意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究 51页

鞭ｐ？龍师嚷議誦腾＾＇’．心：说９４．９＾．巧予学位单位代码分类号ｔ声：１０４３４．：皆：：苗：；＾山．鴻、掉《义戀方又’…ｉ：．…；＇＇扣‘－Ｖ。；苗难＾义＇、＊－－’、、？＇．’．、－；；？．心，节．＾．、ｖ这却＇？兰．；心够．．．ｒ：乃Ｉ＇巧斯逸壶义當ｆ会？Ｗ々八寻‘碱；罐乂會承；蘇输鄉；蔡＾＾＂－｜：１．１，、＊－、、．雜敕靴超＞Ｉ‘、辱．‘＾＇；：＾＇Ｖ、－＾．令ＶＶ＾严也酵ｔ全日制硕±专业学位论交；扇議Ｉ叫＇．．．．１耐１．麵■？？‘’■■、－…．％：；，；巧、也．＾＂ｋ看丈韩蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工縣粮发薛影响、、、壽輸ｉ＇＇、蔡茲■因素的探究埼心镇ｅ‘Ｊ；打ＴｈＩｄｅｎｔｉ巧ｃａｔｉｏｎｏｆＳｔｒａｉｎｓｉｎＮａ化ｒａｌＭａ化ｒｅＢｅｅＢｒｅａｄｏｆＶＶ；＼’箭＇々．賊－Ｈｏｎ巧ＢｅｅＡ．ｍｅｌＨｆｅｒａＬ．ａｎｄＳｔｕｄＯｉｌ化ｅＦｅｒｍｅｎ化ｔｉ〇ｉ（｝ｙ｜成怒皆碟麥ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＡｒｔｉ打ｃｉａｌＢｅｅＢｒｅａｄ＼＾…設巧（苗‘、＇．．．ｇ马．．一燕＇．＇－．．《兴＇＾鱗捉Ｖ苗：心？＇’右．户資．嗦．纖：繞！薦＾＾．巧名：崔学和心於＾．麟巧寒减耗．Ｉｆ寒１機．＇养玻賣Ｖ？．、痛觀：诞ｉ：觀ｉ．為贷试研ｉ究方向：单育动物营养鮮餅心式想峨！ｔ寒華遊Ｉ；；．指导教师：保华城，嫂麵變皆；胥．；：苗篇麵１；锭議‘＇＇．．．＇价奋．娩ｋ＼－ｖ＾Ｖ．．知妹：’苗ｖｒ八护＾６＾９Ｐ－；＾￥１＾＿＾＇■：．．ｙ飞：誠嘴鉛强媒 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果、。对在论文研究期间给予指导帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：日期： 论文提交日期：2015.04.28论文答辩日期：2015.06.09学位授予日期：2015.06学科门类：农业推广答辩委员会主席：单安山 目录中文摘要.......................................................................................................................IAbstract......................................................................................................................III1前言.........................................................................................................................11.1蜜蜂的天然蜂粮......................................................................................................11.1.1蜂粮的定义...........................................................................................................11.1.2蜂粮的营养成分...................................................................................................11.1.3天然蜂粮的形成...................................................................................................21.1.4蜂粮中主要菌类...................................................................................................31.2人工蜂粮研究进展..................................................................................................41.2.1蜜蜂的蛋白质需求的研究进展...........................................................................51.2.2代用花粉研究进展...............................................................................................61.3固态发酵研究进展..................................................................................................71.3.1固态发酵技术.......................................................................................................71.3.2影响固态发酵的因素...........................................................................................81.4本研究的目的与意义............................................................................................102材料与方法..............................................................................................................112.1天然成熟蜂粮菌种的鉴定....................................................................................112.1.1试验材料.............................................................................................................112.1.2试验方法.............................................................................................................122.2人工蜂粮发酵影响因素的探究............................................................................152.2.1试验材料.............................................................................................................152.2.2试验方法.............................................................................................................162.3数据处理与分析....................................................................................................183结果与分析..............................................................................................................193.1天然成熟蜂粮菌落的分离及鉴定........................................................................193.1.1天然成熟蜂粮菌落的分离.................................................................................193.1.2天然成熟蜂粮菌落种类鉴定.............................................................................21 3.2人工蜂粮发酵的影响因素....................................................................................273.2.1水分含量对蜂粮发酵的影响.............................................................................273.2.2菌种添加量对蜂粮发酵的影响.........................................................................293.2.3发酵温度对蜂粮发酵的影响.............................................................................303.2.4发酵时间对蜂粮发酵的影响.............................................................................314讨论.......................................................................................................................334.1人工蜂粮发酵菌种的选择依据...........................................................................334.2初始水分影响人工蜂粮形态和发酵...................................................................334.3菌种添加量影响人工蜂粮发酵速度...................................................................344.4发酵温度影响人工蜂粮的发酵...........................................................................344.5发酵时间影响人工蜂粮的发酵...........................................................................355总体结论及创新点.................................................................................................365.1总体结论................................................................................................................365.2创新点...................................................................................................................365.3存在的不足及进一步解决的问题.......................................................................366参考文献.................................................................................................................377附录.......................................................................................................................418致谢.......................................................................................................................42攻读学位期间发表的论文情况.................................................................................43基金资助.....................................................................................................................43 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要在自然状态下巢房内的蜂粮是哺育蜂群的主要营养来源，也是蜂群繁衍生息的物质基础。但外界蜜粉源环境以及人为管理因素往往会导致蜂群中蜂粮缺乏，为了维持蜂群正常生长、发育与生活，在缺乏天然蜂粮的季节，必须辅助饲喂人工蜂粮。除了营养素配比的差异外，天然蜂粮与人工蜂粮另一主要差异是加工工艺不同。为了解天然蜂粮的菌种分类，探索人工蜂粮的发酵工艺，本试验在蜜蜂营养和代用花粉的研究基础上，对成熟天然蜂粮菌种进行分离鉴定，探究了菌种添加量、初始水分、发酵温度、发酵时间，不同发酵条件对人工蜂粮发酵的影响。旨在为生产实践中蜂粮的发酵提供参考。1、天然成熟蜂粮菌种鉴定。本试验采集泰安地区意大利蜜蜂蜂巢中的天然成熟蜂粮，对蜂粮样品进行菌群种类的分离鉴定。对天然蜂粮样品进行菌液提取、分离培养、菌种纯化、菌落形态学鉴定和分子生物学分析，通过基因序列的比对，确定成熟天然蜂粮中主要菌群类别。结果表明：成熟蜂粮样本中主要分离得到解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和溜曲霉。2、人工蜂粮发酵影响因素的探究。以玉米粉、膨化豆粕、玉米蛋白粉为蛋白质原料，并添加蔗糖，配制成蛋白水平为30%的人工蜂粮。选取乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以1:1:1比例添加，分别控制菌种起始添加量，初始水分含量，发酵温度，发酵时间进行发酵，通过对发酵后人工蜂粮的感官评定和pH值的测定，探索最优发酵条件。结果表明：在该人工蜂粮配方下，较适宜的6发酵条件为，水分初始含量为50%，菌种添加量为1×10cfu/g，发酵时间为3d，发酵温度为30℃（P<0.01）。关键词：意大利蜜蜂；人工蜂粮；菌群鉴定；发酵；I 山东农业大学全日制硕士专业学位论文TheIdentificationofStrainsinNaturalMatureBeeBreadofHoneyBee(A.melliferaL.)andStudyontheFermentationConditionsofArtificialBeeBreadAbstractInthenaturalconditionsbeebreadismainnutrientdietofhoneybeeinthecolonyandthematerialbasisofreproduction.Theenvironmentofnectarandpollenresourcesandhumanfactorswillleadtothelackofbeebread.Wehavetofeedartificialbeebreadtomaintainthenormalgrowthanddevelopmentofthecolony.Inadditiontothedifferentnutrientcontent,processingisthemaindifferencebetweennaturalandartificialbeebread.Inordertoidentifythestrainsandsimulatethefermentativeprocessofnaturalbeebread,thisexperimentseparatedandidentifiedthestrainsinnaturalbeebread,exploredtheeffectsofdifferentfermentativeconditionstowardsartificialbeebread,suchasinoculationamount,moisturecontent,fermentativetemperature,fermentativeduration.Theexperimentwasbasedontheresearchofhoneybeenutritionandpollensubstitute.Itwasaimedatresearchingthefermentativeprocessesofartificialbeebreadandprovidingexperiencesandreferencesforproductionpractice.1.Theidentificationofstrainsinnaturalmaturebeebreadstrains.ThisexperimentcollectedsamplesofnaturalmaturebeebreadfromthecolonyintheTaianarea.Weextractedthebacterialliquid,andthenusedthesematerialstocarryisolation,culture,purificationandidentification.Bycomparingtheoutcomestothesequencingswithreferencestrainstodeterminethemaincategoriesofthefloras.Theresultshowthatmainstrainsweseparatedfromthesampleofmaturebeebreadarestarchsolutionbacillus,bacilluslicheniformisandaspergillus.III 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究2.Studyonthefermentationconditionsofartificialbeebread.Experimentusedtheartificialbeebreadwhichcontainedcorngrain,soybeanmeal,cornglutenmealandsucrose,theproteinlevelis30%.Wechosethelacticacidbacteria,bacillussubtilisandbacilluslicheniformisasfermentationstrains,theywereaddedby1:1:1.Theexperimentfermentedtheartificialbeebreadbycontrollingtheinitialmoisturecontent,inoculationamount,fermentativetemperatureandfermentativeduration.WeoptimizedthefermentativeconditionsbysenseevaluationanddeterminationofthepH-Value.Theresultshowthat,theoptimalparametersforfermentationwereinitial6moisturecontent,50%;inoculationamount,1×10cfu/g;fermentativeduration,3d;fermentativetemperature,30℃.Keywords:Apismellifera;Artificialbeebread;Identificationofbacteriastrain;FermentationIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言1.1蜜蜂的天然蜂粮1.1.1蜂粮的定义蜂粮（Beebread）也称蜂面包或蜂巢花粉，其直接原料是蜜蜂采集的蜂花粉，是哺育蜂群的主要食物，也是蜂群得以生存、发展的物质基础（Koning，1994；Gould，1995）。蜜蜂从显花植物花药内采集的花粉粒，并混入花蜜和消化道分泌物，混合成不规则的扁圆形的花粉团，经过筛选、咀嚼、夯实、吐蜜浸润、混入自身腺体分泌物等行为对花粉团进行初加工，在微生物的作用下，花粉混合物在蜂箱相对稳定的温度、湿度环境中经过一定的时间发酵成成熟的蜂粮（徐景耀，1991）。发酵后的蜂粮品质稳定，可以长期保存（Gilliam，1979）。1.1.2蜂粮的营养成分蜂粮来源于花粉，经过蜜蜂的调制，在相对稳定的环境中，经微生物发酵而成。蜂粮的营养物质的成分取决于花粉和微生物的发酵产物。因而蜂花粉的来源、种类，发酵时的微生物类别，蜂巢内的发酵环境，蜜蜂种类等因素都会影响蜂粮的成分（嵇保中，2006）。袁耀东分析了蜂粮的成分和作用，蜂粮的化学成份与其花粉的品种属性有关它决定了蜂粮的营养特性。蜂粮中维生素、各种氨基酸、微量和常量元素的相对含量对其营养价值都有重要意义（袁耀东，1991）。李忠谱报道将蜂粮当做酵素来源，来处理花粉，对改善花粉的口感、营养价值有较好的效果（李忠谱，1985）。黄文诚发现在自然状态下，蜜蜂更倾向于直接食用蜂粮，而并非是自然状态的花粉。由此也可推测与花粉相比，蜂粮在营养或适口性等方面，有其独特的优越性（黄文诚，1996）。苏松坤等对茶花粉与茶蜂粮营养成进行对比分析，对各样品中的蛋白质、粗脂肪、总糖、还原糖、蔗糖、灰分等进行了测定，得出1~10d蜂粮中蛋白质含量比花粉的含量略高；随着蜂粮酿制时间的延长，蜂粮中蛋白质和总糖含量有所下降，粗脂肪的含量有所增加（苏松坤等，2000）。新鲜茶花粉1 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究和混合茶蜂粮样品中水解氨基酸含量分别为20.15%和20.25%，后者比前者高0.1%。游离氨基酸含量相比较，前者比后者高235.71mg/100g。在新鲜花粉中检测到酪氨酸，而在蜂粮样品中则未检出。检测维生素A、B1、B2、C、D、E的含量发现茶蜂粮中维生素E、维生素B1的含量分别比新鲜茶花粉高54.5%和66.7%，而维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D的含量则分别下降76.3%、58.0%、74.2%和1.4%。其中酶活力测定结果表明1d茶花蜂粮中的过氧化氢酶、淀粉酶的酶活力比新鲜花粉高，而过氧化物歧化酶的活力则比新鲜茶蜂花粉略低;随着酿制时间的延长，茶蜂粮中过氧化氢酶、过氧化物歧化酶的活力下降，而淀粉酶的活力增强（苏松坤等，2002）。1.1.3天然蜂粮的形成蜂粮的整个形成过程包括蜂粮原料采集与微生物发酵两个部分。蜜蜂通过对外界显花植物的花粉的采集，将蜂花粉团放入蜂房中，蜂巢中内勤蜂将花粉团进行挑拣、咀嚼，吐蜜混合，加入自身分泌物，并对蜂粮进行夯实。这样就完成了蜂粮原料的采集和初步的加工。经过该过程的花粉就会在蜂巢这样一个相对密闭的环境中发酵，其主要是蜂粮内部复杂的微生物变化的过程。Chevtchik对鲜花粉和蜂巢中的蜂粮进行微生物分析，分析微生物发酵的四个阶段，发酵开始于乳酸菌，酵母菌，吲哚生成菌和有氧细菌产生。第一个阶段为发酵起始的12小时，其特点是有很多不同种类的微生物包括酵母菌在内的异源微生物利用花粉中丰富的营养物质大量繁殖。第二阶段，厌氧乳酸菌利用酵母菌和腐生细菌所产生的生长因子生长繁殖，引起pH值的降低。第三阶段，其特点是乳链球菌的消失，产乳酸能力更强的乳酸菌菌群开始生长。第四阶段，其特点是由于大量乳酸的积累而导致乳酸菌和特定酵母菌的消失。整个发酵过程接近完成，其pH值接近4（Chevtchik，1950）。2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.1.4蜂粮中主要菌类1）乳酸菌蜂粮的发酵的整个过程中产酸微生物的生长，使蜂粮的pH值下降，从而抑制了其他微生物的生长，其中乳酸菌起到了重要的作用。TobiasC.Olofsson分离鉴定了花粉和蜂粮的乳酸菌，在2周的成熟蜂粮中分离鉴定出31种菌落，几乎所有属于乳酸菌属(Olofsson,2008;Vásquezetal.,2009)，蜂粮样品中的含有9种乳酸菌，其中6种为乳酸杆菌属（Bma5,Hma8,Hma11,Hon2,Bin4,Fhon2），3种为双歧杆菌属（Bin7,Hma3,Bma6）。同时两个月的蜂粮样品无法检测出乳酸菌（Alejandraetal,2009）。苏松坤等对茶花粉和不同酿制时间的蜂粮中的细菌进行分离鉴定，样品中分离出菌落207个，鉴定出包括乳球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属和李斯特氏菌属等12种属，即詹氏乳杆菌、果糖乳杆菌、旧金山乳杆菌、绿色乳杆菌、唾液乳杆菌、微小乳杆菌、干酪乳杆菌鼠李糖亚种、植物乳杆菌、无害利斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌和植物乳球菌（苏松坤等，2001）。2）枯草芽孢杆菌分别从手采杏花粉、蜂杏花粉和1、3、6周的蜂粮中Gilliam分离到41种芽孢杆菌属细菌，其中33种为枯草芽孢杆菌，而且枯草芽孢杆菌还是唯一一种在所有花粉和蜂粮中都存在的芽孢杆菌属细菌，这可能由于该菌在整个蜂粮发酵过程中起重要作用或者该菌在特殊环境中的生存能力较强。除了枯草芽孢杆菌外还分离得到了巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌等（Hayden，1979）。在茶花粉中，苏松坤等也在茶蜂粮中分离得到枯草芽孢杆菌，但未在手采花粉和蜂花粉中分离获得。该菌种可能是蜜蜂将肠道中微生物接种到花粉中而获得的（Gilliam,1976；Gilliam,1978）。3 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究3）酵母菌Janine等(1966)报道乳酸菌、假单胞菌和酵母菌在花粉发酵成为蜂粮的过程中起着重要作用（Janineetal,1966）。Gilliam以杏花为花粉来源，分别对手采花粉，蜂花粉，和1、3、6周的蜂粮为样品进行酵母菌的分离。共分离出包括木兰球似酵母菌、罗伦隐球酵母菌、粘红酵母菌等6个种属的113种酵母菌。其中酵母菌的数量随着贮存的时间的延长而下降。除杏花手采花粉样品外，另外两种样品种分离最多的属木兰拟酵母菌（Gilliam,1979）。还有报道认为花粉发酵中的酶系与酵母的酶系相似(Okunuki,1943)。4）霉菌花粉和蜂粮中的霉菌能产生有机酸、蛋白水解酶和碳水化合物分解酶，这些细菌对蜂粮的形成和蜂粮的保存具有重要意义。Gilliam(1989)报道从杏花手采花粉、蜂花粉、蜂粮样品中分离到148株霉菌，其中包括曲霉菌（17%）、毛霉菌（21%）、青霉菌（32%）（Gilliametal.,1989）。蜂粮中的霉菌对引起蜜蜂白垩病的蜜蜂球囊菌具有拮抗作用（Gilliametal.,1988）。苏松坤利用茶花粉，分离鉴定了花粉和不同时期的蜂粮的霉菌种类、菌落数及所占比例。共分离出包括曲霉菌、青霉菌、拟青霉菌等的9个属。大多数的霉菌为曲霉菌、青霉菌和毛霉菌，分别占霉菌菌落数的45.80%、26.72%和5.34%，其中黑曲霉在茶蜂粮中最为常见（苏松坤，2001）。1.2人工蜂粮研究进展蜂粮是蜂群的食物来源，也是蜂群的全价营养来源(Koning,1994;Gould,1995)。因此整个蜂群的生存繁殖，都需要充足的蜂粮供应。但是由于蜂群自身因素、外界环境因素，人为因素的影响时常会导致蜂巢中蜂粮储备不足，例如蜂王大量产卵，幼虫数量多蜂粮大量消耗导致蜂粮不足；外界没有粉源，蜂群无法从外界采集补充；人为在巢门安装脱粉器大量脱粉，使蜂群中花粉短缺等原因。因此为了弥补蜂群中蛋白质饲料的不足，人们通过对蜜蜂营养需求的研究，尤其是蛋白质营养需求的研究，形成代用花粉，并通过代用花粉发酵形成人工蜂粮。4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.2.1蜜蜂的蛋白质需求的研究进展1.2.1.1蛋白质在蜜蜂中的营养生理功能1）构成机体组织的基本原料蛋白质是有机大分子，是都成细胞的基本有机物质，是生命代谢的主要承担者。在蜜蜂体内，肌肉、腺体以及其他组织等都是由蛋白参与构成。此外，调节蜜蜂生理过程的激素如保幼激素、蜕皮激素及酶类也都是蛋白质(吴杰，2012)。意大利蜜蜂工蜂幼虫、蛹的干重蛋白含量为42.36%~48.47%，工蜂成蜂干重的66%~74%(胡福良，1999)。2）修补组织、维持新陈代谢的必须物质蜜蜂组织器官的细胞通过新陈代谢进行更新与修补，要完成这一过程，就必须从食物或其他组织中获取新的蛋白质，作为更新与修补组织器官的原料。蜜蜂体内所有细胞的新陈代谢过程就是一个自我更新的过程，需要蛋白质作为构建和调节物质(陈盛禄，2001)。3）提供能量蜜蜂体内部分蛋白质可以贮存在脂肪体中，以备在营养不足时进行分解，供应能量。蛋白质充足，还可与糖类或脂肪相互转化，以维持蜜蜂机体正常的生长发育和生命活动。1.2.1.2蜜蜂的蛋白质需求量蛋白质在蜜蜂整个生命过程中都有重要作用，但是蜜蜂蛋白质的需要量也不是一成不变的。对整个蜂群而言，蛋白蜜蜂种类（意蜂、中蜂），蜂群所处环境状态（气候、温度等），蜂群不同的生产阶段（春繁、产浆、取蜜、越冬）会影响蜂群对蛋白质的需求量。对单个蜂体而言，不同的生长发育阶段（幼虫期、蛹期、成蜂）也会影响个体对蛋白质的需求量。一只幼虫从孵化开始，体重达到35mg大约需要50mg蛋白胨(vonRhein，5 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究1956)从幼虫到羽化出房，大约需要120~145mg花粉。每只工蜂一生中要消耗约含3.08mg氮元素的蛋白质，相当于花粉重100mg。一个群势较强的蜂群每年花粉的消耗量约为30~45kg。Kleinschmidt等研究表明粗蛋白水平小于20%的花粉不能满足蜂群生产的需要(Kleinschmidt,1976)。李成成等研究表明蛋白水平为30%时，蜂群群势较强，同时工蜂幼虫虫体蛋白含量和虫体抗氧化性均优于其他水平，适当提高日粮蛋白水平，可显著提高工蜂幼虫体蛋白含量，并降低幼虫体内的丙二醛含量(李成成，2011)。1.2.1.3蜜蜂蛋白质来源蜜蜂蛋白质饲料的来源于外界，但是由于蜜蜂不同的发育时期（幼虫期、成蜂期）和不同的蜜蜂分型（蜂王、工蜂、雄蜂），其主要食物蛋白质来源不同。对于自然状态下工蜂和雄蜂，幼虫期前3天都有丰富的蜂王浆供应，蜂王浆是由工蜂分泌，用于哺育幼虫，因此在该阶段的工蜂和雄蜂幼虫主要的蛋白质来源为蜂王浆。3日龄之后，其食物掺入为蜂蜜、花粉和蜂粮。而成年工蜂和雄蜂，其食物中主要的蛋白质来源是花粉（Crailsheim,1990）。而蜂王其从幼虫时期就一直食用蜂王浆，出房后的蜂王也由工蜂分泌大量王浆哺育，因此蜂王的主要蛋白质来源应为蜂王浆。1.2.2代用花粉研究进展早春的蜂群是全年生产的基础力量。意大利在蜜蜂春繁阶段，必须快速恢复群势来补充越冬时期蜂群数量的损失，此时蜂王需要大量产卵，以增加群势，这就需要大量的蛋白质供给，而此时正值外界缺乏蜜粉源缺乏的季节，蜂群无法从自然界获得丰富的食物，特别是高蛋白的花粉，但是蜂群还需要补充越冬时期蜂群数量的损失，恢复群势，为春季生产打好基础，因此蜂王会大量产卵，以增加群势。蜂农为了辅助蜂群群势的恢复壮大，会向蜂群中饲喂花粉和蜂蜜，但是成本较高。为了降低成本，蜂农尝试用豆粕，玉米粉等蛋白质原料和白砂糖混合饲喂蜜蜂，但是饲喂原料的选择，调制的配方比例，配制工艺不相同，大多凭借个人经验，缺乏科学依据。随着蜜蜂营养需求研究的不断进展深入，研究者们对蜜蜂代用花粉的原料、配方、加工调制方式等进行探究。代用花粉中不同水平的蛋6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文白水平会影响蜂群的生产性能、繁殖性能等。蜂群生产的不同阶段（产浆、春繁等）对代用蛋白的需求也不同。代用花粉在花粉缺乏的时期不仅可以补充蜂群蛋白质饲料的短缺，提高蜂群生产性能（Mohammad,2007;Steen,2007），又还能防治蜂群疾病(宋廷州，2012)。李成成（2012）等探究不同代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各生长发育阶段状况的影响，通过对蜂群饲喂高、中、低蛋白水平饲粮，得出不同的代用花粉蛋白水平影响蜂体蛋白含量，各阶段发育体重及初生蜂体的ProPO基因的表达。不同发育时期对蛋白含量要求不同，幼虫期要求较高，蛋白水平不足25%是严重影响其发育。羽化后工蜂蛋白水平20%即可满足其基本生长发育，水平为30%时最为有利(李成成，2012)。王改英（2012）在产浆阶段代用花粉的适宜蛋白水平的研究中，发现代用花粉蛋白水平为25%~30%时，工蜂初生重、体蛋白浓度、中肠蛋白质酶活等指标表现优异，同时利于工蜂咽下腺发育，可提高王浆产量(王改英，2012)。郑本乐报道，在意大利蜜蜂春繁阶段对蜂群饲喂不同蛋白水平人工代用花粉，会显著影响蜂群群势的增长，工蜂初生重量、HPG腺泡的发育和寿命。春繁阶段代用花粉蛋白水平在30~35%时较为适宜（郑本乐，2012）。除了对蛋白水平的探究，还对饲料蛋白源不同种类进行研究。豆粕、玉米蛋白粉、啤酒酵母等为代用花粉常用的植物性蛋白源。李肖利用玉米蛋白粉、膨化脱脂豆粉、发酵脱脂豆粉、啤酒酵母4种蛋白源，以油菜花粉作为对照饲喂意大利蜜蜂，探究不同蛋白源的影响。不同蛋白饲料对群势增长率没有显著差异，由于不同的蛋白源其本身饲料品质不同，适口性不同，对采食量有较大的影响（李肖，2014）。随着蛋白浓度的升高，采食量降低。蜜蜂通过增加采食量而达到最终蛋白的需要量(Pemaletal.,2001;Kleinschmidtetal.,1978)。1.3固态发酵研究进展1.3.1固态发酵技术1.3.1.1固态发酵定义固态发酵（Solidfermentation，SF）是指在发酵基质呈固态，虽然含水丰富，7 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。其中水分含量多在50%左右，发酵基质中固、液、气三相并存，即在多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质(叶柄奎，2009)。广义上的固态发酵是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，既包括将固态悬浮在液体巾的深层发酵，也包括在没有或几乎没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程(Reetaetal.,2009)。固态发酵物料称之为基质，及时微生物生长的营养源，又是微生物生长的微环境，还是发酵产物的聚集地。宏观意义上固态发酵层可看成是均一相。但在微观上看，物料层同时存在固、液、气三种物质状态：固态基质、与固态基质紧密结合的液态相和物料颗粒间隙中的气相。1.3.1.2固态发酵优点（1）水分活度低，基质水不溶性高，微生物易生长，酶活力高，酶系丰富（2）发酵过程粗放，不需严格无菌条件；（3）发酵原料来源丰富且简单，价格低廉且生产成本低。（4）设备构造简单、投资少、能耗低、易操作（5）产物浓度较大，生产率高1.3.1.3固态发酵缺点（1）限于耐低水活性的微生物，菌种选择较少（2）在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能（3）不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。（4）发酵过程、工艺参数难以控制，发酵产物质量不稳定;（5）发酵速率慢，周期长1.3.2影响固态发酵的因素固态发酵是一个整体的系统，影响固态发酵因素有很多，其中主要有物料的8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文营养成分、发酵物的颗粒度、菌种的接种量、发酵水含量、发酵温度、发酵时间1.3.2.1发酵底物的营养成分发酵底物为微生物提供生存繁殖所需要的营养，主要是碳源和氮源，其中碳氮的比例对微生物的生长和产物形成有很大影响。氮源比例过高，微生物生长发育旺盛，耗料较多，不利于某些代谢产物的积累。氮源不足，则菌体生长缓慢，发酵时间延长，使成本增大。1.3.2.2底物的颗粒度底物的颗粒度与饲料的利用率相关，不同的颗粒度使饲料具有不同的表面积，从而影响微生物与饲料颗粒的接触面积。因此在一定范围内降低底物的颗粒度可以提升发酵速度，但是原料粉碎过细，太小的颗粒容易造成底物结团，颗粒间空隙减小，气体扩散受阻，会对发酵产生影响。1.3.2.3菌种接种量饲料的发酵需要菌种达到一定的数量才能顺利进行，由于接种量与发酵周期有交互作用，接种量太低会延长发酵周期，提高发酵成本，接种量太高，会在发酵前期缩短发酵时间，同样会增加成本，造成浪费。1.3.2.4发酵水含量水分是微生物生长繁殖必须的成分，不同的原料，不同的菌种在发酵时对水分含量需求不同。水分含量过高，会影响气体的交换，使发酵底物多孔性降低，发酵难以降温、通风，从而增加了杂菌污染的危险。水分含量过低，会影响菌种发酵活性，使发酵不充分。1.3.2.5发酵温度温度是发酵的重要参数，选择适宜的发酵温度对发酵的成败至关重要。菌种在不同的温度条件下活力不同，生长速率不同代谢产物的量也不相同。温度过低9 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究不利于菌种的生长，使发酵速率降低，延长发酵周期。温度过高，使底物消耗速率增快，使饲料品质下降，甚至会使发酵菌种失活，使发酵无法进行。1.3.2.6发酵时间发酵时间是从发酵开始到结束的时间。发酵终点的判断对获得优质的发酵饲料有重要的影响。发酵时间太短，发酵不充分，菌种的分泌合成产物不够，不能获得成熟的发酵饲料。发酵时间太长，会使底物营养消耗过大，菌种死亡，影响发酵饲料的品质。1.4本研究的目的与意义在蜜粉源充足的条件下，蜜蜂可以从自然界采集花粉花蜜，除了供给当前需要外，还可酿造成蜂粮贮存于蜂房内，以备蜜粉源缺乏时食用。但如果受外界气候环境影响或肆无忌惮的人为脱粉导致蜂群断粉时间过长，内源储备的天然蜂粮不足以应对长时间的食物短缺时，就需要配制人工蜂粮对蜂群进行补助饲喂，否则会对养蜂生产造成严重损失。但是人工蜂粮的配制主要存在两大问题：第一，缺乏科学性。养蜂生产中，蜂农大多根据自己的经验，以减少成本为原则，随机选用廉价蛋白原料进行配制，缺乏科学指导与理论依据；第二，人工蜂粮与天然蜂粮仍存在一定差异。除了原料不同外，最主要是配制工艺的差别。天然蜂粮在贮存过程中要经过微生物发酵，形成了蜜蜂喜食的酸性食物，而人工蜂粮的配制工艺简单，有的只是蛋白原料与蜂蜜（或糖水）的简单混合。为了探究天然蜂粮发酵过程，配制出蜜蜂喜食的、营养均衡的人工蜂粮，本研究通过对天然成熟蜂粮进行菌种鉴定和巢外蜂粮发酵条件的探索，研究了人工蜂粮的发酵工艺。从而改善代用花粉的适口性，增加采食量，提高营养价值，同时为人工蜂粮的发酵生产提供参考。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2材料与方法2.1天然成熟蜂粮菌种的鉴定2.1.1试验材料2.1.1.1试验样品本地意大利蜜蜂天然蜂粮样品，于山东农业大学试验蜂场采取2.1.1.2试验试剂（1）培养基：YPD培养基1L：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，单蒸水（dH2O）1L。固体YPD培养基需再加15~20g琼脂粉/L。培养基经高压灭菌。LB培养基1L：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，ddH2O1L。固体LB培养基需再加15~20g琼脂粉/L。培养基经高压灭菌（2）试剂细菌基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab公司），RNaseA，异丙醇，溶菌酶；EasyTaqDNA聚合酶（TRAN公司），10×EasyTapBuffer，dNTPs，6×DNALoadingBuffer，琼脂糖，TAE缓冲液，GelRed核酸染料，2.1.1.3试验仪器超净台，灭菌锅，PCR仪，普通离心机(飞鸽KA-1000型)、台式冷冻离心机(eppendorf5810R)，稳压电泳仪，凝胶成像系统Gel3000series(美国)，光学显微镜（尼康日本），恒温摇床，漩涡震荡混匀器，制冰机，超低温冰箱，烘箱，冰箱等11 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究2.1.2试验方法2.1.2.1蜂粮菌群分离培养无菌操作，准确称取蜂粮待测样品10g，加入装有90mL无菌蒸馏水，放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在摇床上振荡30min，使菌液分散均匀，静置20~30s，即为100倍稀释液；再用1mL无菌移液管，吸取稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，震荡15s，使菌液混合均匀，即为1000倍稀释液；以此类推，连续稀释，制成所需稀释倍数的菌液。2.1.2.2菌群的纯化将无菌培养皿编号，倒入已融化并冷却至45~50℃的LB培养基，待培养基凝固后，用无菌移液管按无菌操作要求吸取0.1mL所需稀释度的菌液，分别加入对应编号的培养皿中，然后用无菌涂布棒进行涂布。室温下放置30min左右，然后倒置放入37℃恒温培养箱中培养24~36h。2.1.2.3菌落初步鉴定（1）菌落形态观察菌株在平板上培养48h后，观察菌落形态，包括菌落大小、颜色、表面、边缘、隆起、形状等。并拍照记录（2）菌体形态观察从平板挑取单菌落，经过涂片、固定、染色后在显微镜下观察，并拍照记录菌体的形状。2.1.2.4蜂粮菌群分子生物学鉴定2.1.2.4.1蜂粮菌群基因组DNA提取：（1）取0.5~2ml培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（2）EP管中加700μl的BufferGP1，65℃预热，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20min，离心过程中颠倒离心管混匀样品数次。（3）加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。（4）小心将上层水相转入一新离心管中，加入700μlBufferGP2，充分混匀。（5）将步骤（4）中的所得溶液全部加入到已装有收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液可分多次转入。10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，叫吸附柱重新放回收集管中。（6）向吸附柱中加入500μlBufferGW1，10000rpm离心1min，弃废液。（7）向吸附柱中加入500μlBufferGW2，10000rpm离心1min，弃废液。（8）12000rpm，离心2min，弃掉废液，将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。（9）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μlBufferGE，室温放置2~5min，10000rpm离心1min收集DNA溶液，得到的DNA于-20℃保存。2.1.2.4.2引物的设计与合成根据文献资料中的引物设计合成16sRNA基因和gyrB基因的引物。用ddH2O稀释至10μM工作浓度，具体的引物信息见表3-1。表1引物序列表Table1Primersequenceusedforreal-timePCR退火温度产物长度基因名称引物序列（5’-3’）（℃）（bp）F:GTAGTCATATGCTTGTCTC18sRNA551259R:TCCGCAGGTTCACCTACGGAF:GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGAgyrB551259R:AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT13 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究2.1.2.4.3PCR扩增：（1）PCR反应体系PCR反应液需在冰盒中进行配制，配液顺序为：去离子水(dcffibO)、10×buffer、dNTP、引物、Taq酶、样品DNA。以提取的DNA为模板，反应体系如表:表2PCR体系组分表Table2CompositionofthePCRsystem试剂Ingredients用量(μL)VolumeTemplateDNA1PCRForwardPrimer,10ml0.5PCRReversePrimer,10ml0.5EsTaqDNAPolymerase0.2dNTPMix,2.5mMeach210×EasyTaqBuffer2ddH2O13.8Total20（2）PCR反应参数应用美国Eppendorf公司的PCR扩增仪进行扩增反应，其反应步骤包括预变性、变性、退火、延伸、终延伸。具体参数如表所示：表3PCR反应参数Table3TheparameterofPCRsystem反应步骤温度℃时间预变性95℃5min变性95℃30s退火55℃30s延伸72℃2min终延伸72℃10min2.1.2.4.4PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析（1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g的琼脂糖，加入到60mL含有1×TBE电泳缓冲液的三角瓶中，微14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文波炉内加热至琼脂糖颗粒完全溶化，待温度略低时，按0.5mg/L加溴化乙锭(EB)，倒入制胶器中制备浓度为1.0%(W/V)的琼脂糖凝胶。（2）上样、电泳待凝胶冷却后，将凝胶连同支撑用的塑料板一起移至桌面的水平表面上，分别取5uLPCR扩增产物与1uL载体缓冲液(10×LoadingBuffer)混合均匀，用1kpDNALadderMarker对照，注入到加样孔，以稳压U=120V进行电泳。（3）染色成像:将电泳结束后的凝胶立即放入凝胶成像仪中观察并拍照。2.1.2.4.5PCR产物序列测定(1)按常规方法于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。(2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。(3)称量凝胶重量，以lmg=luL换算凝胶体积。(4)对PCR产物进行纯化。(5)取3uL样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，并测序。将霉菌的PCR产物用18sRNAF，16sRNAR引物测序，将芽孢杆菌的PCR产物用gyrBF，gyrBR引物测序并分别进行序列分析。2.2人工蜂粮发酵影响因素的探究2.2.1试验材料2.2.1.1发酵原料：由山东众成饲料科技有限公司购得膨化豆粕、玉米蛋白粉、玉米粉，经由超微粉碎机粉碎，与白砂糖混合按配方形成发酵饲料15 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究2.2.1.2发酵菌种：乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌由宝来利来生物工程股份有限公司提供。地衣芽孢杆菌由北京科为博生物科技有限公司提供。2.2.1.3试剂及主要仪器设备：去离子水、发酵袋、pH剂标准液冰箱、制冰机、精密pH计、磁力搅拌器、移液器（Eppendorf）电子天平、漩涡混匀器、T6新世纪紫外可见分光光度计(AAS-180-80)、普通离心机(飞鸽KA-1000型)、台式冷冻离心机(Eppendorf5810R)、培养箱、烘箱、封口机、发酵带2.2.2试验方法2.2.2.1人工蜂粮配方选取玉米粉、膨化豆粕、玉米蛋白粉为人工蜂粮蛋白质原料，并添加蔗糖，配制成蛋白水平为30%的人工蜂粮配方（李成成，2011；王改英，2012）。表4人工蜂粮配方及营养成分含量Table4Compositionandnutrientlevelofdiets原料Ingredients，%成分含量composition玉米corngrain21.00大豆粕soybeanmeal50.00玉米蛋白粉cornglutenmeal10.00蔗糖sucrose19.00合计Total100.00营养水平Calculated，%粗蛋白CP，%30.00总能GEKJ/g17.342.2.2.2试验设计通过对初始水分含量、发酵温度、发酵时间、菌种添加量的控制，探究单因16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文素对蜂粮发酵的影响。通过预试验对四种蜂粮发酵条件进行初探，试验中三种条件确定，另外一种为变量，进行单因素试验。三种发酵菌种乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以1:1:1比例添加，以一定的菌种起始量，初始水分含量，发酵温度，发酵时间进行发酵。将发酵底物、菌种、水分充分混匀装入发酵袋中，用真空包装机将发酵袋抽真空并密封，放入恒温培养箱中发酵（1）初始含水量梯度试验：初始水分含量分别为20%、30%、40%、50%、760%，发酵温度为30℃，菌种添加量为1×10cfu/g，发酵时间为3天。45（2）菌种添加量梯度试验：菌种添加量分别为：1×10cfu/g、1×10cfu/g、6781×10cfu/g、1×10cfu/g、1×10cfu/g，初始水分含量50%，发酵温度为30℃，发酵时间为3天。（3）发酵温度梯度试验：发酵温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，7初始水分含量为50%，菌种添加量为1×10cfu/g，发酵时间为3天。（4）发酵时间梯度试验：发酵时间分别为1d、2d、3d、4d、5d、6d，初始7水分含量50%，发酵温度为30℃，菌种添加量为1×10cfu/g。2.2.2.3测定指标及方法（1）pH值将3g发酵蜂粮样品溶于30ml蒸馏水中，充分混匀，用pH计测定混合液的pH值及酸度值（DeGrandi-HoffmanG，2013）。（2）发酵饲料感官评定以发酵蜂粮的颜色、气味、状态，三个因素为主要评价指标表5发酵蜂粮感官评价指标Table5Standardforsensoryoffermentbeebread指标状态描述颜色浅黄色黄褐色浅褐色深褐色气味无气味香气较弱香气明显气味浓郁状态粉状粉状略结团结块膏状17 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究2.3数据处理与分析釆用SAS9.1(SASInstitute,2003)、Excel2013软件进行统计学处理，结果以平均值±标准差表示。方差分析使用One-wayANOVA，如果处理效应差异显著（P<0.05），釆用邓肯氏(Duncan)法进行多重比较。18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3结果与分析3.1天然成熟蜂粮菌落的分离及鉴定3.1.1天然成熟蜂粮菌落的分离3.1.1.1天然成熟蜂粮形态取本地意大利蜜蜂蜂箱中装有成熟蜂粮的蜂巢，利用自制的小勺捣毁蜂巢取出其中成熟的蜂粮。以下是对部分蜂巢和取得蜂粮样品的照片。图1天然成熟蜂粮样品Figure1Sampleofnaturalmaturebeebread3.1.1.2天然成熟蜂粮菌落的生长及形态通过对蜂粮样品中的菌种的提取，涂板后进行菌落进行形态特征观察，菌落形态如下图。并对不同的菌落进行编号，依次编号为FL-1、FL-2、FL-3、FL-4、FL-5、FL-6、FL-7。19 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究FL-5FL-2FL-6FL-4FL-7FL-1FL-3图2成熟蜂粮样品菌落形态Finger2Colonymorphologyofnaturalmaturebeebread3.1.1.3天然成熟蜂粮菌落镜检形态对各个单菌落分别进行镜检，镜检结果如下:蜂粮样品经涂布、培养，根据菌落形态初步判断FL-1、FL-2、FL-3、FL-4四种为芽孢杆菌和FL-5、FL-6、FL-7三种霉菌。图中为天然成熟蜂粮菌落镜检结果a:FL-1b:FL-2c:FL-3d:FL-4e:FL-5f:FL-6g:FL-7图3天然成熟蜂粮菌落镜检形态Finger3Microscopicobservationofnaturalmaturebeebread20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.1.2天然成熟蜂粮菌落种类鉴定3.1.2.1天然成熟蜂粮菌落基因克隆以提取的各菌液样品的基因组为模板，以gyrB和18sRNA为引物，通过PCR的方法进行基因克隆。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图。从图中可以看出已成功扩增出各菌的目的基因。M图4PCR电泳图Figure4TheelectrophoretogramofPCR3.1.2.2天然成熟蜂粮菌种序列分析及比对FL-1、FL-2、FL-3、FL-4以gyrB为引物进行序列测定，FL-5、FL-6、FL-7以18sRNA为引物进行序列测定。得出的序列信息再经BLAST分析。每个菌种的基因序列及比对见图5~图9。FL-1、FL-2菌的gyrB基因序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquifaciens）的gyrB基因序列相似度分别为93%和97%，表明FL-1、FL-2菌为解淀粉芽孢杆菌。FL-3、FL-4菌的gyrB基因序列与地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）的gyrB基因序列相似度分别为97%和99%，表明该种菌为地衣芽孢杆菌。FL-5、FL-6菌的两个菌群测序失败，未测得序列。FL-7菌的18sRNA基因序列与溜曲霉(Aspergillustamarii）的18sRNA基因序列相似度为95%，表明该种菌为溜曲霉。21 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究（1）FL-1菌落gyrB基因序列及基因比对图1CCTGTCGACCGCTCTTGATGTTACGGTTCATCGAGACGGAAAAATCCATTATCAGGAGTT61CGAGCGCGGCGTTCCTGTGGCCGATCTTGGGTGATCGGAGATACGGATATGACCGGAACG121ACCACTCACTTCGTTCTGATCCGGATATTTTACGGAAACGACCGAATACGACTATGATCT181GCTTTCCAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAGGCGTCAACATCACGATTGA241AGACAAGCGAGAAGGACAAGAACGGAGAATGAGTATGCTACGAAGGCGGATCAAAGCTAT301GTTGAACACTTGAACCGTTCCCGGGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGA361TCCAAAGACGGCATTACGGTCGAAGTGGCTCTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAAT421ATTTATTCTTTCGCAAATAACATCCACACATACGAAGGCGGAACGCATGAAGCCGGATTT481AAAACCGGTCTGACCCGGGTTATCAATGATTACGCGAGAAGAAACGGGATTTTCAAAGAA541AATGATCCCGAACTTAAGCGGGGGATGATGTGAGGGAGGGCTGACTGCGATTATTTCAAT601TAAGCACCCGGATCCTCAATTTGAAGGACAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCAGAAGC661GAGAACGATCACTGATGCGCTGTTTTCATCAGCGCTGGAAAATTCCTTCTTAGAAAATCC721GGACTCAGCCGAACAAAAATCGTTGAAAAAGGTGTTATGGCCGCCAGAGCGCGGATGGCA781GCGAAGAAAGCGCGCGAATTGACGCGCAGAAAAAGCGCCCTTGAGATGTCCAATCTGCCG841GGCAAACTGGCTGACTGTTCTTCTAAGATCCGACGCATTTCCGAGCTGTATATCGGTAGA901GGGTGACTCTGCGGGCGGATCAGCGAACAGGGACGCGATCGTCATTTCCAGCTATTCTGC961TCTGAGACGGTAAGATTCTGACGTCGAGAAGCCAGACTGGACTAAGATTTGTCAACCATT1021GAGTTCGATCAATGAATCACGGTCCTCGCAACAGAATTCGGGAGATTCAACTGAAGCCGC1081TACCTAAAGTCGGCATCTGACGATGCTGATGTAATGGCTCGCATTCGAGCAACCGTGCT图5FL-1菌落基因序列及基因比对图Figure5GenesequenceandsequencealignmentofFL-1colony22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（2）FL-2菌落gyrB基因序列及基因比对图1GTCTTCACGGTGTACGGGCGTCTGTCGTAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGT61TCATCGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGCGGTGTACCTGTGGCCGATCT121TGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGA181AATTTTCAAAGAAACAACCGAATACGACTATGACCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATT241GGCCTTCCTGACAAAAGGTGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAACG301GAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGTACTTAAACCGTTC361CAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGT421TGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACAAATAA481TATCAACACATACGAAGGCGGCACGCACGAAGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACCCGTGT541TATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAAATGATCCGAATTTAAGCGG601GGATGATGTGAGGGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATT661CGAAGGGCAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCT721GTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCGCAAAATCGT781TGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCGAAAAAAGCGCGGGAATTGAC841CCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTC901TAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATTCGGTAAGAGGGGTGACTCTGCGGGCGGAT961CAGCGAAACAGGGACGGACGTCATTTCAAGCCATTCTGCCGCTGCGCGTAGATTCTGACG1021TGAGAAAGCCAGACTTGGATAGATTCTCTCAACAATGAGTCAGATCAATGATCACGTCTC1081GAACAGAATCGAAGATTCATCTGGAAAAGCCGTTATCAAACTGTCATCATGACTGAATGC1141GACTGTGAATGTTTCCAT图6FL-2菌落基因序列及基因比对图Figure6GenesequenceandsequencealignmentofFL-2colony23 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究（3）FL-3菌落gyrB基因序列及基因比对图1GCACGGCGTCGGTGCTTCTGTTGTTAACGCCCTTTCAACCGAGCTGGATGTAACGGTTTA61CAGAGATGGAAAAATCCATTATCAGGAATTTGAACGTGGCGTTCCGAAAGCTGATTTGAA121AGTCATTGGAGATACGGAAGTGACGGGAACGACCACACACTTCAAGCCTGATCCGGAAAT181ATTCACGGAAACGACTGAATACGACTATGATACGCTCGCCACTCGTGTCCGCGAACTCGC241TTTCTTGACAAAAGGCGTCAAAATCACGATCGAAGACAAGCGAGAAGGAAAAGAACGCAA301GAATGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAAAGCTATGTTGAACACTTGAACCGTTCGCG361GGAAGTTATTCATGAAGAGCCGGTCTATATTGAAGGATCCAAAGACGGCATTACAGTCGA421GGTGGCTCTTCAATACAATGACAGCTATACAAGCAACATTTATTCATTTGCTAACAACAT481TCATACGTATGAAGGCGGAACCCATGAAGCCGGCTTTAAGACCGGTTTGACGAGGGTCAT541CAATGATTACGCGAGAAGAAACGGCGTATTCAAAGAAAGCGATCCGAACTTAAGCGGAGA601AGACGTCCGGGAAGGTTTGACAGCGATTATTTCAATCAAGCACCCGGATCCTCAATTTGA661AGGGCAGACGAAAACAAAGCTCGGCAACTCAGAAGCGCGTACGATAACAGATGCGCTATT721TTCAGAAGCGCTTGAAAAGTTTCTGCTAGAAAACCCGGATTCAGCGAAAAAAATCGTTGA781AAAAGGGGGTTATGGCCGCCAGAGCACGGATGGCTGCAAAGAAAGCACGCGAATTGACGC841GCAGAAAAAGCGCCCTTGAAGTGTCCAATCTGCCGGGGAAACTTGCTGACTGTTCTTCTA901AAGACCCGACGATTTCCGAACTTTACATCCGTTGGAGGGGTGACTTCTGGCGGGCGGATC961GGCAAACAGGGCCGCGACCGTCATTTCCAGTCAATTTGCCCTTTGGAGAAGGAAAATTTT1021GAACGTCGAAAAAGCCCGCTGACAAATATTGTCCACATGAAGTTCGTCCATGATCACGCT1081TGGCACGAATCGGTGATCACTGAAGCGCTACAAAGTCTGATATGACGATGCCGAGTCATG1141CTCCAT图7FL-3菌落基因序列及基因比对图Figure7GenesequenceandsequencealignmentofFL-3colony24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（4）FL-4菌落gyrB基因序列及基因比对图1CGGTCTGCACGGCGTCGGTGCTTCTGTTGTTACGCCCTTTCAACCGAGCTCGATGTAACG61GTTTACAGAGATGGAAAAGTCCATTATCAGGAATTTGAACGGGGCGTTCCGAAAGCTGAT121TTGAAAGTCATCGGAGAGACGGAAGTGACGGGAACGACCACTCACTTCAAGCCTGATCCG181GAAATATTCACGGAAACGACTGAATACGACTATGATACGCTCGCCACTCGTGTCCGGGAG241CTCGCTTTCTTGACAAAAGGCGTCAAAATCACGATTGAAGACAAGCGAGATGGAAAAGAA301CGCAAGAATGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAAAGCTATGTTGAACACTTGAACCGT361TCGCGGGAAGTTGTTCATGAAGAGCCGGTCTACATTGAAGGATCCAAAGACGGCATTACC421GTCGAGGTGGCGCTCCAATACAACGACAGCTATACGAGCAACATTTATTCGTTTGCCAAC481AACATTCATACGTATGAAGGCGGAACGCATGAAGCCGGCTTTAAGACAGGTTTGACACGG541GTTATCAATGATTACGCGAGAAGGAACGGCGTATTCAAAGAAAGCGATCCAAACTTAAGC601GGGGAAGATGTCCGGGAAGGGTTGACAGCGATCATTTCAATCAAGCACCCGGATCCTCAA661TTTGAAGGACAGACGAAAACAAAGCTTGGCAACTCAGAAGCGCGTACGATAACAGATGCG721CTATTTTCAGAAGCGCTCGAAAAGTTTCTGCTTGAAAACCCGGATTCAGCGAAAAAAATC781GTTGAAAAAGGGGTTATGGCTGCCAGAGCACGAATGGCGGCAAAGAAAGCGCGCGAATTT841GACGCGCAGAAAAAGCGCCCTTGAAGTGTCAAATCTGCCAGGGAAACTGGCTGACTGTTC901TTCTAAAGATCCGACGATTTCCGACTTTACATCGTTGAGGGTGACTTCTGCGGGCGGATC961GGCCAAAACCGGGCCCGCGATCGTCATTTCCAAGCCAATTTGCCTTTGAGAGGGAAATCT1021TGAACGTCGAACACCCCGCCTGGAATAACTTTTGTTCTAACAATGACGTTCGTCTATGAT1081TCACTGTCAATCGGCACCTGAAATCGAGGTAACAGTTCAACTTTGAAAATTCAGCTACTA1141ACAGTCTGCATTAGGACGAAGTCGACGGTGA图8FL-4菌落基因序列及基因比对图Figure8GenesequenceandsequencealignmentofFL-4colony25 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究（5）FL-7菌落18sRNA基因序列及基因比对图1GCACTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGT61ACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACT121TCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTC181ATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCC241TATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTA301GGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGG361CGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCT421CTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGA481GGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTG541TTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCG601AGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGG661GGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAAT721ACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCG781CCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTC841TTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTCATTATCAGG901AACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTACCATAACTATGCC961GACTAGGATCGGGCGGTGTTTCTATGATGACCCGCTCGCACTACGAGAATCAAAGTTTTG1021GTCTGGGGGAGTATGTCGCAGCTGAACCTCAGATGACGGAGCACCACAGCTGAGCTGCGC1081TAATTGACTCACCGGGAACTCACAGGTCGACAATAGATGACGATGAAGCTTTCTGACTGA1141TGGCCATGCGTCTATAGTGCACGTC图9FL-7菌落基因序列及基因比对图Figure9GenesequenceandsequencealignmentofFL-7colony26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2人工蜂粮发酵的影响因素3.2.1水分含量对蜂粮发酵的影响不同的初始水分含量是固态发酵影响微生物生长的重要指标。试验选用初始含水量20%、30%、40%、50%、60%，比较人工蜂粮发酵的感官指标和发酵后pH值。下图是发酵前不同初始水分含量的人工蜂粮的形态和发酵后的形态对比图。由上图可以看出，随着初始水分的改变，饲料形态也随之改变，20%和30%的人工蜂粮，水分几乎没有浸润整个饲料，由于饲料颗粒极细，吸水性强，所以少量的水分仅引起粉料小部分的结团。当水分达到50%时整个饲料结成一块，该饲料的形态适合直接应用于蜂群的饲喂，成块但不散，可以直接切成小块放置于框梁上。水分达到60%时，整个饲料状态较稀，呈膏状，不易进行蜂群饲喂。表6初始水分含量对人工蜂粮感官特征的影响Table6Effectsofdifferentinitialmoisturecontentonthesensoryevaluation初始含水量指标20%30%40%50%60%颜色黄色黄褐色褐色深褐色深褐色气味几乎无味香气较弱香气明显香气浓香气明显状态粉状，略有结团粉团，粉团颗粒小结块，结块易散整体呈块状，不易散膏状，较稀随着加水量不同人工蜂粮颜色加深，酸香味随着加水量的增加而逐渐明显，人工蜂粮整体感官性能在初水分50%时较好。27 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究图10不同初始水分人工蜂粮发酵前形态Figure10Morphologyofdifferentinitialmoisturecontentofartificialbeebreadbeforefermented20%30%40%50%60%图11不同初始水分人工蜂粮发酵后形态Figure13Morphologyofdifferentinitialmoisturecontentofartificialbeebreadafterfermented28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图12初始水分对人工蜂粮pH值影响Figure12EffectofdifferentinitialmoisturecontentonpHvalue从图12可以看出，pH值随着人工蜂粮发酵初始水分的升高而逐渐降低，说明发酵程度随着水分添加量更加充分。初水分在20%、30%时，pH值较高，发酵不充分。初水分为50%时相对于40%有大幅度降低，当达到60%时pH值下降减缓。3.2.2菌种添加量对蜂粮发酵的影响试验分别将乳酸菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌按1:1:1的比例，以456781×10cfu/g、1×10cfu/g、1×10cfu/g、1×10cfu/g、1×10cfu/g菌种添加量，添加到人工蜂粮中，比较人工蜂粮发酵的感官指标和pH值。结果见表7和图13。表7菌种添加量对人工蜂粮感官特征的影响Table7Effectsofdifferentinoculationamountonthesensoryevaluation菌种添加量指标456781×10cfu/g1×10cfu/g1×10cfu/g1×10cfu/g1×10cfu/g颜色褐色气味香气较弱香气较弱香气明显香气浓郁香气浓郁状态整体呈块状，不易散由于只有菌种添加量为变量，其他发酵参数都是定值，因此不同分组对整个感官指标影响较小。但是不同的菌种添加量对气味影响不同，也反映了发酵程度6的差异。添加量为10cfu/g以上酸香气相对明显。29 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究图13菌种添加量对pH值的影响Figure13EffectofdifferentinoculationamountonpHvalue由pH值可知，在相同的发酵时间内，pH值的下降速率随着菌种添加量的增大而增大。但是过高的添加量会提高发酵成本，同时也会造成浪费。菌种添加678量为1×10cfu/g和1×10cfu/g的发酵pH值相似。1×10cfu/gpH值最低，但是该添加梯度需要大量的菌种，经济成本过高和菌种添加量过大。3.2.3发酵温度对蜂粮发酵的影响试验选择20℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度对人工蜂粮发酵，感官指标和pH值结果如下。表8发酵温度对人工蜂粮感官特征的影响Table8Effectsoffermentationtemperatureonthesensoryevaluation发酵温度指标20℃25℃30℃35℃40℃颜色黄褐色褐色褐色褐色深褐色气味香气较弱香气明显香气明显香气明显香气较弱状态整体呈块状，不易散在感官评定中，一定范围内随着温度的升高，发酵程度会随之增加。温度过低发酵不充分，温度过高会增加控制难度，同时也会使菌种活性降低，当温度达到40℃时，发酵的酸香气较弱。30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图14发酵温度对pH值的影响Figure14EffectofdifferentfermentationtemperatureonpHvalue在20~35℃的范围内，随着温度的提高pH值越低，当温度为40℃时，pH值相比于35℃有所提高，说明过高的温度影响了菌种的活性。温度为30℃、35℃、40℃差异不显著，3.2.4发酵时间对蜂粮发酵的影响试验选取1d、2d、3d、4d、5d、6d六个发酵时间点，六天连续取样，分别对其感官及pH值结果如下。表9发酵时间对人工蜂粮感官特征的影响Table9Effectsoffermentationdurationcontentonthesensoryevaluation发酵时间指标1d2d3d4d5d6d颜色黄褐色褐色褐色深褐色深褐色深褐色气味香气较弱香气明显香气明显香气浓郁香气浓郁香气浓郁状态整体呈块状，不易散随着发酵时间的延长，发酵程度逐渐加深，在3天左右基本发酵状态稳定。31 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究图15发酵温度对pH值的影响Figure15EffectofdifferentfermentationdurationonpHvaluepH值在1~3d有较大幅度的下降，pH值差异显著，第3d达到相对稳定，之后pH值下降幅度变小。虽然随着时间的延长pH值仍会继续下降，但考虑加工时间、成本，可以选择3d可以作为发酵时间进行发酵。32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文4讨论4.1人工蜂粮发酵菌种的选择依据蜂粮的自然发酵是一个复杂的过程，整个过程有多种类型的菌参与，本试验选取了成熟的蜂粮，通过分离纯化，镜检，生物学分析，得到测定蜂粮样本中有解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、溜曲霉菌。按照Chevtchik（1950）对蜂粮发酵的四个阶段的划分，该蜂粮样本应该属于第四阶段以后。该阶段由于大量的乳酸积累已经导致了乳酸菌和一些特定菌群的消失，故检测出的菌种数量较少。Gilliam（1979）在6周的蜂粮样品中检测出地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，与本试验检测结果相似。由于该样品的成熟时间较长，故未检测出乳酸菌和其他菌群，但是乳酸菌在蜂粮中的以及在蜜蜂肠道中都发挥着重要作用（Vasquez,2009；BELHADJ,2014）。在蜂粮和花粉中也有多种霉菌的参与，但分离出溜曲霉不一定为蜂粮中原有的菌群，还有未测出序列的两种菌群，也可能是取样过程中污染造成的，故未选择霉菌为发酵菌种。本试验最终选择用乳酸菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌作为发酵菌种。根据菌种分离结果选择地衣芽孢杆菌，它是我国农业部允许使用的饲用芽孢杆菌之一，其具有较强的生命活力，耐高温、耐酸碱、耐挤压，同时能够分泌多种酶（唐娟，2008）。试验中分离出解淀粉芽孢杆菌，它是一种与枯草芽孢杆菌同源性很高的菌种（张娟，2014），但是在发酵饲料中解淀粉芽孢杆菌不如枯草芽孢杆菌利用广泛，故本试验选择枯草芽孢杆菌作为发酵菌种。由于乳酸菌在蜂粮发酵中起重要作用，它能产生乳酸，使蜂粮pH值下降，从而抑制微生物的生长，利于蜂粮的保存，同时改善饲粮的适口性。虽然乳酸菌并未在菌种试验中检出，但仍选择为发酵主要菌种。4.2初始水分影响人工蜂粮形态和发酵人工蜂粮不同于其他发酵饲料，由于蜂粮在饲喂时多团成块状，放至框梁之上，供蜜蜂食用。若蜂粮水分含量过低则为粉末状，无法成团，若水分含量过高33 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究则太稀，容易流淌。水分含量与饲料的形态有很大关系，因此我们通过感官指标对其进行评价。在水分含量为50%时，人工蜂粮的形态与理想状态接近。人工蜂粮的初始含水量也与饲料原料种类和粉碎粒度有关，由于配制蜜蜂饲粮，故在发酵之前将所有原料经过超微粉碎，饲料颗粒都很小，故吸水性较强。同时不同的原料吸水性也不同，玉米吸水性强，同时吸水后粘性较大，相比而言豆粕和玉米蛋白粉吸水性较弱。因此随着饲粮配方的变化，初始水分含量也应该随之相应的进行调整。在生产实践中也应根据饲料的状态进行灵活的调整。水是微生物发酵生长必不可少的因素，提高初始水分含量，一方面可通过增加发酵底物营养物质的溶解和微生物代谢的扩散来促进微生物的生长（Gervais，1996），另一方面可以增加水解酶的产生和促进水解酶的扩散（Gervais和Molin，2003）。若水分含量过低，会直接抑制菌群的繁殖，在本试验中在初始水分含量过低，其pH值与未发酵的相似，说明发酵受到为50%时，pH值较低，发酵充分，故可用于该饲料配方下的水分含量。4.3菌种添加量影响人工蜂粮发酵速度不同的菌种添加量会影响菌种的增值速度，从而影响发酵的速度，只有当菌种数量达到一定时，才能对饲料进行充分发酵。菌种添加量与发酵周期有相互作用，低添加量会延长发酵时间，从而会增加发酵成本；高的菌种添加量在一定范围内会提高发酵速度，但是过高的添加量，同样会增加发酵成本，还会造成菌种浪费。因此应根据发酵状况，发酵时间来确定最适的菌种添加量。4.4发酵温度影响人工蜂粮的发酵发酵温度是固态发酵的一个重要因素，发酵温度会影响微生物的繁殖生长，酶活及其代谢产物的形成（Pandey，2003）。魏志文等在12天的发酵周期内，探究27℃、30℃、33℃和37℃四个温度梯度对秸秆粗蛋白含量的影响。结果表明，30℃时培养物粗蛋白含量最高，达到35.65%，温度降低或升高粗蛋白含量都会降低（魏志文，2008）。吴晖等发现在30℃、发酵72h枯草芽孢杆菌发酵豆粕时，34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文可得到最高的蛋白酶活性630U/g（吴晖，2008）。王园研究豆粕固态发酵条件的试验中发现，发酵温度为40℃时，发酵豆粕样品的pH值最低，大豆蛋白的水解程度最高（王园，2014）。本试验选择20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五个温度梯度，试验发现温度为30℃时发酵充分，与35℃差异不显著，由于在节省能源和温度易于控制方面，选择30℃。温度在40℃时发酵会受到影响，温度过高会发生烧曲现象（Lu,2003）。4.5发酵时间影响人工蜂粮的发酵发酵程度会随着发酵时间的延长而逐渐加深，发酵时间越久发酵越充分，饲粮pH值下降越明显。Hong等发现以米曲霉为菌种发酵豆粕，48h可显著提高其营养价值（Hong,2004）。本试验发现当发酵到3d后，饲粮pH值趋于稳定，3d、4d、5d人工蜂粮pH值差异不显著，综合pH值和成本因素，本人工蜂粮发酵时间为3d较为合适。由于蜂农在野外进行饲喂时可能缺少恒温加热装置，因此可以适当的降低发酵温度，延长发酵时间来提高发酵的程度，但同时也应该防止霉变等因素的影响。35 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究5总体结论及创新点5.1总体结论5.1.1成熟天然蜂粮分离鉴定出的主要菌种为地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和溜曲霉菌。5.1.2在试验室条件下，蛋白含量为30%的人工蜂粮的配方下，采用乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，通过pH值和感官评定，初步探究该人工蜂粮较6适宜的发酵条件为：水分初始含量为50%，菌种添加量为1×10cfu/g，发酵时间为3d，发酵温度为30℃。5.2创新点5.2.1本试验针对于蜜蜂饲料的发酵工艺进行研究，在蜜蜂营养和人工代用花粉的研究基础上，针对于意大利蜜蜂该特殊的动物研究其蜂粮的特性，并探究人工蜂粮发酵的影响因素。5.2.2初步探究了影响蜂粮发酵的因素，为蜂农在生产实践中对人工蜂粮的加工提供一定的借鉴意义。5.3存在的不足及进一步解决的问题5.3.1本研究在菌种鉴定试验中，仅取了成熟的蜂粮样品，但发酵是个持续复杂的过程，在不同的发酵阶段有多种不同菌种的参与。人工蜂粮发酵菌种的确定需要经过大量的试验和筛选工作。5.3.2试验中对影响发酵的因素仅做了单因素试验，对于各因素之间的交互作用没有进一步探究。同时检验发酵饲料最终的指标还应该以蜜蜂的采食来评价，故还应进行大量的饲喂试验和大群饲养试验，并检测蜜蜂采食后的生理生化指标的变化。36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文6参考文献陈盛禄.中国蜜蜂学[M].北京:中国农业出版社,2001.胡福良,陈盛禄.意大利蜂工蜂幼虫、蛹的营养价值研究[J].中国养蜂,1999,50(2):3-5.黄文诚.养蜂手册(第二版).北京:中国农业出版社,1996.嵇保中,刘曙雯,徐丽娜,等.蜂粮研究进展[J].中国农学通报,2006,22(8):165-170.李成成,杨维仁,胥保华,冯倩倩.意大利蜜蜂生长发育适宜蛋白供给水平及其对幼虫抗氧化活性的影响[J].中国农业科学,2011,22:4714-4720.李成成.代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响[D].山东农业大学,2012.李肖.饲料蛋白源对意大利蜜蜂繁蜂效果及蜂王浆品质的影响[D].山东农业大学,2014.李忠谱.用蜂粮处理花粉的方法[J].中国养蜂,1985,06:22.宋廷洲.蜜蜂蛋白质饲料[J].中国蜂业,2012,10:22.苏松坤,陈盛禄,林雪珍,胡福良,余旭平,汪礼国,王正二.茶(Camelliasinensis)蜂花粉与蜂粮中花粉形态和营养成分的比较[J].中国养蜂,2000,06:3-6.苏松坤,陈盛禄,余旭平,林雪珍,胡福良.花粉和蜂粮中霉菌的研究[J].上海交通大学学报(农业科学版),2001,03:179-183.苏松坤,陈盛禄,余旭平,林雪珍,胡福良.花粉和蜂粮中细菌的分离和鉴定[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2001,06:40-43.苏松坤,陈盛禄.茶(Camelliasinensis)蜂花粉及其蜂粮的营养成分研究[J].上海交通大学学报(农业科学版),2002,02:95-99.王改英.意大利蜜蜂产浆期代用花粉中适宜蛋白质水平的研究[D].山东农业大学,2012.王园.豆粕固态发酵条件及其对断奶仔猪饲用效果的研究[D].中国农业大学,2014.魏志文,赵士豪,李宝库.多菌株发酵秸秆饲料研究[J].安徽农业科37 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究学,2008,32:14108-14110.吴晖,卓林霞,解检清,刘冬梅.发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响[J].现代食品科技,2008,10:973-976.吴杰．蜜蜂学[M].北京:中国农业出版社,2012.徐景耀.蜜蜂花粉研究与利用[M].北京:中国医药科技出版社,1991.叶丙奎.混菌固态发酵对饲料营养价值及生长育肥猪生产性能的影响[D].西北农林科技大学,2009.袁耀东.蜂粮的成份和作用[J].中国养蜂,1991,06:36-37.张娟,杨彩梅,曹广添,曾新福,刘金松.解淀粉芽孢杆菌及其作为益生菌的应用[J].动物营养学报,2014,04:863-867.郑本乐.意大利蜜蜂春繁阶段代用花粉中适宜蛋白质水平的研究[D].山东农业大学,2012.BELHADJH,HARZALLAHD,BOUAMRAD,etal.PhenotypicandGenotypicCharacterizationofSomeLacticAcidBacteriaIsolatedfromBeePollen:APreliminaryStudy[J].BioscienceofMicrobiota,FoodandHealth,2014,33(1):11.ChevtchikV.Mikrobiologiepylovéhokvaseni[J].Publ.Fac.Sci.Univ.Masaryk,1950,323:103-130.CrailsheimK.Theproteinbalanceofthehoneybeeworker[J].Apidologie,1990,21(5):417-429.DastouriMR,Maheri-SisN,Aghajanzadeh-GolshaniA,etal.Theeffectofreplacementfeedingofsomeproteinsourceswithpollenonhoneybeepopulationandcolonyperformance[J].J.Anim.Vet.Adv.,2007,6:1258-1261.DeGrandi-HoffmanG,EckholmBJ,HuangMH.AcomparisonofbeebreadmadebyAfricanizedandEuropeanhoneybees(Apismellifera)anditseffectsonhemolymphproteintiters[J].Apidologie,2013,44(1):52-63.GaboratoryBB.Chemicalcompositionandnutritivevalueofbee-collectedandbee-storedpollen[J].1978.38 山东农业大学全日制硕士专业学位论文GervaisP,MolinP.Theroleofwaterinsolid-statefermentation[J].BiochemicalEngineeringJournal,2003,13(2):85-101.GilliamM,PrestDB,LorenzBJ.Microbiologyofpollenandbeebread:taxonomyandenzymologyofmolds[J].Apidologie,1989,20(1):53-68.GilliamM,TaberS,LorenzBJ,etal.Factorsaffectingdevelopmentofchalkbrooddiseaseincoloniesofhoneybees,Apismellifera,fedpollencontaminatedwithAscosphaeraapis[J].JournalofInvertebratePathology,1988,52(2):314-325.GilliamM,ValentineDK.Bacteriaisolatedfromtheintestinalcontentsofforagingworkerhoneybees,Apismellifera:thegenusBacillus[J].Journalofinvertebratepathology,1976,28(2):275-276.GilliamM.BacteriabelongingtothegenusBacillusisolatedfromselectedorgansofqueenhoneybees,Apismellifera[J].Journalofinvertebratepathology,1978,31(3):389-391.GilliamM.Microbiologyofpollenandbeebread:theyeasts[J].Apidologie,1979,10(1):43-53.HaydenC.Microbiologyofpollenandbeebread:thegenusBacillus[J].1979.HongKJ,LeeCH,KimSW.AspergillusoryzaeGB-107fermentationimprovesnutritionalqualityoffoodsoybeansandfeedsoybeanmeals[J].Journalofmedicinalfood,2004,7(4):430-435.JanineP,MaugenetJ.Recherchesbiochimiquesetphysiologiquessurlepollenemmagasinéparlesabeilles[C]Annalesdel"Abeille.EDPSciences,1966,9(3):209-236.KleinschmidtGJ,KondosAC.Influenceofcrudeproteinlevelsoncolonyproduction[J].Australasianbeekeeper,1976.KoningRE.Honeybeebiology[J].PlantPhysiologyWebsite,1994.LoperGM,StandiferLN,ThompsonMJ,etal.Biochemistryandmicrobiologyofbee-collectedalmond(Prunusdulcis)pollenandbeebread.I-FattyAcids,Sterols,VitaminsandMinerals[J].Apidologie,1980,11(1):63-73.39 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究LuW,LiD,WuY.Influenceofwateractivityandtemperatureonxylanasebiosynthesisinpilot-scalesolid-statefermentationbyAspergillussulphureus[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2003,32(2):305-311.NagaiT,NagashimaT,MyodaT,etal.Preparationandfunctionalpropertiesofextractsfrombeebread[J].Food/Nahrung,2004,48(3):226-229.OkunukiK.UberdenGaswechselderPollen.V[J].ActaPhytochim.Japan,1943,13:93-98.OlofssonTC,VásquezA.DetectionandidentificationofanovellacticacidbacterialflorawithinthehoneystomachofthehoneybeeApismellifera[J].Currentmicrobiology,2008,57(4):356-363.PandeyA.Solid-statefermentation[J].BiochemicalEngineeringJournal,2003,13(2):81-84.PernalSF,CurrieRW.Theinfluenceofpollenqualityonforagingbehaviorinhoneybees(ApismelliferaL.)[J].BehavioralEcologyandSociobiology,2001,51(1):53-68.RheinW.UberdieErnährungderArbeitermadevonApisMellificaL.,insbesondereinderAltersperiode[J].InsectesSociaux,1956,3(1):203-212.ŠkerlMIS,BoltaŠV,ČesnikHB,etal.Residuesofpesticidesinhoneybee(Apismelliferacarnica)beebreadandinpollenloadsfromtreatedappleorchards[J].Bulletinofenvironmentalcontaminationandtoxicology,2009,83(3):374-377.VásquezA,OlofssonTC,SammataroD.AscientificnoteonthelacticacidbacterialflorainhoneybeesintheUSA–AcomparisonwithbeesfromSweden[J].Apidologie,2009,40(3):417-417.VasquezA,OlofssonTC.Thelacticacidbacteriainvolvedintheproductionofbeepollenandbeebread[J].Journalofapiculturalresearch,2009,48(3):189-195.40 山东农业大学全日制硕士专业学位论文7附录附图1真空包装机附图2抽真空后蜂粮样品附图3各个梯度蜂粮发酵样品41 意大利蜜蜂天然成熟蜂粮菌种鉴定及人工蜂粮发酵影响因素的探究8致谢本研究是在导师胥保华教授悉心指导下设计完成的。短短两年的研究生时光，对于我来说，是人生中重要的一段历练，一个成长、蜕变的过程。我树立了严谨的治学态度，锻炼了自己发现问题解决问题的能力。然而收获更多的是如何做人，如何做一个堂堂正正的人，一个包容的人，一个阳光的人。然而这一切，都离不开胥保华老师的言传身教，谆谆教导，一位慈父般疼爱自己学生的老师，一位用心为迷茫的年轻人指点迷津的长者。因此借论文完成之际，表达我对恩师诚挚的感激之情。感谢山东农业大学动物科技学院各位老师对我的培育和教导，感谢杨维仁老师、林海老师、王中华老师、李福昌老师、杨在宾老师、宋志刚老师、林雪彦老师、李显耀老师、熊玉英老师等对我专业知识的传授和生活的照顾。感谢研究生处刘希山老师、顾峰老师、石磊老师，在校研究生会给予我的关心照顾，为我提供展示自己的机会和舞台。感谢宝来利来公司、科为博公司、众城公司对我试验提供的技术支持。感谢试验室整个大家庭的每位家人，刘锋、孙汝江、康明江、王红芳、刘振国、李兆勇、肖培新、王改英、王颖、马兰婷、张鸽、张怡丁、李肖、吴在富、杭晓波、董文斌、赵凤奎、王圣伟、张卫星、苏中渠、徐鹏、雷春红、王丽，无论师兄师姐、师弟师妹，都像家人一样温馨和谐，每个人都给予我巨大的鼓励和支持，感谢大家带给我的一切。感谢我的菲飞团，作为我坚强的后盾，让我不惧风雨。感谢校研会所有的同学和那些我们一起奋斗过的日子。感谢我的小伙伴们，我会记得属于我们的舞台和那些一起疯狂的时光。感谢我的家人们，感谢你们给予我生命，抚养我长大，教导我成人，让我幸福快乐，给予我无尽的爱。感谢所有出现在我生命中的你们，我的点滴的成长都有你们的帮助和支持，祝大家身体健康，心想事成；愿我的母校山东农业大学蓬勃发展，桃李满天。崔学沛2015年642 山东农业大学全日制硕士专业学位论文攻读学位期间发表的论文情况崔学沛,吴小波,刘锋,王颖,曾志将,胥保华.不同产地荷花花粉与玉米花粉营养成分及含量分析[J].山东农业科学,2014,11:124-128.基金资助本研究由以下基金资助：1、现代农业产业技术体系建设专项资金资助（theearmarkedfundfortheChinaAgricultureResearchSystem(No.CARS-45)）。2、山东省农业良种工程项目“优质高产蜜蜂及蚕桑新品种培育”资助（2014-2016）（ShandongProvinceAgriculturalFineVarietiesBreedingProjects(2014-2016)）3、国家自然科学基金项目资助（No.31172275）（theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31172275)）43