蜜环菌多糖口服降血糖作用及其机制研究 57页

I II 摘要当前，糖尿病是一个全球性的健康问题，具有较高的发病率和死亡率，由于临床治疗药物常伴有明显的副作用，寻找天然产物作为安全无毒的降血糖保健食品成为了研究热点。蜜环菌是药、食兼用真菌，多糖是其主要活性成分。研究表明，蜜环菌多糖具有抗氧化、提高免疫和降血糖等生物活性，但降血糖作用机制尚未阐明。因此，本论文拟研究蜜环菌多糖的口服降血糖作用及其机制。将蜜环菌子实体经过热水煮提、醇沉、木瓜蛋白酶和纤维素酶联合酶解得到蜜环菌总糖AMP。再利用DEAE-纤维素离子交换层析对AMP进行分离纯化，得到水洗脱的中性糖AMP-N和0.4MNaCl洗脱的酸性糖AMP-A。运用高效液相色谱法分析单糖组成，结果表明AMP和AMP-N中葡萄糖与半乳糖的含量比为1:1,推测含有半乳葡聚糖结构域，AMP-A中葡萄糖与半乳糖的含量比为10:1，推测含有葡聚糖结构域。体外实验中，首先利用建立的高糖高脂诱导胰岛素抵抗细胞模型，比较了三种蜜环菌多糖对胰岛素抵抗的改善活性。AMP和AMP-N显示出较好的改善活性，通过激活IR-Akt-AMPK信号通路改善胰岛素抵抗，而AMP-A没有改善作用，说明半乳葡聚糖可能是其主要的活性结构域。然后利用GFP-LC3稳转细胞和人肝癌细胞，分析自噬小体和自噬相关蛋白的表达，比较了三种蜜环菌多糖诱导自噬的能力。AMP和AMP-N促进了自噬小体的形成。同时，增加了p62蛋白的降解，促使LC3-I向LC3-II的转化，说明AMP和AMP-N具有显著诱导自噬的能力。相反，AMP-A诱导自噬能力较弱。结合胰岛素抵抗改善的结果，推测AMP和AMP-N改善胰岛素抵抗可能与其诱导自噬相关。体内实验中，运用db/db糖尿病小鼠，优化了蜜环菌多糖口服降血糖的剂量和给药时间，确定最佳给药剂量为50mg/kg/d，给药时间为4周。通过随机血糖、GTT和ITT实验，表明AMP和AMP-N具有显著的口服降血糖作用，且AMP-N的降血糖程度强于AMP，而AMP-A没有降血糖效果，这与体外改善胰岛素抵抗的结果一致。血清生化因子分析，AMP和AMP-N降低了血清甘油三酯和游离脂肪酸，说明调节了糖尿病小鼠的脂质代谢；降低了谷丙转氨酶和谷草转氨酶，说明保护了糖尿病小鼠的肝脏功能；降低了血清中胰岛素含量，说明改善了胰岛素抵抗。肝脏HE染色分析，AMP-N减少了肝脏脂滴的数量，干预了脂滴的形成，说明抑制了小鼠肝脏脂肪堆积。肝脏自噬相关蛋白表达分析，AMP-N显著增加了p62蛋白的降解，加大了LC3-I向LC3-II的转化，说明提高了小鼠肝脏的自噬水平。同时，胰岛形态分析结果显示AMP-N保护了糖尿病小鼠胰岛结构的完整性和致密性，恢复了胰岛受损的功能。此外，还分析了蜜环菌多糖的毒性。在给药期间，蜜环菌多糖对小鼠的体重、随机血糖、肝重和脂肪重量均无影响，说明蜜环菌多糖安全无毒。I 综上所述，蜜环菌总糖AMP和中性糖AMP-N具有显著的口服降血糖活性，且AMP-N的降血糖作用优于AMP。结合单糖组成结果，推测半乳葡聚糖可能是其主要的活性结构域。AMP-N降血糖作用的机制，一方面提高糖尿病小鼠肝脏的自噬水平，减少脂肪堆积，提高胰岛素敏感性；另一方面，保护糖尿病小鼠的胰岛，改善受损的功能。论文的结果将为蜜环菌的开发和利用奠定基础，为降血糖保健食品的研发提供依据。关键词：蜜环菌；多糖；降血糖；胰岛素抵抗；自噬II AbstractCurrently,diabetesisaglobalhealthproblemwithhighmorbidityandmortality.Sinceclinicaltherapeuticdrugsareoftenaccompaniedbyobvioussideeffects,lookingfornaturalproductsasasafeandnon-toxichypoglycemichealthfoodhasbecomearesearchhotspot.Amillariellamelleaisanediblefungus,andpolysaccharidesarethemainactiveingredients.StudieshaveshownthatpolysaccharidesfromAmillariellamelleahavebiologicalactivitiessuchasantioxidation,immuneenhancement,andhypoglycemicactivity,butthemechanismofhypoglycemicactionhasnotyetbeenelucidated.Therefore,thispaperintendstostudytheoralhypoglycemiceffectandmechanismofpolysaccharidesfromAmillariellamellea.Thefruitbodywassubjectedtohotwaterboiling,ethanolprecipitation,papainandcellulaseenzymehydrolysistoobtainthetotalAMPofAmillariellamellea.TheDEAE-celluloseionexchangechromatographywasusedtoseparateandpurifytheAMP.WeobtainedtheneutralfractionAMP-NeluatedbydistilledwaterandacidicfractionAMP-Aeluatedby0.4MNaCl.Themonosaccharidecompositionwasanalyzedbyhighperformanceliquidchromatography.TheresultsshowedthatthecontentratioofglucosetogalactoseinAMPandAMP-Nwas1:1,indicatingthattheycontainedgalactoglucandomain,andthecontentratioofglucoseandgalactoseinAMP-Awas10:1,presumablycontainingglucandomain.Invitro,theinsulinresistancecellmodelinducedbyhighglucoseandhighfatwasusedtocomparetheimprovementactivityofthreepolysaccharidesofAmillariellamelleaoninsulinresistance.AMPandAMP-Nshowedbetterimprovementactivity,andinsulinresistancewasimprovedbyactivatingtheIR-Akt-AMPKsignalingpathway,whileAMP-Adidnotimprovetheeffect,suggestingthatgalactoglucanmaybethemainactivedomain.ThenusingcellsstablyexpressingGFP-LC3andhumanhepatocellularcarcinomacells,theexpressionofautophagosomesandautophagy-relatedproteinswereanalyzed,andtheabilitiesofthreepolysaccharidestoinduceautophagywerecompared.AMPandAMP-Npromotetheformationofautophagosomes.Atthesametime,thedegradationofp62proteinandtheconversionofLC3-ItoLC3-IIwereincreased,indicatingthatAMPandAMP-Nhaveabilitiestoinduceautophagysignificantly.Incontrast,AMP-Ainduceslessautophagy.Combinedwiththeimprovementininsulinresistance,wespeculatedthatAMPandAMP-Nmayimproveinsulinresistanceviaautophagyactivation.Invivo,usingdb/dbdiabeticmiceoptimizedtheoralhypoglycemicdoseanddurationofadministrationofpolysaccharidesfromAmillariellamelleatodeterminetheoptimaldoseof50mg/kg/dfor4weeks.Fromtheresultsofbloodglucose,GTTandITT,itwasshownthatAMPandAMP-Nhavesignificantoralhypoglycemiceffects,andAMP-NisbetterthanAMP,whileAMP-Adoesnothavehypoglycemiceffect.SerumIII biochemicalanalysisshowedthatAMPandAMP-Nreducedserumtriglyceridesandfreefattyacids,indicatingthatlipidmetabolismwasregulatedindiabeticmice,andalanineaminotransferaseandaspartateaminotransferasewerereduced,indicatingprotectionofliverfunctionindiabeticmice;decreasedseruminsulincontent,indicatingimprovedinsulinresistance.HEstainningshowedthatAMP-Nreducedthenumberoflipiddropletsintheliverandinterferedwiththeformationoflipiddroplets,indicatingthathepaticfataccumulationinmicewasinhibited.Analysisofliverautophagy-relatedproteinexpression,AMP-Nsignificantlyincreasedthedegradationofp62protein,andtheconversionofLC3-ItoLC3-II,indicatingthatthelevelofautophagywasupregulatedinmiceliver.Atthesametime,theresultsofisletmorphologyanalysisshowedthatAMP-Nprotectedtheintegrityandcompactnessofisletindiabeticmiceandrestoredthefunctionofdamagedislets.Inaddition,thetoxicityofpolysaccharidesfromAmillariellamelleawasalsoanalyzed.Duringtheadministration,thepolysaccharideshadnoeffectonbodyweight,bloodsugar,liverweightandfatmassofmice,indicatingthatpolysaccharidesfromAmillariellamelleaaresafeandnon-toxic.Insummary,thetotalpolysaccharideAMPandneutralfractionAMP-Nhaveobviousoralhypoglycemicactivity,andAMP-NissuperiortoAMPinitshypoglycemiceffect.Combiningtheresultsofmonosaccharidecomposition,itwasspeculatedthatgalactoglucanmaybeitsmainactivedomain.ThemechanismofhypoglycemiceffectofAMP-N,ontheonehand,itimprovesthelevelofautophagyintheliverofdiabeticmice,reducesfataccumulationandimprovesinsulinsensitivity;ontheotherhand,itprotectsisletsofdiabeticmiceandimprovesimpairedfunction.TheresultsofthepaperwilllaythefoundationforthedevelopmentandutilizationofAmillariellamellea,providingabasisforthedevelopmentofhypoglycemichealthfoods.Keywords:Amillariellamellea;polysaccharides;hypoglycemic;insulinresistance;autophagyIV 目录中文摘要..............................................................................................................................I英文摘要...........................................................................................................................III目录.............................................................................................................................V第一章引言...................................................................................................................11.1糖尿病........................................................................................................................11.1.1糖尿病的分类.....................................................................................................11.1.2胰岛素抵抗与II型糖尿病.................................................................................21.1.3II型糖尿病的治疗..............................................................................................21.2自噬............................................................................................................................31.2.1自噬.....................................................................................................................31.2.2自噬与II型糖尿病.............................................................................................41.3多糖............................................................................................................................41.3.1多糖的结构.........................................................................................................41.3.2多糖的降血糖活性.............................................................................................51.4蜜环菌多糖................................................................................................................91.4.1蜜环菌.................................................................................................................91.4.2蜜环菌多糖的分离纯化.....................................................................................91.4.3蜜环菌多糖的活性...........................................................................................101.5本论文立题依据、研究内容及意义......................................................................12第二章蜜环菌多糖的提取和分离纯化.......................................................................132.1材料与方法..............................................................................................................132.1.1材料、试剂与仪器...........................................................................................132.1.2蜜环菌总糖的提取...........................................................................................132.1.3苯酚-硫酸法测定多糖含量..............................................................................132.1.4间羟基联苯法测定糖醛酸含量.......................................................................142.1.5考马斯亮蓝法测蛋白质含量...........................................................................142.1.6蜜环菌多糖的分离纯化...................................................................................142.1.7高效液相色谱（HPLC）分析蜜环菌多糖的单糖组成.................................152.2结果与讨论..............................................................................................................152.2.1蜜环菌多糖的提取...........................................................................................152.2.2蜜环菌总糖的糖含量.......................................................................................162.2.3蜜环菌总糖的糖醛酸含量...............................................................................162.2.4蜜环菌总糖的蛋白含量...................................................................................16V 2.2.5蜜环菌多糖的分离纯化...................................................................................172.2.6蜜环菌多糖各级分单糖组成...........................................................................172.3本章小结..................................................................................................................18第三章蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗...........................................................................193.1材料与方法..............................................................................................................193.1.1试剂与仪器.......................................................................................................193.1.2细胞复苏...........................................................................................................193.1.3细胞培养...........................................................................................................193.1.4细胞冻存...........................................................................................................203.1.5油酸软脂酸高糖处理液（FG）配制..............................................................203.1.6胰岛素抵抗细胞模型的构建...........................................................................203.1.7多糖对胰岛素受体信号通路的影响...............................................................213.1.8Westernblot.......................................................................................................213.1.9免疫荧光法检测多糖诱导自噬的能力...........................................................223.1.10蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗与诱导自噬的关系.........................................223.2结果与讨论..............................................................................................................233.2.1蜜环菌多糖对胰岛素抵抗的改善作用...........................................................233.2.2蜜环菌多糖激活胰岛素受体信号通路...........................................................243.2.3蜜环菌多糖诱导自噬.......................................................................................253.2.4蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗与其诱导自噬的关系.......................................253.3本章小结..................................................................................................................26第四章蜜环菌多糖口服降血糖活性...........................................................................274.1材料与方法..............................................................................................................274.1.1试剂与仪器.......................................................................................................274.1.2小鼠饲养...........................................................................................................274.1.3蜜环菌多糖口服剂量的优化...........................................................................274.1.4蜜环菌多糖给药时间的优化...........................................................................274.1.5空腹血糖的测定...............................................................................................274.1.6葡萄糖耐量（GTT）检测...............................................................................284.1.7胰岛素耐量（ITT）检测.................................................................................284.1.8动物处置...........................................................................................................284.1.9组织H&E染色.................................................................................................284.1.10胰腺胰岛冰冻切片.........................................................................................284.1.11血清生化因子的检测.....................................................................................294.1.12动物组织总蛋白提取.....................................................................................294.1.13蜜环菌多糖的毒性分析.................................................................................294.2结果与讨论..............................................................................................................29VI 4.2.1蜜环菌总糖的降血糖作用...............................................................................294.2.2蜜环菌多糖口服剂量的优化...........................................................................304.2.3蜜环菌多糖给药时间的优化...........................................................................304.2.4蜜环菌多糖降血糖作用...................................................................................314.2.5蜜环菌多糖改善胰岛素耐量...........................................................................324.2.6蜜环菌多糖改善葡萄糖耐量...........................................................................324.2.7蜜环菌多糖对体重的影响...............................................................................334.2.8蜜环菌多糖对脂肪重量的影响.......................................................................334.2.9蜜环菌多糖对肝脏的保护作用.......................................................................344.2.10蜜环菌多糖对脂代谢的影响.........................................................................354.2.11蜜环菌多糖降低血清胰岛素水平.................................................................354.2.12蜜环菌多糖抑制肝脏脂肪堆积.....................................................................364.2.13蜜环菌多糖提高小鼠肝脏自噬水平.............................................................374.2.14蜜环菌多糖保护胰岛beta细胞.....................................................................384.2.15蜜环菌多糖的毒性分析.................................................................................394.3本章小结..................................................................................................................39论文总结...........................................................................................................................40参考文献...........................................................................................................................41致谢............................................................................................................................46在读期间公开发表论文及著作情况...............................................................................47VII 第一章引言1.1糖尿病糖尿病是以血糖升高为特征并伴有多种并发症的疾病。20世纪90年代糖尿病还仅仅发生在美国等发达国家。进入21世纪，随着经济高速增长，生活水平日益提高，生活方式改变，给糖尿病的发展提供了温床，并迅速在中国等发展中国家蔓延。据世界糖尿病联盟（IDF）统计，截止到2015年第七次糖尿病普查结果显示，全世界有4.15亿人患有糖尿病，按照现有发展速度，到2040年，将会达到6.42亿人[1]，也就是10个人当中就会有一个糖尿病患者。2015年，超过500,000人死于糖尿病，全年总投入的12%，至少6730亿美元的卫生支出在糖尿病上[2]。糖尿病的迅猛发展，带给人们不仅是经济上的损失，更多的是精神上的折磨，因此，攻克糖尿病的这道难关刻不容缓。1.1.1糖尿病的分类根据发病机理不同，糖尿病主要分为I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠型糖尿病。（1）I型糖尿病，胰岛素依赖型糖尿病，胰岛素分泌绝对不足或不分泌胰岛素，但具体发生机制并不清楚[3-5]。I型糖尿病多发生于年龄小的青少年群体，一般小于30岁，胰岛素分泌绝对不足或不分泌，导致机体血糖升高，单独使用口服降糖药无效，因此，患有I型糖尿病的患者必须每天注射胰岛素，以维持机体血糖正常水平。I型糖尿病患者常表现为多尿、多饮、多食、体重下降，并伴有精神萎靡不振，乏力、视力下降，症状可突然发作。从免疫学角度来看，胰岛素自身抗体（IAA）、胰岛细胞抗体（ICA）和谷氨酸脱羧酶（GAD）抗体，是检测医学常用来判断I型糖尿病体液免疫异常的三项重要指标，其中GAD抗体阳性率高，持续时间长，对I型糖尿病的诊断具有极大价值，此外，I型糖尿病具有遗传性，加强患者一级亲属防控，有预测I型糖尿病的意义[6]。（2）II型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病。胰岛素分泌相对不足或常伴胰岛素抵抗。随着生活水平的提高（大量高蛋白，高脂肪营养的摄入），生活方式的改变（吸烟、运动不足、汽车代步等），患II型糖尿病的风险加大。肥胖是导致II型糖尿病的重要原因之一，研究表明肥胖维持时间的长短与患糖尿病的几率成正相关。在摄入大量营养后，血液中葡萄糖含量迅速增高，血糖信号刺激胰岛分泌胰岛素，胰岛素入血后，抑制肝脏葡萄糖的产生，加快脂肪合成速度，抑制脂肪分解，加强肌肉组织对葡萄糖的利用，快速清除血液中血糖含量，达到降低血糖的效果。在生理情况下，血液中血糖含量超出胰岛素清除的能力范围时，胰岛细胞会持续产生胰岛素以清除多余的血糖，长时间作用，造成血液中胰岛素含量持续偏高，胰岛功能受损，胰岛素抵抗，最终导致II型糖尿病的发生[7-8]。1 （3）妊娠型糖尿病，处于妊娠期的孕妇在妊娠前已患有糖尿病或者在妊娠期首次出现糖尿病或不同程度的糖耐量异常而引起的高血糖，后者自身和婴儿在出生后，患有糖尿病的机率会大大提高[6]。在糖尿病患者中，90%的患者为II型糖尿病，I型和妊娠型糖尿病不足10%。因此，目前研究糖尿病的发病机理和研发糖尿病的治疗药物主要集中于II型糖尿病。1.1.2胰岛素抵抗与II型糖尿病胰岛素与胰岛素受体结合发挥作用,一旦胰岛素受体结合能力下降,胰岛素浓度再高也不能发挥作用，形成高胰岛素血症。正常情况下，机体血液中葡萄糖的含量会维持在一定的范围内以保证机体能量的供应和功能的正常运转。由于机体葡萄糖代谢紊乱，导致葡萄糖含量增加，机体为维持血糖的稳定，代偿性的分泌过多的胰岛素，促进葡萄糖的代谢和利用，久而久之，导致机体对胰岛素不敏感，形成胰岛素抵抗。胰岛素抵抗也是II型糖尿病的重要发病原因，随着胰岛素抵抗加重，机体对胰岛素敏感性下降，胰岛功能受损，随之导致高血压、体重增加等其他症状陷入恶性循环。高胰岛素血症不仅能抑制胰岛素与其受体的结合,还能损害外周组织受体后葡萄糖转运系统的作用而抑制外周组织对葡萄糖的摄取和利用，减少了非氧化葡萄糖的储存,同时激活葡萄糖/脂肪酸循环,导致游离脂肪酸利用增多,脂肪合成速率加快，糖消耗减少，促使血浆葡萄糖浓度增高，体重增加间接导致胰岛素抵抗[9-10]。陈致瑜[11]等人发现利用高脂饮食诱导的II型糖尿病小鼠，口服灌胃的给药方式，口服二甲双胍58天，采用糖耐量实验与高葡萄糖钳夹技术检测胰岛功能,并分析胰腺中与增殖、脂质代谢及内质网应激相关因子的mRNA及蛋白含量变化。结果提示,二甲双胍可促进小鼠胰岛素分泌功能,改善胰岛素抵抗,其作用机制可能与促进胰腺增殖、调节脂质代谢和缓解胰腺内质网应激状态相关。HyeSeungJung等研究者[12]建立了自噬相关蛋白7（Atg7）缺失小鼠模型，小鼠伴有高胰岛素血症等胰岛素抵抗特征，小鼠胰岛形态及功能受损，实验证明，自噬在改善胰岛素抵抗，增强胰岛功能中扮演关键角色。1.1.3II型糖尿病的治疗当前II型糖尿病是一个全球性的健康问题，它具有较高的发病率和死亡率，至今还不能够完全治愈糖尿病。目前，口服的II型糖尿病治疗药物多为人工合成的药物，如噻唑烷二酮类、美格列脲类、双胍类药物、磺脲类药物、α-淀粉酶抑制剂、GLP-1类似物、DPP-4抑制剂等。然而，这些药物大多都有一定的副作用，包括高血糖症、体重增加、胃肠副作用（腹痛、恶心、呕吐腹泻、腹胀）、水肿和低密度脂蛋白增加[13]。10-20%患有糖尿病的病人因副作用而不得不停止使用这些药物。2 糖尿病是一种需要长期治疗的慢性疾病，一方面要依靠药物治疗，另一方面是改变不良的生活习惯，同时使用副作用小的抗糖尿病功能性食品。目前国内外学者都在天然药物中寻找糖尿病补充治疗剂，以期减少糖尿病药物副作用并改善状况，提高生活质量。1.2自噬1.2.1自噬自噬是存在于真核细胞中自我净化的一种机制。它在生物的发育、生长、衰老过程中能够及时清除多余或受损的蛋白质和异常细胞器，通过水解酶降解自噬底物，产生的物质可再利用或提供能量，维持细胞代谢平衡，实现生命体的更新或存活[14]。在营养匮乏或在其他因素刺激下，受损的蛋白质或异常细胞器增多可诱发自噬。自噬过程分为以下几步：（1）隔离膜的生成和延伸，源自内质网的单层膜凹陷形成双层膜结构的隔离膜，并不断延伸。（2）自噬体的形成，隔离膜延伸将待降解物质包裹形成自噬体。（3）自噬体与溶酶体接触融合成自噬溶酶体。（4）降解，凭借溶酶体中水解酶将自噬底物降解成小分子，实现物质再利用或提供能量[15]。自噬过程是由一系列自噬相关蛋白介导完成的，并且在不同的阶段发挥不同的作用。例如，LC3蛋白(LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白，在细胞内存在两种形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割变成LC3-Ⅰ，当自噬体形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜，且始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此，LC3-II/LC3-I的比值常用来衡量自噬发生的强弱程度[15]。p62是一种多功能泛素结合蛋白,参与泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统两种蛋白降解过程。p62可作为要被清除的泛素化蛋白聚集物的受体，也可作为将要被自噬作用降解的小泡的受体，从而靶向自噬体并促进泛素化蛋白的清除，与自噬活性成反比，与LC3一起作为衡量自噬活性的标志物。自噬相关蛋白及下游信号分子与多条信号通路交织成错综复杂的网络，因此，自噬与许多疾病的发展密切相关。文献报道自噬对肿瘤发生具有抑制作用，肿瘤发生过程中会刺激促炎因子的释放，炎症也会导致肿瘤的转移，激活自噬保护机制，清除炎症因子，抑制肿瘤增长和转移[16]。Beclin1过表达抑制肿瘤细胞的增殖。自噬相关基因ATG2/5/7/9的缺失或突变会诱发胃癌、结肠癌、肝癌等原癌基因的激活。另外，自噬在阿尔兹海默症发病过程起着核心作用。阿尔兹海默症患者脑中beclin1蛋白表达过低，自噬体形成异常，自噬过程受阻，导致阿尔兹海默症的发生[17]。3 1.2.2自噬与II型糖尿病糖尿病的发生是缓慢而长期的过程，是多种不良因素综合导致的后果，自噬与糖尿病的发展密切相关，自噬参与脂质清除，脂质清除缓慢，超重随之而来，多余的脂肪反而会抑制自噬相关蛋白如Atg7、Beclin1、LC3的表达；同时造成内质网压力，导致胰岛素抵抗，胰岛素抵抗是导致II型糖尿病的重要原因之一；多重因素抑制自噬的发生，不能及时调控血糖[18]。李新志等人研究表明[19]，高脂饲料喂养的糖尿病小鼠，给药4周后，玫瑰蜂花粉多糖能够通过AMPK/mTOR途径激活自噬，并在葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验中，改善小鼠葡萄糖耐量，增加胰岛素敏感性。Yangling等研究者[20]同样证明肥胖损伤胰岛功能，并促进内质网压力，诱发肝脏脂质堆积，内质网压力进一步加重胰岛功能损伤，导致高血糖。肥胖抑制Atg7表达，进而抑制胰岛功能，影响葡萄糖代谢。反之，自噬能够抑制内质网压力的发生，提高胰岛素敏感性，加强葡萄糖代谢，减少肝脏脂质堆积，降低体重和血糖，缓解II型糖尿病症状。骨骼肌是胰岛素介导的利用葡萄糖的主要靶组织，因此，骨骼肌中胰岛素抵抗的存在是II型糖尿病发病的关键因素。文献报道了骨骼肌自噬在葡萄糖利用中的作用，研究者利用骨骼肌特异性Atg7-敲除小鼠研究了自噬对胰岛素敏感性的影响。与野生型小鼠相比，这些突变小鼠体重和脂肪量减少，葡萄糖清除和能量消耗增多。此外，Atg7-敲除小鼠免受高脂肪饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗，可能是由于脂解和β氧化增加，以及白色脂肪组织发生褐变[21]。骨骼肌中的脂质堆积是II型糖尿病的显著特征。鉴于自噬参与脂质去除，因此，骨骼肌自噬的评估可能具有临床意义。一项研究发现自噬相关蛋白（Beclin-1和LC3-磷脂酰乙醇胺）的表达在ob/ob小鼠的骨骼肌中上调；然而，这些小鼠的自噬水平没有确定。肥胖抑制骨骼肌自噬并由此促进脂质积累，或者增加自噬以补偿骨骼肌脂质超载，仍有待确定[22]。1.3多糖1.3.1多糖的结构多糖又称多聚糖，是由10个以上单糖分子通过糖苷键连接而成的长链聚合物。多糖广泛存在于动物、植物和真菌生物中，是一类非常重要的大分子物质，是生命活动基本物质之一[23]。多糖结构极其复杂，一级结构是由单糖、主链结构、支链组成和官能团共同决定。二级结构关系到分子中主链的构象，而不涉及侧链的空间排布，因此主要是多糖骨架链间以氢键结合形成的各种聚合体。多糖一级结构的重复顺序构成三级结构，四级结构是多聚链间通过非共价结合形成的聚集体[24]。多糖高级结构非常复杂，且目前解析手段有限，所以研究其空间构象和构效关系有较大难度[25-26]。4 根据多糖的单糖组成，可分为中性糖、酸性糖（果胶）和碱性糖。中性糖主要包括半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和甘露糖（Man）等。葡聚糖是一种通过α或β糖苷键连接组成的多糖，涉及的糖苷键类型有β-1，3、β-1，3，6、β-1，6、α-1，6、α-1，3，6等。甘露聚糖是以β-1,4-甘露糖甘键或葡甘露糖苷键聚合而成的线状多糖。依据主链组成的不同可以分为两大类：线状甘露聚糖和葡甘露聚糖。天然的甘露聚糖分子的侧链常常被半乳糖所取代，根据其侧链含有半乳糖残基的多少，线性甘露聚糖和葡甘露聚糖又分为半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。半乳聚糖是一类由半乳糖单体组成的多糖。存在于多种植物种子和木材中，主要由β-1→4键合的D-吡喃半乳糖残基组成，同时有一部分由1→6键合的半乳糖残基，木材来源半乳聚糖都属于半纤维素，果胶中的半乳聚糖一般以阿拉伯半乳聚糖的形式存在。由于单糖组成和糖基连接方式不同，酸性糖可分为（1）阿拉伯半乳聚糖（AG），主要由D-半乳糖（D-galactose）和L-阿拉伯糖（L-arabinose）组成，并有两种分型，主要区别在于I型阿拉伯半乳聚糖（AG-I）由β-(1-4)-连接的D-吡喃半乳糖形成骨架，并通过半乳糖的O-3位连接L-阿拉伯糖侧链而II型阿拉伯半乳聚糖（AG-II）主要由D-吡喃半乳糖以β-(1-3)-连接构成骨架，半乳糖的O-6位连有β-(1-6)-连接的D-吡喃半乳糖侧链，并且侧链上包括α-(1-3)-连接的L-阿拉伯糖取代[27]；（2）I型聚鼠李半乳糖醛酸（RG-I），它是由α-D半乳糖醛酸-(1-2)-α-L-鼠李糖连接的二糖重复片段组成骨架，并在L-鼠李糖上连有由中性糖组成的支链结构；（3）II型聚鼠李糖醛酸（RG-II）；（4）聚半乳糖醛酸（HG）它是由D-吡喃半乳糖醛酸按照α-(1-4)-连接而成的线性结构，并伴有不同程度的甲酯化和乙酰化。这种类型是所有果胶的基本骨架结构，其差异在于主链长度的不同，以及甲酯化和乙酰化的程度及分布不同；（5）木聚半乳糖醛酸（XGA）等[28]。壳聚糖是一种天然高分子碱性多糖，它的分子由随机分布的D-葡萄糖胺与N-乙酰基葡萄糖胺结构单元，通过α-1，4糖苷键连接而成。1.3.2多糖的降血糖活性文献调查表明，包括各种数据库例如PubMed、Wetofscience、ScienceDirect和Springer，在2011-2015年间与抗糖尿病相关的多糖有114种，其中78种天然来源，像植物、真菌、藻类、动物和细菌，显示出抗糖尿病的潜力。体内外实验表明，这些多糖能减轻β细胞功能障碍，具有降血糖作用，与人工合成药物相比具有更好的效果[29]。（1）多糖增强脂质代谢水提金合欢（Acaciatortilis）多糖（AEATP）由D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸组成。利用链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠模型，AEATP表现出抗糖尿病活性，与降糖药物格列美脲处理的对照组相比，AEATP明显降低糖尿病鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平。AEATP多糖也能提高糖尿病鼠脂质代谢水平，如降低甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)表达，提高5 高密度脂蛋白(HDL)的表达。同时，AEATP多糖能够减少天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶等肝脏损伤标志物的表达，并能提高肝脏脂质代谢水平[30]。从萼状粒毛盘菌（Lachumcalyculsforme）提取的胞外多糖（LEP-1）主要由1-3-β-D-葡聚糖构成，分子量大约445.363KDa。LEP-1在四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠中表现出降血糖作用，并具有剂量依赖性[31]。从乙醇提取残渣中提取五味子水溶性多糖ESCPs继续分级可获得三种均一成分，分子量分别为60000、350000和3000000Da。ESCPs由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖构成。经由ESCP多糖处理四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠21天后明显降低血糖水平，肝糖合成能力增强。ESCP通过减少甘油三酯、胆固醇水平，增加高密度脂蛋白水平，显著提高脂质代谢水平[32]。从海带（Saccharinajapollica）中提取的酸性多糖主要包含岩藻（29.12%）、硫酸盐（33.01%）、糖醛酸（1.93%）和一少部分蛋白质。中性糖由岩藻糖（62.08%）、半乳糖（24.33%）、甘露糖（6.06%）、葡萄糖(1.93%)和阿拉伯糖（5.6%）构成。FPS酸性多糖在四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠中能够明显降低血糖水平、增强血清胰岛素水平，具有显著的降血糖作用[33]。从玉米丝分离出来的蛋白多糖（POCS）在链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠中具有降血糖、降血脂的作用。POCS显著降低血糖水平、血清中甘油三酯、胆固醇含量，并改善葡萄糖耐量[34]。PCE-F多糖从南瓜（pumpkin）提取获得。气相色谱分析PCE-F包含四种单糖：葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖，摩尔比为2.0：1.0:1.5:2.5。在四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠中以200mg/kg剂量静脉注射7h后，PCE-F显著降低血糖水平，血糖从15.9±3.21mM降低至7.19±2.54mM[35-36]。（2）多糖抑制β细胞凋亡2013年一项研究表明患有II型糖尿病患者与正常人群相比，β细胞质量减少，β细胞凋亡速率增长[37]。尽管在II型糖尿病β细胞凋亡的机制复杂并有争议[38-39]，但在II型糖尿病治疗中，抑制β细胞凋亡是一个关键部分。桑叶（Mulberryleaf）多糖MLPII，平均分子质量8.1KDa,由D-阿拉伯糖、D-木糖、D-鼠李糖和D-甘露糖组成，摩尔比1:2.13:6.53:1.04:8.73。MLPII主要由β-糖苷键连接。双标记免疫荧光、蛋白质印记实验、实时逆转录聚合酶链式反应分析，在链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠胰腺中MLPII能够使抗β细胞凋亡的蛋白BCL-2mRNA水平上调，表达增多，使促β细胞凋亡Bcl-2相关x（Bax）mRNA表达量下调，表达减少。MIPII还能抑制促凋亡蛋白caspase-3活化。因此，MLPII增强胰岛细胞增殖，促进胰岛素分泌[40]。灵芝（Ganodermaatrum）多糖PSG-1由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸构成，摩尔比为4.91:1:1:1.28:0.71。PSG-1分子质量1013KDa。采用两种动物模型，一是高脂饲料喂养诱导的糖尿病鼠模型，二是由链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠模型。经由PSG-1处理后，两种鼠模型的空腹血糖均明显6 降低，血清胰岛素水平下降，脂质代谢水平提高。PSG-1能减少Bax表达，提高Bcl-2蛋白表达。组织病理学观察得出，PSG-1在两种糖尿病鼠中保护胰腺胰岛免受损伤[41]。从灵芝子实体提取的蛋白多糖G1-Ps，分子量为8.849KDa,，G1-Ps,总氨基酸含量5.45%，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖组成，摩尔比：22.4:1.9:1.0:2.1。G1-Ps显著上调Bcl-2的mRNA和蛋白表达，减少Bax表达，减少凋亡标志物caspase-3表达，通过抑制β细胞凋亡达到抗糖尿病的作用。[42-43]。从南瓜（pumpkinfruit）获得多糖(PP-1)分子质量为23KDa，单糖组成为D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖，摩尔比1:7.79:70.32:7.05。PP-1通过上调Bcl-2而抑制凋亡，减少一氧化氮（NO）水平，增强抗氧化活性[44]。另一种水溶性多糖（PCE-CC），分子质量115KDa。包含葡萄糖（21.4%）、半乳糖（35.7%）、阿拉伯糖（14.3%）、鼠李糖（28.5%）和己糖醛酸（0.902%）。研究表明，四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠经过21天灌胃给药后，PCE-CC显著降低血糖水平、甘油三酯、胆固醇和HbA1cZ含量，并促进受损的胰岛再生[45]。枸杞酸性多糖（LBP-S-1）单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，摩尔比：1.00:8.34:1.25:1.26：1.91:7.05:15.28。体内外实验结果表明，LBP-S-1提高胰岛素敏感性，促进胰岛β细胞增殖，具有显著降血糖作用[46]。（3）多糖改善β细胞功能障碍II型糖尿病一个共同特征是慢性高血糖症，损伤胰岛素生物合成与分泌，逐步影响β细胞功能，这个过程称为糖毒性[47]。在II型糖尿病发展过程中糖毒性与氧化应激相关的主要风险因子调控有关。氧化压力导致活性氧产生过多，降低了体内抗氧化防卫能力。β细胞由于在氧化应激条件下，β细胞内抗氧化酶表达相对较低，如超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Dx），所以细胞内多余的自由基会损伤细胞大分子，如DNA、蛋白质和脂质[48-49]。换句话说：糖毒性是β细胞长期处于自由基过剩条件下所产生的[50]。研究发现某些药物能增强SOD、CAT和GSH-Dx活性，减少丙二醛含量，能够改善II型糖尿病β细胞功能障碍，减少β细胞凋亡和保护β细胞对抗糖毒性[51-53]。丹参（Salviamiltiorrhizbunge）多糖SMPW1由92.1%碳水化合物，2.3%糖醛酸，3.5%蛋白质构成。体内动物实验表明：SMPW1可以通过减轻氧化应激延缓II型糖尿病发展进程。SMPW1(50mg/kg和100mg/kg)通过减少叔丁基过氧化氢（t-BHP）能够保护和抗氧化能力，与此同时，在血清和匀浆肝脏组织中增强CAT、SOD、GSH-Dx活性，减少丙二醛（MDA）水平。丙二醛认为是一种脂质超氧化的标志物，导致细胞膜损伤、炎症和细胞坏死[54]。SMPW1保护t-BHP对GSH消耗。因此，SMPW1(50、100mg/kg)改善t-BHP对肝和胰腺组织形态学损伤，提高胰岛素敏感性指标[55]。7 在II型糖尿病中，氧化压力与慢性炎症紧密相关。在氧化压力状态下，许多炎症因子如白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6和IL-8在β细胞功能障碍和死亡过程中扮演重要角色[56]。II型糖尿病被证明为炎症疾病[57-58]。炎症导致胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗[59]；临床实验表明，抗炎药物如IL-1和受体拮抗剂，能够降血糖并提高胰岛素敏感性，减轻胰岛炎症浸润、纤维化（病理），进而减缓β细胞功能障碍，提高存活率[60]。当归（Angelicasinensis）多糖（ASP），分子质量72.9KDa，多糖含量为95.1%。单糖组成为阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖，摩尔比为1:2.5:7.5。研究者使用高脂饲料喂养小鼠8周后成功建立糖尿病鼠模型，ASP多糖降低了糖尿病鼠的血糖和血脂。同样，研究者在链脲佐菌素诱导的糖尿病BALB/C鼠中得到相同的结论。ASP通过减少与胰岛素抵抗相关炎症因子IL-6、TNF-α表达起到抗炎作用。TNF-α细胞信号因子，在凋亡细胞中高度表达，与β细胞功能障碍和胰岛素抵抗正相关[61]。此外，IL-6是由T细胞和巨噬细胞免疫应答分泌的。IL-6可抑制胰岛素分泌[62]，多余的IL-6在胰腺胰岛β细胞引起严重的毒性，并导致胰岛素抵抗[63]。此外，ASP还改善小鼠血脂代谢紊乱，恢复受损的胰腺和肝脏[64]。桑枝（Ramulusmori）多糖RMP，分子量460KDa，由62.1%葡萄糖、13.8%半乳糖、6.7%甘露糖、11.6%鼠李糖和5.8%阿拉伯糖组成。RMP增强胰岛素活力和降低血糖水平。RMP通过减少TNF-α、IL-8、IL-6和COX-2表达来抑制炎症反应。COX是由花生四烯酸合成的前列腺素限速酶，分为2个亚型COX-1和COX-2。COX-2是促炎因子。持续的高血糖促进人类胰岛IL-1β的产生进而上调COX-2的表达。COX-2和IL-1β共同上调是导致II型糖尿病β细胞功能障碍的原因[65]。苏木精染色（H&E）显示RMP能改善胰腺组织形态学损伤，这个改善可能是由于炎症因子减少导致的。抑制炎症因子对保护和减轻胰腺损伤和减缓II型糖尿病进程是有益的。在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾脏损伤鼠中，RMP也通过阻塞IL-1/NF-KB信号通路保护肾脏[66]。另外，RMP在胰腺组织中增强SOD和谷胱甘肽活性，RMP通过减少氧化压力提高胰腺功能[67]。（4）多糖抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶II型糖尿病最关键的临床表现是禁食和餐后血糖不规则的升高。因此，控制餐后高血糖是治疗II型糖尿病重要策略。哺乳动物中摄入的碳水化合物都消化分解为葡萄糖和果糖。仅有单糖才能在小肠中吸收入血，人体内有很多有活性的碳水化合物水解酶，胰腺中α-淀粉酶和小肠内α-葡萄糖苷酶最为关键。抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶可以有效延缓葡萄糖向血糖转换进度，减轻餐后血糖升高。因此，可以有效降低II型糖尿病血糖水平[68-69]。从山杏（Apricotpulp）中提取的中性糖APPS1-2MW=25.93KDa，由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，摩尔比1.34:2.01:0.48:0.35。APPS1-2显著抑制α-葡糖苷酶活性。[70]。8 （5）多糖增强胰岛素敏感性血液中葡萄糖和氨基酸的增加会触发胰腺胰岛细胞胰岛素的分泌，胰岛素和其受体相结合，在哺乳动物体内引发一系列生理反应，包括葡萄糖流的增加、糖原合成、糖酵解和抑制肝糖的产生。另外，还影响其他方面，例如细胞增殖[71]，细胞凋亡[72-73]和自噬[74]等。胰岛素激活胰岛素受体底物（IRS）磷酸化进而激活PI3K/Akt/PKB信号通路。AKT是一种多效性激酶，调节糖代谢中胰岛素生物功能，如糖合成激酶（GSK）失活，使果糖激酶活化，促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）移位[75-77]。MAPKs是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族，涉及复杂的生理功能，包括细胞增殖、分化、存活和凋亡[78]。在哺乳动物中，MAPK信号转导通路有5种类型。胞外信号调控激酶（ERK1/2）调控细胞增殖和分化。TNK和P38MAPK信号在压力应答、炎症和凋亡中扮演重要的角色[79]，MAPKs过度活化导致胰岛β细胞凋亡，胰岛素分泌缺陷[80]。桑枝多糖MLPⅡ在高脂喂养的HFD小鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠中处理6周后，能够提高肝糖代谢和改善胰岛素抵抗。MLPⅡ能够提高PI3K-p85和p-Akt2蛋白水平及mRNA水平，表明MLPⅡ多糖激活PI3K/Akt通路增强胰岛素敏感性[40]。高价格和模糊的安全属性引起对高质量、无毒和可负担药物的巨大需求。功能食品对糖尿病病人来说提供一种补充和选择，也是一种趋势。一些病人已经选择尝试使用蘑菇和药用植物来治疗糖尿病。事实上，在中国，一些多糖产品，如黄芪多糖、魔芋多糖、人参多糖、南瓜多糖，已经开发为降糖保健食品。因此，寻找有效抗糖尿病的天然多糖是一个非常有前景的方向。1.4蜜环菌多糖1.4.1蜜环菌蜜环菌隶属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，蜜环菌属，又名榛蘑等。子实体一般中等大。伞盖直径4-14cm，淡土黄色、蜂蜜色至浅黄褐色，老后棕褐色，中部有平伏或直立的小鳞片，有时近光滑，边缘具条纹；菌肉白色；菌褶白色或稍带肉粉色，老后常出现暗褐色斑点。菌柄细长，圆柱形，稍弯曲，同菌盖色，纤维质，内部松软变至空心，基部稍膨大。菌环白色，生柄的上部，幼时常呈双层，松软，后期带奶油色。蜜环菌分布很广，河北、山西、吉林、黑龙江、新疆、云南、西藏等地。产量丰富，是药食兼用真菌，具有极高的经济价值和药用价值。在抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力方面国内外专家和学者获得了丰硕的成果[82]。1.4.2蜜环菌多糖的分离纯化孔小卫[83]等人经纯化得到含半乳糖醛酸的蜜环菌酸性多糖Am-1，利用凝胶色谱法测其相对分子量约为6.65×105Da，采用苯酚-硫酸法、福林-酚法、硫酸咔唑法9 测其糖含量为91.51%、蛋白质含量为2.8%和糖醛酸含量为4.78%。气象色谱分析表明单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-鼠李糖和D-岩藻糖。刘晓杰[84]等人对蜜环菌发酵液进行分步醇沉和葡聚糖凝胶色谱法分离纯化，采用高效液相色谱法纯度鉴定及分子量测定，HPLC法测定单糖组成，得到两种均一多糖，以葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸为主的多糖AMFP-1和以木糖、半乳糖和半乳糖醛酸为主的多糖AMFP-2。谭周进[85]等人对蜜环菌采用发酵液浓缩，乙醇沉淀、75%乙醇洗涤、Sevage法除蛋白、20%H2O2脱色，得到的粗多糖经过DEAE-纤维素柱层析分离得到中性多糖和酸性多糖。中性多糖再经过SephadexG-150柱层析得到均一多糖A。红外光谱表明其含有β-糖苷键，完全酸水解后测得单糖组成为葡萄糖。沈业涛[86]等人将蜜环菌菌索热水提取4h、浓缩、95%乙醇沉淀、真空干燥得到蜜环菌粗多糖，利用SephadexG-150柱，蒸馏水洗脱进行纯化，得到均一多糖Am。经由Sepharose2B鉴定形成均一峰形，Folin-酚试剂法测定不含蛋白，Dische反应测糖醛酸含量，结果表明具有糖醛酸，气象色谱分析Am单糖组成为D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖与糖醛酸。红外色谱分析组成单糖为吡喃糖。1.4.3蜜环菌多糖的活性（1）蜜环菌多糖抗肿瘤活性有研究者利用MTT法筛选对影响肿瘤细胞活性的有效成分及最低抑制浓度，研究表明，黄绿蜜环菌多糖FLP对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，多糖对肿瘤的作用不是直接杀死肿瘤细胞，而是激活具有杀伤肿瘤细胞功能的T淋巴细胞，NK细胞，通过增强机体的免疫防御系统，达到抗肿瘤的作用。进一步建立荷瘤H22小鼠模型，通过统计分析免疫器官指数和相关细胞因子含量的变化以及荷瘤小鼠肿瘤重量，结果表明FLP能够增强机体免疫功能，上调四种细胞因子水平，调控机体免疫机制达到抗肿瘤作用，最后FLP也能够增强正常小鼠免疫功能。研究者采用高效液相色谱方法(HPLC)，测得FLP样品中β-葡聚糖和甘露寡糖含量分别为20.1%和5.7%。文献报道β-葡聚糖和甘露聚糖具有较好的免疫增强作用，因此推测β-葡聚糖和甘露寡糖为蜜环菌多糖的主要活性成分[87]。（2）蜜环菌多糖提高免疫调节王惠国[88]等研究者对实验小鼠以腹腔注射方式给予不同剂量的蜜环菌多糖，给药14天，每天给药1次，给药结束后，利用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、碳粒廓清实验观察小鼠吞噬细胞的吞噬能力；采取MTT法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力；采用血清溶血素形成实验观察蜜环菌多糖对小鼠特异性体液免疫功能的影响。结果表明经蜜环菌多糖处理后，小鼠吞噬细胞的吞噬功能、脾脏T淋巴细胞的增殖能力、小鼠血清中特异性抗体含量均高于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。10 于敏[89]等人利用不同剂量的蜜环菌多糖（100、200和300mg/kg.d）采用灌胃的方式处置实验小鼠，蜜环菌多糖能提高小鼠体重、提高肝脏、胸腺、脾脏等免疫器官的重量、抵抗环磷酰胺对小鼠外周血白细胞数量的影响，上述结果表明，蜜环菌多糖能够增强小鼠免疫系统功能，提高免疫调节。林志彬[90]等人发现蜜环菌多糖(100mg/kg/d)连续灌胃5天，结果发现能显著增加正常小鼠和注射环磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠的溶血素生成。当剂量为50mg/kg/d时，它还能显著增加正常小鼠的空斑形成细胞数。体外试验,蜜环菌多糖(10、50μg/ml)显著增强刀豆素A诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应，但对二硝基氯苯所致小鼠迟发型过敏反应无显著增强作用。此外，蜜环菌多糖还能增加小鼠碳粒廓清速率及腹腔巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数。（3）蜜环菌多糖抗炎活性朱水玲[91]制备蜜环菌正己烷、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇4种不同极性萃取物，检测不同萃取物在两种炎性模型中对细胞增殖、炎症介质一氧化氮（NO）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）等炎症因子分泌量的影响，结果发现蜜环菌乙酸乙酯萃取物在浓度0-300μg/mL范围内可显著抑制LPS诱导两种炎症模型细胞中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌，且具有明显的浓度依赖性。利用硅胶柱色谱法对蜜环菌的乙酸乙酯萃取物进一步分离，获得6个组分，分别为Fr.1-Fr.6。抗炎活性结果显示组分Fr.2对LPS诱导两种炎症模型细胞中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌具有显著的抑制效果。免疫印迹实验发现组分Fr.2能显著抑制LPS诱导的BV-2细胞内NF-κB信号通路中p65蛋白的磷酸化，免疫荧光实验证明组分Fr.2通过抑制NF-κB/p65蛋白入核，从而抑制炎症反应的发生。最后对Fr.2中的化合物进行分离纯化及结构鉴定。从Fr.2中共分离得到7种化合物，结果表明具有抗炎活性。（4）蜜环菌多糖抗氧化活性自由基是机体氧化反应中产生的副产物，多余的自由基可损害机体的组织和细胞，进而引起机体一系列的生理反应。抗氧化系统一般可维持在相对平衡状态，打破平衡，会造成机体的损伤和疾病的发生。在蜜环菌多糖清除自由基抗氧化能力的试验中，蜜环菌水溶性多糖表现出较强的抗氧化活性，而这可能是它防衰老、抗炎症的药理基础[92]。[93]等人将PC12细胞经过300μmol/L的H殷银霞2O2处理12h后，采用MTT法检测蜜环菌多糖对细胞增殖的影响，PC12细胞的含药血清浓度为10%时保护作用最为显著。另外分别采用LDH、MDA、T-SOD比色法检测各组细胞培养液中乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛的含量，结果表明，预先加入蜜环菌多糖含药血清的保护组其乳酸脱氢酶活性和MDA含量都低于损伤组，SOD活性都高于损伤组，因此，蜜环菌多糖具有较强的抗氧化作用，可以有效清除活性氧和自由基。（5）蜜环菌多糖降血糖活性11 研究者[94]培养大鼠胰岛素瘤细胞INS-1，并以四氧嘧啶刺激构建损伤细胞，并向培养液中加入不同浓度的多糖AMP-1，检测AMP-1对INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素和C肽分泌量的影响，同时检测细胞存活率。结果表明，一定浓度范围AMP-1对细胞分泌胰岛素和c肽均具有促进作用，尤其是在葡萄糖刺激浓度为16.7mM时，效果显著，AMP-1可减少四氧嘧啶对INS-1细胞的损伤，使INS-1细胞存活率增加。1.5本论文立题依据、研究内容及意义当前，糖尿病是一个全球性的健康问题，具有较高的发病率和死亡率，由于临床治疗药物常伴有明显的副作用，寻找天然产物作为安全无毒的降血糖保健食品成为了研究热点。蜜环菌是吉林省特产的一种食药兼性真菌，多糖是其主要活性成分，具有丰富的药理活性。虽然文献报道蜜环菌多糖具有降血糖活性，但具有降血糖活性的多糖结构特征及多糖降血糖机制尚不明晰。据此，研究蜜环菌多糖口服降血糖作用及其机制具有重要的理论意义和应用价值。本论文以蜜环菌子实体为研究对象，通过沸水煮提、醇沉、复合酶酶解获得总糖AMP，再通过DEAE-纤维素离子交换柱层析分离纯化得到中性糖AMP-N和酸性糖AMP-A。利用HPLC法分析三种蜜环菌多糖的单糖组成，推测各级分的结构特征。利用高糖高脂诱导的胰岛素抵抗细胞模型，比较三种蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗的活性。再利用GFP-LC3/Hela细胞和人肝癌细胞，比较三种蜜环菌多糖对自噬小体的生成和自噬相关蛋白表达的影响，探讨蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗的活性与其诱导自噬的关系。再运用db/db糖尿病小鼠，分析口服蜜环菌多糖后小鼠体重、血糖、胰岛素耐量、葡萄糖耐量、血清中生化因子和胰岛素含量，研究蜜环菌多糖口服降血糖作用。进一步分析蜜环菌多糖对糖尿病小鼠肝脏脂滴、自噬水平和胰岛形态的影响，研究蜜环菌多糖降血糖的作用机制。论文的研究结果将为开发蜜环菌多糖为降血糖保健食品提供理论支持，为研究多糖的结构与活性的关系奠定基础。12 第二章蜜环菌多糖的提取和分离纯化2.1材料与方法2.1.1材料、试剂与仪器蜜环菌购于长春市桂林路市场。试剂/仪器厂家/货号氢氧化钠北京化工厂乙酸北京化工厂苯酚北京试剂硫酸北京化工厂无水葡萄糖西陇化工股份有限公司间羟基联苯Aladdin考马斯亮蓝G-250北京鼎国生物技术发展中心DEAE-纤维素上海恒信化学试剂有限公司TSK-gelG3000PWxl色谱柱日本TOSOHSepharoseCL-6BGE-healthcare分析型高效液相色谱仪LC-10A日本岛津2.1.2蜜环菌总糖的提取将500g蜜环菌子实体浸泡于12l蒸馏水中过夜，100℃煮提4h，利用300目纱布过滤，收集滤液。然后向滤渣中加入10l蒸馏水，100℃煮提4h，利用300目纱布过滤，收集滤液。合并两次滤液，浓缩，加入4倍体积的95%（体积百分比）乙醇，静置过夜。400rpm离心15min，收集沉淀，常规干燥，即得到蜜环菌水提物。将8g蜜环菌水提物溶于160ml蒸馏水中，调节体系pH至6.5，并向其加入总质量为64mg的木瓜蛋白酶和32mg纤维素酶，使木瓜蛋白酶、纤维素酶和蜜环菌醇提物的配比为0.4U:0.12U:100mg），于45℃孵育2h后，100℃加热煮沸15min使酶失活，得到混合液，将混合液于4500rpm（4000rcf）离心15min，收集上清液，将该上清液浓缩冻干，即得到蜜环菌总糖AMP。2.1.3苯酚-硫酸法测定多糖含量葡萄糖标准溶液：准确称取10mg葡萄糖，定容于100ml容量瓶中，得到标准溶液为0.1g/l。标准曲线的制定：用移液枪分别取0.1g/l的标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml到试管中，加蒸馏水补到1ml。每个浓度重复三个样品，分别向每只试13 管中加入6%苯酚试剂0.5ml，浓硫酸2.5ml，迅速振荡均匀，静置约30min后，于490nm处比色。以葡萄糖含量（μg）为横坐标，以490nm处为纵坐标绘制标准曲线。将样品配成60μg/ml的溶液，取样1ml，不加蒸馏水，其他操作与制作标准曲线相同。测定后，取样品的平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。2.1.4间羟基联苯法测定糖醛酸含量D-半乳糖醛酸标准溶液：准确称取10mgD-半乳糖醛酸，定容于100ml容量瓶中，得到0.1g/l的标准溶液。标准曲线制定：用移液枪分别取0.1g/l的标准溶液0ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml到试管中，加蒸馏水补到1ml。每个浓度重复三个样品，分别向每只试管中加入40μl氨基磺酸，浓硫酸2.5ml，迅速振荡均匀，热水浴约20min后，取出用冷水冷却到室温。再向各管中加入40μl间甲基联苯，摇匀后，室温放置30min。于525nm处比色。以D-半乳糖醛酸含量(μg)为横坐标，以525nm处吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将样品配成60μg/ml的溶液，取样1ml，不加蒸馏水，其他操作与制作标准曲线相同。测定后，取样品的平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。2.1.5考马斯亮蓝法测蛋白质含量蛋白质标准溶液：牛血清白蛋白5mg/ml，-70℃冰箱保存。标准曲线的制定：用移液枪分别取5mg/ml的标准溶液0μl、200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl到试管中，加蒸馏水补到1ml。每个浓度重复三个样品，分别向每只试管中加入4ml考马斯亮蓝溶液，迅速振荡均匀，5min后，于595nm处比色。以BSA质量(μg)为横坐标，以595nm处吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将样品配成1mg/ml的溶液，取样1ml，不加蒸馏水，其他操作与制作标准曲线相同。测定后，取样品的平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。2.1.6蜜环菌多糖的分离纯化取一定量的DEAE-纤维素，用50-100倍的蒸馏水充分浸泡溶胀3-7天。尽可能去除水分后，放入0.5M的NaOH中浸泡1h，用蒸馏水洗至中性。再放入0.5M的HCl中浸泡1h，用蒸馏水洗至中性，并放在蒸馏水中备用。装柱前注意减压处理，以便除去其中的气泡。装柱时，先向柱中加入少量蒸馏水，反冲出气泡，再将DEAE-纤维素缓慢倒入，防止起泡生成，装柱流速为26ml/min。柱子装好后，依次用3倍柱体积的蒸馏水，2倍柱体积0.5M的NaCl和2倍柱体积的蒸馏水进行平衡，此时流速为13ml/min。上样和洗脱的流速应为13ml/min。称取8g蜜环菌总糖AMP，配成20mg/ml溶液，离心（4000rpm，15min）。将上清置于平衡好的DEAE-纤维素离子交换柱进行分级，先用蒸馏水洗脱，收集14 洗脱液经浓缩冻干后得中性糖级分AMP-N；再用0.4MNaCl溶液洗脱，收集洗脱液经3500Da透析袋透析除盐，浓缩冻干得酸性糖级分AMP-A。2.1.7高效液相色谱（HPLC）分析蜜环菌多糖的单糖组成称取蜜环菌多糖样品2mg置于玻璃小瓶中，加入盐酸-甲醇溶液充N2封管（一般为1ml），在80℃的条件下水解16h后用空气泵吹干，再加入1ml2M三氟乙酸，在120℃条件下封管水解1h，待水解产物冷却后，将其转移到蒸发皿中，加入无水乙醇水浴蒸除三氟乙酸，重复多次。加入0.5ml0.3MNaOH溶液和0.5mlPMP试剂于蒸发皿中（PMP是还原糖衍生化最有效的试剂之一），从溶解后的样品中取出100μl于1.5mlEP管中，在70℃条件下水浴30min，分别加入50μl蒸馏水和0.3MHCl溶液终止反应，充分混匀后加入1ml三氯甲烷充分震荡以萃取出剩余的PMP试剂，离心（10000rpm，5min）吸去三氯甲烷层，保留水层，反复萃取三次。用0.22μm滤膜过滤后进行检测。高效液相色谱分析单糖组成条件：仪器：ShimadzuLC-10ATVP高效液相色谱仪，附紫外检测器；色谱柱：DIKMAInertsiLODS-35μm150×4.6mm；检测温度：35℃。；洗脱液：82.2%PBS（0.1M，pH7.0），17.8%AcetonitriLe（v/v）；流速：1.0ml/min。2.2结果与讨论2.2.1蜜环菌多糖的提取图2.1蜜环菌多糖的分离纯化流程15 如图2.1所示，将蜜环菌子实体利用蒸馏水浸泡过夜，沸水煮提，过滤后，收集滤液；再向滤渣中加入蒸馏水，沸水煮提，过滤，收集滤液，合并两次滤液，浓缩，加入95%（体积百分比）乙醇，静置过夜，离心，收集沉淀，常规干燥，即得到蜜环菌水提物。将水提物重新溶于蒸馏水，调节体系pH至6.5，向溶液中加入木瓜蛋白酶和纤维素酶混合液离心，收集上清液，将该上清液浓缩冻干即得到蜜环菌总糖AMP。利用DEAE-纤维素离子交换柱对AMP进行分级，先用三倍柱体积的蒸馏水洗脱，收集洗脱液，将该洗脱液浓缩冻干，即得到蜜环菌中性糖AMP-N；再用两倍柱体积的0.4MNaCl水溶液洗脱，收集洗脱液，将该洗脱液经3500Da透析袋透析除盐，将透析后产物浓缩冻干，即得到蜜环菌酸性糖AMP-A。2.2.2蜜环菌总糖的糖含量表2.1蜜环菌总糖的糖含量试管号123平均值总糖含量（%）AMPA4900.6260.6340.6510.63068.4将样品按照2.1.3所述方法进行测定，得到3个测量值，将算得的平均值代入回归方程，得蜜环菌总糖AMP糖含量为68.4%。2.2.3蜜环菌总糖的糖醛酸含量表2.2蜜环菌总糖的糖醛酸含量试管号123平均值糖醛酸含量（%）AMPA5250.1170.1120.1190.1183.7将样品按照2.1.4所述方法进行测定，得到3个测量值，将平均值代入回归方程，得蜜环菌总糖AMP的糖醛酸含量为3.7%。2.2.4蜜环菌总糖的蛋白含量表2.3蜜环菌总糖的蛋白含量试管号123平均值蛋白含量（%）AMPA5950.3830.3840.3730.3843.6将样品按照2.1.5所述方法进行测定，得到3个测量值，将平均值代入回归方程，得蜜环菌总糖AMP蛋白含量为3.6%。16 2.2.5蜜环菌多糖的分离纯化图2.2蜜环菌总糖经DEAE-纤维素离子交换柱层析将蜜环菌总糖AMP按照2.1.6所述方法，可得由蒸馏水洗脱的中性糖AMP-N和NaCl洗脱的酸性糖AMP-A。如图2.2所示，AMP经过DEAE-纤维素离子交换柱层析后的洗脱曲线出现两个对称性较好且较窄的峰型，说明这两种多糖无杂质，是均一级分。2.2.6蜜环菌多糖各级分单糖组成表2.4蜜环菌多糖各级分单糖组成产率单糖组成(mol%)(%)ManRhaGlcAGalAGlcGalXylAraFucAMP12.8a18.1--3.3--58.619.8----1.5AMP-N35a18.2------49.825.2--6.8--AMP-A47.5a3.3--3.5--81.66.0--1.83.1a:获得物质质量与原物质质量比将蜜环菌多糖按照2.1.7所述方法，得到蜜环菌多糖各级分单糖组成。从表2.4可以看出，蜜环菌总糖（AMP）主要是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成，摩尔比为18.1:3.3:58.6:19.8:1.5，产率为12.8%，半乳葡聚糖；蜜环菌中性糖（AMP-N）主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为18.2:49.8:25.2:6.8，产率为35%，半乳葡聚糖；蜜环菌酸性糖（AMP-A）主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖岩藻糖组成，摩尔比为3.3:3.5:81.6:6.0:1.8:3.1产率为47.5%，葡聚糖。从单糖组成来看，AMP-N含有半乳葡聚糖结构域，AMP-A含有葡聚糖结构域。17 2.3本章小结（1）将蜜环菌子实体沸水煮提，再经过复合酶酶解，获得蜜环菌总糖AMP，得率12.8%。（2）总糖AMP经DEAE-纤维素离子交换柱层析，分离得到中性多糖AMP-N和酸性多糖AMP-A。（3）高效液相色谱（HPLC）分析蜜环菌多糖的单糖组成，结果显示AMP-N含有半乳葡聚糖结构域，AMP-A含有葡聚糖结构域。18 第三章蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗3.1材料与方法3.1.1试剂与仪器试剂/仪器厂家/货号DMEM高糖培养基Gibco胎牛血清GibcoEBSSSigma：E7501Opti-MEMSigma：31985-070NEAAGibco：11140-050G418Gibco：10131-032油酸阿拉丁：s104196软脂酸阿拉丁：p1010059胰岛素Sigma：I0516葡萄糖检测试剂盒北京普利莱：E1010盐酸二甲双胍阿拉丁：M107827荧光显微镜OLYMPUS：BX51/DP71酶标仪TECAN：INFINITEF50低温高速离心机Sigma：1-14k氮吹仪上海极恒实业有限公司：JHD-0013.1.2细胞复苏将冻存的人肝癌细胞HepG2从液氮罐中取出，迅速放入37℃恒温水浴箱中快速融化，用75%乙醇对双手及冻存管表面进行杀菌，移入超净工作台，在超净台中用电动移液器缓慢取出细胞并加入加入3ml事先预热的培养基，1000rpm离心3min。弃去离心管中上清液，用电动移液器加入10ml培养基并将细胞沉淀吹散混匀，移入细胞培养皿中，37℃，5%二氧化碳条件下培养。每日观察细胞状态。3.1.3细胞培养HepG2细胞源于人肝癌细胞株，使用DMEM高糖培养基（Gibco）+10%FBS(Gibco)培养，3天左右可以传代。19 GFP-LC3/Hela细胞株，使用DMEM高糖培养基+10%FBS(Gibco)+0.4mg/mlG418。在超净台中将对数生长期细胞用移液器移去培养盘中培养基，加入5ml事先预热的DHanks液，轻轻摇动培养盘使DHanks液充分洗去残留的培养基，弃DHanks液，加入800μl胰酶，上下轻轻倾斜，使胰酶均匀铺在细胞表面，放入恒温培养箱1min，光学显微镜下观察到细胞变为球形，移入超净台中，用电动移液器吸入5ml细胞培养，轻轻吹打，使细胞完全脱落，收集细胞，1000rpm离心3min，弃上清，加入3ml培养基，反复吹打细胞使其分散混匀，把细胞移入事先放有10ml的培养盘中，每盘1ml细胞。放入细胞培养箱中培养。3.1.4细胞冻存取对数生长期细胞按照传代的方式进行到离心步骤后，弃上清，加入事先配置好的冻存液中（95%培养基+5%DMSO，-20℃预冷10min），吹散细胞，将细胞分装入标好信息后冻存管中，每管1ml，放入-20℃2h，移入-80℃过夜，最后移入液氮罐中永久保存。3.1.5油酸软脂酸高糖处理液（FG）配制取适量的油酸0.03044g、软脂酸0.0128g溶解于10ml无水乙醇中，超声溶解40min，氮气吹干。取牛血清白蛋白0.3g溶解于10ml无血清DMEM高糖培养基中，调pH值至10.0。将含有血清白蛋白的培养基与氮气吹干的油酸软脂酸混合物超声溶解至澄清无浑浊，调pH至7.4，使用0.22μM孔径滤器过滤后分装，1ml每管，-20℃保存，储备浓度为15mM。3.1.6胰岛素抵抗细胞模型的构建取对数生长期HepG2细胞，以0.5×104/well细胞数加入96孔板中，每孔100μl培养基在37℃，5%二氧化碳条件下培养24h，弃上清，用PBS洗一次，弃上清。设置组别如下：空白对照、阴性对照FG（0.5mM）、阳性对照二甲双胍（MET,20μM）以及多糖处理组（0.01、0.1和1.0mg/ml），每组8个重复。0.5mM的FG溶液和多糖或二甲双胍共同处理36h，弃上清，用PBS洗一次，弃上清。每组4个复孔加入含有1nM胰岛素的无血清培养基，每组另外4个复孔加入无血清培养基，继续处理24h。取上清，测葡萄糖含量。结果以胰岛素刺激的葡萄糖吸收率来表示，葡萄糖吸收率=（模型组无胰岛素刺激的培养液葡萄糖含量-模型组胰岛素刺激的培养液葡萄糖含量）/（空白对照组无胰岛素刺激的培养液葡萄糖含量-空白对照组胰岛素刺激的培养液葡萄糖含量）×100%。20 3.1.7多糖对胰岛素受体信号通路的影响取对数生长期HepG2细胞以8×104/well数量置于6孔板中培养24h，弃上清，用PBS洗一次，分别加入0.5mMFG、0.5mMFG+20μMMet、0.5mMFG+0.1mg/ml多糖培养36h，每组2个复孔。PBS冲洗细胞，每组一个孔细胞加入含有50nM胰岛素的无血清培养基，另一个孔的细胞加入无血清培养基，处理10min。弃上清，用PBS洗两次，加入50μl含有1xPI、1xPMSF、1xNa3VO4细胞裂解液，用细胞刮刀收集细胞，4℃垂直旋转裂解1h后，12000rpm,离心20min，取上清，考马斯亮蓝蛋白定量法定量，-80℃保存，westernblot备用，检测胰岛素受体信号通路相关蛋白IR（cellsignalingtechnology,3025s,1:1000）、Akt(cellsignalingtechnology,1:1000)和AMPK(cellsignalingtechnology,1:1000)等。表3.1蛋白裂解液的配制试剂终浓度Tris-cl(pH7.4-8.0)50mMNacl150mMEDTA1mMTX-1001%3.1.8Westernblot根据实验需求，实验前配好所需浓度的凝胶，根据蛋白浓度计算好需要的蛋白量，与4x蛋白上样缓冲液以3:1的比例混匀，在98度加热器上加热5min，使样品充分变性，瞬离10s。上样，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出目的蛋白后，一般120V，90min，取出凝胶，转膜，根据蛋白大小确定转膜时间，一般100V，120min。含有5%脱脂奶粉的PBST封闭至少1h，弃掉封闭液，孵育一抗（3%BSA的PBST按1:1000比例稀释），4度，过夜。回收一抗，用PBST洗三次，每次10min，孵育二抗（5%脱脂奶粉按1:1000稀释）室温，摇床，45min。弃掉二抗，PBST洗三次，每次10min，将显色液A和B按照1:1的比例混匀，均匀滴加在膜上，化学发光仪检测荧光强度。表3.2分离胶的制备8%(ml)10%(ml)12%(ml)15%(ml)超纯水7.056.035.0253.5254xTris-Cl(pH8.8)3.753.753.753.7510%十二烷基硫酸钠SDS0.150.150.150.1530%丙烯酰胺/N,N,-亚甲双丙烯酰胺3.9754.98867.5四甲基乙二胺TEMED7.5x10-37.5x10-37.5x10-37.5x10-310%过硫酸铵0.0750.0750.0750.07521 表3.3浓缩胶的制备5ml10ml15ml20ml超纯水3.0256.059.07512.14xTris-Cl(pH8.8)1.252.53.75510%十二烷基硫酸钠SDS0.050.10.150.230%丙烯酰胺/N,N,-亚甲双丙烯酰胺0.651.31.952.6四甲基乙二胺TEMED0.0050.010.0150.0210%过硫酸铵0.0250.050.0750.13.1.9免疫荧光法检测多糖诱导自噬的能力取对数生长期GFP-LC3/Hela细胞，以5×104/well置于预先在24孔板中放入圆形玻片上培养；24h，小心吸去培养基，用事先预热的PBS洗两次，按照组别设计进行加药：空白对照组（ctrl）、富含营养的培养组（Rich）、使用EBSS培养液的饥饿组（starvation）和多糖组（0.1mg/ml），培养3h，弃去培养基，用PBS洗两次，加入4%多聚甲醛（PFA）避光固定15min，PBS洗一次，加入Hoechest33342(储备浓度1mg/ml，1:200稀释)，避光孵育10min，弃上清，PBS洗两次，取出长满细胞的圆形玻片，沥干水渍，加入适量抗荧光衰减剂，封片，拍照，观察自噬小体数量。表3.4Rich培养液的配制试剂终浓度Opti-MEM：DMEM3：1（体积比）FBS5%NEAA1%Glutamine2mM表3.5EBSS培养液的配制试剂体积(ml)10xEBSS25NaHCO37.3ddH2O217.73.1.10蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗与诱导自噬的关系取对数生长期HepG2细胞以8×104/well数量置于6孔板中培养24h，弃上清，用PBS洗一次，加入0.5mMFG、20μMMet、0.1mg/ml糖样培养24h，弃上清，用PBS洗两次，加入50μl细胞裂解液（包含1xPI、1xPMSF、1xNa3VO4），用22 细胞刮刀收集细胞，4℃垂直旋转裂解1h后，12000rpm,离心20min，取上清，考马斯亮蓝蛋白定量法定量，-80℃保存，westernblot备用，检测自噬相关蛋白LC3(sigma,1:1000)、p62（sigma,1:1000）等。3.2结果与讨论3.2.1蜜环菌多糖对胰岛素抵抗的改善作用图3.1蜜环菌多糖对胰岛素刺激的葡萄糖吸收的影响。*p<0.05,**p<0.01与FG组相比；###p<0.001与CTRL组相比。从图3.1可以看出，以空白对照CTRL为基准，葡萄糖吸收率为100%，FG处理的细胞葡萄糖吸收率达到51%，而MET阳性对照组葡萄糖吸收率达到85%以上，与FG组相比明显改善胰岛素抵抗（0.001AMP>AMP-A。3.2.4蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗与其诱导自噬的关系图3.4蜜环菌多糖对FG处理的细胞自噬的影响。（A）自噬相关蛋白的表达；（B）定量分析。25 由于自噬与胰岛素抵抗密切相关，因此，我们分析了蜜环菌多糖改善胰岛素抵抗是否与其激活自噬相关。从图3.4可以看出，与DMEM空白组细胞相比，FG处理的细胞中自噬底物蛋白p62的降解受到抑制，且LC3-II几乎没有转化，说明FG阻碍了细胞的自噬发生。与FG处理的细胞相比，MET处理的细胞中蛋白p62略有降解，LC3-I向LC3-II的转化显著增多，说明MET逆转了FG对自噬的抑制作用。与FG处理的细胞相比，虽然AMP处理的细胞中LC3-II的转化明显增多，但蛋白p62的降解受到抑制，说明AMP没有改善FG导致的自噬受阻，推测可能由于自噬溶酶体的降解功能没有恢复。与FG处理的细胞相比，AMP-N处理的细胞中蛋白p62明显降解，而且LC3-II的转化也明显增多，说明AMP-N改善了FG对自噬的抑制作用。AMP-A处理的细胞中蛋白p62和LC3的表达比较接近FG处理的细胞，说明AMP-A对自噬的受阻没有改善作用。因此，只有AMP-N逆转了FG诱发的自噬受阻。结合AMP-N改善胰岛素抵抗的结果，我们推测AMP-N通过激活自噬改善胰岛素抵抗。3.3本章小结（1）在高糖高脂诱导的胰岛素抵抗细胞模型中，蜜环菌总糖AMP和中性多糖AMP-N能够改善胰岛素抵抗，提高胰岛素刺激的葡萄糖吸收。酸性多糖AMP-A没有改善胰岛素抵抗的作用。（2）蜜环菌总糖和中性糖改善胰岛素抵抗的机制可能不同，总糖AMP通过激活IR-Akt-AMPK信号通路改善胰岛素抵抗，但与其诱导自噬无关。中性多糖AMP-N通过诱导自噬激活IR-Akt-AMPK信号通路，进而改善胰岛素抵抗。26 第四章蜜环菌多糖口服降血糖活性4.1材料与方法4.1.1试剂与仪器试剂/仪器厂家/货号无水葡萄糖西陇化工股份有限公司胰岛素Sigma:I0516谷丙转氨酶检测试剂盒南京建成:c009-2谷草转氨酶检测试剂盒南京建成:c010-2甘油三酯检测试剂盒南京建成:A110-1游离脂肪酸检测试剂盒南京建成:a042-2胰岛素检测试剂盒IBL:YX-091419血糖仪强生稳豪型托盘天平JPT-1000荧光显微镜日本Olympus:BX51/DP714.1.2小鼠饲养db/db糖尿病小鼠（5周龄，雄性）购于南京大学模式动物研究所，C57BL/6J小鼠（5周龄，雄性）购于南京大学模式动物研究所。小鼠置于SPF动物房喂养，自由取水，摄食，12h光照12h避光，符合动物管理条例。测量体重、随机血糖，剔除体重异常、血糖异常的鼠，随机分配。4.1.3蜜环菌多糖口服剂量的优化按照50mg/kg/d和25mg/kg/d剂量，以灌胃方式给药，每天一次，连续给药3周，每周固定时间测定一次随机血糖，根据随机血糖，确定最佳给药剂量。4.1.4蜜环菌多糖给药时间的优化选用剂量50mg/kg/d，以灌胃方式给药7周，每周固定时间测定一次随机血糖，根据随机血糖，确定最佳给药时间。4.1.5空腹血糖的测定将蜜环菌多糖按照50mg/kg/d的剂量通过灌胃的给药方式对db/db糖尿病鼠进行处理，每天一次，连续给药4周。每周监测空腹血糖，即在测血糖前一晚，小鼠禁食，第二天尾静脉取血进行检测。测量血糖时，对待小鼠动作轻柔，尽量不要使27 小鼠紧张，以免影响准确性，重复测量同一只小鼠血糖时要用酒精片擦掉之前的血渍。4.1.6葡萄糖耐量（GTT）检测小鼠早上6点开始禁止进食空腹8h，期间可以正常饮水，禁食8h后，测各组别血糖（即0时血糖），称体重并记录；葡萄糖按照1.5g/kg的剂量以腹腔注射的方式迅速注入小鼠体内，第一只注射结束即开始计时，分别于15、30、60和120min时间点，尾静脉取血测量血糖，整理数据作图。4.1.7胰岛素耐量（ITT）检测小鼠早上6点开始禁止进食空腹6h，期间可以正常饮水，禁食6h后，测各组别血糖（即0时血糖），称体重并记录；胰岛素按照150mIU的剂量以腹腔注射的方式迅速注入小鼠体内，第一只注射结束即开始计时，分别于15、30、60和120min时间点，尾静脉取血测量血糖，整理数据作图。4.1.8动物处置处死前测量小鼠体重，摘眼球取血，断颈处死小鼠，解剖，称取各组织重量，如肝脏、胰腺、各种脂肪等。肝脏、胰腺等取出一部分放置在4%PFA保存，另一部分置于-80℃保存。4.1.9组织H&E染色取放置于4%PFA中的肝脏送于吉林大学转化医学院进行制片和染色。切片厚度为5μm。4.1.10胰腺胰岛冰冻切片从装有4%多聚甲醛的离心管中取出胰腺组织，用解剖剪刀剪下一小部分外形完整的胰腺组织；把剪下的胰腺组织装进含有15%蔗糖溶液中脱水过夜；将胰腺组织转移到含有30%蔗糖溶液中继续脱水过夜；取出脱水后的组织块用包埋剂进行包埋；放进-80℃冰箱中冰冻；取出冰冻的组织在冰冻切片机切片（使用防脱落载玻片），切片厚度为8μm。待完全干燥后，可直接进行试验或-80℃保存备用。取出冰冻切片，在室温干燥1h（完全干燥）；4%多聚甲醛在室温条件下固定20min；弃去多聚甲醛，用PBS缓冲液在摇床上洗2次，每次5min；使用透化剂透化20min（0.5%TX-100/SDS/PBS），室温；PBS洗3min；封闭液室温封闭3h（5%FBS/1%BSA/PBS）；孵育一抗（1:200），4℃，过夜；PBST洗2次，每次5min，摇床；PBS洗5min，摇床；待组织块未干透孵育二抗（1:200），室温，避光，2h；PBST洗2次，每次5min，摇床；PBS洗5min，摇床；Hoechest3334228 (储备浓度1mg/ml，1:200稀释)，染核10min；PBS洗2次，每次5min，摇床；加入抗衰减淬灭剂，封片；照相，统计分析。4.1.11血清生化因子的检测摘眼球取血后，14000rpm，4度，离心20min，取上清，得到血清。分别检测甘油三酯、游离脂肪酸、胰岛素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量。4.1.12动物组织总蛋白提取称取肝脏组织约50mg，加入800μl细胞裂解液，利用组织研磨器充分研磨组织，放入4℃垂直旋转1h，12000rpm，离心20min，取上清，考马斯亮蓝法测量蛋白含量。-80℃保存待用。4.1.13蜜环菌多糖的毒性分析选择5周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成五组(n>5)，蜜环菌多糖以50mg/kg/d剂量灌胃，每天一次，连续灌胃4周，每周检测体重、随机血糖，处死后，解剖，称取各种组织重量。4.2结果与讨论4.2.1蜜环菌总糖的降血糖作用图4.1蜜环菌总糖对小鼠血糖的影响从图4.1可以看出，db/db小鼠随机血糖随着时间的增长，血糖水平稳步上升。50mg/kg/d的MET给药3周后，小鼠血糖没有升高，与db组小鼠对比，表现出降血糖活性（p<0.001，n=8）。蜜环菌总糖AMP以50mg/kg/d的剂量，灌胃给药3周后，小鼠血糖略有下降，与db组小鼠相比，AMP能够显著降低血糖（p<0.001，n>5）,实验结果表明，蜜环菌总糖AMP具有显著降血糖活性。29 4.2.2蜜环菌多糖口服剂量的优化图4.2蜜环菌多糖口服剂量的优化从图4.2可以看出，按照25mg/kg/d和50mg/kg/d的剂量灌胃3周后，蜜环菌中性糖AMP-N和酸性糖AMP-A都具有降血糖作用（0.0015)。这些结果显示，AMP和AMP-N增强了db小鼠的胰岛素敏感性，而AMP-A对胰岛素抵抗没有改善作用。4.2.6蜜环菌多糖改善葡萄糖耐量图4.6葡萄糖耐量如图4.6所示，与C57BL/6J小鼠的血糖浓度变化趋势相比，db糖尿病小鼠血糖增幅较大，而且高血糖持续时间较长，120min血糖仍高达500mg/dl。蜜环菌总糖AMP处理的db小鼠血糖浓度变化趋势与C57BL/6J小鼠相似，15min时血糖升32 至400mg/dl，随后下降，120min血糖回落至206mg/dl(0.001