意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究 61页

八‘：＾义－＿真辑．辦敬齡議載講曝准論＇、、‘＇．－．．、．．每巧辞早：枝鼻心難：：：ｖ堪議、’．＂’．．、一＇＂＾９４．．．３４＾：说户：；１的：《苗諸提．记巧韦学位单位代码巧．分类号；；：＾义：．；；＾／《．＇’．＇．’＾。、．、生学号：２〇ｍｉ〇４＾，；、Ｋ：義巧；；邊Ｋ，；兵究爲．；、：無．．．、．声；、馬皆壞＇讀舅．壽．’＇．－‘．‘＇＇．；巧’古心、’．．扛々：紙碱／－皆可听，放巧皆、祭勝當．．．．哉嗦聋■护、、＼＇：、＇＾心＇－－－．＇气＇…■＇．、品、、，．子二歌．於、巧．咕＾＼ｆ唉＼＾Ｖ，片；餐＇＼＇＇■－ｖＳｒ：；＃Ｖｔ；ｌｌｆ迎東＞１業乂學屬胃ＩＩ、－－二與．带線，．総蠻．硕±．．学位槪义霊誦＇＇＇’－声：；、ｖ．：硬藏祭：．貧诺六屡纖；ｉ．Ａ辨＇■—＇－．：．心皆乂：＾Ｖ．姑巧織拾￡＂．巧，游嫁掉巧吝絳；意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂伺粮中亚油酸ｉ听常疋裝？ｔ？适宜添加水平的研究胃．．、．．．谋滅户、ｖｒ＾ＡｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｌｅｖｅｌｉｎＤｉｅｔｏｆＡｐｉｓＨ．ｔｖ＾＼＼＾种产…‘／ｗｅ／Ｚ分＾ｒａｗｏｒｋｅｒｂｅｅＬａｒｖａｅａｎｄＡｄｕｌｔ＞＼Ｊ：’、－’、？；ｙ無，．：．、皆；．；辛秦破若．證知嗔’＇＇？＇简苑ｒ鳥．Ｓ拜繁藝兹壽户葛械．；＇；研巧牛王圣碱．吟研巧生：王圣伟．＇．．．．ｌｗ击，／游ＫＶ線驗兴；；於．已，，；—―．、＊‘：如｜’内．．．；心：－１二二．又ＡＶ产．＞；叶，＼巧觀’‘‘＇‘＇。．＾＾；■．矿产、＜：＾：学科专业！动物营养与饲种裤李＞记诲泌這，‘／／；知＇．、’甘一＇、＇■：！＾‘．试姑ＸＪ巧＜．：ｖ鮮古城研巧方向：单宵动物营养：记叫於‘漏游ｆｉ马安听寃，辨讀ｐ＇学院：动巧械学晚啸＂．巧參總畫；省裤紙袭？雙泌３指导教师．：胥保华城＾．＼；．；．賞作《碳、：：而；裏＇＇；．‘＇兴．’．．雌沪〇、與齡濃蹲苗南Ｉ■辟等＼－毕琴．＼＾Ｉ．；ｆ，ｖ＇－－－■．－２０１５＾６Ｂ９０？■八：，．．：＞；為＞如；；ｖ＾；，；、．＇．．、、，‘‘＇、。．八，．兰＜＇、－１沪＼：＇巧麟中’、．．禱＾，声占：矿；—如户織．＇、＇’＇一＾‘■＞；．－－知古＞：－．？．．：、＇‘’－．－＊＂—、、八’．．．＇、－＇．，七＇＾－．心‘；瑰－’一公．＊八心＾＾儀‘？、，、立心＇＾皆少．、ｉ’‘．－，■．’‘．＾＾，‘八－片一、；．、＇、－－ｉ■一■吊？，＞－．ｈ户，、：方．：－二技，ｒ．＂．－＾巧知Ｖ＞．＼ｖ马 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体。本声明的法律责任由本人承担。，均在文中明确说明本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向巧会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：丰—导师签名：Ｍ、日期：含 论文提交日期：2015.04.28论文答辩日期：2015.06.09学位授予日期：2015.06学科门类：农学答辩委员会主席：单安山 符号说明缩写英文名称中文名称ACCAcetylcoenzymeAcarboxylase乙酰辅酶A羧化酶ACPAcylcarrierprotein酰基载体蛋白ALAAlphalinolenicacidα-亚麻酸CLAConjugatedlinoleicacid共轭亚油酸CPTCarnitinepalmitoyltransterase肉毒碱棕榈酰转移酶CYP450cytochromeP450细胞色素P450DHADocosahexaenoicacid二十二碳六烯酸DPADocosapentenoicacid二十二碳五烯酸EPAEicosapentaenoicacid二十碳五烯酸FASFattyacidsynthase脂肪酸合成酶G6PDGlucose-6-phosphateDehydrogenase蜜蜂葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GLAGammalinolenicAcidγ-亚麻酸LALinoleicacid亚油酸MDHmalatedehydrogenase苹果酸脱氢酶T-AOCTotalantioxidantcapacity总抗氧化能力TGTriglyceride甘油三酯TCCholesterol胆固醇T-SODTotalsuperoxidedismutase总超氧化物歧化酶HDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白 SFASaturatedfattyacids饱和脂肪酸MUFAMonounsaturatedfattyacids单不饱和脂肪酸PBPPPAR-bindingproteinPPAR-结合蛋白PGProstaglandin前列腺素PPARPeroxisomeproliferatoractivatedreceptor过氧化物酶体增殖物激活受体PUFAPolyunsaturatedfattyacids多不饱和脂肪酸RXRRetinoidXreceptor类维生素A的X受体SRC-1steroidreceptorco-activator-1类固醇受体辅助激活剂-1VLDLVerylowdensitylipoprotein极低密度脂蛋白 目录中文摘要....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言........................................................................................................................................11.1昆虫中的脂类......................................................................................................................11.2脂类对昆虫的营养生理作用..............................................................................................21.2.1为昆虫生命活动提供能量...............................................................................................21.2.2维持昆虫正常发育和繁殖...............................................................................................21.2.3提高昆虫抗菌能力...........................................................................................................31.2.4可作为信息素的组成成分...............................................................................................31.2.5影响昆虫的寿命...............................................................................................................31.3脂类的代谢.........................................................................................................................41.3.1脂类的消化吸收..............................................................................................................41.3.2脂类的中间代谢..............................................................................................................41.4多不饱和脂肪酸的营养作用..............................................................................................61.4.1调控脂类代谢...................................................................................................................61.4.2调控基因表达和脂肪细胞的分化..................................................................................61.4.3作为细胞膜磷脂的重要成分,维持细胞膜的功能.......................................................81.4.4提高机体免疫能力..........................................................................................................81.5蜜蜂脂类营养需要的研究进展.........................................................................................91.6本研究的目的和意义.........................................................................................................92材料与方法..........................................................................................................................102.1意蜂幼虫饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究...............................................................102.1.1试验动物........................................................................................................................102.1.2试验设计........................................................................................................................102.1.3幼虫饲粮组成.................................................................................................................112.1.4饲养管理........................................................................................................................112.1.5测定指标及测定方法....................................................................................................132.1.6数据分析........................................................................................................................17 2.2意蜂成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究...............................................................182.2.1试验动物........................................................................................................................182.2.2试验设计.........................................................................................................................182.2.3成蜂饲粮组成.................................................................................................................182.2.4饲养管理........................................................................................................................192.2.5测定指标及测定方法.....................................................................................................192.2.6数据分析......................................................................................................................203结果与分析..........................................................................................................................203.1饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫的影响...............................................................................203.1.1饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫化蛹时体重和化蛹率的影响........................................203.1.2饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫虫体蛋白浓度的影响....................................................213.1.3饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫抗氧化能力的影响.........................................................223.1.4饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢的影响.............................................................233.1.5饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢相关基因相对表达量的影响........................273.2饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂的影响...............................................................................283.2.1饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂平均日采食量和存活率的影响....................................283.2.2饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂蛋白浓度的影响.............................................................293.2.3饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂T-AOC的影响..............................................................303.2.4饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂FAS活性和ACC浓度的影响......................................314讨论......................................................................................................................................324.1饲粮亚油酸水平不影响意蜂幼虫化蛹时体重...............................................................324.2饲粮亚油酸水平影响意蜂幼虫化蛹率...........................................................................324.3饲粮亚油酸水平不影响意蜂成蜂平均日采食量...........................................................334.4饲粮亚油酸水平影响意蜂成蜂存活率...........................................................................334.5饲粮亚油酸水平影响意蜂蛋白浓度................................................................................344.6饲粮亚油酸水平不影响意蜂抗氧化能力.......................................................................354.7饲粮亚油酸水平影响意蜂PPARs和脂肪代谢相关酶活性或浓度..............................354.8饲粮亚油酸水平不影响意蜂脂肪代谢相关基因表达量...............................................375总体结论、创新点及后续工作展望..................................................................................375.1总体结论...........................................................................................................................37 5.2创新点...............................................................................................................................385.3后续工作展望...................................................................................................................38参考文献..................................................................................................................................39致谢......................................................................................................................................46攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................47项目资助..................................................................................................................................48 中文摘要亚油酸（LA）是多不饱和脂肪酸（PUFA）之一，是蜜蜂生长发育所必需的脂肪酸，具有调控脂类代谢、调控基因表达和脂肪细胞的分化、维持细胞膜的功能和提高机体免疫能力等重要生理作用。目前关于意大利蜜蜂饲粮中亚油酸的适宜添加水平还没有明确的参考标准，本试验以意大利蜜蜂为研究对象，以亚油酸为试验材料，通过测定不同亚油酸水平的饲粮对意大利蜜蜂生长发育和生理生化指标的影响，探讨意大利蜜蜂幼虫期和成蜂期饲粮中适宜的亚油酸添加水平。该研究结果为制定蜜蜂饲养标准、配制蜜蜂饲粮、人工饲养幼虫提供重要的理论依据和生产指导。一、意蜂幼虫饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究。选取1152只1日龄的工蜂幼虫，随机分为6组，每组192只幼虫，对照饲喂基础饲粮（BLD），试验组分别饲喂添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.10%亚油酸的饲粮，将幼虫置于48孔细胞培养板中饲养，培养板放入培养箱中（35℃、90%R.H.），试验期间每天饲喂1次，每孔每次饲喂150l，试验期7d。在将幼虫转移到化蛹板的时候统计化蛹率和化蛹时体重，第5、6、7天时采集样品，测定虫体蛋白质浓度、过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）和脂肪代谢相关酶活性以及相关基因mRNA相对表达量。结果表明：1）与对照组相比，饲粮添加0.10%亚油酸显著降低了化蛹率（P<0.05），其他组与对照组无显著差异。2）与对照组相比，饲粮添加0.04%亚油酸显著提高了5日龄虫体蛋白质浓度（P<0.05）；饲粮中添加0.10%亚油酸显著降低了7日龄蛹蛋白质浓度(P<0.05)。3)与对照组相比，饲粮添加0.02%亚油酸对6日龄虫体的PPAR活性有显著的抑制作用（P<0.05），添加0.08%的亚油酸则显著提高了6日龄虫体PPAR和PPAR活性。4）与对照组相比，饲粮添加0.04%和0.08%亚油酸显著提高了6日龄虫体脂肪酸合成酶（FAS）活性（P<0.05）；添加0.08%亚油酸显著提高了5日龄虫体乙酰辅酶A羧化酶（ACC）浓度（P<0.05），添加0.06%和0.10%亚油酸显著提高了6日龄虫体ACC浓度（P<0.05），添加低浓度亚油酸显著提高了MDH和CYP450的浓度，当亚油酸添加量过高时则会降低MDH和CYP450的浓度，对CPT和G6PD活性无显著影响。5）饲料中添加本试验设定范围的亚油酸对幼虫FAS、ACC和G6PD基因mRNA相对表达量无显著影响（P>0.05）。综合化蛹率和虫体蛋白质浓度2个指标的拟合曲线结果，得出意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中亚油酸的适宜添加水平为0.024%～0.037%I 二、意蜂成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究。选取1200只初生蜂，随机分为6组，每组200只，对照饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂添加0.35%、0.7%、1.05%、1.4%和1.75%亚油酸的饲粮，蜂盒放入33℃，50%R.H.的恒温恒湿培养箱内。第7、14天取样，每组取5个重复，用于测定蜂体蛋白浓度、T-AOC、FAS活性和ACC浓度。试验期间每天饲喂一次，计算每天采食量，将死亡蜜蜂取出，用于统计平均日采食量和存活率。结果表明：1）亚油酸在一定浓度范围内提高了成蜂存活率，饲粮添加1.05%亚油酸时存活率最高；各组平均日采食量无显著差异（P>0.05）。2）饲粮中亚油酸添加水平显著影响蜂体蛋白浓度(P<0.05)，蜂体蛋白浓度整体呈先上升后下降的趋势，亚油酸添加水平在0%~1.4%范围内时，蜂体蛋白浓度逐渐升高，亚油酸添加水平提高到1.75%时，蜂体蛋白浓度开始下降。3)饲粮添加亚油酸对14日龄成蜂T-AOC有显著影响（P<0.05），蜂体T-AOC呈逐渐上升的趋势，说明亚油酸浓度与T-AOC成正相关。4）总的来说，随着饲粮中亚油酸浓度的升高，FAS活性和ACC浓度呈先上升后下降的趋势。与对照组相比，饲粮添加0.7%亚油酸显著提高了蜂体脂肪酸合成酶（FAS）活性（P<0.05）；添加0.35%~1.4%亚油酸显著提高了蜂体乙酰辅酶A羧化酶（ACC）浓度（P<0.05）。综合存活率、蛋白浓度、FAS活性和ACC浓度四个指标的拟合曲线结果，得出意大利蜜蜂成蜂饲粮中亚油酸的适宜添加水平为0.89%～1.07%。关键词：意大利蜜蜂；幼虫；成蜂；亚油酸II AresearchontheappropriatelinoleicacidlevelinDietofApismelliferaworkerbeeLarvaeandAdultAbstractLinoleicacidisoneofpolyunsaturatedfattyacids,whichisnecessaryforhoneybee.Linoleicacidcanregulatelipidmetabolism,geneexpressionandthedifferentiationofadipocytes,maintainthefunctionofcellmembrane,andimproveanimalimmunityperformance.Atpresent,thereisnoclearreferencestandardoftheappropriatelinoleicacidlevelindietofhoneybee(ApismelliferaL.).Inthisexperiment,ApismelliferaL.astheresearchobject,byusinglinoleicacidasthetestmaterials,throughthedeterminationofdifferentlevelsofdietarylinoleicacidonApismelliferaL.larvaeandadultgrowth,toinvestigatetheappropriatelinoleicacidlevelindietofbeestage.Theresultsofthisstudyforthedevelopmentofbee,beefeedingstandardformulateddiets,andprovideatheoreticalbasisandguidanceoflarvaefedonartificial.Thefirstexperimentwasconductedtostudytheappropriatelinoleicacidlevelsinthedietofapismelliferaligusticalarvae.1152larvaewererandomlyassignedto6groupswith192replicatesineachgroup,andwereaddedwith0%(controlgroup),0.02%,0.04%,0.06%,0.08%and0.1%linoleicacidrespectively.Thetriallastedfor7days.Theresultsshowedasfollows:1)Comparedwithcontrol,thedietcontaining0.1%linoleicreducedthepercentageofpupation(P<0.05).2)Comparedwithcontrol,linoleicatthelevelof0.04%increasedthetotalproteinconcentrationoflarvaeat5daysoldsignificantly（P<0.05）,whentheworkerlarvaedevelopedintopupaat7daysold,0.1%linoleicincreasedthepupaeproteincontentsignificantly（P<0.05）.3)Comparedwithcontrol,the0.02%linoleichadsignificantsupressedeffectsontheactivityofperoxisomeproliferators-activatedreceptor(PPAR)(P<0.05),but0.08%linoleichadstimulatingeffectsontheactivityofPPARandPPARat6daysold.4)Comparedwithcontrol,thelinoleiclevelat0.04%and0.08%improvedtheIII activityoffattyacidsynthetase(FAS)ofpolypideat6daysold(P<0.05).AcetylCoAcarboxylase(ACC)proteincontentofpolypideat5daysoldwasimprovedby0.08%linoleic(P<0.05)andACCproteincontentofpolypideat6daysoldwasimprovedby0.06%and0.1%linoleic(P<0.05).5)DifferentlevellinoleichadnoeffectontheexpressionofFASandACC(P>0.05).Accordingtothecurvefittingresultsofthepercentageofpupationandproteinconcentration,itisconcludedthattheappropriatelinoleicadditivelevelinapismelliferaligusticaworkerlarvaedietare0.024%to0.037%.Thesecondpartisaresearchabouttheappropriatelinoleicacidlevelindietofhoneybee(ApismelliferaL.)adult.Theprimarybeewererandomlydividedinto6groups,thecontrolwasfedthebasaldiet,thetestgroupwerefeddietssupplementedwith0.35%,0.7%,1.05%,1.4%and1.75%oflinoleicacid,thetestwasdividedintotwobatchfeeding,thefirstbatchof100ratsineachgroup,forthedeterminationofphysiologicalandbiochemicalandmolecularmarkers,seventh,tocollectthesamples14days,5ratsineachgrouprepeat.Thesecondgroupof100ratsineachgroup,duringthetestfeedthemeveryday,calculatethedailyfeedintake,removedeadbeesfortheaveragedailyfeedintakeandsurvivalrate.Theresultsshowthat:1)linoleicacidinacertainrangeofconcentrationincreasedadultsurvivalrate,dietarylinoleicacidwasthehighestsurvivalrateis1.05%;theaveragedailyfeedintakehadnosignificantdifference(P>0.05).2)additionleveloflinoleicacidsignificantlyaffectedthebeebodyproteinconcentration(P<0.05),theproteinconcentrationofbeewasfirstincreasedandthendecreased,whentheleveloflinoleicacidaddedintherangeof0%~1.4%,thebeebodyproteinconcentrationincreasedgradually,toimprovetheleveloflinoleicacidaddedto1.75%,beebodyproteinconcentrationbegantodecline.3)dietarylinoleicacidhaveasignificanteffectonT-AOCofbeefor14dayold(P<0.05),T-AOCshowedagradualupwardtrend,linoleicacidconcentrationwaspositivelycorrelatedwithT-AOC.4)ingeneral,withtheincreaseofdietarylinoleicacidconcentration,theactivityofFASandtheconcentrationofACCincreasedfirstlyandthendecreased.Comparedwiththecontrolgroup,thesupplementationof0.7%linoleicacidsignificantlyincreasedthebeebodyfattyacidsynthase(FAS)activity(P<0.05);0.35%~1.4%linoleicacidlevelsignificantlyincreasedthebeebodyofacetylcoenzymeAcarboxylase(ACC)concentration(P<0.05).AccordingtoIV theresultsoffittingcurveoffourindicatorsforsurvivalrate,proteinconcentration,FASactivityandACCconcentration,theappropriatelinoleicacidlevelindietofApismelliferaL.(adult)was0.89%~1.07%.Keywords:apismelliferaligustica;Larvae;honeybeeadult;linoleicacidV 山东农业大学硕士学位论文1前言1.1昆虫中的脂类脂类是由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物的统称，按照组成成分的不同可分为单纯脂、复合脂和非皂化脂三种。单纯脂是脂肪酸和醇脱水缩合形成的化合物，有甘油酯和蜡两种；复合脂是指除脂肪酸和醇组成的酯外，分子中还含有其他成分的脂类，比如磷脂、糖脂等；非皂化脂即异戊二烯脂类，它不含脂肪酸，不能进行皂化，主要有甾醇类及萜类化合物。脂类是昆虫的一种重要组成成分，不同昆虫脂肪含量不同，并且不同发育时期脂肪的含量也不一样。陈晓伟等（2011）测得黄粉虫脂肪含量占干物质的20.70%，中华真地鳖、亮斑扁角水虻及白星花金龟分别为12.92%、33.08%、15.66%；刘晓庚等（2002）研究发现黄粉虫幼虫和蛹的脂肪含量分别为28.80%~34.05%和40.50%，这说明昆虫种类不同脂肪含量不同，同一种昆虫的不同发育时期脂肪含量也不同，一般幼虫期和蛹期高于成虫期。昆虫所需脂肪酸包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。脂肪酸和单不饱和脂肪酸是非必需脂肪酸，可以在昆虫体内由其他物质合成，多不饱和脂肪酸是必需脂肪酸，不能在体内直接合成，只能从食物中获取（王延年等，1984）。当前研究表明，大部分昆虫体内脂肪酸的含量都非常丰富，通常含量介于10％~50％之间，竹节虫等部分昆虫脂肪酸含量高达60％。且昆虫体内的脂肪酸构成相当理想，其不饱和脂肪酸含量很高（邹继红，2008），饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值低于0.4。棕榈酸（16:0）是昆虫体内主要饱和脂肪酸之一，含量基本介于15%~35%之间，单不饱和脂肪酸（MUFA）几乎以油酸（18:1n-9）的含量最高，多在20%~40%左右。亚油酸（18:2n-6）是大部分昆虫体内含量最高的多不饱和脂肪酸，其次是α-亚麻酸（ALA）（18:3n-3）。研究表明，亚油酸与α-亚麻酸的比例与昆虫种类有关，鞘翅目昆虫大部分亚油酸含量偏高，而鳞翅目昆虫则含有丰富的α-亚麻酸。另外，昆虫脂类中还存在自然界罕见的奇数碳脂肪酸，比如十五碳酸和十七碳酸（刘晓庚等，2002）。1 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究1.2脂类对昆虫的营养生理作用1.2.1为昆虫生命活动提供能量脂类是生物储存能量的主要物质之一，昆虫飞行的维持以及各项生理活动都需要高效的氧化代谢，在此过程中碳水化合物和脂肪供应巨大的能量。不少昆虫能利用脂肪作为能源物质，尤其是长距离飞行的昆虫，通常利用脂肪作为持续飞行的能源。Nation(2002)研究发现，在良好饲养条件下，昆虫体内可以拥有足够的脂质，这些脂质能提供给昆虫足够的能量，使其飞行的时间更长。1.2.2维持昆虫正常发育和繁殖脂类是昆虫体壁表皮层和细胞膜的结构要素，昆虫的发育需要脂质，尤其是不饱和脂肪酸和甾醇类物质。如某些鳞翅目昆虫为了成虫的正常羽化和鳞片的形成需要亚油酸和亚麻酸，当饲粮中这两种脂肪酸含量低于最小需要量时，蜕皮就会受到阻碍，鳞片发育就不完全，蝗虫因此而产生畸形成虫，还有一些膜翅目昆虫表现出蜕皮困难，鞘翅目昆虫表现出生长缓慢和成虫繁殖力下降，这可能是因为磷酸酯的形成受阻，进而导致膜发育不全的缘故；花生四烯酸也是某些昆虫正常生长发育所必须的，如刚羽化的尖音库蚊缺乏花生四烯酸时，飞行和生存都受影响，这是因为其羽化后就丧失了将亚油酸转化为花生四烯酸的能力。甾醇是构成细胞膜的主要组分之一，具有多种重要功能，可以作为前体物质合成蜕皮激素，表皮蜡层和脂蛋白载体中都含有甾醇。昆虫自身并不能合成甾醇类物质，只能从外界食物中获取。几乎所有昆虫的正常生长和繁殖都需要甾醇，其中胆甾醇是最重要的一类，刚孵化的幼虫由于卵中含有胆甾醇，第一龄能够蜕皮，但如果不添加食物源胆甾醇，就不能继续蜕皮，在1龄或2龄就会死亡。一些成虫食物需要含有一定量的甾醇才能满足产卵的需要，缺乏胆甾醇，家蝇雌成虫的卵孵化率降低80%（王荫长，2004；McFarland，1985）。李广宏等(1998)研究发现，胆固醇(TC)、氯化胆碱对甜菜夜蛾卵的正常发育有重要作用。用缺乏胆固醇和氯化胆碱的饲料连续饲养3代后，第4代甜菜夜蛾的卵孵化率降为4.2%，而第4代采食添加胆固醇和氯化胆碱的饲料后，卵孵化率提高到79.7%，因此，在饲料中加入一定量的胆固醇和氯化胆碱是必要的。2 山东农业大学硕士学位论文1.2.3提高昆虫抗菌能力微生物是使昆虫致病的主要因素，脂肪酸有抑制细菌和真菌的活性。癸酸、月桂酸(十二烷酸)、肉豆蔻酸、亚油酸、亚麻酸等一系列脂肪酸都具有抗微生物作用。在昆虫免疫的体壁防御中，体壁蜡质层中的脂肪酸可以阻止菌丝的生长。对绿僵菌的研究表明,昆虫体表以辛酸和葵酸为主的一些短链脂肪酸可以抑制真菌萌发,推测脂肪酸可能是通过破坏分生孢子膜的选择透性或进入细胞内，影响酶的合成分泌，从而达到抑制孢子萌发的目的（王海川等，1999）。另外，有研究表明，亚油酸和亚麻酸可以提高蜜蜂抵抗细菌和真菌感染的能力，蜜蜂可以从蜂花粉中摄入这些脂肪酸（Manningetal.，2001；Pandeyetal.，1983）。1.2.4可作为信息素的组成成分化学通讯是生物种内和种间最重要的通讯形式。昆虫个体的许多活动都利用信息素进行交流，比如交配、寄主的选择和定向、产卵场所的识别和防御等。昆虫信息素的化学结构种类很多，其中脂肪酸衍生物是比较重要的一类，雌性鳞翅目昆虫的性信息素以酯最多见。蜜蜂中5-9个碳原子的酯和一些蚁类的蚁酸常用作警戒信息素。另外，蚜虫及一些蚁类常将单萜和倍半萜烯用作警戒信息素，一些蚁类和大黄蜂类分别用萜烯作为踪迹信息素和标记信息素（王荫长，2004）。1.2.5影响昆虫的寿命寿命是衡量生物健康状况的重要指标，有研究表明脂肪酸和昆虫的寿命有紧密的联系。RobManning等(2007)研究发现，饲粮中脂肪酸含量过高或者过低都会降低蜜蜂的寿命，当饲粮中亚油酸含量高于6%或者油酸含量高于2%时，蜜蜂的寿命会显著缩短，而当饲粮中缺乏脂肪酸时，蜜蜂的寿命也会降低。另外，α-亚麻酸具有抗自由基损伤的作用，朱保忠等(2008)通过对小鼠和果蝇的研究发现，α-亚麻酸与抗氧化剂联用可以提高小鼠的抗氧化能力，延长果蝇的寿命。3 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究1.3脂类的代谢1.3.1脂类的消化吸收中肠是昆虫主要的消化部位，具有消化和吸收营养物质的功能。脂肪的消化分解是在中肠中进行的（汪礼国，1985），食物中脂类组分比较复杂，昆虫对不同脂类的消化吸收方式也不同。甘油三酯（TG）需要经脂酶降解为甘油单酯和游离脂肪酸，然后甘油单酯和脂肪酸形成的胶体复合物经肠壁细胞进入血腔，最后转移到脂肪体储存，脂酶由中肠细胞分泌，或由共生物提供。而甾醇类可不经消化直接被吸收利用，植食性昆虫能将吸收的植物甾醇转化为胆甾醇（张复兴，1998；杨凤，2006）。1.3.2脂类的中间代谢1.3.2.1脂类的生物合成在大多数昆虫中，脂类的合成以脂肪的生成为主。脂肪生成主要发生在脂肪体中，在卵巢及其他组织中也有发生。合成过程与其他动物类似。首先是脂肪酸的合成，然后由脂肪酸和甘油合成脂肪。由乙酰CoA开始合成，乙酰CoA可由糖氧化分解或由脂肪酸、酮体和蛋白分解生成，生成乙酰CoA的反应均发生在线粒体中，而脂肪酸的合成部位在细胞质中，因此乙酰CoA必须由线粒体转运至细胞质。但是乙酰CoA不能自由通过线粒体膜，需要通过一个称为柠檬酸-丙酮酸循环来完成乙酰CoA由线粒体到细胞质的转移。乙酰CoA由乙酰CoA羧化酶催化合成丙二酰CoA，然后经酰基载体蛋白（ACP）-丙二酰转移酶和ACP-乙酰基转移酰酶的催化，丙二酰CoA和乙酰CoA分别与ACP形成丙二酰-ACP和乙酰-ACP。由1分子然后乙酰-ACP与丙二酰-ACP经缩合、加氢、脱水和再加氢一系列过程，使碳链延长两个碳单位，产物继续与丙二酰-ACP重复上述反应过程，最终生成脂肪酸的初始产物。在大多数昆虫中，脂肪酸合成脂肪的初始产物是软脂酸，但在一些蝇类和蚜虫中初始产物是豆蔻酸，而在膜翅目拟寄生昆虫中，初始产物则是硬脂酸。除必需脂肪酸需要从食物中获取外，其它脂肪酸均可由脂肪酸初始产物在细胞内通过碳链的延长和缩短、脱饱和加工改造而成。最后，所产生的脂肪酸用于合成甘油三酯（王荫长，2004；杨凤，2006）。4 山东农业大学硕士学位论文1.3.2.2脂类的分解代谢脂类的分解代谢主要是脂肪的氧化分解，昆虫的脂肪主要以甘油三酯的形式贮存在脂肪体内，需要时在脂肪体形成甘油二酯进行释放，并通过载脂蛋白运输。甘油二酯被组织吸收后，在细胞质中由酯酶催化分解成甘油和脂肪酸。甘油先于磷酸结合成磷酸甘油，然后被逐步分解为磷酸丙酮、丙酮酸。丙酮酸进入三羧酸循环，最后氧化成二氧化碳和水，并释放能量（汪礼国，1985）。脂肪酸最主要的氧化形式是β-氧化，此过程与脊椎动物相似，可分为活化，转移，β-氧化三个阶段。脂肪酸的活化形式是脂酰CoA，催化脂肪酸活化的酶是脂酰CoA合成酶。催化脂肪酸β-氧化的酶系在线粒体基质中，但长链脂酰CoA不能自由通过线粒体内膜，要进入线粒体基质就需要载体转运，这一载体就是肉毒碱。催化此反应的酶为肉毒碱脂酰转移酶。但并不是所有昆虫都需要肉毒碱作为载体，对于蜜蜂和蝇类这些以糖类作为主要飞行能源的昆虫，肉毒碱在脂肪酸氧化中几乎不起作用，其线粒体膜上具有大量的酶用来促进丙酮酸到乙酰CoA的迅速氧化，这一体系保证了糖类的代谢。像蝗虫这种以脂类作为主要能源的昆虫，如果缺乏肉毒碱，脂肪酸氧化速率就会减慢，但蛾类的脂肪酸氧化则不依赖于肉毒碱，这种昆虫在飞行时胸部温度会升高，可以提高线粒体膜对脂肪酸的通透性，从而促进脂肪酸进入线粒体。脂酰CoA在线粒体基质中进入β氧化要经过四步反应，即脱氢、加水、再脱氢和硫解，生成一分子乙酰CoA和一个少两个碳的新的脂酰CoA，并且产生1分子FADH和1分子NADH。多次重复上面的循环，就会逐步生成乙酰CoA。脂肪酸β-氧化并不产生ATP，但是生成的FADH和NADH进入呼吸链后可生成ATP。乙酰CoA是一种十分重要的中间化合物，除能进入三羧酸循环氧化供能外，还是许多重要化合物合成的原料，如酮体、胆固醇和类固醇化合物（王荫长，2004；杨凤，2006）。昆虫对环境影响很大，了解脂肪酸的功能和代谢可以增加我们对昆虫的认识，为防虫治虫提供帮助，也可以让益虫种群得到发展。从而尽量避免昆虫对环境的危害，最大程度地发挥其积极的作用。5 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究1.4多不饱和脂肪酸的营养作用多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFA)是一类含有2个或2个以上双键且碳原子数为16～22的直链脂肪酸。按照编号系统可将其分为-9组、-7组、-6组、-3组，其中-3组和-6组具有比较重要生物学功能的。α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)属于ω-3PUFA，中的亚油酸(LA)、r-亚麻酸(GLA)、双高-ω-亚麻酸(DHGLA)和花生四烯酸(AA)属于ω-6PUFA，以上这些都是比较常见的PUFA(张永刚等，2006)。研究表明，多不饱和脂肪酸是所有细胞膜的重要成分，对机体的激素代谢和许多酶的活性起调控作用（于昱等，2003），其研究与应用越来越受到人们的关注。1.4.1调控脂类代谢PUFA具有降低血清中胆固醇和甘油三酯含量的功能。研究发现，对照组饲粮中只添加EPA乙酯，试验组添加DHA乙酯，试验组个体血浆中胆固醇的含量降低，而在对照组中，血浆中胆固醇的含量没有变化，但甘油三酯的水平较原来降低了，这表明DHA主要是降低血浆中总的胆固醇(TC)，而EPA则主要是降低甘油三酯(TG)的含量（Kobatakeetal.1984）。PUFA调控脂类代谢的机制推测有以下几个途径：1)PUFA首先抑制肝脏中相关基因转录，主要是编码脂肪合成酶和糖酵解酶的基因，从而使肝脏中脂类的合成受阻，促进脂类的分解；2)阻碍极低密度脂蛋白(VLDL)的合成，加速清除VLDL；3)加速肝脏中脂肪酸的β-氧化反应，促进脂肪组织中脂肪的消耗，进而减慢体脂沉积的速度，这是n-3PUFA独有的作用，通过增强生物体氧化反应，加速产热来调控脂类代谢（Clarke，2000）；4)增加高密度脂蛋白(HDL)的浓度，普遍认为HDL是对生物体有利的胆固醇，因为它具有将胆固醇从细胞内转移到肝脏的作用，在肝脏中，胆固醇会被代谢掉。1.4.2调控基因表达和脂肪细胞的分化Amri(1991)在培养前脂肪细胞的过程中发现，脂肪酸提高了脂肪细胞中脂肪酸结合蛋白(ap2)mRNA的表达水平。另外，有研究显示，PUFA可以使苹果酸酶、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)等的基因mRNA丰度降低60%~90%。PUFA一方面通过降低基因转录的速率在转录水平对脂肪代谢相关基因进行调节，另一方面就是在mRNA的稳定性上就行调节（颜新春等，2001）。另外，PUFA还可调控脂肪细胞的分化。日粮亚油酸可转化为AA，AA是合成前列腺素(PGE2、PGD2等)的前体物质，6 山东农业大学硕士学位论文而PG可通过核受体转录因子PPARr促进脂肪细胞的分化，还可通过细胞表面前列腺素类受体抑制脂肪细胞的形成。20世纪80年代，人们发现了脂肪酸的另一种重要功能，即可以直接并独立地调控基因的表达，其中，n-3和n-6系列的多不饱和脂肪酸对基因表达的调节作用最为明显。最近的研究发现，脂肪酸可以调控部分代谢过程中关键酶的基因表达，从而调控脂肪酸的生化合成和氧化分解过程。这充分说明了脂肪酸不仅可以提供能量，而且还是生物膜的重要组成部分，并且可通过细胞膜受体信号途径和转录因子活化途径来调节基因表达，从而发挥重要的生理功能（徐盛玉等，2007）。PUFA对动物脂代谢相关基因表达的调控机制的研究主要集中在转录水平上。截止到目前，已发现PUFA的调节调节多种基因表达，比如抑制脂肪酸合成酶、糖酵解酶、L-丙酮酸激酶(UK)和白细胞介素等基因的表达，以及诱导脂肪酸氧化酶基因的表达（Gustafsson，1998）。Clarke等（1993）研究发现，日粮中脂肪酸对FAS基因转录的抑制能力的强弱取决于脂肪酸的碳链长度、双键的数量和位置，而且还和添加脂肪酸的剂量有关，其中n-3和n-6系列PUFA对基因表达调控作用最显著。Flick和James研究发现，用含60%亚油酸的日粮喂大鼠，可以降低肝脏中参与脂肪合成的酶的活性。一般认为，PUFA通过2种机制对基因表达进行调控，第一种是依赖于PPAR的调控机制，如PUFA可以通过调节PPAR来诱导乙酰基辅酶A氧化酶(AOX)基因的表达；第二种是不依赖PPAR的调控机制，研究表明，用PPAR的有效激活剂ETYA来饲喂试验动物，结果肝脏内FAS的表达量并没有变化，但却诱导了AOX基因的表达，这说明生物体FAS基因的调节不依赖于PPAR，同样的用20∶4(n-6)处理鼠的肝细胞，结果表明，肝细胞中FAS的表达量下降，但AOX基因表达量无明显变化，因此可以认为PUFA也通过其他效应因子来起到调控基因表达的作用（Nakamuraetal.，2000）。PPAR依赖机制：PPAR存在几种不同的亚型，分别为PPARα、PPARβ及PPARγ1和PPARγ2，有3种独立的基因编码3种不同的PPAR(α、β、γ)。PPARγ1和PPARγ2来自于同一基因，由于PPARγ基因有两个启动子，按照上游转录起始点的不同，又通过不同的剪接，所以产生了PPARγ1和PPARγ2。这些不同亚型又统称为PPARs。PPARs的不同亚型在组织中分布不同，并且受不同的配体激活，因此具有不同的生理功能（赵法及等，2006）。根据PPARs开放阅读框可以推测出其氨基酸序列，结果表明，PPAR由一个配体结合区和一个DNA结合区组成，这是激素受体的特征。配体结合区是与脂肪酸等配体结7 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究合的部分，与配体结合以后，受体可被激活；DNA序列上有特异反应元件，DNA结合区就是与其相结合的部分，通过这种特异性结合从而调节基因转录。目前已经发现许多酶的基因上都存在PPARs反应元件(PPAR-REs)，比如微粒体酰基辅酶A氧化酶、肉碱软脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、线粒体HMG-CoA合成酶、脂蛋白脂肪酶和脂肪酸结合蛋白等。另外，PPARs还常与类维生素A的X受体(retinoidXreceptor,RXR)结合形成异源二聚体，共同作用于PPAR-REs。当PPARs与RXR形成异源二聚体时，可增加PPARs与PPAR-REs的结合能力（Xuetal.，2001；Nakamuraetal.，2000）。除此之外，PPARs与PPAR-REs的结合，还需要一些辅助激活因子的共同参与，比如类固醇受体辅助激活剂-1(steroidreceptorco-activator–1，SRC-1)和PPAR-结合蛋白(PPAR-bindingprotein，PBP)等。PPAR非依赖机制：脂肪酸还可通过调节HNF-4α、NF-κB和SREBP-lc等转录因子活性，从而调节基因表达。最近的实验研究结果表明：固醇调节元件结合蛋白在调节基因表达发挥重要作用。SREBP蛋白家族是一类重要的转录调控因子，调控TG，脂肪酸和TC合成代谢相关的酶的表达。PUFA调控肝脏一些基因mRNA的下调表达的机制是：成熟型SREBP与受控基因结合从而导致基因的转录，PUFA在SREBP蛋白翻译后的加工过程中抑制成熟型SREBP的产生，成熟型SREBP的减少，从而抑制了这些基因的下调表达。PUFA既可以为生物体提供能量，同时也是构成生物膜的重要成分，在细胞表面信号传导过程中发挥着重要作用。另一方面，PUFA在细胞生化过程中同样起着重要的作用。日粮添加PUFA可以调节动物脂肪代谢相关酶和蛋白基因的表达，抑制动物体脂的沉积，提高动物产品品质。为了生产出更优质的动物产品，研究清楚PUFA调控动物脂肪沉积的分子生物学机制是非常必要的。但是目前只是对PUFA调控动物脂肪代谢相关酶和蛋白基因表达的分子机理有了初步的认识，具体调控机制仍不清楚，有待于进一步深入研究。1.4.3作为细胞膜磷脂的重要成分,维持细胞膜的功能PUFA作为生物膜的组分之一，具有多种重要的功能，比如影响生物膜的流动性和某些酶的活性，并且参与激素与受体的结合和信号的传递。1.4.4提高机体免疫能力研究表明，PUFA能够影响机体的免疫机能（汪灏等，2004）。然而也有资料显示PUFA也可以抑制T细胞的免疫功能，这种免疫抑制部分地是由于增加了脂类的过氧化8 山东农业大学硕士学位论文和降低了抗氧化物的水平，尤其是维生素E的水平，通过补充适当的维生素E可以防止这种情况的发生。研究表明，PUFA可以促进外周淋巴细胞的增殖，并且组织中PUFA的含量随着日粮中PUFA含量的增加而增加。长碳链-3PUFA具有生理活性，是因为它能够渗入寄生菌的组织，从而使其易于遭受吞噬细胞的氧化攻击。另外，-3PUFA可能会进入免疫系统来降低炎症反应而发挥其抗炎效果。1.5蜜蜂脂类营养需要的研究进展脂类在蜂体中除氧化供能外，还具有保持体温、保护器官等作用。脂类中的不饱和脂肪酸是蜜蜂生长发育所必须的营养成分，如果缺少，蛹的发育、成蜂的羽化及展翅都会受到影响。胆固醇是生产脱皮激素的前提，蜜蜂自身不能合成胆固醇及其类似物，必须从食物中获得（吕丽萍等，2006）。脂类作为蜜蜂重要的营养物质之一，在蜜蜂生长发育的各个阶段均有重要的作用。研究证实，一些脂类成分是蜜蜂代用花粉中必需的，但蜜蜂脂类适宜营养需要量的研究报道并不全面。Herbert等(1980)通过饲喂蜂群含脂质提取物的代用花粉和不添加脂质提取物的代用花粉，发现饲喂含脂质提取物的代用花粉那组蜂群子量较高。如今已证实，昆虫饲粮中必须含有亚油酸和亚麻油酸(Dadd,1973)，因为昆虫可以自身合成饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，但是合成一些多不饱和脂肪酸的能力有限，因此这些物质必须从食物中获取。目前对蜜蜂饲粮中脂肪酸的添加水平还没有明确的报道。Manning等(2007)研究发现，如果代用花粉中油酸含量超过6%或亚油酸含量超过10%，蜜蜂寿命就会降低，所以代用花粉中脂肪酸的含量应控制在适宜的范围内。另外，甾醇是合成蜕皮激素的前提物质，也是蜜蜂饲粮中必不可少的。Herbert等(1980)研究发现饲料中添加0.1%的甾醇类物质即可满足蜜蜂的繁殖需要。1.6本研究的目的和意义中国养蜂业的历史悠久，我们的祖先原来饲养的是中华蜜蜂，20世纪初期开始引进西方蜜蜂和现代养蜂技术。经过几代人的努力，中国已成为当今世界第一养蜂大国。中国虽然是个养蜂大国，蜂群饲养总量约700万群，但不是世界养蜂头号强国。中国养蜂业在世界上有领先的地方，但与有些养蜂发达国家相比，仍然有一定的差距。为了使中国养蜂业在21世纪得到更快更稳向前发展，要虚心学习先进养蜂经验（曾志将，2009）。9 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究蜜蜂是全变态发育的昆虫，其个体发育要经过卵期、幼虫期、蛹期和成虫期4个时期。其中幼虫期营养对蜜蜂的发育和健康至为关键。蜜蜂在其生长发育及繁殖过程中，不仅需要蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养素，还需要大量脂肪酸的供给。在自然条件下，蜜蜂通过采集花粉来满足自身营养需要。但天然花粉价格比较昂贵并且容易携带病原微生物，一定程度上影响蜂群健康，这对养蜂业造成极大损失，在此情况下，用人工饲粮来代替天然花粉的作用就显得尤为重要，而配制全价蜜蜂饲粮的前提就是要研究饲粮中各种营养素的适宜添加水平。本试验以意大利蜜蜂为研究对象，以亚油酸为试验材料，以新鲜蜂王浆、D-果糖、D-葡萄糖、酵母提取物、无菌水、亚油酸等成分配制成不同亚油酸水平的幼虫饲粮，以茶花粉、蔗糖、无菌水、亚油酸等为原料配制成不同亚油酸水平的成蜂饲粮，通过测定不同亚油酸水平饲粮对蜜蜂幼虫和成蜂生长发育、蛋白浓度、抗氧化能力、脂肪代谢相关酶活性及基因mRNA相对表达量的影响，探讨意大利蜜蜂幼虫期和成蜂期适宜的亚油酸添加水平。该研究结果为制定蜜蜂饲养标准、配制蜜蜂饲粮、人工饲养幼虫提供重要的理论依据和生产指导。2材料与方法2.1意蜂幼虫饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究2.1.1试验动物本地意大利蜜蜂蜂王所产的1d幼虫，试验蜂群由山东农业大学试验蜂场提供。2.1.2试验设计2.1.2.1试验材料新鲜蜂王浆（由山东农业大学试验蜂场提供）、D-果糖、D-葡萄糖、酵母提取物、无菌水、亚油酸，移虫针、镊子、擦镜纸、玻璃棒、保鲜盒、24孔培养板、48孔培养板，恒温恒湿培养箱，电子天平，漩涡混匀器，分析天平，冷冻离心机，移液器等。10 山东农业大学硕士学位论文2.1.2.2试验分组本试验以新鲜蜂王浆、D-果糖、D-葡萄糖、酵母提取物、无菌水等成分配制成幼虫基础饲粮，对照组饲喂基础饲粮，在基础饲粮中添加亚油酸，分别配制成亚油酸添加水平为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%的5种试验饲粮。选取1152只1日龄意蜂幼虫，随机分为6组，每组192只。用于幼虫化蛹时体重、化蛹率、蛋白浓度、酶活和基因表达量的测定。将幼虫置于48孔细胞培养板中饲养，培养板放入培养箱中（35℃、90%R.H.），试验期间每天饲喂1次，每孔每次饲喂150l。2.1.3幼虫饲粮组成试验饲粮的组成见表1。在基础饲粮中分别添加0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%的亚油酸，制成6种试验饲粮。表1幼虫日粮组成Table1CompositionsofLarvaldiets亚油酸添加水平Linoleicacidlevels(%)原料Ingredients00.020.040.060.080.1蜂王浆Royaljelly505050505050葡萄糖Fructose666666果糖Glucose666666酵母提取物Yeastextract111111无菌水Sterilewater3736.9836.9636.9436.9236.9亚油酸Linoleicacid00.020.040.060.080.1合计Total1001001001001001002.1.4饲养管理2.1.4.1统一幼虫日龄蜜蜂蜂王在巢房内产下卵，经过3天的孵化时间，孵化为1日龄幼虫，本试验从1日龄的蜜蜂幼虫开始饲养，其中，掌握好卵孵化成幼虫的时间至关重要。在蜂群中放入一张空脾供蜂王产卵，第二天查看产卵情况及产卵数，如产卵数符合11 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究试验需要，将脾放到继箱或者标记出产卵区域。第四天，从蜂群中取出此脾（即含有1日龄幼虫的脾），在脾上喷上适量无菌水，保持幼虫巢房内湿度，防止幼虫失水或幼虫天然饲粮挥发干燥致使幼虫失水死亡。将此脾放入已消毒的超净台内待用。2.1.4.2移虫养幼虫用24孔板或48孔板都可以，在移虫之前，要对培养板进行灭菌消毒，一般采用酒精浸泡和紫外线照射，然后将提前配制好的幼虫饲粮加入到培养板中，将其放入34~35℃的培养箱中预热10～20min。在超净台内，用已消毒的移虫针，将1日龄幼虫从巢脾标记好的区域转移入盛有幼虫食物的培养板中。移虫过程要尽量迅速，动作要熟练，不可伤及幼虫，以防止饲粮温度降低或者环境因素对幼虫造成刺激。移虫完毕后，将培养板放入已消毒的保鲜盒中，保鲜盒底部盛有15.5%的甘油溶液以保持95%的相对湿度，盖上保鲜盒盖，将其放入培养箱（34～35℃）。2.1.4.3更换饲粮试验期间每天更换一次幼虫饲粮，在已灭菌消毒的培养板中分别加入不同亚油酸水平的幼虫饲粮，然后预热（34~35℃、10~20分钟）。在超净台中，用灭菌消毒的移虫针将幼虫转移到盛有新鲜幼虫饲粮的新板上，加完后放回保鲜盒内，然后放入培养箱。2.1.4.4幼虫化蛹在实验室内饲养的幼虫比自然条件下的幼虫化蛹时间要延后，在室内饲养幼虫7天后，幼虫排出黄色尿酸晶体，表示幼虫基本进入化蛹期。化蛹阶段采用24孔板进行饲养。在超净台中，将已消毒灭菌的擦镜纸剪成5cm×6cm的纸条，对折2次，折叠成4层纸，然后将其铺入已消毒灭菌的24孔板内，将擦镜纸压平，紫外照射10～30min。首先用移虫针将幼虫转移到已消毒的擦镜纸上，吸除幼虫体表的水分和体表所携带的幼虫饲粮及粪便，然后将幼虫转移到已铺好纸的24孔板内化蛹。保鲜盒中需有饱和氯化钠溶液以维持化蛹阶段75%的相对湿度，将化蛹板放入保鲜盒中，再将保鲜盒置于培养箱（34～35℃）内培养。12 山东农业大学硕士学位论文2.1.4.5化蛹期换纸幼虫移到化蛹板后，前3天是幼虫死亡的高峰期，因为前三天幼虫会继续排便，容易滋生微生物，，造成感染，导致幼虫死亡。将幼虫转移到化蛹板3天以后，幼虫基本排便结束，在第3天，对化蛹板中的擦镜纸进行更换。方法同化蛹板的准备，铺好化蛹板后，将3天的蛹用消毒的镊子转移到新的化蛹板上，动作要轻，以防伤及蛹，然后将培养板放入培养箱中的保鲜盒内。2.1.4.6幼虫羽化出房之后不再移动幼虫，其可在培养板中自行完成化蛹过程，直至羽化成为幼蜂为止。每天观察幼虫生长发育状态，如发现死亡、细菌或真菌感染的幼虫要及时清除。1日龄5日龄6日龄7日龄图1幼虫生长发育过程Fig.1Larvalgrowthanddevelopment2.1.5测定指标及测定方法饲养至5-7日龄时采集样品，每天从每组中随机抽取6只意蜂幼虫。称重后，-80℃保存用于后续指标检测。2.1.5.1化蛹时体重的测定在幼虫化蛹时，把幼虫转移至化蛹板，用电子天平称量幼虫的体重并记录数据。2.1.5.2化蛹率的测定从将1日龄幼虫转移到48孔板开始，每天观察记录幼虫的死亡情况，将死亡个体移除，直至未死亡幼虫全部化蛹，记录转移到化蛹板的幼虫数目(numberofpupa)NP，幼13 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究虫的化蛹率为：化蛹率（%）=化蛹个数/总数*100%2.1.5.3总蛋白浓度的测定取幼虫加入适量生理盐水，用匀浆机制成10%组织匀浆，然后稀释成1%组织匀浆，取50l，采用A045-2总蛋白定量测试盒（南京建成）测定。2.1.5.4抗氧化能力的测定取10%组织匀浆80l，采用总抗氧化能力测定试剂盒（南京建成，货号：A015）测定T-AOC。取1%组织匀浆80l，采用总超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成，货号：A001-1）测定T-SOD。2.1.5.5PPARs和脂肪代谢相关酶浓度的测定每测一种酶，取10%组织匀浆10l，采用蜜蜂ELISA检测试剂盒（雅安达）测定。测定PPAR活性的试剂盒为蜜蜂过氧化物酶体增殖物激活受体ELISA检测试剂盒，测定PPAR活性的试剂盒为蜜蜂过氧化物酶体增殖物激活受体ELISA检测试剂盒，测定FAS活性的为蜜蜂脂肪酸合成酶ELISA检测试剂盒，测定ACC浓度的为蜜蜂乙酰CoA羧化酶ELISA检测试剂盒，测定CPT活性的为蜜蜂肉毒碱棕榈酰转移酶ELISA检测试剂盒，测定MDH浓度的为蜜蜂苹果酸脱氢酶ELISA检测试剂盒，测定G6PD活性的为蜜蜂葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ELISA检测试剂盒，测定CYP450浓度的为蜜蜂细胞色素P450ELISA检测试剂盒。2.1.5.6脂肪代谢相关基因表达量的测定2.1.5.6.1总RNA的提取与检测（1）超净工作台首先用75%的酒精消毒，然后在紫外照射下灭菌30min，预冷4℃离心机。（2）在冰盒中预冷3套1.5mlEP管，其中一套加入1mlTrizol。14 山东农业大学硕士学位论文（3）取2只幼虫，将其放入已经加入Trizol的EP管中。用漩涡混匀器震荡裂解，并上下颠倒10次使其混匀，在4℃离心机中，12000rpm离心10min。（4）取上清，将其转入第二套1.5mlEP管中，并加入200μL氯仿，上下颠倒40次混匀，静置5min。（6）在4℃离心机中，12000rpm离心15min。取上清，并将其转移至第三套1.5mlEP管中。（7）加入500μL异丙醇，上下颠倒10次，静置10min。（8）在4℃离心机中，12000rpm离心10min。小离心机，3000rpm离心30s，抽出残余异丙醇。（9）加入1000μL用0.01%DEPC水配制的75%的乙醇，并用移液枪反复吹打几次，使RNA沉淀。（10）在4℃离心机中，7500rpm离心5min。小离心机，3000rpm离心30s。抽出残余75%乙醇，待乙醇挥发至离心管内壁无液珠时，加入50μL配制好的0.01%DEPC水。（11）轻弹离心管，使RNA再次溶解，分装好后，-80℃保存。（12）取20μL分装好的RNA，用0.01%DEPC水稀释至100μL，在紫外分光光度计下测定OD值。如果OD260/280值在1.8-2.0之间，则表示RNA纯度较好，如其值＜1.8则表示RNA可能被蛋白质污染，如其值＞2.2则表明RNA可能已经降解。2.1.5.6.2反转录首先将RNA去除基因组DNA，具体方法见表2，42℃条件下反应2min。去除基因TM组DNA后，用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)反转录，反转录体系见表2。体系配制好后，37℃条件下按照每个循环反应15min，85℃条件下灭活5s，进行反转录。得到的cDNA，-20℃保存。15 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究表2反转录体系表Table2Compositionofreversetranscriptionsystem试剂体积（μL）5×PrimeScriptBuffer4PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1OligodTPrimer(50μM)*11Random6mers(100μM)*11TotalRNA*1RNaseFreedH2O*2总体积20*1反应体系可按需要同比例放大，本实验所需要的RNA量为1000/RNA浓度计算所得。*2RNaseFreedH2O的添加量为13μL减去添加的总RNA量。2.1.5.6.3各基因PCR引物的合成基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，以β-actin为内参，采用Primer5.0进行引物设计，委托上海桑尼生物科技有限公司合成引物，引物序列如表3所示。表3引物序列Table3PrimersequencesforRT-PCR目的基因引物序列产物长度(bp)登录号LocusPrimersequences(5’-3’)Length(bp)GenBankNo.脂肪酸合成酶F:TGATTCTCCTCTTGGGATGTCT140XM_396268FASR:CAGCACCACTCTCTATCCTTCA乙酰CoA羧化酶F:TCAACCACGACATAAACCTCAA151XM_003250552.1ACCR:TACCGAGAAATAACCCCAAACA葡萄糖-6-磷酸脱氢F:GGAACGCCAAGAAATGAGAT107NC_007071.3酶G6PDR:CACGAAATGAAGGTTACACTGG-肌动蛋白F:CCGTGATTTGACTGACTACCT142NM_001185145-actionR:AGTTGCCATTTCCTGTTC16 山东农业大学硕士学位论文2.1.5.6.4实时荧光定量PCRPCR反应体系如表4。各引物的稀释倍数和引物是否适当，需要制作标准曲线，根据标准曲线来判定。制作标准曲线的方法是：取各实验组cDNA模板2μL，混合好后，0123456用无菌水依次按照如下倍数稀释：2、2、2、2、2、2、2。标准曲线制作好后，按照其斜率计算出扩增率，其中扩增率为0.9-1.2时最适合。依照相同扩增率的目的基因和持家基因，通过一定公式计算出目的基因的相对表达量。实验组目的基因扩增时，要做两次重复，并扩增其相应的持家基因，根据两次重复的相对表达量计算出目的基因的相对标量。表4PCR反应体系Table4CompositionofPCRsystem试剂体积（μL）TMSYBRPremixExTaq(2×)10PCRForwardPrimer(10μM)0.4PCRReversePrimer(10μM)0.4ROXReferenceDyeⅡ(50×)0.4DNA模版2.0dH2O6.8Total20.02.1.6数据分析数据统计均采用SAS9.1统计软件ANOVA法进行单因子方差分析，以Duncan氏法进行平均数多重比较，试验数据以平均值±标准差的形式表示，通过回归分析对剂量－效应关系作二次曲线拟合，根据二次方程计算最适添加水平。P<0.05代表差异显著。17 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究2.2意蜂成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究2.2.1试验动物本地意大利蜜蜂（ApismelliferuL.），由山东农业大学试验蜂场提供。2.2.2试验设计2.2.2.1试验材料油菜花粉，蔗糖，无菌水，亚油酸，笼养意蜂的蜂盒，恒温恒湿培养箱，电子天平，漩涡混匀器，移液器，分析天平，冷冻离心机，烘箱等。2.2.2.2试验分组从姊妹蜂王群中，抓取刚出房的幼蜂，放入含有饲粮和水的蜂盒中，随机分为6组，每组2盒，每盒100只，总共12盒。每组其中一盒用于生理生化和分子指标的测定，第7、14天取样，每组取5个重复。另一盒用于统计采食量和死亡率。2.2.3成蜂饲粮组成以茶花粉，蔗糖，无菌水，亚油酸为原料配制6种不同亚油酸水平的饲粮（0%、0.35%、0.7%、1.05%、1.4%、1.75%），饲粮组成见表5。对照组不添加亚油酸18 山东农业大学硕士学位论文表5饲粮组成Table5CompositionofDiets处理原料(%)ABCDEF茶花粉353535353535蔗糖535353535353无菌水1211.6511.3010.9510.6010.25亚油酸00.350.701.051.401.75合计1001001001001001002.2.4饲养管理蜂盒放入33℃，50%R.H.的恒温恒湿培养箱内。以不同亚油酸水平的饲粮饲喂各组幼蜂，每天更换饲粮和水。试验期间每天饲喂一次，计算每天采食量，将死亡蜜蜂取出，在饲养过程中保证培养箱和饲喂盒的卫生,防止其它不利因素对蜜蜂产生的影响。2.2.5测定指标及测定方法2.2.5.1意蜂成蜂平均日采食量的测定每天更换一次饲粮，统计剩余饲粮和添加饲粮的重量，计算出整个试验过程中每组成蜂的平均日采食量。平均日采食量=（添加饲粮的重量-剩余饲粮的重量）/成蜂只数2.2.5.2意蜂成蜂存活率的测定每天记录死亡蜜蜂的数量，将死亡蜜蜂取出。存活率=(总数-死亡数)/总数*100%19 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究2.2.5.3意蜂成蜂蜂体蛋白浓度的测定在1日龄幼蜂移到蜂盒第7、14天，从每组中随机选取15只，分为5个重复，去除腹部，液氮冷冻，-80℃保存。液氮研磨制成10%组织匀浆，然后稀释成1%组织匀浆，采用A045-2总蛋白定量测试盒（南京建成）测定。2.2.5.4意蜂成蜂蜂体T-AOC的测定同2.1.5.42.2.5.5意蜂成蜂脂肪代谢相关酶活性或浓度的测定同2.1.5.52.2.6数据分析同2.1.63结果与分析3.1饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫的影响3.1.1饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫化蛹时体重和化蛹率的影响研究结果显示，饲粮亚油酸水平对意蜂化蛹时的体重无显著影响（P>0.05），但对化蛹率影响显著（P<0.05）（表6）,其中饲粮亚油酸添加水平为0.1%时，显著降低了化蛹率。以化蛹率（Y）与饲粮亚油酸添加水平（Ｘ）进行曲线拟合，得到如下曲线方程：22Y=-9936.7X+479.67X+91.969（R=0.8952），由方程可知，当亚油酸添加水平为0.024%时化蛹率最高。20 山东农业大学硕士学位论文表6饲粮亚油酸添加水平对幼虫化蛹时体重和化蛹率的影响Table6Effectsoflinoleicacidsupplementallevelonbodyweightwhenpupationandthepercentageofpupationoflarvae亚油酸添加水平化蛹重化蛹率Linoleicacidsupplementallevel/%bodyweightoflarvaewhenpupation/gpercentageofpupation/%a00.2740±0.005294.643±5.357a0.020.2628±0.004696.131±0.298a0.040.2827±0.005890.417±2.917a0.060.2683±0.004981.5±6.5a0.080.2689±0.007380.682±5.682b0.10.2804±0.011733.737±7.930P值P-value0.17080.0013同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。Inthesamecolumn,valueswithnoletterorthesamelettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P＞0.05),whilewithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P＜0.05).Thesameasbelow.3.1.2饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫虫体蛋白浓度的影响饲粮亚油酸水平对幼虫虫体蛋白浓度的影响如表7所示，对于5日龄幼虫，亚油酸添加水平为0.04%时，虫体蛋白浓度显著高于对照组（P<0.05），其他组与对照组无显著差异（P>0.05）；饲粮亚油酸水平对7日龄虫体蛋白浓度有极显著影响（P=0.0067），随日粮亚油酸添加量的增加，7日龄蛹体蛋白质浓度呈现先上升后下降的趋势，但是亚油酸添加0.02-0.08%时，与对照组相比差异不显著（P>0.05），仅亚油酸水平为0.1%时显著抑制了蛹体蛋白的沉积（P<0.05）。以虫体蛋白浓度（Y）与饲粮亚油酸添加水平（Ｘ）22进行曲线拟合，得到如下曲线方程：Y=-29.381X+2.148X+0.4161（R=0.8843），由方程可知，当亚油酸添加水平为0.037%时虫体蛋白浓度最高。21 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究表7饲粮亚油酸水平对幼虫虫体蛋白浓度的影响Table7Effectsoflinoleicacidlevelindietsontheproteinconcentrationoflarvae虫体蛋白浓度亚油酸添加水平Theproteinconcentrationoflarvae/(g/L)Linoleicacidlevel/%5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldbab00.33±0.020.36±0.020.43±0.02bab0.020.33±0.010.33±0.020.42±0.02aa0.040.39±0.020.36±0.010.47±0.02ba0.060.34±0.020.33±0.010.45±0.01abbc0.080.35±0.010.36±0.010.39±0.00bc0.10.34±0.010.33±0.020.34±0.01P值P-value0.12870.44390.00673.1.3饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫抗氧化能力的影响由表8可以看出，饲粮亚油酸水平对5日龄幼虫组织T-AOC有极显著影响（P=0.0064），其中饲粮亚油酸添加水平为0.04%组显著低于饲粮亚油酸添加水平为0，0.02%，0.06%，0.08%和0.1%组（P<0.01）。饲粮亚油酸水平对幼虫组织T-SOD活性无显著影响（P>0.05）。表8饲粮亚油酸添加水平对幼虫T-AOC和T-SOD的影响Table8EffectsoflinoleicacidsupplementallevelonT-AOCandT-SODoflarvae亚油酸添加水平总抗氧化能力总超氧化物歧化酶Linoleicacidsupplementallevel/%T-AOC/U/mgprotT-SOD/U/mgprota026.97±2.7665.47±3.23a0.0234.61±4.0069.46±6.19b0.0414.75±2.2758.09±2.45a0.0627.21±2.1167.28±3.98a0.0826.13±0.2960.39±4.86a0.127.67±1.9458.09±1.82P值P-value0.0064>0.0522 山东农业大学硕士学位论文3.1.4饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢的影响3.1.4.1饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫PPARs活性的影响由表9可以看出，饲粮亚油酸水平对6日龄幼虫PPAR活性有显著影响（P<0.0001），与对照组相比，0.02%组PPAR活性显著降低，0.04%组和0.08组显著升高，0.06%组和0.1%组与对照组差异不显著，但有升高的趋势。与对照组相比，仅0.08%亚油酸添加组显著提高了PPAR的活性（P<0.05）。表9饲粮亚油酸水平对PPARs活性的影响Table9EffectsoflinoleicacidlevelindietsonPPARsactivityoflarvae亚油酸添加水平PPARs活性PPARsactivity/(U/L)Linoleicacidlevel/%PPARPPARcb032.49±5.01166.53±28.06db0.0222.62±1.84231.60±54.35bb0.0443.37±0.79184.73±2.67bcb0.0638.97±1.52176.86±3.41aa0.0899.66±2.79409.78±20.12bcb0.133.57±2.59169.92±8.33P值P-value<0.00010.00283.1.4.2饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢相关酶的影响如表10所示，饲粮不同亚油酸水平对5日龄幼虫和7日龄蛹的FAS活性无影响（P>0.05），仅影响了6日龄幼虫FAS活性（P<0.05）。随日粮亚油酸水平的提高，6日龄幼虫FAS活性呈现先上升后下降的趋势，其中0.04%、0.06、0.08%的亚油酸组的FAS活性显著高于对照组（P<0.05），FAS活性的峰值出现在添加0.08%亚油酸时，当浓度继续增加至0.1%时，FAS活性又降低到与对照组相近的基础水平。由表11可以看出，饲粮亚油酸水平仅对5日龄（P=0.0178）和6日龄（P<0.0001）幼虫ACC蛋白浓度有影响，对7日龄蛹的ACC蛋白浓度无影响（P>0.05）。与对照组相比，0.06%和0.1%的亚油酸能显著提高5日龄幼虫的ACC蛋白浓度（P<0.05），但是仅0.08%的亚油酸提高了6日龄幼虫的ACC蛋白浓度（P<0.05）。23 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究表10饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪酸合成酶活性的影响Table10EffectsoflinoleicacidlevelindietsonFASactivityoflarvae脂肪酸合成酶活性FASactivity/(U/ml)亚油酸添加水平5日龄6日龄7日龄Linoleicacidlevel/%5daysold6daysold7daysoldc033.87±6.7318.98±2.1960.88±5.24bc0.0232.44±3.8926.49±2.6663.87±1.94ab0.0431.47±6.6740.51±8.6064.40±1.35abc0.0644.52±2.3933.71±5.4966.98±1.19a0.0826.95±3.7050.79±7.7565.40±2.57bc0.143.93±7.1129.60±5.3364.71±2.79P值P-value0.170.02070.7696表11饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫乙酰CoA羧化酶浓度的影响Table11EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheACCconcentrationoflarvae乙酰CoA羧化酶浓度亚油酸添加水平TheconcentrationofACC/(ng/ml)Linoleicacidlevel/%5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldbb09.45±2.1522.24±6.2494.73±1.63bb0.0210.68±3.3820.34±0.6396.67±3.67abb0.0420.02±1.5822.49±0.7396.46±3.19ab0.0625.82±3.5817.51±0.5596.58±2.08aba0.0819.37±4.4295.78±6.8496.12±1.73ab0.132.19±5.1518.69±3.8098.44±3.29P值P-value0.0178<0.00010.9602饲粮亚油酸对5、6、7日龄幼虫CPT活性均无显著影响（P>0.05）（表12）。对6日龄幼虫，0.02%组和0.06%组与对照组差异不显著，但有升高的趋势，其余三组与对照组有显著差异，CPT活性显著高于对照组，总体来说有上升的趋势。24 山东农业大学硕士学位论文表12饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫肉毒碱棕榈酰转移酶活性的影响Table12EffectsoflinoleicacidlevelindietsonCPTactivityoflarvae肉毒碱棕榈酰转移酶活性(U/L)亚油酸添加水平(%)CPTactivity(U/L)Linoleicacidlevel(%)5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldb029.900±3.06119.505±1.91142.601±2.067ab0.0228.918±4.22226.309±1.76840.56±2.179a0.0433.038±1.32431.715±6.23747.515±2.207ab0.0631.942±4.39226.158±2.61547.893±7.699a0.0824.646±1.86830.316±0.86439.917±2.542a0.123.361±1.47928.313±1.39942.45±4.717由表13可以看出，饲粮亚油酸对5日龄幼虫MDH浓度影响不显著，与对照组相比，0.02%组有下降趋势，0.06%组有升高趋势，总体MDH浓度先上升后下降；对6日龄幼虫MDH浓度影响极显著（P=0.007），试验组与对照组相比显著升高；对7日龄幼虫MDH无显著影响，与对照组比较，0.04%组MDH浓度稍低，0.06%组偏高，当亚油酸添加量升至0.1%时，MDH浓度呈下降趋势。总体比较，7日龄幼虫MDH浓度普遍高于5、6日龄。饲粮亚油酸对5、6、7日龄幼虫G6PD活性均无显著影响（P>0.05）（表14）。对5日龄幼虫来说，试验组与对照组无显著差异，但0.06%组有下降趋势，当亚油酸添加量为0.1%时，G6PD活性有升高趋势；对7日龄幼虫，与对照组相比，0.04%组G6PD活性呈下降趋势，0.06%组呈上升趋势。25 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究表13饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫苹果酸脱氢酶浓度的影响Table13EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheMDHconcentrationoflarvae苹果酸脱氢酶浓度(ng/ml)亚油酸添加水平(%)TheconcentrationofMDH(ng/ml)Linoleicacidlevel(%)5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldabbab054.32±20.9837.922±1.873106.12±6.54baab0.0229.01±8.6866.638±11.243103.28±4.25abab0.0445.47±18.5482.914±0.92890.03±7.84aaa0.0675.8±6.060.078±3.580114.42±7.04abaab0.0867.5±7.266.39±4.9494.74±10.00abab0.160.45±16.5083.719±8.99484.09±6.39表14饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的影响Table14EffectsoflinoleicacidlevelindietsonG6PDactivityoflarvae葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性(U/L)亚油酸添加水平(%)G6PDactivity(U/L)Linoleicacidlevel(%)5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldabab0136.3±3.6114.53±14.04175.93±12.26abab0.02142.49±6.28129.6±3.1172.87±7.71abb0.04132.79±10.85118.49±44.80150.66±13.02ba0.06120.41±17.81114.66±15.57181.42±1.99abab0.08151.94±10.36158.45±6.67169.81±6.32aab0.1161.13±5.27126.92±17.02163.17±2.73由表15可以看出，饲粮亚油酸对5日龄幼虫细胞色素P450浓度影响不显著（P>0.05），但当亚油酸添加量为0.02%到0.06%时，与对照组相比，CYP450浓度有下降趋势，亚油酸添加量升至0.1%时，CYP450浓度有升高趋势，总体来说CYP450浓度是上升的；对6日龄幼虫有显著影响（P<0.05），亚油酸添加量在0%到0.04%范围内时，26 山东农业大学硕士学位论文CYP450浓度逐渐上升且与对照组差异显著，随着亚油酸添加量的升高，0.06%组和0.1%组与对照组差异不显著但有升高趋势，0.08%组CYP450浓度显著升高；对7日龄幼虫CYP450浓度影响显著（P<0.05），亚油酸添加量在0%到0.04%范围内时，CYP450浓度逐渐下降且与对照组差异显著，随着亚油酸添加量的升高，0.06%组和0.08%组与对照组差异不显著但有下降趋势，0.1%组CYP450浓度相比与对照组显著下降。表15饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫细胞色素P450浓度的影响Table15EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheCYP450concentrationoflarvae细胞色素P450浓度(ng/ml)亚油酸添加水平(%)TheconcentrationofCYP450(ng/ml)Linoleicacidlevel(%)5日龄6日龄7日龄5daysold6daysold7daysoldabca036.713±18.40322.708±2.31887.603±5.059babbc0.0227.955±4.12444.7±6.366.923±2.629bac0.0430.965±6.62358.01±3.5856.12±5.68bbcabc0.0633.897±2.16429.962±5.93170.164±8.566ababab0.0839.916±3.15245.471±5.71681.275±4.559abcbc0.156.429±2.62033.28±6.1767.617±4.0953.1.5饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢相关基因相对表达量的影响由表16可以看出，饲粮亚油酸对5、7日龄幼虫FASmRNA相对表达量影响不显著（P>0.05）。饲粮亚油酸对5、7日龄幼虫ACC基因影响不显著（P>0.05），对7日龄幼虫来说，与对照组相比，0.02%组ACC基因相对表达量有上升的趋势，0.04%组和0.1%组有下降的趋势。饲粮亚油酸对5、7日龄幼虫G6PD基因相对表达量影响不显著（P>0.05），但对5日龄幼虫来说，随着亚油酸添加量的增加，在0.04%到0.08%范围内，G6PD基因相对表达量有上升的趋势，当添加到0.1%时，G6PD基因相对表达量比对照组显著升高，总体呈逐渐上升的趋势。27 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究表16饲粮亚油酸水平对意蜂幼虫脂肪代谢相关基因相对表达量的影响Table16EffectsoflinoleicacidlevelindietsonrelativeexpressionleveloflarvaemRNA相对表达量mRNArelativeexpressionlevel处理（%）5日龄5daysold7日龄7daysoldTreatmentFASACCG6PDFASACCG6PD01.00±0.331.00±0.261.00±0.16b1.00±0.271.00±0.35ab1.11±0.170.021.88±0.491.99±0.581.01±0.07b1.64±0.141.91±0.50a1.64±0.460.040.84±0.190.94±0.231.21±0.16ab0.88±0.310.79±0.14b1.51±0.210.062.68±1.122.66±1.101.43±0.08ab1.28±0.511.38±0.29ab1.61±0.160.081.56±0.252.32±0.491.47±0.21ab0.98±0.541.01±0.33ab1.03±0.440.11.64±0.252.08±0.071.82±0.37a0.58±0.090.76±0.12b1.67±0.71P值P-value0.260.240.090.430.170.783.2饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂的影响3.2.1饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂平均日采食量和存活率的影响如表17所示，饲粮亚油酸对成蜂平均日采食量影响不显著（P>0.05），但与对照组相比，0.35%组和1.4%组平均日采食量有下降的趋势，0.7%组和1.75%组有上升的趋势。随着日龄的增加，成蜂的存活率见图2。试验结果表明：随着饲粮亚油酸水平的提高，存活率呈现先上升后下降的趋势，亚油酸水平为1.05%时，其存活率最高，20日龄时，存活率高于80%。亚油酸水平为1.75%时，存活率最低，20日龄时，存活率为0%。以存活率（Y）与饲粮亚油酸添加水平（Ｘ）进行曲线拟合，得到如下曲线方程：22Y=-126.38X+236.5X-26.344（R=0.9991），由方程可知，当亚油酸添加水平为0.94%时存活率最高。28 山东农业大学硕士学位论文表17饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂平均日采食量的影响Table17EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheaveragedailyfeedintakeofApismelliferaL.处理Treatment（%）平均日采食量theaveragedailyfeedintake（g）ab00.0157±0.0012b0.350.0140±0.0010a0.700.0175±0.0013ab1.050.0160±0.0012b1.400.0140±0.0008a1.750.0180±0.0012P值P-value0.0543图2饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂存活率的影响Fig.2EffectsoflinoleicacidlevelindietsonthesurvivalrateofApismelliferaL.3.2.2饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂蛋白浓度的影响试验结果表明：饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂蛋白浓度影响显著（P<0.05）（表18），随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体蛋白浓度呈现先上升后下降的趋势，对照组蛋白浓度最低。亚油酸水平为1.05%和1.4%时，蜂体蛋白浓度最高，与对照组差异显著（P<0.05），0.35%、0.7%和1.75%组与对照组相比，蜂体蛋白浓度有升高的趋势。以蛋白浓度（Y）29 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究与饲粮亚油酸添加水平（Ｘ）进行曲线拟合，得到如下曲线方程：22Y=-0.0649X+0.1393X+0.7746（R=0.7769），由方程可知，当亚油酸添加水平为1.07%时，蜂体蛋白浓度最高。表18饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂蛋白浓度的影响Table18EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheproteinconcentrationofApismelliferaL.处理Treatment（%）蛋白浓度theproteinconcentration（g/L）c00.7856±0.0347bc0.350.8002±0.0057abc0.700.8329±0.0118ab1.050.8521±0.0079a1.400.8646±0.0065bc1.750.8063±0.0131P值P-value0.02083.2.3饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂T-AOC的影响不同亚油酸水平对意蜂成蜂7、14二个日龄T-AOC的影响见表19。试验结果表明：7日龄时，亚油酸对蜂体T-AOC无显著影响（P>0.05），各组之间无显著差异（P>0.05）。14日龄时，蜂体T-AOC随着饲粮中亚油酸浓度的增加而变大，即T-AOC与饲粮中亚油酸浓度呈正相关，亚油酸添加量为1.75%时，蜂体T-AOC最高，与对照组差异显著（P<0.05），其他试验组与对照组相比，蜂体T-AOC有升高的趋势。表19饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂T-AOC的影响Table19EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheT-AOCofApismelliferaL.处理T-AOC（U/mgprot）Treatment（%）7日龄7daysold14日龄14daysoldb02.8754±0.26521.3641±0.1830ab0.352.9645±0.13431.7265±0.3023ab0.702.4618±0.12211.9545±0.1750ab1.052.7131±0.08191.5697±0.179530 山东农业大学硕士学位论文ab1.402.4742±0.15182.1291±0.2471a1.752.8054±0.26222.5159±0.3979P值P-value0.34880.09173.2.4饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂FAS活性和ACC浓度的影响由表20可以看出，不同亚油酸水平对FAS活性影响不显著（P>0.05）。但随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体FAS活性呈现先上升后下降的趋势，对照组FAS活性最低。亚油酸水平为0.7%时，蜂体FAS活性最高，与对照组差异显著（P<0.05），0.35%、1.05%、1.4%和1.75%组与对照组相比，蜂体FAS活性有升高的趋势。不同亚油酸水平对ACC浓度影响显著（P<0.05）。随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体ACC浓度呈现先上升后下降的趋势，对照组ACC浓度最低。亚油酸水平为0.35%到1.4%时，蜂体ACC浓度显著高于对照组（P<0.05），其中以0.35%组最高。1.75%组与对照组相比，蜂体ACC浓度有升高的趋势。表20饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂FAS和ACC的影响Table20EffectsoflinoleicacidlevelindietsontheFASandACCofApismelliferaL.处理Treatment（%）FAS活性FASactivity（U/mL）ACC浓度ACCconcentration（ng/mL）bc016.7430±2.24497.6852±0.8813aba0.3523.7425±0.990915.3215±2.0887aab0.7030.0656±8.223913.2280±2.1147abab1.0524.6862±1.771314.3445±1.3546abab1.4026.1302±2.560713.8660±1.1920abbc1.7517.7025±2.81389.6392±1.0663P值P-value0.22160.008831 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究4讨论4.1饲粮亚油酸水平不影响意蜂幼虫化蛹时体重和其它完全变态昆虫一样，蜜蜂发育要经过4个阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）。幼虫期，是蜜蜂采食和生长的重要阶段，幼虫期末经变态发育进入蛹期；蛹期，蜜蜂历经蜕皮和色素沉着等一系列复杂的变化，羽化出房为成蜂(Remboldetal.，1980；Thrasyvoulouetal.，1982)。幼虫采食的亚油酸，除了一部分用于能量消耗外，也会通过转化为三大物质的形式进行体沉积，从而使幼虫体重增加。本试验结果表明，饲粮添加不同水平的亚油酸对意蜂幼虫化蛹时体重无显著影响。目前关于亚油酸对昆虫生长性能影响的研究极少，但在畜禽上研究较多。以畜禽为例，李荣刚等（2011）研究表明日粮添加亚油酸对断奶至2月龄肉兔平均日增重无显著影响。Uwayjan等（1983）通过饲喂不同日龄蛋鸡富含亚油酸的日粮，同样发现其对生长性能无显著影响。本研究在意大利蜜蜂幼虫中的研究结果与上述报道相似，发现日粮添加亚油酸并未显著改变工蜂化蛹时的体重。然而，王菊花等研究表明，当日粮中共轭亚油酸（CLA）的添加量为1.0%和2.0%时，可以显著提高断奶仔猪的日增重和饲料利用率（王菊花，2006）。在家禽方面，刘光芒等研究发现，添加低水平的CLA可以提高肉鸭生产性能，但添加水平过高则会降低平均日增重（刘光芒等，2005）。由此可见，亚油酸对畜禽乃至蜜蜂体增重的影响仍存在争议，这可能与添加的亚油酸剂量、种类，研究物种，物种所处的生理阶段以及饲养管理等因素有关。4.2饲粮亚油酸水平影响意蜂幼虫化蛹率脂类是昆虫体壁表皮层和细胞膜的结构成分，昆虫的发育需要脂质，尤其是不饱和脂肪酸和甾醇类物质。如某些鳞翅目昆虫需要足够的亚油酸和亚麻酸才能够正常羽化或形成鳞片，当饲粮中这两种脂肪酸含量不足时，蜕皮就会受阻，鳞片发育就不完全，蝗虫因此而产生畸形成虫，还有一些膜翅目昆虫表现出蜕皮困难，鞘翅目昆虫表现出生长缓慢和成虫繁殖力下降，这可能是因为磷酸酯的形成受阻，进而导致膜发育不全的缘故。通过对化蛹率的统计，结果显示当亚油酸添加水平为0.1%时，幼虫化蛹率显著下降，其他组无显著差异。分析可能是因为多不饱和脂肪酸结构中的不饱和双键会发生过氧化反应，产生自由基，细胞自由基过多会使细胞功能减弱，导致幼虫无法进入蛹期。32 山东农业大学硕士学位论文由此可见，工蜂幼虫日粮中亚油酸的需要量应该处于一个合理范围内，并非多多益善。4.3饲粮亚油酸水平不影响意蜂成蜂平均日采食量采食是蜜蜂摄取营养物质的基本途径，影响采食的因素很多，主要有蜜蜂种类、饲粮营养水平、环境和饲喂技术等。就蜜蜂自身而言，其生长发育的不同阶段，需要蛋白质、碳水化合物、脂肪及维生素的质和量不同。花粉的颜色、气味、脂类物质等因素对蜜蜂的吸引力均有影响（马兰婷等，2011）。另外，目前也已证实花粉中的一些脂类物质对蜜蜂具有诱食作用(Lepageetal.,1968;Hopkinsetal.,1969;Herbertetal.,1980;Dobsonetal.,1997)，不同来源的蜂花粉对蜜蜂的吸引力也不同(Doull,1966;Boch,1982;Levinetal.,1955)。亚油酸是蜜蜂的必需脂肪酸（周冰峰，2002），饲粮中添加亚油酸可以提高其适口性，吸引蜜蜂采食(Singhetal.，1999；马兰婷等，2011)。Singh等（1999）认为亚油酸和亚麻酸可能会对蜜蜂有一定的诱食作用。本试验结果表明，随饲粮中亚油酸添加水平的升高，蜜蜂采食量无显著差异，但与对照组相比，0.35%组和1.4%组平均日采食量较高，0.7%组和1.75%组平均日采食量较低。证明饲粮中亚油酸添加水平并没有影响蜜蜂的采食行为，这可能和环境和饲养方式有关，本试验采用的是笼养方式，而不是大群的饲养方式。4.4饲粮亚油酸水平影响意蜂成蜂存活率蜜蜂的营养差异直接影响蜜蜂个体的寿命，寿命是评估花粉或代用花粉品质优劣的重要指标（Schmidtetal.1987），也是影响蜂群发展和蜂群生产力的重要因素（周冰峰，2002）。不同季节，蜜蜂的平均寿命相差很大，夏季比冬季寿命短（周冰峰，2002）。代用花粉蛋白水平和维生素添加量也可影响蜜蜂的寿命（冯倩倩等，2011；李成成等，2011）。本试验通过室内饲养刚出房蜜蜂，记录每天死亡数目，测定蜜蜂寿命。虽然室内笼养和大群饲养对蜜蜂寿命的影响有一定差异，但季节对蜜蜂的影响较大，而室内笼养消除了环境等因素的差异，更能反映饲料脂肪酸水平对蜜蜂寿命的影响。许多研究证实，日粮中脂肪酸水平与蜜蜂寿命有密切关系。Manning等(2007)研究发现，高油酸日粮能显著降低蜜蜂寿命，并推测油酸含量过高可能会对蜜蜂产生毒性，日粮中高亚油酸同样能降低蜜蜂寿命。Bryant等(1982)和Matheson(1982)指出，当饲喂蜜蜂全脂豆粉和脱脂豆粉时，蜜蜂更倾向采食脱脂大豆粉，并具有较高的存活率。本试验结果表明，33 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究饲粮添加不同水平的亚油酸影响意蜂成蜂存活率，各试验组随着亚油酸添加水平的升高，存活率呈先上升后下降的趋势。Kanazawa等(1985)对日本对虾(Penaeusjaponicus)幼体的研究发现,ω-3HUFA等必需脂肪酸对对虾幼体的发育和存活有直接的影响,并指出ω-3比ω-6系列的不饱和脂肪酸能更有效地促进幼体的生长和发育。有学者通过在其它对虾蟹类幼体饲料中添加ω-3HUFA后的研究结果也证实这一点(王渊源等，1997；高淳仁等，1997；成永旭等，1998)。Montaño等（1996）通过分析野生和养殖的南美白对虾(Penaeusvannamei)幼体内脂肪酸含量的差异,认为野生型幼体之所以具有更强的抵抗外界不良环境的能力,主要与其体内ω-3系列HUFA含量高,特别是EPA和DHA含量较高有关。本实验结果表明，在一定范围内，成蜂存活率随着亚油酸添加水平的增加而升高。所补充的这部分脂类物质可较好地满足发育过程中对大量脂类营养的需求（周洪琪，1992），为蜂体旺盛的代谢提供能量物质和结构物质。但亚油酸在蜂体内具体的代谢及作用机制还不清楚,有待进一步的研究。4.5饲粮亚油酸水平影响意蜂蛋白浓度蛋白质是蜜蜂机体组织的基本原料，能够修补组织维持物质代谢平衡，同时还能提供一定的能量。干蜂的蛋白质含量21%～76%，活蜂的蛋白质含量11%～23%（约翰·布莱克，2007）。邓子龙等（2009）测得雄蜂蜂体干粉蛋白质含量为57.6%。本试验结果显示亚油酸对5、6日龄幼虫虫体蛋白浓度无显著影响，而对7日龄虫体影响显著，亚油酸添加量适中时，虫体蛋白浓度最高，添加量过高则会降低虫体蛋白浓度。成蜂试验结果表明，饲粮亚油酸水平对意蜂成蜂蛋白浓度影响显著，随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体蛋白浓度呈现先上升后下降的趋势，对照组蛋白浓度最低。亚油酸水平为1.05%和1.4%时，蜂体蛋白浓度最高，与对照组差异显著，0.35%、0.7%和1.75%组与对照组相比，蜂体蛋白浓度有升高的趋势。付世建等（2001）通过饲喂南方鲇不同蛋白质/脂肪比的饲料，发现提高饲料中脂肪含量将有助于提高蛋白质的利用效率，具有节约蛋白质的效果，同时向枭等（2009）研究结果证明日粮脂肪水平对翘嘴红鲌幼鱼蛋白质含量有显著影响，呈现出先上升后下降的趋势。以上这些研究的结果与本研究在蜜蜂幼虫上的结果相吻合，即低浓度亚油酸可以提高机体蛋白浓度，这可能是因为脂肪和蛋白质之间可以相互转化，而亚油酸浓度偏高时会对幼虫的生理机能产生负面影响，这可能在一定程34 山东农业大学硕士学位论文度上影响了蛋白质的代谢，所以高浓度亚油酸降低了虫体蛋白浓度。4.6饲粮亚油酸水平不影响意蜂抗氧化能力抗氧化是指抗氧化自由基的简称。生物体因为与外界的持续接触，包括呼吸（氧化反应）、外界污染、放射线照射等因素不断的在体内产生自由基。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。生物体在不可避免地产生自由基的同时，也在自然产生着抵抗自由基的抗氧化物质，以抵消自由基对体细胞的氧化攻击。研究证明，抗氧化系统是一个可与免疫系统相比拟的、具有完善和复杂功能的系统，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切关系，越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。杨小军等（2008）研究表明，日粮中添加鱼油和玉米油对抗氧化酶活性有不同程度的提高。在本研究幼虫试验中，饲粮添加不同水平的亚油酸对5日龄意蜂幼虫T-AOC有影响，0.04%组显著低于其他组；对T-SOD活性、6日龄和7日龄T-AOC无显著影响，表明亚油酸不具有提高幼虫抗氧化能力的作用，即在本试验条件下基础饲粮的亚油酸水平可以满足意蜂幼虫的抗氧化能力需要。在成蜂试验中，不同亚油酸水平对7日龄成蜂T-AOC无显著影响，各组之间无显著差异。14日龄时，蜂体T-AOC随着饲粮中亚油酸浓度的增加而变大，即T-AOC与饲粮中亚油酸浓度呈正相关，亚油酸添加量为1.75%时，蜂体T-AOC最高，与对照组差异显著，其他试验组与对照组相比，蜂体T-AOC有升高的趋势。4.7饲粮亚油酸水平影响意蜂PPARs和脂肪代谢相关酶活性或浓度尽管三种PPARs亚型的氨基酸序列相似，但研究表明PPARα和PPARγ分别在脂质代谢和储存中具有不同的功能(DELERIVEPetal.,1999)。PPARα主要在肝脏中表达，在饥饿状态下活化，通过调节涉及脂肪酸动员、活化和降解过程中的多种基因来提供能量，并起到降低血脂的作用(ISSEMANNIetal.1990;SHAODLetal.1998;LIHetal.1993;35 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究ABEDIHetal.1995)。PPARγ主要存在于脂肪组织，在生理状态下，PPARγ主要在进食后激活，促进脂肪在脂肪组织聚集(RICOTEMetal.1998;TANAKATetal.1999)。本试验结果显示，虫体的PPARs活性受饲粮亚油酸水平的影响，当亚油酸浓度升高到0.08%时，PPARα和PPARγ活性均显著高于对照组，整体上呈现上升的趋势。有研究证明，脂肪酸及其衍生物可以作为配体有效激活PPARs(KLIEWERSAetal.1995;KLIEWERSAetal.1997)。赵占宇(2008)通过在大黄鱼基础日粮中添加0%、1%、2%和4%的CLA，发现CLA（0.4g/kg.bw）能够显著提高大黄鱼肝脏中PPARα和PPARγ的基因表达量。另外，马宏峰(2007)也发现亚油酸可以促进高脂小鼠PPARγmRNA的表达。本试验在工蜂幼虫上的研究结果与前人在其他动物上的研究结果基本一致，说明适宜水平的亚油酸对意蜂幼虫PPARs同样具有激活作用。脂肪酸的饱和程度不同，对脂肪代谢相关酶的影响也不一样，影响强弱顺序从大到小依次是PUFA、MUFA和饱和脂肪酸（SFA）。本试验研究了日粮亚油酸对意蜂幼虫虫体FAS、ACC、CPT、MDH、G6PD和CYP450六种酶活性或浓度的影响，FAS是催化乙酰CoA和丙二酸单酰CoA合成脂肪酸的酶类，ACC是催化脂肪合成的限速酶，其活性的高低直接影响脂肪沉积量，CPT参与脂肪酸的-氧化，是脂酰CoA进入线粒体的限速酶，它们均在脂肪代谢方面发挥重要作用（陈强等，2006）。结果显示亚油酸在低浓度范围显著提高了幼虫虫体FAS、ACC、MDH和CYP450的活性或浓度，当亚油酸添加量过高时则会降低FAS、MDH和CYP450的活性或浓度，对CPT和G6PD活性无显著影响。在成蜂方面，不同亚油酸水平对FAS活性影响不显著。但随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体FAS活性呈现先上升后下降的趋势，对照组FAS活性最低。亚油酸水平为0.7%时，蜂体FAS活性最高，与对照组差异显著，0.35%、1.05%、1.4%和1.75%组与对照组相比，蜂体FAS活性有升高的趋势。不同亚油酸水平对ACC浓度影响显著。随着饲粮亚油酸水平的提高，蜂体ACC浓度呈现先上升后下降的趋势，对照组ACC浓度最低。亚油酸水平为0.35%到1.4%时，蜂体ACC浓度显著高于对照组，其中以0.35%组最高。1.75%组与对照组相比，蜂体ACC浓度有升高的趋势。Mersmann等(1973)在成年猪日粮中添加脂肪酸，降低了脂肪酸合成的速度和FAS、ACC、G6PD的活性。Toussant等(1981)用无脂肪、含红花油和牛脂的日粮喂大鼠，发现饲喂含红花油（主要为PUFA）日粮的大鼠FAS和ACC的活性显著低于饲喂含牛脂（主要为SFA）日粮和无脂肪日粮的大鼠。以上这些报道都认为PUFA对脂肪代谢相关酶有抑制作用，这与本试验结果略有差异，猜测可能是由于脂肪酸种类、添加量、测定的组36 山东农业大学硕士学位论文织部位和不同物种生理代谢的差异造成的。4.8饲粮亚油酸水平不影响意蜂脂肪代谢相关基因表达量近年来研究发现脂肪酸可以调控一些编码代谢关键酶的基因表达，对脂肪酸的生化合成和氧化起独特的调控作用。李琪玲等（2011）研究发现，连续给予小鼠灌胃共轭亚油酸(CLA)4周，发现饲喂CLA的小鼠肝脏中脂肪酸合成酶（FAS）含量显著降低；Zhou等（2007）、Pariza等（2000）也发现，CLA能抑制猪皮下脂肪FAS的表达，进而降低皮下脂肪沉积，但CLA对肌内脂肪FAS的表达却起到了促进作用，增加了肌内脂肪的沉积。另外，脂肪酸不仅对FAS的表达有影响，同时也可以调节乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的转录，Iritani等（1998）在培养的肝细胞中添加紫苏籽油（富含PUFA），ACCmRNA的丰度显著降低。这充分说明了脂肪酸不仅是供能物质和生物膜的重要组成部分，而且可通过调节脂肪代谢相关基因表达而发挥重要的生理功能。本试验中，亚油酸对FAS、ACC和G6PD基因mRNA相对表达量均无显著影响，一些试验已证明：受PUFA抑制的生脂酶包括FAS、ACC、G6PD、L-丙酮酸激酶和S14蛋白（呙于明，2004）。Blake等（1990）通过饲喂大鼠PUFA（鱼油）和饱和脂肪酸，发现饲喂鱼油的大鼠肝脏中FASmRNA丰度是饲喂饱和脂肪酸的6%，这说明了日粮PUFA是FASmRNA的强抑制剂。Clarke等（1990）研究发现日粮中多不饱和脂肪酸可使大鼠肝脏中的FASmRNA水平降低了75%~90%。韩立强等（2012）研究了CLA对小鼠乳腺脂肪合成相关基因表达的影响，发现1.5%CLA组(1.5%CLA+0.5%花生油)与对照组（2%花生油）相比，母鼠乳腺组织的FAS和ACC基因的mRNA表达量显著降低。但是李荣刚（2011）研究认为日粮亚油酸水平对断奶至3月龄生长肉兔的肝脏ACCmRNA表达量影响不显著，这与本试验结果一致。5总体结论、创新点及后续工作展望5.1总体结论1、饲粮中不同亚油酸水平影响蜜蜂幼虫的化蛹率和成蜂存活率，对幼虫化蛹时体重和成蜂平均日采食量无显著影响。37 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究2、饲粮中不同亚油酸水平影响意蜂总蛋白浓度、脂肪代谢和成蜂抗氧化能力。3、根据拟合曲线结果，得出在人工饲养条件下，意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中亚油酸的适宜添加水平为0.024%-0.037%；成蜂饲粮中亚油酸的适宜添加水平为0.94%～1.07%。5.2创新点本试验在成功建立了室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术体系的基础之上，在生产性能、生理生化和分子生物学3个水平上，对意大利蜜蜂幼虫饲粮中亚油酸的适宜添加水平及亚油酸对幼虫生长发育和脂肪代谢的影响进行了研究；同时，也采用了笼养技术研究了亚油酸对蜜蜂成蜂生长发育和脂肪代谢的影响。本试验研究了从蜜蜂从1日龄幼虫到成蜂自然死亡的整个生命过程，为室内人工饲养幼虫、蜜蜂饲粮的配制以及蜜蜂营养需要量的制定和人工饲粮的研制提供了一定的科学理论依据。5.3后续工作展望本试验只对幼虫、成蜂的基本生理生化变化、基因的mRNA相对表达量进行了研究分析，需要进一步分析其作用机理及相互影响，有研究表明，亚油酸可以通过PPAR来调控脂肪代谢相关基因的表达，接下来可以饲喂蜜蜂PPAR的激活剂，测定某些基因表达量是否有变化，来验证亚油酸调控基因表达的通路。此外，成蜂是在室内恒温恒湿培养箱中饲养的，并不能完全代表自然条件下工蜂的状态，需要以自然大群饲养试验进一步研究。38 山东农业大学硕士学位论文参考文献陈强,赖桦,李长强,等.猪脂肪代谢及其调控[J].云南农业大学学报,2006,21(5):635-640.陈盛禄.中国蜜蜂学[M].中国农业出版社,2001.陈晓伟,刘玉升,张萍,干小英.4种昆虫营养成分分析[J].饲料研究.2011，12:80-82.成永旭,严生良,王武,等.饲料中磷脂和多不饱和脂肪酸对中华绒螯蟹大眼幼体育成仔蟹的成活率和生长的影响[J].水产学报,1998,22(1):9-15.邓子龙，付桂明，谢明勇，等.雄蜂蜂体主要营养成分分析与评价.食品科学，2009，29（9）：560～563.付世建,谢小军,张文兵,等.南方鲇的营养学研究:饲料脂肪对蛋白质的节约效应[J].水生生物学报,2001,25(1):70–75.冯倩倩，胥保华，李成成，杨维仁.维生素A对蜜蜂群势、封盖子量及抗氧化性的影响[J].动物营养学报,2011,23(6):971-975.高淳仁,梁亚全,刘庆慧,等.饲料中不饱和脂肪酸对斑节对虾幼虾存活、蜕皮和生长的影响[J].中国水产科学,1997,4(1):75-79.韩立强,郭豫杰,鲁维飞,等.共轭亚油酸对小鼠乳腺脂肪合成相关基因表达的作用研究[J].营养学报,2012,34(1):68–73.李琪玲,王武,章立新.CLA对小鼠的减肥作用[J].食品科学,2011,32(21):229–232.李广宏,陈其津,庞义.甜菜夜蛾人工饲料的研究[J].中山大学学报:自然科学版,1998,37(4):1-5.李荣刚.日粮亚油酸水平对生长肉兔生长性能、组织脂肪酸构成及脂质代谢的影响[D].硕士学位论文.泰安:山东农业大学,2011.李荣刚,麻名文,王春阳,等.日粮添加亚油酸对断奶至2月龄肉兔生长性能免疫指标及脂质代谢的影响[J].中国兽医学报,2011,31(11):1676-1680.李成成,杨维仁,胥保华,冯倩倩.蜜蜂生长发育适宜蛋白供给水平及其对幼虫抗氧化活性的影响[J].中国农业科学,2011,44(22):4714-4720.刘光芒,吴德,何祖锋.共轭亚油酸对肉鸭生产性能与屠体性状的影响研究[J].中国畜牧兽医,2005,32(11):3–5.39 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究刘晓庚，廖晓峰，徐明生，陈梅梅.昆虫油脂及其功能性成分开发利用研究[J].粮食与油脂.2002，2:24-27.吕丽萍，石巍，张秀琳，等.蜜蜂的营养要求和蜜蜂饲料的配制.中国蜂业，2006，57(4):19～20马兰婷,王颖,胥保华.蜂花粉中的脂类对蜜蜂的作用[J].动物营养学报,2011,24(9):1643-1646.马宏峰.亚油酸对高脂小鼠脂质代谢的影响及其机制研究[D].硕士学位论文.合肥:合肥工业大学,2007.王海川,尤民生.绿僵菌对昆虫的入侵机理[J].微生物学通报,1999,26(1):71-73.汪礼国.蜜蜂营养初探[J].蜜蜂杂志.1985,3：42-43.汪灏,黎介寿.ω-3多不饱和脂肪酸对免疫细胞功能的影响[J].肠外与肠内营养,2004,11(5):304~308.王菊花,薛秀恒,刘光林,等.共轭亚油酸对断奶仔猪生产性能及免疫的影响[J].中国饲料,2006(2):22–27.王荫长.昆虫生理学[M].中国农业出版社，2004.王延年，郑忠庆，周永生等.昆虫人工饲料手册[M].上海：科学技术出版社，1984.王渊源,蒋绍霞,陈桥.长毛对虾对不饱和脂肪酸需求量的初步研究[J].水产学报,1997,21(4):380-385.呙于明.家禽营养[M].2版.北京:中国农业大学出版社,2004.向袅，周兴华，陈建，等.日粮脂肪水平对翘嘴红鲌幼鱼生长性能和体组成的影响[J].动物营养学报，2009，21（3）：411-416.徐盛玉,吴德.脂肪酸对基因表达的影响及调控[J].饲料工业,2007,28(5):16~19.颜新春,汪以真,许梓荣.日粮中多不饱和脂肪酸(PUFA)对动物基因表达和脂肪细胞分化的调节[J].饲料研究，2001，2：4~5.杨凤．动物营养学[M]．中国农业出版社，2006．杨小军，贺喜，何丽霞，等.日粮添加多不饱和脂肪酸对肉仔鸡抗氧化指标的影响[J].动物营养学报，2008，20（3）：299-304.于昱,袁缨.多不饱和脂肪酸的营养研究[J].中国饲料,2003,24:21~23.约翰·布莱克.蜜蜂的营养.中国蜂业,2007，58（8）:44～46.邹继红.昆虫饲料的开发与应用[J].现代畜牧兽医.2008,9:51-53.40 山东农业大学硕士学位论文朱保忠，李琳.α-亚麻酸与抗氧化剂联用对果蝇寿命及小鼠抗氧化能力的影响[J].基础医学.2008,12（7）：1264-1267.张复兴.现代养蜂生产[M].中国农业大学出版社,1998.张永刚,印遇龙,黄瑞林等.多不饱和脂肪酸的营养作用及其基因表达调控[J].中国饲料,2006,13:9~12.曾志将.养蜂学[M]．中国农业出版社，2009．周冰峰.蜜蜂饲养管理学[M].厦门:厦门大学出版社,2002,11-101.周洪琪,顾功超.中国对虾幼体的能量代谢[J].水产学报,1992,16(2):167-170.赵占宇.共轭亚油酸(CLA)对大黄鱼脂肪代谢、免疫、肉品质及PPAR基因表达的影响[D].博士学位论文.杭州:浙江大学,2008.赵法及,郭俊生.分子营养学概述.营养学报,2006,28(1):1~3.ABEDIH,ZACHARYI.Signallingmechanismsintheregulationofvascularcellmigation[J].CardiovascularResearch,1995,30(4):544–556.BLAKEWL,CLARKESD.SuppressionofrathepaticfattyacidsynthaseandS14genetranscriptionbydietarypolyunsaturatedfat[J].TheJournalofNutrition,1990,120(12):1727–1729.BochR.Relativeattractivenessofdifferentpollenstohoneybeeswhenforaginginaflightroomandwhenfedinthehive[J].JournalofApiculturalResearch,1982,21:104-106.BryantT.G.Springpollenfeeding[J].NewZealandBeekeeper,1982,43(2):23-24.CLARKESD,HEMBREEJ.Inhibitionoftriiodothyronine"sinductionofratliverlipogenicenzymesbydietaryfat[J].TheJournalofNutrition,1990,120(6):625–630.Clarke.Polyunsaturatedfattyacidregulationofgenetranscription:amechanismtoimpromentenergybalanceandinsulinresistance[J].BrJNutr,2000,83:59～66.ClarkeSD,JumpDB.DietarypolyunsaturatedfatsuniquelysuppressratliverfattyacidsynthaseandS14mRNAcotent[J].Nutr,1993,120:225～231.Dadd,R.H.InsectNutrition:currentdevelopmentsandmetabolicimplications[J].AnnualReviewsinEntomology,1973,18:381-420.DELERIVEP,DEBOSSCHERK,BESNARDS,etal.Peroxisomeproliferator-activatedreceptorαnegativelyregulatedthevascularinflammatorygeneresponsebynegativecross-talkwithtranscriptionfactorsNF-κBandAP-1[J].TheJournalofBiological41 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究Chemistry,1999,274(45):32048–32054.DobsonH.E.M.,PengY.S.Digestionofpollencompoundsbylarvaeoftheflower-specialistbeeChelostomaflorisomne(Hymenoptera:Megachilidae)[J].JournalofInsectPhysiology,1997,43:89-100.DonkinSS,ChiuPY,YinD,LouveauI,SwenckiB,VockrothJ,Evock-CloverCM,PetersJL,EthertonTD.DoullK.M.Therelativeattractivenesstopollen-collectinghoneybeesofsomedifferentpollens[J].JournalofApiculturalResearch,1966,5:9-14.GustafssonJA.Fattyacidsincontrolofgeneexpression[J].Nutr.rev.,1998,56:20～21.HerbertE.W.,ShimanukiH.,ShashaB.S.Broodrearingandfoodconsumptionbyhoneybeecoloniesfedpollensubstitutessupplementedwithstarch-encapsulatedpollenextracts[J].JournalofApiculturalResearch,1980,19:115-118.HerbertE.W.,SvobodaJ.A.,ThompsonM.J.,ShimanukiH.Sterolutilizationinhoneybeesfedasyntheticdiet:Effectsonbroodrearing[J].JournalofInsectPhysiology,1980,26:287-289.HopkinsC.Y.,JevansA.W.Occurrenceofoctadeca-trans-2,cis-9,cis-12-trienoicacidinpollenattractivetothehoneybee[J].CanadianJournalofBiochemistry,1969,47:33-436.IRITANIN,KOMIYAM,FUKUDAH,etal.Lipogenicenzymegeneexpressionisquicklysuppressedinratsbyasmallamountofexogenouspolyunsaturatedfattyacids[J].TheJournalofNutrition,1998,128(6):967–972.ISSEMANNI,GREENS.Activationofanumberofthesteroidreceptorsuperfamilybyperoxisomeproliferators[J].Nature,1990,347(6294):645–650.KanazawaA,TeshimaSI,SakamotoM.Effectsofdietarylipids,fattyacidsandphospholipidsongrowthandsurvivalofprawn(Penaeusjaponicus)larvae[J].Aquac,1985,50:39-49.KLIEWERSA,LENHARDJM,WILLSONTM,etal.AprostaglandinJ2metabolitebindsperoxisomeproliferator-activatedreceptorγandpromotesadipocytedifferentiation[J].Cell,1995,83:813–819.KLIEWERSA,SUNDSETHSS,JONESSA,etal.Fattyacidsandeicosanoidsregulategeneexpressionthroughdirectinteractionswithperoxisomeproliferator-activatedreceptors42 山东农业大学硕士学位论文alphaandγ[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997,94(9):4318–4323.KobatakeK,SakoK,IzawaM,etal.AutoradiographicdeterminationofbrainpHfollowingmiddlecerebralarteryocclusionintherat[J].StrokeMay,1984,15:540～547.LepageM.,BochR.Pollenlipidsattractivetohoneybees[J].Lipids,1968,3:530-534.LevinM.D.,BohartG.E.Selectionofpollensbyhoneybees[J].AmericanBeeJournal,1955,402(95):392-393.LIH,CYBULSKYMI,GIMBRONEMAJ,etal.AnatherogenicdietrapidlyinducesVCAM-l,acytokine-regulatatablemononuclearleukocyteadhesionmolecule,inrabbitaorticendothelium[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology,1993,13(2):197–204.ManningR.,RutkayA.,EatonL.,DellB.Lipid-enhancedpollenlipid-reducedflourdietsandtheireffectonthelongevityofhoneybees(ApismelliferaL.).AustralianJournalofEntomology,2007,46,251-257.Manning,R.Fattyacidsinpollen:areviewoftheirimportanceforhoneybees[J].BeeWorld,2001,82:60-75.MathesonA.Autumnpollenfeeding[J].TheNewZealandBeekeeper,1982,43(1):27-29.McFarland,J.E.,Nutritionanddigestiveorgans.In:M.S.Blum(Ed),FundamentalsofInsectPhysiology.JohnWiley＆Sons,NewYork.1985,58-89.MERSMANNHJ,SHAACKELFORDSD,HAYDENKD.Lipogenesisbyinvitroliverandadiposetissuepreparationsfromneonatedswine[J].AmericanJournalofPhysiology,1973,224:1123–1129.MontañoM,NavarroJC.FattyacidofwildandculturedPenaeusvannameilarvaefromEcuador[J].Aquac,1996,142:259-268.NationJ.Insectphysiologyandbiochemistry[M].CRCPress,BocaRaton,Florida,USA,2002.NakamuraMT,ChoHP,ClarkeSD.Regulationofdelta26desaturaseexpressionanditsroleinthepolyunsaturatedfattyacidinhibitionoffattyacidsynthasegeneexpressioninmice[J].JNutr,2000,130:1561～1565.Pandey,D.K.,Tripathi,R.N.,Tripathi,etal.Fungitoxicologyinpollengrains[J].Grana,1983,43 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究22:31-33.PARIZAMW,PARKY,COOKME.Mechanismsofactionofconjugatedlinoleicacid:evidenceandspeculation[J].ProceedingsoftheSocietyforExperimentalBiologyandMedicine,2000,223(1):8–13.RemboldH.,KramerJ.P.,UlrichG.M.Characterizationofpostembryonicdevelopmentalstagesofthefemalecastesofthehoneybee,ApismelliferaL.[J].Apidologie,1980,11:29-38.RICOTEM,LIAC,WILLSONTM,etal.ThePPARgammaisanegativelyregulatorofmacrophageactivation[J].Nature,1998,391(6662):79–82.RobManning,AprilRutkay,LindaEaton,etal.Lipid-enhancedpollenlipid-reducedflourdietsandtheireffectonthelongevityofhoneybees(ApismelliferaL.)[J].AustralianJournalofEntomology,2007,46,251-257.Schmidt,J.O.,Thoenes,S.C.,Levin,M.D.Survivalofhoneybees,Apismellifera(Hymenoptera:Apidae),fedvariouspollensources[J].AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica,1987,80:176-183.SHAODL,RANGWALASM,BAILLYST,etal.InterdomaincommunicationregulatingligandbindingbyPPAR-γ[J].Nature,1998,396(6709):377–380.SinghS.,SainiK.,JainK.L.Quantitativecomparisonoflipidsinsomepollensandtheirphagostimulatoryeffectsinhoneybees[J].JournalofApiculturalResearch,1999,38:87-92.TANAKAT,ITOHH,DOIK,etal.Downregulationofperoxisomeproliferator-activatedreceptorγexpressionbyinflammatorycytokineanditsreversalbythiazolidinediones[J].Diabetologia,1999,42(6):702–710.ThrasyvoulouA.T.,BentonA.W.Ratesofgrowthofhoneybeelarvae[J].ApicRes,1982,21:189-192.TOUSSANTMJ,WILSONMD,CLARKESD.Coordinatesuppressionofliveracety1-CoAcarboxylaseandfattyacidsynthetasebypolyunsaturatedfat[J].TheJournalofNutrition,1981,111(1):146–153.UWAYJANMG,AZAREJ,DAGHIRNJ.Sunflowerseedinlayinghenrations[J].PoultryScience,1983,62(7):1247–1253.44 山东农业大学硕士学位论文XuJing,MargaritaTeran-Garcia,JungHY,etal.Polyunsaturatedfattyacidssuppresshepaticsterolregulationelementbindingprotein-1expressionbyaccelerationtranscriptdecay[J].Biol.Chem.2001,276:9800~9807.ZHOUX,LIDF,YINJD,etal.CLAdifferentlyregulatesadipogenesisinstromalvascularcellsfromporcinesubcutaneousadiposeandskeletalmuscle[J].JournalofLipidResearch,2007,48(8):1701–1709.45 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究致谢岁月如梭，如歌。转眼间，三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与欢笑也都尘埃落定。农大以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的情怀胸襟、浪漫充实的校园生活育我成人。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。本论文是在导师胥保华教授的悉心指导之下完成的。三年来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。导师不仅授我如何做学问，而且教我为人处事，待人接物的道理，虽历时三载，却赋予我终生受益无穷之道。本论文从选题到完成，几易其稿，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血，在此我向我的导师胥保华教授表示深切的谢意与祝福!感谢山东农业大学动物科技学院领导和老师们的关怀和支持，师恩难忘，永记于心。在开题和课题实施过程中，感谢动物营养系王中华教授、林海教授、杨在宾教授、李福昌教授等老师给予的帮助、关心和建议；在试验过程中感谢师兄师姐——刘峰、孙汝江、王颖、马兰婷、吴在富、张怡丁、杭晓波、张鸽，同级同学——赵凤奎、李肖、董文斌，师弟师妹——张卫星、苏中渠、崔学沛、徐鹏、雷春红、王丽等对我试验的大力帮助。回想整个论文的写作过程，虽有不易，却让我除却浮躁，经历了思考和启示，也更加深切地体会了科研的精髓和意义，因此倍感珍惜。感谢含辛茹苦抚养我、仍在辛苦劳作的父母，正是他们无私的奉献和支持，使我走完了这十多年的求学生涯，正是他们殷切的目光和期望推动着我战胜挫折、不断前进。最后，再次感谢导师胥保华教授对我的培养，我还要向前面未能提到的关心、支持和帮助我的各位同仁、同学和朋友致以最衷心的感谢！祝所有老师、同学、朋友及家人们幸福快乐、平安一生。王圣伟2015年6月46 山东农业大学硕士学位论文攻读学位期间发表论文情况（1）王圣伟，胥保华，王红芳.意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中亚油酸的适宜添加水平[J].动物营养学报，2015，27（5）：1440-1449.47 意大利蜜蜂工蜂幼虫和成蜂饲粮中亚油酸适宜添加水平的研究项目资助本研究由国家蜂产业技术体系建设专项资金(No.CARS-45)和山东省农业良种工程项目“优质高产蜜蜂及蚕桑新品种培育”（2014-2016）资助。48