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密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文蜂蜜挥发性成分的研究StudyofVolatileOrganicComponentsinHoneys硕士研究生：任佳淼指导教师：彭文君研究员申请学位类别：工学硕士专业：食品科学研究方向：功能食品与生物活性物质培养单位：蜜蜂研究所研究生院2015年6月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文蜂蜜挥发性成分的研究StudyofVolatileOrganicComponentsinHoneys硕士研究生：任佳淼指导教师：彭文君申请学位类别：工学硕士专业：食品科学研究方向：功能食品与生物活性物质培养单位：蜜蜂研究所研究生院2015年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudyofVolatileOrganicComponentsinHoneysM.S.Candidate：RenJiamiaoSupervisor：PengWenjunMajor：FoodScienceSpecialty:FunctionalfoodandthebiologicalactivitymaterialMonth2015 独创性声明本人声明所呈交的论文虽我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不也含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的仟:何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:时间：年f月1曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，8卩；中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目蜂蜜挥发性成分的研究功能食品与生物活性论文作者任佳淼专业食品科学研究方向物质指导教师彭文君培养单位(研究所、中心）蜜蜂研究所姓名职称单位专业签名评阅人昝辩景浩教授中国农业大学食品科学之£*席农业部农产品质量安全农产品质量与食物廖超子研究员中心安全y中国农业科学院农业质邱静研究员量标准与检测技术研究食品科学答所中国农业科学院动物营养与饲料科张军民研究员辩北京畜牧兽医研究所学中国农业科学院董捷研究员食品科学委蜜蜂研究所----^Xr--p"员会议记录（秘书）论文答辩时间地点 摘要蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，将其贮存于蜂巢内的巢脾中，并经充分酿造而成的。天然蜂蜜具有特殊的花香气味，主要源于不同的挥发性小分子化合物。不同蜜源蜂蜜的感官特征、营养价值等具有明显差异，消费者的接受程度也不尽相同。随着生活水平的提高，人们对蜂蜜的需求量增长迅速，对其食用品质的要求也越来越高。如何能够保证蜂蜜原料的真实性及其在加工过程中的纯正性，已成为蜂蜜生产、加工和销售环节的重要出发点。为了优化蜂蜜挥发性成分的顶空固相微萃取（HS-SPME）的萃取效率，采用Plackett-Burman（PB）设计法和响应面分析法对萃取条件进行优化。在单因素试验基础上，首先用PB设计对影响蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取条件的因素进行了评价，筛选出具有显著效应的三个因素——萃取温度、萃取时间和样品量。然后用响应面分析法对有显著效应的关键因子进行进一步优化。结果表明萃取温度68.5℃、萃取时间51.5min、取样量5.1g、样品与去离子水质量比10:1、NaCl添加量0.3g、搅拌速度650rpm是蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件。采用优化后的HS-HPME对17种不同蜜源蜂蜜样品的挥发性成分进行富集，经气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析。结果显示，共有79种挥发性成分被鉴别出来，分属于醇类(22.78%)、醛类(17.72%)、芳香类(17.72%)、酯类(16.46%)、酮类(7.59%)、醚类(7.59%)、酸类(5.06%)、酚类(2.53%)、萜烯类(1.27%)和烷烃类(1.27%)。其中苯乙醇在16个样品中被检出，乙酸在15个样品中被检出，糠醛在14个样品中被检出，甲苯和苯甲醛在13个样品中被检出，乙醇在8个样品中被检出。不同蜜源蜂蜜的挥发性成分之间存在明显差异，主要体现在特定物质的种类或含量上。采用成熟的加工工艺对马占相思树蜂蜜进行加工，对各个加工结点进行取样，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析其挥发性成分。结果显示，蜂蜜样品的挥发性成分中共检测到23种物质，分属于酯类（26.09%）、醛类（13.79%）、醇类（13.79%）、酮类（13.04%）、萜烯类（8.70%）、烷烃类（8.70%）和酸类（4.35%）等，其中糠醛、苯甲醛和苯乙醛可能对马占相思树蜂蜜风味具有重要贡献。基于样品挥发性成分损失情况进行判断，发现融蜜条件为加热至71℃保持4min时，可以较好地保持蜂蜜产品的风味。关键词：蜂蜜，挥发性成分，顶空固相微萃取，气质谱联用技术，加工工艺I AbstractAfterbeingcollectedbybees(Apismellifera),thenectarorhoneydewoffloralplantsisstoredinthehoneycombandbecomehoneyduringasufficientbrewing.Naturalhoneywithaspecialfloralscentismainlyduetodifferentvolatilesmallmolecules.Organolepticcharacteristicsandnutritionalvalueofhoneyfromdifferentnectarsourceshaveobviousdifferencesandacceptabilityofconsumersisnotthesame.Aslivingstandardimproving,people"sdemandforhoneygrowrapidly,anditseatingqualityrequirementsisincreasing.Howtoensuretheauthenticityofrawhoneyandpurityduringtheprocesshasbecameanimportantdeparturepointforhoneyproduction,processingandmarketingsectors.Inordertoenhancetheheadspace-solidphasemicroextractionefficiencyofvolatilecomponentsinhoney,Plaekett-Burmandesignandresponsesurfacemethodologywereusedtooptimizeextractionconditions.Onthebasisofsingle-factorsexperiments,PlackettBurmandesignwasfirstlyappliedtostudythefactorsofHS-SPMEextractionconditionsforvolatilecomponentsinHoneyandscreenoutthesignificantimpactfactors:extractiontemperature,extractiontimeandsampleamount.Andthenthelevelofsignificantfactorswerefurtheroptimizedbyresponsesurfaceanalysis.TheresultsshowthattheoptimizedHS-SPMEextractionconditionsforvolatilecomponentsinhoneywereextractiontemperatureof68.5℃,extractiontimeof51.6min,sampleamountof5.1g,sampleanddeionizedwatermassratioof10:1,NaCladditiveamountof0.3gandstirringspeedof650rpm.Thevolatilecomponentsin17kindsofhoneysamplesfromdifferentnectarsourceswereconcentratedbyoptimizationHS-SPMEandanalyzedbygaschromatography-massspectrumGC-MS.Theresultsshowedthat79volatilecomponentswereidentifiedinhoneysamples.Thesecomponentsbelongtoalcohols(22.78%),aldehydes(17.72%),aromaticcompounds(17.72%),esters(16.46%),ketones(7.59%),ethers(7.59%),acids(5.06%),phenols(3.03%),terpenes(1.27%)andalkanes(1.27%).Phenylethanolwasdetectedin16samples，aceticacidwasdetectedin15samples，furfuralwasdetectedin14samples，tolueneandbenzaldehydeweredetectedin13samples，ethanolwasdetectedin8samples.Volatilecomponentsinhoneysfromdifferentnectarsourceshaveobviousdifferencesthatmainlyreflectedinthespeciesorcontentsofspecificsubstances.Honeysamples,producedfromtheflowersofAcaciamangiumbyApismelliferaL,wereconductedbysetprocessingtechnic.WeusedGC-MStoanalysisthevolatilecomponentsinhoneysampledfromdifferentprocessnotes.Astheresults,23volatilecomponentswerefoundinhoneysamples.Thesecomponentsbelongtoesters(26.09%),aldehydes(13.79%),alcohols(13.79%),ketones(13.04%),terpenes(8.70%),alkanes(8.70%),acids(4.35%),andsoon.Furfural,BenzaldehydeandBenzeneacetaldehydemayplayimportantroleinflavorofthehoneysamples.Tojudgethesituationbasedonthelossofvolatilecomponentsofsamples,wefoundvolatilecomponentslosingwaslowerwhileheatinghoneyat71℃for4minanditcanbettermaintaintheflavorofhoneyproduct.Keyword:honey,volatilecomponents,headspace-solidphasemicroextraction,gaschromatography-massspectrum,processingtechnic.II 目录第一章引言...................................................................................................................11.1蜂蜜基本介绍.............................................................................................................11.1.1蜂蜜的理化性质..................................................................................................11.1.2蜂蜜的化学组成..................................................................................................11.1.3我国主要蜂蜜种类..............................................................................................21.2蜂蜜的挥发性成分.....................................................................................................21.2.1蜂蜜挥发性成分的组成......................................................................................21.2.2蜂蜜挥发性成分的提取方法..............................................................................31.2.3蜂蜜挥发性成分的分析方法..............................................................................51.2.4蜂蜜挥发性成分的重要性..................................................................................61.3本文研究的意义及主要内容.....................................................................................91.3.1本文研究的意义..................................................................................................91.3.2本文研究的主要内容........................................................................................10第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化..............................................112.1材料与方法................................................................................................................112.1.1材料与试剂........................................................................................................112.1.2仪器与设备........................................................................................................112.1.3方法....................................................................................................................112.1.4试验设计............................................................................................................122.2结果与分析...............................................................................................................132.2.1单因素试验........................................................................................................132.2.2PB设计确定关键影响因素...............................................................................192.2.3Box-Behnken响应面分析..................................................................................202.3小结...........................................................................................................................23第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析.....................................................................243.1材料与方法...............................................................................................................243.1.1蜂蜜样品及蜜源信息........................................................................................24III 3.1.2仪器与设备........................................................................................................253.1.3方法....................................................................................................................253.2结果与分析...............................................................................................................263.2.1蜂蜜样品中的挥发性成分................................................................................263.2.2蜂蜜样品中挥发性成分分类............................................................................333.2.3蜂蜜样品中挥发性成分的含量........................................................................333.3小结...........................................................................................................................34第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响...................................................................364.1材料与方法...............................................................................................................364.1.1材料与试剂........................................................................................................364.1.2仪器与设备........................................................................................................364.1.3方法....................................................................................................................374.2结果与分析...............................................................................................................394.2.1蜂蜜挥发性成分总离子流图............................................................................394.2.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性........................................................................394.2.3蜂蜜样品中挥发性成分分类............................................................................404.2.4加工工艺对蜂蜜中挥发性成分的影响............................................................414.2.5融蜜条件对蜂蜜中挥发性成分的影响............................................................414.3小结...........................................................................................................................42第五章全文结论.............................................................................................................43参考文献.............................................................................................................................44致谢.................................................................................................................................52作者简历.............................................................................................................................53IV 图目录图2.1萃取温度对总峰面积的影响...............................................................................13图2.2萃取时间对总峰面积的影响...............................................................................14图2.3样品量对总峰面积的影响...................................................................................15图2.4样品与去离子水质量比对总峰面积的影响.......................................................16图2.5NACL添加量对总峰面积的影响........................................................................17图2.6搅拌速度对总峰面积的影响...............................................................................18图2.7萃取温度(X1)和萃取时间(X2)对总峰面积的交互影响.................................22图2.8萃取温度(X1)和样品量(X3)对总峰面积的交互影响.....................................22图2.9萃取时间(X2)和样品量(X3)对总峰面积的交互影响.....................................22图3.1YC样品挥发性成分的总离子流图......................................................................27图3.2蜂蜜样品中挥发性成分种类...............................................................................31图3.3不同样品挥发性成分中主要共有的物质的含量................................................31图3.4ZM样品中各挥发性成分的含量.........................................................................32图4.1S2样品挥发性成分的总离子流图.......................................................................37图4.2蜂蜜样品中挥发性成分种类...............................................................................37图4.3加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响...................................................................39图4.4融蜜条件对蜂蜜挥发性成分的影响...................................................................40V 表目录表1.1单花蜜的挥发性成分标记物....................................................................................7表2.1PB试验设计及相应值..........................................................................................19表2.2总峰面积的估计效应和系数及显著性检验.......................................................20表2.3响应面分析试验因素水平表...............................................................................20表2.4响应面试验设计及相应结果...............................................................................21表2.5回归分析结果.......................................................................................................21表3.1样品采集及蜜源信息...........................................................................................24表3.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性与定量分析.......................................................28表4.1不同加工工艺节点的取样方式...........................................................................35表4.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性分析...................................................................37VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称HDHydrodistillation水蒸气蒸馏SESolventExtraction溶剂萃取SDESimultaneousDistillationExtraction同时蒸馏萃取USEUltrasound-assistedExtraction,超声波辅助萃取SHSStaticHeadspace,静态顶空PTPurge&Trap吹扫捕集HS-SPDEHeadspaceSolid-phaseDynamicExtraction顶空固相动态萃取SPESolid-phaseExtraction固相萃取SPMESolid-phaseMicroextraction固相微萃取HS-SPMEHeadspaceSolid-phaseMicroextraction,顶空固相微萃取GCGasChromatography气相色谱GC-MSGasChromatography-MassSpectrometry气质联用E-noseElectronicnose电子鼻PBPlackett-BurmanRSMResponseSurfaceMethodology响应面VII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1蜂蜜基本介绍1.1.1蜂蜜的理化性质蜂蜜是由蜜蜂Apismellifera采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，将其贮存于蜂巢内的巢脾中，并经充分酿造而成的（AliferisKA.etal.,2010）。成熟蜂蜜是一种具有浓郁花香味的天然甜物质（CortésME.etal.,2011）。由于蜜源植物的差异，蜂蜜的颜色为浅白色至棕色，大部分蜂蜜的基本色调是琥珀色，还有的略带绿色或红色。在常温下，刚从蜂巢里取出的新鲜蜂蜜是透明或半透明的黏稠状液体，相对密度为1.401~1.443，温度低时会出现部分结晶或全部结晶。1.1.2蜂蜜的化学组成蜂蜜是一种高度复杂的糖类饱和溶液，其中3/4是糖分，1/4是水分。此外，蜂蜜中还含有蛋白质、有机酸、氨基酸、挥发性成分、维生素、色素、蜂花粉、激素等。糖类：蜂蜜中主要以果糖和葡萄糖含量最高，其次是蔗糖(闫玲玲等，2005)。一般情况葡萄糖占总糖分的33%~40%以上，果糖占38%~42%以上，蔗糖占5%以下。蜂蜜中还含有一定量的麦芽糖、海藻糖、松三糖、曲二糖、昆布二糖、异麦芽糖、1-蔗果三糖松二糖、黑曲霉二糖、龙胆二糖等（冯立彬等2004）。此外Salonen等人（2011）发现有痕迹量的潘塘存在于矮丛蓝莓蜜中，四没食子酰基葡萄糖存在于木莓蜜中。水分：成熟蜜的水分通常为18%以下，在南北方不同的气候条件下，成熟蜜的含水量不同，但都不超过21%。常温下，含水量超过20%的蜂蜜容易发酵变质。蛋白质：蜂蜜中的蛋白质含量比较低，约占0.26%，主要是酶类。蜂蜜含有丰富的酶类（章彬佳等，2007），有转化酶（淀粉酶、蔗糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶）、还原酶、脂肪酶等。这些酶主要来源于蜜蜂在酿蜜时所分泌，也有少量是由蜜源植物分泌的。有机酸：蜂蜜中含有多种酸，且绝大多数为有机酸。如荆条蜜中的L-苹果酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、D-苹果酸（朱晓玲等，2010）；在栗树蜜中的4-(1-OH-1-异丙基)-环己烷-1,3-二烯-1-羧酸（TruchadoPetal.,2009）；蓟(Galactitestomentosa)蜜中含量高达(418.6±168.9)mg/kg的苯乳酸（TuberosoCIGetal.,2010）；作为新西兰龙眼蜜的地方性标志成分2-甲氧基丁酸和3-羟基-4-甲基-反-2-戊烯二酸（WilkinsALetal.,1995）。氨基酸：蜂蜜中含有0.1%～0.78%的游离氨基酸，主要是精氨酸、组氨酸、赖氨酸、苏氨酸等17种氨基酸（董蕊等，2011）。不同蜂蜜中所含的氨基酸不同，如爱沙尼亚地区采集的蜂蜜中脯氨酸和苯丙氨酸含量较高（RebaneRetal.,2008），西班牙某地区采集的蜂蜜中主要含有谷氨酸和色氨酸（IglesiasMTetal.,2004），因此，蜂蜜中的氨基酸含量对蜂蜜地域性的标记起到了一定的作用。矿物质：蜂蜜中的矿物质约占0.17%，所含种类较多主要有铁、硫、铜、钾、钠、氯、镁、1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言锌、钙等20余种。槐花蜜、枣花蜜、荆条蜜中含有Fe、Zn、Ca、K、Mg、Na、Cu、Mn（吕文英等，2002）；桂花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜中含有Se、AI、Ba、Mn、Ni等元素（郭岚等，2011）；多种蜂蜜中都存在Se和Mo（陈兰珍等，2008）；摩洛哥蜂蜜中除K、Na、Ca、Mg、Al、Fe和Zn在含量较高外，还含有微量Mn、Cu、Ba、Ni、Cr、Co、Se、As、Ag和Be等元素（ChakirAetal.,2011）；意大利蜂蜜中的K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn和Sr的含量均可达到1mg/kg（PisaniAetal.,2008）。1.1.3我国主要蜂蜜种类洋槐蜜：主要产于山东、江苏、安徽、辽宁、山西等省。水白色，黏稠透明，具有槐花的清香气味，甘甜适口，是我国上等蜜之一，价格高于一般蜂蜜。不易结晶。油菜蜜：我国最主要的蜂蜜品种，分布很广。浅琥珀色，略有混浊。气味清香带青草味，有油菜花香味，味道甜润。极易结晶，结晶粒细腻呈油脂状，结晶蜜呈乳白色。枣花蜜：主要产于河南、河北、山西、山东等省。琥珀色，蜜汁透明，黏稠，具有特殊浓烈气味，味道初食饴糖味，尾味是浓郁的杏仁香味。不易结晶，结晶粒粗。椴树蜜：主要产于东北长白山和兴安岭林区。浅琥珀色，气味浓芳香，味道香甜，是我国上等蜂蜜。结晶洁白细腻似猪油。荆条蜜：主要产于辽宁和华北地区。浅琥珀色，气味芳香，甜而不腻。结晶细腻，结晶蜜呈乳白色。荔枝蜜：主要产于我国亚热带地区的广东、福建、广西、云南、四川、台湾等省。特浅琥珀色，气味清香，带荔枝香味。结晶粒细腻，结晶蜜呈乳白色。龙眼蜜：主要产于广东、福建等省，以福建为最多。浅琥珀色，气味芳香，具有龙眼花的特殊花香气味，味道浓甜，列为蜜中上品。结晶颗粒较细，结晶蜜呈暗乳白色。紫云英蜜：主要产于江苏、浙江、安徽、江西、广东、湖南等省。色淡白，气味清香，味道清淡，略有青草味，甜而不腻。不易结晶，结晶呈细粒状，呈乳白色。棉花蜜：主要产于黄河中下游、长江中下游和新疆等地。琥珀色，香味较淡，味道甜略带涩。容易结晶，结晶为粗粒状，色变白。乌桕蜜：分布较广，以浙江、湖北、河南、贵州、云南、四川等省最多。琥珀色，具有轻微的酵酸味，味道甜中略有酸味，回味较重，润喉较差。易结晶，结晶粒粗，呈暗乳色。芝麻蜜：主要产于黄河及长江中下游，其中河南最多，湖北次之。浅琥珀色，气息淡香，味甜而微酸。结晶后呈乳白色或浅黄色。1.2蜂蜜的挥发性成分1.2.1蜂蜜挥发性成分的组成天然蜂蜜具有特殊的花香气味，主要源于不同的挥发性小分子化合物，这些挥发性化合物属于不同的化学族，如烃类、醛类、醇类、酮类、酸类、酯类、苯及其衍生物、呋喃、吡喃和萜烯2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言类等（MontenegroGetal.,2009）。目前已经有超过600种化合物被鉴定为蜂蜜的挥发性成分（BogdanovSetal.,2004）。1.2.2蜂蜜挥发性成分的提取方法蜂蜜含有大量不同化学成分的挥发性物质，且这些物质浓度大多很低，这就造成了蜂蜜复杂且难以分析（Castro-Várquez,Letal.,2003）。另外，萃取系统不同蜂蜜中的挥发性成分组成会有很大的变化，这是由于每种化合物的挥发性和极性都会显著影响其回收率（Alissandrakis,Eetal.,2005）。鉴于此，对于蜂蜜挥发性成分的分析来讲选择合适的萃取技术是必不可少的。1.2.2.1水蒸气蒸馏法(HD)水蒸气蒸馏法是将蜂蜜水溶液置于烧瓶中直接加热蒸馏，蜂蜜中的挥发性成分随着底部受热产生的水蒸气同时蒸馏出来，收集蒸馏液，再经冷凝、蒸发即得到挥发性成分。此法所需设备简单，操作简便，成本低，是提取挥发性成分非常常用的方法。但是HD蒸馏时间较长，蜂蜜长时间受热其中的糖会发生美拉德反应而产生新的物质，影响挥发性成分的测定。Alissandrakis等人（2005）利用四种提取方法对希腊柑橘蜂蜜进行研究，结果发现HD由于条件相对比较剧烈导致副产物的产生，并不利于挥发性成分的提取。因此，HD在蜂蜜挥发性成分的提取中并不常用。1.2.2.2溶剂萃取法（SE）溶剂萃取法是指利用有机溶剂直接对蜂蜜中的挥发性组分进行萃取。此方法操作简单、不需要昂贵的设备且不需要加热，从而避免了热不稳定化合物在热反应下发生变化。因此，溶剂提取法已经广泛应用于蜂蜜的挥发性成分分析上。如Uçkun等人（2012）采用二氯甲烷作为溶剂对塞利省的蜂蜜进行液液萃取。GC-MS分析结果表明检测到41种芳香化合物包括酸、醇、醛、酮、酚、酯和萜烯等。通常选取非极性或弱极性的有机溶剂将蜂蜜中的芳香物质与糖和水等极性化合[17]物分离，然后再利用气相色谱质谱检测。但是每种物质的极性不同导致很难用一种溶剂就分离出所有的香味物质，而且某些分析物会被溶剂掩盖从而不能被气相色谱检测到，溶解于溶剂中的非挥发性化合物还会污染气相色谱的进样口。1.2.2.3同时蒸馏萃取法（SDE）同时蒸馏萃取法是指同时采用水蒸馏法和溶剂萃取法，将水蒸气蒸馏和有机溶剂抽提结合起来。此法是同时加热样品溶液和有机溶剂使之沸腾，由Licken和Nickerson于1964年提出的。将样品置于连接在装置一边的烧瓶中，另外一边连接的烧瓶中盛装溶剂，两边同时进行加热使水蒸气和溶剂蒸气同时冷凝后在装置中的U形管分开并流向两侧，这样只需少量溶剂便可实现大量样品的提取。在前人的文献中已经报道过SDE方法用于分离蜂蜜中的挥发性成分（Cuevas-GloryLFetal.,2007）。由于SDE在提取过程中需要加热，所以很容易产生新的物质且敏感物质容易被氧化。为了避免糖类物质的干扰，Bicchi等人（1983）采用两步法进行萃取，第一步利用丙酮萃取蜂蜜样品，第二步再将提取物在Likens-Nikerson装置中蒸馏萃取。由于热处理会产生美拉德反应的产物且样品在蒸馏过程中容易分解变性，Maignial等人（1992）将Likens-Nikerson装置改进为常温真空蒸馏。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言此后，Bouseta和Collin（1995）又对改进过的Bicchi法进行了改进。他们在惰性气体保护下用二氯甲烷代替丙酮进行萃取。结果发现与丙酮提取的样品相比非酶褐变产生的呋喃衍生物减少了。随后，Guyot等人（1998,1999）使用这种方法研究了栗树和椴树蜂蜜及石楠科不同种蜂蜜的挥发性成分。李成斌等人(2006)也采用同样的方法并利用GC-MS对八种中国蜂蜜的挥发性成分进行检测。1.2.2.4超声波辅助萃取法（USE）超声波辅助萃取法是利用超声波的机械效应搅动萃取溶剂，通过空化作用加强溶剂渗入基质从而加速目标成分进入溶剂。USE显著减少了提取时间，大大提高了萃取效率，而且不需要加热可以避免发生美拉德反应从而产生其他物质。另外，由于没有经过加热，分离出的挥发性和半挥发性物质可以用于鉴别蜂蜜种类（Alissandrakis,Eetal.,2005）。近年来，USE已经被广泛应用到蜂蜜的挥发性成分分析上。Alissandrakis等人（2003）以正戊烷和乙醚为溶剂利用USE对柑橘花和柑橘蜂蜜中的挥发性成分进行提取。Jerković等人（2007）也用同样的方法研究两种单花蜜的挥发物。涂世等人（2011）还利用USE建立了油菜蜂蜜挥发性成分的指纹图谱。1.2.2.5静态顶空法(SHS)静态顶空法是将样品置于密闭容器中，在一定压力、时间、温度等条件下，对容器上方达到平衡态的气体进行检测。该方法无需溶剂的处理不会造成污染，快速方便，对色谱柱伤害也较小，能够准确反映样品的挥发性成分真实信息。但是SHS灵敏度不够高，只能检测高浓度的挥发性成分才能被检测到。Rowland等人（1995）早已证明SHS的分析在蜂蜜中没有得到广泛的应用，这是因为蜂蜜中的挥发性成分浓度较低且一些半挥发性化合物回收率很低。1.2.2.6动态顶空法(DHS)动态顶空法又称为吹扫捕集法（PT），此法将惰性气体如氮气不断通过待测样品，挥发性成分随着气流进入装有固体吸附剂的捕集器，吸附剂会选择性地吸附样品组分，富集了挥发性组分的吸附剂进行加热解吸，并由载气倒入GC-MS、电子鼻等分析仪器（Cuevas-GloryLFetal.,2007）。DHS取样量少、灵敏度高、富集效率高，且对挥发性和半挥发性的分离和鉴定表现出很大的优势，因此被广泛应用于蜂蜜挥发性化合物的分析上（RadovicBSetal.,2001）。Bouseta等人（1992）对不同国家的84种蜂蜜中的挥发性化合物进行萃取和分析，结果得到醛类、酮类、醇类、酯类、环状化合物、碳水化合物和氯化化合物。虽然醛类和醇类化合物可能与微生物活性、蜂蜜加热和长时间的放置导致发酵等因素有关，但是一些醛类化合物仍然可以作为蜂蜜的蜜源特征性成分。TMBianchi等人（2005）利用Carbopack作为吸附剂，鉴别出撒丁岛草莓树蜂蜜的特征标记主要为萜烯类化合物。Soria等人（2008）确定了22个来自8种蜜源的商业蜂蜜样品中的挥发性成分并得出结论DHS结合GC-MS分析可用于确定蜂蜜的植物来源。1.2.2.7顶空固相动态萃取法（HS-SPDE）顶空固相动态萃取法是一种新型的无溶剂技术，使用一根内部带有聚合物膜的空心针，挥发性成分通过注射器柱塞的反复抽吸、排出产生的气体聚集在膜上，然后再导入到GC-MS进行检测。与顶空固相微萃取相比，HS-SPDE具有更强的耐受性，并且可以为吸附的挥发性物质提供表面区域，还可以通过改变聚合物的量增加吸附量（Cuevas-GloryLFetal.,2007）。该方法已成功应用于食品基质中的顶空采样并提供了良好的重复性（BicchiCetal.,2004）。然而，由于该方法较新暂时还没有广泛用于蜂蜜挥发性成分分析中。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2.2.8固相萃取法(SPE)、固相微萃取法（SPME）、顶空固相微萃取法（HS-SPME）固相萃取法是利用高选择性的固相吸附剂对样品中的目标化合物进行吸附，然后再用洗脱液洗脱，从而分离和富集目标化合物。该法避免了热处理且具有减少有机溶剂用量及环境污染等优点，因而被广泛用于蜂蜜挥发物检测分析中。Vázquez等人（2006）利用SPE并通过GC-MS检测发现羟基酮（尤其是3-羟基-2-丁酮）和萜烯（3-氧代-α-紫罗兰酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、氧代异氟尔酮和4-羟基-异佛尔酮）是桉树蜂蜜的特征挥发性成分。Castro等人（2014）利用SPE与GC-MS结合可以从薰衣草蜂蜜中鉴别出杂薰衣草蜂蜜，并指出γ-壬内酯、金合欢醇和香草乙酮可作为薰衣草蜂蜜的蜜源标记物。固相微萃取法是在固相萃取基础发展起来的一种使用有机溶剂的用量更少甚至不使用有机溶剂的技术。SPME可用于气体、液体和固体样品中的极性和非极性化合物的萃取，主要优点为快速、操作简单、灵敏度高、成本低，而且采样范围广可用于室内采样和室外采样（Pontes,Metal.,2007）。此外,它可以很容易地被结合到各种分析仪器上,如气相色谱,气相色谱-质谱、高效液相色谱、液相色谱-质谱和气相色谱-嗅闻（Cuevas-GloryLFetal.,2007）。Lušic等人（2007）利用SPME结合GC-MS对克罗地亚酸橙树蜂蜜、冷杉蜜露蜂蜜和鼠尾草蜂蜜的挥发性成分进行定性定量。粟有志等人（2011）也采用SPME-GC-MS分析了新疆地区沙枣蜜、油菜蜜、葵花蜜以及棉花蜜的挥发性成分，并指出芳樟醇、2-(1,1-二甲基)-环己醇和联苯为沙枣蜜的特征性挥发组分；雪松醇为油菜蜜的特征性挥发物质；葵花蜜的特征性挥发物质为4-萜品醇、9-(3,3-二甲基-环氧乙烷-2-烷基)-2,7-二甲基-九碳-2,6-二烯醇、2-莰烯、1-甲基-4-异丙烯基苯、桃金娘烯醇、α,α,4-三甲基-2,4-环己二烯-1-甲醇和α-萜品醇，其中4-萜品醇是葵花蜜最显著的特征性挥发物质；3-苯基丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醇为棉花蜜的特征性挥发组分。顶空固相微萃取法是SPME最合适的取样方式，由于它避免了基质中非挥发性化合物对纤维的不利影响而且即使改变条件如PH也不会对纤维有影响（Manyi-LohCEetal.,2011）。因此许多研究者将HS-SPME应用于提取蜂蜜中的挥发性化合物，是目前最常用最有效的提取方法。Pino等人（2012）通过HS-SPME与GC-MS和GC-O分析黑皮红树蜂蜜的气味活性化合物，得出结论(E)-β-大马酮、壬醛和癸醛是对其香气贡献最大的气味活性化合物。Luis等人（2012）通过HS-SPME与GC-MS分析墨西哥尤卡半岛三种单花蜜，结果发现通过对苯甲醛、壬醛、对-伞花烃、辛酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、苯乙氰、辛酸乙酯、乙基苄基甲酮、2,3-二甲氧基甲苯和苯乙酸等21种挥发性化合物进行主成分分析可以有效地区分这三种单花蜜。YangY等人（2014）利用HS-SPME提取41种采集于4月到6月的科西嘉―春天‖蜂蜜并进行分析，发现―春天‖蜂蜜的主要挥发性化合物为苯乙醛、苯甲醛和甲苯。1.2.3蜂蜜挥发性成分的分析方法1.2.3.1气相色谱技术（GC）气相色谱技术的发展对挥发性成分的研究起到了积极的推动作用。气相色谱技术是利用不同物质在固定相和流动相分配系数的差别，使不同化合物从色谱柱流出的时间不同，以达到分离目的，其最大的特点就是具有高效的分离能力和良好的灵敏度，但是也具有一定的局限性，对分离5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的成分做进一步的具体分析时还是具有一定程度的困难，比如核磁或是红外等。夏立娅等人（2010）利用GC对枣花蜂蜜的挥发性成分进行分析并且建立了枣花蜂蜜挥发性成分的指纹图谱。1.2.3.2气质联用技术（GC-MS）气质联用技术是一个对复杂化合物高效定性定量的分析工具，充分发挥了气相色谱法高分离效率的优点和质谱法定性专属性的能力，兼有两者之长，因而解决问题能力更强，具有更大的优势，为广大分析工作者提供了一个进行复杂化合物高效的定性定量分析工具。Alissandrakis等人（2005）利用GC-MS在希腊棉花蜂蜜中检测到110种化合物，其中肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸和苯丙醇等15种化合物可以区分希腊9个地区的棉花蜂蜜。Wolski等人（2006）采用GC-MS技术研究4种不同类型的蜂蜜，结果检测到86种挥发性成分，包括醇类、酮类、有机酸类、酯类和烷烃类。Jerković等人（2009）对克罗地亚地区的滨枣蜂蜜进行研究，经GC-MS检测到79种挥发物，其中壬醛、丁香醛异构体、癸醛、壬酸甲酯、己酸和2-乙基乙酸含量较高，有可能是滨枣蜂蜜的植物源标记物。1.2.3.3电子鼻技术（E-nose）电子鼻（Electronicnose,E-nose）是一个新颖的分析、识别和检测复杂气味和挥发性成分的传感器阵列形式的电化学传感系统，它由气敏传感器阵列、信号预处理单元和模式识别三部分组成。气敏传感器阵列首先接触到气味分子并接收到信号，然后由信号预处理单元处理传输过来的]信号，接着再把处理后的信号传到模式识别单元完成对待测气体的最终分。它得到的不是被测样品中某种或某几种成分的定性或定量的结果，而是样品中挥发性成分的整体信息，也称―指纹信息‖（HaugenJEetal.,2006）。它可以在几小时、几天甚至数月的时间内连续、实时地监测特定样品的气味状况。电子鼻技术前处理简单、所需样品量小、灵敏度高，目前在食品的挥发性化合物的研究领域中广泛应用，如腊肠，绿茶，橄榄油，白松露等（TaurinoAMetal.,2003;YangZetal.,2009;HaddiZetal.,2011;PennazzaGetal.,2012）。在蜂蜜的应用中，Ampuero等人（2004）利用E-nose可以对金合欢蜜、栗子蜜、蒲公英蜜、酸橙蜜、冷杉蜜和油菜蜜进行区分，且样品判别率达到了98%。Benedetti等人（2004）同样利用E-nose能够良好地区分刺槐蜜、杜鹃花蜜和柑橘蜜。1.2.4蜂蜜挥发性成分的重要性1.2.4.1蜂蜜植物和地理来源的确定蜂蜜的香气大大影响消费者的喜好，然而其通常被作为混合花蜜推向市场，因此就很难确定植物来源（Cuevas-GloryLFetal.,2007）。蜂蜜的植物来源是评价其质量的重要特征体现。事实上，消费者是基于高度依赖于植物来源的感官特征来评价蜂蜜质量的（Baroni,M.Vetal.,2006）。相同蜜源的蜂蜜会有所不同在某种程度上来说也是由于其地理来源的不同造成的（Castro-Várquez,L.Metal.,2010）。单花蜜具有特殊的挥发性成分可以给出特征信息（Piasenzotto,Letal.,2003），因此这些大量的挥发性化合物可以用来区分植物来源和地理来源。目前已经有许多分析方法用于确定蜂蜜的植物和地理来源，如花粉分析、理化性质分析（SoriaACetal.,2004;FeásXetal.,2010）、感官评价（Castro-VázquezLetal.,2009;AnupamaDet6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言al.,2003）、稳定同位素测定分析（PadovanGJetal.,2003;SchellenbergAetal.,2010）等。其中主要的分析方法是花粉分析。然而，花粉分析是非常昂贵、耗时的，而且对于分析者的判断力有很强的依赖性从而会造成结果各执一词。另外，还需要一个―花粉图书馆‖进行比对（Baroni,M.Vetal.,2006）。更主要的是，有些蜜源的蜂蜜中很少出现花粉，如柑橘、薰衣草和迷迭香（Pérez,R.Aetal.,2002）。Guyot等人（1999）指出在某些情况下花粉分析是没有用的尤其表现在当蜂蜜来自比较贫瘠的植物时。因此，利用更广泛的标记物来确定蜂蜜的植物和地理来源是必不可少的。表1.1单花蜜的挥发性成分标记物Table1.1.Thevolatilecomponentmarkersofunifloralhoney蜜源植物/国家标记物萃取技术鼠尾草（克罗地亚）苯甲酸、苯乙酸USE(Jerković,Jetal.,2006)油菜（中国）苯甲酸-4-羟基-3,5-二甲氧基-酰肼USE(涂世等.,2011)桉树3-羟基-2-丁酮、α-紫罗兰酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、氧（西班牙）SPE代异氟尔酮、4-羟基-异佛尔酮(VázquezLCetal.,2006)薰衣草（西班牙）γ-壬内酯、金合欢醇、香草乙酮SPE(Castro-VázquezLetal.,2014)橡树蜜汁（西班牙）反式橡木内酯SDE(Castro-VázquezLetal.,2006)柑橘芳樟醇、氧化芳樟醇、a-松油醇、松油醇、（西班牙）SDEα-甜橙醛、β-甜橙醛、丁香醛和丁香醇的异构体(Castro-VázquezL.,2007)薰衣草桉树橙花叔醇氧化物SDE（西班牙）3-蒈烯-2-醇,对伞花烃及其衍生醇(Castro-VázquezLetal.,2009)野桂花庚醇、8-羟基香芹艾菊酮、（中国）HS-SPME2-蒎烯-4-酮、薄荷烷-1,8-二醇(张丽珍等.,2012)百里香1-苯基-2,3-丁二酮、苯乙腈、香芹酚、（希腊）HS-SPME3-羟基-4-苯基-2-丁酮、3-羟基-1-苯基-2-丁酮(AlissandrakisEetal.,2007)金合欢荞麦己醛酸橙戊醛、糠醛、2-乙基已醇HS-SPME油菜对甲基苯乙酮（波兰）对伞花烃(Wardencki,Wetal.,2009)柑橘丁香醛、薰衣草内酯、茴香醚、氨茴酸甲酯、（希腊、意大利）SPME橙花叔醇和对-1-孟烯-9-醛的4个异构体(AlissandrakisEetal.,2007)松树（土耳其）壬醛、苯、2-庚酮、α-蒎烯、4-己烯-3-醇SPME(SiliciS.,2011)7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言酸橙树对甲基苯乙酮、香荆酚、8-对薄荷烯-1,2-二醇蒲公英苯乙腈栗树氨基苯乙酮SPME桉树壬酸、乙偶姻（意大利）(Piasenzotto,Letal.,2003)沙枣芳樟醇、2-(1,1-二甲基)-环己醇、联苯油菜雪松醇葵花4-萜品醇SPME棉花3-苯基丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醇（中国）(粟有志等.,2011)石楠（英国、法国、德国、荷兰）4-甲基双环[2,2,2]辛-1-醇、乙酸-4-乙基苯酚酯DHS(RadovicBSetal.,2001)桉树（意大利、西班牙）1-辛烯、2,3戊二酮DHS(RadovicBSetal.,2001)[28]迷迭香（葡萄牙、西班牙）2-乙酰呋喃DHS(RadovicBSetal.,2001)[28]金合欢顺式芳樟醇氧化物、庚醛、（法国、德国、意大利）DHS二甲基二硫化物、苯乙醛(RadovicBSetal.,2001)1.2.4.2对蜂蜜生物医学活性的贡献蜂蜜自古代以来就作为一种有效的药物被人们所利用，这是由于它具有抗氧化性、抗炎性、抗菌性和免疫调节的作用（Manyi-Loh,C.Eetal.,2011）。蜂蜜挥发性成分对于其生物医学活性有贡献的主要是萜类及其衍生物和苯衍生物（Castro-VázquezLetal.,2006）萜类是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物，分为单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜，其中单萜是最重要且最容易研究的萜类化合物。（Manyi-LohCEetal.,2011）单萜类成分已经在许多蜂蜜样品中被鉴定出来，如芳樟醇及其衍生物、β-松油醇、二氢香草醇、β-香茅醇、香茅醛、香叶基丙酮、柠檬烯、蒎烯、四青香叶醇、香芹酚、对伞花烃、1,8-桉油酚、异龙脑、樟脑、香荆芥酚等（Castro-VázquezLetal.,2006;Peña,R.Metal.,2004）。这些挥发性成分可以抑制广泛的微生物包括革兰氏阴性和阳性细菌、病毒和真菌（Inouye,S.etal.,2001;AbdEl-Moaty,H.Ietal.,2010）。此外，柠檬烯对预防乳腺、肝、肺等癌症的病情加重有一定的作用。（Tholl,D.,2006）挥发性苯衍生物在一些蜂蜜中是很重要的。（D’Arcy,B.Retal.,1997）如4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸酯和3,4,5-三甲氧基苯甲酸酯是在新西兰本地蜂蜜中检测到的两个主要的抗菌化合物（Castro-VázquezLetal.,2006）。在南非蜂蜜中鉴定出了噻吩和N-甲基-D3氮杂环丙烷，它们是天然产物和药物的合成中作为重要的前体（34）。这些药物具有重要的生物医学活性包括抗病毒、抗菌、抗真菌、抗肿瘤等（Bondock,Setal.,2010）。另外，蜂蜜中的挥发性成分能被用于环境污染的标记物。Bentivenga等人（2004）报道从巴斯利卡塔蜂蜜中鉴定出的芳香烃是环境污染的一个指示，因此被用来监控原油开采造成的环境污染。1.2.4.3对蜂蜜香气或风味的贡献8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言蜂蜜的香气或风味依赖于其挥发性和半挥发性化合物（Jerković,Jetal.,2006）。与其他食品一样，对于感官品质而言，香气描述是蜂蜜最典型的特征之一，是其在食品工业中应用的重要品质，也是消费者选择的一个标准（PlutowskaBetal.,2011）。单花种蜂蜜具有很高的特征香气，挥发性物质是影响香气的主要因素，与其他因素如味道和物理因素一样对风味有贡献（Baroni,M.Vetal.,2006;Jerković,Ietal.,2010）。蜂蜜的香气是极为复杂的,涉及很多挥发性化合物并且大大依赖于分离的过程（Castro-Várquez,L.etal.,2003;Kaskonienė,Vetal.,2008）。然而，不是所有的挥发性化合物对蜂蜜香气都有显著的影响，主要取决于其浓度与阈值的关系。因此，即使浓度很低的化合物也可能对蜂蜜香气的贡献很大（Kaškonienė,Vetal.,2010）。此外，来自不同地区的蜂蜜香气特征，应该基于天气条件的变化，是否靠海和养蜂技术来考虑（Castro-Várquez,L.Metal.,2010）。Castro-Várquez等人（2010）利用与香气相关的一些挥发性化合物的浓度和感官特征中的显著差异，将来自于西班牙的东北、西北和东南部地区的栗子蜂蜜进行了区分。总而言之,许多消费者在寻求高品质产品时会将清晰的区域标志和感官品质与产地联系起来。因此，这是养蜂业给消费者提供具有特殊地理特征和更高品质（香气或风味）的蜂蜜的最大利益所在（Donarski,J.A.etal.,2010）。1.3本文研究的意义及主要内容1.3.1本文研究的意义蜂蜜一般根据蜜蜂所采集的蜜源植物进行分类，主要蜜源来自单一植物的称为单花蜜，来自多种植物的为百花蜜或杂花蜜（曹炜等，2002）。中国是世界上的养蜂大国,蜂群数量、蜂蜜产量、养蜂从业人员和蜂蜜出口4个指标均居世界前列。而且蜂蜜品种种类和数量繁多，分布广泛，这得益于我国辽阔的国土、优越的地理气候以及丰富的蜜源植物。据不完全统计，我国能被蜜蜂利用的蜜源植物约5千种以上，能取到商品蜜的蜜源植物有100多种（ZhangFX,1998）。但数量较多，流蜜多，花期较长的主要蜜源植物产出的蜜约有20多种。不同蜜源蜂蜜的感官特征、营养价值有差异，受消费者欢迎程度也不同（陈兰珍，2010）。本研究拟解决的主要问题是通过HS-SPME和GC-MS对我国三种大宗蜂蜜及17种不同蜜源蜂蜜的挥发性成分进行分析。全面描述我国主要蜜源蜂蜜的挥发性成分特征，可以为建立蜂蜜品种鉴别和品质评价提供一定的理论基础，对有效指导蜂蜜市场价格、提高我国蜂蜜商品价值以及市场竞争力等均具有重要的理论价值和实践意义。随着生活水平的提高，人们对蜂蜜的需求量增长迅速，对其食用品质的要求也越来越高。生产者不得不对蜂蜜的产品质量和生产能力进行现代化升级，以适应市场的需求（叶振生，2003）。与其他食品一样，蜂蜜具有独特的感官和香气特征，决定着消费者的喜好（BertonceljJetal.,2011）。如何能够保证蜂蜜在商业化加工过程中的纯正性，即特征风味组分不损失或少损失，成为蜂蜜加工领域改进工艺的一个重要出发点。用科学方法从巢脾中取出的成熟蜂蜜（波美度大于42），通常能保持其固有的营养和风味（曾哲灵等，2006）。但是，实际生产中由于质量价格9 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言体系的不合理，促使蜂农生产出大量不成熟蜂蜜（波美度低于40），其产品须经过合理的加工，才能有效地提高品质和延长货架期。为此，通过对蜂蜜加工工艺各个节点的样品进行风味分析，有助于明确蜂蜜中有效挥发性成分的损失环节，改进生产工艺，提高商品化蜂蜜的质量。1.3.2本文研究的主要内容1·通过单因素试验，采用Plackett-Burman设计和响应面分析法确定枣花蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件。2·通过HS-SPME和GC-MS对我国17种不同蜜源蜂蜜的挥发性成分进行分析。3·通过HS-SPME和GC-MS对马占相思树蜂蜜加工工艺不同节点样品的挥发性成分进行分析并优化加工工艺。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化由于萃取条件不同，对相同材料的分析结果差异很大（李明等，2006；张红梅等，2009），因此有必要对HS-SPME萃取条件进行优化研究，以期更真实、高效地反映挥发性组分的成分和含量。尽管不少学者已对蜂蜜挥发性成分HS-SPME法的萃取条件进行了优化（梁虹瑜等，2012；孙雨安等，2013），但到目前为止，所采用的优化方法都是每次只改变一个因素的逐因子实验，只能比较各因素中选定的水平优劣，无法提供未考察的其他因素区域的信息。Plackett-Burman(PB)设计法经济有效，从众多的影响因素中筛选出主要的影响因子只需要通过较少的实验次数。Williams将其与随机平衡实验、部分因子实验相比较，认为PB法在筛选实验重要因子方面最为有效和准确。另外，该方法还具有数据处理简单，以及可适用于任意多个实验因子等优点（WallsIetal.,1998）。响应面法(ResponseSurfaceMethodology)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过分析回归方程来寻求最优工艺参数，是以最经济的方式，很少的试验次数和时间对试验进行全面研究的，并且会得出明显的结论，因其提供了响应面区域内的必要信息、扩展了有限的资源从而十分高效，已被广泛地用于同时存在多个因素影响的试验优化上（KhuriAIetal.,2010）。因此，为了进一步准确研究蜂蜜的挥发性成分，本实验首先进行单因素试验，在单因素试验结果的基础上，采用PB设计法筛选出对蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取条件有显著效应的因子,再利用响应面设计法对有显著效应的关键因子进行进一步的优化，从而确定蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件，使分析更加高效、灵敏、准确，为分析蜂蜜的挥发性成分打下基础。2.1材料与方法2.1.1材料与试剂枣花蜜于2013年6月在甘肃临泽县小河镇蜂场采收2.1.2仪器与设备AR5120电子天平美国Ohaus公司；7890AGC/5975CMS气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司；手动固相微萃取(SolidPhaseMicro-Extraction，SPME)装置、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取纤维头美国Supelco公司；PC-420D加热磁力搅拌器美国Corning公司。2.1.3方法2.1.3.1原材料预处理将样品放在室温下，使样品呈均匀液体状态，摇匀、备用。2.1.3.2萃取头老化11 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃头在首次使用时需在气相色谱的进样口进行老化，温度为270℃，时间为1h。2.1.3.3萃取方法准确称取一定量的蜂蜜样品置于15mL的顶空瓶中，在预先设定好温度的加热磁力搅拌器上平衡一定的时间，将老化好的固相微萃取针插入样品瓶中大约1cm处(不要接触到样品，以免污染针头)，推出萃取头，在设定温度下顶空吸附预制时间，收进萃取头后，拔出针头，迅速置于插入气相进样口(另外萃取头每次插入衬管的长度需保持不变，一般可利用固相微萃取自带的橡胶圈将针头伸出长度固定到1.5cm左右，确保实验的可重复性)，250℃下解析一定时间。2.1.3.4气相色谱条件色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱(30m×250μm，0.25μm)；初始温度40℃，保持2min，4℃/min升温到160℃，保持2min，再以10℃/min升至250℃，保持5min。进样口温度250℃；载气He，流速1.5mL/min，压力11.962psi，不分流。2.1.3.5质谱条件电离方式EI；电子能量70eV；离子源温度230℃；接口温度280℃；扫描质量范围35～500u。2.1.4试验设计2.1.4.1单因素试验设计2.1.4.1.1萃取温度的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定样品量为5g，平衡5min，搅拌速度为650rpm，萃取40min，解析5min，分别在萃取温度为40、50、60、70、80℃的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳萃取温度。2.1.4.1.2萃取时间的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定样品量为5g，平衡5min，搅拌速度为650rpm，萃取温度为60℃，解析5min，分别在萃取时间为20、30、40、50、60min的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳萃取时间。2.1.4.1.3样品量的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定平衡5min，搅拌速度为650rpm，萃取温度为60℃，萃取50min，解析5min，分别在样品量为2、3、4、5、6g的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳样品量。2.1.4.1.4样品与去离子水质量比的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定样品量为5g，平衡5min，搅拌速度为650rpm，萃取温度为60℃，萃取50min，解析5min，分别在样品与去离子水质量比为1:0、10:1、5:1、2:1、1:1的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳样品与去离子水质量比。2.1.4.1.5NaCl添加量的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定样品量为5g，样品与去离子水质量比为10:1，平衡5min，搅拌速度为650rpm，萃取温度为60℃，萃取50min，解析5min，分别在加入NaCl0、0.3、0.6、0.9、12 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化1.2g的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳NaCl添加量。2.1.4.1.6搅拌速度的确定按照2.1.3.3的萃取方法，设定样品量为5g，样品与去离子水质量比为10:1，加入NaCl0.6g，平衡5min，萃取温度为60℃，萃取50min，解析5min，分别在搅拌速度为350、500、650、800、950rpm的条件下进行萃取，通过比较GC/MS中总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积来确定最佳搅拌速度。2.1.4.2PB设计利用PB设计法进行试验设计，在单因素试验的基础上，确定PB试验设计的因素水平，对影响HS-SPME的6个因素，即萃取温度(A)、萃取时间(B)、样品量(C)、样品与去离子水质量比(D)、NaCl添加量(E)和搅拌速度(F)进行考察，每一个因素各取两个水平，即低水平(-1)和高水平(+1)，总峰面积作为响应值Y，筛选得到对萃取效果影响显著的因素。试验设计及数据分析采用Minitab16.0软件辅助完成。2.1.4.3Box-Behnken响应面设计采用Box-Benhnken中心组合试验设计原理，通过PB试验筛选得到的对萃取效果影响显著的因素，以及作为响应值的色谱总峰面积进行响应面分析，确定蜂蜜HP-SPME法萃取挥发性成分的最佳萃取条件。由Design-Expert软件辅助完成试验设计、数据分析及模型建立。2.2结果与分析2.2.1单因素试验2.2.1.1萃取温度的确定13 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.1萃取温度对总峰面积的影响Fig.2.1Effectsofextractiontemperatureonthepeakarea萃取温度是影响HS-SPME萃取效率的重要因素，萃取温度对HS-SPME的影响具有两面性：一方面温度升高，液体内分子的热运动会加快，使气相中的组分含量升高，有利于分析物在基质中的扩散，从而提高吸附效率，同时，温度升高加强了扩散和对流，能够缩短平衡时间、加快分析速度；另一方面，温度升高会使分析物在涂层与基质中的分配系数降低，涂层对分析物的吸附能力减小，从而引起涂层中某些挥发性成分的脱附，影响HS-SPME的灵敏度，而且温度过高会使样品易发生化学变化，破坏原有挥发性物质或产生一些热裂解产物，不利于分析检测。因此需综合考虑，选取一个平衡点作为最佳温度。从图2.1可以看出，一方面当萃取温度为60℃时总峰面积最大，而峰个数随着温度的升高逐渐增多，但是60℃到80℃峰个数增加的幅度很小，这可能是由于蜂蜜中含有大量果糖和葡萄糖，同时又含有一定量的水分，温度过高使样品发生美拉德、热裂解等化学反应，从而产生一些热裂解产物；另一方面，样品中的主要挥发物质基本与总峰面积变化趋势基本一致，苯甲醇、壬醛、3-氨基吡啶和γ－乙烯基丁内酯的峰面积均在60℃时达到最大，苯甲醛的峰面积在80℃时比60℃时高一些，但对整体不产生影响。因此，综合考虑本试验选择60℃作为萃取温度。2.2.1.2萃取时间的确定14 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.2萃取时间对总峰面积的影响Fig.2.2Effectsofextractiontimeonthepeakarea萃取时间即萃取达到平衡所需的时间,决定萃取时间的因素有很多，包括样品基质、物质的扩散速率、样品体积、待分析物的分配系数、不同萃取头膜厚和吸附能力以及涂层的物理化学性质等。一般情况下在萃取过程的初始阶段，挥发性组分很容易富集到固定相的涂层上，吸附量会迅速增大，但随着时间的延续，其富集的速度也会逐渐变慢，进而接近吸附平衡，作为一个转折点，吸附平衡后时间的增加就不会对吸附量产生大的影响。从图2.2可以看出，一方面萃取时间为50min时总峰面积最大且峰个数最多，60min时峰面积明显降低是由于随着时间延长部分挥发性成分会从萃取头上解析出来，而且蜂蜜中自由水和结合水的蒸发析出，使纤维头凝结水滴，大大降低了纤维头对挥发性芳香物质的吸附，从而造成总峰面积的降低和物质种类的减少；另一方面样品中的主要挥发物质的峰面积均在50min时达到最大，与总峰面积的变化趋势基本一致。因此，综合考虑本试验选择50min作为萃取时间。2.2.1.3样品量的确定15 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.3样品量对总峰面积的影响Fig.2.3EffectsofsampleamountonthepeakareaHS-SPME萃取中，分析物挥发性成分的吸附量受到样品量及顶部空间体积的直接影响，取样量太小，分析物通过顶空基质吸附到萃取涂层的质量浓度就小，进而萃取涂层对分析物的吸附量就会变小小，很难达到吸附平衡，从而会使萃取灵敏度较低；取样量太大，顶空体积就会变小，小分子竞争吸附不仅会影响大分子物质的吸附还会影响其定性，而且样品取样量较大时可能接触萃取涂层，引起污染。故选择合适的样品量便可准确定性。从图2.3可以看出，一方面样品量为5g时总峰面积最大且峰个数最多，样品量为2g时，顶空体积大，挥发性成分容易挥发出来造成峰个数较多，但是由于浓度太小导致总峰面积过小，而样品量为6g时，顶空体积变小，挥发物的浓度增加，导致含量高的挥发性化合物吸附较多而其他一些挥发性化合物可能未被吸附，从而造成总峰面积的降低和物质种类的减少；另一方面样品中的主要挥发物质苯甲醇、壬醛和3-氨基吡啶的峰面积均在样品量为5g时达到最大，与总峰面积的变化趋势基本一致，而苯甲醛和γ－乙烯基丁内酯的峰面积在样品量为3g时比5g时大，可能是由于峰个数变多导致，但变化幅度很小，对整体影响不大。因此，综合考虑本试验选择5g作为样品量。2.2.1.4样品与去离子水质量比的确定16 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.4样品与去离子水质量比对总峰面积的影响Fig.2.4Effectsofsampleanddeionizedwatermassratioonthepeakarea蜂蜜为粘稠状液体，由于粘度大，分析物中的挥发性成分不易被释放出来，提取的组分就会很少，峰面积也较小，但是加水量过多，蜂蜜的粘度下降，虽然利于挥发性成分的释放，但是会使蜂蜜的浓度变小，挥发性成分的浓度随之变小，进而使萃取涂层的吸附量变小，降低HS-SPME的灵敏度。因此加入适量的去离子水有利于搅拌和香味成分从分析物中释放。从图2.4可以看出，一方面总峰面积和峰个数随着去离子水质量的增加先增加后减少，在样品与去离子水质量比为10:1时总峰面积最大且峰个数最多，随着去离子水质量的增加有利于挥发性成分的释放，但是浓度降低使有些含量少的挥发性成分无法吸附到萃取涂层上，从而造成总峰面积的降低和物质种类的减少；另一方面样品中的主要挥发物质苯甲醛和壬醛的峰面积在样品与去离子水质量比为10:1时总峰面积达到最大，苯甲醇和γ－乙烯基丁内酯在继续增加去离子水质量后没有检出，说明稀释后含量变低，不在HS-SPME灵敏度范围内，3-氨基吡啶的峰面积随着去离子水质量的增加而逐渐减少，但减少幅度很小，对整体没有影响。因此，综合考虑本试验选择样品与去离子水质量比为10:1。2.2.1.5NaCl添加量的确定17 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.5NaCl添加量对总峰面积的影响Fig.2.5EffectsofNaCladditiveamountonthepeakarea溶液的离子强度改变会改变挥发性组分在液相和气相中的分配系数，氯化钠等无机盐的加入会降低香气物质在分析物液相中的溶解度，有利于物质从液相向气相中转移，香气物质更容易挥发，促进萃取头吸附平衡正移动，提高香气物质吸附量，并且对于低挥发性及低含量物质的吸附具有一定的作用，强化HS-SPME分析的灵敏度，以获得更全面的分析物香气物质信息。从图2.5可以看出，一方面NaCl的添加量为0.3g时总峰面积最大，峰个数随着NaCl添加量的增加先增加后减少，在NaCl的添加量为1.2g时峰个数又再次增加，但是峰面积变小，说明分析物中的挥发性成分含量变低，可能造成有些本来含量很高的主要挥发性成分含量变低；另一方面样品中的主要挥发物质的峰面积均在NaCl的添加量为0.3g时达到最大，与总峰面积的变化趋势一致。因此，综合考虑本试验选择NaCl添加量为0.3g。2.2.1.6搅拌速度的确定18 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化A.总峰面积和峰个数B.主要挥发物质峰面积图2.6搅拌速度对总峰面积的影响Fig.2.6Effectsofstirringspeedonthepeakarea蜂蜜的粘度很大，在不搅拌的情况下分析物中的挥发性成分不易挥发，搅拌可以促进分析物均匀化，使挥发性成分能够更快地脱离分析物以达到气-液分配平衡，提高对挥发物的检测效率，但当萃取头吸附饱和后转速对其萃取效果就不明显了，而且转速太高还会引起整个HS-SPME装置的稳定性变差。从图2.6可以看出，一方面峰个数随着转速的增大先增加后减少，在搅拌速度为650rpm时达到最大值，而总峰面积在搅拌速度为950rpm时达到最大，但是峰个数却比650rpm时少了69个，说明一些含量高的挥发物质含量变的更高，从而含量低的挥发物质难以被吸附，或是吸附后由于含量过低检测不到；另一方面苯甲醛、苯甲醇、壬醛和3-氨基吡啶的峰面积都在搅拌速度为950rpm时比650rpm时有所增加，说明950rpm时总峰面积的变大只是含量高的挥发物质峰面积变大而造成的。因此，综合考虑本试验选择搅拌速度为650rpm。2.2.2PB设计确定关键影响因素2.2.2.1PB试验设计处理及相应值在单因素试验的基础上，确定PB试验设计的因素和水平，由于峰个数及主要挥发物质的峰面积的变化情况与总峰面积基本一致，故只选择总峰面积作为响应值，PB试验设计及相应值见表2.1。表2.1Plackett-Burman试验设计及相应值Table2.1Plackett-BurmantestdesignandresultsD样品与去试验ENaCl添加A萃取温度B萃取时间C样品量离子水质量G搅拌速度总峰面积号量比11（70℃）1（60min）-1（4g）1（1:0）1（0.6g）-1（500rpm）216431333321（70℃）1（60min）1（6g）-1（5:1）1（0.6g）1（800rpm）19852024933-1（50℃）-1（40min）-1（4g）1（1:0）1（0.6g）1（800rpm）108393826741（70℃）-1（40min）1（6g）1（1:0）-1（0g）1（800rpm）7882565755-1（50℃）1（60min）-1（4g）-1（5:1）-1（0g）1（800rpm）1421310478519 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化6-1（50℃）-1（40min）1（6g）1（1:0）1（0.6g）-1（500rpm）7041398937-1（50℃）-1（40min）-1（4g）-1（5:1）-1（0g）-1（500rpm）8444525658-1（50℃）1（60min）1（6g）1（1:0）-1（0g）1（800rpm）66197314591（70℃）-1（40min）-1（4g）-1（5:1）1（0.6g）1（800rpm）1363575350101（70℃）-1（40min）1（6g）-1（5:1）-1（0g）-1（500rpm）777127905111（70℃）1（60min）-1（4g）1（1:0）-1（0g）-1（500rpm）215754765212-1（50℃）1（60min）1（6g）-1（5:1）-1（0g）-1（500rpm）4099485612.2.2.2PB试验设计处理及相应值利用Minitab16.0软件对表1中的数据进行分析,各影响因素的显著性检验及影响效果见表2.2。由表2.2可知,萃取温度、萃取时间和样品量有显著影响，样品与去离子水质量比、NaCl添加量和搅拌速度均无显著影响。因此，影响HS-SPME萃取蜂蜜挥发性成分的主要因素有萃取温度、萃取时间和样品量。表2.2总峰面积的估计效应和系数及显著性检验Table2.2Estimatedeffectsandcoefficientsfortotalpeakareaandtheirsignificancetest项效应系数系数标准误T值P值显著性常量Constant119681558110098722811.850.000A萃取温度6850434003425217001009872283.390.019﹡B萃取时间5398008512699004261009872282.670.044﹡C样品量-618081512-309040756100987228-3.060.028﹡D样品与去离子水质量比126425252632126261009872280.630.559ENaCl添加量176741596883707981009872280.880.422F搅拌速度41121066205605331009872280.200.847注：﹡,﹡﹡表示差异显著（P＜0.05）和差异高度显著（P＜0.01）Note:﹡,﹡﹡denotesignificantandhighlysignificantdifferencesatP＜0.05andP＜0.01levles,respectively2.2.3Box-Behnken响应面分析2.2.3.1响应面分析因素水平的选取在PB试验分析结果的基础上，采用响应面设计，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取条件对总峰面积影响显著的3个因素，萃取温度(X1)、萃取时间(X2)和样品量(X3)，做三因素三水平响应面分析试验，试验因素与水平设计见表2.3。表2.3响应面分析试验因素水平表Table2.3Tableofrespondsurfaceanalysisexpermientalfactorlevel水平代码因素-101X1萃取温度（℃）506070X2萃取时间（min）405060X3样品量（g）4562.2.3.2响应面试验结果20 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化表2.4为响应面分析方案及实验结果，试验共有15个试验点，试验号1～12是析因试验，试验号13～15是中心试验。其中自变量取值X1、X2、X3在所构成的三维顶点作为析因点；零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。表2.4响应面试验设计及相应结果Table2.4Designandresultsofresponsesurfaceexperiments试验号X1萃取温度X2萃取时间X3样品量Y总峰面积1-1-10156755748721-1019324567123-1101346186065411020529834635-10-11630325323610-118053377297-10117091970228101196846613590-1-113116962611001-11798610819110-1116738513661201115857929041300021551224271400021723821931500021248922452.2.3.3模型建立及显著性检验利用DesignExpert软件，对表2.4的数据进行二次多项式回归拟合，以色谱总峰面积为响应值，得到二次多元回归方程如下:987777Y=2.151×10+1.882×10X1+3.725×10X2+4.892×10X3+8.547×10X1X2+2.106×10X1X38828282－1.437×10X2X3－1.201×10X1－3.059×10X2－2.524×10X3对模型进行方差分析，结果见表2.5。由表2.5可以看出：一次项X1为显著，其他两项均不222显著;交互项均不显著；平方项X2极显著，X3显著，X1不显著；模型F=6.54，P=0.0262＜0.05表明模型是显著的；模型的相关系数为0.9217，说明自变量与因变量之间的回归关系显著，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳萃取工艺条件，并且拟合度良好，实验误差小，有助于降低试验误差（李倩等，2012；乔鑫等，2010）。表2.5回归分析结果Table2.5Resultsofregressionanalysis来源自由度平方和均方F值P值显著性模型99.915E+0171.102E+0176.540.0262X112.835E+0172.835E+01716.830.0093﹡﹡X211.110E+0161.110E+0160.660.4538X311.914E+0161.914E+0161.140.3352X1X212.922E+0162.922E+0161.730.2449X1X311.775E+0151.775E+0150.110.7586X2X318.265E+0168.265E+0164.910.07762X115.324E+0165.324E+0163.160.13562X213.456E+0173.456E+01720.510.0062﹡﹡2X312.352E+0172.352E+01713.960.0135﹡残差58.423E+0161.685E+01621 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化纯误差21.156E+0155.778E+014总变异141.076E+018注：﹡,﹡﹡表示差异显著（P＜0.05）和差异高度显著（P＜0.01）Note:﹡,﹡﹡denotesignificantandhighlysignificantdifferencesatP＜0.05andP＜0.01levles,respectively2.2.3.4因素间交互作用的影响根据回归分析结果，各因素间交互作用对总峰面积的影响作出响应曲面见图2.6～图2.8。图2.7萃取温度(X1)和萃取时间(X2)对总峰面积的交互影响Fig.2.7Correlativeeffectsofextractiontemperatureandextractiontimeonthetotalpeakarea图2.8萃取温度(X1)和样品量(X3)对总峰面积的交互影响Fig.2.8Correlativeeffectsofextractiontemperatureandsampleamountonthetotalpeakarea图2.9萃取时间(X2)和样品量(X3)对总峰面积的交互影响Fig.2.9Correlativeeffectsofextractiontimeandsampleamountonthetotalpeakarea22 中国农业科学院硕士学位论文第二章HS-SPME法萃取蜂蜜挥发性成分的条件优化由图2.7、图2.8和图2.9可知响应面坡度都相对平缓，表明其可以忍受处理条件的变异，而不影响响应值大小。等高线图表示在同一椭圆型的区域内，总峰面积是相同的。在椭圆形的区域中心，总峰面积最大，由中心向边缘总峰面积逐渐变小（陈源等，2013）。同时等高线的形状可直观地反映出各因素的交互作用，圆形表示二因素交互作用不显著，而椭圆形表示两因素交互作用显著。（王允祥等，2004）如图2.7所示，样品量为5g时，随着萃取温度的升高，总峰面积增加比较缓慢；随着萃取时间的延长，总峰面积先增加后又有所减少，表明萃取温度和萃取时间的交互作用不显著。如图2.8所示，萃取时间为50min时，随着萃取温度的升高，总峰面积缓慢增加；随着样品量的增大，总峰面积先增加后又有所减少，表明萃取时间和样品量的交互作用不显著。如图2.9所示，萃取温度为60℃时，随着萃取时间的延长，总峰面积先迅速增加后又略有减少;随着样品量的增大，总峰面积也先迅速增加后又略有减少。在较长萃取时间较低样品量区域和在较高样品量较短萃取时间区域，色谱总峰面积较高大，且由响应曲面投影的等高线图为椭圆，表明萃取时间和样品量的交互作用与图2.7和图2.8中两者的交互作用相比较显著，与表2.5的结果一致(P值大小：X2X3＜X1X2＜X1X3)。2.2.3.5萃取条件的优化及模型验证利用Expert-design软件预测出蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取条件为：萃取温度68.49℃，萃取时间51.59min，样品量5.09g，在此条件下响应面模型预测的总峰面积为2235707430。为了验证方法的准确性与可靠性，采用优化后的萃取条件对蜂蜜进行固相微萃取验证试验。考虑到试验的实际操作条件，将萃取的最优条件修正为:萃取温度68.5℃、萃取时间51.5min、取样量5.1g。在此条件下进行4次试验，得到总峰面积实际平均值为2204894036，是预测值的98.6%，说明该模型可较好地反映蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件。2.3小结蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件：萃取温度68.5℃、萃取时间51.5min、取样量5.1g、样品与去离子水质量比10:1、NaCl添加量0.3g、搅拌速度650rpm。23 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析中国是世界上的养蜂大国,蜂群数量、蜂蜜产量、养蜂从业人员和蜂蜜出口4个指标均居世界前列。而且蜂蜜品种种类和数量繁多，分布广泛，这得益于我国辽阔的国土、优越的地理气候以及丰富的蜜源植物。据不完全统计，我国能被蜜蜂利用的蜜源植物约5千种以上，能取到商品蜜的蜜源植物有100多种（ZhangFX,1998）。但数量较多，流蜜多，花期较长的主要蜜源植物产出的蜜约有20多种。不同蜜源蜂蜜的感官特征、营养价值有差异，受消费者欢迎程度也不同。因此，本实验拟解决的主要问题是全面描述我国主要蜜源蜂蜜的挥发性成分特征。采用萃取技术为HS-SPME，再利用GC-MS对挥发性成分进行定性与定量分析，以期得出我国主要蜜源蜂蜜挥发性成分的整体信息，为蜂蜜的真实性评价提供一定理论基础。3.1材料与方法3.1.1蜂蜜样品及蜜源信息本研究中的蜂蜜样品多采自我国各蜜源主产区的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica蜂场，包括11个省份或直辖市的17种蜜源蜂蜜(见表3.1)。所有样品均是在蜜源植物的开花流蜜季节采集，采样时间为2013年3月-8月。每个采样地点一般聚集有10个以上的养蜂户，且各自之间的距离超过5km，养殖规模一般为100群左右。每种蜂蜜样品平行采集3次，共计51个样品，各样品采样量为50g，密封低温6-8℃保存。蜂蜜样品蜜源信息的确认，主要依靠采访养蜂户、调查采样点蜜源植物种类及专业人员的感官鉴别等。表3.1样品采集及蜜源信息Table3.1Samplecollectionandnectarsourcesinformation样品名蜜源植物地点信息采样环境及时间籽瓜新疆草原、草甸及农田系统ZGCitrulluslanatus46.5247°N,83.6283°E2013年8月红花新疆草原、灌木及农田系统HHCarthamustinctorius46.2011°N,82.9827°E2013年8月向日葵新疆草原、草甸及湿地系统XRKHelianthusannuus47.3636°N,87.8004°E2013年7月黄芪山西灌木及农田系统HQAstragalus36.0881°N,111.5190°E2013年8月membranaceus党参山西草原、草甸及灌木系统DSHCodonopsispilosula39.0076°N,113.5963°E2013年8月五味子山西灌木及农田系统WWZSchisandrachinensis36.0880°N,111.5190°E2013年8月乌桕贵州草甸及灌木系统WJSapiumsebiferum28.5500°N,107.4440°E2013年7月苜蓿宁夏灌木及农田系统MXMedicagosativa35.4617°N,105.9842°E2013年6月枸杞宁夏灌木及草原系统GQSchisandrachinensis.36.3620°N,106.1336°E2013年6月苦豆子宁夏草原、草甸及灌木系统KDZSophoraalopecuroides37.5668°N,107.1823°E2013年6月芝麻湖北ZM灌木系统Sesamumindicum31.7746°N,111.8389°E24 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析2013年8月龙眼海南灌木系统LYDimocarpuslongan19.8919°N,110.2674°E2013年4月荔枝福建灌木系统LZLitchichinensis24.4524°N,117.6196°E2013年4月椴树吉林灌木及农田系统DSTiliatuan43.2993°N,128.1157°E2013年7月荆条北京灌木系统JTVerbenaceae39.9941°N,116.2060°E2013年7月洋槐辽宁灌木及农田系统YHRobiniapseudoacacia38.9140°N,121.6147°E2013年5月油菜重庆灌木及农田系统YCBrassicacampestris30.3272°N,107.3327°E2013年3月3.1.2仪器与设备6890N-5975C气质联机(配有EI离子源和NIST2.0数据处理系统)美国Agilent公司；TDS3/TDSA2热脱附系统德国Gerstal公司；Tenax柱，填料为2，6-二苯基-p-苯烯基氧化物德国Gerstal公司；毛细管柱(DB-WAX，30m×0.25mm，0.25μm)美国J&W公司。3.1.3方法3.1.3.1HS-SPME条件蜂蜜挥发性成分萃取前，首先将SPME萃取头插入气相色谱注射孔中老化处理60min。称取蜂蜜样品8g置于100mL的顶空瓶内，用微量进样器加入1μL的2-甲基-3-庚酮(内标，正丁烷溶解，1.632μg/mL)，并加入10mL的饱和NaCl溶液。50℃下将顶空瓶于磁力搅拌器上混匀30min，以达体系的平衡状态。将SPME的萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头后50℃吸附40min。3.1.3.2自动热脱附系统条件将SPME萃取头插入气相色谱的进样孔，推出纤维头。起始温度为35℃，保持0.5min，延迟3min；60℃/min的速度升温至230℃，保持1min，热脱附系统与进样口之间传输线温度为300℃。内附的冷进样系统条件为：初始温度-100℃，平衡0.2min，以10℃/min的速度升温至280℃，保持0.5min。3.1.3.3气相色谱条件弹性石英DB-WAX毛细管柱。柱温条件为程序升温，初始温度为40℃，保持3min，5℃/min速度升温至200℃，保持0min，再以10℃/min速度升温至240℃，保持5min。载气为氦气，保持恒定流速1.2mL/min，进样口温度250℃，压力14.87psi，不分流。3.1.3.4质谱条件电子轰击(EI)离子源，离子源温度：230℃，电子能量：70eV，传输线温度：280℃，四级25 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析杆温度：150℃，溶剂延迟3min，质量扫描范围：55-500m/z。3.1.3.5化合物的鉴定定性主要通过2种途径：利用设备中NIST2.0数据库检索目标化合物，进行定性分析；采用相同条件对正构系列烷烃C8-C27进行GC-MS分析，利用色谱峰的保留时间计算目标相应化合物的保留指数LRI值，并与www.odour.org.uk中查询的LRI值比对认定范围为相差0-100内，实现化合物的辅助定性。色谱峰LRI值计算公式：100(tt)anLRI100nttn1n式中：ta为色谱峰a的保留时间；tn为正构烷烃Cn的保留时间(色谱峰a的保留时间须在正构烷烃Cn和Cn+1之间)。定量根据蜂蜜样品中添加的内标化合物含量、内标化合物色谱峰面积及目标化合物色谱峰面积，计算目标化合物的含量，计算公式为：CSAXCXSA式中：CX为目标化合物的质量浓度；SX为目标化合物的色谱峰面积；CA为内标化合物的质量浓度；SA为内标化合物的色谱峰面积。数据分析试验数据利用MicrosoftExcel和SPSS软件进行统计分析及图表制作。样品中各挥发性成分含量和LRI值的平均值和标准偏差SD，均由3个平行样品的相应数据计算而来。3.2结果与分析3.2.1蜂蜜样品中的挥发性成分3.2.1.1蜂蜜样品中挥发性成分总离子流图26 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析图3.1YC样品挥发性成分的总离子流图Fig.3.1TotalionchromatogramofvolatilecomponentsinsampleYC所有样品的顶空挥发性成分经GC检测，总离子流图的轮廓较为相似，差别集中于少数挥发性成分色谱峰的有无或峰面积大小上。其中，较为典型的为油菜蜂蜜样品YC，见图3.1。各组分色谱峰分离完全，较少出现粘连现象。GC分析过程中，蜂蜜样品中的挥发性成分最早出现于5min左右，最迟出现于27min左右，整个分析过程持续22min左右。图中可以明显看出，面积较大的峰分别代表了乙醇、乙酸和苯甲醇，经计算其含量分别为6.0108μg/μL、0.2542μg/μL和0.2038μg/μL27 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析3.2.1.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性与定量表3.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性与定量分析Table3.2QualitativeandQuantitativeanalysisofvolatilecomponentsinhoneysamplesLRI含量（μg/μL）序值定性方号LRI值(计算)(检化合物式索)ZGHHXRKHQDSHWWZWJMXGQKDZZMLYLZDSJTYHYC2-甲基丁质谱，1814.3846±0.27749030.24140.2282醛LRI值1-(2-烯丙2814.5849±0.641—基缩水)丁0.1203质谱烷质谱，3886.0154±4.4451888乙酸乙酯0.13770.46680.98920.09320.0544LRI值2-甲基呋质谱，4896.4164±1.13948170.0954喃LRI值质谱，5931.7885±1.7266930乙醇0.358027.54691.03751.770511.68140.15520.13076.0108LRI值6932.3832±1.0557—二甲醚2.2573质谱质谱，71041.1849±0.15621040甲苯0.10360.15770.15630.04490.03390.02620.02280.03990.74180.03701.57010.03410.0389LRI值2-甲基-1-81088.7168±0.3817—0.1900质谱丙醇91121.6386±0.50221122乙苯0.0392质谱质谱，101134.113±4.39421130对二甲苯0.02860.0640LRI值质谱，111205.36±3.679812521-戊醇0.22120.17040.4354LRI值2-甲基-1-121205.4628±0.450612040.0231质谱丁醇131216.2267±.1405—1，3-二嗪0.03150.0410质谱质谱，141268.986±0.12221260甲基吡嗪0.05440.11400.1807LRI值151273.6228±0.48921204异丙基苯0.2771质谱2，5-二甲质谱，161324.6308±0.220713160.02260.0272基吡嗪LRI值2，6-二甲质谱，171330.8261±0.156713190.02290.02990.0580基吡嗪LRI值2-羟基-丙质谱，181336.6497±0.606513410.1678酸乙酯LRI值191337.6087±0.1151325乙基吡嗪0.03490.02420.0550质谱，28 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析LRI值乙基201344.5765±0.6672—-(S)-(-)-乳0.1591质谱酸3，4-二甲211444.68±0.4367—0.1887质谱基苯乙烯1-甲氧基221445.7117±0.635—0.0473质谱-4-甲基苯质谱，231451.7485±2.31231459乙酸0.19380.12270.19650.12150.97650.25140.10410.29020.18950.34310.72440.18310.13190.34520.2542LRI值241452.8141±0.8911—甲酸甲酯0.1648质谱质谱，251470.513±2.35781466糠醛0.02370.04520.01580.27310.44020.02010.20360.12470.05330.20160.10990.09120.04110.0364LRI值261471.3808±1.4749—3-糠醛0.0518质谱1-(2-呋喃)质谱，271511.4286±3.579614970.02330.03750.03610.03490.01500.11420.2472苯乙酮LRI值质谱，281534.4252±2.51771530苯甲醛0.14910.08810.02380.12410.19610.04870.04030.01740.32770.17530.04390.06850.0923LRI值3，7-二甲291537.3107±0.4639—基-1，6-辛0.1119质谱二烯-3-醇301544.8985±0.29461484芳樟醇0.12280.0535质谱2，3-丁二311524.5384±0.5941—0.0096质谱醇[R-(R*，321572.6563±0.9295—R*)]-2，3-0.1583质谱丁二酮5-甲基-2-331582.506±1.4888—0.0181质谱呋喃甲醛5-甲基呋341582.7397±0.8843—0.0269质谱喃醛5-甲基-2-351583.3994±0.5477—0.0284质谱糠醛脱氢芳樟361608.8667±0.4537—0.01830.99420.1096质谱醇3，7－二甲基－1，371609.2023±1.3507—0.0880质谱5，7－辛三烯－3－醇质谱，381653.08±4.53991623苯乙醛0.18210.12030.13930.81780.4177LRI值2-呋喃甲质谱，391660.75±0.43216590.05640.04830.03820.0139醇LRI值琥珀酸二401669.1027±0.1539—0.2631质谱乙酯29 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析3-甲基丁411669.4732±1.2517—0.0384质谱酸苯甲基乙421676.8375±0.9588—0.0208质谱酯4-氧代异431703.4605±0.511—0.05060.00980.08190.2249质谱佛尔酮3-吡啶甲441717.5189±0.4213—0.0489质谱醛环氧芳樟451761.7894±0.0912—0.33000.8134质谱醇2，6-二甲基-3，7-辛461825.4892±187.2736—0.03890.7576质谱二烯-2，6-二醇苯乙酸乙471787.4844±5.4579—0.05640.1780质谱酯1-(3-甲基481788.3618±0.6834—乙基)苯乙0.0193质谱酮桃金娘烯491795.5957±0.8196—0.0221质谱醇乙酸-2-苯501813.3163±0.3788—0.1339质谱乙酯511837.634±1.2176—草蒿脑0.0809质谱521839.0834±1.8788—茴香醇0.0177质谱531837.9815±0.3572—茴香脑0.61090.03390.2127质谱542047.609±5.0881—苯丙醇0.05870.3114质谱质谱，551880.0714±3.84591872苯甲醇0.04230.19860.22310.01770.20230.2038LRI值苯丙酮酸561883.4844±0.4745—0.0830质谱乙酯质谱，571917.1877±3.14591939苯乙醇0.01140.01880.03450.14220.82160.78660.15910.04050.04190.71210.45400.75670.56100.04400.11000.1611LRI值2，5-二甲581993.86275±0.3546—0.02050.02480.0667质谱酰基呋喃2，5-呋喃591994.9106±0.649—0.0331质谱乙二醛质谱，602011.639±0.56022004苯酚0.0061LRI值3-呋喃甲612023.8346±0.8285—0.0203质谱酸甲酯4-甲氧基622043.4902±0.324—0.24920.02440.0396质谱苯甲醛3，4，5-632053.8286±0.311—0.1422质谱三甲基甲30 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析苯3-苯基-2-642057.7564±0.8724—0.0070质谱丙烯醛质谱，652055.920±0.12272075辛酸0.0161LRI值1，3-二羟662094.9174±0.8258—0.15430.0465质谱-2-丙酮丁基羟基672097.295±0.706—0.0123质谱甲苯1，3，5-682159.2046±0.7894—0.0401质谱三茴香醚对甲氧基692275.7628±1.3554—0.0371质谱苯基丙酮棕榈酸乙702244.6666±0.0008—0.1685质谱酯氨茴酸甲712254.9764±0.94660.0633质谱酯1-甲基-4-(1-甲基722273.573±0.539—乙烯0.0222质谱基)-1，2-环己二醇癸二酸二732310.5278±0.448—0.0924质谱乙酯1，2，4-742338.1375±0.1498—三甲氧基0.0644质谱苯2，4，5-752364.8023±0.7918—三甲基苯0.0951质谱酚癸烯二酸762454.9713±0.8884—0.2089质谱二乙酯质谱，772455.0842±2.98362435吲哚0.0405LRI值5-羟甲基782505.5516±0.8485—0.0803质谱糠醛5-羟甲基792507.3058±0.6603—-2-呋喃乙0.0767质谱二醛利用HS-SPME方法对17种蜜源蜂蜜样品的挥发性成分进行萃取，发现其组成非常复杂，经GC-MS分析共检测到79种物质，其中27种经过了质谱库和LRI值的双重鉴定，且检索值和计算值相符(相差在0~100范围内)(见表3.2)。未发现某种物质在所有蜂蜜样品的挥发性成分中存在，苯乙醇在16个31 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析样品中被检出，乙酸在15个样品中被检出，糠醛在14个样品中被检出，甲苯和苯甲醛在13个样品中被检出，乙醇在8个样品中被检出，其他挥发性成分则在少数蜂蜜样品中被检出。另外，蜂蜜样品ZM中所检测到的挥发性成分最多，为22种；蜂蜜样品DSH次之，为18种。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析3.2.2蜂蜜样品中挥发性成分分类图3.2蜂蜜样品中挥发性成分种类Fig.3.2Sortsofvolatilecomponentsinhoneysamples将所有蜂蜜样品中挥发性成分进行分类汇总，结果见图3.2。其中的所有挥发性成分主要分属于醇类、醛类、芳香族类、酯类、酮类、醚类、酸类、酚类、萜烯类和烷烃类。其中醇类、醛类、芳香类和酯类物质含量最高，分别为22.78%18种、17.72%14种、17.72%14种和16.46%13种，与前人关于酯类和醛类物质可作为蜂蜜香味主要来源的报道一致（Kaskonienė,V.etal.,2008）。蜂蜜样品的挥发性成分中还含有其他类的物质，如酮类7.59%、醚类7.59%、酸类5.06%、酚类2.53%、萜烯类1.27%和烷烃类1.27%。3.2.3蜂蜜样品中挥发性成分的含量图3.3不同样品挥发性成分中主要共有的物质的含量Fig.3.3Contentsofmainmutualsubstanceinvolatilecomponentsofdifferenthoneysamples由图3.3可以得到，苯乙醇、乙酸和糠醛分别在16种、15种和14种蜂蜜样品的挥发性成分33 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析中被检测到，为主要的共有物质。三类物质在不同样品中的含量差异较大，如乙酸和糠醛在WWZ中含量最高，分别达到了0.9765±0.0012μg/μL和0.4402±0.0009μg/μL，而DSH和JT中未发现乙酸，HQ、LZ和DS中未发现糠醛。苯乙醇在DSH中含量最高，为0.8216±0.0011μg/μL，而其在LZ中未被检出。图3.4ZM样品中各挥发性成分的含量Fig.3.4ContentsofvolatilecomponentsinsampleZM所有蜂蜜样品中，ZM的挥发性成分中所检测到的物质种类最多，为22种，按照不同物质在GC谱图上出现的先后次序制作图3.4。可以看出乙醇、乙酸乙酯和苯乙醛等物质的含量较高，均达到了0.80μg/μL以上。另外，ZM挥发性成分中还检测到了部分不常见物质，如2-甲基-1-丙醇、琥珀酸二乙酯、棕榈酸乙酯、苯丙酮酸乙酯和2,4,5-三甲基苯酚等物质仅在该样品中被发现。3.3小结1·本研究从所有蜂蜜样品挥发性组分中共发现了79种物质，其中包括醇类、醛类、芳香族类、酯类、酮类、醚类、酸类、酚类、萜烯类和烷烃类10类物质。虽然种类差别较小，但是由于各类物质的呈味阈值不同，所以对蜂蜜风味的贡献也应存在明显差异。酯类和醛类物质含量均较高，说明其可能是不同种类蜂蜜风味形成的主要来源，与前人报道一致（KASKONIENEVetal.,2008）。2·17种蜂蜜样品中检测到的苯乙醇、乙酸和糠醛的含量最多，如14种蜂蜜样品挥发性组分中均检测到了糠醛的存在，其含量在0.0163-0.4471μg/μL之间。通常情况下，加热处理会导致糠醛的产生，而固相为萃取技术的加热环节必不可少，故表4.1所反映的糠醛含量并不一定完全来自于蜂蜜样品。其他关于蜂蜜挥发性成分的报道，也发现了糠醛的存在（WolskiTetal.,2006;VázquezLCetal.,2006;KaškonienėVetal.,2008）。3·乙醇在8种蜂蜜样品中被发现，其也可能并不属于蜂蜜自身的顶空挥发性成分，因为酵母菌的存在，会导致富含碳水化合物的体系发酵而产生乙醇（BertelliDetal.,2008）。34 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析4·本文中也发现了部分成分仅出现在某一种蜂蜜样品中，且含量均较低，这种现象可能与蜂蜜的真实性、污染及发酵等有关。当然，也不能排除其他样品中也存在该物质，只是其含量可能超出了GC的检测限而未被检出。5·一般来说，蜂蜜的风味主要取决于其中的挥发性成分，而挥发性成分则依赖于花蜜的组成和蜜源的种类。本文的结果在一定程度上契合了该结论，如具有特殊风味的芝麻蜂蜜ZM和党参蜂蜜DSH所检测到的挥发性成分含量最多，分别为22种和18种。异丙基苯仅在椴树蜂蜜DS的挥发性成分中被检出，且含量较高，为0.2771μg/μL，同异丙基苯可作为椴树蜂蜜标记物质的报道一致（NaefRetal.,2004）。6·醛类物质是蜂蜜风味的重要来源（KASKONIENEVetal.,2008），如丁醛及其衍生物是柑橘蜂蜜挥发性组分中的主要成分，所以其被作为了该蜂蜜的标记物质（Castro-VázquezLetal.,2009）。本文中苯甲醛是芝麻蜂蜜ZM挥发性组分中的重要组成成分，含量达到0.3277μg/μL，在其他蜂蜜中含量则相对较小，从0.017μg/μL到0.1961μg/μL不等。故我们建议，苯甲醛可能可以作为芝麻蜂蜜的标记物。35 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响随着生活水平的提高，人们对蜂蜜的需求量增长迅速，对其食用品质的要求也越来越高。生产者不得不对蜂蜜的产品质量和生产能力进行现代化升级，以适应市场的需求（叶振生，2003）。与其他食品一样，蜂蜜具有独特的感官和香气特征，决定着消费者的喜好（BertonceljJetal.,2011）。天然蜂蜜具有特殊的花香气味，主要源于不同的挥发性小分子化合物，这些挥发性成分主要由以下几个方面产生：1）直接来自于植物或花蜜；2）蜜蜂对植物成分的转变或者直接由蜜蜂产生；3）蜂蜜加工或储存过程中的加热或者其他处理；4）微生物或者环境污染（Manyi-LohCEetal.,2011）。蜂蜜中主要的挥发性成分具有其特定的归类，一般属于不同的化学家族，如醇类、酮类、醛类、酸类和萜烯类等（刘永明等，2012）。某些挥发性成分可以作为特征组分用以鉴定特定蜂蜜的蜜源，如柑橘蜂蜜中半挥发性的氨茴酸甲酯（BertelliDetal.,2008），桉树蜂蜜中的2-羟基-5-甲基-3-己酮和3-羟基-5-甲基-2-己酮（delaFuenteEetal.,2008），栗树蜂蜜中的2-氨基乙酰苯等（GuyotCetal.,1998）。如何能够保证蜂蜜在商业化加工过程中的纯正性，即特征风味组分不损失或少损失，成为蜂蜜加工领域改进工艺的一个重要出发点。用科学方法从巢脾中取出的成熟蜂蜜（波美度大于42），通常能保持其固有的营养和风味（曾哲灵等，2006）。但是，实际生产中由于质量价格体系的不合理，促使蜂农生产出大量不成熟蜂蜜（波美度低于40），其产品须经过合理的加工，才能有效地提高品质和延长货架期。为此，通过对蜂蜜加工工艺各个节点的样品进行风味分析，有助于明确蜂蜜中有效挥发性成分的损失环节，改进生产工艺，提高商品化蜂蜜的质量。关于蜂蜜风味和挥发性成分的研究较多，所采用的方法多以GC-MS技术为基础，其不失为一种有效的研究方法，但是针对蜂蜜加工过程中不同工艺节点样品的挥发性成分研究鲜见报道。在此背景下，本实验以马占相思树蜂蜜为材料，采用HS-SPME对加工工艺不同节点样品进行挥发性成分萃取，再利用GC-MS技术对挥发性成分进行分析鉴定。希望找到蜂蜜加工过程中风味保持的关键控制点，应用于蜂蜜加工工艺优劣的评测，为商品化蜂蜜的标准化和风味优化方面提供实验基础。4.1材料与方法4.1.1材料与试剂马占相思树蜂蜜原料于2011年在马来西亚沙捞越州意大利蜜蜂（Apismelliferaligustica）蜂场采收；系列烷烃（C7-C22，色谱纯）购自北京化学试剂公司；2-甲基-3-庚酮（内标化合物）购自Sigma-Aldrish公司。4.1.2仪器与设备6890N-5975C气质联机（配有EI离子源和NIST2.0数据处理系统）美国Agilent公司；36 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响TDS3/TDSA2热脱附系统德国Gerstal公司；Tenax柱，填料为2,6-二苯基-p-苯烯基氧化物德国Gerstal公司；恒温水浴锅HH-1金坛市至翔科教仪器厂；毛细管柱（DB-WAX，30m×0.25mm×0.25μm）美国J&W公司。4.1.3方法4.1.3.1蜂蜜加工材料与试剂原料蜂蜜委托北京中蜜科技发展有限公司南口生产基地进行加工，其主要的工艺流程为：原料→融蜜（71℃，2min）→过滤→浓缩→灭菌→灌装。本实验从各加工工艺节点进行取样，样品取好后密封冷冻（-20℃）保存。另外，实验对融蜜环节的加热温度和加热时间进行了重新优化，以期在加工过程中降低蜂蜜黏度的同时，尽量减少蜂蜜挥发性成分的损失，提高加工效率和产品质量。具体的取样方式如表4.1。表4.1不同加工工艺节点的取样方式Table4.1Samplemethodsofdifferentprocessnotes样品编号工艺节点取样量样品重复数S1原料10g3S2融蜜（71℃，2min）10g3S3过滤10g3S4浓缩10g3S5灭菌10g3S6融蜜（60℃，2min）10g3S7融蜜（65℃，2min）10g3S8融蜜（68℃，2min）10g3S9融蜜（71℃，4min）10g3S10融蜜（71℃，6min）10g3S11融蜜（71℃，8min）10g3S12融蜜（71℃，10min）10g3S13融蜜（74℃，2min）10g3S14融蜜（77℃，2min）10g34.1.3.2HS-SPME条件称取蜂蜜样品8g置于顶空瓶内，用微量进样器加入1μL1.632μg/mL的2-甲基-3-庚酮（内标，正丁烷溶解），密封状态下50℃平衡30min。将SPME的萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头后50℃吸附40min。4.1.3.3自动热脱附系统（thermo-desorptionsystem）条件37 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响起始温度为35℃，保持0.5min，延迟3min；60℃/min的速度升温至230℃，保持1min，热脱附系统与进样口之间传输线温度为300℃。内附的冷进样系统条件为：初始温度-100℃，平衡0.2min，以10℃/min的速度升温至280℃，保持0.5min。4.1.3.4气相色谱条件弹性石英DB-WAX毛细管柱，30m×0.25mm×0.25um。柱温条件为程序升温，初始温度为40℃，保持3min，5℃/min速度升温至200℃，保持0min，再以10℃/min速度升温至240℃，保持5min。载气为氦气，保持恒定流速1.2mL/min，进样口温度250℃，压力14.87psi，不分流。4.1.3.5质谱条件电子轰击（EI）离子源，离子源温度：230℃，电子能量：70eV，传输线温度：280℃，四级杆温度：150℃，溶剂延迟3min，质量扫描范围：55-500m/z。4.1.3.6化合物的鉴定定性：主要通过2种途径：利用设备中NIST2.0数据库检索目标化合物，进行定性分析；采用相同条件对正构系列烷烃（C3-C27）进行GC-MS分析，利用色谱峰的保留时间计算目标相应化合物的保留指数LRI值，并与（www.odour.org.uk）中查询的LRI值比对（认定范围为相差0-100内），实现化合物的辅助定性。色谱峰LRI值计算公式：100(tt)anLRI100nttn1n注：ta为色谱峰a的保留时间，tn为正构烷烃Cn的保留时间(色谱峰a的保留时间须在正构烷烃Cn和Cn+1之间)。定量：根据蜂蜜样品中添加的内标化合物含量、内标化合物色谱峰面积及目标化合物色谱峰面积，计算目标化合物的含量，计算公式为：CSAXCXSA注：CX为目标化合物的质量浓度，SX为目标化合物的色谱峰面积，CA为内标化合物的质量浓度，SA为内标化合物的色谱峰面积。38 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响4.2结果与分析4.2.1蜂蜜挥发性成分总离子流图对不同蜂蜜样品的挥发性成分进行GC-MS检测，所有样品的总离子流图轮廓相似，其中以S2样品为例进行描述，具体见图5.1。图4.1S2样品挥发性成分的总离子流图Fig.4.1TotalionchromatogramofvolatilecomponentsinsampleS2.本实验中，蜂蜜加工过程中各工艺节点所取样品的挥发性成分相近，差别多集中于同一成分的不同峰度值上，即所有样品的整体风味轮廓较为相似，挥发性成分的含量不同。顶空固相微萃取技术可以很好地吸附蜂蜜样品中的挥发性成分，通过GC-MS的分析检测，可以得到良好的总离子流图，其中各组分峰图分离完全，较少出现粘连现象。GC-MS分析过程中，蜂蜜样品中挥发性成分最早出现于5min左右，而最迟出现于33min左右，整个分析过程持续28min左右。4.2.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性表4.2蜂蜜样品中挥发性成分的定性分析Table4.2Qualitativeanalysisofvolatilecomponentsinhoneysamples序号保留时间(s)化合物LRI值(计算)LRI值(检索)定性方式15.072±0.007乙酸乙酯884.595±0.541888质谱，LRI值25.864±0.004乙醇930.411±0.210930质谱，LRI值37.602松萜1016.4191011质谱，LRI值412.101±0.0081-戊醇1202.938±0.3231213质谱，LRI值512.229水芹烯1208.2231219质谱，LRI值613.7762-乙基-1,4-二甲基苯1272.149—质谱715.244±0.010N,N-二甲基-甲酰胺1334.209±0.427—质谱817.875±0.004乙酸1450.043±0.2031442质谱，LRI值918.289±0.004糠醛1468.794±0.1611455质谱，LRI值39 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响1019.201±0.0122-乙酰基呋喃1510.639±0.5541500质谱，LRI值1119.204±0.0071-(2-呋喃)-1-戊酮1510.831±0.339—质谱1219.672±0.006苯甲醛1533.138±0.2901530质谱，LRI值1320.6685-甲基-2-呋喃甲醛1580.745—质谱1-甲氧基-4-甲基1420.668±0.0031580.729±0.146—质谱-2-(1-甲基乙基)苯1522.130±0.013苯乙醛1653.091±0.0.6771623质谱，LRI值1622.560苯甲酸乙酯1674.6741663质谱，LRI值1723.166龙脑1705.3131698质谱，LRI值1825.375乙酸苯乙酯1822.547—质谱1927.054±0.004苯乙醇1915.79±0.2351903质谱，LRI值2027.409猛杀威1936.233—质谱2128.339±0.0052,5-二甲酰基呋喃1989.816±0.0.283—质谱2231.13癸内酯2159.4122144质谱，LRI值2333.446±0.005邻苯二甲酸甲酯2308.918±0.343—质谱各蜂蜜样品中挥发性成分分别经MS所配置的NIST2.0数据处理系统检索目标化合物，匹配度和纯度大于800作为标准进行鉴定，并利用化合物保留指数LRI值比对，对蜂蜜中挥发性成分进行定性分析，结果见表4.2。所有蜂蜜样品中挥发性成分共检索得到23种，其中14种经过了质谱库和LRI值的双重鉴定，结果较为可信。值得注意的是，挥发性成分中含有糠醛、苯甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛和苯乙醛4种醛类物质，尤其是糠醛、苯甲醛和苯乙醛在所有样品中均被检测到，说明其很可能是马占相思树蜂蜜的香味活性成分。另外，挥发性成分中还含有乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、猛杀威、癸内酯和邻苯二甲酸甲酯等酯类物质，其也可能对蜂蜜的香味来源有所贡献。4.2.3蜂蜜样品中挥发性成分分类图4.2蜂蜜样品中挥发性成分种类Fig.4.2Sortsofvolatilecomponentsinhoneysamples根据表4.2数据，将蜂蜜样品中挥发性成分进行分类汇总，见图4.2。挥发性成分中酯类、醛类和醇类物质含量最高，分别为26.09%（6种）、17.39%（4种）和17.39%（4种），也印证了酯类和醛类物质可能是蜂蜜香味的主要来源。在蜂蜜的挥发性组分中还发现了其他类物质，分别为40 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响酮类（13.04%）、萜烯类（8.70%）、烷烃类（8.70%）和酸类（4.35%）等。4.2.4加工工艺对蜂蜜中挥发性成分的影响图4.3加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响Fig.4.3Effectofprocesstechniconvolatilecomponentsinhoney本实验中所采用的蜂蜜加工程序为比较成熟的工艺技术，主要步骤包括：原料→融蜜（71℃，2min）→过滤→浓缩→灭菌→灌装，各步骤样品的挥发性成分总含量变化形式见图4.3。总体来看，原料和浓缩后样品的挥发性成分总含量较高，融蜜和过滤后样品的挥发性成分损失较大，说明融蜜条件是挥发性成分保持的重要影响因素。基于此，我们继续针对加工工艺中的融蜜条件进行优化。4.2.5融蜜条件对蜂蜜中挥发性成分的影响图4.4融蜜条件对蜂蜜挥发性成分的影响Fig.4.4Effectofthawconditiononvolatilecomponentsinhoney41 中国农业科学院硕士学位论文第四章加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响融蜜条件主要包括融蜜温度和融蜜时间，根据研究报道，优化实验分别设置了60℃-77℃的温度范围，及相应的融蜜时间。从各融蜜条件进行取样，分析其挥发性成分的总含量，具体结果见图4.4。随着融蜜温度的升高，蜂蜜样品中挥发性成分的总含量总体呈现降低的趋势，且60℃-71℃变化程度较大，71℃-77℃变化程度较小。随着融蜜时间的延长，蜂蜜样品中挥发性成分的总含量也呈现逐渐降低的趋势，但是变化程度较为平缓，其中71℃加热4min时，挥发性成分总含量相对较高。4.3小结1·马占相思树蜂蜜的挥发性成分中共检测到了23种物质，其中包括酯、醛、醇、酮、萜烯、烷烃和酸等7类物质。虽然种类没有差别，但是由于各类物质间呈味阈值不同，所以风味贡献程度存在明显差别。酯类和醛类物质含量均较高，并且糠醛、苯甲醛和苯乙醛在所有样品中均能检测到，与前人报道一致（KaškonienėV.etal.,2008;况小玲等，2012），说明醛类可能是影响马占相思树蜂蜜风味的主要物质。醛是食品中最重要的香味物质之一，其风味阈值一般很低，有时低含量时便可使食品产生特征香味（KrishnamurthyRG.etal.,1967）。酯类物质也是一种很重要的风味物质，很多酯类的风味阈值非常低，虽然质量分数不高，但是对风味形成的作用很大（WangJetal.,1967）。醇类物质在马占相思树蜂蜜的挥发性成分中较多，但是由于其风味阈值高，其对蜂蜜的风味贡献不大。蜂蜜挥发性成分中其他类化合物种类数量少，可能对风味的贡献不大。2·通过对不同加工工艺节点的蜂蜜样品挥发性成分的分析，发现原料和浓缩后样品的挥发性成分总含量较高，而融蜜和过滤后样品的挥发性成分损失较大，其中浓缩是人为缩小体积而导致挥发性成分升高，故融蜜是蜂蜜风味保持的重要影响因素。3·本实验中所采用的加工工艺中融蜜条件为加热至71℃保持2min，通过对融蜜条件的进一步优化，我们发现71℃加热4min时，挥发性成分总含量相对较高。如果融蜜温度低（如60℃）则不足以去除蜂蜜的结晶并实现透明均一化，达不到融蜜的效果，而温度过高（如77℃）则易导致蜂蜜中营养成分的损失及风味的破坏。商品化蜂蜜的加工工艺不尽相同，但总体流程相似，均[22]需经过过滤、融蜜、浓缩、灭菌等关键步骤，同时这些步骤也是导致蜂蜜风味损失的原因所在。42 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1·通过以GC-MS中蜂蜜的总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积为观察指标进行单因素试验，对枣花蜂蜜HS-SPME中6个指标萃取温度、萃取时间、样品量、样品与去离子水质量比、NaCl添加量和搅拌速度进行了考察。在单因素试验结果的基础上，采用Plackett-Burman设计对影响蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取条件的因素进行了评价，筛选出具有显著效应的三个因素——萃取温度、萃取时间和样品量。然后用响应面分析法对有显著效应的关键因子进行了进一步的优化。结果得出蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的最佳条件：萃取温度68.5℃、萃取时间51.5min、取样量5.1g、样品与去离子水质量比10:1、NaCl添加量0.3g、搅拌速度650rpm。2·17种不同蜜源蜂蜜样品挥发性组分中共发现了79种物质，其中包括醇类、醛类、芳香族类、酯类、酮类、醚类、酸类、酚类、萜烯类和烷烃类10类物质。其中检测到的苯乙醇、乙酸和糠醛的含量最多，如14种蜂蜜样品挥发性组分中均检测到了糠醛的存在，其含量在0.0163-0.4471μg/μL之间。通常情况下，加热处理会导致糠醛的产生，而固相为萃取技术的加热环节必不可少，糠醛含量并不一定完全来自于蜂蜜样品。另外，乙醇也在8种蜂蜜样品中被发现，其也可能并不属于蜂蜜自身的顶空挥发性成分。本文中也发现了部分成分仅出现在某一种蜂蜜样品中，且含量均较低，这种现象可能与蜂蜜的真实性、污染及发酵等有关。当然，也不能排除其他样品中也存在该物质，只是其含量可能超出了GC的检测限而未被检出。一般来说，蜂蜜的风味主要取决于其中的挥发性成分，而挥发性成分则依赖于花蜜的组成和蜜源的种类。本文的结果在一定程度上契合了该结论，如具有特殊风味的芝麻蜂蜜ZM和党参蜂蜜DSH所检测到的挥发性成分含量最多，分别为22种和18种。异丙基苯仅在椴树蜂蜜DS的挥发性成分中被检出，且含量较高，为0.2771μg/μL，可作为椴树蜂蜜标记物质。醛类物质是蜂蜜风味的重要来源，本文中苯甲醛是芝麻蜂蜜ZM挥发性组分中的重要组成成分，含量达到0.3277μg/μL，在其他蜂蜜中含量则相对较小，从0.017μg/μL到0.1961μg/μL不等。故建议，苯甲醛可能可以作为芝麻蜂蜜的标记物质。3·马占相思树蜂蜜的挥发性成分中共检测到了23种物质，其中包括酯、醛、醇、酮、萜烯、烷烃和酸等7类物质。酯类和醛类物质含量均较高，并且糠醛、苯甲醛和苯乙醛在所有样品中均能检测到，说明醛类可能是影响马占相思树蜂蜜风味的主要物质。醇类物质在马占相思树蜂蜜的挥发性成分中也较多，但是由于其风味阈值高，其对蜂蜜的风味贡献不大。蜂蜜挥发性成分中其他类化合物种类数量少，可能对风味的贡献不大。通过对不同加工工艺节点的蜂蜜样品挥发性成分的分析，发现原料和浓缩后样品的挥发性成分总含量较高，而融蜜和过滤后样品的挥发性成分损失较大，其中浓缩是人为缩小体积而导致挥发性成分升高，故融蜜是蜂蜜风味保持的重要影响因素。本实验中通过对融蜜条件的进一步优化，发现71℃加热4min时，挥发性成分总含量相对较高。如果融蜜温度低（如60℃）则不足以去除蜂蜜的结晶并实现透明均一化，达不到融蜜的效果，而温度过高（如77℃）则易导致蜂蜜中营养成分的损失及风味的破坏。43 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光飞逝，不得不感慨时间的流逝，三年的研究生生活马上就要结束了。回望过去，理想与执着未曾改变，付出与回报并肩同行。在即将毕业之际,谨向所有关心、帮助我的老师、同学、朋友致以最真诚的感谢！首先，要感谢我的导师彭文君研究员，能够成为彭老师的学生是我的光荣与骄傲。彭老师学识渊博，对待科研态度严谨，为人和蔼可亲。三年来，彭老师对我各方面都包容慷慨，只要是我有想法，彭老师都给予最大的支持与帮助。彭老师对我的孜孜教诲我一直铭记于心，他为人处世的道理深深感染着我并一直激励我前进。“三载光景，白驹过隙”，珍贵的时光总是如此短暂，与恩师学习的经历于我之一生弥足珍贵，将为我的明天、为我的未来、为我的一生照亮前行。“春风化雨，润物无声”，老师的恩情永远铭记,在此谨向我的恩师彭老师致以最诚挚的感谢和最衷心的祝福。在整个论文设计，实验实施、文章发表及论文撰写中，我还要特别感谢我师兄赵亚周老师，他给了我无私的帮助和指导。另外，感谢产品室张红城老师在开题、中期和答辩前的指导及平时生活中的照顾。感谢产品室董捷老师、孙丽萍老师及徐响老师对我实验中难题困惑的解答与帮助。感谢中国标准化研究院史波林老师为我创造的实验条件。感谢中蜜公司方小明老师和密云县园林规划局罗其花师姐为我提供的样品。在试验和论文完成期间，感谢中国农业科学院杨艺婷师姐、延莎师姐、上海大学裴高璞师兄给予我的支持与帮助，同时感谢蜜蜂所孙春丽和盖琴宝等同学、汪雪玉和谭洪波等师妹们以及2012级硕士11班所有同学对我的关心与帮助。感谢中国农业科学院为我提供一个如此广阔的平台，感谢研究生院给予我成长的助力，感谢学生工作处佟继旭老师、杨建玲老师、张捷老师及研究生院全体老师对我的培养、关怀、信任与帮助，感谢与团委研究生会所有兄弟姐妹一起奋斗的美好时光，因为你们让我的研究生生活绚烂多彩，感谢蜜蜂所领导及全体老师对我的关爱、鞭策和鼓励。最后，我要感谢我的家人及亲朋好友，是你们对我无私的爱让我无比幸福，无比快乐，你们的支持是我最为坚实的后盾。“父母的养育之恩，恩师的教诲之情，朋友的相伴之谊”，我将毕生铭记，愿岁月静好，你们永葆青春；愿时光逆流，你们健康如意；愿时间静止，我们恒久相伴。任佳淼2015年4月52 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：任佳淼性别：女出生日期：1989年12月出生地：辽宁省沈阳市学历：硕士研究生学习经历：2008.09-2012.06本科辽宁医学院食品科学与工程2012.09-2015.06硕士中国农业科学院蜜蜂研究所食品科学曾获荣誉：中国农业科学院研究生院优秀学生干部中国农业科学院优秀共青团员发表文章：1·任佳淼,彭文君,田文礼,等.加工工艺对蜂蜜挥发性成分的影响[J].食品科学,2014,10:008.2·任佳淼，赵亚周，田文礼，等.不同蜜源蜂蜜的挥发性成分分析.中国食品学报.53