安徽蜜蜂病毒病的发生与流行研究 61页

单位代码；：分类号１２７２学号：００６１密级：ＩＩ＾ＺＩＺＺＩ＾ＺＺ各傲东！〇：义葦学位论文安徽蜜蜂病毒病的发生与流行研究ＳｔｕｄｏｎＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＨｏｎｅｂｅｅＶｉｒｕｓｅｓｙｙｉｎＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ研究生：巧天慰指导教师：余化牛教巧合作指导教师：刘芳博壬申请学位口类级别；农学硕±专业名称；农业昆虫与害虫防治研究方向：资源与城市昆虫：研究牛所在学院．院－答辩委员会主席：２０１５年月《 ＡｎｈｕｉＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇＳｔｕｄｙｏｎＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＨｏｎｅｂｅｅＶｉｒｕｓ粉ｉｎＡｎｈｕｉｙＰｒｏｖｉｎｃｅＰｏｓｔｒａｄｕａｔｅ二ＴｉａｎｓｈｕＷａｎｇｇ－Ｔｕｔｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＬｉｎＳｈｅｎｇＹｕＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ，ＣｈｉｎａＭａ２０１５ｙ， 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，论文中不包含其他人已经发表或撰，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并。与我表示了谢意。研究生签名：Ｚ时间：２０１５年月口日＾／ｙ关于论文使用授权的说明、目本人完全了解安徽农业大学有关保留使用学位论文的规定；，Ｐ学校有权保留送，交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采巧影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：导间：２０１５年月／口日、时作＾一２０第导师簇名：时间１５年：月日＾／Ｃ７ 本论文受下项目共同资助完成；国家蜂产业建设技术体系专项Ｓ￣４５－ＫＸＪ９（ＣＡ民）国家自然科学基金（３１２７２５１１，３１３０２０３９）安徽省自然科学基金１４０８０８５６６（ＱＣ）高校省级优秀青年人才基金重点项目（２０１３ＳＱＲＬ０１８ＺＤ）ＴｈｉｓＰａｐｅｒｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙ：ＳｐｅｃｉａｌＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＰｏｓｔＳｙｓｔｅｍｏｆＨｏｎｅｙｂｅｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｄｕｓｔｒｙ－ＣＡＲＳ４５－ＫＸＪ９（）ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ３１２７２５１１３１３０２０３９，）（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｉｉｏｎｏｆＡｎｈｕｒｏｖｎｃｅｐ１４０８０８５Ｃ６巧（Ｑ－ｆＰｒｏｖｉｉｎｃｉａｌｌｅｖｅｌｏＣｏｌｌｅｄｇｅＯｕｔｓｔａｎｄｎｇＹｏｕｎｇＴａｌｅｎｔＦｕｎｄＫｅｙＰｒｏｅｃｔｓｊ（２０１３ＳＱＲＬ０１８ＺＤ） 摘要１／３，全球的食物产量源于蜜蜂的授粉増收效益蜜蜂在给人类带来益处的同时，其生长发育过程中各个阶段均能遭受到蜂瞒、真菌、细菌、病毒Ｗ及天敌等其他动物侵害。近年来，蜂群数量大幅减少，研究表明蜂群丢失是多种因素共同作用的结果，而蜂喷与ＲＮＡ一各种病毒病的协同侵害是导致蜜蜂健康问题高发的主要诱因之。安徽是中国韦一大养蜂大省之养蜂生产的组织化程度和规模化水平较高，但关于安徽省的蜜蜂健康，情况调査却尚未见系统调查，掌握了安徽省的蜜蜂健康状况，有利于蜂农及相关政府部。口进行有效应对，科学引导我省蜂产业的良好发展本论文内容主要包含＾＾１下两部分：一、安徽省内蜜蜂病毒病流行病学研究本研究调查安徽省内２１个乡镇的３８个蜂场关于７种常见蜜蜂病毒：蜜蜂崎翅病毒（ＤｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｒｕｓＤＷＶ、ｓｒａｅｌｉａ州ｔｅａｒａｌｉｓｖｒｕｓＩＡ）、ｇ，）Ｗ色列急性麻蒋病毒（Ｉｐ八ｉ，ＰＶｃｕｔｅｂｅｅａｒａｉ急性蜜蜂麻窺病毒（Ａｌｓｓｖｉｒｕｓ，ＡＢＰＶ）、慢性蜜蜂麻蒋病毒（ＣｈｒｏｎｉｃｂｅｅｐｙａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓＣＢＰＶ）、黑蜂王台病毒（Ｂｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓ，ＢＣＶ）、ｐｙ，ｑＱ蜜蜂裹状幼虫病病毒（Ｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓ，ＳＢＶ）、克什米尔病毒（Ｋａｓｈｍｉｒｂｅｅｖｉｒｕｓ，ＫＢＶ）的感染发生情况，为安徽养蜂业可持续健康发展提供理论依据。运用反转录ＲＴ－ＰＣＲ和序列分析比对的方法对安徽省内２１个乡镇中的３８个蜂场蜜＞，＾１获得＾上７种蜜蜂病毒的特异性发生倩况。研究结果如下：蜂样品进行研究分析１１．意大利蜜蜂＾知ｙ勘２铅Ｗ仇ａ蜂场感染率：ＤＷＶ（６４％），ＩＡＰＶ（４３％），ＣＢＰＶ〇沁（３２％），ＡＢＰＶ（１４／〇），ＢＱＣＶ（１１％），ＫＢＶ（０％），ＳＢＶ（０％）；中华蜜蜂＾４／ｃｅｒａｎａｃｅｒａ／７３蜂场感染率：ＤＷＶ８０％，ＩＡＰＶ４０％，ＣＢＰＶ３０％，ＡＢＰＶ１０％，ＢＣＶ（０％），（）（）（）（）ＱＫＢＶ（０％），犯Ｖ（０％）。ＳＢＶ和ＫＢＶ在所有的蜜蜂样品中均未检测到。２．将样品呈阳性的五种蜜蜂病毒与ＧｅｎｅＢａｎｋ比对，测序结果表明同源性均超过％％，结果符合预期。其中，ＤＷＶ登记号：化８７８３０４．１（９７％）；ＩＡＰＶ登记号：ＥＵ２２４２７９．１〇（９９／〇）；ＡＢＰＶ登记号：ＨＱ８９７１６１．１（９８％）；ＢＱＣＶ登录号：ＧＵ８２５９６２．１（％％）；ＣＢＰＶ登记号：ＫＪ４３７４４７．１（９７％）。３ＤＷＶＩＡＰＶ，ＣＢＰＶ，ＡＢＰＶＢＱＣＶ．，，在安徽省内大范围都存在发生流行现象，ＳＢＶ和ＫＢＶ对安徽蜜蜂的潜在危害可能性小。二、人工离体培养幼虫及ＤＷＶ侵染试验本试验旨在成功建立人工离体培养幼虫体系，为蜜蜂病毒学的室内研究提供理论基础和研究条件。通过试验，成功获得化蛹出房蜜蜂，建立获得了蜜蜂幼虫人工离体培养体系。试验结果显示：人工离体培养蜜蜂与正常蜂群培育出的蜜蜂在生理指标上并无显著差异；形态指标上前翅的肘脉指数差异显著。ＩＩＩ ＤＷＶ的一ＤＷＶ通过饲喂含有营养液给发育幼虫这方式，能成功侵染蜜蜂幼虫，：ＤＷＶ，出现崎翅现象结果显示能导致蜜蜂羽化异常；感染ＤＷＶ病毒的蜜蜂寿命显。著低于阴性对照组，验证了之前学者的报道－，，，民ＴＰＣＲ关键词：蜜蜂病毒病安徽ＩＶ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｉｓｉｓｔｉｌｅｆｉｒｓｔｄｅｔａｉｌｅｄｒｅｏｒｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌ；ｈｅｓｅｓｅｖｅｎｂｅｅｖｉｒｕｓｅｓ；ｎｙｌ７／ｙ／７７ｅ／／／推拟ｐ／ａｎｄｃｅｒａｗｓ＊ｉｎＡｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｉｔｗｉｌｌｈｅｌｐｂｅｅｉｅｓｅａｒｃｈｅｒｓａｎｄｒｅｌａ化ｄｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ化ｅ＊ｓｃｒｅｅｎｉｎｉｅｓｅｎｔｓｈｕａｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｂｅｅｈｅａｈｈｉｎＡｎｈｕｉａｎｄｗａｒｎ化ｅｍｏｆ也ｅｏｔｅｎｔｉａｌｇｐｙ，ｐ化ｒｅａｔｔｏｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｉｃｕｌ化化．Ｔｈｉｓａｅｒｉｎｃｌｕｄｅｓｔｗｏａｒｔｓａｓｂｅｌｏｗ：１．ＲｅｒｏｔｓｏｎｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓｏｆｈｏｎｅｂｅｅｖｉｒｕｅｓｉｎｐｐｐｐｙＡｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ；２．Ｓｙｓｔｅｍｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｌａｒｖａｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｉｎ化ｌｉｓｓｔｕｄｙｓｉｎｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅＰＣ民ａｎｄｓｅｕｅｎｃｅａｎａｓｉｓａｓｕｒｖｅｏｆｓｅｖｅｎ，ｕｇｐｑｙ，ｙｈｏｎｅｙｂｅｅｖｉｒｕｓｅｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ，ｃｏｖｅｒｉｎｇａｌｍｏｓｔ化ｅｗｈｏｌｅｏｆＡｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉ打ａ．Ｔｅｎａｄｕｉｉｉｉｉｔｉｓｌｔｂｅｅｓｅｒｔｕｂｅｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍａａｒｅｓｎ２１ｔｏｗｎｓｎｃｌｕｄｎ２８ｕｂｅｓｏｆＡｐｐ，ｇｐ併推巧ａｎｃｌ１０ｏｆｃｅｒａ／７江Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ化ｂｅｌｏｗ：１．虹１：ｈｅ／ｗｅ／／／垢／ａｓａｍｐｌｅｓｆｒｅｕｅｎｃｉｅｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：６４％ｏｆａｉａｒｉｅｓｗｅｒｅ，ｑｐ〇〇４〇ｉｎ反ｃｔｅｄｗｉｔｈＤＷＶ，４３／〇ｗｉｔｈｌＡＰＶ，３２／〇ｗｉｔｈＣＢＰＶ，１／〇ｗｉ化ＡＢＰＶ，１１％ｗｉｔｈＢＱＣＶ，ａｎｄ＾ｎｏｎｅｗｉｔｈＳＢＶｏｒＫＢＶ．Ｉ打ｓａｍｌｅｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｆｏｕｒｖｉｒｕｓｅｓｗｅｉｅｉｄｅｎｔｉｉｅｄ：ｐ，ｇｆｒｉ〇〇〇ｉＤＷＶ０％ｏｆａｉａｅｓｌＡＰＶ４０／〇Ｃ目ＰＶ３０／〇ａｎｄＡＢＰＶ１０／〇．Ｓｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｐ，巧），（）（），（）ｍｕｌｔｉｐｌｅｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃｏｍｍｏｎｉｎｂｏｔｈｓｐｅｃｉｅｓ．２．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ油ｏｗｔｈａｔＤＷＶｗｉｔｈＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ＪＸ８７８３０４．１（９７％）；ｌＡＰＶ〇ｗｉｔｈＮＯ．ＥＵ２２４２７９．１９９／〇ＡＢＰＶｗｉｔｈＮＯ．Ｈ８９７１６１．１９８％ＢＱＣＶｗｉｔｈ．）；ＮＯ（Ｑ（）；ＧＵ〇８２巧６２．１巧５％）；ＣＢＰＶｗｈｈＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ＫＪ４３７４４７．１（９７／〇）．３ＤＷＶｌＡＰＶ£８？ＡＢＰＶａｎｄ目ＱＣＶｗｅｒｅｉ打ｓｔｅｄａｌｍｏ巧ｉｎａｌｌｚｏｎｅｓｉｎＡｎｈｕｉ．乂ｆｅ，，，ｅｘｃｐｅｔｅｄＳＢＶａｍｄＫＢＶ．Ｗｅｈｏｐｅｔｈｉｓｗｉｌｌｈｅｌｐｂｅｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｋｕａｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｈｅａｌ化ｉｎＡｎｈｕｉ，ａｎｄｗａｒｎ１：ｈｅｍｏｆ化ｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ化Ｋａｔ！：〇ｓｕｓ１：ａｍａｂｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｉｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｒｔｏｆｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌＵｉｒｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｈｏｎｅｙｂｅｅｗａｓ＊ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＴｈｉｓａｓｓａａｒｔａｉｍｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌＵｉｒｅｓｓｔｅｍｆｏｒｈｏｎｅｂｅｅｙｐｙｙ，＊ｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂ化ｉｓａｎｄｉｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｂｒｓｔｕｄｙｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｖｉｒｏｌｏｇｙｉｎｄｏｏｒ．Ｗｅｕａｅｃｕ＊ｈａｄｈｏｎｅｙｂｅｅｐｌｔｕｒｅｄｓｕｃｃｅ巧ｆＵｌｌｙｅｉｅｓ山化ｓｈｏｗｅｄ化ａｔ化ｅｒｅｗａｓｎｏｐ，讯ｓｉｎｉ巧ｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎａｒｔｉｆｉａｌｉｖｉｔｒｂｅｌｉｃｕｂａｔｉｏｎｏｎｅｇｉｃｎｏｅｓａｎｄｎｏｒｍａｎｓ．Ｂｙ耗ｅｄｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏ打ｓｏｌｕｔｉｏｎ化ａｔｃｏｍａｉｎｅｄＤＷＶ，ｌａｒｖａｅｗｏｕｌｄｂｅｉｎｆｅｃｔｅｄＤＷＶｅａｓｉｌｇｙ，ｗｈｉｗｌｄｂｄｌｉｆｄｌｉｌｌｔｔｔｉｈＣＫｃｈｉｎｇｗｏｕｅｅｆｏｒｍｅｄａｎｄｅｓａｎｅｃｎｅｄｒｅａｔｕｃｏｎｒａｓｗｈｈｅｓ．ｐｇｇｙ，ｈｏｎｅｂｅｅ－Ｋｅｗｏｒｄｓｃｅｒａ／７３ｖｉｒｕｓＡ打ｈｕｉ民ＴＰＣ民：推／ａｙ，，ｙ，，Ｖ 英文缩略表Ａ．ｍｅｌｌｉ＾ｒａｌｉｇｕｓｔｉｃａＡｐｉｓｍ础报ｒａＫｇｕｓｔｉｃａ意大利蜜蜂Ａ．ｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａＡｐｉｓｃｅｒｍａｃｅｒａｎａ中华蜜蜂ＤＷＶＤｅｆｏｒｍｅｄＷｉｎｇＶｉｍｓ蜜蜂崎翅病毒ｌＡＰＶＩｓｒａｅｌｉａｃｕｔｅｐａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓＷ色列急性麻演病毒ＡＢＰＶＡｃｕ化ｂｅｅａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓ急性麻濟病毒ｐＣＢＰＶＱｉｒｏｎｉｃｂｅｅｐａｒａｌｙｓｉｓｖｉｒｕｓＩＳ性麻濟病毒ＢＱＣＶＢｌａｃｋｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｒｕｓ黑蜂王台病毒ｑＳＢＶＳａｃｂｒｏｏｄｖｉｍｓ巧状幼虫病病毒ＫＢＶＫａｓｈｍｉｒｂｅｅｖｉｒｕｓ克什米尔病巧ＰＣＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ多聚酶链式反应－ｒｅｖｅＲＴＰＣＲｒｓｅｉｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｎｒｅａｃｔｉｏｎ多聚醒链式反应ｐＤＥＰＣＤｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｉｔｏｎａｔｅ焦碳酸二乙醒ＲＮＡＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ核糖核酸ＯＤＯｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ吸光度ｐＮＣＢＩＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｉｍａｔｉｏｎ美国国家生物技术信息中也ｃＤＮＡＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ互补脱氧核糖核酸ＴｒｉｓＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｉ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ兰哲甲基氮基甲焼ＣＣＤｃｏｌｏｎｙｃｏｌｌａｓｅｄｉｓｏｒｄｅｒ蜂雖崩溃失调症ｐ＇ＭｈｊｔｏｍｍＭｅｈｓｓｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｏｎｉｕｓ蜂房巧薄ｐｐＥＦＢＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｕｌｂｒｏｏｄ欧洲幼虫腐臭病ＡＦＢＡｍｅｒｉｃａｎＦｏｕｌｂｒｏｏｄ美洲幼虫腐奥病ＲＩｓｒｙａｅＰｅａｎｉｂａｃＷｕｓｌａｒｖａｅ拟幼虫芽巧杆菌ＶＩ 目录…ＩＩＩ摘要ＡｂｓｔｒａｃｔＶ英文缩略表ＶＩ１文献综述９１．１我国养蜂业现状９１２１０．蜜蜂健康及影响因素Ｍ．１２１：Ｔｗａｓ）１０．．真菌性疾病巧子虫病（Ｗｏｐｐ１．２．２细菌性疾病（ＢａｃｔｅｒｉａｌＤｉｓｅａｓｅ）１１１．２．３Ｖｉｒａｌ出ｓｅａ化）病韋性疾病（１２２ｄｔ１．．４蜂巧（Ｖａｒｒｏａｅｓｔｒｕｃｏｒ）１２１２ｅｓｉｃｄｅ１３．．５杀虫剂（ｐｔｉ）１１．３蜜蜂病毒病的种类和分子生物学特征４３．１４１．１病毒病的种类（常见病毒）１３２１６．．传播途径１３．３１７．寄主范围１３．４１７．其他致病因子１４１８．蜜蜂病毒病的诊断方法概述１．４．１基于发病症状的诊断方法１８１４．２１８．基于病毒形态学的显微检测方法１４３１８．．基于免疫学的检测方法１．．４４基于核酸序列的检测方法１９１５１９．蜜蜂病毒病的相关研究进展方向与发展趋势２引胃２１２１２１．研究目的意义２．２研究主要内容２１３材料腑２３３．１试验材料２３’３丄１ＲＮＡ保存液在２５Ｃ２３研巧下的不同保存天数下的保存效果．．２３３１２供试材料３丄３２３幼虫病辜侵染试验材料３丄３试剂Ｗ及主要试剂的配置２５３丄４仪器设备２５３．２２６实验方法３２１ｔｏａＲＮＡ２６．．ｔｌ的提取３．２．２引物设计２６３．２．３ｃＤＮＡ的合成２８３．２．４ＰＣ民扩增２８３２．５．琼脂糖凝胶电泳巧３２６Ｐ２９．．ＣＲ产物基因序列测定与分析３．２．７获得幼虫２９３．２．８试验分组及饲料粮食配制２９３．２．９移虫３０７ ３．２．１０添加及更新饲粮３０３２１１幼虫化蛹３０．．３０３．２．１２化蛹期更换垫纸３３ＰＥ民３１．２．１出房工蜂体重测定、试验３１３．２．１４前翅形态测定３．１．２１５病毒侵染验证３４结解分析３２４１ＲＮＡ３２．保存液保存效果４．２ｔｏｔａｌＲＮＡ的检测３２４３３４．测序结果分析４４３４．样品检测结果４５ＰＥＲ试验３６．６４．６致崎对比３３７４．７形态指权测定－４．８ＴＰＣＲ法验证ＤＷＶ侵染情况３７Ｒ５職３８５．１混合感染３８５２ＤＷＶ３８．５．３ＩＡＰＶ３９５４ＣＢＰＶ３９．５．５ＡＢＰＶ３９５６Ｂ３９．ＱＣＶ５．７其他病胃３９结ｉｆｅ４０参考文献４１附录５５７＾谢５个人简Ａ５８在读期间发表的学术论文５９８ １文献综述一，世界上公认蜜蜂属里面有四个种蜜蜂作为自然界最重要的授粉昆虫之，目前，ｔｏＦａｂｒｉｃｉｕｓ）、ｉ即大蜜蜂（冷地成＊ｒｓａ小蜜蜂（■／！知７ｏｒｅｆｌ［Ｆａｂｒｉｃｕｓ）、东方蟹蜂（４ｐｉｓｃｅｒａｎｃｒｓ＿／１［］？ｏＬＦａｂｒｉｃｉｕｓ）和西方蜜蜂（冷地ｍｅ巧向ｉｎｎａｅｕｓ）。ｒｉｒｉ一＂亚种中蜂，全称中华蜜蜂Ｃ４如ＳｃｍｗＭｆｃｅｒａｍＦａｂｃｕｓ），是东方蜜蜂的。中蜂是生长在我国广东、广西、云南、安徽、四川、等多省的优良蜂种。其体色特征：蜂一一王在自然中有两种本色，种腹节黄色环明显，整个腹部呈褐色种腹节呈有明显；另。工的黑色环，整个腹部呈黑色蜂头胸部为黑色，盖有黑黄色绒毛。雄蜂均为黑色。中１、，华蜜蜂的特点：采集勤奋，抗寒耐热性强能有效利用零星蜜源。２、嗅觉灵敏，飞行速度快。３、工蜂发育快，寿命长。４、抗病力强，对美洲幼虫病、跑子虫病有较强的抵抗力。５、产品质量好。６、爱分蜂、容易盗蜂、易飞逃。７、易受巢虫危害，爱咬巢脾。’＊ｆｅｒａ／ｃａＳｉｎ）。２４意大利蜜蜂巧／脚如ｐ，简称意蜂意蜂工蜂第腹节的背板一，表绒有栋黄色环带，黄色区域的大小和深浅有很大的变化般Ｗ两个黄环为最多；体毛为淡黄色。蜂王的腹部多为黄色至暗栋色，尾部黑色，只有少数全部是黄色。意蜂性，，情温驯，产卵力强，育虫节律平缓分蜂性弱能维持大群，采集里强，；工蜂勤奋善于利用流蜜期长的大宗蜜源泌蜂王浆能力强产蜡多，造赃快保卫和清巢能力强。；分；；。其主要缺点是盜性较强，定向力差，在高绅地区越冬困难，消耗饲料多，抗病力较弱１．１我国养蜂业现状意大利蜜蜂和中华蜜蜂是现在中国主要饲养的两个蜜蜂品种，虽然两种蜜蜂在形态和生活习性上有差异，但是二者都有型态社会分工，在感染的病毒种类上也大同小异。＂＂一、养蜂业被称为农业之翼，它是集经济社会和生态效益于体占有重要经济地一位的口产业，也是现代农业的重要组成部分。中国是世界蜂产品生产和出口大国，蜂蜜、蜂蜡、蜂王浆等蜂产品在国际蜂产品市场中占有重要的比例，历来是我国传统出Ｐ１口创汇产品。同时，蜜蜂作为最重要的授粉资源昆虫，对于维持生态环境稳定，促进农业生产也具有巨大的社会经济效益。蜜蜂授粉每年为我国农业的贡献价值高达Ｗ３０４２別亿元，是中国养蜂业总产值的７６倍，相当于中国农业总产值的１２．３０％。随着现代农业的发展，昆虫栖息地环境遭到破坏、加之农药的大面积使用Ｗ及病虫害爆发Ｗ包括蜜蜂在等原因，内的多种传粉昆虫受到了威胁，数量大幅下降。发展养蜂业，推动农业养蜂授粉服务日益为各国政府所重视。近年来，我国政府也逐渐认可养蜂业的重一Ｗ要性，陆续出台了些养蜂扶持政策，我国养蜂业发展也出现了新的机遇。但在政策扶持一，技术服务等环节相比较欧美发泣国家巧是有我国虽是养蜂大国，定差距。蜜蜂病害对养蜂业造成较大威胁的主要因素与其传播途径与方式的多样性、易，侵染有极大关系，包括流动养蜂造成病害的大范围迁移危害从而引起蜜蜂之间的交叉９ 感染ｗ一。因此，重视蜂业的科普宣传，提升蜂农的技能素质是必要考虑的点。１．２蜜蜂健康及影响因素．．：Ｖｏｓｅ讯ａｓ．１２１真菌性疾病抱子虫病（ｙｐｐ）微抱子虫病（ｉＶｏｓｅｗａｓ／Ｔｐ．）属微抱子虫目（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ），从昆虫和其他无脊椎动ｔＷｌ物，到脊椎动物（包括人类）上分离出来的该目有超过１６０种，１３００类的。微抱子虫一病原是寄生在细胞内的种真菌性疾病，在寄主细胞外Ｗ代谢产生的不活动抱子形式存在、传播，，。在昆虫个体间通过这种抱子的侵染在寄主细胞内芽跑发芽将抱子质通过一８９１’１妃抱子极管从寄主细胞侵染至另寄主细胞的方式实现。蜂抱子虫（Ｍｗｅｗａ巧）和东方蜜蜂微抱子虫（？／Ｖ．ｃｅｒａｎａｅ）这两种是成年蜂的主要致病源。最初，人们认为７Ｖ．ｆＷ是专口侵染西方蜜蜂，意大利蜜蜂，从而导致抱子虫病，而ｉＶ；ｃｅｒａｎａｅ只是针对东方ｆＷ蜜蜂进行侵染危害的。之后，有证据表明东方蜜蜂微抱子虫病在全世界的意大利蜜蜂种群间也广泛传辄ｔＷ抱子虫芽袍存在于排泄物和花粉中，成年蜂摄入之后会染病，芽抱在蜜蜂体内的ｔＷ中损发芽，，释入肠內，侵染中肠的上皮组织细胞然后大量增殖产生新的芽抱。区分是哪种拖子虫病可通过监察蜜蜂感染抱子虫病（ｉＶ．巧妃）发生与否，是否排便颜疾的症ｐａｗｉＶ．的蜂群不能发展。，ｉＶ．状；而ｃｅｒａｎａｅ侵染另夕ｈ０如的侵染仅局限于中肠部位的上皮组织细胞，而ｉＶ．ｃｅｒａｎａｅ侵染的组织更广，包括马氏管，咽下腺体，送些组织侵染Ｐｑ情况可Ｗ通过分子技术方法检测得到。在不同文献关于ｉＶ；ｃｅｒａｎａｅ的侵染对蜜蜂健康一．和蜂群发展所得出的结果是不样的，ｃｅｒａｔｅ引。在西班牙有报道ｉＶ发不正常的抱子ｔｗ’Ｗ虫病，导致蜂群崩溃。相应的，在实验室侵染试验中，这些分离的病菌具有机枪的ｐｓｉ，Ｍａａｃｋ．２００９Ｐａｘｔｏｎ２００７的试验中并没有得到如上的结论论致病性。然而ｙ等，等．证Ｐ４’ｔｗｗｉｌＰＷ，这可能与不同的分离病菌材料不同有光气同样，在其他的报道中与Ｈｉｇｅｓｃｅｒａｎａｅ所描述的病症相同，这说明了相对于全球的广泛的传播性，Ｗ的致病特点更偏Ｐ２’３３３向于地域性。有学者报道随着温度的升高ｅ．，Ｗｃｅｒａｎａ比ｉＶＷｋ有更强的致病性。Ｐ２１Ｗｃｅｒａｎａｅ的活力在低温环境下易受很大影响，而ＴＶ．ｃｅｒａｎａｅ的致病性易受气候环境ＰＷ影响。如今，气候环境对蜜蜂病虫害发生的影响是个研究的热口领域。蜜蜂球囊菌巧妃）侵染引起的真菌性疾病，称为蜜蜂白垂病，因病虫Ｐｙ死后类似黄白色粉笔，也称蜜蜂石膏病。乂巧？ｂ主要通过抱子侵染的形式作用于蜜蜂Ｐ６３幼虫，在花０年。球囊菌抱子生存能力很强粉或者蜂箱内的存活时间可达１Ｗ上，蜂群正常的储存食物和越冬都可能是次年白聖病的传染源，其生物活性存在时间可超过１年ｔｗ，Ｉｄ。食物中的抱子进入蜜蜂幼虫Ｗ内后之内即开始进行生理活动，通过生长的菌，丝汲取幼虫身体内的汁液养分在这个过程中伴随着抱子毒素的分泌，危害着幼虫正常ＰＳ１发育成长，因此，往往蜜蜂幼虫时期即死去。有研究显示对蜜蜂幼虫进行人王侵染球一，囊菌试验，不管侵染日龄与是否进行低温处理，旦幼虫摄入足够数量的菌数就会在１０ ３９［化巧前－２１日，菌丝穿透幼虫尾部ｌ具体表现为菌丝分布在整个虫体，体色由白变灰ｔＷ或黑，最后呈石灰化死在巢房格子内，虫尸上有绒毛状菌丝。患有该病的蜂群群势会因为幼虫的大量死亡而急剧下降，而这也危害了蜂群整体的健康，导致授粉和采集、哺，其危害影响值得重视。蜜蜂袍子虫病易在春天和秋天这两季节流行育等工作能力下降，春秋季的高湿、不通风或者营养缺乏与污染等问题Ｗ及品种抗性差异等多因素都是引发ｆＷ一该病的诱发因子。对于该病的防治，般采取春秋季降低巢內湿度，补充饲料营养，一旦发现病群要采取隔离措施从而提高蜂群抵抗力；，对染病蜂箱进行焚烧销毁，杜绝２ｆ４ｉ给抱子任何生存环境条件。１２２ｉｌＤｉ．．细菌性疾病化ａｃｔｅｒａｓｅａ巧）目前来说Ｍ．和／ｃｉｒｖａｅ是危害蜂群健康的两种主要细菌性疾病，且均只对幼虫侵染发病，分为欧洲幼虫腐臭病ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｕｌｂｒｏｏｄ（ＥＦＢ）和美洲幼虫腐臭病Ａｍ一ｅｒｉｃａｎＦｏｕ化ｒｏｏｄ（ＡＦＢ）。直来，人们认为ＥＦＢ相对于ＡＦＢ对蜜蜂健康的威胁相对要小，但几年前Ｒｏｅｔｓｃｈｉ等Ｗ及Ｗｉｌｋｉｎｓ等的报道显示ＥＦＢ在瑞±、英国等欧洲国４３，ｆＷ家对蜜蜂的健康威胁也很大。美洲幼虫腐臭病在未知原因的蜜蜂崩溃群里因为很容易被检测到，因此其与导致蜂－群崩溃可能有关。此病发生率很高（在德国有５１０％的发生率，记录了１０年的发生率数￡＂１一）据，导致全球养蜂业的巨大损失。因此，可将其视为蜜蜂健康的重要威胁因素之。ＡＦＢ的病原属芽袍杆菌的分支拟幼虫芽抱杆苗放Ｗ／ｏｒｖａｅ）患病蜜蜂幼虫体色由白渐变为淡黄、褐色，死亡虫尸干瘡如鱗片状贴于巢房单元、直至黑褐色一－格子壁上。病虫般逐渐于１２１３日龄表现发病症状，而死于封盖期。病死虫尸的封盖４７呈褐色下陷穿孔ｔｌ，挑出虫尸能闻到恶臭味。欧洲幼虫腐臭病病原为蜂房球苗（Ｍｅ／紅ｓｏｃｏｃｃｗｐ／ｉ／ｔｏＷｗ），是革兰氏阳性尖形球ｔ茵，在系统发生树中与肠球菌属（Ｅｎｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）接近。Ｗ单独、成对、或者链状形态形成不同尺寸。因其生长环境条件要求苛刻，从死ｔ幼虫体内很难得到病茜并培养１９１２。一年Ｗｈｉｔｅ的猜想在１９８３年被Ｂａｉｋｙ通过种特殊的有机体抑１／化《侵染成功而证一４９ｆＷ？化？心的分类得到最终统［１实。Ｍ如公认来得不容易，早期将其划分到化如？化？，口〇］化巧随后划分为旅卿ＯＣＯＣＣＷ如／化ｎ，再后来Ｍｅ似ｓｏｃｏｃｃａｓｆ／ＷｏＨ，最终被归为Ｍ脚ｆｔ／ｔｏＷｗｊ。／通常，主要在１至２曰龄时侵染蜜蜂幼虫，致使幼虫在４至５日龄大量死亡，但受侵染的幼虫也可能将污染的食物排泄到巢房壁上而后化蛹，幼虫抵御感染能力随着日龄的增ＰＷＰＳ加而增加。当幼虫吸收了食物后，ＥＦＢ细苗在幼虫中肠部位数量激增。有人猜想幼虫死于绝食，然后被第二侵入源如蜂房芽抱杆菌（Ｐｆｌｃｎ巧和粪肠球苗（怎Ｗｅｒａｃｏｃｃｗ舟ｅｃｆｌ似）降解，因为这两种经常能在ＥＦＢ现象中检测发现。ＥＦＢ最初发Ｐｑ现在西方蜜蜂身上，但如今更多地发现在危害中华蜜蜂。欧洲幼虫腐臭病（ＥＦＢ）发ＩＩ 病症状表现为巧期幼虫体色苍白，死亡数日后体色变深，呈淡黄色至黄褐色，死亡幼虫一般不Ｗ卷曲状存在于巢房底部，而是扭曲贴在侧壁或者被拉伸出巢房外，在巢内呈腐化状，但挑出的虫尸无粘性。内勤蜂会完成清理虫尸工作，蜂王继续在清理后的空房产Ｐ７３卵，就会形成虫脾插花的现象。８ｔ５３细菌性疾病多用于止霉素、链霉素等药物进行防治。ｉ１．２．３病毒性疾病（Ｖｉｒａｌｄ巧ａｓｅ）２３－，基本上都是正链ＲＮＡ目前，在全球范围肉已经有种病毒被报道能侵染蜜蜂病ＤＰｓ－Ｗ毒ｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）和传染性软化病病毒科（Ｉｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）。，分为两系双顺反子（排除外寄生病虫瓦满的病毒传播因素，病毒在蜜蜂体内长期Ｗ隐藏不发生的潜伏状态存，才有可能引起病毒大量增殖化只有遭遇环境条件恶劣变化影响，弓胞发病的症状。６ｔ３如群势的中毒崩溃，环境温湿度变化而引起的诱发等。目前，己有１９种蜜蜂病毒病被Ｐｓ’ａｉ４成功分离提取，病毒的不稳定性带来了丰富多样的种类，近来又发现了种疑似与Ｍ［］蜜蜂病害有关的病毒。根据文献报道，近年来，全球各地均发生过大规模的蜂群崩溃６ｓｓ６７６８ｔ３ｔｑＰ’’ＤＷＶ、ｌＡＰＶ消亡的现象，堪，而大多数都极有可能跟蜜蜂病毒病有关如各个地区的传播流行。ＩＡＰＶ曾被视为是ＣＣＤ（ｃｏｌｏｎｙｃｏｌｌａｐｓｅｄｉｓｏｒｄｅｒ）的指示性病毒胃１ｗｉ一１ｔ证明其并非唯。ＣＣＤ，而后被原因引起现象很可能是多种病原的综合作用结（ＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓＩＩＶ）果，如寄生在无脊椎微抱子虫身上的动物化彩病毒，ｆｎｉ、携带ＤＷＶ的瓦瞒等中华蜜蜂在众多蜜蜂病毒病当中遭受的最严重挑战即来自Ｐ４１于犯Ｖ。ｔｔｏ１．么４樓蜗（Ｖａｒｒｏａｄｅｓｒｕｃｒ）在养蜂业的所有蜜蜂病害中，毫无疑问，蜂蛾被视为对蜜蜂威胁最为普遍且最为严ｎｔｉ重的病害，这与其通过垂直传播感染病毒或加剧现有感染的方式直接相关。最初，蜂ｕｅｉ瞒是从东方蜜蜂蜂群中发现，随后在西方蜜蜂蜂群中发现同样存在。蜂峨对东方蜜蜂，的危害可Ｗ忽略，因为其在与蜂瞒的长期协同进化中，具备了自动清理机制能将蜂群ｎｔｉ中的蜂瞒及时清除。而西方蜜蜂却没有该生理机制，因此蜂靖能严重危害西方蜜蜂健ｔＷ。，康蜂哦主要通过寄生在蜜蜂身上抑制寄主体内蛋白质的代谢，使得蜜蜂摄取花粉Ｐ９３。，等食物却无法获得其中的蛋白质营养，进而危害蜜蜂健康蜂群中各阶段的蜜蜂从ｓｔｑ幼虫、成虫均遭受蜂瞒危害，导致被寄生的成年工蜂过早地从事采集活动，进而、蛹缩短工蜂的寿命被蜂蝴寄生的工蜂的非联想学习能力和归巢能力Ｗ及免疫力都会８３－８５８６［１［］下降。蜜蜂的抗病能力下降不仅利于蜂巧Ｗ吸食蜜蜂血淋己的方式寄生，更给了病毒，而蜂群生活的生态环境的激变也易引发、东方蜜蜂微抱子虫等其它病害可乘之机体内病毒的激増与发病蜂巧危害不仅在于自身对蜜蜂吸食血淋己造成健康，其体内ｓｓｓｓｆ’ｉ易携带其他病毒，从而促进病毒传播。在病毒对蜜蜂感染影响的问题在蜂瞒侵染意ＰＷ蜂后才变得尤为突出。伴随对蜜蜂血淋已的吸食的同时，蜂瞒的唾液分泌物含有其自１２ 一身所携带的病毒如崎翅病毒等，、腹部短小等（）被侵染蜜蜂进而出现残翅系列典型９１９２，１症於。目前，没有结论性的结果证明蜂群崩溃现象在蜂蝴与多样病毒的互作有直接关系，Ｖ被认为在瓦瞒侵染的蜂群崩溃中扮演着重要作用一除了ＡＢＰＶ和ＤＷ。在夏威夷的，用瓦瞒对幼龄蜂侵染会显著减少ＤＷＶ的种族多样性个最新研究发现，同时增加感染９４［１发生的可能性。结果支持了蜂魄有减少特定的病毒种族多样性，从而减疫病毒毒力的Ｐｓ’Ｍｌ猜想。。上述结果最近也被其他研究验证１．２．５杀虫剂（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）现屯新烟碱类（ｎｅｏｎｉｃｏｔｉｎｏｉｄ）等杀虫剂对蜜蜂的影响逐渐走进了蜂农和研究者的视野。新烟碱类杀虫剂种类繁多ｎ比虫嘛（ｉｍｉｄａｃｌｏｒｄ）、ａｃｅｔａｍｉｒｉｄ）、，包括ｐｉ巧虫脉（ｐ喔虫胺（ｃｌｏｔｈｉａｎｉｄｉｎ）、麾虫嗦（ｔｈｉａｍｅｔｈｏｘａｍ）、嗟虫嘛（ｔｈｉａｃｌｏｒｉｄ）、巧虫胺（ｄｅｆＵｒａｎ）ｐｉｎｏｔ及帰巧虫胺（ｎｉｔｅｎｒａｍ）等ＣｈＲ）ｐｙ。该类杀虫剂是对抑制昆虫烟碱型乙骄胆碱受体（ｎＡＰＷＳＩ。的枯抗剂，干扰屋虫神经的正常生理活动有研究显示在向日葵上用药化虫嘛后，ｗ长成的向日葵花殺中存在农药残留现象ｔｉ，蜜蜂采集了有药残的蜜源之源，会将其带回蜂巢，最终会流向人类食用的蜂产品中。ｉｗｆｊ不同的侵染机制对蜜蜂影响不同，体壁接触比饲喂给药的方式毒性要小。通过进行急性致死毒性的评估，算出试验对象对应的致死中量（ＬＤ５０或ＬＣ５０）。有研究Ｂ１８２２ｎ曾得出如下结果：比虫嘛（ｎｇ／只）、喔虫胺（ｇ／只）、喔虫嗦（３０ｎｇ／只）、巧虫胺１０１【］（７５ｎ／１３８ｎ／只）、賠虫化（７ｕｇ／只）１５ｕ／明ｇ只）、稀巧虫胺（ｇ、喔虫晰（ｇ只），表不同的烟碱类农药的急性致死计量不同。慢性致死毒性则通过饲喂或体壁接触的方式给０－ｄ／／药１ｌｌ后只）、嗟虫嗦（１ｎ，，，巧虫脉（１ｕｇｇ只）因此对蜜蜂生存问题无显著影ｎ〇２］￣响。亚致死剂量的化虫晰（５〇ｕｇ／Ｌｌ２００ｕ／Ｌ），亚致死剂，ｇ影响蜜蜂的采集行为被ｉｗｆｉ量化虫嘟处理过的蜜蜂的采集和归巢能力有显著影响，甚至有不归巢现象。非致死ＵＷ剂量（１．３４ｎ２０ｕＬ庶糖溶液）的唾虫嗦也会影响蜜蜂的归巢能力。综合来看ｇ溶于，ＵＷ杀虫剂对蜜蜂蜂群的健康与生存存在不小的影响。与蜂峨类似，，杀虫剂不仅自身对蜂群会有危害其造成的免疫力下降亦会引诱其它１＾￡病原的危害（蜜蜂微抱子虫、病毒）。有试验曾对蜜蜂进行亚致死剂量化虫嘛处理ｉｆＷ后饲喂微抱子虫，蜜蜂体内的微抱子数日后数量激増。亚致死剂量的喔虫胺、化虫嘟处理后的蜜蜂体内ＤＷＶ浓度大幅上升，结果显示对蜜蜂的抗病毒免疫能力能造成不ＵＷ利影响。蜜蜂基因组中编码异源物质解毒酶基因的数量与果蜗（ＺＶｏｗｐ片航冈比亚按蚊（ｚｉｎｏｐＡｅ／ｅｓｇａｗＷａｅ）相比较少，这也从基因组水平上部分ｉｗ［］解释了蜜蜂对杀虫剂敏感的原因。１３ １．３蜜蜂病毒病的种类和分子生物学特征１．．３１病毒病的种类（常见病毒）（１）蜜蜂残翅病毒ＤＷＶｎｉＤｊｉｉｌＤＷＶ首次分寓鉴定在１９９１年，如今已流行分布在全世界范围内。此外在东方ｉｉＷＷＷＶｔ蜜蜂和另外巧巾野生蜜蜂也被证实有Ｄ存在。蜜蜂残翅病毒的发病症状表现为翅膀卷曲，，无飞行能力，寿命极短体色较正常蜂要暗等。该病毒可Ｗ侵染蜜蜂的各个阶段，感染该病毒的幼虫在蛹期羽化时翅膀分化异常，会出现翅膀崎形，出房后病蜂的ｉｉｉｗｉｗ’ｑ。寿命也明显较正常大量减少，无活力该病毒在蜂满未传播开来么前对西方蜜。蜂对无影响，但病毒会随着蜂群内瓦瞒寄生会传播开来高密度瓦横寄生的蜂群内，ｎｗＤＷＶ浓度往往也很高，ＤＷＶ发生流行和爆发现象往往与寄生蜂群的蜂瞒密度关系ｉｉ７ｍ］［’密切。如今，蜂賴与病毒的联合危害被确认为是导致全球授粉蜂群数量持续下降的首要原因。口）窠状幼虫病毒孤ＶＳＢＶ一胃第次成功分离鉴定是在１９１３年，该病毒的分布范围非常广泛，在全球范６３１２０’１２１化［’１围内的冷妃ｍｅ／ｅｒａ当中均能被检测到。不过，囊幼病对西方蜜蜂的危害并不一ＳＢＶ严重，也般仅在每年的早春繁殖期发生。侵染周期较长，可侵染幼虫与成年蜂，其中，３日龄前的幼虫为易感期，通过摄取带有病毒粒子的染病哺育蜂分泌的王浆营养ｎｎｉ一。，液而感染化蛹前，病虫最后次的蚁皮过程被干巧抑制蚁皮液存积在老皮内而。无法正常晚皮，进而无法完成化蛹过程，死亡病虫表皮变硬成囊袋状，呈暗黄色。虫尸干后呈船勾状，头部勾起而身体姑于巢房壁。早春蜂群繁殖期常发生该病，这很可能一ｌｕｊ与这时期外界蜜源缺乏有关。成年蜂无明显发病症状，但寿命可能缩臧。樹急性麻瘦病毒ＡＢＰＶＡＢＰＶ和ＣＢＰＶ发病症状相似，都会出现麻蒋症状，爬行缓慢，失去飞行能力，寿ｗｆｉ。１９６３命短急性麻婷病毒于年首次被分离鉴定发现，随后，该病的发生在全球各地范围内的西方蜜蜂中广泛都被发现报道该病毒侵染阶段周期长，在所有的发育阶段的个体中均可检测到。该病毒在蜂群中传播迅速，将病毒Ｗ饲，最主要的原因就是患病蜂能通过哺育幼虫料的形式侵染到幼虫体内，但也，成，受感染幼虫常在封盖前死去有部分能成功羽化为ｉｎｆｉ一携毒的隐性病蜂。如今，研究者们公认急性麻瘍病毒为已导致蜂群崩溃的大重要，，，原因尤其与蜂瞒的协同侵害，危害更为严重蜂瞒能携带该病毒使病毒的活动范围大大增加４）ＣＢＰＶ（慢性麻瘍病毒一）。，蜜蜂麻蒋症曾度被怀疑是因蜜蜂气管瞒如Ｓｏｏ泌之前ｗ的寄生引起的４１ ＣＢＰＶ已经ｎｉｗｗ如今，侵害到除南美洲Ｗ外的其它任何地区的西方蜜蜂。成年工蜂是该病毒的侵袭对象，，严重时也能导致蜜蜂数量急剧下降高温高湿季节易诱发该病发生。染病蜂群可能会出现２种典型的麻谤病症，分为Ｉ型麻蒋综合症和凸ｔｗ型麻瘍综合症ｌ。其中，Ｉ型表现为病蜂身体与双翅不正常的震颤，只能爬行，伴有腹部肿胀、下痴Ｗ及双翅无法闲合等病症。患病蜜蜂个体出现病症后数日内死亡。ＩＩ型＂＂又被称为脱毛黑蜂症。初期能够飞行，但身体绒毛逐渐脱落，巧部也准见变黑呈油亮光黑。数日后，失去飞行能力，出现身体不停颤抖等麻谤症状，随后很快死去。该病ｉｕｔｌ任何使其均可发生，但多在春夏两季发生流行。巧）Ｗ色列急性麻瘍病毒ＩＡＰＶｉＭｔｌＩＡＰＶ是Ｗ其首次成功分离鉴定所在地命名，故称作Ｗ色列麻蒋病毒。病蜂体色，变暗，绒毛逐渐脱落，振翅最终麻婷死去。由于从其系统发生树分析其与ＡＢＰＶ和ＫＢＶｉ２９ｔ，因此表现病症与急性麻蒋病毒非常相似５％和７５％非常接近，同源性分别达到６ｌ因为２００７年ＣＣＤ的爆发，从而引起了养蜂界的广泛关注。当使用宏基因组研究蜂群崩溃ｕｑＣＣＤｆ的差异分析后ＩＡＰＶ。群巧健康蜂群，结果显示与有强烈的关联性之后，ＩＡＰＶ在世界各地均被广泛报道，因此，该病毒也已经在全球苑围内广泛传播开来。后来的研究发现，ＩＡＰＶ并非引发ＣＣＤ的直接原因，蜂群崩溃现象是个复杂的多因素综合作用的一ｔｕｉ’ｉ气因化ＣＣＤ与蜜蜂病害之间的关结果，这推测目前还需更多的实验数据支持系仍有待掲示。做克什米尔病毒ＫＢＶＫＢＶ第一次被成功分离鉴定是于１９７７年，从意大利蜜蜂的侵染试验中发现。不久，［１１１’１３３］原寄主为亚洲蜂ＡＷｓｃｅｒａｗｉ的ＫＢＶ在无东方蜜蜂活动的澳大利亚被发现。现在，ＫＢＶ也已在世界范围内广泛被发现。由于ＫＢＶ与ＡＢＰＶ从基因系统分化上有着极离的ｔｎｗ同源性，这两种病毒无论从血清学还是发病症状都很难辨认看来，只有通过分子片段的鉴定技术才能确认。ＫＢＶ是目前发现侵染能力最强的蜜蜂病毒。但饲喂含ＫＢＶ病一毒营养液的方式并不能感染蜜蜂，说明ＫＢＶ是不经消化道途径这方式传播。研究表＂１２４一＂￡］血淋己＊明，ＫＢＶ的爆发与体壁传播途径有直接关系。另夕ｈ，瓦瞒府ｒｒｏｏ杰■说＞７ｉｗ也能够携带和传播ＫＢＶｆｉ，因此，瓦巧与ＫＢＶ的协同侵害对蜜蜂来说也是极严重。ｕｑＫＢＶ的流行与爆发与蜂群内的蜂满密度紧密相关ｆ。仍黑峰王台病毒的ＣＶｗｔｉＢＣＶ的－Ｑ首次分离鉴定是在１９７７年。该病毒主要危害蜜蜂的３１６日龄时期，常见于春夏时节。发病蛹期，，体色变暗，快速死亡，往往出现王台染成栋黑色因此得名。ｉｉｗｉｉｉ黑蜂王台病广泛存在于全球的各种不同蜜蜂种间ｔ’ｗ，该病毒习惯Ｗ隐性方式存在于蜜蜂体内，传播途径为通过口器传播，当其与蜜蜂微抱子虫协同侵害时，往往能表现１５ ｔｗｉ出极强的致病性。虽然在瓦靖体内能检测到黑蜂王台病毒巧ＱＣＶ），但并不能证明瓦靖的寄生与ＢＱＣＶ的流行有直接联系。１３２．．传播途径一￣（２００００６００００个正常的蜂群拥有庞大数量的蜜蜂个体，，只工蜂），容易导致能通过体表传播的病毒急剧爆发，呈现发病症状。蜜蜂病毒可通过水平方向（平行）和垂直ＰＳｌ（纵向）方向上进行传播。１．３．２．１水平传播（１）虫媒传播蜜蜂病害如今大规模的发生与流行与蜂瞒、抱子虫等的协同侵害有很大关系，给病，毒的大范围转移与快速传播提供了条件，从而传播扩散至全球给全球养蜂业带来了巨大的打击。瓦峨（防成ｓ／ｍｒｆｏｒ）的生活史可分为侵害蜜蜂幼虫阶段的繁殖期（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｈａｓｅ）Ｗ及（ｈｏｒｅｔｉｃｈａｓｅ）。瓦瞒的寄生对蜜ｐ侵袭成蜂阶段的携播期ｐｐ蜂的健康产生危害，同时通过吸食虫体体液的同时能释放其自身携带的病毒，这种方式方ｗ－ｉＷ式同样能使蜜蜂患持。送种蜜蜂病毒和瓦蝴共同侵害蜜蜂后表现出的特殊病症被Ｕ４３称作蜜蜂寄生瞒综合症（ｂｅｅｐａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）。寄生满对于蜜蜂的恐怖之处在于其病毒微粒在其内部能在短时间内大量复制拷贝，而高浓度的病毒粒子进入蜜蜂体内无猜对蜜蜂个体乃至其整个蜂群健康造成极大威胁。瓦蝴与蜜蜂病毒的联合作用能更ｔＷ严重并更迅速地导致蜂群崩溃。研究结果表明瓦靖可传播多类蜜蜂病毒因此，控制好，防范好蜂群内蜂瞒的数量对维护蜂群整体的健康发展是至关重要的。另主为大蜜蜂命地ｒｆｏＷａｔｏ的小峰满７＞，〇７＆１６Ｗ也能传播蜜蜂病毒外，有报道指出原寄／崎１４７’１４８［］心Ｗ口（ＤＷＶ），与瓦满的危害类似。虽没直接证据表明蜜蜂气管瞒如Ｓｗｏｏ泌可携带和传播某种蜜蜂病毒，但其通过吸取蜜蜂体液的方式对寄主直接产生危害，如若与ｗｆｌ病毒的联合危害，则能导致有寄生横的蜂群出现麻搏病症状。０一消化道传播）食物病毒不仅可Ｗ污染蜂粮蜜，还可能通过内勤蜂清理巢房（粪便或染病幼虫）等方式ｌｗｔｌ侵染蜜蜂。病毒通过上述传播的证据已经储存在巢内的食物和蜜蜂中厥和粪便内的一多种高浓度病毒颗粒的存在。蜜蜂个体之间存在着普遍的互喂行为，这也是最普遍的种病毒水平传播方式，但通过这种方式传播的病毒很少能直接危害到蜂群的正常运行，ｌｌｔｑ特定的诱发因素才是蜜蜂病害发生与爆发的直接原因。（巧体表接触传播ｎｎｌ病毒还可直接通过破损的表皮接触传播感染。尤其在出现盗蜂或者蜂群数量多一，个高效的传播方式。因此时这也为病毒传播提供了，蜂农在生产实践中，大范围的转移蜂箱时，而，蜜蜂个体间的碰撞易使互相感染病毒到达新的花蜜采集地后，也会增。加与当地蜜蜂间的病毒传播，形成交叉感染等１６ １．３．．２２蜜蜂病毒的垂直传播处女王需要多次飞到空中与雄蜂进行飞舞交配，这种多次交配能大大增加蜂王卵巢感染多种病毒的概率，而蜂王感染病毒后，能导致某种或多种病毒在该蜂群的感染与传ｉｆＷ。播雄蜂的精囊和精液中常含有多种高浓度的病毒颗粒，这些带毒精子通过交配侵入胆存于蜂王的储精囊中，供蜂王终生授精使用。同时带毒精子也会感染蜂王的储精囊＾５和卵巢气导致病毒垂直传递于亲代与子代间。蜂王卵巢与未受精的卵内均能检测到病一ｉ５３ｆ３，证实感染病毒的卵巢能传播至虫卵。研毒，送也是种普遍存在的垂直传播方式一ｗ’ｗｉ究表明ＫＢＶ、ＡＢＰＶ、ＤＷＶ、ＳＢＶ、ＢＱＣＶ等多种病奉均可通过这方式在传辄。１．３．３寄主范围ｆｉｓＭｓｓ％ｉ病原体当中多重寄主类占有的比例为６０。多种蜜蜂病毒已被发现可在多种ｓｔｗ’ｉｗＢＰＶ和ＫＢＶ同寄主上寄生，Ａ，如黑蜂王台病毒和崎翅病毒在多个熊蜂种中检出ｆｉＷ样能够侵染数种熊蜂。在美国有研究数据表明常见的几种蜜蜂病毒已分布于１１个非ｆｗｉ一蜜蜂科的膜翅目授粉昆虫中，生活在同环境的不同蜜蜂科也发现其携带黑蜂王台病ｔｉｎｉ毒和崎翅病毒。蜜蜂病毒也吝欢寄生在非蜜蜂科的的膜翅目授粉昆虫当中。通常，小甲虫＾／４如化／？／（妃、大蜡螺说脉／伯／？６化》７６化？、满虫、甚至细苗等都能成为蜜蜂病毒的４７１’１４９’１６２［］寄主，但在这些其他寄主当中的存在与传播被认为只具有单向性。通过分析９种蜜蜂蜂种ＤＮＡ序列的系统发育，大蜜蜂处妃ｒｆｏｗａｔｏ和小蜜蜂冷地ｙＺｏｒｅａ比西方蜜蜂ｉｗｊ■４地ｍｅｉｓ［，＜；巧向和东方蜜蜂如ｃｍｗＭ在进化程度上要似但在长期的进化中，已成一为当地热农业生态系统中不可分割的部分。１．３．４其他致病因子蜜蜂病毒往往需要寄主才能满足自身的生存条件，包括蜜蜂与其他銷翅目昆虫或者一峨虫等身上。在蜜蜂身上通常也都Ｗ隐性感染方式存在，病毒浓度在个比较低的浓度一水平，没有特定因素刺激（如营养不良）是不会大量激增，显示出发病症状，旦免疫ＵＭ’Ｗｌ力低下或者蜂瞒等寄生病害发生时，染病个体通常会短时间内死去。另外，气候也是直接影响蜜蜂健康的因素，，。蜂巢具有保持恒温恒湿的机制在子脾中也区温度基’ＵＭ］本恒定在（３５±０．５）Ｃ。蜜蜂幼虫对发育时的环境温湿度要求非常苛刻，尤其是温ｉＷｆ度，蜂群内蜜蜂数量如果不足够提供幼虫或化蛹发育所需条件，极易死亡。尤其在，外界环境温度不稳定，春秋季，昼夜温差大也会影响弱群的正常发展。幼虫发育期若受低温伤害，，，，往往不能正常羽化出房即使羽化出房其免疫力较低下容易受外界病１Ｍ［］茜侵害。研究证实蜜蜂幼虫在羽化期受低温或高温影响，导致蜜蜂正常生理机理功ｔｗｉ能奈乱，可诱发隐性感染蜜蜂体内病毒浓度激增，寿命也会缩短。此外一，食物营养跟蜜蜂免疫力息息相关。大面积的耕作某种蜜源会使蜜蜂的，单一食物来源单，营养不够全面，往往也会对蜜蜂免疫力产生负面影响蜂农在蜜蜂越冬期前饲喂蜜水要注意营养均衡，可将几种花粉很合于蜜水中饲喂，避免营养失衡造１７ Ｕ７Ｕ成免疫力底下，使疾病易于发生与爆发。１．４蜜蜂病毒病的诊断方法概述近些年来，随着分子检测技术的发展，人们能够精确地检测出蜜蜂体内的病毒种类。一蜜蜂病毒含量水平高低决定着蜂群疾病的发生与否，因此建立个可量化的评价标准对ｆｕｑ蜂产业的健康良好的建设来说意义重大。１４１．．基于发病症状的诊断方法部分蜜蜂病毒能引起明显的病症，形成畴翅ＳＢＶ能，如ＤＷＶ能使羽化功能受损；使幼虫出现船勾状尖头死在巢房内，巢脾形成花子现象，但蜜蜂感染的大部分病毒并不。表现出可观测特异性症状绝大多数蜜蜂对神经系统造成损害，导致蜜蜂行为异常，损，，只能爬行伤或丧失定位、飞行、采集Ｗ及学习能力严重后身体出现震颤，较快死亡一等现象。般，受病毒感染的蜜蜂即使不显出发病症状，但对其生命历期可能存在影响。一若蜂群感染病害的蜜蜂数量不多，在定程度上蜂群仍能维持正常的运营发展，因为患病的蜜蜂可Ｗ被新生的健康蜜蜂代替补偿。但是，若发病程度超过该蜂群可承受的风险阔值范围，则会导致蜂群群势下降，出现蜂群逃离老巢，甚至全部消亡的严重结果。无论在个体或群体水平上蜜蜂病毒病的流行与爆发均同病毒总量增长正相关。、对发病蜜蜂进行观察判断是最快速便捷而廉价的检测方法，但这只限于有明显发ＣＶＳＢＶ一病特点与症状的蜜蜂病毒种类，如ＤＷＶ，ＢＱ和等。蜜蜂麻窺病也是种容易容易观察到的现象，但是发病机制比较复杂，如若想准确判定是哪种病毒凭经验是很难断定的。多种蜜蜂病毒（如ＡＢＰＶ、ＩＡＰＶ、ＣＢＰＶ）均会引起蜜蜂麻窺病症。蜜蜂病毒低于一定浓度是导致蜜蜂不会发病的，所Ｗ在多数情况下仅依靠发病症状来诊断是无法获得准确可信的结论。１４．．２基于病毒形态学的显微检测方法０？绝大多数的蜜蜂病毒在显微镜下观察其生理结构基本上呈直径为２３０ｎｍ的正二千面体颗粒状。因此，只能在电子显微镜（ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下才能直接观测到分离纯化后的蜜蜂病毒颗粒样本。由于病毒粒子基本上都是类似结构与大小的外形，因此该一方法虽能较为精确地测定出蜜蜂病毒的大小、外形和侵染位置，但在电镜下无法进步一区分病毒颗粒的种类。另外，从硬件成本和人工技术复杂等多方面角度考虑，这诊断方法不便用于常规检测。１．４．３基于免疫学的检測方法免疫学检测技术是通过用纯化的病毒原液或病毒蛋白作为抗原注入寄主体内使其产生免疫反应，从而产生特异性抗体，再从寄主体内回收体液进行免疫检测试验。通过酶的催化，病毒样本与非特异性抗体结合成可显像的分子标记然后引入特异性抗体替换与病毒蛋白结合的非特异性抗体，通过显色反应（测定样本吸光值）获得检测结１８ 一果，是。免疫检测这些特异性抗体种低廉的可同时定性和定量的方法。但是分析蜜蜂Ｐ１１一，病毒系统发生树后发现，由于多种蜜蜂病毒间具有高度的基因同源性使得这方法检测的特异性较差，不能得到准确的结果。因此，该法无法用于蜜蜂病毒病的诊断。１．４．４基于核酸序列的检测方法一一组基因编码组成的核酸序列，因此地球上所有生命都有自己的唯，利用核酸序列的差异性能够准确地鉴定不同的生物种类，包括用于蜜蜂病毒病的鉴定。目前，利用人工合成的基因小片段的蜜蜂病毒基因互补序列，使互补序列和模版相互结合，形成稳定的双链结构，从而能够实现对蜜蜂病毒样本的快速而精确地定性和定量检测。目前运用最广泛的鉴定方法是反转录聚合酶链式反应技术（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏ—ＲＮＡ的ＤＮＡｐｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｗ下简称ＲＴＰＣＲ）。其诊断原理在于依赖聚合酶（ｒＴａｑ酶）的作用下，Ｗ蜜蜂病毒的ＲＮＡ分子为模板进行逆转录（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ），合成互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）。在反应湿度达到揭开双链的情况下，在ＤＮＡ聚合酶的作用下一，脱氧核巧酸引物与ＤＮＡ的另条链配对结合，拷贝数随每个循环倍３５ＰＣＲＲＴ－ＰＣ民增，通常进行个循环次数技术的优点在于能够检，该过程成为循环。测出极低浓度的ＲＮＡ样本，具有极高的灵敏性。近年来，随着ＰＣＲ技术的快速发展，ＰＣＲ（ｕａｎｔｔａｔｖｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｔｏｎＰＣＲ新的核酸检测技术不断涌现，如定里逆转录ｑｉｉｉｐｉ，－重ＰＣ民ｏｒＲＴＰＣＲ）可对样本中ＲＮＡ病毒浓度进行准确地定量（ｍ山ｔｉｌｅｘＰｑ；多ｐＣＲ）可进行多种病毒种类检测与鉴定。ＰＣＲ检测技术具有应用广泛、简单、快速、廉价和精确和结果样本好保存等优点，已成为蜜蜂病毒病检测的首选方法。因此，现代分子生物学的发展极大地推进了蜜蜂病毒学的硏究。１５．蜜蜂病毒病的相关研究进展方向与发展趋势虽然自然生态环境的破坏是导致授粉昆虫消亡的主要原因，但蜜蜂病敌害的广泛流行将是当前对全球养蜂业的最大威胁与挑战。西方蜜蜂种群下降的首要因素现己被公确认为蜂蝴综合症，瓦蛾这种传播途径已使蜜蜂病毒在全球各地传播开来。虽然近十几年来蜜蜂病毒学的相关研究发展很迅速，但在病毒发病机制、寄主免疫学Ｗ及流行病学等方面依然缺乏足够的掌捏。鉴于蜜蜂病毒病的流行范围广，因此，单打独斗的研究、控制相关病害的发展与传，播流行显得不切实际，从而建立世界范围内的各地区共同合作Ｗ期解决授粉昆虫的消亡问题。如欧盟于２００８年成立的ＣＯＬＯＳＳ（Ｈｏｎ巧ＢｅｅＣｏｌｏｎｙＬｏｓｓ化Ｓ）组织，联合５２个国家共２口个成员单位，涵盖从科研机构的科学家、私营蜂场的蜜蜂饲养员到大型蜂业公司的技术员，共同致力于从蜜蜂个体和群体水平解释蜜蜂种群下降的原因。中国农业部也建成了蜜蜂产业科技服务体系，，串联行业专家联合各地蜜蜂机构（科研、政府一管理部口、企业公司和线蜂农），由点到面全方位调整我国蜜蜂产业结构，Ｗ期解决历史遗留问题，。健全蜜蜂疾病监测预报体系，实现从养蜂大国到养蜂强国的转变该体１９ 系同时积极参与国际合作，并加强基础研究，ｗ求在蜜蜂科学的热点领域做出贡献。一蜜蜂病毒病是种应激类的疾病，，具有在不稳定环境下易诱发致病的特性。所Ｗ当前具有挑战性的一个工作就是揭示清楚病毒与环境当中各种诱因二者间是如何相互一作用。另个重要工作是综合考虑好蜂群环境各因素是如何协同作用，即便这项工作复杂、量大，但如能揭示如群势强弱、寄生虫情况、饲料和蜜蜂病毒含量浓度等这些因素一对蜜蜂健康的影响机制，对蜜蜂送模式生物的病害防控将会产生深远影响，对其他昆虫的病害防治也将产生积极参考意义。在分子生物学相关研究进展上，已经开始了ＲＮＡｉ对蜜蜂病毒干扰抑制的研究。在实际田间养蜂生产领域，蜜蜂病毒病的快速诊断相关的实用检测工具也已经开发完成，进入到商品化生产当中。２０ ２引言一，也是社会虫群中授粉昆虫的主力军蜜蜂是种真社会性昆虫，全球１巧的蜜源植物都是由蜜蜂来完成授紛工作。蜜蜂除了可对人类提供蜂产品外，还对维护自然生态系统的稳定和保持农业生态系统的增产效应发挥着不巧估量的作用一。中国作为世界第养蜂大国，养蜂业的健康发展不仅能提供大量优质的蜂产品造福于人类，蜜蜂作为最主要的一授粉昆虫，更能提升农业产量，样从而保证我国的粮食安全。和其他动物，蜜蜂在给人类带来效益的同时，自身成长发育过程中的各阶段都会不同程度地受到各种内在与外、在的不利因素，如寄生瞒病毒、真菌、细苗和其他天敌的危害等。近年来蜜蜂病毒病在世界范围内的广泛传播与发生一，是导致世界蜂群数量持续下降的个重要原因。由此引起的授粉昆虫减少一，授粉活动缺失而带来的系列对整个自然生态的负面影响进而引发了世界范围内的蜂农和学者的关注，授粉昆虫的持续减少对整个狂会，乃至自然生态一都是严唆的问题，如何解决好这问题显得极为重要。在蜜蜂病害方面有研究表明，ＲＮＡ病毒病是引起蜜蜂蜂群崩溃、数量大量减少的主要原因之一。其中，７；蜜ｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｓｖｉｒｕｓ最常见的种蜜蜂病毒为蜂残翅病毒（ｄｇ，ＤＷＶ），蜜蜂黑王台病毒（ｂｌａｃｋｑｕｅｅｎｃｅｌｌｖｉｍｓ，ＢＱＣＶ），蜜蜂奏状幼虫病毒（ｓａｃｂｒｏｏｄｖｉｒｕｓ犯ＶＫａｓｈｍｉｒｂｅｅｖｉｒｕｓＫＢＶ）（ａｃｕｔｅｅｅ，），克什米尔病毒（，蜜蜂急性麻蒋病毒ｂ，ａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓＡＢＰＶ）（ｃｈｒｏｎｉｃｂｅｅａｒａｌｓｉｓｖｉｍｓＣＢＰＶ）和ｐｙ，蜜蜂慢性麻演病毒，色列，ｐｙＷ急性麻瘍病毒（ＩｓｒａｅｌｉａｃｕｔｅａｒａｌｓｉｓｖｉｍｓＬＡＰＶ。ｐｙ，）蜜蜂病毒长期并广泛地Ｗ无明显发病症状的低浓度隐性感染方式存在于蜜蜂蜂群，中但多数蜜蜂病毒在特定环境条件下可被激活，随后开始在寄主体细胞内的快速复制，表现出强烈的致病性。引发致死性蜜蜂病毒病的流行与爆发蜜蜂病毒病相关知识的缺乏，化及复杂的蜜蜂病害签定技术使得蜜蜂病毒病难Ｗ得到及时确诊与防治，每年在养蜂生产上造成的巨大损失已严重阻碍了我国养蜂业的可持续健康发展。本试验采取安徽各地区样品，利用了蜜蜂病毒病分子学诊断方法，调査本省蜜蜂病，ＤＷＶ对害发生情况并进行了蜜蜂侵染相关的研究，该结果与结论能直接服务于养蜂科学，具有现实应用与研究意义。２．１研究目的意义１．调查安徽省中华蜜蜂和意大利蜜蜂的病毒病发生流行情况；２，．为发展蜂产业相关人员提供参考结果将直接服务于安徽养蜂业；３一．蜜蜂幼虫离体培养体系建立，对后续的相关蜜蜂病毒的进步研究具有重要意义。２．２研究主要内容１．ＲＮＡ保存液在不同保存时间下的保存效果研究；２２－１３８ＰＣ民．本试验Ｗ个乡镇的个蜂场的成年蜂为样品，利用ＲＴ进行快速病原学鉴定，２１ 统计阳性发生率，分析感染情况；３．对阳性样品进行核酸序列测定，验证是否为该种病毒病；４．进行蜜蜂幼虫的体外人工培养，建立蜜蜂幼虫人工培养体系；５．对蜜蜂幼虫进行ＤＷＶ侵染；６．对人工培养幼虫和人工饲喂病毒侵染幼虫进行部分生理、形态测定与分析。２２ ３材料和方法３．１试验材料’３．１．１研究ＲＮＡ保存液在巧Ｃ下的不同保存天数下的保存效果ＲＮＡ病毒在寄主死亡后极容易降解，因此，大范围的调査采样都样品的ＲＮＡ保存，有着特殊的要求《件。然而采样工作往往因为工作量大，路途遥远，给试验所造成的影响也很严重，因此，本试验中，为了使对病毒病的抽样调査工作能够顺利进行，前期ＲＮＡ’做了关于保存液在２５Ｃ下的不同保存天数下的保存效果的预试验，通过比较ＲＮＡ’ｐｒｏｔｅｃｔｏｒｌｉｑｕｉｄ（Ｔａｋａｒａ公司）在２５Ｃ自然环境下对蜜蜂ＲＮＡ的降解的时效情况，为全省采样工作的保存提供依据。本预试验采集了两管蜜媛样本，毎管３０只，将其全部浸入ＲＮＡ保存液中，放置于‘２５Ｃ室温环境下，在Ｉｄ，３ｄ，４ｄ，５ｄ后每天分别随机取５只样品进行ｔｏｔａｌＲＮＡ提，检测０Ｄ值和浓度。结果见表１。３１２．．供试材料试验采用的中华蜜蜂和意大利蜜蜂样品均由安徽省农业委员会畜牧推广总站的工作人员联系省内各地大型蜂场及蜂场合作社的负责人员，由当地蜂场王作人员负责采一样，采样所需工具（采样说明、装有ＲＮＡ保存液的５０ｍＬ去酶离也管、镜子、次性手奢等）提前邮寄至采集人员。每个蜂场分别随机选取意大利蜜蜂或中华蜜蜂蜂群中各３０只成年蜂。具体采集点见图１。采集蜂的取样；用録子捕捉在蜂箱的巢口口前爬行的蜜蜂，将其放入ＲＮＡ保存液３０只成年蜂一中，在采集完成后的第，分别从每群中采集时间寄回至安徽农业大学蜂’业研究所－８０，收到后放在Ｃ超低温冰箱中保存、备用。３．１３．幼虫病毒侵染试验材料蜜蜂幼虫和蜂王浆Ｄ－（采购自安徽农业大学蜂业研究所蜂场）、无菌水、果糖、葡萄糖、酵母提取物、４８孔培养板、滤纸、ＤＥＰＣ处理水、灭菌剪刀、医用宽口摄、恒温恒湿培养箱、只含有ＤＷＶ的ｔｏｔａｌＲＮＡ溶液、微型测量系统。２３ ＡＬｏ就吊風！ｓｓｍｅ－、〇Ａｐｔｈｔ＾ｍＳｌ么韦與蜜蜂－ｅｒａｎａ／ｃＶ｜ＡＡｐｈｃｈａ〇ｈ？／ｆ＾篇＼作Ａ＼〇〇３ｖｎｒｊＨｕａｆｉ綠船ｙｊ＼ｇ图１安徴地区蜜蜂病毒病采样点分布圍－化ｒｏｎｅｅｅＦｗｅｉＵｖｒｉｇｕｒｅ．１ＴｙｏｎｅｓａｍｐｌｉｎｇｓｉｓｆｏｈｉｕｓｅｓａｓｅｄｎＡｎｈｒｏｖｎｃｅ．ｙｂｄｉｇｎｏｉ山Ｐｉ２４ ３１４－，试剂ｗ及主要试剂的配置ＳａｍｐｌｅＰｒｏｔｅｃｔｏｒｆｏｒＲＮＡ／ＤＮＡ，ＴａＫａＲａ宝生物公司ＲＮＡｉｓｏＰｈｉｓ，ＴａＫａＲａ宝生物公司？ＰｒｉｉｍｅＳｃｒｉｔＲＴｒｅｅｎｔＫｔＴａＫａＲａ宝生物公司ｐｇ，？ＴａＫａＲａＴａｑ，ＴａＫａＲａ宝生物公司？？ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴｉｌＲＮａｓｅＨｐｌｕｓ），ＴａＫａＲａ宝生物公司ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＵ０００，ＴａＫａＲａ宝生物公司ＴｒａｎｓＤＮＡＭａｒｋｅｒＩ，北京全式金生物技术有限公司ＧｏｌｄＶｉｅｗ，上海赛百盛基因技术有限公司艺二胺四艺酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司娜酸，国药集团化学试剂有限公司，分析纯Ｔｒｉｓｂ化ｅ，ＷＧＭＡＲｅｕａｒ－ＡａｒｏｓｅＧ１０Ｂ防ＷＥＳＴｇｌｇ，－超纯水，电阻率达到１８．２兆欧，符合国家实验室用水规格（ＧＢ６６８２９２）无水艺醇，分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司ＤＥＰＣ水，上海生物生工工程有限公司氯仿，国，分析纯药集团化学试剂有限公司异丙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司５ＸＴＢＥ的配制（保存液）：准确称量５４ｇＴｒｉｓｂａ化、２７．５ｇ棚酸、２０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，，定容至ｌＯＯＯｍＬ。用超纯水溶解，高压灭菌０．５ＸＴＢＥ的配置（工作液）：用量筒准确量取ｌＯＯｍＬ的５ＸＴＢＥ，加入超纯水定容至ｌＯＯＯｍＬ。’０．１％ＤＥＰＣ处理水：取ＩｍＬＤＥＰＣ溶于ｌＯＯＯｍＬ超纯水中，３７Ｃ下，髙压灭茵１２ｈ，４．Ｃ保存。八％艺＾ｍＬ，２５ｍＬ，。醇，无水乙醇加入超纯水将其混合均匀３１．．５仪器设备８－密理博超纯水制备系统．２Ｍｉｍ；电阻率达到１兆欧，Ｑ，美国电子天平；ＦＡ２２０４，上海市安亭电子仪器厂－０精密鼓风恒温干燥箱：ＤＧＴＧ２５，合肥华德利科学器材有限公司－立式压力蒸汽灭菌器－－０１－：ＹＸＬＳ５０ＳＩＩ００上海博讯实业有限公司医疗设备厂Ｑ，－８６Ｖ３％超低湿冰箱，安徽中科都菱商用电器股份有限公司；ＭＤＦ－－：ＳＷＣＪ１Ｄ净化设备有限公司单人净化工作台，苏州２５ ２４Ｒ低湿高速冷冻离也机：５４ｅｅｎｄｏｒｆ公，德国ｐｐ司一－电泳仪电源：ＤＹＹ６Ｃ，北京市六仪器厂一ＣＰ－３１ＣＮ电泳化ＤＹ，北京市六仪器厂ＰＣＲ化ＴＣ－９６／Ｇ／ＨＣ似，杭州博日科技有限公司防－３８０凝胶图像分析系统；，上海培清科技有限公司Ｐ２Ｐ１０Ｐ２０Ｐ１００Ｐ２００Ｐ１０００，Ｇｉｌ移液枪；、、、、、ｓｏｎ公司分光光度计：ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００，Ｔｈｅｒｍｏ公司ＤａｒｔｈＣａｒｔｅｒＨＷＳ－Ｐ，恒湿恒湿培养箱：系列合祀华德利科学器材有限公司３．２实验方法３．２．１ｔｏｔａｌＲＮＡ的提取’（１）将研体、研磨棒、剪刀、钥匙用锡猶包好，然后放入烘箱中１８０Ｃ烘５、镇子ｈ。将烘好的实验用具冷却。（２）将１０只蜜蜂全身（置于液氮中保存的）放入研体中，加入适量液氮，研磨，反复几次直至蜜蜂头部被完全研磨成粉末，将粉末用钥匙转移至５０ｍＬ的离也管（去ＲＮＡ酶）中，加入ｌＯｍＬ的ＲＮＡｉｓｏＰ山Ｓ（本实验每次都是用１０只蜜蜂，加入ｌＯｍＬ的ＲＮＡｉｓｏＰｈｉｓ），然后上下颠覆１０下，进行摇匀。（３）５ｍｉｎ全分离。样品静置，Ｗ使核酸与蛋白质完‘（４）１２０００ｇ４Ｃ离也５ｍｉｎ，然后取５ｍＬ上清液转移至新的离也管中，并在离也１００，５ｍ管中加入阵氯化将其上下颠倒振荡，使其混匀室温静置虹。’（５Ｍ２０００ｇ４Ｃ离也１５ｍｉｎ。样品分层，这时ＲＮＡ主要存在于上层水相中，取２ｍＬ上清液于新的离也管中，然后加入２ｍＬ的异丙醇，将其混匀后，室温静置ｌＯｍｉｎ。’（６）１２０００４Ｃ离也ｌＯｍｉｎ。管壁和管底出现了淡红色的沉淀（若没有出现沉淀，ｇ则需要重新提取ＲＮＡ），弃上清液，然后加入ｌＯｍＬ的７５％乙醇洗涂沉淀。’（７）１２０００ｇ４Ｃ离也５ｍｉｎ。弃上清液，室温干燥沉淀，干燥后加入３００＾的ＤＥＰＣ叫水，用移液枪反复吹打，使沉淀完全溶解。（８）用分光光度计测定提取的ｔｏａｔａｌＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ下的吸光度值（ＯＤ）－，０〇〇〇１．８２１，ＲＮＡ（１８值若２６〇／２８〇的值在．范围内则该样品符合要求若低于．则ＲＮＡ中有蛋白质污染，若高于２．１则ＲＮＡ出现降解现象），同时测定ＲＮＡ样品的浓度，并记录。’－Ｃ（９）将提取到的ＲＮＡ样品收好，保存在８０超低温冰箱中，备用。３．２．２引物设计本试验中所应用的７种病毒引物均参照其他文献所给出的序列设计，由生工生物工程有限公司合成引物１。。引物序列的详细内容见表２６ ．ｒ？。＿？？７７／苗口ａ７７７ｓ口２口。ｏ；；呂ａＯａ々；；ａ；占ＳＳＯａＳ０＂罢岂ＳＯＯ０ＯＯ．６三Ｐ？Ｊ農巧Ｎ？ＮＺＮｎ污归一Ｊ皂ＯＯ§Ｂ夏ｑ§万之Ｚ２扫方Ｓ５５ｃｏ；》ＷＭＭＺ《Ｍ？Ｘ聖ｐＰｐＯｐＰ己２００Ｘ００Ｚ０Ｚ閣进口运／９ｐ９Ｌ９ｐ９Ｌ９Ｌ．泛穿？二《ＭＷ？？ｐｐＰＰＰｐＰ為ｓｏＯ９００９１ｃ窝ｅ巧Ｅ勇巧￡Ｓ￡Ｓ？务ＳＳｅｖ巧ｃ致名０巧ｗ？Ｍ《ｍｗＣＪ垫ｐＰｐＰＰｐＰ３己００ｏ〇ｏ々ｏＮ々，Ｓ居输巧６￡Ｓ￡６ｔ：６￡Ｓ￡６￡６Ｐ艮口崇蛾００ｍ。均豁ｏｙ－ｃ０００听咕ｏ汝ｏ《為《爲装（巧ｃ＾ｏ繫ｕ占ＣＳＡＵＷｃ．耶ＩｏＯｃＪ巧６ａ？ｗ？ＭｗＭ忘ｄｐＰｐＰＰｙＰ巧ｌｎ０ｏ０〇ｏｏ３俄ｑ々寸寸ｗ化Ｕ占ａ６￡Ｓｅ６￡Ｓ￡Ｓｅ６Ｓ运曲睽左Ｌ巧ｓＺｐ古Ｕ巧巧ｕｕ挥ｕ｜ｃ＆ｕｎ（ｄ靴ｃｑｇ复）摆９一巧冷法０意累９々０菱累一巨粗一Ｓｊ屯ｄ７０？一芭ｕｕ胀ｄｗａｖＯ￡ＶＵ｝ｕ．Ｕ０ＩａｕＤ０＜＜ＶＩＨ０１ｖＵＵＤｖｖｖＵＤＵ１ｏ３ＵＤ０＜ＬａＨｌＵ１立０ｏｕ＜ｖａ１１ｗＵ１ＤＵ田１ＵＤ９ｌＯＶＵＸＶｖｖ＜Ｄｖｕ１＜ｌｌＱ１１ＨａＶ１ｖｌＵＵｕＨ０ＤＶｌＤＤｖ３ｗＷＶｏＵＵｖＯＨｕ１ＵＤ１＜＜ｌＶｕＤＯＵｋ〕Ｏ：ｌｗＬｗ０＞Ｖ肚ＤＤＷｖ１奪１ｏＤ１ｌＤＬｏ＜３ＤＵ巨ａ９ｕＤｏＯ１Ｄ志ＶＤｌｏ３Ｉ丢ＤｖＶＤＤＶＤ＜ＤｉＶｕＶＤｖＵＤｗ＜ＵｌＷＤＶＶｌｌＶｖＯＶＤＵＶｌ１ｘＶＤＵＵＯ３ｖｕＷＯｏＯＤｏＸ＜ｕｌ０Ｖｕ＜ＤＤＣ．ａＶＵｌＶ３ｖＨ１ｌＤＬＬＤ０ＤｗＵｏ０ＶＤＶＬＯＪ０＜０ｌＯＬ口Ｊｘ１＜ａＬｕＶＯｌ＜ＷＡ＞＞Ａ＞＞舰２＞ｕｄ！ＡＶ畜ｓ据Ａａ受３＜受ｌｖ香 ３２．３ｃＤＮＡ．的合成根据各样品测得ｔｏｔａｌＲＮＡ的浓度，将各个ｔｏｔａｌＲＮＡ进行稀释处理，为满足试剂说明书中试验条件要求，使其浓度低于５００ｎｇ／ｉＬ。２ＲＴ（＾按照表所列的组份配置反应液反应液配置在冰上进行）。表２．反转录反应体系Ｔａｂｅ．ｅｒｅｖｅ巧ｅｔｒａｎｓｃｒｔｎｌ１Ｔｈｉｐｉｏｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ试剂使用量最终浓度ＲｅａｇｅｎｔＵｓａｇｅａｍｏｕｎｔＦｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ５ＸＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔ？ＢｕｆｉｆｅｒｆｏｒＲｅａｌＴｉｍｅ２ＩＸｐ（）阵ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔ？ＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘ１０．５ｐｊｉＬＯｌｉｏｄＴＰｒｉｍｅｒ５０ｉｍｏｌ／Ｌ化５２ｍｏｇｆ）片Ｌ５ｐｌＲａｎｄｏｍ．６ｍｅｒｓ（１００ｉｍｏｌ／Ｌ０５５０ｍｏｌ＞）ｐＴｏｔａｌＲＮＡＲＮａｓｅＦｒｅｅ瓶２〇Ｕｐｔｏ１０（ｉＬ°‘反转录反应条件：３７Ｃ１５ｍｉｎ（反转录反应）８５Ｃ５ｓｅｃ（）。；反转录酶的失活反应‘ｃＤＮＡ－２０Ｃ保存备用将得到的样品放入。３．２．４ＰＣＲ扩増（１）ＰＣＲ反应体系（１０阵）：终浓度１０阵Ｗａｔｅｒ４．６４６阵１０ＸｂｕｆｅｒＩＸ１．０阵ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）０．２５ｍＭ１．０｜ｉＬ２＋Ｍｇ２５ｍＭ１．８ｍＭ０．７２ｘＬ（）ｆＴａ５Ｕ／ｕＬ０．７５Ｕ０．１ｑ（）阵ＰｒｉｍｅｒｘＭ／ｕＬ０．２７Ｌ２〇Ｌｆ｜口）ＤＮＡ１．３（２）ＰＣＲ扩増条件：’９４Ｃ预变性５ｍｉｎ’９４Ｃ变性５０ｓｅｃ＊°‘５８Ｃ＾５Ｃ退火５５ｓｅｃ３０／３５个循环＾’Ｊ７２Ｃ延伸１ｍｉｎ’７２Ｃ延伸５ｍｉｎ＊退火温度根据不同的引物的退火温度来设定，详细请参照表１。２８ ３．２．５琼脂糖凝胶电泳一角缓慢倒入，先将琼脂糖凝胶液从板子，Ｗ防胶内产生气泡胶灌完后再次调节水平化待胶凝聚约３０ｍｉｎ。将１咕的ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ与５ｎＬＰＣＲ产物混合，加样入已固化做好的琼脂糖凝胶的加样孔中，在加样孔中加入Ｍａｒｋｅｒ，将０．５ＸＴＢＥ电泳缓冲液加满电８０Ｖ，然后将已加样的琼脂糖凝胶放入槽肉，设定电压时间４０ｍｉｎ，开始准备电泳。泳槽，一一（注，：整套电泳设备，包括玻璃板电泳槽，电泳仪，梳子等均购自北京六仪器厂）。具体操作程序；（１）用１ＸＴＢＥ缓冲液配制１．５％的琼脂糖溶液（每１ＯＯｍＬ的１ＸＴＢＥ缓冲液加琼脂糖１．５），于微波炉中加热至沸腾，打开微波炉稍微振荡几下，，ｇ避免产生气泡Ｗ便使琼脂糖完全充分溶解。其中，每ｌＯＯｍＬ琼脂糖溶液加７．５ｕＬＧｏｌｄＶｉｅｗｅｒ。室温下冷却２０ｍｍ后倒胶，让琼脂糖溶液凝固３０ｍｉｎ。Ｕ）按５阵ＰＣＲ反应液与１咕ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ混匀于无菌封口膜上，然后吸取６阵一的该样液加入己固化的胶中，第道加Ｍａｒｋｅｒ，第二道空白对照，第Ｈ道开始按序加样液。（３）ＤＮＡＭａｒｋｅｒ５３，提前拿出冰箱，静置ｍｍ后摇匀并离也ｓｅｃ。一－（４）５ｌＯＶ／ｃｍ－电压设置按标准进行电泳。电压不可太高，８０Ｖ９０Ｖ般，电泳时间设为４０ｍｍ左右。（５）电泳完毕使用凝胶成像系统照相，于紫外灯下观察有无目标条带。（６）有目标条带的话，调节光圈化及曝光时间，即可得到清晰、背景亮度较低的成像；拍照及送样品至公司测序一，１＾＾进步确定所检测的蜜蜂病毒。３６ＰＣ民．２．产物基因序列测定与分析将检测到亮带的ＰＣＲ扩增产物直接寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；利用ＮＣＢＩ中Ｂｌａｓｔ软件将各种病毒的测序结果同ＧｅｎＢａｎｋ中已发表序列进行同源性比对。３．２．７获得幼虫，置入蜂群中产卵将蜂王囚入有空脾的限王产卵器中，Ｈ日后可賠化获得１日龄幼虫。３．２．８试验分組及词料粮食配制从产有１日龄的巢脾中随机移取２４０只工蜂幼虫，分别置于４８孔细胞培养板中，随机分成５组，每组４８只幼虫，对照组为２组，处理组为３组。对照组饲喂营养液，３Ｏ营养液具体配方见表处理组的基础饲粮中每ｌ１００＾；向ｇ营养液中添加叫含有ＤＷＶ的ｔｏｔａｌＲＮＡ溶液（浓度含量４２２ｎｇ仙Ｌ），配制成ＤＷＶ水平为４２２ｍｇ／Ｌ的试验营养’４液，对处理组进行饲喂处理。配置好的营养液至于Ｃ下保存。每天添加营养液前，放‘’在３５Ｃ的培养箱内预热１５ｍｉｎ，设置培养箱湿度为％Ｃ，湿度为９５％，幼虫６日龄后２９ 准备化蛹，在７日龄时停止对其添加营养液，将待化蛹的大幼虫转移至塾有滤纸的新的’培养板中，化蛹阶段将培养箱温度设为３４Ｃ，湿度设为７０％，直至蜜蜂全部羽化。做好观察记录。将培养板放入含有有１５．５％的甘油的保鲜盒中，目的是避免营养液中水分挥发而使幼虫失水，造成对幼虫的损害。表３．饲粮营养液配方Ｔａｂｌｅ３．Ｄｉｅｔｆｏｎｎｕｌａ孤ｄｃｏｍｐｏｓ出０凸ｆｏｒｈｏｎｅｙｂｅｅｌａｒｖａｅ龄〇ＩＤ２Ｄ３Ｄ４Ｄ５Ｄ６Ａｇｅｌｄａｙｓ葡萄糖６ａＧ山ｃｏｓｅ脖母ＩｇＬｌＯＯ＾ｉＬ２００阵２００阵１００啡１００｜ｉ巧ｇＲｏｙａｌｅｌｌｙｊ去菌水５０ｇＤｅｉｏｎｉｚｅｄｗａｔｅｒＤ－果籍６°狂Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ３．２．９移虫考虑到幼虫容易受伤和对环境条件的极其敏感性，移虫是在人工离体培养蜜蜂幼虫一操作中最关键的步。首先，培养板）、营养液（包括配好ＤＷＶ，将移虫工具（移虫针’的营养液）化及保鲜盒放入培养箱，设置３５Ｃ，预热３０ｍｉｎ，预热的目的是因为幼虫的敏感脆弱性、，避免环境因素对其造成刺激伤害。移虫过程要小也，技术要熟练迅速，避免伤害到虫体，，移虫工作结束后按组添加营养液与病毒营养液，最后将培养板盖好放有。％甘油的保鲜盒，放入培养箱。３．２１０．添加及更新饲粮观察并拍照，记录每天幼虫的生长发育变化。按照表７每日添加饲料，保证足够的营养供给，盖好培养版放入保鲜盒，置于培养箱中即可。。添加完毕后３２１１．．幼虫化蛹先将滤纸和剪刀用７５％的酒精进行浸泡，至于紫外灯下灭菌消毒２４ｈ，然后倒掉废’弃酒精，将滤纸和剪刀至于烘箱烘干（烘箱设定温度２８Ｃ，Ｉｈ）。在超净台内将滤纸按照４８孔培养板的底部大小栽剪后，用缀子夹取放入培养板底部。用医用塑料粗口镜子将幼虫转移至垫有滤纸的培养板，全部转移完成后盖好放入保鲜盒，置于预先设置好的培’养箱（参数设为７０％的相对湿度，湿度设为３５Ｃ），等待化蛹。３２１２．．化蛹期更换垫纸化蛹期的前Ｈ日，是比较关键的时期。由于前３日幼虫会不断排便，如不及时清理，更换垫纸，就给了细菌滋生的环境条件，从而伤害到化踊的正常进行，损害幼虫健康。转移至新换的垫有滤纸的培养板，具体过程参照４丄２．５。３０ ３．２．１３出房工蜂体重测定Ｐ巧试验、在工蜂出房后，进行体重测定，记录数据；将工蜂固定住，使其头部能自由活动，０％１％３％５％０％３０％用牙签沾取不同浓度的蜜水（．１，，，，１，）饲喂，观察并记录蜜蜂伸吻情况。３．２．１４前翅形态测定将培养出来的成年蜂前翅从翅權基部剪下，置于涂油凡±林的载玻片上，盖上盖玻片，调节好微型测量系统的焦距，背景亮暗度等参数，使其呈现清晰的图像，用微型测量系统测量蜜蜂前翅形态数据。蜜蜂前翅意示意图见图２。留２．蜜蜂前翅图Ｆｉｇｕｒｅ２．Ｉｌｌｕｓｔｎｔｉｏｎｏｆｂｅｅｆｂｒｅｗｉｎｇ测量翅长，肘脉指数是测定反曲肘、翅宽、翅面积Ｗ及肋脉指数这几个数据。其中一Ｗｓｆｊｑ脉，这是蜜蜂形态测定的常用指标Ｗ及鉴定蜂种的个重要指标。具体测定部分＝３４。Ｈ肘室分为ａ、ｂ，肘ｃＯａ／ｂ。见图、图将第两部分脉指数（財肘巧瞬：：．．：＇豐艮＇巧採。ｔ寿二＇ｃ一辦方；图３蜜蜂形态前翅时脉ａ测定图图３．蜜蜂形态前翅时脉ｂ测定图Ｆｒｅ．ｖａｅｎｔｈｒｅｗｉｎｃｕｂ化ｖｅｕｒｅ．ｖａｌｅｎ比ｆｏｒｅｗｎｃｕｂｉｔｎｉｇｕ３ｌｕｅｏｆａｇｏｆｂｅｅｆｏｇｉ１ｉｎａ巧３ｕｏｆａｅｏｂｅｅｆｉａｌｖｅｉｂｇ邑ｇ３２．１．５病毒侵染验证－ＰＣ民３１５ＤＷＶ是否对成功离体培养的幼虫进行ＲＴ检测，检测方法参照．．，验证侵染Ｗ及是否只有ＤＷＶ侵染。３１ ４结果与分析４．１ＲＮＡ保存液保存效果表４．ＲＮＡ保存液在２５Ｃ下的不同保存天数下的保存效果°．ｅｄｓｕｉｄｒｅ２５Ｔａｂｌｅ３ｅｆｏｆＲＮＡｒｏｈｃｔｏｒｌｉｆｏｄｉｆｒｅｎｔｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｄａｓｕｎｄｅｒＣｐｑｐｙ保存天数吸光度浓度（帖／片Ｌ）Ｄｅｐｏｓｉｔｅｄａｙｓ０化《／２８〇Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｊｉｇ／ｊｉＬ）Ｉｄ２．０９１４６６．２（Ａ营）．Ｉｄ）２．０９１４９７５（Ｂ管３ｄ（Ａ管）２．１０１４６７．９７３ｄＢ）２．１２１３６．８（管４ｄＡ２．．０２１７９６２（暂）４ｄ（Ｂ）１．９１１６５３．１管５ｄ．（Ａ）１．７４３８管说５ｄ）１．７０５．（Ｂ營如５结果表明保存的样品ＲＮＡ质量在５ｄ后变得相对较差，浓度也急剧降低，已不符。ＲＮＡ保存液进行全省蜜蜂采样具有可行性合后续试验要求预试验结果表明采用该种，４一在采集完成后日内收集到该样品即可。该试验为蜜蜂病毒检测的采样保存方法提供定的理论依据。４．２ｔｏｔａｌＲＮＡ的检测５表．中华蜜蜂和意大利蜜蜂ＲＮＡ０Ｄ值Ｔａｂ－ｖａｌｅ．ＴｈｅＲＮＡＱｕｅｙｎＡｐｉｓｃｅｒａｃａｃｅｒａｎａ５Ｄｌ＊采样点吸光度值（２６０／２８０）浓度（ｎ／咕）ｇ＊ＳａｍｌｉｎｓｉｔｅＯＤｖ加ｅ（２６０／２８０）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／ｉＬ）ｐｇｊ意大利蜜蜂＊４＾ｍｅ＜＾／／於Ｍ－＂４ＣＺｌ１２９３．４２，０１化１４１０６１．９６ＦＣ－１３４２１２．０２ＦＣ－２１４４２＞＂２－１ＩＪ１２４２２．０３Ｐ－Ｊ２１６６７．ＦＴ－１８６０２３１１．１－２０ＴＣ１１７２０５－Ｌ８７ＴＣ２１拍２．０２ＳＳ－１１６１０－ＳＳ－２１８８１７４２３２ ２０３－．ＭＧ１１６１５－９３－２１４７２ＭＧ１１．９９－ＮＱ１１３巧．１８１ＮＱ－２４１４９２．０４ＴＨ－１１８０２．－１９４ＴＨ２１５１４．－２０１ＬＱ１１２５８ＬＱ－２２．００１８０９ＳＸ－１．９８９９８１ＳＸ－２１？於ｌＯＨ－１ＨＺ２．０２８０１－ＨＳ１２．１０９１０－ＷＨ１２．００１０４３ＹＱ－１１．９１２５９０ＪＸ－１１．９７５８８－Ｊ１．１８６１５６０－ＣＨ１．１９９２１巧中华蜜蜂如ｂｃｅｍ／ｗ－１２．０９１ＷＨ１９５－ＺＹ１２．１５７８８－ＨＳＱ１５７１．８３１２－２ＨＳＱ１．９０９１０－ＨＺ．１１８６８０１－ＣＺ．１２０５１８３４－ＮＧ１１．９２１２５１－ＮＧ２１．９９１４１７－Ｊ１．８９２１１０８－ＪＸ１ｕｎ＾ａ－采样点简写：ＣＺ，池掛：揪阳；ＦＣ，巧昌：ＴＣ，巧城；ＳＳ，宿松：ＭＧ明光；ＮＱ，南谁区；ＴＨ，太巧；ＰＪ，潘集区：ＦＴ，凤台；ＬＱ，瞄泉：ＳＸ，巧溪；ＨＳＱ，黄山区；Ｈ之，街州区；脱，含山；ＷＨ，宪湖县；ＹＱ，桶桥；议，绩溪；Ｊ，沒县；ＮＧ宁国；畑，巢湖，ａ．Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓｏｆｓａｍｐｌｅａｒｅａｓ：ＣＺ，Ｃｈｉｚｈｏｕ；之Ｙ，之ｏｎｇｙａｎｇ；ＦＣ，Ｆ如ｃｈａｎｇ；ＴＣ，Ｔｏｎｇｃｈｅｎｇ；ＳＳ，Ｓｕｓｏｎｇ；ＭＱＭｉｎｇｇｕａｎｇ；ＮＱ，Ｎａｎｑｉａｏｑｕ；ＴＨ，Ｔａｉｈｅ；ＰＪ，Ｐａｎｊｉｑｕ；ＦＴ，Ｆｅｎｇｔａｉ；ＬＱ，Ｕ叫ｕａｎ；ＳＸ，Ｓｕｉｘｉ；ＨＳＱ，Ｈｕａｎｇｓｈａｎｑｕ；ＨＺ，Ｈｕｉｚｈｏ叫ｕ；ＨＳ，Ｈａｎｓｈａｎ；ＷＨ，Ｗｕｈｕｃｏｕｎｔｙ；ＹＱ，Ｙｏｎａｏ？ｎｘｎｎｕｏａｏｈｕ．ｇｑｉ；ＪＸ，巧ｄ；Ｊ，Ｊｉｈ；ＮＧＮｉ；ＣＨ，ＣｈｇｇｇＯＤ－，１８２１，ＲＮＡ所有采集的样品经过值测定后均在．．之间质量均符合后续试验要求。３３ ４．３测序结果分析－ＰＣＲ方法对来自安徽省内２本研究通过ＲＴ１个乡镇中的３８个蜂场蜜蜂样品进行快速病原学检测。最终检测出５种病毒（表６）。通过序列分析比对，所测序列分别与如下登记号匹配率为；ＩＡＰＶ（ＥＵ２２４２７９）９９％，ＣＢＰＶ（ＫＪ４３７４４７）９７％，ＳＱＣＶ（ＧＵ８２巧６２）〇段８％９５／〇ＡＢＰＶ（ＨＱ８９７１６１）９８％，ＤＷＶ（７８３０４）９７，，同源性均超过％％，符合预期结果。４４．样品检测结果在所有的意大利蜜蜂与中华蜜蜂样品中均未检测到ＳＢＶ和ＫＢＶ。在意蜂的２８个样品中，感染率最高的是ＤＷＶ，检出蜂场数占所有蜂场数的比率达到６４％，ＩＡＰＶ为３２％ＣＢＰＶ为３２％，ＡＢＰＶ为１４％ＢＱＣＶ为１１％１０，，；中蜂的个样品中，ＤＷＶ感染８０％ＣＢＰＶ３０％Ｉ０％ＡＢＰＶ为１０％。中率同样最高，，ＡＰＶ为４，蜂样品中未检，为为测到ＢＱＣＶ。试验结果显示此次病毒检测并未亟示出有明显的地理性差异。在意蜂与中４名一ＤＷＶ蜂结果中按感染率高低排名发现，前的病毒感染种类是致的，对应为：，ＩＡＰＶＣＢＰＶ和ＡＢＰＶ。之，。，前在中国尚未有类似报道－６．安敏意蜂与中蜂ＤＷＶＳＣＢＰＶＡＢＰＶＢＱＣＶＫＢＶＡＶＴＰＣ表ＢＶＩＰ７种病毒的ＲＲ检测结果，，，，，，ａｂ－Ｔｌｅ６．ＳｕｒｖｅｙｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒＲＴＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｎＤＷＶＳＢＶＣＢＰＶＡＢＰＶＢＱＣＶＫＢＶａｎｄＩＡＰＶ，，，，，＊虹ｍｅ／／於Ｍｌ４／ａｎｄｖｐｂｃｅａ巧ａｉｎＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ采样ａ点ＤＷＶＳＢＶＣＢＰＶＡＢＰＶＢＱＣＶＫＢＶＩＡＰＶａＳａｍｐｉｍｇｓＵｅ意大刑蜜蜂ＡｐｉｓｍｅＨｉｆｅｍｂＣＺ－＋－－－－１￣－－－ＺＹ＋？＋－１－－－ＦＣ－１＋．－－－ＦＣ－２－－＋－ＰＪ１＋■－－－ＰＪ－２－－ＦＴ－．．．－－１－＋－－ＴＣ１－＋－．ＴＣ２．．－－－－＋ＳＳ－－牛１ＳＳ－２＋－－牛－－＋＋－－－－－－＊ＭＧ１－－ＭＧ－２＋？＋－？３４ Ｎ－＋－＋－－－－ＱＩ－－－－ＮＱ２＋＋－＋ＴＨ－＋－＋＋－－＋１－－－－－ＴＨ－２＋＋Ｌ－＋－－－－－＋Ｑ１ＬＱ－２－－＋－－－－－Ｓ５ＣＩ＋＋＋－－－牛－－ＳＸ２－＋－－－－－－ｈｉＺ－１－－－ＨＳ＋－－＋＋１－－－ＷＨ１＋Ｙ－＋－－＋－－卡Ｑ１－－－－－－ＪＸ１＋＋－１－－牛－－－牛Ｊ－．ＣＨ－．．１ｅ阳性感染率％１８０９４３０１２（）Ｎｕｍｂｅｒｏｆ１４４３。６４０３１１０（）（）（＂（）（）（）（）ｏｓ出ｖｅ％ｐ（）中华蜜蜂令－＋－．．．ＷＨ１ＺＹ－－－－１ＨＳＱ－＋－－＋．－＋１－ＨＳＱ－２＋－＋－－－－－－ＨＺ－＋－＋．１＋－．．．ＣＺ－Ｉ－＋－－－－牛ＮＧ－１－＋－－－－ＮＧ２－＋－－ｊ１－－－－－＋ＪＸ１牛＋ｅ阳性感染率（％）８０３１００４Ｎｕｍｂｅｒｏｆ－８００３０（）（１０００４０）（）（）（）（）（）ｐｏｓｉｔｉｖｅ（％）＊ａ．采样点简写同表４ａ。－ｂ．性＋阳性。，阴：，ｃ．发生流行情况用阳性感染率表示。３５ ＊ａｌ．ＡｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓｏｆｓａｍｐｌｅａｒｅａｓａｓｔｈｅｓａｍｅａｓＴａｂｅ４ａ．ｂ－Ｎｅ．ａｔｉｖｅ＋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ．，ｇ；，ｃ．Ｔｈｅｒｅｖａｌｅｎｃｅｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｔ；ｈｅｅｒｃｅｎｔｏｆ化ｅｏｓｉｔｉｖｅａｉａｒｉｅｓ．ｐｙｐｐｐ４．５ＰＷ试验＇＇Ｓ■ＩＰＴＷＫｍ一－＾＾＊＊＂＊ｊｇ＾ｉ＾補！…ｊ寨■調图５．Ａ．４８孔培养板下培育的６日龄（即将化蛹）大幼虫：Ｂ．将蜜蜂固定住，进行饲喂糖水的巧Ｒ伸吻试验Ｆｕｒｅ５－－ｗｅ．Ａ．６ａｌｒｖｒｕａｔｏｎｎ４８ｌｃｕｌｕｒｅｏａｒｄＢ．ｈｏｎｅｒｅｗｆｏｒＰＥ民：ｅｓｉｇｄａｙｇｅａａｅｆｏｉｉｌｔｂｓｃｅｄｕｐｔｔｐｐ；ｙｂｅｅ分析试验结果显示，对照组对较低浓度（１％，３％）的糖水有较敏感的伸吻反应，而处理组对较低浓度糖水有敏感性（伸吻）的蜜蜂数量比对照组少，猜想可能蜜蜂畴翅病毒对意大利蜜蜂的嗅觉Ｗ及野外采集蜜源能力有影响。４．６致崎对比鸣ｉ—￣＾Ｋ—戰瑜；ＪＲ＼６．图．Ａ．对照姐正常形态翅Ｂ；处理组致畴形态翅，，Ｆｉｇｕｒｅ６．Ａ．ｔｈｅＣＫｓ，ｎｏｒｍａｌｗｉｎｇ；Ｂ．ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ｄｅｆｏｒ扭ｅｄｗｉｎ居３６ ５ＤＷＶ能通过幼虫从图可Ｗ看出，摄取含有病毒饲粮的方式侵染意大利蜜蜂，侵染后的蜜蜂在第２到３日就死亡，对照组的蜜蜂在室内人工饲喂蜜水饲料的情况下，平均能存活７ｄ。结果显示，ＤＷＶ对染病蜜蜂的寿命有显著影响。４７．形态指标测定表７．离体蜜蜂幼虫人工培养样本形态指标测定结果Ｔａｂｌｅ７．ｖａｌｕｅｓｏｆＭｏｒｐｈｍｅｔｒｉｃｉｎｄｅｘｆｏｒ化ｅｈｏｎｅｙｂｅｅｉａｒｖａｅｓｉｎｖｉｔｒｏａｍｌｅ样本编号Ｓｐｉｎｇｎｕｍｂｒｓ形系指禄ｏｒｈｍｅｉ２４５Ｍｔｒｉｃｎｄｅｘ３６ｐ＼。＇胃〇的３２０．８７０１０．９０７２０．８９６９０．９０３１ＬｅｎｇｔｆｅｗＳｇｃｎ．｜（）刖翅宽＊？０．２８７５１０．２９０６０．２８％０．２８７７０．２９６３０．２９０８气．，、Ｗｉｄ化化ｒｅｗｍｇｃｍ（）刖翅ｆｉ、０．１２８５０．１２％０．１２０２０．１３７４０．１３０１０．１３２２Ａ产ｒｅａｗｉｎｃｍｇ（）前翅肘脉ａ０．．．．．Ｌｅｎｇｔｈｆｂｒｅｗｉｎｃｕｂｔａｌｖ．０５％００５巧００４９８００５如００５４４００５６７ｇｉｅｉｎａｃｍ（）前翅肘脉ｂＬ０．．．０２１．．１７１．ｅｎｇｔｈｆｏｒｅｗｉｎｕｂｔａｌｖｅ０１５７００１９６０７００１７４００００１９５ｇｉｉｎｂｃｃｍ（）脉抬数３．７０４４２．８５４９２．６０５５３．１９７３３．２３９８２．９７１８、＾Ａｎｇｌｅｅｘｏｎｅｎｔｐ４－．８ＲＴＰＣＲ法验证ＤＷＶ侵染情况ｗＪ１２３４５６７８ＣＫｌＣＫ２＊区…心」‘图７．处理組和对照組引物扩増条带图谱ｍｅｎ－Ｆｉｕｒｅ７．ＰＣ民ｆｒａｔａｍｉｆｉｅｄｗｉ化ＤＷＶｆｅｅｄｉｎｔｒａｔｍｅｎｔａｎｄｇｇｐｌｇｅＣＫｓ＊３－ＤＷＶ－１１１２．．１０巧道为处理组泳道为对巧沮；＊－３－８－ｉ－ＣＫｔｉｌ．Ｌａｎｅ１０ｍａｒｋｅｄ１ＤＷＶｆｅｅｄｎｉｒｅａｔｍｅｎＬａｎｅ１１１２ｓｗｉｉｈｎｕｔｒｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｏｎ．，ｇｔ；，ｙ从图７可知，通过饲喂含有ＤＷＶ病毒的营养液能成功侵染蜜蜂幼虫，在蜜蜂幼虫期，除了２号蜜蜂没有检测出外，其他样都呈阳性。本结果验证了通过摄取饲料能传ＤＷＶ病毒这一传播方式，且含有ＤＷＶ病毒的饲料极易感染蜜蜂崎翅病毒播。由于成功脑化出房的蜜蜂数量有限，数据还不够充分，但从出房到死亡的天数记录结果来看，染病蜜蜂的寿命明显低于对照组。３７ ５讨论５１．混合感染７３％在所有被检测的地区蜂场中，漏合感染的情况普遍，占比数达到。所检测蜂场〇〇存在２种（３４／〇）、３种（占２０％）甚至４种（占１９／〇）的源合感染情况（表８）。此外，调ＤＷＶ，，查结果还得出：在安徽感染情况十分普遍并易与其他病毒源合感染蜂群其中与ＩＡＰＶ漏合感染最为严重，共有１０个蜂场感染这２种病。表８．安徽地区蜜蜂样品多种蜜蜂病毒混合感染情况Ｔａｂｌｅ８．Ｆｒｅｑｕｅｎ巧ｏｆｓｉｒｍｒｉｔａｎｅｏｕｓｖｉｒｕｓｉｎ色ｃｔｉｏｎｓｉｎＡｎｈｕｉｂｅｅｓａｍｐｌｅｓ．％＝蜂群的感染率（Ｍ２１）感染类型检測到的病毒来源地巧Ｐｅｒｃｅｎａｅｏｆｃｏｏｎ的ｗｔｇｌｉｉｔｈｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（）ＴｙｐｅｏｆｈｆｅｃｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｅｄｖｉｒｕｓｅｓＯｒｉｉｎｓｇＮ＝２！（）单一感染ＷＨｒｃ；；ＤＷＶ１９％Ｄｕａ－ｎｆｅｃｔｏｎｌｉｉＴＣＧＣ；ＤＷＶ＋ＣＢＰＶ巧；之Ｙ；胆１４％二种混合感染ＤＷＶ＋ＢＱＣＶＭＧ５％－＋ｌＤｕａｉｎｆｅｃｔｉｏｎＤＷＶＩＡＰＶＬＱＮＧ１０％；ＣＢＰＶ＋ＩＡＰＶＪ５％总：３４％Ｔｏｔａｌ：３４％ＤＷＶ＋ＢＱＣＶ＋ＩＡＰＶＨＳ５％三种祗合感染ＤＷＶ＋ＡＢＰＶ＋ＩＡＰＶＹＱ５％Ｔｒｅ－ｎｆｅｃｏｎｉｐｌｉｔｉ＋Ｃ＋ＤＷＶＢＰＶＩＡＰＶＪＸＳＸ１０％；总：２０％Ｔｏｔａｌ：２０％ＤＷＶ＋ＡＢＰＶ＋ＢＱＣＳＳ５％四种混爸感染Ｖ＋ＩＡＰＶＴ－＋＋ｅｔｒａｉｎｆｅｃｔｉｏｎＤＷＶＣＢＰＶＡＢＰＶＨＳＱ；ＮＱ；ＴＨ１４％＋ＩＡＰＶ总：巧％Ｔｏｔａｌ：１９％５．２ＤＷＶ一ｗｔｉ１９９１年在日本，蜜蜂崎翅病毒第次成功分离，之后此种病毒在世界范围内迅速传播开来，不论是在中华蜜蜂还是在欧洲蜜蜂中本研究中，我们３８ ＤＷＶ一７３％ＤＷＶ的发现是流行最广泛的种病毒，达到。分析传染途径，我们发现它ｓｓ’ｉ不仅可Ｗ通过瓦满防化如＇Ｍｃ化？ｆ／传播叩还可Ｗ在卵中检测到，通过垂直传播至—ｍ，ｍ］ＤＷＶ下仿，在幼虫食物中也检测到，说明也能通过食物横向传播。因化各种不同的传播方式是导致ＤＷＶ在世界范围内广泛传播的重要原因。５３ＩＡＰＶ．２００６—２００７，ＣＣＤ）年期间蜜蜂崩溃失调症（在美国流行反生并被首次报道，近ｎ７８’ｉ７９］些年蜂群消亡报道在世界其他地方也有发生，其对养蜂业和农业造成了不可忽视的威胁。在ＣＣＤ群落中，有研究发现其与ＩＡＰＶ有很强的相关性。Ｌｉ等研究发现腊化染有ＩＡＰＶ的蜜蜂，在其归巢和采集能力都明显受到弱化影响。本研究结果显示，ＩＡＰＶ在安徽地区是第二高的感染率，并易与其他病毒多重感染存在。５４ＣＢＰＶ．慢性麻森病毒在安徽地区之前尚未见到报道，本研究发现在中华蜜蜂和意大利蜜蜂中发生率分别为３０％和３２％。调査结果比其他地区感染该病毒的发生率要高，如［＂４］［１７３［１８１］９％，１〇％和２．２％。法国和泰国地区的调查在有该病毒的群中检测瓦攒內是否含有ＣＢＰＶ，结果显示瓦靖呈阴化因化瓦靖很可能并不是畑ＰＶ的传播方式。５．５ＡＢＰＶ急性麻蒋病毒在中华蜜蜂和意大利蜜蜂样品中都检测到，但感染率较低，分别为１０％和１４％。Ｂａｉｌｅｙ等研究发现该病毒在成年蜂中隐性感染，但与蜂群后期蜂瞒引起的ｉｎｗｆｉｔｉ大面积死亡可能有直接关系。本研究的较低感染率与丹麦和法国的调查的结果差距较大，它们在其所调查蜂场都达到５８％。Ａｌｌｅｎ和Ｂａｌｌ（１９９６）曾指出，该病毒ｔｗｉ一在欧洲广泛传播，然而，国内的些调查显示在中国其感染率并不高，如吴孟洁等ｗ［］１７４２０［］（１４）调査的１．９％和Ａｉ（２０１２）调查的６％。等５６．ＢＱＣＶＢａｉｌｅｙ等（１９８３）曾报道ＢＱＣＶ与小抱子虫（寄生虫）有密切关系，通过入口感染ｉｎ一的情况完全依赖于小抱子虫的存在ｆｉ。１９％年Ａｌｌｅｎ和Ｂａｌｌ第次报道在亚洲也出现ｆＭｌｔｉＭ’１８１１此种病毒感染，至今，ＢＱＣＶ已在四川、浙江、湖南存在。韩国的调査甚至高［ｗ］达７０．９６％。本研究中，ＢＱＣＶ在意蜂样品地区的零星分布Ｗ及在中蜂样品地区未检测到的结果说明，该病毒在安徽蜂群中处于比较低的感染水平。５．７其他病毒ＫＢＶ和一一ＳＢＶ在本次调查中均未检测到。此结果出乎预料，但与唯的篇曾报道一ＵＭ过安徽蜂群病毒调查情况的结果是ｌ致的，在Ａｉ的调查样品中，成年蜂，踊，幼虫样品均未检测到安徽地区感染有ＫＢＶ和ＳＢＶ。因此，这两种病毒属于在安徽处于威胁水平较低的种类。３９ 结论ＤＷＶ，ＩＡＰＶ，ＣＢＰＶ，ＡＢＰＶ，ＢＱＣＶ在安徽省巧大范围都存在发生流行现象，ＳＢＶ和ＫＢＶ对安徽蜜蜂的潜在危害可能性小。研究结果说明这５种病毒可能在安徽省广泛分布，虽然采集时并未有报告有蜂场有明显的蜜蜂病害问题，５种病毒可能在安徽省广泛分布但此次检测结果说明这。虽然蜜蜂病毒通常寄坐在蜜蜂体内并不会引发疾病症状一，甚至单个蜜蜂体内经常存在不止种蜜蜂病毒，，但还是能潜在影响到蜜蜂的健康与寿命尤其在不确定的自然环境下，通过ＤＷＶ侵染试验，结果显示ＤＷＶ对蜜蜂寿命有明显影响。因此，应引起蜂企和蜂农的重孤采取一定的预防措施。由于目前检测地区样品数量有限，还不能确切说明安徽全一省蜜蜂健康情况，仍需进步进行临床样品的收集与检测。不同种类的蜜蜂病毒在蜜蜂体内的相互影响的动态变化与它们与蜜蜂个体之间的潜在作用等关系仍值得深入研究。幼虫离体人工培养试验中，通过试验，成功获得化踊出房蜜蜂，建立了蜜蜂幼虫人工离体培养体系，为后续的病毒侵染机制研究提供指导和理论基础。试验结果显示：幼虫体外培养的蜜蜂与正常蜂群培育出的蜜蜂在生理指标上并无虽著差异。通过饲喂含有ＤＷＶ的营养液给发育幼虫这一方式，ＤＷＶ能成功侵染蜜蜂幼虫，结果显示：ＤＷＶ能导致蜜蜂羽化异常，出现時翅现象；感染ＤＷＶ病毒的蜜蜂寿命显著低于阴性对照组。后续试验可Ｗ建立在幼虫体外培养体系上，进行病毒的侵染与繁殖机制研究，ＲＮＡｉ蜂低抑制病毒繁殖扩増等等方面的研究。４０ 参考文献１￣．Ｍ．安徽：２００６１５１８．余林生蜜蜂产品安全与标准化生产［安徽科学技术出版社，［］］，２．口，２０１０，刘朋飞，李海燕技术壁垒对我国蜂蜜出影响的实证分化国际贸易问题［］－１１９９１０４．：》棚飞，．，２０１１問，吴杰李海燕等中国农业蜜蜂授粉的经济价值评化中国农业科学，４４２４－：５１１７５１２３．（）［４］徐环李，杨俊伟，孙洁茹．中国野生传粉蜂的研究现状与保护策略．植物保护学报，２００９３６４－：３７１３７６．，（）２０￣內外养蜂政策现状及分析中国蜂业１２５：４３４６．巧李海藏刘伟平国町，，（）ＢｌＡｎｄｒｅａｄｉｓＴＧＭｉｃｒｏ巧ｏｒｉｄｉａｉｎｉｎｓ说ｔｓｅｃｎｅ．Ｉｎ：ＷｉｔｅｒＭｅｉｓｓＬＭｅｄｓＴｈｅ化，Ｗ阀（）ｍｉｉｒｉｄｉｏｉｉｉｉｃｒｏｓｏｒｉｄａａｎｄｍｃｒｏｓｏｓｉｓ．ＡｍｅｒｃａｎＳｏｃｅｔｏｆＭｃｒｏｂｉｏｌｏＰｒｅｓｓｐｐｙｇｙ，９４４７－ＷａｓｈｉｎｔｏｎＤＣ１９９５０１．ｇ，，，ｐｐ１７］Ｇａｎｎ化ｇＥＵ，ＬｏｍＪ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ巧，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ—Ｗ民Ｂａ打民ＴＳｔｚＤＡＯｗＲＬ９９４Ｈｕｍａｎｍｉｉｌ１１６ｅｂｅｒｒｃｈｗａｒｅｎｃｒｏｓｏｒｉｄａ；，ｙ，，。）ｐｉｉＣｌｉＭ－ｎｆｅｃｔｏｎｓｉｌＲ１９８６７４２６４６１．ｎｃｒｏｂｉｏｅｖ：．，，［巧ＢｉｇｌｉａｒｄｉＥ，ＳａｃｃｈｉＬ．Ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ虹ｆｅ冲２００３－１：３７３３７９．，９Ｆｒａｎｚｅｎｌ￣Ｃ．Ｈｏｗｄｏｍｉｃｒｏｓｏｒｉｄｉａｉｎｖａｄｅｃｅｋ？ＦｏｌｉａＰａｒａｓｉｔｏｌ２００５５２：３６４０．ｐ，［］，１０ＺａｎｄｅｒＥ．ＴｉｅｒｉｓｃｈｅＰａｒａｓｉｔｅｎａｌｓＫｒａｎｋｈｅｉｔｓｅｒｒｅｅｒｂｅｉｄｅｒＢｉｅｎｅ．Ｍｉｉｎｃｈｅｎｅｒ［］ｇ－Ｂｉｅｎｅｎｚｅｉｔｕｎ１９０９３１６：１９２０４．ｇ，，［１１］ＦｒｉｅｓＩ，ＦｅｎｇＦ，ｄａＳｉｌｖａＡ，Ｓｌｅｍｅ打ｄａＳ目，Ｐｉｅ打ｉａｚｅｋＮＪ．ｉＶｏｊｅ／ｗａ從ｒａｗ幻ｅｎｓｐ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ，Ｎｏｓｅｍａｔｉｄａｅ），ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｍｉｃｒｏｓｏｒｉｄｉａｎａｒａｓｉ化ｏｆ化ｅＡｓｉａｎｈｏｎｅｂｅｅｃｅｎａｗ幻ＨｍｅｎｏｔｅｒａＡｉｄａｅＥｕｒ（．ｐｐｙｙｐ，ｐ）ＪＰｒｔｓｔｏ－ｏｌ１３２３５６３６５ｉ９９６：．，，ＣｈＹＥｓＪＤＳｍ－口ｅｎｖａｎｔｈＩＢＰｅｔｉｓＪＳ．Ｍｗａｉｓａ１〇雌巧５１ａｎｄ，ｉｅ／ｗｃｅｒａ内０６６１１［］，，口－ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆ化ｅＥｕｒｏｐｅａｎｈｏｎｅｙｂｅｅＴｗｅ／／尸口ｉｎｔｈｅ於）Ｕｎｂ－ｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ．！ＩｎｖｅｒｔｅｒＰａｔｈｏｌ２００８９７：１８６１８８．，，［１３］ＧｉｅｒｓｃｈＴ，ＢｅｒｇＴ，ＧａｌｅａＦ，ＨｏｍｉｔｚｋｙＭ．Ｎｏｓｅｍａｃｅｒａｎａｅｉｎｆｅｃｔｓｈｏｎｅｙｂｅｅｓ｛Ａｐｉｓｔｔｈ—ａｎｄｃｏｎａｍｉＡｕｓｔｌｉａＡｉｄｌｏｉ２００９４０１１７１２３ｗｅ从ｒａｉｎａｅｓｏ打ｅｎｒａ．ｏｅ：．於）ｙｐｇ，，。４］ＨｉｇｅｓＭ，Ｍａｒｔｉｎ民，ＭｅａｎａＡ．ｉＶａｓｅ／ｗ口ｃｅｎａｒ打幻ｅ，泣ｎｅｗｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｎｐａｒａｓｉ１：ｅｉｎｈｏｎ—ｂｅ巧ｉｎＥｕｒｏｅＪＩＰｔｈｌ２００６９２３９５．ｎｖｅｒｔｅｂｒａｏ：９．巧ｐ，，［１引Ｈｕａｎ呂ＷＦ，Ｊｉａｎｇ瓜，ＣｈｅｎＹＷ，ＷａｎｇＣＨ．ＡＭ？此ｗ。ｃｅｒａｗｃｅｉｓｏｌａｔｅｆｒｏｍｔｈｅｈｏｎｌｌＡ－ｅｂｅｅｍｅｉｅｒａｉｄｌ２００７３８３０３７，ｏｏｉｅ：．ｙｆｐｇ，，［１６］ＫｌｅｅＪ，Ｂ巧ａｎａＡＭ，ＧｅｎｅｒｓｃｈＥ，ＧｉｓｄｅｒＳ，ＮａｎｅｔｉＡ，ＴａｍＤＱ，Ｃｈｉ打ｈＴＸ，ＰｕｅｒｔａＦ，民ｕｚ４１ 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［料］ＲｏｅｔｓｃｈｉＡ，ＢｅｒｔｈｏｕｄＨ，Ｋｕｈｎ民，ＩｍｄｏｒｆＡ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｒａｔｅｂａｓｅｄｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ’－化巧３１村１１１６ＰＣＲｏｆＭｅ拍Ｍ０Ｃ０ＣＣＷ化。ｚｕｓｅｃａｕｓａｌａｇｅｎｔｏｆＥｕｒｏｅａｎｆｏｕｌｂｒｏｏｄ，ｉｎ，ｐｅｂｅｅｏ＊－ｈｏｎｃｌｏｎｉｅｓｂｅｆｏｉｅａｎｄａｆｔｅｒａｐｉａｒｙｓａｎｉｔａｔｉｏｎ．Ａｐｉｄｏｌｏｇｉｅ２００８３９：３６２３７１．ｙ，，［４４］ＷｉｌｋｉｎｓＳ，ＢｒｏｗｎＭ，ＡｎｄｒｅｗＡ，ＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎＧＳ．ＴｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｐｅｓｔｓａｎｄＷ－ｄｉｓｅａｓｅｓｉｎＥｎｌａｎｄａｎｄａｌｅｓ．Ｐｅ巧ＭａｎａｇＳｃｉ２００７，６３：１０６２１０６８．ｇ，［４５］ＡｌｅｘａｎｄｅｒＪＭｃＭｅｎａｍｉｎｌａｎｄＥｌｋｅＧｅｎｅｒｓｃｈ．Ｈｏｎｅｙｂｅｅｃｏｌｏｎｙｌｏｓｓｅｓａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－ｖｉｒｕｓｅｓ．ＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅ２０１５８：２２１４３７４５．，，４６ＬｕＹＬｉｏｕＹＨｈｅｎＳＹａｎＹＬ．Ａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃｅｆｅｃｔｓｏｆｈｏ打ｅｂｅｅｍｉｃｒｏ丹ｏｒａ］，；；，；［，Ｃｇ，ｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａａｉｎ巧Ｐａｅｎ化ａｃｉｌｌｕｓｌａｒｖａｅＴｈｅｃａｕｓｅｏｆＡｍｅｒｉｃａｎｆｏｕ化ｒｏｏｄ化ｓｅａｓｅ．ｇ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｎＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＧｌｏｂａｌＣｈａｎｇｅ，ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈ／８ｔｈＪｏｉｎｔＭｅｅｔｉｎｇｏｆＡＦＥＲＰ，ＡＳＲＧＡ，ＰＩＳＥａｎｄＳ巧ＮｅｗＹｏｒｋｊ２０１２．［４７］梁勤，陈大福．蜜蜂保护学［Ｍ］．中国农业出版社，２００９：２１６．［４巧ＢａｉｌｅｙＬ，Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｔｏｎ，ｔｈｅｃａｕｓｅｏｆＥｕｒｏｐｅａｎｆｏｕ化ｒｏｏｄｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｓ（Ａｐｉｓ－ｓ？？ＪＡｌＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９８３５５：６５６９．巧）ｐｐ，，［４９］ＷｈｉｔｅＧＦ（＾９１巧ＴｈｅｃａｕｓｅｏｆＥｕｒｏｐｅ舶ｆｏｕｌｂｒｏｏｄ．ＵＳＤ巧ａｒｔｍｅ打ｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＢｕｒｅａｕｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙＣｉｒｃｕｌａｒＮｏ．１５７．ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．５０ＢａｉｌｅｙＬ．ＴｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｏｎａｎｄｆｕｒｔｈｅｒ［］ｐ＂＂－ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏ打ｓｏｎＢａｃｔｅｒｉｕｍｅｕｒｙｄｉｃｅ？ＪＧｅ打Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９巧，１７：３９４８．ＭＤ＾＾Ｗ５１ＢａｉｌｅｙＬ，Ｃｏｌｌｉｎｓ．ＲｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｔｏｎ（ｈｉｔｅ）ｉｎａｎｅｗ［］ｅｎｕｓＭｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓａｓＭｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｏｎｎｏｍ．ｒｅｖ．ｃｏｍｂ．ｎｏｖ．ＪＡｌＢａｃｔｅｒｉｏｌ，ｇ，ｐ；ｐｐ－１９８２５３２１５２１７．：，２ＣａＪＣｏｌｌｉｎｓＭＤ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｒａｃｌｏｓｅｅｔｉｃｉ，ｆｏｈｙｌｏｇｅｎ口］ｐｒｅａｉｏｎｓｔｗｅｅ打ｅＨ巧ｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｏｎｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅａｅｎｔｏｆＥｕｒｏｅａｎＦｏｕｌｂｒｏｏｄｌｔｈｉｐｂｅＭｐ，ｇｐ－ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｔｈｅｅｎｕｓＥ打ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓＪ１９４４３６５３６７．ＩｎｔＳｓｔＢａｃｔｅｒｉｏｌ９４：．，ｇｙ，，５３ＴｒｕｐｅｒＨＱｄｅＣｌａｒｉＬ．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃｎｏｔｅ：ｅｒｒａｔｕｍａｎｄｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆｆｕｒｔｈｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ［］ｅｐｉｔｈｅｔｓｆｏｒｍｅｄａｓｓｕｓｔａｎｔｉｖｅｓｎｏｕｎｓ）ｉｎａｏｓｉｔｉｏｎ．ＩｎｔＪＳｙｓｔＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９８，４８：６１５．（ｐｐ［５４］ＢａｉｌｅｙＢａｌｌＢＶ－Ｈｏｎｅｙｂｅｅｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１．［５５］ＥｌｋｅＧｅｎｅｒｓｃｈ．Ｈｏｎｅｙｂｅｅｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｃｕｒｒｅｎｔｔｈｒｅａｔｓｔｏｈｏｎｅｙｂｅｅｓａｎｄｂｅｅｋｅｅｐｉｎｇ．Ａ２０－ｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０８７：８７９７．，５婷，冯峰，董秉义中华蜜蜂的欧洲幼虫腐臭病病原硏究化霞虫学报２０００，（ＳＩ）：［巧周－１０４１０８．５７张泉生．中蜂欧洲幼虫腐臭病的诊治内？蜜蜂杂志．１９９００６：１８．［］，４４ ？？５８］伊哥别斯帕勒科，吴延瑜．用链霉素治巧欧洲幼虫腐臭病阴．中国养蜂杂志．［－１９５５０８：２９３０．，Ｃｈ－－５９ｅｎＹＰＳｉｅｄｅＲ：Ｈｏ打ｂ巧ｖｉｍ化Ｓ．ＡｄｖＶｉｒｕｓＲｅｓ２００７７０：３３８０．［，巧，，］６０Ｒｕｎｃｋｅ巧ｅｎｎｉｋｅｎＭＬｌｌＣＥｎｅＪＣＲｕｂＪａｎｅｍＤＡｎｄｉｎｏ民ＤｅＲｉｓｉＪＬ：，，［］，ｇ，ｙＱＧ，Ｔｅｍｐｏｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｏｎｅｙｂｅｅｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｒｅｖｅａｌｓｆｏｕｒｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｒｅｖａｌｅ打ｃｅｏｆｋｎｏｗｎｖｉｒｕｓｅｓＮｏｓｅｍａａｎｄＣｒｉｔｈｉｄｉａ．ｊＰＬｏＳＯＮＥ２０１１６：ｅ２０６％．ｐ，，，，［６。ＬｉＪＬ，ＣｏｍｍａｎＲＳ，Ｅｖａｎｓ瓜，ＰｅｔｉｓＪＳ，Ｚｈａｏ乂ＭｕｒｐｈｙＣ，ＰｅｎＷＪ，ＷｕＪ，Ｈａｍ化ｏｎＭ阻－Ｂｏ打ｃｒｉｓｔｉａｎｉｅｔａｌ：Ｓｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄａｎｄｒｏａａｔｉｏｎｏｆａｌａｎｔａｔｈｏｅｎｉｃｖｉｒｕｓｉｎ，ｙｐｐｇｐｐｇＥｕｒｏｅａｎ－ｈｏｎｅｅｅｓＡｐｉｓｍｅｌ．ｍＢｏ２０１４５ｅ００８９８１３ｐｙｂｌｉｅｒａｉ００８．，，，ｆ［於］ＨａｉｌｓＲＳ，ＢａｌｌＢＶ，ＧｅｎｅｒｓｃｈＥ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｏｆｉｎｓｅｃｔｖｉｒｕｓｅｓ．ＩｎＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄ１：ｈｅＨｏｎ巧Ｂ说？ＥｄｉｔｅｄｂｙＡｕｂｅｒｔＭ，ＢａｌｌＢＶ，ＦｒｉｅｓＩ，ＭｏｒｉｔｚＲＦＡ，ＭｉｌａｎｉＮ，Ｂｅｍａ－ｒｄｉｎｅｌＨＩ．Ｅｕｒｏｐｅ抑Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ；２００８：２５５２７５．［６＾ＡｌｌｅｎＭ，ＢａｌｌＢＶ－Ｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｗｏｒｌｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｖｉｒｕｓ阴．ＢｅｅＷｏｒ－６２ｌｄ．１９９６７７３；１４１１．，（）［６４］ＲｕｎｃｋｅｌＣ，ＦｌｅｎｎｉｋｅｎＭＬＥｎｇｅｌＪＣ，ｅｔａｌ．Ｔｅｍｐｏｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｏｎ巧ｂｅｅｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｒｅｖｅａｌｓｆｏｕｒｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｋｎｏｗｎｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｔｈｄ－ＮｏｉａＪＰＬＯ２０１１６５６６０ｓｅｍａａｎｄｒｉｉ．ｏｓｎｅ．６：．，［］，（）６化２００９０３：巧．［引黄文化ＣＣＤ与蜜蜂病毒有关町中国蜂，（）［６６］ＭａｒｔｉｎＳＪ，ＨｉｇｈｆｉｅｌｄＡＣ，ＢｒｅｔｅｌｌＬｅｔａｌ．Ｇｌｏｂａｌｈｏｎ巧ｂｅｅ乂柏１ｌａｎｄｓｃａｐｅａｌｔｅｒｅｄｂｙ－ａａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅＪＳｃｉｅｎｃｅ２０１２６０８６１３０４１３０６．．３３６：．ｐ［］，（）［６７］ＬＢ，ＧｉｂｂｓＡＪ，Ｗｏｏｄｓ民Ｄ．ＴｗｏＶｉｒｕ化ｓｆｒｏｍＡｄｕｌｔＨｏ打巧Ｂｅｅｓ（却／ｓｗｅ巧抑口－Ｌｉｎｎａｅｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏ１９６３２１：３９０３９５）ｇｙ．．阴，［６８］ＧｏｖａｎＶＡ，ＬｅａｔＮ，ＡｌｌｓｏｐｐＭ，ｅｔａｌ．Ａ打ａｌｙｓｉｓｏｆ也ｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ－ａｃｕｔｅｅｅａｒａｌｓＳ化ｅｎｏｖｅｌｂｉｓｖｉｒｕｓｓｈｏｗｓ化ａｔｔｂｅｌｏｎｓｔｏｒｏｕｏｆｉｎｓｅｃｔｉｎｆｅｃｔｉｎＲＮＡｐｙｇｇｐｇｖ－ｉｒｕｓｅｓＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００２７７２：４５７４６３．［］，（）ｏｘ－Ｆｏｓ６９ＣｔｅｒＤＬ，ＣｏｎｌａｎＳ，ＨｏｌｍｅｓＥＣｅｔａｌ．Ａｍｅｔａｅｎｏｍｉｃｓｕｒｖｅｏｆｍｉｃｒｏｂｅｓｉｎ［］，ｇｙｈｏｎ－ｂ说ｃｏｌｏｎｙｃｏｌｌａｓｅｄｉｓｏｒｄｅｒ？Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７，３１８５８４８：２８３２８７．巧ｐ的（）７０ＶａｎｅｎｅｉｉｌｓｄｏｒＤＴａｒＤＲＬｅｎｅｒｃｈＥＪｅｔａＬＩｄｉｏａｔｈｉｃｂｒｏｏｄｓｅａｓｅｓｎｄｒｏｍｅｇｐ，ｐｙ，ｇ，ｐｄｙ［］ａｎｄｕｅｅｎｅｖｅｎｔｓａｓｒｅｃｕｒｓｏｒｓｏｆｉｉｃｏｌｏｎｍｏｒｔａｌｉｔｎｍｉｒａｔｏｒｂｅｅｋｅｅｎｏｅｒａｔｏｎｓｉｎｑｐｙｙｇｙｐｇｐｉＪＭ－－化ｅｅａｓｔｅｒｎＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ．Ｐｒｅｖｅ打ｔｉｖｅＶｅｒｅｒｉｎａｒｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３１０８２３：２２５２３３．［］ｙ，（）７１ｄｅＭｉｒａｎｄａＪＲＧｅｎｅｒｓｃｈＥ．ＤｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｖｉｒｕｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｉｆｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅａｔｈｏｌｏ．［］，ｇ［］ｐｇｙ－％２０１０１０３Ｓ：Ｓ４８１．，７２Ｂ＊ｒｏｍｅ打ｓｈｅｎｋＪＪＨｅｎｄｅｉｓｏｎＣＢＷｉｃｋＣＨｅｔａｌ．Ｉｒｉｄｏｖｒｕｓａｎｄｍｉｃｒｏｓｏｒｉｄａｎｌｉｎｋｅｄ，，ｉｉ［］，ｐ－化ｈｏｎｅｙｂｅｅｃｏｌｏｎｙｄｅｃｌｉ打ｅＪ．ＰＬｏｓＯｎｅ．２０１０５１０：１３１８．［］，（）４５ ［７３］ＤａｉｎａｔＢ，ＥｖａｎｓＪＤ，ＣｈｅｎＹＰ，ｅｔａｌ．Ｄｅａｄｏｒａｌｉｖｅ：ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉ打ｇｖｉｍｓａｎｄＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒｗｄｕｃｅｔｈｅｌｉｆｅｓｐａｎｏｆｗｉｎｔｅｒｈｏｎｅｙｂｅｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭ－ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１２７８４：９８１Ｗ７．，（）７４？２００６２６９：张建国？中蜂易患囊状幼虫病的内外因分析及防治对策化蜜蜂杂志，［］（）２５－２６．７５ＧＥ－ｅｎｅｒｓｃｈＡｕｂｅｒｔＭ：Ｅｍｅｒｉｎｇａｎｄｒｅｅｍｅｒｉｎｖｉｒｕｓｅｓｏｆｔｈｅｈｏｎｅｅｅｉｓ［］，ｇｇｇｙｂ｛Ａｐｍｅｌｌｉｅｒｄ．ＶｅｔＲｅｓ２０１０４１：５４ｆ），，．Ａｎｄｅｒｓｏ。ＤＴｒｕｅｍａｎＪ．Ｖａｒｒｏａａｃｏｂｓｏ打ｉＡｃａｒｉ：Ｖａｒｒｏｉｄａｅｉｓｍｏｒｅｔｈａｎｏｎｅｓｅｃｉｅｓ，１７巧ｊ（）ｐｌｄａｃａ－，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆ａｐｐｉｅｒｏｌｏｇｙ２０００２４３：１６５８９．巧，，（）－ＸＵｔ７７ＰＥＮＧＹＳＦＡＮＧ义Ｓｅａｌ．ＴｈｅＫｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ化ｅＡｓｉａｎｈｏｎｅｂ说，［］，ｙ，括ｃｅ／Ｙｚ讯７Ｆａｂｒ．，ｔｏａｎｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅ，ＶａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎｉＯｕｄｅｍａｎｓ？Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｊ阴－ｒｔｔｅａｔｈｏｌｏ１９８７４９１５４６０．ｉｎｖｅｅｂｒａ，：ｐｇｙ，（）７ＬｅＣｏｎｔｅＹ，ＥｌｌｉｓＭＲｉｔｅｒＷ．Ｖａｒｒｏａｍｉｔｅｓａｎｄｈｏｎｅｂｅｅｈｅａ恤：ｃａｎＶａｒｒｏａｅｘｌａｉｎ［巧，ｙｐｌｉｌ－ｉ１３３５３６３ａｒｔｏｆｔｈｅｃｏｌｏｎｏｓｓｅｓ？Ｊ．Ａｄｏｏｅ２０１０４：．ｐｙ［］ｐｇ，，（）９ＡｌａｕｘＣＤａ打ｔｅｃＣＰａｒｒｉ打ｅｌｌｏＨｅｔａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｏｍｉｃｓｉｎｈｏ打ｅｂｅｅｓ：姐ｉｔａｌｅｎｅ，，，ｇｙｇｇ［７］＇ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｌｉｌｔｒｉｔｓａ－Ｊｐａｎａｙｓｓｏｆｏｌｅｎｓｎｕｉｔｖｅｅｆｆｅｃｏｎｈｅａｌｔｈｎｄｖａｒｒｏａａｒａｓｉｔｉｚｅｄｂｅｅｓ．ｐｙｐ［］ＢｍｃＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，口。）：４９６．巧０］Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ巧Ａｕｍｅｉｅｒ巧ＺｉｅｇｅｌｍａｉｍＢ．ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｆ－ｌｏｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅａｔｈｏｌｏ２０１０１０３：Ｓ９６Ｓ１１乂ｐｇｙ，，［８１］ＡｍｄａｍＧ乂ＨａｒｔｆｅｌｄｅｒＫ，ＮｏｒｂｅｒｇＫ，ｅｔａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｉｎｗｏｒｋｅｒｈｏ打ｅｙｂｅｅｓＨｙｍｃｏｏｐｔｃｒａ：ＡｐｉｄａｃｉａｆｅｓｔｃｄｗｉｔｈｔｈｅｍｉｔｅＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒＡｘ＾ａｒｉ：Ｖｋｒｒｏｉｃｋｃ：身（）（）ｆａｃｔｏｒｉｎｃｏｌｏｎｌｏｓｓｄｕｒｉｎｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎ？Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃｅｎｔｏｍｏｌｏ２００４ｙｇｇ［ｇｙ，］，９７３：７４＾７．（）８２］ＤｅＪｏｎｇ０，ＤｅＪｏ打ｇ巧Ｇｏ打ｃａｌｖｅｓＬ．Ｗｅｉｇｈｔｌｏ巧孤ｄｏｔｈｅｒｄａｍａｇｅ１：０ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ［ｗｏｒｋｅｒｈｏｎｅｙｂｅｅｓｆｒｏｍｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎｗｉｔｈＶａｒｒｏａａｃｏｂｓｏｎｉａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［ｐ］［］ｊｌ９８２ＡｉｃｕｌｔｕｒａＲｅ化ａｒｃｈ１．ｐ，８３ＫｒａｌｊＪ，ＢｒｏｃｋｍａｎｎＡ，ＦｕｃｈｓＳ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｐａｒａｓｉｔｉｃｍｉｔｅＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒａｆｅｃｔｓ［］－ｎｏｎａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅｌｅａｒｎｉｎｇｉｎｈｏｎｅｂｅｅｆｏｒａｅｒｓ＾ｍｅＵｉｅｒａＬＪ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｙｇ，公虹ｆ［］Ｃ－ｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏｇｙＡ，２００７１％：３６３７０．ｐｙ，口）８４ＫｒａｌＪＦｕｃｈｓＳ．ＰａｒａｓｉｔｉｃＶａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒｍｉｔｅｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅ日ｉｈｔｄｕｒａｔｉｏｎａｎｄｈｏｍｉｎ［］ｊ，ｇｇａｂｒａ－ｉｌｔｏｆｎｆｅｓｔｅｄｂｍｅ／／ｏｒａｅｒｓ？Ａｏｌｏｉｅ２００６３７：巧７８７．ｉｙｉ於ｆｇｐｉｄｇ，，如阴口）８５ＹａｎＸＣｏｘ－ｆｏｓｔｅｒＤ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆａｒａｓｉｔｉｚａｔｉｏ打ｂＶａｒｒｏ汪ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒｏｎｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉａｎｄｇ，ｐｙｐ［］ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｒａｉｔｓｏｆ沁ｗｅ巧冷ｒ口扣ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｖｉｒａｌｉｎｃｉｄｅ打ｃｅａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌ４／－ｃｈａｌｌｅｎｅＪ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ２００７１３４０３：４０５１２．ｇｇｙ，［］，（）４６ 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附录论文中涉及化学试剂及溶液的配制：＾．ＳＸＴＢＥ的面制（保存液）：２０ｍｌ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ用超纯水溶解，定容至１０００ｍレ高压灭菌２Ｌ，Ｔｒｓｂａｓｅ５４ｉｇＢｏｒｉｃａｃｉｄ（测酸）２７．５§ＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／ＬＨ８．０２０ｍＬ，ｐ）Ｗａｔｅｒ（超纯水）化化２．１０ＸＰＣＲｄｉｆｆｅｒ的组成＂１０Ｘ？巧Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＰｌｕｓ）ｇ－…ＴｒｉｓＨＣｌ（Ｈ８．３）ＯｍＭｐＫＣｌＳＯＯｉｎＭＭｇ幻２１５ｍＭ－２〇ｒ保存。３．ＤＬ１０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ－Ｈ８ｌＯｍＭＴｒｉｓＨＣｌ．０（ｐ）６ｍＭＥＤＴＡ６％丙Ｈ醇０．００８３％漠敢蓝０．００３３％二甲苯青．－２０Ｃ保存４．ＤＮＡｌｏａｄｉｎｂｕｆｆｅｒ：ＳＯｍＬｇ９８％甲敵按４９ｍＬ（１００％）ｌＯｍＭ己二胺Ｈ８．０ｌｍＬ０四乙酸（）（．５ＭＨ８．０ｐ，ｐ）０．２５％ＢＰＢ（漠敌蓝）０．１２５ｇ０．２５％ＰＸ（二甲苯青）０．１２５ｇ室温保存。５．ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）Ｈ８．０Ｏ．ＩＬｐ１８．６口＋ＳＯｍＬ无０．５Ｍｇ菌水至用ＮａＯＨ调至ｐＨ８．０５５ ６．０．５ＸＴＢＥ的配置（工作液）：用量筒准确量取ｌＯＯｍＬ的５ＸＴＢＥ，加入超纯水定容至ｌＯＯＯｍＬ，高压灭菌。７：．０．１％ＤＥＰＣ处理水’°压灭菌取ＩｍＬＤＥＰＣ溶于ｌＯＯＯｍＬ超纯水中，＾Ｃ下，高１２ｈ，４Ｃ保存。５６ 致谢本论文是在导师余林生教授的悉也指导下完成的。在论文的选题、试验的方案制定与实施Ｗ及最后的论文撰写都得到了导师精也地指导和耐也教诲。Ｈ年时间，白骑过隙，导师对我的学习生活倾注了大量的也血，我在其指导下学习到了不少做人做事的道理，这也必将对我今后的工作和生活产生深远影响。余老师渊博的学识、开阔的思路、严谨的治学态度和对科研的执着追求使我受益匪线，也将永远激励、鞭策着我。借此机会，向我的导师致Ｗ诚擎的敬意和衷也的祝福！论文在设计与撰写过程中，得到了导师余林生与刘芳老师的悉也指导和认真细致的审阅，在此，表示由衷的感谢！、在试验过程中，得到师兄宗超施腾飞、齐磊、张蠢等同学的帮助；同时还感谢农！学院张海萍老师提供的部分试验设备帮助，深表谢意Ｈ年研究生学习生活中，我得到了安徽农业大学植保学院、动物科技学院和研究生一学院的领导和老师们的关怀和帮助！，在此并表示感谢！感谢我的家人，是他们的默默支持给了我完成学业的动力，谢谢你们在完成论文毕业之际，再，向理解和关爱我的学校领导与老师、亲戚和同学朋友们次表示感谢！，祝愿您们身体健康、阔家幸福本论文是由国家蜂产业建设技术体系专项ＣＡＲＳ－４５－ＫＸ巧（）；国家自然科学基金３１２７２５１１３１３０２０３９；１４０８０８５Ｃ６；（，）安徽省自然科学基金（Ｑ巧高校省级优秀青年人才基！金重点项目（２０１３ＳＱＲＬ０１８ＺＤ）共同资助完成。在此谨表谢意最后！！，感谢答辩委员会Ｗ及论文评网的专家教授们谢谢２０１５年４月于安徽农业大学５７ 个人简介汪天谢，男，１９９０年０６月出生，安徽安庆人，共青团员，２００８年９月参加全国高考，进入安徽科技学院植物生产大类专业学习，学制４年，于２０１２年６月毕业，并获９学±学位，同年月参加研究生入学考试，成为安徽农业大学植物保护学院农业昆虫与害虫防治专业的学术型硕±。一，自进入大学依赖我时刻警醒着自己作为新代的青年，要努力奋斗，为社会贡献一，可Ｗ培养自身的综合素质能力。在思想方面自己的份力量，认真学习，我拥护党的各项方针政策和各项规章制度，成为入党积极分子：；工作方面积极认真协助导师完成＂安排的任务，，做好本职工作，，本科期间曾获优秀；学习方面我努力学习持之Ｗ恒＂＂＂学生干部１次、全国大学生英语竞赛二等奖、参加校第屯届大学生创新创业活动＂＂＂＂二并获得第四届挑战杯校Ｈ等奖、通过省计算机级《ＶＦＰ》、通过全国大学生＂＂一英语四级考试；研究生期间曾获好研究生１次暨安科生物奖学金、第作者发一表论文２篇、译文篇、Ｗ参与作者发表３篇；多次参加各种学术会议与报告。５８ 在读期间发表的学术论文１．汪天綺，施腾飞，刘芳，余林生，齐磊，孟样金．安徽省４：种蜜蜂病毒病的发生与巧５２２４－．应用昆虫学报，２０：３３３２．流行研究，（巧２．汪天樹，刘芳，余林生，潘巧，江朝焊，付月生．蜜蜂蜂群湿湿度调节的研究进展．２０－１５３５０生态学报，，（１）；．３？，．）．巧余林生．译蜜蜂细胞培养基（西方蜜蜂膜翅目蜜蜂科恩．天樹，韦亨特２０－１３６４５４５６中国蜂业，，：．４．施腾飞，刘芳，余林生，汪天谢，齐磊．意大利蜜蜂不同日龄工蜂脑部Ｈ种ｒａｉＲＮＡ的－２０１４．．昆虫学报，５７口）：１３６８１３７４表达水平，（４．施腾飞，余林生，刘芳，宗超，汪天慰．蜜蜂ｍｉｃｒｏＲＮＡ的研究进展．昆虫学报．２０－６０６１４５７巧）：６０１．５．ＬｎｓｈｅｎＹｕＦａｎＬ山ＣｈａｏＺｏｎＴｉａｎｓｈｕＷａｎ．Ｍｏｒｈｍｅｔｒｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｉｓｃｍｍｏｉｇ，ｇ，ｇ，ｇｐｙ心－ｏｕｌａｔｉｏｎｓｉｎＨｕａｎｓｈａｎＣｈｉｎａ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆａｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｃｉｅｎｃｅ２０１４５７２：１１７１２４．ｐｐｇ，，ｐ，（）５９