中国蜜蜂微孢子虫种质分布及侵染意蜂中肠的蛋白质组分析 71页

密级：论文编号：中囯农业科学院学位论文中国蜜蜂微孢子虫种质分布及侵染意蜂中肠的蛋白质组分析GermplasmDistributionofNosemaspp.inApismelliferainChinaandProteomicAnalysisinApismelliferaMidgutInfectedbyNosemacerana硕士研宄生：张建燕指导教师：王强副研宄员申请学位类别：农业推广硕士专业领域名称：养殖培养单位：蜜蜂研宄所2015年4月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年S月y日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：武達疼时间：1/>代年V月巧日 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目我国蜜蜂微孢子虫种质分布及侵染意蜂中肠的蛋白质组分析特种经济论文作者张建燕专业养殖研宂方向动物饲养指导教师王强培养单位（研宄所）蜜蜂研宄所硕（博）姓名职称单位专业签名导师评阅人答辩主席北京市农林科学院硕导口张芝利研宄员植物保护环境保护昆虫学.博导0研宄所硕导口中国科学院张润志研宄员昆虫学博导0动物研究所硕导口中国农业大学农学与高希武教授昆虫学博导0<生物技术学院答硕导口中国农业大学农学与彩万志教授昆虫学博导0生物技术学院辩硕导口中国农业大学农学与秦玉川教授昆虫学博导0生物技术学院委员会议记录（秘书）杨磊论文答辩时间地点2015年5月22号蜜蜂所会议室 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationGermplasmDistributionofNosemaspp.inApismelliferainChinaandProteomicAnalysisinApismelliferaMidgutInfectedbyNosemaceranaM.S.Candidate：ZhangJianyanSupervisor：ViceProf.WangQiangDegree：MasterofAgriculturalExtensionSpecialty:RearingApril2015 摘要蜜蜂作为昆虫模式生物，是自然界中的一种重要的授粉昆虫。微孢子虫病是由微孢子虫所引起的危害成年蜜蜂健康的一种重要疾病。它不仅影响了蜜蜂的消化系统，降低了蜜蜂的抵抗力，而且导致蜂王繁殖能力下降，使群势大幅下降。目前已知危害蜜蜂的微孢子虫有两种：一种是蜜蜂微孢子虫（Nosemaapis）；另一种是东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana）。据目前国际上的报道发现，东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana）已成为西方蜜蜂群中微孢子虫病的主要病原，对西方蜜蜂造成了更大的损失。鉴于我国这方面的系统研究尚少，有必要对我国主要意大利蜜蜂养蜂地区微孢子虫的种群分布进行进一步调查。此外，虽然关于微孢子虫病的相关报道越来越多，但蜜蜂的微孢子虫病致病机理及蜜蜂的免疫应激反应尚不是很清楚。为了明确蜜蜂的病原微孢子虫种群分布以及微孢子虫的致病机理，本研究通过采用多重PCR的方法对蜜蜂微孢子虫在全国主要养蜂地区的种群分布情况进行了调查；并采用iTRAQ技术，对东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana）侵染前后意蜂（Apismellifera）中肠组织进行了差异蛋白质组分析；结合受侵染蜜蜂蛋白质组分析结果对东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂的致病机理及蜜蜂的免疫反应进行了初步的探究。本实验所得到的主要结果如下：1.对采集自全国16个养蜂地区的69份样品进行了微孢子虫种质鉴定。鉴定结果发现，所有69份样品均发现了东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana），而仅在山东寿光的一份样品中同时检测到了东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana）和蜜蜂微孢子虫（Nosemaapis）。初步明确了东方蜜蜂微孢子虫在中国西方蜜蜂群中已成为主要的病原种，同时进一步验证了前人所报道的同一个蜂场可以同时感染2个种微孢子虫的现象。82.选取浓度为2×10个/mL的东方蜜蜂微孢子虫（Nosemacerana）对意蜂（Apismellifera）进行人工侵染，采用iTRAQ技术对侵染后24h、48h、96h、144h的病蜂进行蛋白质组研究，共鉴定到1888种蛋白质。3.对侵染后24h的意蜂（Apismellifera）及对照的中肠总蛋白质进行生物信息学分析和差异比较。我们检测到308个差异蛋白，其中表达上调的已知蛋白有48种，表达下调的已知蛋白有47种。结合GO功能分类以及KEGGPathway富集结果可知，多种差异蛋白与意蜂的免疫反应相关，其中整合素蛋白为意蜂受东方蜜蜂微孢子虫侵染后中肠组织病变中的主要差异蛋白。关键词：意大利蜜蜂；微孢子虫；种质分布；iTRAQ；差异蛋白质组I AbstractAsamodelinsect,honeybeeisanimportantpollinationinsect.Microsporidiosisisanimportantdiseasecausedbymicrosporidia(Nosemaspp.)inadulthoneybee.Itdoesn’tonlyaffectthedigestivesystemandreducetheimmunityofhoneybee.Atthesametime,italsocaninducethedeclineofqueen’sbreedingability,andeventuallyleadstothegreatlydeclineofColonysituation.Therearetwospeciesofmicrosporidiathatcaninfecthoneybee,includingNosemaapisandNosemacerana.Accordingtothecurrentinternationalreports,wecanfindthatNosemaceranahasbeenanimportantparasiteinApismellifera,andmakemuchlossinApismellifera.BecausetherelatingreportsofChinaislesstosee.ItisnecessarytoinvestigatethedistributeofNosemaceranainApismelliferafromthemainareasofbeekeepinginChina.Althoughthereportsaboutmicrosporidiosisismoreandmore,itspathogenesisandtheimmunestressresponseofbeesisnotsoclear.ToconfirmthedistributionofNosemaceranaanditspathogenesistoApismellifera,thisstudyconductaninvestigationofthedistributionofNosemaceranainApismelliferafromthemainareasofbeekeepinginChinabymulti-PCR,andstudiedonthedifferencesinproteomicanalysisofApismelliferaepithelialtissueafterinfectedbyNosemaceranawithiTRAQ.Accordingtotheresultofdifferencesinproteomicanalysis,wecanmakeaprimarystudyonNosemacerana’spathogenesistoApismelliferaandtheimmunestressresponseofbees.Themainresultsofthisstudyasfollows:1.Weidentifiedthemicrosporidiaspeciesof69samplesfrom16provincesandcitiesofbeekeepinginChinabythetechnologyofmulti-PCR.Fromtheresult,wecanseethatNosemaceranawasfoundinallthe69samples,butbothofthetwomicrosporidiaspecieswerefoundonlyinshouguangShandongprovince.WehaveprimarylyconfirmedthatNosemaceranahasbeenthemajorpathogeninApismellifera.Atthesametime,wehadthefurtherconfirmthephenomenonreportedbyothersthatthetwomicrosporidiaspeciescanbepresentinthesamebeefieldatthesametime.82.WechosetheNosemaceranaconcentrationof2×10/mLtoinfecttheworkerbee,andresearchedthedifferencesinepithelialproteomicanalysisofinfectedrespectivelyafter24h、48h、96hand144hbythetechnologyofiTRAQ.Weidentified1888speciesofprotein.3.Weconductedbioinformaticsanalysisanddifferencecontrastsonthesampleofinfectedafter24hbyNosemaceranaandthecontrol.Wedetected308speciesdifferentialproteins.48oftheseareup-regulatedand47ofthesearedown-regulated.CombinedtheresultsofGOfunctionclassificationandKEGGPathwaygathering,wecanseethatmanydifferentialproteinsarerelatedtotheimmunityresponseofhoneybee,andamongtheseproteinswefoundaproteinnamedintegrin.ItistheimportantdifferentproteinofintestinaltissuepathologicalchangesinApismelliferainfectedbyNosemacerana.Keyword:Apismellifera;Nosemaspp.;Germplasmdistribution;ITRAQ;DifferentialproteomeII 目录第一章引言.....................................................................................................................11.1蜜蜂的生物学特征及其价值...................................................................................11.1.1蜜蜂的生物学特征............................................................................................11.1.2蜜蜂的价值........................................................................................................11.2蜂产业的发展现状及蜜蜂病虫害...........................................................................11.2.1养蜂业的发展现状............................................................................................11.2.2蜜蜂的主要病虫害............................................................................................21.3蜜蜂微孢子虫及蜜蜂微孢子虫病...........................................................................31.3.1蜜蜂微孢子虫的生物学特性............................................................................31.3.2蜜蜂微孢子虫病................................................................................................31.4蜜蜂蛋白质的研究进展...........................................................................................41.4.1蛋白质组及蛋白质组学....................................................................................41.4.2蜜蜂蛋白质组学研究........................................................................................51.4.3蛋白质组学研究技术........................................................................................61.5本实验研究目的、意义以及主要研究内容...........................................................71.5.1研究目的............................................................................................................71.5.2研究意义............................................................................................................71.5.3主要研究内容....................................................................................................7第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查...............................................................................82.1材料与方法...............................................................................................................82.1.1供试蜜蜂............................................................................................................82.1.2化学试剂..........................................................................................................112.1.3主要仪器设备..................................................................................................122.1.4实验方法与步骤..............................................................................................132.2结果与分析.............................................................................................................142.2.1东方蜜蜂微孢子虫电泳结果..........................................................................142.2.2西方蜜蜂微孢子虫电泳结果..........................................................................15III 2.2.3测序结果..........................................................................................................162.3讨论.........................................................................................................................16第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析.........................................173.1实验材料与方法.....................................................................................................173.1.1实验材料..........................................................................................................173.1.2实验试剂..........................................................................................................173.1.3实验仪器..........................................................................................................183.1.4数据采集及处理过程中使用的软件信息......................................................183.1.5实验步骤..........................................................................................................193.2结果与分析.............................................................................................................243.2.1微孢子虫鉴定结果..........................................................................................243.2.2蛋白质定量结果..............................................................................................243.2.3HPLC色谱结果...............................................................................................253.2.4蛋白定性、定量及生物信息学分析..............................................................263.3讨论.........................................................................................................................48第四章全文结论.............................................................................................................514.1全国蜜蜂微孢子虫种群分布调查.........................................................................514.2病蜂中肠差异蛋白质组分析.................................................................................514.3侵染24H后差异蛋白质组分析.............................................................................514.4前景展望.................................................................................................................51参考文献.............................................................................................................................52致谢.................................................................................................................................60作者简历.............................................................................................................................61IV 图目录图2.1样品分布图...........................................................................................................10图2.2所有样品均仅检测出166bp的看家基因β-actin带和218bp的东方蜜蜂微孢子虫N.ceranae带...........................................................................................................15图2.3SG泳道为山东寿光的样品，检测出了321bp的蜜蜂微孢子虫N.apis条带15图3.1所需要蜜蜂微孢子虫种质鉴定...........................................................................24图3.2SDS-PAGE检测胶图...........................................................................................25图3.3SCX分离图..........................................................................................................25图3.4差异蛋白分子量分布...........................................................................................31图3.5差异蛋白等电点分布...........................................................................................32图3.6细胞组分中所涉及的上调蛋白...........................................................................33图3.7生物进程中所涉及到的上调蛋白.......................................................................34图3.8分子功能中所涉及到的上调蛋白.......................................................................37图3.9细胞组分中所涉及的下调蛋白...........................................................................40图3.10生物进程中所涉及到的下调蛋白.....................................................................42图3.11分子功能中所涉及到的下调蛋白.....................................................................43图3.12致病性大肠杆菌感染通路.................................................................................47图3.13白细胞跨内皮层迁移通路.................................................................................48V 表目录表2.1样品信息.................................................................................................................8表2.2PCR反应体系.......................................................................................................13表3.1肽段标记信息.......................................................................................................20表3.2HLPC液相梯度....................................................................................................21表3.3Q-E质谱仪参数...................................................................................................21表3.4NanoLC液相梯度................................................................................................22表3.5筛选参数...............................................................................................................22表3.6检索参数...............................................................................................................22表3.7定量参数...............................................................................................................23表3.8蛋白质定量结果...................................................................................................24表3.9总蛋白检索结果...................................................................................................26表3.10上调蛋白信息.....................................................................................................26表3.11下调蛋白信息.....................................................................................................29表3.12细胞组分中所涉及的上调蛋白.........................................................................32表313生物进程中所涉及的上调蛋白.........................................................................33表3.14分子功能中所涉及的上调蛋白.........................................................................35表3.15细胞组分中所涉及的下调蛋白.........................................................................38表316生物进程中所涉及的下调蛋白.........................................................................41表3.17分子功能中所涉及的下调蛋白.........................................................................43表3.18KEGG通路信息.................................................................................................45表3.19以上两个通路具体信息.....................................................................................48VI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1蜜蜂的生物学特征及其价值1.1.1蜜蜂的生物学特征蜜蜂在世界范围内（除南极以外）分布广泛，寿命短，蜂王的繁育能力强使蜜蜂蜂群能够基本维持在万只以上的蜜蜂数量上，并使其持续拥有足够的工蜂采集蜂；蜜蜂是一种易于人工饲养的群居性昆虫；蜜蜂的飞行半径可以达到3km以上，在植物开花的季节，蜜蜂的飞翔和采集能力较强，对花粉、花蜜、甘露、蜂胶和水等食物进行大量的贮存；蜜蜂对于花粉和花蜜的采集具有单一性，且蜜蜂对植物保护性农药，如杀虫剂等反应较为敏感（吴黎明等，2008）。1.1.2蜜蜂的价值蜜蜂是自然界中的一种重要的授粉昆虫，它是最具有经济效益的授粉者，根据估计约有35%的人类食物消耗直接或间接地依赖于昆虫授粉(Delaplaneetal.,2000)。对于欧洲农作物而言，84%的产量至少在某种程度上而言依赖于动物授粉(Kleinetal.,2007)。而蜜蜂，尤其是意大利蜂(Apismellifera)对于世界上的单一栽培植物而言是最具有经济价值的授粉者(McGregor,1976;Watanabe,1994)，一些水果、种子以及干果作物在没有这些授粉者的情况下将有可能减产90%以上(Southwicketal.,1992)。不仅如此，蜜蜂授粉对于生物多样性的作用是无价的，授粉者种类的减少将导致植物物种种类的平行性下降(Biesmeijeretal.,2004)。由于蜜蜂的授粉作用，为农作物和野生植物进行授粉使其成为现代世界农业生产以及生态系统中的一种不可或缺的重要元素(Jaffeetal.,2010;Kleinetal.,2007;Pottsetal.,2010)。同时，蜜蜂具有较高的经济学价值，用2006年的每吨蜂蜜584美元来计算，2007年全球蜂蜜总收益为12.5亿元(Vanengelsdorpetal.,2010)。从养蜂中所获得的平均年收入相对较高，能够占到养蜂者总的年收入的28.95%，这充分证明了养蜂在农村地区收入的提高和多样化方面具有重要的作用(Adgabaetal.,2014)。蜜蜂独特的生物学特性使蜜蜂及蜂产品成为环境污染监测的一种经济、有效的生物指示器（张复兴，1998）。蜜蜂和蜂产品可以用来监测杀虫剂、空气和环境中的重金属，放射性污染水平的监测，有机物污染和转基因植物检测（吴黎明等，2008）。另外，蜂产品作为食品或者是药品和医学产品的添加剂具有相当大的市场(Moritzetal.,2010)。在从甜菜和甘蔗中提纯蔗糖的工艺提高之前，蜂蜜是欧洲人唯一的可以获取的可食用甜料(Voorhiesetal.,1933)。1.2蜂产业的发展现状及蜜蜂病虫害1.2.1养蜂业的发展现状在过去的几十年里，管理型的蜂群数量不断下降(Pottsetal.,2010)，尤其在欧洲的整个地区都在不断地下降(Vanengelsdorpetal.,2010)。而野生蜂的数量也在不断地下降(Jaffeetal.,2010;Krausetal.,1995;Moritzetal.,2007)，很有可能是因为土地利用的加强、杀虫剂的毒害、病害以及很多虫1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言害(Moritzetal.,2010)。当野生蜂不再进入农田时，饲养蜂成为唯一的一种农作物授粉的途径(Kleinetal.,2007)。随着野生的非蜜蜂授粉者种类和数量的不断下降，蜜蜂饲养与管理变得比之前更为重要，但蜜蜂蜂群的健康正在受多方面因素的影响(Moritzetal.,2010)。蜜蜂种群衰竭失调的原因仍然不够明确，它至今仍旧是一个未解之谜(Hutchisonetal.,2007)，它可能是虫害及饲养管理共同协作的结果(Moritzetal.,2010)。1.2.2蜜蜂的主要病虫害由于蜂群衰竭失调（CCD）对国际养蜂业的严重影响，世界各地的研究人员不得不对引起蜜蜂种群下降的病原学原因进行彻底的研究(Cox-Fosteretal.,2007)。目前已知比较常见的蜜蜂病虫害包括：病毒病、螨虫病、微孢子虫病以及细菌病。目前已鉴定出至少有18种病毒能够侵染蜜蜂幼虫或成蜂(Baileyetal.,1991;Ribièreetal.,2008)。即使健康的蜂群也存在病毒隐性感染的情况(Tentchevaetal.,2004)。螨是一些病毒的载体，同样地，一些病毒似乎与微孢子虫的侵染也具有密切地相关性(Moritzetal.,2010)，能够明显地影响微孢子虫对蜜蜂的致病性(Baileyetal.,1991)。这表明蜜蜂的病虫害之间可能存在着相互协同的作用。残翅病病毒由于和螨具有紧密的相关性(Bowen-Walkeretal.,1999)，成为了目前分布最广泛的一种病毒(deMirandaetal.,2010;Ribièreetal.,2008)。残翅病病毒伴随着螨几乎无所不在地分布于整个欧洲(Allenetal.,1996)。残翅病病毒是蜜蜂致病率最低的一种病毒，它对于蜜蜂个体的危害仅仅是由于它与螨的相关性(Moritzetal.,2010)。黒蜂王台病毒本身并没有独特的致病性，但是它通过后续进一步的危害与微孢子虫的侵染发挥协同效应(Baileyetal.,1981,1983)。最近的研究表明他存在于法国和中欧30%的蜂群中(Berenyietal.,2006;Gauthieretal.,2007;Tentchevaetal.,2004)，这使它成为了一种比较重要的病毒。以色列急性麻痹病病毒是包括克什米尔蜜蜂病毒以及急性蜜蜂麻痹病病毒在内的一种较大的种群复合体中的一部分(deMirandaetal.,2010)，在美洲，以色列急性麻痹病病毒已经被认为是与蜜蜂种群衰竭失调有关的一个因素(Cox-Fosteretal.,2007;Johnsonetal.,2009)。寄生的小螨虫无疑是世界蜂产业效益的一大障碍(Sammataroetal.,2000)。这种蜜蜂的专性寄生虫既存在于蜜蜂的幼虫期，也可以寄生在成蜂体内，并在幼虫体内进行繁殖(Moritzetal.,2010)。尽管它对于它的最初宿主亚洲蜜蜂（东方蜜蜂）而言几乎造成不了太大的危害，但是对于30年前转移到的宿主欧洲意蜂种群而言它具有致命性的危害(Matheson,1993)。螨虫的防治严重依赖于会残留在蜂蜜和其他蜂产品内的化学药物(Bogdanov,2005)，虽然如此，几个小的欧洲蜜蜂种群却能够不使用化学控制也能在有螨虫寄生的情况下存活(Friesetal.,2006,2007;LeConteetal.,2007,2010;Nordstrometal.,1999)。当然，还有一些欧洲蜜蜂种群从未受到螨虫的侵染，比如法国乌埃尚岛、瑞典的很大一部分地区以及波罗的海的爱尔兰的芬兰岛(Moritzetal.,2010)。由小孢子虫属的微孢子虫是一种世界范围内的成蜂肠道寄生虫(Moritzetal.,2010)，它所引起的蜜蜂微孢子虫病是蜜蜂种群衰竭失调的一个原因(Higesetal.,2008;Martin-Hernandezetal.,2007),它对世界范围内的蜂产业造成重大的经济影响(Gierschetal.,2009;Heintzetal.,2011;vanEngelsdorpetal.,2008;Vanengelsdorpetal.,2010)。它们侵染宿主的中肠上皮细胞，并破坏受侵染蜂2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的代谢进程(Fries,1988,1993)。细菌性病原体比如孢子形状的类芽孢杆菌幼虫能够引起美洲幼虫腐烂病，这种病是蜂产业中最为严重的细菌性疾病，尽管早在100多年前这种疾病已经被鉴定出来，但它目前依旧是欧洲养蜂业的一大困扰(Moritzetal.,2010)。蜜蜂病虫害的产生受多方面因素的影响，包括蜜蜂饲养生产、宿主的基因变化或者是气候(Botiasetal.,2012;Fenoyetal.,2009;Fontbonneetal.,2013;Fries,2010;Gisderetal.,2010;Jaraetal.,2012;Martin-Hernandezetal.,2009,2012)。1.3蜜蜂微孢子虫及蜜蜂微孢子虫病1.3.1蜜蜂微孢子虫的生物学特性微孢子虫是一种细胞内专性寄生原生生物(Corradietal.,2009;Martin,2001)，主要分布于主要的动物细胞内，包括昆虫和其他的无脊椎动物(Larsson,1986)，但是也有一些会寄生在脊椎动物比如人体细胞内(Canningetal.,1986;Weberetal.,1994)。目前已知的微孢子虫种类包括1000多种，它们分别归属于将近150多个属(Wittneretal.,1999)。微孢子虫首先是由Nageli于1857年在家蚕中发现的，并将其命名为Nosemabombycis。目前，在人体中发现的微孢子虫属有7个，而蜂小孢子虫属（Nosemaapis）和蚕小孢子虫属（Nosemabombycis）很少在人体中发现，大部分的小孢子虫属的微孢子虫寄生于无脊椎动物体内(Franzena,2001)。微孢子虫的孢子的直径约1.0~3.0μm，在不被染色的条件下很难在光镜下观察到。在蜜蜂体外微孢子虫以孢子形态生存，孢子呈长椭圆形，长5~6μm，宽2.2~3.0μm，孢子外壳为几丁质，内有双核、液泡和极丝，极丝以螺旋形式卷曲在液泡里（王强等，2009）。目前人们已知的微孢子虫结构差异性主要表现在两种微孢子虫上，一种是家蚕微孢子虫，另一种是桑尺蠖类孢子虫(Kudo,1920)。与其他真核生物有所不同的是微孢子虫不含有线粒体、微粒体和中心粒，并且具有和原核生物大小一致的70S核糖体，是由分别含有23S和16SRNA的50S和30S亚基组成。此外，与其他真核生物最显著的区别是微孢子虫Vairimorpha.Necatrix内未发现有5.8SRNA的存在，其5.8SRNA的同源序列存在于23S大亚基RNA上(Vossbrincketal.,1986)。1.3.2蜜蜂微孢子虫病1.3.2.1蜜蜂微孢子虫病及其诊断方法微孢子虫的孢子可伴随水或食物进入蜜蜂中肠，在碱性环境的中肠内，微孢子虫的孢子壁通透性得以改变，从而使内部渗透压升高，进一步压迫极丝由极帽射出孢子体进入蜜蜂中肠细胞（王强等，2009）。目前所常用的蜜蜂微孢子虫病的诊断与鉴定方法包括：光学显微镜检测，形态学鉴定，内部超微结构鉴定，分子生物学检测，特异性PCR扩增法，PCR产物测序法，多重PCR法以及PCR-RFLP法，另外还有微孢子虫的免疫学检测与鉴定法（吴杰等，2010）。其中，多重PCR法不仅具有PCR方法的一般特性，及灵敏度和准确性高，同时，它可以在同一反应中加入两对或两对以上的引物以达到对同一样品中两种微孢子虫进行检测与鉴定的目的。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.3.2.2蜜蜂微孢子虫病研究进展蜜蜂微孢子虫广泛分布于世界上所有的养蜂地区(Matheson,1993)。目前，已知的侵染蜜蜂脑室上皮的微孢子虫有两类，一类是蜜蜂微孢子虫（Nosemaapis）(Zander,1909)，另一类是东方蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae）(Friesetal.,1996)。在欧洲早在100多年前就已经对蜜蜂微孢子虫进行相关描述并有大量文献对其进行记载(Baileyetal.,1991)。但是，近来已经在意蜂体内检测到了东方蜜蜂微孢子虫，并且现在在温带地区已经表现为蜂群主要的疾病(Heintzetal.,2011;Hgesetal.,2010;Higesetal.,2008;Martin-Hernandezetal.,2007,2012)。东方蜜蜂微孢子虫最初是在亚洲蜜蜂（东方蜜蜂）（吴杰等，2010）体内发现的，但是现在已经在几个地域位置较远的蜂种中检测到了东方蜜蜂微孢子虫的存在，比如欧洲(Higesetal.,2006)，美洲(Kleinetal.,2007)，亚洲(Huangetal.,2007)，非洲(Higesetal.,2009)以及大洋洲(Gierschetal.,2009)。东方蜜蜂微孢子虫在意蜂体内的分布受到了蜂产业贸易全球化的影响(Kleeetal.,2007)。对加那利群岛的蜂群进行微孢子虫的检测和鉴定发现，151份样品中没有发现蜜蜂微孢子虫，其中有52份样品中检测到有东方蜜蜂微孢子虫，在1998年以前未在任何一个岛屿上检测到东方蜜蜂微孢子虫，然而自2008年之后的研究发现拉斯帕尔马斯的蜂群感染东方蜜蜂微孢子虫的几率竟达到了75%，并且在近几年感染频率一直处于明显的上升趋势，这种现象可能是由于蜂王的引入所造成的(Munozetal.,2014)。有报道显示，两种微孢子虫分布的不同与不同的气候条件分布状况一致(Botiasetal.,2012;Fenoyetal.,2009;Fries,2010;Gisderetal.,2010)。蜜蜂微孢子虫的侵染与较冷的气候相关，而东方蜜蜂微孢子虫则在较温暖的气候地区占主导地位(Fenoyetal.,2009;Gisderetal.,2010)。基于目前对两种微孢子虫分类及诊断方法的研究，发现蜜蜂微孢子虫已不再是侵染西方蜜蜂的唯一的一种微孢子虫，东方蜜蜂微孢子虫已对西方蜜蜂造成了一定的危害(Higesetal.,2006)。通过对取自我国养蜂地区意蜂体内的微孢子虫的16SrRNA进行序列分析，结果显示所检测的微孢子虫几乎全部为东方蜜蜂微孢子虫（刘锋，2009）。尽管东方蜜蜂微孢子虫并未在个体寄主蜂体内表现出竞争优势(Forsgrenetal.,2010)，但是东方蜜蜂微孢子虫有逐渐取代蜜蜂微孢子虫在意蜂体内生态位的趋势(Kleeetal.,2007)。1.4蜜蜂蛋白质的研究进展1.4.1蛋白质组及蛋白质组学首先，蛋白质组的定义最初是由澳大利亚麦考瑞大学的MarcWilkins于1994年提出的(Wasingeretal.,1995)，蛋白质组是指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein)。蛋白质学本质上是指在整体、动态、定量的水平上研究蛋白质特征，从而对基因组有更进一步的了解，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白的相互作用等，由此获得蛋白质水平上关于疾病发生及生理生化反应等细胞代谢过程的整体而全面的了解(Andersonetal.,1998)。目前蛋白质组的研究主要分为两个部分：一是研究蛋白质的表达，二是研究蛋白质的功能及相互作用关系，具体包括样品中蛋白质种类的发掘与鉴定、蛋白质表达图谱的建立、蛋白质网络的建立以及蛋白质的修饰与定位(Liebler,2002)。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言蛋白质组学的研究策略有两种：一种是完全蛋白质组学，目的是检测一种细胞类型或一种组织内基因组表达的所有蛋白质，另一种是差异蛋白质组学，主要筛选和鉴定不同种类或不同状态下各样本之间蛋白质组的差异和变化（何大澄等，2002）。1.4.2蜜蜂蛋白质组学研究随着西方蜜蜂（Apismellifera）基因组测序的完成以及精确的基因图谱的建立(Gramatesetal.,2006)，蜜蜂研究进入了后基因组时代即功能基因组时代，蛋白质组学的研究逐步成为蜜蜂研究的一个热点。蜜蜂卵期为蜜蜂发育的重要阶段，蜜蜂的卵细胞可在体外长期培养，因此，蜜蜂胚胎发育期蛋白质组的研究对其作为昆虫模式生物具有重要意义（李建科等，2011）。目前的研究表明，意大利蜜蜂的工蜂和雄蜂卵的蛋白质均在2日龄时表达最为活跃（张兰等，2007；房宇等，2008,2009），其中与碳水化合物和能量代谢、细胞骨架、抗氧化和生长调节相关的差异蛋白质在卵的发育过程中具有重要作用，并且有很大一部分在卵发育中后期所表现出的表达水平较高(Lietal.,2009)。幼虫期时蜜蜂体重从大约0.15mg增长到150mg，上千倍的体重改变使其成为蜜蜂生长发育最快的一个时期(Wang,1965)。研究表明，4日龄的幼虫表达处于高峰期（陈健等，2008；李建科等，2008；Liaetal.,2007）。对5~6日龄的意蜂幼虫进行研究表明，营养储存蛋白、转运相关的蛋白以及受体蛋白表达随着幼虫发育而上调，而与翻译和蛋白质周转相关的蛋白质表达下调，同时发现除酚氧化酶和apisimin的表达同幼虫发育呈现正相关以外，其他免疫相关蛋白质随着发育的进行表达量变化不显著。蛹期是蜜蜂胚后发育最长的时期，各日龄的蛋白质随着蛹的生长呈上升的趋势，并且大部分与细胞骨架、代谢及抗氧化相关的蛋白质会随着日龄的增长呈现明显的增高的现象（李建科等，2011）。对于合成信息素的蜂王上腭腺和合成王浆的上腭腺蛋白质组分析发现，只有在蜂王中乙醛脱氢酶1、中联乙酰辅酶A脱氢酶和电子转移黄素蛋白α进行表达，而脂肪酸合酶只在工蜂中进行表达，这蜜蜂上腭腺在乙醛/脂肪酸代谢方面具有细胞类型和级型的选择性(Hasegawaetal.,2009)。意蜂1-20日龄的工蜂咽下腺中与能量代谢、发育调节、蛋白质合成、蛋白质折叠、转运、抗氧化、细胞骨架和王浆主蛋白等相关的蛋白质在咽下腺发育前期表达量较高，而在咽下腺的发育后期，与花蜜相关的蛋白质表达上调（李建科等，2011）。并且，在咽下腺蛋白质组分析中发现了一些与发育相关同时也是基因敲除、转基因和RNAi等生物技术操作过程中的靶蛋白(Fengetal.,2009)。通过对蜜蜂血淋巴蛋白质组分析发现，酶是血淋巴蛋白中最丰富的物质，包括参与蛋白质和碳水化合物代谢的酶，另外还有结构蛋白、转运和储存蛋白以及免疫相关蛋白、王浆主蛋白以及一些功能未知的蛋白(Fengetal.,2009)。在雄峰淋巴液中发现了一种可以作为诊断蜜蜂残翅病的分子标记的多聚蛋白(Chanetal.,2006)。于2004年相关文献报道了受微孢子虫感染前后意蜂血淋巴蛋白的变化（周婷等，2004）。另外，对于蜜蜂维持雄蜂精液蛋白质组和维持雄蜂精液蛋白活性功能蛋白质组的研究已有相关的报道(Baeretal.,2009;Collinsetal.,2004;denBoeretal.,2009)，花粉(Lietal.,2008)、王浆(Sanoet5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言al.,2004;Scarsellietal.,2005;Schönlebenetal.,2007)等蜂产品以及蜂毒(Peirenetal.,2005)蛋白质组的相关研究工作也已经完成。1.4.3蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究的理论和技术基础包括：大量的基因组序列信息、蛋白质的分离技术、质谱分析技术以及生物信息学技术（李建科等，2011）。首先，在蛋白质的分离纯化技术中，根据分子大小进行分离的方法包括：透析、超滤、离心和凝胶过滤；根据溶解度的不同进行分离纯化的方法主要包括等电点沉淀法、pH调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法等；根据电荷的不同进行分离主要包括电泳和离子交换层析两种；利用对配体的特异性亲和力进行分离纯化的方法为亲和层析法（王子佳等，2009）。层析技术具有分离效率高的特点，和电泳分离技术相比层析过程更易于放大和自动化（李恩江，1992），并且适用性广。包括分子筛层析、羟基磷灰石层析、离子交换层析、疏水作用层析、反向作用层析以及亲和层析等。目前比较成熟的蛋白质研究中的定量方法有两种（谢秀枝等，2011）：一种是基于传统的双向电泳及染色；另一种是基于质谱技术。其中，双向电泳技术是一种通过对样品进行第一向的等电聚焦以及第二向的SDS-PAGE凝胶分离相结合的方法对蛋白质进行分离的技术。双向电泳技术是目前能够覆盖的蛋白质数目最多的一种技术，因此它仍旧是目前较为常用的蛋白质分离技术（李鑫，2006）。差异凝胶电泳技术是在双向电泳的基础上加以改进，对不同的两个样品应用荧光进行标记后同时上样，以检测两个样品中差异表达的蛋白质，从而消除了双向电泳在技术上的不平行性以及操作上的差异对电泳结果的影响(Lilleyetal.,2004;Zhouetal.,2002)。但是双向电泳本身受到的蛋白质丰度、大小、pH和疏水性等条件的影响，使其应用范围受到了影响，且操作费时费力不易自动化（谢秀枝等，2011）。基于质谱的蛋白质定量技术又可分为：标记定量技术和非标记定量技术。其中，同位素标记相对和绝对定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ）是一种标记反应中单肽来自于自由氨群的相对定量技术，标记反应在体外进行，且最多可同时对8个样品进行相对量化。iTRAQ试剂几乎可以和样品中所有的蛋白结合且易受样品处理过程中缓冲液的污染，另外iTRAQ试剂价格昂贵也是其不能广泛应用的一个制约因素（谢秀枝等，2011）。采用iTRAQ技术与多维液相色谱及质谱连用，具有高灵敏度、可重复性以及准确性高等特点，使其成为目前蛋白质定性和定量研究中的主要技术手段（谢秀枝等，2011）。在实际的研究工作中，往往不够能单纯地利用一种技术对蛋白质分离纯化，需要结合几种技术才能够达到分离纯化蛋白质的目的，我们需要根据分离纯化的目的及蛋白质的性质对分离纯化方法进行选择。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.5本实验研究目的、意义以及主要研究内容1.5.1研究目的通过对蜜蜂微孢子虫在全国主要养蜂地区的种群分布调查，了解国内蜜蜂微孢子虫的分布状况；通过分析微孢子虫侵染前后蜜蜂中肠上皮组织及血淋巴内蛋白质的含量和种类变化，寻找与蜜蜂微孢子虫病相关的特异性蛋白。1.5.2研究意义近年来，由于蜜蜂微孢子虫对蜜蜂（意蜂）的侵染对蜜蜂个体乃至蜂群均造成了巨大影响，蜜蜂微孢子虫病的研究已成为蜜蜂病虫害研究的热点内容之一。对于蜜蜂微孢子虫的种群分布调查，国外已有相关的报道。但是，这些只是其他国家或地区的蜜蜂微孢子虫的种群分布情况，对于我国主要养蜂（意蜂）地区蜜蜂微孢子虫的种群分布情况鲜有报道。从目前对蜜蜂微孢子虫病的研究进展来看，国内外同时出现了东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂的现象，但国内研究由于采样时间、地区等条件的限制尚不能够明确地表明目前国内东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂的情况，为了更好地补充国内蜜蜂微孢子虫病的研究的不足，本实验对全国范围内主要养蜂地区侵染意蜂的微孢子虫种类进行鉴定，以对蜜蜂微孢子虫病的基础研究进行进一步的完善，并为蜜蜂微孢子虫病的染病机制研究以及有效防治奠定了一定的理论基础。对于目前蜜蜂种群衰竭失调的可能因素之一的蜜蜂微孢子虫病而言，其现有的诊断方法如形态学检测法、PCR鉴定法以及免疫学检测法等多为实验室鉴定方法，很难在养蜂的生产实践中得以应用，并且目前就蜜蜂微孢子虫病而言尚未有能够对其预防和治疗有效而可靠的药物。蜜蜂微孢子虫病的致病机理成为蜜蜂微孢子虫病预防和治疗的一大障碍，而蛋白质组学研究成为人们对于生物的新陈代谢以及疾病等认识的重要途径。蜜蜂微孢子虫病是由微孢子虫侵入蜜蜂中肠上皮细胞所引起的，因此，对于微孢子虫侵染前后蜜蜂中肠组织蛋白质组的研究对于蜜蜂微孢子虫病的致病机理以及蜜蜂微孢子虫病的预防和进一步的的治疗具有重大意义。另外，对于蜜蜂微孢子虫病致病机理的探究以及病蜂差异蛋白的发现也将有助于能够应用于养蜂实践中的蜜蜂微孢子虫病的快速、简便而有效的检测技术或方法的发掘与应用。1.5.3主要研究内容1.采用多重PCR法对全国主要养蜂（意蜂）地区的蜜蜂微孢子虫种类进行分布调查；2.分析东方蜜蜂微孢子虫侵染前后意蜂中肠组织差异蛋白质组；3.根据东方蜜蜂微孢子虫侵染前后意蜂中肠组织差异蛋白质组研究结果进行生物信息学分析，对东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制进行初步探究。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查蜜蜂微孢子虫病是侵染西方蜜蜂并造成危害的主要病虫害，主要侵染成年蜜蜂的中肠细胞。目前已知能够侵染蜜蜂并造成危害的微孢子虫种类有蜜蜂微孢子虫(Nosemaapis)以及东方蜜蜂微孢子虫(Nosemaceranae)两个种。自2006年起陆续有研究人员在欧洲、美洲及台湾等地区的西方蜜蜂群（Apismellifera）中发现被东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）侵染的现象，尤其近些年的研究发现在许多国家或地区西方蜜蜂群（A.mellifera）中东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）有逐渐取代蜜蜂孢子虫（N.apis）成为主要病原种的趋势。由于东方蜜蜂微孢子虫对西方蜜蜂具有相对更强的侵染性和致病性，越来越多的研究人员倾向于认为东方蜜蜂微孢子虫是造成近些年欧美地区西方蜜蜂大面积死亡的一个重要原因。鉴于此，调查蜜蜂微孢子虫种群分布陆续成为各国的研究热点。本项实验试图参考国外最新的蜜蜂微孢子虫种群鉴定技术，对我国主要养蜂地区发生的微孢子虫样本进行种质鉴定，明确目前我国发生与流行的蜜蜂微孢子虫种类，从而为蜜蜂微孢子虫在我国的流行规律研究及防治工作奠定一定的基础。2.1材料与方法2.1.1供试蜜蜂样品采集自中国16个养蜂地区的69份病蜂样品(见表2.1和图2.1)。所有样品均经镜检确定含有微孢子虫。表2.1样品信息Table2.1Themessagesofthesamplescollected省份采集地点采集时间编号绥化市纯棱县4.121黑河市嫩江县5.92黑龙江双鸭山市宝清县5.83海林市6.174盘石市2.15吉林白山市靖宁县5.126北票市蒙古营乡7.287辽宁丹东市宽甸11.138商洛市商南县5.99陕西咸阳市礼泉县7.310渭南市富平县12.711沧州市河间5.2112河北承德市5.2213保定市涞源县王安镇5.26148 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查省份采集地点采集时间编号门头沟区4.215房山区4.816昌平区4.1817海淀区香山4.2118通州区4.2219海淀区香山4.2320房山区4.2621房山区4.2622北京密云县太师屯镇5.223海淀区香山5.824海淀区香山5.925门头沟区5.2626房山区5.2727海淀区香山8.2828门头沟区9.2929门头沟区-30晋城市沁水县苏云乡5.531山西临汾市汾西县5.2432南通市如东县3.833徐州市丰县3.1534江苏佛山市向荣市4.135南通市如皋市6.636扬州市仪征岳塘乡11.1837济源市3.1238南阳市新野县4.1739河南漯河市西平县4.2940洛阳市宜阳县赵堡乡4.2941郑州市6.1542滁州市来安县2.2543合肥市巢湖市3.1044滁州市凤阳县3.1245安徽滁州市凤阳县4.246六安市舒城县4.847池州市青阳县5.948黄山市歙县深渡镇15.16499 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查省份采集地点采集时间编号黄山市歙县深渡镇25.1650文安市10.1451浙江嘉兴市永江3.2652天门市2.753黄冈市浠水县3.354黄冈市红安县3.3155湖北孝感市安陆市濮水镇4.1456武汉市5.157襄樊市南漳县6.1758湖南常德市4.759内江市威远县镇西镇3.560四川峨眉山市3.2661深圳市坪山新区8.1162广东深圳市龙肖区9.663德州市宁津县4.764烟台市牟平区王格庄镇5.965山东济南市5.966潍坊市寿光市111.1467潍坊市寿光市211.1468图2.1样品分布图Fig.2.1Samplesdistributionmap10 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查2.1.2化学试剂CTAB、Tris、EDTA、NaCl、超纯水、液氮、蛋白酶K溶液、苯酚、氯仿、95%乙醇、70%乙醇、琼脂糖、TAE缓冲液、Goldview、loadingbuffer、Taq酶试剂盒2.1.2.1HBRC提取缓冲液0.03M的CTAB、0.05M的Tris、0.01M的EDTA、1.1M的NaCl，CTAB10.935gTris6.057gEDTA2.92248gNaCl64.284g超纯水800mL调节PH至8.0超纯水定容至1L贮存于4℃2.1.2.20.5M的EDTANa2EDTA.2H2O186.1gdH2O800mL用NaOH调节PH至8.0定容至1L高温灭菌后室温保存。2.1.2.3蛋白酶k溶液（20mg/mL）蛋白酶k200mg超纯水9.5mL超纯水定容至10mL分装成小份贮存于-20℃2.1.2.4苯酚氯仿（1:1）苯酚2mL氯仿2mL混匀避光保存2.1.2.53M醋酸钠NaOAc.H2O40.8g11 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查超纯水40mL搅拌溶解加入醋酸钠调节PH至5.2超纯水定容至100mL高温灭菌后室温保存2.1.2.650×TAETris-base242g0.5MEDTA100mL超纯水800mL加热溶解冰醋酸57.1mL超纯水定容至1L室温放置2.1.271×TAE（现配先用）50×TAE20mL超纯水定容至1000mL2.1.2.82.5%琼脂糖琼脂糖2g1×TAE80mL微波炉加热溶解至澄清2.1.3主要仪器设备镊子、研钵、匀浆器、制冰机、移液器、微波炉，恒温水浴锅HH.S11-Ni1；电子天平RS232C；光学显微镜NikonBIOFHOT；低温高速离心机eppendorfcentrifuge5417R；PCR仪GeneAmp®PCRSystem9700；电泳仪JY600C；凝胶成像仪FR-200A。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查2.1.4实验方法与步骤2.1.4.1DNA提取参照Hamiduzzaman等的HBRC法(Hamiduzzamanetal.,2010)对蜜蜂及孢子虫的DNA进行提取并加以改进，从每份样品中取经镜检感染有孢子虫的蜜蜂，将蜜蜂腹部分别液氮冻磨并匀浆，加入300μL的提取液及4μL蛋白酶K溶液（20mg/mL），60℃水浴3h，水浴后加入等体积（300μL）的苯酚:氯仿（1:1）混合液，并轻轻混匀；13,000rpm条件下离心15min，将上清液移至另一个新管中，再次加入等体积（300μL）的苯酚：氯仿（1:1）混合液，并轻轻混匀，同样条件下离心,取上清,向上清液中加入等体积（300μL）的氯仿并轻轻混匀，13000rpm条件下离心5min，将上清液（300μL）移至新管中，加入预冷的两倍体积(600μL)的95%的乙醇和1/10体积（30μL）的3M的NaOAc，轻轻混匀，-20℃过夜沉淀，10000rpm离心15min，移去上清，沉淀用1mL的70%的乙醇洗涤两次，烘干后加入20μL的ddH2O，置于65℃的条件下水浴10min，轻轻溶解,混匀每个管中的沉淀物，10000rpm条件下离心10s，-20℃保存备用。2.1.4.2PCR扩增引物、扩增反应体系及反应步骤均参照Hamiduzzaman等(Hamiduzzamanetal.,2010)所设计并经验证的蜜蜂微孢子虫鉴定方法。用所提取的DNA样品在同一个PCR反应体系中进行东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微孢子虫的16SrRNA以及蜜蜂的actin基因的共扩增反应（见表2.2）。表2.2PCR反应体系(20μL)Table2.2PCRreactionsystem(20μL)试剂体积mix10μL10μM引物（3对）4.8μLddH2O4.2μLDNA样品（5ng/μL）1μL反应的循环参数为：94℃条件下2.5min→94℃条件下15s→61.8℃条件下30s→72℃条件下45s→后三步进行16个循环→94℃条件下15s→61.8℃条件下30s→72℃条件下50s→20个循环→72℃条件下延伸7min。引物序列：东方蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae）：MITOC-F(5’CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA)MITOC-R(5’CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG)产物大小：218bp13 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查蜜蜂微孢子虫（Nosemaapis）：APIS-F(5’GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA)APIS-R(5’GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG)产物大小：321bp用蜜蜂看家基因β-actin作为对照：β-actin-F(5’GCAAAAAGAAATCACTGCCCTA)β-actin-R(5’GGATGGTCCAGACTCGTCGTAT)产物大小：166bp2.1.4.3扩增产物的分离与鉴定扩增产物用50bp和100bp的ladder以及2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离（电泳仪为六一电泳仪），120V电压下进行32min。用凝胶成像系统对产物进行成像及分析。2.1.4.4扩增产物的测序将检测结果中218bp的N.ceranae条带和321bp的N.apis条带进行测序（华大基因），利用NCBI中的BLAST软件将条带测序结果与GenBank中已发表的序列信息进行同源性比对。2.2结果与分析2.2.1东方蜜蜂微孢子虫电泳结果Mbpbp70030025021820016615010050图2.2(1)14 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查Mbpbp70030025021820016615010050M图2.2(2)bpbp70030025021820016615010050图2.2(3)图2.2所有样品均仅检测出166bp的看家基因β-actin带和218bp的东方蜜蜂微孢子虫N.ceranae带Fig.2.2AllsampleshavebeenidentifiedthatwereinfectedbyN.ceranaeonly由图2.2我们可以看出所有的69份样品中均检测到了东方蜜蜂微孢子虫。2.2.2西方蜜蜂微孢子虫电泳结果MSGbpbp700600500400300321200166100图2.3SG泳道为山东寿光的样品，检测出了321bp的蜜蜂微孢子虫N.apis条带Fig.2.3SGbandisthesamplecollectedfromShandongprovincewhichtheonlyoneinfectedbyN.Apis15 中国农业科学院硕士学位论文第二章蜜蜂微孢子虫种群分布调查由图2.3我可以看出，仅有山东寿光的样品中检测到了蜜蜂微孢子虫。2.2.3测序结果用东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）特异性引物扩增出来的218bp的DNA片段的测序序列与NCBI上GenBank登录号分别为EF584422，EF458657，DQ374656，DQ673615和DQ286728的序列进行同源性序列比对，其同源性最高为98%；蜜蜂微孢子虫（N.apis）特异性引物扩增出来的321bp的DNA片段的测序序列与NCBI上GenBank登录号分别为DQ235446，X73894，EU545140，EF458660和EF584423的序列进行同源性序列比对，其同源性为83%。从序列比对结果可以看出，两种微孢子虫16SrRNA特异序列扩增产物与已发表的东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）和蜜蜂微孢子虫（N.apis）的16SrRNA序列信息相似度较高，表明PCR扩增产物为东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）和蜜蜂微孢子虫（N.apis）的特异序列。2.3讨论蜜蜂微孢子虫是中国乃至世界范围内影响蜂群健康发展的一个重要病原。随着分子生物学检测技术的发展，自2006年起陆续在欧洲、美洲及台湾等地区的西方蜜蜂群中发现东方蜜蜂微孢子虫侵染的现象(Chenetal.,2008;Guzman-Novoaetal.,2011;Higesetal.,2006;Huangetal.,2007;Martin-Hernandezetal.,2012;Vanengelsdorpetal.,2009)，本项研究结果同目前国际上的研究现状基本保持一致。近些年国际范围内的研究发现许多地区的西方蜜蜂群（A.mellifera）中东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）已逐渐取代蜜蜂孢子虫(N.apis)成为主要病原种(Munozetal.,2014)。由于东方蜜蜂微孢子虫对西方蜜蜂具有更强的侵染性和致病性(Higesetal.,2007)，因此越来越多的研究人员倾向于认为东方蜜蜂微孢子虫是造成近些年欧美地区西方蜜蜂出现蜜蜂蜂群衰竭失调症(ColonyCollapseDisorder)而大面积死亡的一个主要原因。本项研究结果初步明确了东方蜜蜂微孢子虫在中国西方蜜蜂群中已成为主要的病原种。结合蜜蜂微孢子虫病在中国的发生及流行调查，认为这同样有可能是近些年我国蜜蜂微孢子虫病害流行及危害逐年增加的原因之一。此外，采自山东寿光的同一蜂场的样品分别鉴定出了2个种，这进一步验证了前人所报道的同一个蜂场可能会同时感染2个种的微孢子虫的现象(Moritzetal.,2010)。由于样品采集时间及数量所限，某些省份所采集的样品相对缺乏代表性，还有些地区尚无数据，后续将进一步对这些地区继续进行重点跟踪调查，以彻底明确我国蜜蜂微孢子虫的种系构成与分布。16 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析孢子虫是由Zander于1909年在成年工蜂消化道上皮细胞中首次发现并命名的(Zander,1909)，蜜蜂微孢子虫病是由微孢子虫侵染蜜蜂中肠所引起的蜜蜂肠道疾病，蜜蜂微孢子虫病是危害蜜蜂个体乃至蜜蜂种群健康的重要肠道疾病。根据对全国主要养蜂地区（意蜂）内蜜蜂微孢子虫的调查发现，东方蜜蜂微孢子虫已逐渐取代蜜蜂微孢子虫在意蜂体内生态位，成为意蜂蜂群中主要的病原种，东方蜜蜂微孢子虫对其新宿主——意蜂的健康造成严重威胁。根据前人研究结果发现，2日龄和5日龄的意蜂接种东方蜜蜂微孢子虫后产孢子的量明显多于8日龄和11日龄（黄少康等，82007）。为探究蜜蜂微孢子虫对蜜蜂的侵染机制，本实验采用iTRAQ技术，对用浓度为1×10个/mL的东方蜜蜂微孢子虫人工侵染的意大利蜂（Apismellifera）中肠组织差异蛋白质组进行分析，寻找差异蛋白并对差异蛋白进行GO功能分类和Pathway富集，寻找与微孢子虫侵染蜜蜂相关的差异表达蛋白。3.1实验材料与方法3.1.1实验材料所选用的蜂群由中国农科院蜜蜂研究所蜂保室提供的群势良好、健康且未受微孢子虫侵染的蜜蜂为实验蜂群。供试蜂为经显微镜检测无孢子虫侵染的出房后8h以内的新出房蜂。3.1.2实验试剂蒸馏水、亚甲基蓝、蔗糖、NaCl、CTAB、Tris、EDTA、NaCl、超纯水、液氮、蛋白酶K溶液、苯酚、氯仿、95%乙醇、70%乙醇、琼脂糖、TAE缓冲液、Goldview、loadingbuffer、Taq酶试剂盒，0.1%亚甲基蓝：亚甲基蓝0.001gdH2O1mL生理盐水：NaCl9gdH2O1L糖水（1:1）：蔗糖100gdH2O100mL尿素（GibcoBRL公司）分析纯乙二胺四乙酸（Amesco）ultrapuregrade；PMSF（Amesco）ultrapuregrade；二硫素糖醇（Promega公司）化学纯；17 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析碘乙酰胺（Promega公司）化学纯；考马斯亮蓝染料G250（Amesco）ultrapuregrade；SDS（SIGMA公司）化学纯；N,N,N’,N-四甲基乙烯二胺（SIGMA公司）分析纯；过硫酸胺（AMRECSO）化学纯；溴酚蓝（SIGMA公司）分析纯；甲叉双丙烯酰胺（SIGMA公司）分析纯；甲酸（北京化工厂）质谱纯；甲醇FisherScientific质谱纯；乙腈FisherScientific质谱纯；乙醇（北京化工厂）分析纯；乙酸（北京化工厂）分析纯；丙烯酰胺（SIGMA公司）化学纯；®iTRAQReagent-8PlexMultiplexKitAppliedBiosystem；strata-XC18除盐柱phenomenex；SCX强阳离子交换柱phenomenexLunaSCX100A；3.1.3实验仪器镊子、研钵、载玻片、盖玻片、血球计数板、计数器、蜂笼、饲喂条、移液器，光学显微镜NikonBIOFHOT；低速离心机TGL-16G-W。安捷伦常规液相1100；戴安纳升液相U3000；质谱仪（Thermofisher）Q-Exactive；扫描仪（UMAX）Powerlook2100XL-USB；振荡器（IKA）；电泳槽（Tanon）；电泳仪(北京六一仪器厂)DYY-7C；恒温加热块；离心机eppendorfcentrifuge5417R型；手掌式离心机(其林贝尔仪器)LX-100；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）HWS24型。3.1.4数据采集及处理过程中使用的软件信息数据采集软件ThermofisherProteomeDiscoverer1.3Mascotversion2.3.018 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析3.1.5实验步骤3.1.5.1实验蜂群中蜜蜂微孢子虫种质鉴定自中国农业科学院蜜蜂所蜂保室病蜂蜂群取携带有微孢子虫的蜜蜂10只，液氮条件下研磨至粉末，取部分粉末，对蜜蜂微孢子虫进行鉴定，具体鉴定步骤见2.1.4。3.1.5.2东方蜜蜂微孢子虫的提取取剩余研磨粉末加入蒸馏水，研磨均匀后转入10mL离心管中，500rpm低速离心3min，将上清转入新的10mL离心管中，弃沉淀，2000rpm高速离心10min，弃上清，用清水重新悬浮沉淀，4000rpm离心10min，取沉淀，多次重复后，取沉淀，用1mL生理盐水溶解沉淀，置于4℃，储存备用。3.1.5.3东方蜜蜂微孢子虫的继代培养用提取的东方蜜蜂微孢子虫对新出房意蜂饲喂，在人工气候箱（30±0.5℃，RH为65%~80%）中进行继代饲养。3.1.5.4东方蜜蜂微孢子虫的提取与纯化取经镜检感染微孢子虫致死的意蜂10只，取其腹部，置于放入蒸馏水的研钵中进行研磨，具体提取步骤见3.1.5.2。3.1.5.5东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的人工侵染用0.1%的亚甲基蓝对提取的东方蜜蜂微孢子虫进行活性测定：吸取10μL的孢子虫提取液置于载玻片上，吸取10μL0.1%的亚甲基蓝滴到同一载玻片上，用枪头吸打均匀，静置3min，置于显微镜下，观察微孢子虫是否呈无色（蓝色表示无活性）。将东方蜜蜂微孢子虫抽提原液吸取20μL滴到血球计数板（25中格×16小格）上，置于显微4镜（40×15）下进行观察，计数，利用公式：细胞数/mL=（80小格内的细胞数/80）×400×10×稀释倍数，对孢子虫浓度进行计算。取新出房8h内的工蜂置于蜂笼中饲养，对照组和处理组各3笼，每笼30只，置于30±0.5℃，RH为65%~80%的培养箱中进行培养，饲喂1:1的糖水和经过镜检无孢子虫的花粉。8将计数后的微孢子虫分别用1:1的糖水稀释为：1×10个/mL。8通过微量注射器分别用每只2μL的1:1的糖水和浓度为1×10个/mL的孢子虫悬液对处理组和对照组的新出房的蜜蜂进行口饲侵染，培养过程中随机取食1:1的糖水和经过镜检无孢子虫的花粉。3.1.5.6意蜂中肠的获取8分别在用1:1的糖水口饲和用浓度为1×10个/mL的东方蜜蜂微孢子虫侵染24h、48h、96h19 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析和144h后，从对照组和处理组中分别取出10只蜜蜂，在冰袋上，用镊子抽取中肠，然后用清洁的手术刀将中肠竖切，置于离心管中，用生理盐水进行清洗至澄清，用吸水纸将洗涤后的中肠内的液体吸掉，置于离心管中，存放在-70℃的条件下，保存以备用。3.1.5.7蛋白质提取用TCA-冰丙酮法分别进行东方蜜蜂微孢子虫侵染后的处理组的以及口饲1:1的糖水的对照组的蜜蜂中肠蛋白质的提取，具体方法参照沈阳农业大学田丰博士学位论文（田丰，2014）。3.1.5.8蛋白质SDS-PAGE电泳对所提取的8组意蜂中肠蛋白质进行SD-PAGE电泳，对蛋白质质量进行检测。3.1.5.9蛋白质定量使用bradfford法对所提取的8组蛋白进行定量。3.1.5.10蛋白质的消化取每个样品的蛋白体积100μg，加入1μg/μL的Trypsin和每100μg蛋白质底物加入3.3μg的酶，对蛋白质进行消化，真空抽干，最后用TEAB水进行肽段复溶。具体方法参照沈阳农业大学田丰博士学位论文（田丰，2014）。3.1.5.11肽段的标记1.将标记试剂平衡至室温。2.每管标记试剂中加入70ul异丙醇，涡旋震荡1min，离心甩至管底。3.将混好的标记试剂加入到消化后的肽段中，用不同大小的同位素对不同样品标记。4.将肽段和标记试剂混匀后，甩至管底，室温条件下，静置2h。5.对标记后样品进行真空抽干。标记信息如表3.1：表3.1肽段标记信息Table3.1Peptidestaginformation样品编号标记信息24113标记48114标记96115标记144116标记C24117标记C48118标记C96119标记C144121标记20 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析3.1.5.12HPLC（强阳离子交换色谱）使用SCX（强阳离子交换柱）对肽段进行预分离，具体方法参照沈阳农业大学田丰博士学位论文（田丰，2014）。洗脱梯度如表3.2：表3.2HLPC液相梯度Table3.2ThegradeofHLPCTime（min）B液比例0.01Start（0%）350%365%5630%6150%6650%71100%81100%81.01Stop3.1.5.13肽段的纯化（C18反相色谱除盐）对液相预分离的蛋白质肽段进行进一步的纯化，具体纯化步骤参考沈阳农业大学田丰博士学位论文（田丰，2014）。3.1.5.14质谱检测对纯化后的肽段采用Q-Exactive质谱仪检测肽段信号，所使用的参数如表3.3：表3.3Q-E质谱仪参数Table3.3Massspectrometerparameters参数名称参数值离子模式正离子模式一级扫描范围350-2000Da二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择二级分辨率17500毛细管温度320度离子源电压1800V碎裂模式HCDNanoLC的洗脱条件及梯度：A液成分：水，0.1%FAB液成分：乙腈，0.1%FA色谱柱：类型C18，规格100mm*75mm，孔径300A，粒径5um流速：400nl/min21 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析洗脱梯度如表3.4所示：表3.4NanoLC液相梯度Table3.4ThegradeofNanoLCTime（min）B液比例05%105%4030%4560%4880%5580%585%655%65.01STOP3.1.5.15蛋白质定性与定量分析质谱扫描，将质谱图输入到PD软件后，对质谱谱图进行筛选，筛选参数如表3.5，用mascot进行搜索，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。检索参数如表3.6。表3.5筛选参数Table3.5Screeningparameters参数名称参数值母离子质量范围350-6000Da二级质谱图中最小峰数10信噪比S/N域值1.5表3.6检索参数Table3.6Retrieveparameters参数名称实验选项Mascot版本号version2.3.0固定修饰Carbamidomethyl(C)可变修饰Oxidation（M），Gln→Pyro-Glu(N-termQ)，iTRAQ8plex（K），iTRAQ8plex（Y），iTRAQ8plex（N-term）一级质朴的精度15ppm二级质谱的精度20mmu最大允许漏切数1酶Trypsin数据库bees_UNI_34735库Timefilescompressed:SatFeb2810:39:162015;Numberofsequences：11823022 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析Carbamidomethyl(C)是还原烷基化处理后，半胱氨酸产生的脲甲基化；Oxidation（M）是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺时，可能会产生自身环化，变成谷氨酸；iTRAQ8plex（K），iTRAQ8plex（Y），iTRAQ8plex（N-term）是iTRAQ试剂在不同位置的结合；定量分析参数如表3.7：表3.7定量参数Table3.7Quantitativeparameter参数名称实验选项用来定量的肽段取值方法取中位值的方法（median）用来定量的最少的特异性片段数1矫正方法选取一组样品中全部可定量蛋白的中位值（median）P-value<0.05P-value蛋白可信度评估，小于0.05代表蛋白可信度大于95%。3.1.5.16BLAST分析对质谱分析后所提交的蛋白质序列进行数据库比对（BLAST）得到相似的蛋白质序列，为之后的GO分析和Pathway分析提供一定的信息基础。3.1.5.17GO分析对于BLAST结果，采用国际标准化的基因功能分类体系基因本体（GeneOntology，GO）来全面描述生物体中蛋白质的属性，对其进行功能注释。GO包括三个独立的ontology，分别描述基因的细胞组分（cellularcomponent）、分子功能（molecularfunction）、参与的生物过程（biologicalprocess）。依据分析结果从这三个方面对蛋白质进行聚类分析，依据聚类分析的结果进行绘图，得到鉴定的蛋白质的GO分类图。3.1.5.18Pathway分析采用KOBAS2.0对于BLAST结果进行KO注释，添加到相应的蛋白质注释信息中，采用KEGG对鉴定到的蛋白质进行生物通路（pathway）层面的信息注释。对存在于同一信号通路的蛋白质进行富集，结合所得到的定量结果得到差异表达蛋白所涉及到的Pathway图。23 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析3.2结果与分析3.2.1微孢子虫鉴定结果图3.1蜜蜂微孢子虫种质鉴定Fig.3.1GermplasmidentificationofNocemaspp.从图3.1中我们可以看出，蜜蜂所携带的孢子虫检测条带为218bp，是东方蜜蜂微孢子虫的特征性条带，所取的实验病蜂中所携带的孢子虫为东方蜜蜂微孢子虫（Nocemaceranae）。3.2.2蛋白质定量结果对8个样品进行中肠蛋白质提取后，蛋白质定量结果如表3.8：表3.8蛋白质定量结果Table3.8Theresultofproteinquantity样品编号12345678样品名称C24C48C96C144244896144浓度0.991.20.870.981.00.971.10.88（μg/μL）24 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析蜜蜂受东方蜜蜂微孢子虫侵染前后，蜜蜂中肠蛋白质量检测胶图如图3.2：12345343678M678676kDa976645312014图3.2SDS-PAGE检测胶图Fig.3.2SDS-PAGEtestinggluefigure图3.2中的1~8泳道分别代表样品C24、C48、C96和C144的样品以及它们分别对应的处理组24、48、96和144样品，从胶图中我们可以看出，条带清晰无降解，样品之间相对平行，表明实验稳定性强，准确性高，蛋白质完整性较好。3.2.3HPLC色谱结果色谱图如图3.3：图3.3SCX分离图Fig.3.3SCXseparationfigure25 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析3.2.4蛋白定性、定量及生物信息学分析3.2.4.1在bees_UNI_34735库中检索到的蛋白质定性信息通过质谱对肽段进行分析，并用PD提取图谱，通过mascot进行搜索并结合第一步筛选后的图谱进行定量分析，其中共检测得到319820个图谱。能够匹配上的有39078个图谱，共鉴定到12261个蛋白肽段，在bees_UNI_34735库中鉴定到的总蛋白为1888个，具体信息如表3.9所示。FDR<1%，即可信度达到99%。表3.9总蛋白检索结果Table3.9Theretrieveresultofthetotalprotein参数名称参数值Allspectra319820Matchedspectra39078Peptide12261ProteinGroup1888Allspectra为全部的图谱数；Matchedspectra为匹配上的图谱数；Peptide为肽段种类数；ProteinGroup为匹配上的蛋白总数；FDR为假阳性率，本实验是使用假阳性率小于1%来对结果进行过滤。3.2.4.2侵染后24h的中肠蛋白质变化对侵染24h的处理组和对照组的蛋白质信息进行分析，用mascot分析，从bees_UNI_34735库中鉴定到的差异蛋白质种类有308种，其中处理组相对于对照组表达上调（113/117≥1.2）的蛋白质共有119种，其中已知的蛋白质有48种，具体蛋白质信息列表如表3.10所示：表3.10上调蛋白信息Table3.10Theinformationoftheup-regulatedproteinsAccessionProteinnameOSPECoverageMW[kDa]calc.pI113/11760SacidicribosomalV9IIV6proteinP1Apiscerana279.28%11.64.52.377A0A087ZNF1TransgelinApismellifera359.50%13.19.542.253A0A088A0N0HistoneH2AApismellifera354.84%13.310.732.153MyelingeneV9IH96regulatoryfactorApiscerana22.85%30.99.632.122ElongationfactorZacosmiaQ590V81-alpha(Fragment)maculata343.47%40.98.631.81926 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析AccessionProteinnameOSPECoverageMW[kDa]calc.pI113/117NucleosideA0A088ATV8diphosphatekinaseApismellifera355.19%17.67.331.802V9IK89Proteindpy-30Apiscerana247.37%8.48.51.797S-adenosylmethionineV9ICM2synthaseApiscerana22.97%44.46.321.636ElongationCeratinafactor-1alpha(Neoceratina)D5JGD5(Fragment)sp.Solomons451.30%20.88.951.596A0A088ADV7ImportinsubunitalphaApismellifera38.30%58.75.341.576Q14SN0Globin1Apismellifera232.16%19.58.591.566Elongationfactor1CtenoplectrinaB2XRY0alpha(Fragment)alluaudi444.53%287.031.526V9IDV0Cdc42Apiscerana243.54%16.56.551.51Elongationfactor-1CentrisA0A076MF55alpha(Fragmentchlorura466.67%24.57.941.509ATPsynthasesubunitV9IKG8deltaApiscerana245.96%17.65.571.508Acetyl-coenzymeAV9IIJ8transporter1Apiscerana27.54%52.17.711.443Elongationfactor-1EpicharisA0A076ME81alpha(Fragment)minima449.12%24.57.031.425Guaninenucleotide-bindingproteinG(Q)subunitV9IAK1alphaApiscerana236.54%41.55.21.4A0A088AJN6Beta-glucuronidaseApismellifera36.28%76.96.111.376L-lactateA0A088A9S3dehydrogenaseApismellifera35.18%51.69.171.366A0A088ASZ6TransgelinApismellifera366.30%20.58.661.361ChelostomaElongationfactorsp.2B5AND31-alpha(Fragment)CJP-2008355.41%40.38.351.348Alpha-glucosidaseA1IHL0isozymeIApiscerana211.09%66.66.091.316ElongationfactorChilicolaB4UUY71-alpha(Fragment)inermis353.15%39.77.991.305Actin-relatedproteinV9IM082/3complexsubunit3Apiscerana27.74%19.68.511.299AspartateA0A088ASL4aminotransferaseApismellifera358.63%41.57.241.297A0A087ZXU0FerritinApismellifera318.89%25.26.541.296MyosinlightchainV9IF54alkaliApiscerana242.11%174.61.26827 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析AccessionProteinnameOSPECoverageMW[kDa]calc.pI113/117HoplitisElongationfactor-1(Hoplitis)sp.L7QEU8alpha(Fragment)n.3CS-2012465.38%31.27.941.266ArgininekinaseA9Y256(Fragment)332.96%204.921.261V9IJ18Valyl-tRNAsynthetaseApiscerana23.81%60.69.061.26Serine/threonine-proteinphosphatase2AV9ICG5regulatorysubunitAApiscerana233.96%59.15.151.258Serine/threonine-proteiA0A088AFC7nphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBApismellifera35.64%50.86.111.254V9IAY7Epsin-2Apiscerana22.58%43.65.851.252GlutamatesynthaseV9IBK9[NADPH]largechainApiscerana215.03%2307.211.25ElongationfactorLasioglossumQ965A81-alpha(Fragment)parvum344.69%38.97.751.247Multidrugresistance-associatedV9IM54proteinlethal(2)03659Apiscerana214.83%35.95.991.247PutativeuncharacterizedD3XL69protein(Fragment)Apismellifera231.84%18.94.781.244PhosphopantothenoylcV9ILW3ysteinedecarboxylaseApiscerana235.42%16.17.741.237ElongationfactorChelostomaB5AND91-alpha(Fragment)foveolatum345.41%40.38.351.236TroponinIisoformQ3B7086a1Apismellifera434.43%25.49.721.231Microtubule-associatedproteinRP/EBV9IKJ0familymember1Apiscerana212.81%325.171.223ATPsynthasesubunitV9IEZ9gApiscerana217.17%11.19.81.217Uridine5"-monophosphateV9IJ50synthaseApiscerana27.88%18.57.091.212ElongationfactorAndrenaQ71GH7alpha-1(Fragment)afimbriata474.07%11.77.811.211Elongationfactor1HalterapisH2D557alpha(Fragment)nigrinervis456.06%21.47.941.209V9IHB5AdenylatekinaseApiscerana226.59%28.58.351.206Q8I9W0CatalaseApismellifera244.83%588.281.228 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析处理组相对于对照组表达下调（117/113＞1.2）的蛋白质共有189种，其中已知的蛋白47种，具体蛋白质信息列表如表3.11所示：表3.11下调蛋白信息Table3.11Theinformationofthedown-regulatedproteinsMWAccessionProteinnameOSPECoverage[kDa]calc.pI113/117HistoneH2AOS=ApisceranaGN=ACCB03555PE=2SV=1V9IGJ8-[V9IGJ8_APICE]Apiscerana265.71%7.79.520.192V9IJK460SribosomalproteinL3Apiscerana220.77%47.210.260.22V9II61HistoneH3,embryonicApiscerana254.35%5.28.220.258V9IEP9UMP-CMPkinaseApiscerana234.58%12.16.540.267Elongationfactor1-alphaChelostomaB5ANE7(Fragment)ventrale345.41%40.38.650.291P01501MelittinApismellifera10.21437.64.720.299Elongationfactor-1alphaScrapterG1CGP9(Fragment)ruficornis40.289317.66.80.346V9IBC8Dynactinsubunit1Apiscerana20.0166101.65.440.366ApismelliferaI1VC82PhospholipaseA2carnica20.4251196.840.373CytochromeP450Q309A5monooxygenaseApismellifera20.186457.98.380.398V9IDR4Uridinephosphorylase1Apiscerana20.461838.56.740.509Elongationfactor1-alphaAndrenasp.Q6XJW1(Fragment)Ansp64330.482339.98.410.514C3andPZP-likealpha-2-macroglobulinV9IB20domain-containingprotein8Apiscerana20.262333.14.730.536Q17058Alpha-glucosidaseApismellifera10.047665.55.240.56V9IG07CytochromeP450Apiscerana20.3083618.150.577Elongationfactoralpha-1AndrenaQ71GB2(Fragment)sagittagalea40.740711.78.470.588V9IEC6CytidinedeaminaseApiscerana20.147513.38.720.651A0A088AM85ChloridechannelproteinApismellifera30.019111.48.190.654Acidicleucine-richnuclearV9IH37phosphoprotein32familymemberAApiscerana20.114628.44.20.687A0A088AFH7TransferrinApismellifera30.026778.67.060.69A0A088A188IntegrinbetaApismellifera30.03389.25.690.697DNA-directedRNAA0A088AA86polymeraseApismellifera30.0162160.67.990.705V9IH90COP9signalosomecomplexApiscerana20.088629.66.270.70629 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析MWAccessionProteinnameOSPECoverage[kDa]calc.pI113/117subunit7ATP-dependentRNAhelicaseV9IJF1DDX3XApiscerana20.039978.68.950.706P56682ChymotrypsininhibitorApismellifera10.62564.730.751RabproteinsgeranylgeranyltransferaseV9IG24componentA1Apiscerana20.140767.14.960.757A0A088AME9AlkalinephosphataseApismellifera30.138659.47.870.769StructuralmaintenanceofA0A088AHL5chromosomesproteinApismellifera30.0449139.48.270.77Elongationfactor1-alphaDiadasiaQ9GQ17(Fragment)rinconis40.484628.57.490.771A0A088A788IntegrinbetaApismellifera30.143284.95.490.777V9IAD5Actin-bindingLIMprotein1Apiscerana20.191563.28.470.784A0A088APM5GlucosylceramidaseApismellifera37.63%58.57.390.786ATP-dependentRNAhelicaseV9I9R9p62Apiscerana220.00%58.79.10.79Guaninenucleotide-bindingV9IM78proteinG(O)subunitalphaApiscerana223.45%40.45.270.79V9I8Z4ProteinkinaseCandcaseinkinasesubstrateinneuronsprotein2Apiscerana222.87%51.75.550.801A0A088A8J8DeoxyhypusinehydroxylaseApismellifera311.55%34.25.110.804Delta-1-pyrroline-5-carboxylateV9IDN8synthetaseApiscerana237.80%84.87.810.809ABCtransporterGfamilyV9IFD5member20Apiscerana22.95%49.460.809A0A088AKU7tRNApseudouridinesynthaseApismellifera33.08%45.68.060.814A0A087ZSH4LipaseApismellifera36.40%46.56.960.816WDrepeat-containingproteinV9IH3348Apiscerana22.57%56.46.540.818Elongationfactor-1alphaCentrisA0A076MF36(Fragment)caesalpiniae438.99%17.45.580.825V9IKL7IntegrinbetaApiscerana216.48%60.26.610.825V9ICI5Heatshockproteinbeta-1Apiscerana225.00%21.25.670.828SignaltransducerandactivatorA0A088AEX7oftranscriptionApismellifera312.74%92.86.790.829A0A088AH5160SribosomalproteinL18Apismellifera319.15%21.711.750.83Mannose-1-phosphateV9IEC1guanyltransferasealpha-AApiscerana212.10%30.88.980.83130 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析3.2.4.3侵染后24h的处理组和对照组差异蛋白质的理化性质3.2.4.3.1差异蛋白质量分析受东方蜜蜂微孢子虫侵染的意蜂与对照组中肠蛋白质比较发现的差异蛋白质的相对分子量大小分布范围如图，分子量小于20kDa的蛋白有69个，占总蛋白的22.4%；分子量在20~40kDa的蛋白有83个，占总蛋白的26.9%；分子量在40~60kDa的蛋白有75个，占蛋白总量的24.4%；分子量在60~80kDa的蛋白有30个，占总蛋白的9.7%.；分子量在80~100kDa的蛋白有15个，占总蛋白的4.9%；分子量大于100kDa的蛋白有36个，占总蛋白的11.7%；最大的相对分子量为480.6（A0A088AK81），最小的相对分子量为5.2（V9II61）。蛋白质质量分布图如图3.4所示：80706050sin40teorp30foreb20muN100<2020~4040~6060~8080~100>100MW(KDa)图3.4差异蛋白分子量分布Fig.3.4MWdistributionofdifferentproteins3.2.4.3.2差异蛋白等电点分布受东方蜜蜂微孢子虫亲染的意蜂与对照组中肠蛋白质比较发现的差异蛋白质的等电点大小分布范围如图，等电点小于4的蛋白有1个，占总蛋白的0.3%；等电点在4~5范围内的蛋白有26个，占总蛋白的8.4%；等电点在5~6的蛋白有59个，占总蛋白的19.2%；等电点在6~7的蛋白有60个，占总蛋白的19.5%；等电点在7~8的蛋白有49个，占总蛋白的15.9%；等电点在8~9的蛋白有63个，占总蛋白的20.5%；等电点大于9的蛋白有50个，占总蛋白的16.2%；等电点最低的蛋白为3.94（A0A087ZXG1），等电点最高的蛋白为11.75（A0A088AH51）。蛋白质等电点分布图如图3.5所示：31 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析605040sinteor30pforeb20muN100<44~55~66~77~88~9>9pI图3.5差异蛋白等电点分布Fig.3.5PIdistributionofdifferentproteins3.2.4.4侵染后24h的处理组和对照组上调蛋白的GO分析结果差异蛋白注释到了3024个GO条目，在细胞组分中注释到328个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有7个；在生物进程中注释到2327个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有91个；在分子功能中注释到369个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有20个，每个本体中所包含的条目中涉及的蛋白质数目分别如下表（由于BiologicalProcess分类较多，仅选出14种较具有代表性的进程作图）：表3.12细胞组分中所涉及的上调蛋白Table3.12Up-regulatedproteinsinvolvedinCellularComponenttermdesc#indifferentproteininvolvemitochondrialGO:0005758intermembranespace4Q8I9W0,V9IHB5,A0A088AMM2,A0A087ZXB2,organelleenvelopeGO:0031970lumen4Q8I9W0,V9IHB5,A0A088AMM2,A0A087ZXB2,smoothendoplasmicGO:0005790reticulum2A0A088AMG8,A0A088AVI9,fungal-typevacuoleGO:0000329membrane2V9IM54,A0A088ANW3,Q590V8,D5JGD5,B5AND3,B4UUY7,Q965A8,A0A088A0N0,H2D557,V9IHB5,A0A076MF55,A0A076ME81,A0AGO:0005811lipidparticle11088AVI9,GO:0000322storagevacuole2V9IM54,A0A088ANW3,GO:0000324fungal-typevacuole2V9IM54,A0A088ANW3,32 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析fungal-typevacuole2storagevacuole2lipidparticle11fungal-typevacuolemembrane2smoothendoplasmicreticulum2organelleenvelopelumen4CellularComponentmitochondrialintermembranespace4024681012Numberofprotein图3.6细胞组分中所涉及的上调蛋白Fig.3.6Up-regulatedproteinsinvolvedinCellularComponent表313生物进程中所涉及的上调蛋白（部分）Table3.13Up-regulatedproteinsinvolvedinBiologicalProcess（partly）termdesc#indifferentproteininvolveQ590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUYGTPmetabolic7,Q965A8,Q71GH7,A0A088ATV8,L7QEU8,H2D557,AGO:0046039process140A076MF55,A0A076ME81,A0A088AMM2,guanosine-containinQ590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUYgcompound7,Q965A8,Q71GH7,A0A088ATV8,L7QEU8,H2D557,AGO:1901068metabolicprocess140A076MF55,A0A076ME81,A0A088AMM2,ribonucleosideQ590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUYtriphosphate7,Q965A8,Q71GH7,A0A088ATV8,L7QEU8,H2D557,VGO:0009199metabolicprocess159IM54,A0A076MF55,A0A076ME81,A0A088AMM2,negativeregulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingA0A088A5M4,A0A088A008,A0A087ZYD4,A0A088AGO:0090101pathway4GT8,negativeregulationA0A088A5M4,V9IDV0,V9ICG5,A0A088A008,A0A088ofresponsetoANW3,A0A088A9Z0,V9IAY7,A0A087ZYD4,A0A088GO:0048585stimulus12AMM2,A0A088AGT8,A0A088ASF2,A0A088AK81,negativeregulationA0A088A5M4,V9IDV0,V9ICG5,A0A088A008,A0A088ofcellANW3,A0A087ZRF3,V9IAY7,A0A087ZYD4,A0A088GO:0010648communication11AMM2,A0A088AGT8,A0A088AK81,positiveregulationA0A088ATV8,V9IDV0,A0A088A0C7,A0A088A008,A0ofcellA088AM39,A0A088A5W1,A0A088AGT8,A0A088ASXGO:0045597differentiation89,A0A088A5M4,V9IDV0,V9ICG5,A0A088A008,A0A087negativeregulationZRF3,V9IAY7,A0A087ZYD4,A0A088AMM2,A0A088GO:0023057ofsignaling10AGT8,A0A088AK81,33 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析termdesc#indifferentproteininvolvenegativeregulationA0A088A5M4,V9IDV0,V9ICG5,A0A088A008,V9IAY7ofsignal,A0A087ZYD4,A0A088AMM2,A0A088AGT8,A0A088GO:0009968transduction9AK81,regulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingA0A088A5M4,A0A088A008,A0A087ZYD4,A0A088AGO:0090092pathway4GT8,negativeregulationoftransforminggrowthfactorbetareceptorsignalingGO:0030512pathway3A0A088A5M4,A0A088A008,A0A088AGT8,A0A088ATV8,V9IDV0,A0A088ADV7,A0A088A008,Vpositiveregulation9IH96,A0A087ZRF3,V9IKJ0,A0A088ASX9,A0A088AGO:0010628ofgeneexpression9K81,positiveregulationoftranscription,A0A088ATV8,A0A088ADV7,A0A088A008,V9IH96,A0GO:0045893DNA-dependent8A087ZRF3,V9IKJ0,A0A088ASX9,A0A088AK81,responsetosteroidV9IM54,A0A088ANW3,A0A088ASL4,A0A088AM39,GO:0048545hormonestimulus7A0A088A9Z0,A0A088A9S3,A0A088A5W1,responsetosteroidhormonestimulus7positiveregulationoftranscription,DNA-dependent8positiveregulationofgeneexpression9negativeregulationoftransforminggrowthfactorbetareceptor…3regulationoftransmembranereceptorproteinserine/threonine…4negativeregulationofsignaltransduction9negativeregulationofsignaling10positiveregulationofcelldifferentiation8negativeregulationofcellcommunication11BiologicalProcessnegativeregulationofresponsetostimulus12negativeregulationoftransmembranereceptorprotein…4ribonucleosidetriphosphatemetabolicprocess15guanosine-containingcompoundmetabolicprocess14GTPmetabolicprocess1405101520Numberofprotein图3.7生物进程中所涉及到的上调蛋白（部分）Fig.3.7Up-regulatedproteinsinvolvedinBiologicalProcess（partly）34 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析表3.14分子功能中所涉及的上调蛋白Table3.14Up-regulatedproteinsinvolvedinMolecularFunctiontermdesc#indifferentproteininvolveQ590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,A0A076MF55,A0A076ME81,GO:0003924GTPaseactivity15A0A088AMM2,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,A0A088ATV8,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,A0A076MF55,GO:0005525GTPbinding16A0A076ME81,A0A088AMM2,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,translationfactoractivity,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,L7QEU8,H2D557,GO:0008135nucleicacidbinding12A0A076MF55,A0A076ME81,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,A0A088ATV8,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,A0A076MF55,GO:0019001guanylnucleotidebinding16A0A076ME81,A0A088AMM2,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,A0A088AguanylribonucleotideTV8,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,A0A076MF55,GO:0032561binding16A0A076ME81,A0A088AMM2,GO:0016831carboxy-lyaseactivity3A0A088ASL4,V9ILW3,V9IJ50,inositolmonophosphateGO:00089341-phosphataseactivity2A0A088AVE6,A0A088AVE8,inositolmonophosphateGO:00528334-phosphataseactivity2A0A088AVE6,A0A088AVE8,inositolphosphateGO:0052745phosphataseactivity2A0A088AVE6,A0A088AVE8,inositolmonophosphateGO:0052834phosphataseactivity2A0A088AVE6,A0A088AVE8,oxidoreductaseactivity,actingontheCH-NH2GO:0016638groupofdonors2A0A088A8V8,V9IBK9,inositolmonophosphateGO:00528323-phosphataseactivity2A0A088AVE6,A0A088AVE8,35 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析termdesc#indifferentproteininvolveQ590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,Q7YU97,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,V9IM54,A0A076MF5nucleoside-triphosphatase5,A0A076ME81,V9IF54,A0A088AMM2,A0A08GO:0017111activity208AVI9,A0A088AK81,serine-typeendopeptidaseGO:0004867inhibitoractivity2A0A088A9Z0,A0A088ASF2,transferaseactivity,transferringalkyloraryl(otherthanmethyl)GO:0016765groups3V9ICM2,A0A088AFL5,A0A088AM39,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,hydrolaseactivity,actingB4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,Q7YU97,Lonacidanhydrides,in7QEU8,H2D557,V9IDV0,V9IM54,A0A076MF5phosphorus-containing5,A0A076ME81,V9IF54,A0A088AMM2,A0A08GO:0016818anhydrides208AVI9,A0A088AK81,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,Q7YU97,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,V9IM54,A0A076MF55,A0A076ME81,V9IF54,A0A088AMM2,A0A08GO:0016462pyrophosphataseactivity208AVI9,A0A088AK81,Q590V8,D5JGD5,B5AND9,B5AND3,B2XRY0,B4UUY7,Q965A8,Q71GH7,V9IAK1,Q7YU97,L7QEU8,H2D557,V9IDV0,V9IM54,A0A076MF5hydrolaseactivity,acting5,A0A076ME81,V9IF54,A0A088AMM2,A0A08GO:0016817onacidanhydrides208AVI9,A0A088AK81,carbon-carbonlyaseGO:0016830activity3A0A088ASL4,V9ILW3,V9IJ50,phosphotransferaseactivity,nitrogenousGO:0016775groupasacceptor2A9Y256,A0A088ATV8,36 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析phosphotransferaseactivity,nitrogenousgroupasacceptor2carbon-carbonlyaseactivity3hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides20pyrophosphataseactivity20hydrolaseactivity,actingonacidanhydrides,inphosphorus-…20transferaseactivity,transferringalkyloraryl(otherthanmethyl)…3serine-typeendopeptidaseinhibitoractivity2nucleoside-triphosphataseactivity20inositolmonophosphate3-phosphataseactivity2oxidoreductaseactivity,actingontheCH-NH2groupofdonors2inositolmonophosphatephosphataseactivity2inositolphosphatephosphataseactivity2MolecularFunctioninositolmonophosphate4-phosphataseactivity2inositolmonophosphate1-phosphataseactivity2carboxy-lyaseactivity3guanylribonucleotidebinding16guanylnucleotidebinding16translationfactoractivity,nucleicacidbinding12GTPbinding16GTPaseactivity150510152025Numberofprotein图3.8分子功能中所涉及到的上调蛋白Fig.3.8Up-regulatedproteinsinvolvedinMolecularFunction在细胞组件（CellularComponent）分析中可以发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织表达上调的蛋白中与细胞组分主要表达于线粒体膜间隙（mitochondrialintermembranespace）、细胞器包膜内腔（organelleenvelopelumen）、光面内质网（smoothendoplasmicreticulum）、真菌型液泡膜（fungal-typevacuolemembrane）、脂肪微滴（lipidparticle）、贮藏液泡（storagevacuole）、真菌型液泡（fungal-typevacuole）。在表达上调蛋白生物学途径（BiologicalProcess）功能注释中我们发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织表达上调的蛋白主要为参与分化、基因表达以及应激反应调节进程，其中包括有核糖核苷三磷酸的代谢（ribonucleosidetriphosphatemetabolicprocess）、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的负调节（negativeregulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingpathway）、刺激反应负调节（negativeregulationofresponsetostimulus）、细胞交流负调节（negativeregulationofcellcommunication）、细胞分化正调节（positiveregulationofcelldifferentiation）、信号负调节（negativeregulationofsignaling）、信号转导负调节（negativeregulationofsignaltransduction）、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的调节（regulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingpathway）、转换生长因子β受体信号通路的负调节（negativeregulationoftransforminggrowthfactorbetareceptorsignalingpathway）、基因表达正调节（positiveregulationofgeneexpression）、DNA依赖性转录正调节（positiveregulationoftranscription,DNA-dependent）、甾类激素刺激反应（responseto37 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析steroidhormonestimulus）、鸟苷化合物代谢进程（guanosine-containingcompoundmetabolicprocess）、GTP的代谢过程（GTPmetabolicprocess）等生物进程。在分子功能（MolecularFunction）注释中发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织表达上调的蛋白主要功能为结合类和催化类，如鸟嘌呤核糖核苷酸结合（guanylribonucleotidebinding）、鸟苷酸结合（guanylnucleotidebinding）、GTP结合（GTPbinding）、GTP酶活性（GTPaseactivity）以及转录因子活性和核酸结合（translationfactoractivity,nucleicacidbinding）和核苷三磷酸酶活性（nucleoside-triphosphataseactivity）等。3.2.4.5侵染后24h的处理组和对照组下调蛋白的GO分析结果表达下调蛋白注释到了3949个GO条目，在细胞组分中注释到411个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有21个；在生物进程中注释到3036个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有174个；在分子功能中注释到502个条目，其中根据P值小于0.05显著富集的有8个，每个本体中所包含的条目中涉及的蛋白质数目分别如下表（由于BiologicalProcess分类较多，仅选出18种较具有代表性的进程作图）：表3.15细胞组分中所涉及的下调蛋白Table3.15Down-regulatedproteinsinvolvedinCellularComponenttermdesc#indifferentproteininvolveA0A088AVH5,A0A088A0F5,A0A088AKU7,A0AGO:0005667transcriptionfactorcomplex5087ZWF1,A0A087ZRP7,alpha9-beta1integrinGO:0034679complex3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,alpha3-beta1integrinGO:0034667complex3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,alpha8-beta1integrinGO:0034678complex3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,A0A088ATA9,A0A088A788,V9IKL7,A0A088A18GO:0055120striatedmuscledensebody48,Q17058,A0A087ZPE3,A0A088ACV5,A0A088AFH7,A0A088A788,V9IKL7,A0A088AH97,A0A087integraltoplasmaZNN2,A0A088A9Z3,A0A088ABQ3,A0A088A188GO:0005887membrane14,A0A087ZW99,A0A087ZYJ9,A0A088AM85,GO:0008278cohesincomplex2A0A088AHL5,A0A088A0F5,alpha9-beta1GO:0071133integrin-ADAM8complex2A0A088A788,A0A088A188,A0A088ACV5,A0A088A788,V9IKL7,A0A088A1GO:0043235receptorcomplex488,38 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析termdesc#indifferentproteininvolveQ17058,A0A087ZPE3,A0A088ACV5,A0A088AFH7,A0A088A788,V9IKL7,A0A088AH97,A0A087intrinsictoplasmaZNN2,A0A088A9Z3,A0A088ABQ3,A0A088A188GO:0031226membrane14,A0A087ZW99,A0A087ZYJ9,A0A088AM85,GO:0008305integrincomplex3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,integraltoendoplasmicU3KR34,A0A088A633,A0A087ZYD9,A0A088AEGO:0030176reticulummembrane6T0,A0A088ATH4,A0A087ZWE0,intrinsictoendoplasmicU3KR34,A0A088A633,A0A087ZYD9,A0A088AEGO:0031227reticulummembrane6T0,A0A088ATH4,A0A087ZWE0,A0A088A788,V9IKL7,A0A088AH97,A0A088A11GO:0042383sarcolemma67,A0A088A188,A0A088AM85,V9IJF1,A0A087ZS18,A0A088AVH5,A0A088A0F5,A0A087ZPR6,A0A088AKU7,A0A087ZWF1,A0A087ZRP7,A0A087ZQ62,A0A088A0L4,A0A088GO:0044451nucleoplasmpart12A1W6,A0A088AA86,externalsideofplasmaA0A088A788,V9IKL7,A0A088AH97,A0A088A1GO:0009897membrane588,A0A087ZW99,A0A088A788,V9IKL7,A0A088ANY0,A0A088A1GO:0001669acrosomalvesicle488,A0A088AVH5,A0A088AHL5,V9IG24,A0A088A0GO:0000922spindlepole5L4,V9IBC8,myelinsheathabaxonalGO:0035748region3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,GO:0030056hemidesmosome3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,A0A088ARP9,A0A087ZS18,A0A088AHL5,A0A0GO:0000790nuclearchromatin687ZWF1,A0A088A0L4,A0A088A2K9,39 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析nuclearchromatin6hemidesmosome3myelinsheathabaxonalregion3spindlepole5acrosomalvesicle4externalsideofplasmamembrane5nucleoplasmpart12sarcolemma6intrinsictoendoplasmicreticulummembrane6integraltoendoplasmicreticulummembrane6integrincomplex3intrinsictoplasmamembrane14receptorcomplex4CellularComponentalpha9-beta1integrin-ADAM8complex2cohesincomplex2integraltoplasmamembrane14striatedmuscledensebody4alpha8-beta1integrincomplex3alpha3-beta1integrincomplex3alpha9-beta1integrincomplex3transcriptionfactorcomplex5051015Numberofprotein图3.9细胞组分中所涉及的下调蛋白Fig.3.9Down-regulatedproteinsinvolvedinCellularComponent40 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析表316生物进程中所涉及的下调蛋白（部分）Table3.16Down-regulatedproteinsinvolvedinBiologicalProcess（partly）termdesc#indifferentproteininvolveA0A088AEX7,A0A088A788,V9IKL7,A0A088AGO:0042113Bcellactivation5747,A0A088A188,GO:0006968cellulardefenseresponse3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,A0A088AEX7,A0A088AVH5,A0A088A9Z3,A0GO:0033077Tcelldifferentiationinthymus4A087ZW99,V9IJF1,A0A088AF83,A0A088AEX7,A0A088AregulationofcytokineH97,A0A088APM5,A0A087ZTY2,A0A087ZN5GO:0001817production74,A0A088AEX7,A0A088AVH5,A0A088A788,A0GO:0048771tissueremodeling6A088AVY2,A0A088A188,A0A087ZSH4,A0A087ZPE3,A0A088A788,V9IKL7,A0A088AGO:0010669epithelialstructuremaintenance4188,regulationofosteoclastGO:0045670differentiation3A0A088AVH5,A0A088A788,A0A088A188,positiveregulationofmyeloidGO:0002763leukocytedifferentiation3A0A088AEX7,A0A088A788,A0A088A188,positiveregulationofmitoticGO:1901992cellcyclephasetransition3V9IJF1,A0A088A0F5,A0A088AVY2,A0A088AEX7,V9IM78,A0A088A788,V9IKL7,A0A088ANY0,A0A087ZWF1,A0A088AVY2,A0multi-multicellularorganismA088A117,A0A087ZWE0,A0A088A188,A0A08GO:0044706process117ZVX2,GO:0050798activatedTcellproliferation2A0A088AEX7,A0A088A747,regulationofactivatedTcellGO:0046006proliferation2A0A088AEX7,A0A088A747,calcium-dependentcell-cellGO:0016339adhesion3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,maintenanceofepithelialGO:0035160integrity,opentrachealsystem3A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,positiveregulationoftissueGO:0034105remodeling2A0A088A788,A0A088A188,regulationofTcellGO:0033081differentiationinthymus2A0A088A9Z3,A0A087ZW99,41 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析termdesc#indifferentproteininvolvepositiveregulationofA0A088A788,V9IKL7,A0A088AH97,A0A088AGO:0010811cell-substrateadhesion4188,A0A088AEX7,A0A088AVH5,A0A088A9Z3,A0GO:0030217Tcelldifferentiation4A087ZW99,Tcelldifferentiation4positiveregulationofcell-substrateadhesion4regulationofTcelldifferentiationinthymus2positiveregulationoftissueremodeling2maintenanceofepithelialintegrity,opentrachealsystem3calcium-dependentcell-celladhesion3regulationofactivatedTcellproliferation2activatedTcellproliferation2multi-multicellularorganismprocess11positiveregulationofmitoticcellcyclephasetransition3positiveregulationofmyeloidleukocytedifferentiation3BiologicalProcessregulationofosteoclastdifferentiation3epithelialstructuremaintenance4tissueremodeling6regulationofcytokineproduction7Tcelldifferentiationinthymus4cellulardefenseresponse3Bcellactivation5024681012Numberofprotein图3.10生物进程中所涉及到的下调蛋白（部分）Fig.3.10Down-regulatedproteinsinvolvedinBiologicalProcess（partly）42 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析表3.17分子功能中所涉及的下调蛋白Table3.17Down-regulatedproteinsinvolvedinMolecularFunctiontermdesc#indifferentproteininvolveA0A087ZS18,A0A088AVH5,A0A088AHL5,A0A088GO:0003682chromatinbinding7A0F5,A0A087ZWF1,A0A088A0L4,A0A088A2K9,celladhesionmoleculeGO:0050839binding4A0A088AVH5,A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,Q309A5,A0A088AJJ2,V9IG07,A0A087ZXV9,A0A08GO:0004497monooxygenaseactivity68A8J8,A0A088A361,estrogenreceptorGO:0030331binding2V9I9R9,A0A087ZUH9,G-proteincoupledGO:0004930receptoractivity2A0A088ACV5,A0A087ZYJ9,transcriptionfactorGO:0008134binding4V9IJF1,A0A088AVH5,A0A087ZUH9,A0A087ZWF1,A0A088A9C4,A0A088A3L2,A0A088AFH7,A0A088GO:0017171serinehydrolaseactivity5AEY3,A0A087ZYG3,proteinheterodimerizationA0A088AFI9,Q17058,A0A088A788,V9IKL7,A0A088GO:0046982activity6ANY0,A0A088A188,proteinheterodimerizationactivity6serinehydrolaseactivity5transcriptionfactorbinding4G-proteincoupledreceptoractivity2estrogenreceptorbinding2monooxygenaseactivity6MolecularFunctioncelladhesionmoleculebinding4chromatinbinding702468Numberofprotein图3.11分子功能中所涉及到的下调蛋白Fig.3.11Down-regulatedproteinsinvolvedinMolecularFunction在细胞组件（CellularComponent）分析中可以发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织差异蛋白中与细胞组分主要表达于细胞质膜组分（integraltoplasmamembrane）、质膜内在蛋白（intrinsictoplasmamembrane）、转录因子复合体（transcriptionfactorcomplex）、核染色质（nuclearchromatin）、半桥粒（hemidesmosome）、髓鞘轴外区（myelinsheathabaxonalregion）、纺锤体极（spindlepole）、顶体囊泡（acrosomalvesicle）、细胞质外膜（externalsideofplasmamembrane）、核浆部分（nucleoplasmpart）、肌纤维膜（sarcolemma）、内质网膜的固有成分（intrinsictoendoplasmic43 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析reticulummembrane）、内质网膜组分（integraltoendoplasmicreticulummembrane）、受体复合物（receptorcomplex）、黏连蛋白复合体（cohesincomplex）、横纹肌密集体（striatedmuscledensebody）以及几种整合素复合体中，如α9-β1整合素复合体（alpha9-beta1integrincomplex）。在表达下调蛋白生物学途径（BiologicalProcess）功能注释中我们发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织表达下调的蛋白主要为参与分化、代谢以及代谢调节进程，其中包括有B细胞活化（Bcellactivation）、细胞防御反应（cellulardefenseresponse）、多细胞间生物进程（multi-multicellularorganismprocess）、骨髓白细胞分化正调节（positiveregulationofmyeloidleukocytedifferentiation）、有丝分裂细胞周期转换正调节（positiveregulationofmitoticcellcyclephasetransition）、钙依赖性细胞间粘附（calcium-dependentcell-celladhesion）、上皮组织完整性以及开放性气管系统的维持（maintenanceofepithelialintegrity,opentrachealsystem）、细胞因子产生的调节（regulationofcytokineproduction）、胸腺T细胞分化的调节（Tcelldifferentiationinthymus）、以及组织重构的正调节（positiveregulationoftissueremodeling）、细胞基底粘合的正调节（positiveregulationofcell-substrateadhesion）、活化的T细胞增殖（activatedTcellproliferation）、活化的T细胞增殖的调节（regulationofactivatedTcellproliferation）等生物进程。在分子功能（MolecularFunction）注释中发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染后的意蜂中肠组织表达下调蛋白主要功能为结合类和催化类，如蛋白异源二聚化活性（proteinheterodimerizationactivity）、丝氨酸水解酶活性（serinehydrolaseactivity）、G蛋白耦合受体活性（G-proteincoupledreceptoractivity）、单氧酶活性（monooxygenaseactivity）、雌激素受体结合（estrogenreceptorbinding）、细胞粘合分子结合（celladhesionmoleculebinding）、核染色质结合（chromatinbinding）和转录因子结合（transcriptionfactorbinding）等生物功能。3.2.4.6侵染后24h的处理组和对照组差异蛋白的KEGG分析结果通过对差异蛋白Pathway进行富集分析表明，有144个差异蛋白注释到了96个Pathway，其中显著富集即P值小于0.05的有51个蛋白注释到了14个Pathway，显著性最高的为致病性大肠杆菌感染通路(PathogenicEscherichiacoliinfection)，另外还有在RNA转运（RNAtransport）、鞘脂类代谢（Sphingolipidmetabolism）、利什曼病（Leishmaniasis）、细胞黏附分子(CAMs)[Celladhesionmolecules(CAMs)]、药物代谢-其他的酶(Drugmetabolism-otherenzymes)、轴突导向(Axonguidance)、胞外基质与受体互作(ECM-receptorinteraction)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycandegradation)、白细胞跨内皮层迁移（Leukocytetransendothelialmigration）、细菌侵入上皮细胞(Bacterialinvasionofepithelialcells)、致心律失常性右室心肌病(ARVC)[Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy(ARVC)]、弓形体病(Toxoplasmosis)、小细胞肺癌(Smallcelllungcancer)。具体通路信息列表如表3.18所示：44 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析表3.18KEGG通路信息Table3.18TheinformationsofKEGGPathway鉴定的差异蛋白注释到鉴定的蛋白注释到该通通路ID编号通路名该通路的数目及比例路的数目及比例P值Pathway#PathwayProteinswithpathwayAllProteinswithPvalueIDannotation(144)pathwayannotation(973)致病性大肠杆菌感染1Pathogenic10(6.94%)25(2.57%)0.001659024ko05130EscherichiacoliinfectionRNA转运222(15.28%)83(8.53%)0.002591254ko03013RNAtransport鞘脂类代谢3Sphingolipid3(2.08%)3(0.31%)0.003184113ko00600metabolism利什曼病43(2.08%)4(0.41%)0.011347918ko05140Leishmaniasis细胞黏附分子(CAMs)5Celladhesion3(2.08%)4(0.41%)0.011347918ko04514molecules(CAMs)药物代谢-其他的酶6Drug8(5.56%)23(2.36%)0.013011195ko00983metabolism-otherenzymes轴突导向76(4.17%)16(1.64%)0.021154479ko04360Axonguidance胞外基质与受体互作85(3.47%)12(1.23%)0.021903014ko04512ECM-receptorinteraction糖胺聚糖降解9Glycosaminogly3(2.08%)5(0.51%)0.025299683ko00531candegradation45 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析鉴定的差异蛋白注释到鉴定的蛋白注释到该通通路ID编号通路名该通路的数目及比例路的数目及比例P值Pathway#PathwayProteinswithpathwayAllProteinswithPvalueIDannotation(144)pathwayannotation(973)白细胞跨内皮层迁移10Leukocyte7(4.86%)22(2.26%)0.032821303ko04670transendothelialmigration细菌侵入上皮细胞11Bacterial8(5.56%)27(2.77%)0.034917854ko05100invasionofepithelialcells致心律失常性右室心肌病(ARVC)12Arrhythmogenic5(3.47%)14(1.44%)0.043208751ko05412rightventricularcardiomyopathy(ARVC)弓形体病135(3.47%)14(1.44%)0.043208751ko05145Toxoplasmosis小细胞肺癌14Smallcelllung4(2.78%)10(1.03%)0.046958458ko05222cancer46 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析从上表我们可以看出，差异蛋白Pathway富集显著性最高的致病性大肠杆菌感染通路(PathogenicEscherichiacoliinfection)，共有10个差异蛋白参与到了该通路，占总量的6.94%，绿色标注为表达下调，红色标注为表达上调，如图3.12所示：图3.12致病性大肠杆菌感染通路Fig.3.12ThepathwayofPathogenicEscherichiacoliinfection47 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析与免疫相关的差异蛋白Pathway白细胞跨内皮层迁移（Leukocytetransendothelialmigration），共有7个差异蛋白参与到了该通路，占总蛋白的4.86%，绿色标注为表达下调，红色标注为表达上调，如图3.13所示：图3.13白细胞跨内皮层迁移通路Fig.3.13ThepathwayofLeukocytetransendothelialmigration两个通路具体信息如表3.19：表3.19以上两个通路具体信息Table3.19Thedetailinformationofthetwopathwaysabove通路蛋白编号#PathwayProteins致病性大肠杆菌感染,A0A088ARP9,A0A087ZSC1,A0A087ZYZ2,A0A088AFI9,V9IDV0,1PathogenicEscherichiacoliA0A088AVH5,A0A088A788,V9IKL7,A0A088A188,V9IM08infection白细胞跨内皮层迁移,A0A088ARP9,V9IDV0,A0A088AVH5,A0A088A008,A0A088A788,10LeukocytetransendothelialV9IKL7,A0A088A188migration3.3讨论对蛋白质进行定性和定量分析发现，受东方蜜蜂微孢子虫侵染的意蜂中肠组织蛋白表达既存在表达上调又存在表达下调的现象，且上调蛋白与下调蛋白数目无明显差别。差异蛋白分子量偏小，小于60kDa的差异蛋白占总差异蛋白的73.4%，且差异蛋白的等电点分布较为均匀。48 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析对于病原体的侵染，蜜蜂有多重对抗机制(Evansetal.,2006)：一些昆虫受它们外部的抗菌分泌物以及对病原体有敌对性的肠道环境的保护。当病原体穿越这些屏障的时候，上皮细胞往往足够用来阻止其进一步的侵染。当病原体穿过形态学防御时，接下来将面对细胞和体液免疫防御。昆虫免疫与人类以及其他的脊椎动物的固有免疫有许多相似之处，包括多样性机制，比如抗菌肽的分泌、吞噬、黑化以及病原体的酶解(Hoffmann,2003;Hultmark,2003)。根据先前的报道，东方蜜蜂微孢子虫在意蜂体内能够给意蜂造成严重的健康问题包括：免疫抑制(Antúnezetal.,2009)，意蜂肠道上皮细胞退化(Higesetal.,2007)，以及蜜蜂寿命的缩短(Higesetal.,2007)。蜜蜂肠道上皮细胞是组织病原性微生物入侵的第一道防线，这种典型的固有免疫在防御广泛的微生物方面具有重要作用(Medzhitovetal.,1997)。生物学过程中参与组织重构的已知蛋白A0A088A188（Integrinbeta）、A0A088A788（Integrinbeta）、A0A087ZSH4（Lipase）、A0A088AEX7（Signaltransducerandactivatoroftranscription）均表现为表达下调，这表明东方蜜蜂微孢子虫影响了蜜蜂肠道的组织重建，导致肠道组织受损，并最终导致蜜蜂死亡，这从机理上证明了先前报道的东方蜜蜂微孢子虫可抑制病蜂的肠道组织的更新(Dussaubatetal.,2012)。在表达上调蛋白生物学途径（BiologicalProcess）跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的负调节（negativeregulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingpathway）、刺激反应负调节（negativeregulationofresponsetostimulus）、细胞交流负调节（negativeregulationofcellcommunication）、信号转导负调节（negativeregulationofsignaltransduction）、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的调节（regulationoftransmembranereceptorproteinserine/threoninekinasesignalingpathway）、转换生长因子β受体信号通路的负调节（negativeregulationoftransforminggrowthfactorbetareceptorsignalingpathway）以及甾类激素刺激反应（responsetosteroidhormonestimulus）等生物进程中的已知蛋白有A0A076ME81、A0A076MF55等12种延长因子以及A0A088A9S3（L-lactatedehydrogenase）、A0A088ADV7（Importinsubunitalpha）、A0A088ASL4（Aspartateaminotransferase）、A0A088ATV8（Nucleosidediphosphatekinase）、V9IAY7（Epsin-2）、V9ICG5（Serine/threonine-proteinphosphatase2AregulatorysubunitA）、V9IDV0（Cdc42）、V9IH96（Myelingeneregulatoryfactor）和V9IKJ0（Microtubule-associatedproteinRP/EBfamilymember1）。这些差异蛋白表达上调表明东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂后，意蜂的信号转导、应急反应以及细胞间的信息交流等过程受到抑制。表达下调蛋白参与的生物过程B细胞活化（Bcellactivation）、细胞防御反应（cellulardefenseresponse）、多细胞间生物进程（multi-multicellularorganismprocess）、骨髓白细胞分化正调节（positiveregulationofmyeloidleukocytedifferentiation）、钙依赖性细胞间粘附（calcium-dependentcell-celladhesion）、细胞因子产生的调节（regulationofcytokineproduction）、胸腺T细胞分化的调节（Tcelldifferentiationinthymus）以及细胞基底粘合的正调节（positiveregulationofcell-substrateadhesion）、活化的T细胞增殖（activatedTcellproliferation）、活化的T细胞增殖的调节（regulationofactivatedTcellproliferation）中的已知蛋白A0A087ZSH4（Lipase）、A0A088AEX7（Signaltransducerandactivatoroftranscription）和A0A088A788（Integrinbeta）、V9IKL7（Integrinbeta）、A0A088A188（Integrinbeta）等均表现为表达下调。表明东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂后，意蜂的免疫、防御以及应激反应均受到抑制通过上述分析我们可以看出差异蛋白多涉及到蜜蜂中肠的组织重建、蜜蜂的固有免疫以及特49 中国农业科学院硕士学位论文第三章东方蜜蜂微孢子虫侵染后意蜂中肠蛋白质组分析异性免疫等与蜜蜂机体免疫紧密相关的生物学过程，证明东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂的侵染已经穿过了肠道上皮细胞的第一道防线的固有免疫，进入蜜蜂的细胞免疫和体液免疫引起了蜜蜂的特异性免疫反应并使蜜蜂特异性免疫受到抑制，蜜蜂的这些生理变化在一定程度上解释了东方蜜蜂微孢子虫对意蜂致病性的生理机理。同时，通过KEGGPathway分析，我们发现蛋白质显著性最高的通路致病性大肠杆菌感染通路(PathogenicEscherichiacoliinfection)所涉及到的10种蛋白质中，已知蛋白有V9IDV0（Cdc42）和V9IM08（Actin-relatedprotein2/3complexsubunit3）表达上调，蛋白A0A088A788（Integrinbeta）、V9IKL7（Integrinbeta）和A0A088A188（Integrinbeta）表达下调。白细胞跨内皮层迁移（Leukocytetransendothelialmigration）通路中所涉及到的已知蛋白V9IDV0（Cdc42）表达上调，蛋白A0A088A788（Integrinbeta）、V9IKL7（Integrinbeta）和A0A088A188（Integrinbeta）表达下调。结合差异表达蛋白GO功能分析的细胞组分分析中我们发现，表达下调的蛋白A0A088A788（Integrinbeta）、V9IKL7（Integrinbeta）和A0A088A188（Integrinbeta）分布于α9-β1整合素复合体（alpha9-beta1integrincomplex）等多种β1整合素蛋白复合体中。从上述分析中我们可以发现整合素蛋白β是意蜂受东方蜜蜂微孢子虫侵染后最主要的差异表达蛋白，整合素是一类广泛存在的细胞表面黏附受体，介导细胞-细胞以及细胞-细胞外的信息传递，在细胞的增殖、分化、凋亡以及组织修复和肿瘤转移等方面发挥重要作用（李祖国等，2001；刘少华等，2001；唐红英等，2007；邵钦树等，2005）。根据β亚基的组成，我们可以将其分为三类即β1、β2和β3(Hynes,1987)，其中β1包括鸡整合蛋白复合体(Horwitzetal.,1985)、人类纤连蛋白受体(Pytelaetal.,1985)以及非常晚期抗原（VLAs）。非常晚期抗原（VLAs）最初是在活化的人类T细胞中发现的(Hemleretal.,1985)，并存在于多种人类细胞中。该整合素含在脊椎动物、无脊椎动物以及真菌中具有高度保守的序列，这个序列在整合素与细胞支架互作中起到重要作用(Marcantonioetal.,1988)。有研究表明整合素蛋白与人类组织病理学改变相关(蔡新华等，2008)，由此推断我们有可能通过研究整合素β1的表达与蜜蜂的组织病变的关系以明确整合素β蛋白对于蜜蜂中肠组织病变研究的作用与意义。同时，我有可能通过改变β1的构象来对整合素β1的活性进行调节(Takadaetal.,1993)，试图缓解东方蜜蜂微孢子虫引起的意蜂的蜜蜂微孢子虫病。50 中国农业科学院硕士学位论文第四章全文结论第四章全文结论4.1全国蜜蜂微孢子虫种群分布调查依据微孢子虫16S基因的特异性，采用多重PCR法，对收集自全国16个养蜂地区的69份样品进行了微孢子虫种质鉴定。鉴定结果发现，在所检测的69份样品的所有样品中都检测到了东方蜜蜂微孢子虫，而在山东寿光的一份样品中同时检测到了东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微孢子虫。初步明确了东方蜜蜂微孢子虫在中国西方蜜蜂群中已成为主要的病原种，补充了国际上对蜜蜂微孢子虫种群分布调查中国范围内的研究，同时进一步验证了前人所报道的同一个蜂场可能会同时感染2个种的微孢子虫的现象。4.2病蜂中肠差异蛋白质组分析8选取浓度为2×10个/mL的东方蜜蜂微孢子虫对意蜂进行侵染，采用iTRAQ技术和液谱质谱分析相结合的方法对侵染后24h、48h、96h、144h的病蜂进行蛋白质组研究。通过在bees_UNI_34735库中对质谱结果进行检索，共鉴定到1888种蛋白质。4.3侵染24h后差异蛋白质组分析对侵染后24h的意蜂中肠蛋白质的质谱分析结果进行生物信息学分析。我们发现东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂24h后病蜂检测到有308个差异蛋白，其中表达上调的已知蛋白有48种，表达下调的已知蛋白有47种。结合GO功能分类以及KEGGPathway富集结果，多种差异蛋白与意蜂的免疫反应相关，其中整合素蛋白为意蜂受东方蜜蜂微孢子虫侵染后中肠组织病变后的主要差异蛋白。4.4前景展望导致蜜蜂蜂群衰竭失调的原因尚不够明确。蜜蜂微孢子虫病是危害蜜蜂个体乃至蜜蜂种群健康的重要肠道疾病。根据对全国主要养蜂地区（意蜂）内蜜蜂微孢子虫的调查发现，东方蜜蜂微孢子虫将逐渐取代蜜蜂微孢子虫在意蜂体内生态位，成为意蜂蜂群中主要的病原种，东方蜜蜂微孢子虫对其新宿主—意蜂的健康造成严重威胁。因此，东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制，包括东方蜜蜂微孢子虫侵入蜜蜂体内后对意蜂肠道等造成的危害，以及意蜂在受到东方蜜蜂微孢子虫侵染后所产生的防御反应的研究将是近几年蜜蜂微孢子虫病研究的重中之重。随着意蜂基因组测序的完成，后基因组时代如期而至。差异蛋白质组研究为蜜蜂生理过程及疾病探究的重要途径，iTRAQ技术因其具有较高的重复性和准确性，使成为目前蛋白质组研究的一项重要研究技术。本实验已通过对东方蜜蜂微孢子虫侵染24h后的病蜂中肠差异蛋白质组分析，在分子水平上初步了解了东方蜜蜂微孢子虫对意蜂健康所造成的危害以及意蜂在受到东方蜜蜂微孢子虫侵染时所进行的防御反应。东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂相关的整合素蛋白差异表达的发现，为接下来蜜蜂微孢子虫病治疗的研究奠定了一定的理论基础。目标蛋白的寻找为后续实验中目标蛋白在蜜蜂微孢子虫病的重要作用的研究提供了一定的理论基础。51 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.蔡新华,毛会丽,赵丙泉,等.先天性肌性斜颈患儿胸锁乳突肌组织病理改变和整合素β1表达[J].实用儿科临床杂志,2008,23(7):550-552.2.陈健,李建科.王浆高产蜜蜂(A.m.ligustica)与喀尼鄂拉蜂(A.m.carnica)幼虫期蛋白质组比较[J].中国农业科学,2008,41(10):3292-3299.3.房宇,李建科.意大利蜜蜂(A.m.ligustica)雄蜂卵期发育蛋白质组分析[J].中国农业科学,2008,41(11):3793-3800.4.房宇,李建科.王浆高产蜜蜂和原种意大利蜜蜂雄蜂卵期发育蛋白质组分析[J].中国农业科学,2009,42(7):2552-2563.5.何大澄,肖雪媛.差异蛋白质组学及其应用[J].北京师范大学学报(自然科学版),2002,38(4):558-562.6.黄少康,杨守深,王丽华,等.中蜂来源的微孢子虫对意蜂工蜂的侵染性研究[J].中国蜂业,2007,58(1):7-8.7.李恩江.人工智能色谱过程自动控制的现状与未来[J].生命科学,1992,4(5):30-32.8.李鑫.比较蛋白质组学研究与应用进展[J].国际免疫学杂志,2006,29(3):156-160.9.李建科,李华玮,张兰.王浆高产蜜蜂(ApismelliferaL.)工蜂幼虫发育期蛋白质组分析[J].中国农业科学,2008,41(3):880-889.10.李建科,冯毛,郑爱娟.蜜蜂蛋白质组研究进展[J].中国农业科学,2011,44(17):3649-3657.11.李祖国,张进华.整合素β1对大肠癌细胞与血管内皮细胞间细胞通讯的影响[J].第一军医大学学报,2001,21(3):171-172.12.刘锋.蜜蜂微孢子虫种质资源调查及免疫学诊断技术研究[D].北京:中国农业科学院,2009.13.刘少华,程刚.下颌骨骨折愈合过程中整合素β1表达的免疫组化研究[J].实用口腔医学杂志,2001,17(2):115-117.14.唐红英,伍素华,陈建,等.整合素β1对人表皮干细胞增殖与分化的影响[J].中华实验外科杂志,2007,24(1):22-24.15.邵钦树,叶再元,凌志强,等.胃癌患者血清选择素-E和整合素-β1及细胞间黏附分子-1表达水平的临床意义[J].中华胃肠外科杂志,2005,8(2):155-158.16.田丰.费氏中华根瘤菌Sneb183防控大豆胞囊线虫病机理研究[D].沈阳农业大学,2014.17.王强,周婷,代平礼,等.蜜蜂微孢子虫研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009,27(2):171-174.18.王子佳,李红梅,弓爱君,等.蛋白质分离纯化方法研究进展[J].化学与生物工程,2009,26(008):8-11.19.吴黎明,王勇,田晓薇,等.蜜蜂及其产品作为环境污染生物指示器的研究进展[J].中国农业科技导报,2008,10(3):18-23.20.吴杰,陈文锋,李继莲.感染蜜蜂及熊蜂的微孢子虫检测与鉴定方法[J].中国农学通报,2010,52 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢本论文是在王强老师的悉心指导下完成的，从最初的论文选题、实验设计、方案修改、论文撰写以及论文修改等过程都倾注了王老师的心血。感谢三年来王老师在我学习、工作和生活中给予的批评、鼓励、关心、指导和帮助，导师扎实的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处事的道理，使我不仅仅收获了学术知识，更学会了如何去发现生活和学习中的问题并能够独立解决问题的能力。本论文的顺利完成同样离不开曲英萍师姐在实验过程中给予的悉心指导和帮助，以及生活中给予的朋友般的帮助与鼓励。同时，要感谢实验室周婷老师、代平礼老师、徐书法老师、褚艳娜老师以及吴艳艳老师等老师们对于我学习和生活的悉心关怀和指导！对于中国农业科学院蜜蜂研究所生物技术与饲养研究室的李建科老师给予的实验平台的提供，以及房宇老师、冯毛老师、韩宾老师、韩平安师姐以及亓玉萍师妹在实验技术上的指导和帮助，我表示衷心的感谢！感谢我的研究生同窗好友郭伟华、贾慧茹、靳三省、孙春丽、盖琴宝、任佳淼、吴招斌、魏月和王小奇同学在我的研究生生活和学习中给予的鼓励和帮助，有你们陪伴我度过了研究生三年的时光，陪我一起经历研究生生活的点点滴滴，使我的研究生生活更加丰富多彩，并使我更加顺利地完成了研究生的学习和科研任务。祝你们学业有成，前途似锦！感谢家人和朋友们一直以来默默的支持与鼓励，在你们的关心和支持下我才能够顺利完成学业，祝你们在以后的学习、工作和生活中一切顺利！张建燕2015年4月60 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：张建燕性别：女民族：汉出生年月：1988年8月籍贯：河南省濮阳市教育经历：2008年9月~2012年7月河南科技大学生物科学专业学习获理学学士。2012年9月~2015年6月中国农业科学院蜜蜂研究所，攻读农业推广硕士学位。论文发表情况：张建燕,刁青云,代平礼,等.中国部分主要养蜂地区侵染西方蜜蜂（Apismellifera）群微孢子虫种质分布调查[J],畜牧兽医学报,2015,(已接受)。61