预测温州蜜柑果实贮藏寿命生物标记的开发 48页

辛111土fHUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTERSDEGREEDISSERTATION预测温州蜜柑果实贮藏寿命生物标记的开发BIOMARKERDEVELOPMENTFORSTORAGELIFEPREDICTINGINSATSUMAMANDARIN(CitrusunshiuMarc.)研究生：孙力CANDIDATE:SUNLI导师：程运江教授SUPERVISOR:PROFESSORCHENGYUNJIANG专业：园艺学major：horticulture研究方向：采后生物学与技术FIELD:POSTHARVESTBIOLOGYANDTECHNOLOGY中国武汉WUHAN,CHINA二〇一五年六月JUNE,2015 分类号密级：华中农业大学硕士学位论文预测温州蜜柑果实贮藏寿命生物标记的开发BIOMARKERDEVELOPMENTFORSTORAGELIFEPREDICTINGINSATSUMAMANDARIN(CitrusunshiuMarc.)研究生:孙力学号:2012305110033指导教师:程运江教授指导小组:邓秀新教授陈玲玲教授郭文武教授徐娟教授徐强教授专业：园艺学研究方向：采后生物学与技术获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2015年6月华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室二○一五年六月 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发目录摘要....................................................................................................................................IABSTRACT......................................................................................................................II缩略词...............................................................................................................................IV1前言..................................................................................................................................11.1课题提出....................................................................................................................11.2生物标记的研究进展................................................................................................21.2.1生物标记的研究背景.........................................................................................21.2.2植物体中生物标记的研究进展.........................................................................21.2.3柑橘果实采后贮藏的研究.................................................................................31.3柑橘采后贮藏期生物标记开发的数据基础............................................................51.4本研究的目的及内容................................................................................................62材料和方法......................................................................................................................72.1实验数据....................................................................................................................72.2实验方法....................................................................................................................82.2.1转录组数据中差异基因的鉴定.........................................................................82.2.2主成分分析转录组数据.....................................................................................92.2.3偏最小二乘法判别分析转录组数据.................................................................92.3REAL-TIMEPCR测定基因表达................................................................................92.4代谢物数据分析......................................................................................................103结果与分析....................................................................................................................113.1预测温州蜜柑采后贮藏期的基因标记..................................................................113.1.1基于转录组数据的差异基因筛选...................................................................113.1.2温州蜜柑采后贮藏过程中基因数据对其不同生理状态的划分...................113.1.3温州蜜柑采后贮藏基因标记的筛选...............................................................133.1.4标记基因表达模式分析和注释.......................................................................14I 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文3.1.5候选标记基因的定量验证................................................................................183.2温州蜜柑采后贮藏代谢物标记的预测..................................................................183.2.1根据代谢物对温州蜜柑采后贮藏时期生理状态的划分................................203.2.2温州蜜柑采后贮藏过程中代谢物标记筛选....................................................223.3温州蜜柑果皮和果肉在采后贮藏期的比较..........................................................254讨论.................................................................................................................................274.1有机酸和糖作为果实采后贮藏寿命预测生物标记不适用性..............................274.2基因标记与代谢物标记联系..................................................................................284.3生物标记在采后贮藏中的实用性和展望..............................................................29参考文献............................................................................................................................31附录I柑橘采后贮藏期间初生代谢物种类..................................................................36附录II硕士期间发表论文..............................................................................................38致谢................................................................................................................................39II 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发摘要柑橘是全球第一大鲜食水果，具有贮藏时间长、销售范围大的特点。为确保贮藏果实的品质，对柑橘果实所处采后生理状态的预测既可丰富柑橘采后生物学基础理论，也能为大规模的柑橘贮藏化解风险。本研究利用温州蜜柑采后贮藏0-50d的基因芯片数据和初生代谢物数据，结合聚类分析、主成分分析、最小二乘法判别分析和支持向量机等机器学习的方法，旨在将温州蜜柑采后贮藏时期按生理状态进行划分，挖掘出能反映柑橘采后贮藏期间的不同生理阶段和具有代表性的生物标记，并且运用qRT-PCR验证了转录组数据的可靠性。实验主要结果如下：温州蜜柑在采后贮藏0-50d期间，生理状态可经历三个阶段：第一阶段，贮藏前期（0-20d）；第二阶段，风味最佳期（20-40d）；第三阶段，贮藏后期（40-50d）。通过对基因芯片数据分析和验证发现，以贮藏取样第一个时间点为参照，谷胱甘肽S-转移酶（Cit.15371.1.S1_at）在贮藏前期实时定量表达值在0.8-1.0之间，风味最佳期表达值在0.7-0.8之间，贮藏后期表达值低于0.7，具有明显的阶段性特征，因此谷胱甘肽S-转移酶可作为温州蜜柑采后贮藏寿命的基因标记；通过对代谢物数据分析，发现甘氨酸（Glycine）、3-氨基-6-甲氧基吡啶甲酸（3-Amino-6-methoxypicolinicacid）、丁烯二酸（2-Butenedioicacid）、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-四个代谢物含量在温州蜜柑果实贮藏前期处于一个高水平状态，随后含量发生显著性下降且将持续一段低水平状态，到贮藏后期，四种代谢物含量会发生显著性升高，因此它们含量的变化具有明显的阶段性特征，可以作为代谢物水平的候选生物标记。关键词：生物标记；温州蜜柑；采后贮藏；生物信息学；基因芯片；初生代谢物i 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文AbstractCitrusistheworld"slargestfreshfruitamongglobalfruitindustry,whichhasalongstorageperiodduringpostharveststage.Inordertoensurethefruitqualityduringstorage,predictingthephysiologicalstateafterharvestisthereforeparticularlyimportant,whichcannotonlyenrichthebasictheoryofcitruspostharvestbiology,butalsoresolvetheriskofdeteriorationinlarge-scaleduringcitrusfruitstorage.BasedonthemicroarrayandprimarymetabolitesdataofSatsumamandarinduring0-50DAH(daysafterharvest),approachesofhierarchicalclustering,principalcomponentanalysis,partialleastsquaresdiscriminantanalysisandsupportvectormachinemodelwereintegrativelyusedtogaininsightintodifferentphysiologicalstatusandtominerepresentativebiomarkercandidatesrepresentingcitrusfruitstorageprocess.Additionally,thehighreliabilityoftranscriptomedatawasverifiedbyqRT-PCR.Themainresultsareasfollows:Accordingtobioinformaticsanalysisofmicroarrayandprimarymetabolitesdata,thepost-harveststorageprocessofSatsumamandarincouldbeclassifiedintothreephysiologicalstages:stage1,earlystageofpost-harveststorage,stage2,fruitbringingthebestflavorcharacters,andstage3,theterminalstageoffruitstorages.AnalysisofmicroarraydataandresultsofReal-timePCRindicatedthatthequantitativeexpressionvaluesofglutathioneS-transferase(Cit.15371.1.S1_at)rangedfrom0.8to1.0atearlystoragephase,0.7-0.8atthestageofbestflavorandbelow0.7attheterminalstoragestagerespectively.TheexpressiontrendofglutathioneS-transferasehasobviousstagecharacteristics,andthereforeitcanbeusedasabiomarkerevaluatingSatsumamandarinpost-harveststoragestatus.Throughdataanalysisofmetabolites,wecouldfindthatthecontentsofGlycine,3-Amino-6-methoxypicolinicacid,2-Butenedioicacid,Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-experiencedastagechange.Attheearlystoragephase,thecontentofthefourmetabolitesstoodatahighlevel.Thenitdeclinedsignificantlyandmaintainedatlowlevelinthephaseofbestflavorfruit.Tothelateperiodofstorage,thecontentofthefourcomponentsincreasedsignificantly.Takentogether,weii 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发deducedthattheycouldbeusedascandidatemetabolitebiomarkerstopredictcitrusstoragestatus.Keywords:Biomarkers;Satsumamandarin;postharveststorage;bioinformatics;microarray;primarymetabolitesiii 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文缩略词Abbreviations缩略符号英文中文含义DAHDaysAfterHarvest果实采后贮藏时间DEGDifferentExpressionGenes差异表达基因GOGeneOntology基因本体论GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽S-转移酶PCAPrincipalComponentAnalysis主成分分析QuantificationalReal-timePolymeraseqRT-PCR定量反转录聚合酶链式反应ChainReactionSVMSupportVectorMachine支持向量机SAMSignificanceAnalysisofMicroarrays芯片数据显著性分析VIPVariableImportanceintheProjection模型中重要变量iv 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发1前言1.1课题提出柑橘作为全球主要的水果，果肉酸甜可口，并富含维生素等营养物质，果皮可入药，有理气燥湿等功效，深受广大消费者喜爱。柑橘产量高但成熟期相对集中，为尽可能延长市场供应期，柑橘果实采后贮藏保鲜显得尤为重要。然而，柑橘果实在采后贮藏期间因自身机械损伤和病害的滋生导致大量果实在出售前就已经失去商品价值，从而导致大量经济损失。因此，若能开发出一种实时监控果实新鲜程度的方法或生物标记将使果实的贮藏保鲜变得可控，进而通过改变贮藏环境或及时销售以减轻经济损失。目前我国园艺产业仍然面临着“重采前，轻采后”的问题，比如我国园艺产业采前的投入约为90%，而发达国家的采前投入不足30%，70%的投入用于采后处理和深加工（程运江2011）。柑橘果实采前与树体具有复杂的能量和物质的转化与运输，而采后果实则脱离了树体，形成了相对独立的代谢个体。由于能量库源关系的改变，会发生一系列的生理生化变化，特别是对果实采后品质和风味影响较大的糖酸、酚类、萜类物质变化明显。随着采后果实的逐渐衰老，果实的风味、香味、色泽也在不断发生变化。前人已对柑橘果实采前发育的生理生化规律开展了大量研究，并将果实发育时期分为细胞分裂期、细胞膨大期（细胞体积增大和水分积累）和成熟期(Bain1958)。但是，对柑橘果实采后的物质、能量代谢研究相对较少，无法衡量柑橘果实风味变化、衰老程度和采后贮藏期柑橘果实所处的生理状态，也无法按其生理品质特征划分柑橘果实采后贮藏的特定生理时期，因此，研究柑橘采后生理状态，划分柑橘采后贮藏时期具有重要的意义。温州蜜柑是我国最重要的宽皮柑橘，近十余年来一直面临生产能力季节性或地域性过剩，果实采后品质快速劣变，价格持续低迷等突出问题。适当延长果实销售时期，客观评价和科学预测果实品质，是实现温州蜜优质价格，提升产业效益的必要前提。开发温州蜜柑采后果实生理状态的生物标记用于评价不同贮藏时期果实的品质变化，可为柑橘鲜果采后生产提供重要理论基础和指导意义，让果实在其风味最佳时期上市，不仅可以使消费者购买到鲜美的果实，并能够为柑橘主产区大规模1 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文贮藏柑橘的企业作好果实贮藏风险预测提供依据。1.2生物标记的研究进展1.2.1生物标记的研究背景生物标记的概念可以追溯到1980年，最初的研究人员主要是想开发一种标志物来代替一个临床终点，逐步发展到用标记物来反映病人的状况、治疗的效果等(Aronson2005)。1998年美国国家卫生院（NIH）正式对生物标记进行了定义，通常是指在血液或体液中的某种蛋白质，通过它的含量可以反应出某种疾病的出现、严重程度或有机体所处的生理状态。2010年NIH再次将生物标记定义为客观评价正常生理状态、病理过程或药物干预后机体反应的一类指示物(StrimbuandTavel2010)。在医学上，可将生物标记分为五大类：第一类，筛选标记，它主要用来检查和治疗早期癌症的状态；第二类，诊断标记，可以确定癌症是否存在；第三类，预兆标记，在还未进行治疗的情况下预计癌症发展的结果；第四类：预测标记，预测特定治疗后的癌症发展情况；第五类，监控标记，监控治疗的进程和反应情况(ZhangandChen2011)。生物标记包括范围甚广，又称为生物指标。它在医学、细胞生物学、地质和天体生物学中广泛应用。如医学中使用呼气丙酮（EBA）浓度来诊断心衰和判断严重程度的生物标志物(Marcondes-Bragaetal2012)，环境监控中检测海水有机磷暴露与否就可以通过检测海洋生物体内的乙酰胆碱酯酶（AChE）活性这一生物标记(Xavier1998)。综上可知，生物标记能够鉴别有机体的生命状态和生理阶段，若在植物果实研究中运用“诊断”标记，则能够监测植物果实在生长、发育和衰老过程的各个生理状态。对于贮藏期较长的植物果实来说，划分采后贮藏期生理状态能够用来预测果实贮藏寿命。因此，生物标记在采后生物学上有着重要的作用，对耐贮藏柑橘果实采后生物标记的研究具有重要应用价值。1.2.2植物体中生物标记的研究进展在对植物的研究中，生物标记在很大程度上指分子标记或遗传标记。它主要是利用特异性DNA片段对不同品种和个体进行区分和辨别，同时也能辅助育种和遗2 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发传图谱构建(Haywardetal2015)。然而目前研究中生物标记指的是植物生长、发育、成熟和衰老过程中能够表征植物体在生命活动中的不同生命阶段或生理状态。如Agudelo-Romeroetal（2013）通过对葡萄三个不同品种和四个时期的转录组和代谢组的分析，运用独立成分分析（ICA）和主成分分析（PCA）可以将葡萄生长和发育阶段分为转色前和转色后两个不同生理阶段，并通过分析解释了两个生理阶段在碳水化合物、脂质、氨基酸和丙氨酸代谢途径的差异，初步筛选出能表征两个不同生理状态的基因和代谢物标记(Agudelo-Romeroetal2013)；此外，对草莓花后10-40d的极性代谢物数据研究发现，草莓在生长和发育过程中可以分为三个明显的阶段：细胞分裂期（10-15d）、细胞膨大期（20-30d）、果实成熟期（35-40d）(Zhangetal2011)，与传统的细胞学研究方法得到的结果相吻合；还有研究通过计算生物学方法比较分析了水稻中对生物胁迫和非生物胁迫具有广泛抗性的基因标记(ShaikandRamakrishna2014)和比较不同物种相同代谢物数据，分析了具有保守性的代谢物标记(Klieetal2013)。上述对于植物体中生物标记的研究主要集中在模式植物的果实生长和发育阶段或是比较不同处理及不同物种之间的分析，而对植物果实采后贮藏期间不同生理阶段的划分和生物标记的挖掘研究非常有限。目前，已发表的关于果实采后贮藏期间生物标记的研究只有中国杨梅，Chengetal（2014）通过对中国杨梅三个品种（“荸荠”、“东魁”、“枫红中”）、不同温度（室温和4℃）和贮藏时间（0-14d）果实挥发性代谢物数据进行分析，结果发现所有品种在采后贮藏期间都可以大概的分为采后贮藏前期、开始腐烂期和完全腐烂期三个不同的生理状态，具体贮藏时间由温度和品种决定。并且作者通过生物信息学分析预测出辛醛（octanal）、1,6-辛二烯-3-醇-3,7-二甲基（1,6-Octadien-3-ol,3,7-dimethyl-）和2-戊烯-2-甲基（2-Pentene,2-methyl）可作为生物标记物以评估“荸荠”的新鲜度，用乙酸甲酯（Aceticacid,methylester）和蛇麻烯（Humulene）可评估“东魁”的新鲜度，用α蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、D-柠檬烯（d-Limonene）可评估“枫红中”的新鲜度(Chengetal2014)。而柑橘果实贮藏期间的生物标记开发与应用尚未有相关报道。1.2.3柑橘果实采后贮藏的研究柑橘果实采后贮运环节对保证柑橘果实的平衡供应尤为重要。柑橘果实采后成3 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文为一个独立的生命体，将经历完熟到逐渐衰老的整个过程，其风味主要由糖、有机酸、糖酸比和挥发性芳香物质等因素综合决定(Klee2010)。这些成分作为代谢底物或者产物广泛参与到各种初生代谢和次生代谢途径中。因此，对柑橘果实采后贮藏的研究主要集中于以下两个方面：1）寻找与柑橘衰老调控相关的代谢途径与机理，2）对柑橘采后果实进行物理和化学处理来延长柑橘的贮藏寿命和货架期。柑橘果实采后贮藏阶段是一个复杂的衰老调控过程。糖酸等初生代谢物在贮藏过程中发生显著的动态变化，直接反应了果实的品质和新鲜度。从柑橘果实有机酸代谢途径研究中发现，除了有机酸共同的三羧酸循环（TCA）一条代谢途径外，在柑橘果实采后贮藏后期，过量柠檬酸也会参与到GABA代谢途径进而转化为氨基酸(Cercosetal2006;Deguetal2011;Sunetal2013)；在糖代谢研究中发现主要糖类如蔗糖、葡萄糖和果糖在采后贮藏期间呈现“心电图”式的波动下降趋势。有趣的是在柑橘采后贮藏期间，果肉中总糖含量变化不明显，但蔗糖含量明显降低，而在果皮中随贮藏时间延长，其可溶性糖一直在减少，说明柑橘果实在采后贮藏期间果肉中碳水化合物在往果皮运输或是碳水化合物进行了重新分配(Sunetal2012)，这可能是由于柑橘果皮直接与环境接触，对整个柑橘果实具有保护作用，因而需要消耗大量的碳水化合物。Dingetal(2015)通过对柑、橘、橙和柚四种不同类型的柑橘果实在不同采后贮藏时间节点的转录组和代谢组数据的网络研究发现，柑橘果实采后贮藏期间转运蛋白在基因水平表达变化进一步肯定了以下推论：果皮在贮藏期间需要抵御外界的生物和非生物逆境胁迫，需要消耗更多的能量，因此营养物质会从果肉向果皮运输以保证果皮的生物学活性。另外的一些关于柑橘采后贮藏阶段的机理研究则主要集中在植物激素、生长调节剂和转录因子中，通过植物激素（如乙烯、油菜素内酯）、2,4-D以及NAC，MYB96转录因子等的作用机理阐述它们在果实贮藏期间的功能。柑橘采后贮藏研究的另一个重点是通过物理和化学处理来延长采后果实贮藏期和货架期。物理方法主要包括套袋、温度处理（冷处理、热处理、发汗处理）、打蜡、通风库贮藏、地窖贮藏和冷库贮藏等。其中温度处理对柑橘果实贮藏性能的影响已经从分子水平得到证实(Yunetal2013b;Zhuetal2011)。对柑橘果实的化学处理研究最多应该是2,4-D的保鲜作用，近年来的研究更多关注于从分子水平揭示2,4-D的保鲜机理，以及其替代保鲜剂的开发(Maetal2014)。4 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发上述研究，大部分是依赖于组学数据从整体水平上对柑橘采后贮藏过程分子机理进行研究，并没有指出具体基因、代谢物或是蛋白能够表征柑橘果实在成熟和衰老过程中的生理状态。1.3柑橘采后贮藏期生物标记开发的数据基础随着计算水平和测序技术的进步，“组学”为全面了解果实采后不同贮藏时期的生理生化变化奠定了良好基础。2001年人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）的完成，标志着生命科学进入了“后基因组时代”，功能基因组研究得到巨大发展。传统以杂交电泳为基础的研究方法无法反映基因组的全貌，而基因芯片技术具有快速、高效自动化、高通量等特点，现已成为利用功能基因组学手段研究系统复杂生物过程的一种有效手段。2006年Affymetrix公司开发出柑橘类基因组芯片GeneChip®CitrusGenomeArray，从CitrusHarvEST的EST和cDNAclusteringdatabase收集序列信息，制成包含30171个探针，覆盖包括枳属在内的多个柑橘品种的33879个柑橘转录本，能有效地进行柑橘类植物组织基因表达分析。在以柑橘为对象的研究中，芯片技术已得到一定的应用，Maul等利用Affmetrix公司生产的柑橘芯片，对葡萄柚在不同低温处理条件下诱导基因表达差异和对低温耐受力影响进行了研究。结果表明，低温诱导在转录水平上产生了应答响应，这些基因主要涉及细胞膜组分、脂类、甾醇、糖代谢、DNA结合蛋白和转录因子。该研究还指出遮光处理对葡萄柚的低温耐受力和低温敏感性具有重要影响，这对葡萄柚果实采后处理具有重要应用价值(Mauletal2008)；Albrecht等使用Affymetrixcitrusmicroarray研究受黄龙病(HLB)侵染的甜橙在转录水平上的响应机制(AlbrechtandBowman2008)。芯片技术的大量应用，促进了柑橘基因表达分析研究的发展。与此同时随着二代测序技术的发展，许多非模式植物的生物学研究能够在基因组水平上展开。近几年，关于植物基因组的论文数量也不断攀升(崔晓峰2013)，柑橘基因组草图的完成(Xuetal2013)为柑橘芯片提供了更加精确的功能注释，同时也让转录组的研究得以在全基因组水平展开。植物代谢物是植物生理状态的直接反应，同时它是植物基因表达水平和植物表型的之间的纽带(Luo2015)。研究预计植物体中总的代谢物数量将超过200000种(PicherskyandLewinsohn2011;Schwab2003)，但实际能够鉴定的数量却相对较5 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文少。虽然转录组和蛋白组能够鉴别到较多的信息，但是它们在很大程度上都需要依赖基因组信息进行比对分析，具有一定局限性。目前，代谢组学已广泛应用于植物生物学的研究中，为果实发育和衰老进程中特定代谢物的研究提供了理论基础。包括拟南芥(Kimetal2007)、草莓(Zhangetal2011)、小麦(BaiandShaner2004)、马铃薯(Roessneretal2001)、黄瓜(Tagashiraetal2005)、水稻(Satoetal2004)、番茄(Schaueretal2005)和苜蓿(Broecklingetal2005)等。在柑橘中，Yunetal(2013a)运用代谢组学和比较蛋白组学方法，分析了热处理后柑橘抗病性增加的分子机理。另外，通过分析伏令夏橙黄龙病及缺锌状态下叶片的代谢物，得到了感染黄龙病的潜在代谢物标记，为本研究代谢物标记的寻找提供了参考(Cevallos-Cevallosetal2011)。随着代谢组学的不断完善和进步，其在柑橘果实品质，功能性代谢物质的鉴定，以及突变体的研究中将发挥越来越大的作用。此外，计算生物学在代谢物的分析中的应用越来越广泛，特别是主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)和偏最小二乘法（Partialleastsquaresdiscriminantanalysis,PLS-DA）等方法的运用。PCA是一种简单、非参数的标准数据分析方法，它可以从复杂的数据集中提取重要相关信息。它通过减少数据集的维度(Erikssonetal;Shlens2014)，保留数据本身的大部分变异，按照数据集对方差的最大贡献值，保留数据的最主要方面。PCA现在已广泛应用到多个研究领域。在生命科学领域，主成分分析常被用来识别生物基因和各项生理指标的表达模式相似情况；PLS-DA是建立在最小二乘法回归模型的基础上的一种分类方法，同时它也作为一种有监督的机器学习方法，在临床预测癌症状态和对癌症治疗的监控上有着重要的应用(Pérez-EncisoandTenenhaus2003)。这些分析方法为本研究对柑橘果实采后贮藏阶段的划分及生物标记的筛选提供了很好的计算基础。1.4本研究的目的及内容柑橘果实采后贮藏是保证柑橘能够长期供应的重要措施。同时，柑橘成熟期相对集中，采后贮藏能缓解果实销售压力。但是果实在贮藏期间，柑橘的风味物质和品质都会发生改变，如异味物质的积累，糖和有机酸的波动性变化，这些都将影响到柑橘果实的商品性。另外，由于贮藏环境的不同，果实逐渐衰老的速率也不尽相同，如果不能在果实商品性尚佳的时候将果实销售出去，那么长期的贮藏将给柑橘产业6 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发带来的巨大的经济损失。本研究拟通过对温州蜜柑芯片数据和代谢物数据的深入挖掘，分析柑橘果实在采后贮藏的几个不同的生理状态，开发能监控柑橘果实采后生理状态的生物标记，从而来预测柑橘果实的衰老进程，不仅能为消费者提供鲜美的柑橘果实，而且能够为从事柑橘贮运的大型企业进行柑橘果实贮藏的风险预测。主要研究内容如下：1)对温州蜜柑果实采后贮藏期进行生理状态和贮藏时期的初步划分。2)筛选能够预测温州蜜柑贮藏期果实衰老进程的生物标记（基因和代谢物），并对获得的标记进行实验验证和实用性评价。2材料和方法2.1实验数据1.供试验的果实材料为2008年11月26日采自湖北宜昌果园的“尾张”温州蜜柑（CitrusunshiuMarc.cv.Owari）。选取没有受到机械损伤和病害的柑橘果实作为实验材料，经发汗处理后贮藏于华中农业大学通风库中（温度16-20°C，相对湿度85%-90%）。本研究所用数据为实验室已发表在NCBI上GEO数据库GSE63706中的温州蜜柑果皮和果肉部分，具体登录号见表2-1。2.供验证预测生物标记可靠性的温州蜜柑于2014年8月购于华中农业大学中百超市。果实选取方法和贮藏方法与2008年相同。定量验证试验果实每隔3-5d进行取样，每次随机取8-10个果实，对果肉进行取样，均匀混合得到混样，样品用液氮进行速冻并置于-80℃冰箱中保存，备用。表2-1温州蜜柑贮藏期间芯片数据Table2-1MicroarraydataofSatsumaMandarinduringstoragephase登录号样品描述GSM1555930rindofsatsuma,0DAH,rep1GSM1555931rindofsatsuma,0DAH,rep2GSM1555932rindofsatsuma,10DAH,rep1GSM1555933rindofsatsuma,10DAH,rep2GSM1555934rindofsatsuma,20DAH,rep1GSM1555935rindofsatsuma,20DAH,rep27 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文GSM1555936rindofsatsuma,30DAH,rep1GSM1555937rindofsatsuma,30DAH,rep2GSM1555938rindofsatsuma,40DAH,rep1GSM1555939rindofsatsuma,40DAH,rep2GSM1555940rindofsatsuma,50DAH,rep1GSM1555941rindofsatsuma,50DAH,rep2GSM1555942fleshofsatsuma,0DAH,rep1GSM1555943fleshofsatsuma,0DAH,rep2GSM1555944fleshofsatsuma,10DAH,rep1GSM1555945fleshofsatsuma,10DAH,rep2GSM1555946fleshofsatsuma,20DAH,rep1GSM1555947fleshofsatsuma,20DAH,rep2GSM1555948fleshofsatsuma,30DAH,rep1GSM1555949fleshofsatsuma,30DAH,rep2GSM1555950fleshofsatsuma,40DAH,rep1GSM1555951fleshofsatsuma,40DAH,rep2GSM1555952fleshofsatsuma,50DAH,rep1GSM1555953fleshofsatsuma,50DAH,rep22.2实验方法2.2.1转录组数据中差异基因的鉴定芯片杂交实验中存在样品提取和信号检测的一些误差，给基因表达值的检测带来一些偏差，因此在鉴定差异基因前必须对芯片原始数据预处理。此处主要采用R语言Bioconductor(Gentlemanetal2004)中的Affypackage(Gautieretal2004)分三步进行：(1)背景校正（BackgroundCorrection），(2)样品均一化（Normalization），(3)表达量检测（RobustMulti-arrayAnalysis）。数据的质量控制使用XPSpackage的MAS值来评估基因的表达情况，忽略在六个时间点都没有表达的探针数据供后续分析。差异基因检测首先使用SAM(SignificanceAnalysisofMicroarrays)算法(Chuetal2001)，设置种子set.seed(84048)，以FDR小于0.001作为筛选阈值，可得到443个差异基因。由于此种算法较为粗放，本研究同时将6个时间点的数据进行比较。为进一步准确筛选目的基因，此处用biweight算法(Xuetal2012)对6个时间点的数据计算8 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发加权平均值，比较每个时间点上基因表达值与加权平均值的大小，以±0.5作为阈值。若某一时间点上基因表达值与加权平均值的差值大于0.5，则说明这个基因在这个时间点上是高表达基因；若某一时间点上基因表达值与加权平均值的差值小于-0.5，则说明这个基因在这个时间点上是低表达基因。此时共得到差异基因5232个。综合以上两种差异基因的检测方法，取二者差异基因的并集得到5232个差异基因做后续分析。2.2.2主成分分析转录组数据本研究用PCA对柑橘采后贮藏的6个时期进行生理状态的划分，初步预测柑橘在采后不同的生理阶段。此处使用R语言mixOmics软件包(Dejeanetal2011)完成主成分分析,该软件包也广泛应用于基因芯片和代谢物数据的特征提取中。2.2.3偏最小二乘法判别分析转录组数据本研究以PCA预测的柑橘采后生理阶段作为响应变量，即以柑橘果实采后贮藏阶段分类，将芯片表达谱数据归一化后，使用开放软件R(http://www.r-project.org)进行分析。根据最小二乘法回归模型中的变量重要性（variableimportanceonaprojection,VIP）来预测影响柑橘不同生理状态的关键基因,本文中以VIP大于1.5作为阈值(Yangetal2013)。2.3Real-TimePCR测定基因表达为保证生物标记物在实际检测中的可靠性，提取2014年购于华中农业大学中百超市的温州蜜柑果实RNA,参照(Yuetal2012)方法，对温州蜜柑采后贮藏期间具有生物标记作用的基因表达模式进行Real-timePCR验证。使用PrimerExpress3.0软件（AppliedBiosystems）完成待验证基因引物的设计，引物如表2-2。采用ABI7500实时定量PCR仪（AppliedBiosystems,CA,USA）进行Real-TimePCR扩增，以actin作为内参基因。其引物如下：Forward:5/-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3/Reverse:5/-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3/9 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文表2-2实时荧光定量PCR引物序列Table2-2PrimersequencesforReal-timePCR基因正向引物反向引物GeneForward（5’to3’）Reverse（5’to3’）Cit.1816.1.S1_s_atTGGCCTAAAACCCACATCGATCGCTATTGCTGCTCCATGCAATGGCit.2526.1.S1_s_atGCGAAGAACTGTGGGACCATTGAAACCAATTTGCTGGAACTGCit.3087.1.S1_atGAAACAAGTGAAACAAAAGTTGCAAGGGTGACTGTGGGAAGAATCTTCit.3706.1.S1_atGAAACCTATGGCCCTTCCACTAATTTCTCCAAACCAATAAAGCGGCit.5412.1.S1_atGGTTATGGCAATCCGATCTTCAAACCGATGGAGATGCAGGAACit.6084.1.S1_s_atCCTCACAAGGGCTAAAGCTAGGAGCCATAATGCAATGAAAACTTAAAGACit.6312.1.S1_atGTCCACGTGCTCCCTGATGGATGCTTGGACGCCACTTGCit.6412.1.S1_atTGATGACTTGCTTTCCGACATTTCATCTTGCCGAAACCTGAGACit.11441.1.S1_atTCTTCAATTTGCAGATGACTTTGCCCTTGCTTTGATGCCACACTTCit.11927.1.S1_s_atCCACCGCGACCATTTTCTTTTGATTTCTGTGGGACTGATGACit.13786.1.S1_s_atTGGTGCCGGAGCTCAAGTGGCCAGCCGCAATATATCGCit.15371.1.S1_atCGGGATGGATGCCAACAAGCCTGGCCTTTTCCCATAATCit.15460.1.S1_atCGTCTTCTCTCTCGGCCACTTGGCAAATTAGGGAGGTTCCATTCit.18862.1.S1_atGTCAGGGACGGGTCAAACAGAGAGAGGAATCGGGGAAGTCit.19708.1.S1_s_atCGACAGGACATCGAGCTAACGAAATTATTAATGAAGGTGACGAAGCA2.4代谢物数据分析另取一部分样品用GC-MS进行初生代谢物的测定，在温州蜜柑采后贮藏的6个时间点共鉴定出42种代谢物。首先按照PCA和PLS-DA方法将温州蜜柑采后6个时期分成不同的生理阶段，依据最小二乘法模型得到的VIP（variableimportanceonaprojection）大于1.5进行代谢物重要性的筛选。为验证由偏最小二乘法判别分析预测的温州蜜柑采后生物标记物的准确性，本文使用支持向量机(supportvectormachine,SVM)对温州蜜柑采后6个时期再次进行分类学习(ChangandLin2011)。6个时间点共收集13个样品，将其中9个作为训练集，剩余的4个样品作为测试集，根据分类情况和拟合度筛选出能够预测温州蜜柑采后不同生理状态的生物标记。将SVM和PLS-DA的预测结果进行比较以得到最有10 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发代表性的生物标记物。3结果与分析3.1预测温州蜜柑采后贮藏期的基因标记转录组数据可以全面的检测温州蜜柑在采后贮藏期间各时期基因表达情况，通过对6个时间点上差异基因的筛选，可以对转录组数据进行降维的作用。后续借助无监督机器学习PCA将温州蜜柑采后贮藏时期划分为不同的生理状态。再利用有监督机器学习方法PLS-DA预测出能够代表温州蜜柑采后不同生理状态的生物标志物。3.1.1基于转录组数据的差异基因筛选本研究中所分析的转录组数据为温州蜜柑果肉采后贮藏0-50d，正好可以涵盖温州蜜柑在贮藏过程中从采后前期到采后衰老失去商品价值的所有生理状态。在6个时间点上共检测到30171个探针，用mas5calls函数除去在6个时期上都没有表达的基因，剩余23247个基因做差异基因分析。由于时间点较多，直接比较每两个时间点上的基因差异复杂且实用性不大，则此处采用R语言中多重比较的SAM算法，设定阈值FDR小于0.001，共筛选出443个差异基因。SAM作为芯片数据差异基因筛选方法在理论上仍然不够精确，会忽略掉一些表达量相对较低的差异基因；本研究中又用biweight均值确定差异基因，分别计算每个基因在每个时期表达值与其biweight均值的差值，以±0.5作为阈值筛选出5232个差异基因。比较由SAM和biweight得出的差异基因，发现用SAM鉴定的443个差异基因全部都包含在由biweight鉴定的5232个差异基因中。此处筛选到的5232个基因将作为后续分析的基因集。3.1.2温州蜜柑采后贮藏过程中基因数据对其不同生理状态的划分从有表达的23247探针中筛选出5232个差异基因，但其数量相对于12个样本数来说维度仍然很高，一般的多元比较分析无法进行再次筛选，此处使用PCA将基因进行组合得到新的主成分。结果如图3-1。11 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文从结果可以看出，在第一主成分方向（贮藏期间温州蜜柑生理状态）特征值占总方差的45.67%，能够初步的将温州蜜柑采后贮藏50d划分为三个不同的阶段：0—20d左右为贮藏前期，20-40d左右为贮藏中期，40-50d左右为贮藏后期。这与果实采后生理状态的变化是吻合的。一般地，柑橘采后刚开始贮藏的一段时间，果实脱离树体，营养物质开始自己自足，处于一个寻找新的营养平衡的状态；随着果实对贮藏环境的适应，其生理代谢逐渐稳定，糖酸间的相互转化，使得果实口感和风味逐渐变好，处于一个销售最佳期；当贮藏时间达到一定程度，果实物质代谢再一次wr_awr_bwr_cwr_dwr_ewr_fPC2(18.36%)0030200110-20-30-4--2002040PC1(45.67%)图3-1温州蜜柑采后贮藏期（0-50d）基因芯片数据PCA分析，其中wr代表温州蜜柑果肉，a-f代表贮藏时间0-50d。Figure3-1PCAplotshowingtranscriptionaldiscriminationofstoragestagesofSatsumaMandarin.Thefirst(PC1)andthesecond(PC2)principalcomponentsarepresented.‘wr’representsthefleshofSatsumaMandarinandthelettersatofrepresentthestoragephasefrom0to50days.发生较大变化，加速衰老至逐渐失去商品价值。综合数据分析和已有果实状态变化情况，温州蜜柑在贮藏期间可以大致分成三个不同的阶段：贮藏前期、中期和后期。12 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发3.1.3温州蜜柑采后贮藏基因标记的筛选对温州蜜柑采后贮藏时期内不同生理状态的划分，旨在寻找能够代表温州蜜柑不同生理状态的生物标记。最小二乘法判别分析（PLS-DA）已经应用到许多芯片数据分类中(Fujarewicz2012)，此处根据PCA将温州蜜柑采后贮藏期间分成三类不同生理状态的结果，应用最小二乘法判别分析（图3-2）。PLS-DA得到的前五个主成分能够解释5232个基因80.8%的方差，同时模型对温州蜜柑分成三个不同生理状态的解释可以达到99.7%，并且在10倍交叉验证的情况下，模型预测准确率可以到95.2%。因此，以上数据分析再次证明了温州蜜柑在采后贮藏期间将经历三个不同生理阶段的可靠性。在这个判别分析模型的基础上，根据变量重要性打分（VIP）高于1.4，一共可以筛选出392个具有代表性的基因，其中VIP大于1.5的共有三个包括外层包膜蛋白（Cit.19708.1.S1_s_at，VIP=1.505351997）、葡萄糖磷酸变位酶（Cit.11441.1.S1_at，VIP=1.502331574）和谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at，VIP=1.500944055)。wr-awr-bwr-cwr-dwr-ewr-fcomp2(11.0%)-30-20-100102030-80-60-40-200204060comp1(46.5%)图3-2温州蜜柑采后贮藏期（0-50d）基因芯片数据PLS-DA分析Figure3-2PLS-DAplotshowingtranscriptionaldiscriminationofstoragestages(0-50d)ofSatsumaMandarin.Thefirstandthesecondprincipalcomponentsarepresented.13 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文3.1.4标记基因表达模式分析和注释将上述筛选的392个基因进行Z-score归一化，所得数值四舍五入取整，对它们在六个时期的表达趋势进行比较可以得到35种不同的表达模式，选取包含多于3个探针的模式共有15种，占筛选出全部基因的93.8%，其中下调表达有6类（47.2%），上调表达有9类（46.6%）。A0.7%12.2%1.5%42222111111000000000‐1‐1‐1‐1-2-2-2‐2Z-scorevalue01020304050010203040500102030405012.2%19.6%0.7%222111111000000000-1-1-1-1Z-scorevalue-2-2-2-2-2010203040500102030405001020304050B0.7%18.1%11.2%323221112211110000000000-1-1-1-1-1-1-1-1Z-scorevalue-2-2-20102030405001020304050010203040501.0%10.2%0.7%4442222221000000000-1-1-1-1-1-1-1-1-2-2-2Z-scorevalue0102030405001020304050010203040501.5%1.3%1.8%222111111000000000-1-1-1-1-1Z-scorevalue-2-2-2-2010203040500102030405001020304050Storagetime（d）Storagetime（d）Storagetime（d）图3-3温州蜜柑采后贮藏期（0-50d）重要基因（VIP>1.4）表达模式。将基因表达量z-score14 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发归一化后，将表达值分类标记-1（z-score<-0.5）、0（-0.50.5）.(A)下调表达趋势共6类；（B）上调表达趋势共9类.Figure3-3Theexpressiontrendsofselectedgenes(VIP>1.4)instoragestagesofSatsumaMandarin.Geneexpressionwasnormalizedbyz-scoretransforming.If（z-score<-0.5）{label=-1};If（-0.50.5）{label=1}.(A)Theup-expressiontrend;(B)Thedown-expressiontrend.从趋势表达上看，无论是基因处于上调表达，还是处于下调表达都有着很明显的规律：在温州蜜柑贮藏的50d内，基因表达可以分为三类，且在20-30d基因表达趋势趋于稳定，与柑橘口感在这个时期表现最佳相吻合。用AffymetrixGeneChip®ConsortiaProgram中柑橘的注释信息文件对392个在不同时间点特异表达的基因进行注释，并寻找与TAIR10中同源的基因，共有253（64.54%）个基因有功能注释。根据mapman功能分类，我们可以将差异基因分为27类（图3-4），运用超几何分布对功能分类富集分析发现，其中功能富集的只有氨基化合物代谢（amidacidmetabolism）和蛋白质（protein）两类，说明氨基化合物代谢的变动在温州蜜柑采后贮藏期间尤为明显。4035*30252015*10ThenumberofDEGs50图3-4温州蜜柑采后贮藏期（0-50d）重要基因（VIP>1.4）功能分类.Figure3-4Distributionsandfunctionalcategoriesofselectedgenes(VIP>1.4)instoragestagesofSatsumaMandarin.15 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文温州蜜柑采后贮藏期间具有明显表达趋势的392个基因中，上调表达有195个，下调表达有197个。为进一步发现这些基因参与的生物学过程，对这些差异基因进行基因本体富集分析（GeneOntologyEnrichmentAnalysis）。如表3-1所示，上调表达基因主要归于核小体组装（nucleosomeassembly，FDR=0.002057）这一生物学过程。与之相比，下调表达基因富集通路较多，分布在芳香氨基酸家族代谢（GO:0006810，aromaticaminoacidfamilymetabolic,FDR=1.53E-03）、膜转运蛋白（GO:0055085,TransmembraneTransport,FDR=4.73E-02）、转运（GO:0006810，transport，FDR=4.73E-02）和蛋白酶解（GO:0006508，Proteolysis，FDR=4.73E-02）四个生物过程中。其中核小体组装和蛋白酶解生物过程与细胞凋亡过程相关(Löw1997)，这两个生物过程的变化与柑橘果实贮藏期间的衰老特征吻合。同时柑橘果皮在抵御外界环境中发挥主要作用，因此在柑橘衰老后期果肉向果皮输送营养物质会增加(Dingetal2015)，因而与膜转运蛋白相关的基因也会发生较大的变化。表3-1基于超几何分布计算上调表达和下调表达基因的GO富集分析（FDR<0.05）Table3-1Thesignificantlyoverrepresented(FDR<0.05)geneontology(GO)termsintheup-ordown-regulatedgroupsofeachexpressionpatternweredeterminedbyahypergeometricdistributionalgorithm.GOtermProcessesFDRUpregulatedGO:0006334nucleosomeassembly0.002057DownregulatedGO:0009072aromaticaminoacidfamilymetabolic1.53E-03GO:0006810Transport4.73E-02GO:0055085transmembranetransport4.73E-02GO:0006508Proteolysis4.73E-02为了初步筛选最能够代表温州蜜柑采后贮藏期间三个不同生理状态的转录因子，我们使用BLASTN软件，利用植物转录因子数据库PlantTFDB中的Citrus_sinensis转录因子注释信息(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)对差异表达的转录因子进行了整体分析。在三个不同生理阶段具有明显表达特征的转录因子只有15个（如表3-2），分布于8个转录因子家族中，其中bZIP家族转录因子最多（5个），它作为真核生物中最保16 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发守、分布最广的一类转录因子直接参与到植物抗病反应中(SudipChattopadhyay1998)。此外，ERF是乙烯应答元件结合因子，参与植物抗病信号传递。本研究中两个ERF转录因子（Cit.34473.1.S1_at、Cit.21709.1.S1_at）均呈现逐渐下降的表达趋势，表明随着温州蜜柑逐渐衰老其抗病信号传递出现问题，抗病能力也随之下降。有趣的是，此处并没有发现与调控果树组织衰老密切相关的NAC转录因子家族，这可能与NAC转录因子家族调控的复杂性相关，且在温州蜜柑采后贮藏期间并没有明显的表达特征。表3-2筛选转录因子表达模式Table3-2ExpressionprofileofselectedTFsduringstoragestagesofSatsumaMandarin.AffyIDTFE-value0d10d20d30d40d50dCit.3069.1.S1_atorange1.1g017497m|bHLH01100-1-1Cit.5652.1.S1_atorange1.1g035883m|bHLH2.00E-126-1-10012Cit.9261.1.S1_atorange1.1g032101m|YABBY4.00E-321100-1-2Cit.30230.1.S1_atorange1.1g020303m|G2-like3.00E-171-2-10011Cit.29890.1.S1_atorange1.1g021533m|DBB2.00E-115-1-10002Cit.14579.1.S1_atorange1.1g042153m|B32.00E-591100-1-2Cit.34473.1.S1_atorange1.1g014123m|ERF8.00E-22-1-10011Cit.21709.1.S1_atorange1.1g020922m|ERF2.00E-91-1-10002Cit.29552.1.S1_atorange1.1g019170m|TALE2.00E-1581100-1-2Cit.3239.1.S1_atorange1.1g019151m|TALE6.00E-821100-1-1Cit.3748.1.S1_s_atorange1.1g013223m|bZIP5.00E-3311000-2Cit.35863.1.S1_atorange1.1g036441m|bZIP2.00E-15911000-2Cit.11829.1.S1_atorange1.1g044691m|bZIP1.00E-86-1-10002Cit.14850.1.S1_s_atorange1.1g014879m|bZIP2.00E-82-1-10002Cit.7963.1.S1_atorange1.1g036039m|bZIP0-1-10111植物内源激素在果实衰老过程中起着极为重要的调控作用，因此我们研究了柑橘果实在采后贮藏期间具有特异表达模式的激素物质。通过与拟南芥激素数据库(http://ahd.cbi.pku.edu.cn)中激素相关基因的对比分析，共找到17个与激素相关的特异表达基因（如表3-3），它们分别属于脱落酸、生长素、油菜素内酯、细胞分裂素、乙烯、水杨酸和茉莉酸。在这些激素中并没有检测到延缓果实衰老进程的赤霉素（Payasi2004andSingh2007），暗示着温州蜜柑果实在贮藏期间其衰老进程处于一个相对稳定的状态。另外，我们发现在所有具有明显表达模式的激素当中，调17 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文控脱落酸的基因最多，这为后续研究温州蜜柑自然衰老过程的生理机制提供一定的理论基础。3.1.5候选标记基因的定量验证为检验由芯片数据分析温州蜜柑采后贮藏期间特异表达基因的可靠性，我们于2014年8月15日从华中农业大学中百超市购进刚从云南采收的温州蜜柑。后期利用Real-TimePCR的方法对选择的15个差异表达基因在温州蜜柑采后贮藏期的表达模式进行了分析。这15个基因为PLS-DA中的VIP值最大的基因构成，其引物序列在试验方法中给出。定量验证结果如图3-5所示。从图中表达趋势可以看出这些基因表达量在温州蜜柑采后贮藏期间都呈现出了三个阶段。其中谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)和富含半胱氨酸重复分泌蛋白（Cit.3087.1.S1_s_at）的表达趋势尤为明显，结合PLS-DA模型中VIP>1.5的筛选条件，本研究确定谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)可作为基因标记物。以第一个取样时间点为参照，谷胱甘肽S-转移酶在贮藏前期实时定量表达值在0.8-1.0之间，风味最佳期表达值在0.7-0.8之间，贮藏后期表达值低于0.7，具有明显的阶段性特征，因此可以指示温州蜜柑在采后贮藏中三个不同的生理阶段，为温州蜜柑的最佳销售期提供一定的指导意义。3.2温州蜜柑采后贮藏代谢物标记的预测实验室根据温州蜜柑芯片数据取样时间，运用GC-MS测定了温州蜜柑在0-50d内的初生代谢物，共鉴定出42种代谢物（附录I），其中糖类有12种，有机酸11种，氨基酸8种，其他物质11种。由于实验数据时间点较多，如果使用简单的差异分析比较并不能得出表征柑橘在采后贮藏整个过程当中生理状态的代谢物，此处同样采用聚类和机器学习的方法对柑橘采后贮藏阶段的代谢物数据进行分类。18 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发表3-3激素相关基因表达模式Table3-3Expressionprofileofselectedhormone-relatedgenesduringstoragestagesofSatsumaMandarin.AffyIDHomologCatagoryAnnotation0d10d20d30d40d50dCit.29552.1.S1_atAT5G25220cytokininHomeoboxproteinknotted-1-like31100-1-2Cit.3239.1.S1_atAT5G25220cytokininHomeoboxproteinHD11100-1-1Cit.12762.1.S1_atAT5G09810auxinUbiquinonebiosynthesisprotein11000-2Cit.13299.1.S1_atAT4G33090auxinPuromycin-sensitiveaminopeptidase1100-1-2Cit.12308.1.S1_atAT4G23650ABACalcium-dependentproteinkinase211000-2Cit.20430.1.S1_s_atAT1G07420ABAPutativemethylsterolmonooxygenase1100-1-1Cit.23416.1.S1_atAT4G23650ABACalcium-dependentproteinkinase21100-1-2Cit.3748.1.S1_s_atAT4G34000ABAABSCISICACID-INSENSITIVE511000-2Cit.32293.1.S1_atAT4G36830ABAGNS1/SUR4membraneprotein-1-10002Cit.7658.1.S1_atAT5G50600ABAdehydrogenase/reductase(SDR)-1-10012Cit.35787.1.S1_atAT1G55020ABALinoleate9S-lipoxygenase1-1-10011Cit.5819.1.S1_atAT2G28900JAOuterenvelopeporeprotein1100-1-1Cit.25712.1.S1_s_atAT2G33150JA3-ketoacyl-CoAthiolase1,peroxisomal-1-10002Cit.29664.1.S1_atAT5G38970BRCytochromeP45085A1-1-10011Cit.4931.1.S1_s_atAT3G11980BRFattyacyl-CoAreductase11100-1-1Cit.39054.1.S1_s_atAT5G14930SALipase1100-1-2Cit.21709.1.S1_atAT5G64750EthyleneERF-1-1000219 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文图3-5qRT-PCR验证转录组结果Figure3-5ValidationofMicroarraydatawithquantitativereal-timePCR3.2.1根据代谢物对温州蜜柑采后贮藏时期生理状态的划分由于实验得到的42种初生代谢物含量存在一定数量级差异，为保证其可比性，20 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发在进行数据分析前首先对数据进行整体的Z-score归一化。本研究中首先使用了层级聚类的方法（Hierarchicalclusters）,对数据进行了初步筛选，排除误差较大的数据，图3-6温州蜜柑贮藏期（0-50d）代谢物数据聚类分析，“wr”后的数字表示重复实验次数。Figure3-6Hierarchicalclusteranalysisofmetabolitesinstoragestages(0-50d)ofSatsumaMandarin，thenumbersafter‘wr’representexperimentalrepetitions.如图3-6所示，其中在0d的一组代谢物数据（wra.1）有明显的偏差，因此在后续的分析中，0d的代谢物数据只有2个重复。另外，从聚类的层次关系上，我们可以清楚的发现，20-30d温州蜜柑的生理状态最为接近，但0d，10d和50d的相似性也较大，即采后前期和加速衰老期的生理状态无法从简单的聚类中进行区分。因此我们继续运用无监督聚类主成分分析。在没有先验知识条件下，温州蜜柑在采后贮藏过程中代谢物变化可以明显的将果实在20-30d的生理状态与0-10d和50d的分开，由代谢物权重组成的第一主成分（37.11%）和第二主成分（16.35%）的特征值共占到总方差的53.46%（图3-7A）。虽然在第一主成分和第二主成分上无法区分柑橘采后贮藏前期（0-10d）的生理状态与贮藏后期（50d）生理状态，但从前三个主成分的角度分析，发现柑橘采后贮藏前期和贮藏后期的生理状态的差异可以在第三维上进行区分（图3-7B）。这主要有两方面的原因：第一，实验中鉴定出来的初生代谢物数据种类偏少，无法准确指示柑橘在采后衰老过程中各种不同的生理状态；其次，温州蜜柑采后贮藏前期（0-10d）与贮藏后期（50d）的代谢过程都会有很大变化。在温州蜜柑采后贮藏的前期，由于果实刚脱离母体，无法再从树体吸21 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文收营养，必须重新找到营养平衡的一个供给点，因此体内代谢将发生一系列的复杂变化。随后，果实会逐渐适应贮藏环境，代谢水平相对稳定，但随着果实营养物质消耗，进入到贮藏后期，温州蜜柑果实逐渐加速衰老，果实代谢又将发生一系列复杂变化，因此和温州蜜柑在采后贮藏前期的生理状态可能具有一定的相似性。AB（16.35%）wr_awr_bwr_cwr_dwr_fPC2(16.35%)（37.11%）-4-2024-4-2024（12.02%）PC1(37.11%)图3-7温州蜜柑贮藏期（0-50d）代谢物PCA分析(A)PCA分析二维图；（B）PCA分析三维图Figure3-7PCAanalysisofprimarymetabolitesinstoragestagesofSatsumaMandarin.(A)Two-dimensionalplotbetweenPC1andPC2(B)Three-dimensionalplotbetweenPC1,PC2andPC3.综合上述分析，根据温州蜜柑采后贮藏期间初生代谢物的变化，同样可以将温州蜜柑在采后贮藏期划分成三个不同的生理阶段，即采后贮藏前期（0-10d），风味最佳期（20-30d），贮藏后期（50d左右），且大致期间与之前转录组数据的划分相同。3.2.2温州蜜柑采后贮藏过程中代谢物标记筛选无监督聚类主成分分析能够根据温州蜜柑采后贮藏期间代谢物的变化对温州蜜柑成熟衰老整个进程进行初步的生理状态划分，为后续数据分析提供了一定的先验知识，但它并不能准确筛选出具有表征柑橘贮藏寿命的生物标记，因此本研究中采用最小二乘法判别分析和支持向量机（SVM）来探寻能够预测温州蜜柑采后贮藏寿命的代谢物标记。运用PLS-DA对代谢物数据进行分析，温州蜜柑在采后贮藏的三个生理阶段可22 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发以明显区分（图3-8）。在第一维上可以将温州蜜柑果实贮藏中期即最佳风味期（20-30d）与果实贮藏前期和后期的生理状态区分开，并且它对偏最小二乘法判别模型方差解释为37%，在第二维上可以将温州蜜柑果实贮藏前期与后期的生理状态区分开，它对模型的方差解释占14.6%。这个分类结果与之前转录组数据分析结果是一致的。wr-awr-bwr-cwr-dwr-fcomp2(14.6%)-4-2024-4-2024comp1(37.0%)图3-8温州蜜柑贮藏期（0-50d）代谢物PLS-DA分析Figure3-8PLS-DAanalysisofprimarymetabolitesinstoragestagesofSatsumaMandarin.根据PLS-DA模型中的VIP分值判别重要代谢物，其中大于1.5（第一维度）的物质共有7种，分别为Glycine、Sucrose、3-Amino-6-methoxypicolinicacid、2-Butenedioicacid、Glucose、Fructose、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-。此外，我们运用支持向量机的分类方法（http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm/），按照温州蜜柑采后贮藏期间三个不同的生理状态进行分类，将代谢物实验数据分成两组，其中一组为训练数据集，另一组为测试数据集。利用全部42种代谢物可以将温州蜜柑采后贮藏0-50d数据分成三个不同生理阶段的准确度为88.9%，在严格的23 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文交叉验证情况下，选用10个重要代谢物将温州蜜柑采后贮藏时期分成3个不同生理阶段的准确率也可以达到88.9%（图3-9）。SVMclassification60565040333020ErrorRate10111111042211052Numberofvariables图3-9用支持向量机（SVM）分类方法在10倍交叉验证情况下，42种代谢物和10代谢物的分类错误率都为11%（即正确率为89%）Figure3-9Classificationerrorratesofprimarymetabolitesupon10-foldcrossvalidationusingSVM.Theerrorrateusingallof42or10selectedmetaboliteswas11%(89%accuracyofclassification)同样地，此处可以根据支持向量机模型中的特征值（F-score）大小筛选出重要的代谢物。根据前面预测准确率，我们选出了10个重要代谢物（表3-4）。表3-4SVM模型中得到特征值最高的10个代谢物Table3-4TopTenmetaboliteswiththehighestF-scoreinSVMmodel.MetaboliteF-scoreL-Asparticacid58.9661443-Amino-6-methoxypicolinicacid38.566585Glycine38.005071Sucrose31.381630d-Galactose26.6200712-Butenedioicacid24.062234Glucose9.415098Fructose7.798813Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-5.772728Asparagine2.265383其中Sucrose、Glucose、Fructose、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-四24 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发种物质含量在数量级上明显都高于其他几种物质含量，因此在传统的统计差异研究中对于微量物质的就很容易忽略，本文运用分类的方法揭示了一些微量代谢物在柑橘采后贮藏过程中的作用。比较PLS-DA与SVM两种不同的分类方法的结果发现，Glycine、Sucrose、Glucose、3-Amino-6-methoxypicolinicacid、2-Butenedioicacid、Fructose、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-具有较稳定的性质（表3-5），是能够用来预测温州蜜柑采后贮藏寿命的代谢物标记。表3-5PLS-DA和SVM中共同筛选的7个代谢物Table3-5TopsevenmetabolitesselectedbyPLS-DAandSVM.PLS-DASVMMetabolites(VIPscore)(F-sore)Glycine1.6437012238.005071Sucrose1.64096296731.381633-Amino-6-methoxypicolinicacid1.63974479938.5665852-Butenedioicacid1.62938747124.062234Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-1.583414655.772728Glucose1.569402079.415098Fructose1.5552593037.7988133.3温州蜜柑果皮和果肉在采后贮藏期的比较柑橘在解剖学结构上可以明显的分成果皮和果肉，且Dingetal（2015）已经从复杂网络的研究中指出，不同柑橘品种在采后贮藏衰老寿命不同主要由于柑橘解剖学结构的差异导致。无论是紧皮柑橘，还是宽皮柑橘在衰老过程中，都主要是果皮作为外部结构来抵御生物和非生物胁迫，因此从生物学能量供应上来看，果皮将消耗的大量的能量。本研究对比分析了温州蜜柑果肉和果皮在采后贮藏0-50d期间生理状态变化。我们对温州蜜柑采后贮藏期间0-50d的果皮基因芯片数据进行处理分析，筛选差异基因方法与果肉相同，在果皮中得到6个时间点上的差异基因共有6554个，并且发现果皮中在每个时间点上的差异基因数量多于果肉（图3-10A），这说明温州蜜柑果皮在采后贮藏期间经历着更剧烈的变化。此外，我们用PCA分析比较了温州蜜柑果皮果肉采后贮藏各时期的差异，我们可以明显看到温州蜜柑果肉可以明显的划分为三个时期（图3-10B），但在果皮中贮藏期间前40d并没有明显区分，只是在贮藏到25 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文50d时，可以与其他时间点进行区分，这说明了在温州蜜柑的整个贮藏期间，果皮在前40d的生理状态变化不大，直到50d的时候才会逐渐发生变化，并且果皮的衰老进程要晚于果肉的衰老进程。A40003803300031012634227120002085wr1429wp1000101510946568082283440ThenumberofDEGsW‐aW‐bW‐cW‐dW‐eW‐fStoragetimeBCPC2PC2-1000-30030-100050150-60-202060PC1PC1图3-10温州蜜柑果皮和果肉分别在时间分布上的基因差异和PCA分析.（A）果皮和果肉分别在时间分布上差异基因数比较;（B）温州蜜柑果肉在贮藏期（0-50d）PCA分析；（C）温州蜜柑果肉在贮藏期（0-50d）PCA分析.Figure3-10DEGsbetweendifferenttimestagesinpulpandpericarpofSatsumaMandarinandPCAanalysis(A)ThenumberofDEGsbetweendifferenttimestagesinpulpandpericarpofSatsumaMandarin.(B)PCAanalysisofpulp.(C)PCAanalysisofpericarp.26 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发4讨论4.1有机酸和糖作为果实采后贮藏寿命预测生物标记不适用性柑橘果实采后贮藏阶段，可溶性糖、有机酸和糖酸比对柑橘果实风味具有重要影响，并且相对较高的有机酸含量对柑橘果实的贮藏寿命有明显的延缓作用(Schirra2011;Sunetal2013)，但对比有关柑橘果实采后贮藏阶段的糖酸研究发现，有机酸和糖在采后贮藏期间含量一直出现平稳的波动现象，并没有明显的阶段性特征。并且从本试验的代谢物数据可以看出，可溶性糖（蔗糖、葡萄糖和果糖）的含量较其他类别的代谢物含量之间有着1-2个数量级的差别，如果本研究没有采取z-score归一化的方法，在聚类分析中将会扩大可溶性糖在计算中的比重，从而非常容易忽略一些具有重要指示性的微量代谢物。此外，所有果实的风味都与主要有机酸和可溶性糖含量相关，而生物标记的一个重要特点就是具有生物特异性，因此用有机酸和可溶性糖是不适合作为柑橘果实采后贮藏阶段的代谢物标记。本研究分析得出Glycine、3-Amino-6-methoxypicolinicacid、2-Butenedioicacid、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-四个潜在代谢物标记，在柑橘果实采后贮藏期表达趋势如图4-1，它们在采后贮藏前期和后期均处于高值，在贮藏中期却降到1.512-Butenedioicacid0.5Glycine03-Amino-6-methoxypicolinicacidZ-scorevalue-0.5Cyclohexanone,2-[dimethylamino.methyl]--1-1.50d10d20d30d50dStoragetime图4-1温州蜜柑贮藏期（0-50d）潜在代谢物标记表达模式Figure4-1ThetrendsofpotentialmetabolitebiomarkersofSatsumaMandarinduringstoragephase(0-50d).较低水平，这可能主要是它们可以作为糖和有机酸代谢底物，来抵御果实风味的变坏。以甘氨酸为例，它可以通过脱羧作用向丝氨酸转化进而转化为脱羧丙酮酸和甘27 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文油，以此形式参与到蔗糖和多糖合成代谢当中(Miflin2014)，从而维持柑橘果实风味。丁烯二酸中在柑橘果实中研究比较多的主要是延胡索酸，虽然它含量远低于主要有机酸，但在对纽荷尔脐橙果实采后贮藏期延胡索酸的研究中发现，果实在贮藏各时期延胡索酸含量差异极明显（熊晶晶2007）。代谢物3-Amino-6-methoxypicolinicacid和Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-目前在柑橘中研究并不多见，作为低含量的代谢物，有待进一步验证。4.2基因标记与代谢物标记联系本研究通过数据分析将温州蜜柑采后贮藏阶段分为采后贮藏前期、风味最佳期和贮藏后期，并通过变量重要性筛选得到的最能评估温州蜜柑采后贮藏期三个不同生理状态的基因标记分别为外层包膜蛋白（Cit.19708.1.S1_s_at）、葡萄糖磷酸变位酶（Cit.11441.1.S1_at）、谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)。其中在qRT-PCR验证中只有谷胱甘肽S-转移酶的表达模式与温州蜜柑采后贮藏期三个不同生理状态最为吻合。GST在动植物及微生物中具有重要作用，植物中的GST研究已经阐述了它与生物胁迫和非生物胁迫、植物激素响应和生长发育变化的之间的联系(Dixonetal2010)。一方面GST可以与内源性和外源性化合物发生共轭反应对机体起到解毒的作用，另一方面它们也可以参与依赖性谷胱甘肽过氧化反应或异构化反应当中，此外，它还有具有一些非催化功能，如和非底物配体结合，诱导应激信号的传导过程和防止细胞凋亡(Öztetik2008)。在温州蜜柑采后贮藏衰老阶段，芯片数据显示谷胱甘肽S-转移酶随衰老的进行表达量逐渐降低，说明温州蜜柑果实的抗性在逐渐降低，它的变化趋势正好符合整个果实衰老的进程。在对谷胱甘肽S-转移酶内源代谢途径的研究中发现，Zeta家族GST是酪氨酸代谢途径的关键酶之一。它的含量对酪氨酸向延胡索酸和乙酰乙酸的转化具有重要影响。本研究中得到的基因标记谷胱甘肽S-转移酶表达量在温州蜜柑果实整个采后贮藏期间一直处于下调表达趋势，且在贮藏前期、风味最佳期和贮藏后期具有明显的差异，结合得到代谢物标记含量变化发现，丁烯二酸含量在温州蜜柑贮藏前期和风味最佳期这两个生理状态变化很可能是由于谷胱甘肽S-转移酶表达量的变化导致酪氨酸代谢途径变化造成的。本研究得到的基因标记和代谢物标记在代谢途径中的28 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发关系并不大，但是从他们的合成和作用途径来看，都间接的参与到可溶性糖和有机酸的代谢中，这为以后寻找与果实风味变化相关的研究提供一个方向。4.3生物标记在采后贮藏中的实用性和展望本研究中开发的生物标记目的是为区分温州蜜柑在采后贮藏期间的不同生理状态，进而依据不同的生理状态来预测温州蜜柑果实还能贮藏的时间或者是否已经到达最佳销售期，以期为柑橘主产区大规模贮藏柑橘的企业做好风险预测，减少由于果实的风味变化或腐烂造成经济损失。同时，这些生物指标也能在一定程度上指导柑橘在风味最佳期销售，使消费者受益。研究仅从数据角度出发分析了表征温州蜜柑果实采后贮藏期的生物标记，也是在柑橘采后生物学研究中第一次提出将柑橘采后贮藏期按生理状态进行划分，从而对柑橘贮藏时间长短进行预测。本研究开发了谷胱甘肽S-转移酶、Glycine、3-Amino-6-methoxypicolinicacid、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]-、2-Butenedioicacid5个潜在生物标记，通过对基因及代谢物的功能分析和定量验证表明它们具有一定的实用性，但在企业中的具体检测方式和区分不同生理状态的各生物标记含量的准确值需要进一步的实验验证。实际生产中甜橙贮藏期更长，其产量也远多于温州蜜柑，且甜橙的采后贮藏0-50d的基因芯片和代谢物数据也已发表，但在本研究中开发的生物标记只针对温州蜜柑这一品种，主要是因为这一贮藏数据时间跨度较小，无法覆盖甜橙整个衰老进程，且Dingetal(2015)中指出甜橙贮藏0-50d正好处于贮藏前期，因此对于贮藏期较长的柑橘果实无法根据现有数据来开发预测果实采后贮藏寿命的生物标记。对于宽皮和紧皮柑橘，尽管属于柑橘不同品种，具有解剖学上的差异，但在贮藏过程中代谢途径大致相同，因此本研究开发预测温州蜜柑贮藏寿命的5个生物标记可能对柑、橙、柚三个品种依然适用，只是生物标记的表达值或含量存在差异，这也有待进一步实验验证。由于柑橘采后贮藏期间，影响贮藏效果的因素很多，如贮藏环境中的温度、湿度、病原微生物等，即使同批次的柑橘在相同贮藏条件下也会有不同的贮藏时间，因此对果实采后贮藏阶段生理状态的划分实际上是一个极其复杂的过程。同时消费者对风味的感官评价涉及到包含大量感官信息的复杂系统，如果实颜色、营养物质，29 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文甚至是人体中嗅觉受体(Klee2010)。本研究中并没有深入直观考虑消费者对于柑橘果实的风味评价，并且不同消费者对于柑橘果实好坏的感受也具有明显差异。因此想得到柑橘采后贮藏准确的生理阶段划分，还需从消费者感官评价入手，初步得到贮藏期温州蜜柑风味变化的阶段划分，再利用本研究中基于转录和代谢数据的预测方法。此外，生物体成熟和衰老是一个复杂的代谢过程，基因表达变化、酶和代谢物含量都是相互影响的，因此现在许多研究也逐渐网络化，那么只用一个基因标记或是代谢物标记来准确预测温州蜜柑果实贮藏寿命是比较局限的。在医学诊断领域中，已经开始利用多种生物标记来进行诊断测试，如目前在乳腺癌诊断中使用了数十种与乳腺癌相关基因(Jamesetal2007)。因此要得到能够准确预测温州蜜柑果实贮藏寿命的生物标记必须开发综合多种基因或代谢物的指数。30 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发参考文献1.程运江.2011.园艺产品贮藏运销学[M].第二版.北京：中国农业出版社.2.崔晓峰.2008~2013年间植物生物学领域国内外重要研究进展比较.植物生理学报,2013,49(6)3.Agudelo-RomeroP,ErbanA,SousaL,PaisMS,KopkaJ,FortesAM.Searchfortranscriptionalandmetabolicmarkersofgrapepre-ripeningandripeningandinsightsintospecificaromadevelopmentinthreePortuguesecultivars.PLoSOne,2013,8:e604224.AlbrechtU,BowmanKD.GeneexpressioninCitrussinensis(L.)OsbeckfollowinginfectionwiththebacterialpathogenCandidatusLiberibacterasiaticuscausingHuanglongbinginFlorida.PlantScience,2008,175:291-3065.AronsonJK.Biomarkersandsurrogateendpoints.BrJClinPharmacol,2005,59:491-4946.BaiG,ShanerG.ManagementandresistanceinwheatandbarleytoFusariumheadblight1.Annu.Rev.Phytopathol.,2004,42:135-1617.BainJ.Morphological,anatomical,andphysiologicalchangesinthedevelopingfruitoftheValenciaorange,/Citrussinensis/(L)Osbeck.AustralianJournalofBotany,1958,6:1-238.BroecklingCD,HuhmanDV,FaragMA,SmithJT,MayGD,MendesP,DixonRA,SumnerLW.MetabolicprofilingofMedicagotruncatulacellculturesrevealstheeffectsofbioticandabioticelicitorsonmetabolism.JExpBot,2005,56:323-3369.CercosM,SolerG,IglesiasDJ,GadeaJ,FormentJ,TalonM.Globalanalysisofgeneexpressionduringdevelopmentandripeningofcitrusfruitflesh.AproposedmechanismforcitricAcidutilization.PlantMolBiol,2006,62:513-52710.Cevallos-CevallosJM,Garcia-TorresR,EtxeberriaE,Reyes-De-CorcueraJI.GC-MSanalysisofheadspaceandliquidextractsformetabolomicdifferentiationofcitrusHuanglongbingandzincdeficiencyinleavesof"Valencia"sweetorangefromcommercialgroves.PhytochemAnalysis,2011,22:236-24611.ChangC-C,LinC-J.LIBSVM:alibraryforsupportvectormachines.ACMTransactionsonIntelligentSystemsandTechnology(TIST),2011,2:2712.ChengH,ChenJ,LiX,PanJ,XueSJ,LiuD,YeX.Differentiationofthevolatile31 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预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发CatagoryMetabolites0d10d20d30d50dAlanine-0.6630897-0.66565310.333543721.20019776-0.6479129Asparagine-0.8586897-0.6428589-0.69398470.276341981.41867513Citrulline-0.4369997-0.4856349-0.4399818-0.33015071.38522216aminoacidsGlycine0.701178330.90879135-1.098269-0.93691640.96187231Serine-0.92614440.53795267-0.8436596-0.15987021.26232436Threonine-0.648508-0.6485081.57041409-0.0572287-0.648508Valine-0.5052172-0.5052172-0.15712781.33596784-0.50521722,3,4-Trihydroxybutyricacid-0.32688-0.7674793-0.37179420.584323040.51704413-Amino-6-methoxypicolinicacid0.713298160.95667453-1.0246509-1.00928260.920618355-Aminohexanoicacid0.523073530.74902015-1.1533373-0.50683270.81210763Cyclohexanone,2-[dimethylamino.methyl]-0.774101860.7544704-1.2062852-0.75297920.94021625Silane-0.0843260.93316992-1.3009486-0.21365710.94870976othersRibitol0.017844150.69341909-0.30618730.35342386-0.5214121phosphate1.376123930.07398405-0.54167240.26040022-0.6854665Glutamine-0.4034607-0.4034607-0.40346071.34486899-0.4034607Hexadecanoicacid-0.3420779-0.334337-0.28639120.99324367-0.2559093Hexadecanoicacidtrimethylsilylester-0.4305505-0.42949181.36347163-0.3596007-0.4305094Octadecanoicacidtrimethylsilylester0.882773530.95694806-0.82802120.55331898-0.951778837 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文附录II硕士期间发表论文1.华中农业大学.《一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用》.专利申请号：20151085393.2.2015-04-202.ZhengBB,FangYN,PanZY,SunL,DengXX,GrosserJW,GuoWW.iTRAQ-basedquantitativeproteomicsanalysisrevealedalterationsofcarbohydratemetabolismpathwaysandmitochondrialproteinsinamalesterilecybridpummelo.JProteomeRes,2014,13:2998-301538 预测温州蜜柑果实采后贮藏寿命生物标记的开发致谢从2008年到2015年，七年的求学生涯即将在华中农业大学圆满结束。一路走来，酸甜苦辣、悲伤喜悦，最后都将汇成人生的美好回忆。这段期间我深深感受到团队的力量，感受到柑橘采后课题组给我带来像家一样的温暖。首先要感谢我的导师程运江教授对我论文的悉心指导！程老师严谨的治学态度，对科学孜孜不倦的科研精神，高超的管理技能，真诚和善的做人态度和宽广的胸怀和视野，不仅仅培养了我的科研素养，更教会了我如何做人和做事，这些都让我受益终身。同时，也感谢程老师在就业中的指导和帮助，作为华中农业大学柑橘采后课题组的一名研究生让我深感荣幸。特别感谢本校生物信息学课题组陈玲玲老师，让我能有机会在生物信息学实验室学习和参与课题组会讨论，为我在预测柑橘采后贮藏寿命生物标记开发的研究中提供了很好的计算生物学基础。真诚地感谢柑橘课题组邓秀新院士、郭文武教授、徐娟教授、徐强教授、叶俊丽老师在课题研究及论文思路等方面的支持与帮助。感谢丁毓端师姐和常继伟师兄在实验思路上给予的指导；许让伟师姐在贮藏实验中给予的帮助；何义仲、朱峰、肖雪和张鸣飞和朱凯杰在qRT-PCR实验中给予的支持；朱丽华在专利撰写投稿中的指导；感谢马巧利、王金秋、盛玲、李卓然等柑橘采后小组的全体成员，在实验和生活上给予我的关心和帮助。感谢这个优秀的集体让我成长，让我感到家的温暖。感谢柑橘课题组所有成员；感谢三年来和我一起成长的生物信息学实验室所有成员。感谢多年来默默支持我的父母、姐姐和安璐，在我迷茫痛苦时是他们的支持与鼓励让我一路前行。感谢他们一路的陪伴，向他们表示我最深的谢意。特别感谢我的母校华中农业大学，我将青春最美丽的7年时光留在了这里，我也将从这里起航，继续寻找我的梦想。本研究受国家现代农业柑橘产业技术体系柑橘贮运保鲜岗位科学家专项经费支持。孙力2015年5月于狮子山39