油菜蜂蜜成熟过程中蛋白质和糖分变化的研究 75页

密级：公幵中图分类号：硕士学位论文论文题目：油菜蜂蜜成熟过程中蛋白质和糖分变化的研究作者姓名：叶梦迪学科专业：食品科学与工程研究方向：现代食品制造技术指导教师：顾振宇教授提交日期：年月 DissertationSubmittedtoZhejiangGongshangUniversityforMaster"sDegreeofEngineeringRESEARCHONTHECHANGEOFPROTEINANDCARBOHYDRATEOFRAPEHONEYINRIPENINGPROCESSAuthor:MengdiYeMajor:FoodScienceandEngineeringSupervisor:Prof.ZhenyuGuJan.2015CollegeofFoodScienceandBiotechnology,ZhejiangGongshangUniversityHangzhou,310018,P.R.China 浙江工商大学硕士学位论文油菜蜂蜜成熟过程中蛋白质和糖分变化的研究摘要蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾内经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中主要含有糖类、蛋白质、酶类等成分。这些成分的组成和含量与花源品种及蜂蜜的成熟过程有关。按生产方式不同，蜂蜜大致分为种类型，分别为天然原料蜜、加工浓缩蜜、天然成熟蜜。由于蜂蜜的酿造受到蜜源植物的花期、蜂群势力、天气情况等因素的影响，使得天然成熟蜜的生产受到一定程度地限制。目前，我国蜂蜜产品的质量存在一些问题，最主要的原因是生产不成熟蜂蜜，因其水分含量很高，导致其中的活性成分在进行加工浓缩的过程中遭到严重破坏。而天然成熟蜜因经过蜜蜂的充分酿造而具有很高的营养价值和显著的保健功效。大量的研宄单纯分析了不同品种蜂蜜中各种成分的差异，以此来判别蜂蜜品质的高低，而并没有把蜂蜜的成熟过程纳入其中。本研宄对蜂蜜在酿造过程中蛋白质和糖分的变化进行分析，以期鼓励生产天然成熟蜜并丰富蜂蜜品质的检测，研宄结果如下：对天然油菜蜂蜜在成熟过程中的理化指标和种主要酶类物质的活性进行了测定，发现水分含量与可溶性固形物含量及电导率之间存在很好的相关性，说明蜂蜜中真实的水分含量可以通过固形物 浙江工商大学硕士学位论文含量和电导率来反映。我们还发现淀粉酶、（葡萄糖苷酶（转化酶）和葡萄糖苷酶活性之间也存在较好的相关性，故认为可以通过检测其中一种酶的活性来预测或评估蜂蜜中其他几种酶。通过电泳和技术，我们发现天然油菜蜂蜜在成熟过程中蛋白质组成很稳定，主要存在葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、、和这种蛋白质，且均由蜜蜂分泌产生。同时也发现随着蜂蜜酿造天数的增加，蜂蜜中的蛋白质含量由显著增加到，说明蛋白质含量可以很好地表征蜂蜜自然成熟的程度。通过对天然油菜蜂蜜在成熟过程中糖分的变化进行研究，发现蜂蜜中含量最丰富的是果糖和葡萄糖。将糖分的变化与酶类的活性进行分析，发现果糖含量在成熟过程中不断升高是由葡萄糖苷酶的水解作用引起的，并且在蜂蜜酿造的后期发现有海藻糖和异麦芽酮糖不断生成。关键词：蜂蜜；成熟；蛋白质；葡萄糖苷酶；糖分 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文目录第章弓言蜂蜜的定义、成分及其质量现状蜂蜜中的蛋白质及酶类物质蜂蜜中的糖类物质课题研究的目的及意义课题研究的内容及方法第章天然油菜蜂蜜在酿造过程中理化特性和酶活性的研宄材料与仪器材料蜂蜜样品试验试剂试验仪器与设备试验方法水分含量的测定可溶性固形物含量的测定值的测定电导率的测定淀粉酶活性的测定葡萄糖苷酶活性的测定试剂的制备具体操作葡萄糖氧化酶值的测定试剂的制备具体操作葡萄糖苷酶值的测定试剂的制备具体操作 浙江工商大学硕士学位论文结果与讨论蜂蜜理化指标结果分析蜂蜜酶活性的分析本章小结第章油菜蜂蜜中蛋白质的研究材料与仪器试验材料蜂蜜样品试验试剂仪器与设备试验方法蜂蜜蛋白质的提取蜂蜜蛋白质含量的测定电泳测定分析结果与讨论天然油菜蜂蜜的蛋白质含量变化分析天然油菜蜂蜜的蛋白质电泳图谱分析市售油菜蜂蜜的蛋白质含量与电泳图谱分析天然油菜蜂蜜的蛋白质质谱鉴定分析本章小结第章天然油菜蜂蜜在酿造过程中糖分变化的研究材料与方法试验材料蜂蜜样品采集试验试剂试验仪器与设备试验方法蜂蜜样品的处理 浙江工商大学硕士学位论文糖标准品溶液的配制液相色谱条件结果与讨论色谱条件的选择糖标准品的色谱分析果糖标准曲线的绘制葡萄糖标准曲线的绘制蔗糖标准曲线的绘制异麦芽酮糖标准曲线的绘制麦芽糖标准曲线的绘制海藻糖标准曲线的绘制不同酿造天数蜂蜜的色谱分析本章小结第章总结论、创新点与展望总结论创新点展望参考文献隱独创性声明 浙江工商大学硕士学位论文第章引言蜂蜜的定义、成分及其质量现状蜂蜜是蜜蜂釆集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾内经转化、脱水、存至成熟而储藏在蜂巢里的天然甜物质。蜂蜜中的主要成分是糖类物质，其中以果糖和葡萄糖这两种单糖为主，约占总成分的，还含有一些微量的蛋白质、酶类、有机酸、氨基酸、色素、矿物质、维生素、黄酮及粉类物质这些成分的组成和含量与蜜蜂的品种、蜜源植物的种类及蜂蜜的成熟过程有关，同时也受到放蜂环境、采蜜季节、养蜂技术及地域差异等诸多因素的影响丨。蜂蜜具有抗氧化、抗菌、镇静安神、促进伤口愈合和加快新陈代谢的作用，同时还有保护肝脏、治疗演疡和胃炎，促进消化的功效。全球每年的蜂蜜产量总值大约为万吨，而蜂蜜的消耗量在发达国家中所占的比重最大，其中有的蜂蜜被用作糖果类产品的开发。我国幅源辽阔，气候适宜，蜜蜂资源丰富，是世界第一养蜂大国，同时也是世界蜂产品生产和出口大国。蜂蜜、蜂王衆、蜂胶等产品在国际蜂产品市场中占有重要的比例，其中，每年出口的蜂蜜总量就占了世界出口总量的左右丨主销市场为美国、欧洲、日本等一些发达国家和地区。我国蜂蜜在生产和销售中主要存在种类型，分别是天然原料蜜、加工浓缩蜜和天然成熟蜜。其中天然成熟蜜又称为巢蜜，它由外勤工蜂采集植物的花蜜或蜜露存于蜜囊中，返回蜂巢后将花蜜吐出，由内勤工蜂进行不断吞吐、转化，并不断振翅挥发水分，直至巢房中的蜂蜜的水分含量达到以下，内勤工蜂对巢房进行封盖将蜂蜜储存起来作为今后的食物来源。天然成熟蜜因经过充分酿造，口感醇厚，具有非常丰富的活性成分，营养价值很高，保健功效显著，因其水分含量很少不利于微生物的生长而具有很长的保质期。蜂蜜的采集及成熟受到蜜源植物的花期、蜂群势力、天气情况等因素的影响，出现封盖至少需要天，直至完全封盖大约需要个月的时间。为了提高产量和经济利益，蜂农更愿意釆集仅酿造天左右的蜂蜜，即天然原料蜜，这种蜂蜜中含水量很高，营养物质含量很低，蜂蜜生产商必须通过加工浓缩来达到相关的标准，目前市场上大多蜂蜜都是这种成熟度不高的加工浓縮蜜。传统的蜂蜜加工主要经过预热融蜜、过滤、升温、真空浓缩和冷却这几部工序丨】，其中预热融蜜和升温对蜂蜜品质有很大的影响，因为温度达到°以上，容易引起美拉德反应的发生，会造成蜂蜜中的营养成分被破坏，尤其是一些具有活性的物质，如蜂蜜中的一些蛋白质和酶类物质，高温使得它们变性失活，从而降低了蜂蜜的质量 浙江工商大学硕士学位论文及品质。蜂蜜的质量与其组成成分密切相关，成分的差异使得不同品种的蜂蜜具有不同的保健效果和药用价值。如新西兰的麦卢卡蜂蜜，因其含有一种独有的抑菌物质一独麦素（，而具有很强的抗菌及抗氧化能力。它可以有效促进机体伤口的自然愈合，并且在调养胃肠道方面表现极佳，因而具有很高的市场价值。近年来，这些高品质的蜂蜜陆续涌入我国，而我国生产的蜂蜜由于内在品质先天不足，并且监管制度不够完善，造成了消费者纷纷把目光投向了那些高品质的进口蜂蜜，这对国内蜂蜜产业的发展造成了严重的冲击。我国蜂蜜产品质量不高，主要存在以下几方面问题：（国内养蜂普遍采用郎式继箱体形式饲养蜂群，即采完一个蜜源后需要马上转地去采下一个蜜源。而国外养蜂基本上采用多箱体生产，有多个放蜂点，不需有专人看守，直至主要蜜源花期结束后，只收取成熟封盖的蜜脾进行过滤和分装上市，因此他们采收的都是天然成熟蜜。由于生产天然成熟蜜需要较长的时间，并且产量不高，我国的很多蜂农受到经济利益的驱使，不愿意生产天然成熟蜜，而是“三天一摇蜜”，甚至“每天取蜜”，这种不成熟蜂蜜的含水量很高，容易造成微生物的滋生，尤其是引起酵母菌的发酵，并且这类蜂蜜中的营养物质含量很少，价格低廉，蜂蜜生产商收购这种不成熟蜂蜜进行加热浓缩以满足相关标准，进而在国内上市，甚至出口到国外，较低的价格又导致蜂蜜出口商收购价格相对较低的不成熟蜜，陷入恶性循环蜂蜜质量的高低与其蜜源植物品种、蜂蜜的组成成分有直接关系。可以将蜂蜜分为一等蜜、二等蜜、三等蜜和等外蜜，其中一等蜜有椴树蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、龙眼蜂蜜、荡枝蜂蜜、相橘蜂蜜、枇杷蜂蜜和紫云英蜂蜜等，这类蜂蜜滋味甜润、具有蜜源植物特有的花香⋯，营养成分含量丰富，但是此类蜂蜜产量不多而市场需求量较大，造成其价格比较昂贵，因而容易成为掺假的对象。蜂蜜市场普遍存在以次充好的现象，生产商在这些高等蜜中掺入花蜜来源复杂、价格低廉，质量较差的低等蜜以获取利益，使得蜂蜜品种参差不齐，对蜂蜜质量的监测和蜂蜜市场的管理造成了沉重的打击；（蜂蜜中农兽药残留超标，导致质量不过关的蜂蜜流入了市场。很多蜂农一味地追求产量，出现“多取蜜，勤取蜜”的现象，对蜂群的健康造成了很大的伤害，并且有些蜂农文化素质不高，科学意识差，对农兽药没有很好地认识，用药不规范，导致了蜂蜜中农兽药残留超标。年，美国检疫机构称从我国出口到美国的蜂蜜中检出氯霉素残留量超标，之后将中国蜂蜜中氯霉素的残留量由降到了。年，我国出口到欧盟的蜂蜜中，有批蜂蜜被欧盟官方通报，主要原因是养蜂户使用了许多限用药物，其中个别蜂农使用了欧盟禁用的药物。这些问题的存在不仅损害了我国广大消费者的根本利益，同时 浙江工商大学硕士学位论文还使我国蜂蜜的出口受到限制，面临更严峻的形势。其中最根本的原因是生产的蜂蜜并未完全成熟，从而引发了这一系列的问题。蜂蜜中的蛋白质及酶类物质蛋白质是由氛基酸通过脱水缩合的方式组成的多肽链经过折叠修饰后形成的具有特定空间结构的物质。蛋白质是生物功能的载体，主要参与生物体的新陈代谢、调节其余蛋白质执行其生理功能和起到细胞防御的作用。其中，酶是一类具有高度催化作用的蛋白质，生物体内的各种化学反应几乎都需在相应酶的参与下进行。此外，酶可以参与食物的消化、蛋白质的生物合成、生物能量的控制及其他生命活动中的化学变化蜂蜜中含有多种蛋白质和酶类物质，大约占蜂蜜总成分的。其中最重要的蛋白质为蜂王奖主要蛋白（，它是蜂王衆蛋白的主要组成部分，约占蜂王衆总蛋白含量的【】。蜂蜜中的酶类物质主要有淀粉、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶（和葡萄糖苦酶（同时还有一些微量的过氧化氢酶（和酸性磷酸酶（蜂蜜中很大一部分蛋白质和酶类是由蜜蜂的咽下腺或消化腺分泌产生的，而另一部分则来源于花粉或花蜜【。它们在花蜜成熟为蜂蜜的过程中扮演着重要的角色，使得蜂蜜具有独特的性质和功效而有别于一般的甜类物质。蛋白质和酶是蜂蜜中重要的活性物质，因其具有独特的作用而引起了愈来愈多研宄者的关注。年，等人采用凝胶过滤色谱法（和蛋白质凝胶电泳法对不同地区采集的种不同品种的蜂蜜中的蛋白质进行提取、纯化后发现，利用蛋白质的研宄可以很好地区分蜂蜜的产地及花源种类。年，等人利用二维凝胶电泳法（和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（对种不同品种的单花蜂蜜中的蛋白质进行纯化、分析后发现，蜂蜜中的蛋白质一部分为另一部分为参与碳水化合物代谢的酶类物质。淀粉酶是蜂蜜中最主要的酶类物质，它有淀粉酶和淀粉酶两种形式。等人将棉子蜜中的淀粉酶进行提取纯化后，通过薄层色谱法（对提取的淀粉酶与枯草芽孢杆菌和大麦中的淀粉酶进行比对分析后证实蜂蜜中的淀粉酶为淀粉酶，该酶可以随机分解糖苦键产生麦芽糖和其他的中间产物。由于淀粉酶对热很敏感，世界各国将淀粉酶值作为表征蜂蜜新鲜度、受热损伤的程度及真实性的一项重要指标。等人研究热加工过程对杂花蜜中的淀粉酶活性的影响，发现淀粉酶活性受高 浙江工商大学硕士学位论文温处理时间的影响要比处理温度更显著，研宄结果表明将蜂蜜在°恒温小时后，淀粉酶的损失率达到了，而在恒温小时和恒温小时的过程中，淀粉酶的活性分别降低了和。根据理论，在加热的情况下，酶分子具有足够的动能来克服相互间的排斥力，从而缩短了酶分子之间的距离，进入到一个过渡态。一旦酶分子之间的能障消失，就会引起酶分子结构的改变，从而导致酶分子发生不可逆的变性。酶分子发生变性的程度与通过自由能形成过渡态的酶分子的含量成比例，同时还与加热的强度有关。在较低的加热温度下，只有一小部分酶分子有足够的动能来克服能障，进入到过渡态，而那些没有通过能障的酶分子回到其自然态，使得蜂蜜中酶的催化作用并没有受到很大程度的干扰。然而，增加加热温度会造成更多的酶分子通过能障，使得酶分子变性从而降低了酶的活性。葡萄糖苷酶，又称为称葡萄糖苷水解酶、鹿糖酶和麦芽糖酶，广泛分布在植物、哺乳类动物、昆虫和微生物中。蜜蜂中存在种类型的葡萄糖苷酶，分别为葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖苦酶】。葡萄糖苷酶和对底物的断裂具有别构调节作用，其中葡萄糖苷酶对鹿糖、麦芽糖、对硝基苯葡萄糖苷具有负协同效应，遇到该类底物，葡萄糖苷酶的活性减弱，但遇到松二塘和麦芽糊精等底物时表现出较强的正协同效应；葡萄糖苷酶只对鹿糖、松二糖、曲二糖和可溶性淀粉有正协同效应；然而葡萄糖苷酶并没有这些别构调节作用。等人将意蜂中分离出的种类型的葡萄糖苷酶和蜂蜜中的葡萄糖苷酶比对分析后证实蜂蜜中的葡萄糖苷酶为葡萄糖苷酶，是由蜜蜂的咽下腺分泌产生，在花蜜的采集和酿造过程中混入了该酶，葡萄糖有酶具有水解鹿糖和麦芽糖的作用，将其转化为葡萄糖和果糖在世纪年代初，有研究学者发现蜂蜜中存在葡萄糖氧化酶，此酶可以将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氧。葡萄糖酸是蜂蜜中最主要的酸类物质，而过氧化氧则可以有效抑制大多数细菌的生长这两种物质的存在使得蜂蜜具有一定的抗菌能力和药用价值。蜂蜜中葡萄糖氧化酶的活性受到蜂蜜的黏度、糖分含量和成熟过程中蜜蜂的转化作用的影响。在稀蜜中，葡萄糖氧化酶的活性来源于葡萄糖酸内酷和过氧化氢，但是花蜜成熟为蜂蜜后，葡萄糖氧化酶的活性就被抑制，一旦成熟的蜂蜜被稀释，活性可以增强倍。年，对意蜂的咽下腺里分离出的多个进行研宄，发现部分是用来编码葡萄糖氧化酶的，证实蜂蜜中的这种酶来自于蜜蜂的咽下腺。葡萄糖苷酶，又称葡萄糖苷水解酶，别名纤维二糖酶和龙胆二糖酶它可以水解低聚糖和多糖中结合于末端、非还原性的葡萄糖苷键，同时 浙江工商大学硕士学位论文释放出葡萄糖】。葡萄糖苦酶广泛分布在动物、植物、细菌和真菌中。葡萄糖苷酶根据底物的特异性可以分为三类第一类是既有糖基化葡萄糖脊酶活性，又有芳基化葡萄糖苦酶活性，此类酶可以水解纤维二糖、乳糖、对硝基苯葡萄糖苦、对确基苯半乳糖苦和对硝基苯果糖苦；第二类葡萄糖苷酶只有糖基化葡萄糖苷酶活性，该类酶只能水解纤维二糖和乳糖；第三类葡萄糖苷酶是只有芳基化葡萄糖苷酶活性，该类酶可以水解等类似物。蜂蜜中的葡萄糖苷藤属于第三种类型。等人丨对蜜蜂的咽下腺、蜜囊、中肠中提取的葡萄糖苷酶进行鉴定分析后发现，三种组织纯化出的葡萄糖苷酶属同一种，但在不同部位表现出了不同的活性。他们认为葡萄糖若酶是由蜜蜂的咽下腺分泌到嘴里，在蜜蜂进食过程中随着食物转移到了蜜囊中。随后，在蜜蜂对采集的蜂蜜进行吞吐酿造的过程中，蜜囊中一部分葡萄糖苷酶混入到了蜂蜜中，另一部分则转移到了中肠中，利用中肠对食物进行进一步的消化吸收。张翠萍等人研宄发现新鲜采集的蜂胶中具有比较强的葡萄糖苷酶活性，而在随机购买的市售蜂胶中几乎不存在葡萄糖苷酶，并且通过分析证实蜂胶中葡萄糖苦酵活性会随着存时间的延长而急剧下降。因此他们认为可以将葡萄糖昔酶活性的测定作为评判蜂产品新鲜度的一项指标。蛋白质和酶是蜂蜜与生俱来的特征性成分，它们在蜂蜜中的作用主要是防御外源微生物的入侵和参与碳水化合物的代谢，其中酶类的存在是花蜜向蜂蜜转变的必要条件，它使蜂蜜中碳水化合物的组成结构高度复杂化。并且，酶类的活性可以很好地反应蜂蜜的新鲜度、成熟度及热加工处理和储存条件对蜂蜜造成的影响，因此测定蜂蜜中生物酶的活性对蜂蜜产品的生产、质量的控制、市场的监管具有重要的意义。然而，现有大多数研宄单纯关注不同品种蜂蜜中的蛋白质及酶活性的差异，而对于花蜜成熟为蜂蜜的过程中，有关蛋白质和酶类变化规律的报道还很少，因此研究蜂蜜在酿造过程中，蛋白质和酶类的变化对于蜂蜜的生产和加工具有重要的指导作用。蜂蜜中的糖类物质蜂蜜的主要成分是糖类物质，约占总成分的。蜂蜜的这些糖分以单糖为主，即葡萄糖和果糖，通常占蜂蜜总成分的以上。此外，蜂蜜中还含有一些含量比较少的寡糖，如鹿糖、麦芽糖、松二糖、曲二糖、异麦芽酮糖、新海藻糖、黑曲霉糖、昆布二糖、蜜二糖、龙胆二糖、异麦芽糖等双糖，及一些三糖，如麦芽三糖、松三糖、棉子糖和卩比喃葡糖基鹿糖，同时还存在一些四糖、五糖蜂蜜中糖分的种类及含量与蜜源植物的品种、 浙江工商大学硕士学位论文地域环境及采蜜季节有关，同时也受到蜂蜜酿造过程的影响。这些糖分的存在使得蜂蜜具有比较高的粘性、吸湿性和能量值。其中有很大一部分寡糖并不存在于花蜜中，但都在蜂蜜中检测到了这些糖分的存在，因此这些糖类物质很可能是在蜂蜜成熟过程中，通过蜜蜂的分泌物与花蜜含有的酸类物质的共同作用而转化形成的。寡糖亦称低聚糖，是由两个或两个以上单糖单位通过糖苷键相连而成的糖类物质，根据参与组成的单糖单位的数量，可将寡糖分为双糖（如鹿糖、麦芽糖）、三糖（如棉子糖）、四糖、五糖和六糖等。年，通过研究报道，寡糖主要存在于植物中，并且已知的寡糖有余种寡糖主要具有以下几个方面的作用：（不易被人体消化吸收，而能被肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌消耗利用，从而可以促进这些益生菌的增殖，增强机体的免疫功能可以有效抑制腹湾，并保护胃肠道、呼吸道、泌尿生殖器不被感染；（可增强机体对矿物质的吸收，并有效降低血清中胆固醇和甘油三酷的含量，减少糖尿病、肥胖症和恶性肿瘤的发生率；（不被齿禹齿菌形成基质，也没有凝结菌体作用，可防顧齿。其中，寡糖可以促进肠道益生菌生长的作用尤为显著。等人对蜂蜜中的寡糖进行提取，利用体外发酵系统研究蜂蜜寡糖的益生作用，并结合统计学分析法发现蜂蜜中的寡糖可以有效促进双歧杆菌和乳酸杆菌、的增殖，说明蜂蜜中含量较少的寡糖可以有效促进益生菌的生长，从而增强人体的抵抗能力。也有研宄发现，蜂蜜具有润肠通便的功效，而这很可能来自蜂蜜中寡糖的作用。近几年，有关蜂蜜中糖分的研宄方兴未艾，愈来愈受到研宄者的重视。年，等用高效阴离子交换色谱脉冲安培检测法（对新西兰的麦卢卡蜂蜜、石楠花蜂蜜、苜蓿蜂蜜、山毛榉蜂蜜中的糖分进行分析，发现不同品种蜂蜜中含有的寡糖含量存在显著的差异。年，等利用高效液相色谱示差折光法（对个不同地区生产的巴西蜂蜜中的糖分进行研宄，发现在种纯蜂蜜中检测出了种主要的双糖，并且通过分析得出产自东南部地区的蜂蜜中的麦芽糖含量（明显低于东北部地区（、中西部地区（和北部地区（生产的蜂蜜，同时发现黑曲霉糖、松二糖和麦芽三糖在不同地区蜂蜜中的含量也存在显著的差异。年，等人利用对蜂蜜储存温度对糖分变化的影响进行研究，发现两种主要的单糖和部分双糖的含量随着温度的增加而呈下降的趋势，然而也有部分寡糖含量在较高温度下储存后显著上升，如松二糖和曲二糖。他们认为蜂蜜中一些寡糖的产生主要有两方面的原因，一是蜂蜜中某些葡萄糖苷酶的转糖基作用，二是某些单糖 浙江工商大学硕士学位论文的化学转变作用。年，等人利用超高效液相色谱蒸发光散射检测法对纯蜂蜜与掺有低聚麦芽糖的蜂蜜中的糖分进行分析，提出蜂蜜中的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖的含量最高可为、、、、和，一旦蜂蜜中低聚麦芽糖的量超过该值，则可将蜂蜜视为掺假蜂蜜。由此可见，国内外对蜂蜜中糖分的研宄成果很多，但是大多数的研宄局限于通过分析糖分的种类及含量来区分蜂蜜的蜜源植物和产地，以此来作为评判蜂蜜真实性的依据。而对于蜂蜜在醜造过程中，糖分变化的研宄还很少，对特征性糖分产生的研宄报道更是寥寥，因此研宄蜂蜜中糖分在酿造过程中的变化具有重要而实际的意义。课题研究的目的及意义我国蜂蜜的生产及销售由于受到养蜂技术落后、经济利益驱使、消费者科学意识淡薄等多方面因素的影响，使得蜂蜜产品出现成熟度不高、品种混乱、品质不佳等质量问题，其中生产不成熟蜂蜜问题尤为突出。然而，大部分的试验并没有对花蜜成熟为蜂蜜的整个醜造过程进行研究，而是单纯地在某个时间点上研宄不同品种蜂蜜的组成及组分的含量来区分蜂蜜的蜜源植物品种或产地，以此作为判别蜂蜜真实性及品质的依据。然而，有研究表明蜂蜜的酿造是一个极其复杂的过程，其中特征性成分的变化对其品质的鉴定具有重要的理论指导作用。因此，我们研究蜂蜜在酿造过程中蛋白质和糖分的变化，这对科学指导蜂农养蜂、鼓励生产天然成熟蜜、完善蜂蜜品质检测、规范蜂蜜市场的管理具有重要的现实意义。课题研究的内容及方法本课题的主要研宄对象为个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜，由于蜂蜜的酿造受到蜜源植物的花期、蜂群势力、天气情况等因素的影响，使得蜂蜜样品的采集受到一定条件的限制，造成样品的差异性较大。因此本次采样是由本课题组于浙江湖州长兴汝民蜂业公司在严格控制时间等因素下现场釆集，并在之后的研究中与种不同品牌的市售油菜蜂蜜进行对比分析。本次课题对个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜样品的项理化指标（水分含量、可溶性固形物含量、值、电导率）和种生物酶（淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、 浙江工商大学硕士学位论文葡萄糖苷酶）活性进行测定，并釆用对这些指标进行单因素方差分析（差异显著水平设为，以确立蜂蜜成分在酿造过程中的变化情况。在蜂蜜蛋白质和酶的研究中，本次课题采用十二院基磺酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（技术对天然油菜蜂蜜和市售蜂蜜中的蛋白质进行分析，并对天然油菜蜂蜜中的主要蛋白质进行鉴定。本次课题通过高效液相色谱蒸发光散射检测法（对个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜中的糖分进行定性及定量分析，试图了解蜂蜜酿造过程中糖类的分布及部分寡糖产生的原因。本课题对所有测定的数据（理化指标、生物酶酶值、蛋白质及酶的种类及糖类成分）进行整合，分析蜂蜜在酿造过程中酶值的变化规律与特征性糖分之间的关系。 浙江工商大学硕士学位论文第章天然油菜蜂蜜在酿造过程中理化特性和酶活性的研究蜂蜜是蜜蜂将采集的植物花蜜或蜜露与自身分泌物混合后，在蜂巢内经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中的成分是糖类物质，主要是果糖和葡萄糖，还有一些含量较少的蛋白质、酶类、有机酸、矿物质、维生素和挥发性物质。这些成分受到蜜源植物种类、放蜂环境、蜂蜜成熟过程等因素的影响，它们在一定程度上通过蜂蜜的一些理化特性表现出来，如水分含量、可溶性固形物含量、值、电导率等。蜂蜜中含有多种酶类物质，主要有淀粉酶、葡萄糖苦酶（转化酶）、葡萄糖氧化酶和葡萄糖苦酶。这些酶很大一部分是由蜜蜂的咽下腺或消化腺分泌，而另一部分来源于花粉或花蜜。它们在蜂蜜中的催化作用使得蜂蜜具有独特的性质和功效，如转化酶可以将蜂蜜中的鹿糖转化为更利于人体吸收的葡萄糖和果糖，而葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖产生过氧化氢，起到很强的抗菌作用。本章对个不同醜造天数的天然油菜蜂蜜中的项理化指标及主要生物酶的活性进行了研宄分析，希望找到它们之间存在的关系。材料与仪器材料蜂蜜样品本章共采用个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜样品，均于浙江湖州长兴汝民蜂业公司现场采集，见表。所有样品在分析前均：存于低温冰箱中。在油菜花盛幵期，随机选定几片油菜田作为实验区。年月日购置了箱蜜蜂置于实验区，月日凌晨将所有蜂箱中的蜜脾清空，幵始计时。实验所需的不同酿造天数的蜂蜜样品均为傍晚点现场采集，分装到塑料瓶中后立即置于冰箱中存。 浙江工商大学硕士学位论文表蜂蜜样品信息酿造天数采集时间采集天气采集温度封盖情况年月日天年月日多云天年月日晴°天年月日晴°天年月日晴°天年月日晴°天年月日多云°天年月日晴°出现封盖天年月日阴°小部分封盖天年月日多云°小部分封盖天年月日晴°—半封盖天年月日多云°大部分封盖天年月日多云大部分封盖天年月日晴°基本封盖天年月日晴完全封盖注：表示未封盖。试验试剂对硝基苯基批喃葡萄糖昔、对硝基苯基批喃葡萄糖苦、对硝基苯粉（美国公司）；典，碘化钾，乙酸钠，冰醋酸，氯化钠，可溶性淀粉，磷酸二氢钾，二水合磷酸氢二钠，三经甲基氨基甲烧，盐酸，过氧化氢，高猛酸钾，靛蓝胭脂红，乙酸，梓檬酸，无水碳酸纳，均为国产分析纯。试验仪器与设备数字阿贝折射仪（上海精密科学仪器有限公司）；台式酸度计（新加坡优特仪器有限公司）；电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器莎蹄厂）；紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；先行者分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；超纯水机美国公司）；型超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司）。试验方法水分含量的测定参考中规定的方法，采用阿贝折射仪在室温下进行测 浙江工商大学硕士学位论文定，根据表进行查阅，实验结果用％表示。表水分含量与折射率关系表書办“肪郷棚明棚啦姆雜銘现热騰乃猶初结果计算：（若室温°，°若室温°，°式中：—室温—蜂蜜样品在室温下的折光率°下样品折光率根据换算所得的°査表得到蜂蜜样品的水分含量。可溶性固形物含量的测定可溶性固形物含量，即样品的锤度，采用阿贝折射仪进行测定，数值可以直接由仪器读出，结果用表示。值的测定参考等人丨】的方法，准确称取蜂蜜样品溶解在去二氧化碳的水中，搅拌均匀后用计进行测定。电导率的测定 浙江工商大学硕士学位论文参照的方法】，称取相当于的无水蜂蜜，用超纯水定容至在用电导仪测定其电导率，结果用表示。淀粉醜活性的测定参照蜂蜜的淀粉酶值是指蜂蜜所含淀粉酵在：条件下，内可转化淀粉溶液的毫升数，结果用表示。蜂蜜中若存在淀粉，将淀粉溶液加入蜂蜜样品溶液中，部分淀粉会被蜂蜜中所含的淀粉酵水解，剩余的淀粉与加入的碘溶液反应而产生蓝紫色，随着反应的进行，其蓝紫色反应逐渐消失。用分光光度计于波长处测定其达到特定吸光度所需要的时间即可换算出淀粉酶的酵值。葡萄糖苷醜活性的测定参考丨的方法，结果用表示。对硝基苯基啦喃葡萄糖苷（作为测定转化酶酶活的底物，易被分解为葡萄糖和对硝基粉。将反应物的调为，则反应立即终止，对确基酌被转变为对确基紛阴离子，相当于的转化量，从而通过测定波长下的吸光度即可得到转化酶的酶值。试剂的制备磷酸盐缓冲溶液准确称取和，用超纯水溶解后，转移至容量瓶，并定容。对硝基苯基卩比喃葡萄糖昔（：准确称取的，用磷酸盐缓冲液溶解，定容至。由于微溶于水且不稳定，可加热溶解°后立即冷却。反应终止液（：准确称取三经甲基氨基甲烧，用超纯水溶解后，定容至。用盐酸调为。样品溶液：避光条件下准确称取蜂蜜，用少量憐酸盐缓冲液溶解后，转移至棕色容量瓶中，并用磷酸盐缓冲液定容。具体操作准确移取溶液到试管中，恒温后，吸取蜂蜜样品溶液加入到试管中混勻，开始计时。将混合物在°下恒温后，加入反应终止液终止反应，立即冷却 浙江工商大学硕士学位论文至室温，每个样品做次平行。对照组：吸取溶液到试管中，在：恒温后，先加入终止液终止反应，混匀之后再加入蜂蜜样品溶液，立即冷却至室温。以对照组为参比，在波长下测定吸光度，后读数。计算公式：，表示在测定条件下，每蜂蜜中所含有的转化酶在内水解鹿糖的量（。葡萄糖氧化酶值的测定参考胡虹的方法蜂蜜的葡萄糖氧化酶值是指蜂蜜中所含葡萄糖氧化酶在°条件下、内氧化葡萄糖产生过氧化氢的微克数。本实验采用褪色光度法测定氧化产生的痕量过氧化氧，进而推测出蜂蜜中葡萄糖氧化酶的酶值。葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖氧化产生过氧化氢和葡萄糖酸，在加热的条件下，使反应产生的过氧化氢直接与靛蓝胭脂红在的乙酸乙酸钠缓冲溶液中发生褪色反应，其反应速度在一定范围内与过氧化氧的浓度成正比，因此通过测定褪色反应速度即可测定过氧化氢的浓度，进而测定葡萄糖氧化酶值试剂的制备过氧化氢标准溶液：将的过氧化氢溶液配制成的备液，用高猛酸钾标准溶液标定，可于°下避光保存一周。临用时将其稀释为的工作液。餘蓝胭脂红溶液（：准确称取靛蓝胭脂红粉末，用超纯水溶解后，立即转移至棕色容量瓶中，并定容。乙酸乙酸钠缓冲溶液（：由的乙酸和的乙酸钠溶液混合而成，调节值为。蜂蜜样品溶液：准确称取蜂蜜样品，用超纯水溶解后转移到棕色容量瓶中，并定容。具体操作标准曲线的绘制：准确吸取、、、、、、过氧化氢标准溶液，分别置于具塞比色管中，加入乙酸乙酸钠缓冲液和靛蓝胭脂红溶液，稀释至刻度，摇勾后置于沸水浴中加热后取出，立即冷却至室温，终止反应，在波长下以超纯水做参比测定吸光度，绘制标准曲线。样品溶液测定：将蜂蜜样品溶液置于°中水浴后，准确吸取蜂蜜溶液按照上述方法测定过氧化氢的含量，从而测定葡萄糖氧化酵的酶值，每个样品做 浙江工商大学硕士学位论文次平行。葡萄糖苷酶值的测定参考易松强的方法。蜂蜜中的葡萄糖苦酶的酶活力为每克蜂蜜每分钟催化形成对硝基苯酷所需要的酶量。以对硝基苯基葡萄糖苗为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对摘基苯紛可用分光光度计进行比色测定。试剂的制备对硝基苯基葡萄糖苦：准确称取于小烧杯中，用少量超纯水溶解后，转移至容量瓶中并定容。梓檬酸磷酸氢二钠缓冲液（：由的貯檬酸溶液和的磷酸氢二钠溶液混合而成，调节值为。溶液：准确称取无水碳酸钠于烧杯中，用少量的超纯水溶解后，转移至容量瓶，用水洗漆烧杯次，用超纯水定容。对硝基苯紛：精确称取对硝基苯酌，用超纯水溶解后，定容到。蜂蜜样品溶液：准确称取蜂蜜于烧杯中，用少量梓樣酸憐酸氢二钠缓冲液溶解后转移至棕色容量瓶中，并用缓冲液定容。具体操作对硝基苯酌标准曲线的绘制：按表分别吸取不同体积的对硝基苯紛，用梓檬酸磷酸氢二钠缓冲液（稀释成一系列浓度，然后测定波长为下的吸光度，绘制标准曲线。表不同浓度对硝基苯酌的吸光度表浓度（缓冲样品溶液测定：准确吸取样品溶液和对硝基苯基葡萄糖苦（于试管中，混勾后置于°水浴中恒温后，加入的溶液，终止反应，立即冷却至室温，每个样品做次平行。 浙江工商大学硕士学位论文对照组：在试管中加入蜂蜜样品溶液和的，混勾后立即置于沸水浴中加热，然后加入的溶液，终止反应，立即冷却至室温。在波长下以对照组为参比测定样品溶液的吸光度，计算蜂蜜中葡萄糖苦酶的酶值。结果与讨论蜂蜜理化指标结果分析每个蜂蜜样品的理化指标平行测定次，结果用平均值±标准偏差表示，见表。表蜂蜜样品的理化指标水分含量可溶性固形物含量电导率酸造天数咖）天±±±天±±±±天±±士。±天±±±±天±±±±天士±±±天牡±±±天±士±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±注：肩标小写字母不同表示有显著性差异（；肩标小写字母相同表示不存在显著性差异（〉。由表可知，蜂蜜样品的水分含量随着蜂蜜酿造天数的增加由显著下降到。蜂蜜的水分含量是表征蜂蜜成熟度的一个重要指标，蜂蜜国标⑴中规定，除蒸枝蜜、龙眼蜜、批橘蜜、鹅掌柴蜜、乌桕蜜外，其余品种蜂蜜中的水分含量至少。蜂蜜中水分含量过高容易引起酵母菌的发酵而使得蜂蜜变质，目前，很多蜂农和生产加工商由于受到经济利益的驱使，出现“三天一摇蜜”甚至“每天取蜜“的现象，由研究 浙江工商大学硕士学位论文结果可知，酿造天数短的蜂蜜中的水分含量远没有达到规定的标准，生产加工商必须对蜂蜜进行加工浓缩才能出售，然而加工热处理的过程必然会造成蜂蜜品质大大下降。在表中，试验结果显示蜂蜜样品中的可溶性固形物含量的变化趋势与水分含量相反，而是随着蜂蜜醜造天数的延长而显著增加（。我们对蜂蜜中的水分含量与可溶性固形物含量之间的关系进行分析后发现，水分含量与可溶性固形物含量之间呈负相关图，说明蜂蜜中的可溶性固形物的含量随着水分含量的减少而显著增加。同时，试验结果表明酿造时间长的蜂蜜中的电导率值相对比较低，我们将水分含量与电导率进行线性拟合后，发现两者之间也存在较好的相关性（图，。蜂蜜的电导率取决于蜂蜜中拥有的导电离子数，这些离子主要来自水电离的和、有机酸电离的和以及一些矿物质离子（如、和当蜂蜜的水分含量较低时，分子与分子之间、分子与离子之间、以及离子与离子之间的作用力较大，带电离子的运动受到了约束，表现为有机酸表观电离度小，自由离子的活度也变小，使得蜂蜜的电导率较小导：“§■■‘■■■■■■‘■图水分含量与可溶性固形物含量线性拟合 浙江工商大学硕士学位论文■————‘‘‘——图水分含量与电导率线性拟合由表可以看出，所有的蜂蜜样品都有比较强的酸性，蜂蜜在巢脾中酿造的前期，值由显著增加到，造成这种现象的原因可能是蜂蜜中的酸此时还不能稳定存在。而从第天开始，直至蜂蜜完全成熟的过程中，蜂蜜的并没有发生显著性的变化（〉。根据蜂蜜现场采集的情况，酸造天数为天的蜂蜜刚好开始出现封盖。封盖蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾内经充分酿造至封盖而成的蜂蜜，这种蜂蜜具有很高的营养价值和很长的保质期。试验结果说明蜂蜜达到一定的成熟度后，其值不易受到外界因素的影响。因为蜂蜜的酸度可以影响其质地、粘稠度及货架期等方面所以研宄值对评价蜂蜜的品质具有重要的意义。蜂蜜酶活性的分析每个蜂蜜样品的酶活性平行测定次，结果用平均值土标准偏差表示，见表。—：：；■■■—■‘柳图过氧化氢标准曲线图对硝基苯酸标准曲线 浙江工商大学硕士学位论文表蜂蜜样品的活性西电、生；教淀粉酶值”葡萄糖苷酶值葡萄糖氧化酶值葡萄糖苗酶值天±±±±天±±士±天±±±士天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±±±±天±土±±蜂蜜中含有多种酶类物质，主要有淀粉酶、葡萄糖昔酶（转化酶）、葡萄糖氧化酶和葡萄糖若酶。其中淀粉酶值可以作为衡量蜂蜜新鲜度、成熟度、加工热处理程度和储存条件的重要指标。淀粉酶可以分解低聚糖和多糖中的糖苷键，该酶酶值的高低直接影响蜂蜜的品质，它是目前世界各国通用的用于表征蜂蜜中淀粉酶活性和蜂蜜生物活性的重要指标我们对个蜂蜜样品中的淀粉酶值进行测定发现，随着蜂蜜酿造天数的增加，淀粉酶值由显著增加到。有研宄证实蜂蜜中的淀粉酶来自于蜜蜂的咽下腺，咽下腺分泌的所有蛋白质中有的成分是淀粉酶】。蜂蜜在巢脾内酿造的过程中，因为要经过蜜蜂的不断吞吐作用，期间混入了蜜蜂分泌的淀粉酶。根据峰蜜标准对蜂蜜中淀粉酶值的规定，除荡枝蜜、龙眼蜜、柑橘蜜、鹅掌柴蜜的淀粉酶值之外，其他品种蜂蜜的淀粉酶值必须。由表可得知，所有蜂蜜样品的淀粉酶值都达到了规定的标准。但由于现在蜂蜜加工商收购的原料蜂蜜的成熟度很低，含水量非常高，为了使出售的蜂蜜具有更好的货架期和感官品质，必须对原料蜂蜜进行加工处理，由于淀粉酶对热很敏感，这势必会对蜂蜜中的淀粉酶值造成很大的影响。但为了达到标准规定的淀粉酶值，一些不法商贩就会往蜂蜜里添加耐高温的人工淀粉酶，如诺维信淀粉酶这说明仅用淀粉酶值的高低来判断蜂蜜的品质还存在一定的缺陷，需要 浙江工商大学硕士学位论文我们对其他几种酶的活性进行进一步的研宄。由表可知，蜂蜜中的葡萄糖苷酶（转化酶）和葡萄糖苗酶随着蜂蜜在巢脾中醜造时间的延长，活性呈显著增加的趋势（。转化酶可以催化蔗糖、麦芽糖、松三塘、棉籽糖、蜜二糖、海藻糖转化为更利于吸收的葡萄糖和果糖由于其对热非常敏感，转化酶值可以很好地反应蜂蜜的新鲜度及其受加工处理的影响程度。有研究学者对蜂蜜中转化酶的耐热性质进行研宄，发现转化酶的热稳定性比淀粉酶低，因此建议将转化酶值来替代淀粉酶值作为判定蜂蜜品质的一项标准。同时，我们发现葡萄糖脊活性的变化趋势与转化酶类似。葡萄糖苦酶可以水解低聚糖或多糖释放出葡萄糖，它参与生物体的糖代谢，对于维持生物体正常的生理功能起着重要的作用易松强等人对浙江平湖采集的种波美度蜂蜜中的葡萄糖苦酶活性进行测定分析，试验结果表明波美度与波美度蜂蜜中葡萄糖酶活性之间并不存在显著性差异（，分别为和，但发现波美度为度蜂蜜的葡萄糖苷酶活性明显高于前两种浓度的蜂蜜，显著增加到了这说明蜂蜜的酿造过程对蜂蜜中的葡萄糖苷酶活性有很大的影响。蜂蜜中的葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖转变为葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖酸是蜂蜜中最主要的酸类物质，而可以抑制大多数细菌的生长这两种物质使得蜂蜜具有很强的抗菌能力和药用价值。我们在表中发现，在蜂蜜成熟过程的前期，葡萄糖氧化酶活性有下降的趋势。人为葡萄糖氧化酶在稀蜜中具有比较强的活性，但是蜂蜜成熟后，该活性被抑制，一旦成熟蜜被稀释，葡萄糖氧化酶的活性可以明显增强。但由于现在市售的蜂蜜都经过热加工处理，使得葡萄糖氧化酶活性大大下降，从而严重影响了蜂蜜的抗菌能力。等人通过研究证实照射射线可以很好地起到杀菌的效果，同时还不会引起蜂蜜葡萄糖氧化酶活性的下降，因此可以考虑对蜂蜜进行照射射线来达到灭菌的效果。试验结果表明蜂蜜中的淀粉酶活性、葡萄糖苗酶（转化酶）活性、葡萄糖苷酶活性都随着蜂蜜酿造时间的延长而显著增强，我们对三者之间的相关性进行分析后发现，淀粉酶值与葡萄糖昔酶值之间存在很好的相关性（图，。在等人的研宄中也出现了类似的结果，他们对种未加工的市售蜂蜜的淀粉酶和转化酶的活性进行研究发现，两种酶的活性分别在和之间变动，并且分析得到淀粉酶值和转化酶值之间存在较好的相关性（。同时，我们分别对葡萄糖苗酶值与淀粉酶值及葡萄糖苷酶值之间的关系也进行了分析，发现均存在较好的 浙江工商大学硕士学位论文相关性（图和图。因此，我们认为蜂蜜中的生物酶之间存在一定的关联，在蜂蜜酿造的过程中存在相同的变化趋势，即我们可以通过检测其中一种酶的活性来预测其余几种酶。“香■■丄■■‘‘‘■‘‘图淀粉酶值与葡萄糖苷酶值线性拟合。：护乂■■产■‘‘■‘■图淀粉酶值与葡萄糖苷值线性拟合 浙江工商大学硕士学位论文§乂‘—‘‘—‘—‘图葡萄糖苷酶值与葡萄糖苷值线性拟合本章小结通过对个不同酿造天数蜂蜜中的理化指标测定后，结果表明酿造天数短的蜂蜜中的水分含量普遍偏高，超出了有关标准，这将导致该类蜂蜜出现酸败变质而不易储藏。然而出现封盖的蜂蜜中的水分含量满足国家标准，并且在其酿造的后期，蜂蜜中的值趋于稳定。同时，我们还发现蜂蜜中的水分含量与可溶性固形物含量及电导率之间存在较好的相关性。而后，本章分别对不同酿造天数蜂蜜中的种主要生物酶的活性进行测定分析后，发现所有样品的淀粉酶值都达到了有关规定，并且葡萄糖苦酶活性和葡萄糖苷酶活性在蜂蜜酿造过程中的变化趋势与淀粉酶活性一致，都随着酿造天数的增加而显著增强。但是我们惊奇地发现，葡荀糖氧化酶活性与其他种酶的变化趋势略有不同，在蜂蜜酿造过程的前期，该酶活性缓慢下降，但是随后又显著升高。我们将变化趋势一致的种酶之间的关系分析后发现，淀粉酶值、葡萄糖苷酶值及葡萄糖苷酶值之间都存在较好的相关性，故我们认为可以通过检测其中一种酶的活性来预测或评估蜂蜜中其余几种酶。 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文第章油菜蜂蜜中蛋白质的研究蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾内经转化、脱水、存至成熟而成的天然甜物质。蜂蜜中存在多种生物活性物质，主要是蛋白质，含量大约为，这些物质大部分是由蜜蜂自身分泌产生，还有一小部分是来源于花蜜或花粉，它们在蜂蜜中的作用主要是参与碳水化合物的代谢和防御外源微生物的入侵蛋白质是蜂蜜与生俱来的特征性成分，但是大量的研宄通过测定蜂蜜的一些基本理化指标和主要物质，如糖类、挥发性有机酸、类黄酮、紛类物质来鉴定蜂蜜的品质，而忽略了含量甚微的蛋白质的研究。目前，通过分析不同品种蜂蜜中的蛋白质谱图差异来辨别蜂蜜的花源和鉴定蜂蜜的品质己成为大部分研宄关注的焦点，而在本章的研宄中，我们以蛋白质为切入点，采用聚丙稀酷胺凝胶电泳技术对比蛋白质谱图差异，并联用质谱分析技术对代表性蛋白质进行鉴定分析，以期找到蜂蜜在酿造过程中蛋白质的变化规律，并从蛋白质的角度将天然油菜蜜和加工浓缩蜜加以区分。材料与仪器试验材料蜂蜜样品本章共釆用个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜样品（均于浙江湖州长兴汝民蜂业公司现场采集，同和种不同品牌的市售油菜蜂蜜样品，见表。所有样品在分析前均存于低温冰箱中。 浙江工商大学硕士学位论文表蜂蜜样品信息蜂蜜属性样品编号产地采集时间生产日期天然油菜蜜浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日天然油菜蜜天浙江湖州年月日市售油菜蜜湖北黄丙年月日市售油菜蜜浙江杭州年月日市售油菜蜜上海年月日市售油菜蜜浙江宁波年月日市售油菜蜜江苏昆山年月日试验试剂牛血清白蛋白（纯度、考马斯亮蓝、美国公司）；电泳蛋白质美国公司）；十二院基硫酸钠、过硫酸铵、甘氨酸、溴酷蓝、巯基乙醇、丙稀酰胺溶液、考马斯亮蓝、、上海生工生物工程公司；乙腈、三氟乙酸（德国公司）；美国公司；其余试剂均为国产分析纯。仪器与设备型超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；先行者分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；蛋白质电泳仪（美国公司）；台式高速冷冻离心机美国公司）；紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；凝胶成像仪（美国公司）；美 浙江工商大学硕士学位论文国公司）；电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器莎蹄厂）；超纯水机美国公司）。试验方法蜂蜜蛋白质的提取准确称取蜂蜜样品，将其溶解在超纯水中，低温高速离心（，以除去花粉颗粒。收集上清液，采用硫酸铵沉淀法冰浴沉淀蛋白质，磁力搅拌后，以的转速离心，获得沉淀，将其定容到，存于°冰箱备用。蜂蜜蛋白质含量的测定测定蛋白质含量的方法有很多，主要有双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、紫外吸收法。本章采用法测定蛋白质含量。测定法是根据考马斯亮蓝蛋白质浓度检测法改进而来的，这种方法的特点是简便迅速、灵敏度高以及消耗样品量少，并且反应物可以稳定小时。其实验原理是在酸性条件下考马斯亮蓝能与蛋白质通过范德华键结合，使最大吸收峰从变为，在蛋白质浓度范围内符合朗伯比尔定律，波长处蛋白质溶液的吸光度与蛋白质含量成比例，所以采用该方法测定蜂蜜中蛋白质的含量。电泳测定蛋白电泳即十二烧基磺酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳。在一般蛋白电泳中，蛋白质会受到电荷等其他因素的影响，但是我们在中加入了阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，与蛋白质的疏水部分结合成蛋白胶束，在强还原剂（如巯基乙醇和二硫苏糖醇）存在的条件下，使蛋白质络合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，其电泳迁移率主要取决于它的相对分子量，从而排除了电荷，蛋白质形状等影响，当蛋白质的分子量在到之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。具体操作：固定玻璃板，插入制胶梳，在离梳齿底处用记号笔标记一横线，然后将梳子取出备用。配制分离胶（配方见表，混合均勾后立即沿壁注到制胶板中（尽可能不要有气泡）直至标记的横线处，再沿壁缓缓加入超纯水压胶液面。聚合约分钟，待出现一明显的分界线后，将水倒去并用滤纸吸干制胶板内的超纯水； 浙江工商大学硕士学位论文配制浓缩胶（配方见表，混合均勾，立即注入到制胶板中（位于分离胶之上），液面达到短板顶部即停止注入，插入制胶梳，静置，使浓缩胶充分聚合分钟；将制胶梳轻轻拔出，用电泳缓冲液洗漆加样槽，赶走气泡，之后将胶转移到垂直电泳槽中；加入电泳缓冲液，电泳缓冲液液面应漫过内槽的玻璃板高度，但又低于外槽的玻璃板高度；样品预处理：蜂蜜蛋白质提取液与上样缓冲液（，甘油，溴酹蓝，巯基乙醇，混合，°加热，离心将和预处理后的蛋白样品液依次加到上样孔中，每孔先在初始电压下使样品跑到浓缩胶与分离胶的界面上，大约需要，之后调至，恒压跑至漠酷兰指示界面离分离胶底部处。电泳结束后把胶剥出置于染色液中，于摇床（约上染色。之后将胶转移到脱色缓冲液中，于摇床（约上脱色，分次，每次分钟。最后将胶置于凝胶成像仪中成像拍照、测量距离，计算分子量。表分离胶和浓缩胶配方分离胶浓缩胶丙稀酰胺丙稀酰胺”⋯卿过硫酸铵过硫酸按分析经检测后的蛋白样品交由上海生工生物工程股份有限公司进行质谱分析。检测基本流程：胶内酶切—抽提酶解肽段—脱盐—质谱分析—质谱原始数据—数据库搜索 浙江工商大学硕士学位论文主要测试参数：检测光源：激光源，波长检测方式：正离子，反射检测（加速电压样品紀：基质：数据库选择：数据库结果与讨论天然油菜蜂蜜的蛋白质含量变化分析。‘‘图标准蛋白溶液的标准曲线表不同酿造天数的天然油菜蜂蜜蛋白质含量变化酿造天数蛋白质，酿造天数蛋白质含量酿造天数蛋白质含量；天±天±天±天±天±天±天±天±天±天±天±天±天士天士天士 浙江工商大学硕士学位论文由表可知，天然油菜蜂蜜的蛋白质含量范围为随着蜂蜜酿造天数的不断增加，蜂蜜中蛋白质含量呈显著增加的趋势（。其原因是花蜜成熟为蜂蜜的过程是由蜜蜂来完成的，蜜蜂不断吞吐蜂蜜并振翅挥发水分使得蜂蜜成熟，随着蜜蜂吞吐次数的增加，蜜蜂自身分泌的蛋白质也不断混入到蜂蜜中。比较不同醜造天数蜂蜜中的蛋白质含量可得，虽然蜂蜜的蜜源植物相同，但由于酿造天数不同，导致蛋白质含量有明显的差异，这说明蛋白质含量可以很好地表征蜂蜜自然成熟的程度。天然油菜蜂蜜的蛋白质电泳图谱分析对个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜进行十二院基擴酸钠聚丙炼酷胺凝胶电泳（测定，结果表明不同酿造天数蜂蜜的蛋白质的种类及组成并没有存在差异（图，其原因可能是这些蛋白质都是由蜜蜂自身分泌，在蜜蜂对蜂蜜进行吞吐、转化的过程中，分泌的蛋白质不断混入到蜂蜜中。电泳图谱显示主要由条蛋白谱带构成，相对分子质量分别约为、、、、、。虽然没有发现特殊的蛋白谱带，但由图可知，谱带的颜色深浅有差别，这与蛋白质的含量有关。天天天天天天天天天天天天天天天★■？、仏“簽權！園象纖驗■漏瞻，图不同酿造天数的天然油菜蜂蜜的蛋白质电泳图类似的结果也出现在等人的研宄中，他们对栗子蜜、向日葵蜜、桉树蜜、橘蜜和刺槐蜜中的蛋白质进行提取和电泳分析后发现，种蜂蜜的蛋白谱带组成很一致，都分布在范围内，最主要的两个谱带在和处出现，谱带之间唯一的差别就是谱带颜色略有不同。之后他们对主要蛋白质进行质谱鉴定分析发现种蜂蜜中，除了一种甘油酸磷酸脱氢酶来自于蜜源植物外，其余蛋白质均是由蜜蜂分泌产生。 浙江工商大学硕士学位论文市售油菜蜂蜜的蛋白质含量与电泳图谱分析对种市售的油菜蜂蜜中的蛋白质含量测定结果显示（表，蛋白质含量相差最多的有倍之多，蜂蜜中蛋白质含量最高，为±，但与天然成熟的油菜蜂蜜中的蛋白质含量之间还是存在一定的差异。这些结果与等人的研宄结果相似，他们对种未经加工的天然夏威夷蜂蜜和种市售的夏威夷蜂蜜进行分析发现，未经加工的蜂蜜中的蛋白质含量很接近，在之间，而市售蜂蜜中的蛋白质含量则很低，有的甚至显示未检出。表市售油菜蜂蜜蛋白质含量变化蜂蜜品牌蛋白质含量±±士±土同时，我们又将市售油菜蜂蜜与醜造天数为天的天然油菜蜂蜜的蛋白质谱图进行比对分析，选择天的原因是现在蜂蜜生产商收购的原料蜜的醜造天数最多为天。根据图可以明显看出，市售蜂蜜的蛋白质组成发生了一定的变化，有种蜂蜜表现出了与天然蜂蜜类似的条带，大约在、、、陆续出现，其中蜂蜜与天然油菜蜂蜜在谱带条数和颜色深浅上最接近，而及蜂蜜的条带颜色非常浅，这些现象是蛋白质含量差异造成的。试验结果说明不同品牌的商品蜂蜜中蛋白质种类与含量存在较大的差异，其原因在于原料蜜的成熟度不同以及加工中可能存在人为因素。辦鳳孤擺严：：纏議轉—：注：泳道酿造天数为天的天然油菜蜂蜜。图市售油菜蜂蜜的蛋白质电泳图 浙江工商大学硕士学位论文天然油菜蜂蜜的蛋白质质谱鉴定分析时丨禁；图蜂蜜蛋白质电泳图表天然油菜蜂蜜蛋白质的质谱鉴定结果「天然油菜蜂蜜蛋白质经分析后，对主要的条蛋白谱带（如图进行酶切和鉴定（见附录），采用数据库搜索，结果显示条蛋白谱带分别对应于葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、、、表，且均由蜜蜂（分泌。在等人的研究中也有类似结果出现，他们对种不同花源蜂蜜的蛋白质进行质谱分析得到，在所有蜂蜜中都鉴定出了种由蜜蜂分泌产生的蛋白质，其中种为族蛋白，其余两种分别为葡萄糖苷酶和防御素。这些结果在等人的研究中得到了初步证实，他们对意蜂的咽下腺里分离出的多个进行研究，发现部分是用来编码葡萄糖氧化酶的，之后又对该酶进行活性测定证实蜂蜜中的葡萄糖氧化酶是由工蜂的咽下腺分泌，在花蜜酿造为蜂蜜的过程中，通过蜜蜂的转化作用而混入了葡萄糖氧化酶。等人通过研究证实，葡萄糖苷酶也是由蜜蜂的咽 浙江工商大学硕士学位论文下腺分泌产生，并且在所有咽下腺蛋白质中占了的含量，为最丰富的蛋白质。蜂蜜中存在多种酶类物质，且大多数酶都是由蜜蜂的咽下腺分泌产生。本次试验通过质谱鉴定证实天然油菜蜂蜜中存在葡萄糖氧化酶和葡萄糖昔酶（转化酶）。其中葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖转变为葡萄糖酸和过氧化氢，这两种物质使得蜂蜜具有很强的抗菌能力。而葡萄糖苦酶可以催化鹿糖、麦芽糖、松三塘、棉好糖、蜜二糖、海藻糖转化为葡萄糖和果糖】，它可以很好地反应蜂蜜的新鲜度和品质。目前已有研宄鉴定出蜂蜜中存在个蜂王装主要蛋白，简称为，均是由蜜蜂分泌产生，其中占蜂王装总蛋白的【】。是一种弱酸性的糖蛋白可以保护肝细胞并促进肝细胞再生，有种不同的亚型可以有效调节免疫系统，和是基础氨基酸的重要来源。蜜蜂向花蜜中加入这些动物性的蛋白质，不仅丰富了蜂蜜中的营养成分并优化了其结构，对于增强蜂蜜的保健作用具有重要意义。我们将质谱测定所得的蛋白质的相对分子质量与测定结果进行比较，发现存在较大的差异，这可能是由于蜂蜜中含糖量过高，使得某些蛋白质与糖结合为糖蛋白，结果造成不同的研宄手段得到了不一致的分子量。等人研宄糖基化作用对蜂蜜蛋白质的影响，通过电泳分析后发现蜂蜜中提取的蛋白质去糖基前后的蛋白谱带发生了偏移，相对分子质量分别约为和，经分析鉴定，该蛋白为，且相对分子质量为，这说明为糖蛋白。我们对电泳及质谱鉴定结果进行分析后发现，谱带和为同一种蛋白质，这说明蛋白质的端链接的寡糖种类及链接方式对分子量有很大的影响。本章小结蛋白质和酶类物质作为蜂蜜中特征性成分，具有很强的活性作用。在本章研究中，我们发现天然油菜蜂蜜在成熟过程中，蛋白质组成很稳定，主要存在葡萄糖氧化酶、葡萄糖昔酶、、和这种蛋白质，且这些蛋白质都由蜜蜂分泌产生。并且发现随着蜂蜜酿造天数的增加，蜂蜜中的蛋白质含量有增大的趋势，说明蛋白质含量可以很好地表征蜂蜜成熟的程度。同时，我们将天然油菜蜂蜜与市售油菜蜂蜜中的蛋白质含量与蛋白质种类进行比对分析，发现存在很大的差异，市售油菜蜂蜜中的蛋白质含量普遍不高并且蛋白质种类也较少，其原因可能在于原料蜜的成熟度不高以及加工中可能存在人为的因素，这说明研究蜂蜜中的蛋白质的差异可以较好地区分天然油菜蜜和市售油菜蜜。 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文第章天然油菜蜂蜜在醜造过程中糖分变化的研究蜂蜜中含有丰富的营养物质，主要成分是糖类物质，其中以单糖（果糖和葡萄糖）为主，约占蜂蜜总成分的以上，还含有一些蛋白质、酸、矿物质、色素、维生素和芳香类物质等。这些成分的种类及含量与蜂蜜的成熟过程有很大的关联。等人对蜂蜜的糖分进行研究，发现蜂蜜中含有一些含量很少的寡糖，这些寡糖是单糖在不同的位点通过不同糖音键连接而成的，如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、黑曲霉糖、麦芽酮糖、曲二糖、松二糖、昆布二糖和异麦芽酮糖等。蜂蜜中的寡糖具有调节肠道菌群，有效抑制糖尿病、月巴胖症的发病率，增强机体免疫功能的作用。但是有研究发现蜂蜜中许多含量较少的糖分并不存在于花蜜或花露中，而在蜂蜜中检测到了它们的存在，这些寡糖可能是在蜂蜜的酿造过程中通过各种酶和酸的作用形成的。本章研宄了蜂蜜在酿造过程中糖分的变化以及其与生物酶之间的关系，希望从酶的作用来分析蜂蜜酿造过程中糖分种类及含量的变化。材料与方法试验材料蜂蜜样品采集本章共采用个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜样品，均于浙江湖州长兴汝民蜂业公司现场采集，见表。所有样品在分析前均存于低温冰箱中。在油菜花盛幵期，随机选定几片油菜田作为实验区。年月日购置了箱蜜蜂置于实验区，月日凌晨将所有蜂箱中的蜜脾清空，开始计时。实验所需的不同酿造天数的蜂蜜样品均为傍晚点现场采集，分装到塑料瓶中后立即置于冰箱中存。 浙江工商大学硕士学位论文表蜂蜜样品信息酿造天数采集时间采集天气采集温度封盖情况年月日天年月日多云°天年月日晴°天年月日晴°天年月日晴°天年月日晴°天年月日多云天年月日晴°出现封盖天年月日阴°小部分封盖天年月日多云°小部分封盖天年月日晴：—半封盖天年月日多云°大部分封盖天年月日多云°大部分封盖天年月日晴°基本封盖天年月日晴完全封盖注：“”表示未封盖。试验试剂果糖、葡萄糖、松二糖、海藻糖、，海藻糖、异麦芽酮糖、麦芽酮糖、蜜二糖阿拉丁公司；鹿糖、麦芽糖、海藻糖美国公司；乙腈（德国公司）；有机相过滤膜。试验仪器与设备高效液相色谱仪（德国公司；蒸发光散射检测器（美国公司）；色谱柱（’无油空气发生器上海复宏机电有限公司）；超声波清洗器；先行者⑴分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；型超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；超纯水机美国公司）。试验方法蜂蜜样品的处理所有样品在测定前将瓶盖旋紧，置于的水浴中温热、振荡，待蜂蜜样品完全融化后，立即冷却至室温，搅拌均匀，过滤备用。准确称取蜂蜜样品于烧杯中，加入超纯水，搅拌至样品完全溶解后，转移至棕色容量瓶中，然后用 浙江工商大学硕士学位论文超纯水洗漆烧杯，并转移到上述容量瓶中，用乙腈定容，混匀，配成的蜂蜜样品溶液。进液相色谱分析前过的滤膜。糖标准品溶液的配制果糖标准溶液：准确称取果糖标准物质，用超纯水溶解后，转移至容量瓶，用乙腈定容，配制成的标准储备液。分别用移液管吸取该储备液、、、，配制成浓度依次为、、、、的果糖标准工作液。葡萄糖标准溶液：准确称取葡萄糖标准物质，用超纯水溶解后，转移至容量瓶，用乙腈定容，配制成的标准储备液。分别用移液管吸取该储备液、、、、配制成浓度依次为、、、的果糖标准工作液。鹿糖、麦芽糖标准溶液：分别准确称取蔗糖和麦芽糖标准物质，用超纯水溶解后，转移至容量瓶，用乙腈定容，配制成的标准储备液。分别用移液管吸取该储备液、、、配制成浓度依次为、、、的鹿糖、麦芽糖标准工作液。异麦芽酮糖、海藻糖标准溶液：分别准确称取鹿糖和麦芽糖标准物质，用超纯水溶解后，转移至容量瓶，用乙腈定容，配制成的标准储备液。分别用移液管吸取该储备液、、、、配制成浓度依次为、、、、的鹿糖、麦芽糖标准工作液。松二糖、，海藻糖、异麦芽糖、麦芽酮糖、蜜二糖标准工作液：分别将上述糖标准物质，用的乙腈水溶液配制成的标准工作液。液相色谱条件流动相：、、、、乙腈水溶液柱温：±°流速：蒸发光散射检测器漂移管温度：气体流量：增益值：进样量：结果与讨论色谱条件的选择 浙江工商大学硕士学位论文根据相关文献丨，对色谱条件的选择，本次试验对流动相设定了种不同配比，分别为、、的乙腈水溶液，挑选了酿造天数为天的蜂蜜进行色谱分析，如图。由图可知，将流动相设为乙腈水溶液时，糖分的出峰时间最快，但是分离效果不好，而在（中，我们发现流动相为的乙腈水溶液的分离效果较的明显，但出峰时间过慢；图（显示，糖分的出峰时间较快，并且分离度高于（，这说明在本次试验中，乙腈水溶液为较好的流动相配比。■—、—‘‘—‘‘ 浙江工商大学硕士学位论文■——‘‘“—““‘“““―‘”■ 浙江工商大学硕士学位论文■、、八—‘‘‘‘‘“■‘—‘“—图不同流动相配比色谱图乙腈水溶液乙腈水溶液乙腈水潘液乙腈水溶液乙腈水溶液乙腈水溶液为了获得最佳的色谱流动相配比，我们又设置了种不同浓度的乙腈水溶液作为流动相，分别为。。、、。由图我们发现把流动相配比设为时，出峰时间最 浙江工商大学硕士学位论文适宜，并且分离效果最好，因此，乙腈水溶液是本次试验的最佳流动相配比。糖标准品的色谱分析每个糖标准品分别按照之前选择出的最佳色谱条件进行分析，得到了不同的响应信号。表糖标准品的保留时间糖标准对照品保留时间（葡萄糖蔗糖松二糖异麦芽酮糖麦芽酮糖麦芽糖海藻糖海藻糖异麦芽糖蜜二糖果糖标准曲线的绘制以果糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。■，‘—图果糖标准曲线 浙江工商大学硕士学位论文葡萄糖标准曲线的绘制以葡萄糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。容‘图葡萄糖标准曲线蔗糖标准曲线的绘制以簾糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。：■‘‘■‘图蔗糖标准曲线 浙江工商大学硕士学位论文异麦芽酮糖标准曲线的绘制以异麦芽酮糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。；容‘■‘■■■，图异麦芽酮糖标准曲线麦芽糖标准曲线的绘制以麦芽糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。图麦芽糖标准曲线 浙江工商大学硕士学位论文海藻糖标准曲线的绘制以海藻糖标准工作液的浓度为横坐标，分析得到的色谱峰的积分面积为纵坐标绘制标准曲线，如图。‘图海藻糖标准曲线不同酸造天数蜂蜜的色谱分析表蜂蜜样品的糖类成分酉随数葡萄糖麦芽糖“异麦芽酮糖海藻糖天±±±±天±士±±天士±±士天±±±士天±±±士天±±±±天±±±±土天±±±±±天±±士±±天±±±士±天±±士土±±天±±±土±±天±±士±±±天±±±±±±天±±±士 浙江工商大学硕士学位论文我们分别对个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜在最佳色谱条件下进行分析，得到不同的色谱图（见附录）。我们对蜂蜜中的糖分进行统计分析，由表可知，所有蜂蜜样品中都检测到了果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，而在蜂蜜酿造的后期，发现了有异麦芽酮糖和海藻糖的生成。其中，果糖的含量最丰富，随着蜂蜜酿造时间的延长，果糖含量由显著增加到，其次是葡萄糖含量，在到之间变化。这与等人】的研宄结果相似，他们也通过研究发现葡萄糖和果糖是蜂蜜中含量最高的糖分。等人通过研宄报道，蜂蜜中的葡萄糖和果糖含量与花源分泌的成分有直接关系。蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量在酿造过程中发生变化与水分含量不断减少有关。此外，除了物理变化使得蜂蜜中糖含量增加外，蜂蜜在酿造过程中还发生了一系列生物化学反应，通过酶和酸的作用使得某些寡糖不断合成。在第二章中，我们通过对蜂蜜中几种酶的活性进行测定发现，蜂蜜中的葡萄糖苦酶转化酶）的活性随着蜂蜜酿造天数的增加而逐渐增强。葡萄糖苷酶对鹿糖具有水解作用，它可以把鹿糖水解为果糖和葡萄糖。并且我们在表中发现随着蜂蜜酿造天数的增加，果糖含量也越来越高。因此我们对葡萄糖苷酶值与果糖含量进行分析（图，发现酿造天数为天后的蜂蜜中的葡萄糖苷酶值与果糖含量可能存在比较好的相关性，通过线性分析，我们发现蜂蜜中的葡萄糖苗酶值与果糖含量确实存在较好的相关性。而在蜂蜜醜造的前两天，葡萄糖苗酶值与果糖含量之间并不存在关联，可能是因为那时巢脾刚被清空，蜂箱里的内勤蜂由于暂时食物的短缺，导致外勤蜂采集的花蜜在蜂房内酿造不稳定。■—图葡萄糖苦酶值与果糖含量拟合 浙江工商大学硕士学位论文图葡萄糖苗酶值与果糖含量线性拟合葡萄糖苦酶值可以把鹿糖水解为分子的果糖和分子的葡萄糖，我们发现蜂蜜在酿造过程中，葡萄糖苦值与果糖含量之间存在一定的相关性，可是我们通过表分析发现，蜂蜜中的葡萄糖含量在酿造过程中的变化趋势与果糖大一致。在蜂蜜酸造的前期，葡萄糖含量急剧增加，而从天开始，葡萄糖含量开始减少，但到酸造的最后天，葡萄糖含量又有升高的趋势。而我们也在表中发现在蜂蜜酸造的后期，有海藻糖不断生成。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过，糖昔键构成的非还原性糖，有种异构体，分别为海藻糖（，型）、异海藻糖（，型）和新海藻糖（型）丨丨。海藻糖即为海藻糖，该种寡糖广泛地分布于植物、节肢动物、真菌和地衣中。在等人的研宄中也出现了类似的结果，他们利用对种未加工蜂蜜中的糖分进行检测，发现蜂蜜中存在种双糖和种三糖，其中有两种双糖是，海藻糖和，海藻糖，但是没有发现，海藻糖的存在。蜂蜜从第天酿造到天的过程中，可能是由于两分子的葡萄糖通过酶和酸的作用合成了海藻糖而造成了葡萄糖含量显著下降，可是我们在第天才检测到蜂蜜中存在海藻糖，可能是由于合成海藻糖需要一段时间，直到第天才释放出来，而海藻糖的具体合成过程还需要进行进一步的研宄。我们在表中还发现，除了蔗糖含量随着蜂蜜酿造时间的增加而不断减少外，麦芽糖也有相同的变化趋势。麦芽糖是一种还原糖，可以被葡萄糖苦酶水解成分子的葡萄糖。在蜂蜜酿造的后期，我们看到葡萄糖含量不断增加，而在整个蜂蜜酿造过程中，蔗糖和麦芽糖的水解作用一直在进行，葡萄糖含量增加很有可能是因为海藻糖的合成作用小于蔗糖和麦芽糖的水解作 浙江工商大学硕士学位论文用。鹿糖和麦芽糖是蜂蜜中主要的两种双糖，但是蜂蜜标准中对鹿糖含量进行了规定，除了桉树蜜、相橘蜜、紫花苜宿蜜、蒸枝蜜和野桂花蜜中的蔗糖含量之外，其余品种蜂蜜的蔗糖含量必须，由表可知，酿造天数为天的蜂蜜中的鹿糖含量最高，为。与葡萄糖和寡糖占主导地位的花蜜相比，蔗糖含量丰富的花蜜更容易吸引蜜蜂】。鹿糖含量在醜造过程中逐渐下降是因为蜂蜜中的葡萄糖苦酶对鹿糖具有水解作用。可是我们在表中发现，在蜂蜜酿造的后期，有异麦芽酮糖生成，并且其含量随着酿造时间的延长而显著增加（。异麦芽酮糖是鹿糖的异构体，又称为帕拉金糖或异构蔗糖。异麦芽酮糖因其具有不易被唾液、胃酸和胰液消化、非致龋齿性并且可以改善大脑功能性等特点，被作为一种功能性双糖而广泛应用于糖果、饮料、面包及各类甜味剂的开发中。异麦芽酮糖在之后的酿造过程中不断生成，很可能是由于蜜蜂的消化腺中存在某种异构酶，蜜蜂对蜂蜜进行吞吐、转化的过程中，当鹿糖达到某一个含量时，鹿糖的水解作用受到抑制，而蜜蜂消化腺分泌的异构酶对蔗糖进行转化，随着蜜蜂吞吐次数的增加，异麦芽酮糖就不断积累。我们对葡萄糖苗酶值和鹿糖含量变化进行分析（图由图可知，葡萄糖苷酶对鹿糖的水解作用随着酿造时间的延长而趋于稳定，这种现象的出现可能来自于两方面的原因，一是葡萄糖苷酶对麦芽糖的水解作用增强，二是一部分的蔗糖被异构酶转化生成了异麦芽酮糖，簾糖的水解作用受到抑制，而至于这种异构酶的具体来源及特性还有待进行进一步的研宄。」：。：。■■■———————‘―—‘——‘——‘——‘——‘—图葡萄糖苷醇值和鹿糖含量拟合 浙江工商大学硕士学位论文本章小结我们通过对蜂蜜在酿造过程中糖分的变化进行了研宄，发现蜂蜜中含量最丰富的是果糖和葡萄糖，其次是蔗糖和麦芽糖。由于蜂蜜中葡萄糖苷酶的活性随着蜂蜜醌造时间的延长而显著增强，水解作用一直在进行，使得蜂蜜中的鹿糖和麦芽糖含量不断下降。将葡萄糖苷酶值和果糖含量进行分析得到两者之间存在较好的相关性，说明蜂蜜中果糖含量在酿造过程中不断升高是由葡萄糖苷酶的水解作用直接引起的。然而，葡萄糖含量的变化趋势与果糖不一致，在整个蜂蜜酿造的过程中，葡萄糖含量先显著增加，到达第天后，又不断减少，之后又呈现上升的趋势，并且其与葡萄糖苷酶值之间也不存在相关性，其原因很可能是一部分的葡萄糖通过酶和酸的作用合成了海藻糖并不断释放，而之后造成葡萄糖含量又增加的原因可能是鹿糖和麦芽糖的水解作用大于海藻糖的合成作用。试验还发现在蜂蜜酿造后期，有异麦芽酮糖不断生成，该糖是庶糖的异构体，可能是由于蜜蜂的消化腺中存在某种异构酶，当蜜蜂对蜂蜜进行吞吐的过程中，混入了这些异构酶，使得异麦芽酮糖在蜂蜜中不断积累。而对于该种异构酶的了解还需要展开进一步的研究。 浙江工商大学硕士学位论文第章总结论、创新点与展望总结论本研究对不同酿造天数的天然油菜蜂蜜的项理化指标和种主要生物酶的活性进行测定，发现成熟度低的蜂蜜中的水分含量很高，但随着蜂蜜酿造时间的增加，水分含量逐渐下降。并且通过分析发现蜂蜜中的水分含量与可溶性固形物含量及电导率之间存在较好的相关性，说明蜂蜜中真实的水分含量可以通过可溶性固形物含量和电导率来反映。同时，试验结果表明淀粉酶活性、葡萄糖苦酶（转化酶）活性和葡萄糖昔酶活性在蜂蜜酿造的过程中有相似的变化趋势，都随着醜造时间的延长而显著增加，并且三者之间存在很好的相关性，故认为可以通过检测其中一种酶的活性来预测或评估蜂蜜中其他几种酶；本次研究通过蛋白质电泳和技术对个不同酿造天数的天然油菜蜂蜜和种不同品牌的市售油菜蜂蜜的蛋白质进行分析，发现天然油菜蜂蜜在酿造过程中蛋白质组成很稳定，主要存在葡萄糖氧化酶、葡萄糖苦酶、和这种蛋白质，且均由蜜蜂分泌产生。并且发现随着蜂蜜酿造天数的增加，蜂蜜中的蛋白质含量由显著增加到，说明蛋白质含量可以很好地表征蜂蜜自然成熟的程度。同时，将天然油菜蜂蜜与市售油菜蜂蜜中的蛋白质含量与蛋白质种类进行比较，发现存在很大的差异，这说明研宄蜂蜜中的蛋白质可以较好地区分天然油菜蜜和市售油菜蜜。最后，本研宄通过对蜂蜜在酿造过程中糖分的变化进行研宄，发现蜂蜜中含量最丰富的是果糖和葡萄糖，其次是簾糖和麦芽糖。将糖分的变化与生物酶活性之间的关系进行分析后，发现果糖含量在酿造过程中不断升高是由葡萄糖苷酶的水解作用直接引起的，并且在蜂蜜酿造的后期发现有部分葡萄糖不断合成海藻糖，同时有异麦芽酮糖在蜂蜜中逐渐积累，这可能是通过蔗糖的异构作用形成的。通过研宄油菜蜂蜜在成熟过程中蛋白质和糖的变化，证实蜂蜜的酸造是一个极其复杂的过程，蜂蜜中的蛋白质和糖在此过程中都发生了不同程度的变化，这为鼓励成熟蜂蜜的生产、丰富蜂蜜品质的检测提供了一定的理论依据。 浙江工商大学硕士学位论文创新点首次研究了蜂蜜在酿造过程中蛋白质和糖分的变化。通过蛋白质电泳和质谱鉴定技术，发现蜂蜜中主要存在种稳定的蛋白质，且均来自于蜜蜂，这在评判蜂蜜品质的过程中具有重大的研究价值。利用技术研究不同酿造天数蜂蜜中的糖分的差异，通过初步的机理分析，找到了在蜂蜜酿造的过程中，糖分的变化与生物酶活性之间存在一定的相关性。展望我们对蜂蜜在成熟过程中蛋白质的变化进行了研究，发现蜂蜜中稳定地存在葡萄糖氧化酶和葡萄糖苗酶，而现有的蜂蜜国标中对蛋白质的检测只涉及淀粉酶值的测定，希望通过本次试验可以为今后蜂蜜品质的检测提供一定的参考。在本次研宄中，仍存在一些值得探讨的问题，如蜂蜜在酿造过程的后期，某些糖分产生的原因及具体的合成过程等。此外，由于蜂蜜样品的采集受到很多因素的制约，造成本次试验样品品种比较单一，要更真实、可靠地来解释或者建立起蜂蜜中特征性成分分析的体系，还需要我们对丰富的蜂蜜样品进行完整而深入的研究。 浙江工商大学硕士学位论文参考文献，中华人民共和国供销合作行业标准，邓建军，焦霞，杨海霞，等利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析蜂蜜蛋白质行为食品科学，，谢文闻，童越敏，何微莉，等蜂蜜保健和药理作用研究进展中国食物与营养，，，，，马伦姣我国蜂蜜出口竞争力的国际比较安徽农业科学，，彭展芬，潘建国国内外蜂蜜加工工艺流程的新进展蜜蜂杂志，，许政，邱泽群，胡军军天然成熟蜂蜜及巢蜜中国蜂业，朱俊波，杨红梅中国蜂蜜贸易国际竞争力分析安徽农业科学，曹彦忠蜂蜜兽药残留分析技术研宄及现状中国蜂业，王镜岩，朱圣庚，徐长法生物化学（面向世纪课程教材，第三版朱金明酶的功能—蜂疗保健维护人体健康的重要因素蜜蜂杂志，，，刘娟蜂王裴蛋白的分离纯化及常温储存过程中的变化中国农业科学院，，， 浙江工商大学硕士学位论文，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，， 浙江工商大学硕士学位论文，，，，，，，幽，，，查忠秀，鲁亚芳，董怡为温度对蜂蜜的电导率的影响食品科学，，中华人民共和国国家标准，胡虹蜂蜜生物酶活性及固体蜂蜜加工工艺研宄南昌：南昌大学，庄会荣，胡顺香，陈鸿琪靛红褪色光度法测定过氧化氢理化检验（化学分册易松强蜂蜜中葡萄糖昔酶的研究学位论文董怡为，鲁亚芳蜂蜜的电特性—蜂蜜的电导率与其成份的关系食品科学，，，，，曾哲灵，万冬满，叶贞雄，等热加工（存）过程对蜂蜜中淀粉酶酶值的影响南昌大学学报：理科版，李军生，何仁，江权燊，等蜂蜜淀粉酶在鉴别蜂蜜掺假中的应用研究食品科学， 浙江工商大学硕士学位论文，，，，，龙翔，庭芳，生物化学，等生化实验方法和技术：高等教育出版社，，，，张智武，单斌，彭文君，等蜂王梁中水溶性蛋白质和活性肽的研究进展食品研究与幵发，，’，，，，，，， 浙江工商大学硕士学位论文余娟，莫海涛，武金良，等法测定蜂蜜中的糖分广西轻工业，，张英，石雪萍，张卫明—法与—法检测蜂蜜中糖分的比较中国野生植物资源，，，， 浙江工商大学硕士学位论文附录‘，一等，。‘留容丨。缓堯运——— 浙江工商大学硕士学位论文伽⋯“。丨鬚§§！圓圓——；’‘‘君■投§§蜜——丄 浙江工商大学硕士学位论文■於°；■资霞§■？丨“纥。！昏、声—图蜂蜜蛋白质质谱图谱带谱带谱带谱带谱带谱带 浙江工商大学硕士学位论文；。？丨；！。—！卿§“—、‘‘—；—一■’‘厂一”“‘—————■⋯：“⋯务⋯“厂‘”广⋯⋯ 浙江工商大学硕士学位论文‘文、“—、難，‘■——§—，—————⋯⋯⋯“—°■、”一■—“？！‘一⋯⋯⋯。 浙江工商大学硕士学位论文■卸■°°」‘二丨—？；——一■：————厂一？！——！，—「―“产厂—細￡二，——“““？ 浙江工商大学硕士学位论文——富：§—！厂一厂一—？广———！⋯⋯⋯—§膽—‘―“，’！“‘‘！§■卿”：—■■！‘‘‘‘‘‘‘‘‘！ 浙江工商大学硕士学位论文§——叫——？”—！■“—￡§—————■—百一⋯“⋯一丨⋯“⋯―⋯⋯——⑶）丨，“§§！—丨二二丨二！—「— 浙江工商大学硕士学位论文賺二—”：！！！！■“‘：！！！图不同酿造天数的天然油菜蜂蜜的色谱图天（天（天（天（天（天（天（天天（天（天（天（天（天（天 浙江工商大学硕士学位论文致谢光阴荏苒，岁月如梭。两年半的研宄生学习生涯即将结束，回首这段时间的点点滴滴，感慨万千。借此论文完成之际，我要向帮助过我的老师和朋友表达我最诚挚的谢意。首先，我要衷心地感谢我的导师顾振宇教授。顾老师为人谦和，平易近人。从论文的选题、研究方案的确立、试验样品的釆集、实验室工作到论文撰写，顾老师都倾注了极大的关怀和鼓励。他严谨的治学态度、敏锐的洞察力和对事业的孜孜追求将使我终身受益。借此机会，我谨向顾老师致以深深地谢意。其次，我还要感谢傅月华、顾青、陈跃文、张燕平等老师在学习、研究等方面给予的帮助指导和支持。我还要感谢这两年半来与我互勉互励的同学，赵钰、孙亚链、张婷婷、林陈芳、张晨、徐贤和陈冰霞等人在学习、生活和实验方面对我的支持与无私帮助。在各位同学的共同努力之下，我们始终拥有一个良好的生活环境和一个积极向上的学习氛围，能在这样一个团队中度过，是我极大的荣幸我要感谢浙江工商大学，感谢食品与生物工程学院，感谢所有任课老师，是你们让我开阔了眼界，是你们教会了我做一个积极向上、努力奋斗的人。同时我也要感谢浙江湖州长兴汝民蜂业有限公司的邱汝民、邱凯总经理和高云主任及养蜂师傅张师傅，正是因为他们的热情帮助及技术支持，我的实验才会进展得这么顺利。最后，我要衷心地感谢我的父母，无论是精神上还是物质上都给予我最大的支持与鼓励。正是因为我的家人的无私付出，才让我在科研的道路上走得更长远。我将在今后的工作、学习中加倍努力，以期能够获得更多的成果来回报他们、回报社会。再次衷心地感谢他们，祝他们一生幸福、安康！叶梦迪年月于浙江工商大学 浙江工商大学硕士学位论文硕士期间完成的论文、叶梦迪顾振宇，林陈芳《油菜蜂蜜中蛋白质及酶的研究》，中国食品学报，正在审稿中 浙江工商大学硕士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：叶兮日期：对年丨月日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名油导师签名日期：年月°日