延边地区蜜蜂白垩病流行病学调查及pcr检测方法的初步建立 45页

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学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标巧和致谢的部分外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料一同工作的间事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了。与我明确的说明并表示谢意。一本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的切责任和后果。研究生签名：日期：年／月Ｉ曰学位论文使巧授权声明本人在导师指导下所完成的学位论文，，学校有权保存其电子和纸制文档可Ｌ乂借阀或上网公布本学位论文的全部或部分巧容，可ｋ乂向有关部口或机构送交并、授权其保存借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。本学位论文属于：１．保密□．，在年解密后适用于本声明；２不保密曰，：＇／研究生签名：娘高导师签名：曰期六／年／月／日 延边大学硕ｄｒ学位论文￣摘要摘要＂＂＂＂延边朝鲜族自治州，Ｗ下简称延边地区地处长白山区，拥有天然的环境优势，并且也有很好的自然资源。这里有很好的锻树蜜源，并且也有多种多样的草木本蜜粉植物生长在这里。主要优质蜜源植物有极树、胡枝子、荆条等３００多种。据专家测算，按照延边地区现有蜜源面积可载蜂８０万箱。目前，拥有蜂群２２．４万群。蜜蜂白蛋病（ｂｅｅｃｈａ化ｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅ）病原为蜜蜂球裹茵（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａ巧ｉｓ），一种分布广泛的幼虫死亡的蜂病是，为重要的检疫性病害。它的抱子抗逆性很强，在花粉中存活１２个月没问题，即使在干燥的环境下，也能存活１５年。白蛋病在国内和世界其他地方都有发生，近年在国内部分地方的蜂群中传染病发展流行特别快，随着到延边地区转地放路的蜂群不断増多，蜜蜂疫病传播途径和机会不断增加，传播的速度不断加快，蜜蜂白聖病已经排名延边化区蜜蜂疫病发病前Ｈ位，严重阻碍了养蜂业的发展，并且不利于提窩蜂蜜的品质和产量。这种病主要的传播媒介是水、饲料和养蜂工具等，其传播媒介多种多样，非常广泛。蜂群内部的传播主要是在内勤蜂在进行饲喂活动时，将抱子通过花粉传给了健康的幼虫使幼虫染病，而且，菌丝体也可Ｗ直接侵染健康幼虫。此病发病后控制难度高，对蜂群的危害也极大，甚至影响整个蜂群的生存，因此，白至病流行病学研究显得十分紧迫和必要。根据蜜蜂白聖病流行病学基础研究一套Ｗ，初步建立了ＰＣ民为基础蜜蜂白聖病分子诊断技术，该分子诊断技术具有准确、灵敏和快捷的特点，完全不依赖于典型症状，所Ｗ可用于蜂群无典型症状或症状不易发现的发痛巧期或处于潜伏期的病原检测。本研究为蜜蜂白垂病流行病学研究提供理论依据一，为进步筛选功能基因，并为利用ＰＣ艮诊治蜜蜂白聖病奠定基础，从而推动我国特色蜜峰产业健康快速发展。关键词：延边地区；蜜蜂垄病ＰＣ民检测；白；流行病学；Ｉ 延巧大学硕±学位论文一ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔ＂＂＂ＹａｎｂｉａｎＫｏｒｅａｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏａｓｙａｎｂｉａｎ，＂ａｒｅａｉｓｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｈａｎｇｂａｉｍｏｕｎｔａｉｎｓＨａｓａｕｎｉｑｕｅｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｎａｔｕｒａｒ巧ｏｕｒｃｅｓｅｎｏｔｏｎｒｉｃｈｉｎｌｉｎｄｅｎｈｏ打ｅｂｕｔａｌｓｏｗｉｔｈａｌａｄｖａｎｔａｌｉｓｇ，ｙｙ，ｗｉｄｅｖａｒｉｅｔｏｆｗｏｏｄａｎｄｈｅｒｂａｃｅｏｕｓａｕｘｉｏｗｄｅｒｌａｎｔｋｎｏｗｎａｓｔｈｅｙｙｌｉａｒｙｐｐ，＂＂＊ｕａ１化ｒａｉｙｄｏｎｇｓｈａｎｈｏｎｅｙ．Ｍａｉｎｑｌｉｔｙｎｅｃｔａｒｉｆｅｒｏｕｓｐｌａｎｔｌｉｎｄｅｎ，ｌｅｓｐｅｄｅｚａ，ｔｈｏｒｎｓａ打ｄｓｏｏ打ｍｏｒｅｔｈａｎ３００．Ａｃｃｏｒｄｉ打ｇｔｏｅｘｅｒｔｅｓｔｉｍａｔｅｓ，ａｃｃｏｒｄｉ打ｇｔｏｔｈｅｐｅｘｉｓｔｉｎｇｎｅｃｔａｒｓｏｕｒｃｅａｒｅａｏｆ化ｅｙａｎｂｉａｎｒｅｉｏ辽ｃａｎｃａｒｒ８０００００ｃａｓｅｓｂｅｅ．Ａｔｇｙｒｅｓｅ打ｔ２２４０００ｂｅｅｓｒｏｕ．ｐ，ｇｐＢｅｅｓｃｈａｌｋｄｉｓｅａｓｅ（ｂｅｅｃｈａｌｋｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅｓ）ｐａｔｈｏｇｅｎｓｆｏｒｂｅｅｓｂａｌｌｏｏｎｂａｃｔｅｒｉａ（Ａｓｃｏｓｐｈａ巧ａａｐｉｓ），ｉｓａｋｉｎｄｏｆｗｉｄｅｓｐｉｒｅａｄｂｅｅｌａｒｖａｅｄｅａｔｈｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｅｅｓｂａｌｌｏｏ打ｆｕｎｇｕｓｓｐｏｒｅｓｈａｖｅｓｔｒｏｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃａｎｓｕｒｖｉｖｅａｙｅａｒｉ凸ｏｌｌｅｎｃａｎｌｉｖｅ１５ｅａｒｓｕｎｄｅｒｄｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｄｉｓｅａｓｅｈａｖｅｐ，ｙｙｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｏｕｒｃｏｕ打ｔｒｙ，ａｎｄａｒｏｕｎｄｔｈｅｗｏｒｌｄｉｎｒｅｃｅ打ｔｙｅａｒｓｉ打ｏｕｒｃｏｕ打ｔｒｙｓｏｍｅａｒｅａｓｏｆ１：ｈｅｓｗａｒｍｏｆｂｅｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｕｔｂｒｅａｋａｓｔｏｔｈｅａｎｂｉａ打ａｒｅａ，ｙｔｕｒｎｅｄｔｏｕｔａｓｗａｒｍｏｆｂｅｅｓ，ｂｅｅｄｉｓｅａｓｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｗａｙａｎｄｔｈｅｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙｔｏｐｃｏｎｔｉｎｕｅｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｅａｄｂｅｅｄｉｓｅａｓｅｈａｓｂｅｅｌａｕｅ，巧，ｐｇｏｕｔｂｒｅａｋｏｆｔｈｅｙａｎｂｉａｎｒｅｇｉｏｎｔｏｐｔｈｒｅｅ，ｂｅｃｏｍｅｔｈｅｅ打ｅｍｙｏｆａｐｉｃｕｈｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｅｒｉｏｕｓｉｍｐａｃｔｓｏ打ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｙａｎｂｉａｎｒｅｇｉｏｎｂｅｅｋｅｅｐｉｎｇａｎｄｉｅｌｄａｎｄｕａｌｉｔｙｏｆｈｏｎｅ．ｙｑｙＢｅｅｓｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｓｐｒｅａｄｏｆｄｉｓｅａｓｅｉｓｖｅｒｙｂｒｏａｄ，ｓｕｃｈａｓｗａｔｅｒ，ｆｅｅｄｗｉｔｈｂｅｅｓａｒｅｔｈｅｍａｉｎｍｅｄｉａｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｗｉｔｈｉｎｇｒｏｕｐｓｐｒｅａｄｍａｉｎｌｙｔｈｒｏｕｇｈｂａｃｋｏｆｆｉｃｅｂｅｅｆｅｅｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔｈｅｐｏｌｌｅｎｏｆｂｒｕｓｓｅｌｉｎｆｅｃｔｈｅａｌｔｈｙｌａｒｖａｅａｎｄｄｉｓｅａｓｅ，ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｃａｎａｌｓｏｉｎｆｅｃｔｄｉｒｅｃｔｌｙｌａｒｖａｅ．Ｃｈａｌｋａｆｔｅｒｄｉｓｅａｓｅｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｃｈａｌｋｓｗａｒｍｓｉｃｋｉｓｗｉｅｄｏｕｔｗｈｏｌｅｒｏｕ，ｐｇｐ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｇｒｏｕｐｏｆｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｓｗａｎｉｎｇ．Ｃｈａｌｋｄｉｓｅａｓｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ａｐｐｅａｒｖｅｒｙｕｒｇｅｎｔａｎｄｎｅｃｅｓｓａｒｙ．ＡｃｃｏｒｃＵｎｇｔｏｔｈｅｂｅｅｄｉｓｅａｓｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔｅｃｈｎｉｕｅｓｂａｓｅｄｏｎＰＣ民ｂｅｅｓｃｈａｌｋｄｉｓｅａｓｅｔｈｅｑ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓ１：ｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃ１：ｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｅ打ｓｉｔｉｖｅａｎｄｆａｓｔ，ａｎｄｎｏｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｓｏｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｂｕｚｚｅｒｓｎｏｔｙｐｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓｏｒｔｈｅｏｎｓｅｔｏｆｓｙｍｐｔｏｍｓｉｓｎｏｔｅａｓｙｔｏｆｉ打ｄｔｈｅｅａｒｌｙｏｒａｔｈｏｅｎｐｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎ化ｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｅｒｉｏｄ．ｐＩＩ 一Ａｂ延边大学硕±学位论文ｓｔｒａｃｔＴｈｉｓ巧ｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｂｅｅｄｉｓｅａｓｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｅｓｏｕｒｈｅｒｓｃｒｅｅｎ打ｅ打ｅｓａｆｏｕｎｄａｔｏ打ｕｓｎＰＣ民ｉｔｆｔｉｆｕｎｃｔｉｏ打ａｌａｎｄｌａｙｉｆｏｒｉ，ｇｇｇ，ｂｅｅｓｃｈａｌｋｏｆｄｉａｇ打ｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄｒｏｍｏｔｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｂｅｅｐｉｎｄｕｓｔｒｙｈｅａｌｔｈａｎｄｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｅｎｔｉｎＣｈｉ丘ａ．ｙｐｍＩｌｌ 延边大学硕±学位论文一目录目录Ｉ摘要ＨＡｂｓｔｒａｃｔｍ２Ｉ蜜蜂白聖病流行病学２１１．蜜蜂白蛋病概述３１２蜜蜂白聖病病原、传染源及传播途径．４１．３影响白聖病发病的内外因素６１．４蜜蜂白里病的症状和流行病学特点７１．５ＣＣＤ与蜜蜂白垄病７２延边地区养蜂业概况及疫病防治７２１．延边地区养蜂业概况８２．２蜜蜂疫病防治意义区蜜蜂白聖病流行病学调查９３延边地９３．１延边地区蜜蜂总体调查１１３．２延边地区蜜蜂疫病调查１２３．３延边地区蜜蜂白聖病调查１３３４延边地区蜜蜂白聖病流行病学调查．１４３．５延边地区蜜蜂白聖病调查分析及结果１５４蜜蜂白聖病检测方法研究进展１６４１．蜜蜂白聖病传统诊断方法４１６．２蜜蜂白蛋病常规生化检测方法聖病的分子检测方法研究进展１７４．３蜜蜂白１７５研究目的及意义１９材料与方法１９１Ｍ料１．１材料１１１．．样品１丄２试剂与仪器１．２方法１２．１病料的处理．２０１２．２蜜蜂球囊菌总ＤＮＡ的提取．２０１２．３义务的设计与合成． 延边大学硕±学位论文一目录２０１２４ＰＣＲ扩增及最佳退火温度的筛选．．２１１．２．５ＰＣ民产物的回收与克隆２１１、．２．６重组质粒的鉴定序列测定２１１．２．７特异性试验２２１１．．８敏感性试验２２１２．９ＰＣ民检测方法的初步应用．２２２结果ＰＣ民扩增２２２．１蜜蜂球囊菌的２２２２ＰＣ民检测敏感性试验结果．２．３目的基因克隆及重组质粒鉴定２．４序列测定及同源性分析２５Ｐ．Ｃ民检测特异性试验结果２．６ＰＣ民检测方法的应用２８Ｗ论２７结ｉｆｅ２８参考文献致谢３３３４作者简介３５附录（在研期间发表的专著及论文）／ 延边大学硕±学位论文一前言—１—刖旨我国是世界养蜂大国，养蜂业在我国有着悠久的历史，蜂群饲养量和蜂产一Ｗ，品产量均占世界第位。养蜂是对自然环境具有保护作用的生态产业更是能够带领农户脱贫致富的产业。蜜蜂生产的蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、蜂花粉等天然优质的产品，广泛应用于食品、医药、轻工业等行业中。除与其它畜牧养殖业具有共性外，养蜂还具有为农作物传花授粉促进农业增产的特殊性，蜜蜂与植物协同进化，其授粉价值为蜜蜂产品本身价值的１０７倍，对植物多样性及环境的可持续发展具有举足轻重的作用，在农林业生产生活中被广泛应用，可Ｗ为保护地、大田作物等授粉，增产增效，具有良好的经济价值。因此，养蜂是口－３经济效益Ｊ、生态效益、社会效益兼顾的产业。世界上蜜蜂属包括大蜜蜂、黒大蜜蜂、小蜜蜂、黑小蜜蜂、东方蜜蜂扔■ｙｃｅｍｎａＦａｂｒｉｃｉｕｓ）和西方蜜蜂ｍｅ化诉ｒａＬ．）６个种。目前，我国饲养的蜜蜂主要有中华蜜蜂（ＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａＦａｂｒｉｃｉｕｓ）、意大利蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅ一ｌｌｉｆｆｅｒａ）、东北黑蜂、喀尼阿兰蜂和新疆黑蜂Ｗ及西方蜜蜂的些杂交种。就全国而言，我国饲养最普遍的是东方蜜蜂（ＡｐｉｓｃｅｒａｎａＦａｂｒｉｃｉｕｓ）的地理亚种中华蜜蜂（ＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｉｒａｎａＦａｂｒｉｃｉｕｓ）和西方蜜蜂（ＡｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａＬ．）中的意大利蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｆｅｒａ），在我国的生产实践上，还有中蜂。蜜蜂饲养Ｗ量为８００多万群，其中饲养中华蜜蜂１５０多万群。＂＂＂＂延边朝鲜族自治州，ｙＸ下简称延边地区化处长白山区，面积４３４７４平方公里，自然环境很好，水资源，气候，温度适宜，还有优质的地理环境和丰富的林地资源，形成了十分丰富的蜜、粉源植物，这里有很好的根树蜜源，并且也有多种多样的草木本蜜粉植物生长在这里。能这正是蜜蜂繁衍生息的必要条件。全州内有很多锻树、胡枝子、荆条、洋槐等，而这些正是是优质的蜜＂，花和农作物蜜源也多种多样，据统计有超过Ｈ百多种之多源，素有东山蜜＂库之称。而且，最近几年来，随着州内水飞劑、角瓜、苹果梨等特色产业的飞速发展，形成了很大的规模，也为蜜蜂提供了大量的辅助性蜜源。充分依靠，比如密、粉等植物现有的资源，提高养蜂的经济巧益，也是全州发展农村经一个重要手段济的，而且蜜蜂能为农作物授粉提島座果率，对推进农业建设，发展高产、优质、高效、生态、安全农业都有重要作用。养蜂业是延边的传统特色产业。，，养殖历丈悠久近年来在州委、州政府的島度重视和系列优惠政策的扶持下，，养蜂业得到了快速发展己成为延边特色５［］牧业中极具发展潜为和广阔前景的产业。１ －延边大学硕上学位论文一前言一蜜蜂的常见病是蜂业生产最重要的影响因素之，主要包括传染病、寄生虫病、中毒病等。传染病根据病原不同，可分为细菌、病毒、真菌、衣原体、支原体、立克次体病等。掌握好并运用好蜜蜂常见病的防治方法，是保证蜂群ｗ－ｓｉｔ健康、维持蜂业生产必须具备的技术。一一我国农业部于九九年的二月十二日公布的《、二、Ｈ类动物疫病病种名录》既已将蜜蜂病确定为二类疫病，而这其中就包含了白聖病。这类疫病有可能给经济带来很大的损失，，因此有必要通过严格的防控防治措施来阻止它的扩散。养蜂业的发展受蜜蜂疾病的严重影响。只要蜂群中产生这类疾病，势必造成蜂群变弱，降低蜜蜂产品的品质和产量，同时影响着农作物的授粉，更甚者会导致养蜂者的破产。因此，开展蜜蜂白里病流行病学调査及ＰＣＲ检测方法的初步建立，来快速准确地诊断蜜蜂疾病，对防止疾病传播和保证养蜂生产的正常进行具有重要意义。１蜜蜂白聖病流行病学１．１蜜蜂白聖病概述９＂＂一ｅｅ［］蜜蜂白聖病（ｂｃｈａｌｋｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅ）又称石灰质病，是由种蜜蜂球囊菌引发的，菌丝侵入蜜蜂幼虫中肠围食膜，引－一１０１１一起蜜蜂幼虫死亡的［］种顽固性真菌传染病。１９１３年Ｍａｓｓｅｎ在德国第次报道了对白聖病的观察。之后，这种病迅速的传播到很多国家。１９６８年Ｗ前主１２－要是发生在欧洲各国［１３］，随着养蜂行业的发展，及蜜蜂制品的贸易活动，一１９７０年ｔＵ后快速传播至美洲，东南亚等些国家１９８３。年首次在我国台湾省发现该病一，并快速蔓延至台湾全省各地，成为台湾地区蜜蜂的大主要病害４－１１５。９６１［］大陆在１年曾经报道发生过白里病１６，但当时未造成危害［］尚未引起足够的重视。１９８８年，白里病在±耳其大势爆发，给改过养蜂业照成了及－其严重的危害。调查显示１９８６１９８８年间主要通过蜂蜡出口，将白蛋病传播到＾７９９日］其他国家。１年９月在浙江省发现了该病。１９９１年我国大陆第二次发现该病，由于饲养管理措施的改变和大规模的转地饲养，Ｗ及过度索取蜂产品，导致蜜蜂抗逆性降低，绝大部分峰群都缺乏抗性，Ｗ致该病在国内快速传播，［Ｗ１９９２年已在国内很多蜂场流行。我国养蜂业的发展也收到极大的影响。口１这种蜜蜂疫病正是被定名为蜜蜂白垄病］，是在第２８届国际养蜂大会上，该届会议于１９８１年举办。发现白聖病后，全世界的科研人员多了很多研究工作，Ｉ４２２３［］口］：研究包括它的发生分布范围、发病情况、分类学，最适培养条件、蜜２ 延边大学硕±学位论文一前言ＰＷＰＳ１ＰＷ蜂的免疫反应、病原的生物学特性、流行规律、病理组织学、病情的诊断方式Ｗ及生物防治［２７］等等方面，但尚无研制出特效的治疗药物。虽然白聖病在国内曾得到了有效控制，但是，又出现了新的问题，比如化学药物的过度使用，对蜜蜂产品的过度索取等，尤其是在最近几年部分地区也出现Ｔ大规模爆发的趋势。养蜂业是延边的传统特色产业。近年来，、，养殖历史悠久在州委州政府的离度重视和系列优惠政策的扶持下，养蜂业得到了快速发展，已成为延边特色牧业中极具发展潜力和前景广阔的产业。但由于近两年，延边地区雨水较大，蜂业，，尤其是蜜蜂白聖病发展受到自然灾害的较大影响蜜蜂病害不断增加。蜜蜂白聖病是延边州主要蜜蜂疾病之一，对养蜂生产影响较大。主要蜜峰病敌害调查延边地区３０户养蜂蜂农，共计２５４６群蜜蜂，发现白里病发病率为４７％，排名于延边，仅次于蜂魄州主要蜜蜂疫病第二位。为此，我们就延边地区蜜蜂白里病流行病学调查及ＰＣＲ检测方法的初步建立蜜蜂白聖病ＰＣＲ及巧光ＰＣＲ检测方法立题进行了研究。１．２蜜蜂白聖病病原、传染源及传播途径蜜蜂白聖病是一Ａ种由蜜蜂球囊菌ｓｃｏｓｈａｅｒａａｉｓ寄生，通过感染幼虫而（ｐｐ）导致蜜蜂幼虫死亡。是由德国人Ｍａｓｓｅｎ于１９１３年发现的，目前白聖病的病原不是很明确Ａ一，主流的观点是蜜蜂球囊菌ｓｃｏｓｈａｅｒａａｉｓ病原（ｐｐ）是其的唯。按新的（主流的）分类方法，将其归属于菌物界巧ｕｎｇｉ，真菌口巧ｕｍｙｃｏｔａ，子囊））菌亚ｎ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ），不整子囊菌纲（Ｐｌｅｃ化ｍｙｃｅｔｅｓ），散囊菌目巧ｕｒｏｔｉａｌｅｓ），球囊菌科（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）球囊菌属（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａ），蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）［２別。球囊菌属只有蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）和花粉球囊菌两个种。花粉球囊菌巧ｅ化ｉａａｌｖｅｉＣ浊ＯＵ）会引起厚壁抱子，蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａ巧ｉｓ）就是引起白至病的病原真菌，不产生厚壁抱子。蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）的菌丝是两性异体的。雌性菌丝呈白色，雄性菌丝呈黄褐色。温度３（ＴＣ，相对湿度达８０％Ｗ上是运种真菌的最佳生长条件。蜂球囊菌抱子有很强的生命力，口９］在干燥状态下可Ｗ存活１５年之久。到现今为止，自然界中发现的抱囊真菌比较多一，共有有２２种３０，而其中有十多种能引起蜜蜂总科患上白垂病３１，［］［］一，并且还有很多新种被发现出来是蜜蜂的重要病原。在国内直认为蜜蜂白聖病的病原是蜜蜂球囊菌，截止目前，由于我国蜜蜂白蛋病的病原缺乏全面的鉴定，还没法确定是有没有存在其他的病原。蜜蜂白聖病病原菌发生原因多种多样，并且是Ｗ很多途径在蜂群之间不断３ 延边大学硕±学位论文一前言Ｗｊ传播。国巧也有很多研究员对白聖病病原菌进入蜂箱方式和途径，蜂群感染上白里病的原因进行Ｔ很多研究和探讨。ＪｏｈｎＰ．Ｋｏｅｎｉｇ等人用已消毒的蜂机具、巢础和未检出蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）的笼蜂建立了试验蜂群，试验过程中观察到次年在试验蜂群中白垄病的水平明虽比前一年观察到的水平富很多因此他们判断病原菌蜜蜂球囊菌Ａｓｃｏｓｈａｅｒａａｉｓ来自蜂群Ｗ外（ｐｐ）。有研究人员认为蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）的传播可能是由于养蜂人或其他人的活动、蜂箱内的幼虫尸体和被污染的饲料、水源、采集蜂的体表、蜜蜂巢脾、蜜蜂的采集及盗蜂行为等等引起的蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）的袍子扩散，主要是蜜蜂在凤巢外的所有活动中无意沾染了病原物，把它带回了蜂群，或是通过内勤蜂的饲喂活动，将抱子传给了健康的幼虫导致幼虫感染，此外，幼虫也容易被菌丝体感染，通过随意调换子脾，补喂被污染的花粉所引起，还有就是由早已染病的蜂群中的蜜蜂在飞行时把病原带到了其他地方。ＪｏｈｎＰ．Ｋｏｅｎｉｇ通过严格的试验发现，从采集蜂的体表、水源、粉源分离可Ｗ得到蜜蜂球囊茜（Ａｓｃｏｓｈａｅｒａａｉｓ）。蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｈａｅｒａｉｓ抱子能在±壤ｐｐｐ巧）、污水、杂草ＰＳ１等很多地方生存。另外工蜂保持良好的蜂箱内温湿环境，也可能会引起蜜蜂３６［］巢内花粉中的蜜蜂球囊菌抱子（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ和抱子囊的繁殖。这些证）明蜜蜂白恶病的传播可（发生在野外很多东西的表面上，也可发生在蜜蜂么间。并且他们的试验结果证明了，当蜜蜂出去采集时，也有可能从蜂群中携带出去白至病病原。该种义集蜂会把蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）带到它活动过的各个地方，这样其他的蜜蜂就可能会接触到，并被感染。１．３影响白垂病发病的内外因素蜜蜂常见病种类很多，发生机理各不相同，表现症状各式各样，防治方法各有侧重和不同口７］，但是，都是内部因素和外部因素同时起作用的结果。内部因素是指蜜蜂抵抗疾病的能力，主要包括蜂种的抗病力、卫生行为、蜂群的群势及健康状况、蜜蜂的营养状况等；外部因素是指蜜蜂受到的环境压力主要包３８括环境因素［］、蜜源状况、饲养管理措施、饲养人员等等。Ｗ上因素不论作用大小，都可能会引起白至病的发生。但是如何影响白里病发生的，目前部分方面尚存在很大争议。蜜蜂对白聖病抗性机制的一个最重要的方面是行为抗性，其中卫生斤为对４ 延边大学硕±学位论文一前言蜜蜂疾病的抗性作用比较显著。蜜蜂会清扫蜂巢，这种清扫活动就是蜜蜂的卫生行为。在理论上主要是由于在巢房里开始发育的未成年的蜂瞒被杀死，使每只母瞒后代的平均数降低，从而限制了蜂瞒虫口的增长。而蜜蜂能够检测到感染病或被蜂瞒寄生的幼虫或蛹，是病、死虫蛹具有某些挥发性物质产生特殊气味使成年工蜂获得嗅觉刺激，从而清理巢房。金汤东曾经观察表面蜂群发一病与否与蜂瞒有定关系，。蜂蝴很可能是蜜蜂白聖病苗的携带者但也有人不这么认为。通过５０多年Ｗ来的大量研究，研究人员认为蜜蜂的卫生行为是蜜蜂一抗御任何病虫害的种机制，而且是可遗传的。可Ｗ通过人工的办法使这个ｔＷ性状不断累积和加强。蜜蜂的清洁行为主要是基于遗传的，这己经有人通过将抗病和易感的蜜蜂按不同比例混合成的蜂群实验得到了证明。卫生行为比较好的蜜蜂，对病、死虫蛹Ｗ及被蜂瞒寄生的虫蛹产生的化学物质具有较低的反应，如经筛选获得的具有良好卫生行为的蜂群聖病感染的幼虫发出的，对受白醋酸苯乙醋在极低浓度下，就可Ｗ表现出强烈的卫生反应，或是蜜蜂能感受到健康和不正常的虫蛹产生的热量不同。研究结果显示，含有的抱子的数量，具有清洁行为的蜂群明显要少，所Ｗ蜜蜂的清洁行为和蜜蜂对白里病的抗性有相关性。＂由具有清洁行为品系的蜂王自然交配所产生的意大利蜜蜂蜂群与未经筛且产蜜量高＂选清洁行为的蜂群相比较，患白聖病的比例较少，也没什么蜂瞒。，是由Ｓｐｉｖａｋ和Ｒｅｕｔｅｒ在１９９８年观察到的。为了找寻蜂群抗病性的差异和原因，Ｗｏｏｄ一在１９４１年ｒｏｗ，（美国昆虫和植保局）开始试验了。试验得出的结论之是，蜜蜂共有的斤为似乎是移去病虫。不管蜜蜂蜂群是否恢复健康，病虫都会被移去。而Ｈａｒｂｏ，Ｊ．Ｒ．１９９５的试验也并未发现蜂群患白聖病的程度与它们的清洁（）＝？＝＝２７行为有明显的关系巧０．０２０．６５１１。，，）不过这并不能证明白聖病的发生与蜜蜂的清洁行为是相互独立的，可是说明Ｔ在控制白聖病发生上有比蜜蜂清洁行为更加重要的方面。蜜蜂通过加热，冷却，改变空气流通的路径和速度，可Ｗ来调节蜂巢内的４３ｔｌ温度。这个是蜜蜂的温度调节行为。蜜蜂群体可Ｗ控制蜂巢的温度波动，使°一温度维持在３２－Ｃ３４。这也是蜂群抵抗外部物种入侵的个办法。曾经有研究报道过有关蜜蜂产热Ｗ应对病原菌威胁。曾经有研究人员发现微小的但是有显著意义的巢础升温，这种升温出现在白聖病的蜜蜂球囊菌病原菌入侵的时候。通过蜜蜂梳理行为的其他行为必须去除异物，抗病性和强大到足Ｗ理清蜜５ 延边大学硕±学位论文一前言蜂使用，Ｗ防止病原微生物传播给他的同伴。蜜蜂还有通过与同件相互梳理来移除外来物质和同伴身上的病原微生物一。蜜蜂的这种行为可能是由种梳理舞Ｗ１蹈行为引起的，目前蜜蜂通过这个办法来杀死蜂蜡的研究较多。很多被感染的蜜蜂很有可能在蜂巢外面死掉，蜜蜂及时将死亡的蜂从巢房中清理出去，也能降低感染病原的几率，有助于蜂群的健康发展。根据调查，延边地区部分蜂场蜜蜂白蛋病与种蜂蜂王有直接关系。蜂王的遗传因素与蜜蜂抗白恶病有一定的联系，抗病性的蜂群中的蜂王所产下的后代也有抗病性。部分研究人员认为蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）和其它真菌广泛的传播是引发这个病的主因。抗菌素的大量使用，，破坏了蜜蜂体内微生物的平衡和制约为真菌在蜂群中生长发育创造了条件。延边地区白聖病往往在春夏交替时发生，，，此时雨水较多空气潮湿温度波动频繁，而此时的蜂群整在高速繁殖，边脾和鹏边缘的幼虫由于蜂团收缩易受冻，容易发病，，，。蜂巢内的通风环境不好的温度都会加重病害的产生阴，特别是连续大雨低温影响极大则病情加重。同时雨低温潮湿，其他季节，缺乏良好的饲养管理蜂群的措施，比如给蜂巢提供的饲料和营养不足，会造成蜜蜂不能有很好的发育和身体，导致蜜蜂的抗病能力和采集能力减弱，若此时外部环境突然变化剧烈，使蜜蜂很容易感染白垄病。同时，旧巢脾极有可能携带着蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）抱子，也会加速蜂群白恶病的发展，１．４蜜蜂白里病的症状和流行病学特点白聖病主要引起西方蜜蜂的雄蜂和工蜂幼虫、蛹的死亡。成年蜂不发生此病，但会在蜂箱内外传播真菌抱子。患白聖病的幼虫在封盖后的头两天或在前蛹期死亡。幼虫被侵染后虫体开始肿胀并长出白色的绒毛，充满巢房，形状可呈巢房的六边形。接着虫体皱缩、变硬，房盖常被工蜂咬开。病虫变成白色的块状是此病的主要特征。死虫体上长出的白毛是蜂球囊菌长出的气生菌丝，等长出子实体后，病死幼虫的尸体便带有暗灰色或黑色状物，有时整个虫尸变为黑绿色，虫尸易从巢房中取出。白聖病严重时，在巢口前能找到块状的干虫尸。蜜蜂白蛋病的流行学特点一；第，白聖病发病的季节性较明显，由于蜂球囊菌需要在潮湿的条件下萌发和生长，因此，多雨潮湿、温度不稳、变化频繁，发病率较离。尤其是春末夏初昼夜温差较大，气候潮湿，白垂病最容易发生和６ 延边大学硕±学位论文一前言流行。若遇连阴雨天或巢内本身湿度过大，都会使病情加重。第二，据观察，由于子脾边缘湿度变化大一、幼虫体质较差有关，发病群般都是由边缘向中必。发展第Ｈ，蜂箱内的虫尸是主要的传染源，病害主要通过泡子传播，当蜜蜂，幼虫食入真菌巧子时抱子在巧道内开始处于静止状态，当环境条件适宜时，例如肠道厌氧的环境或幼虫本身抵抗力低下，抱子开始萌芽、增殖，形成菌丝，并穿透食膜侵入真皮细胞，再穿透肠壁在体腔内増殖，进而穿破体壁，使体表充满菌丝。该菌拖子的萌芽需厌氧条件，而菌丝生长需好氧条件。蜜蜂幼虫在？３４日龄吞食真菌巧子后最易感染。第四，蜂群清巢为的强弱决定其抗病力的强弱一。白里病不易发病，或者发病Ｔ也不容易扩散的蜂群，般都是有很强的清扫能力，病情清扫速度较快的蜂群。如果是清扫能力较弱的蜂群，就容易使该病流行开来一。蜂群的清扫能力，品种因素有定的影响，成蜂与幼虫的比率也有关系一，成蜂和幼虫的比例不低于二比的时候，这个蜂群清巧能力会比较强。对于减轻白蛋病，可Ｗ通过适当控制蜂王产卵来增加成蜂的比例实现。第五，花粉不多，或者根本没有巧粉，也可能导致病情加重。由于花粉缺乏，蜂群极易发生白里病，而且容易引起流行。进入花期Ｗ后，由于花粉充足，且气温平稳Ｗ，白恶病逐渐减控。１．５ＣＣＤ与蜜蜂白里病国际上对蜜蜂白里病越来越重视一一一。最近些年来，有种现象直没搞清楚原因，国际上称为蜂群衰竭失调（ＣｏｌｏｎｙＣｏｌｌａｐｓｅＤｉｓｏｒｄｅｒ，简称ＣＣＤ），就是蜂巢内很多工蜂突然消失的现象，这种状况给养蜂行业带来了严重的损失。目前ＣＣＤ病因有多种ｔｗ假说，其中有人提出可能与蜜蜂白聖病等有关。２延边地区养蜂业概况及疫病防治２．１延边地区养蜂业概况一延进地区的养蜂生产大体经历了五个阶段－（解放后）；第阶段是１９４５１９５７年间的自然散养平缓发展阶段。解放初期，民间自由养蜂，年养千余群，到１９４９年发展到４９５３群９９－，产蜜贿，平均每群产蜜２０公斤。第二阶段是１９５８１９７８年间的集体饲养曲折前进阶段一。这时期，养蜂生产两升两降，起伏波动大，养蜂最低年粉（１９６５年）有１４化８群，最高年份（１９７１年）有４８０３２群，相差２．４倍。饲７ 延边大学硕±学位论丈一前言９养形式ｙ？集体为主。从此养蜂业由兼业生产转为专业生产。第Ｈ阶段是１７９年－１９８９年间的蜂农自主经营的商品生产阶段。养蜂业由集体生产为主转变成Ｗ个体生产为主、公养、私养并举的生产结构。随着经济体制的改革，养蜂业生产发７９一生Ｔ很大变化。１９年，党的千届Ｈ中全会后，发，允许并支持个人养蜂展家７２２４庭副业，把１年末未变的蜂蜜价格从元／公斤上调到．元／公斤，使长期压抑的个体养蜂生产迅速兴起，到１９８１年发展到５２７６８群，比１９７８年增加了３０％，成为历史最高年份－１。第四阶段是１９９０年２００年间从过去松散型的只能解决农家所需油盐酱醋的小副业项目，逐步发展为生产基地化、加工专业化阶段，从１９８９年２６７７７群发展到２０１０年１６．８９万群。养蜂地成Ｔ我州特色经济新的増长点，同时拉动了，２２工业的不断发展。第五阶段是２０１１年至今．４农业，延边地区养蜂已发展到万群。养蜂业不仅是农业的重要组成部分，而且对于促进农民增收、提高农作物产量和维护生态平衡具有重要意义。２．２蜜蜂疫病防治意义随着我国与世界各国贸易往来不断增加，国内蜜蜂及蜂产品流通渠道增多，蜜蜂疫病传播途轻和机会不断增加一，传播的速度不断加快，些老的蜜蜂疫病还没有完全有效控制，而新的蜜蜂疫病又开始不断出现。我国养蜂业状况不容乐观，原因一，蜜，，生产能力下降，蜂蜂种种性退化严重抗病性弱，良种利用率低蜂产品产量低，经济效益不稳定。区域性引种需要综合考虑各方面的因素，比如饲养目的，本地蜜源，环境气候，还有周围蜂场的状况等等，目前的蜂农引种时，缺乏专业性和技术性，各弄各的，或者别人怎么说就怎么弄，没有系统方案和计划，导致了蜜蜂种性不断的退化，即使是优良的品种，很快也失去了优势，有的还不如本地蜂种二；原因，养蜂人员对保护蜜蜂健康意识较差，缺乏健康养殖技术，很多先进的养蜂技术不知道怎么利用，比如蜂群防疫技术、抗病饲养技术、饲养两个蜂王或轮换饲养蜂王技术，大量箱体生产技术等，主要还是传统的方法，单一蜂王饲养方法且大多使用陈旧的蜂具，而，容易导致蜂产品的污染，由于受到各方面的影响，就算是生产峰蜜，品质方面也不是很理想；原因Ｈ，对蜜蜂疾一，病无法确诊蜂农最为头疼的是蜂病的确诊往往在需要段时间，初期不易发现一或确认，像抱子虫病、幼虫病等，而当爬蜂满地时（些疾病被蜂农统称为爬蜂病，病因不详，但根树花开前多数能够自愈），除了使用化学药物别无它法，但化学药物也不是次次见效，治不好蜂病不说，，还会伤害蜜蜂自身甚至污染蜂蜜，严重打消了蜂农养蜂的积极性，大大降低了养蜂业的经济效益，不能使养蜂的经８ 延边大学硕±学位论文一前言济效益最大化。到２０１４年，我国养蜂总量接近１０００万群，如此庞大的基数，使得蜂瞒、白里病、中蜂裹状幼虫病和爬蜂综合征等重大蜂病防治难度增加，而且造成的损失很大。３延边地区蜜蜂白聖病流行病学调查３．１延边地区蜜蜂总体调查在延边州内的延吉市、图们市、浑春市、龙井市、和龙市、安图县、敦化市、汪清县八个县，面积３．０５万平方公里的范围内，市开展了蜂农、加工企业、４－蜂业协会、合作社调查。调查范围北韩１度巧分４４度３０分，东经１２７度巧－分１３１度８。１分调查的蜂场多位于延边朝鲜族自治州各乡镇的村屯，饲养蜜蜂的地方很多８５％都是山地、林区等小转地，，这些地方适合蜜蜂生存，占调查总数的大转地饲养的蜂场蜜蜂疫病很多，虽然可Ｗ导致蜜蜂白里病的传播，但由于大转地饲养蜂縣流动性较大。，主要为南方蜂场，因此本次不作为主要对象进斤调查本次抽样调査Ｗ定地养蜂或定地结合小转地养蜂调查为基础，进行基本信息（养蜂人页姓名、性别、出生日期、民族、文化程度、蜂场人数、养蜂年恨、联系电话），养蜂情况（饲养蜂种名称、蜂群数量、养蜂方式、蜂王平均使用时间、巢脾平均使用时间、全年饲料使用量、蜂场饲料使用量、蜂产品生产情况、蜂场周围水源和环境情况、蜂机具消毒情况等等），种蜂王使用情况、蜂机具使用情况、蜂群发病情况等相关信息调查登记１０。从毎个县市中抽出个峰场进行蜜蹈疫病调査，寻找疑似白垂病的蜂场收集患病成蜂，采取拍照、取样及填写取样调査表相结合的方式，记录每个样点蜂场的经练度、蜜粉源及气候等自然条件，调查各蜂场蜂群饲养、蜂产品生产、蜜蜂病敌害、蜂种等相关内容，调査结果存档保存。３．１延边蜂农＾、加工企业、蜂业协会、合作化调查登记汇总表调数量辛县（市）巧农登记（人）加工企业（个）蜂业协会（个）合作社（个）延吉巧４９１２困们市１＾敦化市１１１７＾９ 延边大学硕±学位论文一前言龙井市Ｍ和龙市Ｉ８１１７Ｊ汪清甚１１７＾浑春市１７＾安图县５３６２１７合计６５＾＾一，根据抽样调查得知目前，蜂种主要是两大系列，是我国本地的蜂种，一就是中华蜜蜂，另个是外来蜂种，比如意大利蜂、高加索，主要是各种西蜂蜂、喀尔己奸蜂、卡尼阿兰蜂等等，意蜂又分为美意、原意等。１９３０年之前，延边地区主要蜂种是中华蜜蜂，送、，也就是长白山野生中蜂种蜂抗寒越冬性好、饲料用量少、擅长采集零星蜜源３０，；年代中后期高加索蜂种进入延边地区；８０年代、９０年代，意大利种先后被引入。西蜂的优点在于个体大、采集力强一。现在，我们所使用的蜂种，Ｗ中蜂和西蜂杂交出来的蜂种为主，如松丹号一二、二号，延蜂号、号等。这些经过反复培育、筛选的蜂种，比较适应延边地区本地的气候，，而且既抗病、又有强大的采集力。可Ｗ说蜂种的改昆和更新一，是蜂业大发展非常重要的个基础。表３．２２０１４年延边地区主要饲养蜜蜂种（前十序号１２３４５６７８９１０蜜蜂Ｗ种黑环系卡蜂思＇蜂浆蜂２＾６号１号２号１号３２．延边地区蜜蜂疫病调查＂根据对延边地区养蜂场（户）２０１１年至２０１４年发病情况的抽样调查，爬＂４７ｔｌ、蜂瞒、白聖病分别占据蜂病发病率的前Ｈ位。蜂病，造成的经济损失也最大表３—－‘．３２〇ｎ２０１４年延ａ地区蜂群发病１化抽样调查情况＾＾年度２０１１２０１２２０１３２０１４养蜂场（户）数（个）１４１１３９１２４１１２蜂箱数（箱）７６２１８１４９８７９８９０７２０１ 延边大学硕±学位论文一前言平均养峰数（箱）５４５８．６７１８１发病数蜂曠７７０／１０％７６１／９．３％５７８／６．６％７５１／８．３％及／８１２５／４巧４．爬蜂病６０６％１５２／１３．８５０％．６％４％／发病率３２３／４１．白巧病．２％４１３／５％４４／４７％６８５／７．６％损失蜂群数（箱）８８０１２２５４７０７化直接经济损失（元）４４８８００６２４７５０２３９７００３６９７５０注：１、蜂箱均为标准箱。２、直接经济损失包括；蜂群损失（按加０元／箱＋）治疗费用（按１０元／箱）图；３．１２０１１２０１４年延边地区蜂群蜂蜗、白垄病、爬蜂病、幼虫病发病情况玉伽１２Ｄ０１０００Ｂ蜘？ａｏｏＩＢＨ■白就８．＊■．．—＂－—伽－—ｉ巧狩ｊｊｊ翻Ａｃ之谷ｕ率城王鍵城玉游泌王轉＜Ｊ表３．４延边州蜜蜂病害调查整理表１１ －延边大学硕上学位论文一前言序号市１巧弄方式＾）ｆｔ名巧功片民巧＃再巧ｇ种＋病害一ＩＩＩ＾Ｗ龙井巧旧孜男朝鲜巧＾＾白重病＾小转地卢＾即片５日１号＾￣￣＾＾＾＾＾＾２龙弄三玄泰乙男＊朝鲜族；５０巧巧巧巧定地－１Ｉ＇＂＜？－３＾３如？李普奎男＾朝幹肤＾龙井？５６白山已号＋＾小转地＾—￣￣４片李相龙扛男片朝鲜巧占７□片延巧１号占大巧＾定地古３１：Ｘ意＾Ｖ３片５＾龙并４何太义４男＾巧族日恥卡４小转地￣￣￣心即＾黑环＇＾和龙＾崔宋春朝鲜於、黄巧系定地山￣￣Ｗ奎东巧＾男朝留巧＾日扣ｉｋｉ号＾大巧＾定地；￣￣山８片和龙＾周胜却占＾Ｓ蛇、Ｅ号忘化白里病＾定地９＾＾＾＋巧龙别延君男巧族Ｅ？１Ｗ后代、查胶白里病定化１一巧肢口〇＾Ｅ后化ｓｍ早定化Ｗ和龙李明费男４＊＾＜Ｐ４＂１１敦化妄１！金玉男巧巧即卡Ｘ息白里病定化￣￣＾占１２＾高培才占男＞汉巧已Ｗ黄环系白聖病＾定地；、大巧＾王成义＾男＾一＾口《巧巧＾１１０＾黑环系白聖病定地＂：！１扣＜敦化？温胜劑＾男４巧巧＾５０占４白里病定地；＾Ｘ意￣￣￣￣￣￣￣＾３＇１５敦化＾壬国金占＾１１ＣＨ黑环、黄环亲白里病古定化占—＾＾＾８＾１６张阳女＾规货０公巧巧２号＾大小塊＾＾一一占１Ｗ汪洁申刚Ｐ男汉巧巧恥卡Ｘ意帕巧转地＾冉片一Ｋ扭片巧？王清占苏亚君男巧巧１２０（后代白里病小巧地＾＾＾１Ｗ汪清于巧同男巧族＾１１５巧巧１号白聖病定地￣￣２０＾郭录扭＾巧巧＾浆巧扛小葫定地＾２＾＊＾＜＊３＾＾１＾库春周令军男巧巧占１３０白山６号白聖病定地￣＾＾＾占＾Ｅ巧巧兵陈国吉男＜巧巧３５＊后化別１旱白空病、巧雄小巧岳＾—￣—￣３巧春４金希巧击＾朗舆族心品再京蟲贏定地山１占：到巧春＾金苦巧＾男扭朗鲜族４日Ｗ黒环系＾白聖病和定地片２５－Ｐ巧春壬福君＾男汉族＾口ＷＳ班号＞３丈货＜Ｐ定地扭￣＾占３巧＾安由三赵忠＾男巧族扣＾黒环系白聖病＊小巧地占谷片＂：＇巧安图車涯国》男苗巧换ＰＰ定化占１０２占Ｄ恥白聖病￣１和＾王学立片？＾空胶，巧安田男巧巧８５、ｓｍ号＊白聖病、幼虫病蔚ｆｉｐ４３＜：！；！：！＊巧户安图牵洪巧？男＋４４黒环系ｔ＾视段１１０、Ｋ白聖病、爬埋病小转地＾３３０＾安图昔租注男＋巳□扭皿、查巧４白聖痛定地占汉族１号３．３延边地区蜜蜂白里病调查选择了延边地区的安图县、敦化市、龙井市、和龙市、汪清县Ｗ及巧春等一六个县级城市，并且从任何个是市随机抽样调研五个养蜂场随机抽取的养，蜂场存在高达十五千米上的距离，，基于定地养蜂Ｗ及定地附展小转地养蜂来做详细调查，对于有关内幕细节进行拍摄、做调研报表、抽取样本等等互补的方式进行系统调查。总共涵盖了高达Ｈ千余户养蜂场，其中有两千五百余群１２ 延边大学硕±学位论文一前言一，从，百五十群，最低为四十群蜂群，人均九十余群其中最多的养殖户高达＝，此次录像摄影包括调中抽取样本高达百余只蜜蜂，包括疾病资料五十余份查范围内的蜜蜂养殖户、Ｈ型蜂、病敌害等图像近９００张。…＇＂、—．……？—、ｍ．产Ｔ＾；‘．乃４＾ｆ＾兴Ｋ；：—．．．图３．１蜜蜂白垄病调查点分布图３．４延边地区蜜蜂白聖病流行病学调查显，由于蜂球囊菌需要在潮湿的根据调查发现，白聖病发病的季节性较明、、，发病率较高。尤条件下萌发和生长，多雨潮湿溫度不稳变化频繁，因此白垂病最容易发生和流行。若遇连阴其是春末夏初昼夜温差较大，气候潮湿，ｔｗ雨天或巢内本身湿度过大。，都会使蜜蜂白巧病病情更加重蜜蜂感染白聖病不仅与温湿度有关，还与蜜蜂蜂种、地理条件和气候条件等因素有关的抵抗能力的大小是不同的。在延边。蜜蜂蜂种不同对蜜蜂白垄病２号６。、白山号白垂病发病率较高地区黑环系的蜂种白聖病发病率较低，松丹目前喀尔己斤白聖病，意、喀尼阿兰等黑色蜂种及其杂交种很少感染，在我国大利蜜蜂抗白里病的能力最弱，还不及中华蜜蜂抗病力强。白至病在国外发病也是黑蜂少于意蜂。尤其是日本、韩国Ｗ及东南亚国家和地区Ｗ饲养意蜂为主一的，蜜蜂感染白垂病非常严重。在平行的意大利蜜蜂蜂群之间发病的水平有国研究者也都有过类似的报道。定差异，各，各群蜜蜂对白至病的易感性不同一，可Ｗ，，白蛋病严重的同时，还发现同箱蜂群蜜蜂白空病的发病程度不同３，３．３．４３．２图和３在巢口前找到。（图．１患白里病蜜脾与图健康蜂群蜜脾对比、幼虫体质较差蜜蜂白聖病蜂群的蜂箱底。）蜂群中由于子脾边缘温度变化较大１３ 延边大学硕±学位论文一前言有关一染，因此，通常情况下位于子脾边界的幼体Ｗ及工蜂幼体于病蜂群里第病，随后向中间蔓延。ｍｍ图３．１蜜蜂患白聖病的蜜脾图３．２蜜蜂健康蜂群的蜜脾ｉｍ漏Ｈ！图３．３蜜蜂白里病蜂群蜂箱图３．４蜜蜂白里病蜂群蜂箱３．５延边地区蜜蜂白聖病调查分析及结果根据调查，蜜蜂球囊菌可Ｗ采取不同的方式进入蜂群内：而且抱子的抗逆性强一，因此单的防治方法较难取得好的效果，而应该采取综合防治。即运用适当－ｓｉ５２的饲养管理措施ｆ：！、合理地使用药物治疗、Ｗ及抗病育种和抗病品系等等。因此应该在延边地区建立及应用蜜蜂健康养殖技术体系，主要从蜜蜂疾病防疫、抗病饲养两个大方面，从蜂种引进、抗病选育、防患未然、抗病技术和蜂场生态入手。即引进蜂王、蜂群的安全性，随后通过高科技的管控养殖措施，主要针对优质群体做好防御工作；锁定顶级的强群食材，增强其体质的同时，挑选抗病优质品种，并通过现代化的生化措施防护栽培种苗，采用自然淘汰或者加速灭亡的方式进行蜜蜂白聖病的选育，也可用于其他蜜蜂疫病的防疫。１４ 延边大学硕±学位论文一前言￣一一＊…＂……？■Ｉ■与■■Ｉｆ、｜淡带＾芋’！蜜巧＾｛＼擬惠麵饱董选撰—」ｙｙ—＾＝ｃ＞ｊ（引进巧群ＩＩｐ—織育真ｆ选育巧度巧病性拔ＩＩｊ与／Ａ／證煙疾分子铺助ＩＩ１＾＼／ｆｒｉ＝：ｉ—＊Ｉ气ｐ弓Ｉ进病旗油速巧ｔ：ｕＩ消宙巧苗，ｆＩ…＾ｉｉｉＳＬｉ＝＞｜ｇｒｉｎＳ９—一《２Ｊ巧娜治巧计蠢行余巧等違１ｊ［Ｊ（麵巧养ｉｆ１４。囊ｆ良好巧。０ｆ温ａｗ性空性分巧法—一￣￣。麵巧殖词另口ｊｉ＝Ｃ＞ｆｉｌｌｆｉｉｉｉｎ。齡—．．■．Ｉ：：：ｎ…―．＊＾ｅｍＴ、酬ｒｔ狩阳Ｉｋ／＼痛环境￣（Ｉ｜—＾…？蜜悠巧…Ｉ＾／＼Ｖｍｔｍ—水燃媒／＼／Ｉ１Ｔ＼／：ｆｗｍｍｍｗｍｍｍｆ［＿￣￣緻夸Ｉ璋」。，罕嘉Ｉ横涵想麵夸離ｆ今受！。ｆｊ—絲、Ｉｊ［Ｉ马ｒ化鲜号煤Ｉ。ｆｆｔｘｒＩ图３．５蜜蜂健康养殖体系４蜜蜂白聖病检测方法研究进展目前这个范畴的调研工作多半情况下主要针对蜜蜂白垂病的实，全世界在力度欠佳。由于蜜际发病率控制和诊断，但是面向蜜蜂产物里活性抱子的专注一蜂子的测查存在较大差异。第，白里病的相关诊断报告和蜜蜂产物里活性抱二Ｗ及病蜂通常存在较为显著的生病状态。第，病蜂身上的蜜蜂子囊球菌菌丝活性抱子具备抗病优势，通过测查不难发现此规律，但是蜜蜂生产物由于牵制，工具、环境、卫生习惯及胆藏、运输和加工等诸多因素的影响于生产方式、产生抱子的原因和节点多，构成抱子的元素种类繁多，所说，蜜蜂生产物应一一种方式在全世体化的、监测Ｗ及观察的方式，而送当具备统、高效的培育界范围内都还罕见。１５ 延边大学硕±学位论文一前言４．１传统的蜜蜂白里病判断方式当下我国基于蜂球囊菌的主要测查方式还是依赖于常规的生化测查法。而针对蜜蜂的球裹菌，常规的生化测查法在耗费人为物力的同时，针对发病体的特异性的测查敏感度并不可观，不过再好的测查方式都是基于常规的生化测查法的概念形成的。蜜蜂白里病传统的诊断方法是依赖于典型症状，如患白里病的蜜蜂幼虫在封盖后的头两天或在前蛹期死ｔ。幼虫被侵染后躯体先肿胀和微软，后期则失＂＂一＋水缩小成坚硬的块状物或是。在只有个株系感染幼虫时，无论是都不能形成子实体，死亡的幼虫残体为白色霉状物、棉绒毛状物、粉笔样物；要是二个株系共同浸染幼虫上生长时，死虫体表形成子实体，干尸表面呈深墨绿色至黑色。在蜂群中雄蜂幼虫比工蜂幼虫相对更容易受到感染，尤其是受冻幼虫和雄蜂幼虫最容易感染。蜜蜂幼虫食入蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）抱子后第一天和第二天没有什么异常反应，普通幼体和生病幼体蜜蜂不存在显著差异；但是到了第Ｈ天很多工蜂幼体相继呈现出白聖病的症状，并且部分供奉幼体内部出现了雪白菌丝一，被诊断为白聖病但是发展到下天；，半数Ｗ上的雄蜂则相继呈现出里病症；而过半的病虫幼体于第五天相继灭亡。染病的幼体蜜蜂逐步变成雪白色，过了第屯天则变成灰黑色，直到逐步形成顽固的僵硬石。石灰体质起巧是纯白的灰体质，局部脱离了巢房之后，渐渐转变为灰褐色，随后埃彻底脱离蜂巢一；残留了病虫幼体死尸的巢房外围则由层浅颜色的菌丝ｉ盖。在白垄病较重的蜂群中，可能留下封盖房，但为零散的，封盖房中有结实的僵尸，当摇动巢脾时能发出撞击声响。蜜蜂白至病的症状相对比较典型，与其他蜜蜂幼虫疾病不易混淆，所般情况下用症状来诊断比较准确。但是，对于症状不明显的发病初期，病虫数量较少，平时管理中不容易发现，利用传统诊断方法就很难判断了。由于发病初期甚至在潜伏期能准确诊断病情，对于疾病的控制和预防有着至关重要的作用，因此，建立快速、准确的检测方法尤Ｗ１为重要。４．２蜜蜂白聖病常规生化检测方法常规生化检测方法研究进展通常针对改善养蜂场的养殖环境及规范生化１６ －延边大学硕上学位论文一前言测普法的角度去加大力度一。陈广全、刘玉萍等有关权威人±于九九四年在试－ＹＥ培养基±豆培养基验之后对于ＳＤＡ、ＹＧＰＰＡ培养基Ｗ及ＰＧＡ培养基（基于蜂球囊菌发展的状况加＞１比，＾＾较和权衡锁定了其最容易发展的±豆培养基ｓｓ一和相关养殖要件ｆｊ邵瑞宜于；九九屯年针对蜜蜂白垂病的出处做出了细胞养殖和测查与此同时假设了综合预防疾病的措施牟方酷于一九九九年基于此５７１］勤＾＾１及陈大深入调研了蜂蜜里涵盖蜜蜂子囊球菌的常规生化测查指标；梁福等科学家于二零零零年度测查了相应潮湿度、温差Ｗ及酸碱值对蜜蜂球囊菌活性抱子发展的作用ｆＷ二一年深入调研了周；王建鼎、梁勤Ｗ及陈大福于零零５９￡１围环境对蜜蜂球囊菌生长和繁育后代的作用，改观了白聖病原的培养条件。４．３蜜蜂白至病的分子检测方法研究进展一一球囊菌属内涵该了系列病原微生物Ｗ及系列腐生生物。当下，尚经过鉴定的球囊菌属就多达二十余种，其通常Ｗ致命性真菌Ｗ及腐生菌的形式寄生于蜜蜂身体一聚合酶链式反应（Ｐｌｏｙｒａｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）为种新型科技，其适用迅速在蜜蜂身体外部增强特异性基因片断，采用简单的促迸酶生长反应可Ｗ在短时间让实验体的特异性基因増强到高这百万倍数。ＰＣＲ技术有很多的优势，比方说：高效简洁、灵活度离Ｗ及特异性好等等，基于寄生体Ｗ及病原微６２－６３生物的测查角度展示出很高的创新性［］。自从临床检测于上个世纪八十年代广泛运用Ｗ来，这种测查增强特异性基因的技术愈来愈普及和受欢迎。在当下的临床病控监测里，不单适合传染病的诊疗方式，针对染病的有关病体都适用６４－６５［于此技术］。基于蜜蜂病原微生物的判定Ｗ及诊疗，ＰＣＲ技术的实用性也很广泛。依照当下存在的许多蜜蜂微生物病原的有关核酸资料目录，假设特异性参照物，从而将实验体的核酸目录作为参照物，在ＰＣＲ的反应下，可增设实验病体的特异性基因片断呈现出阳性，相反则是阴性。由此实现判定实验疾病体微生物的存在与否。Ａｂｓ等科学家于…Ｓ．Ｊ．Ｇｉｂ九九八年依照蜜蜂球囊菌ＩＴ１澳洲国立大学的，５ＲＮＡＴＳ２．ＳｓｒＩ通过ＰＣＲ反应测查蜂球囊菌的数量，保守序列假设参照物，，并６６ｈａｅ［］－并顺利的在蜂群里测查出了蜜蜂球囊菌（Ａｓｃｏｓｐｒａａｐｉｓ）。美国ＵＳＤＡＡＲＳ蜜蜂生物系统学科研室的Ｒ．Ｒ．Ｊａｍｅｓ，Ｊ．Ｓ．Ｓｋｉｎｎｅｒ等科学家在二零零五年基于实验，顺利的创建了蜂球囊菌ＰＣＲ的测查方式。依照球囊菌种的特异性参照７１ 延边大学硕±学位论文￣前言ｗｆｉ物．Ｒ．ａｍｅｓ．．ｉｎｎｅｒ。，由ＲＪ和ＪＳＳｋ从体外扩增出Ｔ球襄菌的基因序列是５本研究的目的及意义俾随人类生存条件的变化Ｗ及环境因素的改变，蜜蜂发病成因的调研课题也将变成１＾＾后养蜂行业的热口巧题，而蜂产品安全生产，与蜜蜂疾病的防治息息相关，优质蜂产品的生产，必《巧加强蜜蜂疾病的研究，使蜜蜂产品安全从基础抓起，防患于未然。白聖病是由真苗蜂裹球菌引起的，该病虽对蜂群摧毁性不大，但因幼虫患病致使蜂群辭势骤减，能够严重导致蜂群生产力降低，从而为国内的养蜂行业带来很多的负面影响。基于蜜蜂的白聖病诊疗方法，我国依旧依照临床病症来做传统的判定，从而诊巧方式过于落后。琼脂扩散之类的免疫学方式在个例中有所运用，介于此方式的特异巧Ｗ及敏感度偏低，从而针对某种复杂性感染病１症不容易加＞区分。１＾ＰＣ反测查法的优势主要是特异性好、敏感性Ｗ及速率都较棒，对于白垄病的判定可在短时间内出结果，针对复杂性感染病症的判定非常精准和迅速。日前，ＰＣ艮之类的分子生物学测查方式Ｗ迅猛的速率发展，面向各类动物包括人类的传染病判定诊断方面早已大面积运用，基于蜂病的科研效果在海外相继出现了部分调研资讯，而我国尚不具备此类的研究资讯。此课题对此针对延边区域的蜜蜂白里病的流行病学和ＰＣＲ测查方式设立做出了深入调研。为更透彻的分析白垂病的传染病现状与恃点，在延边地区对蜜蜂白里病的流行病学的相关情况进行全面细致的调查分析，调查清楚病源和扩展的源头所在，确切认识传染病的发展动向Ｗ及现情，并通过研究设计出科学合理的综合防控方案，为其他蜜蜂疾病的诊断治疗、预防按制提供科学依据。在参考国内外相关研究文献的基础上，初步建立ＰＣ民检测方法，为该病的尽早防治争取最大的时间，为准确而详细地掌握该病对延边地区养蜂业的危害情况、流行病学及制定有效的疾病防制措施提供理论依据和技术支持。就区域当下的病倩，致力于消除蜂业密切关注的隐患，完善对蜜蜂病困扰的有关科研报道，搭建蜜蜂病困扰预防系统和蜜蜂病相关诊断的桥梁，推动我州乃至我省持色蜜蜂产业健康发展将具有千分重要和深远的意义。１８ 延边大学硕±学位论文一结果材料与方法１材料１．１材料１．１．１样品蜜蜂球窠苗，蜜蜂败血杆菌和蜜蜂幼虫芽拖杆菌由延边大学农学院动物医学系预防兽医学实验室分离保存４５份病料由本实验室从延边地区的安图县、；敦化市、龙井市、和龙市、巧清县、谭春六个直市的３０个养蜂场采取疑似病例。１．１．２设备和试剂细菌基因培养实验组少剂量的抽取试剂盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．．０）ＥｘＴａＤＮＡ聚合酶ｄＮＴＰ（各２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、，、ｑ、－ｌＯＸｂｕｆｆｅｒ缓冲液、ＰＭＤ１８Ｔ载体、１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ等源于ＴａＫａＲａ宝生物工程（大连）有限公司。ＰＣＲ纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）ｏｍｅｔｒａＴｒａｄｅｎｔ－有限公司；马铃墓琼脂培养基；ＰＣＲ扩增设备，Ｂｉｇｉ９６源于Ｂｉｏｍｅｔｒａ公Ｂｉｎｄｅｒ公。德屆司，微生物培养箱来自德国的司１．２方式１．２．１如何处置病料把可能存在白垂病的蜜蜂病料搁置到百分之九千五浓度的酒精里进行消毒十秒，随后把病料取出并切成１ｍｍ的均匀正方体，并且在ＰＤＡ培养基上进行培育种子，搁到兰十度保温培养箱进行养育监测，培养基在两天左右出现了雪白色菌丝群，并于菌丝群边界处抽选茵丝培养到新的ＰＤＡ培养基上，ｓｒｃ培养７ｄｏ１９ 延边大学硕±学位论文一结果１．２．２蜜蜂球囊菌整体基因的抽取依据ＴａＫａＲａ细菌基因组少量抽样试剂盒操作示范，抽取蜂球囊菌的基因，封存在零下二十度的空间Ｗ备实验。１．２．３如何设计Ｗ及合体引物－－依照Ｇｅｎｅｂａｎｋ里显巧的蜜蜂球囊菌口Ｓ１５．８ｓＩＴＳ２ｒＤＮＡ保守序列，ｒ＂—应用ｐｉｍｅｒ５．０和０１ｉｇｏ６．０软件设ｌｉ对特异引物，引物序列：＇＇Ｐ１－－：日ＡＴＧＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＡＧＧＴＧＣ３’＂’Ｐ２－ＴＴ－：５ＣＣＡＣＴＡＧＡＡＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＣＳ引物是上海生工生物工程技术服务有限公司合体的。１．２．４ＰＣＲ的增加和最佳退火温度的选定ＰＣＲ反应的特异性基因増加：ＰＣＲ在每升巧Ｕ反应状态下进行：成分剂量ＤＮＡ２ｙＬ１０ＸＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ２．５ｎＬＥｘＴａｑ０．５ｙＬｄＮＴＰ２．ＯｉｉＬ上下游引物各ｌｕＬｄ加２日１６ｕＬ建立并优化的ＰＣＲ反应程序：Ｉ１°°９４ｉＣ９４ＣＩ：：ＩＩＩ２０ＩＩ：；Ｉｉ：：Ｉ －延边大学硕±学位论文一结果°５ｍｉｎ３０ｓＡ７２Ｃ１２Ｖ’Ｃ＼Ｓｒ３５＾＼０ｍｉｎ４＾ｙ°°３５ｓ３５个循环１ＰＣＲ．２．５产物的回收与克隆一取ＰＣＲ产物１０ｕＬ，在完成百分之的琼脂糖凝胶电泳监测之后，通过基－因回收试剂盒把目的条带回收１８Ｔ载体相连，并且转化，并将目的条带巧ＰＭＤ－嵌入大肠埃希菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ感ＩＰＴＧＧａｌ受态细胞里，把它涂巧和具有Ｗ及Ｘ的氨节ＬＢ平板，在Ｈ十韦度的恒湿下过夜，反应体系见表１。表１连接反应体系ＴａｂＳｓｆａｉｉｏｎｌｅ１ＴｈｅｙｔｅｍｏＬｉｔｏｎＲｅａｃｔｇ成分剂量（ＰＬ）目的片段４．５ＭＤ－ｐ１８ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ０．５ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ５．０混匀后’４Ｃ连接过夜１．２．６重组质粒的监测、序列的判定通过过滤藍白斑，锁定纯白菌丝群加大培养力度Ｗ后抽样质粒，来做ＰＣＲ反应，把确证的重组质粒提供到上海生工生物工程技术服务有限公司去判定序列。１．２．７特异性试验蜜蜂败血杆苗、蜜蜂幼虫芽抱杆菌的基因组都是从延边大学预防兽医学实验室供应的。依据最佳退火温度扩増ＰＣＲ特异巧基因，从而实验最终得出琼脂糖凝胶电泳的数据监测结果。２１ 延边大学硕±学位论文一结果１．２．８检测敏感度的试验挑取适量的球囊菌移入ｌＯｍＬ无菌蒸溜水中揽匀制成菌悬浮液并将其１０倍一一一倍比溶解。抽取每种梯度的菌液毫升来做平板计数。通过平板倾注法在Ｈ千屯度恒温培养后根据平板菌丝群检测法判定菌丝群的总额，再把所溶浓度不同的平板相应抽取的基因当成参照物，在ＰＣＲ的监测下观看实验结果。１ＰＣＲ．２．９测杳方式的实践运用价值在创建的ＰＣＲ方式中对抽样延边区域的四十余份球囊菌感染可疑性的幼蜂做ＰＣＲ测查，并且做姬姆萨染色镜检测，对于二者的阳性概率加比较。２最终结论２．１蜜蜂球囊菌的ＰＣＲ扩増本试验构思的两个参照物基于蜜蜂球囊菌增加的结果可见图１，呈现出的日００ｂ一基因增加片段大概在ｐ，与预期大致相符（５３０ｂ），需进步测序分子ｐ，阴性对照未见扩增条带。Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００．ｓｃｏｓｓ．；１Ａｐｈａｅｒａａｐｉ；２Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ图１ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ．１ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｏｆＡｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ２．２ＰＣＲ对敏感度实验的测查结果基于优化完毕的ＰＣＲ反应系统Ｗ及相关要件，检测实验体的敏感度。Ｗ茵２２ 延边大学硕±学位论文一结果夜为模板经１０倍倍比稀释后，按照所建立的ＰＣＲ检测方法进行扩増，进行敏感性试验，结果表明细菌含量在１０ＣＦＵＡｎＬ仍能出现目的条带，ＰＣＲ敏感性检测结果如图２所示。（图２）圓Ｈ．３ｉＭ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００１．１０Ｘｌ〇ＣＦＵｌ＾２．１０Ｘｌ〇ＣＦＵ／ｍＬ３．１０Ｘ１０化ＦＵ／ｍ＾４．．Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；：／ｍ；：ｇ图２ＰＣＲ敏感性试验结果Ｆｉｇ．２ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＰＣＲ２．３目的基因克隆及重组质粒鉴定ＰＣＲ－ＭＤ１８Ｔ连接，将回收的产物与ｐ，转化感受态细胞ＤＨ５ａ筛选阳性克隆。用质粒小量提取试剂盒提取质粒ＤＮＡ，引物Ｐ１／Ｐ２进行ＰＣＲ鉴定一，与预期结果致。２．４序列测定及同源性分析对初步鉴定为阳性的重组菌液进行测序分析，结果显示目的基因全长５３０ｂｐ。测序结果显示：该基因片段与蜜蜂球囊菌５．８ＳｒＲＭ基因序列（Ｕ６８３１３）同源性均在１００％（如图３）：＊＊＊＊？２０４０６０８０－ＹａｎＢｉａｎＡ：：巧＿－＾＾＾＾＾ＳＨＳＥ＾ＳＢ８ＢＢＥＢＢＢＢＢ８８ＢＢ８ＳＢＢ＆３ＢＢ８＆ＢＢＢＢＢ８ＢＢＢＢＳＢＡ！牌牌凹Ｃ！Ｇ！ＧＣＧＳＣ的促ＧＴＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＭｋＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣａＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴ史奶ＣＴＡＣＣＴＴＡＣＣ的ＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＴ＊１００１２Ｑ＊＊＊？１４０１６０ＩＢＱＴＣＴＣＧＣ城ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣ扫姑ＧＧＧＧＴＴＡＧＳＴＣＣＣＣＣＣ丈ＧＧＣＴ》ＧＣＧＴＣＣＧＣＣＧＡｆｌ姑ＴＡＭＣＧＭＣＴＣＣＡＧＴＣＧＪＵＶＧＡＴＴＧＡａＧＴＣＴＧａＡＧａａ＆Ａ２００＊２２０＊＊＊２２４０２£０８０Ａｓｃｏｈａｅｒ；巧：ＴＴＧａａａａＡＴＡＡａＴＣａ＾ａＡＣＴＴＴＣａａＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧａＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＭＴＧＣＧＡＴＭＧＴＡＡＴＧＴＧＭＴＴＧＣＡＧａＡ＊＊＊＊＊３００３２０３４０３６０３８０，玄ＣＣＧＥＳＡＡＳＣＡＴＣＧａＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＣＣｆｔＣＡＴＥＧＣＧＣＣＣＣＩＧＧＪＡＩＴＣＣＧＧＧＣａｉｒＧＧＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＧａＧＣＧＩＣＡＴＴＧＣｉ＆ＣＣＣＴＣＡＡＧＣａＣＧＧＣ＊４００＊＊４４０＊４＊４２０６０ 延边大学硕±学位论文一讨论讨论＂延边地区的养蜂业具有悠久的历史，明清时期就有人在延边放养过中华＂＂＂一蜜蜂，清朝时延边的东山白蜜直被作为御用贡品，长白山区生产的锻树蜜在建国前就誉满东亚。延边地处长白山区，拥有着非凡的自然环境ｌｉｌ及资源特长，不但富有多样化的碳树蜜源，与此同时具有很多种可Ｗ辅助蜜粉的木本Ｗ及草本植物＂＂，从而被冠名为东山蜜源。本论文通过对延边地区蜜蜂白垂病流行病学调查，对延边州各县市养蜂业发展概况、蜜蜂饲养总体情况、延边地区蜜蜂疫病、蜜蜂白聖病等进行Ｉ全方面了解一，发现蜜蜂白里病是延边地区主要蜜蜂疫病之，对养蜂生产影响较大。２０１４年７月末延边地区蜂群饲养量为２２．４万群，定地结合小转地饲养蜂群占调查总数的８５％，主要饲养蜂种为松丹１号、松丹２号和白山６号，近四年蜂病发病率前Ｈ位的是＂爬蜂病＂、蜂峨、白聖病，蜂农对患有蜜蜂疫病的蜂群滥用蜂药，严重污染了蜂产品，蜜蜂白里病发病季节性明显，尤其是春末夏初昼夜温差大、气候潮湿时最容易发生。蜜蜂疫病严重影响着养蜂业的发展及蜂产品的产量和质量。白垄病是延边一地区主要蜜蜂疫病之。蜜蜂白垄病早期仅在欧洲发生，但近年在我国及世界各地都有发生，延边地区蜜蜂白里病爆发呈上升趋势里，有的蜂场蜜蜂感染白病后，整个蜂群整体衰弱，有的蜂场蜜蜂全部死亡，损失非常严重。延边地区该病的诊断主要根据临床证状来进行诊断白聖病，但试验证明如果蜜蜂幼虫的白垄病感染率低于１２％。，根据蜂群的日常检查来发现蜜蜂白聖病很困难如果在日常检查中发现了蜜蜂白至病，这时该病己经进入发病高危期。在延边地区琼脂扩散等免疫学方法也有个别应用一，但诊断水平还比较低。为此，开发些简单、快速、准确的检测技术，在蜜蜂发病前就能检测出病原是十分必要的。蜜蜂球囊菌的ＰＣＲ扩增试验一，根据设计对引物对蜜蜂球囊菌扩增结果，显示的扩增片段在约５００ｂｐ，与预期大致相符５３０ｂｐ（），阴性对照未见扩增条带；敏感性试验所建立的ＰＣＲ检测方法进行扩增，进行敏感性试验，结果表明细菌含量在１０Ｃ即／ｍＬ仍能出现目的条带、；Ｗ微抱子虫病原蜜蜂幼虫芽跑杆菌、蜂房蜜蜂球菌、来检测基因的特异性，从电泳结果中得知，只有蜜蜂球囊菌被从条带里増加出来，别的对应参照物的菌种还有阴性参照物都不曾发现从条带扩增出来而得出结论ＰＣＲ，从，检测法和幼蜂芽跑杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌、蜜蜂微抱子虫之间不存在交互。由此可见，ＷＰＣＲ技术为一基础，采用特异性试验、敏感性试验等，构建套具有快速、准确和灵敏等特点的分子诊断技术…，在蜜蜂感染的开始阶段就当机立断的从蜂蜜、幼蜂Ｗ及２６ 延边大学硕±学位论文一讨论蜜蜂产物里精准的测查出病原所在，并迅速设升疾病防控方案，极为防止该传染病蔓延此技术将不断适用在养蜂化的疾病防控工作领域Ｗ及蜂病的疫苗范，畴，针对促进国内养蜂领域甚至农业的进展有无法估量的功劳。２７ 延边大学硕±学位论文一结讫结论１、通过白至病流行病学调査发现了延边地区养蜂产业现状。２、发现了延边地区蜜蜂白里病发病情况。３、本试验建立了蜜蜂白蛋病的ＰＣ民检测方法。本论文存在的不足如下：一第：由于知识面有限，没有达到更寓的学识，所Ｗ本论文仅调查了延边地区蜂业发展现状，及对延边地区蜜蜂白里病流行病学的研究，研究不够深入。第二；由于条件限制，本论文仅对延边朝鲜族自治州部分直市的养蜂情况进行了研究分析，不够全面而且没有做过于细致的研究。第本文只是初步建立了延边地区蜜蜂白里病ＰＣＲ检测方法，其他方并。未做研究，所Ｗ研究还不够深入２８ 延边大学硕ｆ：学位论文一参考文献：．参考文献－［１］陈盛：２．禄主编．北京：中国农业出版巧，２００１１９１，中国蜜蜂学［Ｍ］［２］《华西养蜂全书》编委会，华西养蜂全书［Ｍ］．四川：四川科学技术出版－１９９１：６０３６０８狂．，－３代养蜂生产．：１９９８：３６０％４．［］张复兴主编［Ｍ］中国农业大学出版社，现北京，４－：１［］彭文君主编，蜜蜂饲养与病敌害防治［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００６２５２０３６４４４４－［］张魁．，１（）：４８．，侯丽娜延边州蜂业发展现状与对策，中国蜂业，［６］张魁，张健，侯丽娜编著，蜜蜂饲养技术图解．长春：吉林科学技术出版社，－２０１３１２：１３７１４２，７：［］张中印陈崇蕉主编．河南，中国实用养蜂学［Ｍ］河南科学技术出版，±２００３－？：３７９３８０．，［８］陈世璧，刘进祖，杜宏业编著，程序化养蜂法．北京：中国农业出版社，２０１０，６－：６１１９－［］江．３００３０１西省养蜂研究所主编，养蜂手册农业出版社，一－０．１：［１］陈大福，梁勤蜜蜂白聖病的研究进展（连载）［Ｊ］．蜜蜂杂志０１３４，２０，［１１］奧斯伯ＦＭ，金斯顿ＲＥ，塞德曼Ｊｔ等（编）马学军，舒跃龙（译）．２００５．精编分子生物学实验指南（第四版）［Ｍ］．北京：科学出版社，－－－１６８９３１４３６５１６８５．，，［１２］Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄＭ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｃｈａｌｋｂｒｏｏｄ（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）ｉｎｈｏｎｅｙｂｅｅｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ－．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ１９７２：１１９３１１９８，６４巧），［１３］邵瑞宜。蜜蜂白垂病病原观察及其综合防治措施［Ｊ］．福建农林大学学报，－１９９７２６（３）；３４５３４８，［１４］余林生，孟样金，吴树生，沈磊．蜜蜂白垂病发病规律与防治措施的研究．４－养蜂科技，１９９９，（３）７：１５［］朱亮光，刘帽恩，何错光。台湾蜜蜂白垂病发生之初报［Ｊ］．台湾大学植物病虫害，１９８４，（１１）－［１６］袁耀东主编，倚明养蜂手册．北京：中国农业大学出版社２００２．４：２９５２９９，＂＂［１７］金汤东，汪建如，陆学校．蜜蜂白聖病幼虫病在宁波地区发生情况的初报调查及其防治新技术－［Ｊ］．中国养蜂，１９９１５）：２８２９．，（２９ 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延边大学硕±学位论文￣参考文献ｈｏ打ｅｙｂｅｅｃｏｌｏｎ－ｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆａｐｉｃｕｌｔｕｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７２６３）：１９１１９５，（［３４］ＪｏｈｎＰ．Ｋｏｅｎｉｇ，Ｇ．ＭａｌｌｏｒｙＢｏｕｓｈ，Ｅ．Ｈ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊｒ．？ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣｈａｌｋｂｒｏｏｄｐａｔｈｏｇｅｎ，Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ，ｆｒｏｍｈｏｎｅｙｂｅｅ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ｓｕｒｆａｃｅｓ，ｐｏｌｌｅｎｌｏａｄｓ，ａｎｄａｗａｔｅｒｓｏｕｒｃｅ．Ａｐｉｃｕｌｔｕｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ８７－：１９，巧５８１５８３，）［３５］ＦｌｏｒｅｓＪＭ，ＧｕｔｉｅｒｒｅｚＩ，ＥｓｐｅｊｏＲ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｐｏｌｌｅｎｉｎｃｈａｌｋｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅｉｎＡｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇｃｏｎｄ－ｉｔｉｏｎｓ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ．２００５９７（６）：１１７１１１７６．，３６ＴＡＫＡ化Ｅ等．蜜蜂［］［日本」白恶病原及传染途径的研究．养蜂科技，１９９２，－１：４７４８（）７－［３］张华瑞？试述蜜蜂白坐病流行特点与致病因素．养蜂科技９４４：１６１７，１９（），口引杨±清？．１９９３ＣＳ）：巧影响白至病发病的内外因素养蜂科技，，［３９］Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｍ，ＴａｂｅｒＩＩＩ，Ｓ．ａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＧＶ１９８３．Ｈｙｇｉｅｎｉｃｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｓｉ打ｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｃｈａｌｋｂｒｏｏｄｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ，１４：２９－３９．－４０黄文诚？［］．蜜蜂的丑生行为和抗病育种蜜蜂杂志，２０００，（１）；２１２３［４１］ＳａｌｌｙＢａｎｉｆｏｒｄａｎｄＬ．Ａ．Ｆ．Ｈｅａｔｈ．ＴｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＡｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｌａｒｖａｅｂｙＡｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｕｌｔｕｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈｐａｐｉ，１９８９２８１－：，（）３０３日４２Ｚ－［〕．Ｆ，Ｇｌｉｎｓｋｉ．ＪａｒｏｓｚＡ．Ｗｅｒｎｉｃｋｉ．Ａｒｅｌｏｂｕｌｉｎｌｉｋｅｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ，ｇｐｐｒｅｓｅｎｔｉｎｌａｒｖａｌｂｌｏｏｄｏｆｔｈｅｈｏｎｅｂｅｅＡｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｙｐａｃｕｌｔｕｒａｌ－ｐｉｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８６，２５（２）：７１７７［４３］ＳｅｅｌｅｙＴＤ，ＶｉｓｓｃｈｅｒＲＫ，１９８５．Ｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｓｉｎｃｏｌｄｃｌｉｍａｔｅｓ：ｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｔｉｍｉｎｇｏｆｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｎ－ｔｏｍｏｌｏｇｙ１０：８１８８，［４４］Ｂｏｅｃ；ｋｉｎｇ０，ＳｐｉｖａｋＭ，１９９９．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｄｅｆｅｎｓｅｓｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｓ过ａｉｎｓｔＶａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎ－ｇｊｉＯｌｉｄ．Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ３０：１４１１５８，［４５］ＪｅｖｒｏｓｉｍａＳＴＥＶＡＮＯＶＩＣ，ＺｏｒａｎＳＴＡＮＩＭＩＲＯＶＩＣＥｌｋｅＧＥＮＥＲＳＣＨｅｔ，，ａｌ．Ｄｏｍｉｎ过ｎｅｅｏｆＮｏｓｅｍａｃｅｒａｎａｅｉｎｈｏ打ｅｙｂｅｅｓｉ打ｔｈｅＢａｌｋａｎｃｏｕｎｔｒｉｅｓｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｃｏｌｏｎｙｃｏｌｌａｐｓｅｄｉｓｏｒｄｅｒ［Ｊ］，Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ，２０１１，－４２：４９５８．４６］张．国际有关蜜蜂突然消失［婷（ＣＣＤ）的研究进展（二）［Ｊ〕．中国蜂业，２００９，０８：５３．［４７］陈黎红．国际有关蜜蜂突然消失（ＣＣＤ）的研究进展［Ｊ］．中国蜂３１ 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延边大学硕±学位论文一参考文献９０９８－０３．：１３３ 延边大学硕±学位论文一致谢致谢在延边大学获取兽医研究生学历的时间即将消逝，，在研究生生涯中我时刻触景生情，并且时刻具有很强的学习动力推动我前进，却总感觉内也虽是火，但语言是苍白的，热的，那些曾经的热情和帮持让我无Ｗ言表。虽如此值此论文收笔之时一，我还是必须在这里表泣我的份微薄的谢意。该论文在鲁承教授的淳谭教导和函授下由我编译。鲁承教授谨慎的学风、严格的论证方式Ｗ及务实的科学精神让我收获甚多，尤其是针对蜜蜂传染病的防控的态度非常严谨，并在本人的学习过程Ｗ及课余生活中带来了许多正能量和好的影响。从锁定课题、搭建论证纲领、实验的操作步骤最后落实到撰写正、文，，，鲁承教授的尽屯尽力让我非常感动在该篇论文即将完成的时候特别予Ｗ恩师最真诚的道谢信Ｗ及至高无上的敬意。本人能顺利在吉林延边大学攻克研究生学历，和本人所在部口领导的密切关注Ｗ及支持是息息相关的。长期Ｗ往领导在工作中教育我总结经验和不断学习进取从而赋予我很多帮助，并且时刻激励我不断学习和深造，并亲自担任了我的第二导师，让我受益匪浅。在本论文完成过程中，在具体实验过程中，均给予资金、仪器、蜂群及时间上的大力支持让我能够有时间、有力量顺利完，成我的论文。张春波局长、金龙副书记、张林国副局长等有关部口负责人非常关注本人的学习和日常生活、感谢你们！，本人在这里衷屯在研究生的学习中得到了延边大学预防兽医专业全体老师的无私帮助，在此我送上最真孽的谢意！我还要特别感谢宋建臣副教授、李太元教授、崔成都教授、金蠢教授、张雪梅教授、许应天教授、刘学龙副教授、梁晚枫副教授、李海峰副教授和李文学副教授在专业课上的教育培养，还要感谢高建伟、薛书江、刘明明、赵文猜、金丽玲等师哥师姐，Ｗ及感谢我的师弟修占武在我实验进程中给予的帮助，无论选题、论文写作还是其他事宜上，是你们让我的研究生生活有了更多的色彩。在论文即将完毕的时候，本人还要真擎的感谢自己的衣食父母所给予我的一，感谢父母为我多年操劳物质上的不断支持，使我能够有今天的切，所有感激之辞都Ｗ无所表达，希望父母能够身体安康，永远幸福。我还要向长期与我生死相依的丈夫秦洒东老师表示由衷的谢意，在他体贴入微的生活关怀照顾下，本人成功的攻读了硕±学位。也要致谢于我的儿子，秦绪巧先生，当我遇到困难想要退缩的时候，当我愁眉不展的时候，他的淘气和聪明，都成了我继续研究的信也和努力拼搏前进的动力。一最后，中必致谢于切对我的学习生活有过关注和支持的相关人员，再次３４ －延边大学硕ｄ学位抢文一＾谢对你们表示由衷的感谢！并向参与此次论文审评的指导老师獻及答辩讨论组的权威人±表法谢意，你们很伟大！３５ 延边大学硕±学位论文￣作者简介作者简介１侯丽娜，女，９８２年生，吉林省延吉市人，毕业于吉林农业大学动物医学专业，本科，延边大学攻读兽医硕±学位，延边州畜牧总站副站长，多次获得＂＂＂＂２０１２９先进个人、优秀党员等荣誉称号。年月考入延边大学农学院动。物医学系攻读兽医硕±学位，研究方向为动物传染病学，导师为鲁承教授Ｅ－ｍａｌｉ：３６ －＇延边大学硕±学位论文一作者简介附录（在研期间发表的专著及论文）在研期巧发表的专著；［１］张魁．１，张健，侯丽娜，蜜蜂饲养技术图解吉林：科学技术出版社，２０４在研期间发表论文：［１］侯丽娜．黄牛疫病的综含防控措施，中国畜牧兽医文摘，２０１４，３０（５）：脈［２］侯丽娜．蜂淸越冬期的管理，中国蜂业，２０１４化（１２）：２０．，３－［］２０１５６６；２６２６侯丽娜，蜂病防治探讨，中国蜂业，，（１）［４］侯丽娜，蜂箱排列方法，中国蜂业，２０１５６５（２）；３４，参与论文：［１］张魁，侯丽娜．延边州蜂业发展现状与对策，中国蜂业，２０１３，６４（４）：４４－４８．［２］修占武，张魁，侯丽娜，胡洪飞，窩旭，鲁承．延边地区中华蜜蜂流行病概况，中国畜牧兽医２０１４５０３８，，巧）：［３］张魁，侯丽娜．蜂群室外越冬方法，中国蜂业，２０１４，６５（１２）：２６３７