意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究 61页

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关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体。本声明的法律责任由本人承担。，均在文中明确说明本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可｛＾将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可［＾采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名；诞資３导师签名：啼、气日期：么地＾０ 论文提交日期：2015.04.28论文答辩日期：2015.06.09学位授予日期：2015.06学科门类：农学答辩委员会主席：单安山 符号说明TPHTryptophanhydroxylase色氨酸羟化酶5-HT5-hydroxytryptamine5羟色胺5-HTR5-HTreceptor5羟色胺受体MDAMalondialdehyde丙二醛T-AOCTotalAntioxidantCapacity总抗氧化能力ODOpticaldensity光密度PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应R.H.relativehumidity相对湿度cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核苷酸mRNAMessengerRNA信使RNAPLCPhospholipaseC磷脂酶CACAdenylatecyclase腺苷酸环化酶IDOIndoleamine2,3-dioxygenase吲哚胺2，3-双加氧酶 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言.........................................................................................................................................11.1色氨酸对蜜蜂的作用..........................................................................................................21.1.1色氨酸简介......................................................................................................................21.1.2色氨酸的来源..................................................................................................................21.1.3色氨酸的作用..................................................................................................................31.1.4色氨酸发挥作用的主要途径..........................................................................................61.2蜜蜂的蛋白质（氨基酸）营养需要研究进展..................................................................71.3氨基酸营养需要的研究方法.............................................................................................91.4本研究的目的和意义........................................................................................................102材料与方法...........................................................................................................................112.1意大利蜜蜂幼虫饲粮中适宜色氨酸水平的研究............................................................112.1.1试验对象.........................................................................................................................112.1.2试验分组与饲养管理.....................................................................................................112.1.3幼虫饲养配方.................................................................................................................122.1.4测定指标及测定方法.....................................................................................................132.1.6数据处理.........................................................................................................................172.2意大利蜜蜂成蜂饲粮中适宜色氨酸水平的研究............................................................172.2.1试验对象.........................................................................................................................172.2.2试验设计.........................................................................................................................172.2.3成蜂饲料组成.................................................................................................................182.2.4测定指标及测定方法.....................................................................................................182.2.5数据处理.........................................................................................................................213结果与分析...........................................................................................................................223.1不同日粮色氨酸水平对意蜂幼虫的影响........................................................................223.1.1日粮色氨酸水平对意蜂幼虫生长发育的影响............................................................223.1.2日粮色氨酸水平对意蜂虫体MDA含量、T-AOC活性的影响.................................253.1.3日粮色氨酸水平对蜜蜂幼虫5-HT途径代谢相关基因表达量的影响.......................26 3.2不同日粮色氨酸水平对意蜂成蜂的影响........................................................................273.2.1日粮色氨酸水平对意蜂成蜂生长发育的影响............................................................273.2.2日粮色氨酸水平对意蜂成蜂生产性能的影响............................................................293.2.3日粮色氨酸水平对意蜂成蜂MDA含量的影响.........................................................313.2.4日粮色氨酸水平对意蜂成蜂5-HT途径的影响.........................................................324讨论.....................................................................................................................................344.1色氨酸影响意大利蜜蜂生长发育...................................................................................344.1.1色氨酸影响意大利蜜蜂体蛋白含量.............................................................................344.1.2色氨酸影响意大利蜜蜂幼虫血淋巴游离色氨酸及成蜂色氨酸体沉积量.................354.1.3色氨酸影响意大利蜜蜂幼虫化蛹率、羽化率.............................................................364.1.4色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂王浆腺腺泡尺寸发育.....................................................364.2色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂生产性能...........................................................................374.2.1色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂采食量.............................................................................374.2.2色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂体重及存活率.................................................................384.3色氨酸影响意大利蜜蜂抗氧化功能................................................................................384.4色氨酸影响意大利蜜蜂5-HT途径................................................................................394.4.1色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂5-HT含量......................................................................394.4.2色氨酸影响意大利蜜蜂5-HT途径代谢相关基因的表达..........................................405结论及创新点.......................................................................................................................425.1结论....................................................................................................................................425.2创新点................................................................................................................................425.3后续工作及展望................................................................................................................43参考文献..................................................................................................................................44致谢......................................................................................................................................49攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................50项目资助..................................................................................................................................51 山东农业大学硕士学位论文中文摘要色氨酸是意大利蜜蜂工蜂的10种必须氨基酸中的一种，对意大利蜜蜂工蜂幼虫的生长发育具有重要的作用，亦是意大利蜜蜂工蜂成蜂不可缺少的营养物质，其能够影响工蜂成蜂的生产性能、生长发育等。因此，探索意大利蜜蜂工蜂幼虫期、成蜂期适宜色氨酸水平对于科学饲养意大利蜜蜂具有重要意义。幼虫试验旨在研究意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平，为探明意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段的色氨酸营养需要提供理论依据。试验选用1日龄工蜂幼虫1008只，随机分为7组，每组3个重复，每个重复48只幼虫，分别饲喂色氨酸水平为7.84mg/g、8.84mg/g、9.84mg/g、10.84mg/g、11.84mg/g、12.84mg/g和13.84mg/g的7种日粮。取5日龄工蜂幼虫虫体测定色氨酸羟化酶（Tryptophanhydroxylase，TPH）基因与5羟色胺受体（5-hydroxytryptaminereceptors,5-HTR）1、2α、2β、7基因表达量；取6日龄工蜂幼虫虫体测定总蛋白含量、MDA、T-AOC；取6日龄工蜂幼虫血淋巴测定其中游离色氨酸水平；7日龄时，统计工蜂化蛹率；取9日龄工蜂蛹测定色氨酸体沉积量，统计21日龄工蜂出房数目，计算羽化率。结果表明，色氨酸水平为10.84mg/g时，6日龄工蜂化蛹率显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05），6日龄工蜂幼虫虫体蛋白含量显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05），9日龄工蜂蜂蛹色氨酸体沉积显著多于其他色氨酸水平（P＜0.05），21日龄工蜂羽化率显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05）。色氨酸水平为10.84-11.84mg/g时，5日龄工蜂幼虫TPH基因表达量显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05），5日龄工蜂幼虫5-HT受体1、2α、2β基因表达水平显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05），6日工蜂幼虫血淋巴游离色氨酸含量显著高于其他色氨酸水平（P＜0.05）。5日龄工蜂幼虫5-HT受体7基因表达量在色氨酸水平为7.84-11.84mg/g时，处于较低水平，12.84-13.84mg/g时显著高于其他水平（P＜0.05）。6日龄工蜂幼虫MDA在色氨酸水平为7.84-11.84mg/g时含量较低，12.84-13.84mg/g时含量显著高于其他水平。6日龄工蜂幼虫T-AOC，在色氨酸水平为7.84-9.84mg/g时处于较低水平，10.84-11.84mg/g时处于较高水平，12.84-13.84mg/g时显著高于其他水平。综合以上生理生化指标及分子生物学指标，针对6日龄幼虫体总蛋白浓度、9日龄蛹色氨酸体沉积量、幼虫化蛹率、幼虫羽化率、6日龄幼虫TPH基因相对表达量制作拟合曲线，计算并分析后认为意大利I 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究蜜蜂幼虫饲料中适宜的色氨酸水平为9.85-11.34mg/g。成蜂试验旨在研究意大利蜜蜂工蜂饲料中适宜色氨酸水平，为探明意大利蜜蜂工蜂发育阶段的色氨酸营养需要提供理论依据。意大利蜜蜂工蜂被随机分成7组，每组3个重复，每个重复100只蜜蜂，分别被饲喂色氨酸水平为9mg/g、10mg/g、11mg/g、12mg/g、13mg/g、14mg/g的人工日粮。6日龄工蜂被用来测定：总蛋白浓度、MDA含量、5-HT含量、TPH,5-HT1R,5-HT2αR,5-HT2βR,5-HT7R基因的相对表达量。此外，试验还测定了8日龄意大利蜜蜂工蜂的王浆腺腺泡尺寸、12日龄意大利蜜蜂工蜂的色氨酸体沉积量、采食量、体重、存活率等。结果表明，色氨酸水平为12mg/g时，6日龄工蜂5-HT含量、6日龄TPH,5-HT1R,5-HT2αR,5-HT2βR,5-HT7R基因的相对表达量、工蜂存活率、8日龄工蜂王浆腺腺泡尺寸、12日龄意大利蜜蜂工蜂色氨酸沉积量显著高于其他色氨酸水平（P<0.05）。色氨酸水平为10-12mg/g时，工蜂5-HT2β基因相对表达量显著提高（P<0.05）。色氨酸水平为9-13mg/g时，5-HT7基因相对表达量适中（P<0.05）。色氨酸水平为9-12mg/g时，MDA含量处于较低水平（P<0.05）。不同水平色氨酸，对6日龄及12日龄意大利蜜蜂工蜂的体重影响差异不显著（P>0.05）。根据以上生理生化指标，针对6日龄工蜂体总蛋白浓度、12日龄工蜂色氨酸体沉积量、工蜂采食量、5-HT2α受体基因相对表达量、5-HT2β受体基因相对表达量制作拟合曲线，计算和分析后我们推断意大利蜜蜂工蜂饲料中适宜的色氨酸水平为10.75-11.52mg/g。本研究表明，饲料中的色氨酸水平能够影响意大利蜜蜂工蜂幼虫、成蜂的生长发育及相关生理生化指标，意大利蜜蜂幼虫饲料中适宜的色氨酸水平为9.85-11.34mg/g，意大利蜜蜂工蜂饲料中适宜的色氨酸水平为10.75-11.52mg/g。关键词：意大利蜜蜂；工蜂；幼虫；成蜂；色氨酸水平II 山东农业大学硕士学位论文TheappropriateleveloftryptophanforApismelliferaworkerbeelarvaeandadultfeedAbstractTryptophanisoneofthetenessentialaminoacidsforhoneybeeand,ithasanimportantroleinhoneybeedronelarvagrowthanddevelopment,itisalsotheindispensablenutrientsforworkerbees,whichcanaffecttheirperformance,growthanddevelopment,andsoon.Exploringtheappropriatetryptophanlevelsoffeedforhoneybeelarve(oradult)isgoodforkeepinghoneybeescientificallyandhealthily.ThislarvaetestisdesignedtostudytheappropriatelevelsoftryptophaninApismelliferaworkerbeelarvaefeed，andprovideatheoreticalbasisforthenutritionalneedsoftryptophan.1008one-day-oldlarvaeswererandomlydividedintosevengroupsofthreereplicatesof48larvaes,andwerefeddifferentdietswithtryptophanatthelevelsof7.84mg/g,8.84mg/g,9.84mg/g,10.84mg/g,11.84mg/g,12.84mg/gand13.84mg/grespectively.5-day-oldworkerbeelarvaeswereusedformeasuringTPH（Tryptophanhydroxylase，TPH）geneand5-HTreceptors（5-hydroxytryptaminereceptors,5-HTR）1,2α,2β,7geneexpression.Take6-day-oldworkerbeelarvaeassamplesfordeterminingtotalproteincontent,MDA,T-AOC,and6-day-oldlarvalhemolymphwastakentobeusedformeasuringtheleveloffreetryptophan.Thepupationratewascalculatedat7daysold.Depositionamountoftryptophanwasanalysedusing9-day-oldpupa,andtheworkerbeeeclosionratewascalculatedat21daysold.Pupationrateandlarvaetotalproteincontentat6daysold,tryptophandepositionat9daysoldpupaandworkerbeeeclosionrateat21daysoldwerehighestwhenthetryptophanlevelwas10.84mg/g(P<0.05).TheexpressionsofTPH,5-HTreceptors1,2αand2βgenesoflarvaeat5daysoldandhemolymphfreetryptophancontentoflarvaeat6daysoldwereelevatedsignificantlyby10.84-11.84mg/gtryptophan(P<0.05).However,5-HTreceptor7geneexpressionof5-day-oldworkerbeelarvaeandMDAlevelof6-day-oldworkerbeelarvaefed12.84-13.84mg/gtryptophanwerehigherthanworkerbeelarvaefed7.84-11.84mg/gtryptophan(P<0.05).Dietarysuppliedwith10.84-13.84mg/gtryptophanimprovedsignificantly6-day-oldworkerbeelarvaeT-AOCcomparedwithdietarywith7.84-9.84mg/gtryptophan(P<0.05).Tosumup,weanalyzetheindicatorsofPhysiology,biochemistryandIII 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究molecularbiology.Wemakethefittingcurvesof6-day-oldlarvaetotalproteinconcentration,9-day-oldpupatryptophandepositionrate,larvaepupaterate,larvaeeclosionrateandtherelativeexpressionlevelsof6-day-oldlarvaeTPHgene.Aftercalculationsandanalysis,weconcludedthattheappropriateleveloftryptophanforApismelliferaworkerbeelarvaeis9.85-11.34mg/g.ThisresearchisdesignedtostudytheappropriatelevelsoftryptophaninApismelliferaworkerbeeadult,andprovideatheoreticalbasisforthenutritionalneedsoftryptophan.Theworkerbeeswererandomlydividedintosevengroupsofthreereplicatesof100workerbees,andwerefeddifferentdietswithtryptophanatthelevelsof9mg/g,10mg/g,11mg/g,12mg/g,13mg/g,and14mg/grespectively.6-day-oldworkerbeeswereusedformeasuringthetotalproteinconcentration,MDAcontentration,5-HTcontentration,andthetranscriptionlevelsofTPH,5-HT1R,5-HT2αR,5-HT2βR,5-HT7Rgene.Inaddition,wehadmeasuredthehypopharyngealglandacinussizeof8-day-oldworkerbees,theTryptophandepositionof12-day-oldworkerbees,feedintake,weight,andsurvivalrateandsoon.The6-day-oldworkerbeeconcentrationof5-HT,the6-day-oldworkerbeerelativeexpressionsofTPHand5-HT1Rgenewerehighest,the8-day-oldworkerbeehypopharyngealglandacinussize,the12-day-oldworkerbeetryptophandeposition,thesurvivalrateofworkerbees,whenthetryptophanlevelwas12mg/g(P<0.05).Therelativeexpressionsof5-HT2βRgenewereelevatedsignificantlybythetryptophanlevelsof10-12mg/g.Therelativeexpressionsof5-HT7Raremoderate,whenthetryptophanlevelswere9-13mg/g(P<0.05).TheconcentrationofMDAislowwhenthetryptophanlevelsof9-12mg/g(P<0.05).Therewasnosignificantdifferencesbetweendifferenttryptophanlevels,abouttheweightof6-day-oldand12-day-oldworkerbees(P>0.05).Tosumup,weanalyzetheindicatorsofPhysiology,biochemistryandmolecularbiology.Wemakethefittingcurvesof6-day-oldworkerbeetotalproteinconcentration,12-day-oldwokerbeetryptophandepositionrate,therelativeexpressionlevelsof6-day-oldwokerbee5-HT2αgeneandtherelativeexpressionlevelsof6-day-oldwokerbee5-HT2βgene.Aftercalculationsandanalysis,weconcludedthattheappropriateleveloftryptophanforApismelliferaworkerbeeis10.75-11.52mg/g.StudiesshowthattryptophancaninfluencethephysiologicalandbiochemicalindicesrelatedwithgrowthofApismelliferaworkerbeelarveandadult.TheappropriateleveloftryptophanforApismelliferaworkerbeelarvaefeedis9.85-11.34inmg/g,theappropriateleveloftryptophanforApismelliferaworkerbeeadultfeedis10.75-11.52mg/g.Keywords:ApismelliferaL.;Workerbee；Larvae;Adult;Levelsoftryptophan.IV 山东农业大学硕士学位论文1前言蜜蜂的生长发育过程中，自身不能合成的氨基酸约有10种，色氨酸即是其中的一种（张怡丁，胥保华，2012；陈盛禄，2001），在畜禽方面色氨酸的作用已有相关研究，其中色氨酸的主要生理作用包括影响情绪、采食量，调节免疫应答、蛋白质合成等功能，促进核黄素发挥作用等功效（Le等，2011；李剑欣等，2005），由此可以推测，色氨酸对意大利蜜蜂的生长发育也应具有重要的作用，亦是意大利蜜蜂不可缺少的营养物质。探索意大利蜜蜂工蜂幼虫（成峰）期适宜色氨酸水平对于科学、健康饲养意大利蜜蜂具有重要意义。色氨酸在生物体内可经过一系列化学反应，最终可以变成血清素（又称五羟色胺），其英文名称是Serotonin（简称5-HT）。该过程中的起发动作用的酶是色氨酸羟化酶，人们常将其简记为TPH,其英文全称是Tryptophanhydroxylase。5-HT能够影响人体蛋白质合成、免疫等（Blenau&Thamm，2011；Le等，2011；李剑欣等，2005），对于蜜蜂来说能够影响蜜蜂的攻击行为（Blenau&Thamm，2011）、寿命、生殖、生物学节律（Barnes&Sharp，1999；Tierney，2001）、免疫功能、抗氧化功能（Hoyer等，2002）等。5-HT发挥相应功能时首先是与其受体（5-HTR结合，激活下游功能途径。其关键的功能受体包括5-HTR1、5-HTR2α、5-HTR2β、5-HTR7，这些受体属于视紫红质类（属于GPCRs）偶联受体，其中5-HTR1、5-HTR7能分别对AC起到抑制作用和激活作用，5-HTR2α、2β能够对能够通过激活PLC发挥作用（Kmiecik,2014；Qiu，2009；Gao，2013）。对于意大利蜜蜂来说，5-HT受体1的主要功能是：影响意大利蜜蜂的视觉、嗅觉、学习、记忆、趋光行为（Hannon，2008；Pauwels，2000；Tierney，2001），蜜蜂5-HT受体2α、5-HT受体2β、5-HT受体7的功能目前研究的较少，目前一种被广泛认可的观点认为它们可能参与调节了蜜蜂的攻击行为（Blenau&Thamm，2011）。综上，认为色氨酸在意大利蜜蜂体内发挥作用，主要有两大途径：一是色氨酸作为合成蛋白质的成分之一，影响了蜜蜂幼虫体蛋白的含量，二是通过5-HT途径调节蜜蜂生物节律、寿命、免疫功能、抗氧化功能等。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的高低是反映机体抗氧功能的指标之一。反应生物体抗氧化机能强弱的综合指标为总抗氧化能力（TotalAntioxidantCapacity，T-AOC），其活性能够综合展现出生物抗氧化功能的好坏。MDA与细胞内脂类物质氧化反应过程有关，其含量高低能反映生物体细胞受到自由基1 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究伤害的轻重状况。一般情况下MDA含量越低，证明虫体细胞受到自由基氧化攻击的程度越低，其氧化代谢状况越良好，将越有利于幼虫（成蜂）的生长发育。T-AOC是指细胞抵抗氧化损伤的能力，对于蜜蜂幼虫（工蜂）来说，T-AOC的高低能反映其抗氧化能力的强弱。此外色氨酸的体沉积、消化吸收率、化蛹率、羽化率、存活率、体重、王浆腺腺泡尺寸、5-HT含量等，也是衡量幼虫（成蜂）生长发育好坏的重要指标。关于色氨酸的适宜营养水平，家兔、家禽、肉牛、小鼠、大鼠等已经有具体标准(NRC,1977;NRC,1994;NRC,1995;NRC,2000），但是在意大利蜜蜂方面还没有具体的参考标准。本试验拟通过探索饲粮色氨酸水平对血淋巴游离色氨酸含量（工蜂幼虫）、体总蛋白浓度（幼虫、成蜂）、色氨酸体沉积量、MDA水平、T-AOC、TPH基因与5-HT受体基因的表达量、化蛹率、羽化率、存活率、体重、王浆腺腺泡尺寸、5-HT含量等的影响，探索工蜂幼虫（成蜂）饲料中最佳的色氨酸水平，旨在为工蜂幼虫（成蜂）的色氨酸营养需要和饲养提供理论参考和借鉴。1.1色氨酸对蜜蜂的作用1.1.1色氨酸简介色氨酸的标准名是β-吲哚丙氨酸（Tryptophan，简称Trp）。色氨酸最早在被人类发现距今约190年，并于被发现后的第67年被正式命名。科学家首次在距今约113年前，从酪蛋白中经过一系列提纯首次得到了色氨酸。现实生活中有3种色氨酸，它们分别是：左旋色氨酸（L型）、右旋色氨酸（D型）、内消旋色氨酸（DL型）。其中只有L-色氨酸能发挥主要作用，它即是人和动物的8种必需氨基酸之一(左祖桢等,2010)，又是蜜蜂的10种必需氨基酸的一种（张怡丁，胥保华，2012；陈盛禄，2001）。1.1.2色氨酸的来源蜜蜂的生长发育过程中，自身不能合成的氨基酸约有10种，色氨酸即是其中的一种（张怡丁，胥保华，2012；陈盛禄，2001），蜜蜂不能在机体中自己生成色氨酸，只能从外界（如花粉、水、花蜜等）摄入。而蜜蜂获取氨基酸的方式主要靠摄入食物中的蛋白质来提供，如自然界的蜜蜂获取氨基酸最佳途径即是通过花粉获得。蜂花粉是工蜂从自然界中采集植物花粉后，经过自身一列的加工过程形成的，是蜜蜂的蛋白质或者氨2 山东农业大学硕士学位论文基酸的主要来源。蜂花粉成分复杂多样，占比最多是蛋白质（包含游离氨基酸）。蜂花粉中的蛋白质（包括游离氨基酸），比例均衡，且种类丰富。蜂花粉中蛋白占所有成分的比例约为20%，其包含蜜蜂所需的所有氨基酸（如色氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸等）。蜂花粉中除了必需氨基酸外，还包含大约5-9种非必需氨基酸（赵凤奎，2013）。除了从花粉中摄取色氨酸外，蜜蜂还可能从蜂蜜中获得少量游离色氨酸或者从添加了色氨酸的人工代用花粉中获得。1.1.3色氨酸的作用（1）色氨酸能调节机体蛋白质合成。色氨酸作为氨基酸来说，有其独特的性质和功能，具体体现在其不仅能组成蛋白质（最初是从酪蛋白中获取并命名），还能够影响生物体蛋白的生成过程（李剑欣等，2005）。对于哺乳动物来说，不能自己生成色氨酸，但是色氨酸在机体内会被分解和合成5-HT，被分解的色氨酸不能够在用来生成蛋白。哺乳动物色氨酸在蛋白质的含量是1.2g/100g蛋白，远低于其他氨基酸(Nathalie等,2011)。对于哺乳动来说，色氨酸主要通过影响肝脏细胞中的核糖体及RNA的聚合、微粒体内的相关酶活性（如与氧化有关的复合酶等）、P450含量等来影响机体蛋白的合成过程。此外有研究还表明色氨酸缺乏能够影响动物机体蛋白生成过程，色氨酸影响动物机体蛋白合成过程的机理，目前较多的观点认为是通过胰岛素来调节动物肝脏或者动物肌肉中的蛋白质合成。但是色氨酸对蛋白合成的作用机理，目前尚未完全弄清楚，还需要系统、全面、深入的探索和探讨（李剑欣等，2005）。对于蜜蜂来说，没有肝脏，但是蜜蜂有类似功能的脂肪体（Roma等，2010），因此推测，色氨酸影响蜜蜂蛋白质的合成，可能是通过影响脂肪体的代谢功能实现的。（2）色氨酸能调节动物机体的消化功能。色氨酸能够调节生物体的消化功能，具体是通过影响生物体消化道内如胰液、胃液等分泌过程来实现的（李剑欣等，2005）。用于转化色氨酸合成5-HT的TPH的异构体TPH1存在于肠嗜铬细胞中，且机体5-HT中约95%存储在肠道中。IDO也在多种动物的肠道中表达，能够调节T淋巴细胞和免疫反应，因此IDO可能参与肠道免疫反应的控制(Nathalie等,2011)。（3）色氨酸能调节动物的生长和采食量。猪在色氨酸方面的相关研究已经有很多，色氨酸是猪不可缺少的氨基酸，日粮色氨酸不足时会显著影响其采食量、生长率和料肉比等，人工额外添加一定量的色氨酸后，以上症状会显著改善（Nathalie等,2011；徐国茂，2009）。5-HT被视为一种调节食欲的调节剂，可以作为饥饱感的控制因子。采食量3 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究减少可能是由于饲粮色氨酸缺乏，导致大脑中的色氨酸与其他氨基酸比例发生变化引起的，并由此激发大脑中控制食欲的中枢，产生食欲抑郁症，进而影响采食量（Nathalie等,2011；Le&Seve，2007）。5-HT对采食量的调节有外周和大脑中枢两种途径，一：饲粮色氨酸不足时，导致中枢中的5-HT含量降低，进而导致动物采食量下降。二：饲粮色氨酸过多时，外周5-HT含量高于正常含量，此外由于外周5-HT含量过高可以使动物在未吃饱的情况下减少动物的饥饿程度，进而造成动物的采食量下降（李剑欣等，2005）。目前赞同比较多是，色氨酸对采食量的调节作用，可能是通过5-HT作用于其相应的受体实现的，如5-HTR1、5-HTR2α、5-HTR2β、5-HTR7等调节外周5-HT含量来实现的（Blenau&Thamm,2011；李剑欣等，2005）。（4）色氨酸能调节动物的情绪、行为。中央血清素（5-HT）系统在影响情绪、认知、活动、采食量等方面占据着重要的地位。色氨酸缺乏会导致中央血清素（5-HT）系统功能失常，进而会导致情感性精神障碍、焦虑、易怒、压力感和饮食失调等问题。色氨酸水平能够影响情绪变化，适当增加色氨酸水平能有效缓解轻度和中度抑郁。色氨酸影响情绪可能是通过影响神经系统（中枢或外周）中5-HT的含量。研究还发现色氨酸缺乏会导致大鼠焦虑和产生类似抑郁的行为。此外大量动物实验证明，增加饲粮色氨酸能够显著改善动物的攻击行为，最终甚至能使其减少（Nathalie等,2011）。色氨酸对动物的情绪、行为的影响，可能类似于色氨酸影响动物食欲的影响，即可能是神经系统中的5-HT与其相应的受体结合产生一系列的反应，最终发挥作用。5-HT2α受体及5-HT2β受体具有减少黑腹果蝇的攻击行为的作用，5-HT7受体具有抑制黑腹果蝇的攻击行为的作用（Blenau&Thamm,2011）。由此可以推测，色氨酸水平如果过高或者过低，引起5-HT含量产生相应的变化，可能都会对动物的产生不利的影响，是动物的情绪不稳定（易怒或者情绪低落等）。因此只有保证饲料中适度的色氨酸水平，才能有利于动物情绪稳定，也能更有利于动物生产工作的开展。（5）色氨酸能影响动物的抗氧化功能。常见的与生物体抗氧化有关的指标有：T-AOC活性、SOD活性、MDA水平等。生物体内有两种抗氧化机制(酶类、非酶类)。酶类抗氧化机制的活性基团，一般是微量元素，而非酶类抗氧化机制的活性基团，一般是以氨基酸、含有特殊元素的蛋白质、维生素等，色氨酸即是属于非酶类抗氧化系统活性中心的一种（刘肖挺等，2012；魏宗友等，2012；袁超等，2012）。研究发现提高饲料的色氨酸含量，能显著降低机体MDA含量、提高与抗氧化有关酶的活性，由此可以推断色氨酸不仅能在非酶类抗氧化机制中发挥作用，也能在酶类抗氧化机制中发挥作用4 山东农业大学硕士学位论文（袁超等，2012）。色氨酸目前在国外，已经被广泛应用在抗应激方面，如猪方面的应用是，饲料中添加适宜的色氨酸以此来减轻或者消除生产中的应激。在家禽方面的应用是，日粮中添加色氨酸，改善家禽的不良行为，如由于家禽攻击性过强造成的啄肛等不良行为（袁超等，2012）。色氨酸经过TPH的催化最终可以生成5-HT，5-HT可以进一步生成褪黑素（刘肖挺，2012）。5-HT能在机体抗氧化功能方面发挥重要的作用，具体体现在其能够清除自由基及抑制超氧化物的生成(Wen等,2014;Le等,2011;Terrón等,2009)。褪黑素能强力清除羟基自由基，小鼠的饲喂褪黑素试验表明，长时间饲喂褪黑素的小鼠脑部以及心肌SOD活性增强、T-AOC活性增强、MDA含量下降（刘肖挺等，2012）。（6）色氨酸能增强动物免疫功能。色氨酸能够影响机体的免疫作用，抗原呈递细胞（如巨噬细胞）中能检测到色氨酸的降解产物，活化的免疫细胞能够释放炎症因子激活IDO活性（Nathalie等,2011）。色氨酸能够通过对T淋巴细胞的生成过程影响，从而发挥对动物免疫（体液）的影响，此外色氨酸还能够影响多核糖体的功能，这可能是色氨酸影响体液免疫的机理（李剑欣等，2005）。免疫器官是生物体发挥免疫作用的重要地方，也是与免疫有关的细胞产生、发育、生长的主要处所，此外生物体对病原体等产生的应激反应，也是在免疫器官中启动。免疫器官指数能反映机体免疫系统是否健全，免疫器官重量也能反映免疫系统是否健全。机体中枢中与免疫有关的重要器官，主要有胸腺等，家禽早期还包括法氏囊（后期消失）。（刘肖挺等，2012；魏宗友等，2012）。研究表明，色氨酸能够促进小鼠脾脏细胞增殖和分化，还能够促使小鼠脾脏器官增重，并能够以此来增强小鼠的免疫力（Kenney等，1970）。适宜的色氨酸水平还能促进鼠的脾脏发育，提高鼠的脾脏免疫指数，日粮中添加一定的色氨酸能够改善鸭的免疫指数，具体体现在可以改善脾脏等器官的效能(张括等，2011；邱时秀，2009)。研究发现，色氨酸缺乏会导致鼠的免疫球蛋白含量下降，相反色氨酸水平在一定范围内增加时，血清中的IgG和IgM含量均增加（魏宗友，2012）。研究还表明，鸡感染法氏囊病后，如果日粮色氨酸不足会导致淋巴发育不全，还能导致包括巨噬细胞在内的免疫细胞（如淋巴细胞等）出现功能异常，但是添加适宜的色氨酸的后不仅能改善以上状况，还能缓解法氏囊病的危害(Emadi等,2010)。色氨酸的代谢过程中产生的褪黑素，可能是促进免疫器官发育的一个重要物质。研究表明，饲喂正常大鼠褪黑素，不仅能使大鼠的脾脏和胸腺重量显著增加，还能抵抗应激条件下造成的胸腺萎缩的状况（Pertsov，2003）。5 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究（7）色氨酸与其他营养素之间的关系。摄入大量的碳水化合物，能提高血浆中色氨酸的含量、降低血浆中中性氨基酸（LNAA）的含量，从而改善机体内色氨酸与中性氨基酸的比例。饲料中的单糖能够抑制色氨酸的吸收、二糖和多糖能够促进色氨酸的吸收。大部分氨基酸（如脯氨酸等）能够促进色氨酸在小肠内的吸收，但是蛋氨酸却会导致小肠中色氨酸的吸收减少。色氨酸能显著影响肝脏中的脂肪（脂肪酸）、类脂等的含量。色氨酸的代谢产物能补充烟酸的缺乏，这与色氨酸在机体的一种代谢途径（“犬尿酸原”）有关，该途径可以生成烟酸，此外维生素C等能够影响生物体内该途径中烟酸的合成过程。添加色氨酸能够防止鲑鱼的钙质沉积，还能够促进小肠对锌的吸收，但是对于铅来说却能够抑制色氨酸在空肠的吸收（徐国茂等，2009）。1.1.4色氨酸发挥作用的主要途径色氨酸在生物体中发挥着作用，这种作用有两种方式较为重要：犬尿酸原代谢方式、5-HT代谢方式。犬尿酸原代谢方式是色氨酸在动物机体中的主要分解代谢途径，途径中可以合成烟酸等，但是对于大部分动物和蜜蜂来说色氨酸5-HT代谢方式，可能占据更为重要的地位，因为5-HT广泛分布在包括大脑（神经中枢）在内的神经系统中，此外在外周神经系统中也有分布，并对机体具有举足轻重的作用（Blenau&Thamm，2011；徐国茂等，2009）。对于意大利蜜蜂来说，其5-HT途径的发挥作用主要靠作用其相应的受体（5-HT受体1、5-HT受体2α、5-HT受体2β、5-HT受体7），这些受体主要分步在意大利蜜蜂大脑蘑菇体中，5-HT途径的关键酶是TPH，5-HT是该途径的重要激活剂（Blenau&Thamm，2011）。5-HT在意大利蜜蜂机体内的合成，是在色氨酸羟化酶（TPH）、脱羧酶等催化下合成的（图1）（Blenau&Thamm，2011）。意大利蜜蜂神经系统（中枢及外周）内的5-HT，通过其主要受体发挥重要的调节作用（图2）（Blenau&Thamm，2011；Hannon&Hoyer，2008；Hoyer等，2002；Tierney等，2001；Barnes等，1999）。6 山东农业大学硕士学位论文（L-色氨酸）色氨酸羟化酶（5-L-羟色氨酸）脱羧酶（5-羟色胺）图15-HT生物合成过程Fig.1Biosynthesisofthe5-HT激活5-HT2α受体减少攻击行为PLC5-HT2β受体激活视觉、嗅觉、5-HT抑制学习、记忆、5-HT1受体AC趋光行为等激活抑制攻击行5-HT7受体AC为、影响情绪等图25-HT在意大利蜜蜂工蜂体内发挥作用的通路Fig.2Thepathwayof5-HTinApismeiliferaworkerbee.1.2蜜蜂的蛋白质（氨基酸）营养需要研究进展蛋白质是生命之源，对于蜜蜂来说亦是如此，蜜蜂体的主要组成部分即是蛋白质，蜜蜂的日粮中蛋白水平是一项衡量蜜蜂饲料好坏的重要指标。很多蜂产品中蛋白质也是其主要的组分之一，如蜂王浆、蜂花粉等。对于蜜蜂来说，蛋白质是其新陈代谢的重要养分，蜜蜂体内蛋白质有着不同的构象和存在形式，构象和存在形式不同，它们发挥的作用也不同，如参与酶的组成时具有催化机体反应的作用，参与组织构成时具有维持生物体形态的作用等。日粮中蛋白质，可以被分解成分子量更小的氨基酸或者小链多肽，经肠道消化吸收7 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究后，可以根据不同的组织和器官的需要，重新组合成新的蛋白质，蛋白质也是机体必需氨基酸的主要来源。意大利蜜蜂自身不能合成的氨基酸约有10种，色氨酸便是其中的一种，包括色氨酸在内的这些蜜蜂自身不能合成的氨基酸中大多数，都必须靠食物等外界摄入才能保证机体所需的正常供给量。蜂花粉中一般含有蛋白质、碳水化合物、矿物元素（常量及微量）、氨基酸等，植物的种类不同，花粉中的氨基酸与蛋白质的种类丰富、含量均衡。通过对三种蜂花粉（南瓜花粉、荞麦花粉、向日葵花粉）的成分对比和分析，发现这三种蜂花粉中的脂肪酸、氨基酸和微量元素等的含量差异显著（赵秀英，张宏利，1992）。蜜蜂获取氨基酸的方式主要靠摄入食物中的蛋白质来提供，如自然界的蜜蜂获取氨基酸最佳途径即是通过花粉获得。蜂花粉是蜜蜂的主要蛋白质来源，其成分复杂，主要成分是蛋白质、脂类及少量的氨基酸等。蜂花粉中蛋白约占总养分的20%，其包含蜜蜂自身不能合成的氨基酸约有10种（如色氨酸等）。蜂花粉中除了必须氨基酸外，还包含大约5-9种非必需氨基酸（如丝氨酸等）。通过对蜂花粉的成分测定分析,发现蜂花粉所包含的必需氨基酸极为丰富，比常见的蛋白类食物（如蛋类、奶制品等）的含量还高（赵凤奎，2013）。目前为止，虽然关于意大利蜜蜂饲料中适宜蛋白、氨基酸水平有了一定的研究，但是由于受到蜜蜂生产的制约，还没有一个系统、全面的研究结果供我们参考。蜜蜂生产受到很多因素的制约，如蜜蜂的生产阶段不同，蜜蜂对蛋白质（氨基酸）的需要量不同。此外蜜蜂所处的发育阶段不同，对蛋白质和氨基酸的需求也不尽相同，如蜜蜂卵期仅卵中的蛋白就可以供其孵化所需，幼虫期则需要工蜂额外饲喂蜂王浆和蜂粮来供给蛋白质和氨基酸等，成蜂期则需要通过摄入花粉、饲料、蜂蜜等来补充蛋白质和氨基酸。蛋白质供给量必须适当才能有利于，蜜蜂的正常的生长发育。蛋白质缺乏可能会导致工蜂的咽下腺不能正常发育、工蜂的存活率下降（Sagili等,2005）、蜂王不能正常产卵、工蜂的王浆分泌量下降等。蛋白质供给量过高，并不一定意味着更有利于蜜蜂自身的生长发育。因为当饲料中蛋白水平过高时，可能会超过蜜蜂机体所能承受的蛋白水平，甚至打破蜜蜂机体的氮代谢平衡，引起氮代谢紊乱等。此外，如果日粮中的蛋白水平过高，可能会导致意大利蜜蜂工蜂的卵巢过度发育，最终可能会造成工蜂产卵现象（Human等,2007），这种现象对于整个蜂群来说是不利的。目前已有研究表明，粗蛋白水平对蜂群有重要的影响，蜂群日粮中如果粗蛋白水平低于20%时，蜂群不能够进行正常的生产工作。花粉中的蛋白组分一般因种类等不同而略有差别，花粉中如果蛋白组分很少，则需要通过摄入量更多花粉，以此来满足蜜蜂的8 山东农业大学硕士学位论文正常发育所需的蛋白质，相应的如果蛋白组分多的花粉，则需要摄入少量的花粉，即可满足蜜蜂所需的蛋白质（Kleinschmidt&Kondos,1976）。对于大田状态下的意大利蜜蜂来说，幼虫期蛋白水平不能低于25%、最佳蛋白水平是30-35%，成蜂期蛋白水平不能低于20%、最适宜的水平为30%（李成成，2011）。对于生产蜂王浆时期的意大利蜜蜂来说，日粮蛋白水平为25-30%，最有利于蜂王浆的生产，且此时蜂王浆的品质、产量最佳（王改英，2011）。由于受到如生产阶段、蜂种、发育期等诸多因素的限制，目前蜜蜂的蛋白质营养需要研究的并不全面和系统，蜜蜂的氨基酸营养需要更是研究的很少、更不系统和规范。因此对于蜜蜂来说，这些研究还需继续全面、系统和深入的进行。争取早日将较为完善的蜜蜂蛋白质和氨基酸营养需要的理论数据公布，最终实现促使养蜂产业的积极、健康地发展。1.3氨基酸营养需要的研究方法氨基酸营养需要：是指动物处于生长环境良好、体况良好的前体下进行生产时，所需要氨基酸的最低提供量，简称氨基酸营养需要。对于氨基酸营养需要来说，其值并不是个体值，而是根据群体的氨基酸营养需要计算的平均值。常见的研究氨基酸营养需要的方法有：一、测定相关动物机体中氨基酸的组分，根据氨基酸的种类、含量、比例（测定氨基酸的沉积量、氨基酸的利用率等）等确定氨基酸营养需要量。二、根据日粮中的氨基酸含量（或者添加水平），研究动物的生长发育、生产性能等有关的指标（根据一定的梯度在日粮中添加的不同水平的氨基酸，制作相应的曲线，如消化吸收曲线等，确定相应曲线的平衡点），最终根据相关结果确定氨基酸的营养需要量（石桥晃，1990）。目前，如家兔、家禽、肉牛、小鼠、大鼠等的氨基酸营养需要量已经有具体标准(NRC,1977;NRC,1994;NRC,1995;NRC,2000），但是对于意大利蜜蜂来说，还没有具体的氨基酸营养需要量或者与氨基酸有关的饲养标准。因此对于意大利蜜蜂来说，针对氨基酸展开相应的研究工作，是有必要和急切的。蜜蜂的氨基酸等营养需要有如下方法：①采用化学方法测定蜜蜂的体成分等作为基本数据来衡量相应的组分的营养需要量。②测定蜂花粉、人工代用花粉的相关组分，来确定营养需要量。③针对某种营养成分（如氨基酸等），配制具有一系列梯度的人工日粮，先通过饲养蜜蜂，最终测定蜜蜂的生产性能9 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究（如采食量、封盖子面积、幼蜂数量、初生重等）、测定生长发育指标（如王浆腺发育状况等）制作反应曲线，跟据曲线的特征判断某种营养成分的需要量。④测定代谢相关酶（蛋白酶、氧化酶等）的活性反应营养状况。⑤此外还可以通过测定相应的抗氧化指标（如SOD活性、GSH-px活性、MDA含量等）、蜜蜂的抗病力、蜜蜂的抗逆性等，来判断是否有利于蜜蜂的生长发育（李成成等，2010）。本试验采用的是通过饲喂意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）不同色氨酸水平的日粮，测定意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）的生理生化指标（体蛋白浓度、色氨酸体沉积量、MDA含量等）、生长发育指标（存活率、羽化率、化蛹率、王浆腺腺泡尺寸等）、相关基因的表达水平等，并选取其中重要的指标制作拟合曲线，根据拟合曲线的结果计算判断日粮最适的色氨酸水平。1.4本研究的目的和意义色氨酸是蜜蜂生长发育的必需氨基酸之一，在畜禽方面色氨酸的作用已有相关研究，其主要生理作用包括影响情绪、采食量、抗氧化功能、生长发育，调节免疫应答、以及促进蛋白质合成等。由此可以推测，色氨酸对意大利蜜蜂（Apismellifera）的生长发育及养蜂生产工作也具有重要的作用，亦是意大利蜜蜂不可缺少的营养物质。探索意大利蜜蜂幼虫（成蜂）期适宜色氨酸水平对于科学、健康饲养意大利蜜蜂具有重要意义。本试验通过饲喂意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）不同色氨酸水平的日粮，以色氨酸水平为主要变量，在意大利蜜蜂幼虫基础日粮（蜂王浆、酵母提取物、果糖、葡萄糖、无菌水）的基础上，配制不同色氨酸水平的7种幼虫人工日粮，以油菜花粉、蔗糖、无菌水、色氨酸为原料配制出色氨酸水平不同的6种成蜂人工日粮。通过饲养试验，测定意大利蜜蜂幼虫的化蛹率、幼虫羽化率，取样后测定体蛋白浓度、MDA含量、色氨酸体沉积、成蜂存活率、与色氨酸代谢5-HT途径有关的基因相对表达量等生理生化指标，来探讨意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）饲料中适宜的色氨酸水平。本试验的结果可以为人工饲养意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）、配制工蜂幼虫（成蜂）人工日粮等提供一定的借鉴，还可以为意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）色氨酸营养需要的标准制定提供一定的参考。10 山东农业大学硕士学位论文2材料与方法2.1意大利蜜蜂幼虫饲粮中适宜色氨酸水平的研究研究时间：2013年6月-7月；研究地点：山东农业大学，动物科技学院实验室2.1.1试验对象意大利蜜蜂工蜂幼虫2.1.2试验分组与饲养管理试验选用1日龄工蜂幼虫1008只，随机分为7组，每组3个重复，每个重复48只幼虫用于测定常规生理生化、分子生物学指标，选用1日龄工蜂幼虫2016只，随机分为7组，每组3个重复，每个重复96只幼虫用于测定羽化率及化蛹率，分别饲喂色氨酸水平为7.84mg/g、8.84mg/g、9.84mg/g、10.84mg/g、11.84mg/g、12.84mg/g、13.84mg/g和14.84mg/g的7种日粮。将1日龄工蜂幼虫放入48孔板中，每孔添加150μl饲料，将培养板放入干燥器（95%R.H.15%甘油溶液），干燥器放入培养箱（35℃、90%R.H.）中饲养。每天换一次料。培养至6日龄时，将大幼虫转移至铺满无菌垫纸的24孔板上化蛹(停止饲喂)，9日龄时将蜂蛹转移至新的铺满无菌垫纸的24孔板中，饲养至幼蜂羽化出房。11 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究图3幼虫生长发育过程。注：A，1日龄；B,6日龄；C，白眼期；D，红眼期；E，黒眼期；F，羽化Fig.3Larvalgrowthanddevelopment.Note:A,1dayold;B,6dayold;C,Superciliousperiod;D,RedEyeperiod;E,Blackeyeperiod;F,Feather2.1.3幼虫饲养配方试验采用7种不同色氨酸水平的人工幼虫日粮饲喂意大利蜜蜂幼虫，7种饲料分别记为A、B、C、D、E、F、G，具体配方详见表1。12 山东农业大学硕士学位论文表1幼虫日粮配方Table1CompositionsofLarvalrecipe处理Treatments项目ItemsABCDEFG原料(%)蜂王浆50505050505050Royaljelly葡萄糖6666666Fructose果糖6666666Glucose酵母提取物1111111Yeastextract无菌水3736.936.836.736.636.536.4Sterilewater色氨酸00.10.20.30.40.50.6Tryptophan合计100100100100100100100Total色氨酸营养水平TryptophanNutrientlevel色氨酸含量(mg/g)7.848.849.8410.8411.8412.8413.84Tryptophancontent(mg/g)2.1.4测定指标及测定方法2.1.4.1样本处理方法随机选取5日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫作为分子生物学样品，采用Trizol法提取样品总RNA，用于研究蜜蜂化蛹前相关基因的表达水平。将6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫进行组织匀浆，用生理盐水配置成10%和1%的匀浆液，4℃条件下3000r/min离心10min后取上清。10%匀浆用于测定MDA和T-AOC，1%匀浆用于测定蜜蜂幼虫虫体蛋白浓度。采用直径20µL毛细采血管汲取6日龄工蜂幼虫血淋巴，用于测定血淋巴中游离色氨酸含量。将饲料、9日龄意大利蜜蜂工蜂蛹用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合酶消化，[]得到蛹体消化液，用于研究蜜蜂色氨酸体沉积。2.1.4.2饲料中色氨酸含量测定饲料消化液，每组3个重复，与重氮化的对苯二胺盐酸（冰浴；50%硫酸环境下亚13 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究硝酸钠催化）反应后，522nm波长，用UV-2450紫外分光光度计测定OD值。用同样的方法制作色氨酸浓度与其相应OD值的标准曲线，并得到线性拟合方程，根据拟合方程计算出饲料中色氨酸含量（mg/g）(靳挺等，2008；任娇艳，2006；Nagaraja,2003;申哲民等，2002)。2.1.4.3幼虫虫体总蛋白浓度测定6日龄幼虫1%的组织匀浆，每组3个重复，采用南京建成的A045-2总蛋白定量测试盒测定幼虫体蛋白浓度。2.1.4.4幼虫血淋巴游离色氨酸含量、9日龄蛹色氨酸体沉积测定6日龄幼虫血淋巴、9日龄蛹消化液，每组3个重复，与重氮化的对苯二胺盐酸盐反应后，在UV-2450紫外分光光度计上，采用紫外分光光度计法测定色氨酸含量(靳挺等，2008；任娇艳，2006；Nagaraja,2003;申哲民等，2002)。2.1.4.5幼虫化蛹率及羽化出房率的测定每组饲养3个重复用于测定幼虫化蛹率和羽化率，每个重复96只幼虫。幼虫化蛹率=幼虫化蛹总数/幼虫总数；幼虫羽化率=幼虫羽化出房总数/幼虫化蛹数。2.1.4.6幼虫虫体MDA含量、T-AOC含量测定6日龄幼虫10%的组织匀浆，每组3个重复，分别采用南京建成A003-1MDA测试盒、A015T-AOC测试盒测定（MDA及T-AOC均用虫体总蛋白含量矫正）。2.1.4.7幼虫色氨酸代谢相关基因表达量的测定2.1.4.7.1提取总RNA并检测纯度（1）通风橱首先用75%的酒精消毒，然后进行30min的紫外消毒，预冷4℃离心机。（2）在冰盒中预冷3套1.5ml离心管，其中一套加入1mlTrizol。（3）将2个工蜂幼虫，放进已加入Trizol的离心管中。用漩涡振荡器振荡裂解，用力摇动10次，待摇匀后，在4℃离心机中，转速12000rpm，10min后离心结束。（4）移至第二套1.5ml离心管中，随后将200μL氯仿移入，用力摇动40次，摇匀后常温放置5min。（6）在4℃离心机中，12000rpm离心15min。将离心管上部的上清转移至第三套1.5ml离心管中。（7）随后移入500μL异丙醇，用力摇动10次，放置10min。（8）在4℃离心机中，12000rpm离心10min。小离心机，转速3000rpm，30s结束离心，14 山东农业大学硕士学位论文抽出剩余的少量异丙醇。（9）移取1000μL75%的乙醇（用0.01%DEPC水配制），继续使用1000μL的移液枪，连续向离心管底部吹气，促使RNA沉淀。（10）在4℃离心机中，7500rpm离心5min。小离心机，3000rpm离心30s。抽出残余75%乙醇，待乙醇挥发至离心管内壁无液珠时，加入50μL配制好的0.01%DEPC水。（11）轻弹离心管，使RNA再次溶解，分装好后，-80℃保存。（12）取20μL分装好的RNA，用0.01%DEPC水稀释至100μL，在紫外分光光度计下测定OD值。如果OD260/280值在1.8-2.0之间，则表示RNA纯度较好，如其值＜1.8则表示RNA可能被蛋白质污染，如其值＞2.2则表明RNA可能已经降解。2.1.4.7.2RNA反转录成cDNA首先要除掉已获得的RNA中的DNA，具体方法见表2，42℃条件下反应2min。除TM掉DNA后，用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)反转录，反转录体系见表3。配好反转录体系后，37℃条件下，每循环进行15min，85℃条件下，对反应体系中的酶进行5s的灭活操作，之后进行反转录。得到的cDNA，-20℃保存。表2gDNA去除体系Table2.gDNAremovalsystem试剂使用量（μL）5×gDNAEraserBuffer2.0gDNAEreaser1.0TotalRNA*1RNaseFreedH2oUpto10○R○R*1:20μL反转录体系中，SYBRGreenqPCR法最多可使用1μg的TotalRNA,TapManProbeqPCR法最多可使用2μg的TotalRNA。表3反转录体系Table3.Compositionofreversetranscriptionsystem试剂使用量（μL）5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）4PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1*1RTPrimerMix1RNaseFreedH2O4步骤1的反应液10*2总体积20*1根据实验目的不同，可以不使用RTPrimerMix，选择OligodTPrimer50pmol/20μL反应体系或者GeneSpecific*Primer5pmol/20μL反应体系。2反应体系可按需要相应扩大。15 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究2.1.4.7.3与色氨酸代谢有关基因PCR的引物基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，以β-actin为内参，采用Primer5.0进行引物设计，委托上海桑尼生物科技有限公司合成引物，引物序列如表4所示。表4基因引物序列Table4Sequencesofgeneprimers目的基因引物序列产物长度登录号TargetgenePrimersequence(5′-3′)ProductlengthGenBanknumber(bp)F:AGAAGAGGCGACAACTGG色氨酸羟化酶TPH357XM_394674R:AAGGGATGGAGCGTGAGGF:ACCGTTGTCGGGAATCTG5羟色胺受体15-HT1receptor148NM_001171108R:TTATCTCGTAAACCGCACCF:CTGCCATTGGTCATTAGTCT5羟色胺受体2α5-HT2αreceptor131FR727107R:TCACGGTAAAGGGAGGTTF:GTAGCCGTGCTTGTAATGC5羟色胺受体2β5-HT2βreceptor154FR727108R:GGTATCGGTCCACGCTTATF:TTTGTTGGTTACCGTTCT5羟色胺受体75-HT7receptor142NM_001077821R:AGAGTCGCATAGATGATAGF:CCGTGATTTGACTGACTACCTβ-肌动蛋白β-action142NM_001185145R:AGTTGCCATTTCCTGTTC2.1.4.7.4RealTimePCR反应PCR反应体系如表5。各引物的稀释倍数和引物是否适当，需要制作标准曲线，根据标准曲线来判定。制作标准曲线的方法是：取各实验组cDNA模板2μL，混合好后，0123456用无菌水依次按照如下倍数稀释：2、2、2、2、2、2、2。标准曲线制作好后，按照其斜率计算出扩增率，其中扩增率为0.9-1.2时最适合。依照相同扩增率的内参、待测定基因的PCR值，通过一定公式计算出要测定的相关基因的相对表达量。实验组相关基因扩增时，要做两次重复，并扩增其相应的内参基因，根据两次重复的相对表达量计算出相关基因的相对表达量。16 山东农业大学硕士学位论文表5RTPCR反应体系Table5.CompositionofRTPCRsystem试剂使用量（μL）TMSYBRPremixExTaq(2×)10PCRForwardPrimer(10μM)0.4PCRReversePrimer(10μM)0.4ROXReferenceDyeⅡ(50×)0.4DNA模版2.0dH2O6.8Total20.02.1.6数据处理数据采用SAS9.2软件进行单因素方差分析（one-wayANOVA）和邓肯氏法（Duncan）多重比较，结果表示为平均值±标准差。P＜0.05表示差异显著。2.2意大利蜜蜂成蜂饲粮中适宜色氨酸水平的研究2.2.1试验对象意大利蜜蜂工蜂2.2.2试验设计2.2.2.1试验分组随机选取1800只新出房的意大利蜜蜂工蜂，用于测定相关的生理生化指标。随机选取另外1800只新出房的意大利蜜蜂工蜂，用于测定采食量。所有的意大利蜜蜂工蜂均来自山东农业大学试验蜂场，取样时间为2014年9月。蜂群被饲养在上下两层的蜂箱内，中间有隔王板。试验蜂场的蜂王，均是具有相同血统的全同胞姊妹蜂王。试验所取的样品，饲养在木质人工饲养盒（23×9.5×5厘米）内。1800只蜜蜂被平均分为6个组，每组3个重复，每个重复100只蜜蜂。人工饲养盒被放在，32℃、相对湿度55-60（RH）的培养箱内，每组试验蜜蜂被分别饲喂色氨酸水平不同的7种人工日粮（表6）。17 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究2.2.3成蜂饲料组成2.2.3.1成蜂饲养配方以油菜花粉、蔗糖、无菌水、色氨酸为原料，配制成色氨酸水平（9、10、11、12、13、14mg/g）不同的6种人工日粮，分别标记为A、B、C、D、E、F具体见表6。其中以饲喂色氨酸水平为9mg/g的人工日粮的组为对照组。表6饲养配方Table6.CompositionofDiets分组Treats项目ItemsABCDEF原料Ingredients（%）油菜花粉Rapepollen353535353535蔗糖Sucrose555555555555色氨酸Tryptophan0.50.60.70.80.91.0无菌水Sterilewater9.59.49.39.29.19.0合计Total100100100100100100色氨酸含量Tryptophan91011121314content（mg/g）注:油菜花粉中色氨酸的含量为：11.71mg/g。2.2.4测定指标及测定方法2.2.4.1饲料中色氨酸含量测定取适量的油菜花粉样品，用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合酶消化，得到的消化液，与重氮化的对苯二胺盐酸（冰浴；50%硫酸环境下亚硝酸钠催化）反应后，522nm波长，用UV-2450紫外分光光度计测定OD值。用同样的方法制作色氨酸浓度与其相应OD值的标准曲线，并得到线性拟合方程，根据拟合方程计算出饲料中色氨酸含量（mg/g）(靳挺等，2008；任娇艳，2006；Nagaraja,2003;申哲民等，2002)。2.2.4.2样本处理方法头胸部组织，在研钵中用液氮研磨。冰浴条件下，将组织转移到离心管中，组织与0.9%生理盐水（w/v），以1:9的比例配制10%组织匀浆。3000rpm离心10min，取上清分装。取分装液的一部分配制按照1:9的比例配制1%组织匀浆，将配制好的1%及10%18 山东农业大学硕士学位论文组织匀浆保存于-20℃。1%组织匀浆用于总蛋白浓度测定，10%的组织匀浆用于测定MDA含量测。蜜蜂头部的组织采用相同的方式处理，并配制成10%的组织匀浆，分装保存于-20℃，用来测定5-羟色胺的含量。测定色氨酸体沉积的头胸部组织，放入研钵中用液氮研磨。将组织称重并转移到5ml离心管中，加入1ml木瓜蛋白酶液（24mg/ml），50℃水浴24h，然后加入1ml风味蛋白酶液（96mg/ml），50℃水浴6h。最后95℃水浴15min，将复合酶灭活。最后用无菌水将消化液定容至4ml。得到的消化液用于测定色氨酸体沉积。2.2.4.3意蜂成蜂体蛋白浓度测定随机选取6日龄工蜂头胸部组织，每组3个重复，每个重复5个头胸部组织。处理成1%的组织匀浆，采用南京建成的A045-2总蛋白定量测试盒测定头胸部组织蛋白浓度。2.2.4.4意蜂成蜂色氨酸体沉积测定随机选取12日龄工蜂头部组织，每组3个重复，每个重复10个头部组织。按照要求处理成头部组织消化液，将得到消化液与与重氮化的对苯二胺盐酸（冰浴；50%硫酸环境下亚硝酸钠催化）反应后，522nm波长，用UV-2450紫外分光光度计测定OD值。用同样的方法制作色氨酸浓度与其相应OD值的标准曲线，并得到线性拟合方程，根据拟合方程计算出头部组织中色氨酸含量（mg/g）。2.2.4.5意蜂采食量的测定随机选取意大利蜜蜂新出房的工蜂，随机分成6组，每组3个重复，每个重复100只蜜蜂，将其放入木质饲养盒，在32℃、相对湿度55-60（RH）的培养箱内饲养。分别饲喂不同色氨酸水平的人工日粮，测定0-3日龄采食量、4-6日龄采食量，计算两次采食量的平均值。2.2.4.6意蜂成蜂王浆腺腺泡尺寸测定每组中随机选取一只8日龄蜜蜂，在解剖镜下解剖王浆腺。用配置好的稀碘液对王浆腺进行染色，制成临时装片。在解剖镜下观察（20×1.5倍），选择6个边界清晰的王浆腺腺泡，测量其直径最长的部分，以像素（pixel）为单位，最后计算6个尺寸的平均值。2.2.4.7意蜂成蜂体重、存活率测定体重测定：随机选取6日龄工蜂，每组3个重复，每个重复10只工蜂，称重，并计算10只工蜂的平均体重。平均体重=10只工蜂体重/1019 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究存活率测定：分别统计3日龄、6日龄、9日龄死亡工蜂的总数，每组3个重复，分别计算每个重复工蜂的存活率（%）。存活率=100×死亡工蜂总数/工蜂总数（%）2.2.4.8意蜂成蜂5-HT含量测定随机选取6日龄工蜂头部组织，每组3个重复，每个重复10个头部组织，并制作10%头部组织匀浆。用北京雅安达生物技术有限公司的蜜蜂5-羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒测定蜜蜂头部组织的5-HT含量。2.2.4.9意蜂成蜂体MDA含量测定随机选取6日龄工蜂头胸部组织，每组3个重复，每个重复5个头胸部组织。处理成10%的组织匀浆，采用南京建成的A003-1MDA测试盒测定头胸部组织MDA含量（用头胸部组织蛋白浓度矫正）。2.2.4.10意蜂成蜂色氨酸代谢相关基因表达量的测定2.2.4.10.1提取总RNA并检测纯度（1）通风橱首先用75%的酒精消毒，然后进行30min的紫外消毒，预冷4℃离心机。（2）在冰盒中预冷匀浆管，吸取1ml裂解液（RZ）于匀浆管中。（3）取2只蜜蜂，将其放入已经加入裂解液RZ的匀浆管中。用匀浆仪进行匀浆，15-30℃放置5min，上下摇动，使其摇匀，在4℃离心机中12000rpm离心，5min后结束离心。（4）离心后吸取匀浆管上层液体，将其移入1.5ml离心管中，并加入200μL氯仿，上下摇动15秒，常温放置3min。（6）在4℃离心机中，12000rpm离心10min。吸取上层液体，并将其移入第三套1.5ml离心管中。（7）将250μL无水乙醇移入以上离心管中，上下摇动，将得到悬浊液一起转入吸附柱（CR3）中，在4℃离心机中，12000rpm离心30秒，弃掉废液。（8）吸附柱（CR3）中加入500μL去蛋白液RD，在4℃离心机中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。（9）CR3中加入700μL漂洗液RW，静置2min，在4℃离心机中，12000rpm离心30秒。倒掉废液，重复上一步操作。（10）CR3放入2ml收集管中，在4℃离心机中，12000rpm离心2min，倒掉废液。（11）CR3放入新的1.5mlEP管中，加入50μLRNase-FreeddH2O,室温放置2min，在4℃离心机中，12000rpm离心2min，在离心管中分装后，于-80℃条件下储存。20 山东农业大学硕士学位论文（12）取20μL分装好的RNA，用0.01%DEPC水稀释至100μL，在紫外分光光度计下测定OD值。如果OD260/280值在1.8-2.0之间，则表示RNA纯度较好，如其值＜1.8则表示RNA可能被蛋白质污染，如其值＞2.2则表明RNA可能已经降解。2.2.4.10.2RNA反转录成cDNA方法同2.1.5.7.22.2.4.10.3与色氨酸代谢有关基因PCR的引物基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，以β肌动蛋白为内参，采用Primer5.0进行引物设计，委托上海桑尼生物科技有限公司合成引物，引物序列如表7所示。表7基因引物序列Table7.Sequencesofgeneprimers目的基因Targetgenes引物序列（5’-3’）Primersequences(5’-3’)登录号GenBankNo.色氨酸羟化酶F：AGAAGAGGCGACAACTGGXM_394674TPHR：AAGGGATGGAGCGTGAGG5羟色胺受体1F:ACCGTTGTCGGGAATCTGNM_0011711085-HT1RR:TTATCTCGTAAACCGCACC5羟色胺受体2αF:CTGCCATTGGTCATTAGTCTFR7271075-HT2αRR:TCACGGTAAAGGGAGGTT5羟色胺受体2βF:GTAGCCGTGCTTGTAATGCFR7271085-HT2βRR:GGTATCGGTCCACGCTTAT5羟色胺受体7F:GCAACAGCATCAGCCAGTGNM_0010778215-HT7RR:CAAAGAACGGTAACCAACβ肌动蛋白F:AGTATTCTTGCGGTGTCTCTTTGNM_001185145β-actionR:CGGAGCCATTGTCAACTACG2.2.4.10.4RealTimePCR反应方法同2.1.5.7.42.2.5数据处理数据采用SAS9.2软件进行单因素方差分析（one-wayANOVA）和邓肯氏法（Duncan）多重比较，结果表示为平均值±标准差。P＜0.05表示差异显著。21 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究3结果与分析3.1不同日粮色氨酸水平对意蜂幼虫的影响3.1.1日粮色氨酸水平对意蜂幼虫生长发育的影响3.1.1.1日粮色氨酸水平对意蜂幼虫体蛋白含量的影响色氨酸显著影响6日龄幼虫虫体总蛋白浓度（P＜0.05）。各组幼虫虫体总蛋白浓度总体趋势呈抛物线形，色氨酸水平为7.84—10.84mg/g时，处于上升范围，10.84mg/g时达到峰值，11.84—13.84mg/g时处于下降范围。色氨酸水平为8.84—11.84mg/g与对照组（A组）相比，差异不显著（P＞0.05），色氨酸水平12.84-13.84mg/g与对照组（A组）相比差异显著（P＜0.05）（表8）。根据6日龄幼虫虫体总蛋白浓度制作拟合曲线，以总蛋白浓度为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方22程如下：Y=-0.0087X+0.1714X-0.4308（R=0.8925），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为9.85mg/g时，幼虫体体总蛋白浓度最高。表86日龄幼虫虫体总蛋白浓度Table8Totalproteinconcentrationof6-day-oldlarvae组别饲料色氨酸水平(mg/g)幼虫总蛋白浓度(g/L)GroupsDietarytryptophanlevel(mg/g)Totalproteinlarvalconcentration(g/L)A7.840.39±0.02abB8.840.39±0.03abC9.840.39±0.02abD10.840.43±0.01aE11.840.38±0.01abF12.840.33±0.03bG13.840.27±0.01c注不同字母表示差异显著。下同3.1.1.2日粮色氨酸水平对意蜂幼虫血淋巴游离色氨酸含量、蛹色氨酸体沉积的影响饲料不同色氨酸水平对幼虫血淋巴中的游离色氨酸含量影响差异显著（P＜0.05），饲料色氨酸水平为7.84—11.84mg/g时，血淋巴游离色氨酸含量随饲料色氨酸水平增加22 山东农业大学硕士学位论文而显著上升；饲料色氨酸水平为11.84—13.84mg/g时，幼虫血淋巴游离色氨酸含量随饲料色氨酸水平增加无显著变化。对照组与色氨酸水平8.84—13.84mg/g相比差异显著（P＜0.05），色氨酸水平11.84—13.84mg/g差异不显著（P＞0.05）（图4）。饲料中不同色氨酸水平对9日龄蛹色氨酸体沉积量影响差异显著（P＜0.05）。饲料色氨酸水平为7.84—10.84mg/g时，幼虫色氨酸体沉积量处于上升范围，10.84mg/g时为色氨酸体沉积的峰值，饲料色氨酸水平在11.84—13.84mg/g范围内时，幼虫色氨酸体沉积量处于下降范围。对照组与色氨酸水平10.84、12.84mg/g差异显著（P＜0.05）（图5）。根据9日龄蛹色氨酸体沉积量制作拟合曲线，以色氨酸体沉积量为纵坐标（Y），以2色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方程如下：Y=-0.2984X+6.7666X2–29.533（R=0.6834），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为11.34mg/g时，9日龄蛹色氨酸体沉积量最高。图46日龄幼虫血淋巴游离色氨酸含量Fig.4Hemolymphfreetryptophancontentof6-day-oldlarvae23 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究图59日龄蛹色氨酸体沉积量Fig.5Tryptophandepositionamountof9-day-oldpupae3.1.1.3日粮色氨酸水平对意蜂幼虫化蛹率、羽化率的影响色氨酸水平为7.84—10.84mg/g时，幼虫化蛹率呈上升趋势，10.84mg/g时达到峰值，11.84—13.84mg/g时化蛹率呈下降趋势。对照组与色氨酸水平9.84—11.84、13.84mg/g差异显著（P<0.05）。羽化率与化蛹率趋势一致，10.84mg/g时达到峰值。对照组与色氨酸水平8.84—12.84mg/g差异显著（P<0.05）（表9）。根据幼虫化蛹率制作拟合曲线，以幼虫化蛹率为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性22回归方程如下：Y=-1.7035X+37.576X–119.33（R=0.6224），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为11.03mg/g时，幼虫化蛹率最高。根据幼虫羽化率制作拟合曲线，以色氨酸体沉积量为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回22归方程如下：Y=-3.8617X+80.849X–341.27（R=0.671），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为10.47mg/g时，幼虫羽化率最高。24 山东农业大学硕士学位论文表9幼虫化蛹率及羽化率Table9.Therateoflarvalpupationandeclosion组别饲料色氨酸水平幼虫化蛹率羽化率GroupDietarytryptophanlevel(mg/g)Larvalpupationrate(%)Eclosionrate(%)A7.8470.83±1.20e51.01±1.29eB8.8478.99±0.72c73.45±3.05cC9.8482.64±0.69b82.35±0.15bD10.8497.16±0.71a94.91±1.43aE11.8479.17±1.20b67.58±1.37dF12.8482.95±1.55c42.14±2.30fG13.8475.36±0.72d50.00±0.82e3.1.2日粮色氨酸水平对意蜂虫体MDA含量、T-AOC活性的影响色氨酸水平为7.84—11.84mg/g时，幼虫虫体MDA含量处于低水平，且随饲料色氨酸水平的升高有上升趋势，但差异不显著（P>0.05）。但色氨酸水平继续提高到12.84—13.84mg/g时，幼虫虫体MDA含量迅速增至较高水平，且显著高于其他水平（P＜0.05）（表10）。色氨酸水平为7.84—9.84mg/g时，6日龄幼虫的T-AOC较低，10.84、11.84mg/g时，幼虫T-AOC处于中间水平，12.84、13.84mg/g时，T-AOC最高。对照组与色氨酸水平8.84、9.84mg/g差异不显著（P>0.05），与色氨酸水平10.84、11.84mg/g差异显著（P＜0.05）。色氨酸水平10.84mg/g与12.84、13.84mg/g相比，T-AOC差异显著（P＜0.05）（表10）。表106日龄幼虫T-AOC及MDA含量Table10.T-AOCandMDAcontentof6-day-oldlarvae组别饲料色氨酸水平幼虫MDA含量幼虫T-AOCGroupDietarytryptophanlevel(mg/g)LarvaeMDAcontentLavalT-AOC(nmol/mg(nmol/mgprotein)protein)A7.840.98±0.20b1.82±0.11cB8.840.79±0.06b3.02±0.15cC9.840.85±0.04b4.63±0.14cD10.840.92±0.11b12.59±1.80bE11.841.01±0.04b14.63±1.56abF12.841.78±0.02a18.13±2.19aG13.841.76±0.39a19.24±1.56a25 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究3.1.3日粮色氨酸水平对蜜蜂幼虫5-HT途径代谢相关基因表达量的影响TPH基因相对表达量随日粮色氨酸水平的提高呈先上升后下降趋势，10.84mg/g时表达水平达到峰值且与除11.84mg/g外的其他各处理差异显著（P<0.05）。适中水平的色氨酸（10.84、11.84mg/g）能显著上调5羟色胺受体1基因的表达（P<0.05）。5羟色胺受体2α基因表达水平总体上呈先上升后下降趋势，11.84mg/g时表达水平达到峰值，且与除10.84mg/g外的其他各处理差异显著。5日龄幼虫5-HT受体2β基因表达水平同样呈先上升后下降趋势，在10.84mg/g时，基因表达水平达到峰值。色氨酸对5日龄幼虫5-HT受体1基因表达水平影响差异显著（P<0.05）。5日龄幼虫体5羟色胺受体7基因表达水平总体上呈先上升后下降趋势，色氨酸水平12.84mg/g时表达水平达到峰值且与其他处理差异显著（P<0.05），13.84mg/g时表达水平较高（图6）。根据5日龄幼虫TPH基因相对表达量制作拟合曲线，以TPH基因相对表达量为纵坐标（Y），以色氨酸2水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方程如下：Y=-0.8017X+17.312X–86.3952（R=0.5628），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为10.78mg/g时，5日龄幼虫TPH基因相对表达量最高。图65日龄幼虫TPH、5-HT1R、5-HT2αR、5-HT2βR、5-HT7R基因表达水平Fig.6TPH,5-HT1R,5-HT2αR,5-HT2βR,5-HT7Rgenesexpressionlevelsof5-day-oldlarvae26 山东农业大学硕士学位论文3.2不同日粮色氨酸水平对意蜂成蜂的影响3.2.1日粮色氨酸水平对意蜂成蜂生长发育的影响3.2.1.1日粮色氨酸水平对意蜂成蜂体蛋白含量的影响色氨酸含量增加时，工蜂头胸总蛋白浓度呈抛物线状（P<0.05）（图7）。在9-11mg/g的色氨酸水平时，工蜂头胸总蛋白浓度上升，但色氨酸水平在11-14mg/g的时候下降（P<0.05）（图7）。当色氨酸水平在11mg/g时，工蜂头胸总蛋白浓度最高（P<0.05）（图7）。根据工蜂体总蛋白浓度制作拟合曲线，以工蜂总蛋白浓度为纵坐标（Y），以2色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方程如下：Y=-0.0355X+0.7787X2–3.4507（R=0.5566），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为10.97mg/g时，工蜂体总蛋白浓度最高。图76日龄工蜂总蛋白浓度Fig.7Thetotalproteinconcentrationof6-day-oldworkerbees.3.2.1.2日粮色氨酸水平对意蜂成蜂色氨酸体沉积的影响当色氨酸含量增加时，工蜂的色氨酸体沉积变化也呈抛物线形。当色氨酸水平为27 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究9-12mg/g时，工蜂色氨酸体沉积量逐步上升，但当色氨酸水为12-14mg/g的时候，色氨酸体沉积量下降（P<0.05）（图8）。色氨酸水平为12mg/g时，抛物线达到峰值（P<0.05）。从图中我们可以看出12mg/g水平以后，虽然色氨酸水平继续提高，但色氨酸沉积量并不增加。根据工蜂色氨酸体沉积量制作拟合曲线，以工蜂色氨酸体沉积量为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方程如下：Y=-220.14X+3.0979X–13.377（R=0.8449），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为11.06mg/g时，工蜂色氨酸体沉积量最大。图812日龄工蜂色氨酸体沉积量Fig.8Thetryptophandepositionamountof12-day-oldworkerbees.3.2.1.3日粮色氨酸水平对意蜂成蜂王浆腺腺泡尺寸的影响色氨酸对意大利蜜蜂工蜂王浆腺腺泡尺寸，影响差异显著（P<0.05）（图9）。随着色氨酸水平的上升，王浆腺腺泡尺寸大小呈先增大后减少趋势，其中色氨酸水平为12mg/g时，王浆腺腺泡尺寸最大，显著大于其他色氨酸水平下的王浆腺腺泡尺寸（P<0.05）（图9）。28 山东农业大学硕士学位论文图98日龄工蜂王浆腺腺泡尺寸Fig.9Thehypopharyngealglandacinussizeof8-day-oldworkerbees.3.2.2日粮色氨酸水平对意蜂成蜂生产性能的影响3.2.2.1日粮色氨酸水平对意蜂成蜂采食量的影响色氨酸对意大利蜜蜂工蜂采食量影响差异显著（P<0.05）（图10）。工蜂采食量随着色氨酸水平的增加总体呈先上升后下降趋势，其中色氨酸水平为11mg/g时，工蜂采食量达到峰值，显著高于其他色氨酸水平（P<0.05）（图10）。根据工蜂采食量制作拟合曲线，以工蜂采食量为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回22归方程如下：Y=-0.1895X+4.3665X–17.488（R=0.7657），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为11.52mg/g时，工蜂采食量最高。29 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究图10工蜂采食量Fig.10Thefeedintakeofworkerbees.3.2.2.2日粮色氨酸水平对意蜂成蜂体重、存活率的影响色氨酸对6日龄意大利蜜蜂工蜂体重影响差异不显著（P>0.05）（图11）。色氨酸对意大利蜜蜂工蜂存活率影响差异显著（P<0.05）（表11）。意大利蜜蜂的存活率，随着日龄的增加逐步下降。意大利蜜蜂工蜂存活率随着色氨酸水平的上升，呈先上升后下降趋势，其中色氨酸水平为11-12mg/g时，工蜂的存活率显著高于其他色氨酸水平下的工蜂存活率（P<0.05）（表11）。30 山东农业大学硕士学位论文图116日龄意大利蜜蜂工蜂体重Fig.11Theweightof6-day-oldworkerbees.表113、6、9日龄工蜂存活率（%）Table11Thesurvivalrateof3-day-old,6-day-old,9-day-oldworkerbees(%)色氨酸水平（mg/g）日龄（d）Day(d)Tryptophanlevel(mg/g)369958.20±0.45d38.53±0.37d31.15±0.36d1051.20±1.85e26.75±1.89e18.30±1.91e1179.14±0.97c45.91±1.17c39.07±1.22c1296.83±0.61a90.49±0.62a68.31±0.65a1382.98±0.57b64.90±0.54b50.00±0.53b1438.77±1.14f7.05±1.16f3.08±1.16f3.2.3日粮色氨酸水平对意蜂成蜂MDA含量的影响色氨酸对意大利蜜蜂工蜂MDA含量影响差异显著（P<0.05）（图12）。色氨酸水平为9-12mg/g时MDA含量处于较低水平，显著低于色氨酸水平为13-14mg/g时MDA含量（P<0.05）（图12）。31 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究图126日龄工蜂MDA含量Fig.12TheMDAcontentrationof6-day-oldworkerbees.3.2.4日粮色氨酸水平对意蜂成蜂5-HT途径的影响3.2.4.1日粮色氨酸水平对意蜂成蜂5-HT含量的影响色氨酸水平对意大利蜜蜂成峰5-HT含量的影响差异显著（P>0.05）（图13）。随着色氨酸水平的增加，意大利蜜蜂工蜂5-HT含量先上升后下降，色氨酸水平为11-12mg/g时，5-HT含量显著高于其他色氨酸水平下的含量（P>0.05）（图13）。图136日龄工蜂5-HT含量Fig.13The5-HTcontentrationof6-day-oldworkerbees.32 山东农业大学硕士学位论文3.2.4.2日粮色氨酸水平对意蜂成蜂5-HT途径代谢相关基因表达量的影响色氨酸对意大利蜜蜂工蜂TPH,5-HT1受体,5-HT2α受体，5-HT2β受体，5-HT7受体基因相对表达量影响差异显著（P<0.05）（图14）。随着色氨酸水平增加，TPH基因相对表达量呈先上升后下降趋势，色氨酸水平为12mg/g时，其表达量达到峰值，显著高于其他色氨酸水平下的基因相对表量（P<0.05）（图14）。5-HT1受体基因相对表量，随着色氨酸水平的逐渐增加，呈现为先升高后下降趋势，其中色氨酸水平为12mg/g时，其表达量显著高于其他色氨酸水平下的5-HT1受体基因相对表量（P<0.05）（图14）。5-HT2α受体基因相对表达量，随着色氨酸水平的逐渐增加也呈现先上升后下降趋势，在色氨酸水平为11mg/g时达到峰值（P<0.05）（图14）。色氨酸水平为9-12mg/g时，5-HT2β受体基因相对表量逐步上升，色氨酸水平为13-14mg/g时，其表达量逐步下降（P<0.05）（图14）。色氨酸水平为10-12mg/g时，5-HT2β受体基因相对表量显著高于其他色氨酸水平下的基因表达量（P<0.05）（图14）。5-HT7受体基因相对表达量在色氨酸水平为9-13mg/g时处于较低水平，色氨酸水平为14mg/g时处于较高水平（P<0.05）（图14）。根据工蜂5-HT2α受体基因相对表达量制作拟合曲线，以工蜂5-HT2α受体基因相对表达量为纵坐标（Y），以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方22程如下：Y=-0.0732X+1.5779X–7.2917（R=0.6109），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为10.78mg/g时，工蜂5-HT2α受体基因相对表达量最高。根据工蜂5-HT2β受体基因相对表达量制作拟合曲线，以工蜂5-HT2β受体基因相对表达量为纵坐标（Y），2以色氨酸水平为横坐标（X）。得到近似的非线性回归方程如下：Y=-0.0841X+1.8082X2–8.4856（R=0.9801），根据回归方程，可以计算出当色氨酸水平为10.75mg/g时，工蜂5-HT2β受体基因相对表达量最高。33 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究图146日龄工蜂基因相对表达量Fig.14Therelativeexpressionofgenesof6-day-oldworkerbees.4讨论4.1色氨酸影响意大利蜜蜂生长发育4.1.1色氨酸影响意大利蜜蜂体蛋白含量研究表明：色氨酸是比较特殊的氨基酸，其不仅能组成蛋白质，还能对蛋白质的生成过程产生影响，还能够与其他氨基酸相互作用。在人和哺乳动物体内，肝脏是蛋白生成的主要部位，色氨酸对哺乳动物等蛋白质的生成过程的影响，即是通过影响该部位来实现的（李剑欣等，2005；Le&Seve，2007；Pastuszewska等,2007；Le等,2011）。蜜蜂没有肝脏，但是其具备类似肝脏功能的器官。大量试验表明，昆虫的脂肪体具备生成蛋白质的功能（Roma等，2010）。研究还发现，昆虫贮藏蛋白在昆虫变态发育时期具有重要作用，主要是作为氨基酸贮存库，为昆虫发育构成组织架构（Haunerland等，1996）。因此昆虫贮藏蛋白多少，能反映昆虫的发育程度及健全与否。由此也可以推测，昆虫虫34 山东农业大学硕士学位论文体总蛋白越丰富，昆虫发育的可能越健全。通过意大利蜜蜂幼虫人工饲养试验发现色氨酸对6日龄意大利蜜蜂幼虫体总蛋白浓度影响差异极显著，色氨酸水平为10.84mg/g时虫体总蛋白浓度最高，说明10.84mg/g的色氨酸水平有利于意大利蜜蜂幼虫虫体总蛋白的合成，此水平可能对意蜂工蜂幼虫的健康生长最为有利。通过意大利蜜蜂工蜂人工饲养试验发现色氨酸对6日龄意大利蜜蜂工蜂体总蛋白浓度影响差异显著，色氨酸水平为11mg/g时，工蜂体总蛋白浓度最高，说明对于意蜂工蜂来说，11mg/g色氨酸水平最有利于其蛋白合成，此水平也最利于工蜂生长发育。4.1.2色氨酸影响意大利蜜蜂幼虫血淋巴游离色氨酸及成蜂色氨酸体沉积量有研究发现，日粮中色氨酸含量不同时，血清中色氨酸的含量具有显著差异（Ma等，2012）。饲料中色氨酸水平逐步增加，血清中游离色氨酸含量先增加，后稳定在一定水平，且能够影响色氨酸的体沉积量（席鹏彬等，2011）此外还有研究表明，必需氨基酸在动物体内沉积的越多，代表该饲料的利用程度越高，也表明了该饲料的质量越高（赵振山,林可椒，1995）。饲料的营养成分能够影响肉仔鸡的生长，并能够用来预测营养成分的营养需要（Carrasco等，2014）。由此推断，色氨酸类营养物质在一定水平范围内，可能会随着其营养水平的增加在体液中的含量逐渐增加，但是超过机体所需的最适水平后吸收效率及利用率可能会降低，具体可能表现在体沉积会相应减少。本研究中色氨酸含量在7.84-11.84mg/g范围内时，意大利蜜蜂幼虫血淋巴中游离色氨酸含量会随着日粮中色氨酸含量的上升，而呈逐步上升趋势，但是当色氨酸含量继续增加（至12.84，13.84mg/g）时，血淋巴中游离色氨酸含量持续保持在较高水平，不再出现显著上升，Ma等通过实验也得出了相似的研究结果。日粮色氨酸含量为7.84-10.84mg/g时，随着色氨酸含量的逐步上升，色氨酸体沉积量也随之上升，并于10.84mg/g时呈现峰值，11.84-13.84mg/g时体沉积量反而下降。综上认为日粮色氨酸含量为10.84-11.84mg/g时，蜜蜂幼虫对色氨酸的吸收效率及利用率可能最高。对于意大利蜜蜂工蜂来说，色氨酸水平为9-12mg/g时，色氨酸体沉积量逐步上升，在色氨酸含量为12mg/g时到达峰值，此后色氨酸含量为13-14mg/g时，色氨酸体沉积量迅速下降至较低水平（P<0.05）。因此对于工蜂来说色氨酸含量12mg/g时，其对饲料中色氨酸的消化吸收利用率可能最高。35 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究4.1.3色氨酸影响意大利蜜蜂幼虫化蛹率、羽化率意蜂幼虫的化蛹率、羽化率，是直接反映意蜂幼虫是否发育健全的重要指标。有人研究了必需氨基酸缺乏或者蛋白质缺乏对昆虫生长、生殖等的影响，研究发现意大利蜜蜂营养缺乏会导致其寿命缩短、降低其产卵力、抑制其腺体发育、使其体重下降及抗病力下降等（Alaux，2010；Avni，2014）。研究还认为营养水平对意大利蜜蜂的级型分化具有重要的影响，并且还能影响意大利蜜蜂幼虫的发育过程，如果空间条件一致的情况下，营养水平对工蜂幼虫将来成长为蜂王或者工蜂起着至关重要的作用（石元元，2011）。由此推断，影响蜜蜂化蛹和羽化的因素可能很多，其中营养因素的作用不容忽视，营养不良的意大利蜜蜂幼虫可能不能正常化蛹和羽化，相反营养充足的意大利蜜蜂幼虫可能更容易正常羽化和发育。根据色氨酸在意大利蜜蜂体内的主要代谢通路，我们推测色氨酸影响意大利蜜蜂工蜂幼虫羽化率的主要机理可能是：首先色氨酸能够影响工蜂幼虫贮存蛋白合成（李剑欣等，2005；Le&Seve，2007；Pastuszewska等,2007；Le等,2011），而幼虫贮存蛋白是其生长发育的氨基酸贮存库（Haunerland，1996），因此能够直接影响工蜂幼虫是否能正常化蛹及羽化。其次色氨酸能够影响包括MDA含量及T-AOC（Tamer，2002；Suji﹠Sivakami,2008；Bitzer等，2010）,还能够通过中间产物5-HT清除自由基及抑制超氧化物产生（李剑欣，2005；Tamer，2002；Suji&Sivakami,2008；Bitzer等，2010），从而影响工蜂幼虫的抗氧化功能，而抗氧化功能强弱与幼虫能否正常发育直接相关因此能够影响其化蛹率及羽化率。再次是色氨酸能够影响5－HT受体1、2α、2β、7的活性（Blenau，2011），通过这些主要受体的作用影响其化蛹率及羽化率。还有一种可能是，色氨酸通过其代谢途径影响幼虫体内维生素、脂肪酸等的代谢（李剑欣，2005），从而影响羽化率及化蛹率。本研究结果显示，色氨酸水平能显著影响意大利蜜蜂工蜂幼虫的化蛹率及羽化率（P<0.05）。色氨酸含量为7.84-10.84mg/g时，意大利蜜蜂幼虫的化蛹率和羽化率呈上升趋势，10.84mg/g时达到峰值，11.84-13.84mg/g时化蛹率及羽化率呈下降趋势。由此可以推断色氨酸含量过低或过高，可能均会导致意大利蜜蜂幼虫不能正常化蛹和羽化。色氨酸含量为10.84mg/g时，可能是意蜂工蜂幼虫正常的化蛹和羽化所需要的最适宜的含量。4.1.4色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂王浆腺腺泡尺寸发育蜂花粉或者人工日粮中蛋白水平不同，能够显著影响年轻工蜂的王浆腺腺泡的尺寸36 山东农业大学硕士学位论文及王浆腺的发育。日粮蛋白水平还与工蜂的免疫应答反应、群势等有关系，人工日粮中添加蛋白甚至有可能预防群势减少。这是由于花粉或者人工日粮蛋白水平能够影响王浆腺的发育，而王浆腺能够合成蜂王浆饲喂幼虫，从而影响蜂群群势（DeGrandi,2010）。色氨酸是意大利蜜蜂必须氨基酸中的一种，在蜜蜂体内具有很重要的作用，因此我们推测色氨酸也能够影响意大利蜜蜂工蜂的王浆腺的发育。色氨酸能够影响乳腺的早期发育，其对早期乳腺的发育的影响主要是通过5-HT的自分泌及旁分泌介导的调节器进行调节。上皮细胞中的5-HT可以作为机体内环境的旁分泌或则自分泌的调节剂（Matsuda，2004）。工蜂体内没有乳腺，但是有类似功能的王浆腺。因此我们推断，色氨酸影响工蜂王浆腺的发育是通过TPH催化色氨酸产生的5-HT（即5-HT途径）发挥作用的。本试验中色氨酸水平为12mg/g时，王浆腺腺泡尺寸显著大于其他色氨酸水平下的王浆腺尺寸（P<0.05）。由于王浆腺发育的越完善，其合成的蜂王浆越多，蜂王浆的产量越高，因此王浆腺的发育状况是衡量蜂王浆产量的一个衡量指标。由此我们根据试验结果推断，色氨酸水平为12mg/g时可能最有利于王浆腺的发育及蜂王浆的生产。4.2色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂生产性能4.2.1色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂采食量目前大量试验发现，色氨酸能够通过影响食欲来影响采食量（Le等,2011;Panella等,2009;Le&Seve，2007）。如猪的日粮中色氨酸不足时，会导致大脑中枢中的色氨酸含量降低，食欲减退、采食量减少。由于饲料中缺乏色氨酸，导致食欲下降的机理目前还不是很明确。但是支持较多的观点是：饲料色氨酸缺乏导致血脑屏障中的色氨酸含量下降，并且间接影响了5-HT在生物体内的最终生成量，而5-HT被视为饥饱感的调节剂。5-HT发挥调节食欲的作用，还受到蛋白等能量物质的影响。此外还有一种假说支持比较多：大脑中存在着色氨酸与其他氨基酸比例感应中枢，当这个比例发生改变的时候，就会激发这个感应中枢，产生食欲的抑郁症，并最终到导致食欲下降，这种影响是非特异性的。色氨酸在机体外周还可能通过影响胰岛素的分泌来影响食欲（色氨酸缺乏促进食物的胃排空速率及葡萄糖吸收率或者抑制消化道粘膜释放肠促胰岛素、血糖介导的胃肠道促胰岛素多肽的释放），具体体现在色氨酸通过影响生长激素释放肽、胃肠激素等来参与采食量的调节（Le&Seve，2007）。一般来说，饲料的采食量高低能反映饲37 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究料的适口性好坏，适口性越好，饲料的采食量越高。本试验中，随着日粮色氨酸含量的逐步变化，工蜂采食量首先逐步上升随后逐渐下降，色氨酸含量为9-11mg/g时，处于上升期，12-14mg/g处于下降期，色氨酸水平为11mg/g时处在峰值的位置（P<0.05）。因此可以推断饲料色氨酸含量为11mg/g时，饲料的适口性最好、动物的食欲最好、采食量最高。4.2.2色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂体重及存活率本试验的结果可以看出，色氨酸对6日龄意大利蜜蜂工蜂体重影响差异不显著（P>0.05）。这可能是由于，体重收到包括日粮中蛋白水平、机体发育状况、食物的消化率等诸多因素的影响，不仅仅因为日粮中单一营养素的变化而产生显著的变化。因此也给了我们一个启示，即在蜜蜂的日常生产中不能仅仅通过测量工蜂的体重来判断蜜蜂发育状况好坏，还要结合其他更多的生理生化指标、分子生物学指标来综合判断。意大利蜜蜂工蜂的寿命，能够显著影响蜂群趋势，寿命越长群势越强，相反则群势越弱(Schmid,1993)。因此工蜂的寿命是衡量蜂群生产性能的一个重要指标，工蜂的寿命可以用存活率或者死亡率来反映，本试验采用的是测定存活率来反映工蜂的寿命。饲料中的营养缺乏能导致蜜蜂寿命减少、群势下降、腺体发育不良、抗病力下降、体重减少等，只有营养均衡才能有利于蜂群的健康发展（Dorit，2014）。由此可见，工蜂的寿命不仅是蜂群群势好坏的反映，还是蜂群日粮营养成分是否均衡的反映，只有日粮的营养全面工蜂的寿命可能才能更长。本试验结果，可以看出，随着日龄的增加逐步上升，工蜂的存活率均下降，但是不同的色氨酸水平下工蜂的存活率不同（P<0.05）。其中色氨酸含量为12mg/g时，工蜂的存活率显著高于其他色氨酸水平下的存活率（P<0.05）。由此可知，可能色氨酸含量为12mg/g，是意蜂工蜂生长发育的最适含量。色氨酸含量过高，反而降低工蜂的存活率说明，日粮的色氨酸含量如果超出了机体的最适浓度，可能会导致机体的负担加重，甚至给机体造成伤害。4.3色氨酸影响意大利蜜蜂抗氧化功能关于色氨酸对生物体抗氧化及免疫能力影响的研究已有很多。现有的研究发现，色氨酸能影响动物机体的免疫功能，具体体现在色氨酸通过羟化生成5-HT，5-HT不仅能清除自由基，还能防止过多超氧化物的产生，从而增强机体免疫能力（李剑欣等，2005；Le等，2011；Wen，2014；Terrón，2009）。意大利蜜蜂工蜂幼虫试验中发现，色氨酸含38 山东农业大学硕士学位论文量为7.84-11.84mg/g时，MDA含量较低，12.84-13.84mg/g时MDA含量较高。色氨酸含量在7.84-9.84mg/g时，T-AOC活性较低，随着色氨酸含量增加（10.84-11.84mg/g）时，T-AOC活性处在中间位置，色氨酸含量增加至12.84-13.84mg/g时，T-AOC达到高水平。表面上看MDA和T-AOC结果好似相反，其实不然。生物体中MDA与生物体内的脂类代谢有关，MDA是这些反应的代谢产物，其含量高低能表示机体受到氧化反应损害程度严重与否，其含量越高说明生物体受到的氧化损伤程度越大，（Bitzer等，2010；suji等，2008）。T-AOC能综合反应生物体抗氧化功能的强弱，与MDA能共同反应机体抗氧化能力强弱,T-AOC与MDA含量具有负相关关系，T-AOC活性低，则MDA含量高（Tamer等，2002）。由此可以推断，蜜蜂幼虫体内MDA含量越低、T-AOC的活性越高，虫体抗氧化能力越强、越有利于其生长发育。T-AOC活性在12.84-13.84mg/g时最高，可能是由于幼虫机体反馈调节所致，因为当虫体受到抗氧化损伤时，虫体可能会通过一系列反应（如分泌抗氧化酶等），来提高抗氧化能力。综合试验结果表明，色氨酸水平为10.84-11.84mg/g时，意大利蜜蜂幼虫的抗氧化功能较强。意大利蜜蜂工蜂试验中，MDA含量随着色氨酸水平的逐步上升呈现，先稳定在一定的水平，后迅速上升至较高水平，其中色氨酸水平为13-14mg/g时MDA含量显著与其他色氨酸水平下的MDA含量。根据MDA的作用及MDA含量与T-AOC的反比关系，我们推测可能色氨酸水平为9-12mg/g时，意大利蜜蜂工蜂的抗氧化功能可能较强，色氨酸水平超过13mg/g时，工蜂机体抗氧化功能可能下降，且可能不利于机体的生长发育。4.4色氨酸影响意大利蜜蜂5-HT途径4.4.1色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂5-HT含量色氨酸在工蜂体内，经过TPH的催化生成5-HT，5-HT通过其主要的受体（5-HT1R、5-HT2αR、5-HT2βR、5-HT7R）发挥作用（Blenau&Thamm,2011）。5-HT是神经系统中的一种重要的传递神经信号的因子，能发挥很多重要的生理作用。5-HT可以作为一种饥饱感的调节因子，通过影响生长激素释放肽、胃肠激素等来参与动物机体采食量的调节和控制（Le&Seve，2007）。对于意大利蜜蜂工蜂来说，其机体内环境中的5-HT可能还能通过影响5-HT自身的自分泌及旁分泌介导的调节器，来调节王浆腺腺体的发育，39 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究5-HT是该调节过程中的重要的信号因子（Matsuda，2004）。5-HT还能在机体抗氧化功能方面发挥重要的作用，具体体现在其能够清除自由基及抑制超氧化物的生成(Wen等,2014;Le等,2011;Terrón等,2009)。本试验中，随着色氨酸含量的逐步上升，5-HT的含量先升高后先降低，色氨酸含量为12mg/g时达到峰值，其中色氨酸含量为11-12mg/g时，5-HT含量显著高于其他色氨酸含量下的5-HT含量，随着色氨酸含量的继续上升，5-HT含量反而下降说明了，色氨酸水平超过工蜂的最适含量后可能不利于5-HT的合成及发挥功能。根据5-HT的功能我们推断，可能色氨酸含量为11-12mg/g时最有利于意大利蜜蜂工蜂的生长发育。4.4.2色氨酸影响意大利蜜蜂5-HT途径代谢相关基因的表达4.4.2.1色氨酸影响意大利蜜蜂幼虫5-HT途径代谢相关基因的表达研究表明，意大利蜜蜂体内色氨酸代谢的主要通路是以TPH为关键酶，并最终通过生成5-HT来发挥作用（Blenau&Thamm，2011）。本研究结果表明，色氨酸水平对意大利蜜蜂幼虫TPH基因表达量有显著影响（P<0.05）。色氨酸含量为7.84-10.84mg/g时，TPH基因表达量随着色氨酸含量的升高呈上升趋势，10.84-11.84mg/g时，TPH基因表达量达到峰值，12.84-13.84mg/g时，TPH基因表达量迅速降到很低。由酶与底物浓度的关系推测（胡兰，2006），7.84-9.84mg/g时虫体色氨酸含量很低，TPH过剩，所以TPH基因表达水平不高，10.84-11.84mg/g时，TPH不足，因此TPH基因表达上调，12.84-13.84mg/g时，TPH处于饱和状态，5-HT途径受到最大程度的激活，所以TPH基因表达量表现为很低。由此可见，10.84-11.84mg/g的色氨酸水平能够显著刺激其代谢途径中的关键限速酶—TPH的表达，从而使色氨酸的功能在5-HT途径中得到最佳的发挥。色氨酸代谢的羟化产物5-HT在传递神经信号中发挥着重要的作用，其发挥作用时，首先要与其受体结合。有研究发现意大利蜜蜂体内主要有4种5-HT受体，这些受体主要分布在意大利蜜蜂大脑蘑菇体中，它们分别是5-HTR1、5-HTR2α、5-HTR2β、5-HTR7。研究还表明，色氨酸代谢产生的5-HT通过作用5-HTR1，影响蜜蜂的视觉、嗅觉、学习、记忆、趋光行为等。对于另外3种受体蜜蜂中的研究还很少，但是果蝇方面的研究可以提供借鉴，研究表明5-HT通过作用于5-HTR2（2α、2β），减少果蝇的攻击性行为，通过作用于5-HTR7抑制果蝇的攻击行为（Blenau&Thamm，2011）。本研究发现，色氨酸对5日龄蜜蜂幼虫5-HT受体（1、2α、2β、7）基因的表达有显著影响（P<0.05）。色40 山东农业大学硕士学位论文氨酸含量为7.84-10.84mg/g时，5-HT受体1、2α、2β基因表达量受到上调，10.84-11.84mg/g时表达量显著高于其他水平，12.84-13.84mg/g时，5-HT受体1、2α、2β基因表达量受到下调。随着色氨酸水平的升高，5-HT受体7基因表达量受到上调。5-HT受体1、2α、2β活性可能与TPH类似，遵循酶与底物关系规律（胡兰，2006），受体表达过剩时相应受体基因表达减少、不足时基因表达上升、饱和时表达下降。5-HT受体7为激活腺苷酸环化酶型G蛋白欧联受体（Qiu，2009；Gao等，2013；Kmiecik，2014），可能因此随着色氨酸水平上升呈持续激活状态，因而表达量持续上升。由5-HT受体的功能可以推测，5-HT受体1、2α、2β活性越高，对于意大利蜜蜂幼虫的生长发育越有利，因为蜜蜂幼虫需要储备成蜂所具有的学习、记忆、攻击防卫等能力。5-HT受体7具有抑制意大利蜜蜂攻击行为的功能（Blenau&Thamm，2011），还具有潜在影响感觉、调节昼夜节律、调节体温和情绪等功能（Hannon&Hoyer，2008）。由此可以推断，5-HT7R基因表达量过低时可能不能充分发挥其作用，工蜂幼虫可能会对外界的环境因素过于敏感而产生过多的应激反应，从而影响其正常生长发育。相反当5-HT7R基因表达量过高时，其发挥作用可能过强，从而可能过分抑制了工蜂幼虫对外界环境因素的感知能力、可能导致昼夜节律不正常等。对于工蜂幼虫来说只有对外界环境因素正常感知且不过于敏感、昼夜节律正常，才能正常发育和生长，因此5-HT7R基因可能只有表达适中时才能发挥其正常的功能。综上可以推断，色氨酸水平为10.84-11.84mg/g时可能最有利于意大利蜜蜂幼虫5-HT受体（1、2α、2β、7）发挥最佳的调节作用。4.4.2.2色氨酸影响意大利蜜蜂成蜂5-HT途径代谢相关基因的表达在意蜂工蜂体中的色氨酸，发挥主要作用的通路也是5-HT途径，色氨酸通过TPH作用下逐渐变成5-HT（Blenau&Thamm，2011）。意大利蜜蜂工蜂试验中可以发现，色氨酸含量为12mg/g时，TPH基因相对表量最高，显著高于其他色氨酸水平下的相对表达量（P<0.05）。说明此色氨酸水平下，TPH基因能显著表达，5-HT途径能最大程度的激活。5-HT是一种主要存在于神经系统的神经递质，主要是通过其受体发挥（5-HT受体1、5-HT受体2α、5-HT受体2β、5-HT受体7）作用（Blenau&Thamm，2011）。工蜂5-HT受体1的主要作用，是影响视觉、嗅觉、学习、记忆、趋光行为。对于工蜂5-HT受体2α、2β、7的功能，目前研究的很少，但是果蝇的研究可以为我们提供借鉴，它们都在工蜂的情绪调节方面发挥功能，5-HT受体2α、2β能减少在黑腹果蝇的攻击性行为，5-HT受体7能抑制黑腹果蝇的攻击性行为（Blenau&Thamm，2011）、还具有潜在影响感觉、调节昼夜节律、调节体温和情绪等功能（Hannon&Hoyer，2008）。41 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究根据工蜂体内不同受体的功能，我们可以推断，5-HT受体1、2α、2β基因的相对表达量较高时，可能比较有利于工蜂生长发育。5-HT受体7则不同，因为其相对表达量如果过高，则可能会抑制工蜂的攻击行为，最终甚至会导致工蜂丧失防卫蜂巢的能力，如果其相对表达量过低，则可能不能充分发挥受体的功能，工蜂可能会情绪暴躁，易攻击养蜂人，不利于养蜂生产工作。意大利蜜蜂工蜂试验结果可以看出，5-HT受体1基因相对达表量在色氨酸含量为12mg/g时最高，5-HTR2α基因的相对表达量在色氨酸含量为11mg/g时最高，5-HTR2β基因的相对表达量在色氨酸水平为10-12mg/g时最高，5-HTR7基因的相对表达量在色氨酸含量为9-13mg/g时适中，在色氨酸含量为14mg/g时表达量显著高于其他色氨酸含量下的相对表量。综上，可以推断出，色氨酸含量在11-12mg/g时，可能最有利于TPH、5-HT受体（1、2α、2β、7）发挥最佳的调节作用。5结论及创新点5.1结论结论1：日粮色氨酸水平能够显著影响意大利蜜蜂工蜂幼虫的体蛋白含量、色氨酸体沉积、化蛹率及羽化率等。意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料中适宜的色氨酸水平为9.85-11.34mg/g，该色氨酸水平能够有利于意大利蜜蜂工蜂幼虫正常生长发育。结论2：日粮色氨酸水平能够显著影响意大利蜜蜂工蜂成蜂的体蛋白含量、色氨酸体沉积、王浆腺腺泡发育及存活率等。意大利蜜蜂工蜂成蜂饲料中适宜的色氨酸水平为10.75-11.52mg/g，该色氨酸水平能够有利于意大利蜜蜂工蜂成蜂正常生长发育及提高生产性能。5.2创新点本试验在实验室人工饲养意大利蜜蜂幼虫、成蜂研究的基础上，通过配制人工日粮，进行饲养试验，通过测定生产性能、生理生化指标、分子生物学指标等来探究意大利蜜蜂幼虫、成蜂饲料中适宜的色氨酸水平。本试验结果可以为养蜂生产中如：人工饲养意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）、配制工蜂幼虫（成蜂）人工日粮等提供一定的借鉴，还可以为意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）色氨酸营养需要的标准制定提供一定的参考。本试验42 山东农业大学硕士学位论文还在测定饲料中色氨酸含量、幼虫血淋巴中游离色氨酸含量、幼虫体及工蜂色氨酸体沉积量方面，采用了复合酶（木瓜蛋白酶+风味蛋白酶）消化法，此法解决了传统饲料用浓硫酸或者浓碱等消化时，色氨酸被破坏无法测定的问题。5.3后续工作及展望本试验由于试验时间及试验技术等诸多方面的限制，目前只进行了意大利蜜蜂幼虫、成蜂的实验室饲养试验，并未来得及进行自然状态下大群验证试验，实验室条件可控，有可能在自然环境下条件更多变，因此试验后续还需要进行大群饲喂进行验证试验结果。此外虽然色氨酸在意大利蜜蜂体内的5-HT途径发挥着重要作用，在本试验的结果中也进行了一定的验证和讨论，但是其具体的作用机理和色氨酸在意大利蜜蜂体内发挥作用的主要通路还有待未来试验中进行全面深入的研究和探讨。由于目前国际和国内没有关于意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂色氨酸营养需要的标准及饲养标准，因此本试验结果可以为养蜂生产中如：人工饲养意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）、配制工蜂幼虫（成蜂）人工日粮等提供一定的借鉴，还可以为意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）色氨酸营养需要的标准制定提供一定的参考。本试验的后续工作是，在自然条件下饲养意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂），验证在实验室条件下得到的适宜色氨酸水平是否准确，届时结合本试验的结果，可以为意大利蜜蜂工蜂幼虫（成蜂）生产中的人工代用花粉（饲料）配制提供借鉴，有利于蜂农更好的配制工蜂饲料，能够促进蜂业健康发展，也可以为确立意大利蜜蜂工蜂幼虫、成蜂色氨酸营养需要提供一定的借鉴和参考。43 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山东农业大学硕士学位论文致谢本试验的研究成果是在胥保华教授的精心选题、悉心设计下顺利完成的，试验中遇到困难和缺陷，都是在胥保华老师的悉心指导下解决的，试验的成果充满了胥保华老师的智慧、辛勤和汗水。胥保华老师对工作一丝不苟、孜孜不倦，对学生认真负责、关爱有加、和蔼可亲，对同事随和、大方、平易近人，对学术严谨认真、精益求精。时光飞逝，日月如梭，转眼间三年的研究生生活即将结束了，回首往事历历在目。三年中有好多的经历终生难忘，也好多回忆在脑海中久久难忘。回顾我的研究生生活，想说的最多的就是感谢。感谢有幸加入了胥老师的团队，感谢胥老师三年来对我无微不至的关怀，感谢我们优秀的团队的成员间互助互爱，感谢胥老师为我们提供的优秀平台。恩师的高风亮节的为人处事态度、兢兢业业的工作态度、平易近人的待人风格，一直影响着我，也将在我未来的道路上继续指引着我。三年来我不仅学到了丰富的专业知识、不仅获得了一些学术成果、更多是学会了宝贵的为人处事的能力及乐观面对生活的态度。再次，由衷的感谢我的恩师，感谢您三年来在学习和生活上无微不至的关怀。感谢山东农业大学动物科技学院老师在实验室公共平台上提供的帮助和支持，感谢同学们对我的学习和研究上提供的帮助和支持。在试验设计和准备过程中得到了实验室刘锋博士、孙汝江博士的热心帮助和支持。在蜜蜂饲养试验过程中得到了王颖博士、同级同学王圣伟、李肖、董文滨的帮助和支持。在试验样品测定过程中得到了师兄师姐马兰婷博士、张鸽、张怡丁，师弟师妹张卫星、苏中渠、徐鹏、崔学沛、雷春红、王丽,女友李芳翠的帮助和支持。在此特别感谢王红芳老师等，在我的已发表和待发表的论文修改、数据处理过程中提供的巨大帮助和支持。此外还要感谢动物科技学院开题、论文答辩过程中给予我帮助、支持、建议的老师。在此对以上对我的研究提供支持和帮助的老师、同学表示感谢。感谢我的父母及家人对我的学业支持和帮助，感谢你们对我的生活上无微不至的关怀，感谢你们对我的信任和理解。在即将毕业之际，我将以我的研究成果向你们表达最诚挚的祝福和感激。最后再一次感谢导师胥保华教授对我的培养，以及论文中未提到的对我的试验提供帮助的同学、朋友。祝愿给予我支持和帮助的老师、同学、朋友、家人，一生平安、身体健康。49 意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜色氨酸水平研究攻读学位期间发表论文情况1.赵凤奎,胥保华.蜂花粉的抗氧化作用[J],中国蜂业,2013,64:38-43.2.赵凤奎,胥保华,王红芳.意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平[J].中国农业科学,2015,48(7):1453-1462.3.ZHAOFengkui,WANGHongfang,XUBaohua.TheappropriatesupplementaryleveloftryptophaninthedietofApismelliferaworkerbee[J].Animalsciencejournal，2015，(审稿中)50 山东农业大学硕士学位论文项目资助国家蜂产业技术体系建设专项资金（CARS-45）、山东省农业良种工程项目“优质高产蜜蜂及蚕桑新品种培育”(2014-2016)51