亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡影响研究 102页

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中国农业科学晓博壬学位论文评阅人、答辩委员会签名表定文香目亚致死剂量ｎ比虫嘛对蜜蜂脑神经细胞调亡影响研究胃誦专业研誦Ｉ；ＩＩＩ）＞蠢导教师周婷研究员培养单位（研巧所、中也■蜜蜂研究所＾｜Ｉ—１＊｜，ｊ１］１Ｉ姓名职称单位专业签名Ｓ！＿＿—＾张劍研究员农龍抛崖糸ｙ严Ｉ中国科动勸研张润志研究员农化昆虫与害虫荫治ｉ認＾扭奔秦玉川教授中国农业大学农业昆虫与害虫巧治Ａ离希武教授中圍农业大学农业邑虫与畜虫防治＾彩万志教授中国农业大学农业昆虫与害虫防治＾吴杰研究员ｍｍｍｍ：中国院蜜徐书法研究货認諸特种经济动顿饲养知令集会议记录（秘书）杨磊论文答辩时间地点２０１５年５月２２日蜜蜂所＇？， 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成，论文中不包含其他人已经发■，長巧所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外表写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证一中作了巧面使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文—巧碗的说明并表示了谢意。研究生签名：矣．时间：｝々巧年５月＊日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科、缩学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文彼査巧和借巧，可Ｗ采用影印论文。同意中国农业科学院可＊＾用不同方式在不巧或扫描等复制手段保存、汇编学位。同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容＊时邮７＾１５年《月＜２／曰研究生签名：Ｘ掉丰？导师签名时间：年月日：之【＾ 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡影响研究ApoptosisintheNerveCellsofHoneyBee(ApismelliferaL.)BrainInducedbytheSublethalDosesofImidacloprid博士研究生：吴艳艳指导教师：周婷研究员申请学位类别：农学博士专业：特种经济动物饲养研究方向：特种经济动物病虫害与疫病防治培养单位：蜜蜂研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationApoptosisintheNerveCellsofHoneyBee(ApismelliferaL.)BrainInducedbytheSublethalDosesofImidaclopridPh.D.Candidate：WuYanYanSupervisor：ZhouTingMajor：SpecialEconomicAnimalsRearingSpecialty:PestsandEpidemicDiseasesControlofSpecialEconomicAnimalsMay2015 摘要蜜蜂是重要的授粉昆虫之一，却受到环境有毒有害物的侵害。新烟碱类杀虫剂是目前广泛应用的杀虫剂之一，据报道新烟碱类杀虫剂在亚致死剂量时能够引起蜜蜂幼虫中肠、卵巢和唾液腺等部位的细胞凋亡，而此类杀虫剂的作用靶标位置主要位于昆虫脑部，因而对其脑神经细胞的影响更有针对性，此方面报道较少；此外，该类杀虫剂同样影响蜜蜂的学习和记忆能力，而有关其运动能力的研究较少。有关此类杀虫剂对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，结合蜜蜂爬行能力的检测，为研究此类杀虫剂对非靶标昆虫—蜜蜂的神经毒性提供一定的理论基础。本实验以新烟碱类杀虫剂的代表品种吡虫啉为供试杀虫剂，以成年意大利蜜蜂为实验对象，分别从蜜蜂脑组织、细胞、亚细胞和分子水平，研究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，并与爬行能力检测方法相结合，探求亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的神经毒性。具体结果如下：1.在实验室水平，吡虫啉剂量为每头每天饲喂0.5、1.5和4.5ng，分别对处理3、6、9和12d的蜜蜂进行取样，利用TUNEL法检测成年蜜蜂脑神经细胞的凋亡情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡；并且细胞凋亡率随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应。2.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，利用Caspase-3免疫荧光法检测成年蜜蜂脑神经细胞的凋亡情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内Caspase-3蛋白的激活；并且阳性细胞率随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应；并且与脑神经细胞凋亡正相关。3.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，利用荧光定量法检测caspase-1基因的转录情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内caspase-1mRNA表达量，随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应。结合Caspase-3实验的结果，推测亚致死剂量吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞凋亡与Caspase依赖型凋亡途径相关。4.在实验室水平，每头每天饲喂蜜蜂1.5ng吡虫啉剂量，处理9d时，利用透射电镜法检测蜜蜂脑神经细胞超微结构的变化情况。结果显示在亚细胞水平，处理组的蜜蜂脑神经细胞与空白对照组相比存在明显的形态学变化，其中染色质凝聚并边集到核膜上、凋亡小体形成、细胞核变小等形态学变化，呈现凋亡现象，而不同于典型凋亡特征的是细胞核延迟降解；另外，自噬包括自噬泡、自噬体的出现以及线粒体、内质网和高尔基体等肿胀和发泡等现象。5.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，测定了亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行能力和存活率的影响，并比较了脑细胞凋亡、爬行能力和存活率之间的关系。结果显示，在吡虫啉特定剂量和暴露时间时，虽然蜜蜂存活率无显著性差异，却能够引起蜜蜂爬行能力显著性降低；并且在相同处理条件下，在低剂量（0.5和1.5ng）吡虫啉作用下，蜜蜂脑神经细胞凋亡率较其他两个指标（存活率和爬行能力）较早出现显著性差异。关键词：蜜蜂，吡虫啉，神经细胞，凋亡，自噬，爬行行为I AbstractHoneybeesareimportantpollinators,buttheyarecurrentlythreatenedbynoxioussubstancesintheenvironment.Neonicotinoidisoneofthemostwidelyusedpesticides.Itwasreportedthatsublethatldoseofneonicotinoidpesticidescouldinduceapoptosisinthecellsofmidgut,ovariesandsalivaryglandsofbeelarvae.Whilethetargetsiteofthesepesticideswasatthebrainofinsets,thestudyontheneuronofbrainwaswell-focused,onwhichtheinformationwaslimited.Moreover,neonicotinoidpesticidescanalsoaffectthelearningandmemorycapacityofthehoneybees.However,veryfewreportshavebeenknowninthisaspect.Wediscussedtheeffectofneonicotinoidpesticidesontheapoptosisofbrainneuronsofthehoneybees.Bytestingtheclimbingabilityofthehoneybees,theneuraltoxicityofneonicotinoidpesticidesonhoneybeesasanon-targetinsectwasevaluated.Imidacloprid,therepresentativeofneonicotinoidpesticides,wasusedasthepesticideagainsttheadultApismelliferaL..Thebraintissueswereharvested,andtheeffectofthesublethaldoseofimidaclopridontheapoptosisofbrainneuronsofthehoneybeeswasanalyzedonthemolecularandsubmolecularlevels.Theneuraltoxicityofimidaclopridwasevaluatedbycombiningwithtestingapoptosisandtheclimbingabilityofthehoneybees.Theresultswereobtainedasfollows:1.Underlaboratoryconditions,thehoneybeesweredailyfedwithimidaclopridatthedoseof0.5,1.5and4.5ng/individual,respectively.Samplingsweredoneon3,6,9and12doftreatment.TUNELassaywasperformedtodetecttheapoptosisofbrainneuronsofadulthoneybees.Resultsshowedthatthesublethaldoseofimidaclopridcouldinducetheapoptosisofbrainneurons.Thecellapoptosisrateincreasedwiththedoseandtheprolongingoftreatmenttime,indicatinganobviousdoseandtimeeffect.2.Underthesametreatmentmethodsandfeedingconditions,immunofluorescencemethodwasadoptedtodetecttheapoptosisofbrainneuralcellsinadulthoneybeesbymeasuringthelevelofCaspase-3.ItwasfoundthatthesublethaldoseofimidaclopridcouldinducetheactivationofCaspase-3inthebrainneurons.Thepositivecellrateincreasedwiththedoseandtheprolongingofthetreatmenttime,showingadoseandtimeeffect.Moreover,apositivecorrelationwasobservedwiththeapoptosisofbrainneurons.3.FluorescencequantitativemethodwasusedtodetectthetranscriptionallevelofCaspase-1gene.ResultsshowedthatthesublethaldoseofimidaclopridcausedthemRNAexpressionofCaspase-1inbrainneuralcellstoincreaseinadose-andtime-dependentmanner.CombiningwiththedetectionoftheCaspase-3expression,itisinferredthattheapoptosisofbrainneuralcellsinducedbysublethaldoseofimidaclopridisassociatedwiththeCaspase-dependentapoptoticpathway.4.Eachbeewasfedwith1.5ngimidacloprideveryday.At9doffeeding,transmissionelectronmicroscopywasemployedtoobservetheultrastructuralchangesofbrainneurons.Thetreatmentgroupandtheblankcontrolgroupshowedobviousdifferencesinsubmolecularmorphology.Inthetreatmentgroup,thechromatinwascondensedandconcentratedonthenuclearmembranewiththeformationofII apoptoticbodiesandreducedsizeofnuclei.Theseweretypicalapoptoticsigns,exceptforthedelayeddegradationofnuclei.Thesignsofautophagyincludedtheformationofautolysosomesandautophagosomesandtheswellingofmitochondria,endoplasmicreticulaandGolgiapparatuses.5.Theeffectofsublethaldoseofimidaclopridontheclimbingbehaviorandsurvivalofadulthoneybeeswasevaluated,andtherelationshipbetweenapoptosisofbrainneurons,climbingabilityandsurvivalrateofthebeeswastested.Accordingtotheresults,althoughtherewasnosignificantdifferenceinsurvivalrateunderthegiventreatmentdoseandtime,theclimbingabilityofbeesinthetreatmentgroupwasobviouslyimpaired.Otherconditionsbeingconstant,astatisticallysignificantdifferencebetweenthetwogroupswasobservedatanearliertimeintheapoptosisrateofbrainneuonsunderlowdosethanintheindicatorsofclimbingabilityandsurvivalrate.Keyword:honeybee,imidacloprid,neuron,apoptosis,autophagy,climbingbehaviorIII 目录第一章引言...................................................................................................................11.1蜜蜂的重要性...........................................................................................................11.2蜂群崩溃失调现象...................................................................................................21.3新烟碱类杀虫剂及危害...........................................................................................41.3.1新烟碱类杀虫剂概况........................................................................................41.3.2昆虫神经系统....................................................................................................51.3.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害........................................................................71.4细胞凋亡...................................................................................................................91.4.1定义....................................................................................................................91.4.2细胞凋亡检测方法..........................................................................................101.4.3细胞凋亡技术在蜜蜂领域的应用..................................................................121.5自噬.........................................................................................................................131.6蜜蜂行为学检测.....................................................................................................141.7本研究的目的意义、研究内容和技术路线.........................................................151.7.1本研究的目的意义..........................................................................................151.7.2研究内容..........................................................................................................161.7.3技术路线..........................................................................................................17第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测..........................................................182.1材料与方法.............................................................................................................182.1.1材料..................................................................................................................182.1.2方法..................................................................................................................192.2结果与分析.............................................................................................................272.2.1成年意蜂工蜂脑组织和脑切片......................................................................272.2.2蜜蜂脑神经细胞群的分布..............................................................................322.2.3吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞凋亡率..............................................352.3讨论.........................................................................................................................37第三章Caspase-3活性的免疫荧光法检测....................................................................40IV 3.1材料与方法.............................................................................................................403.1.1材料..................................................................................................................403.1.2方法..................................................................................................................403.2结果与分析.............................................................................................................423.2.1不同部位Caspase-3的阳性细胞率................................................................423.2.2吡虫啉处理后蜜蜂脑神经细胞Caspase-3阳性细胞率................................443.3讨论.........................................................................................................................45第四章caspase-1mRNA表达量的测定........................................................................484.1材料与方法.............................................................................................................484.1.1材料..................................................................................................................484.1.2方法..................................................................................................................494.2结果与分析.............................................................................................................524.3讨论.........................................................................................................................52第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化.............................................555.1材料与方法.............................................................................................................555.1.1材料..................................................................................................................555.1.2方法..................................................................................................................565.2结果与分析.............................................................................................................565.3讨论.........................................................................................................................65第六章蜜蜂爬行能力检测.............................................................................................676.1材料与方法.............................................................................................................676.1.1材料和仪器......................................................................................................676.1.2方法..................................................................................................................676.2结果与分析.............................................................................................................696.2.1中毒后蜜蜂的症状..........................................................................................696.2.2爬行行为能力的改变......................................................................................696.2.3蜜蜂幸存率......................................................................................................716.2.4蜜蜂幸存率、爬行能力及凋亡率..................................................................71V 6.3讨论.........................................................................................................................73第七章全文结论.............................................................................................................75参考文献.............................................................................................................................76致谢.............................................................................................................................86作者简历.............................................................................................................................87VI 图目录图1.2神经细胞结构.........................................................................................................5图1.3蜜蜂脑神经细胞.....................................................................................................6图1.4Apisα7-1mRNA在成年蜜蜂脑部的表达.............................................................8图1.5TUNEL法检测过程.............................................................................................11图1.6蜜蜂幼虫各组织内细胞凋亡的TUNEL法检测................................................12图1.7线粒体自噬的分子机制.......................................................................................14图2.1蜜蜂的实验室内饲养...........................................................................................20图2.2蜂笼和食槽...........................................................................................................21图2.3样品包埋后的形状...............................................................................................24图2.4贴附在载玻片上的蜜蜂脑切片...........................................................................24图2.5意大利蜜蜂脑部侧面观示意图...........................................................................25图2.6意大利蜜蜂脑组织和脑切片...............................................................................29图2.7未经切片的蜜蜂脑组织和神经细胞（Hosech33285染色）...........................29图2.8蕈体内联系神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）.........................................30图2.9视神经交叉处的神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）.................................30图2.10嗅叶处神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）..............................................31图2.11成年意大利蜜蜂工蜂脑神经细胞分布（Hoechst33258染液）....................34图2.12吡虫啉诱导的意大利蜜蜂蕈体内联系神经细胞的凋亡情况.........................36图2.13吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞的凋亡率.............................................37图3.1蜜蜂脑组织冰冻切片...........................................................................................42图3.2吡虫啉处理后成年意大利蜜蜂脑神经细胞Caspase-3的免疫荧光检测.........43图3.3吡虫啉诱导的蜜蜂蕈体冠内联系神经细胞caspase-3的激活情况.................44图3.4吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞Caspase-3阳性细胞率.........................45图4.1蜜蜂脑组织内caspase-1mRNA的表达量.........................................................52图5.2空白组蕈体内的联系神经细胞...........................................................................58图5.3空白组联系神经细胞内的细胞器.......................................................................58图5.4空白组视神经交叉处的神经细胞内的细胞器...................................................59VII 图5.5空白组联系神经细胞内的线粒体.......................................................................59图5.6实验组视神经交叉处凋亡的神经细胞...............................................................60图5.7实验组联系神经细胞内核膜模糊.......................................................................61图5.8实验组联系神经细胞细胞核皱缩.......................................................................62图5.9实验组联系神经细胞染色质凝集.......................................................................62图5.10实验组联系神经细胞内凋亡小体.....................................................................63图5.11实验组视神经交叉处神经细胞内线粒体肿胀................................................63图5.12实验组联系神经细胞内质网发泡.....................................................................64图5.13实验组联系神经细胞内自噬体.........................................................................64图5.14实验组联系神经细胞内自噬泡与线粒体.........................................................65图5.15实验组视神经交叉处神经细胞内自噬体和自噬泡.........................................65图6.1蜜蜂爬行能力测试盒...........................................................................................68图6.2吡虫啉处理后蜜蜂的症状...................................................................................69图6.3吡虫啉处理后蜜蜂的爬行能力情况...................................................................70图6.4吡虫啉处理后蜜蜂的存活率...............................................................................70图6.5吡虫啉处理3d时的存活率/爬行能力/凋亡率...................................................71图6.6吡虫啉处理6d时的存活率/爬行能力/凋亡率..................................................72图6.7吡虫啉处理9d时的存活率/负趋地爬行行为/凋亡率.......................................72图6.8吡虫啉处理12d时的存活率/负趋地爬行行为/凋亡率.....................................73VIII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称A.m.Apismellifera意大利蜜蜂CCDcolonycollapsedisorder蜂群崩溃失调AChacetylcholine乙酰胆碱AChRacetylcholinereceptor乙酰胆碱受体LD50Themedianlethaldose致死中量LC50Themedianlethalconcentration致死中浓度terminaldeoxynueleotiodyltrasferasemediated末端脱氧核苷酸转移酶介导TUNELdUTPnickandendlabeling的dUTP缺口末端标记TdTterminaldeoxynucleotidyltransferase末端脱氧核苷酸转移酶FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素dUTP2"-deoxyuridine5"-triphosphate2"-脱氧-5"-三磷酸尿苷天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋Caspasecysteineasparticacidspecificprotease白酶ICEInterleukin-1βconvertingenzyme白介素1β转化酶PERProboscisExtensionReflex吻伸反射PARPpolyADP-ribosepolymeraseDNA修复酶HEHematoxylinandeosin苏木素和伊红IX 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言1.1蜜蜂的重要性蜜蜂属于膜翅目（Hymenoptera）、蜜蜂科（Apidae）、蜜蜂属（Apis）。蜜蜂属有9个种，其中多数蜜蜂种类分布在亚洲，大蜜蜂（A.dorsataF.）、黑大蜜蜂（A.laboriosaS.）、小蜜蜂（A.floraeF.）、黑小蜜蜂（A.andreniformisS.），多分布于热带亚洲国家；东方蜜蜂（A.ceranaF）分布在热带和温带的亚洲地区；西方蜜蜂（A.mellifera）分布范围最广，在世界多数国家均有分布（吴杰，2013）。西方蜜蜂是目前饲养蜂群数量最多的蜂种，根据地理位置的不同，可分为3类（表1.1）（胥保华，2000）。欧洲类型中的意大利蜜蜂（A.m.ligusticaS.）、欧洲黑蜂（A.m.melliferaL.）、卡尼鄂拉蜂（A.m.carncaP.）和高加索蜂（A.m.caucasicaG.）因其适应性强、蜂王繁殖力和蜂群产出高而成为经济价值最高的蜂种；我国主要饲养蜂种为意大利蜜蜂。蜜蜂为社会性昆虫，由三种承担不同职能的蜜蜂类型组成的有机群体叫做蜂群。任何一只蜜蜂不能单独生活，而是所有蜜蜂互相依存，共同生存和繁衍。蜂群通常由一只蜂王、几万只工蜂和几百只到上千只的雄蜂组成。这三种类型的蜜蜂相互配合，默契合作。除蜂王外，工蜂和雄蜂的数量随季节的变化而变化。工蜂为生殖器官发育不完全的雌蜂，个体比蜂王和雄蜂小，但数量占蜂群总数的绝大多数，且是承担最多分工的蜂种（周婷，2014）。绝大多数现存的被子植物的有性生殖均依赖于昆虫授粉而完成，其中包括70%以上供人类食用和利用的(Cox-Fosteretal.,1996;Kearnsetal.,1998)农作物；此外，绝大多数的野生植物的生存也需要依赖昆虫授粉（insectpollinators）(Greenleaf&Kremen,2006;Kleinetal.,2007;Winfreeetal.,2008；Decourtyeetal.,2010)。昆虫传粉在维持生态平衡和生物多样性方面具有重要的、不可替代的作用(MorseandCalderone,2000;AshmanandMorgan,2004;Kleinetal.,2007;吴杰，2013)。在世界范围内，蜜蜂是最重要和最具价值的授粉昆虫之一(Watanabe,1994)。经蜜蜂授粉后的农作物，不仅作物产量有所提高，而且其品质也有不同程度的提高（周冰杰和张淑娟，1994；吴杰，2013）。此外，蜜蜂是最常见的被人类驯化的授粉昆虫之一。蜜蜂个体和整个蜂群能够为人们带来多种多样的蜂产品，其中包含具有食用和医用价值的蜂王浆、蜂蜜和蜂胶，具有化工和医用价值的蜂蜡、蜂毒和蜂胶蜂产品（Farooquietal.,2012）；基于这些方面的作用，蜜蜂对社会和经济价值高。同时，当某些因素影响或危害到自然和生态环境时，蜜蜂能够作为生物指示器为人类提供有价值的信息和数据(CelliandMaccagnani,2003)。由此可见，蜜蜂对自然界（包括生态环境、植物和人类等）具有诸多贡献和不可替代的重要性，也提示我们需增加对蜜蜂的关注度，并增强对蜜蜂的保护意识。1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言表1.1西方蜜蜂的分类Table1.1ClassificationofA.mellifera中文名称拉丁名称欧洲型意大利蜜蜂A.m.ligusticaSpinola欧洲黑蜜蜂A.m.melliferaLinnaeus卡尼鄂拉蜜蜂A.m.carnicaPollmann高加索蜜蜂A.m.caucasicaGorbatschev黄色高加索蜜蜂A.m.remipesGerstacker伊比利亚蜂A.m.ibericaGoetze马其顿蜂A.m.cecropiaKiesenwetter黄色高加索蜜蜂A.m.remipesGerstacker中东型安纳托利来蜜蜂A.m.anatoliacaMaa叙利亚蜜蜂A.m.syriacaButtel-Reepen波斯蜜蜂A.m.meaShoridov塞浦路斯蜜蜂A.m.cypriaPollmann非洲型摩洛哥大蜂A.m.majorRuttner埃及蜜蜂A.m.LamarckilCockerll坦桑海滨蜜蜂A.m.litorenSmith塞内加尔蜜蜂A.m.adansoniiLatreille单色蜜蜂A.m.unicolorLatreille突尼斯蜜蜂A.m.intermessaButtel-Reepen撒哈拉蜜蜂A.m.sahariensisBaldensperger东非蜜蜂A.m.scutellataLepeletier乞力马扎罗蜜蜂A.m.menticolaSmith海角蜜蜂A.m.capensisEscholtz也门蜜蜂A.m.yementiticaRuttner1.2蜂群崩溃失调现象虽然蜜蜂对环境有很好的适应性，但相对与其他昆虫而言，蜜蜂体内缺乏相应的解毒酶（Claudianosetal.,2006），来自环境和人为因素对蜜蜂造成的多方面影响仍然不容忽视。目前，蜂群崩溃失调（colonyccollapsedisorder,CCD）现象是世界范围内养蜂界较为关注的事件。此事件起源于2006年，位于美国东海岸的商业蜂场出现了场内蜂群急剧减少的异常现象，此态势迅速蔓延到西海岸的部分蜂场。其中受害严重的甚至全部蜂群消失殆尽。平均损失率均在30%以上，尤其在冬季蜂群越冬期间，蜂群更是损失惨重。美国30%以上的农作物需要蜜蜂进行授粉，而且很大比例是其国内商业养蜂场出租蜂群为大面积作物进行授粉（倪龙凤等，2007）。由于蜂群崩溃失调现象使得很多蜂场，包括商业养蜂场，2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言遭受了严重的损失，蜂群保有量在短时间内急剧降低；这种现象引起后续农作物，另有桃、樱桃和各种瓜类等经济作物接受蜜蜂授粉机会出现不同程度的短缺，由此也引起了后续农产品的产出率降低。蜜蜂的消失也在很大程度上影响了依赖以植物为食的牲畜；多种畜牧业需要的草料也部分依靠蜜蜂进行授粉。由于此次病害出现的症状与往年蜂群正常的损失情况区别很大（Johnsonetal.,2009；吴艳艳等，2013），因而该国养蜂业人将其定为新的病症，称其为“蜂群崩溃失调”。该现象从北美国家传播到中东国家、南美洲部分国家和德国、法国、英国等欧洲多个国家。至今，该现象持续了八年之久，期间蜂群损失和受害情况有所减缓，但由于并不是由单一因素引发，所以尚无应对此现象的有效的措施（vanEngelsdorpetal.,2009,2011;RatnieksandCarreck,2010）。可以预想，如果此种现象持续下去，全球可能出现授粉昆虫的短缺现象，进而造成农作物授粉不足，在一定程度上影响农业的产出；同样由于蜜蜂的骤减，造成在生态、农业、环境和社会等多个层面受到负面影响。表1.2CCD与以往蜂群损失症状的对比Table1.2MorphologicalcomparisonbetweenCCDandthepreviouslossofcolonies症状CCD以往损失情况患病蜜蜂或蜜蜂适龄采集蜂外出采集，未返回蜂巢而不知所踪；大量遍及蜂箱周边，有时也在蜂箱内部尸体蜂箱内外未见病死蜂或数量极少发现病死蜜蜂损失速度快（几天或者数周）明显较CCD慢（除急性中毒外）损失蜂群数量数量巨大（30%-90%）明显少于CCD（17%-20%）引发原因尚无定论通常有明确的诊断结果防治措施尚无针对性强的解决方法针对不同病症，有相应的防治手段CCD具有多种诱因，这些因素对蜜蜂造成不同程度的损害，目前人们推测，这些因素通常先引起蜜蜂身体的免疫缺陷（immunodeficiency），而后导致蜜蜂出现对多种病害更敏感的趋势，而后随着病情的恶化出现CCD现象，并最终导致蜂群损失严重（Johnsonetal.,2009）。研究显示，新烟碱类杀虫剂被认为是引发CCD最主要的因素之一，与CCD的关系最为密切。此类杀虫剂主要用于农田内农业害虫的防治。另外，蜜蜂病害，主要是蜜蜂寄生螨和蜜蜂病毒协同作用（多种病毒借助寄生螨进行传播），是引起CCD的另一主要诱因（Reynaldietal.,2011）。在我国，由于不同地区蜂群农药中毒现象时有发生，而且蜜蜂农药中毒的特征具有突发性和严重性，与其他病害不同，蜜蜂农药中毒无潜伏期，而蜜蜂传染病或者其他病害有长短各异的潜伏期或者前期症状；另外，一般单一的蜜蜂病害仅影响处于同一个发育历期的蜜蜂群体（蜜蜂卵、幼虫、蛹和成蜂），而蜜蜂农药中毒几乎影响到蜜蜂整个蜂群的所有发育历期的蜜蜂，蜜蜂对绝大多数农药很敏感，在接触到很低剂量的农药时即可能出现死亡现象；蜜蜂农药中毒在农药喷洒季节呈现高发性；因此，农药中毒在我国蜂业中也需引起重视。我国是蜂群数量和蜂蜜产量最多的国家，其中西方蜜蜂是国内饲养最多的蜜蜂种类。我国蜂群数量为800万群（Zhengetal.,2011），也有文献指出850万群左右（刘之光等，2014）。虽然尚无官方数据证实我国蜂场内有大规模的CCD现象出现，但由于我国的蜂业大国地位更不可放松警惕，也需加强此方面的研究。3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.3新烟碱类杀虫剂及危害1.3.1新烟碱类杀虫剂概况在种类繁多的杀虫剂种类中，其中90%属于神经毒剂，并且包括五种类型的毒剂，分别是有机磷化合物、有机氯化合物、氨基甲酸甲酯类、拟除虫菊酯和新烟碱类。神经毒剂类杀虫剂之所以能够达到杀虫的效果，主要源于其对昆虫体内神经传导的阻断作用（Raymond-Delpechetal.,2005;Zhouetal.,2011）。其中，新烟碱类杀虫剂（Neonicotinoidpesticides）是20世纪80年代末开发的一类新型神经毒剂，“新”是相对与传统“烟碱类”杀虫剂而言，最具优势的是新烟碱类杀虫剂，该毒剂对哺乳动物是低毒的，因而被认为是较为“完美”的杀虫剂（Matsudaetal.,2001;唐磊，2010）。此类杀虫剂主要作为乙酰胆碱受体（AChR）的激动剂，从而与真正的烟碱型乙酰胆碱竞争位于昆虫中枢神经系统的结合位点，进而导致昆虫兴奋，甚至导致昆虫被迅速麻痹致死（Baietal.,1991;Buckinghametal.,1997;TomizawaandCasida,2005；姚明德等，2008）。目前，凭借其多方面优势，新烟碱类杀虫剂在世界各国的销量已经是增长最快的一类新药，占领了全球近30%的杀虫剂销售份额（CasidaandDurkin,2013）。此类杀虫剂被广泛的应用于多种常见农作物的田间的刺吸式和部分咀嚼式口器害虫的防治（王彦华和王鸣华，2008），另外有百余国家允许此类杀虫剂应用于千余种植物上应用（EFSA，2012），由此可见其应用范围之广泛；在我国已经登记有8个具有杀虫活力的成分，也是目前我国农业上使用最多的杀虫剂之一（蔺哲广等）。其中商品化且应用较广的新烟碱类杀虫剂主要为吡虫啉（imidacloprid）、噻虫嗪（thiamethoxam）、噻虫啉（thiacloprid）和噻虫胺（clothianidin）等。2011年，噻虫嗪和吡虫啉在全球的销售额已经突破了10亿美元（中国农药网）。目前棘手的问题是，此类杀虫剂对主蜜蜂的毒性很高。图1.1吡虫啉的化学结构式Fig1.1Thestructuralformulaofimidacloprid吡虫啉，化学名称为1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺（C9H10CN5O2）（图1.1），为新烟碱类杀虫剂的经典代表产品（李乃杰，2005）。它除了具备新烟碱类杀虫剂的多种优势外，还兼具高度的抗光解能力，因而更成为防治靶标昆虫的首选杀虫剂之一（TomizawaandCasid,2003）。4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.3.2昆虫神经系统作为神经毒剂的吡虫啉，同样是主要针对昆虫的中枢神经系统起作用，干扰破坏昆虫神经系统的生理、生化过程而最终引起中毒甚至死亡（赵善欢，1993；宗娜，2001）。昆虫神经系统由中枢神经系统（或中央神经系统）和外围神经系统构成。昆虫中枢神经系统是吡虫啉作用的靶标位置，由功能相互关联的大量神经细胞构成的细胞体以及位于核心位置的纤维和突触组成。这些纤维并不进入到细胞体内；另外昆虫体内没有明显的髓鞘，即昆虫中枢神经系统外表面贴附着一层纤维肌，也叫做“神经鞘”。神经鞘能够起到阻断外源物质进入到神经鞘内部，对中枢神经系统起到保护作用。然而，中枢神经系统也是最易受到外源物损伤的部位。（http://www.nicerweb.com/bio1152/Locked/media/ch48/neuron.html）图1.2神经细胞结构Fig1.2Neuronsturcture神经系统的行使功能的重要单位是神经细胞或者神经元。神经元与其他类型的细胞虽然形式上差异很大，但多数细胞特征是相同的，其中神经元在细胞能量供应方式、相关蛋白质合成以及其他需要维持细胞所必需的复制生理生化物质方面很相近。神经细胞由一个细胞体、轴状突，轴状突分支组成。细胞体通常为近圆形或者椭圆型球体，由细胞膜、细胞核、细胞质、高尔基体、内质网、线粒体等细胞器构成。与其他类型细胞的区别是，神经细胞具有高度的、特化的、传导电信号的功能，或者是在神经细胞之间进行神经信号的传递，同时在感觉器官和反应器官以及反应器官与神经系统的功能行使中起到重要的作用。神经细胞在接受来自其他神经细胞的神经信号过程中，是通过神经细胞表面很多树状的分支，即树突，完成的。树突中比较大而且较长的分支为轴突，神经传导的信息由它传递出去。在轴突的末端又有很多更小的分支，神经信号传递的信息被这些小分支传递给树突或者另外的神经原，也可能是其他的反应器官。而神经细胞之间的信5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言息传递可以归结为电传导和化学传导（赵善欢，1993）。图1.3蜜蜂脑神经细胞Fig1.3Neuronsfromthebrainofhoneybee神经系统的化学传导，涉及到一种重要神经递质——乙酰胆碱，乙酰胆碱受体即吡虫啉等新烟碱类杀虫剂所针对的作用对象，也是此类杀虫剂的杀虫机理所涉及的主要物质（赵善欢，1993；李黎，2009）。这种传导在神经细胞的前突触和后突触之间发生。发出信息的神经细胞的突触为前突触，在这个突触的末端膨大部分是突触体，而接受信息的神经元的突触为后突触。在发出和接受信息之间的两个神经细胞的突触间即为突触间隙。绝大多数神经元之间起到化学传递作用的物质是乙酰胆碱，因而它们对神经系统以及神经系统的功能的发挥至关重要。而乙酰胆碱与乙酰胆碱受体的结合激活后续的神经信号传递过程。吡虫啉即作为与乙酰胆碱的类似物竞争与乙酰胆碱受体结合，从而使乙酰胆碱过量累积而引起昆虫异常兴奋，甚至麻痹死亡（邓鸿飞等，2011）。蜜蜂的中枢神经系统主要由脑组织和腹神经索二部分构成，其功能主要对感觉器官和运动器官发出指令（周婷，2014）。蜜蜂脑组织主要由前脑、中脑和后脑组成；其中、前脑是体内最大、行驶功能最多、结构最复杂的部位；而其次是中脑。如果以神经节进行划分，蜜蜂脑组织是由多个神经节组合而成。前脑由前脑叶和两侧膨大的视叶组成，其主要作用是行驶视觉功能。前脑叶分出的神经通向单眼，视叶分出的神经通向复眼。前脑叶包括球状细胞群、神经纤维体和神经接索等部分。蜜蜂脑中特化的联系神经元为球形细胞（图1.3）。这些聚集的神经元组成了球状细胞群，这些细胞群分别与不同的脑部位相连，行使相应的功能（周婷等，2008）；脑体由密集的神经纤维群和神经纤维球组成并构成了脑的联系中枢。前脑主要有四种结构构成，分别是2对覃体、1个脑桥体、1个中心体和1对腹体。其中蕈状体（或称蕈体、蘑菇体）位于脑桥体两侧，是最为复杂的中枢结构之一，主要作用为协调和联系各个脑体行驶各自的功能。因其行驶功能的复杂性与其体积相关，因而不同昆虫的蕈体结构和体积有所差异，相对与多数昆虫，蜜蜂蕈体的6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言体积较大，可能的原因是与蕈体在蜜蜂中枢神经系统中起着更为重要的作用有关。蜜蜂中脑位于前脑背面，食管两侧，具有1对膨大的中脑叶。中脑是控制触角神经的中心。触角感觉神经纤维在中脑髓体周围形成很多神经纤维球（金卓明，2006；周婷，2014）。后脑位于中脑下方，由一对后脑叶组成，每个后脑叶具有一髓体，由此发出上唇神经和额神经。1.3.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害吡虫啉对蜜蜂危害极大。此类杀虫剂除应用于防治田间害虫外，另一主要用途是作为种衣剂使用（Schmucketal.,2001;Laurinoetal.,2013），并且最早于1994年于法国用作向日葵种子的种衣剂。在种子发芽后，该药剂通过极强的内吸性而被传送到植物的茎、叶和花等部位，因而，在喷洒此类药剂时，药剂随风飘散的粉尘可能会到达蜂群附近或由采集蜂粘附于体表而引起蜜蜂个体和蜂群农药急性中毒，另一个蜜蜂接触途径即蜜蜂吸食含有亚致死剂量的此类杀虫剂的花蜜或者花粉，导致慢性中毒（Cresswell,2011;Krupkeetal.,2012;Stokstad,2012;Hatjinaetal.,2013）。在用作种衣剂二年后，即有报道指出发生了蜜蜂大量死亡现象，并怀疑与应用此药剂有关，后续也有类似报道（Baietal.1991;Buckinghametal.,1997;TomizawaandCasida,2005）。因此此类神经毒剂对蜜蜂个体和群体两个层面的研究已经不可避免的成为了全球养蜂领域、杀虫剂生产公司及相关政府农药监管部门关注的焦点，但是此方面的理论尚不完善。2013年末，虽然数据尚未完善，但考虑应及早干预对蜜蜂的保护行动，欧盟委员会颁布了关于禁止使用吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺的法案。这是新烟碱类杀虫剂中应用范围最广和销量最大的三种产品。禁止将它们应用到蜜蜂的蜜源或粉源农作物上，包括油菜、向日葵和玉米等作物。此外，美国俄勒冈州也同样怀疑因新烟碱类杀虫剂而导致该州境内的蜜蜂等授粉昆虫大量死亡（吴艳艳等，2014）。该市不允许在本州境内的城市花园和开阔地使用吡虫啉，这也是美国第一个提出新烟碱类杀虫剂禁令法案的州，该法案的提出意图避免因吡虫啉造成的主要授粉昆虫大面积死亡现象的发生。另外，加拿大、巴西和澳大利亚等国也对禁用新烟碱类杀虫剂的法案进行了审查和复审。吡虫啉在我国也是应用最广的杀虫剂之一，其销售份额在逐年扩增。2013年，国内登记注册的吡虫啉原药厂家为68家，其中，除部分用于国内相关吡虫啉成品药剂的生产外，部分原药用于出口。我国尚无新烟碱类杀虫剂方面的官方禁令，但相关部门已经有所警觉。2013年，国家农业部所属的农药鉴定所组织此方面专家召开了“新烟碱类农药风险分析探讨会”。目的是分析国内外新烟碱类杀虫剂的安全管理措施，需加强此类杀虫剂的具体管理措施。虽然新烟碱类杀虫剂在农业中的作用巨大，然而由于其对蜜蜂具有潜在的安全风险，会议建议加强新烟碱类杀虫剂对蜜蜂影响的监测工作，建立系统科学的评估此类杀虫剂对蜜蜂影响的评估方法（中国农药信息网）。以往吡虫啉引起蜜蜂中毒多集中在吡虫啉对成年蜜蜂的急性致死率的测定实验；由于实验对象和实验条件的差异较大，实验获得的LD50的范围也较大（12.0-80.0ng/bee/day）(Elbertetal.,1991;Schmuck,1999;Suchailetal.,2000,2001;Schmucketal.,2001)，所以以往多数报道的研究方法仍关注其LD50（或LC50）的测定；此外有关蜜蜂生长发育，主要是蜜蜂工蜂各项发育指标的检测，包括工蜂化蛹率、蛹的羽化率和幼虫封盖率等指标的测定（Suchailetal.,2001;Ladurneretal.,2005;Yangetal.,2012）。相对而言，对于亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的慢性中毒和神经毒性关注较少。亚7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言致死剂量通常指虽不引起实验对象的死亡，但是能够引起其行为方式的反常或部分功能的减退的剂量（Cresswell,2011）。由此引起的缓慢的中毒过程也称为慢性中毒。目前，随着蜂群崩溃失调现象以及多国开始禁用此类药剂，使得亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂慢性中毒方面的研究逐渐受到关注。在严格按照吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的商品使用说明进行施药时，蜜蜂能够接触到的一般为花蜜或花粉中的亚致死剂量药剂（Cresswell,2011）。通常不会因此而引起蜜蜂的大面积死亡，但由于此类杀虫剂能够在蜜蜂体内（包括成虫或幼虫）累积，从而引起慢性中毒的症状，包括采集蜂飞行和导航等能力，另外不同日龄的工蜂也会出现学习与记忆能力的异常（Kirchner,1999）；同时作为社会性昆虫的蜜蜂间的分工协作和信息沟通能力都会受到不同程度的影响（Stokstad，2012）。有报道指出新烟碱类杀虫剂与CCD具有较高的相关性，进而推测该类杀虫剂是蜜蜂大量死亡和消失的因素之一（Hsuetal.,2007）。也有研究进行了大田实验，发现饲喂亚致死剂量吡虫啉的蜂群呈现垮群和蜜蜂消失的现象，而且多个症状符合蜂群崩溃失调现象的特征（Johnsonetal.,2009）。由此也可以看到，在有关亚致死剂量吡虫啉引起蜜蜂慢性中毒的报道中，研究进行了蜜蜂个体和蜂群整体的行为异常的评价（Decourtyeetal.,2003,2004;Ramirez-Romeroetal.,2005；Bacandritsosetal.,2010;Girolamietal.,2011;Whitehornetal.,2012）。行为上的改变可以看做为外在的表现，而外在表现应该由蜜蜂神经系统的改变引起，据此推测，作为吡虫啉的靶标——蜜蜂中枢神经系统的脑神经细胞，也应该能够出现相应的变化。（Thanyetal.,2005）图1.4Apisα7-1mRNA在成年蜜蜂脑部的表达Fig1.4ExpressionofApisα7-1mRNAinadultbrainA：蕈体；B：视叶；C：嗅叶；ncc：非致密联系神经细胞；me：视髓层；la：视小叶；al：嗅叶A:mushroombody;B:opticlobe;C:antennallobe;ncc:noncompactKenyoncells;me:medulla;la:lamina;al:antennallobe.吡虫啉等神经毒剂引起的胃毒毒性的报道较多，有关脑部组织的研究报道相对较少，蜜蜂脑组织内具有5种乙酰胆碱受体亚基（α2、α3、α7、α7-1和α7-2），而这些亚基均在成年蜜蜂脑组织中的蕈体、视叶和嗅叶处表达（Thanyetal.,2003;Goldbergetal.,1999;Thanyetal.,2005;周婷等,2013）。乙酰胆碱受体的各个亚基通常在特定部位表达，而这些部位主要为神经细胞群的出现部位（图1.4；Thanyetal.,2005）。这些受体主要在神经细胞内表达，在神经胶质细胞中极少出现乙酰胆碱受体的表达情况（KarlinandAkabas,1995）；因而，对吡虫啉引起的神经细胞毒性，针对的主要是蜜蜂神经细胞。目前，仍缺少吡虫啉对蜜蜂脑神经水平和亚细胞水平影响的研究。8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.4细胞凋亡1.4.1定义细胞凋亡，其英文单词最早源于希腊语。从单词组成上看,该单词的前三个字母在希腊文中为“从……”，而后半部分的解释为“落下”。因而“凋亡”最初指树叶从大树的枝干上落下来（史立新，2002）。细胞凋亡是指细胞由相关基因控制的，细胞主动的，有序的死亡。换言之，细胞通常为了维持内环境的稳定，在一定的生理条件下，遵循自身的程序，自我结束生命的过程。这个过程需要一系列酶的参与，许多基因的激活、表达和调控等复杂的生理生化反应。这种过程不是被动引发的，与细胞增殖相对应，是生物体存在的一种正常的生理现象。1965年，细胞被发现具有凋亡现象；在电镜下能够观测到实验动物肝组织内散落很多的死亡细胞。在细胞内部溶酶体没有像在常见的坏死细胞内那样发生破裂。这是最早被观测到认为不同于坏死方式的另一种新的细胞死亡方式。而后Kerr等人（1972）将这种新发现的现象命名为“细胞凋亡”。在细胞凋亡被定义之前人们就发现在生物体个体胚胎发育过程中，干细胞分化过程中，或者特定组织内的细胞，不会坚持到最后就执行自我死亡程序，而且这是正常发育所必需的。人们熟知的蝌蚪转变为青蛙的变态过程中、昆虫的变态过程以及哺乳动物指间蹼发育过程中都有细胞凋亡过程的参与。自细胞凋亡的概念提出至今四十余年，期间此方面的研究一直是生命科学，尤其是医学领域研究的热点之一。这种程序性死亡方式在多细胞生物的生存中作用巨大，其中信号传导方面的前沿领域也是对细胞凋亡等相关机理进行研究。既然细胞凋亡是生物机体细胞有选择性的死亡，是生命的普遍现象，这种过程也是维持组织机能和形态所必需的，那么可预见，在此程序出现异常情况时，机体也会随之发生相应的病理反应（Renshaw,2006;KnightandMelino,2011）。很多人类疾病和临床治疗中，与细胞凋亡相关的技术和手段具有重要的意义。分析和检测细胞凋亡过程对设计治疗方案，寻求调节细胞增殖与死亡之间的平衡具有非常重要医用价值（Gérinetal.,1998）。细胞凋亡具有多个特征可用于指示凋亡的发生（Clarke,1990;Ellisetal.,1991）。其中较为容易操作的是利用光学显微镜观察病理组织切片或体外培养细胞的形态学变化。通常先排除细胞坏死引起炎症的可能（症状包括细胞膜破裂和溶酶体损坏破裂等现象），然后观察细胞体积缩小情况，染色质的疏密程度，死亡细胞发泡（bledding）情况和凋亡小体（apoptoticbody）；如果排除了细胞坏死的情况，细胞体积缩小，染色质密集化，有的呈斑块状，另外凋亡后期，细胞出现发泡现象和凋亡小体的形成（表3）（王淑婷等，2001）。如果利用电镜进行亚细胞水平的观测，凋亡细胞会出现细胞间连接不紧密，染色质聚集，贴附在核膜上，有的呈现月牙形状；值得注意的是，凋亡细胞与坏死细胞不同，其细胞膜、线粒体和高尔基体等细胞器的被膜是完整的；细胞核皱缩，并最终裂解；细胞膜包裹部分细胞器、细胞其他内容物或细胞核等碎裂的残片，通过出芽或者发泡的方式形成凋亡小体（金钢和叶建仁，2006）。凋亡小体或者凋亡细胞的碎片，通常由其他临近的正常的细胞或吞噬细胞识别而吞噬，其内容物又再次被新的细胞所回收利用（金钢和叶建仁，2006）。9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言表1.3细胞凋亡与细胞坏死的区别Table1.3Differencesbetweenapoptosisandnecrosis区别处细胞凋亡细胞坏死诱发原因自然生理过程/病理性过程病理性变化/严重损伤炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放胞内物质影响范围单个或多个细胞群/大片组织区域细胞膜基本完整破损而导致胞质外流细胞体积固缩变小，细胞间隙扩大变大，肿胀细胞器情况不一，不变/肿胀/固缩肿胀，内质网溶解消失染色质凝聚，贴附在核膜内，呈月牙状絮状凋亡小体有，位于细胞周边，被临近细胞或巨噬细胞无，细胞自溶，残余碎片被巨噬吞噬细胞吞噬蛋白质合成有无主动/被动受基因组调控，有序进行被动进行细胞凋亡技术在研究神经系统疾病中发挥了巨大的作用。目前认为阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是一种由于人类大脑神经细胞大量凋亡而引发的神经退行性疾病，即该病发病的主要病理学机理为神经元细胞凋亡；另外，免疫炎症机制也是引发该病的另一个因素，正因为免疫与炎症反应的防御过当进而导致“错误攻击”神经组织和神经细胞，而导致过多的损伤和凋亡，最终引起了神经退行性变或早衰。也可以说是神经退行性疾病中内外因素激活细胞自身基因程序而引起神经元凋亡。由此猜想，可利用神经细胞的凋亡检测技术在昆虫神经行为毒力学方面进行研究，为阐述昆虫神经系统的损伤和机理提供技术方法（苗明三，2003）。1.4.2细胞凋亡检测方法在昆虫领域研究较多的是果蝇，常用的检测方法有原位末端标记法（简称TUNEL法，terminaldeoxynueleotiodyltrasferasemediateddUTPnickandendlabeling）。此方法是由Gavricli等在1992年首次提出应用的，属于分子生物学与形态学相结合的检测方法，也是检测凋亡细胞的经典方法，通常凋亡细胞的染色体DNA断裂出现3"-OH粘性末端，而其他状态的细胞不会出现这种粘性末端，即这种检测方法能够特异的对单个凋亡细胞进行原位染色，不但能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学变化（DNA断裂出现的3"-OH粘性末端）和形态变化，还能获得凋亡细胞在组织中的确切位置（StadelmannandLassmann,2000）；用途较广，可用于石蜡组织切片、冰冻组织切片、培养细胞和分离到的原代细胞的凋亡检测，甚至能够检测极少量凋亡细胞，灵敏度远高于其他组织化学和生物化学法。其原理概括为外源性核苷酸在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）作用下，首先透过通透性增加的凋亡细胞的细胞膜，进而到达细胞核内，在DNA聚合酶I的作用下与凋亡细胞的单链或双链DNA的3"-OH粘性末端相结合，之后就通过TdT介导的dUTP（生物标记物）缺口末端标记，此时即可通过一定的显示系统（卵白素或链卵白素标记的辣根过氧化物酶于光学显微镜观测，HRP；荧光素标记的dUTP一般为FITC-dUTP，于荧光显微镜下观察）呈现凋亡的细胞，确切的说是凋亡细胞的细胞核的位置。这种检测细胞凋亡的方法特异性强，敏感性高。10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图1.5TUNEL法检测过程Fig1.5ProcessofTUNELassayCaspases蛋白家族（cysteineasparticacidspecificprotease）即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,是一类与凋亡密切相关的酶类的总称；caspase酶类最初以无活性的酶原的形式存在，通常情况下在蛋白的氨基酸链上特定的天冬氨酸处由相应的剪切酶（如颗粒酶B）在此处进行剪切，至此该蛋白酶被激活；活化后的caspases酶类水解相应底物，并通过级联放大的催化反应引起凋亡的发生；因而，此类蛋白酶的活化也是细胞凋亡的典型特征之一（Scaffidietal.,1999）。目前发现在不同物种中存在15种caspase蛋白。其中，caspase-1是最早被发现的，起初名称为白介素-1β转化酶（ICE）。如按照功能分类，主要参与死亡因子受体介导的细胞凋亡途径的caspase为第一类，包括caspase-1，4，5和从caspase-11至caspase-14的四个酶，共计七个；其余为第二类，在这之中，又将存在于级联反应上游，能够自我激活并激活下游的caspase称为起始caspase（initiatorcaspase），这类酶有caspase-2,caspase-8至caspase-10,caspase-15共计5个；其余则为效应caspase（effectorcaspase），它们位于级联反应下游。在被激活后，下游caspase酶类的作用于自身底物，引起复杂的生理生化反应进而导致细胞形态学变化。Caspases族蛋白酶具有N末端结构域、大和小亚基三个组成部分。N末端结构域序列在不同物种之间的变异性很大，当被激活后，大、小亚基组成异源二聚体形式（Nicholson,1999），N末端结构域水解。大、小亚基的序列相似性则较高,而且在生物界基因组中广泛存在；其半胱氨酸酶切位点的氨基酸序列具有很高的保守性，即此类酶都具有QACXG（谷氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酸/精氨酸/甘氨酸-甘氨酸）五肽保守区，其中X可为Q（谷氨酸）、R（精氨酸）或者G（甘氨酸）；此外该类蛋白酶的二级结构也具有较高的保守性，这也是不同来源的caspases族蛋白的相应抗体（anti-activatedcasapaseantibody）具有普遍的适用性的分子基础。其他检测细胞凋亡的方法还有AnnexinV-FITC和PI双染法，正常细胞中，磷脂酰丝氨酸位11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言于细胞膜内侧，它随着细胞凋亡的发生，迅速从细胞内侧翻转到细胞膜外侧表面，这时可利用能够与磷脂酰丝氨酸相互作用的抗凝血剂AnnexinV检测凋亡细胞外侧的磷脂酰丝氨酸（赵婷秀等，2005）。这种方法多应用与体外稳定培养的细胞系，可以利检测凋亡细胞的百分率。1.4.3细胞凋亡技术在蜜蜂领域的应用蜜蜂作为一种重要的模式生物，也是研究昆虫生长发育的良好材料。在蜜蜂的整个发育历期（包括卵、幼虫、蛹和成虫）中，细胞凋亡和增殖在研究整个变态过程中应用较广。对即将进入预蛹期阶段的蜜蜂幼虫取样，对其唾液腺的组织切片进行细胞增殖和细胞凋亡检测，发现其细胞呈现凋亡现象，并伴有自噬发生（Silva-Zacarinetal.,2008）。除此之外，利用蜂群能够接触到的杀虫剂，包括毒死蜱（chlorpyrifos）、吡虫啉、氟胺氰菊酯（fluvalinate）、蝇虫磷（coumaphos）、腈菌唑（myclobutanil）、百菌清（chlorothalonil）、甘草磷（glyphosate）和西马嗪（simazine）等制剂对蜜蜂幼虫进行喂毒实验，其中毒死蜱能够引起蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的凋亡而对再生细胞影响较小，而西马嗪和蝇虫磷能够引起这两种类型的细胞的凋亡，只是两者引起的细胞凋亡率有所不同，另有西马嗪引起蜜蜂卵巢细胞的凋亡；这几种杀虫剂均能够引起蜜蜂幼虫中肠细胞、唾液腺和卵巢细胞不同程度和几种类型的细胞的凋亡（图1.6）（Silva-Zacarinetal.,2008;Wardetal.,2008）。此外，也有研究指出在经土霉素处理后，蜜蜂幼虫中肠上皮细胞也出现明显凋亡现象；可见应用到蜂群的化学药剂有可能引起蜜蜂体内细胞的凋亡；此外，蜜蜂病原细菌（幼虫芽孢杆菌，Paenibacilluslarvaevar.larvae）引起蜜蜂中肠上皮细胞全部坏死，而并非凋亡。然而，吡虫啉主要作用于昆虫中枢神经系统，因而有关吡虫啉对蜜蜂神经细胞危害的研究更有针对性，推测在蜜蜂脑神经细胞处很有可能也受到凋亡影响，进而影响蜜蜂神经系统的功能，这也许是受到吡虫啉危害后蜜蜂出现中毒和死亡症状的原因之一；蜜蜂脑神经细胞凋亡的检测可通过细胞形态和相关生化免疫组化反应进行检测，但此方面研究极少。（GregorcandEllis,2010）图1.6蜜蜂幼虫各组织内细胞凋亡的TUNEL法检测Fig1.6CelldeathindifferenttissuedetectedusingtheTUNELassay.6日龄蜜蜂幼虫经杀虫剂连续处理4d，经TUNEL法检测细胞的凋亡程度。阳性细胞用黑色箭头指示；阳性反应的再生细胞用黑色12 中国农业科学院博士学位论文第一章引言三角形指示；阴性反应的细胞用白色箭头（上皮细胞）或三角形（再生细胞）指示；A：毒死蜱处理后幼虫中肠柱状细胞和再生细胞；B：西马嗪处理后中肠柱状和再生细胞；C:蝇虫磷处理后中肠柱状和再生细胞；D:晴菌唑处理后蜜蜂幼虫唾液腺细胞；E：空白对照组唾液腺细胞；F:西马嗪处理后，幼虫卵巢细胞。Six-day-oldlarvae,afterthefourconsecutivedailypesticidetreatments.CelldeathwasdetectedusingtheTUNELtechnique.Positivecellsindicativeofimpendingcelldeathisindicatedbyablackarrow.Reactionproductlocalizationtotheregenerativecellsisindicatedbyablackarrowhead.Wherethereactionproductisabsent,eitherthearrow(midgutepithelialcells)orarrowhead(regenerativecells)iswhite.PanelAshowsachlorpyrifos-treatedlarvainthemidgutcolumnarepithelial-cellnucleiandtheregenerativeepithelialcells.PanelBshowsmidgutepitheliuminasimazine-treatedlarva.PanelCshowsamidgutepitheliumsectionofacoumaphos-treatedlarva.Thecolumnarandregenerativeepithelialcells.PanelDshowssalivaryglandtissueofamyclobutaniltreatedlarvawherethemajorityofcellswerepositive.PanelEshowsuntreated,controllarvaewithsalivaryglandcells.PanelFshowstheredazo-dyeproductsporadicallyinnursecellsinovariesofasimazine-treatedlarva.1.5自噬自噬（autophagy）最早于上世纪50年代末被发现。其英文单词同样来自于希腊文，释义是“自我吞噬”。自噬的明显特征是自噬体的出现，通常自噬体由自噬泡和内部包裹物和溶酶体组成。自噬泡为单层、双层膜或者多层膜结构，溶酶体最终将包裹的细胞质、蛋白质、细胞器或者其他细胞碎片降解掉，用于实现细胞自身的物质清除和更新（曹奕，2005；YorimitsuandKlionsky,2005;贺晓芳，2006），这种现象在真核生物中也是一种正常而普遍存在的生理现象，因而自噬也被称为II型程序性细胞死亡。一般被分为大、小自噬（macro-andmicroautophagy）和分子伴侣自噬（chaperone-mediatedantophagy）三种方式；其中真核生物细胞内的自噬主要为大自噬。有时自噬泡也具有选择性，可根据机体实际需要有选择性的包裹某个细胞器，对其进行消化，这样的自噬方式根据内部包裹的细胞或者物质成分而被单独命名，有线粒体自噬（mitophagy）（图1.7）、细胞核自噬（nucleophagy）和过氧化物酶体自噬（pexophagy）等（Okamotoetal.,2009;Parketal.,2009;Manjithayaetal.,2010;SureshbabuandBhandari,2013）；自噬细胞典型形态学特征可通过透射电镜进行观测。电镜下可以观察到发生自噬的细胞的单层或多层膜结构的自噬泡（主要为空泡，还未吞噬胞质或其他细胞器）或者自噬体（内部包含为降解的细胞器，如线粒体、核糖体或其他细胞器）。通常在哺乳动物体内，中枢神经系统内的自噬现象很少发生，而常见于其他组织和器官内；然而，当中枢神经系统内部的神经细胞出现了损伤或者神经系统组织出现神经退行性病变，此时自噬现象增加，自噬体和自噬泡数量大幅增加（Petersenetal.,2001）。正常生理状态下，在昆虫体内，细胞自噬程度同样很低；而当正处于变态发育过程中、如营养不良等饥饿状态下、缺氧或者病原等其他不利因素，会引起昆虫细胞内的自噬水平会提高，以供应维持正常生理、营养或者抵抗外源不利因素而继续生存的需要（KourtisandTavernarakis,2009）。13 中国农业科学院博士学位论文第一章引言（SureshbabuandBhandari,2013）图1.7线粒体自噬的分子机制Fig1.7Themoleculareventsofmitophagyprocess透射电镜是观测细胞内自噬过程的常用技术。透射电镜的固定液对细胞超微结构的观测影响较大，主要原因是固定液不同对细胞的保护程度也不同，锇酸作为固定剂的优点是与细胞内几乎全部化学成分结合，对细胞结构固定性强，保存脂肪、对磷脂蛋白和核蛋白的保护性较好，而且能够增加膜的反差（RoatanddaCruz,2010）；缺点是不能固定糖原、核酸和碳水化合物，要求固定时间长，强致癌作用。戊二醛作为固定剂的优点为能够保存糖元、蛋白质、核蛋白和核酸等重要物质，较锇酸毒性小很多；而缺点为不保存脂肪和无电子染色作用；2.5%戊二醛-多聚甲醛溶液较以往单独用戊二醛或者锇酸更为常用，因其对细胞的保护作用优于单独戊二醛固定液，渗透速度快，固定液时间短，对酶的活性保护作用强，而且较锇酸经济方便，低毒。由此可见，投射电镜的固定液可选择2.5%戊二醛-多聚甲醛溶液，增加对细胞内多种重要物质的保护作用，使得细胞状态更接近真实情况，更环保低毒。1.6蜜蜂行为学检测在有关神经毒剂对昆虫的影响研究中，神经行为毒理学（Neurobehavioraltoxicologyofhoneybee）方法较为常用，可对因神经毒剂引起的行为改变进行研究。行为学的改变能够较为直观的被观测到。在昆虫领域，通常因研究对象不同而具有不同的行为学观测方法。蜜蜂行为学具有自身特殊的检测方法，蜂群内采集蜂的采集行为也是观测指标之一，在摄入亚致死剂量的吡虫啉后，采集蜂的回巢率显著降低（Decourtyeetal.,2004;Ramirez-Romeroetal.,2005），这就引起采集蜂的数量降低，进而蜂群蜂粮储备受到影响；蜜蜂个体行为检测的方法主要为喙伸反应（ProboscisExtensionReflex，PER）和运动能力（motoractivity）的检测（Medrzyckietal.,2003）。目前利用喙伸反应的研究较多，包括蔗糖敏感性试验、习惯化行为试验（BraunandBicker,1992），主要用于检测蜜蜂个体的学习和记忆能力，同样的，当饲喂蜜蜂亚致死剂量吡虫啉后，蜜蜂的学习和记忆能力减弱（Decourtyeetal.,2003）。昆虫的运动能力检测也是评价其受毒害程度的手段之一；但此方面的研究相对较少。通常情况下，如果蜜蜂运动能力（主要为爬行能力）受损，将14 中国农业科学院博士学位论文第一章引言影响其平衡能力、活动性、自身的社会分工（采集、哺育或清理行为等）等方面（Yangetal.,2007）。Lambin及其所在的研究室利用类似哺乳动物的旷场试验的方法检测蜜蜂的爬行能力。此方法利用计算机软件及视频捕捉功能相串联，在模拟的旷场中对蜜蜂爬行的路径与在每个点停留的时间进行跟踪与测定（Lambinetal.,2001）；通过检测得知，氟虫腈（Fipronil）在低剂量（每头每天饲喂0.01ng）时，蜜蜂出现静止不动的时间显著高于其他处理组；而在亚致死剂量的啶虫脒和噻虫嗪（1/10LD50）和氟虫腈（1/500LD50）对蜜蜂运动、触觉和认知行为无显著影响。另外，运动能力检测在模式生物果蝇的神经毒性方面上应用较广，在相应的运动能力的测试中，实验室水平下，主要应用趋地爬行实验检测其爬行能力，与Lambin等人的方法相比，趋地爬行实验所需实验设备仅为玻璃等透明具塞小瓶和秒表，结构更加简单，更易获得。趋地性（geotaxis）是生物的特性之一，指能够根据重力刺激的感应，朝向地下方向运动，是某些生物与生俱来的一种特性。在检测果蝇的爬行能力时，轻轻敲击容器外壁，果蝇会从垂直的瓶壁上方掉落到瓶底，而后它们会立即自发的沿瓶壁向上爬动，在规定时间内能够自下而上成功爬过相应长度的果蝇个体占总测试数目的百分比（Podratzetal.,2011）即为爬行能力的检测指标；可利用果蝇的这种特性（实际为负趋地性，negativegeotaxis）对其运动能力（主要为爬行能力）（Rivaletal.,2004）进行检测。这种方法较旷场法实验更符合昆虫爬行能力的检测；如果能将此方法应用到蜜蜂爬行能力的检测，可为蜜蜂行为检测提供一种简便易行的操作方法，目前尚无此方面的报道。Podratz等人，利用此方法检测了放射性元素顺铂（cisplatin）对果蝇的神经毒性的影响，主要检测了其爬行能力变化，并结合对其脑神经细胞的神经毒性影响进行分析与比较，发现果蝇在经顺铂处理后（50ug/ml，3d），脑神经细胞凋亡显著增加，可见顺铂的神经毒性作用，另外凋亡异常情况的发生早于爬行行为的改变，顺铂引起的果蝇脑神经细胞的凋亡是果蝇后续行为异常的主要诱因之一。通过脑神经细胞凋亡检测与爬行能力检测相结合，在一定程度上，能够从多个层面（分子、细胞和外在表现）评价神经毒剂对昆虫的影响情况。1.7本研究的目的意义、研究内容和技术路线1.7.1本研究的目的意义蜜蜂作为自然界重要的授粉昆虫却受到诸多环境有毒有害物质的侵害，其中蜜蜂农药中毒对养蜂业造成巨大损失。农药中绝大多数为神经毒剂类药剂。主要神经毒剂—新烟碱类杀虫剂因被认为是CCD现象的主要诱因之一，而受到广泛关注。有关此类杀虫剂对非靶标生物蜜蜂的神经毒性的研究具有主要的理论意义和应用价值。以往研究多关注此类杀虫剂对蜜蜂急性毒性和蜜蜂各个历期的发育指标的影响，而有关其神经毒性的研究较少。有报道指出，除了影响蜜蜂的学习与记忆能力外，亚致死剂量吡虫啉（新烟碱类杀虫剂代表品种）对蜜蜂幼虫中肠、唾液腺和卵巢等部位的细胞具有致凋亡作用。然而，此类杀虫剂在昆虫体内的主要作用位置为中枢神经体系，中枢神经系统行使功能的单位为脑神经细胞，因而有关此类杀虫剂对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，对研究其神经毒性更具有针对性；此方面研究能在脑组织、脑神经细胞水平、分子水平和亚细胞水平，研究吡虫啉的神经毒性提供一定理论依据。另外，在了解此类杀虫剂对蜜蜂脑神经细胞水平影响的同时，希望结合蜜蜂个体行为学的影响对其神经毒性进行研究。蜜蜂行为学的研究多集中在蜜蜂学习与记忆能力、对蔗糖敏感性和认15 中国农业科学院博士学位论文第一章引言知能力等方面的研究，而对运动能力的关注较少；另外，果蝇的爬行行为检测方法，较旷场实验方法更符合昆虫特性，而且所需实验器材和检测方法更为简便，利于普及，如果能将此方法应用到蜜蜂爬行能力的检测，可为后续评价蜜蜂爬行能力提供可供科研人员和一线人员易操作和普及的方法，另外，希望根据不同浓度和作用时间对蜜蜂的影响程度，规范和限定吡虫啉等神经毒剂类杀虫剂在田间的施用剂量和方法提供一定的理论基础。1.7.2研究内容本实验以吡虫啉为供试杀虫剂，以成年意大利蜜蜂（A.melliferaL.）为实验对象，分别从蜜蜂脑组织、细胞、亚细胞和分子水平研究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，并通过结合神经细胞形态学变化与爬行行为变化检测方法，研究神经毒剂类杀虫剂对蜜蜂毒力影响。具体实验内容如下：（1）TUNEL法对成年蜜蜂脑神经细胞凋亡情况的检测实验利用多个剂量梯度的吡虫啉，对不同处理时间的蜜蜂进行取样，检测其脑神经细胞凋亡百分率的情况，为吡虫啉引起的蜜蜂神经系统损伤提供细胞水信息和数据。（2）Caspase法对蜜蜂脑神经细胞凋亡情况的检测实验利用前述多个剂量梯度的吡虫啉，对不同处理时间的蜜蜂进行取样，检测其脑神经细胞凋亡后Caspase-3蛋白激活情况，能够与TUNEL检测方法进行相互验证。（3）荧光定量法对caspase-1mRNA表达量的检测实验在分子水平分析前述多个剂量梯度和不同处理时间作用下，蜜蜂脑神经细胞caspase-1mRNA表达情况，据此判断吡虫啉引起的凋亡是否与Caspase依赖型凋亡途径相关。（4）透射电镜法对蜜蜂脑神经超显微结构的观察实验检测特定剂量和处理时间的吡虫啉引起蜜蜂脑神经细胞凋亡后，细胞形态变化或对凋亡和自噬特征进行观测，为吡虫啉引起蜜蜂脑神经细胞凋亡提供亚细胞水平的实验证据。（5）亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行行为和存活率的检测实验通过吡虫啉对蜜蜂运动行为的影响进行检测，期望获得不同剂量和处理时间吡虫啉对蜜蜂爬行能力的影响，为蜜蜂爬行能力检测提供简单易操作的方法，通过细胞水平和整体爬行能力相结合的方法研究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的神经毒性作用。16 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.7.3技术路线出房12h内的意蜂工蜂气候箱内饲养饲喂不同剂量吡虫啉蜜蜂脑神经细胞凋亡的蜜蜂爬行能力和存活率检测的检测TUNELCaspase-3Caspase-1透射爬行能力存活率法免疫荧光法mRNA电镜法表达量探讨脑神经细胞凋亡、爬行能力以及存活率之间的关系亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行能力和存活率的影响明确亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响17 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测有关吡虫啉对蜜蜂毒性的研究，有报道指出亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂幼虫中肠、王浆腺和卵巢等部位具有致凋亡作用，然而，吡虫啉作用于昆虫的靶标位置主要为蜜蜂中枢神经系统，而脑神经细胞是其主要的功能单元，尚无有关亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响。针对蜜蜂脑神经细胞，利用TUNEL法对亚致死剂量吡虫啉引起的凋亡作用进行的研究。期望分析不同剂量吡虫啉与作用时间下，亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1主要试剂吡虫啉原药（99.99%，美国Sigma公司）TUNEL反应液（50次，罗氏公司）蛋白酶K（2mg/ml，宝生物工程大连有限公司）DNaseI(宝生物工程大连有限公司)4%多聚甲醛溶液（碧云天生物科技有限公司）冰冻包埋剂（德国徕卡公司）苏木精染液（北京索来宝生物科技有限公司）伊红（北京博润莱特科技有限公司）Hoechst33258染液（碧云天生物科技有限公司）抗荧光淬灭剂（碧云天生物科技有限公司）其他常规试剂购自北京化工厂、西陇化工股份有限公司和国药集团化学试剂有限公司其他试剂的配制：生理盐水:NaCl7.0gKCl0.2gNaHCO30.1gNaH2PO40.1gCaCl20.1gMgCl2·6H2O0.1g葡萄糖5.0g加蒸馏水至1L4℃，存放蛋白酶K工作液：母液2mg/ml18 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测10mMTris-HCl(pH值7.4)稀释酶液100倍封闭液：30%H2O21ml甲醇9ml载玻片洗涤液1×PBS（0.01M）：NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO40.2gKCl0.2g加蒸馏水至1LpH值调至7.4吐温200.1%（终浓度，提前配制，放置一天后混入）1%盐酸酒精：70%酒精99ml盐酸1ml伊红酒精溶液:95%酒精100ml伊红0.5g2.1.1.2主要仪器与器材气候培养箱（型号RXZ-380C，宁波江南仪器厂）；蜂笼(长×宽×高=10cm×7cm×8cm)；解剖镜（型号JENA，德国CARLZEISS公司）；各种规格染色缸（上海纪宁实业有限公司）；石蜡切片机（型号RM2155，Leica）冰冻切片机（型号CM1950，Leica）阳性玻片（ESCO，美国ThermoSCIENCE公司）3金属浴仪器（型号H2O，金银杏生物科技北京公司）显微镜（型号Primostar，德国ZEISS公司）荧光显微镜（型号Primostar，德国ZEISS公司）电子称（上海越平科学仪器有限公司）2.1.1.3供试昆虫实验所用蜂种为意大利蜜蜂（简称意蜂，A.m.ligustica)，选择成年工蜂进行测定。蜂群饲养地点为北京市香山中国农业科学院蜜蜂研究所的实验室蜂场（40.20°N，116.12°E）。2.1.2方法2.1.2.1取样及饲养方法19 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测（1）随机选取来自不同蜂群的巢脾若干张，巢脾上具有正在出房的工蜂；蜂群在实验前，进行了常规治螨，在至少间隔1个月后，在取样前，人为检查蜂群螨害情况。当确保蜂群无螨害后进行取样（Aliouaneetal.,2009）。（2）将巢脾放置于气候培养箱内培养（培养条件：33±1℃，相对湿度70±5%，黑暗），放置巢脾的隔层需要事先铺放与箱体面积相当的铁板，防止出房蜜蜂从隔层漏到培养箱底部，尽量避免不必要的蜜蜂死亡或受伤情况的出现。期间定期检查加湿器内的水面，防止水干而使培养箱内湿度降低，需保存实验条件稳定不变；（3）收集刚羽化出房的工蜂装入蜂笼，每笼60头；将在12h内出房的蜜蜂随机抓取放入蜂笼，取蜂时需动作轻缓，蜜蜂对身体上的损伤很敏感，避免因人为因素损伤蜜蜂，而影响后续实验结果；（4）蜂笼内放置一次性食槽，其中各个孔中分别加入花粉、糖水和无菌蒸馏水，其中各个成分总量为花粉1.0g、50%糖水（w/v）3000μl和无菌蒸馏水600μl；（5）根据蜜蜂取食情况，在饲喂7d内，需每日更换新的花粉和食槽，前期花粉消耗较后期多，因而，需及时关注花粉量并及时添加。定时补充和调整糖水和水的填加量，使其满足蜜蜂每日食物需求且能够任意取食(Ramirez-Romeroetal.,2008）；（6）每日更换食槽，并在温度适宜时，将蜂笼从气候培养箱中取出，待蜜蜂排泄后再放回培养箱继续培养，此步骤利于在实验室内长期饲养蜜蜂，按照此方法，蜜蜂通常存活40d以上，使其与蜂群内蜜蜂生存状态更为接近（图2.1）。图2.1蜜蜂的实验室内饲养Fig2.1Honeybeesrearedinlaboratory20 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图2.2蜂笼和食槽Fig2.2Cagesandfeedersforbees2.1.2.2药物处理方法（1）蜜蜂正常饲喂7d，从第8d开始饲喂含有特定剂量吡虫啉的糖水。（2）实验所用亚致死剂量吡虫啉剂量（每天每头蜜蜂饲喂0、0.5、1.5和4.5ng）参考了宋怀磊等（2011）和其他有关亚致死剂量测定实验（Elbertetal.,1991;Suchailetal.,2000,2001;Schmucketal.,2001;Halmetal.,2005）。将吡虫啉原药粉末溶于丙酮（0.03%）中制成母液，与50%糖水（w/v）配制为相应浓度药液（按照每头蜜蜂饲喂0.5μl的剂量）；空白对照组饲喂含有丙酮（0.03%）的糖水。（3）用软镊子将蜜蜂从蜂笼中逐个取出，并用微量移液器饲喂蜜蜂0.5μl含药物糖水，待蜜蜂吸尽后，饲喂后的蜜蜂蜂笼被放入另一个蜂笼，每笼60只蜜蜂。在饲喂剂量（2-5μl）较多时，到饲喂到后期时（喂药6d后），有的蜜蜂可能不能将全部糖水用尽，经预实验获知，一直20d，所有受试蜜蜂均能够用尽0.5μl；由于量较少，挥发较快，因而需尽量贴近蜜蜂吻，刺激其伸出吻取食。（4）蜂笼内放置无药物糖水（50%糖水，3000μl），同样定时补充糖水填加量，使满足蜜蜂每日食物需求且能够任意取食（Decourtyeetal.,2003;Ramirez-Romeroetal.,2008）。（5）在连续按照此方法饲喂3，6，9和12d取样。每个处理组随机选取9只蜜蜂用于后续头部解剖、固定和切片。2.1.2.3神经细胞和神经胶质细胞实验中主要针对蜜蜂脑神经细胞（即细胞球体，也是主要功能单元）进行计数，因而需要区分蜜蜂脑神经细胞和神经胶质细胞。两者的区分可以通过对石蜡切片上的蜜蜂脑组织进行苏木精21 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测-伊红染色后辨别。蜜蜂脑组织获取：（1）将取样蜜蜂迅速置于冰上30s；在体式解剖镜下进行蜜蜂脑组织解剖。（2）在预冷的生理盐水中，利用游丝镊剥离蜜蜂头壳和王浆腺；解剖时需从头部上方单眼处利用大头针轻轻刺破脑壳，但不伤及内部组织，以此处为解剖起始位置，或者利用解剖剪在脑的后下方脑壳处剪口，同样要不对内部组织有所伤害；（3）沿刺破或开口位置轻轻撕下一侧复眼上方脑壳，通常对称进行利于对蜜蜂脑组织的保护；（4）按照同样方法，轻轻撕下另一侧复眼上方脑壳；（5）一个镊子平压脑上方，另一镊子将触角附近的脑壳撕去；（6）将围绕脑组织王浆腺等丝腺体，慢慢撕下；注意丝腺体围绕脑组织，在撕扯脑下方丝腺体时注意不要将脑割裂开；（7）将两侧复眼轻轻撕下，避免损伤脑组织；（8）此时露出包被着脑膜的脑组织，对称地撕去脑膜，动作要尽量轻柔，在用游丝镊子刺破脑膜时，将镊子粘连的部分轻轻撕下，此时，稍停顿5s，脑膜在失去内部压力，并在生理盐水的作用下，脑膜短暂脱水，变干并被部分氧化，颜色稍黄，此时利于进一步整片撕下脑膜。（9）利用手术剪剪断脑组织与胸部连接部分；如果不希望用手术剪，可以先将脑组织外部能剥离的其他组织尽量剥离干净；此时，脑部组织呈近似漂浮状态，可以轻轻翻转蜜蜂脑组织，露出脑下方的与胸部连接的组织，用游丝捏在离脑组织1mm距离处扭断剩余连接组织，但这种方法易将蜜蜂嗅叶处的空洞撕裂，嗅叶受损；因而，尽量选择手术剪进行剪短处理。（10）将剥离干净的脑组织迅速置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定12~16h。由于蜜蜂脑呈蝴蝶状展开，多漂浮在固定液的上表面，通常将盛装固定液和蜜蜂脑组织的离心管倒置，每隔6h，轻轻晃动固定液，使得脑组织尽量全部浸没在固定液中或不同部位能够接触到固定液。石蜡切片的制备和苏木精-伊红染色主要步骤：（1）冲洗：将固定好的蜜蜂脑组织用纱布包好，放于金属网内，流水冲洗过夜；（2）脱水：梯度酒精中脱水，依次为30%(3h)→50%(3h)→70%(2h)→80%(2h)→90%(40min)→95%(40min)→100%(Ⅰ)(15min)→100%(Ⅱ)(15min)；（3）透明：二甲苯-无水酒精（1:1）（20min）→二甲苯（3min）；此处注意二甲苯的处理时间需严格按照3min进行，时间过长易导致蜜蜂脑组织碎裂；尤其需留意吡虫啉处理组的蜜蜂脑组织的状态，处理组的较空白对照组的更易出现碎裂现象。（4）浸蜡：石蜡Ⅰ（60℃，30min）→石蜡Ⅱ（56-58℃，30min）→石蜡Ⅲ（56-58℃，30min）；（5）包埋：将组织块放入预先融好的石蜡内，自然冷却；（6）修块和切片：将带有蜜蜂脑组织的蜡块进行切割，争取将脑组织部位位于修好后的蜡块中央，注意因需要脑横切片，需要调整、摆正蜡块使蜜蜂脑组织能够为横切片切取，切片厚度4μm，用手动切片和后续展片和粘片操作获取蜜蜂脑组织连续切片，38℃烘干；（7）脱蜡：二甲苯Ⅰ（3min）→二甲苯Ⅱ（3min）→二甲苯-无水乙醇（1:1，3min）→无水乙醇Ⅰ（5min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→95%乙醇（5min）→80%乙醇（5min）→70%乙醇（5min）→50%乙醇（3min）；此处同样需要注意二甲苯的处理时间和后续乙醇的处理时间；22 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测（8）苏木素染色：PBS冲洗3次（每次5min）→苏木素染液（5min）→蒸馏水浸洗2min→1%盐酸酒精浸洗数秒，时间根据镜检结果而定，当分色到切片粉红色后为止；（9）蓝化：用自来水冲洗，直至镜检后能看到清晰的蓝色细胞核，细胞核轮廓明显。由于蜜蜂脑组织内的神经细胞的细胞核几乎充满整个细胞，因而，神经细胞多呈现蓝色，细胞质由于空隙较小，着色不易分辨，主要以细胞核的位置进行区分。（10）蒸馏水浸洗1min；此处可将切片夹好放入小型染色缸进行浸洗，通常更换2-3个染色缸；（11）50%乙醇（1-2s）→70%乙醇（1-2s）→80%乙醇（1-2s）→伊红酒精溶液2min→95%乙醇（1-2s）→100%乙醇Ⅰ（1-2s）→100%乙醇Ⅱ（2min）；（12）二甲苯-无水乙醇（1:1，1-2s）→二甲苯（2min）；（13）封片：在组织上滴加中性树胶，小心盖好盖玻片，烘干；（14）镜检：烘干后的玻片即可用于保存和镜检。神经细胞与神经胶质细胞的判定标准：神经细胞为分布在神经纤维束周边，细胞核染色均匀且呈淡蓝色，近似圆形或椭圆形，排布规律，位置集中，大小均一；细胞质呈粉色（多为神经纤维内着色，神经细胞球体细胞质着色较少，难于分辨）；神经胶质细胞为分布在神经纤维束内或外部，染色致密且呈深蓝色，形状为不规则多边形，排布杂乱，多分布在髓的内部或者外部边缘，通过分布位置、着色深浅、形状大小通常能够在石蜡切片上区分神经细胞球体和神经胶质细胞。2.1.2.4蜜蜂脑神经细胞的观测实验中细胞计数均以冰冻切片为载体。冰冻切片制作步骤：（1）冰冻切片机提前开机，温度设定为：样品固定点（样品头），-20℃；机箱，-19℃；切片机参数的设定是获取完整的连续冰冻切片的关键；当切片操作进行了1-2h时，由于长时间操作过程中的频繁开关机箱封盖（取送样品、调整切片参数或粘取切片等操作），导致机箱内温度不稳定，而引起切片粘刀或者切片撕裂不连续的现象产生；此时需暂停操作，关闭机箱盖，待温度恢复设定值后重新开始切片，避免因追求切片效率而损失目标脑切片（能够包含几乎全部脑结构的切片数量较少）。（2）将固定好的蜜蜂脑组织在PBS洗液中浸洗3次，每次5min；（3）在样品托上用组织包埋剂做成表面平整的底托，厚度约1cm，将其放置在冰冻切片机内的样品制备槽内，冻牢固（通常20min），并将其表面用切片机切成平面；(4)将组织包埋剂在底托上，先将蜜蜂脑组织外周液体用吸水纸吸干，再用镊子将其平放浸没到组织包埋液中，调整组织角度，使其平面尽量水平；包埋剂可塑造成水珠型（图2.3），利于切片的完整性。此处关键为将样品表面的水分尽量吸干，避免在冰冻后出现冰颗粒而引起脑切片的撕裂现象；但动作需迅速，避免脑组织表面干燥而引起蜜蜂脑切片外围神经细胞出现假阳性结果（干燥处更易着色且着色较深）（刘婷婷，2009）；(5)将同一时间点取样的蜜蜂，均包埋完毕，密封后放于-80℃；如短期能够处理，可放于-20℃；23 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测此处关键为密封处理，如密封不好，包埋剂出现脱水现象，后期可能从样品托上脱落而需重新溶解和包埋；（6）对已经调整好的样品固定在冰冻切片机的样品头上，后续进行切片步骤；在固定时，确保固定牢固，避免对刀头的损伤；另外通常需要多次调整包埋剂的方向使其利于产生连续切片。（7）在切到脑组织处，改为4μm连续切片（图2.4）；（8）在出现两侧复眼时，此时的切片为目的切片，具有完整的2侧复眼和2对蕈状体（或称蕈体），另外选取带有嗅叶的切片（图2.5）；复眼成向内弯曲的弧形，因呈现褐色或黑色而便于观测，当出现深色边缘时，通常需要将样品托在样品头内进行旋转而达到使两侧复眼对称的目的，利于获得对称脑切；（9）将完整的脑切片吸附到阳离子玻片上；通常一个载玻片贴附一张冰冻切片，因而需利于小刷子对连续切片进行小心分离和展片，而后迅速分别粘取每一片脑片；（10）每个脑组织处迅速用100μl4%多聚甲醛溶液覆盖，室温固定10min；（11）PBS洗涤3次，每次5min；每次洗涤，尽量吸尽洗涤液，而后进行下一次操作。图2.3样品包埋后的形状Fig2.3Appearanceofembeddingagentwithsampleinit图2.4贴附在载玻片上的蜜蜂脑切片Fig2.4Sectionofbrainofbeesadheretoaslide24 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测MBMBALALDLDL100μm图2.5意大利蜜蜂脑部侧面观示意图Fig2.5SchematicrepresentationofbrainofApismelliferaligusticaAL:嗅叶；DL:后脑叶MB:蕈状体AL:Olfactorylobe;DL:Dorsallobe;MB:Mushroombodies.Hoechst33258染液对细胞核染色（1）Hoechst33258染液室温，避光，染色5min；（2）PBS洗涤3次，每次5min；（3）将玻片上多余液体利用滤纸吸走；（4）滴加抗荧光淬灭剂并加盖盖玻片；此处需小心倾斜盖上盖玻片，防止气泡产生，如产生气泡需避开气泡处进行计数，而不能将盖玻片揭开重新加盖，此操作易将脑片带离载玻片；（5）玻片放置于避光湿盒内；此操作使得荧光淬灭的时间推迟1-2h，可满足同一批次脑切片的图像采集要求，另外，湿润条件避免因时间过长导致的脑片干燥；（6）荧光显微镜观察拍照。镜检（1）首先启动图像采集窗口，荧光显微镜发射光源和荧光显微镜电源均打开，设备前期预热和自检；（2）选择激发光波长358nm，对Hoechst33258染液染色后细胞核进行观测，在发射光波长461nm处采集图像；捕捉视野下蜜蜂脑组织中神经细胞的细胞核发出的蓝色荧光；（3）可选操作：可选择紫外光观测，用于观测部分神经纤维的分布和走向；（4）选择合适的放大倍数（600倍），进行图像采集和拍照；（5）神经细胞计数区域可选择脑部主要功能区内部或周边，区域内神经细胞大小均一，排列规律，分布集中，细胞轮廓清晰，便于计数。对图2.5所示2个横切面观察脑部结构与神经细胞分布规律。其中右侧虚线处的切片用于观测蕈体、视叶、前脑叶、中心体和各个髓体部分，而25 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测左侧虚线处的切片用于观测嗅叶和部分蕈体部位。2.1.2.5TUNEL法检测细胞凋亡率首先对冰冻切片进行TUNEL法荧光染色用于指示凋亡细胞，再经Hoechst33258复染，用于选定区域内总细胞计数（Olivieretal.,2008）。切片于4%多聚甲醛溶液内室温固定15min；0.1mol/LPBS洗涤3次，每次5min。TUNEL步骤为：（1）细胞通透处理：将蛋白酶K（终浓度20g/μl）100μl覆盖脑组织，25℃，5min；此处为使实验条件一致，均将载玻片放置金属浴仪器上进行处理；（2）PBS洗涤3次，每次5min；每次洗涤后，尽量吸干液体；（3）封闭液，25℃，20min；（4）PBS洗涤3次，每次5min；（5）新鲜配置的TUNEL反应液（45μl标记混合液，另外混入5μlTdT酶）；将溶液滴加在脑组织上；（4）TUNEL反应在避光条件下，37℃，孵育1h；因反应液体积少，因而此步骤的关键为防止反应液挥发，反应体系需在密闭的湿盒中进行；另外，载玻片上小心加盖略小于载玻片宽度的封口膜；在孵育结束时，小心移去封口膜，避免将脑组织带离载玻片；（5）PBS洗涤3次，每次5min；（6）阳性对照的制备：脑组织经蛋白酶K（20g/μl），25℃，5min；PBS浸洗3次，每次5min；脑组织上滴加100μlDNaseI反应液（利用酶体系自带的缓冲液进行稀释，终浓度为10U/μl，），30℃，10min；其余步骤与处理组步骤相同。（7）阴性对照：滴加无TdT酶的缓冲液，其他操作条件与处理组一致。将上述脑切片进行PBS浸洗，3次，每次5min；吸干每个脑切片周围的多余液体；Hoechst33258染液复染（1）每个脑切片滴加50μlHoechst33258染液，25℃；放置5min；此处需避光反应；（2）PBS浸洗3次，每次5min；（3）同样尽量吸干脑组织周围的多余液体；（4）滴加抗荧光淬灭剂1-2滴，从载玻片一侧小心倾斜盖上盖玻片，防止气泡产生；（5）最终将带检测的载玻片均迅速放入暗盒内，逐个进行镜检和拍照。镜检（1）主要步骤同2.1.2.4叙述的镜检前期准备步骤；（2）设置绿色荧光的激发光490-495nm，发射波长为520-530nm；26 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测（3）首先对细胞计数部位进行蓝色荧光观测与拍照，保持视野不变，变换为观测绿色荧光的光路并拍照，因此在同一个视野获取蓝、绿两种可对比和叠加的照片；（4）后续对脑切片上神经细胞的凋亡百分率进行计数与统计。（四）结果判定蓝色荧光指示总细胞，绿色荧光指示TUNEL阳性细胞，两者均为细胞核染色；前者能够穿透细胞膜，对所有细胞的细胞核进行染色，而后者在进入细胞核后，与凋亡细胞内断裂的染色体DNA的粘性末端进行结合（荧光素的带入），指示凋亡细胞。每个处理组9个蜜蜂脑，每个脑随机选取具有全脑主要部分的切片对选定部位（蕈体、视叶和嗅叶）观测，对每个脑选定的部位的数据进行加和（上述三个主要部位，每个部位随机选取3个视野，每个视野内计数100个细胞，每个脑片计数900个细胞）并计算总凋亡率（Khuranaetal.,2006）。具体为：（1）通过Hosech33285（蓝色）染色能够标记出神经细胞的细胞核的位置，即细胞的位置，通过对细胞聚集处，对标记为蓝色荧光的细胞进行人工计数，这时统计的数据为全部的神经细胞数量；（2）TUNEL法荧光染色（绿色）能够标记处凋亡的细胞的细胞核的位置，同样是凋亡细胞的位置，通过对其标记的绿色荧光的细胞进行计数，此数据为凋亡细胞的数量。另外，如果荧光信号均较强，利于将蓝、绿荧光图片重叠观测，将两者图片重叠后，首先对选定区域内仅为蓝色荧光的细胞进行计数，记为此区域的全部细胞数量，而对出现蓝绿色荧光的细胞进行计数，此为凋亡细胞数量；此过程中可对照单独获取的蓝色和绿色荧光的图片对蓝绿色的阳性细胞进行反复确认；（3）对数据记录与整理，凋亡细胞数与此区域全部细胞数之比即为凋亡百分率。2.1.2.6数据统计与分析细胞凋亡率的数据分析，实验数据以平均数±标准误差(SEM)表示；应用SPSS19.0统计学软件进行单因素方差分析（one-wayANOVA），Tukey’sHSD法多重比较分析差异显著性（P<0.05）。统计方法适用于后续实验的多重比较分析。细胞凋亡百分率的时间效应以及两者相关性分析，通过简单散点图检验线性关系，对符合线性关系的进行双变量和Spearman法分析差异显著性。2.2结果与分析2.2.1成年意蜂工蜂脑组织和脑切片蜜蜂脑部外部脑壳高度骨化，在经解剖操作后，将脑组织具有单眼的一侧朝上放置，可看到完整的蜜蜂脑组织外形似展开翅膀的蝴蝶形状（图2.6）；单眼两侧的组织为对称的蕈体；两侧外围膨大的组织为视叶，近似扇形；中间偏下方处的圆孔为抽离食管和其他腺体后留下的空洞；圆孔左右两侧为嗅叶；圆孔正上方和蕈体下方为中心体和脑桥体。利用石蜡切片及组织化学染色技术，可看到蜜蜂蕈体的横切面为弯向单眼，上方开口的近似的半圆形的结构；也可看到蕈体根部的髓的走向（均朝向中心体的位置弯曲）、中心体以及嗅叶处的横切面；另外，在冰冻切片上看到蜜蜂一侧视叶的形态和各个部分的排列方式；通过紫外光27 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测激发，意外的观测到视髓层内的部分神经纤维的排布情况，可观测到神经纤维联通视小叶和视外髓部分，神经细胞发出红色荧光，与髓体部分界限清晰。在蜜蜂脑组织内部，可观测到蜜蜂不同部位的细胞群和神经纤维体。在将解剖后的蜜蜂脑组织直接进行染色后观察（未进行切片处理，直接将解剖后的脑组织利用Hosech33285染液进行染色后，滴加2滴PBS溶液后，加盖载玻片进行镜检）；可观察到视叶的细胞群与切片所示的位置相近，集中在神经交叉部位（图2.7），蕈体部位的细胞集中在蕈体冠内部，蕈体冠外围也有一些排列更加紧密的细胞，较蕈体冠内部的神经细胞较难区分；嗅叶周围也呈现围绕中间髓体的细胞群；另外通过这种方法能看到蜜蜂脑神经细胞球体（globulicell，简称细胞体，文中指神经细胞））内细胞核的外部形状，从外部看，多接近球形，但也有很多不规则的形状；通常正常细胞的细胞核（蓝色，图2.8）几乎充满整个细胞，所以可以将此时观测的细胞核的形状近似为神经细胞球体的外部形状。此外，可观测到神经胶质细胞（图2.7-2.10）；在主要的细胞群处，当神经细胞球体与神经胶质细胞尺寸差异较大时，此时较容易区分两种细胞类型（图2.9和2.10），而当两者尺寸相近时，有时荧光信号较强时，荧光信号易覆盖真实细胞的形状而影响两者的鉴别，单从细胞大小和形状有时较难区分两种细胞（图2.8），而实验需对其具有重要功能的神经细胞进行计数，因而需对两者进行后续区分。28 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图2.6意大利蜜蜂脑组织和脑切片Fig2.6BrainandsectionsofbeesMB：蕈体；LO：视叶；AL：嗅叶；NF：神经纤维；NE：神经细胞MB:mushroombody;LO:Lobula;AL:antennallobe;NF:nervefibre;NE:neuron图2.7未经切片的蜜蜂脑组织和神经细胞（Hosech33285染色）Fig2.7Brainandneuronsfrombeefreeofsectioning(Hosech33285stain)OC：外神经交叉；ME：视髓层；IC：内神经交叉；LO：视叶OC：Externalchiasma;ME:medulla;IC:internalchiasma;LO:Lobula.29 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图2.8蕈体内联系神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）Fig2.8Kenyoncellsandglialcellsinmushroombody(HEstain)MB：蕈体；GC：神经胶质细胞；KC：联系神经细胞MB:mushroombody;GC:glialcells;KC:Kenyoncells.图2.9视神经交叉处的神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）Fig2.9Neuronsandglialcellsincellsininternalchiasma(HEstain)MB：蕈体；ME：视髓层；IC：视神经交叉；CIC：视神经交叉细胞；GC：神经胶质细胞MB:mushroombody;ME:medulla;IC:internalchiasma;CIC:cellsininternalchiasma;GC:glialcells.30 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图2.10嗅叶处神经细胞和神经胶质细胞（HE染色）Fig2.10Neuronsandglialcellsinantennallobe(HEstain)AL：嗅叶；NE：神经细胞；GC：神经胶质细胞AL:antennallobe;NE:neurons;GC:glialcells.通过对蜜蜂脑组织进行石蜡切片及苏木素-伊红染色，可区分神经细胞球体和神经胶质细胞；蕈体冠内神经细胞核呈现浅蓝色（有些偏蓝紫色）（图2.8）；神经细胞球体形状多为圆形或椭圆形，因细胞核几乎充满整个细胞，使得神经细胞多呈现蓝色，紧密排列在一起，位置集中，大小均一；其它髓体部位为浅粉色；而神经胶质为浓染的蓝色（或蓝紫色），染色致密，形状不规则，通常为多棱角的实心点状蓝色，分布不规律，较为杂乱，排列不连续（图2.8）；蜜蜂脑组织具有二对蕈体冠，共4个根部，对称的排列在蜜蜂单眼两侧；在蕈体冠内，可看到神经细胞球体几乎充满整个蕈体冠，而胶质细胞出现在蕈体冠的中央，在从蕈体冠延伸到单眼方向的区域，有一束带状的神经胶质细胞区，此处神经细胞与神经胶质细胞较难区分；同样看到蕈体冠外围致密排列的神经细胞，尺寸较蕈体冠内侧神经细胞小；另外，在蕈体的其他部位分散着很多神经胶质细胞，体积明显小于神经细胞球体，神经胶质细胞呈现浓染蓝色，长条状，有的首尾相连，因而易于与神经细胞进行区分；在蕈体或其他部位的髓体内也分散着神经胶质细胞，而神经细胞球体很少在其中分布；神经细胞多分布在神经纤维束周边，因而多选取神经细胞较为集中的部位进行细胞计数。通过观察视叶处的神经细胞球体和神经胶质细胞，可见靠近视神经交叉内部位置的神经细胞球体较蕈体内细胞稍大，形状较规则，同样近圆形或者卵圆形，排列紧密，大小均一；此处神经胶质细胞呈现不规则形状的蓝点，在神经细胞群内零星分布；相比蕈体内的神经胶质细胞，此处31 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测神经胶质细胞更易被区分，因与神经细胞球体相比，其尺寸更小，数量也较少，通过其外观即可辨别。在接近蕈体冠上方的外围分布着很多细胞尺寸小于靠近蕈体下方的视神经交叉部位的神经细胞；同时，此外可观测到着色较深的神经胶质细胞，而且越靠近复眼和髓体上方的位置，神经胶质细胞比例越高，在神经胶质细胞和神经细胞交互出现的位置，较难区分神经细胞和神经胶质细胞。在嗅叶处，在髓体周围可见大量的神经细胞球体，细胞尺寸与视叶的视神经交叉处的神经细胞相当，形状也多为圆形或近圆形，但也看到其他不规则形状的细胞；神经胶质细胞多贴附在髓体外侧花瓣状的神经纤维体的表面，形状多为细条状，弯曲弧度多靠向髓体外表面，且尺寸较小，浓染为蓝色，易于与神经细胞球体区分。在中心体附近多分布着各个脑体的髓体，髓体之间可看到零星分布的神经细胞，神经胶质细胞在此处分布较多，且在髓体内部和髓体之间都大量分布，此处神经胶质细胞尺寸不均一，当荧光信号较强时，多呈现类似神经细胞的形状（详见2.2.2）；较难区分神经细胞与神经胶质细胞。2.2.2蜜蜂脑神经细胞群的分布通过对细胞核进行Hoechst33258染色，确定了神经细胞球体的分布情况（图2.11A）。在神经纤维体外侧，神经细胞球体多规律排列，细胞核大小均一，近椭圆型；各类神经胶质细胞在纤维体内部，呈不规则多边形，大小不均一。意蜂脑部主要结构包括视神经节层（lamina）、外神经交叉（externalchiasma）、视髓层（medulla）、内神经交叉（internalchiasma）、视叶（lobula）、蕈状体(mushroombodies)、中心体（centralbody）、前侧脑叶（protocerebrallobes）、食道下神经节（suboesophagylganglion）和触角叶[antennallobe，又称嗅叶(olfactorylobe)等部位（2.11A）。在上述部位内部或之间分布着神经细胞，根据意蜂脑组织部位的不同以及神经细胞分布规律，可看到多个细胞集中区域（图2:A，从左至右）：外神经交叉区神经细胞（oc下侧方框）（图2.11B）、内神经交叉区神经细胞（ic下侧方框）（图2.11C）、蕈状体冠上端的联系神经细胞（Kenyoncells，也称内源性神经细胞）（mb左上方方框）（图2.11D）、前侧脑叶各个神经纤维束间的神经胶质细胞（pl处方框）（图2.11F）、中央体神经纤维束外侧神经胶质细胞（cb处方框）（图2.11G）和食道下神经节周围神经细胞（sog处方框）（图2.11H）。由于图2.11A所示切片未包含嗅叶部分，图2.11E可用于嗅叶内部和周围神经细胞计数（al处方框）（图2.11E）。外神经交叉部位可见大量的神经细胞（图2.11B），细胞形状规则，排列规律，然而由于处于脑组织的最外围，通过多次溶液的洗涤，孵育等操作，使得外围组织处易破损，而影响后续的计数；内神经交叉部位（图2.11C），处于组织内部位置，通常实验各项操作对其损伤较小，在接近视叶下方或者上方的部位，神经细胞分布较为集中，且细胞大小均匀，轮廓清晰；而沿此交叉处向内部中央位置延伸，神经细胞排列较下部或上部的细胞排列松散，形状不规则，有的呈现长条或长椭圆型，通过与苏木素-伊红染色后相同位置进行比较后得知，中央处的神经细胞分布较少，而神经胶质细胞分布较多，尺寸较大，在强的荧光信号下，易于神经细胞相混淆，因而此处较视神经交叉上、下部位的细胞群较难区分神经细胞和神经胶质细胞。蕈体冠内（图2.11D）分布的神经细胞密集，形状较规则，排列紧密，尤其蕈体中央的细胞32 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测较靠近边缘的细胞排列更为紧密，通过与相同位置苏木素-伊红染色切片（图2.8）进行比较后得知，蕈体中央部位排列紧密的细胞为神经细胞核神经胶质细胞混杂处，此处的神经胶质细胞与神经细胞尺寸相当，在荧光信号较强时，同样较难区分两者；而位于蕈体冠内两侧的位置的神经细胞分布集中，排列整齐，轮廓清晰，神经胶质细胞较少，利于对神经细胞的计数；而且，通过目测蕈体冠内能够利于计数的细胞数量多于其他部位（图2.11D）。中脑具有对称的两侧髓体，这也是嗅叶的中心，触角感觉神经纤维在髓体外围形成了很多神经纤维球，也可见这些纤维球的横切面类似花瓣状（图2.11E）。此处神经细胞轮廓清晰，尺寸较大，因神经胶质细胞多贴附在髓体表面，利于此处两种细胞类型的区分。前侧脑叶（图2.11F）根据不同髓体的走向，呈现大的花瓣状（图2.11A），荧光图片显示此处分布着很多不同形状和尺寸的亮点，而且髓体内部也具有亮点，在苏木素-伊红染色切片上可观测到此处多为神经胶质细胞，而神经细胞分布极少。蜜蜂中心体横切面类似马蹄形（或圆拱形）（图2.11G），其周围荧光染色的亮点分布较多，且在其髓体内部和髓体之间区域均有分布，而同样根据苏木素-伊红染色结果得知，此处神经细胞较少，多为神经胶质细胞。食道下神经节处的神经细胞主要分布在髓体外围，但因此部位暴露在切片上的细胞较少，又因靠近外侧，如在进行大量实验样本的处理时容易受到实验中操作的影响而部分缺失，因而，较其他内部位置的完整度较差。100μmAAB100μmC100μm33 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测100μm100μmDEF100μm100μmGH100μm图2.11成年意大利蜜蜂工蜂脑神经细胞分布（Hoechst33258染液）Fig2.11Distributionofnervecellsinbrainofadultworkerhoneybee(Apismelliferaligustica)（Hoechst33258stain）A:脑结构示意图;la:视神经节层;oc:外神经交叉;me:视髓层;ic:内神经交叉;lo:视叶a;mb:蕈状体;pl:前侧脑叶;cb:中心体;dl:后脑叶;oes:食道;sog:食道下神经节;al:触角叶或嗅叶.B–H:分别为oc,ic,mb,al,pl,cb和sog选定部位.A:Schematicrepresentationofbrain.;la:Lamina;oc:Externalchiasma;me:Medulla;ic:Internalchiasma;lo:Lobula;mb:Mushroombodies;pl:Protocerebrallobes;cb:Centralbody;dl:Dorsallobe;oes:Esophagus;sog:Suboesophagylganglion;al:Antennallobeorolfactorylobe.B–H:Partsselectedinoc,ic,mb,al,pl,cb,andsog,respectively.34 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测2.2.3吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞凋亡率经口饲喂亚致死剂量吡虫啉（每头每头饲喂0.5、1.5和4.5ng），处理3、6、9和12d；对集中在蕈体、视神经交叉和嗅叶处的细胞群内的神经细胞进行凋亡率的统计（图2.11A）。Hoechst33258（图2.12B和C）可确定计数部位内总细胞数；TUNEL染色（图2.12D和E）可确定计数部位内凋亡细胞数，并经苏木素-伊红染色排除神经胶质细胞，可确定计数部位内的凋亡细胞率。得知在各个饲喂剂量组中，仅在吡虫啉剂量为每头蜜蜂每天饲喂4.5ng，在饲喂3d后，蜜蜂脑神经细胞的凋亡率较空白对照组具有显著性差异（P<0.001），为空白对照组2.74倍。饲喂0.5ng吡虫啉处理组，仅在饲喂12d后检测到与空白对照组存在显著性差异（P<0.001），为空白对照组2.48倍；饲喂1.5ng吡虫啉饲喂组，饲喂6d后，处理组与空白对照组存在显著性差异（P<0.001)，为空白对照组2.14倍；其中饲喂4.5ng吡虫啉处理组在饲喂12d时的凋亡率最高，为空白对照组6.20倍。空白对照组随时间递增未呈现出显著性差异。在本实验中，在吡虫啉剂量为每头蜜蜂每天饲喂0.5、1.5和4.5ng时，处理3、6、9和12d，神经细胞凋亡率表现出时间效应和浓度效应。35 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图2.12吡虫啉诱导的意大利蜜蜂蕈体内联系神经细胞的凋亡情况Fig2.12Imidacloprid-inducedapoptosisinKenyoncellsofmushroombodyofA.mellifera.吡虫啉处理后蜜蜂脑切片经Hoechst33258染色后示意图。KC:蕈体内联系神经细胞（白色箭头指示）；CIC：视神经交叉区域的细胞（红色箭头指示）；CPL：前侧脑叶内的细胞（绿色箭头指示）；CDL：后脑叶内的细胞（绿色箭头指示）。（B和C）蕈体内联系神经细胞经Hoechst33258染液染色；（D和E）凋亡细胞由TUNEL检测试剂盒染色；来自吡虫啉处理组（G）和空白对照组（F）的蜜蜂的脑神经细胞，TUNEL阳性细胞（P，红色箭头指示）和阴性细胞（N,白色箭头指示）。图B、D和F为空白对照组，并且C、E和D为处理组（每头蜜蜂每天饲喂1.5ng，9d）。图F由图B和D的重叠而成，并且G由C和E重叠而成。图A中标尺为100µm；36 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测图B到G中标尺为10µm。(A)Brainsofbeesharvestedfromtheimidacloprid-treatedhoneybeeswerestainedwithHoechst33258stain.KC:Kenyoncells(whitearrows)inthemushroombodies,CIC:cellsintheinternalchiasma(redarrows),CPL:cellsintheprotocerebrallobe(greenarrow),CDL:cellsinthedorsallobe(greenarrow).NucleioftheKenyoncellsinthemushroombodywerestainedwithHoechst33258stain(BandC),andapoptoticcellwasdetectedbyTUNELkit(DandE).TUNEL-positive(P,redarrows)andnegative(N,whitearrows)cellsinbrainofbeesfromcontrolgroup(F)andimidacloprid-treatedgroup(G).B,DandFwereforcontrolgroup,andC,EandGfortreatmentgroup(1.5ngimidacloprid/bee,ondaynine).FwastheoverlappingimageofBandD,andGwastheoverlappingimageofCandE.BarinA:100µm;BarinB-G:10µm.图2.13吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞的凋亡率Fig2.13PercentageofTUNEL-positivecellsinbrainsofbeesfromimidacloprid-treatedA.mellifera.蜜蜂经吡虫啉（每头每天饲喂0、0.5、1.5和4.5ng）分别处理3、6、9和12d。同时被TUNEL法和Hoechst33258染色的细胞记为凋亡的神经细胞，Hoechst33258染色的细胞为全部神经细胞，两者之比为凋亡百分比。图中每个数据为平均值±标准差（n=9）;数据通过Tukey-Kramer法进行ANOVA事后检验（P﹤0.05）。图中不同字母表示处理与对照间差异显著。以下图表的数据处理方法皆同。Honeybeesweretreatedwithimidacloprid(0,0.5,1.5and4.5ngperbeeperday)forthree,six,nineand12days.ThepercentageofapoptosiswasdeterminedbycomparingthenumberofHoechst33258-stainedneuronstothenumberofneuronsco-labeledwithTUNELstaining.Thedataarepresentedasmean±SE(n=9).DifferentlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatmentswithineachexposuretimeaccordingtoTukey-Kramermultiplecomparisonpost-ANOVAtest(P﹤0.05).Themethodofstatisticanalysiswasthesameinallgraphs.2.3讨论细胞凋亡技术是一种检测神经毒剂的毒性常用的方法（FrenchandHeberlein,2009;Podratzetal.,2011）。DNA片段化是细胞凋亡最重要的现象之一，DNA断裂处的3’-OH粘性末端可以利用TUNEL法进行检测。作为重要授粉昆虫的蜜蜂在接触吡虫啉后，其经口摄入的方式较接触性的摄入所产生的急性毒性强（USDA，2012）；本研究选择了经口饲喂吡虫啉的方式以及TUNEL法，检测亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞的影响。另外，选择冰冻切片进行后续实验，是因为选用冰冻切片做载体会较石蜡切片获取时间更短，实验步骤简化，而更重要的是冰冻切片对组织上37 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测抗原的损害程度较石蜡切片要小很多，避免脱水和透明等对组织损伤大的操作，使得实验结果更接近真实情况。通常情况下，冰冻切片的厚度为10-15μm，而本实验切片厚度控制在与石蜡切片同等厚度，4μm，一是能够利于与石蜡切片进行比较，再者由于蜜蜂神经细胞直径为4.92±1.71nm（见第五章），因而此厚度切片所获得的神经细胞通常为单层细胞切片，后续荧光染色，细胞图片更为清晰，利于后续荧光染色对细胞的形态学变化的观测和细胞计数。另外，利用荧光染色法，可以分别获得不同颜色荧光的图像，在后续计数阳性细胞数和总细胞数时，可在各自的图像上计数，也可叠加两种颜色后计数；而利用可见光对着色细胞进行计数时，阳性细胞和全部细胞均在同一个图像中进行计数，如果细胞排列紧密或者细胞着色与背景相近时，与荧光法相比对细胞进行区分具有一定的难度。同时，成年意蜂的脑神经细胞和其他部位的细胞凋亡检测的方法不同，前者需通过苏木素-伊红方法区分神经胶质细胞与神经细胞，而其他部位组织虽然细胞类型不同，但均具有完整的细胞结构，在对其凋亡检测时，通常将同一部位不同类型细胞均考虑在内（GregorcandEllis,2000），不特殊进行细胞类型的区分；而针对脑神经细胞中两种细胞类型（细胞结构和细胞功能差异很大）的研究，多根据实验要求分别对待，且多关注对神经细胞的影响的研究。神经胶质细胞多分散在各个髓体内部或者髓体的外围边缘处，主要与其功能有关，神经胶质细胞功能包括保护、支撑、营养和修复神经元（赵艳艳，2009；彩万志等，2011）以及参与髓鞘的形成。分布在脑组织的神经胶质细胞又分为多种类型（星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等）；其中星形胶质细胞尺寸稍大，细胞核在细胞的中间位置，通常染色较浅，少突胶质细胞内细胞核为圆形，但尺寸较小，其中有多种细胞器，因而多染色较深；小胶质细胞因尺寸较小而得名，形状有长条状和近椭圆型的，染色也较深；因而通过观测苏木素-伊红染色图和Hoechst33258染色结果推测，意蜂工蜂脑神经细胞中神经胶质细胞多为后两种类型；作为另一重要蜂种的中华蜜蜂，在工蜂蕈体的胚后发育过程中，神经胶质细胞通常较神经纤维网先行出现在特定区域，主要起到引导后者进一步形成的作用，而无接受和传导刺激的功能（李兆英，2008）；本研究在检测吡虫啉对蜜蜂的神经毒性的影响时，主要选择对神经细胞进行观测。另外，由于此部位的神经细胞通常无活跃的增殖现象，因而仅对神经细胞凋亡或者坏死进行观测。昆虫脑组织主要由神经细胞和神经纤维束形成各个部分，且各部分的功能随部位各异又相互联系。蜜蜂的脑也是其感觉器官的中心部位，位于头部食管的背面，又称为食管上神经节（周婷，2014）。成年意蜂工蜂脑部由前脑（protocerebrum）、中脑（deutocerebrum）和后脑（tritocerebrum）组成。其中，前脑行驶的功能最多也最为复杂，其次是中脑。在脑间部（parsintercerebralis）分布着大量神经细胞（周婷，2014）。本实验通过石蜡切片及苏木素-伊红染色技术对成年蜜蜂脑组织中的神经细胞和神经胶质进行了区分；首先观测结果显示蜜蜂脑组织横切片中，靠近中间层的位置，能够获得较为完整的、包括脑组织主要功能区的脑切片，通常这样的切片（4μm，单层细胞的脑切片）能够获得6-8个，可满足后续实验的需要。从这些脑切片上可根据神经细胞群和神经纤维束的分隔与排布，分为10个部位（内神经节层、外神经交叉、视髓层、内神经交叉、视叶、蕈状体、中心体、前侧脑叶、食道下神经节和嗅叶等）。在这些部位中又以视神经交叉、蕈体冠和嗅叶髓体周围的神经细胞较为集中，此处的神经细胞群完整性较好、排列紧密、形状、大小相近，其他靠近组织边缘的部位易受损、神经细胞排列稀疏，形状、大小差异较大；因而，实验中主要针对上述三个部位的细胞进行计数。本研究以冰冻切片为载体、免疫荧光法与TUNEL38 中国农业科学院博士学位论文第二章蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测法相结合检测凋亡细胞，能够在细胞水平和分子水平提供直观的数据，因而可作为检测杀虫剂对蜜蜂神经毒性的参考方法之一。GregorcandEllis（2011）利用TUNEL法检测吡虫啉对蜜蜂幼虫的影响的研究中发现，与空白对照组相比，吡虫啉能够引起蜜蜂幼虫中肠、唾液腺和卵巢细胞凋亡现象；经草酸（oxalicacid）处理的蜜蜂幼虫出现细胞凋亡异常现象(Gregorcetal.,2004)；可见多种化学物能够诱导蜜蜂幼虫体内细胞发生凋亡。此外，果蝇在经乙醇处理后，其头部触角的神经细胞出现凋亡现象（FrenchandHeberlein,2009）。吡虫啉作为神经毒剂，昆虫的脑神经细胞作为其主要作用靶标位置尚无此方面研究，因而本实验检测了亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡率的影响，即在脑神经细胞和分子水平，证实亚致死量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡且表现为时间和剂量效应。吡虫啉对蜜蜂幼虫各个部位的影响实验中，仅对LD50剂量的吡虫啉进行了检测，未做多个剂量梯度的影响实验，而其结果显示，吡虫啉引起中肠两种细胞类型（中肠柱状上皮细胞和再生细胞）呈现不同的凋亡率，而蜜蜂脑组织中也具有不同功能和类型的神经细胞（蕈体冠内的联系神经细胞、视神经交叉处细胞和嗅叶处的神经细胞），推测蜜蜂脑组织中神经细胞的凋亡率可能也随着部位不同而不同。因而，本实验对蜜蜂主要部位均进行了观测，综合各个部位的凋亡数据进行统计与分析。当吡虫啉的剂量在0.5ng时，对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响是最小的，在与空白对照组比较时，也是最迟（12d）出现显著性差异的剂量，由此可见，在低剂量（<0.5ng）吡虫啉作用于蜜蜂时，短时间内（3、6和9d）可能未见对蜜蜂的明显影响，但具有慢性神经毒性（12d）；随着剂量的增加，脑神经细胞凋亡率出现显著性差异的时间缩短（1.5ng，6d），当吡虫啉剂量在每头蜜蜂每天饲喂4.5ng时，处理3d的蜜蜂的脑神经细胞即出现显著性差异，可见如果每头蜜蜂每天摄入4.5ng及更高剂量的吡虫啉，3d时蜜蜂脑神经细胞凋亡率即出现显著性差异。本研究结果提示，在使用吡虫啉进行农业害虫防治的同时，需规范使用剂量和施用方法，同时，监测植物和环境中蜜蜂能接触到的吡虫啉的药物残留的剂量和时间，尽量避免对蜜蜂造成慢性神经毒性。蜜蜂脑神经细胞凋亡的趋势与果蝇经乙醇处理后的类似，其触角神经细胞传导信号的能力随着乙醇处理剂量和暴露时间的增加而减弱，而且TUNEL检测结果显示，果蝇触角神经细胞经乙醇处理后出现凋亡现象，而且凋亡途径与caspase族蛋白的激活有关，因而，提示我们对蜜蜂脑神经细胞内的caspase族蛋白进行相关分析，可更深入的了解吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞凋亡途径。神经毒性通常引起行为的改变，亚致死剂量的顺铂能够引起果蝇脑神经细胞凋亡外，其爬行能力显著降低；另外，亚致死剂量吡虫啉能够引起蜜蜂学习和记忆能力显著降低；在本实验设置的全部测试剂量下，蜜蜂脑神经细胞凋亡率在蜜蜂处理12d时产生的神经毒性均较高；推测此时由于神经细胞凋亡的比率较高，重要的功能区—中枢神经系统可能会出现功能上异常现象，即支配其学习、记忆、运动和其他行为能力的功能也会受到一定程度的损伤。39 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测第三章Caspase-3活性的免疫荧光法检测通常Caspase-3在正常细胞内以无活性酶原的形式存在，当细胞发生凋亡时，Caspse-3被相应蛋白酶剪切后成为具有活性的酶，是昆虫细胞凋亡过程中的重要酶类；因而Caspase-3的激活是细胞凋亡检测的另一个重要指标；对其活性检测，不但能够与TUNEL法结果互相验证，还能通过检测此蛋白的激活情况并初步判断是否与caspase依赖型凋亡途径有关。本研究通过激活型Caspase-3单克隆抗体与免疫荧光法对蜜蜂脑神经细胞中Caspase-3激活的阳性细胞率进行了检测，希望获知经亚致死剂量吡虫啉处理后，蜜蜂脑神经细胞Caspase-3的活性以及与细胞凋亡的关系。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1主要试剂激活型Caspase-3单克隆抗体（碧云天生物科技有限公司）抗兔FITC（碧云天生物科技有限公司）3.1.1.2主要仪器与器材主要仪器与器材与章节2.1.1.2相同3.1.2方法3.1.2.1免疫荧光法检测Caspase-3阳性细胞率激活型Caspase-3的抗体对发生凋亡的细胞进行染色，主要对细胞质染色；Hoechst33258染液进行复染，指示所有细胞的位置和数量（Yangetal.,2007;Podratzetal.,2011）。（1）一抗（兔抗激活型Caspase-3单克隆抗体）提前在4℃缓慢摇动过夜，目的是使后续孵育效果更好；（2）将100μl4%多聚甲醛溶液覆盖冰冻切片上的蜜蜂脑组织，室温固定15min；（3）1%BSA封闭，25℃，20min；（4）一抗孵育：将一抗利用试剂盒自带稀释液进行500倍稀释；尽量快速吸去封闭液，将溶液尽量吸干；立即加入200μl稀释好的一抗，在25℃孵育60min；此处需将载玻片放置在避光的湿盒内；一抗用封口膜盖住，防止过多挥发，期间30min时，从封口膜一侧缓慢补加50μl一抗，避免因挥发而引起溶液粘稠使得封口膜与载玻片发生粘连，而对蜜蜂脑切片造成不必要的损伤；（6）回收一抗，在再次使用时，注意离心后取上清，用于后续实验；40 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测（7）PBS洗涤3次，每次5min；（8）二抗（抗兔FITC）孵育：利用免疫荧光染色的二抗稀释液将二抗稀释1000倍；快速吸去洗涤液；将多余液体尽量吸干；25℃，孵育60min；将载玻片浸没在稀释后的二抗溶液中，避光；回收二抗；（9）PBS洗涤3次，每次5min；尽量吸去多余液体；（10）Hoechst33258复染方法参见2.1.2.4。(10)封片详见2.1.2.4。(11)镜检镜检前期准备参见2.1.2.4；因荧光素为FITC，选择绿色荧光通道，对caspase-3激活的阳性细胞发出的绿色荧光图片进行获取；利用蓝色荧光通道获取Hoechst33258染液染色的全部细胞的图像；（12）结果判定：绿色荧光指示阳性细胞（caspase-3激活的细胞），蓝色荧光指示总细胞（细胞核）。详细计数方法见2.1.2.5节。3.1.1.2不同部位caspase-3阳性细胞率的检测蜜蜂脑组织切片上呈现的几处细胞群内的细胞凋亡率随部位不同而凋亡程度可能不同。由于细胞群主要分布在视神经交叉处、蕈体冠内和嗅叶的周围，其余部位神经胶质细胞较多，而神经细胞球体少且分散，不利于计数；因而，实验主要对前述三处神经细胞群进行计数；为评价其不同区域凋亡的异同，以饲喂吡虫啉每头每天9.9ng，饲喂9d为处理组，检测其各个部位caspase-3阳性细胞率情况。（1）蜜蜂饲养和药物饲喂方法同2.1.2；（2）在饲喂9d时，取20头蜜蜂进行后续试验；（3）按照2.1.2进行解剖、固定、冰冻和石蜡切片和Hoeschst33285染色；（4）通过对比石蜡切片上神经胶质细胞的位置，剔除观测部位的神经胶质细胞；（5）按照3.1.1.1，利用免疫荧光法检测Caspase-3阳性细胞率；（6）记录和分析三个部位细胞群内caspase-3激活的阳性细胞率；每个部位随机选取3个视野，每个视野内计数100个细胞，每个部位计数5次，对来自20个脑的20片脑片进行分析。3.1.1.3吡虫啉引起的蜜蜂脑神经细胞caspase-3阳性细胞率的检测（1）用于caspase-3检测的脑切片与TUNEL法的脑切片来自相同的蜜蜂脑组织。每个处理组9个蜜蜂脑，每个脑随机选取具有全脑的主要部分的切片进行后续免疫染色，通常将连续切片利用小刷子将其分开，分别利用不同的载玻片进行粘片处理；而后分别用于TUNEL法和caspase-3法检测实验（图3.1）。（2）按照3.1.1.1，进行Hoeschst33285染色；Hoeschst33285染液对全部脑片上的神经细胞41 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测的细胞核进行染色，能够指示细胞核的位置，细胞核发出蓝色荧光，而细胞核的位置即细胞的位置。对蜜蜂脑组织各个细胞群内的随机选定进行计数，记录区域内总细胞数量；（3）按照3.1.1.2，免疫荧光法检测Caspase-3阳性细胞率；（4）通过对比石蜡切片上神经胶质细胞的位置，剔除观测部位的神经胶质细胞；（5）Caspase-1阳性细胞发出绿色荧光，指示发生凋亡而引起caspase-3激活的神经细胞的位置；对与选定的Hoeschst33285染色区域，随机选取的视野中相同的部位的细胞进行计数，用计数器记录caspase-3阳性细胞数；每个脑部片caspase-3阳性细胞数量与记录的全部细胞数量（900）的比值即为caspase-3阳性细胞率。（6）每个脑片记录900个神经细胞，重复计数5次，每个脑组织取1片计数，共计9个蜜蜂脑组织，即每个处理9个重复。（7）对处理3、6、9和12d时各处理的照片和数据进行记录和保存。图3.1蜜蜂脑组织冰冻切片Fig3.1FrozensectionofbrainfrombeeS：冰冻切片S:frozensections3.2结果与分析3.2.1不同部位Caspase-3的阳性细胞率42 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测GGCCCNCNCPCP50μm50μmBAGCCGCCNNNGCCPCP50μm50μm50μmFDE图3.2吡虫啉处理后成年意大利蜜蜂脑神经细胞Caspase-3的免疫荧光检测Fig3.2Apoptosisofnervecellsinthebrainofadulthoneybee(Apismelliferaligustica)aftertreatmentwithimidaclopriddetectedbyCaspase-3immunofluorescenceA-C:内神经交叉神经细胞;D-F:嗅叶神经细胞.A,D:处理组Hosech33285染色;B,E:处理组TUNEL免疫荧光法（FITC）；C:空白对照组免疫荧光法;D:处理组Hosech33285染色；F:HE染色.CP:阳性细胞;CN:阴性细胞;GC:神经胶质细胞.N:神经细胞;al:嗅叶.AC:Nervecellsofinternalchiasma;DF:Nervecellsofolfactorylobe.A,D:Hosech33285stainingofthetreatmentgroup;B,E:TUNELimmunofluorescence(FITC)ofthetreatmentgroup;C:Immunofluorescenceoftheblankcontrolgroup;D:Hosech33285stainingofthetreatmentgroup;F:hematoxylinandeosinstaining.CP:Positivecells;CN:Negativecells;GC:Glialcells.N:Nervecells;al:Olfactorylobe.对蜜蜂脑组织三个主要神经细胞群，包括蕈体冠内的联系神经细胞、视神经交叉内神经细胞和嗅叶髓体外围的细胞进行观测；利用吡虫啉（每头每天饲喂9.9ng，饲喂9d）诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡；通过免疫荧光染色法检测了与细胞凋亡密切相关的蛋白Caspase-3的激活情况。Hoeschst33285染液对全部脑片上的神经细胞的细胞核进行染色，发出蓝色荧光（图3.2A）；利用激活型Caspase-3单克隆抗体指示Caspase-3阳性细胞（图3.2B）的位置，细胞发出绿色荧光，在计算细胞数目时，排除神经胶质细胞；通过分析发现，三个部位凋亡率不同，其中内神经交叉神经细胞凋亡率最高为78.67±7.04%（图3.2B），显著高于其他两个部位的凋亡率（P=0.01）；而嗅叶髓体周围的神经细胞中caspase-3阳性细胞率最低，为22.03±3.09%（图3.2E），且与蕈体内细胞的caspase-3阳性细胞率不存在显著性差异。43 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测3.2.2吡虫啉处理后蜜蜂脑神经细胞Caspase-3阳性细胞率实验中蜜蜂经口摄入亚致死剂量吡虫啉（每头蜜蜂每天饲喂0.5、1.5和4.5ng），分别处理3，6，9和12d。在吡虫啉饲喂剂量为0.5ng，饲喂9d时，蜜蜂脑神经细胞中caspase-3激活阳性细胞率较空白对照组具有显著性差异（P<0.001），为空白对照组的2.41倍；当剂量为1.5ng时，在饲喂吡虫啉6d时，处理组脑神经细胞caspase-3激活的阳性细胞率较空白对照组具有显著性差异（P=0.013），为空白对照组的2.60倍；在剂量为4.5ng时，饲喂吡虫啉3d时，处理组蜜蜂脑神经细胞caspase-3激活的阳性细胞率即具有显著性差异（P=0.032）；其中在吡虫啉剂量为每头蜜蜂每天饲喂4.5ng，处理12d时，蜜蜂脑神经细胞caspase-3激活的阳性细胞率最高（54.60±4.55%），为空白对照组的6.28倍。空白对照组随时间的递增无显著性差异（图3.4）。在吡虫啉剂量为0.5、1.5和4.5ng时，蜜蜂脑神经细胞caspase-3激活的阳性细胞率分别表现出剂量和时间效应。同时，通过相关性分析得知在吡虫啉剂量为4.5ng时，神经细胞凋亡率与Caspase-3激活阳性细胞率正相关（r=0.91，P<0.05）。图3.3吡虫啉诱导的蜜蜂蕈体冠内联系神经细胞caspase-3的激活情况Fig3.3Imidacloprid-inducedcaspase-3activationinKenyoncellsofmushroombodiesofA.mellifera.蜜蜂脑组织取自吡虫啉处理组和空白对照组（丙酮）。蕈体冠内联系神经细胞细胞核的Hoechst33258染色（蓝色，图A和B）。激活性caspase-3抗体（FITC荧光素）对细胞内激活的caspase-3蛋白的检测（绿色，图C和D）。）图E和F：caspase-3激活阳性细胞（P，红色箭头指示）和阴性细胞（N，白色箭头指示）。图A、C和E为空白对照组，并且B、D和E为处理组（吡虫啉剂量：每头每天饲喂1.5ng，9d）。图E由图A和C叠加而成，并且图F由图B和D叠加而成。图A-F标尺为10µm。Brainsofbeeswereharvestedfromcontrolgroups(acetone)andimidacloprid-treatedgroups.NucleiofKenyoncellsinthemushroombodywerestainedwithHoechst33258stain(blue,AandB).Cellswithactivatedcaspase-3likeprotein（withFITC）weredetectedbyanti-activatedcaspase-3antibody(green,CandD).(E)and(F):Activatedcaspase-3-positivecells(P,redarrows)andnegativecells(N,whitearrows).A,CandEwereforcontrolgroup,andB,DandFfortreatmentgroup(1.5ngimidacloprid/bee,ondaynine).EwastheoverlappingimageofAandC,44 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测andFwastheoverlappingimageofBandD.BarinA-F:10µm.70control0.5ng/beeacells601.5ng/bee4.5ng/bee50acaspase-340ab30bbb20bbccc10dddcdcdPercentageofactivated036912Exposuretime(d)图3.4吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞Caspase-3阳性细胞率Fig3.4Percentageofactivatedcaspase-3-positivecellsinbrainsofhoneybeesfromimidacloprid-treatedA.melliferaCaspase-3激活的细胞数量与Hoechst33258染色的全部细胞数量之比为Caspase-3激活的阳性细胞率。数据以平均值±标准误差表示（n=9）。多重比较方法为事后单因素方差分析（Tukey-Kramer），显著性差异有不同字母表示（P﹤0.05）。ThepercentageofapoptosiswasdeterminedbycomparingthenumberofHoechst33258-stainedneuronstothenumberofneuronsco-labeledwithactivatedcaspase-3-positivecells.Thedataarepresentedasmean±SEM(n=9).DifferentlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatmentswithineachexposuretimeaccordingtoTukey-Kramermultiplecomparisonpost-ANOVAtest(P﹤0.05).3.3讨论杀虫剂能否引起昆虫细胞损伤取决于多种因素的影响，其中较为关键的因素为杀虫剂的穿透性、靶标识别力、作用机制和饲喂剂量等。昆虫血淋巴与神经系统之间的膜，能够阻断离子通过，因而杀虫剂的离子化程度越低越利于对膜的穿透性；吡虫啉在生理pH值条件下，仅有极少量被质子化（Shimomuraetal.,2002），因而极易进入昆虫神经系统。此外，吡虫啉能够自动识别意蜂脑神经细胞内的乙酰胆碱受体（nAChRs），并在不同类型神经细胞内充当全部或部分激动剂（Nauenetal.,2001）。因外源物对组织部位或者细胞的穿透的能力的不同可能引起不同部位的损伤程度存在差异，当利用西马嗪处理蜜蜂幼虫时，处理组幼虫中肠的柱状上皮细胞（columnarmidgutepithelialcell）与再生细胞（regenerativecell）均出现凋亡现象，但凋亡率不同（GregorcandEllis，2011）；推测蜜蜂脑神经细胞的凋亡也可能随部位和细胞类型不同而不同。由于凋亡发生率较低，对比较不同部位的真正差异不如caspase-3的激活性敏感；而caspase-3的激活也是凋亡的指标之一；因此，希望通过检测不同部位caspase-3的激活情况反映其凋亡情况。通过对蜜蜂脑组织主要细胞群进行分析后发现，蜜蜂脑组织主要有三个神经细胞群便于计数，蕈体冠、视神经45 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测交叉区域和嗅叶髓体外侧的细胞群；其余部位神经细胞或较为分散或太过紧密，或者处于组织边缘易破损，或多为神经胶质细胞。通过对这三个细胞群内的细胞进行caspase-3激活的阳性细胞率进行检测发现，三个部位的caspase-3阳性细胞率存在差异，视神经交叉部位的神经细胞凋亡率最高，与其他两个部位具有显著性差异；因而，在计算脑组织的细胞凋亡相关数据时，需对此三处部位共同观测，以减少因只对一个或两个部位的检测所造成的与真实值之间的偏差，即按照脑功能和结构选取特定部位进行总凋亡率计算，较以往随机选取视野的方法更加全面和准确。乙酰胆碱是昆虫中枢神经系统重要的神经递质，在多种昆虫中枢神经细胞（如果蝇、蚜虫、烟草天蛾和沙漠飞蝗等）发现了不同的乙酰胆碱受体的亚基（nAChRssubunits）；并且主要有两种类型，其中α亚基的特征是在半胱氨酸残基处临近处有一个二硫键，而β亚基则无此结构（GundelfingerandSchulz,2000）。组织化学实验显示乙酰胆碱受体在意蜂脑组织均有分布，部位包括蕈体和嗅叶（KreisslandBicker,1989）；目前，在意蜂脑组织中共发现5种α亚基（α2、α3、α7、α7-1和α7-2），其中已经证实吡虫啉能够与这些亚基相互作用（Guezetal.,2003）；而且这些亚基随着蜜蜂不同发育历期而在脑组织不同部位表达，其中已知α3在幼虫唾液腺处表达，而后在成年蜜蜂的视叶、嗅叶和蕈体内表达（Thanyetal.,2003）；α7-1和α7-2在蛹期时不在视叶表达，而在成年蜜蜂视叶处表达（Thanyetal.,2004）；本实验室宋怀磊也发现，α7亚基主要在蜜蜂脑组织的蕈体和视叶部位表达，并且在后者处的表达量高于蕈体，经亚致死剂量吡虫啉处理后，成年意蜂工蜂脑组织内的α7亚基表达受到抑制（宋怀磊，2013），与蕈体内的表达量相比，吡虫啉对视叶内的α7亚基的表达量具有显著性抑制作用；本研究结果也表明在意蜂脑组织不同部位的神经细胞caspase-3阳性细胞率不同。乙酰胆碱主要分布在蜜蜂的脑组织内，而在脑组织内，该神经递质又主要集中于蜜蜂的视叶部位，吡虫啉的杀虫机理即是与乙酰胆碱竞争结合位点，因而在乙酰胆碱分布最集中的视叶部位（复眼的功能部位）是受到吡虫啉神经毒性最强的部位（Kral.1980；Kraleral.,1981看宋怀磊论文）；因而本文也与此前研究的结果也均证实，吡虫啉对视觉功能的损害可能大于对嗅觉和蕈体的损伤，具体影响的指标还需进一步深入研究。Caspase-3是细胞凋亡过程中最为关键的执行分子（keyexecutioner），同时也是凋亡效应器（effectors）之一（Hakimetal.2010）；其主要功能为剪切参与细胞在凋亡过程的重要酶类（例如PARP），另外也对因凋亡引起的细胞核内DNA裂解和细胞形态的改变起关键作用(Fischeretal.,2003)。Caspase-3作为caspases族蛋白一员，同样以酶原（无活性）和激活的具有催化活性的蛋白两种形式存在。通常caspase-3酶原在Asp28和Ser29以及Asp175和Ser176之间被剪切，产生具有活性的大、小亚基。正常细胞内caspase-3以酶原形式存在，很少被激活，而当细胞出现凋亡现象是caspase-3被激活；因而Caspase-3的激活也是细胞凋亡的重要检测指标之一。Shahidi-Noghabietal（2010）利用两种黑色接骨木凝集素（SambucusnigraagglutininsIandII，来源于接骨木果的两种蓖麻毒素类蛋白）诱导不同种类的昆虫细胞组成(中肠、卵巢和脂肪体内细胞等)发生细胞凋亡，通过检测caspase-3类蛋白的活性，发现这两种毒素均引起上述昆虫细胞组分发生caspase依赖型凋亡。此外，在烟草夜蛾（Heliothisvirescens）中肠组织内，烯虫酯（methoprene，保幼激素类物质）能够通过使凋亡抑制蛋白保持在较高的表达水平，进而阻断了该组织部位的程序性细胞死亡（PCD）(ParthasarathyandPalli,2007)。由此可见，在昆虫体内，caspase-3是参与凋亡途径发生的重要蛋白之一；本研究结果也在蜜蜂脑组织中证实了这一点。利用兔抗激活型Caspase-3单克隆抗体进行了免疫荧光染色，在经口摄入亚致死剂量吡虫啉（每头蜜蜂每天饲喂46 中国农业科学院博士学位论文第三章Caspase-3活性的免疫荧光检测0.5、1.5和4.5ng）后，分别处理3、6、9和12d，蜜蜂脑神经细胞caspase-3激活的阳性细胞率表现出时间和剂量效应。同时，神经细胞凋亡率与Caspase-3阳性细胞率成正相关性，因而，推测意蜂脑神经细胞凋亡途径与Caspase-3的激活相关。在相同处理时间时，caspase-3阳性细胞率较凋亡细胞的百分比高，也推测Caspase-3是引发凋亡的上游因子之一。此外，通常哺乳动物组织或昆虫幼虫整个虫体进行匀浆，而后用ELISA法检测对底物的催化作用而检测该酶类的活性，本实验利用免疫荧光法和激活型caspase-3抗体相结合进行检测，较6ELISA法（每个重复至少需要10个细胞）需要的细胞总体数量少，而且利用单克隆抗体检测，使得结果较为特异和准确；也为检测杀虫剂对蜜蜂神经毒性提供了可选方法。47 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定第四章caspase-1mRNA表达量的测定Caspase-1也是细胞凋亡的重要因子之一，目前在果蝇上研究较广；但在蜜蜂体内此基因mRNA表达情况尚无报道；在细胞凋亡过程中，根据caspase-1mRNA表达情况的变化可初步判断此基因是否参与了此凋亡路径。本实验通过荧光定量PCR技术，检测了蜜蜂脑神经细胞caspase-1mRNA的表达量的变化情况。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1主要试剂SV总RNA提取试剂盒（美国Promega公司）M-MLV逆转录酶（宝生物工程（大连）有限公司）DNaseI（宝生物工程（大连）有限公司）RNaseInhibitor（美国FermentasMBI公司）6×LoadingBuffer（美国FermentasMBI公司）dNTP（10mM，美国Promega公司）2ExTaqMix（美国Promega公司）DL2000分子量标准（宝生物工程大连有限公司）Evagreen（美国Biotium公司）琼脂糖（西班牙Biowest公司）异丙醇（北京化工厂）无水乙醇（北京化工厂）氯仿（北京化工厂）无水乙醇（北京化工厂）醋酸钾（北京化工厂）50TAE（韩国BIONEER公司）GelRed（美国biotium公司）RealTimePCR（8联管/盖，美国BIO-RAD公司）10µl/200µl/1000µl吸头（美国AXYGEN公司）1.5ml/0.5ml离心管（美国AXYGEN公司）主要试剂配制：（1）RNA裂解液：4MGTC；0.01MTris（pH7.5）；0.97%β‐巯基乙醇此溶液现用现配，在配制时将1ml的β‐巯基乙醇加入到50ml的RNA裂解缓冲液中；48 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定（2）DNaseI孵育混合液的配制：孵育缓冲液（0.0225MTris，1.125MNaCl，pH7.5）40μl0.09MMnCl25μlDNaseI5μl将上述混合物轻轻混匀，避免剧烈振荡。4.1.1.2主要仪器与器材PCR仪（型号9700，美国AppliedBiosystems公司）荧光定量PCR仪（ABI7500FAST，美国AppliedBiosystems公司）电泳槽（型号JY600C，北京君意东方电泳设备有限公司）凝胶成像系统（型号FR-200A，上海复日科技有限公司）离心机（型号5417R，德国Eppendorf公司）超净工作台（HDL，北京东联哈儿仪器制造有限公司）各种规格体积的移液器（德国Eppendorf公司）灭菌器（SX-500，日本TOMY公司）漩涡混合器（美国ScientificIndustris公司）电子称（上海越平科学仪器有限公司）4.1.2方法经吡虫啉处理后，每个时间点，每个剂量随机选取6头蜜蜂，置于液氮中速冻处理，并于-80℃保存。每个处理随机选取6个蜜蜂脑组织，每头蜜蜂单独进行后续处理实验。4.1.2.1RNA提取（1）每头蜜蜂自-80℃取出后，放置到液氮中；（2）将头部迅速转移到装有液氮的1.5mlEP管中；利用电动研磨杵进行充分研磨，使头部始终浸没于液氮中；利用一次性研磨杵充分研磨，尽量将蜜蜂脑组织研细，通常呈淡黄色粉末，并同时注意液氮的剩余量，避免长时间暴露在室温下；（3）用SV总RNA提取试剂盒，提取样品RNA；待液氮挥发后，迅速向研磨充分的组织中加入175μlRNA裂解液；（4）颠倒离心管几次，使组织与裂解液充分混匀；（5）向175μl裂解物中加入350μl的RNA稀释缓冲液，颠倒3－4次混合。（6）将离心管放置于事先预热的金属浴加热器内；70℃，3min。注意不要超过3min，以免损害组织内的RNA的完整性；（7）12000-14000g离心10min；（8）每个样品配备一套离心管和吸附柱，吸附柱的盖子可自行扭掉；将吸附柱置于配套离心管内备用；（9）离心结束后，用移液器将澄清的上清转移到另一个无菌离心管内，注意转移时尽量不要带有杂质，否则可选择重新离心；49 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定（10）通常可吸取上清体积为500μl，再向澄清裂解液中加入200μl95%乙醇，用移液枪吸放34‐次以混合；（11）将此混合物转移到离心柱中；（12）12000g离心1min；（13）从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体。将离心柱装回到收集管上。（14）加600μlRNAWashSolution于离心柱装配体；并确认RNAWashSolution已用乙醇稀释；（15）12000g离心1min。（16）将收集管中的液体弃掉；（17）将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；需注意要让溶液与膜接触并完全覆盖膜；此处需注意孵育混合物需现用现配，另外，缓冲液与MnCl2应分开贮存；（18）于20‐25℃孵育15min。然后，向离心柱中加入200μlDNase终止溶液；此处需确认终止液已加入乙醇；（19）12000g，离心1min；（20）加入600μlRNA洗涤液，此处仍需洗涤液确认已加入乙醇；（21）离心12000g，1min；（22）清空收集管，向离心柱内加入250μlRNA洗涤液；（23）离心12000g，2min；（24）将离心柱取出，弃掉收集管，从试剂盒中取出1.5ml洗脱管；将离心柱放于新的洗脱管内；向离心柱上加入100μl无核酸酶水，此处确保加入的水能覆盖全部柱内膜表面；（25）离心12000g，1min；（26）收集的总RNA于-80℃保存。操作过程全程佩带一次性乳胶手套和医用口罩；4.1.2.2RNA琼脂糖凝胶电泳（1）将总RNA4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液1µl；（2）点样后，120V，25min；（4）凝胶成像系统观察。4.1.2.3RNA反转录为cDNA（1）反应体系：总RNA2µg引物（50µM）2µlDEPCH2O至12µl。70℃，10min，冰浴5min；5×buffer4.0µldNTP（10mM）1µlRNaseInhibitor0.5µlM-MuLV1.0µl50 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定DEPCH2O至20µl（2）反应程序：42℃，60min，70℃，15min。4.1.2.4PCR检测（1）反应体系：模板（cDNA）1µl10M引物F1µl10M引物R1µl2ExTaqMix10µlddH2O8µl引物：caspase-1引物F：5’-AATGTCCTACACTTTCTGGAAAACC-3’caspase-1引物R：5’-ATGAACCATGAACCGCGAGTG-3’β-actin引物F：5’-ATCCTGGAATCGCAGATAGAATG-3’β-actin引物R：5’-GGATGGTCCAGACTCGTCGTAT-3’caspase-1扩增产物为217bp；β-actin扩增产物为188bp。（2）反应程序：混匀后置于PCR仪中，95℃5min预变性，95℃30s→65℃30s40个循环，72℃，5min4℃∞。（3）120V电压下电泳20min，电泳结束后在凝胶紫外分析仪。4.1.2.5荧光定量PCR实验参数（1）反应体系：模板（cDNA）1μl10M引物F0.5μlEvagreen1.25µl10M引物R0.5μl2ExTaqMix12.5µlddH2O补至25µl（2）反应程序：混匀，置于荧光定量PCR仪中。95℃5min；95℃，30s；65℃，30s，40个循环。溶解曲线65℃-95℃。51 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定4.2结果与分析经口饲喂吡虫啉（每头蜜蜂每天饲喂0.5、1.5和4.5ng），在3、6、9和12d时，对caspase-1mRNA的表达量经荧光定量PCR检测后得知，在剂量为0.5ng时，饲喂3-12d，处理组和空白对照组无显著性差异；剂量为1.5ng时，在饲喂6d时，处理组与空白对照组具有显著性差异（P=0.027），为空白对照组1.67倍；剂量为4.5ng时，饲喂3d时，处理组与空白对照组具有显著性差异（P=0.011），为空白对照组的1.65倍。在吡虫啉供试剂量（1.5和4.5ng）作用下，蜜蜂脑组织内的caspase-1的mRNA表达量均随时间的递增而增加，并在作用12d时达到最大值；其中，4.5ng处理12d时，caspase-1mRNA的表达量最大，为空白对照组的2.88倍。另外，在同时处理3d时，仅当剂量为4.5ng时，处理组与空白对照组具有显著性差异；在同时处理6、9和12d时，剂量为1.5和4.5ng时，处理组与空白对照组具有显著性差异，此两个剂量的处理组之间无显著性差异。因而，在本实验设置条件下，亚致死剂量吡虫啉（每头每天0.5、1.5和4.5ng）诱导的蜜蜂脑组织内的caspase-1mRNA的表达量具有时间效应和浓度效应。图4.1蜜蜂脑组织内caspase-1mRNA的表达量Fig4.1Expressionofcaspase-1mRNAinbrainsofA.mellifera.实验对蜜蜂饲喂不同剂量的吡虫啉（每头每天饲喂0、0.5、1.5和4.5ng），分别饲喂3、6、9和12d。caspase-1的表达量计为相对于β-actin的表达量的倍数，通过比较两者的循环阈值而获得。数据以平均数±SEM表示（n=6）。数据通过事后检验（Tukey-Kramer法）进行多重比较分析，以不同字母表示显著性差异（P﹤0.05）。Honeybeesweretreatedwithimidacloprid(0,0.5,1.5and4.5ngperbeeperday)forthree,six,nineand12days.Thefold-differenceofcaspase-1mRNAexpressionrelativetoβ-actinexpressionwascalculatedbycomparingcyclethresholds.Thedataarepresentedasmean±SEM(n=6).DifferentlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatmentswithineachexposuretimeaccordingtoTukey-Kramermultiplecomparisonpost-ANOVAtest(P﹤0.05).4.3讨论Caspase-1在多数情况下是促进细胞死亡的重要因子（pro-celldeathfactor），是细胞凋亡的主要执行者之一（王华等，2002）；不同来源的caspase-1蛋白具有很高的保守性，果蝇体内的drICE、52 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定来自草地贪夜蛾（spodopterafrgiperda）的Sfcaspase-1（Vilaplanaetal.,2007；王文祥等，2011）和家蚕（Bombyxmori）（Terashimaetal.,2000;Rheeetal.,2002）体内的caspase-1为同系物，它们均可作用于相应的底物进而引起细胞凋亡程序。其中drICE在果蝇发育过程中参与程序性细胞死亡（PCD），且是该程序的关键酶类。蜜蜂体内Caspase-1（ProteinID:XP39569-7.2）由298个氨基酸组成，并具有Caspase-1蛋白保守五肽结构域QACQG（吴艳艳等，2014）。本研究通过饲喂吡虫啉（每头每天1.5和4.5ng），在处理3、6、9和12d时，得知在亚致死剂量吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞凋亡过程中，caspase-1mRNA表达量表现为时间和浓度效应，推测蜜蜂caspase-1参与吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞的凋亡过程；另外，蜜蜂脑组织内caspase-3激活的阳性细胞率也表现为时间和浓度效应，且此阳性细胞率与TUNEL法检测的细胞凋亡率正相关；本研究不但证实亚致死剂量吡虫啉能够引起蜜蜂脑神经细胞凋亡，同时，指出此凋亡途径可能与caspase依赖型相关。本实验中caspase-1对细胞凋亡具有促进作用，这与在果蝇S2胚胎细胞的凋亡中的作用不同。在果蝇基因组中，与caspase-1同源的基因为drICE（对应蛋白为Drice）；6+朱伟等人发现，经铬处理果蝇S2胚胎细胞时，细胞凋亡存在剂量效应；在一定剂量处理下（400μm），Drice表达量并不随凋亡率的递增而增加，反而显著性下降，果蝇S2胚胎细胞的凋亡不依赖于caspase-1（朱伟等，2013），虽不依赖caspase-1，但果蝇体内细胞凋亡依赖其他caspase族蛋白发生凋亡（DEICE和DRONC）（Dorstynetal.,2004）。因而，Caspase-1在不同物种的细胞凋亡过程中的作用也可能不同。在昆虫体内凋亡途径的研究主要集中在对模式昆虫果蝇的凋亡途径上。研究发现在果蝇体内至少存在三条凋亡的引发途径，其一是需要caspase族蛋白参与的途径，这也是研究最深入的途径，此途径在昆虫和哺乳动物神经细胞内的机制较为保守；在果蝇变态发育过程中，其神经细胞内的凋亡为Dapaf-1（caspase族蛋白同系物）和Apaf-1(apoptoticproteaseactivationgfacter-1，凋亡酶激活因子）依赖型凋亡；另一条同时需要线粒体细胞色素C和caspase族蛋白（果蝇中的caspase组蛋白同系物为Dapaf-1）共同参与才能引发凋亡的途径（Kanukaetal.,2005）；第三条为不需要上述两种物质的凋亡途径，此途径所必需的物质尚无定论（Zhouetal.,1999；刘凯于等，2008）；而本实验中，亚致死剂量吡虫啉引起的蜜蜂脑神经细胞凋亡与caspase族蛋白相关，也属于昆虫神经细胞发生的凋亡，是否也属于昆虫神经细胞保守性较强的caspase族蛋白/凋亡酶激活因子依赖型凋亡或者为caspase族蛋白/细胞色素C依赖型凋亡，还需对蜜蜂神经细胞内细胞色素C以及蜜蜂基因组中Apaf-1的同系物的变化情况进行检测。另外，在吡虫啉饲喂剂量为每头每天1.5和4.5ng时，caspase-1mRNA的表达量分别在饲喂6和3d时，与空白对照组相比具有显著性差异；这种趋势与之前细胞凋亡率检测（1.5ng，6d；4.5ng，3d）和caspase-3阳性细胞率（1.5ng，6d；4.5ng，3d）的检测中的趋势相近。在吡虫啉剂量为0.5ng时，caspase-1mRNA的表达量仅在处理12d时，处理组较空白对照组具有显著性差异；而对于caspase-3阳性细胞率，在处理9d时，处理组较空白对照组具有显著性差异。由此可见，蜜蜂在低剂量吡虫啉（每头每天饲喂0.5ng）作用下，同高剂量处理组（每头每天饲喂1.5和4.5ng）相比较，出现凋亡现象的程度最小且时间上更为滞后。推测成年意蜂工蜂对低剂量的吡虫啉具有一定的耐受性或者对蜜蜂的影响在能检测到的范围之外。与本文结果相似，在饲喂蜜蜂幼虫一定量（LD50或者略低的剂量）多种杀虫剂中，氟胺氰菊酯（蜂群用于常规杀灭蜂螨的药物的有效成分，在养蜂业应用了20余年）是对蜜蜂中肠柱状细胞的凋亡影响最小的药物；这为53 中国农业科学院博士学位论文第四章caspase-1mRNA表达量的测定实际生产中对蜜蜂低毒的药物选择和合理用药提供数据支持；所有试验剂量均在处理12d时，细胞凋亡出现显著性增加，因而对亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的慢性毒性仍需受到重视。54 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化细胞凋亡的多个典型特征均为形态学变化，其中细胞超微结构的变化包括细胞核缩小、染色质固缩和边集现象以及凋亡小体的出现（陈英，2001）；有研究指出，蜜蜂唾液腺细胞在凋亡过程中同时出现了自噬现象（Zacarin,2007）；本实验通过透射电镜的方法对蜜蜂脑神经细胞的超微结构进行了观测，希望探求蜜蜂脑神经细胞在凋亡过程中是否也同样伴随着自噬现象。5.1材料与方法5.1.1材料5.1.1.1主要试剂戊二醛（国药集团化学试剂有限公司）Spurr环氧树脂（上海桑戈生物科技有限公司）醋酸铀（美国sigma公司）柠檬酸铅（美国sigma公司）电镜固定液的配制（1）母液I（0.2MPB，pH7.4）：A液NaH2PO4·2H2O7.8g，蒸馏水定容至250ml；B液Na2HPO4·12H2O71.6g，蒸馏水定容至1000ml；235mlA液与1000mlB液混合后即为母液。（2）母液II（10%多聚甲醛溶液）2.5g多聚甲醛固体粉末溶于25ml蒸馏水中；加热到60-70℃时，逐滴加入1MNaOH至溶液透明为止；自然冷却至室温；pH值测定，此步骤关键需确保pH值≤7.0。（3）电镜固定液（2.5%戊二醛-多聚甲醛混合液）配比为：母液I50ml母液II20ml50%戊二醛5ml加蒸馏水至100ml此溶液需现用现配，母液I、母液II和戊二醛溶液分别存放于4℃；待使用前按比例进行混合使用。5.1.2.2主要仪器和器材超薄切片机（型号PowerTom，美国RMC公司）透射电镜（7500，日本HITACHI公司）55 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化5.1.2方法（1）选取本实验设置的剂量梯度和时间梯度中较为中间的处理组进行电镜样品取样。蜜蜂在每头每天饲喂1.5ng吡虫啉，9d时，随机选取6头蜜蜂；（2）按照2.1.2中的方法，在预冷到4℃的生理盐水中将蜜蜂脑组织进行解剖；（3）在得到完整蜜蜂脑组织后，用手术刀将蜜蜂脑组织切割成几个主要部分，两侧视叶部分（两个小块）、两侧覃体及剩余部分（一个小块）；按照一样的部位分别盛放于不同离心管内（100ml），离心管内事先装有50ml2.5%戊二醛-多聚甲醛混合液；每个蜜蜂脑部解剖和分割需要在5min内完成，尽量避免在室外暴露的时间，使组织状态更接近真实情况；（4）4℃固定12h。（5）PBS缓冲液洗涤3次，每次15min；（6）样品脱水（郝宏京等，2006）：室温下，梯度丙酮溶液脱水30%→50%→70%→80%→90%→100%（I）→100%（II）→100%（III）；每个步骤进行脱水处理30min；（7）渗透和包埋（郝宏京等，2006）：丙酮/环氧树脂包埋剂（2:1），室温4h；丙酮/环氧树脂包埋剂（1:1），室温4h；丙酮/环氧树脂包埋剂（2:1），室温4h；纯环氧树脂包埋剂，室温12h；渗透处理后的样品，37℃，12h；45℃，6h；60℃，6h；70℃，12h；（8）将包埋好的样品进行超薄切片处理；切片厚度80nm；（9）醋酸铀-柠檬酸铅染色（宁仁德和张先龙，2010）：超薄切片经柠檬酸铅染色，10min；去二氧化碳双蒸水洗涤3次，每次15min；醋酸铀染色25min；双蒸水清洗3次，每次15min；（10）待切片干燥后，即可进行透射电镜观测与拍照。（11）另外，对细胞最大直径进行了测量；随机选择6个部位，每个部位100个细胞，测量最大直径处的长度，细胞最大直径为测量细胞的平均值±SEM。5.2结果与分析在经口摄入亚致死剂量吡虫啉（每头蜜蜂每天饲喂1.5ng），处理9d后，通过对成年意蜂工蜂的视叶和覃体冠部位进行透射电镜观测，得知两个部位的神经细胞集中的区域均出现相应程度的凋亡和自噬现象，而空白对照组极少出现。56 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化正常的细胞形态，细胞体积正常（图5.1）；神经细胞最大直径为4.92±1.71μm。细胞膜完整，未见褶皱现象；双层膜清晰，未见断裂和溶解现象；细胞连接紧密（图5.2），未见细胞间较大空隙；细胞核几乎充满整个细胞，未见细胞核明显缩小现象（图5.1和5.2）；核膜完整，双层膜结构亦完整，未见核膜降解、凹陷或褶皱现象；细胞核内染色质均匀，未见固缩和边集现象；细胞质均匀，未见明显空泡化现象；细胞器丰富、轮廓清晰，形态正常。线粒体形状和体积正常，近圆型和长椭圆型（图5.1-5.3），线粒体内部可见脊结构（图5.5），未见有肿胀或者变型现象；内质网（长的内质网包围高尔基体）和高尔基体形态正常（图5.3和5.4）；可见高尔基体的多个扁平膜囊堆，每个囊膜堆由5-8个近似平行膜囊紧密排列在一起。高尔基体的最外围由一层内质网包围，内质网背向高尔基体的方向贴附着核糖体（黑色小颗粒，纵向排列，粘附在内质网外侧）；未见细胞器发泡现象（图5.4）。图5.1空白组视神经交叉处的神经细胞Fig5.1NeuronininternalchiasmafronthecontrolgroupM：线粒体；N：细胞核M:mitochondria;N:nuclei57 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.2空白组蕈体内的联系神经细胞Fig5.2KenyoncellsinmushroombodyfromthecontrolgroupN：细胞核N:nuclei图5.3空白组联系神经细胞内的细胞器Fig5.3CellorganellesinKenyoncellfromthecontrolgroupN：细胞核；M：线粒体；ER：内质网；GA：高尔基体N:nuclei;M:mitochondria;ER:endoplasmicreticulum;GA:Golgiapparatus.58 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.4空白组视神经交叉处的神经细胞内的细胞器Fig5.4CellorganellesinthecellofinternalchiasmafromthecontrolgroupN：细胞核；NE：核膜；RI：核糖体；ER：内质网；GA：高尔基体；M：线粒体；CM：细胞膜N:nuclei;NE:nuclearmembranes;RI:ribosome;ER:endoplasmicreticulum;GA:Golgiapparatus;M:mitochondria;CM:cellmembrane.图5.5空白组联系神经细胞内的线粒体Fig5.5MitochondriainKenyoncellfromthecontrolgroupN：细胞核；M：线粒体；CR：线粒体内部的脊N:nuclei;M:mitochondria;CR:cristaeinmitochondria.吡虫啉处理组中，细胞的形态发生改变，细胞膜界限模糊或者呈现单层膜形式，但仍然维持细胞形状，无破裂现象发生（图5.6）；细胞表面出现褶皱现象；细胞间的间隙较空白对照组增大，连接松散，在细胞间隙内出现空泡，类似细胞碎片的物质（图5.6和5.10）；细胞核并不像空白对照组那样几乎充满整个细胞，而是缩小（图5.7和5.9）；核膜界限模糊，核膜出现降解现象（图59 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化5.6-5.9）；由于有的细胞核膜降解严重，核孔复合物清晰可见，细胞核横切面呈现由核孔组成的“项链”（图5.7和5.8）；有的细胞核核膜皱缩，变型，异染色质边集，附着在核膜内侧的皱褶中（图5.8）；另外，观测到浓缩的染色质，边集到核膜上，呈现月牙状（图5.9）；有的细胞周围出现凋亡小体，凋亡小体为椭圆型或不规则形状，并且可见内部包裹细胞质及细胞碎片，尚无膜包裹着核降解残片的结构出现（图5.9和5.10）；细胞器出现不同程度的变形，其中线粒体肿胀，内部脊结构减少（图5.11）；高尔基体的扁平膜囊堆结构多数情况下都消失，膜囊结构出现发泡现象，可见到原来膜囊的位置出现了很多近似圆形的小泡（图5.13）；包裹在高尔基体外侧的内质网出现肿胀和发泡现象，但膜完整，无类似坏死的内质网膜的消失现象；并且内质网由正常的扁囊状呈现空泡化，核糖体部分脱落（图5.13）。另外，较为常见的、典型的形态学变化是自噬体和自噬泡的出现（图5.9和图5.14-5.16）。在吡虫啉处理后的视神经交叉部位神经细胞和覃体冠内联系神经细胞内，均可见这两种结构。可见很多自噬泡由单层（图5.9）、双层（图5.14）或者多层（图5.16）包裹；另外还可看到其内部包含细胞器和细胞碎片的自噬体（图5.14和5.16）；有些细胞内部，可观测到自噬泡与线粒体的融合阶段（5.15），单层自噬泡（内质网末泡或溶酶体自噬泡）与邻近的线粒体接触，彼此在接触的位置进行细胞膜之间的融合，是包裹线粒体的自噬体的前体形式。此类自噬体通常被称为线粒体自噬体，其内部包含1-3个线粒体（图5.14和5.16）。图5.6实验组视神经交叉处凋亡的神经细胞Fig5.6NeuronininternalchiasmafromthetreatedgroupN：细胞核；M：线粒体；CRR：染色质；V：空泡N:nuclei;M:mitochondria;CRR:chromatin;V:vacuole60 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.7实验组联系神经细胞内核膜模糊Fig5.7FuzzynuclearenvelopeinKenyoncellfromthetreatedgroupN：细胞核；M：线粒体；NU：核孔；V：空泡N:nuclei;M:mitochondria;NU:nuclearpore;V:vacuole61 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.8实验组联系神经细胞细胞核皱缩Fig5.8WrinklednucleiinKenyoncellfromthetreatedgroupN：细胞核；NE：核膜；CRR：染色质N:nuclei;NE:neuron;CRR:chromatin图5.9实验组联系神经细胞染色质凝集Fig5.9CondensedchromatininKenyoncellsfromthetreatedgroupC：凝聚的染色质；NE：核膜；M：线粒体；V：空泡；AP：凋亡小体C:condensedchromatin;NE:nuclearmembranes;M:mitochondria;V:vacuole;AP:apoptoticbody62 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.10实验组联系神经细胞内凋亡小体Fig5.10ApoptoticbodyinKenyoncellfromthetreatedgroupAP：凋亡小体；CT：细胞质AP:apoptoticbody;CT:cytoplasm图5.111实验组视神经交叉处神经细胞内线粒体肿胀Fig5.11SwollenmitochondriainthecelloftheinternalchiasmafromthetreatedgroupN：细胞核；NE：核膜；M：线粒体；CR：线粒体内部的脊N:nuclei;NE:nuclearenvelope;M:mitochondria;CR:cristasinmitochondria63 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.12实验组联系神经细胞内质网发泡Fig5.12VacuolarendoplasmicreticuluminKenyoncellfromthetreatedgroupN：细胞核；ER：内质网；GA：高尔基体；M：线粒体N:nuclei;ER:endoplasmicreticulum;GA:Golgisapparatus;M:mitochondria图5.13实验组联系神经细胞内自噬体Fig5.13AutophagyinKenyoncellfromthetreatedgroupN：细胞核；AT：自噬体；M：线粒体；AV：自噬泡N:nuclei;AT:autophagy;M:mitochondria;AV:autophagicvacuole64 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化图5.14实验组联系神经细胞内自噬泡与线粒体Fig5.14AutophagicvacuoleandmitochondriainKenyoncellfromthetreatedgroupN：细胞核；M：线粒体；AV：自噬泡N:nuclei;M:mitochondria;AV:autophagicvacuole图5.15实验组视神经交叉处神经细胞内自噬体和自噬泡Fig5.15AutophagyandautophagicvacuoleintheneuronofinternalchiasmafromthetreatedgroupAV：自噬泡；AT：自噬体AV:autophagicvacuole;AT:autophagy.5.3讨论本研究结果表明，经亚致死剂量吡虫啉处理后，成年意蜂工蜂脑神经细胞的凋亡与Caspase依赖型凋亡有关；另外，细胞还具有自噬现象。自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，在某些情况下细胞凋亡与自噬可交替或同时发生（朴英杰等，1996；Baehrecke,2003;LockshinandZakeri,2004）。65 中国农业科学院博士学位论文第五章透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化意蜂在化蛹过程中，其唾液腺细胞具有细胞凋亡和自噬过程重叠的现象（Zacarin,2007），且其自噬特征包括细胞内出现细胞质空泡（cytoplasmvacuolation）、自噬泡（autophagicvacuole）；而且除了正常的凋亡现象外，还出现细胞核降解延迟的现象。本研究观测结果与其相似，在经亚致死剂量吡虫啉处理后，意蜂脑神经细胞同时出现自噬与凋亡现象；其中最为典型的凋亡特征是染色质凝聚，断裂，贴附在核膜内侧，有的呈现典型的“新月”形状；核膜横切面呈现“项链”状，有的细胞核开始皱缩，为后续细胞核碎片化做准备，但并未见被膜包裹的细胞核碎片；细胞膜、细胞器膜（线粒体膜、内质网膜和高尔基体等细胞器的被膜）未破损，仍然保持完整的形状；本文与蜜蜂唾液腺结果不同的是，之前文章未见凋亡小体，核膜只是有小的褶皱，而本文有凋亡小体出现，另外，细胞核的降解程度大于唾液腺细胞内的。本文在这些症状的观测中更为典型。因细胞核降解延迟，本实验未观测到包裹核碎片的凋亡小体的出现，而观测到疑似通过自噬机制形成的、包裹线粒体、内质网或其他类型细胞器的凋亡小体，贴附在凋亡细胞的表面，这种现象在刘海峰等人文章中也有所综述（2008）。此现象与蜜蜂唾液腺的发育过程中的部分特点一致，其凋亡细胞也出现染色质边集、核膜褶皱和细胞核降解延迟现象。目前细胞核延迟降解的机制尚不清楚，是否与同时发生的自噬现象有关仍需进一步研究。蜜蜂脑神经细胞内出现清晰的自噬体形态，其内部有的包裹着线粒体，属于大自噬（macroautophagy）类型中线粒体自噬（mitophagy）（Okamotoetal.,2009;AshmanandMorgan,2013）；另外，也观测到自噬泡的存在。通常在线粒体受损或需要被清除时，细胞会启动自噬的方式进行选择性的对其进行消除（Tolkovsky,2009）。本实验中即观测到大量的线粒体自噬现象，有的自噬泡包裹着1-3个线粒体，推测意蜂脑神经细胞中线粒体自噬体和自噬泡的内部物质会在溶酶体的作用下逐渐降解，并最终由其他细胞吞噬进行循环利用。烟草天蛾Manducasexta化蛹时跗节牵引肌神经细胞出现自噬现象（Kinchetal.,2003），且细胞呈现大量的自噬体、线粒体固缩和细胞核解体等现象；本研究结果与其不同点为线粒体肿胀而不是固缩，并被自噬泡包裹后形成线粒体自噬体。即吡虫啉引起的蜜蜂脑神经细胞自噬至少存在两种自噬方式（线粒体自噬和自噬泡自噬）。本研究中蜜蜂脑神经细胞超微结构也显示，蕈状体周围和视神经交叉区域的神经细胞的内部构成不同，前者细胞内部线粒体的数量高于后者，而线粒体是细胞的能量工厂；线粒体还参与细胞的分裂、生长、信号传导和细胞分化等多个重要的生物过程（McBrideetal.,2006）；线粒体越多代表着细胞越活跃，据此推测蕈体较视叶更活跃。另外，本实验可观测到高尔基体外围的内质网出现发泡现象，这也是细胞发生自噬的特征之一；此外，也出现很多自噬泡，这与蜜蜂唾液腺内细胞的自噬特点相似。自噬泡的膜通常为内质网发泡形成，推测蜜蜂脑神经细胞内的自噬泡的膜由内质网发泡形成。本研究再次证实蜜蜂体内存在细胞凋亡和自噬重叠发生并引起程序性细胞死亡的现象，而两者共同作用所呈现的特征在不同条件下有可能不同。本研究首次证实亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞发生凋亡和自噬；自噬发生过程中，溶酶体活性能够激活细胞凋亡，这是两种死亡程序能够相互作用的机制之一（FerriandKroemer,2001;Boyaetal.,2003）。本研究中的另一个典型特征是，线粒体自噬较为活跃，后续需对线粒体途径的凋亡进行深入研究，为进一步阐述吡虫啉的神经毒性提供一定的理论基础。66 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测第六章蜜蜂爬行能力检测蜜蜂行为学方面的研究，多集中在利用蜜蜂喙伸反映研究环境有毒有害物对蜜蜂学习与记忆能力的影响；通过蜜蜂的运动能力（主要是爬行能力）较喙伸反映更易操作、更为直观的观测行为的改变，这也是果蝇应用最多的行为测试之一，然而有关蜜蜂的运动能力研究较少。本研究希望参考果蝇的爬行实验方法，利用蜜蜂的趋地趋光特性，研究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的爬行行为能力的影响情况；也为观测环境有毒有害物对蜜蜂个体行为的影响提供一种简便易行可选方法。6.1材料与方法6.1.1材料和仪器6.1.1.1主要材料和试剂主要材料和试剂参见2.1.1.16.1.1.2主要仪器和器材机械计数器（绍兴安昌号码机厂）小型手电筒（型号PD32，中国菲尼克斯公司）其他主要材料和试剂参见2.1.1.26.1.2方法6.1.2.1爬行能力检测实验的取样与饲养（1）随机选取若干具有正在出房的蜜蜂的巢脾，随机抓取12h新出房蜜蜂，经7d正常实验室内饲养，蜜蜂取样和室内饲养与2.1.2同；每个剂量6笼蜜蜂，每笼60头蜜蜂。（2）分别在处理3、6、9和12d时取样，进行蜜蜂爬行能力检测；（4）爬行能力通过对一定时间内，自下而上爬过一定距离的蜜蜂数量占总测试蜜蜂数量的百分比进行统计。规定时间和爬行长度的确定：参考果蝇爬行能力检测实验（Podratzetal.,2011），制作检测蜜蜂爬行能力的装置，并设定适合蜜蜂爬行能力测试的时间的高度。根据蜜蜂特性，选择适合蜜蜂爬行的表面，另外容器方便取放蜜蜂；根据对几种容器比较后，选用装蜜的塑料瓶进行蜜蜂爬行测试，在轻敲瓶壁后蜜蜂因摩擦系数刚够爬行而不能满足牢固贴附瓶壁，而落到瓶底，此装置能满足后续爬行能力的检测要求；利用黑色不透光胶纸，除留一侧不处理，用于观测蜜蜂外，将塑料瓶其他外表面进行遮光处理；在塑料瓶上方一侧开小口，用于将小手电筒的光作为光源射入瓶内，利用蜜蜂趋光性吸引蜜蜂向上爬动；67 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测确定测定时间和爬行距离：实验在暗室中进行，以空白对照组蜜蜂进行检测，每笼随机从蜂笼移取10只蜜蜂，装入具塞玻璃试管，而后转移到装置中，盖好瓶盖，将光源打开，轻敲瓶壁，使所有蜜蜂均被敲落到瓶底；与此同时，按下秒表，记录全部蜜蜂从瓶底爬到瓶顶（与光源等高度位置）的时间，每批次蜜蜂测试5次，并记录时间，计算平均时间；按照此方法，记录不同批次蜜蜂爬行到光源等高位置的时间；（5）按照确定爬行能力测试的时间和高度后，进行后续试验，测试亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行能力的影响。在每个时间点，每笼取10头蜜蜂进行爬行能力检测；按照上述方法，共计测试5次，在特定时间内，从瓶底爬到光源等高位置的蜜蜂数量占总蜜蜂数量的百分比，并求平均值；每个处理对6笼蜜蜂（每笼10头）进行观测，即每个处理6个重复。空白对照组也按照此方法进行。分别测定饲喂3、6、9和12d蜜蜂的爬行能力；爬行能力的检测在饲喂新的一天的药物之前进行。图6.1蜜蜂爬行能力测试盒Fig6.1Boxforclimbingassayofbees6.1.2.2蜜蜂幸存率检测（1）蜜蜂取样与饲养条件同6.1.2.1；（2）每个剂量6笼蜜蜂，每笼60头，即每个处理6个重复；（3）对每头蜜蜂每天饲喂0、0.5、1.5和4.5ng吡虫啉，在饲喂3、6、9和12d时，分别从各个蜂笼中取出死亡蜜蜂，并记录死亡个数；每个时间点的蜜蜂幸存率，指去掉之前死亡蜜蜂个数，剩余幸存下的蜜蜂数量与最初蜜蜂数量（60头）之比。68 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测6.2结果与分析6.2.1中毒后蜜蜂的症状饲喂药物后，有的处理组（0.5和1.5ng）与空白对照组差异较小，其他处理组（4.5ng）蜜蜂出现先兴奋后麻痹的现象，在蜂笼内上下飞舞，发出声响较大，有的仰翻在地，不能自行翻转过来，在原地打转。前、中和后足出现不同程度的麻痹现象，并伴有翅膀麻痹；爬行行出现异常，步态不稳，平衡能力减弱；少量蜜蜂出现身体蜷缩、痉挛现象；通常此症状在喂药6-12h后消失，多数蜜蜂在次日恢复正常状态。死亡蜜蜂体色黑，背部、头部和尾部绒毛脱落，有的蜜蜂吻伸出，双翅展开（图6.2）。图6.2吡虫啉处理后蜜蜂的症状Fig6.2Symptomofbeesafterimidaclopridtreatment6.2.2爬行行为能力的改变经统计分析后，确定蜜蜂爬行距离（瓶底到光源处长度，15cm）和爬行时间（全部蜜蜂爬至此高度的时间，18s）。在饲喂不同剂量吡虫啉（每头每天饲喂0.5、1.5和4.5ng），处理3、6、9和12d时，分别对各个处理组进行爬行行为能力的检测，得知空白对照组和剂量为0.5ng的处理组，在3-12d时，随着时间递增各个处理组中的蜜蜂爬行能力均无显著性差异；在剂量为1.5ng时，随着时间递增，仅在处理12d时，处理组较空白对照组具有显著性差异（P=0.02）；在剂量为4.5ng时，随着时间递增，在处理9和12d时，处理组较空白对照组具有显著性差异（P=0.001）。在相同处理时间不同剂量的爬行能力比较中得知，在分别同时处理3和6d时，蜜蜂爬行能力均不随吡虫啉剂量的增加而具有显著性差异；在同时处理9d时，剂量为4.5ng时，处理组的爬行能力较其他三个剂量（0、0.5和1.5ng）具有显著性差异（P=0.036）。在同时处理12d时，剂量在1.5和4.5ng时，处理组与空白组具有显著性差异（1.5ng，P=0.012；4.5ng，P=0.003），而剂量为1.5和4.5ng组之间无显著性差异。69 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测3d6d9d12d120aaa100abababaabababababab80bc）cc%60（4020爬到设定高度的蜜蜂的百分率000.51.54.5吡虫啉处理剂量（ng）图6.3吡虫啉处理后蜜蜂的爬行能力情况Fig6.3Climbingabilityofbeesfromimidacloprid-treatedA.mellifera蜜蜂经吡虫啉（每头每天饲喂0、0.5、1.5和4.5ng）分别处理3、6、9和12d。图中每个数据为平均值±标准差（n=6）；图中不同字母表示处理与对照间差异显著。Honeybeesweretreatedwithimidacloprid(0,0.5,1.5and4.5ngperbeeperday)forthree,six,nineand12days.Thedataarepresentedasmean±SE(n=6).Differentlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatments.1203d6d9d12daaaaaaaaa100aaaaa）b%8060c40蜜蜂存活率（20000.51.54.5吡虫啉处理剂量（ng）图6.4吡虫啉处理后蜜蜂的存活率Fig6.4Persentageofsurvivalofbeestreatedwithimidacloprid蜜蜂经吡虫啉（每头每天饲喂0、0.5、1.5和4.5ng）分别处理3、6、9和12d。图中每个数据为平均值±标准差（n=6）；图中不同字母表示处理与对照间差异显著。Honeybeesweretreatedwithimidacloprid(0,0.5,1.5and4.5ngperbeeperday)forthree,six,nineand12days.Thedataarepresentedasmean±SE(n=6).Differentlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatments.70 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测6.2.3蜜蜂幸存率利用亚致死剂量吡虫啉（每头每天饲喂0.5、1.5和4.5ng）饲喂蜜蜂3、6、9和12d时，剂量为0.5和1.5ng时，随着时间递增，处理组与空白对照组无显著性差异；仅在饲喂剂量为4.5ng时，在处理9（P<0.001）和12d（P=0.013）时，处理组与空白对照组具有显著性差异。在同一个处理时间，处理3、6和9d，存活率不随浓度递增而增加；在处理12d时，剂量为0和0.5ng时，与后两个剂量（1.5和4.5ng）处理组之间具有显著性差异，而两组内部之间不存在显著性差异。在剂量为4.5ng，处理12d时，蜜蜂存活率最低。6.2.4蜜蜂幸存率、爬行能力及凋亡率在吡虫啉处理3d时，剂量在0、0.5和1.5ng时，蜜蜂存活率、爬行行为和蜜蜂脑神经细胞凋亡率与空白对照组相比，均无显著性差异；在剂量为4.5ng时，爬行能力稍有下降，但与空白对照组无显著性差异；而蜜蜂脑神经细胞凋亡率较空白对照组具有显著性差异。在吡虫啉处理6d时，前两种指标仍不随吡虫啉剂量增加而有明显变化；爬行行为能力在剂量为0.5和1.5ng时较空白对照组稍降低，但差异不显著，而在剂量4.5ng处理后，爬行能力较前两组剂量处理后的稍高，但与空白对照组不具备显著性差异，并未因剂量增加而活动性降低；在剂量为1.5和4.5ng时，蜜蜂脑神经细胞凋亡率较空白对照组具有显著性差异，而蜜蜂存活率和爬行行为能力无显著性变化。图6.5吡虫啉处理3d时的存活率/爬行能力/凋亡率Fig6.5Percentageofsurvival,climbingabilityandapoptosisat3daftertreatmentwithimidacloprid在吡虫啉处理9d时，在剂量为0.5和1.5ng时，蜜蜂存活率和爬行行为能力均较空白对照组无显著性差异；其中剂量为0.5ng的处理组的存活率较空白对照组的稍降低，但差异不显著，当剂量在1.5ng时，蜜蜂存活率较0.5ng处理组稍高，其存活率受剂量增高的影响有限，与空白对照组和剂量为0.5ng的处理组无显著性差异；当剂量升高到4.5ng时，蜜蜂存活率和趋地爬行71 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测行为能力均出现显著性降低；剂量为1.5和4.5ng时，蜜蜂脑神经细胞凋亡率较空白对照组具有显著性差异，而蜜蜂存活率和趋地爬行行为能力无显著性变化。图6.6吡虫啉处理6d时的存活率/爬行能力/凋亡率Fig6.6Percentageofsurvival,climbingabilityandapoptosisat6daftertreatmentwithimidacloprid图6.7吡虫啉处理9d时的存活率/负趋地爬行行为/凋亡率Fig6.7Percentageofsurvival,climbingabilityandapoptosisat9daftertreatmentwithimidacloprid在吡虫啉处理12d时，蜜蜂存活率随剂量增高的趋势类似9d时，在剂量为0.5ng时，蜜蜂存活率稍下降，但较空白对照组无显著性差异；当剂量为1.5ng时，蜜蜂存活率较剂量为0.5ng时稍增加，但与空白对照组和剂量为1.5ng的处理组均无显著性差异；当剂量升高到4.5ng时，蜜蜂存活率较空白对照组和0.5、1.5ng处理组均具有显著降低。在剂量为0.5ng时，处理组的蜜蜂爬行能力与空白对照组无显著性差异；当剂量升高到1.5和4.5ng时，蜜蜂爬行能力较空白对72 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测照组显著降低。蜜蜂脑神经细胞凋亡率也在剂量为1.5ng和4.5ng出现显著性增加。可见，在1.5ng时，虽然存活率较高，几乎接近空白对照组，但其爬行能力明显降低，且脑神经细胞凋亡明显增加，此时吡虫啉（每头每天饲喂1.5ng，处理12d）不但对蜜蜂造成神经细胞毒性，而且对爬行能力具有明显抑制作用。图6.8吡虫啉处理12d时的存活率/负趋地爬行行为/凋亡率Fig6.8Percentageofsurvival,climbingabilityandapoptosisat12daftertreatmentwithimidacloprid6.3讨论新烟碱类杀虫剂能够迅速抢占全球的杀虫剂市场，得益于其良好的选择性。此类药剂在达到高效杀虫的同时对哺乳动物的危害较其他传统农药的低。在农业领域得到广泛应用的同时，该类杀虫剂对非靶标昆虫带来了负面影响（deJongetal.,2008）。新烟碱类杀虫剂的代表品种，吡虫啉、噻虫嗪（Henryetal.,2012）和啶虫脒（ElHassanietal.,2008），对成年意蜂的学习、记忆和运动能力产生不利影响（Ramirez-Romeroetal.,2008;Yangetal.,2012）。另外，亚致死剂量的吡虫啉（每头每天饲喂0.1-20ng）能够损害蜜蜂的导航、采集、哺育幼虫和学习记忆能力（WilliamsonandWright,2013）。在饲喂不同剂量吡虫啉后，本研究中凋亡实验和电镜结果也证实，相应剂量吡虫啉能够诱导成年意蜂工蜂脑神经细胞凋亡且存在时间和浓度效应，这在细胞水平证实吡虫啉在亚致死剂量时对意蜂具有慢性神经毒性；此外导致蜜蜂爬行能力也出现异常。这与果蝇的相应研究结果相似，果蝇的运动能力（主要为趋地爬行行为能力）的检测是研究神经毒性的重要手段之一；果蝇在经乙醇处理后，在相同处理时间时，不仅其触角神经细胞出现凋亡现象，而且其运动能力随处理剂量的增加而显著降低，并且在剂量相同的条件下，其运动能力（主要为爬行速度）随暴露时间的递增呈现先显著增强而后又降低（与空白对照相当，无显著差异）的趋势；由此可见，果蝇中枢神经系统相应部位神经细胞的凋亡对其运动功能也存在影响；推测昆虫在其中枢神经系统中相应部位的神经细胞出现异常，可能均会对其运动能力存在一定的影响。本研究利用操作简易，较为公认的方法对蜜蜂的爬行能力进行检测（CoulomandBirman,2004;73 中国农业科学院博士学位论文第六章蜜蜂爬行能力检测Podratzetal.,2011）；在参照果蝇的实验方法进行实验时，发现趋地性不足以让所用蜜蜂从瓶底向瓶顶部爬行，因而利用蜜蜂趋光性特点，在检测装置上增加了光源，吸引蜜蜂向上爬动。本研究利用此装置对蜜蜂爬行能力进行了测定，获知蜜蜂在低剂量吡虫啉（每头每天0.5和1.5ng），短时间作用下（3和6d）时，其爬行能力和存活率与空白对照组相比无明显差异；而有趣的是，在作用3、6、9和12d时，剂量为1.5ng的处理组的爬行能力反而较剂量为0.5ng处理组的略高（3、6和12d）或持平（9d），而且从蜜蜂状态观察，蜜蜂在此剂量处理时更为活跃；由此推测，在剂量为0.5ng时，吡虫啉对蜜蜂的活动性有一定的抑制性，只是为达到显著性差异，而当剂量为1.5ng时，蜜蜂的活动性与空白对照组相当，受影响较小。剂量在1.5ng时，蜜蜂脑神经细胞的凋亡率随着处理时间递增，凋亡率逐渐升高，在处理12d时，虽然蜜蜂爬行能力较空白对照组稍高（差异不显著），稍显兴奋，但其存活率和脑神经细胞凋亡率均较空白对照组显著性降低，由此可见，吡虫啉引起的兴奋对蜜蜂而言可能是致命的，另外神经细胞也可能因神经细胞信号的传导的改变（受抑制或者兴奋）引起细胞凋亡，且凋亡细胞的比例逐渐增加。在剂量4.5ng，处理6d时，蜜蜂脑神经细胞凋亡率较空白对照组显著增多，其他两个指标，爬行能力和存活率陡然下降（均差异显著），推测剂量4.5ng可能已经高出蜜蜂脑神经系统自我保护能力的界限，其中逐渐增加的凋亡率可能替代了蜜蜂脑部神经信号传导变化的影响，而成为诱使蜜蜂爬行能力降低和死亡的主要因素之一。除了吡虫啉，来自Lambin实验组的科研人员对亚致死剂量的啶虫脒和噻虫嗪（两种药剂均为新烟碱类杀虫剂）对蜜蜂的影响进行了检测，发现每头每天经口饲喂蜜蜂啶虫脒1μg能够显著增加蜜蜂对糖水的嗅觉敏感性，并严重损伤其长期记忆的能力（Aliouaneetal.,2009）；而在低剂量（0.1和0.5μg）时，处理组与空白对照组在这两种行为能力上不具有显著性差异；而且在全部实验剂量下（0.1、0.5和1.0μg）对蜜蜂的爬行能力无显著性影响。噻虫嗪在实验剂量下（0.1、0.5和1.0ng）对蜜蜂上述三种行为能力均无显著性影响。这些结果连同本实验结果表明，新烟碱类杀虫剂在亚致死剂量下（经口饲喂吡虫啉和噻虫嗪0.5ng，啶虫脒0.1和0.5μg），对蜜蜂的爬行能力无显著性影响；然而当剂量增加到一定程度后（吡虫啉1.5ng，9d；啶虫脒1.0μg），对蜜蜂爬行能力具有显著性影响。因此，这些数据再次提示人们在生产和施用上述新烟碱类杀虫剂时，为避免伤害非靶标昆虫，需对此类药剂使用方法和剂量进行规范，并对环境和植物中的药物残留进行监测。此外，本实验结果表明，在检测亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的影响时，细胞凋亡出现异常的情况早于爬行行为和幸存率两个指标的时间，因而，细胞凋亡检测结果可对吡虫啉对非靶标昆虫的神经毒性提前预警，为研究神经毒性对非靶标昆虫的毒性的评价提供参考方法。在与蜂农接触中，发现尤其经验不足的蜂农，对蜂群中毒症状判断不清，延误隔离或搬离药物喷洒或使用区域的时限，而导致蜜蜂损失严重。这种测定蜜蜂爬行能力的简易装置，为蜂农自检自查蜜蜂的爬行行为异常提供一种可供选择的检测方式；在蜜蜂死亡率还没有显著性差异时，通过爬行能力的异常能够提示蜜蜂的异常现象，及早查找和解决问题，降低损失。74 中国农业科学院博士学位论文第七章全文总结第七章全文结论1.以冰冻切片为载体、荧光法与TUNEL法相结合检测凋亡细胞，使得细胞核较在石蜡切片上易于分辨和计数，可为检测杀虫剂对蜜蜂神经毒性提供参考方法。亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡；而且细胞凋亡率呈现剂量和时间效应。2.以冰冻切片为载体，利用激活型Caspase-3单克隆抗体与免疫荧光法相结合，能够利用少量细胞即可灵敏的检测Caspase-3的活性，也为检测杀虫剂对蜜蜂神经毒性提供参考方法。亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内Caspase-3蛋白的激活；并且阳性细胞率也表现出剂量和时间效应；并且与脑神经细胞凋亡正相关。3.亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内caspase-1mRNA表达量的增加；并且caspase-1mRNA表达量随着吡虫啉剂量（0.5和1.5ng）和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应；与脑神经细胞凋亡正相关；推测亚致死剂量吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞凋亡与Caspase依赖型凋亡途径相关。4.蜜蜂脑神经细胞超微结构呈现细胞凋亡和自噬的双重特征，其中凋亡特征包括细胞核缩小、染色质固缩并边集、凋亡小体出现等；自噬特征包括自噬泡、自噬体和主要细胞器（线粒体、内质网和高尔基体等）肿胀和发泡等。5.在吡虫啉特定剂量和暴露时间时，蜜蜂存活率无显著性差异，却能够引起蜜蜂爬行行为能力显著性降低；另外，在低剂量（0.5和1.5ng）作用下蜜蜂脑神经细胞凋亡较其他两个指标（存活率和爬行能力）较早出现显著性差异；本研究对亚致死剂量吡虫啉引起的蜜蜂脑神经细胞的凋亡影响进行观测，在细胞、亚细胞和分子水平证实，亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡（并伴有自噬现象），并能影响蜜蜂爬行能力和存活率，这为进一步规范吡虫啉在田间的使用和施用方法，避免对非靶标昆虫的危害提供了一定的理论基础。75 中国农业科学院博士学位论文参考文献参考文献1.彩万志，庞雄飞，花保祯，梁广文，宋敦伦.普通昆虫学.北京：中国农业大学出版社，2011.2.曹奕.自噬/溶酶体途径在NMDA受体介导的神经兴奋性毒性中的作用[硕士学位论文].苏州：苏州大学,2005.3.陈英,朴英杰.人肝细胞自噬性凋亡的形态学观察.电子显微学报,2002,05:477~478.4.陈英.自噬与凋亡分子水平相关关系的探讨[博士学位论文].第一军医大学,2001.5.邓鸿飞，桑晓清，周丽娟.植物源次生代谢物质的杀虫作用机制.世界农药，2011，33（3）：17~21.6.郝宏京,李莉,韩建永.温度对制备超薄切片的影响.电子显微学报.2006,25(增刊):274~275.7.贺晓芳.龙牙百合低温解除休眠中茎尖的显微和超微结构变化[硕士学位论文].南昌大学,2006.8.金钢,叶建仁.植物细胞程序性死亡(PCD)分析测试方法的发展.山西农业大学学报:自然科学版,2006,02:113~118.9.金卓明.CREB在拟黑多刺蚁学习记忆中的作用研究[硕士学位论文].陕西师范大学,2006.10.李黎,巨修练.绿色农药环氧啉的开发及应用.湖北植保,2009,05:55~56.11.李兆英,奚耕思.中华蜜蜂工蜂蕈体胚后发育中神经胶质的形成模式.昆虫学报,2008,51(9):916~923.12.蔺哲广，孟飞，郑火青，周婷，胡福良.新烟碱杀虫剂与蜜蜂健康.2014年全国蜂产品市场信息交流会暨中国（哈尔滨）蜂业博览会论文集，2014:205~218.13.刘海峰,孙文汇,高洪等.细胞凋亡的特征及其检测方法.动物医学进展,2008,29(3):106~108.14.刘凯于，邓玉杰，张许平，彭建新，李毅，洪华珠.昆虫细胞程序性死亡的研究进展.昆虫学报，2008，6:652~658.15.刘婷婷.银杏叶提取物对阿霉素所致大鼠心肌损伤的预防保护作用及其机制研究[硕士学位论文].泸州医学院,2009.16.刘之光，吕丽萍，丁桂玲，郭海坤，石巍.中国与以色列养蜂业发展比较分析.中国农业科技导报，2014,3:162~168.17.苗明三.对细胞凋亡研究的认识——疾病与细胞凋亡.河南中医学院学报,2003,03:27~31.18.倪龙凤,金水华,龚佩珍.关于平湖市蜜蜂授粉技术应用的可行性和必要性分析.中国蜂业,2007,09:40~41.19.宁仁德,张先龙.金黄色葡萄球菌感染侵入人成骨细胞的体外实验.骨科,2010,1(1):19~22.20.朴英杰,黄行许,霍霞,濑口春道.淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究.第一军医大学学报,1996,03:165~171.21.史立新.细胞凋亡与前列腺癌.国外医学:泌尿系统分册,2002,05:301~304.76 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中国农业科学院博士学位论文致谢致谢本论文在我敬爱的导师周婷研究员的悉心指导下完成。作为周老师的学生与助手，我感到很荣幸。周老师办事严谨，为人谦和，善解人意。相处8年来，周老师亦师亦友，在我迷茫时，她给我以指引，我就像风雨中的小船看到了灯塔的光芒；我在退缩时，她给我以勇气，我就像无助的小草接受阳光的照耀。感谢周老师对我的鼓励，让我继续深造，使我从博士研究生阶段的学习、工作和生活经中，收获了受益终生的养分。周老师在本论文的选题、实验方法的确定、后期实验的指导以及文章的撰写工作中倾注了太多心血，在此表达我由衷的感谢和崇高的敬意。感谢蜂保室的同仁，王强、代平礼、褚艳娜老师和研究生贾慧茹和张建燕，他们对我工作给予了无私的帮助，在平时实验中也给我了很多宝贵的建议，尤其是学习到他们工作生活中的智慧，使我逐步走向成熟，逐步完善自己的世界观和人生观；感谢我的办公室室友和好友贾慧茹，她勤奋、认真和乐观的精神一直激励着我不断超越自我，给予我铁杵成针、水滴石穿的信念，不断尝试着去使自己的业务能力精益求精。感谢徐书法、安建东、李建科、黄家兴、张金振和李继莲老师以及罗其花、王星、刘峰、宋怀磊、徐响、房宇和郭军等，在本论文完成过程中给予的帮助和启迪。感谢中国农业大学病理研究室的佘锐萍老师和毛晶晶同学在石蜡切片和超薄切片方面的指导和帮助。感谢李贵荣给了我很多生活中待人接物方面的正能量，给了我平衡事业与家庭的质朴而真诚的建议；他们都是我一辈子的朋友和财富。感谢研究生院的各位老师的理解和支持；由于预产期延误了文化课考试，文化课读了二个学期，半工半研三年，期间研究生院的各位老师给予了我无私的帮助，使得我能顺利完成文化课、各项文件材料和博士相关事宜；也借此机会再次感谢齐齐哈尔大学和东北农业大学两所母校和老师在我学士和硕士研究生阶段对我给予的学费等相关费用的减免和生活上的资助。感谢我未提及的我认识的和认识我的朋友。感谢我的家人，爱人的支持与理解是我坚持下去的动力，感谢公公婆婆、奶奶、爷爷和我的父母照顾我的家和女儿，是他们让我有更多的时间和精力为事业拼搏。我的女儿陪我考博读博，博士课程就是她的胎教，希望将来能够成为栋梁之才。这几年工作和学习过程中，无论承担的课题和实验内容是什么，我都认真做了，这使我拓宽了视野并巩固了业务能力，感谢导师和领导的信任与栽培；在业务上，做事更务实了，生活中，看待问题更淡定了，人生观价值观逐步成熟。实验和论文与导师的期望还存在很大的差距，我立志在今后的工作中不断努力进行更深一步的探索，也会坚持将蜜蜂的甜蜜事业作为终生奋斗的目标。感谢国家蜂产业技术体系（CARS-45-KXJ6）和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基本科研业务专项给予的资金支持！86 中国农业科学院博士学位论文作者简历作者简历姓名：吴艳艳性别：女出生日期：1984年11月20日籍贯：山东省潍坊市主要教育经历：2011.09至今中国农业科学院特种经济动物饲养专业博士研究生2004.09-2007.07东北农业大学生物化学与分子生物学专业硕士2000.09-2004.07齐齐哈尔大学生物工程专业学士主要工作经历：2007.09至今中国农业科学院蜜蜂研究所生物安全与蜜蜂保护研究室科研岗攻读博士学位期间参加的主要课题：参加了国家蜂产业技术体系（CARS-45-KXJ69）（2011.01-2015.12）主持中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基本科研业务费专项《亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行能力影响的研究》（2014.01-2014.12）主持国家自然科学基金青年基金项目《亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡影响研究》（31402148）（2015.01-2017.12）博士期间发表及递交的论文：[1]Yan-YanWu,TingZhou,QiangWang,Ping-LiDai,Shu-FaXu,Hui-RuJia,XingWang.Programmedcelldeathinthehoneybee(Apismellifera)(Hymenptera:Apidae)workerbraininducedbyimidacloprid.JournalofEconomicEntomology.Accept(DIO:10.1093/jee/tov146).[2]吴艳艳,周婷,AbebeJenberieWUBIE,王强,代平礼,贾慧茹.吡虫啉对成年意大利蜜蜂脑神经细胞致凋亡作用.昆虫学报,2014,2:194~203.[3]吴艳艳,周婷,王强,代平礼.蜂群衰竭失调现象研究进展.动物医学进展,2013,05:95~99.[4]吴艳艳,周婷,贾慧茹.有关美国俄勒冈州新烟碱类杀虫剂的禁令.中国蜂业,2014,06:61.[5]吴艳艳,周婷,王强,代平礼,贾慧茹.杀螨剂对蜜蜂的危害.中国蜂业,2014,08:30.[6]吴艳艳,周婷,贾慧茹,王星.蜜蜂慢性麻痹病诊断实例.中国蜂业,2014,07:22~23.[7]周婷,宋怀磊,王强,代平礼,吴艳艳,孙继虎.吡虫啉对意大利蜜蜂脑乙酰胆碱受体分布的影响.昆虫学报,2013,11:1258~1266.[8]代平礼,周婷,王强,吴艳艳,耿文龙,宋怀磊.吡虫啉对意大利蜜蜂学习行为的影响.农药,2013,07:512~514.[9]吴艳艳,周婷.RNA干扰在蜜蜂病害防治中的应用.中国蜂业,2013,16:58.发明专利：吴艳艳，周婷.一种快速测定蜜蜂爬行能力的便携式环保型装置.201310410631.国家发明专利.2014年授权周婷，吴艳艳.杀灭巢虫及其卵的环保杀虫剂.201310193836.3.国家发明专利.2014年授权87 中国农业科学院博士学位论文作者简历周婷，吴艳艳.熏烟型杀螨剂.201010148227.国家发明专利.2013年授权参编著作：周婷主编.蜜蜂医学概论.北京：中国农业科学技术出版社.2014孔宪刚主编.兽医微生物学(第二版).北京：中国农业出版社.2013吴杰主编.蜜蜂学.北京：中国农业出版社,2012.博士期间获奖及考试情况：欧洲科研人员欧洲委员会（EURAXESSLinkofEuropeancommission），科学大满贯（ScienceSlam中国赛区第一届），决赛前六名，2013年全国出国培训备选人员外语考试，国家外国专家局，全国出国培训人员考试委员会，高级证书，2013年88