研究，通过HPLC分析、显著性差异分析方法以期选育出一株优质突变菌株。-9- 第2章WJ-1菌株鉴定2.1概述齿菌属(Hydnellum)真菌在我国分布广泛，如在云南、安徽、山西、西藏、新疆、福建、青海、江西等地区，主要在夏末秋初生长，单生或丛生在林地表[56]面，齿菌属真菌到2008年共发现了93种。该属真菌的主要特征是许多种类[57]子实体菌盖上有红色分泌物附着，在1877年就有科学家研究了这类色素。近年来，该属真菌的次级代谢产物研究及生物活性报道相对较少，已经发现的化[58,59]合物种类包括联苯化合物、萜类、甾醇、色素等。早在1965年，从亚齿菌(HydnellumdiabolusBanker)中发现了齿菌橙，随后1966年从H.caeruleum(Hornem.)P.Karst中发现了裂盒蕈色素，这两种三联苯[60,61]化合物具有抗凝血和抗肿瘤活性。1974年，从锈色亚齿菌(H.ferrugineum(Fr.)[62]P.Karst.)中发现一个新颖的色素Hydnuferrugin。2006年，首次从H.Suaveolens和H.geogeninum两株齿菌中分离得到含氮联苯类化合物：HydnellinsA,HydnellinsB和Sarcodoninδ，这类化合物活性测定显示具有一定的抗氧化活性[63]和降糖活性等。另外，2004年从H.caeruleum中发现了三联苯化合物ThelephantinsI-N和dihydroaurantiacindibenzoate，遗憾的是当时并未进行活性[58][64]测定。王兴娜等从H.repandum中分离到两个鸟巢烷型二萜类化合物：[59,65]sarcodoninA和scabronineB，有良好的抗菌活性。杨小龙等对H.concrescens的分离中，发现了四个麦角甾醇类化合物：(22E,24R)-麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇、5α,8α-过氧-(22E,24R)-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇、(22E,24R)-麦角甾-5,22-二烯-3β-羟基-7酮、6-甲氧基-cerevisterol和一个木栓烷型三萜：friedelin，此类化合物显示良好的病毒抑制活性。2.2实验材料与设备2.2.1原材料2.2.1.1菌种WJ-1菌株，采集于四川九寨沟。-10- 2.2.1.2材料材料生产厂家α-葡萄糖苷酶Sigma(St.Louis，USA)P-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷Sigma(St.Louis，USA)柱层析硅胶青岛海洋化工有限公司阿卡波糖德国拜耳医药维生素CSigma(St.Louis，USA)SephadexLH-20美国Fluka公司1%琼脂糖凝胶北京化学试剂公司10×PCR缓冲液TaKaRa公司dNTPsTaKaRa公司引物上海生物工程技术服务有限公司合成Taq酶TaKaRa公司DL2000DANMaker南京诺唯赞生物科技有限公司2.2.2培养基及配方培养基配方马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)马铃薯20%,葡萄糖20%,蒸馏水1L，琼脂2%，PH自然，115℃，灭菌30min2.2.3主要试剂试剂生产厂家显色剂10%H2SO4-乙醇溶液（实验室配制）甲醇（色谱纯）天津四友化学试剂公司甲醇（分析纯）北京化学试剂公司二甲基亚砜（分析纯）北京化学试剂公司石油醚北京化学试剂公司丙酮（分析纯）北京化学试剂公司二氯甲烷（分析纯）北京化学试剂公司正己烷（分析纯）北京化学试剂公司-11- 三氯乙酸北京化学试剂公司三氯化铁溶液实验室配置乙酸乙酯（分析纯）北京化学试剂公司三氯甲烷北京化学试剂公司异戊醇北京化学试剂公司乙醇北京化学试剂公司CTAB缓冲液实验室配置2.2.4主要仪器仪器型号生产厂家RP-C18色谱柱250×9.4mm5MAgilent数控超声波清洗器KQ3200DE型昆山市超声仪器有限公司旋转蒸发仪RE-52AA上海亚荣生化仪器厂河南省巩义市予华仪器有循环水式真空泵SHZ-D(III)型-P5B型限责任公司冷冻干燥离心机GL-21M湘仪离心机仪器有限公司高压蒸汽灭菌锅MLS-3780三洋灭菌锅哈尔滨东联电子技术开发超净工作台ZHJH-C1106B有限公司电子分析天平AL240瑞士梅特勒公司电磁炉JYC-21HS87九阳有限股份公司离心机AnkeTgl-16c型上海安享科学仪器厂PCR仪9700美国应用生物系统公司电泳仪DYY-6C北京市六一仪器厂凝胶成像系统TanonGis一2008天能科技有限公司HPLCAgilent1100、1200系列AgilentRP-C18色谱柱150×4.6mm5MAgilent2.3实验方法2.3.1形态学观察-12- 根据《中国蕈菌原色图集》、《常见野生蘑菇识别手册》等文献作为参考，[66-70]对采集到的菌株进行形态学观察。2.3.2分子生物学鉴定2.3.2.1DNA的提取步骤方法1将野外采集的子实体干燥2取适当子实体放入研钵中，加液氮充分研磨至粉状；样品转移到5mL离心管中，加入1.5mL65℃CTAB缓冲液，65℃3恒温水浴1h，不时颠倒混匀离心(12000rpm)10min，取上清至5mL离心管中，加入等体积4的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，轻轻混匀,静置10min5离心(12000rpm)10min，取上清至5mL离心管中6加入三分之二体积预冷的异戊醇，-20℃沉淀30min；离心(12000rpm)10min，弃上清，用70%乙醇洗涤2次，离心7(12000rpm)1min，干燥8用20μL无菌水溶解，-20℃保存2.3.2.2PCR扩增步骤方法ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG10×PCRbuffer2.5μLdNTP(2mmol/L)2.5μLITS4(10μmol/L)1.0μLPCR反应体系(25μL)ITS5(10μmol/L)1.0μLddH2O15.25μLTaq酶0.25μL-13- DNA模板1μLMgCl2(25mmol/L)1.5μL预变性：95℃5min变性：95℃30sPCR反应程序退火：56℃30s35个循环延伸：72℃50s补平：72℃10minPCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。扩增后的序列经公司测序，将测得的序列在GenBank中BLASTN检索，进行同源序列比对，下载比对后相似率大于在80%的同源物种序列，与本文研究的序列共9个进行系统发育分析，用ClustalX软件对序列排序，使用MEGA(version6.1)软件构建系统进化树，采用邻位相连法(NJ，neighbor-joining)，统计学上的每个分支系统树的[71]分析方法以自展法(bootstrap)引导，重复1000次。2.3.3次级代谢产物特征及活性2.3.3.1提取与分离将野外采集的子实体自然条件下干燥，称重后粉碎。用乙酸乙酯约2L浸泡，每3天超声提取1次，共提取3次。将提取液合并后用真空旋转蒸发仪浓缩，得到粗提物，称重。将甲醇溶解的粗提物HPLC分析，流动相[58]为10%-100%乙腈/水梯度洗脱45min，紫外吸收230nm分析。粗提物以TLC和HPLC分析特征信号为指导策略，经减压柱、SephadexLH-20凝胶柱、正相硅胶柱等进行分离纯化，通过NMR波谱数据，对单体化合物结构进行鉴定。2.3.3.2生物活性(1)抗氧化活性对分离获得的单体化合物进行抗氧化生物活性评价，采用DPPH自由基清除活性测试，如表2-1；以及还原力测试，如表2-2，进行综合[72,73]评定。表2-1DPPH自由基清除活性除测试方法Table2-7ScavengingactivityinadditiontotestmethodofDPPHfreeradical样品组对照组阴性对照组步骤(sample)(samplecontrol)(control)-14- 不同浓度样品乙醇溶液100μL100μL--DPPH乙醇溶液(0.2mM)100μL--100μL乙醇溶液--100μL100μL反应条件30min结果测试至96孔板，517nm测定吸光度[ODDPPH.control-(ODsample-ODsample.control)]/自由基清除率%ODDPPH.control×100%表2-2还原力活性测试方法Table2-2Reducingpoweractivitytestingmethod步骤样品组不同浓度样品溶液1mL磷酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)2.5mL1%铁氰化钾溶液2.5mL反应条件50℃水浴20min快速冷却10%三氯乙酸1mL反应条件4℃4000r/min离心10min，取上清2.5mL蒸馏水2.5mL0.1%三氯化铁(新配制)0.5mL反应条件10min结果测试700nm测定吸光值(样品吸光值-空白吸光值)/空白吸光值×还原率%100%(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性测试利用α-葡萄糖苷酶抑制模型测试单体化合物[74]降糖活性。操作步骤如下。步骤样品组样品空白组对照组对照空白组不同浓度受试化合物25μL25μL-----15- α-葡萄糖苷(0.2U/mL)25μL--25μL--磷酸缓冲液(50mM,pH6.8)175μL200μL200μL225μL反应条件温室孵育10minp-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷25μL25μL25μL25μL反应条件37℃水浴30min结果测试离心取上清至96孔板，405nm测定吸光度[(OD对照-OD对照空白组)-(OD样品-OD样品空白组)]/抑制率%(OD对照-OD对照空白组)×100%2.4结果与分析2.4.1形态学观察结果菌盖近圆形，边缘凹凸，所采集WJ-1菌株直径从4~8厘米不等，菌盖中部下凹，似盘状，表面齿状，有绒毛及亮色环纹，边缘呈浅褐色，向中心颜色逐渐变深为深褐色或棕黑色，革质；子实体干燥后，颜色变深；菌齿较短，褐色，韧质；菌柄长为5cm左右，直径在1.5cm左右，连接菌盖处直径较菌根处略大，中生，近似菌盖色。如图2-3。图2-3WJ-1菌株子实体Table2-3WJ-1fruitingbody[66-70]根据《中国蕈菌原色图集》、《常见野生蘑菇识别手册》等参考文献。可初步鉴定WJ-1菌株可能为环纹亚齿菌(H.concrescens(Pers.)Banker)。2.4.2分子生物学鉴定结果-16- PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳扩增结果如图2-4，PCR扩增后的DNA片段显示单一条带，大小在700bp左右，与测序结构基本一致。图2-4WJ-1菌株PCR扩增凝胶电泳图Table2-4GelelectrophoresisofPCRamplifiedWJ-1通过BLASTN同源搜索，确定菌株同源性达99%，即可以认为它们是同一[75]种。WJ-1菌核酸序列经检索后，序列最大相似率是100%，基本可确定WJ-1菌为环纹亚齿菌(H.concrescens(Pers.)Banker)，与形态学鉴定结果一致。图2-5是基于该菌的碱基序列构建的系统发育树。图2-5基于WJ-1菌株碱基序列构建的系统发育树Table2-5ThephylogenetictreeconstructedbasedonthenucleotidesequenceofWJ-12.4.3次级代谢产物特征及活性结果2.4.3.1提取和分离菌株子实体干重约为200g，粗提物重量20g。230nm紫外吸收HPLC分析结果如图2-6，保留时间20-34min处次级代谢物丰富。粗提物经减压柱层析，洗脱剂依次的正己烷/乙酸乙酯(v/v，100:0，100:2，100:5)、二氯甲烷/丙酮(v/v，100:1,100:2,100:3,100:5,100:10，100:15,100:20,-17- 0:100)梯度洗脱，得到11个馏分。以TLC和HPLC分析特征信号为指导策略，对中等极性部位HC-6、HC-7、HC-10三个馏分进行分离纯化。3.002.502.001.50AU1.000.500.000.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.0046.0048.0050.0052.0054.00分钟图2-6WJ-1菌株HPLC分析图谱Table2-6AnalysisofWJ-1HPLCHC-6(920mg)馏分经SephadexLH-20凝胶柱流动相甲醇/水(v/v,9:1)分离后，获得两个子馏分HC-6-2(50mg)、HC-6-6(50mg)。HC-6-2经HPLC分离纯化，洗脱条件45-75%乙腈/水梯度洗脱75min，62.0min得到化合物3(14.6mg)，70.0min时得到化合物5(1.7mg)；HC-6-6经正相硅胶柱二氯甲烷/丙酮(v/v,100:2)、凝胶柱(甲醇/水，v/v,9:1)分离纯化获得化合物4(10.5mg)。图2-7WJ-1菌株分离流程图Table2-7WJ-1separationflowchart-18- HC-7(150mg)馏分经HPLC分离纯化，洗脱条件58-68%甲醇/水梯度洗脱55min，41.0min分离获得化合物2(4.9mg)，48.0min分离获得化合物7(3.8mg)，24.0min分离获得化合物8(1.0mg)三个化合物。HC-10(220.0mg)馏分经经凝胶MeOH/H2O(v/v，9:1)分离得子馏分HC-10-4(75.0mg)，经正相硅胶柱、SephadexLH-20凝胶柱(甲醇/水，v/v，9:1)、60%甲醇/水经HPLC等度制备，12.5min分离纯化获得化合物1(8.7mg)，22.0min分离纯化获得化合物6(9.0mg)两个化合物。共分离纯化获得化合物8个，分离流程如图2-7所示。2.4.3.2化合物结构解析通过MNR波谱分析对获得的8个化合物进行结构解析，均为三联苯类化合物，其中包括2个新化合物，6个已知化合物。化合物具体结构如图2-8所示。-19- 图2-8化合物1-8的结构（*标注为新结构化合物）Table2-8Thestructureofcompound1-8(*annotationwerenewcompounds)(1)新化合物1结构解析化合物1是灰色固体，易溶于甲醇和氯仿，通过正离子模式的HR-ESI-MS+给出准分子离子峰为[M+H]m/z473.1236，结合NMR数据分析，得出该化合物113分子式为C27H20O8，不饱和度为18，UV吸收是230nm、260nm，H和C的NMR谱图数据如表2-9所示。1H-NMR谱显示化合物1有1个甲基氢信号δ1.73(3H,s)，13个芳香族氢信号δ6.73(2H,d,J=8.6Hz)，6.84(2H,d,J=8.6Hz)，7.20(2H,d,J=8.6Hz)，7.22(2H,d,J=8.6Hz)，7.43(2H,t,J=7.7Hz)，7.59(1H,t,J=7.7Hz)，7.88(2H,13d,J=8.5Hz)。C-NMR显示化合物1有1个甲基碳信号，24个芳香族碳信号2包括4个苯酚碳信号(δ141.2,141.3,156.6,和156.7)、18个sp杂化碳信号[114.5(2-20- 个碳),114.6(2个碳),122.5,122.6,123.5,123.6,128.1(2个碳),128.3,128.8,129.4,131.2(4个碳),133.5]、2个酯羰基碳信号(δ164.7和169.2)。113借助HSQC信号将其归属。化合物1的H和CNMR数据与已知化合物TerrestrinD相似，包括对三联苯骨架、苯甲酰基团、乙酰基。根据HMBC显示H-2(H-6)与C-1、C-3、C-4、C-1"相关，H-3(H-5)与C-1、C-2、C-4相关，H-2""(H-6"")与C-1""、C-3""、C-4""、C-4"相关，H-3""(H-5"")与C-1""、C-2""、C-4""相关，因此确认C-1"和C-4"是两个对位取代苯基，如图2-10(1)所示。另外，HMBC显示H-2b与C-1b相关，H-3a(H-7a)与C-1a相关，确认乙酰基和苯甲酰的存在，如图2-10(1)所示。根据NOESY谱图，H-2b与H-2""有NOE相关信号，H-3a(H-7a)与H-2b有NOE相关信号，从而确定了C-3"为的乙酰基取代和C-2"位的苯甲酰取代，如图2-10(1)所示。将化合物1与TerrestrinD的核磁数据比较，有相同的相对分子质量，因此确定了化合物1的结构。113表2-9化合物1和2的H和CNMR数据113Table2-9Compounds1and2HandCNMRdataNO.1(CD3OD)2(DMSO-d6)δCδH(mult.;JinHz)δCδH(mult.;JinHz)1122.5120.82,6131.26.84,d(8.6)130.37.09,d(8.7)3,5114.67.20,d(8.6)115.36.72,d(8.7)4156.7157.41"123.5129.72"128.1139.13"128.1138.94"123.6129.75"141.2139.16"141.2138.91"122.6120.82",6"114.66.73,d(8.6)130.37.09,d(8.7)3",5"131.27.22d(8.6)115.36.72,d(8.7)4"156.6157.41a164.7163.32a128.8127.33a,7a129.47.88,d(8.5)129.47.72,d(8.7)4a,6a128.37.43,t(7.7)128.97.34,t(7.5)-21- 5a133.57.59,t(7.7)134.37.53,t(7.5)1b169.2168.02b18.71.73,s19.92.05,s1c163.32c127.33c,7c129.47.72,d(8.7)4c,6c128.97.34,t(7.5)5c134.37.53,t(7.5)1d168.02d19.92.05,s图2-10.化合物1和2的HMBC和NOE相关Table2-10Compounds1and2oftheHMBCandNOEcorrelation(1)新化合物2结构解析化合物2是灰色固体，易溶于甲醇和氯仿，通过正离子模式的HR-ESI-MS+给出准分子离子峰为[M+H]m/z619.1599，结合NMR数据分析，得出该化合物113分子式为C36H27O10，紫外吸收是230nm、267nm，H和C的NMR谱图数据如表2-5所示。-22- 113根据HNMR和CNMR的数据显示，化合物2有1个对取代苯[δH6.72(2H,d,J=8.7Hz)、7.09(2H,d,J=8.7Hz)；δC115.3(2个碳)、120.8、130.3(2个碳)]、1个苯甲酰信号[δH7.34(2H,t,J=7.5Hz)、7.53(1H,t,J=7.5Hz)、7.72(2H,d,J=8.7Hz)；δC127.3、128.9(2个碳)、129.4(2个碳)、134.3,168.0]、1个乙酰基信号[δH2.05(3H,s)；δC19.9、168.0]、1个六取代苯[δC129.7(2个碳)、138.9(2个碳)、139.1(2个碳)]。化合物2的NMR数据与已知化合物dihydroauran-tiacindibenzoate(5)相似，除了化合物2的乙酰基以外。根据HMBC数据显示H-2(H-6)与C-1、C-3、C-4、C-1"相关；H-3(H-5)与C-1、C-2、C-4相关；H-2""(H-6"")与C-1""、C-3""、C-4""、C-4"相关；H-3""(H-5"")与C-1""、C-2""、C-4""相关，确定化合物2为对三联苯结构，如图2-6(2)所示。根据化合物2的分子式，推测化合物2是一个对称结构。根据NOE谱图，H-3a(H-7a)与H-2(H-6)有相关信号，H3-2d与H-2(H-6)有相关信号，从而确定了中间芳环的取代模式，如图2-6(2)所示。基于光谱数据，确定了化合物2的结构。(3)化合物3波谱数据化合物3是白色固体，分子式为C41H28O10，紫外吸收是232nm、267nm。113[58]通过H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物ThelephantinL。-23- (4)化合物4波谱数据化合物4是红色固体，分子式为C26H18O7，紫外吸收是241nm、248nm，通113[58]过HRESIMS、H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物ThelephantinI。(5)化合物5波谱数据化合物5是白色固体，分子式为C46H30O10，紫外吸收是230nm、257nm，113[58]通过HRESIMS、H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物dihydroauran-tiacindibenzoate。-24- (6)化合物6波谱数据化合物6是红色固体，分子式为C32H22O8，紫外吸收是226nm、264nm，通113[58]过HRESIMS、H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物ThelephantinJ。(7)化合物7波谱数据化合物7是灰色固体，分子式为C39H26O9，紫外吸收是231nm、260nm，通113[58]过HRESIMS、H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物thelephantinK。-25- (8)化合物8波谱数据化合物8是灰色固体，分子式为C31H24O10，紫外吸收是230nm、268nm，113[58]通过HRESIMS、H、CNMR数据与参考文献比对，表明该化合物为已知化合物CurtisianA。2.4.3.3生物活性评价(1)抗氧化活性结果测试结果如表2-11，到目前为止，并没有报道对化合物1-8进行抗氧化评价。通过DPPH自由基清除法和还原力法测定了化合物1-8的抗氧化活性，化合物1和4显示DPPH自由基清除活性的EC50值分别为82.50μM和161.75μM。铁氰化钾还原法是测定抗氧化活性的一个重要指标。化合物1和4还原力活性EC50值是193.57μM和152.94μM。在两个抗氧化实验中化合物2、3、5-8显示弱抗氧化能力其EC50值大于200μM。表2-11化合物1-8的抗氧化活性结果(EC50)Table2-11Theantioxidantactivityofcompound1-8(EC50)(μM)抗氧化活性化合物DPPH自由基清除活性(EC50)还原力活性(EC50)182.50±1.68193.57±0.352>200>2003>200>2004161.75±1.32152.94±0.41-26- 5>200>2006>200>2007>200>2008>200>200Vc25.67±1.6248.23±0.49(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性结果根据表2-12的测试结果显示，化合物1-4，6-8的α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分别是0.99、3.11、4.53、18.77、2.98、5.16、8.34μM。由此看出化合物1有强的抑制活性，其次是化合物2和化合物6。化合物5表现较弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值大于50。通过构效关系进行初步推断，在α-葡萄糖苷酶抑制活性中三联苯骨架中心苯环比苯醌环贡献大，化合物1-3，6-8比化合物4抑制活性强，其中央苯环的苯甲酰基部分的取代有很大的影响。阳性对照阿卡波糖的IC50值是目前应用较多的，且与文[76]献报道一致。表2-12化合物1-8的α-葡萄糖苷酶抑制活性结果(IC50)Table2-12Compound1-8α-glucosidaseinhibitoryactivityresults(IC50)(μM)化合物IC50化合物IC5010.99±0.0462.98±0.1223.11±0.0675.16±0.3634.53±0.0888.34±0.28418.77±0.11阿卡波糖319.06±0.145>50总之，共分离并确定了2个新的对三联苯衍生物的结构(化合物1和2)与6个已知的类似物(化合物3-8)。在体外生物活性测定实验表明，化合物1-8有α-葡萄糖苷酶的抑制作用。根据我们目前的数据，食用菌中对三联苯衍生物的抑制活性，证实了其作为抗糖尿病药物的潜在效用。近年来全球糖尿病的发病率呈逐渐上升趋势。糖尿病作为一种代谢性疾病，以高血糖为特征，治疗糖尿病的药物除胰岛素外，主要是口服降糖药，大致分为磺脲类、双胍类、中药制剂等，传统的降糖药，易出现过敏和耐药性等副作用，因此从天然产物中寻找安-27- [77-80]全、有效的降血糖以及防治糖尿病并发症的药物具有重要意义。化合物1-8在体内的疗效尚待评价。2.5本章小结在对野外采集的菌株分离筛选人工培养时，可能因菌株放置时间过久、培养条件不适等因素影响，该菌株并没有在人工培养基上培养成功，因此，并未对其进行育种研究。今后对该菌株应再次采集，加大对其人工培养可能性的研究，并且通过育种研究获得优质突变菌株。通过对WJ-1菌株子实体的形态学观察，参照鉴定手册，初步鉴定该菌株为环纹亚齿菌。结合分子生物学鉴定结果，通过BLASTN同源检索测序后核酸序列，最大相似率为100%，基本确定WJ-1菌株为环纹亚齿菌(H.concrescens(Pers.)Banker)，与形态学鉴定结果一致。通过HPLC对其次级代谢产物进行分析，其代谢产物丰富，结合色谱学和波谱学技术，共分离纯化8个单体化合物，并确定其化学结构，均为三联苯类化合物，其中包括2个新化合物。同时，对分离得到的8个化合物进行了抗氧化(还原力活性、DPPH自由基清除活性)活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果显示新化合物1有较好的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性，极有可能成为治疗糖尿病的潜在药物。-28- 第3章JZ-10菌株鉴定3.1概述野生的蜜环菌属(Armillaria)真菌在环境条件适宜情况下能够存在几百年，多数在夏秋两季的雨后生长，因其能寄生在灌木丛、草本植物、阔叶乔木或者[8腐生在老树、死树的跟部，所以蜜环菌属真菌在世界上多分布于一些森林地区1]。除在北美洲、欧洲等温带地区存在，我国主要分布在吉林、黑龙江、辽宁、湖南、内蒙古、湖北、陕西、山东、贵州、四川、甘肃、云南、新疆等省市地[82]区。目前，已知的蜜环菌属真菌约有40种，如高卢蜜环菌(ArmillariagallicaMarxm.&Romagn.)是在中国和北半球广泛分布的蜜环菌属真菌，在中国的黑龙[83]江和吉林分部较广。随着对蜜环属真菌研究的深入，其中活性物质表现出良好的营养和药用价值，如人体必需的微量元素、氨基酸；具有降血糖、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节功能的多糖类物质；具有抗病毒、抗肿瘤等作用的原伊鲁烷[84]型倍半萜类；具有降血脂、抗病毒等功效的黄酮类化合物等。蜜环菌属真菌是一类具有广泛寄主范围、世界性分布、强致病力的大型真[85]菌。早在1857年Staude就首先确立了蜜环菌属。由于生态环境的差异，该属真菌中的某些种类形态差异大，如菌盖颜色、大小、菌柄特征等方面不稳定，造成该属真菌的分类存在分歧不易识别，因生物种概念是以蜜环菌属分类基础,被菌物分类学广泛接受。由于气候原因，担子果产生受到限制，并且交配工作繁琐、各大洲之间的实验交流困难。因此，分子生物学鉴定方法在蜜环菌属真菌的分类中得到广泛应用，如DNA重组、RAPD分析、DNA序列分析等，另外，免疫学方法、同功酶分析法等方法也得到发展，其中的DNA序列分析法最[86]近应用较多。2008年Lima等发现南美洲新种A.paulensis用DNA序列分析法，蜜环菌属真菌分类中DNA序列分析将是未来发展方向。3.2实验材料与设备3.2.1原材料3.2.1.1菌种编号为JZ-10菌株，采集于黑龙江省穆棱林区。-29- 3.2.1.2材料材料生产厂家D2000DNAMaker天根生化科技北京有限公司同2.2.1.23.2.2培养基与配方培养基配方马铃薯葡萄糖培养基(PDB)马铃薯20%,葡萄糖20%,蒸馏水1L，PH自然，115℃，灭菌30min大米培养基大米80g，蒸馏水100mL3.2.3主要试剂同2.2.33.2.4主要仪器试剂名称型号生产厂家上海智城分析仪器制造摇床ZHWY211B型有限公司其他同2.2.43.3实验方法3.3.1人工培养从野外采集的菌株中选取生长良好的子实体，选取适当大小的菌褶部分，用70%的酒精消毒后用无菌水清洗，接种到PDA平板培养基上，25℃恒温培养。选取有萌发的白色菌丝体的平板，挑取菌丝体，重新接种到PDA平板培养基上，25℃培养30天，观察生长状态，将长势良好、未染杂菌的菌株命名编号，4℃低温保存备用。3.3.2形态学观察根据《中国蕈菌原色图集》、《常见野生蘑菇识别手册》等文献作为参考，[66-70]对采集到的菌株进行形态学观察。-30- 3.3.3分子生物学鉴定3.3.3.1DNA提取同2.3.2.13.3.3.2PCR扩增步骤方法ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC5×PrimerSTARBuffer5.0μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μLITS1(10μmol/L)1.0μLITS4(10μmol/L)1.0μLPCR反应体系(25μL)ddH2O25.0μLTaq酶(5Umol/L)0.2μLDNA模板2.0μL2+Mg（25mM）1.0μL预变性：94℃5min变性：94℃30sPCR反应程序退火：56.5℃45s30个循环延伸：72℃1min补平：72℃10min3.4结果与分析3.4.1人工培养结果图3-1JZ-10菌株PDA培养物Table3-1JZ-10PDAculture-31- 从PDA平板培养基中选择长势良好、未染杂菌的JZ-10菌株作为研究对象，如图3-1。3.4.2形态学观察结果3.4.2.1子实体特征采集到的菌株子实体菌盖直径约3~8cm，肉质，菌盖向边缘逐渐变薄，向内卷曲，棕黄色或棕色；菌盖下面的菌褶奶油色或浅橙色；菌柄长度一般在6cm左右，圆柱形，稍弯曲，直径在1.5cm左右，到根部逐渐变细，菌柄的颜色呈棕色或浅褐色，中空；菌柄根部呈深棕色，有像黑色根的菌索；菌柄上靠菌盖处有白色菌环；独特的芳香气味。如图3-2。图3-2JZ-10菌株子实体Table3-2JZ-10Fruitingbody3.4.2.2菌丝体特征气生菌丝体28℃培养时，在最初的7-12左右天为白色，绒毛状，随着不断生长，13天左右部分菌丝体逐渐变成淡褐色，20天左右时表面形成红褐色的皮壳状的菌丝体盖，上面有褐色水珠状液滴；营养菌丝体最初8天左右为白色或者乳白色，形似植物的根，随着生长逐渐变为黄褐色，气味芳香。根据《中国蕈菌原色图集》、《常见野生蘑菇识别手册》等作为参考，可[66-70]初步对JZ-10菌株鉴定为蜜环菌属。野生高等真菌的鉴定仅通过传统的鉴定形态特征具有一定的局限性，特别是一些形态特征非常相似的物种很难准确区分。3.4.3分子生物学鉴定结果PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳扩增结果如图3-3，PCR扩增后的DNA片段显示单一条带，大小在800bp左右，与测序结果基本一致。-32- 将公司测序后的序列通过BLASTN同源搜索，若菌株同源性达99%，即可[75]以认为它们是同一种。JZ-10菌株核酸序列经检索后，序列最大相似率是84%，其前3个菌株分别是A.calvescens、A.cepistipes、A.gallica，因此，JZ-10菌株是这三株菌的可能性很大，但并不能将该菌鉴定到种的水平。通过以上数据对JZ-10菌株的鉴定，只能确定为蜜环菌属(Armillaria)真菌。图3-3JZ-10菌株PCR扩增凝胶电泳图Table3-3GelelectrophoresisofPCRamplifiedJZ-10若要对该菌株的种进行准确鉴定，可进一步观察微观特征如孢子特征，菌丝体特征等进行研究探讨；在分子生物学鉴定方面，可以选择对核酸的其他序[71][87]列区段进行测序分析如IGS序列分析，或者用核酸分子杂交手段进行鉴定。基于该菌株的碱基序列构建的系统发育树，见图3-4。图3-4基于JZ-10菌株碱基序列构建的系统发育树Table3-4ThephylogenetictreeconstructedbasedonthenucleotidesequenceofJZ-103.5本章小结对采自穆棱林区的菌株进行人工培养，分离筛选出一株长势良好、未染杂-33- 菌的JZ-10菌株。通过对JZ-10菌株的形态学观察，参照鉴定手册，初步鉴定该菌株为蜜环菌属真菌。结合分子生物学鉴定结果，通过BLASTN同源检索测序后核酸序列，最大相似率为84%，排在前3的菌株是A.calvescens，A.cepistipes，A.gallica，JZ-10菌株是这3株菌的可能性很大。通过以上数据对JZ-10菌株的鉴定只能确定为蜜环菌属(Armillaria)真菌。-34- 第4章JZ-10菌株初步育种研究4.1实验材料与设备4.1.1菌株野外采集后，人工培养的JZ-10菌株。4.1.2主要试剂试剂生产厂家生理盐水北京化学试剂公司其他同2.2.34.1.3主要仪器同2.2.44.2实验方法4.2.1菌株培养用75%的酒精擦洗超净工作台，将已灭菌的接种工具如镊子、接种针、生理盐水等放入超净工作台里，紫外线杀菌30min。用接种针挑取1~2cm大小的菌丝体接种到培养皿的固体培养基中，每个培养皿中接1~2个菌丝体片段。然后将已接种的培养皿放入25℃恒温培养箱中进行培养30天。取已培养好的新鲜菌种，生理盐水洗涤菌丝体片段，将混有菌丝体的生理盐水放入盛有玻璃珠的50ml三角瓶中，剧烈振摇，直至将菌丝体打碎，备用。4.2.2诱变剂量选择设置时间梯度为0s，5s，10s，15s，25s，35s进行紫外照射。计算致死率。原始菌落数-诱变后菌落数诱变致死率%100%原始菌落数诱变致死率为90%-99%时，存活的细胞中负突变菌株较多，正突变菌株较少，诱变致死率为70%-80%时，活细胞中正突变株较多。所以选取致死率为[41]70%-80%时的紫外照射时间做为最佳诱变时间。-35- 4.2.3紫外诱变因本研究采用菌丝体进行诱变育种初步研究，通过平板计数法对菌落计数。取6个平板，编号为I1，I2…I6，每个平板接菌丝体悬液100μL，涂布，使菌丝-1体均匀分布在PDA平皿上；将菌丝体悬液稀释10倍，取6个平板，编号为II1，II2…II6，每个平板接菌丝体悬液100μL，涂布，使菌丝体均匀分布在PDA平皿-2上；再将菌丝体悬液稀释10倍，取6个平板，编号为III1，III2…III6，每个平板接菌丝体悬液100μL，涂布，使菌丝体均匀分布在PDA平皿上。紫外灯需提前预热30min，使灯的功率稳定以达到光波稳定。诱变过程要在黑暗条件下进行，照明尽量采用红灯泡。将上述三组共18个平皿分别放在超净工作台紫外灯(30W)正中下方距离为15cm处照射，处理后用黑布包裹培养。4.2.4突变株筛选诱变后形成的菌落在直径和生长活力方面都有较大差异，分别从紫外照射5s，10s，15s的平皿中挑选6个菌落直径较大、生长最旺盛的突变株。将6株突变株每株接两个PDA平皿培养，并做好标记，25℃平皿培养30天，观察菌丝的生长情况。因时间关系，从12个平皿中选取一株菌落直径最大、菌丝体生长最旺盛的突变株(编号JZ-10U)进行研究。因野生真菌人工培养困难、培养时间长等劣势，筛选生长速度快的突变菌株为其深入研究奠定基础。4.2.5遗传稳定性测定通过菌丝体连续传代方法，评价诱变后菌株次级代谢物的遗传稳定性，将原始菌株JZ-10和突变菌株JZ-10U分别接种到PDA平皿培养基，25℃恒温培养30天，传代3次，并对菌落直径进行显著性差异分析，显著性差异分析是用于处理实验中两组数据之间是否存在差异、以及差异是否显著的分析方法。在显著性分析中，P大于0.05时，差异性不显著，P在0.01和0.05之间时，差异[91]性显著，P小于0.01时表示差异性极显著。菌株平皿生长情况见附录。菌丝体用乙酸乙酯提取，经旋转蒸发仪获得粗提物，配置适当浓度待测溶液。洗脱剂10-100%乙腈/水梯度洗脱，每针进样10μL，进行HPLC分析，参照文献对蜜环菌属真菌的次级代谢物研究，选择紫外吸收260nm时不同保留时间[88-90]显著峰，以选育出一株生长旺盛、次级代谢产物丰富的可稳定遗传的突变-36- 菌株。4.3结果与分析4.3.1诱变剂量选择紫外诱变菌丝片段，分别紫外照射0、5、10、15、20、25s，25℃恒温培养，如图4-1是不同照射时间平板菌落数。图4-1不同时间紫外照射后菌落生长情况Table4-1GrowthofdifferenttimeofUVirradiation-1表4-2显示，在菌丝体悬液稀释10倍时菌落数多少适当。选取致死率为70%-80%时的紫外照射时间作为最佳诱变时间，所以本实验选取紫外照射10s(致死率为74.0%)时为菌株诱变的最佳处理剂量。-37- 表4-2JZ-10菌株紫外诱变处理结果Table4-2JZ-10ultravioletmutationresults项目0s5s10s15s20s25s10较多较多较多较多较多较多-1107346191362-210641000致死率%037.074.082.291.897.3根据表4-2，绘制JZ-10菌株紫外诱变致死率曲线，如图4-3。图4-3JZ-10菌株紫外诱变致死率曲线Table4-3RatecurveofJZ-10UVinducedlethal4.3.2突变株筛选菌株经紫外照射处理后，诱变菌株菌丝体生长发生变化，少量菌落生长不良，菌落较小。选择经紫外照射10s平皿中的一株菌，其在培养过程中菌丝体生长速度明显大于其它的突变菌株，如图4-4。图4-4原始和突变菌株PDA平皿培养Table4-4TheoriginalandmutantstrainPDAculture-38- 4.3.3遗传稳定性测定原始和突变菌株分别在PDA平皿培养基25℃恒温培养30天，传代3次，对其菌落直径进行显著性差异分析。如表4-5所示，在3次的传代中，与原始菌株相比，突变菌株在菌落直径上有极显著性差异，并且可稳定遗传3代。表4-5突变株差异性显著分析结果（X±S)Table4-5Thethirdgenerationofmutantsignificantdifferenceanalysisresults菌落直径(cm)组分原始菌株突变菌株第一代2.2±0.213.6±0.12**第二代1.9±0.294.8±0.62**第三代2.7±0.375.1±0.21****表示与原始菌株相比P<0.01突变菌株粗提物经HPLC分析后，选取保留时间分别约为12min、17min、20min、22min、33min、36min、37min、40min、41min、44min的10个次级代谢产物显著峰，如图4-6。图4-6JZ-10U菌株HPLC图谱Table4-6HPLCfingerprintsofJZ-10U对3次传代的突变菌株粗提物分别进行HPLC分析，结果表明，所选择的不同保留时间的10个次级代谢产物显著峰存在，证明该突变菌株可稳定遗传3代，如图4-7。由图可见，该菌株次级代谢产物丰富，本实验未进行分离鉴定，希望今后可完成这部分实验，并评价单体化合物生物活性。-39- 图4-7JZ-10U菌株传3代HPLC图谱Table4-7JZ-10UstrainsofthethirdgenerationofHPLC4.4本章小结本研究采用紫外诱变手段对人工培养JZ-10菌株进行初步育种研究，确定照射时间为10s，致死率是74%，该条件作为诱变JZ-10菌株的最佳条件。选择紫外诱变10s后平皿中一株长势良好菌株进行稳定性研究，突变菌株通过与原始菌株的生长直径对比，进行显著性差异分析，结果表明突变菌株生长直径与原始菌株有极显著差异，突变菌株可稳定遗传3代。通过对3次传代的突变菌株粗提物分别进行HPLC分析，所选取保留时间分别约为12min、17min、20min、22min、33min、36min、37min、40min、41min、44min的10个次级代谢产物显著峰，其突变菌株可稳定遗传3代，初步选育出一株长势良好、次级代谢产物丰富的可稳定遗传3代的突变菌株。-40- 结论本文研究对象是采自黑龙江省穆棱林区(JZ-10)和四川九寨沟地区(WJ-1)的两株野生真菌，通过生物学方法和分子生物学技术相结合鉴定了两株野生真菌，并对JZ-10菌株紫外初步育种研究进行了探讨。(1)通过分析WJ-1菌株的形态学特征并结合分子生物学鉴定结果，确定该菌株为环纹亚齿菌。(2)在次级代谢产物HPLC分析中，其代谢产物丰富，结合色谱学和波谱学技术，共分离纯化了8个单体化合物，并确定其化学结构，均为三联苯类化合物，其中包括2个新化合物。(3)对分离得到的8个化合物进行了抗氧化(还原力活性、DPPH自由基清除活性)活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果显示新化合物1有较好的抗氧化活性和降糖活性，极有可能成为治疗糖尿病的潜在药物。(4)对穆棱林区采集的菌株分离筛选，成功人工培养选育一株JZ-10菌株，通过观察形态学特征及结合分子生物学鉴定结果，确定该菌株为蜜环菌属真菌。(5)对人工培养的JZ-10菌株进行紫外初步育种研究，确定照射时间为10s，致死率是74%，该条件作为诱变JZ-10菌株的最佳条件。(6)诱变后，在照射10s的平皿中筛选了一株长势良好的突变菌株，通过显著性差异分析和粗提物的HPLC分析，突变菌株可稳定遗传3代。野生真菌依赖其良好的食用、药用价值，是可开发的重要生物资源，本研究为今后深入研究奠定了基础。-41- 参考文献[1]卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州:河南科学出版社,2000:7.[2]WasserS.Medicinalmushroomsasasourceofantitumorandimmunomodulatingpolysaccharides[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2002,60(3):258-274.[3]林晓民,李振岐,侯军.中国大型真菌的多样性[M].北京:中国农业出版社,2005:1.[4]BorchersAT,SternJS,HackmanRM,etal.Mushrooms,tumors,andimmunity[J].ProceedingsoftheSocietyforExperimentalBiologyandMedicine.1999,221(4):281-293.[5]钟昕,周素梅,王强.药用真菌多糖研究进展[J].科技导报,2009(09):97-101.[6]GaoJM.NewbiologicallyactivemetabolitesfromChinesehigherfungi[J].CurrOrgChem.2006.10(8):849-871.[7]LiuJK.N-ContainingCompoundsofMacromycetes[J].ChemicalReviews.2005,105(7):2723-2744.[8]LiuJK.NaturalTerphenyls:Developmentssince1877[J].ChemicalReviews.2006.106(6):2209-2223.[9]刘吉开,胡琳,丁智慧,高锦明,董泽军,谭建文.高等真菌次生代谢产物及其生物活性[J].中草药杂志.2003,34(1):84-86.[10]刘吉开.高等真菌化学成分及其生物活性的研究[J].中国科学基金.2007,21(2):69-70.[11]ManziP,AguzziA,PizzoferratoL.NutritionalvalueofmushroomswidelyconsumedinItaly[J].FoodChemistry.2001,73(3):321-325.[12]MendilD,UluözlüÖD,HasdemirE,etal.DeterminationoftraceelementsonsomewildediblemushroomsamplesfromKastamonu,Turkey[J].FoodChemistry.2004,88(2):281-285.[13]段玉云.野生食用菌的化学成分分析[J].食用菌.1999(5):35-37.-42- 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HMBCspectrumofThelephantinI(4)inDMSO1HNMRspectrumofdihydroauran-tiacindibenzoate(5)inDMSO.(500MHz)-60- 13CNMRspectrumofdihydroauran-tiacindibenzoate(5)inDMSO.(125MHz)1HNMRspectrumofthelephantinJ(6)inCD3OD.(500MHz)-61- 13CNMRspectrumofthelephantinJ(6)inCD3OD1HNMRspectrumofthelephantinK(7)inDMSO.(500MHz)-62- 13CNMRspectrumofthelephantinK(7)inDMSO1HNMRspectrumofCurtisianA(8)inDMSO.(500MHz)-63- 13CNMRspectrumofCurtisianA(8)inDMSO原始菌株传代3次PDA平皿培养突变菌株传代3次PDA平皿培养-64- 致谢时间如白驹过隙，回想三年研究生生活，忙碌并充实着。转眼间我的研究生生涯即将结束，我要向所有关心、帮助、指导过我的老师、同学、家人以及朋友表示深深的感谢！感谢我的导师金涛教授，无论是在科研上还是生活上，金老师都给我悉心的指导和帮助，使我的论文得以顺利成稿。从论文的开题、中期、论文的修改等无不注入了老师的心血和汗水。在此，特别感谢中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室刘宏伟研究员，刘老师在科研上渊博的知识，严谨的态度让我受益匪浅。再次对刘老师的指导和关怀致以最诚挚的谢意。感谢真菌学国家重点实验室宝丽副研究员、韩俊杰老师对我学习和生活中的关心与帮助；感谢真菌学国家重点实验室次生代谢产物平台李二伟副研究员、任晋玮老师、裴云飞老师、王文昭老师的指导和帮助。感谢我在北京的日子里马轲师兄、王波涛师兄、王康济师兄对我实验中的指导和生活中的帮助；感谢与我共同奋斗的齐秋月、汪锴、田锦、何璐薇、陶巧巧、陈保送，谢谢大家对我的帮助。感谢黑龙江大学邹积宏教授、李海英教授、葛菁萍教授对论文立题和实验过程的指导。感谢黑龙江大学所有老师在我攻读研究生期间提供的便利条件，以及对我学习上的教诲。感谢东北农业大学李杰教授，以及他的学生刘天齐对真菌种属鉴定工作进行的指导和鼎力帮助。感谢黑龙江大学108实验室李佳嬴、邹芳华、李敏华对实验的帮助，真诚的友谊，我会铭记在心。最后，感谢我的家人和朋友对我的关怀与支持，谢谢大家的鼓励与陪伴！王世梅2015年3月于黑龙江大学-65- 攻读学位期间发表的论文发表学术论文：ShiMeiWang,JunJieHan,KeMa,TaoJin*,LiBao,Yun-FeiPei,HongWeiLiu.Newα-glucosidaseinhibitorswithp-terphenylskeletomfromthemushroomHydnellumconcrescens.Fitoterapia.2014,98:149-155.(SCIIF5-year=2.321)参与课题：1参与创新课题，榛属植物内生真菌分离及种属鉴定（黑龙江大学创新创业训练计划项目）.2013.2参与创新课题，产黄酮榛蘑发酵菌株的诱变育种（黑龙江大学创新创业训练计划项目）.2013.3参与创新课题，产抑真菌物质菌紫外诱变育种研究（黑龙江大学创新创业训练计划项目）.2014.4真菌来源活性物质分析（黑龙江大学研究生学术交流项目）2014.5药用榛属植物内生真菌多样性及功能菌株筛选的研究（中国博士后科学基金项目）.6榛属植物内生真菌与菌根菌的分离及具药用保健功能代谢产物分析（黑龙江省博士后资助基金）.7菌产紫杉烷类化合物代谢研究（省教育厅一般项目）.8东北地区高等真菌药用活性成分研究（普通高校微生物重点实验室（黑龙江大学）项目）.-66-