中华蜜蜂malvolio基因在内勤蜂和采集蜂中的表达与定位研究 52页

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学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是在导师指导下，独立进行工作所取得的成果，本论文不包含研究。蘇文中已注明引用的内容外任何其他个人或集体已经发表或撰泻过的作品成果。对本文研究做出过重要贡献的个人和集体，均已在文中公明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。）一作者签為：＾ｎＩ曰（亲笔左苗位年至］＾学位论文版巧使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定。即学位论文的知识产权属山西农业大学；同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的原件、复印件和电子版；允许论文被查阅和借阅；本人授权山西农业大学可＂将学位论文的全部或部分内容编入有＇＜关数据库进行检索＾〔，可乂采用影印、缩印或担描等复制手段保存、；编学位论文。作者签亲笔）：如仅年＾月厂７曰导师签名（亲笔２Ｗ女年会月（７日 资助项目＂＂国家公益性行业（农业）科研专项蜜蜂授粉增产技术集成与示范项目编号：２０１２０３０８０（）＊ＴｈｉｓｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｒａｎｔｓｆｒｏｍＴｈｅＳｅｃｉａｌＦｕｎｄｆｏｒｇｐ＂Ａｒｏ－ｉｅｎｔｉｆｉＲｅｓｒｅｓｇｓｃｃｅａｒｃｈｉｎ化ｅＰｕｂｌｉｃＩｎｔｅｔＮｏ．２０１２０３０８０（） 缩略词表（Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ）缩写英文名称中文名称ＩＨＪｕｖｅｎｉｌｅｈｏｒｍｏｎｅ保幼激素ＯＡＯｃｔｏｐａｍｉｎｅ章鱼胺ＭＰＧｕｅｅｎ’ｓｍａｎｄｉｂｕｌａｒｇｌａｎｄｈｅｒｏｍｏｎｅＱｐ蜂王信息素ｍＮａｔｕｒａ－ｒＮｒａｐｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｏｔｅｉｎ天然抗性相关巨嘘蛋白ｐＴＭＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ跨膜结构域ＳＬＣｌｌＳｏｌｕｔｅｃａｒｒｉｅｒｆａｍｉｌ１１ｙ溶质转运蛋白家族ＨＤＣＴｌＤｉｖａｌｅｎｔｃａｔｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ二价阳离子转运体ｃＡＭＰＣｉｒｃｌｅａｄｅｎｉｎｅｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｈｏｓｈａｔｅ环腺囑吟单核昔酸ｐｏ－ＩＰＳＩｎｓｉｔｏｌ１４５ｔｒｉｓｈｏｓａｔｅ肌醇三磯酸，，ｐｐｈＰＫＡＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ蛋白激酶ＡＰＫＣＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ蛋白激酶Ｃ 目录摘要１第一章前言２２１昆虫的取食斤为１．１昆虫的取食行为２１．２影响昆虫取食的因素２２蜜蜂的觅含行为３２．１蜜蜂适应采集的特征３２．２蜜蜂采集行为对授粉的作用３３影响蜜蜂采集行为的因素４３．１巢内外环境４３．２激素４３．３細５一４蜜蜂的觅食基因Ｍａ／ｖｏ说６４．１Ｍｉ／ｖｏ舶基因的结构特点６４．２基因的功能７５本研究的目的和内容８５．１研究目的８５．２研究内容８第二章基因编码蛋白的相似性分析９１材料与方法９１．１试验材料９１．２分析方法９２结果与分析９２．１Ａｃｍｖｌ与其它物种氨基酸序列的进化分析９２．２Ａｃｍｖｌ与其它物种氨基酸序列的结构相似性分析１１３職１３４１４／ｍＲ１５第吉章ＡｊｗｖＮＡ的组织表达差异性分析１材料与方法１５１．１试验材料１５１．２试验方法１６２结果与分析１７ ２．１各组织总ＲＮＡ的提取及检测结果１７２．２标准曲线的建立１８２．３扩増动力学曲线及烙解动力学曲线１８；２．４Ａ７ｍ／ｍＲＮＡ在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织的表达１９３论２０３．１关于基因在腹部表达的分析２００３．２关于基因在胸部和足部表达的分析２３．３关于Ａｔｍｖ／基因在头部表达的分析２１４小Ｓ２１第四章内勤蜂和采集蜂各组织Ａｃｍｖｌ蛋白的表达分析２２１材輯与方法２２１．１试验材料２２１．２试验方法２３２结果与分析２５２．１Ａｃｍｖｌ多克隆抗体质量检测２５２．２内勤蜂２６、采蜜蜂和采粉蜂各组织Ａｃｍｖｌ蛋白的相对表达量分析３讨论２７３．１关于ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验条件的优化２７３．２内参蛋白在腹部组织中无表达的分析２７３．３Ａｃｍｖｌ蛋白在内勤蜂与采集蜂各组织的表达分析２８４小结２８第五章中华蜜蜂脑部心ｃｍｖ／ｍＲＮＡ的定位研究２９１＃料施２９１．１试验材料２９１．２试验方法３０２结果与分析３１３舰３１４小Ｓ３２全结论３３参考文献３４Ａｂｓｔｒａｃｔ３９附录４１＾£４５ 中华蜜蜂基因在内勤蜂和采集蜂中的表达与定位妍究摘要中华蜜蜂ｉｓｃｅｒａｗａｃｍｗｉａ是原产于我国的优灸蜜蜂品种其授粉在维持我国生如，态系统平衡和现代化农业中的贡献不容小觀。蜜蜂的主要食祇来源为蜜粉源植物的花蜜和花粉而篇糖是花蜜中主要的糖成分之一，蜜蜂对蕉糖反应的差别影响其采集行为。，Ｍａ／ｖｏ／沁基因已被化实影响果蛇的某糖反应，且该基因在西方蜜蜂头部的转录水平与其采集巧为相关。目前，该基因的研究多集中在果蛇上，蜜蜂中仅有关于西方蜜蜂头部组织ｍＲＮＡ表达水平的报道。因此，探究该基因在不同组织表达特征与定位研究可Ｖ乂为更好的了解中华蜜蜂采集行为提供理论参考。本研究在已获得ｃＤＮＡ序列的基础上，对其氨基酸序列与其當物种的同源序列进巧了比对分析采用Ｒｅａ－ｏｌｔｉｍｅＰＣＲ技术和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｔｉｎ技术分别检测了内勤蜂、；ｇ采蜜蜂和采粉蜂触角、头、胸、腹和足各组织中Ｍ口／ｖｏｆｔｏ基因的ｍＲＮＡ和蛋白表达量，并分析了ｍＲＮＡ表达量与采集行为之间的关系；采用原位杂交技术在采集蜂脂中，对基因ｍＲＮＡ的表达进行了定位分析。结果如下：Ｕ）基于氨基酸序列构建的系统发育树结果显示，Ａｃｍｖｌ氨基酸序列除与膜翅目露虫的Ｍ一较大分支外２ａｌｖｏｌｉｏ氨基酸序列聚为与哺乳类动紙中人和小鼠的Ｎｒａｍ聚为，ｐ另一大分支Ａｍ白同源体的比对ｃｍｖｌ氨基酸序列与小鼠、果媽、躁母、水稻的Ｎｒ；ａｐ蛋结果显示，Ａｃｍｖｌ蛋白待合Ｎｒａｍｐ蛋白家族的结构特征，属于Ｎｒａｍｐ家族，且与Ｎｒｍｎｐ２的相似性最高。，似Ａ：ｗｖ／ｍＲＮＡ在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂的触角、头、胸、腹和足５个部位组织内均有表达，但高表达于内勤蜂的胸部，采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部，表明该基因的表达差异影响采集巧为。３ｃｌ（）Ａｍｖ蛋白在内勤蜂和采集蜂的头部、胸部和足部均有表达，而在腹部几乎不表达一。同时内勤蜂中Ａｃｍｖｌ蛋白在胸部表达最高这与ｍＲＮＡ的表达情况致，，；，采蜜蜂和采粉蜂中Ａｃｍｖｌ蛋白均在头部表达最高且表达量均高于内勤蜂头部。，，（４）心ｗｊｖ／ｍＲＮＡ表达于采集蜂腑部的草形体、视叶、触角叶的神经元细胞中。综上所述，本论文通过对中华蜜蜂心ｗｖ／基因在内勤蜂和采集蜂各组织ｍＲＮＡ和蛋白表达Ｗ及其在脑部的定位研究，揭示了该基因在各组织的表达特征与采集行为的关系为进一步了解蜜蜂的采集机制提供了理论参考。，关键词：中华蜜蜂；Ｊｃｗｖ／基因；ｍＲＮＡ表达；蛋白表达；原位杂交－－１ 第一章前言１昆虫的取食行为距今３．５亿年前，地球上就已经出现了昆虫，过了近２亿年，被子植物开始出现，二者一在漫长的岁月中相互作用，协同进化，形成了重要的植物昆虫生态系统，其中，１／２的屋虫Ｗ取食植物为生，昆虫取食行为对植物种子巧花粉的传播起到了极为重要的Ｕ作舟。１．１尾虫的取食行为昆虫的取食行为是指屋虫在接受内外信息后，由神经系统和肌肉系统作出的综合反一Ｗ应表现出摄取食物及与此相关的系列活动。由于食性的差异，不同种类的昆虫一在对食料植物采集时，会表现出定的选择性，但其取食行为的过程基本相似，其过程为：首先，通过视觉和嗅觉确定食物源所在的位置；接触到食物后，会利用味觉感受器对食物进行辨别和评价一；最后选择合适的食物。这过程受到其视觉、嗅觉、味觉感受器，Ｗ及神经系统的综合调控。１．２影响昆虫取食的因素１．２．１昆虫自身因素昆虫的取食行为与其自身的发育、生理及行为状态有关。挪也叶甲幼虫在１、２日－，取食量小、被取食叶片极少会形成病斑５龄时；而在３龄期时，被取食叶片会形成大面积病斑Ｗ。，造成叶片腐烂斜纹夜蛾幼虫解化后，最先接触到的食物即成为其Ｗ后偏Ｗ爱取食的食物。口器的分化是昆虫取食行为差异的一个典型的外在特征。昆虫的口器与其取食的食，如巧嚼式曰器适于取食固态食物物类型相适应，而刺吸式、虹吸式、甜吸式等口器适合于取食液体食物，嚼吸式口器兼具取食固态和液体食物的功能。１．２．２植物的性巧特征植物本身花的颜色和气味、花蜜、花粉Ｗ及次生产物都可作为吸引或驱避昆虫采集的因素。花色给传粉昆虫最直接的视觉刺激，不同的昆虫之所Ｗ被不同的花色吸引，是由于它们的视觉系统可Ｗ区分不同的吸收光谱，Ｗ致对花色形成不同的感受Ｗ。例如膜翅目蜜蜂对黄色、蓝色、白色敏感，而对红色不敏感；双翅目魄类对暗色、褐色或绿色敏感；－２－ 鱗翅目蝶类对红色、紫色等鲜艳的色更敏感。＇在漆黑的夜晚，某些屋虫也能访花，说明其在夜间主要是靠气味确定花的位置。花主要芳香型气味成分包含单荫和倍半荫，还有酶及简单的醇、爾、醋类等，有些花释放出令人厌恶的臭味一一。，其成分主要是胺类种花般包括其中１个或几个主要成分，昆虫能精确地识别其中特定的气味组分，蜜蜂能感受到至少２８种成分组成的特定的向曰Ｗ葵气味。传粉昆虫访花的主要目的是为了获得花蜜或花粉花蜜中含有大量的糖，主要是旗糖、葡萄糖和果糖，不同的花蜜含量和种类不同。花蜜中的营养成分除糖外还有氨基酸、蛋白质和脂类物质，这些物质能满足传粉者对营养和能量的需求。然而，有的花蜜中含有生物碱和有机酸等一些有害成分。不同的昆虫对花蜜的糖浓度有不同的偏好，且主要糖的比例（旗糖的浓度）也与传粉者的采集行为相关Ｗ花的外部结构、形态等表型特征是昆虫访花的识别信号。取得花蜜的难易程度取。决于花形，尤其是蜜腺的位置筒状花的蜜腺较深，只有塚长的昆虫如蝶类才能取食其一，些皿状花植物中深藏的花蜜，蜜腺露于外面的蜂类也能利用其中，因而即使瞭较短的花蜜。植物在代谢过程中产生的一些短链的碳氨化合物及其衍生物植物等非花器挥发性Ｗ，虽然含量微小物质，但成分多样、易变化，也具有吸引或驱避的作用。２蜜蜂的觅食行为２．１蜜蜂适应采集的特征蜜蜂主要通过采集花蜜和花粉来满足其对能量和蛋白质的需求，并兼采集树胶、水和无机盐等。口器是蜜蜂采集的主要工具，在长期自然选择中，特化为既能适应于阻嚼ｔｗ工花粉，也能吸晚花蜜的嚼吸式日器。其中，蜂的吻较蜂王和雄蜂更为发达，无疑是一吸取花朵基部花蜜的种适应。一蜜蜂周身密被绒毛，长短疏密不，有的还有分叉，能粘带零散的花粉粒；足部进行了离度特化、、花粉巧和花粉售等结构，可Ｗ将绒毛上的花粉，形成了花粉刷花粉巧１Ｕ捜集到花粉售内形成花粉团带回蜂梨。２．２蜜蜂采集行为对授粉的作用自然界中可Ｗ传粉的昆虫主要来自半翅目、缕翅目、雜翅目、鱗翅目、双翅目和膜翅目一。其中由于不同昆虫的习性各不相同，它们在授粉时往往会表现出对些植物的偏爱性。Ｋｎｕ化在３９５种植物上共搜集到８３８种传粉屋虫，其中膜翅目４３．７％，双翅目占－３－ 〇２６．４／〇，銷翅目占１４．４％；而在膜翅目传粉昆虫中，５５．７％的屋虫属于蜜蜂总祁气蜜蜂是一种理想的授粉昆虫，蜜蜂传紛可Ｗ大大提高作物和果实产量及品质，其授粉所带来的经济价值远髙于本身生产的蜂产品价值。Ｌｅｖｉｎ评估了１２９种依赖蜜蜂授粉作物的授粉经济价值，结果发现蜂类授粉为农作物产生的价值为１８９．６亿美元，约为蜂产品价值ｕｉｔ的。－１４３倍刘朋飞对２００６２００８年间我国％种蜜蜂授粉农作物的授粉经济价值进行了评估，结果湿示，蜜蜂授粉的年均价值约为３０４２．２０亿元，占到中国农业总产值的３影响蜜蜂采集行为的因素一蜜蜂作为种典型的社会性屋虫，其群体内部具有明确而细致的劳动分工，，其中－蜂王和雄蜂共同负责繁殖，而王蜂板据其生理日龄承担巢内外所有工作，１３周，作为内勤蜂、保温赔卵及清理巢房等３，，在巢内饲嗯幼虫；周后成熟为采集蜂，开始出巢ＵＳ１采集花粉、花蜜、树胶和水。工蜂由内勤蜂到采集蜂的行为转变受巢内外环境、激素水平、脑部化学物质和结构、ｔＷ脑部基因表达等多种因素影响。已测得蜜蜂头部几千个基因的表达与这种转变有关，而＿Ｆｏｒａ如巧（Ｆｏｒ）和Ｍａ／ｖｏ化？（Ｍｖ／）是被认为是最可能影响蜜蜂的采集行为的基因３．１巢内外环境一。蜜蜂是种高度社会化的昆虫，群内个体通过独特的信息交流来维持巢内稳态蜜一蜂的采集行为很好的解释了这现象，，虽然蜜蜂采集勤奋但其采蜜积极性也与巢内的蜂子比（蜂群中工蜂与子脾的比值）有关，比值越大说明有更多的工蜂可Ｗ摆脱哺育负担，参加采蜜活动；比值越小，蜂群内幼虫和羽化幼蜂较多，由于工蜂具有很强的恋子ｆＷ性，所外出采集活动明显减少。花粉是幼虫发育的重要蛋白质来源，它们对花粉的需求也驱动了蜜蜂的采紛行为。ｆＷ另外，天气和蜜粉源条件的好坏也是影响蜜蜂采集的重要外在因素。３．２激素蜜蜂分泌的激素基本上可为内激素与外激素（信息素）。内激素为内分泌器官所分泌，借体液传递，影响各器官的机能，控制调节某些活动或代谢的过程，具有重要作用的主要为保幼激素（ｊｕｖｅｎｉｌｅｈｏｒｍｏｎｅ，ＪＨ）与章鱼胺（ｏｃｔｏｐａｍｉｎｅ，ＯＡ）等。外激素为特有腺体分泌到体外，能引起机体行为或生理变化的化学物质，蜜蜂最主要的外激素为ｕ’蜂王信息素（ｇｅｅｎｓｍａｎｄｉｂｕｌａｒｌａｎｄｈｅｒｏｍｏｎｅ，ＱＭＰ）。ｇｐ一ＪＨ是由昆虫的咽侧体合成分泌的种内激素。ＪＨ，其含量与其行为发育密切相关－４－ 体内含量在１日龄最低，之后随着日龄的増大，其含量逐渐増高，至采集日龄达到最高ＰＤ］ｍ值。Ｊａｓｓｉ的研究也发现ＪＨ滴度在蜜蜂开始采集行为前显著升高，而采集蜂血液中一ＪＨ滴度明虛高于内勤蜂，进步用ＪＨ或其类似物处理幼年工蜂后，幼虫会提前出巢采ＰＵ集。可见，ＪＨ与蜜蜂采集行为的启动有关。０Ａ的分布及含量变化可（＾｜调节蜜蜂的采集行为。Ｈａｒｒｉｓ等研究结果显示新羽化的西方蜜蜂中枢神经系统中０Ａ含量显著低于普通成虫，说明不同生长阶段０Ａ水平不同Ｐ３一。内勤蜂脑部触角叶ＯＡ水平明显低于采集蜂，进步口服ＯＡ会引起工蜂提早进行ＳＭＰ’ｌ采集活动，表明０Ａ可能与内勤蜂向采集蜂的转变有关。ＪＨ与０Ａ都会引起蜜蜂提早采集，但二者的作用又不尽相同。用ＪＨ类似物处理后，幼蜂（尤其是１２日龄后）触角叶内０Ａ水平显著升商；而用０Ａ饲喂咽侧体切除的幼蜂后，蜂群中采集蜂的数量与正常咽侧体工蜂蜂群的采集蜂数量相等，且喂食０Ａ的年幼工蜂相比于ＪＨ类似物会更快转变为采集蜂。因此，用影响蜜蜂采集行为的启动可能是通过提高脑部章鱼胺的水平来实现的二ＪＨ，但者也可能存在协同作用，因为同时用Ｓ一Ｐ１巧０Ａ处理幼蜂比单独用种因素处理更能使幼蜂转变成采集蜂。Ｐ一。ＱＭ是由蜂王上颖腺分泌的种化学物质，主要包含五种成分它们在不同蜂群Ｐ０中影响工蜂对蜂王的反应。研究发现ＱＭＰ可Ｗ推迟工蜂从内勤蜂到采集蜂的行为转变，Ｐａｎｋｉｗ等研究发现，蜂王的出现Ｗ及蜂王分泌的ＱＭＰ减慢了幼年工蜂的个体发育，延缓了工蜂由巢内工作到巢外采集的时间，经ＱＭＰ处理过的工蜂ＪＨ水平降低，而ＪＨ７Ｐ＾水平的升高与工蜂从巢内工作转到巢外工作有关。表明，ＱＭＰ可能通过抑制？ＴＨ的产生来调节工蜂由内勤蜂到采集蜂的转化进程。３．３基因２００６年，西方蜜蜂全基因姐序列的公布为蜜蜂基因和行为关系的研究提供了更为广阔的平台。蜜蜂具有依赖年龄进行采集分工的特点，这种行为变化被证实与脑部成千上’＊万基因的表法相联系。目前，（戶ｅｒ）、仍ｒａ挪巧（仍）／）、Ｍａ／ｖｏ＆ｏ（Ｍｖ／）等是关注度较商的与采集相关的基因。３．３．１化ｒ基因在蜜蜂群体中，内勤蜂在巢内较为黑暗的环境下，进行与日节律无关的工作，而采集蜂在巢外进行与日夜节律密切相关的采集活动，这也显示蜜蜂的采集行为与日节律变化相关。化ｒ是调控生理节律的高度保守的时钟基因。Ｔｏｍａ等研究发现，蜜蜂Ｐｅｒ基因ｍＲＮＡ化－的水平与其日龄相关，２０日龄左右采集蜂头部的ｒｍＲＮＡ表达量明显高于４９一日龄的内勤蜂；在同日龄蜂群中，提早采集的蜜蜂头部的ＰｅｒｍＲＮＡ表达量与正常开－５－ ＰＳｌＡ始采集的蜜蜂无显著差异，这表明，脑部戶ｅｒｍＲＮ水平并不是严格随年龄变化。人为提供光照黑暗交替条件与持续黑暗条件巧比，蜜蜂脑部的化ｒｍＲＮＡ表达量也无显著差异，表明化ｒ基因的表达不是由外部光周期引起的与内源牲调控有关。，而３．３．２仍ｒ基因Ｆｏｒ基因是在对果赃觅食的研究过程中首先发现的，随后在蜜蜂的研究中证明，仍ｒ一基因编码个ｃＧＭＰ依赖的蛋白激酶Ｇ（ＰＫＧ），采集蜂头部ＦｏｒｍＲＮＡ和ＰＫＧ水平口９］显著高于内勤蜂，且用ｃＧＭＰ饲喂幼龄蜜蜂，会引起其提早采集。Ｈｅｌｅｎ等研究了ｙ－２５日）ＦｏｒＦｗ基因在蜜蜂由内勤蜂转变为采集蜂时期（１３ｍＲＮＡ的龄，蜜蜂头部表达，ＦｏｒｍＲＮＡ表法量－结果显示，在１８２２日龄达到最离峰值，早于或晚于该日龄段，表达ＰＷ量均会降低，这表明仍ｒ基因可能刺激了工蜂采集行为的转变。３．２．３Ｍｖ／基因基因是在筛选果蜗廉糖反应基因时发现的，后来发现可Ｗ通过影响蜜蜂的旗糖ＰＵ－反应来影响其采集行为。ＢｅｎＳｈａｈａｒ等研究了西方蜜蜂采集蜂和内勤蜂头部Ｍｖ／２＋Ｇ４／ｎｍｖ／）基因的表达量，发现采集蜂高于内勤蜂且在食物中添加Ｍｎ，会引起年幼工Ｐ２１蜂提早出巢采集，迭表明Ｍｖ／基因的确对蜜蜂的采集行为起着非常重要的作用，但该基因的具体功能（＾（及影响采集行为的机制还不清楚。４一Ｍａｌｖｏｌ蜜蜂的觅食基因ｉｏ４．１基因的结拘特点Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ等克隆了果赃的Ｍｖ／基因，并发现其属于天然抗性相关巨睡蛋白（ｎａｔｕｒａｌ－削ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏａｅｒｏｔｅｉｎｒａｍ。；ｐｈｇ，Ｎ）家族该家族的典型结构特点有ｐｐ－①具有１２－１０个跨膜结构域（ＴＭ），氨基和幾基端均位于胞内ＴＭ７ＴＭ８之间含有；②一一个糖基化的胞质外环状结８－ＴＭ９之间；③ＴＭ含有个转运蛋白特征结构域（ＣＴＭ）；Ｐ３－３④ＴＭ１ＴＭ８具有高度的保守性。利用Ｍｖ／ｃＤＮＡ探针在果魄脑部进行原位杂交，发现其表达于外周和中央神经系统、口１造血细胞］，尤其是巨懂细胞中。但是，目前Ｍｖ／基因影响果贼味觉的机制还不清楚，而它与ｉＶｒａｍｐ家族序列的窩度保守性可能为其功能的揭示提供思路。－６－ Ｌ；Ｌｕｍｅｎ＇９，。３？鑽刪｜禱Ｍ；，扩杏ｐ＇＼＿－ＰＶＣＯＯＨＮＨｇ＼Ｊ－１图１ｌＮｒａｍｐ蛋白的跨膜结构示意图（引自Ｇｏｖｏｎｉ，９９８）－ｒａｍｒｏ化ｎＦｉｇ．１１Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆ出ｅｍｅｍｂｒａｎｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＮｐｐｉｓ４．２Ａ／ａ／ｖｏ／Ｚｏ基因的功能Ｎ一ｒａｍｐ是个古老的膜整合转运蛋白家族，又称溶质转运家族１１（ｓｏｌｕｔｅｃａｒｒｉｅｒｆａｍｉｌｙ１１，ＳＬＣｌｌ），在各物种间具有高度的保守性，且普遍具有二价金属离子转运功能３４［］０，基因的定位研究显示，它主要表达于吞睡细胞中如巨略细胞和多核型白细胞ＰＳ’，可Ｗ调节哺郭动物对结核巧菌、布氏杆菌、沙口伤寒菌等胞内病原菌抵抗能力３Ｗ２＋２＋２＋。后来，发现酵母耐０具有转运Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ离子的功能，ｉＶｒａｍ如作为二价金Ｐ７１属离子转运体的功能才被发现。目前ｉＶｒａｍｐ／，关于作为金属离子转运体來抵抗病原体侵染的机制还不清楚，当细菌被巨，主要有Ｗ下两种解释，①金属离子流入型机理隨细胞吞懂后ＴＶｒａｍ？／二价金属离子转运到巨嗟细胞，巨隨细胞膜上的／通过将胞质中的ｅｒ－Ｗｄｓｓ反应产生大量径自由基的吞随小体中，从而对巨隨细，这些金属离子通过Ｈ油ｔＷ胞中的细菌产生抑制作用②金属离子流出模型，细菌被巨礎细胞吞隨后形成吞隨小体后，巨随细胞会通过产生活性氧或氮的中间物来杀死细菌；而细菌会通过合成２＋２＋ＷＦｅ或Ｍｎ等金届离子为辅酶活性氧清除系统来清除活性氧，而位于吞唆小体膜上的Ｗｒａｗｐｉ会竞争性的将金属离子从吞隨小体内腔转运到胞质，使细菌不能清除活性氧而死亡Ｇｕｎｓｈｉｎ等在研究爪赡卵母细胞中的铁摄取相关基因时，发现了二价阳离子转运体３４［ＤＣ７】（ｄｉｖａｌｅｎｔｃａｔｉｏｎｔｒ犯ｓｐｏｉｌｅｒ；７），也称为ＤＭ７７。随后，Ｆｌｅｍｉｎｇ等鉴定了Ｚ）Ｍ７７－－７ 一Ｗ与已发现的的序列致。ｉＶｍｍ的广泛表达于哺乳动物、植物、细菌、鱼类和果赃等的绝大部分组织和细胞中，哺乳动物中，该基因主要表达于十二指肠绒毛膜刷状３４一［］缘处，是介导肠腔内非血红素铁转入肠细胞的唯转运体。具有宽范围的离２＋２＋２＋２＋２＋２＋２＋子转运功能，可Ｗ转运Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｎｉ、Ｃｏ等金属离子在２＋２＋果魄中，Ｍｉ／ｖｏ／沁影响果蜗味觉识别已有报道，并且通过在食物中添加Ｍｎ、Ｃｕ和２＋４７４ｔＦｅ’＾可Ｗ恢复该症状，但关于该基因影响蜜蜂采集行为的报道还仅限于西方蜜蜂，ｒｍｖ／基因的研究尚未见报道中华蜜蜂Ａ。５本巧究的目的和内容５．１研究目的蜜蜂与植物经过长期的协同进化，是，具有突出的与传粉相适应的形态及生理特征最理想的授粉昆虫。蜜蜂传粉可Ｗ大大提高作物和果实产量及品质，其授粉所带来的经济价值远高于本身生产的蜂产品价值。蜜蜂授粉的过程也是采集的过程，因此对其采集行为的研究，有助于为蜜蜂授粉提供依据。我国本±的中华蜜蜂在采集方面具有西方蜜蜂不可比拟的优点，具体表现为，嗅觉灵敏、强善于发现分散蜜粉源；采集勤奋；抗寒４９抗病为强ｆｉ，寒冷地区的早春开花植物只能依靠中蜂授粉。Ｐｉ４７Ｓ’ｌＰＩ目前，关于基因的研究大多Ｗ果魄为研究对象，，蜜蜂中的研究较少只有少数几篇关于西方蜜蜂的报道，而中华蜜蜂Ｍｊ／ｖｏ／Ｚｏ基因如ｍｖ／的研究尚未见报道。本文通过对基因编码蛋白的相似性分析，对该基因在内勤蜂和采集蜂各组织的ｍＲＮＡ与蛋白表达量进行了研究，并在脑部进行定位分析，Ｗ期深入了解中华蜜蜂的采集行为，为更好的利用和保护我国蜜蜂资源提供理论依据。５．２研究内容中华蜜蜂基因编码蛋白的相似性分析；中华蜜蜂的内勤蜂和采集蜂各组织灰ｗｖ／ｍＲＮＡ表达的差异性分析；中华蜜蜂的内勤蜂和采集蜂各组织Ａｃｍｖｌ蛋白表达差异性分析；中华蜜蜂采集蜂脑部ＡＴＭｖ／ｍＲＮＡ的定位研究。－８－ 第二章基因编码蛋白的相似性分祈本课题組已经通过克隆获得了中华蜜蜂心ｗｖ／ｃＤＮＡ的全长序列，并对其编码的氨一基酸序列进巧了初步的生物信息学分析。为了进步了解基因的功能，我们将该基因的氨基酸序列在不同物种间进巧了相似性分析，Ｗ期找到该基因的同源基因，为其功能研究提供理论参考。１材料与方法１．１试验材料本课题组己获得的＾ｃ／ｎｖ／基因的氨基酸序列及生物信息学分析结果。１．２分析方法Ｕ）在ＮＣＢＩ中将已获得的Ａｒｍｖ／基因的氨基酸序列利用ＢＬＡＳＴ功能进行相似性比对分析。樹采用Ｍｅａ．ｌｇ５０软件对部分膜翅目昆虫及哺孰动物中与Ａｃｍｖ相似性较高的氨基酸序列构建系统发育树，进行亲缘性分析。－－谢基于本课题组对该蛋白质的理化性质、信号肤、０糖基化位点、Ｎ糖基化位点、磯酸化位点及二级结构的预测结果，将Ａｃｍｖｌ氨基酸序列与Ｃｅｌｌｉｅｒ研究的天然抗性相ａ－ａｓｓｏｃｄ关巨睡蛋白Ｎｒａｍ（ｎｔｕｒａｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉａｔｅｍａｃｒｏｈａｅｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎｒａｍ）家族的氨基ｐｐｇｐｉｗｉ酸序列结构进行比对分析。２结果与分析２．１Ａｃｍｖｌ与其它物种氨基酸序列的进化分析ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ－ＷＶ／将心ｗｖ／基因的氨基酸序列在中利用搜索后发现（表２１），心’化基因与膜翅目蜜蜂科屋虫中的西方蜜蜂０４如ｙｗｅ／／於ｒａ）、大蜜蜂（如Ｓ成ｗｓａ）、：小蜜蜂（Ａｐｉｓｏｒｅａ）、Ｂｏｍｂｕｓｉｍａ打ｅｎｓ）及切（Ｍｅａｃｈｉｌｅｗｔｕｎｄａ化）Ｍａｈ＞ｏｌｉｏｆｌ熊蜂（ｐ叶蜂ｑ一＞翅目昆虫、、Ｓ８％、８９％８６％基因的氮基酸序列致性最高，分别为９９％９９％和；与双’’Ｗ中的红火蚁（舶／ｅｗ地ｚ＞ｍｃｔｏ）、丽蜗蛹集金小蜂（ｉＶｏｓｏ／ｗａＶ化ｅｎ／ｚｂ）、果魄（Ｚ）ｍｓｏ／ｆｌｑｐ却＿ｐｗｅ一Ｔ／ａｗｏｇｏｓｔｅｒ）及冈比亚按蚊（如航ａｅ）ＭＷｖｏＫｏ基因的氨基酸序列致性分别为７７％、７２％、７０％和５７％。如ＷＶ／基因与哺乳动物中大鼠和人中相似性较高的基因一ａｆｎ为ｉＶｒａｗ／？家族的ｉＶｈｗｗ如和ｉＶｒａ？ｊｐ２，其中与小鼠ｉＶｈ如和的致性分别为－－９ 一５６％和６３％，与人ｉＶｒａ／ＭｆＪ和的致性分别为５９％和的％。基因与真苗的相似性最低一，与酵母Ｓｍｆｌ、ＳｍＣ和Ｓｍ投的致性分别为３０％、３０％、２０％。－ｃｗｖ表２１中华蜜蜂Ｊ／基因与其他物种的相似性分析Ｔａｂ－ｌｅ２１ＳｉｍｉｌａｒｉｔｙａｎａｌｓｉｓｏｆＡｃｍｖｌｂｅｔｗｅｅｎＡｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａａｎｄｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｙｐ物种相似基因一致性ｎｋ（％）ＧｅｎｅＢａ登录号ｓ－昆虫大蜜蜂ＡｐｉｄｏｒｓａｔａＭａｌｖｏｌｉｏｌｉｋｅ９９ＸＰ００６６１６７２５巧方蠻蜂ＡｐｉｓｍｅＨｉｆｅｍＭａｌｖｏｆｉｏ９９ＸＰ００６５３１１４ｍ－小蜜蜂如ｉｓｆｏｚＭｉＭ？化？ｌｉｋｅ９８ＸＰ００３６９４４５ｊ－８９ＸＰ熊峰巧ｏｍｂｕｓｉｍｐｃ抹ｅＭａＺｖｏｔｉｏｌｉｋ００３４８５１９８［ｎｓｅｅａｃｈ－切畔峰ＭｑｉｌｅｒｏｔｗｕｉａｔａＡｆｏ／ｖｃ诉ｏｌｉｋｅ８６ＸＰ００３７０８３０６纽火蚁Ｓｏｉｅｎｏｐｓｉｓｉ打ｖｉｃｔａＭａｌｖｏｌｉｏ７７ＸＰ０１１１巧２７２丽蛹蛹集金小蜂ＭａｌｖｏＵｏ７２ＸＰ００１６００９６７Ｎａｓｏｎｉａｖｉｔｒｉｐｅｎｎｉｓ黑腹果觸ＭａｌｖｏＵｏ７０ＡＡＡ８２５％Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ冈比亚按蚊ＤＭＴｉＮｒａｍｐ）５７ＡＢＲ８８１４８Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅ哺享商病＾Ｎｒａｍｐ２？ＮＰ００１１３９６３３ＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＮｒａｍｐｌ５６ＮＰ０３８６４０人Ｎｒａｍｐ２６３ＮＰ００１１６７巧６ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＮｒａｍｐｌ５９ＮＰ０００５巧真畜ＥＥＳ＃＾ＮＰ０１４５１９ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｍｆ２３０ＮＰ０１１９１７ｙｉＮＰ０１３１３４采用Ｍｅｇａ５．０对中华蜜蜂Ａｃｍｖｌ化及西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜峰、熊蜂、切叶蜂红火蚁、丽蜗蛹集金小蜂、赤拟谷盗、黑腹果赃、人和小鼠中与Ａｃｍｖｌ相似的序列构建一２－系统发育树，如團２。进化，之树结果显示，中华蜜蜂先与西方蜜蜂聚为个小分支一，与其它膜翅目屋虫Ｍａｌｖｏｌｉｏ构成个较大分支后，此分支由蜜蜂科、切叶蜂科、蚁科ｒａｍ２聚一和小蜂总科４个亚支构成；而与脊椎动物中的小鼠和人Ｎｐ为另大分支。－－１０ 為化艇？則广抑《沉巧＇Ｔ身鑛繳擊。燃鄉巧沒＂？ＭＬｃｌｒ：ｇａ……＇—．ｑＪ＾星，？３＾為終Ｓ觀ｉｒｗ＾＾－■－．－ＪｆｔＩｍ技ｙ《婦孩ａ掛巧０Ｓ■Ｂｏ觀ｉｔｏ绿沒ｃ输她塵—…ＪｆｉＩ於ｓ進分如巧ｏｗｗ約护；ａ＾—巧ｉ｜．＜為資或询巧急＇＇ｆ繳嫁ｗｍＰＩＷ巧擲滯乂蔚巧孩關－Ｉ—巧皮＆增游嫁邊离凌嫁疑碑輪城去读巧該？著ｒ．－＊￣＇￣＇＊＊＇￣？￣＊从然４城化＾＊？＊＾？＊￣＊炙余１Ｉ患々｜鄰？。．淀ｇｉ好麵巧《Ｉ０離图２－１基于中华蜜靖与其他物种Ｍａｏｌｉｏｌｖ氨基酸序列所构建的系统发育树Ｆ－ｉｇ．２１ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｘｘｅｎｃｅｓｏｆＭａｌｖｏｌｉｏｆｒｏｍＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａａｎｄｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ注－：系统发育树采用邻接法（ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）进行了１０００次重复构建，树枝度代表遗传距离，进化树分支上的数值Ｂｏｏｓｔｓｔｒａｐ代表１０００次絕环检验时的置信度。Ｎｌ－ｉｗｏｔｅ：Ｐｈｏｅｎｅｔｃｔｒｅｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｎｅｉｈｂｏｒｏｉｎｉｎｉｔｈ１０００ｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｓｂｒａｎｃｈｌｅｎｔｈｏｆｔｒｅｅｒｅｒｅｓｒａｉｔｅｄｔｈｅｙｇｙ，ｇｊｇｐｇｐｄｉｓｔａｎｃｅｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎ良ｏｏｔｓｔｒａｓｕｏｒｔｖａｌｕ货％）ｂａｓｅｄｏｎ１０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓｗｅｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ．，ｐｐｐ（ｐｃｍｖ一本课题组利用生物信息学软件分析了Ａｌ氨基酸些结构特点，得到的结果为；①该蛋白编码５８７个氨基酸，分子量为６５．８６ＫＤ，理论等电点（ｐｉ）为６．０３，包含２０种常见氛基酸．１．６％）ｓ１．），其中Ｈｅ（１０７％）含量最高，其次为Ｌｅｕ（０，Ｃｙ（０％含量最低，带负电氨基酸残基数（Ａｓｐ＋Ｇ山）为４４，带正电氨基酸残基数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３９。ｉ３②该蛋白无信号肤－２０（Ｓｅ，存在１１个跨膜结构域（图２２）ｆ；分别具有个糖基化位点６＂３２１３３５３＂＂２５８〇９１３’’’’’’巧化’和ｔＶ）、７个Ｎ糖基化位点（Ａｓｎ）和１４个磯酸化位点（８货１巧２的拍５！２５？７８１２４２３２〇５６４，，，，巡，，，，，二级和如）。③结构预测，ａ螺旋化ｅｌｉｘ）、Ｐ折叠（ｓｔｒａｎｄ）和环－。（ｌｏｏｐ）的比例分别是５８．４３％、１．５３％和４０．０３％（图２２）２．２Ａｃｍｖｌ与其它物种氯基酸序列的结构相似性分析将Ａｃｍｖｌ氨基酸序列与Ｃｅ９９５）证ｒａｍｐｌｌｉｅｒ（１实的关于小鼠、果购、水稻及酵母Ｎ家族同源体的氨基酸序列进行比对，并结合已预测的Ａｃｍｖｌ氨基酸序列的结构进行相似性分析－，结果如图２４所示。可见中华蜜蜂Ａｃｍｖｌ与Ｎｒａｍｐ家族同源体在跨膜区（ｔｒａｎｓｅｍｂｒａｎｅｄｏｍｉｎＴＭ）、、Ｔｒａｎｓｍｏｔｉｆ）ｍａ，跨膜区所带电荷转运蛋白特征结构域（ｐｏｒｔ！＾＾及氨基酸序列上都具有高度的保守性。序列结构相似性具体表现为：＠运用ＰＳＩＰＲＥＤｃｍｖ－软件预测Ａｌ氨基酸序列具有１１个跨膜结构（图２３）。这与Ｎｒａｍｐ家族普遍具有一＾１０１２个跨膜结构特点致二者；②在跨膜区及跨膜区带电残基上具有商度保留性，ＴＭ１、４、６、１０保守性最赢ＴＭ８、１１、１２保守性最差；在ＴＭ１、３、４、５、７中含有－－１１ －－－ＴＭＴＭｌ－、、８带负电的保守性残基，６和９中包含带正电的保守性残基２、２３３４９；③ｏｏ且在ＴＭ？ａｖｏ间的ｌｐ区也高度保守的，８ＴＭ９之间，ＡＣＭＶＬ与小Ｎｒａｍｐｌ和Ｍｌｌｉｏ在Ｔ一Ａｍｖ转运蛋白特征的结构域（ｒａｎｓｐｏｒｔｍｏｔｉｆ）上仅有个氨基酸不同；④ｃｌ蛋白与ＮＴＭ？ＴＭ－ｒａｍ蛋白家族在７８之间１ｐ，均含有个Ｎ糖基化的胞质外环状结构。Ｉ爹画》｜，貧蜘８８４幽，ｔ姊巧．辣ｉ滕齡泌纖麵㈱細＾晴唯师Ｉｐ綠筆麵難曲，漆両禱縛細占＇ＡＡ＞－．ＶＳ！‘与；Ｉ酿験編ＩＩ读觀々》ＭＨ巧Ｓ穿苗ｇ泣与Ｊ：城讀齡麵激Ｍ鈴賴絲Ｉ議陵Ｉｎ約紛絲ｔｍｉ齡磯漏ｌＨＩｉＳ紛穿ｉ加Ｉ巧齡，…；．？、９４，４，Ｔ＾■？＊巧．＊，车ＳｔＳ！ｉ：、■－Ｋ．：；ｉ；；？ｖ：？Ｗ》Ｓ；典；：去，：Ｋ；＞：ＶＣＶｓ＇Ｖ＇，，魚成．、、，？■■Ｓ；．－４＇一，ａ＾ｉＷＮＩ巧巧城巧巧穿詞游請ＭＭＭＮＮｉ．ｉｆＰＷ子！齡汹进獅幾Ｓ獲１１１脚薦穿義錄３＇把姊ｉ鶏闻Ｉ＇■－ｒｗ＊ｒ出《＂，ｔ：Ｊｆ作ｆｉ＇？．‘Ｓ知《！）Ｓ，．巧Ｎ把私；ａ＇；卓；，：１盛翻画棋念ｉ§Ｉｌ滅１龄＾適幽賴議㈱Ｉ賴輸．．ｉ＊！＾龍編３＃邏！幽１幽燃齡钻效１曝雌＾編細幽娜？＇＇＞占护告巧■啤？功的中＾…：－知如＞祖獅一：巧ｆ食繫ｆ尹至．‘．。齡ｙ．＊ｗ：，：－＾５：Ｖ取－巧ｗａ７＇，＇ｆ￣？一：咨＊‘，．＞’＇Ｓ，Ｓ）；？＂、产再■：：：：巧嚇＇、ＨＭＭｍＭ關撫物寒燃繊翻觸脚煤爲ｉｉ期廢，一？。扔＂？、………一＇＇，，＇’＞＜＾＾＾＝？＾＊糾＇。ｒ丰巧５，，＾＾请■＇…＇＂■？＇—＇一＇．。＇？—。？＇＂＇。＇…？—…、，＊．；，＇、《，，，户巧占户旅议、．磁，＇，知如似．心棋孤Ｗ沁ｉ龙…，护齡．拍巧Ｗ巧。：＊Ｓ？Ｗ；於＆＊；：．少＊，＊？如，：１：ｉ，：為兴。一‘，，‘？抑Ｉ渐东赫獅＇ＭＭＭｍ《齡津據画齡幽赛鋪汝約煤雞＂，一－：心ｒ＇：：：：弟，：■＆．－＇Ｖ畔古，Ｈ占＇、口．Ｊｉ：，？？宾Ｊｇ鲜巧心ＹＶＷ巧￡■＜？巧＇－綠‘ｍｍＭＳ料ＩＳａ，ａ？９Ｕ４ｉｉ紙料蝴獻换松＊妨Ｍ賺化＊的ＩｌＭｌＩ制Ｎ料锅ｐｉＭＨ媒紛Ｍ＇护與、＞和。…、．。１祭＜ｆ巧Ｓ？、巧，Ａ？＊＊，如龄＊．＂＜…一一一巧＇？；，＂巧家。ｆ。－：．、。；：：．＞：，ｊ？療口；．…＂ｒＩ＇Ｖ：一？图２－２巧ＩＰＲＥＤ软件预测的Ａｃｍｖｌ蛋白二级结构Ｆｉ－ｇ．２２Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆ化ｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡｃｍｖｌｒｏｔｅｉｎｂＰＳＩＰＲＥＤｐｙ－换，撫ｗ惦ｓ；＾．私＼：锭代Ｉ＼＼、ｆ＼ｆ＼ｉ／＼／ｊ麗湿ＩＩ；誦■誦Ｉ‘羅‘＇■ｉＭＢＩ‘＇Ｊ．Ｉ，：巧－Ｉ冬雪１１講画義編９１－了—＂＾＇＇■誦Ｉｌ麵’：ｔ７Ｉ！５５ｆｆｉ＼！＼／＼Ｊｉ／ＶＪＶ－聯巧如ｉ！础的；叫＼＊泌？齡２－３适过ＰＳ圧ＲＥＤｃｍｖ图软件分析的中华蜜蜂Ａｌ跨膜螺旋结构示意图巧－ｍｏｄｅｇ．２３ＳｃｈｅｍａｔｉｃｌｏｆＡｃｍｖｌｉｎｃｅｒａ＂。ｃｅｍ。。ｂｙＰＳＩＰＲＥＤ注－－：ＳｌＳｎ代表不同的跨膜区。Ｎｏｔｅ：ＳｌＳｌｌｒｅｐｒｅｓｅｎｔ化ｅｄｉｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ．－－１２ 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成的ＢＬＡＳＴ软件是目前最常用的序列比对软件。利用ＢＬＡＳＴ序列比对工具可Ｗ将未知的目的序列一（核昔酸序列或蛋白序列）根据序列相似性或致性与ＮＣＢＩ数据库中的已知序列进行匹配，从而获得未知序列的结构或功能相关的信息。本研究将Ａｃｍｖｌ氨基酸序列在ＮＣＢＩ中利用ＢＬＡＳＴ工具比对后发现，该序列与双翅目的冈比亚按蚊、哺郭’动物的人和小鼠的Ｎｒａｍｐ家族同源体有较商的相似性。而果魄的Ｍａ／ｗ／ｔｏ基因，化及酵母ＰＵ的讯诉、讯於和讯诉基因业已被证明属于ｉＶ心家族。系统发育树结果显示，Ａｃｍｖ一ｌ除与膜翅目昆虫的Ｍａｌｖｏｌｉｏ聚为支夕ｈ与哺乳类动物中人和小鼠的Ｎｒａｍｐｌ和２聚为另一一Ｎｒａｍｐ个大分克且序列致性分别为５９％和６３％，这表明中华蜜蜂Ａｃｍｖｌ与哺乳动物Ｎｒ一ａｍｐ蛋白在进化中都非常保守，可能源于个共同的祖先。因此，Ａｃｍｖｌ作为果魄的同源基因，可能也属于Ｗｒａ／ｎｆ家族。Ｃｅｌｌｉｅｒ将小鼠（Ｎｒａｔｎｐｌ和Ｎｒａｍｐ２）、植物（Ｏｓｎｒａｍｐｌ）、果蛹（Ｍａｌｖｏｌｉｏ）、酵母（Ｓｍｆｌ和Ｓｍ￡２）的Ｎｒａｍｐ家族同源体的氨基酸进行比对分析，总结出了Ｎｒａｍｐ家族Ｐ０１的结构特征。而本研究通过对Ａｃｍｖｌ氨基酸序列与上述６个Ｎｒａｍｐ家族同源体的序列比对结果显示，Ａｃｍｖｌ氨基酸序列符合Ｎｒａｍｐ蛋白家族的结构特点，属于Ｎｒａｍｐ家族。自１９９１年，在小鼠中发现ｉＶｒａ／Ｍｐ家族后，该家族基因已在植物、真菌及细菌中得Ｗ克隆－ｉ。在不同的物种中，该家族成员具有１３个不等，如，哺乳动物和线虫中Ｖｒａ／ｎｐ、家族有２个成员，酿酒酵母中已发现了Ｍｗｈ；？家族的３个同源体，而冈比亚按蚊淡色按蚊一ＰＵ、埃及伊蚊、果赃及西方蜜蜂中仅发现个基因。对其定位及功能研究表明，哺乳动物ｉＶ＞ｗｎｐｉ基因主要在巨睡细胞中表达，可Ｗ通过转运二价金属离子来抵ＰＳ抗分支巧菌及沙口氏杆茵的感染；主要表达于小肠和十二指肠上皮细胞的绒２＋毛膜刷状缘处一，是介导麻腔内Ｆｅ转入肠细胞的唯转运体４小结基于Ａｃｍｖｌ氨基酸序列相似性所构建的进化树及其与Ｎｒａｍｐ蛋白家族的氨基酸序列比对分析表明，Ａｃｍｖｌ与Ｎｒａｍｐ基因家族在进化上具有高度的保守性，属于Ｎｒａｍｐｒａ２的同源基因。此外／基因家族，且可能为Ｎｍｐ，心ｗｖ基因作为Ｗｒａｍｐ家族的同源体可能具有相同或相似的金属离子转运功能。－４－１ 第三章ｖ４ｃｗｖ／ｍＲＮＡ的组织表达差异性分析一蜜蜂作为种典型的社会性昆虫，其群体内部具有明确而细致的劳动分工。其中，蜂王和雄蜂共同负责繁殖－，而工蜂根据其生理日龄承担巢内外所有工作，１３周，作为内勤蜂，在巢内饲喂幼虫、保温解卵及清理巢房等；３周后，成熟为采集蜂，开始出巢采集花粉、花蜜、树胶和水。本研究对Ａｃｍｖｌ基因在内勤蜂和采集蜂各组织转录水平的一研究旨在了解该基因的组织表达将征，为采集行为的研究提供定的理论依据。１材抖与方法１．１试验材料１．１．１样本采集试验所用的蜜蜂样本采自山西农业大学动物科技学院实验蜂场饲养的中华蜜蜂蜂群。一选取群健康无病、群势６足框、无自然分蜂的正常蜂群作为试验蜂群。先从该蜂‘一Ｃ的、群中取出个老熟的封盖子脾，置于３４．５恒温恒湿箱中，待其羽化出房后，用无毒无味的油漆在其胸背部标记工蜂２００只后，放回原蜂群中。然后，于标记日起的第７日－ｎ点蜜蜂采集商峰期上午９，在巢口口采粉蜂和采蜜蜂的回巢蜜蜂各１００只，之后，打开蜂箱取标记的蜜蜂（内勤蜂）１００只。在冰上分别按触角、头、胸、腹、足５个部－Ｃ位取下，并分别搜集，用锡猶纸包好后巧入液氮速冻，８（Ｔ保存备用。Ｕ．２主要化器本试验所用的主要仪器有：超低温冰箱ＦＯＲＭＡ７００ＳＥＲＩＥＳ美国真空干燥箱Ｅ２－１０．ＤＺＦ６２１０中国广东－超净工作台ＢＣＭ１０００苏州（安泰）－核酸蛋白测定仪ＮＤ１０００美国（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）－９０纖祸振荡仪ＱＬ１江苏（海口）凝胶成像系统美国（伯乐）实时炎光定量ＰＣＲ仪ＭＸ３０００Ｐ美国（Ｓｔｒａｔａｅｎｅ）ｇ制冰机ＳＩＭ－Ｆ１２４日本ＳＡＮＹＯ移液枪德国（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）梯度基因ＰＣＲ扩增仅ＡＢＩＶｅｒｉｔｉ９６ｐｃｒ仪美国（ＡＢＩ）一电泳仪ＤＹＹ－３北京（六）１丄３主要试剂Ｔｒｉｚｏｌ、反转录试剂盒（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）、实时巧光－－１５ ＹＢＲ？ＡＰＣＲ试ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａＩＩ）口ＫａＲａ公司。Ｄ邸Ｃ、定量剂盒（Ｓｑ及进枪头均购自Ｔａ固相ＲＮａｓｅ清除剂等常规试剂均购自武汉博±德生物公司。１．２试验方法１．２．１总ＲＮＡ的提取’从－８０Ｃ冰箱内取出已分离好的分别由０１０只内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各自不同部位组织（触角、头、胸、腹和足）组成的混合样品，参照ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ说明书进行各组织总ＲＮＡ提取：，步骤见附录１ｃＤ一链的合成１．２．３ＮＡ第提取的各组织总ＲＮＡ，按照Ｐｒｉｍ始ｃｒｉｐｔ？ＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ反转录试ｃＤｍｅ？ＲＴｔｅｒ剂盒说明书进行反转录ＮＡ的合成。反转录体系为２０咕，其中５ｘＰｒｉＭａｓＭｉｘ为４ｊｉＬ，总ＲＮＡ量为１０００ｎｇ（每１０曲体系，可反转录ＲＮＡＳ５００ｎｇ），最后用’°ＲＮａｓｅＦｒｅｅ（１地２〇补足。反转录程序为：３７Ｃ１５ｍｉｎ，８５Ｃ５ｓ。１．２．４引物设计与合成根据ＮＣＢＩ网站上已公布的西方蜜蜂ｍＲＮＡ序列（登录号；ＸＭ６２３９４３），＿ｍｅｒｍｅｒ－－采用Ｐｒｉ３ｌｕｓ在线软件结合ＮＣＢＩ网站上Ｐｒｉｂｌａｓｔ设计特异性引物（见表３１），ｐ由华大基因生物公司合成。表３－１目的基因和内参基因引物序列－ｒｍｅｒｕｅｎｃｅｓｆ－Ｔａｂｌｅ３１Ｐｉｅｄｈｏｕｋｅｅｉｎｓｅｑｏｔａｒｇｔａｎｓｅｐｇｅｎｅｓｇ１＇基因引物序列—（５３）退火溫度尸Ｃ产物长度／ｂｐＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓＡｎｎｅａｌｉｎｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｌｅｎｔｈｑｇｐｇＦｏｒｗａｒｄ：ＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴＡＡｃｍｖｌ５８１００ＲｅｖｅｒｓｅＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣ：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＣＣＧＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＣＴＴＴ１化ｒＲＮＡ５８１２１Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＣＧＣＴＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣ１ａ－．２．５ＲｅｌｔｉｍｅＰＣＲ反应体系及条件优化先用反转录的ｃＤＮＡ模板对内参基因和目的基因引物进行普通ＰＣＲ检测＞，１＾１便筛选出引物的最佳退火温度一ｃＤＮＡ。然后ＭＸ３０００Ｐ炎光定量仪上再进，在步确定适合的。Ｒｅａ－ｍＲ反应模板浓度和引物退火温度最后，针对各组织样品进行ｌｔｉｅＰＣ，检测相应引物的扩増烙解曲线、目的基因和内参基因的扩增效率。适合的反应条件为：总反应体系２０咕，包搞ｃＤＮＡ模版２咕，ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘ？Ｔａｑ＾（２ｘ）１０＾ｌＬ，上、下游引物（１０＾ｌＭ）分别为０スｎＬ，民ＯＸＲｅｆ班ｅｎｃｅＤｙｅＩＩ（５０ｘ）°，’０．４ｎＬ，ｄｄＨ２〇６ｎＬ。扩増条件为：９５Ｃ预变性３０ｓ；９５Ｃ变性５ｓ，６３Ｃ退火及延伸３０－１６－ Ｓ，４０个循环。每个样本重复３次。根据标准曲线及扩増曲线Ｃｔ值计算结果。１２．．６标准曲线的制作将ｃＤＮＡ模板按照２倍稀释８个浓度梯度。然后，根据优化的试验条件，进行Ｒｅａ－ＭＸＰ－３０００ＰｌｔｉｍｅＰＣ民反应。由ｒｐＭＸ软件导出曲线方程、扩增效率及决定系数，分析目的基因和内参基因的扩増效率。１．２．７目的基因的相对定量分析本试验分别对内勤蜂（７日龄）、采蜜蜂及采粉蜂的触角、头、胸、腹和足５个部位组织，共１５个样本进行了巧光定量ＰＣＲ反应。其中，每个样本的目的基因和内参基因一各做３个技术重复，每次试验均设有同对照组。１．２．８数据处理与结果分祈通过分析目的基因和内参基因的标准曲线－且，证实二者的扩增效率在９０％１１０％，５２Ａ＆ＥＴ］［相对偏差接近５％，即符合法运算条件。可Ｗ采用２法计算Ａｃｍｖｌ基因相对１８ＳＲＮＡ的相对表达量。运用ＳＰＡＳＳ１７．０中的单因素ＡＮＯＶＡ方法进行方差分析，并选用新复极差法进行多重比较。２结果与分析２．１各组织总ＲＮＡ的提取及检测结果ＲＮＡ？用核酸蛋白测定仪检测各组织中提取的总ＯＤ２６０／２８０均在１．８２．０之，发现其３－间，属于合格的ＲＮＡ。１％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测结果显示（图１）２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ及５ＳｒＲＮＡ的电泳条带均清晰可见，且无明显拖尾现象，说明所提取的ＲＮＡ样品较为完整一，可Ｗ进行下步试验。３－图１中华蜜蜂各组织总ＲＮＡ的电泳检测图Ｆ－Ｒｉｉ．３１ｅｓｕｌｔｓｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｄｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｏｆｃ．ｃｅｒａｎａｇ注：Ｍ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ。ＭｉｓＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．－－１７ ２．２标准曲线的建立２３－２＝），０本试验目的基因和内参基因掠准曲线结果显示（图目的基因的Ｒ．９９９，内２＝－－参基因１８Ｓ的Ｒ０．９９６，且二者的斜率分别为３．６４４和３．３５４，表明基因Ｑ值和起始ｃＤＮＡ浓度之间具有良好的线性关系，符合相对定量要求。而瓜ｗＷ基因和１８Ｓ的扩增＆Ａｎ＇效率分别为８８．１％和９８．７，接近理想ＰＣＲ反应。可Ｗ采巧ｒ法进行相对定量结果分Ｃ＝Ｃ－ＡＡＣ－ＡＣ）姐。析（注：Ａｔｉ目Ｃ［，ｆＡＯｒａ验；（撤坦）ｐ的細ｔ的細ｔ９参細ｔｆ雜帽｜！ｉ禱幽ｉｌｌ藝｜：：壞肴前简積，：觸賊鳴５静琴ｆ補Ｉ禱觀！麵Ｓ｜｜謙職專｜圓‘＇：亩斬易＾麵攀读奪蠢礁讀ｇ誦茜豁部是赛！軒議幽售纖谭姻瞬審蠕Ｉ議．．．＾—．—．．．．—．．．一－ｉＩｆ中生ｓｒ；ｖ；ｗｉｂ咕ｔ古—＿＿＿＿＿一＿＿＿＿＿＿图３－２＾ｃｗＷ和ＳｒＲＮＡ的标准曲线１８－ＦｉｒＲＮＡｇ．３２Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆ心ｗｉｖ／ａｎｄ１８Ｓ２３护增动力学曲线及炼解劝力学曲线ＰＣＲ技术一根据相对巧光定量的试验要求，试验必须设置Ｈ个水平的校正，是物理校正，即通过添ＲＯＸ来校正各ＰＣＲ反应管间的误差；二是重复校正，即要求至少Ｓ个化ｉ：的生物重复；呈是内参基因校正，用Ｗ校正取样时存在的误差。本试验Ｗ１８Ｓ为内参一基卸个泡合样本、三个技术重复同时进行先ｗＷ基因和１８Ｓ的定量扩增，扩增结果显示’’３－３（图），目的基因和内参基因扩增曲线的拐点清晰基线平直，可型曲线良好。猜吕：＾Ｉ１．＃［＇＾？■＇＾■＊．．．＊：：．．Ｈ？■■■？■ｔ＂＾＾Ｒｉ＾＊？ｉｆｉ＾Ｂ呼Ｓ备去吝？ｆｉ￣：■：：：；：：；；＾；ｉ，．＾；；；；ｉ１；＾；ｊｙＩＩＩＩ■卓．‘＇，■－？■■：，；１■：＇：：？‘？■！■，＜ｉ－。■■■？．．．？—－．一——ｒ？ｎ？―，——Ｉ图３－３灰ＷＶ／和ＩＳＳｒＲＮＡ的扩增动力学曲线－１ＲＮＡＦｉ．３３Ａｍｌｉｃａｉｏｎｌｏｔｓｏｆ心Ｔｗｖ／ａ打ｄ８Ｓｒｇｐｔｐ－－１８ 样品基因和ＩＳＳｒＲＮＡ的扩增产物溶解曲线结果湿示３－（图４），目的和内参基因的扩增产物擦解曲线均为单峰，说明ＰＣＲ扩增过程中无非特异性扩増产物及引物二聚体（图示结果为横坐标为温度，级坐标为巧光信号强度变化关于温度的负导数）。ｋＩ，．＇．．．，ｆ：．…．．＇Ｌ－．？■－’‘：．？Ｖ參：ＬＶ—－－．－－．－—－，ｒｉｎｎｒＴｎｒｒＴｒｍｍ「，ｔ｜Ｊｎｇ＂ｉ＂ｉＭｉ＂ｉｉｉｉｉｍｉＭｉＪＩ）ｉｉＪＩｉＵｉＪＪＩｌｕｌｉｍｉｌＵＪ｜｜）ｌＪ矜，．图３－４＾ｃｗＷ和Ｊ＆Ｓｒ民ＮＡ的扩增溶解曲线－Ｆｉ．３４ＤｉｓｓｏｃｉｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＡｃｍｖｌｒｇａｎｄ１８ＳＲＮＡ２．４ＡＴｗＷｍＲＮＡ在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织的表达通过实时炎光定量ＰＣＲ分析了基因在中华蜜蜂内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂的５个不同部位组织（触角－、头、胸、腹和足）ｍＲＮＡ的表达差异，结果表明（图３５），基因在内勤蜂及采集蜂的各组织均有表达。内勤蜂中，胸部表达量最高（７．４７１），显著高于其它部位組织（户＜０．０５），其次为头部（３．６９１），再次为足部（１．２２８）和腹部（１．１２６），但二者间差异不显著，最低为触角（０．４４４）采蜜蜂中，腹部（２．９５６）；和足部（２．７５９）表达量最高，与其它部位组织差异显著（户＜〇．〇５），头部次之（１．６０７），触角（０．５１２）和胸部（化６０７）表达量最低，且二者间差异不最著粉蜂中；采，腹部表达最髙（４．２２５），显著高于其它组织（戶＜０．０５），足部（２．２６６）次么其次是胸部（１．０６１）和触角（１．０００），且二者间差异不显著，头部表达量最低（０．５９３）。－－１９ １０－｜￡－，；；？二。内巾？！！阶Ｎｕｒｓｅ＇ａＣＨ０５３义皆站巧Ｎｅ＇８ｔａｒＩｕｒａ护ｒ－Ｍ￣厂１Ｂ圍ＩＭ那＞胖Ｐｏｌｌｅｎｒ〇ｒａｙｅ．ｉ製６－Ｉ圓Ｉｂ囊Ｓ４－ｉ＃ｂ１圓Ｉ，圍Ｉ旨島＿＿＿＿＿＿。＾！筆璋擊与Ｉ与草ｊ學音華擊＿擊＾＇Ａｈ■．．？＞ＡｌｌｌｉｅＩｌ！，＜ＡｌＵＴｈＵＡＩＩ．Ｉｌ．庐１ｌｍ八ｈｎ＞ＡｈＬ１幻Ｉ＂Ｉｉｓｓｕｅｓ３－５图＾ｃｗｖ／在中华蜜峰不同组织的表达量Ｆｉ－ｍ．３５Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ＾ｃ／ｎｖ／ｄｅｒｅｎｔｓｓｕｅｓｏｆｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａｗｏｒｇｐｉｆｆｔｉＡｐｉｋ巧注：Ａｎ：触角Ａｎｔ畑ｎａ；Ｈｅ：头Ｈ閒ｄＴｈ：獅ＴｈｏｒａｘｗｉｔｈｗｉｎＡ；．；师翅）；ｂ腹ＡｂｄｏｍｅｎＬｅ：足Ｌｅ图中数据为（ｇ）；ｇ平均值±标准误，柱上小同的小写字母表巧差异盈著（户＜０．０５，单因素方差分析）Ｄａｔａｗｅｒｅｍｅａｎ±ＳＥ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｒｅｎｃｅ－ａｂｏｖｅ．ｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｎ巧ｃａｎｔｄｉｆｅａｔ化ｅ００５ｌｅｖｅｌＯｎｅＡＮＯＶＡｒｉ．ｇ（ｗａｙｖａａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ）３讨论３．１关于＿４ｃｗＷ基因在腹部表达的分析广泛表达于各组织和细胞内，具有宽范围的离子转运功能，可Ｗ转运打产、２２＋２＋２＋２＋２＋２＋［巧＂４５ＭｎＣＺｎ’’Ａ］＼Ｍｇ、ｏ、、Ｃｄ、Ｎｉ和Ｐｂ等二价金属离子。哺乳动物中，Ｗ２＋ｒｃｍｚｐｊ主要表达于小肠和十二指肠上皮细胞的绒毛膜刷状缘处，是介导肠腔内Ｆｅ转一ｆＷ入肠细胞的唯转运体。果蜘中脑、马氏管、性腺、胚胎羊浆膜及幼虫和成虫的消化道也检测到２＋Ｍｆｌ／ｗ献基因的表达，其中在中肠前端和后端肠细胞内的的表达可能与ＦｅｗｉｔＢ离子的吸收转运相关。ｅｔｅｄｉ等通过金属含量测定实验，发现Ｍａ／ｖｏ化？基因主要影响果颇体内铁平衡，且果蜗体内的多铜氧化酶ｍｃ〇３可能具有类似哺乳动物亚铁氧化酶２＋３＋的功能，即能够将肠细胞吸收的外源性Ｆｅ氧化为Ｆｅ排放到血液循环系统供给全身各处这提示在内勤蜂、采蜜蜂和采粉峰腹部的表达差异可能与腹部肠细胞转运２＋２＋２＋２＋Ｍｎ、Ｃｕ和Ｆｅ有关，尤其是Ｆｅ。３．２关于＾曰所以基因在胸部和足部表达的分析，且可Ｗ转运多种二价金属离子基于在体内广泛分布，在不同组织可能行使不通的功能。王海涛等发现游泳训练组大鼠通过上调脾脑肌细胞膜上ＤＭＴ１（属于Ｎｒａｍｐ蛋白家族，又称为Ｎｒａｍｐ２）和ＴｆＲｌ（转铁蛋白受体），进而向肌细胞内２＋５ＳＦ１２＋ｉ转运更多ｅ来满足运动的需教。这表明Ｖｒａ／ｎ批可Ｗ通过转运Ｆｅ参与了肌肉运动，而蜜蜂的胸部和足部含有大量肌肉组织，所１＾＾髙表达于内勤蜂胸部和采集蜂足部２＋也可能与转运Ｆｅ参与肌肉运动有关。－２０－ ３．３关于基因在头部表达的分析Ｂ－ｅｎＳｈａｈａｒ等采用原位杂交技术检测到表达于西方蜜蜂脑部的葦形体、触角叶和合管下神经节蜜蜂的采集过程也是一个对喜欢或厌恶的条件刺激进行学习记忆一一的过程，而多己胺和，糖对蜜蜂来说是种奖励刺激，而盐是蜜蜂不喜欢的种刺激ｐｑ０Ａ在蜜蜂和果蜗奖励或惩罚的学习记忆中扮演着重要的角色。研究表明，多臣胺受到脑内掌形体和食管下神经节的支配０Ａ在触角叶中的功能也可能与蜜蜂的采集行２＋２＋２＋Ｗ７４８’ｌ为相关加之，早有Ｍｎ、Ｆｅ和Ｃｕ影响果赃味觉识别的报道。因此，灰ｍｖ／２＋２＋在头部的功能可能是通过转运Ｍｎ、Ｆｅ和打产参与多己胺及０Ａ通路来影响蜜蜂庶糖反应进而影响其采集行为的。。本研究结果显示，，采，在头部表达量为内勤蜂最窩粉蜂最低，采蜜蜂居中－Ｓｈａｈａｒ等在西方蜜蜂头部表达量内勤蜂最低这与Ｂｅｎ，采粉蜂最高，采蜜蜂居中的结果Ｐ２一巧致。Ｂｅｎ－Ｓｈａｈａｒ所取的采蜜。送可能与蜂种及采样群当时所处的巢内外环境有关蜂和采粉蜂均大于３周龄，而本研究是根据行为特征而随机取的采蜜蜂和采粉蜂，未考一。虑其日龄因素，样品中可能包含有提早采集和过老的采集蜂而另个与采集行为相关Ｆｏｒ基因化－２２日龄达到最高，早于或晚于该日龄段，表的在西方蜜蜂头部表达量为，ｗｔｉ达量均会降低。这提示Ｍｖ／与Ｆｗ同样作为与果魄觅食相关的基因，其对采集行为的影响也可能随日龄变化，在早熟和过老的采集蜂头部表达量较低。刘芳对意大利蜜蜂哺育蜂和采集蜂头部ｍＲＮＡ高通量测序的结果显示，Ｆｏｒ基因表达量在哺育蜂头部高于采集蜂且差异不显著ＷＩ。因此，还，采集行为除受调控外会受到峰群结构及外界蜜一粉源环境等因素的影响。所Ｗ有关对中华蜜蜂采集行为的影响还有待进步研究。４小结本试验对Ａｒｍｖ／基因在中华蜜蜂内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂触角、头部、胸部、腹部和足部５个部位组织的ｍＲＮＡ表法进行了定量分析，结果显示，基因鳥表达于内勤蜂胸部、采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部，这表明该基因表达的差异影响采集行为。由２＋２＋２＋于为ＪＶｒｗｗｐ家族的成员，且具有转运Ｃｕ、Ｍｎ和Ｆｅ的功能，因此，推测心ＷＶ／基２＋２＋２＋２＋因影响采集行为可能与转运Ｃｕ、Ｍｎ和Ｆｅ（尤其是Ｆｅ）有关。－－２１ 第四章内勤蜂和采集蜂各组织Ａｃｍｖｌ蚕白的表达分析基于Ａｃｍｖｌ基因的氨基酸序列分析，发现Ａｃｍｖｌ蛋白其属于Ｎｒａｍｐ蛋白家族，且该家族蛋白普遍具有二价金属离子转运功能。为探究该蛋白在各组织的表达差异，本研４ｃ究在了解内勤蜂和采集蜂各组织ｙ７ｗｖ／基因转录水平的基础上，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ技术，对其蛋白在各组织的表达情况进行了探究，Ｗ期找到该基因在不同组织的表达量与采集行为间的关系。１材料与方法１．１试验材料１丄１样本采集试验样本选取内勤蜂和采集蜂头、胸、腹、足五个组织部位，样本采集方法同第二章１丄１。１丄２主要仪器本试验所用的主要仪器有：超低温冰箱ＦＯＲＭＡ７００ＳＥＲ圧Ｓ美国１０－真空干燥箱Ｅ２．ＤＺＦ６２１０中国广东全自动高压灭菌器ＭＬＳ－３０２０日本（三洋）凝胶成像系统美国（伯乐）高速冷冻离也机Ｃｅｎｔｒ航ｇｅ５４１５Ｒ德国（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）－核酸蛋白测定仪ＮＤ１０００美国（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）繊祸仪〇以９０１江苏（海口）ＢＧ－ｖｅｒＭＩＮＩ迷你垂直电泳仪北京（百晶）－ＢＧｔｒａｎｓＢＬＯＴ迷你转移芯北京（百晶）ＩＭ－Ｆ制泳机Ｓ１２４日本ＳＡＮＹＯ单道可调量程移液器德国（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）侧摆摇床ＥＳＨ０２上海（碧云天）电泳仪邸％００上海（天能）－ＨＤＢＰ山Ｓ恒温金属浴ＨＤＢ－Ｐ山Ｓ北京（鼎吴源）－２Ｆ上海ｐＨ汁ＰＨＳ（雷磁）１丄３主要试剂及配制方法－２２－ 试验所用的主要试剂有：Ｔｒｉｓ（ＭＷ１２１．１４）；浓盐臉甘氨臉过硫酸倭（ＡＰ）；十二烧基横酸销（ＳＤＳ）；ｘ３０％丙帰蘭胺；ＴＥＭＥＤ；５Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｅｒ；凝胶蛋白蓝染试剂念；彩色预染中分子量蛋－立春红染液白Ｍａｒｋｅｒ（货号：ＡＲ１１１３）ＮＣ膜（０．４５畔）（货号：ＡＲ０１３４５）（货号；；；－ＡＲ０－１４２）；羊抗兔ＩｇＧＢｉｏｔｉｎ二抗（货号：ＢＡ１０５４）ａｃｔｉｎ抗（货号：ＢＡ２３０５）；；ｐ兔ＢＣＡ蛋白定量试０－剂盒（货号：ＡＲ０１４６）；哺乳动物组织蛋白提取液（货号：ＡＲ０１１１００）；ＰＭＳＦ（货号；ＡＲ１１７８）；脱脂奶粉；Ｔｗｅｅｎ２０（货号；０７７７）；超敏ＥＣＬ发光底物（货一－：ＡＲ１１７１）化钢ａｃｉｎ号，均购自武汉博±德生物公司。多克隆目的抗及ｐｔ；甲醇；氯一抗由京天成生物技术有限公司制备提供多克隆。－－主要试剂、分离胶和浓缩胶的配制方法见表４１和表４２。表４－１主要试剂配制方法ａｂ－ＴＴｌｅｔ４１ｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒｅｇｅｎｔｓｒｅａｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｓｓｔｕｄｙｐｐＩＳｉＳＢ制方法ＲｅａｇｅｎｔＴｈｅｐｒａｒｅｍｅｔｈｏｄｏｆｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｑｐ．５ｌ／（，，１ｍｏＬＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．８）扣ｓｂａｓｅ４５．４２ｇ，ｄｄ＆ＯＺＯＯｍＬ调ｐＨ至８．８定容至２５０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨｔ８）Ｔｒｉｓｂａｓｅ６．０６ｇ，ｄｄＨａＯＳＯｍＬ，调ｐＨ至瓦８，定容至ｌＯＯｍＬ１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）Ｔｒｉｓｂａｓｅ３０．２９ｇ，ｄｄ＆Ｏ２００ｍＬ，调ｐＨ至７．５，定容至２５０ｍＬ１０％ＳＤＳＳＤＳｌｇ，ｄｄＨｓＯｌＯｍＬ，加热溶解，常温放置°ｍＬ一１０％ＡＰＡＰＯ，ｄｄＨＯ，，４Ｃ避光保存．ｌｇｓｌ溶解后周电泳缓冲液Ｔｒｉｓｂａ祀３．０３ｇ，Ｇｌｙｌ４．４ｇ，ＳＤＳｌｇ蒸馈水定容至ＩＬ转移缓冲液扣ｓｂａ化３．的ｇ，Ｇｌｙｌ４．４ｇ，甲醇２００ｍＬＴＢＳＮａＣ１８．８ｇ，ＴｒｉｓＨＣｌ（７．５）ｌＯｍＬ，蒸溜水定容至ＩＬＴＥＳＴＴＢＳ７００ｍＬ，２０％Ｔｗｅｅｎｌ．６５ｍＬ，混匀后，室溫保存封闭液脱脂奶粉０．５ｇ，ＴＥＳＴ１０ｍＬ，现用现配混句后‘２０％ＴｗｅｅｎＴｗｅｅａ２ｍＬ４（１氏〇ｌＯｍＬ，４Ｃ保存，，表４－２本试验所用８％分离胶及５％巧缩胳的配巧方法－ｎｄＴａｂｌｅ４２Ｔｈｅｒｅａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆ８％ａ５％ｓｔａｃｋｉｎｅｌｐｐｇｇ各组分名称８％分离胶（口ｍＬ）５％浓缩胶（５ｍＬ）Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ８％ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｅｌ５％ｓｔａｃｋｉｎｇｅｌｇｇ蒸饱水５觀３．４３０％丙稀醜胺３．４８０．８３１—．５ｌ／ＬＴｒｉｓＣｌ（ｍｏ．ＨｐＨ８．８）３．２８０—．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．６３１０％ＳＤＳ０．１３０．０５１０％ＡＰ０．１３０．０５ＴＥＭＥＤ０．００７８００５１．２试验方法－２３－ １．２．１各组织总蛋白提取’从－８０Ｃ冰箱中取出保存的内勤蜂和采集蜂各组织样品，逐个放入含有液氮的研体中进行研磨，至粉末状后，用小药匙将其刮入ＥＰ管中。称量每个样品粉末的净重，按照样品重量（ｇ）：蛋白提取液体积（ｍＬ）为１：１０的比例加入蛋白提取液，然后按照加ＰＭＳＦ：ＰＭＳＦ入蛋白酶抑制剂；蛋白提取液为１１００的比例加入，迅速游祸混匀后，置’－１也２次－Ｃ于冰上裂解２３ｈ。然后，２０００ｇｌ０ｍｉｎ，离。吸取上清液分装于小ＥＰ管中，８０保存。１．２．２蛋白浓度的测定根据ＢＣＡ蛋白定量试剂盆说明书进行总蛋白浓度测定，见附录２。１．２．３聚丙浦醜胺凝胶电泳试验前ｃｍｖｌ蛋白的多克隆抗体的效价进行检测，并，先要对公司制备的中华蜜蜂Ａ对分离胶浓度一、抗和二抗浓度及转膜时间等试验《件进巧摸索，Ｗ便选用最优的反应条件。Ｕ）制胶；将洗净瞭干的成对玻璃板放于制胶器中对齐夹紧防漏胶），然后固定。于基座上根据表分离胶的配方配制１０％的分离胶，，依次加入各组分后，充分摇匀后一入６巧ＩｍＬ移液器吸取该溶液从玻璃板ｍＬ时，正好侧沿两板的间隙处缓缓加入，加到分离胶和浓缩胶的分界处。，然后吸取双蒸水沿胶面缓缓加满，Ｗ便将分离胶压平静一３０ｍｉｎ。将残置，水和胶分界处出现条折线时，胶便凝固好倒去上层双蒸水，用滤纸留水吸走。然后，用同上方法酷制５％浓缩胶，并灌注好后，缓慢将梳子垂直插入，静置３０ｍｉｎ，Ｗ便胶凝固。议上样电泳；１００ｉ根据所测的蛋白浓度，每个样品总蛋白上样量为＾ｇ，计算样品’体积。然后将样品与於ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ按照１：４的体积比进行混合，离也后，９８Ｃ，变性１０ｍｉｎ，离也，：８０Ｖ，Ｉｈ，跑浓Ｖ，３ｈ跑分离胶，，进行电泳条件为缩胶，１２０约，城转膜；在膜的选择上，由于Ａｃｍｖｌ蛋白分子量为６５．８６ｋＤａ，所Ｗ选用孔径为一０．４５的ＮＣ膜。第步，切胶。将玻璃板从制胶器上取下来，用蒸觸水冲干净表面。的电泳缓冲液，左手拿玻璃板，长板朝上，短板朝下，右手用塑斜尺轻轻将玻璃板鏡开第二步，膜和滤纸的裁剪。根据胶的大小，准备膜和滤纸，膜要稍大于胶，胶要稍大于滤纸一，Ｗ兔发生短路。膜和滤纸剪好后，在膜的背面角进行标记，放于转移缓冲液中浸泡。第Ｈ步，Ｈ明治的制作，将海绵垫放在最下层，然后依次放上剪好的滤纸、胶、一步都要用尺子将中间的气泡赶走膜和滤纸，毎，最后盖上海绵垫，将其放在转膜用的‘。４Ｃ１００夹子的黑面上，夹好将夹子黑面向着转移槽的黑面，白面对着插入槽的红面，Ｖ，９０ｍｉｎ进行转膜。－２４－ ４：，Ｍａｒｋｅｒ条带是否清晰来判断转膜完全与否（）封闭膜转完后可观察预染，用５％ＢＳＡ，在摇床上室温封闭１．５ｈ。樹抗体脾育一；用１：３０００比例稀释目的和内参抗分别对目的和内参蛋白进行解育，°Ｃ解育过夜一在摇床上４。第二天，将膜用ＴＢＳＴ清洗２次，每次１０ｍｉｎ，ＴＢＳ清洗次，－ｌＯｍｉｎ。然后用１：３０００１５ｈ，ＴＢＳＴ清洗２次，ＯｍｉｎＴＢＳ清配制的二抗脾育ｌ．每次ｌ，一洗次，１０ｍｉｎ。一做ＥＣＬ检测：打开Ｉｍａｇｅｌ沁软件进行发光检测，设置好系列参数后，吸取适量相同体积的ＥＣＬ发光液的Ａ液和Ｂ于ＥＰ管中混合，将膜冗面朝上，均匀滴加混合液后，置于凝胶成像系统进行检测。选取条带清晰的图片。１．２．４图像处理及分析利用ＩｍａｇｅＪ分析软件对各部位组织内参及目的蛋白条带进行灰度值分析，目的基因的相对表达量为心ｗｖ／与相应献Ｊ的灰度比。ＰＡＳＳ１７０ＡＮＯＶＡ．软件中的单因素方法运巧Ｓ，比较同种采集蜂（内勤蜂、采集蜂或采粉蜂）各组织的表达量，Ｗ及不同采集蜂的相同组织的表达量。２结果与分析２．１Ａｃｍｖｌ多克隆抗体质量检测按照上述操作方法和试验条件，提取中华蜜蜂采集蜂头部的总蛋白，测定浓度后，一每个上样孔的总蛋白量为１００帖：，血清浓度也，抗浓度为１３０００作为阴性对照，阴性为３００－１：０，结果如图４１所示，用Ａｃｍｖｌ蛋白僻育的膜上，在接近６５姐ａ处出现明显的蛋白条带，而用阴性血清解育的膜上，该位置几乎没有蛋白条带。说明中华蜜蜂Ａｃｍｖｌ一蛋白的多克隆抗体制备良好，可Ｗ进斤下。，试验条件合适步试验—／？ｋｉ＞＜ｉ—ｓ；伽峭争Ｉ贴１辭ｏｏｒ，巧化ｏｕｗ．ｎｒｉ巧图４－１Ａｃｍｖｌ多克隆的检测Ｆ－－Ａｉｇ．４１ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｃｍｖｌａｎｔｉｂｏｄｙｆＡ。ｃｅｒａ。化ｏ－－２５ ２．２内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织Ａｃｍｖｌ蛋白的相对表达量分析－２可见Ａｃｍｖ由图４ｌ基因分别在中华蜜蜂内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂头部（带触角）、４－Ａ胸部（带翅膀）、腹部和足部个部位组织的蛋白表达结果，其中，ｐａｃｔｉｎ和ｃｍｖｌ蛋白在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂的头、胸和足部均有表达，而在腹部表达极少或不表达。１２３４１２３４１２３４■ｎ■ｉＡｃｍｖ？■１葬ｉｋＤａｌ勇、ｐｌｉ■Ｉ１！１１議｜｜？６５－ｐａｃｔｉｎｍｍＭ４２ｋＤａｍｍＮｕｒｓｅＮｅｃｔａｒｆｏｒａｇｅｒＰｏｌｌ削ｆｏｒａｇｅｒ４－２Ａｃｍｖ图ｌ室白在中华蜜蜂内勤峰、采蜜蜂和采粉蜂各组织的表达－Ｆｉ．４２Ｅｘｒｅ化ｉｏｎｏｆＡｃｍｖｌｒｏ化ｉｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｉｎｎｕｒｓｅｎｅｃｔａｒｆｏｒａｅｒａ打ｄｏｌｌｅｎｆｏｒａｅｒｏｆＡａｇｐ，ｐｇｐｇｃｅｒａｍ．１：头（带触角）；２；胸部（带触角）；３：腹部；４；足部。１：Ｈ说ｄ（ｗｉ化ａｎｔｅｍｉａ）；２：Ｔｈｏｒａｘ（ｗｉｔｈｗｉｎｇ）；３：Ａｂｄｏｍｅｎ；４：Ｌｅ．ｇｃｍｖ－Ａｌ蛋白在送Ｈ种工蜂头、胸和足３个部位组织的表达量分析结果见表４３。内勤蜂中，Ａｃｍｖｌ蛋白在胸部的表法量最高，显著高于头部和足部（Ｐ＜０．０５），头部和足部无虽著差异；采蜜蜂中，Ａｃｍｖｌ蛋白在头部表达最高，显著高于胸部和足部（Ｐ＜化０５），足部和胸部无显著差异；采粉蜂中，Ａｃｍｖｌ蛋白在头部和胸部的表达量显著高于足部（Ｐ＜化０５），头部和胸部间差异不显著。Ａｃｍｖ４－ｌ蛋白在Ｈ种蜜蜂相同组织的表达量分析结果见表３，在头部，采蜜蜂的表达量最高，显著高于内勤蜂和采粉蜂（戶＜０．０５），而内勤蜂与采粉蜂无显著差异；在胸部，内勤蜂的表达量最高，显著高于采蜜和采粉蜂（戶＜化０５），而采蜜蜂和采粉蜂表运量间无显著差异；在足部，采蜜蜂和内勤蜂表达量均显著高于采粉蜂（户＜化〇５）。表４－３Ａｃｍｖｌ蛋白在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂Ｈ种组织中的表达量Ｔａｂ－Ｔｈｉｉｉｈｉｌｅ４３ｅｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆＡｃｍｖｌｒｏ化ｎｎｔｒｅｅｓｓｕｅｏｆｎｕｒｓｅｎｅｃｔａｒｆｏｒａｅｒａｎｄｐｐｔ，ｇｏｅｎｏｒａｅｒｐｌｌｆｇ采集蜂头（带触角）胸（带翅ＳＩ）ｉＦｏｒａｇｅｒＨｅａｄ（ｗｉ化ａｎｔｅｎｎａ）Ｔｈｏｒａｘ（ｗｉ化ｗｉｎｇ）Ｌｅｇ＇＾＊＾？＂＾＾ｎｕｒｓｅ１．±．．１０１±０．０１６１７３５±０．０％０８２９００２９．＾＇＇＾２＇？＾ｎｅｃｔａｒｆｏｒａｅｒ．０００±０．１６２０．９９１±０．００８１．１７９±０．０２２ｇ？＂？＊＂±＊？ｐｏｌｌｅｎｆｏｒａｇｅｒ０．９６４±０．０８５０．８９４０．１８５０．３３２±０．０１７一一注。＜０．０）：各组织蛋白表达量用平均值标准误表示同行中，上角标小写字母表示差异想著（Ｐ５同列中上角标，大写字母表示差异显著。±Ｎｏｔｅ：ＴｈｅｐｔｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｈｏｗｅｄｉｎｍｅａｎＳＥ．Ｉｎ化ｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｅｒｉｎｓｕｅｒｓｃｒｉｔｓｍｅａｎｓ化ｅ，ｐｐｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｓｓｉｇｎｌｆｉｃａ打ｔ如化ｅｌｅｖｅｌｏｆ０．０５ｉｎｔ：ｈｅｓａｍｅｌｉ打ｅｌｏｗｅｒｃａｉｔａｌｌｅｔｅｒｉｎｓｕｅｒｓｃｒｉｔｓｍｅａｎｓ化ｅ出ｆｅｒｅｎｃｅｉｓ，，ｐｐｐｓｉｎｉ行ｃａｎｔ．ｇ－２６－ ３讨论３．１关于ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验条件的优化ｅ一蛋白印迹（ｗｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ）技术是目前在研究蛋白表达中应用最多的种实验技术。它通过电泳将分子量不同的蛋白分子镶嵌在凝胶介质中，再将其转印到固相转移膜一抗及相应二抗与之结合上，然后通过特异性，再根据标记物测量结合在膜上的标记信６２号虽然免疫印迹的灵敏度和特异性较高［１，可Ｗ较好地对蛋白进行定性及半定量分一析，但操作较复杂，在试验过程中仍有些细节问题需要注意。①制胶，分离胶浓度要一－５－４０ｋＤａ的根据目的蛋白的分子量而定，般１％２０％的凝胶适于分离１０ｋＤａ样品，－－－５％的凝胶适于分离４０ｋＤａ０Ｄ５－０％１０％１１００ｋａ的样品，％１的凝胶适于分离１００５００ｋＤａ的样品。而制胶化凝胶中各组分的纯度及用量也影响蛋白分子的迁移速率。配胶时要按顺序加入各组分，现用现配，配好后不要放在冰箱中，防ＳＤＳ结晶，影响实验结果②电泳，电泳时，槽内正极的缓冲液要没过内侧的玻璃板；上样时，加样量要合适，太多会导致条带条带重叠，太少会出现条带不清晰；加样过程中要避免出现气泡，Ｗ免样品溢出一，影响上样致性。⑤转膜。转膜前，将剪好的胶和膜在转移缓冲液中浸－ｍ泡５ｌＯｉｉｉ，使其充分活化，，提高转膜效率；要注意膜、胶、滤纸的大小膜的正反面，°一转膜时间和溢度，Ｗ及转膜时的正负极。④抗体结合。抗最好在４Ｃ，侧摆摇床上解育过夜，可降低背景３．２内参蛋白在腹部组织中无表达的分析利用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ研究不同处理条件下目的蛋白的相对表达量时，通常将各样品的总蛋白浓度调到一致。然而，由于现有的几种蛋白浓度测定方法均存在不同程度的局限性，不能准确反应各样品的蛋白浓度，而且，在上样操作误差也会造成各样品总蛋白一ｔＷ的差异。而内参基因的设定可Ｗ较好地解决Ｗ上问题。因为，般内参基因都具有Ｗ下特点：①在不同的组织和细胞中成中、高程度表达，且表达量相近；②表达不受内源、外源化及实验处理等因素的影响；③表达水平与目的基因相似，且与细胞周期及细胞是否活化无关。此外，内参作为空白对照，可Ｗ用于检测整个实验条件是否正常。ｅｓｅｒｎｂ－Ｗｔｌｏｔｉｎｇ试验中常用的内参基因有：ＧＡＰＤＨ、ａｃｔｉｎ和Ｔｕｂｕｌｉｎ。基于Ｐ＇－］＾３１１！１１６２８〇１１１６１沈（ｒａｍ；６在研究淡色按蚊＿４／１〇如６／６５ａ／Ｗｗａｍｗ中Ｎｐ家族同源体蛋白的组＾２１－－３〇化分吐且）３织表达时，３如〇作内参在各組织呈稳定表达，与６５０；０子量约为４２ｋＤａ的目的蛋。白可Ｗ很好的区分开，同步进行内参和目的蛋白的巧育及显色本研究选－ａｃ用ｔｉｎ作、Ｐ为内参，结果显示，他在不同蜜蜂头胸和足部均有表达，但在腹部没有检－２７－ 测到其表达信号。其中，头、胸和足部内参和目的蛋白表达正常，说明提取液ｗ及提取方法合理。而腹部无内参蛋白表达的原因可能为：工蜂腹部分布有蜜囊、中肠、后肠及马氏管等结构一，成分比较复杂。提取过程中，内参基因编码的蛋白可能在些内源性酶的作用下被降解了。由于这个原因还未查明，因此，目的蛋白在腹部是否表达化及表达量也不能定论。送个问题的出现也为我们今后的研究提供了思路。３．３Ａｃｍｖｌ蛋白在内勤蜂与采集蜂各组织的表达分析ｃｍｖｌ在内勤蜂中，Ａ蛋白表泣水平为，胸部表达量显著高于头部和足部，逸与第三＾ｃｍｖ一章／ｍＲＮＡ在内勤蜂各组织中脚部表达量最高的结果致。而采蜜蜂和采粉蜂中，心ＷＶ／蛋白表达均为头部表达最商，这与灰ｗｖ／ｍＲＮＡ在采蜜蜂和采粉蜂中腹部和足部表法量最离的结果不同。从基因转录和翻译的变化可Ｗ看出，采集蜂中，头部蛋白表达的增加与其采集斤为相关，尤其是采蜜蜂。在不同的组织或发育阶段，转录因子通过有序地与目标基因启动子序列中的顺式调控元件结合，调控基因的转录。但基因在转录水平的表达量并不能完全解释生命体的功能，而蛋白作为生命活动的体现者，可Ｗ通过磯酸化、糖基化、甲基化、乙醜化Ｗ及泛素化等修饰调控基因的功能。因此，蛋白质与ｍＲＮＡ之间并不存在严格的线性关系，蛋白水平的变化更能反映目的基因的功能。基于本实验结果，Ａｃｍｖｌ蛋白在采集蜂头部表达量均高于内勤蜂，且采蜜蜂头部的。表运量显著高于内勤蜂，得出ＣＷＶ／基因在头部的表达影响其中华蜜蜂的采集行为Ｍｚ／ｖｏ如基因在果蛹脑部的定位研究显示，该基因广泛分布于成虫期果赃脑部的神经元一细施中，且淡色按蚊脑部也检测到该基因具有较高的表迭量，这与本试验结果致。’Ｍａ／ｖｏ＆ｏ基因的功能研究表明，该基因突变会明显降低果觸对薦糖的敏感性，送种症状２＋或２＋可通过在食物中添加ＭｎＦｅ而得到恢复，但其影响味觉反应的具体机制还不清２＋２＋楚。因此，基因可能通过转运Ｍｉｉ或Ｆｅ来影响蜜蜂的蜜蜂的采集行为。４小结本试验对基因在中华蜜蜂内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂头（带触角）部、胸部、腹部和足部４个不同部位组织的蛋白表达量进行了研究，结果显示，Ａｃｍｖｌ蛋白在内勤蜂和采集蜂的头部、胸部和足部均有表达，而在腹部表达很少或几乎不表达。同时，在ｃｍｖ一内勤蜂中，Ａｌ蛋白在胸部表达最高，这与ｍＲＮＡ的表达情况基本致；采蜜蜂和采粉蜂中，Ａｃｍｖｌ蛋白均在头部表达最高，且表达量均高于内勤峰头部。可知，Ａ？／ｎｖ／２＋２＋基因在蜜蜂头部的表达与其采集行为相关，且极有可能通过转运Ｍｎ或Ｆｅ来影响蜜蜂其采集行为。－２８－ 第五章中华蜜蜂脑部心ｗＷｍＲＮＡ的定位研究３ｍｍ－蜜蜂的脑容积不足１，重约１ｍｇ，仅含有８５００００９５００００个神经元，却拥有丰富的个体和社会行为，甚至还有学习、记忆、认知等高级行为，现已被众多神经科学研究者作为模式生物一。蜜蜂在采集花蜜和花粉的过程，也是个对花香、糖类或蛋白等測激进巧学习的过程，这种学习行为离不开脑部神经系统的调控。因此，为探究该基因ｍＲＮＡ在蜜蜂脑部的表达部位，本研究采用原位杂交技术对该基因在脑部的表达进行了定位研究，旨在了解该基因影响蜜蜂庶糖反应的原因。１材料方法１．１试验材料１丄１样品米集取样蜂群来自山西农业大学动物科技学试验蜂场的中华蜜蜂一，选取个健康正常的蜂群，取采集蜂１２只，带回实验室。取样方法见第二章。１丄２主要仪器超低温冰箱ＦＯＲＭＡ７００ＳＥＲＩＥＳ美国（Ｔｈｅｒｍｏ）冷冻切片机ＣＭ１８５０美国（Ｌｅｉｃａ）恒温培养箱ＬＲＨ－２５０２广东体视显微镜ＳＺＸ８１上海（明兹）光学显微镜ＢＸ５１日本（Ｏｌｙｍｐｕｓ）加热磁力揽拌器ＩＫＡＲＥＴ基本型上海－游丝辕子０３０３－５ＰＯ瑞±（Ｄｕｍｏｎｔ）ＰＨＳ－２Ｆ上海阳计（雷磁）侧摆摇床ＥＳＨＫ０２上海（碧云天）１丄３主要试剂主要试剂有：原位杂交试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒、４％多聚甲酵、多聚赖氨酸防脱载玻片、中性树胶、氯化钢、甲醇、甘油、Ｄ邸Ｃ、３０％过氧化氨、巧樣酸、巧樣酸；＊二，二二销（Ｃ６Ｈ５〇７Ｎａ３２Ｈ２〇）、十二水合磯酸氮销（Ｎａ２ＨＰ〇４１２Ｈ２〇）、水合憐酸氨销＊（ＮａＨ２Ｐ〇４２Ｈ２〇）购自均购自博±德生物公司ＯＣＴ包埋剂（Ｓａｋｕｒａ，）；美国购自常州市飞勒斯仪器有限公司。１丄４主要试剂配制－２９－ 试剂配制前准备；为防止组织中ＲＮＡ的降解，枪头及ＥＰ管均用０．１％的ＤＥＰＣ水浸泡过夜，灭菌，烘干；配制溶液的蒸馈水中均加入０．１％的ＤＥＰＣ，灭菌。．ｍＬＰＢＳ：氯化销３０ｇ，Ｎａ２ＨＰ（Ｖ１２Ｈ２〇６ｇ，ＮａＨ２Ｐ〇４２Ｈ２〇０．４ｇ，ｌＯＯＯ蒸馈水溶解；３％巧樣酸：巧樣酸３ｇ，１００ｍＬ蒸馈水溶解；２ＸＳＳＣ：氯化钢１７．６ｇ，巧樣酸兰销义８ｇ，ｌＯＯＯｍＬ蒸溜水溶解；０．５ＸＳＳＣ：３００ｍＬ蒸馈水加１００ｍＬ２ｘＳＳＣ；Ｘｘ０．２ＳＳＣ：２７０ｍＬ蒸馈水加３０ｍＬ２ＳＳＣ；２０％甘油：２０ｍＬ甘油加８０ｍＬ蒸馈水。－１％多聚（７．２７．６）。甲酵ｐＨ：用４％的多聚甲酸和阳Ｓ稀释配制１．２试验方法１．２．：Ｍｃ／ＭＷｍＲＮＡ杂交探针的设计合成根据本课题组已获得的中华蜜蜂＾ｃｍｖ／ｃＤＮＡ全长序列，设计Ｈ条特异性好的反义链寡核巧酸探针，探针的地高辛标记及探针合成工作交由武汉博±德生物公司协助完成。正义链探针杂交结果即为阴性对照。表５－１原位杂交探针序列－ｒｏｅＴａｂｌｅ５１Ｐｂｅｓｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ＇探针名称探针序列５－３〇（＊＇ＰｒｏｂｅＳｅｑｕｅｎｃｅ５－３（）ＡｃｍｖｌＣＡＡＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＴＩＴＣＧＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＣＡＡ１．２．２原位杂交方法Ｗ蜜蜂脑的解剖：用缀子将蜜蜂从集蜂器中夹出，用大头针在胸背部将它固定于蜡盘中。然后，在体视显微镜下用游丝慑子小也地揭去其头部几了质外壳，保留复眼及脑外层膜质，Ｗ确保脑结构的完整性，从而解剖出完整的脑和视叶。议固定及脱水：将解剖出的蜜蜂脑在原位杂交专用ＰＢＳ中轻轻晃动，使脑部粘附的杂质去除，然后置于装有４％多聚甲醒的青霉素瓶中，固定２＾１后，分别转入１５％、２０％、３０％庶糖溶液中进行梯度脱水，直至组织沉底。’㈱冰冻切片－；开启冰冻切片机２０Ｃ，待机器温度达到要求后，，设置切片温度为一先在承载器上滴滴包埋剂８ｍｉ。，待其快变白时，用吸热器将它压平。切片厚度为＾调试防卷板，使组织切片能平整地摊在防卷板上。将粘附载玻片正面朝下与组织切片轻－３０－ 轻一贴，组织就贴在了载玻片上。４（）原位杂交具体操作见附录２。樹显微镜下观察记录实验结果。２结果与分析用地离辛标记的针对基因的寡核昔酸探奸作为实验组，用不含探针的预杂交液代替杂交液作为对照组，在蜜蜂脑中进行原位杂交，ＤＡＢ显色后，杂交信号呈掠黄色颗粒状－（團５１）。从图中可Ｗ看出，杂交信号主要分布在脑内的草形体、视神经节及触角叶内的神经元细胞中。．、￣‘；气．读奏键Ｕ：靴；＜皆７ｒ，偷編＇＇，‘’．矿￣＊＞妊苗。＾／＾＾；碱篡，：／＾５－＾ｃｗ图１ｖ／ｍＲＮＡ在中华蜜蜂脑部的定位Ｆ－１Ｌｏｃａ打ｉｇ．５ｔｉｏｏｆｍＲＮＡｉｎｂｒａｉｎｏｆ乂Ｃ．ｃｅｒａ／ｚ化法：Ａ和ａ分别为用反义链＾ｃｗｖ／ｍＲＮＡ探针杂交的试验组和正义链杂交的对照组，杂交信号为踪黄色颗粒状。Ｂ、Ｃ和Ｄ分别表示擊形体肯尼亚细胞、视神绪节和触角叶的踪黄色颗粒阳性杂交信号，ｂ、Ｃ和ｄ分别为相应部位的阴性对照。Ｎｏｔｅ：Ａｉｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｏｕｈｂｒｉｄｉｚｅｄｗａｎｒｇｐｙｉ也ｔｉｓｅｎｓｅｐｒｏｂｅｅｖｅｒｓｅｌｙ过ｉｓｃｏｎｔｒｏｌｒｏｒｉ出ｉｔｈ，，ｕｐｈｙｂｚｅｄｗｓｅｎｓｅｒｏｂｅａｎｄ化ｅｇ，ｐｄａｒｋｅｌｌｏｗｐａｒｔｉｃｌｅｓａｒｅｏｓｉｔｉｖｅｓｉｎａｌｓ．ＢＣａｎｄＤｒｅｓｅｃｎｙｐｇ，ｐｔｉｖｅｌｙｒｅｐｒｅｓｅｎｔ比ｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｉｇａｌｓｉｎＫｅｎｙ饼ｉｃｅｌｌｓｏｆｍｕｓｈｒｏｏｍｂｏｄｌａｍｉｎａａｎｄａｎｔｅｎｎａｙ，ｌｌｏｂ货ａｎｄｂｃａｎｄｄａｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｒｅｉ．＾，，，ｐｇｏｎｓｇ３讨论蜜蜂在采集时，根据花香及花色等刺激找到合适的蜜粉源，获取花蜜和花粉等营养物质一。花蜜中的糖类物质，尤其是庶糖，常作为其发现蜜粉源的个奖励刺激。在西方蜜蜂中，如０如〇齡基因可｜＾｜调控蜜蜂对廉糖的敏感性，＾及对奖赏性刺激的２＋２＋４８应答町通过在食物中添加Ｆｅ和Ｍｎ［］可换欧复该基因突变果魄的味觉缺陷。哺乳２＋Ｍ动物中ｔ］，Ｍｎ被发现参与了多己胺的奖赏性应答，而类似于哺乳动物多己胺，蜜蜂的一６６６７０Ａ作为种神经递质［’］，参与了其庶糖反应及奖赏性学习通路的信号传导。研究发现，０Ａ能神经元ＶＵＭｍｘ胞体位于蜜蜂脑部的食管下神经节，而且其突起在掌形体肯ｉ－３１－ 尼亚细胞、触角叶和侧前脑部位均有投射，当蜜蜂接受薦糖刺激时，该神经元会分泌ＭｆｌＯＡ，并下斤调控蜜蜂吻的伸出。伸吻反应的试验也说明了该结果，在伸吻试验中，一先给予蜜蜂种气味刺激后，用庶糖进行饲喂。而对蜜蜂进行相，蜜蜂会做出伸吻反应同的气味刺激后，不饲喂旗糖，而是对ＶＵＭｍｘｉ神经元进行电刺激，结果发现，蜜蜂同一样会做出伸吻反应，送说明０Ａ作为种神经递质，在蜜蜂的奖赏性应答中其重要作用，一些研究也证明ＯＡ也具有类似的功能还有，如可Ｗ提高蜜蜂对庶糖的敏感性，诱导其伸吻反应等Ｓｃｈｕｌｚ等在研究ＯＡ表达与蜜蜂采集行为的关系巧，发现采集蜂脑部的葦形体－、触角叶和触角叶外的中脑中的０Ａ、多己胺及５哲色胺的表达量均显著高于内６９ｔ］Ａ勤蜂，其中０Ａ的表达差异最大，且与工蜂日龄无关，这表明Ｏ在触角叶内的表达可Ｗ调控蜜蜂的采集行为。、有关０Ａ的作用机制研究显示，０Ａ在与其受体结合后，会激活膜上的Ｇ蛋白酶＊ｃｓｏｌ－ｏｓｈａｔｅ或离子通道，产生第二信使ＡＭＰ和化醇三磯酸（ｉｎｏｉｔｌ４５ｔｒｉｓ，ｎ，［，３），ｐｈｐ］进而通过激活蛋白激酶Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ，ＰＫＡ）和蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）一些蛋白质进行稱酸化修饰将细胞内，调节细胞反应。有趣的是，在葦形体和触角叶均ＰＫＣ－检测到有较高程度的表达，而０Ａ、多己胺和５哲色胺均可激活孽形体内的ＰＫＡ的产生，０Ａ也激活触角叶中ＰＫＡ的产生。视叶是传递和处理来源于复眼视觉信息的主要部位，外界环境的蜜粉源信息通过视觉通路的传递和加工，汇集到葦形体中枢，与其他感觉信息进行整合后，输出信息来调控蜜蜂的采集行为。综上所述，中华蜜蜂中ＣＷＶ／基因对采集行为的影响可能通过作用于滿糖反应相关的０Ａ系统而实现的。４小结本研究对中华蜜蜂心ＣＷＶ／基因在采集蜂脑部的表达进行了定位分析，结果显示，Ａｗｖ／基因在脑部的葦形体、触角叶和视叶３个部位的神经元细胞中表达较高。基于ＯＡ可Ｗ提商蜜蜂对庶糖反应的敏感性，Ｗ及其在蜜蜂脑中孽形体和触角叶的具有较高水平的表达情况，我们认为，基因对采集行为的影响可能是通过作用于庶糖反应相关的０Ａ系统而实现的。－３２－ 全文结论ｃｍｖｌｃＤＮＡ的基础上它与Ｎｒａｍ在已获得Ａ，分析了其氨基酸序列的结构特征，表明ｐｒａｍ蛋白家族具有高度保守性，符合Ｎｒａｍｐ家族的结构特征，属于Ｎｐ家族，可能为Ｎｒａｍｐ２的同源基因。采用焚光定量、免疫印迹及原位杂交技术对内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂Ａｃｍｖｌ基因在转录和翻译水平的表达特征进行了分析，结果表明该基因在广泛表法于内勤蜂和采集蜂各组织。且在内勤蜂中，胸部的ｍＲＮＡ及蛋白表达均高于其他部位组织；采集蜂中，ＲＮＡ一头部的蛋白水平高于其他部位组织，迭，与ｍ水平不致可能与该基因的转录后调控有关ｃｍｖｌ、视叶、触。Ａ基因的ｍＲＮＡ定位结果显示，它在采集蜂脑部的掌形体角叶的神经元细胞中均有表达。－巧－ 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４２ＢｉｄｅＤＪ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｏｆｍｅａｌｉｏｎｒａｎｓｏｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗ］ｔｔｒｔ？［ｇｙｐｙ口］ｏｆ￣ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１９％１８１：４４１４６９．，，（）［４３］Ｆｌｅｍｉｎｇ民Ｅ，ＭｉｇａｓＭＣ，ＺｈｏｕＸ，別口／．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｒｏｎａｂｓｏｒｐｔｉｏ打ｉｎｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｈｅｒｅｄｉａｒｅｍｏｃｈｒｏｍａｏｓｉｓ：ｎｃｒｅａｓｅｄｕｏｄｅｎａｌｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆｅｉｒｏｎｒａｎｓｏｅｒＤＭＴｌ．ｔｙｈｔｉｄｐｉ化ｔｐｒｔ口］Ｐ化Ｎｉ－ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｅａｔｏ打ａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９９９９６６：３１４３３１４８．，，（）４４ＬｉｕＸＦＳｕｐｅｋＦＮｅｌｓｏｎＮ幻／．Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｈｅａｖｍｅｔａｌｕｔａｋｅｂ化ｅＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，，，［］ｇｙｐｙｉｉ－ｃｅｒｅｖｓａｅ良ＳＤ２ｅｎｅＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｏｃａＣｅｍｓｒ１９２７２１：１１７１１７．ｇｌｇｉｌｈｉｔｙ９７８６３６９，，［］（）＋４５ＣｈｅｎＸＰｅｎＪＣＡ－ｏｈｅｎａ／．Ｙｅａｓ及Ａ／Ｆ／ｍｅｄｉ］ｉａｅｓＨｃｏｕｌｅｄｉｒｏｎｕａｋｅｗｉ化ｃｏｎｃｏｍｔａｎｔ，ｇ，，別ｔｔｔ［ｐｐ－ｕｎｃｏｕｌｅｄｃａｔｉｏｎｃｕｒｒｅｎｔｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｏｏｉｃａｅｍｓｔｒ１２７４４９：３５０８９３５０９４．ｐｉｌｇｌＣｈｉｙ９９９，，［］（）ＮＹＮｌＮＴｈ４６ｅｖｏｅｓｏｎ．ｔｔｉｏｎＦ２２７Ｉｉｎｃｒｅａｓｅｓ化ｅｃｏｕｌｉｎｆｍｅｌｉｏｎｉｎＤＣ７７．，ｅｍｕａｔａｔｒａｎｓｐｏｒｔ［］ｐｇｏ口］ＪｏｕｒｎａｏｆＢｉｏｌｏｃａｅｍｓｒ２００４５１－：５５３０６１．ｌｇｉｌＣｈｉｔｙ２７９３０５６，，（）［４７］ＳｏｕｔｈｏｎＡ，ＦａｒｌｏｗＡ，ＮｏｒｇａｔｅＭ，ｅｔａｌ．ＭａｌｖｏｌｉｏｉｓａｃｏｐｐｅｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅａ打ｏａｓｅｒ－．Ｊ怎公２００８２１５７７１６．ｌｇｔＪｏｗＴｚ幻／〇？＂如／ｏｔｏ１：０９］，，［／巧ｇｙ（）［４別ＯｒｇａｄＳ，ＮｅｌｓｏｎＨ，ＳｅｇａｌＤ，ｅｆ幻Ｍｅｔａｌｉｏｎｓｓｕｐｐｒｅｓｓ化ｅａｂｎｏｒｍａｌ化ｓｔｅｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｔｈｅＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｕｔａｎｔ服加ｏｆｏ－．Ｊ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｘｅｅｎａｏｏ１１：１．ｐｒｉｍｔｌｂｉｌｇｙ９９８２０１１５２０，，［］＾）４９．２０口李彬．，王绍帅，张钢等中华蜂种群急剧萎缩的化态人类学探究的原生态仿族文化学刊，［］，４３２－：７．（）５０ＣｅｅｒＭｏｖｏｎＧＨ－ｈａＤＮＡ［ｌｌｉＧｉＶｉｄａｌＳｅｔａｌｕｍａｎｎａｔｕｒａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏｅｒｏｔｅｉｎ：ｃ，，，］ｐｇｐｃｌｏｎｉｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ打ｅｍｏｍｏａ打打ａｎｄｔ－了Ｊｏｒｎａｌｍａｉｉｃｒｉｚａｔｉｏｉｓｓｕｅｓｅｃｉｆｉｃｅｘｒｅｓｓｌｇｉｏ打．Ｊ．ｈｅｕ，ｐｐｇ，ｇｇ，ｐｐ［］ｏｆｌ１１－１ｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｍｅｄｉｃｉｎｅ９９４８０５：１７４１７５２，ｐ，，（）－ｎ５１ＭａｒｔｉｎｅｚＢａｍｅｔｃｈｅＪＳｏＭＬｅｃｏｎａＮ．ｎａｎｄｎｃｃａｔｏｎｏｆｅｌａｃｈｅＧＡ幻／Ｃｌｏｉｆｏｔｉｏ打ａｌｃｈａｒａｔｅｒｉｚｉ化，，，呂［］ａ化／ｍ幻灼Ｍ及ＤＭ了１／ＮＲＡＭＰｈｏｍｏｏ：ｓｒｏｎｍｅａｓｍｓｕｏｅｓｌｇｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｔｂｏｌｉｉｎｍｏｑｉｔＪ．［］Ｉｎｓｅｃｏｃｈｅｍｉｓｒａ打ｄｍｏｅｃｕｌａｌ２００７５３－５３９ｔｂｉｔ．ｌｒｂｉｏｏ３７：２ｙｇｙ，，（巧５２ＬｉｖａｋＫＪＳｈｍ－ｍｅｃｉｔｅｎＴＤ．ＡｎａｓｓｏｒｅｌａｖｅｅｎｅｅｘｒｅｓｓｏｎａｓｎｒｅａｉｖｅＰＣ民［］ｌｉｆｔｉｉｄ化ｕｉｌｔｉｕａｎｔｉｔａｔ，ｇｙｇｐｇｑＡ—ａｃｔ－ａｎｄ化ｅ２ｍｅ出ｏｄ口．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００１２５４：４０２Ｗ８．］，，（）５３ＦｏｌｗｅｌｌＪＬＢａｒｔｏｎＣＨＳｈｅｐｈｅｒｄＤ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｉｌｅＤ．ｍｅ／幻巧ｏ口別ｅｒＮｒａｍｈｏｍｏｌｏｕｅ［，，各ｐｇ］ＭａｌｖｏｌｉｏｔｏｇｕｔａｎｄＭａｌｐｉｇｈｉａｎｔｕｂｕｌｅｓｐｒｏｖｉｄｅｓｅｖｉｄｅｎｃｅ化ａｔＭ口／ｖｏ扣ｏａｎｄＴＶｒａｗｆｉａｒｅｏｉｏｕｓｍｅｎ－ｔｈｏｌｏＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｘｅｒａｏｏ１：１ｇｐｉｔｌｂｉｌｇｙ０１９８８９９５．，２００６，２０９［］（）［５句Ｂｅｔｔｅｄｉ１＾，ＡｓｌａｍＭＦＳｚｕｌａｒＪ別幻／．Ｉｒｏ打ｄｅｌｅｔｉｏ打ｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉ打ｅｓｏｆＭ幻ｍｕｔａｎｔｆｌｉｅｓｄｏｅｓ打ｏｔ，，ｐｏｃｃｕｒｉｎ出ｅａｂｓｅｎｃｅｏｆａｍｕｌｔｉｃｏｅｒｏｘｉｄａｓｅＪｉＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｂｉｏｌｏ２０１１２１４：ｐｐ，，［］ｐｇｙ（巧９７１－９７８．－灵垃倩刘建国等２００９１９６１．口引王海戴．骨骼肌细胞铁代谢的研究进展化体育学刊６３：００，，，（）［５６］ＳｃｈｗａｅｒｚｅｌＭ，ＭｏｎａｓｔｉｒｉｏｔｉＭ，ＳｃｈｏｌｚＨ，扣口ＤｏｐａｍｉｎｅａｎｄｏｃｔｏｐａｍｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｂｅｔｗｅｅｎａｖｅｒｓｉｖｅａｎｄａｅｉｉｖｅｏｆａｃｏｒｍｅｍｏｒｅｓｉｎＤｒｏｓｏｉａＴｈｅｒｎａｏｆｎｅｕｒｏｓｃｅｎｃｅ２００３ｐｐｔｔｌｔｙｉｐｈｌｉ．Ｊｏｕｌｉ，，［］２－３３３：１１０４９５０５０２．（）５７ＳｅｌｃｈｏＭＰａｕｌｓＤＨａｎｅ／口ＡＴｈｅｒｏｌｅｏｆｄｏａｍｉｎｅｉｎＤｒｏｓｏｉｌａｌａｒｖａｌｃｌａｓｓｉｃａｌｏｌｆａｄｏｒ［］，，吟ｐｐｈｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎＪ．ＰＬｏＳＯｎｅ２００９４６：ｅ５８９７．ｇ，［］，（）８ＳｃｈｕｌｚＤＪ民ｏｂｉｎｓｏｎＧＥ．Ｂｉｏｅ打ｉｃａｍｉｎｅｓａｎｄｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆｌａｂｏｒｉｎｈｏｎｅｂｅｅｃｏｌｏｎｉ巧：ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｌ口，ｇｙ］ｙｒｅ－ｌａｔｅｄｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎａｌｌｏｂｅｓａｎｄａｅｒｅａｅｄａｎｅｓｎｍｕｓｒｏｏｍｏｄｅｓｏｕｒｎａｏｆｇｇｌｔｃｈｇｉｔｈｅｈｂｉ＂？Ｊｌ］ＣｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏＡ１９９９１８４５１－ｐｇｙ：４８４８８．ｙ，，（）５ｅｌｅｎＫＧｏｂｉｎ巨ＢｉｌｌｅｎＪ別口／．ｒｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｉｎｔｈｅｈｏｎｅｅｅｂｒａｉｎ：Ａｔｒｉ巧ｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒ［却Ｈｙ５，，於ｐｙｂｇｇ－打ｕｒｓｅｆｏｒａｅｒｉ－ｔｒａｎｓｔｉｏｎＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｃｔｈｓｉｏｌｏｇｙ２００８５４：４００．ｇ化（１０１１４０３［］ｐｙ，，＾）［６０］刘芳．意蜂哺育蜂与采集蜂头部ｍＲＮＡｓ与ｍｉＲＮＡｓ表达谱Ｓｏｌｅｘａ测序比较分析及其调控网络研－３６－ 究［Ｄ］．浙江大学，２０１２．２００７４２６－１１７１２０．，韩双艳集免疫检测技术的研究进展化食品与生物技术学报，：Ｗ］林影，叶茂，（）脾］周娜．免疫印迹技术常见问题的解决方案化生物技术世死２０１４，７：１０９．－６３郭尧君．ＳＤＳ电泳技术的实验考虑及最新进展机１９９１１８１３２３７［．生物化学与生物物理进展：．］，（），６４李晓明．水稻内参蛋白质的选辉及鉴定［Ｄ］．河北农业大学２０１０．［］，６５ＳａｌａｍｏｎｅＪＤＣｏｒｒｅａＭＭｉｎｏｔｅＳｅｔａＬＮｕｃｌｅｕｓａｃｃｕｍｂｅｎｓｄｏａｍｉｎｅａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｅｆｆｏｒｔ［］，，ｇ，ｐｇｕ－ｉｎｆｏｏｄｓｅｅｋｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｉｌｉｆｔｉｔｌｔｉｉｔｒａｎｄｄｒｕＪ．ｇ：ｍｐｃａｔｉｏｎｓｏｒｓｕｄｅｓｏｆｎａｕｒａｍｏｔｉｖａｏｎ，ｓｃｈａ，ａｂｕｓｅｐｙｙｇ［］Ｊｏｕｍａ－ｌｏｆＰｌｉａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｅｕｔｉｃｓ２Ｑ０３３０５：ｌ８．ｐｐ，，ｙ）巧６］ＨａｍｍｅｒＭ，Ｍｅｎｚｅｌ民？Ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｔｅｓｏｆ拋ｓｏｃｉａｔｉｖｅｏｄｏｒｌｅａｒｎｉｎｇａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｌｏｃａｌｂｒａｉｎ－ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆｏｃｔｏｐａｍｉｎｅｉｎｈｏｎｅｙｂｅｅｓＵ．Ｌｅａｒｎｉｎ＆Ｍｅｍｏｒｙ１９９８，５：１４６１５６．］ｇ，ｙ）６７ＭｅｎｚｅｌＲＨｅｎｅＡＫｉｎｚｅｌＣｅｔａＬＰｈａｒｍａｃｏｌｏｉｃａｌｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎ，［］，ｙ，，ｇｇ，ｇｄｒ－ｒｅｎｕｎｃｎｅｓｓｎｄｈａｖｒａａｎｅｓｏｎｓｅｌｅａｓｉｇｆｔｉｏｎｓｏｆｒｅｗａｒｄｉｎｈｏｙｂｅｅｃｌａｉｃａｌｃｏｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｊ，Ｂｅｉｏｌｐ［］ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１１３（４）：７４４．ＰａｅＪｒＲＥＥｒｂｅｒＪＦｏｎｄｒｋＭＫ．Ｔｈｆｅｃｔｅｎｏｔｅｃｍｒｅｓｏｎｓｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ化ｓｕｃｒｏｓｅａｎｄ巧糾ｇ，，ｅｅｏｆｇｙｐｐｆｏｒａｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｈｏｎｅｂｅｅｓＡｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａＬ．Ｊ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏＡ１９９８ｇｇｙ｛）［］ｐｙｇｙ，，１８２４－：４８９５００．（）巧９ＳｃｈｕｌｚＤＪ，民ｏｂｉｎｓｏｎＧＥ．Ｂｉｏｇｅｎｉｃａｍｉｎ故ａｎｄｄｉｖｉｓｉｏ打ｏｆｌａｂｏｒｉｎｈｏｎｅｙｂｅｅｃｏｌｏｎｉ巧：ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｌｙ］－ｒｅｌａｔｅｄｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅａｎｔｅｏｎａｌｌｏｂｅｓａｎｄａｅｒｅｌａｔｅｄｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｍｕｓｈｒｏｏｍｂｏｄｉｅｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｇｇｇ［］Ｃ－ｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏＡ１９９９１８４５４８１４８８ｐｙｇｙ：．，，（）－－巧 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附录附录１为保证ＲＮＡ的成功提取，在试验前应将所要用到的枪头、离也管、枪头盒等塑料°ｅ。器皿用化１％的固相ＲＮａｓ清除剂浸泡１２ｈＷ上，再经高湿高压灭菌后，８０Ｃ烘干备用’陶瓷及玻璃器皿需要在洗净后，放在１８０Ｃ烤箱中烘烤４ｈ。剪刀、綴子、钥匙等金属器皿需要洗净，高压灭菌后，烘干备用。操作注意事项：试验前ｅ，先用化１％固相ＲＮａｓ清除剂处理过的酒精棉球将超净台桌面擦拭干净后，开肩紫外巧照射２０ｍｉｎ。ＲＮＡ提取步骤参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ说明书进行，主要步骤如下：１（）从液氮中取出保存的各组织样本，称量后，用综子将组织夹入成有液氮的研体。．中进行研磨，其间适当添加液氮，直至粉末状用药匙将粉末刮到１５ｍＬ的ＥＰ中，待－液氮挥发完后，加入ＩｍＬＴｒｉｚｏｌ，震荡混匀后置于冰上５１０ｍｉｎ，使组织细胞裂解完全（裂解液中基本无沉淀）。现在可Ｗ继续进行下面的试验，也可将裂解后的样品放入－ＴＣ８（冰箱备用，Ｗ后再继续提取。一２也（）１２０００ｇ离ｌＯｍｉｎ，将枪头伸入油脂下方吸取上层匀浆液加入另卧管中，弃去沉淀。入°樹每个ＥＰ管中２００阵氯化剧烈震荡１５ｓ室温静置３ｍｉｎ。４Ｃ１２０００，加，ｇ离也１５ｍｉｎ，然后可见管内液体分为三；层，上层为无色水相，中间层为敵氯仿相，下层为有机相，ＲＮＡ在无色水相中。４（）小也吸取上层水相至新的１．５ｍＬ邸管中，（操作化可用１００咕移液器操作多吸几次，注意不能吸入中间蛋白层）５００ｌＬ（００＾，约可吸，然后，加入等体积约５＾叫的异丙醇’，混匀室温静置１０ｍｉｎＲＮＡ。然后４Ｃ１２０００也１０ｍｉｎ，，Ｗ沉淀总，ｇ离，可见米粒大小沉淀。脚弃去上清聽向含有沉淀的ＥＰ管中加入ＩｍＬ７５％乙醇溶液清洗沉淀，７５００ｇ离也５ｍｉｎ，弃去上清，打开管盖，用烘烤过的滤纸吸干残留大部分浓体后，倒置在滤－５０ｌＬＲｎａｓｅ－ｆｒｅｅｉ。纸上瞭干，加入３０水，静置…ｍｎ，使财１乂完全溶解＾－４－１ 附录２第一步，配制工作液。（１）配制适量ＢＣＡ工。作液，充分混匀根据标准品和样品数量，按５０体积ＢＣＡ试剂Ａ加１体积ＢＣＡ试剂Ｂ（５０：１）似稀释标准品。具体操作见下表；表１标准品的稀转方法Ｔａｂｌｅ．１Ｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｓｕｂｓｔａｎｃｅ管号稀释液体积（＾ｌＬ）标准品体积（咕）终浓度（帖ＺｍＬ）Ａ２４０如２０００Ｂ３０９０（从Ａ管取）１５００Ｃ６０６０（从Ａ管取）１０００Ｄ６０６０（从Ｂ管取）７５０Ｅ６０６０（从Ｃ管取）５００Ｆ说６０（从Ｅ管取）２５０Ｇ６０６０（从Ｆ管取）１２５Ｈ１００２５（从２５Ｇ管取）Ｉ６０００（空白孔）做将２５阵的标准品和合适浓度范围的样本分别加入％孔板的微孔中。（４）各孔加入２００ＢＣＡ工作液，充分混匀。‘Ａ妨盖上９６化板盖，巧Ｃ腊育３０ｍｉｎ。第六步，冷却到室温，用酶标仪测定５６２，根据标准曲线计算出蛋白浓度（每个标准品和样品设置２个重复）。－４２－ 附录３Ｕ）内源性过氧化酶的灭活：将切片置于含有３０％Ｈ２化与纯甲醇的混合液（化〇２与甲醇比为：ｉｎ５ｍｉｎ。：１５０）的染曲中，室温处理３０ｍ，然后，在摇床上用蒸馈水洗３次，每次脚暴露ｍＲＮＡ核酸片段：在切片组织上滴加３％梓樣酸新鲜稀釋的胃蛋白酶（ｌｍＬ３％’巧樣酸加２滴浓缩型胃蛋白酶Ｃ或室温－，混匀），３７消化５１２０Ｓ（消化时间需要摸索，找到合适的，有时也可不消化），原位杂交专用ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ，蒸馈水洗一次，５ｍｉｎ。樹后固定：将切片在１％多聚甲醇中室温固定１０ｍｉｎ，蒸馈水洗３次，每次５ｍｉｎ。（４）预杂交：在干净的杂交盒中加入２０ｍＬ２０％甘油，作为湿盒，用Ｗ保持湿度，每张切片加２０＾ｌＬ预杂交液，诬组织被预杂交液完全覆盖，将切片放入湿盒中，置于巧＾：－恒温箱中２４ｈ。佩杂交：用滤纸小也吸取组织周围的预杂交液，不洗；加上杂交液，用原位杂交一一专用盖玻片盖从侧轻轻在组织上。选取同，避免有气泡玻片上距离较远的组织作为°对照组，用ＰＢＳ代替杂交液作为对照。将实验组和对照组玻片水平放于湿盒中，在３９Ｃ恒温箱中杂交过夜。’做杂交后洗涂：小也揭掉盖玻片（可Ｗ将玻片浸在３７Ｃ左右的溶液中，轻轻晃动，’‘ＸＸＣ０．使盖玻片脱离），用３７Ｃ预热好的２ＳＳＣ中洗瀑２次，每次１０ｍｉｎ，３７５ＳＳＣ洗°ＸＳＳ５ｍ涂１次，１５ｉｎ，３７Ｃ０．２Ｃ洗涂２次１ｉｎ。ｍ，每次：滴加封闲聽巧解育３０ｍｉｎ去多余液体，不洗。仍封闭，甩‘佩滴加生物素化鼠抗地高辛：巧（：解育６〇１１１１１１？８８４１〇１１１１１１。，洗次，每次’ｍｎ。㈱滴加ＳＡＢＣ：巧Ｃ解２０ｉｎ３１０ｉ育ｍ或室温３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗次，每次一ＤＡＢ显色ｍＬ蒸傭水、Ｂ、。（蝴：Ｉ加ＡＣ各滴，混匀后，加入切片组织上显色显色时，可Ｗ在显微镜下观察染色情况确定显色时间。然后，充分用蒸馈水洗恣。ａｉ）苏木素复染；复染后，充分水洗。⑩将組织切片经梯度酒精脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片。－４３－ 致谢本论文的完成离不开导师姜玉锁教授的悉也指导，在论文的各个方面都体现了导师治学严谨、Ｈ年研究生学习已近尾学识渊博，，、严于律己的风格为我树立了了终生的学习典范。转眼间我的声！，导师在生活中对我如沐春风的关怀，不断激励我奋进向前，在此向导师致最诚擎的感谢衷也感谢马卫华师姐，，生、赵慧婷师姐在实验过程与论文写作中的指导与帮助活中的鼓励与建议一，与师姐起的实验岁月我将终生难忘。感谢实验室全体老师、师兄弟姐妹在学习生活中的关也和帮助一。感谢实验室各位同学的陪伴，有你们是我生的幸福。特别感谢姚建军同学对我学习巧生活上的帮助与支持。再一次感谢所有在生活、学习及试验过程中给予我无私帮助和支持的各位老师、同学、亲人和朋友们，，化们的关也和支持已成为我生命中最难忘、最美好的回忆将永远激励着我奋发向上。最后，Ｗ此文献给我的导师与家人。至締２口／５年６巧－４５－