乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响 43页

＇、．祗ｉ賴扔跟豁，，毒，鮮一词腎一－？、獅；．，沸黎？辕子气觀：觀據一．—．―爲着＾４‘‘’＾．．、，ｒｓ幾＾韻嫌游顏葡套荒．鉛：ｒ、＇－．—Ｖ‘）．Ｖ．．／分类号８２６：；巧予学位单位代码：１Ｍ３４：餐：Ｓ础：難識猿巧读ｈ：心：１－？—ｗ々絮欠巧．、乂；心滅擺辑為攝；雜、、、。＾．．知铺画誦全日制硕±专业学位论义麵’＇：：識，爆蘇養鑛靜．於議冷＂，ｉ、‘、：斬＇；乳酸杆菌和巧草芽巧巧菌对意大利蜜蜂生长发育和二三免疫指禄的影响ｎｄ７／ｓｖｅｍｅｎｔ、ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｊＬａｃ化ＡａｃＷｗａ巧ａｃＷｆｆＳｉＳ？Ａ々ｏｎＤｅｌｏｐａｎｄ结、产Ｆｕｎ？ＩｍｍｕｎｅｃｔｉｏｎｓｏｆＨｏｎ巧Ｂｅｅｓ（／４ｐｉ＞ｙ／ｗｅ巧向＂厶），记；蹲；，．議棘屬＇感、、Ｉ师、－、．，＾＾料澈，巧癒藤約知沁：辑读—．．．巧：制動載、．名■雅淺薄瞧遠专业类别：农业推广３－５１；驚Ｖ＾．；，Ａ賴知灣、？．’、．晴．研巧方向：单焉动妨舍ｒ禱冀讀殘■＇■■■、■＞－■；；：指导教师：胥保华微；．：：。：：；統巧巧雞紙＇‘‘ｔ料．翁纖Ｃｉ；．於？ｐ焉纔魄？輪＾。：義种＾＾ｔｉｇ 关于学位论文原创性和使用授权的声明，本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名；方＾＾导师签名：化兮Ｊ。‘日期；Ｕ 论文提交日期：2015.04.28论文答辩日期：2015.06.09学位授予日期：2015.06学科门类：农业推广答辩委员会主席：单安山 符号说明缩写英文名称中文名称CPCrudeprotein粗蛋白GEGrossenergy总能ROSReactiveoxygenspecies活性氧2-OSuperoxideanion氧自由基H2O2Hydrogenperoxide过氧化氢SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶CATCatalase过氧化氢酶GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽S-转移酶GSHGlutathione谷胱甘肽MDAMalondialdehyde丙二醛POPhenoloxidase酚氧化酶proPOProphenoloxidase酚氧化酶原 目录中文摘要...............................................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................................II1前言....................................................................................................................................11.1益生菌的发展现状.............................................................................................................11.1.1益生菌的概念..................................................................................................................11.1.2饲用益生菌的作用机理...................................................................................................11.1.2.1刺激免疫反应................................................................................................................11.1.2.2维持正常的肠道菌群....................................................................................................11.1.2.3参与代谢，促进营养物质的吸收...............................................................................21.1.3枯草芽孢杆菌的研究概况..............................................................................................21.1.4乳酸杆菌的研究概况......................................................................................................21.1.5益生菌在蜜蜂上的应用..................................................................................................31.2蜜蜂的消化生理.................................................................................................................41.2.1蜜蜂的消化道..................................................................................................................41.2.2蜜蜂的消化酶..................................................................................................................41.2.3蜜蜂的肠道微生物..........................................................................................................51.2.3.1蜜蜂肠道正常菌群.......................................................................................................51.2.3.2蜜蜂肠道的致病菌.......................................................................................................51.3蜜蜂防御病原菌的机制......................................................................................................61.3.1体壁防御..........................................................................................................................61.3.2活性氧防御......................................................................................................................61.3.3抗菌肽..............................................................................................................................71.4本研究的目的和意义..........................................................................................................72材料与方法............................................................................................................................82.1试验材料.............................................................................................................................82.2试验设计与饲养管理.........................................................................................................92.3测定指标及方法.................................................................................................................92.3.1蜂群的采食量..................................................................................................................92.3.2日粮中蛋白质的消化率..................................................................................................9 2.3.3蜜蜂消化酶活性的测定.................................................................................................102.3.4头胸部的蛋白质浓度....................................................................................................102.3.5头胸部的抗氧化性........................................................................................................102.3.6中肠形态学指标............................................................................................................112.3.7基因表达定量检测........................................................................................................112.3.7.1蜜蜂总RNA的提取和检测.......................................................................................112.3.7.2cDNA的合成..............................................................................................................122.3.7.3实时荧光定量PCR分析...........................................................................................132.3.6.3.1引物及反应条件的确定..........................................................................................132.3.7.3.2实时荧光定量PCR检测基因表达水平................................................................132.4数据处理...........................................................................................................................133结果与分析..........................................................................................................................143.1不同益生菌对不同日龄蜜蜂采食量的影响....................................................................143.2不同菌种对蜜蜂存活率的影响.......................................................................................153.3不同菌种对不同日龄蜜蜂日粮蛋白质消化率的影响...................................................153.4不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响...............................................163.5不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部抗氧化能力的影响...............................................163.5.1不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸SOD活性的影响..................................................163.5.2不同日龄和不同菌种饲粮对蜜蜂头部MDA的影响..................................................173.5.3不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部T-AOC的影响...................................................173.6不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠胰蛋白酶活性的影响...............................................183.7不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响...........................................193.8不同菌种对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响...........................................................204讨论......................................................................................................................................214.1益生菌影响意蜂的采食量...............................................................................................214.2益生菌影响意蜂的肠道发育...........................................................................................224.3益生菌影响蜜蜂的寿命和抗氧化能力...........................................................................224.4益生菌制剂影响蜜蜂的消化酶活性和体蛋白浓度.......................................................234.5益生菌制剂影响蜜蜂的蛋白消化率...............................................................................244.6益生菌影响免疫相关基因的表达...................................................................................24 5总体结论、创新点及展望..................................................................................................255.1总体结论...........................................................................................................................255.2本研究的创新点...............................................................................................................255.3存在的不足及进一步解决的问题...................................................................................25参考文献............................................................................................................................27致谢................................................................................................................................32基金资助............................................................................................................................33 中文摘要使用益生菌制剂对于维护蜜蜂肠道菌群平衡、保持蜜蜂健康具有重要作用。不同的益生菌对蜜蜂的肠道发育和饲料利用效果不同。本研究选用了两种具有代表性的益生菌制剂——乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌，探究饲喂益生菌制剂对意大利蜜蜂采食量、蛋白消化率、中肠围食膜厚度、组织抗氧化能力和免疫性能的影响，以期为蜂用益生菌制剂的选择提供参考。本试验从姐妹蜂王群中取新出房（1日龄）的意蜂3600只，随机分为3个处理组，每组4个重复，每个重复60只蜜蜂。试验Ⅰ组为对照组，饲喂普通油菜花粉，试验Ⅱ88组和Ⅲ组饲喂分别添加了1×10cfu/kg乳酸杆菌制剂和1×10cfu/kg枯草芽孢杆菌制剂的油菜花粉，为试验组。整个试验期30天，期间均保证糖浆（50%蔗糖溶液）和水的充足供应。于试验的第3、6、9天取样，测定存活率，采食量，蛋白消化率，中肠酶活性，抗氧化能力，免疫相关基因表达量等指标并进行分析。结果表明：（1）油菜花粉中添加乳酸杆菌制剂和枯草芽孢杆菌制剂对存活率无显著影响（P＞0.05），但饲喂添加了乳酸杆菌的花粉能显著提高工蜂在6日龄的采食量。（2）在第3、6、9日龄，试验组相较对照组蜜蜂头胸部蛋白浓度、T-SOD活性显著提升（P＜0.05），MDA活性显著下降（P＜0.05），T-AOC活性在第3、6、9日龄均差异显著（P＜0.05）。（3）试验组相较对照组蛋白消化率没有显著差异（P＞0.05），提示饲料中添加益生菌对蛋白消化率没有影响。（4）肠壁厚度显著增加、隐窝深度降低、围食膜厚度增加（P＞0.05），试验组蜜蜂中肠发育情况优于对照组。（5）在第9日龄，油菜花粉中添加枯草芽孢杆菌制剂和乳酸杆菌制剂均能显著提高Abeacin和Defense两个抗菌肽基因的mRNA表达量（P＜0.05）,酚氧化酶原PPO基因的表达量降低（P＜0.05）。本研究表明，乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌制剂能够促进意大利蜜蜂的生长发育，提高蜜蜂消化酶的活性，提高机体的抗氧化能力，提高两个抗菌肽基因和酚氧化酶原基因的mRNA表达量。关键词：乳酸杆菌；枯草芽孢杆菌；意大利蜜蜂；中肠发育；免疫I EffectsofLactobacillusandBacillusSubtilisonDevelopmentandImmuneFunctionsofHoneyBees（ApismelliferaL.）AbstractProbioticshasbecomearesearchhotspotoffeedadditiveswiththecharacteristicsofsafety,highefficiency.Atpresent,theresearchofprobioticsonItalybeeisrare.Thisstudyselectedprobioticsintworepresentative:LactobacillusandBacillussubtilis,toexplorethemechanismofactionofprobioticsinItalybee.Inordertoprovidereferenceforthefurtherdevelopmentofbeefeedadditive.Probioticshasbecomearesearchhotspotoffeedadditiveswiththecharacteristicsofsafet,highefficiency.Atpresent,theresearchofprobioticsonItalybeeisrare.Thisstudyselectedprobioticsintworepresentative:LactobacillusandBacillussubtilis,toexplorethemechanismofactionofprobioticsinItalybee.Inordertoprovidereferenceforthefurtherdevelopmentofbeefeedadditive。ThisexperimentwasconductedtostudytheeffectsofLactobacillusandBacillussubtilisongrowthandimmuneindexofItalybee.ThetestgroupfromsisterqueenfromthenewApismelliferawererandomlydividedinto3treatmentgroupsofhousing,with4replicationspergroup,60chickensineachreplicateofbees.Onetreatmentgroupascontrolgroup,fedwithnormalrapepollen,1*108cfuofLactobacillusandBacillussubtilis1*108cfupreparationofrapepollenbyaddingothertwotreatmentgroupswerefedrespectively,bothtoensureadequatesupplyofsugarandwater.Determinationofthesurvivalrate,feedintake,proteindigestibility,intestinalenzymeactivity,antioxidantability,expressionofimmunerelatedgenesandotherindicators.Determinationofproteindigestibilityinhoneybeeswerefeddietsaftertestinthemidgutofthechymeevacuationtimebasedonthe.Theresultsshowedthat:(1)addingLactobacillusandBacillussubtilishadnosignificanteffectonsurvivalrateinrapepollen,butpollenweresupplementedwithlactobacilluscansignificantlyimprovetheworkerattheageof6daysonfeedintake.(2)inthird,6,9days,experimentalgroupcomparedwiththedifferencebetweenthetwogroupsofbeesheadchestproteinconcentration,T-SODactivity,MDAactivitywerethecontrol(P<0.05).ButtheactivityofT-AOCat6daysofagehadnosignificantdifference(P>0.05),significantdifferencesinthe3,9daysofage(P<0.05).(3)theexperimentalgroupcomparedwithcontrolgrouptheproteindigestionratehadnosignificantdifference(P>0.05).(4)theexperimentalgroupcomparedwiththecontrolgroupthemidgutdevelopmentbetter,bowelwallthicknessincreasedsignificantly,anddecreasethecryptdepth,theperitrophiII cmembranethicknessincreased(P<0.05).(5)atninthdaysofage,rapepollenaddingBacillussubtilisandLactobacilluscouldsignificantlyincreasetheAbeacin,DefenseoftwoantimicrobialpeptidegeneexpressionofmRNA(P<0.05).ExpressionofprophenoloxidasegenePPOdecreased(P<0.05).Thisstudyshowsthat,LactobacillusandBacillussubtilispreparationcanpromotethegrow-thanddevelopmentofItalybeebee,improvetheactivityofdigestiveenzymes,enhancethebody"santioxidantability,stimulatetheimmunesystemofbees.Keywords:Probiotics；Lactobacillus；BacillusSubtilis；ApismelliferaL.；MidgutDevelopment；ImmunefunctionIII 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言1.1益生菌的发展现状1.1.1益生菌的概念益生菌的概念随着研究的不断进展在不断的变化。1989年，Fuller将益生菌定义为能够改善肠道微生物平衡，而对动物产生有利影响的活的微生物制剂。随着科学研究的深入，益生菌的研究不断发展。2001年，联合国粮农组织世界卫生组织(FAO/WHO)将益生菌定义为“摄入量足够时对机体产生有益作用的活性微生物”。益生菌的种类很多，目前比较常用的是我国农业部2008年公布的16种饲料微生物添加剂。1.1.2饲用益生菌的作用机理1.1.2.1刺激免疫反应益生菌是一种很好的免疫增强剂，能够有效的刺激机体的免疫系统。在哺乳动物的研究中，许多结果都能够证明益生菌能够刺激机体的免疫系统。2012年，边连泉等发现饲喂仔猪一定量的枯草芽孢杆菌能够提高日增重，增强仔猪的体液免疫功能和免疫器官的发育。Inook的研究也表明以一定剂量的枯草芽孢杆菌饲喂雏鸡能够显著提高T淋巴细胞的数量。哺乳动物和昆虫对于病原菌的免疫识别系统是相对保守的（KangD，1998）。Basset等研究发现以胡萝卜软腐欧式杆菌饲喂果蝇，能够刺激果蝇的免疫系统。Evans等研究发现饲喂乳酸菌制剂能够刺激意大利蜜蜂的免疫系统，上调酚氧化酶原基因的表达。1.1.2.2维持正常的肠道菌群在胃肠道的微生态系统中，优势菌群占据着主导地位，维持着正常的肠道菌群。益生菌作为动物肠道的优势菌群，可以弥补正常菌群的数量，同时通过竞争排斥的机理有效的抑制致病菌的生长，调节肠道菌群的平衡。Chamber研究发现，益生菌通过与病原菌竞争营养物质和着附位点，从而排斥病原菌的生长。Giang等研究发现，益生菌能明1 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响显改良仔猪腹泻，减少了粪样中的大肠杆菌数。Forsgren等通过琼脂平板试验和幼虫生物测定抑制实验探究蜜蜂肠道内的乳酸菌对幼虫芽胞杆菌的抑制作用。1.1.2.3参与代谢，促进营养物质的吸收益生菌对于昆虫的营养贡献已经有了初步研究。益生菌对昆虫的营养贡献包括:对大分子的碳水化合物具有分解作用;促进碳氮营养的吸收,帮助合成维生素等等（WenzelM,2002）。在许多种昆虫肠道中都曾分离到降解难溶大分子物质如纤维素、木聚糖等的细菌。在白蚁和鳞翅目昆虫肠道微生物基因组中发现了多种木聚糖酶基因（KlnigHJ,2006)。金汤东等研究发现EM制剂能提高意大利蜜蜂的胰蛋白酶活性。1.1.3枯草芽孢杆菌的研究概况枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，能够产生芽孢，相比于其他益生菌种有易于分离和培养，利于保存和运输，抗不利环境因素能力强等优点，是优良的益生菌品种。枯草芽孢杆菌通过芽孢在动物肠道内增殖而起作用，1980年，Hisanga首次证实芽孢可在兔子胃肠道中萌发，Casula通过检测只在枯草芽孢杆菌生长阶段表达的ftsH基因的方法最终证明芽孢可以在动物肠道中萌发。Duc用大鼠作为试验动物，证明芽孢可以穿过肠黏膜屏障，转移到了肠系淋巴结。芽孢的转移能够有效的刺激机体的免疫反应，是益生菌的重要作用机理。枯草芽孢杆菌的芽孢能够代谢产生一些抗菌物质，如枯草菌素（Subtilin）和凝结素（Coagulin），也有一些抗生素类的物质，如表面抗菌肽（Surfactin），伊枯草菌素A（IturinsA）和溶杆菌素（Bacilysin）等。枯草芽孢杆菌在畜禽上的研究很深入，Fritts使用枯草芽孢杆菌饲喂肉鸡，结果表明21d后体增重明显提高，并降低了需氧性大肠杆菌数。Samanya等使用枯草芽孢杆菌饲喂小鸡，结果表明能提高小鸡的采食量和食物利用率，显著提高十二指肠和回肠的绒毛长度。边连全等使用枯草芽孢杆菌饲喂仔猪，结果表明显著提高了日增重，提高机体的体液免疫功能。但是，对于枯草芽孢杆菌的具体作用机理的探究尚未展开，限制了枯草芽孢杆菌作为益生菌制剂的大规模应用。1.1.4乳酸杆菌的研究概况乳酸杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸命名。它是一群杆状或球状的革兰2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文氏阳性菌，一般为0.5~1.0μm宽，2.0~10.0μm长，微好氧或厌氧，嗜酸性，最适pH为4~6。目前已分离出40多种乳酸杆菌。乳酸杆菌的益生作用主要体现在以下几个方面：1提高机体的免疫功能。乳酸杆菌可通过非特异性免疫来具有早期的抗感染作用，特别是可以增强巨噬细胞功能，还可以增强黏膜的屏障功能，控制炎症反应强度；并可以刺激机体特异性免疫，增加血清或黏膜中的lgA、lgG、lgM水平，促进B、T两种淋巴细胞的成熟，增强细胞免疫，从而提高肠道抗病力，抵抗疾病。2生物拮抗效应。拮抗效应有着以下几个方面：首先表现在对营养物质的竞争，营养物质竞争的位置处于小肠上皮细胞，乳酸杆菌是肠道内优势菌种，有限利用小肠食糜的营养物质，限制了有害菌群的繁殖。其次是对吸附部位的竞争，无论是致病菌还是乳酸杆菌均都是吸附在黏膜上皮后才能发挥作用，部分致病菌因有益菌与黏膜上皮紧密结合而被排斥在外。再次乳酸杆菌分泌的细菌素也可以发挥杀菌作用。3提供营养物质。很多研究显示某些谷物经乳酸菌发酵后营养价值大幅提高。如果乳酸菌在机体内正常代谢，可为宿主提供部分必需氨基酸和维生素，增强动物营养代谢，促进动物生长。乳酸杆菌在畜禽上已经得到了广泛的应用，作为猪肠道优势菌群之一，乳酸杆菌对维持猪的肠道稳态有着重要意义。日粮添加乳酸杆菌显著提高了断奶仔猪的平均日增重及饲粮粗脂肪表观消化率，并且可以预防并治疗仔猪腹泻。鸡的肠道黏膜上皮黏附有大量乳酸杆菌，从而在小肠黏膜表面形成屏障，降低了有害菌经由肠道侵染鸡体的概率。益生菌无污染、无副作用及保健功能决定了其在未来领域必定应用广泛。乳酸杆菌已被证明是动物消化道中的益生菌，对动物无不良反应，还可通过改善肠道稳态、提高动物免疫力、生物拮抗等机制发挥作用，目前已被广泛应用于动物生产，前景十分广阔。1.1.5益生菌在蜜蜂上的应用目前所使用的益生菌制剂仍然存在许多问题，如在实际养殖过程中不同时期的不同动物的益生菌添加量没有科学依据、部分益生菌制剂随着贮存时间延长后活力易下降甚至失活从而导致使用效果不佳，这些都需要科学的探索。作为替代抗生素的新型添加剂，绿色养殖已引起广泛关注。因益生菌不仅可作为动物添加剂，还能作为人的功能性食品，具有保健、治病的功效，因此被称为„„21世纪的热门话题‟‟。人和动物体肠道内寄居的大量微生物与机体的生理活动息息相关。饲喂益生菌可以调节肠道菌群稳态，增强机体免疫，提高饲料利用率，促进机体生长；而益生菌的使用不会污染环境，有着极其重要的环保意义；益生菌本身无毒副作用，所以对人3 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响类健康也是很有益的。随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，人们对环保、卫生安全和食品安全的问题更加关注，益生菌的应用前景十分广阔。关于蜜蜂肠道菌群的研究已经比较深入，对于蜜蜂肠道菌群的组成和结构分析的比较透彻。应用蜜蜂肠道固有菌群来进行生物防治的研究已经展开。Gilliam等在研究非致病性微生物对蜜蜂的影响的时候发现最常见的曲霉菌属真菌对白垩病有抑制作用，并且蜜蜂肠道内的毛霉菌和根霉菌对白垩病也有一定的抑制作用。Evans等发现乳酸菌能促进蜜蜂的内在免疫反应以抵抗病原菌的侵入。Cox-Forster等研究发现蜂群衰竭失调症（CCD）也与蜜蜂肠道菌群失衡有关。1.2蜜蜂的消化生理1.2.1蜜蜂的消化道蜜蜂的消化道起始于口，终止于肛门，包括前肠（foregut）、中肠（midgut）和后肠（hindgut）三部分。前肠包括口、咽、食道、嗉囊和前胃，起到接纳、暂时储存和初步消化食物的功能。蜜蜂的嗉囊主要用于储蜜，又称蜜囊。蜜囊内有来自唾液腺的消化酶和中肠倒流过来的消化酶，可以对囊内的食物进行初步消化。蜜囊内有稀疏的绒毛，可以起到过滤的作用，能分开糖浆和花粉，只让花粉进入中肠。前胃是前肠的最后一部分，主要起对进入中肠的食物进行调节和过滤作用。中肠是消化食物和吸收营养的主要部位。蜜蜂中肠由内向外由围食膜、底膜、环肌、纵肌和围膜组成。中肠细胞有柱状细胞，再生细胞和内分泌细胞三种，柱状细胞是分泌消化酶和吸收消化产物的主要功能细胞。围食膜昆虫中肠的一种特殊结构，能够保护中肠免受食物颗粒和病原微生物的损害，同时能允许分子量较小的淀粉酶和胰蛋白酶通过，阻止分子量较大的α-葡萄糖酶通过，维持特定部位酶的高浓度，起到分子筛的作用。蜜蜂的后肠由小肠和后肠组成蜜蜂在越冬期间产生的粪便,都集中储存在直肠中,而直肠肠腺能够分泌防止粪便发酵腐败的物质,这对蜜蜂长期储存大量粪便而安全越冬意义重大。1.2.2蜜蜂的消化酶蜜蜂的消化酶主要有糖酶和蛋白酶。糖酶主要有α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和α-4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文淀粉酶三种酶组成。意大利蜜蜂中肠能分泌α-葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ，这两种酶的最适PH约为5.0-5.5，这两种酶能够迅速的分解麦芽糖和麦芽三糖，这对于以糖类为主要食物的蜜蜂来说是非常重要的，也是意大利蜜蜂的主要的消化酶。胰凝乳蛋白酶是蜜蜂中肠中最为丰富的蛋白酶类，这类酶不依赖Ca离子，最适PH值在7左右。蜜蜂的蛋白酶在蛹和刚出房的新蜂体内活性比较低，但是出房几个小时后迅速升高，这于蜜蜂出房后开始采食蜂粮的行为相契合。蜜蜂的蛋白酶活性收到季节、蜂种、蜜蜂的年龄等多个因素的影响。蜜蜂中肠的柱状细胞是分泌的消化酶的主要细胞，通常通过局部分泌（merocrinesecertion)的方式进入肠腔。1.2.3蜜蜂的肠道微生物1.2.3.1蜜蜂肠道正常菌群对于蜜蜂肠道微生物区系的研究已经开展的较为深入。早在1974年，Gilliam等就用过传统的分离培养的方法从意大利蜜蜂工蜂的肠道分离出了8株细菌，7株真菌和7属的酵母菌。随着16sRNA技术的发展，通过PCR-DGGE技术分析蜜蜂肠道的微生物又成为主流。常伟等通过16sRNA技术对我国南方越夏期的意大利蜜蜂的肠道微生物区系进行了比较系统的分析。随着基因组学技术的不断进步，对于蜜蜂肠道微生物菌群的分析更加透彻和精准，Cox-Fors通过宏基因组测序技术发现意大利蜜蜂的的肠道优势菌群是γ－变形菌门、厚壁菌门、α－变形菌门。基因组学的研究能够更直观的研究多组样品间微生物区系的差异，通过现代分子生物学分析和预测的方法对蜜蜂肠道微生物进行更深入的研究。通过以上的研究我们发现，蜜蜂的肠道结构简单，所以肠道微生物区系构成并不复杂，酵母菌和芽孢杆菌是蜜蜂蜂体上最主要的微生物。同时也证明，蜜蜂是一种良好的研究肠道微生物区系的模式生物。蜜蜂肠道的微生物菌群并不是一成不变的，受到季节，食物源，地区等因素的影响(RadaV,1997)。1.2.3.2蜜蜂肠道的致病菌蜜蜂的许多疾病都是由病原菌引起的，其中主要的细菌有幼虫芽孢杆菌，蜂房球菌，真菌主要是蜂球囊菌。幼虫芽孢杆菌引起的美洲幼虫腐臭病是西方蜜蜂的毁灭性疾病，一旦蜂群患病就很难治愈。幼虫芽孢杆菌的抗逆性极强，主要原因是其具有7层包围结构。蜂房球菌引起的欧洲幼虫腐臭病广泛发生于所有养蜂国家，中蜂与西方蜜蜂都有可5 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响能患病。蜂房球菌属于革兰氏阳性菌，能够长久的存货与病虫死尸和蜜粉中。白垩病由蜂球囊菌引起，1985年世界养蜂大会讲白垩病列为学术会议的主要议题（冯峰，1995），随着蜜蜂原种的引进传遍全国各地，对养蜂业危害极大。1.3蜜蜂防御病原菌的机制1.3.1体壁防御蜜蜂的体壁由蛋白质、几丁质、脂类和蜡质组成。其中，几丁质具有抵抗真菌孢子的功能，同时对孢子的萌发也有一定的抑制作用。蜜蜂中肠的围食膜主要由蛋白质和几丁质组成，其功能与体壁相似。每个龄期，中肠围食膜都会定期脱落更换。这两层屏障能够防止大部分的病原菌的侵入。1.3.2活性氧防御病原菌侵染哺乳动物时，其上皮细胞会产生活性氧ROS来杀灭病原菌，与之相似，蜜蜂产生ROS也是重要的免疫途径。活性氧是指包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子自由基（O2·）、羟基自由基（·OH）在内强氧化性的小分子物质，其可由O2还原生成，彼此之间又可以相互转换，对组织和有机体有较强的毒害作用，可以有效杀灭病原物和寄生虫，在蜜蜂防御病原物入侵和寄生虫寄生过程中发挥重要作用（Milleretal.1997;NathanandShiloh2000）。研究人员通过对果蝇的研究建立了病原菌-昆虫相互作用的模式。当病原物入侵果蝇时，果蝇体内的模式识别蛋白会有效识别外源物，并通过一系列的调控模式激活基因的表达，合成活性氧（Lemaitreetal.2007;Vallet-Gelyetal.2008）。Heat等研究发现，当肠道上皮细胞收到感染时，就会催使体内产生活性氧来清除病原菌。在这个过程结束之后，过氧化氢酶又会清除多余的活性氧来维持内环境的平衡（Vallet-Gelyetal.2008）。通过体外实验，研究人员发现过双氧化酶（DUOX）同源结构域（PDH）又可以将活性氧的H2O2催化生成氧化性更强、更具杀菌活性的的HClO（LemaitreandHoffmann2007）。Ha等人敲除了DUOX基因后发现活性氧的生成受阻，不能杀灭入侵的病原菌，果蝇的存活率明显降低。而当敲除过氧化氢酶（ImmuneResponsiveCatalase,IRC）时，与对照相比，果蝇的成活率依旧显著降低，这表明活性氧对机体本身也有很大的毒害作用，因此维持体内活性氧的平衡十分关键。病6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文原物的侵染会激活这些关键基因的表达，产生活性氧，杀灭病原体，而昆虫体内的氧化压力则调控有机体的氧化平衡，从而在有效抵御病原物入侵的同时保护有机体免受强氧化条件的损害（Haetal.2005；Ryuetal.2010）。除了双氧化酶（DUOX），NADPH氧化酶（NADPHOxidase,NOX）也是参与这个过程的重要的酶。NOX是一种含有血红素的跨膜蛋白，可跨膜运送电子，NADPH作为电子供体通过NOX作用将电子转移给2-氧，生成超氧阴离子O，产生的活性氧具有强氧化性，能够有效杀灭病原物（Segal，2008）。随着活性氧研究的深入，超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）和过氧化物酶（Peroxidase,POD），三者协同作用，对抗生物体内的氧化压力，以避免强氧化压力对宿主本身生物组织造成的伤害。1.3.3抗菌肽众所周知，哺乳动物的免疫系统由特异性免疫和非特异性免疫系统组成，但蜜蜂的免疫系统比较简单，只有非特异性免疫系统，抗菌肽就是其中非常重要的一环。抗菌肽自上个世纪末被研究人员从蜜蜂体内分离出来以后就成为研究的热点，因为蜜蜂的抗菌肽具有广谱抗菌的效果，对细菌、真菌、病毒等多种病原体都有很强的拮抗作用。抗菌肽能够非特异性的与病原菌结合，通过破坏病原菌细胞膜的完整性来杀灭病原菌，Locky通过电镜观察证实了这一点。但是抗菌肽对病原是否有特异性的识别，抗菌肽同其他抗菌因子的协同作用等方面还有待进一步的探究。意大利蜜蜂的抗菌肽编码基因主要由Apidaecin、Abeacin、Hymenoptaecin和Defensin四个基因家族编码而成。这四种抗菌肽都已经被研究人员从蜜蜂体内分离成功。2006年，蜜蜂的全基因组序列发布，关于这四种抗菌肽基因的研究也更为深入和广泛。Apidaecin类抗菌肽与Abeacin类抗菌肽结构和功能相似，其前体物质均比较简单，当蜜蜂收到病原体侵染时，这两类抗菌肽均能快速的表达。这两类抗菌肽对大部分的革兰氏阴性菌和一部分革兰氏阳性菌都具有良好的杀菌作用。Defensin类抗菌肽在蜜蜂体内的表达量较少，而且需要有大量的病原菌刺激才会表达，但是这类抗菌肽能够有效的对抗许多革兰氏阳性菌，这是其他抗菌肽所不具备的能力。1.4本研究的目的和意义我国是养蜂大国，蜂群数量和蜂产品数量都位居世界第一位。多样的蜂产品丰富了7 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响百姓的食谱，也为蜂农带来了客观的经济收入。同时，蜜蜂作为一种授粉昆虫在生态农业的发展中也起到关键的作用。益生菌是一种绿色、高效的微生物添加剂，在畜禽的生产中已经得到了广泛的应用，并取得了良好的效果。目前，我国养蜂业使用人工饲料已经成为常态，但是益生菌在蜜蜂的应用还很少。本试验选用目前在养蜂生产中占主要地位的意大利蜜蜂为研究对象，通过使用添加了益生菌的花粉饲喂离群蜜蜂来探究益生菌对蜜蜂生长发育的影响。通过存活率、肠道发育、中肠消化酶活性、抗菌肽基因的表达量等指标从营养的角度来评价乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌这两个特定的益生菌种对意大利蜜蜂的益生作用。为蜜蜂人工饲料添加剂的发展提供一定的理论依据，为蜜蜂专用微生态制剂的筛选研究打下基础。2材料与方法2.1试验材料试验动物取自山东农业大学试验蜂场的本地意大利蜜蜂（ApismelliferaL.)。试验饲粮：油菜花花粉（粉碎，过40目）、蔗糖、去离子水。乳酸杆菌制剂与枯草芽孢杆菌制剂购自宝来利来生物公司。试剂及耗材：蛋白定量测定试剂盒（南京建成）；微量丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（南京建成）。4%福尔马林溶液；95%乙醇；75%乙醇；二甲苯；苏木精，伊红，中性树胶，冰醋酸；蒸馏水；双蒸水，盐酸，硝酸；生理盐水；福林酚；石蜡；Tris-HCl(pH7.9)；蔗糖；去离子水。试验仪器：高温烘箱，电热恒温水浴锅（HHS，上海），核酸蛋白检测仪（eppendorf，BioPhotometerplus），原子吸收分光光度计（AAS）（仪器型号：AAS-180-80），J230023型电子天平，T6新世纪紫外可见分光光度计，电子秤（ACS-ZL），茂福炉（SX2-4-10），低温离心机（eppendorf，Centrifuge5810R），小型高速离心机（eppendorf，Centrifuge5424），BMJ23包埋机，轮转式石蜡切片机（LEICARM2135），显微照相机（PM-20），光学显微镜，恒温培养箱，全自动样品快速研磨仪（上海净信科技，Tissuelyser-24），超低温冷冻冰箱。8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2.2试验设计与饲养管理本试验于2014年7月23日-10月12日在山东农业大学动物营养实验室进行，其中预试期25天，正试期50天。本试验从姐妹蜂王群中取新出房的意蜂3600只，随机分为3个处理组，每组4个重复，每个重复60只蜜蜂。试验Ⅰ组为对照组，饲喂普通油88菜花粉，试验Ⅱ组和Ⅲ组饲喂分别添加了1×10cfu/kg乳酸杆菌制剂和1×10cfu/kg枯草芽孢杆菌制剂的油菜花粉，均保证充足的糖和水的供应。实验二测定蜜蜂头部和胸部的抗氧化指标及中肠形态学指标，试验分3个处理组，每个处理组3个蜂盒，即三个重复。取第3、6、9日龄的蜜蜂解剖头部和胸部存样，解剖腹部取中肠。其中的两个处理组分别饲喂新鲜的磨碎过目的油菜花花粉，保证充足的水和糖水，对照组只饲喂糖水（白砂糖+蒸馏水）和蒸馏水。试验开始前对室内培养箱进行酒精和紫外消毒，灭菌。随机分组处理好后，全部置于30℃、60%湿度恒温培养箱内饲养。油菜花花粉粉碎后过40目，50%蔗糖溶液按1:1比例充分混匀。将配制好的油菜花花粉日粮分成若干小份置于盖玻片上，精确称重，每个试验组饲喂一份日粮，多余日粮放于-20℃冰箱中贮存。试验过程糖水和饲粮均保证充足、新鲜（少量多次），所有蜜蜂均自由采食水。2.3测定指标及方法2.3.1蜂群的采食量记录每次饲喂日粮的始料重和余料重，统计每个处理平均每只蜜蜂整个试验期的采食量。2.3.2日粮中蛋白质的消化率将配制好的油菜花花粉日粮分成若干小份置于盖玻片上，精确称重，每个试验组饲喂一份日粮，3天后取出称余料重，每个测试期为三天，共三个测试期。测试期内枯草8杆菌组和乳酸杆菌组的50%的糖水中各加入1×10cfu的菌种混匀后饲喂蜜蜂。试验期结束后各组蜜蜂饥饿3天后解剖取直肠内容物，放于盖玻片上测定饲粮中蛋白质的消化率。日粮蛋白质的消化率采用凯氏定氮法。日粮中蛋白质的消化率（%）=（食入日粮中蛋白质的量-直肠内容物中蛋白质的量）9 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响/食入日粮中蛋白质的量×100%2.3.3蜜蜂消化酶活性的测定分别对枯草芽孢杆菌组，乳酸杆菌组以及对照组的3日龄、6日龄、9日龄意大利蜜蜂测定其蔗糖酶，脂肪酶和淀粉酶活性。20%中肠匀浆液制备：从饲喂盒中取蜜蜂，在冰上迅速解剖其中肠放入预冷离心管中，按1:4的比例加入生理盐水，讲离心管置于冰水中，用电动匀浆机匀浆30S左右，于40C离心机中5000r/min离心10分钟，上清液即为20%组织匀浆。蔗糖酶活性测定：采用二糖酶测定试剂盒（CAT:A082-3,购自南京建成公司）测定。样品浓度为20%组织匀浆液，测定方法参照说明书。淀粉酶活性测定：采用淀粉酶（AMS）测定试剂盒（购自南京建成公司）测定。样品浓度为0.25%中肠组织匀浆，测定方法参照说明书。中肠脂肪酶活性测定：采用脂肪酶（LPS）试剂盒（购自南京建成公司）测定。样品浓度为20%组织匀浆，测定方法参照说明书。胰蛋白酶活性测定：解剖中肠后置于装有100μlTris-HCl的Eppendorf管中，-80保存。测定时每个管中加入900μlTris-HCl，用匀浆机粉碎中肠，40C离心5min，取上清20ml测定蛋白酶活性，吸光度OD660表示。2.3.4头胸部的蛋白质浓度分别对枯草杆菌组、乳酸杆菌组以及对照组的3日龄、6日龄、9日龄意大利蜜蜂成蜂的头部和胸部按重量体积比1:9加入生理盐水，用动物组织破碎仪机械匀浆，5000r/min离心10min，取上清制成10%的组织匀浆备用。蜜蜂头部和胸部的蛋白质浓度测定时将10%组织匀浆稀释到1%，采用蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，A045-2），用UV-2450可见光分光光度计（Spectrophotmeter）在595nm波长下测定吸光度。2.3.5头胸部的抗氧化性分别对3日龄、6日龄、9日龄意大利蜜蜂饲喂枯草杆菌、乳酸杆菌组饲粮以及对照组的头部和胸部的抗氧化性能进行测定。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文各处理组中分别取出10只蜜蜂进行解剖，分别取头部和胸部进行称重，编号。然后按质量体积比1：9加入生理盐水，在动物组织破碎仪上匀浆，1000r,5min离心取上清，并置于-20℃保存。总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定采用T-SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，A001-1）测定。丙二醛含量的测定采用MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，A003-2）测定。总抗氧化能力（T-AOC）测定采用T-AOC测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，A015）。2.3.6中肠形态学指标在对照组，饲喂乳酸杆菌组，饲喂枯草杆菌组各取10只蜜蜂，解剖分离中肠，迅速固定于4%的福尔马林溶液，固定48h后取保存好的组织块，逐级脱水、透明、包埋、切片（5μm）、染色、封片、图像采集，切片在100×放大倍数下用光学显微镜检查并测量中肠围食膜厚度。2.3.7基因表达定量检测贮存于-80℃的分子样品，用于Defensin,Abaecin和PPO基因mRNA表达量分析。RNA提取和反转录过程中的所用的试验耗材均经过高温高压灭菌或DEPC水处理，以除去RNase污染。具体实施过程如下：用试剂盒法提取样品总RNA，核酸检测仪测定RNA浓度值和OD260/280值，根据OD260/280值对RNA质量进行筛选，将质检合格的RNA立即采用反转录试剂盒将其反转录成cDNA。采用Bio-radCFX96实时荧光定量PCR仪对Defensin,Abaecin和PPO基因进行定量分析。反应体系参照SYBR®PrimeScriptTMRT-PCRKit说明书，反应程序：94℃30s，94℃5s，55℃15s，72℃10s，共40个循环。采用Primer5.0软件设计基因RT-PCR引物，序列如表1，通过溶解曲线、扩增曲线、标准曲线确认引物的特异性与扩增效率。2.3.7.1蜜蜂总RNA的提取和检测(1)加1mlRNA-SolvReagent裂解细胞。(2)加入组织样本，破碎匀浆，然后室温静置2-3min。(3)加入0.2ml氯仿，小心盖紧，用力摇晃15秒，然后置于冰盒中孵育10min。11 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响(4)4℃离心12000×g15min。液体被分成3层，最下面是氯仿层，中间层和最上面的上清液层，RNA在上清中。(5)将80%体积的上清转移到一个新的离心管中，添加1/3体积的无水乙醇,涡旋震荡15sec。(6)将不超过700µl的混合液加到HiBindRNAcolumn柱子中（提前将柱子放在收集管上）。步骤5中加入乙醇后可能会形成沉淀物，涡旋并将所有液体加到柱子中，室温10000×g离心30-60sec，弃废液，收集管再次利用。(7)如果液体大于700µl,将剩余的液体加到柱子中，重复步骤6,离心并丢弃废液。(8)将柱子置于一个新的收集管中，加300µlRNAWashBufferI，如上离心弃掉废液，收集管再利用。(9)将柱子放在收集管中，加400µlRNAWashBufferI，如上离心和弃掉废液。(10)将柱子置于收集管中，加500µlRNAWashBufferII如上离心弃掉废液。(11)再用500µlRNAWashBufferII清洗一次柱子，如步骤10，离心并弃废液。然后收集管13000r空离2min。(12)柱子置于干净的1.5ml离心管中，加30-50µlDEPCwater，室温静置2min，全速离心1min。如果需要RNA量＞50µg，可以二次洗脱。第一次洗脱可能获得80%的RNA，二次洗脱可能降低RNA浓度。将水预热到70℃，加到柱子中后室温孵育5min可提高RNA产量。(13)取1uLRNA，加到仪器的探针内，于核酸蛋白检测仪下读取RNA浓度值和OD260/280值。2.3.7.2cDNA的合成（1）RNA经反转录反应合成cDNA的第一条链，反应体系如下：mRNA4LgRNARemover1LMix4LRNase-freewaterupto20L（2）上述反应物轻轻吸打混匀后，42˚C水浴15min，85水浴5sec失活TransScript®12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文RT和gDNARemover，微离心并于-20˚C保存。2.3.7.3实时荧光定量PCR分析2.3.7.3.1引物及反应条件的确定（1）用Primer5.0软件设计基因Defensin,Abaecin和PPO的引物Abeacin-up,Abeacin-down,PPO-up,PPO-down,Defensin-up,Defensin-down（表1）。（2）所用的内参基因为意大利蜜蜂中的肌动蛋白基因（β-actin，GenBank注册号：HM640276），所用内参引物为β-s和β-x（表1）；（3）以反转录产物为模板，反应体系参照SYBR®PrimeScriptTMRT-PCRKit说明书，反应程序：94˚C30sec94˚C5sec55˚C15sec40个循环72˚C10sec扫描65˚Cto95˚C0.5˚C/secEnd（3）按5×浓度依次稀释模板，共稀释5个梯度，定量PCR反应构建相对标准曲线。验证引物的扩增效率，以及目的序列在此浓度范围内是否线性扩增，并根据融解曲线验证引物扩增的特异性，从而确定引物扩增条件。所用仪器为Bio-radCFX96实时荧光定量PCR仪。2.3.7.3.2实时荧光定量PCR检测基因表达水平（1）用试剂盒提取不同处理样品的总RNA；（2）以反转录产物为模板，β-s和β-x为内参引物，进行实时荧光定量PCR分析，每个基因均有内参同时扩增，默认条件下读取Ct值；2.4数据处理（1）数据分析采用双标准曲线法，计算平均表达量和相对偏差，用Excel作图。同13 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响-ΔΔCT时利用2大致计算与内参的相对表达量，确定基因的表达丰度；（2）实验数据用SAS9.2软件进行统计学分析（SASInst.,Inc.,Cary,NC,USA）结果以平均值±标准误表示。方差分析使用One-wayANOVA，差异显著者进行Duncan氏多重比较，显著水平P<0.05。表1荧光定量所用引物Table.1TheprimersusedinthisstudyofqPCRAbbreviationPrimersequence(5′-3′)DescriptionAbeacin-upGGATCTGAGAGAAAGATCTGCACReal-timePCRprimer,forwardAbeacin-downGGCGAGTAGTGCGAAGATAAAReal-timePCRprimer,reversePPO-upGCGAACGGCTATGTAATCGReal-timePCRprimer,forwardPPO-downGACTGGCAACAAGGGAATCTReal-timePCRprimer,reverseDefensin-upATTGTCGGCCTTCTCTTCATReal-timePCRprimer,forwardDefensin-downGTCGGCACGTTCTTCATTCTReal-timePCRprimer,reverseβ-sCCGTGATTTGACTGACTACCTStandardcontrolprimer,forwardβ-xAGTTGCCATTTCCTGTTCStandardcontrolprimer,reverse3结果与分析3.1益生菌对不同日龄蜜蜂采食量的影响表2益生菌对3、6.、9日龄意大利蜜蜂日粮采食量（mg/只）的影响Table2effectofprobioticsondietaryconsumptionofApismelliferaat3,6,9age组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄0.63±0.046b0.72±0.039b0.71±0.031b0.3211第6日龄0.85±0.041b0.92±0.033b2.16±0.067a*0.0014第9日龄1.77±0.31a1.98±0.024a2.01±0.029a0.5737P值0.00090.0006＜0.0001注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性（P<0.05），字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性不同益生菌菌种对不同日龄意大利蜜蜂日粮的采食量的影响见表2。两组意蜂采食量均随日龄而增加，3和9日龄意蜂采食量均无显著差异（P>0.05）在第6日龄乳酸杆菌组的采食量明显高于枯草芽孢杆菌组和对照组。同一菌种日粮不同日龄之间的采食量差异显著（P<0.05）。14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2益生菌对蜜蜂存活率的影响图1蜜蜂存活率随时间的变化趋势Fig.1Percentageproportionoflivebeesinthedynamicchangesovertime不同菌种对意大利蜜蜂存活率的影响见图1。由图1可知，蜜蜂的存活率随日龄的增长而逐渐降低。实验前期以对照组和乳酸杆菌组降低最快；实验后期，枯草杆菌组和乳酸杆菌组的存活率差异不显著。由以上结果可见，饲喂枯草杆菌和乳酸杆菌对蜜蜂寿命没有显著影响。3.3益生菌对不同日龄蜜蜂日粮蛋白质消化率的影响表3益生菌对3、6、9日龄意蜂日粮中蛋白质消化率（%）的差异Table3effectofprobioticsonprodigestibilityofApismelliferaat3,6,9age组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄69.23±1.85a65.10±5.01a68.77±2.62a0.6346第6日龄66.20±1.61a60.18±2.69a62.18±5.31a0.9245第9日龄60.60±2.97a56.60±4.02a60.71±4.31a0.4270P值0.56360.15970.4711注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性（P<0.05），字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性不同菌种对不同日龄意大利蜜蜂饲粮蛋白质的消化率的影响见表3。由表3可以看出，在第3日龄，第6日龄和第9日龄，添加枯草杆菌组意蜂日粮蛋白质的消化率与乳酸杆菌组相比差异不显著（P>0.05），第3日龄，第6日龄和第9日龄时枯草杆菌组和乳酸杆菌组组内意蜂日粮蛋白质的消化率无显著差异（P>0.05）。总体来看，乳酸杆菌组和枯草杆菌组意蜂对日粮蛋白质的消化率随日龄的增长呈下降趋势，在第3日龄和第15 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响6日龄意蜂对日粮蛋白质的消化率影响不大，9日龄后影响较大。3.4益生菌对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响表4益生菌对意大利蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响Table4effectofprobioticsonApismelliferaheadandchestproteinconcentration组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄0.37±0.017b0.85±0.020a*0.91±0.017a*0.0102第6日龄0.35±0.030b0.79±0.011a*0.84±0.023a*0.0306第9日龄0.35±0.024b0.81±0.033a*0.87±0.031a*0.0009P值0.87920.54280.0643注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响见表4。由表4可见，对照组与益生菌组的蜜蜂头胸部蛋白质浓度在第3、6、9日龄均有显著差异（P<0.05），试验组的头胸部体蛋白浓度明显高于对照组。对照组、枯草杆菌饲粮组、乳酸杆菌饲粮组在第3、6、9日龄蜜蜂的头胸部蛋白浓度的差异均不显著（P>0.05）。3.5益生菌对蜜蜂头胸部抗氧化能力的影响3.5.1益生菌对蜜蜂头胸SOD活性的影响表5益生菌对意大利蜜蜂头胸SOD活性的影响Table5effectofprobioticsonApismelliferaheadandchestSODactivity组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄32.51±0.73a55.58±3.40a*65.53±3.01a*0.0004第6日龄37.54±1.29a55.46±1.66a*66.23±1.41a*＜0.001第9日龄37.85±0.37a56.98±0.61a*64.06±3.17a*＜0.001P值0.06430.86730.5428注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性（P＜0.05），字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性。不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌组和乳酸杆菌组与对照组蜜蜂头部SOD活性的影响见16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表5。在第3日龄、第6日龄、第9日龄对照组和饲粮组的蜜蜂头胸部SOD的活性差异均显著（P<0.05）。对照组、枯草杆菌饲粮组、乳酸杆菌饲粮组，在第3日龄、第6日龄、第9日龄各个日龄间的意大利蜜蜂头部SOD的活性差异均不显著（P>0.05）。在第3日龄，枯草杆菌组和乳酸杆菌组蜜蜂头部SOD的活性差异不显著（P>0.05），但与对照组相比差异极显著（P<0.01）。6日龄枯草杆菌组蜜蜂头胸部SOD的活性与对照组相比差异极显著（P<0.01），与乳酸杆菌组相比差异不显著（P>0.05）；枯草杆菌组蜜蜂头胸部SOD的活性与对照组相比差异显著（P<0.05）。3.5.2益生菌饲粮对蜜蜂头部MDA的影响表6益生菌对意大利蜜蜂头胸MDA活性的影响Table6effectofprobioticsonApismelliferaheadandchestMDAactivity组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄3.24±0.11b2.16±0.060a*2.13±0.15a*0.003第6日龄3.42±0.060b2.23±0.27a*1.59±0.23a*0.002第9日龄4.47±0.48a2.62±0.14a*2.14±0.10a*0.005P值0.5120.19950.0783注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性。不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂头胸MDA活性的影响见表6。由表6可知，在第3日龄，枯草杆菌日粮组和乳酸杆菌日粮组蜜蜂头部MDA的活性差异不显著（P>0.05），但与对照组相比差异极显著（P<0.01）。6日龄枯草杆菌日粮组蜜蜂头胸部MDA的活性与对照组相比差异极显著（P<0.01），与乳酸杆菌日粮组相比差异不显著（P>0.05）；9日龄，枯草杆菌日粮组与乳酸杆菌组蜜蜂头胸部MDA的活性与对照组相比差异显著（P<0.05）。3.5.3不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部T-AOC的影响17 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响表7益生菌对意大利蜜蜂头胸部T-AOC活性的影响Table7effectofprobioticsonApismelliferaheadandchestAOCactivity组别日龄P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄95.00±6.58a122.61±13.18a*144.04±6.06ab*0.0442第6日龄91.32±6.36a130.33±10.20a*138.71±12.24b*0.0007第9日龄87.11±4.73a128.47±11.68a*158.12±18.96a*0.0262P值0.40110.74050.1302注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性。不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂胸部T-AOC活性的影响见表15。由表15可知，在第3日龄，枯草杆菌日粮组和乳酸杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性差异不显著（P>0.05），但与对照组相比差异极显著（P<0.01）。6日龄枯草杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性与对照组相比差异极显著（P<0.01），与乳酸杆菌日粮组相比差异不显著（P>0.05）；9日龄，枯草杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性与对照组相比差异显著（P<0.05）。3.6不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠胰蛋白酶活性的影响表8菌种和日龄因素对意大利蜜蜂中肠胰蛋白酶活性的影响Table8effectofageandprobioticsonApismelliferamidgutproteaseactivity日龄组别P值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄0.25±0.013b0.45±0.020b*0.27±0.011b0.0022第6日龄0.37±0.026a0.64±0.039a*0.34±0.019b0.0001第9日龄0.23±0.032b0.44±0.016b*0.30±0.018b＜0.0001P值0.00690.00010.1302注：同行数据右上角*代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性在3、6、9日龄，枯草芽孢杆菌组的胰蛋白酶消化率明显高于对照组和乳酸杆菌组（P＜0.01），但对照组和乳酸杆菌组之间差异不显著（P＞0.05）。日龄因素对于蜜蜂中肠胰蛋白酶的活性影响极显著（P＜0.01),尤其以6日龄蜜蜂的中肠胰蛋白酶活性最高。18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.7益生菌对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响不同日龄意大利蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响见图1-9。图中*表示中肠围食膜的位置。通过对不同日龄和饲粮的中肠的切片我们可以观察到：枯草杆菌组的中肠厚度比乳酸杆菌的厚，处理组蜜蜂的中肠厚度随着日龄增长也逐渐变厚。枯草杆菌组的中肠隐窝深度比乳酸杆菌的深。图2对照组3d中肠组织切片，H&E染色,10×图3对照组6d中肠组织切片，H&E染色,10×图4对照组9d中肠组织切片，H&E染色,10×图5乳酸杆菌组3d中肠组织切片，H&E染色,10×图6乳酸杆菌组组6d中肠组织切片，H&E染色,10×图7乳酸杆菌组9d中肠组织切片，H&E染色,10×H&Estain,10×H&Estain,10×19 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响图8枯草芽孢杆菌组3d中肠组织切片，H&E染色,10×图9枯草芽孢杆菌组组6d中肠组织切片，H&E染色,10×图10枯草芽孢杆菌组组9d中肠组织切片，H&E染色,10×3.8益生菌对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响图11为不同菌种对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响。由图11A可看出，对于基因Abaecin，枯草杆菌组和乳酸杆菌组显著高于对照组(P<0.05)，而枯草杆菌组和乳酸杆菌组无差异。由图11B可看出，对于基因Defensin，枯草杆菌组和乳酸杆菌组的表达量均显著高于对照组，而枯草杆菌组和乳酸杆菌组无差异。如图11C所示，枯草杆菌组和乳酸杆菌组PPO的表达量无差异，但枯草杆菌组和乳酸杆菌组的PPO表达量均显著低于对照组(P<0.05)。20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图10枯草杆菌和乳酸杆菌对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响Fig.10EffectofBacillusandLactobacillusonhoneybeeantibioticpeptidegeneexpression4讨论4.1益生菌影响意蜂的采食量蜜蜂是一种社会型昆虫，由蜂花粉和蜂蜜调制的蜂粮是蜂群的主要食物来源。蜜蜂个体生长发育所需蛋白均是从花粉中摄取的（Crailsheim，1990）。蜜蜂的采食量受到蜜蜂种类，饲粮的营养水平，环境等多种因素的影响。花粉的颜色，气味，表明结构等因素对蜜蜂的吸引力也有影响（马兰婷等，2011）。关于益生菌影响动物采食量的研究，在哺乳动物上有许多报道，Samanya等使用纳豆芽孢杆菌饲喂雏鸡，显著提高了采食量。董晓丽等使用乳酸杆菌饲喂仔猪，对采食量的影响不显著，但是改善了饲料的转化效率。蜜蜂的采食量是衡量蜂群群势的一个重要指标，采食量高，证明群势旺盛，生产性能好。试验数据显示，工蜂出房后的1至2天，花粉的采食量较低，随后几天呈逐渐升高的趋势。这与杭晓波等的研究结果相似。试验组的采食量明显高于对照组，可能的原因是饲喂的花粉团需要经过糖水的调制，添加益生菌后会降低PH，益生菌的产物也会将部分大分子营养物质分解，使得花粉团更为贴近自然状态下的蜂粮，增强了花粉的适口性。21 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响乳酸杆菌组的采食量要比枯草芽孢杆菌组更高一些，这可能与乳酸杆菌的产酸、降低PH的特性有关。4.2益生菌影响意蜂的肠道发育中肠是蜜蜂的消化吸收的主要场所，中肠的形态学结构是衡量蜜蜂消化吸收功能的主要指标之一。蜜蜂中肠的柱状细胞能够分泌消化酶，是消化吸收最主要的功能细胞。研究表明，饲喂益生菌能够显著的改善动物的肠道结构，1987年，Yason研究发现，粘膜绒毛的加长能够增大肠壁与食糜的接触面积，提高消化率。Pangan等人也指出隐窝的深度越深，表明肠上皮细胞越不成熟，不利于消化。Awad等研究发现，使用添加了乳酸杆菌的饲粮饲喂肉鸡，能明显提高绒毛高度，使肠道保持良好的形态。2012年，辛娜研究表明，饲喂枯草芽孢杆菌能够显著提高仔猪十二指肠，空肠中段的绒毛高度/隐窝深度数值。关于益生菌制剂对蜜蜂的肠道发育的影响的研究主要以围食膜的厚度为参考指标，金汤东等研究表明EM制剂能够增加蜜蜂中肠围食膜的厚度。从试验结果可以看出，枯草芽孢杆菌组与乳酸杆菌组的肠道形态明显优于对照组，肠壁厚实，完整，隐窝深度浅。4.3益生菌影响蜜蜂的寿命和抗氧化能力蜜蜂的寿命直接决定蜂群的生产能力（周冰峰，2002）。蜜蜂的寿命受到很多因素的影响，季节，饲粮的营养成分等因素都能影响蜜蜂的寿命（周冰峰，2002）。本研究采用恒温箱室内饲养成蜂的的方法，温度与湿度等环境因素都尽量模仿自然蜂群，并保证充足的糖，水和饲料的供应，将环境对蜜蜂寿命的影响尽量减小。而且通过不断的摸索，已经可以维持室内饲养的蜜蜂较高的成活率。1955年，Harman提出了氧化应激理论，该理论认为机体的生命与ROS的富集有关，在随后的研究中，这个理论相继在哺乳类、鸟类和昆虫中得到了证明（Sohaletal．，1995；Barjaetal．，1994；Brunet-Rossinni，2004)。昆虫在收到外界刺激时，能够通过产生ROS来清除异己成分，这是机体重要的防御途径。在这个过程结束之后，需要通过超氧化物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶（CAT）的协同作用来清除多余的ROS，以免机体受到ROS的损害。MDA是自由基与脂肪酸发生反应的终产物，是评价机体过氧化程度的重要指标（Kamada，1983）。试验结果显示，试验组的SOD活性明显高于对照组，说明机体在收到益生菌的刺激之后确实产生了22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文ROS来清除体内的不利成分。不同日龄的蜜蜂的SOD活性变化不大。这也与肖培新等的研究结果相一致。试验组的T-AOC活性与对照组差异不显著，原因可能是SOD是清除自由基的主要的酶，而且也是机体清除ROS最先起作用的酶（Robinson，2006），T-AOC的调节有滞后的趋势。枯草芽孢杆菌组和乳酸杆菌组的SOD和T-AOC活性差异不显著，说明这两种益生菌均能刺激蜜蜂机体产生ROS。试验组与对照组之间蜜蜂的寿命也没有明显差异，说明饲喂益生菌虽然刺激机体产生了活性氧，但并没有引起机体的氧化应激，ROS的水平还处在能够被机体的抗氧化系统清除的阶段。同时，蜜蜂的寿命也是评价益生菌制剂安全性的重要指标。4.4益生菌制剂影响蜜蜂的消化酶活性和体蛋白浓度蜜蜂的消化道内含有多种消化酶，主要包括蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，蔗糖酶和海藻糖酶（Snodgrass，1956）。有报道显示，枯草芽孢杆菌在繁殖的过程中会产生蛋白酶，淀粉酶和脂肪酶。同时还能产生分解一些如果胶、纤维素等大分子物质的酶。这些酶都会促进动物的消化吸收。Maxwell的研究表明，乳酸杆菌在体外培养时会产生淀粉酶和碳水化合物酶。蛋白质是蜜蜂生长发育和构成机体的最重要的营养素，测定蜂体蛋白的浓度意义重大（DeJongetal.，2009）。Schmickl等研究发现，蜂房中的花粉存储量越多，蜂体蛋白浓度越大，这说明蜂体蛋白浓度受到食物的影响。在一定的范围内，食物的蛋白水平越高，蜂体的蛋白浓度也越高。本实验中，枯草芽孢杆菌组的胰蛋白酶，蔗糖酶和脂肪酶的活性相比于对照组都有显著的提高，这与许多在哺乳动物上的报道相一致，说明枯草芽孢杆菌在生长代谢的过程中确实产生了具有蛋白酶、蔗糖酶和脂肪酶活性的物质。饲喂乳酸杆菌对蜜蜂胰蛋白酶的活性没有显著的提高，但是显著的提高了蔗糖酶和脂肪酶的活性。这可能与乳酸杆菌会代谢产生乳酸，降低了肠道PH有关。蜜蜂成蜂中肠的PH值一般在5.8-6.3左右，而大部分蔗糖酶的最适PH值一般在5.0左右，而不管是胰蛋白酶还是类胰蛋白酶的最适PH约为7.0。所以，乳酸杆菌代谢产生乳酸，降低了肠道的PH，能够显著的提高蛋白酶的活性。试验组的蜜蜂体蛋白浓度明显的高于对照组，但枯草芽孢杆菌组与乳酸杆菌组之间并没有显著差异。造成这种差异的原因可能是益生菌的代谢产物能够分解花粉中半纤维素与果胶，同时菌体蛋白平衡了饲粮中的蛋白质组成结构，使蜜蜂的体蛋白浓度升高。23 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响4.5益生菌制剂影响蜜蜂的蛋白消化率动物消化蛋白质的机理已经阐述的十分明确（McDonald，2002），蛋白质的消化率会因为物种、食物来源、环境和饲喂技术等因素而变化。蜜蜂对于蛋白质的消化率也会随着蛋白质的种类、花粉的结构等因素而变化（Roulston。2000）。近期的研究也发现蛋白消化率也会随着食物蛋白水平的变化而变化（Pernal，2002；Lietal，2012）。蜜蜂作为一种典型的社会昆虫，工蜂在其整个生命过程中要承担许多不同的任务，不同生命阶段其蛋白质的消耗量也会有所不同，所以，日龄因素也是影响其蛋白消化率的重要因素。有报道称，饲喂雏鸡枯草芽孢杆菌能够提高其粗蛋白的消化率。试验结果显示，尽管枯草芽孢杆菌组的胰蛋白酶活性较高，对照组与试验组在蛋白消化率方面并没有明显差异，可能是因为环境和花粉的结构影响了蛋白消化率。4.6益生菌影响免疫相关基因的表达PPO（酚氧化酶原）基因编码合成酚氧化酶原，经过酚氧化酶的级联反应成为具有生物活性的酚氧化酶，参与到机体的免疫反应中去。酚氧化酶主要参与蜜蜂的体液免疫中血淋巴的凝集过程，以便于血淋巴中的吞噬细胞消灭异物（Theopoldetal，2002）。但酚氧化酶并没有直接杀灭病原菌的作用（Bidlaetal，2005）。Lee等人人工诱导了昆虫的血细胞凝集，并从中分离纯化了一种分子量为72KDA的蛋白质，并证明了这正是酚氧化酶（Leeetal，1999）。本试验中，分析了6日龄的工蜂PPO基因的表达量，试验组明显低于对照组，这与Moret等人的研究结果一致，这是因为工蜂在收到外界刺激时，PPO的表达量会上升，但如果以后一段时间没有收到其他抗原的刺激，PPO的表达量会降低，PO与蜜蜂的长期免疫没有关系。Abeacin类抗菌肽是蜜蜂重要的一类抗菌肽，抗菌效力强，反应迅速。这主要得益于其比较简单的前提物质。蜜蜂在受到抗原刺激后，会激活TOLL和Imd信号通路，来调控抗菌肽基因的表达（Lecleicetal，2004），Evans等（2006）通过饲喂蜜蜂幼虫添加了致病菌的饲料来刺激抗菌肽的表达，结果表明Abeacin类抗菌肽基因上调表达了数十倍，幼虫体内的抗菌肽浓度达到0.4mM，这个浓度远远高于体外抗菌试验时的有效浓度。试验结果表明，试验组的Abeacin基因表达量要远远高于对照组，说明益生菌可以作为一种有效的刺激原来激活抗菌肽基因的表达，从而达到提高机体免疫力的24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文目的。但Evans还指出，不管是病原菌还是从蜜蜂肠道中分离的益生菌，对蜜蜂幼虫来说都会降低成活率，这可能与蜜蜂幼虫还不完善内环境调控机制有关。Defensin类抗菌肽分子量很小，一般只有34-46个氨基酸残基组成。蜜蜂的Defensin类抗菌肽还不同于其他昆虫，它并不具有C-末端延伸结构（Fujiwaraetal，1990）。相比于Abeacin类抗菌肽，Defensin类抗菌肽具有更强的抗菌活性，其MIC水平甚至要低于μmol/ml的水平，而且作用迅速，在体外试验中证实约1分钟的时间就可以有效的杀灭大部分革兰氏阳性菌（Barbaultetal,2003）。但是只有当大量抗原刺激时，机体才会调控表达这类抗菌肽。在本试验中，对照组与试验组的Defensin1基因表达量没有显著的变化，原因可能是益生菌的数量还不能刺激Defensin类抗菌肽的表达。5总体结论、创新点及展望5.1总体结论5.1.1蜜蜂日粮中添加益生菌制剂能提高新出房工蜂的采食量，促进肠道发育，提高蜜蜂的抗氧化能力，提高消化道蛋白酶的活性，而对蜜蜂的寿命，蛋白消化率的影响不显著。5.1.2工蜂饲喂益生菌制剂后两种关键的抗菌肽的基因mRNA表达量都有所上调。酚氧化酶原基因mRNA表达量下调。5.2本研究的创新点5.2.1通过直肠法测定了蜜蜂对花粉中蛋白质的消化率，为研究蜜蜂的消化率的方法的改进提供了一定的参考。5.2.2采用特定的益生菌菌种饲喂蜜蜂，主要从营养和免疫的角度分析了益生菌对蜜蜂的影响。为以后研究蜜蜂专用的微生态制剂提供一定的依据。5.3存在的不足及进一步解决的问题5.3.1本研究主要从营养和免疫的角度分析了益生菌对蜜蜂的影响，没有分析益生菌对25 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响肠道微生物区系的影响。肠道微生物区系的变化是一个动态过程，蜜蜂作为全变态昆虫其变化更为复杂，其变化还有待于进一步的研究。5.3.2本研究只取了三个日龄的蜜蜂进行探究分析，虽然显示了一定的趋势，但是不能完整的体现出机体的生理动态。5.3.3基因组学是研究蜜蜂肠道微生物的有效的方法，通过对表达差异基因的分析，能够更完整的体现出组间差异，是研究蜜蜂益生菌的良好的方法。26 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