意大利蜜蜂与中华蜜蜂工蜂咽下腺基因表达分析 48页

．－、１—？－、，、？Ａ—＾■．—■■．－１—？Ａ，＂．ｖ．．－－记斬．—、掛分类号：Ｓ８９１学校代码；１０４１０密级：学号；０２０２０１２２００紅成朱葦夫聲硕女《像讼Ａ部ＸＴ今＇遞讀皂芒意大利蜜蜂与中华蜜蜂工蜂咽下腺基Ｓ因表达分析：？二户Ｇｅ打ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ打ａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ牛？ｇｌａ打ｄｂｅｔｗｅｅｎ巧ｅｉｉｉ／ｅｒ沒ａｎｄ＾公／公．．．．巧杳ｃｅｒａｎａｗｏｒｋｅｒｓｊ．．申请人：文！）浩指导教师：磬志将教授学料专业：特种经济动物饲养所在院：（所）动物科学与技术学院二〇—论文提交日期：五年六月 独创性声巧本人声明，所呈交的学位论文，，是在指导教师指导下通过我的努力取得的成果且是自，并己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材料一。与我同对本研究做出寅献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重慢犯他人知识产极的巧为，由本人承担应有的责任。ＩＳ学位论文作者亲笔签名：过基＿日孤心论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，手允许论文被查阅和借阅；学校可Ｗ公布论文的全部或部分内容，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不’保密，本学位论文属于不保密。ｙ‘‘（请在方框内打小）学位论文作者亲笔签名；摩日期；姆５．《、巧指导教师亲笔签名：道遂＾日期：挪如＾ 本论文得到国家蜂产业技术体系（No.CARS-45-KXJ12）和江西省“赣鄱英才555工程”领军人才项目资助。ThisworkwassupportedbytheEarmarkedFundfortheChinaAgriculturalResearchSystem(No.CARS-45-KXJ12)andthe555talentsprojectofGanPoofJiangxiprovince. 目录摘要................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................II第一章文献综述.............................................................................................11.1东方蜜蜂与西方蜜蜂生物学特性..........................................................................11.1.1西方蜜蜂(Apismellifera)................................................................................11.1.2东方蜜蜂(Apiscerana)...................................................................................11.2蜜蜂蜂王浆及咽下腺发育研究进展......................................................................21.2.1蜂王浆研究概述.............................................................................................21.2.2咽下腺研究概述.............................................................................................21.2.2.1咽下腺发育程度与工蜂的劳动分工..................................................21.2.2.2东方蜜蜂与西方蜜蜂咽下腺形态差异..............................................21.2.2.3咽下腺发育程度与蜂王浆分泌活性的影响因素..............................41.3数字基因表达谱(DGE)...........................................................................................41.4本论文的研究内容与意义......................................................................................5第二章意大利蜜蜂与中华蜜蜂咽下腺数字基因表达谱分析....................62.1引言..........................................................................................................................62.2实验材料与方法......................................................................................................62.2.1实验蜜蜂.........................................................................................................62.2.2实验方法.........................................................................................................62.2.2.1蜜蜂样品的采取和咽下腺的解剖......................................................62.2.2.2标签序列文库的构建和测序..............................................................72.2.2.3数据处理和测序质量评估..................................................................82.2.2.4测序饱和度和重复性分析..................................................................92.2.2.5CleanTags的拷贝数分布统计............................................................92.2.2.6CleanTags的比对统计和基因表达注释............................................92.2.2.7差异表达基因的筛选........................................................................102.2.2.8GO功能显著性富集分析..................................................................102.2.2.9Pathway显著性富集分析..................................................................102.3实验结果................................................................................................................112.3.1数据处理和测序质量评估...........................................................................112.3.2测序饱和度与重复性分析...........................................................................112.3.3CleanTags拷贝数分布统计.........................................................................112.3.4基因注释、标准化与差异表达基因的筛选...............................................112.3.5GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析..............................122.4讨论........................................................................................................................212.4.1DEGs表达模式分析.....................................................................................212.4.2王浆主蛋白基因分析...................................................................................212.4.3核糖体蛋白基因分析...................................................................................222.4.4王浆分泌活性主要影响基因分析...............................................................222.4.5TOR、胰岛素/IGF和TGF信号通路..........................................................22第三章意大利蜜蜂咽下腺六个基因表达分析...........................................28i 3.1引言........................................................................................................................283.2实验材料与方法....................................................................................................283.2.1实验蜜蜂.......................................................................................................283.2.2实验方法.......................................................................................................283.2.2.1蜜蜂样品的采取与咽下腺的解剖....................................................283.2.2.2RNA的提取与cDNA的合成...........................................................283.2.2.3定量引物设计及实时荧光定量PCR................................................293.2.2.4数据统计与分析................................................................................303.3实验结果................................................................................................................303.4讨论........................................................................................................................30第四章结论与展望.......................................................................................334.1主要结论................................................................................................................334.2研究展望................................................................................................................33参考文献.........................................................................................................34攻读硕士期间已发表和已投稿论文及获奖情况.........................................40致谢.............................................................................................................41ii 摘要蜂王浆主要是6~12日龄工蜂头部咽下腺和上颚腺的分泌物，成分非常复杂，具有许多重要的生物学功能。多项研究已表明东方蜜蜂与西方蜜蜂蜂王浆产量差异显著，其主要原因为咽下腺发育程度及其分泌活性存在差异。本研究利用Solexa平台的数字基因表达谱(DigitalGeneExpressionProfiling,DGE)技术分析中华蜜蜂（Apisceranacerana,简称中蜂）和意大利蜜蜂（Apismelliferaligustica,简称意蜂）不同发育阶段咽下腺（出房、哺育和采集）中mRNAs的表达差异。此外运用实时荧光定量PCR(q-PCR)技术对意蜂三个发育阶段咽下腺（哺育、采集和逆转哺育）中SV2C、PDK1、eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1六个基因进行表达差异分析。通过DGE测序分析，分别从意蜂出房、哺育和采集三个发育阶段咽下腺文库中检测到3,564,493、3,551,143和4,811,364个cleantags。哺育蜂VS出房蜂、采集蜂VS哺育蜂和采集蜂VS出房蜂三组对比数据中，分别有279、614和1419个差异表达基因(DifferentiallyExpressedGenes,DEGs)，总共1482个；中蜂出房、哺育和采集三个发育阶段咽下腺中分别检测到2,441,553、2,421,403和2,709,506个cleantags，哺育蜂VS出房蜂、采集蜂VS哺育蜂和采集蜂VS出房蜂三组对比数据中，分别有1,209、103和331个DEGs，总共1313个。研究发现中蜂和意蜂中大部分DEGs表达量都随时间推移而降低。此外，对中、意蜂间相同发育阶段咽下腺（出房、哺育和采集）中基因表达量进行对比分析，分别有623、1072和462个DEGs，总共1417个，其中于意蜂中表达上调的基因数分别为509、981和182个，表达下调的基因数分别为114、91和280个。研究结果表明mRNAs在蜜蜂咽下腺发育和蜂王浆分泌过程中很可能都发挥了重要作用。通过mRNAs表达量综合分析，筛选出6个候选基因：1个蜂王浆分泌活性影响基因(SV2C)和5个咽下腺发育影响基因（PDK1、eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1）。通过q-PCR技术分析哺育、采集和逆转哺育意蜂咽下腺中上述6个候选基因，结果表明SV2C可能参与调控咽下腺蜂王浆分泌活性，eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1可能与咽下腺发育相关，而PDK1可能与咽下腺寿命相关。关键词：东方蜜蜂；西方蜜蜂；咽下腺；mRNAs；数字基因表达谱I AbstractRoyaljellyissecretedbyhypopharyngealgland(HG)andmandibularglandwhichlocateintheheadofworkerhoneybeesabout6~12days-old.Royaljellyhastheverycomplicatedcompositionandmanyimportantfunctions.ResearchesshowedthattheyieldofroyaljellybetweenApismelliferaandApisceranahasahugedifference,whichmainlybecauseofthedevelopmentdegreeofHGandtheirsecretoryactivityofroyaljelly.Inthisstudy,weanalyzedthemRNAsexpressiondifferenceofthedifferentdevelopmentalstagesofHGs(newlyemergedworker,nurseandforager)betweenApismelliferaligustica(Aml)andApisceranacerana(Acc)usingdigitalgeneexpressionprofilingtechnology(DGE)whichbelongstoSolexaplatform.Besidesthat,wealsoanalyzedtheexpressionofSV2C,PDK1,eIF-4E,eIF-4E,cellgrowth-regulatingnucleolarprotein,IMPandTGF-βR1indifferentdevelopmentalstagesofHG(nurse,foragerandreversednurse)inAmlusingquantitativereal-timePCR(q-PCR).ForDGE,3564493,3551143and4811364cleantagsweredetectedfromAmlnewlyemergedworker,nurseandforagerstagesHGsrespectively.Atotalof1482genesshowedanexpressiondifferenceinatleastonepairwisecomparison.Ofthese,279,614and1419genesweredifferentiallyexpressedinthecomparisonsamongnewlyemergedworkervs.nurse,nursevs.forager,andnewlyemergedworkervs.forager.Andcorrespondingtothat,therewere2441553,2421403and2709506cleantagsdetectedfromAccnewlyemergedworker,nurseandforagerstagesHGsrespectively.TheDEGsnumberwas1209,103and331respectively,atotalof1313.MostoftheseDEGs’expressioninAmlandAccreducedcontinuallywiththeincreaseoftime.Inaddition,theirwere623,1072and462DEGsbetweenAmlandAccnewlyemergedworker,nurseandforagerstagesHGsrespectively,atotalof1417.With509,981and182genesup-regulatedand114,91and280genesdown-regulatedinAmlgroups.TheseresultssuggestedthatmRNAsprobablyplayedanimportantroleinregulatingthedevelopmentofHGsandtheprocessofroyaljellysecretion.Inaresult,wescreenedout1genewhichperhapsaffectedthesecretoryactivityofroyaljellyinHGsand5genesmaybeassociatedwiththedevelopmentofHGs.Thereafterweanalyzedabove-mentioned6genesinAmlnurse,foragerandreversednursestagesHGsbymeansofq-PCR.ResultsindicatedthatSV2CcouldberegardedascandidategeneassociatedwiththesecretoryactivityofroyaljellyinHGs,eIF-4E,TGF-β,cellgrowth-regulatingnucleolarproteinandIMPperhapsassociatedwiththedevelopmentofHGs,andPDK1mightberelatedwiththelifespanofHGs.Keywords:Apiscerana;Apismellifera;hypopharyngealgland;mRNAs;DGEII 第一章文献综述1.1东方蜜蜂与西方蜜蜂生物学特性蜜蜂是一种典型的社会性经济昆虫，属于节肢动物门(Arthropoda)、昆虫纲[1](Insecta)、膜翅目(Hymenoptera)、蜜蜂总科(Apoidea)、蜜蜂科(Apidae)、蜜蜂属(Apis)。目前认为，蜜蜂属中共有9个种：沙巴蜂(Apiskoschevnikovi)、绿努蜂(Apisnulunsis)、苏拉威西蜂(Apisnigrocinta)、大蜜蜂(Apisdorsata)、小蜜蜂(Apisflorae)、黑大蜜蜂(Apislaboriosa)、黑小蜜蜂(Apisandreniformis)、东方蜜蜂(Apiscerana)和西方蜜蜂(Apis[2-3]mellifera)。东方蜜蜂和西方蜜蜂虽然有许多相似的生物学特性，但由于长期的地理隔离造成进化趋异，两者在形态和生活习性等方面还是有所差异。1.1.1西方蜜蜂(Apismellifera)西方蜜蜂原产于非洲、欧洲和中东等地区，由于大量的引种，现已成为世界各地[1]的主要饲养蜂种。由于生态地理环境差异，西方蜜蜂形成了不同的地理亚种，主要有意大利蜜蜂（Apismelliferaligustica,Aml,简称意蜂）、东非蜜蜂(Apismelliferascutelata)、欧洲黑蜂(Apismelliferamellifera)、卡尼鄂拉蜂(Apismelliferacarnica)、高加索蜜蜂(Apismelliferacaucasica)、突尼斯蜜蜂(Apismelliferaintermissa)和安纳托利亚蜜蜂(Apismelliferaanatolica)等。西方蜜蜂的共同特点是分蜂性弱，蜂王产卵力强；工蜂采集力强，善于利用大面积蜜粉源，采集树胶；分泌蜂王浆能力强，但易受蜂螨危害。我国养蜂科技人员以意蜂、欧洲黑蜂和卡尼鄂拉蜂为基础，选育出蜂蜜高产杂交种（国蜂213）、蜂王浆高产杂交种（国蜂414）、“浙农大1号”和“喀（阡）黑[1]环系”等优良品种（系），对我国蜂业的蓬勃发展起了重要作用。1.1.2东方蜜蜂(Apiscerana)[1]东方蜜蜂是原产于亚洲的蜂种，分布于中国、日本、朝鲜、伊朗等多个国家。由于长期的定地饲养及各地不同的生态条件，形成了许多地理亚种，主要包括中华蜜蜂（Apisceranacerana,Acc,简称中蜂）、海南蜜蜂(Apisceranahainana)、喜马拉雅蜜蜂(Apisceranahimalaya)、印度蜜蜂(Apisceranaindica)、日本蜜蜂(Apiscerana[4]japonica)和阿坝蜜蜂(Apisceranaabanisis)等。东方蜜蜂具有抗逆性强；有较强的耐寒性和抗螨性，但抗囊状幼虫病力弱；可充分利用山林区域零星蜜粉源，但不采集树[5]胶等特点。1 1.2蜜蜂蜂王浆及咽下腺发育研究进展1.2.1蜂王浆研究概述蜂王浆主要是6~12日龄工蜂头部咽下腺(HypopharyngealGland,HG)和上颚腺的[6-7]分泌物。由于是蜂王的终身食物而得名为“蜂王浆”，同时它也是3日龄以内蜜[8]蜂幼虫的食物，因此也被称为“蜂乳”。新鲜蜂王浆为淡黄色或乳白色，半透明状，[6]微粘稠，味微甜、酸、辛、涩，有特殊香味，在雌性蜜蜂级型分化中扮演了极其重[9-10]要的角色。蜂王浆的成分非常复杂，且不同地区、不同年份的蜂王浆并不相同，一般主要包[11-12]含水、蛋白质、脂类、总糖及其他物质（少量的维生素、游离氨基酸、无机盐等），其中蛋白质可分为水溶性蛋白(Water-SolubleProteins,WSPs)和非水溶性蛋白，WSPs是蜂王浆蛋白的主要成分（约占46%~89%），称为王浆主蛋白(MajorRoyalJelly[13]Proteins,MRJPs)。[14-17][18-21][22]蜂王浆是一种纯天然的保健品，主要有调节血压、免疫调节、抗疲劳、[23-24][25-29][14、30-32][14、33]抗菌、抗氧化、促进细胞生长、防肿瘤等重要功能。我国目前[34]蜂王浆年产量超过3000吨，约占世界总产量的90%。蜂王浆生产所用蜂种主要为意大利蜜蜂，而中蜂作为中国独有的种质资源，其蜂王浆产量却只有意蜂的[35]1/15~1/30。蜂王浆产量受蜂群群势、台浆数量和台基接受率以及外界环境条件等[36]诸多因素影响。此外，还有咽下腺的发育程度、蜂王浆分泌活性及泌浆持续时间等[37]重要因素。1.2.2咽下腺研究概述1.2.2.1咽下腺发育程度与工蜂的劳动分工咽下腺是一对位于蜜蜂头部、由许多呈葡萄状腺泡组成的腺体。两条腺体的分泌[38]管一端游离，另一端分别通于口片两侧。工蜂咽下腺的发育程度、分泌活性及其功能与其日龄密切相关，有研究者将咽下腺的发育程度作为蜂群中工蜂的分工标准（表1-1）。1.2.2.2东方蜜蜂与西方蜜蜂咽下腺形态差异东方蜜蜂与西方蜜蜂王浆产量差异很大，其主要原因在于咽下腺发育程度及分泌活性的差异。曾志将等对意蜂和中蜂不同发育阶段咽下腺进行形态研究，发现同一蜂种不同发育阶段，咽下腺平均宽度差异显著；相同发育阶段，意蜂咽下腺平均长度和[39]腺泡数量显著高于中蜂（表1-2）。2 表1-1工蜂咽下腺发育程度、分泌活性及其功能与日龄间关系Table1-1relationshipbetweenthedevelopmentdegree,secretionactivityofworkerhoneybee’shypopharyngealglandsandthedays-old日龄咽下腺发育程度咽下腺分泌活性工蜂功能其他1分化形成，呈扁平状刚羽化出房还未形成分泌囊泡称为出房蜂3开始出现分泌囊泡有少许王浆蛋白保温孵卵[40]分泌清理产卵房3~6分泌活性较低调剂花粉和蜂蜜饲喂大幼虫6发育至最高峰，出现大量分泌蜂王浆饲喂蜂王和3日称为哺育蜂大量分泌囊泡分泌活性高龄以内蜜蜂幼虫腺泡饱满，直径约为出房蜂的2倍9发育完全蛋白分泌量达到--最高12开始退化大量蛋白分泌，分--泌量大大降低12~18退化分泌活性降低清理蜂巢咽下腺细胞的死亡方式建造巢脾具有明显的编程性，且[42-43]哺育蜂和采集蜂咽下腺18--分泌α-葡糖苷酶、酿造蜂蜜[41]细胞死亡方式不同淀粉酶和葡糖氧化酶等酶[45]21--外出采集（称为采开始出现溶酶体[4、44]集蜂）及防卫24----溶酶体最多，其他细胞器开始解体注：“--”意为“同上”Note:―--‖means―ditto‖表1-2意大利蜜蜂与中华蜜蜂不同发育阶段咽下腺形态差异Table1-2MorphologicaldifferenceofdifferentdevelopmentalstagesofHGsbetweenAmlandAcc工蜂腺泡数（个）平均长度(mm)平均宽度(mm)意蜂中蜂意蜂中蜂意蜂中蜂出房蜂52732512.348.990.320.34哺育蜂54134012.419.100.530.49采集蜂52732412.279.030.330.363 1.2.2.3咽下腺发育程度与蜂王浆分泌活性的影响因素影响咽下腺发育程度及蜂王浆分泌活性的因素有很多，国内外学者对此做了广泛研究，也取得了许多可喜结果。例如匡云华发现蜂群在30℃~35℃温度下咽下腺泌[46][47]浆活性最好。虽然越冬工蜂咽下腺在整个冬季腺泡饱满，但没有分泌活性。同[48-49]时，哺育蜂必须受到幼虫刺激才会分泌蜂王浆；当蜂群失王或蜂群内哺育蜂不足[50-52]时，有一部分咽下腺已退化的采集蜂会重新回到巢内工作，且咽下腺重新发育。[53-58]此外，工蜂咽下腺的影响因素还有食物的摄入及体内保幼激素的含量等。李建科等对意蜂咽下腺做了一系列蛋白质组分析，研究发现王浆高产意蜂（简称浆蜂）咽下腺在各发育阶段的蛋白表达总数和特有蛋白表达量都比原种意蜂更高，且[40、59]管家蛋白和特有蛋白在表达模式上都存在差异；浆蜂于2日龄卵、4日龄幼虫及6日龄成蜂时蛋白表达量最高，此类蛋白主要与碳水化合物、脂质和蛋白质的新陈代[60-62]谢、细胞骨架、抗氧化活性和发育调控等相关；同时还发现浆蜂和原种意蜂于1日龄时工蜂咽下腺就已具备泌浆潜力，3日龄时有王浆蛋白表达，6~12日龄时达到高[63]峰，此外于咽下腺蛋白质互作网络中发现35个对咽下腺发育至关重要的节点蛋白。目前关于咽下腺分子水平的研究还比较少，Liu等对卡尼鄂拉蜂不同日龄工蜂咽下腺进行转录组测序分析，借此寻找与咽下腺发育相关的差异表达基因，研究发现了一系列碳水化合物、脂质和蛋白质的新陈代谢、细胞骨架、抗氧化活性和发育调控等[64]相关基因。1.3数字基因表达谱(DGE)[65]自Sanger等人于1977年建立传统双脱氧链终止法测序技术以来，在基因组研究的推动下，测序技术迎来了一个新高潮，被称为第二代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)。目前，第二代测序技术主要有3种测序平台：Roche公司基于焦磷酸测序法的454平台、Illumina公司边合成边测序的Solexa平台和AppliedBiosystems(ABI)公司基于连接酶测序的SupportedOligoLigationDetection(SOLiD)平[66]台。它们具有极高的测序通量且节约了大量的建库时间和成本，现已广泛用于研究[67][68]基因组测序、DNA甲基化、基因转录组测序以及数字基因表达谱(DigitalGene[69]ExpressionProfiling,DGE)。DGE是一种以新一代高通量测序为基础，对标签序列直接进行测序的技术。利用内切酶NlaⅢ与MmeⅠ识别并切断每个反转录cDNA上CATG位点及其下游17bp处位点并建立一个21bp的标签文库，标签序列的数目代表相应基因的mRNAs表达量，具有数字化信号、技术重复性高、检测阈值宽、高通量测序、可在不依赖已知基因条件下检测新转录本及反义链转录本和与分析芯片的软件兼容等优势，已被广泛应用于医学研究、生物工程、基础科学研究等多个领域。随着2006年西方蜜蜂全基因[70-71]组序列图谱的面世，DGE技术已广泛应用在蜜蜂研究领域。4 1.4本论文的研究内容与意义本研究利用DGE技术构建了意蜂和中蜂三个发育阶段咽下腺（出房、哺育和采集）的cDNA文库，在东方蜜蜂基因组未公布的情况下，以西方蜜蜂基因组作为参考基因组进行比对，获得DGE数据库并进行基因表达图谱分析，比较mRNAs表达差异，分析可能影响工蜂咽下腺发育程度和蜂王浆分泌活性的基因。同时以意蜂为实验材料，应用实时荧光定量PCR(q-PCR)技术，分析SV2C、PDK1、eIF-4E、IMP、CGNP和TGF-βR1等六个基因在哺育蜂、采集蜂和逆转哺育蜂咽下腺中的表达水平。以期为进一步阐明工蜂咽下腺发育和蜂王浆高产机理提供重要依据。5 第二章意大利蜜蜂与中华蜜蜂咽下腺数字基因表达谱分析2.1引言蜂王浆因其具有良好的营养保健作用和生物学功能，已倍受国内外学者高度关注。我国是一个蜂王浆生产大国，蜂王浆产量直接影响到蜂农的经济效益。目前关于蜂王浆产量影响因素的研究主要集中于外界环境、蜂群状况、蛋白摄入及激素水平等方面，分子水平的研究还比较少。此外，研究主要集中于以意蜂等以王浆高产闻名的西方蜜蜂上，而东方蜜蜂因其王浆分泌量少，与此有关的研究非常稀少。中蜂作为中[2]国的独有种质资源，具有很强的环境适应性、抗逆性和抗螨性，因此，对中蜂的科研同样具有很高的价值。本研究以意蜂和中蜂为材料，采用DGE技术分析了出房、哺育和采集三个发育阶段咽下腺mRNAs的表达差异，发现许多可能与咽下腺发育程度及蜂王浆分泌活性相关的差异表达基因(DifferentiallyExpressedGenes,DEGs)。2.2实验材料与方法2.2.1实验蜜蜂本研究蜂群来源于江西农业大学蜜蜂研究所饲养的意蜂和中蜂，分别选取2群作为生物重复，所有蜂群按标准技术饲养。2.2.2实验方法2.2.2.1蜜蜂样品的采取和咽下腺的解剖每群随机抓取出房蜂、哺育蜂（不断将头伸入有小幼虫的巢房内）和采集蜂（后足花粉耙上带有花粉）各60只，共180只，中、意蜂总共720只。所有蜜蜂均活体取样，随即放入液氮中速冻，并于-80℃保存。咽下腺具体解剖步骤如下：（1）剪下头部，于双目显微镜下，用弯头镊子夹住上唇固定头部，再用刀片沿脑后侧缝横向割开颅骨。（2）用直镊子去除颅壳后，徐徐滴入几滴生理盐水(137mmol/LNaCl,10mmol/LNa2HPO4,2mmol/LKH2PO4和2.7mmol/LKCl)，使咽下腺与其他组织游离。（3）用镊子将咽下腺从口片处切断后置于DEPC水中涮洗，将60只同一蜂群、同一发育程度的工蜂咽下腺混合为一个样品放入1.5mlEP管中并置于液氮中保存。总共获得12份咽下腺组织样品。（4）为防止RNA降解，解剖室处于16℃；生理盐水和DEPC水置于冰上，蜜蜂样品保存于干冰中；每只蜜蜂的解剖过程约4min内完成。将咽下腺混合样品放入装有适量液氮的研钵中，充分研磨后移置加有1mlTrizol6 的1.5mlEP管中，置于干冰中保存并送至深圳华大基因公司进行DGE测序分析。2.2.2.2标签序列文库的构建和测序采用SV总RNA提取系统从咽下腺样品中提取出总RNA后进行质量检测，质检合格后，取其中6μg利用IlluminaGeneExpressionSamplePrepKit建立标签序列文库。Tags的制备原理和步骤如下（图2-1）：（1）利用Oligo(dT)磁珠吸附mRNA3"末端polyA结构的特性，将mRNA从6μg总RNA中纯化，经反转录作用合成双链cDNA。（2）利用内切酶NlaⅢ识别并切断cDNA链上的CATG位点，再利用磁珠沉淀纯化出含3"末端的cDNA片段，将Illuminaadaptor1与cDNA片段的5"末端相连。（3）利用内切酶MmeⅠ识别CATG位点与Illuminaadaptor1结合处，并在CATG位点下游17bp处切断cDNA链，得到带有Illuminaadaptor1的Tags。（4）利用磁珠沉淀去除含3"末端的cDNA片段，将Illuminaadaptor2与Tag的3"末端相连，获得两端含有不同接头序列的CATG+17bp标签。（5）经15个PCR循环扩增后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE胶电泳）纯化回收并构建Tag文库。（6）利用Agilent2100Bioanalyzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem进行质量检测，合格后用IlluminaHiSeq™2000系统采用边合成边测序法(SequencingBySynthesis,SBS)对文库进行测序，再利用basecalling将测序得到的原始图像数据转化为原始reads，每条通道可得到数百万条读长49bp的原始reads（包含一段3"Illuminaadaptor2序列），以FASTQ格式文件保存。标签文库的构建和序列测定以及后续的信息分析均由深圳华大基因公司完成。DGE实验和信息分析流程图见图2-2和2-3：图2-1Tag的制备原理和步骤Fig2-1Theprincipleandstepsoftag’preparation7 图2-2数字基因表达谱的实验流程Fig2-2Theexperimentprocessofdigitalgeneexpressionprofile图2-3数学基因表达谱的信息分析流程Fig2-3Theinformationanalysisprocessofdigitalgeneexpressionprofile2.2.2.3数据处理和测序质量评估测序得到的原始序列数据除用于进行基因注释和标准化的CATG+17ntTags外，还有很多杂质数据，包括reads自带的3"adaptor序列、只含3"adaptor的空载reads、含有未知碱基的低质量Tags、长度不是21nt的Tags及可能由于测序错误产生的拷贝数为1的Tags等。将此类杂质数据去除后得到的数据称为CleanTags。8 TotalTagsDistribution代表所有Tags的数量分布情况；DistinctTagsDistribution代表所有Tags的种类分布情况。一般低质量Tags含量≤2%且各种杂质Tags总含量≤15%时认为测序质量良好。2.2.2.4测序饱和度和重复性分析饱和度分析用于检测当样本有极深测序深度时，测序的Tags数量不断增加，Tags的种类数是否也会随之上升。重复性分析用于检测同一样本两次技术重复或当样本有不同生物重复时，实验结果的可靠性和操作的稳定性，相关性越接近1代表测序结果可信度越高。2.2.2.5CleanTags的拷贝数分布统计细胞mRNAs的表达具有不均匀性，即大多数种类的mRNAs表达水平很低，只有少数种类的mRNAs表达量极高。CleanTags拷贝数代表相应基因表达量，TotalCleanTagsDistribution代表所有CleanTags的数量分布情况；DistinctCleanTagsDistribution代表所有CleanTags的种类分布情况。2.2.2.6CleanTags的比对统计和基因表达注释据统计，高等生物中含有CATG位点的基因约占其全基因组的98%，21bp的Tag长度可检测约25,000个基因。由于中蜂基因组尚未公布，且中蜂与意蜂同源基因间21bp的碱基序列差异甚微，因此，本研究以西方蜜蜂全基因组作为参考数据库。通过检索西方蜜蜂基因组中所有的CATG+17nt序列(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Apis_mellifera)，并建立参考标签数据库，参考数据库中基因总数为11,060，含CATG位点的基因数为10,395，对应的Tags数有68,608个，其中可注释的Tags数为67,646（表2-1）。将所有的CleanTags比对至参考数据库，最多允许一个碱基错配，对只比对到唯一一个基因的CleanTags进行基因注释，并对其数量进行标准化处理【TPM=（某基因的CleanTags数/该样本的CleanTags总数）*1,000,000】，所得结果即为该基因的表达量，即每一百万个CleanTags中某基因的[72]CleanTags数为该基因的表达量。未表达基因的表达量标准化为0.01。表2-1参考标签数据库Table2-1Referencetagsdatabase类型数量ReferenceGene11,060GenesWithCATGSite10,395(93.99%)TotalReferenceTags68,608UnambiguousTags67,646(98.60%)9 2.2.2.7差异表达基因的筛选本研究参照Tarazona等基于实验中对于生物重复的需要而提出的―NOISeq‖计算[73]方法对基因组间表达量进行差异比较，从而筛选出DEGs。此方法能更好地适应数据库的大小，更有效的控制假发现率(FalseDiscoveryRate,FDR)。NOISeq法的基本思想是若某基因表达量组间差异大于组内生物重复间差异，则认为差异显著。g具体而言，令Xij代表基因g在组i(i=1,2)生物重复j中表达量，利用两个计算gggggg公式来确定组间表达差异：Ms=log(1/2)和Ds=1-2。通过建立一个组内生物重复的集合(Mn,Dn)，以此构建一个“噪声”分布作为参照用于评估某基因组间表达量差异是否显著。计算某基因的组间比较结果建立集合(Ms,Ds)，从而构建一个累积分布函数F(|Ms|,|Ds|)。F值越大，代表差异显著的概率越高。如F=0.8时，则差异显著的概率为80%，本研究选取Q=F=0.8作为阈值。目前NOISeq法已得到广[74-75]泛应用。2.2.2.8GO功能显著性富集分析基因本体(GeneOntology,GO)是一个已广泛使用的基因功能分类系统，一共包括三个分支：基因在细胞组件中的位置(cellularcomponent)、发挥的分子功能(molecularfunction)和参与的生化过程(biologicalprocess)，其基本单位是词条(term)，每个term[76]对应一个属性。进行GO功能显著性富集分析（简称GO分析）可以确定DEGs的主要生物学功能。GO分析是将所有的DEGs映射至GO数据库(http://www.geneontology.org)的各term，以参考基因组作为背景，应用超几何分布确定DEGs中显著富集的GOterms，计算公式为：公式中，N表示参考基因组中带有GO注释的总基因数；n表示N中DEGs数；M表示参考基因组中某特定GOterm的基因数；m表示M中的DEGs数。所得结果经Bonferroni校正后，P≤0.05的GOterms定义为DEGs中显著富集的GOterms。2.2.2.9Pathway显著性富集分析基因在生物体中需要相互协调方能行使其生物学功能，Pathway显著性富集分析（简称Pathway分析）有助于对此进一步了解，确定DEGs参与的主要信号转导途径和生化途径。Pathway分析是以KEGG作为数据库，以参考基因组作为背景，应用超[77]几何分布确定DEGs中显著性富集的Pathway。Pathway分析的计算公式与GO分析相同，Q≤0.05的Pathways定义为DEGs中显著富集的Pathways。10 2.3实验结果2.3.1数据处理和测序质量评估如表2-2所示，中、意蜂出房、哺育和采集三个发育阶段咽下腺中原始reads经一系列去杂质数据处理所得CleanTags均约占总Tags的98%（由于采集蜂中原始reads含大量空载reads，导致意蜂采集蜂中CleanTags数只占总Tags的62%，图2-4），且各组CleanTags数无明显差异（约5,900,000，图2-4和图2-5）。各组数据中低质量Tags含量≤2%且各种杂质Tags总含量≤15%（去除采集蜂咽下腺中空载reads），符合测序质量要求。2.3.2测序饱和度与重复性分析如图2-6和图2-8所示，当测序的Tags量达到2M时，检测出的基因数增长曲线趋于平缓，即测序结果达到饱和。意蜂出房、哺育和采集蜂生物重复间相关性分别为0.886、0.999和0.997；中蜂分别为0.912、0.995和0.997，表明具有很高的可重复性（图2-7和图2-9）。2.3.3CleanTags拷贝数分布统计分别对中、意蜂三个发育阶段咽下腺中CleanTags拷贝数分布进行统计，结果显示超过80%的CleanTags拷贝数超过100，且其种类分布低于6.3%；而其余拷贝数低的CleanTags却占种类分布的大部分范围，如拷贝量在2~5间的CleanTags种类数超过52%，表明测序结果符合mRNAs的表达不均匀性（图2-10和图2-11）。2.3.4基因注释、标准化与差异表达基因的筛选将三个发育阶段咽下腺中检测所得CleanTags与参考数据库进行比对，对匹配至唯一一个基因的CleanTags进行基因注释。经标准化处理后统计每个基因的表达量，结果见表2-2。意蜂出房、哺育和采集蜂中分别有3,564,493、3,551,143和4,811,364个CleanTags与参考基因唯一匹配（生物重复间取平均值），分别代表了7,799、7,595和7,255个基因，占参考基因总数的69.25%、66.72%和62.22%。总共8080个基因；中蜂出房、哺育和采集蜂中分别有2,441,553、2,421,403和2,709,506个CleanTags与参考基因唯一匹配（生物重复间取平均值），分别代表了7125、6294和6882个基因，占参考基因总数的64.35%、57.50%和61.34%。总共7486个基因（图2-12）。本研究选取Q≥0.8作为基因表达差异显著的判断标准，将三个发育阶段咽下腺的基因表达量进行对比分析，结果发现哺育蜂VS出房蜂、采集蜂VS哺育蜂和采集蜂VS出房蜂三组对比数据中，意蜂分别有279、614和1419个DEGs，总共1482个，其中上调基因数分别为17、25和28个，下调基因数分别为262、589和1391个；中蜂分别有1209、103和331个DEGs，总共1313个，其中上调基因数分别为17、8611 和44个，下调基因数分别为1192、17和287个（图2-13）。此外，对中、意蜂间相同发育阶段咽下腺的基因表达量进行对比分析，发现出房、哺育和采集蜂中，分别有623、1072和462个DEGs，总共1417个，于意蜂中表达上调的基因数分别为509、981和182个，表达下调的基因数分别为114、91和280个（图2-14）。2.3.5GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析本研究着重对中、意蜂哺育蜂VS出房蜂和采集蜂VS哺育蜂两组对比数据的DEGs进行GO分析和pathway分析，结果表明意蜂出房蜂和哺育蜂间有21个条目，哺育蜂和采集蜂间有8个条目GO功能显著富集(P<0.05)。Pathway显著富集的信号通路分别有3个和6个(Q<0.05)，哺育蜂和出房蜂间显著富集的信号通路为―Ribosome‖,―Proteinprocessinginendoplasmicreticulum‖和―Proteinexport‖，采集蜂和哺育蜂间的富集信号通路为―Ribosome‖,―Metabolicpathways‖,―Oxidativephosphorylation‖,―Parkinson"sdisease‖,―Fattyacidmetabolism‖和―Proteinprocessinginendoplasmicreticulum‖，这些信号通路功能均与咽下腺的变化相符；中蜂出房蜂和哺育蜂间有53个条目，哺育蜂和采集蜂间只有1个条目―Proteintyrosine/serine/threoninephosphataseactivity‖GO功能显著富集(P<0.05)。Pathway分析发现有19个信号通路在哺育蜂和出房蜂间显著富集(Q<0.05)，其中有3个同样存在于意蜂哺育蜂和出房蜂间。而采集蜂和哺育蜂间未发现显著富集的信号通路。此外，对中、意蜂间1417个DEGs进行GO分析和pathway分析，其中有9个条目GO功能显著富集(P<0.05)，分别为―Cytoplasmicpart‖,―Cytoplasm‖,―Macromolecularcomplex‖,―Ribonucleoproteincomplex‖,―Mitochondrion‖,―Mitochondrialpart‖,―Structuralmoleculeactivity‖,―Metabolicprocess‖和―Organicsubstancemetabolicprocess‖。Pathway分析发现有―Ribosome‖,―Metabolicpathways‖,―Oxidativephosphorylation‖,―Parkinson"sdisease‖,―Fattyacidmetabolism‖,―Valine,leucineandisoleucinedegradation‖和―Proteinprocessinginendoplasmicreticulum‖等7个信号通道显著富集(Q<0.05)。12 表2-2中、意蜂咽下腺DGE测序结果统计Table2-2StatisticsofDGEsequencingofAccandAmlHGsSummaryNEW1NEW2Nurse1Nurse2Forager1Forager2TotalAml6,000,0006,000,0006,000,0006,000,0009,020,7229,018,19442,038,916RawTagAcc6,000,0006,000,0006,000,0006,000,0006,000,0006,000,00036,000,000Aml211,272198,230157,958160,974289,909256,7321,275,075DistinctTagAcc215,863219,554144,442130,883170,217213,9171,094,876Aml5,882,059(98.03%)5,890,202(98.17%)5,910,901(98.52%)5,911,105(98.52%)5,423,816(60.13%)5,849,152(64.86%)34867235(82.94%)CleanTagAcc5,883,978(98.07%)5,878,500(97.98%)5,917,830(98.63%)5,923,277(98.72%)5,904,132(98.40%)5,871,384(97.86%)35,379,101(98.28%)DistinctCleanAml100,676(47.65%)95,104(47.98%)77,435(49.02%)80,286(49.88%)61,548(21.23%)52,987(20.64%)468,036(36.71%)TagAcc106,580(49.37%)104,133(47.43%)71482(49.49%)63,646(48.63%)82,699(48.58%)95,883(44.82%)524,423(47.90%)AlltagAml3,958,194(67.29%)4,039,673(68.58%)4,749,009(80.34%)4,687,158(79.29%)4,578,511(84.41%)5,206,584(89.01%)27,219,129(78.07%)mappingtoAcc2,476,714(42.09%)2,570,588(43.73%)2,740,538(46.31%)2,755,741(46.52%)2,422,568(41.03%)3,091,826(52.66%)16,057,975(45.39%)geneUnambiguousAml3,549,912(60.35%)3,579,074(60.76%)3,550,900(60.07%)3,551,385(60.08%)4,465,416(82.33%)5,157,312(88.17%)23,853,999(68.41%)tagmappingAcc2,370,309(40.28%)2,512,797(42.75%)2,520,841(42.60%)2,321,965(39.20%)2,404,037(40.72%)3,014,975(51.35%)15,144,924(42.81%)togeneMappingtoAml1,100,732(18.71%)1,025,724(17.41%)732,560(12.39%)751,100(12.71%)558,499(10.30%)458,366(7.84%)4,626,981(13.27%)genomeAcc925,681(15.73%)1,002,791(17.06%)659,768(11.15%)492,653(8.32%)923,103(15.63%)773,385(13.17%)4,777,381(13.50%)AllAml8,060(72.88%)7,705(69.67%)7,725(69.85%)7,464(67.49%)7,388(66.8%)6,761(61.13%)45,103(67.97%)tag-mappedAcc7,317(66.16%)7,385(66.77%)6,656(60.18%)6,450(58.32%)6,961(62.94%)7,045(63.7%)41,814(63.01%)genesUnambiguousAml7,826(70.76%)7,491(67.73%)7,503(67.84%)7,255(65.6%)7,184(64.95%)6,578(59.48%)43,837(66.06%)Tag-mappedAcc7,077(63.99%)7,157(64.71%)6,469(58.49%)6,250(56.51%)6,743(60.97%)6,824(61.7%)40,520(61.06%)GenesAml823,133(13.99%)824,805(14.00%)429,332(7.26%)472,847(8.00%)286,806(5.29%)184,202(3.15%)3,021,125(8.66%)UnknowntagAcc2,481,583(42.18%)2,305,121(39.21%)2,517,524(42.54%)2,674,883(45.16%)2,558,461(43.33%)2,006,173(34.17%)14,543,745(41.11%)13 图2-4意蜂各样本中Tags数量和种类分布Fig2-4DistributionofTotalTagsandDistinctTagsineachAmlsample14 图2-5中蜂各样本中Tags数量和种类分布Fig2-5DistributionofTotalTagsandDistinctTagsineachAccsample15 图2-6意蜂各样本中CleanTags饱和度分析Fig2-6SaturationanalysisofthecleantagsineachAmlsample图2-7意蜂各生物重复样本间相关性Fig2-7ReproducibilitybetweenbiologicalreplicateAmlsamples16 图2-8中蜂各样本中CleanTags饱和度分析Fig2-8SaturationanalysisofthecleantagsineachAccsample图2-9中蜂各生物重复样本间相关性Fig2-9ReproducibilitybetweenbiologicalreplicateAccsamples17 图2-10意蜂各样本中CleanTags数量和种类分布Fig2-10DistributionofCleanTagsandDistinctCleanTagsinAmleachsample18 图2-11中蜂各样本中CleanTags数量和种类分布Fig2-11DistributionofCleanTagsandDistinctCleanTagsineachAccsample19 图2-12中、意蜂咽下腺共表达和特异表达注释基因分布Fig2-12Distributionofdevelopmentalstage-specificandco-expressedannotatedgenesinAmlandAccHGs图2-13中、意蜂咽下腺差异表达基因分布Fig2-13DistributionofDEGsinAmlandAccHGs20 图2-14中、意蜂相同发育阶段咽下腺间差异表达基因分布Figure2-14DistributionofDEGsbetweenthesamedevelopmentalstageofAmlandAccHGs2.4讨论2.4.1DEGs表达模式分析对意蜂1482个和中蜂1313个DEGs进行表达模式分析，发现大部分基因在出房蜂中表达量最高，随后表达量持续降低或在采集蜂中略微回升（图2-13和2-15），这与工蜂咽下腺的生理活性一致：刚羽化出房时工蜂咽下腺正处于迅速发育阶段，发育相关基因大量表达；尽管哺育蜂中咽下腺的发育程度和分泌活性达到最高，但咽下腺细胞的营养成分主要用于分泌王浆蛋白，因此与王浆蛋白合成及分泌相关基因高度表达而其他基因的表达量却有所降低；而采集蜂中咽下腺开始萎缩且蛋白分泌量锐减，因此大部分基因表达量维持较低水平或继续降低。此外，对中、意蜂间1417个DEGs进行分析，发现出房蜂和哺育蜂中大部分基因于意蜂中表达量更高，且哺育蜂中表达上调的DEGs数量最多，这或许就是中、意蜂间咽下腺发育程度和蜂王浆产量差异极显著的原因（图2-14）。2.4.2王浆主蛋白基因分析本研究发现7个王浆主蛋白基因于中、意蜂间共表达，分别为MRJP1(NM_001011579.1),-3(NM_001011601.1),-4(NM_001011610.1),-5(NM_001011599.1),-6(NM_001011622.1),-7(NM_001014429.1)和-8(NM_001011564.1)。中、意蜂间MRJPs表达模式一致：MRJP1、-5和-7表达量较高且于哺育蜂中最高；MRJP6表达量较低且于采集蜂中最高；MRJP8几乎不表达。此外，MRJP3和-4于意蜂哺育蜂中表达量最高，于中蜂中几乎不表达；MRJP6和-7表达量于中蜂中更高（表2-3，图2-16）。同时，对中、意蜂7个王浆主蛋白基因表达量进行聚类分析，研究发现MRJP1于中、意蜂间都有高丰度表达，且意蜂中表达量显著高于中蜂（哺育阶段无显著差异，Q<0.8，图2-16）。MRJP1是蜂王浆蛋白质的主要成分，约占WSPs总量的48％，21 [78]且是雌性蜜蜂级型分化的关键因子。因此我们认为，中、意蜂咽下腺在哺育阶段都需大量表达MRJP1以此维持蜂王浆功能，且MRJP1可能在出房蜂和采集蜂中发挥某些非营养功能。MRJP1~5是蜂王浆的主要成分，约占90%，具有显著的营养功能[13、21、79][80-83]；而中蜂采集蜂中高表达的MRJP6表明其可能具有某些非营养功能。MRJPs的非营养性功能已被广泛研究，如MRJP1、-2和-7可在大脑的覃形体中表达[21、84-85][86]。MRJP1和-3也可在雄蜂头部、幼虫及蜂王卵巢和幼虫中表达。更令人惊[80]讶的是MRJP8和-9存在于蜂毒中，蜂王浆中反而含量很少。2.4.3核糖体蛋白基因分析研究表明核糖体蛋白可与rRNAs结合形成核糖体的两个亚基进而参与细胞内蛋[87]白质的合成。本研究发现1417个DEGs中共有56个核糖体蛋白基因，约占全基因组中核糖体蛋白基因总数的1/3。其中，出房、哺育和采集蜂中差异显著的核糖体蛋白基因数分别为23、40和26。对56个基因表达量进行聚类分析，结果表明大多数核糖体蛋白基因的表达量在意蜂出房和哺育阶段显著高于中蜂，且哺育蜂中差异尤为显著（图2-17），表明意蜂咽下腺可能比中蜂咽下腺具有更强的王浆蛋白合成能力。2.4.4王浆分泌活性主要影响基因分析鉴于工蜂羽化出房后咽下腺迅速发育，且于6~12日龄时蜂王浆分泌活性最高，我们认为影响咽下腺泌浆活性的基因可能在哺育蜂中表达量最高且显著高于出房蜂和采集蜂，因此对中、意蜂间此类基因进行汇总分析（表2-4）。研究发现中、意蜂间分别有4个和6个基因与预期相符，但只有MRJP7一个基因中、意蜂间共存。尽管如此，我们仍发现这9个基因中有2个基因在中、意蜂中表达模式一致且于意蜂中表达量更高，分别为MRJP5和突触囊泡糖蛋白2C基因(SV2C,XM_394660.4)。SV2是所有突触囊泡和内分泌囊泡内与神经冲动传导密切相关的跨膜糖蛋白，它具有跨膜转运、细胞外基质蛋白受体、调节神经递质的浓度及释放和调节其他突触蛋白活性等[88-89]多种功能。目前关于SV2的研究主要侧重于SV2A和SV2B，SV2C是它们的同源基因，更接近于SV2A。尽管并没有找到任何资料证明SV2C可参与蛋白质外分泌，但是结合本研究SV2C的表达模式分析，本研究仍认为SV2C可能参与了王浆蛋白的合成和分泌过程。2.4.5TOR、胰岛素/IGF和TGF信号通路由于中、意蜂咽下腺形态差异显著，本研究推测中、意蜂咽下腺中细胞生长及分化相关影响基因可能存在表达差异，因此重点分析了此类基因，如TOR、胰岛素/IGF和TGF信号通路基因等。研究发现1417个DEGs中存在两个TOR信号通路基因：3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1,XM_394208.4)和真核细胞翻译起始因子4E(eIF-4E,XM_624287.3)；两个胰岛素/IGF信号通路基因：IGF-IImRNA结合蛋白基因22 (IMP,XM_393878.4)和细胞生长调节核仁蛋白基因(CGNP,XM_623800.3)。这四个基因的表达量在意蜂出房和哺育蜂中都显著高于中蜂，与中、意蜂咽下腺不同发育阶段形态差异变化相符（表2-5）。TOR和胰岛素/IGF信号通路是控制细胞生长的两个主[90]要途径：TOR信号通路作为多细胞生物的营养传感器并以此调控细胞生长；胰岛素/IGF信号通路依据内分泌信号参与协调细胞生长且在无脊椎动物和脊椎动物的生长调控中扮演了重要角色。此外，研究还发现TGF-β受体1基因(TGF-βR1,XM_003251608.1)在意蜂出房和哺育蜂中高丰度表达且显著高于中蜂。TGF-β信号通[91]路参与细胞的增值、分化、死亡和移位，是重要的生长调节因子。这些基因或许参与了促进意蜂咽下腺发育过程，一定程度上导致蜂王浆的高产。图2-15中、意蜂咽下腺差异表达基因的表达模式Fig2-15ExpressionpatternoftheDEGsinAmlandAccHGs23 表2-3中、意蜂咽下腺中王浆主蛋白基因Table2-3TheMRJPgenesinAmlandAccHGsNewNurseForagerQvalueQvalueGeneIDDescription(TPM)(TPM)(TPM)(Nurse/New)(Forager/Nurse)Aml54435.36120966.4336168.50.770.81NM_001011579.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein1precursorAcc21996.06132599.653164.2290.890.92Aml59.86105.311.300.650.94NM_001011601.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein3precursorAcc0.010.010.26**0.15Aml9893.3818936.27191.570.710.96NM_001011610.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein4precursorAcc0.607.860.600.730.70Aml1252.152578.851264.320.750.71NM_001011599.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein5precursorAcc133.87769.6751.610.880.86Aml2.812.2028.70.170.82NM_001011622.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein6precursorAcc40.03186.86669.480.870.78Aml39.25238.803.350.870.94NM_001014429.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein7precursorAcc1106.0211179.6264.640.890.99Aml0.770.850.010.080.44NM_001011564.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein8precursorAcc0.185.2414.110.680.63注：生物重复间基因TPM取平均值，未表达基因TPM标准化为0.01，下同。Note:TheTPMofthegenesbetweenbiologicalrepeatstakeanaverage,andtheTPMofgeneswhichdonotexpressedstandardizedto0.01,thesamebelow.24 图2-16中、意蜂相同发育阶段咽下腺间王浆主蛋白基因聚类分析Figure2-16HierarchicalclusteringanalysisofMRJPsgenesbetweenAmlandAccHGs图2-17中、意蜂相同发育阶段咽下腺间核糖体蛋白基因聚类分析Figure2-17Hierarchicalclusteringanalysisofthe56ribosomalproteingenesbetweenAmlandAccHGs25 表2-4中、意蜂咽下腺中蜂王浆分泌活性主要影响基因Table2-4GenessaffectingthesecretoryactivityofroyaljellyinAmlandAccHGsGeneIDNewNurseForagerQvalueQvalueDescription（意蜂哺育阶段表达量最高）(TPM)(TPM)(TPM)(Nurse/New)(Forager/Nurse)Aml39.92395.0325.940.880.85XM_001122741.2Apismelliferaproteintakeout-likeAcc60.8720.7826.210.810.28Aml3.9131.641.250.830.83Apismelliferasuccinatedehydrogenase[ubiquinone]XM_392269.4Acc31.3027.620.770.780.87flavoproteinsubunit,mitochondrial-likeAml39.25238.803.350.870.94NM_001014429.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein7precursorAcc1106.0211179.6264.640.890.99Aml5.4430.376.230.810.81XM_001121305.2Apismelliferavesicularglutamatetransporter2.1-likeAcc53.5637.9354.370.480.40Aml32.54148.454.960.860.85XM_394660.4Apismelliferasynapticvesicleglycoprotein2C-likeAcc14.2841.381.020.790.89Aml15.8965.1416.510.830.81Apismelliferapyridoxine/pyridoxamine5"-phosphateXM_623928.3Acc0.010.010.01****oxidase-likeGeneIDNewNurseForagerQvalueQvalueDescription（中蜂哺育阶段表达量最高）(TPM)(TPM)(TPM)(Nurse/New)(Forager/Nurse)Aml0.682.6250.360.430.55Apismelliferavoltage-dependentcalciumchannelXM_003251053.1Acc2.0460.8111.620.880.81subunitalpha-2/delta-3-likeAml54435.36120966.4136168.590.770.81NM_001011579.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein1precursorAcc21996.06132599.653164.220.890.92Aml1252.152578.851264.320.750.71NM_001011599.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein5precursorAcc133.87769.6751.610.880.86Aml39.25238.803.350.870.94NM_001014429.1Apismelliferamajorroyaljellyprotein7precursorAcc1106.0211179.6264.640.890.9926 表2-5中、意蜂间表达差异显著的信号通路基因Table2-5DifferentiallyexpressedsignalpathwaygenesbetweenAmlandAccHGsNewNurseForagerQvalueQvalueGeneIDDescription(TPM)(TPM)(TPM)(Nurse/New)(Forager/Nurse)XM_394208.4Aml118.43100.8378.500.280.39Apismellifera3-phosphoinositide-dependentproteinkinase1-likeAcc18.205.6641.500.750.81Qvalue(Aml/Acc)0.880.880.55****XM_624287.3Aml280.00124.433.680.770.85Apismelliferaeukaryotictranslationinitiationfactor4EAcc34.017.1012.510.830.47Qvalue(Aml/Acc)0.890.880.66****XM_393878.4Aml28.4618.272.120.520.80ApismelliferaIGF-IImRNA-bindingproteinAcc4.931.024.420.620.56Qvalue(Aml/Acc)0.810.840.43****XM_623800.3Aml109.7237.485.510.810.82Apismelliferacellgrowth-regulatingnucleolarprotein-likeAcc15.472.881.450.780.34Qvalue(Aml/Acc)0.880.860.58****XM_003251608.1Aml120.4782.3952.000.510.57ApismelliferaTGF-betareceptortype-1Acc6.632.4511.560.600.70Qvalue(Aml/Acc)0.890.880.78****27 第三章意大利蜜蜂咽下腺六个基因表达分析3.1引言由DGE测序实验可知，SV2C、PDK1、eIF-4E、IMP、TGF-βR1和CGNP可能与工蜂咽下腺发育及蜂王浆分泌有关。SV2C是所有突触囊泡和内分泌分泌囊泡内与神经冲动传导密切相关的跨膜糖蛋白；PDK1、eIF-4E、IMP、TGF-βR1和CGNP则与细胞生长及分化密切相关。然而，目前还没有这些基因在工蜂咽下腺中的功能研究。因此，本研究利用实时荧光定量PCR(q-PCR)技术比较了这六个基因在意蜂三个不同发育阶段（哺育、采集和逆转哺育）咽下腺中的表达差异。3.2实验材料与方法3.2.1实验蜜蜂本研究所用意蜂来源于江西农业大学蜜蜂研究所，选取2群作为生物重复，所有蜂群按标准技术饲养。3.2.2实验方法3.2.2.1蜜蜂样品的采取与咽下腺的解剖每群随机抓取哺育蜂（不断将头伸入有小幼虫的巢房内）、采集蜂（后足花粉耙[52]上带有花粉）和逆转哺育蜂（参考Huang等人实验方法）各60只，总共360只。所有蜜蜂均活体取样，随即放入液氮中速冻，并于-80℃保存，用于后续操作。咽下腺解剖详细步骤见第二章。3.2.2.2RNA的提取与cDNA的合成取20只同一蜂群、同一发育程度的意蜂咽下腺混合为一个样品放入含液氮的研钵内，研磨至粉末状后移置加有1mlTrizol的1.5mlEP管中。参考秦秋红实验方法[92]对样本RNA进行提取。最后所得总RNA通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。TM用核酸蛋白测定仪(NanoPhotometerP300,IMPLEN)测定OD260/280值（1.9~2.1之间符合标准）和RNA浓度值，每个样品测定3次，取平均值。将RNA标定至1μg，根据Takara试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。具体步骤如下：试剂体积(μL)总RNA1,000/RNA浓度Oligo-dT(50μM)3DEPC水23-1,000/RNA浓度总体积2628 将26μL试剂混匀，于70℃温育灭活5min后，立即冰浴5min。试剂体积(μL)RTM-MLVbuffer(5×,Takara)RTM-MLVbuffer(5×,Takara)10dNTP混合液(2.5mMeach,Takara)10RNase抑制剂(50U/μL,TransGen)2M-MLV反转录酶(50U/μL,Takara)2总体积24加入上述24μL试剂混匀，于42℃温育60min，随后于70℃温育5min，最后合成的cDNA加50μLDEPC水稀释，置于-80℃保存。3.2.2.3定量引物设计及实时荧光定量PCR根据NCBI网站上所示西方蜜蜂基因组序列，用Primer5.0软件设计引物序列。[93][94]因Gpdh和Arp1在蜜蜂发育过程中表达较稳定，本研究以之作为内参基因。实时荧光定量PCR所用引物序列见表3-1。表3-1q-PCR引物序列Table3-1Geneprimersusedinquantitativereal-timePCR基因名称基因编号上、下游引物序列(5′–3′)ACTCGGCTTGTGCTCGGTATT/SV2CXM_394660.4CTGCTTTGATTTATTCTTTTGCGATCAAACATCCACTTCAACATACA/eIF-4EXM_624287.3TACATTTACAACAGCCCCACAATCACCACCATCAACCCG/PDK1XM_394208.4GTAGGACAGGACGAAATAGAGTAGACGCAGGAACAAGCACAAC/IMPXM_393878.4CGAGAATACGAAGCGGGAAGTGTGAAAGAAAGCAACAAGAATGGA/CGNPXM_623800.3ACTGCTGATGGTATTTTGTGACGAGGTGTTACGATAAGGTGCG/TGF-βR1XM_003251608.1CGTGAGGAGGAATAAAGGGCGCTGGTTTCATCGATGGTTT/GpdhNM_001014994.1ACGATTTCGACCACCGTAACTCCTGGAATCGCAGATAGAATG/Arp1NM_001185146.1GGAAGGTGGACAAAGAAGCAAGQ-PCR实验采用10μL反应体系：1μLcDNA模板，灭菌超纯水3.2μL，上、下®TM游引物各0.4μL(10μM/L,invitrogen)及5μLSYBRPremixExTaqⅡ(Takara)，混匀、离心后放入q-PCR仪中扩增。Q-PCR反应条件：95℃预变性30s；40个PCR循环(95℃,10s;60℃,1min)。扩增反应结束后从55℃缓慢加热至95℃（每10s升高0.5℃），建立熔解曲线。每个cDNA重复三孔。29 3.2.2.4数据统计与分析运用Bio-RadiQ52.1软件计算各基因CT值（每个PCR反应管内荧光信号到达所[95-96]设定阈值时所经历的循环数），q-PCR软件包计算其扩增效率。各基因在不同样[93]品中的相对表达量的计算参考Huang等人试验方法，公式如下：Et：目的基因扩增效率，Ei：内参基因扩增效率，CT,t：目的基因CT值，CT,i：内参基因CT值，n：内参基因数量。采用StatView软件(v5.01,USA)―ANOVAorANCOVA‖方法对实验数据进行统计分析。3.3实验结果如图3-1所示，PDK1基因表达量在逆转哺育蜂中继续降低(P>0.05)，这与预期相反。其余5个基因表达量在逆转哺育蜂中与采集蜂相比都有不同程度回升【SV2C显著回升(P<0.05)，eIF-4E、IMP、CGNP和TGF-βR1有回升，但无显著差异(P>0.05)】。此6个基因在哺育蜂和采集蜂中的表达情况与DGE测序结果相符。3.4讨论SV2C是一种几乎存在于所有神经元及内分泌细胞内的跨膜糖蛋白，与神经递质[97]的正常分泌密切相关。此外，SV2同样存在于非神经内分泌细胞中。尽管并未找到任何文献证明SV2C可参与蛋白外分泌，但是依据本研究DGE测序实验和q-PCR实验中SV2C的表达情况，本研究仍认为SV2C可能与咽下腺王浆分泌活性相关。研究表明IMP、TGF-βR1、PDK1和eI-4E分别属于IGF、TGF、PKB/Akt和TOR信号通路基因。IMP和TGF-βR1可引导IGF-II和TGF-β激活磷酸肌醇3激酶(PhosphatidylInositol3-Kinase,PI3K)进而直接或在PDK1协助下激活PKB/Akt信号通路。随后激活许多下游信号通路，如调控蛋白分泌和细胞生长的TOR信号通路。此外，几乎所有的核糖体的加工和组装都在核仁中完成，核仁蛋白基因与核糖体的合成密切相关，CGNP参与调控细胞增殖和死亡。TOR和IGF信号通路是公认的调控细[90]胞生长的两条主要信号通路，TGF-β信号通路参与包括增殖、分化、死亡和移位等[91]在内几乎所有的细胞行为。总之，这5个基因可通过相互作用参与调控碳水化合物[98-99]代谢、脂质代谢和蛋白质代谢、细胞分化、增殖、凋亡和寿命调控等生理变化。本研究表明eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1在出房蜂和哺育蜂中表达量显著高于采集蜂，在逆转哺育蜂中表达量回升，这与咽下腺的生理变化一致：出房蜂中咽下腺处于迅速发育阶段，哺育蜂中咽下腺需要分泌大量蜂王浆；因此与之有关的基因大量表达，而采集蜂中咽下腺开始萎缩、蛋白分泌量锐减和大量细胞凋亡，因此基因表30 达量迅速降低；然而逆转哺育蜂中咽下腺重新发育且生物代谢再次活跃，与之有关的基因表达量也因之大量回升。因此，结合eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1的生物功能及其表达情况，本研究认为它们或许参与了咽下腺的发育。与上述4个基因相反，PDK1的表达量随时间推移而持续降低，与本研究DGE测序结果中PDK1表达模式一致(P>0.05)。因此，本研究认为PDK1可能参与调控咽下腺的寿命。Reddy也曾发[100]现PDK1可通过PDK1-PKB/Akt-S6K1-rpS6信号通路调控小鼠卵母细胞寿命。总之，本研究表明SV2C可作为影响咽下腺蜂王浆分泌活性的候选基因，eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1可能与咽下腺的发育相关，而PDK1可能与咽下腺寿命相关。最后，本研究绘出咽下腺中IGF、TGF和TOR3个信号通路网络简略图（图3-2）。图3-1SV2C,PDK1,eIF-4E,CGNP,TGF-βR1和IMP在不同发育阶段咽下腺中的表达Fig3-1ExpressionofSV2C,PDK1,eIF-4E,cellgrowth-regulatingnucleolarprotein,TGF-βR1andIMPinthedifferentdevelopmentalstagesofHGs注：N代表哺育蜂；F代表采集蜂；RN代表逆转哺育蜂。不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。N:nursestage;F:foragerstage;RN:reversednursestage.Differentlettersontopofbarsindicatesignificantdifference(P<0.05)betweenthegroups.31 图3-2咽下腺中TGF,IGF和TOR信号通路网络简略图Figure3-2ThesketchofTGF,IGFandTORsignalpathwaynetworkinHGs注：TGF：转录起始因子；IGF：胰岛素生长因子；IRS1：胰岛素受体底物1；PI3K：磷脂酰肌醇三激酶；PIP2：磷酯酰肌醇二磷酸；PIP3：三磷酸磷脂酰肌醇；PKB/Akt：蛋白激酶B；FOXO：叉头框；TOR：雷帕霉素靶蛋白S6K：核糖体蛋白S6激酶;GSK3:糖原合成激酶。Note:TGF:transforminggrowthfactor;IGF:insulin-likegrowthfactor;IRS1:insulinreceptorsubstrate1;PI3K:phosphoinositide3-kinase;PIP2:phosphatidylinositalbiphosphate;PIP3:phosphatidylinositoltrisphosphate;PKB/Akt:proteinkinaseB;FOXO:forkheadbox;TOR:mammaliantargetofrapamycin;S6K:ribosomalproteinS6kinase;GSK3:glycogensynthasekinase3.32 第四章结论与展望4.1主要结论（1）利用DGE技术，首次系统比较了中蜂和意蜂不同发育阶段咽下腺（出房、哺育和采集）中mRNAs的表达差异。分别从中、意蜂不同发育阶段咽下腺中获得1313个和1482个DGEs，中、意蜂间相同发育阶段咽下腺中获得1417个DEGs。（2）通过中、意蜂mRNAs表达量综合分析，筛选出6个候选基因，即1个蜂王浆分泌活性影响基因（SV2C）和5个咽下腺发育影响基因（PDK1、eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1）。（3）采用q-PCR技术首次分析了意蜂三个发育阶段咽下腺（哺育、采集和逆转哺育）6个候选基因的表达情况，研究表明SV2C、eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1六个基因可能参与了蜂王浆分泌及咽下腺发育的调控，而PDK1可能与咽下腺寿命相关。4.2研究展望（1）虽然本研究首次在基因组层面上对中、意蜂不同发育阶段（出房、哺育和采集）咽下腺mRNAs进行DGE综合分析，为深入了解工蜂咽下腺发育和蜂王浆分泌的分子机理提供了重要信息，但详细机理目前仍不清楚，且其中有些未知功能的基因仍有待进一步注释。（2）本研究表明SV2C、eIF-4E、CGNP、IMP和TGF-βR1可能参与了蜂王浆分泌及咽下腺发育的调控，但仍需应用其它实验进一步验证，例如可对越冬工蜂咽下腺进行q-PCR分析或对哺育工蜂进行RNAi分析等。此外它们的详细机理也还有待进一步研究。33 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攻读硕士期间已发表和已投稿论文及获奖情况Ⅰ.已发表和已投稿的主要论文：[1]HaoLiu,Zi-LongWang,Liu-QinTian,Qiu-HongQin,Xiao-BoWu,Wei-YuYan,Zhi-JiangZeng.TranscriptomedifferencesinthehypopharyngealglandbetweenWesternHoneybees(Apismellifera)andEasternHoneybees(Apiscerana).BMCgenomics,2014,15:744.(SCI,IF=4.041)[2]HaoLiu,Zi-LongWang,Lin-BinZhou,Zhi-JiangZeng.Quantitativeanalysisofthegenesaffectingdevelopmentofthehypopharyngealglandinhoneybees(ApismelliferaL.).Sociobiology,2015,accept(SCI,IF=0.364)[3]Xu-JiangHe,Liu-QinTian,CuiGuan,AndrewB.Barron,HaoLiu,Xiao-BoWu,Zhi-JiangZeng.Behaviourandmolecularphysiologyofnursesofworkerandqueenlarvaeinhoneybees(Apismellifera).JournalofAsia-PacificEntomology,2014,17:911-916.(SCI,IF=0.875)[4]田柳青,刘浩,何旭江,曾志将.蜜蜂也会轮班工作.蜜蜂杂志,2012,12:4-6.[5]潘其忠,巢福海,刘浩,颜伟玉.江西半枫荷蜜理化指标和香味成分分析.蜜蜂杂志,2013(8):5-6.[6]吴小波,王子龙,李淑云,甘海燕,刘浩,颜伟玉,曾志将.羽化和性成熟时中华蜜蜂蜂王和雄蜂转录组分析.昆虫学报,2014,8:007.[7]田柳青,何旭江,吴小波,甘海燕,韩旭,刘浩,曾志将.基于RFID技术的西方蜜蜂采集行为研究.应用生态学报,2014,25(3):831-835.Ⅱ.主要获奖情况：[1]国家硕士研究生奖学金获得者，2014年。40 致谢能够顺利完成本论文，首先需要感谢导师曾志将教授的悉心指导和帮助。从选取课题、设计方案到撰写论文，甚至在日常生活上，曾老师都给予了我及时的帮助。读研期间，曾老师渊博的学识、严谨的治学态度以及勤恳的工作作风，都是我追求的目标和学习的榜样。本论文在实验过程中还得到了实验室颜伟玉、吴小波和王子龙老师的指导和帮助，让我克服了一次次困难。衷心地祝您们！此外，还要感谢身边许多同学的大力支持和热心帮助，非常感谢大家让我的三年研究生生活变得如此多姿多彩。最后我还要特别感谢我的家人、亲戚和朋友。在物质上和精神上都给予了我莫大帮助，让我能顺利的完成学业。谨以本文献给所有关心和帮助我的老师、同学和朋友们，衷心地祝福您们身体健康、工作顺利、阖家幸福！刘浩2015年5月41