中华蜜蜂气味受体基因aceror1和aceroreo的表达及定位研究 54页

’．．一：分类号Ｓ８９１＇学￣？ｒ巧ｉｆ丈聲全日制硕±学位论文中华蜜蜂气味受体基因和的表达及定位研究姓名；杨珊珊指导教师；姜玉锁教授学科专业；动物遗传育种与繁殖培养单位：动物科技学院中国？山西？太谷二〇—五年六月 ｔ．，．＇－．‘■Ｖ．ＶＳｈ汪ｎｘｉ■Ａｒｉｃｕｌｔｕｒ泣ＩＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＦｕ－ｌｌｔｉｍｅＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＬｏｃａｌｉｚａ村ｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｄｏｒａｎｔＲｅｃ巧ｔ：ｏｒＧｅｎｅｓａｎｄｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＨｏｎｅｙｂｅｅＡｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａ，Ｎａｍｅ：ＳｈａｎｓｈａｎａｎｙｇＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＹｕｓｕｏｉａｎｊｇＭａｏｒ；ＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＢｒｅｅｄｉｎａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｊ，ｇＴｒａｉｎｉｎｇＵｎｉｔ：ＣｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅｇｙＴａｉｇｕＳｈａｎｘｉＣｈｉｎａＪｕｎｅ２０１５， 学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文研究做出过重要贡献的个人和集体，均已在文中乂明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。＂ｖ矜作者签違（亲笔化年！）巧学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定。即学位论文的知识产权属山西农业大学；同意学校保留并向国家有关部口或抗构连交论文的原件、复印件和电子版；允许茲文疲查阅和借＂阅＾乂将学位论文的全部或部分内容编入有；本人授权山西农业大学可关数据库进行检索，可从采用影印、缩印或扭描等复制手段保存、；〔编学位论文。為＞〇ｒ作者签若：／Ｊ日（亲笔）痴碱ｆ年＾月方导师签名（亲笔）：抑Ｘ年＾月曰 本研究由国家自然科学基金项目（项目编号：３１２７２５１３）提供资助ＴｈｉｓｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｒａｎｔｓｆｒｏｍｇＣｈｉｎｅｓｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｎｏ．３１２７２５１３） 目录１摘要一第章文献综述２１２．昆虫的嗅觉感器２．昆虫嗅觉相关蛋白３２．１气味结合蛋白ＯＢＰｓ４２．２化学感受蛋白ＣＳＰｓ４２．３神经元膜蛋白ＳＮＭＰｓ５２．４气味降解酶ＯＤＥＳ５２．５气味受体ＯＲｓ６３嗅觉信号转导途径７４本研究的目的与意义９第二章和Ａ＾ｅｒＯｒｃｏｍＲＮＡ在中蜂各组织的表达研究１１１试验材斜与方法１１１１１．试验材料１１丄１试验样本采集１１１丄２试验仪器１１１丄３试验试剂１２１．２试验方法１２１１２．２．１溶液的配置１１２．２．２总ＲＮＡ的提取及检测１．２．３反转录１３１．２．４引物设计１３１１４．２．５反应条件的优化１１４．２．６标准曲线的建立１．２．７心的相对定量分析１４１．２．８数据处理与分析１４２结果与分析１５１２．１总ＲＮＡ提取及检测５２１５．２标准曲线的建立２．３样品扩增动力学曲线及烙解曲线１６２．４内勤蜂和采集蜂的表达特点１８ ２．５内勤蜂和采集蜂的表达特点１９３．论２０４２１．小结第Ｈ章ＡｃｅｒＯｒｌ和ＡｃｅｒＯｒｃｏ受体蛋白在中蜂各组织的表达研究２２１材料与方法２２１．１试验样本采集２２１．２试验仪器及试剂２２１．２．１试验仪器２２１．２．２试验试剂及配方２３１．３试验方法２４１．３．１多克隆抗体的制各２４１．３．２组织蛋白样品的制备２５１．３．３蛋白含量的测定２５１－．３．４ＳＤＳ聚丙帰醜胺凝胶电泳２５１．３．５转膜２６２６１．３．６免疫反应１．３．７ＥＣＬ化学发光检测２７２结果与分析２７２．１多克隆抗体检测结果２７２．２蛋白提取效果的检测２８ｓｅｒｎ－２．３ｗｅｔｂｌｏｔ结果及分析２９２．３．１ＡｃｅｒＯｒｌ在内勤蜂和采集蜂各姐织中蛋白的相对表达分析２９２．３．２ｒｒｃｏＡｃｅＯ在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白的相对表这分析２９３讨论３０４小结３１第四章ＡｃｅｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ在中蜂触角中的表达定位３２１试验材料与方法３２１．１试验材料３２１丄１试验样本采集３２１丄２主要仪器３２１丄３主要试剂３２１．２试验方法３３１．２．１主要溶液的配置３３１．２．２试验步骤３３ ２结果与分析３４３ｉｔ论３６４小结３７全文结３８参考献３９Ａｂｓｔｒａｃｔ４５＾４７ 中华蜜蜂气味受体基因和的表达及定位妍究摘要昆虫的嗅觉系统复杂而灵敏这是露虫为适应外界复杂环境长期进化的结果。昆虫，依靠灵敏的嗅觉进行宽食、选择栖息地、个体间交流信息Ｗ及交配繁殖后代等。中华蜜蜂是原产于我国的优民蜂种，具有节省饲料、耐寒耐热、抗蠕和抗美幼病等优点，非常适合为山区和冬季开花的植物进行授粉，对保持我国植物多样性起到了非常重要的作用。本研究Ｗ中华蜜蜂为研究对象，从转录和翻译水平对中蜂气味受体基因八ｙｉｃｅｒＯｒｃｏ进行定量及蛋白水平的表达定位研究，获得如下结果：（１）采用巧光定量？０民技术，对中蜂气味受体基因＿（４￡；６八＞７、＾４（；６八於；０在内勤蜂和采集蜂各组织中ｍＲＮＡ的相对表达量进行研究。结果表明，转录本在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，其中触角中的表达量最高。另外，两基因在采集蜂各组织中的表达量普遍高于内勤蜂。（２）根据两基因ｃＤＮＡ序列设计合成多肤段免瘦制备多克隆抗体利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，，技术对两蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白的相对表达情况进行研究。结果显示，在内勤蜂和采集蜂的胸部表达最多而则主要集中在头部表达。，Ｕ）通过免疫组织化学技术对两气味受体基因在中蜂工蜂触角中蛋白的表达进行定位分析。结果表明，ＡｃｅｒＯｒｌ主要在靠近触角底膜的板形感器的神经元细胞中表达，这与Ａｃ■而ＡｃｅｒＯｒｃｏ在板形感器和毛形感器中均有表达ｅｒＯｒｃｏ的共受体身伤和功能相对，应。本研究通过对中华蜜蜂气味受体基因ＡｃｅｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ的表达及定位研究，为深入探讨中华蜜蜂嗅觉感受机制一定的科学依，揭示中蜂优越的蜜粉源搜寻能力提供了据。关键词：ｍＲＮＡ表达中华蜜蜂；气味受体基因；；；蛋白表达蛋白定位－－１ 第一章文献综述１．昆虫的嗅觉感器一昆虫的嗅觉感器是由器官表皮细胞特化形成的种表皮突起，由毛原细胞、感觉神ｌ经元细胞所形成还附加辅助细胞ｔｊ，有时，主要分布于触角，少部分位于下飄须、下唇须嗅觉感器的表皮上有很多微孔，外界环境中的气味分子可Ｗ经由送些微孔进入嗅一Ｗ１－里面充满了淋巴液觉感器中。嗅觉感器中部是个空腔（图１），在淋己液内分布，有许多感受神经元的树突一个昆虫嗅觉感受器中通常，这是嗅觉信号转导发生的场所。包含有一个或多个嗅觉神经元，每个神经元细胞上的树突都很发达，用Ｗ接受外界气味一一分子所传递的化学信号神经元细胞另端的轴突直延伸到触角叶，经由触角叶将６７’’—ｐｊ嗅觉受体转导的电信号传导至更高的神经回合中也覃体。。。＼／思器淋己液１＂Ｍ：厂ｒ？神结元ＩｓＴ。Ｉ友持油胞层＼，＼＂画Ｉ？？？？＾＾—Ｍ—Ｉ軸突Ｗ图－１昆１虫嗔觉感器结构模式图的－ｃａｓｃｒｅｍｏｆｎｓｅｃ打ｇ．１１Ｔｉｌｌｔｒｕｔｕｉｔｏｌｆａｃｔｏｒｓｅｎｓｉｌ山ｙｐｙｙ在昆虫诸多类型的感器中，可Ｗ执行嗅觉功能的主要有板形感器、毛形感器、腔锥、９８９Ｅｌｔ形感器锥形感器等。１，北京大学杜芝兰首次利用扫描电镜（ＳｃａｎｎｉｎｇｅｃｒｏｎＭ’ｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）对中华蜜蜂（如ｚｓｃｍｍａｃｅｒａｎａ）工蜂触角上的感受器进行了研究，其中与嗅觉相关的感器研究结果如下：（１）板形感器（ｓｐ）：是在工蜂触角上分布最多的感器，也是中华蜜蜂嗅觉感受的主要感器一。主要分布在触角的第Ｈ到第十鞭节，紫密排列在起，覆盖于触角的表面上呈滿圆形的盘状结构一。圆盘外侧环绕着，，个楠圆环形的宽边在放大倍数较大的情Ｗ况下能够看到上面有许多沟福射延伸到盘中央。板形感器在触角背面的分布比腹面多。－２－ ａ）毛形感器（Ｓｔ）；根据长度、形态上的差异分为多种类型，共同的特点是呈毛，状，槽为圆形，术端稍纯，表面光滑，逐渐均匀的变细，内部中空。其中毛形感器（Ｓｔ）一Ｗ是工蜂触角上最普通的种感受器，在板形感器的丰富区内混合分布。一（３）腔锥感器（ＳＣＣ）；呈小孔状的结构，孔略呈楠圆形。在孔的底部常有个粗－－４１１壮的小锥状物仲出，长度约２．４３．９１１１１直径约为４．５〇，在柄＾，孔的＾节和梗节上都有分Ｗ布。（４）锥形感器（ｓｂ）：形状粗大而直立，似木粧，顶端相当纯，非中空，有几种一大小不同的类型。基部周围的膜般不像毛形感器下沉的那样深，槽呈圆形，在折断的一２３－感器内没有关节与它相连，，因此，感器只能倾斜而不能弯曲，般长度约为２７叫ｎＷ从第Ｈ鞭节到第九鞭节都有它的分布。２．昆虫嗅觉相关蛋白ＡＩＲ■＜？：础。募秦？：Ｏ資巧袭窠：ｊ，ＯＢ护．．．．．－鐵ｔ次＾品。ｆ＼ｆ＾公’＂’Ｖｔｏ贫－誦心Ｉ謂穿韦Ｗ一ＣＹＴＯＳＯＬＷ图－２琵虫嗔觉感受过程示意图１５［］Ｆ－ｉｓｒｏｃｅｓｓ．１２Ｄｉａｒａｍｆｉｎｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｏｒｓｅｎｓａｔｏｎｉｇｇｏｙｐ５ｔ３（－屋虫的嗅觉感受过程十分复杂，基本过程为图１２）：外界环境中的气味分子经由嗅觉感器表皮上的微孔进入到感器腔内，与感器淋巴液中的气味结合蛋白ｏｄｏｒａｎ－ｅｍｏｓｅｎｓｏｒｒｏｅｎｓＰｓ（ｔｂｉｎｄｉｎｇｒｏｔｅｉｎｓ，ＯＢＰｓ）或化学感受蛋白（ｃｈｙｐｔｉ，ＣＳ）相ｐ－ＯＢＰ／ＣＳＰｓ复合体穿过淋己液到达嗅觉神经元树突膜，与结合，形成复合体；气味分子膜上的气味受体（ｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，０民Ｓ）和神经元膜蛋白（ｓｅｎｓｏｒｙｎｅｕｒｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ－３－ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＮＭＰｓ）相互作用，从而使膜通透性发生变化阳离子内流，产生动作电化一在电信号传入中枢神经系统，引起昆虫系列生理和行为反应后，ＯＢＰｓ作用于气味分Ｐ１ｒ－ｄｅｒａｄｉｎｅｎｚｍｅｓｓ）。子，使其失活，最后由气味降解酶（ｏｄｏｇｇｙ，ＯＤＥ将其降解２．１气味结合蛋白ＯＢＰｓ一一些疏水性的小分子气味分子般是，它们必须通过由昆虫嗅觉感器淋己液形成的水环境才能到达神经元树突膜一，与膜上的受体结合。在送种情况下，种在感器淋己液一ＯＢＰ蛋白家族发挥了重要的作用中高丰度表达的特定分泌蛋白。ｓ是由昆虫触角感受神经元细胞外层的支持细胞分泌－ＯＢＰ，通常由１６０１８０个氨基酸组成的水溶性蛋白。ＯＢＰｓ家族内成员间的序列相似性通常小于２０％，并可通过短的特征一序列进行鉴定。般ＯＢＰｓ被认为参与气味小分子的运输，但现在多项研究表明，ＯＢＰｓ还具有其它多种功能ｔＷ。昆虫ＯＢＰｓ最初是从鱗翅目昆虫中分离得到的，最近又在ｉ４ｗ［’巧［］同果蜗＿Ｄｍｓｏ抑航！／ｗｅ／ａｎｏｇａｓｔｅｒ、西方蜜蜂作ｉｓｗｅ佩如ａ、真菌、冈比亚按蚊’＂ｉ９［’］口＂ｙｉｗｏ／ｊＡｅ／Ｍａ／ｎｈａｅ、致倦库蚊〔》／妨＾及埃及伊蚊４６成５〇！巧７／妃ｇ中发现。昆虫的ＯＢＰｓ蛋白序列与脊椎动物的相似性很低，因此推测其功能也有所不同。ＯＢＰｓ主要分为３种，包括信息素结合蛋白（Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＢＰ）、普通气味结合蛋白Ｉ（ＧｅｎｅｒａｌｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＩ，ＧＯＢＰＩ）、普通气味结合蛋白ＩＩＰＳ一ＯＢＰｌ（ＧＩＩ）。般认为ＯＢＰｓ的主要功能是在感器淋巴液中结合和运输亲脂性的气一味分子。ＯＢＰ还有选择性结合定类别的气味分子，在气味识别中起着外周滤器的作用。２．２化学感受蛋白ＣＳＰｓ化学感受蛋白ＣＳＰｓ与气味结合蛋白ＯＢＰｓ都是存在于感器淋己液中的水溶性球蛋白，都有结合气味分子和化学刺激物并将其转运到神经元膜上相应受体的功能。所不同２３４［３］的是：ＯＢＰｓ主要存在于触角嗅觉感器淋己液中，结合并转运挥发性的气味分子；ＣＳＰｓ广泛分布于各种化学感受器的淋己液中，结合并转运非挥发性的气味分子ｐｗｑ。－ｄ是１９９４年从黑腹果蛹公ｍｓｃｐＷ／ａｗｅ／最早被发现的昆虫ＣＳＰｓＤｍｅｌｏｓｆｗｏｇｏＷｅｒ的触ＰＳ角中发现并克隆出来的，随后又在许多昆虫中发现了此类蛋白。ＣＳＰｓ分子量通常比ａ？ＯＢＰｓ小约为１３ｋＤ，多１００１１５二，肤链由个氨基酸残基组成，级结构与ＯＢＰｓ相似，由７Ｐ１６ａ－二硫Ｐ螺旋构成，但只有４个保守的半脫氨酸位点键。ＣＳｓ具有较高的个，形成２个保守型，不仅种内ＣＳＰｓ之间有较高的保守性，种间同源性也很高。研究表明ｓ主要具有运载功能息素、非挥发性的气味分子Ｗ，ＣＳＰ，可Ｗ结合性信２７＂８一＇１些昆虫体表的碳氨化合物１及，从而在昆虫性信息素的形成和运输、感受气味、巢穴和种群内个体间的识别过程中发挥着重要的作用另外，ＣＳＰｓ已证实与昆虫的发－４－ 育有关，蜜蜂ＣＳＰ３在蛹和成虫税皮期表达水平明显增加，ＣＳＰ参与昆虫脱皮在云杉色ＵＷＤ卷蛾ＣＡｏＷＷｏｎｅｗａ／ｗｍ與ｒａｎａ中也有报道。ｍｅｌＰＥＢＩＩＩ被认为导致果魄发育成嗅ＰＵ’觉削弱突变型。发育中的美洲大撫化ｒ的ａ／ｎｅｎｃａｗｗｆｌ［巧胎足中ＰａｍｅＰｌＯ的表达Ｐ２：＞量是成虫足的３０倍，可能与表皮发育和组织重建有关。ＣＳＰ５在意大利蜜蜂冷＞枯ｗｅＷ矿ｅｒａ的胚胎外脏层中有表达，且参与了胚胎覆盖物的形成２．３神经元膜蛋白ＳＮＭＰｓＳＮＭＰｓ是特异性在嗅觉神经元和树突膜上表达的中性蛋白，分子量约为６７ｋｕ，约￣２ＭＰ是在有５１９５２５个氨基酸残基，与ＯＲｓ不同，它只有个跨膜结构域。第１个ＳＮ、多声大蚕蛾中发现的，此后在烟草天蛾家蚕和烟芽夜蛾中也发现了此类蛋白研究表明ＳＮＭＰｓ与昆虫气味识别有关，破，可与ＯＲ或者细胞内的蛋白相互作用坏气味分子与ＯＢＰ复合物的稳定性，使信号终止；移除膜附近的气味分子，保持神经元对低浓度气味的敏感性；在感器神经元间起通信连接作用，保持各神经元的独特性等ＰＷ一。Ｖｏｓｓｈａｌｌ等在果赃中发现种ＳＮＭＰ，与ＣＤ３６的蛋白结构和功能都很相似，可ＷＪｉｎ结合并运输脂肪酸，识别细菌的受体Ｗ及作为免疫系统的组成部分而等发现ＳＮＭＰ对于一ＰＷｅＶＡ是必要。果赃感受性信息素的，但对感受般气味分子是不必要的２．４气味降解醇ＯＤＥｓ一系列信号转化与传导么后在气味分子刺激相应受体引起，必定存在某种使气味分子失活的机制，Ｗ避免嗅觉信号饱和造成的嗅觉失灵Ｗ及持续性的化学刺激对昆虫神经系统造成巨大的伤害。气味降解酶便参与了气味分子降解的过程。－气味降解酶主要包括醋酸醋酶－Ｓ、乙酵醒酶、乙醇醋酶、过氧化物晦和谷脫甘化Ｐ９＾一转移酶、细胞色素Ｐ４５０等。１９８１年，Ｖｏｇｔ和Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄ第次在多声大蚕蛾触角中发现了气味降解酶—酷酶ＡｏｐｌＳＥ，这种醋酶可Ｗ降解多声大蚕蛾性外激素中的乙酸Ｗ０１雄蛾触角中特异性表达。随后，Ｒｂｃｚｎｓｋｉ等在烟酷組分，且在ｙｙ草天蛾触角中发现了能够分解酵类化合物的气味降解酶，不久之后在多声大蚕蛾和家蚕的触角中也发现了类４２一Ｗ，ｌ似的酵氧化酶。当昆虫嗅觉器官受到外界环境中有害化学物质的侵害时，组织中－－ＳＧＳＴ）些酶类，如谷腕甘肤转移酶（、细胞色素Ｐ４５０氧化还原酶和各种脱氨酶的含一量会增加ｆ－Ｓ－。ＭｓｅｘＧＳＴｏｌ是在烟草天蛾中发现的个触角特异的谷脱甘肤转移酶，它可Ｗ保护昆虫嗅觉系统免受有毒物质侵害和使整类物质失活的功能目前对昆虫气味降解酶的研究报道还相对较少。一ＤＥ对于性信息素和气味分子的失活机制，目前有两种模型；种模型认为Ｏｓ直接酶解气味分子或性信息素，使之永久失活Ｋａｉｓｓｌｉｎｇ认为性信息素进入感器内腔后先－５－ 与还原型的性信息素结合蛋白（ＰＢＰ）结合形成复合物，当复合物穿过感器淋己液与气味受体作用后，催化ＰＢＰ变成氧化型，从而使性信息素失活。气味降解酶参与到之后的Ｍ信息素分解的过程中。２．５气味受体ＯＲｓｔｗ嗅觉基因最巧是在脊椎动物褐家鼠中发现的，随后线虫中也发现了此类基因，在此基础上料学家们曾试图利用同源搜索的方法在昆虫中寻找同类基因，但未成功。直到一４７Ｉ：■１９９９年Ｐｅｎｎｉｓｉ等从黑腹果魄中鉴定出屋虫第。之后科学家利用，个气味受体基因生物信息方法从果蜘全基因组序列中，筛选出６２个ＯＲｓ基因，其中６１个ＯＲｓ在触角一或下飄须的嗅觉感觉神经元（〇１拉ｃｔｏｒｓｅｎｓｏｒｎｅｕｒｏｎｓ，ＯＳＮｓ）中特异性单表达ｙｙ，且４８［３送些ＯＲｓ基因在种间具有高度变异化种内各嗅觉受体基因之间同源性也很低。基于对果赃气味受体基因的研究，随后在冈比亚按蚊如ｏｐＡｅ／ｅｓｇｗｗＷａｅ的基因組中筛选ＷｓｔｗｔＲｏｂ出了７９个ＯＲｓ基因，家蚕中筛选出４８个ＯＲｓ基因。２００６年，ｅｒｔｓｏｎ和Ｗａｎｎｅｒ通过对意大利蜜蜂却＆ｗｅ巧向的基因组序列进行分析，得到了１７０个气味受体基因（包ＰＵ含７个假基因。）作为模式动物，果赃传统气味受体功能的研究更为详细。２００１年Ｗｅｔｚｅｌ等通过在ａ－ｅ爪赡卵母细胞中表达ＤＯｒ４３受体，并用双电极电压错记录（ｔｗｏｌｅｃｔｒｏｄｅｖｏｌｔａｇｅｃｌａｍｐｒｅｃｏｒｄｉｎ）发现ｒ４３ａ受体对环己丽、环己醇、苯甲酸和苯甲醇等常见的气味分子ｇ，ＤＯ有识别作用。将果赃化３Ａ嗅觉神经元中的ＤＯｒ２２ａ气味受体基因利用基因敲除技术５３５４人工敲除掉ｔ’，缺失了该基因的化３Ａ嗅觉神经元会失去对气味的感受能力ｌＨａｌｌｅｍ等同样对果蝴气味受体ＤｍＯＲ８５Ａ、ＤｍＯＲ５犯和ＤｍＯＲ６７Ｃ进行基因敲除试验，发现这Ｈ种受体对脂类有强烈的反应，而对ＤｍＯＲ８２Ａ的研究发现它对含脂的Ｈ荫反应强ａ烈，而脂类和含脂的Ｈ席是水果气味中的主要物质Ｈ和Ｓｍｉ化通过对Ｔ１感器突变￣￣Ｄｏｒ６７ｄ是感受果魄１１－ｃ体的果蛹进行研究证明信息素ｉｓｖａｃｃｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ（ｃＶＡ）的受％］体。其他屋虫中，对传统气味受体功能的研究也陆续报道。家蚕ＢｍＯｒｌ气味受体基因只在雄性触角的毛形感器中表达，通过在爪赡卵母细胞中表达ＢｍＯｒｌ受体基因，发现该Ｐ７１。Ｍｉｕｒａ受体对性信息素蚕蛾醇有特异性反应，推测是感受性信息素蚕蛾醇的受体等５８１ｒＥＵ－４碳研究发现，Ｏｌ在玉米換属昆虫中较为保守，对信息素１帰起反缸。将冈比亚按蚊ＡＯｒＯｒ２受ＡＯｒ２只对２－ｇｌ和Ａｇ体分别在果蛹的空神经元中表达，发现ｇ甲酥气－ＡＯｒｌ对４ｒ－ｌ，味分子有反应，而ｇ甲酪敏感，并且ＡｇＯ只在雌性体内表达由于４甲嵌一２－Ｏｒｌ被认为是冈比亚按蚊识别人是人体汗液的种成分，而甲酪不是，所ＷＡｇ体汗－６－ 一Ｐ９’Ｗ液气味成分的气味受体之。Ｂｏｎｂｏｔ和Ｄｉ浊ｅｎｓ等运用电生理学试验技术，发现表一一一－ｏｃｅｎ－－ｏ达在蚊子下颖须锥型感器的０ｔ８专性地识别种宿主引诱剂的对映体ｌｔ３ｌ，ｔＷ而对其它结构相似的化合物的敏感性很低。Ｒ一一ｓ基因ｒ８３ｂ在对果魄Ｏ家族的研究中发现，有个受体基因Ｏ，在几乎所有的嗅觉神经元中与传统的气味受体基因共同表达，且具有重要的作用，是传统气味受体基因６２［１在神经元树突膜上准确定位不可缺少的因素。此后陆续从其它昆虫中鉴定出〇ｒ８３ｂ的’６３ｌＨｖｔ直向同源基因，如烟芽夜蛾成巧０伽Ｓｗｍｓｃｍｓ的ｉｒＲ２、冈比亚按蚊如ｅ／ｅｓ６５￡ｌａｎＷａｔＷｇ／ｅ的ＡｇＯｒ７、西方蜜蜂／ｗｅ化於ｒａ的ＡｍｏｌＲ２等。由于在不同昆虫中命名不同一，为方便交流，后将〇ｒ８３ｂ及其同源受体重新Ｗ４个代表昆虫种名的字母（第３ｒｅｏｏｒａｎ－ｔｒｅｃｅｔｏｒｃｏｒｅｃｅｏｒ个字母表示属名，后个字母为种名的前３个字母）加Ｏ（ｏｄｐｐｔｔＷ的缩写）的形式命名。与传统气味受体不同，Ｏｒｅｏ在种间具有高度的保守性。在Ｏｒｅｏ突变缺失的果峭中气味诱导的电生理反应消失，嗅觉感受能力大大降低，在此突变体的神经元中表达冈比亚按蚊、地中海实蝴及美洲棉铃虫的Ｏｒｅｏ基因，突变体可恢复正常的嗅觉反应这说明在昆虫不同种间Ｏｒｅｏ基因的功能也十分保守。采用ＲＮＡｉ技术，化’在赤拟谷盗７Ｈ＆０疏ＷｃｏｓｔｏｗｅＭ／Ｍ和黄曲条跳甲巧Ｊｏｔｏａ的蛹期对Ｏｒｅｏ基因进行沉默，成虫均表现出对某些信息素或气味分子感受能力下降虽如此，Ｏｒｅｏ本身并不结合配体，它能提高配体和传统气味受体相互作用的效率。另外，Ｏｒｅｏ可帮助传统气味受体在嗅觉神经元树突膜上准确的定位，Ｗ及增强传统气味受体的稳定性。３嗅觉信号转导途径脊椎动物和线虫的ＯＲｓ均是通过结合特定气味分子被激活的跨膜屯次的Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲｓ）。当相应的气味分子与经典的ＧＰＣＲｓ结合后，诱导ＧＰＣＲ发生构象二ＯＲ一信，产信化弓ｓ似乎也应该遵循这改变，激活Ｇ蛋白生第Ｉ发级联反应。昆虫号传导机制。但发表在自然杂志上的两项研究表明，果魄的嗅觉信号传导途径与经典的ＧＰＣＲ途径相差很大，实际上它是由传统气味受体结合共受体Ｏｒ８３ｂ形成气味口控阳离子通道实现的。早期有迹象表明，昆虫的化学信号转导可能不同于其他嗅觉系统模型首先是昆虫的〇反Ｓ与其他物种之间缺乏同源性；其次是昆虫的ＯＲｓ虽也是走次跨膜蛋白，但其拓－肿结构与普通Ｇ蛋白偶联受体正好相反，Ｎ端在膜内，Ｃ端在神经元膜外（图１３）一这就引出了个问题，昆虫ＯＲｓ在结合了气味分子之后是怎样进行信号转导的呢？－７－ Ｃｃ一＇－＾山■０山＾化。化ＮＮｉｈＸＵ诚３ｂ＿ｎｔｉ图１－３果蜡气味受体典型的拓扑结构＾＾１－ｓｒｕｃｕｒｅｏｄｏｒａｎｒｅｃｅｏｒＦｉｇｏｉＤｒｏｓｏｉＰ．３ＴｙｐｉｃａｌｔｏｐｏｌｏｇｙｔｔｔｔｈｌａｐｐＷｉｃｈｅｒ和Ｓａｔｏ两个小组在脊椎动物细胞中表达果赃的ＯＲｓ和Ｏｒ８３ｂ，并采用膜片一，发现了。两个小组均表明错技术测量其离子流个昆虫特有的新的嗅觉信号转导模式，只有在人工培养的细胞中共表达０巧礼和传统ＯＲ才能检测到对气味敏感的离子流，送－Ｃａ意味着ＯＲＭ化异源二聚体形成了配体口控离子通道。Ｓｔｏ和他的同事采用外切膜技－Ｗ术确定了〇Ｒ〇ｒ８３ｂ异源二聚体具有配体口离子通道的特性；同时，ｉｃｈｅｒ和同事发现，在Ｏｒ８３ｂ缺失的突变体中，由气味诱导的离子通透性发生了改变。这两项研究可得出结论－，〇民〇巧礼异源二聚体形成了可渗透钢离子、钟离子、钩离子的非选择性阳离子通剛道。研究人员观察到的离子电流的几个特性可Ｗ解释昆虫嗅觉神经元在机体内的功能。在气味分子浓度高时－〇ｒ８３ｂ，气味分子活化〇Ｒ口控离子通道和动作电位的产生之间有一－１４）ｃｅｒ个较短的延时（潜伏期），符合直接Ｗｉｈ配体口控机制（图；和同事发现，－当气味分子浓度低时，气味分子刺激〇Ｒ〇ｒ８３ｂ异源二聚体时，由Ｇ蛋白调节产生的环核脊酸浓度增加，且这种环核昔酸可通过〇ｒ８３ｂ调节异源二聚体口控通道。若用Ｇ蛋白一抑制剂阻断气味诱导产物－环核巧酸的产生，果蜗ＯＲｓ会激活种环化酶来激活Ｇ蛋白，一ａ－从而产生环核昔酸。Ｓｔｏ等人做了相似的实验，也观察到些ＯＲＯｒ８３ｂ复合物对环核昔酸有敏感性，上述两个研究的结，但却无法确定这种敏感性对气味有依赖。尽管如此果均认为昆虫的ＯＲｓ为异源配体口控阳离子通道，这表明昆虫具有独特的、不同于其他动物的嗅觉信号转导机制。－８－ ＨＳｆｓｈｏｒｔ＇ＳＯ。。。心。＞。雌＋＊ｃ．與沪谦＆山！ｎｔＣ问扛ＮＫ＾ｌ．ｙ＂Ｉ＾｜ｌＳｌｏｗＡＴＰｆ；ＡＭＰＴＷＧＹＬＧｎｅｄｒｏｌｏｇｐ图￣４１昆虫双重模式暧觉信号转导模式［７２１ｉ－４Ｄｏｕｂｍｏｄｉａ化ｗａｉｎｉｎｓｅｃｆＦｌｅｅｒ〇１ｃｔｏｒｓｎａｌｔｒａｎｄｕｃｔｉｏｎｉｇ．１ｌ化化ｙｇｐｙ之后出新的观点。２００８年，Ｗｉｃｈｅｒ，又不断有科学家对昆虫嗅觉信号的转导机制提７３［］Ｊｓ０巧化可单独形成阳离子通道。ｏｎｅ等等人研究发现在传统嗅觉受体缺失的情况下，４８［］Ｎｉｃｈｏｌｓ等研究认为０民和〇巧化对口控阳离子通道的的研究得到了同样的结果。但７５一［］Ｎ浊〇民和０巧化Ｃ通透性均起作用。ａｇａｗａ等的研究结果支持这观点，并且认为？端的氨基酸对〇心〇巧化口控阳离子通道的功能具有重要作用。４本研究的目的与意义嗅觉对昆虫的生存与繁殖极为重要。通过对昆虫嗅觉机制的研究，可为经济、高效、环保的进行农业害虫和卫生害虫的防治提供新的思路；也可为合理饲养和利用经济昆虫。，提供科学依据近几年，随着果晚基因组测序的完成Ｗ及各种分子生物学和细胞生物学实验技术的发展，对昆虫嗅觉机制的研究也更加深入。目前，昆虫的嗅觉感受过程己基本清楚的介导者，而逐渐成为研，其中参与该过程的嗅觉受体被证明是嗅觉信号转导究的热点。一的产量和产品质蜜蜂是种重要的经济昆虫，它们不仅可Ｗ为作物传粉，提高作物量，还可生产蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂胶和蜂蜡等营养和医药价值高，应用广的蜂产饲料少，，抗逆、抗病性强善于利用品。中华蜜蜂是我国宝贵的蜂种资源，它具有消耗零星蜜粉源Ｗ及产卵有节制等优点，非常适合在我国的山林地区饲养，其授粉作用在保持我国生物多样性方面发挥了重要作用。Ｗｅｓｅｍ－ｂ本研究采用巧光定量和ｔｌｏｔ技术对中华蜜蜂气味受体基因的ｍＲＮＡ和蛋白表达进行相对定量分析，采用免疫组化技术对两基因的蛋白－９－ ，ｗ期通过对两基因分子表达特性的研究表达进行定位分析，初步分析预测其可能具有的功能。－－１０ 第二章和＾ｃｅｒＯｒｃｏｍＲＮＡ在中蜂各组织的表达妍究１试验材料与方法１．１试验材料１．１．１试验样本采集试验所用中蜂样本采自山西农业大学动物科技学院实验蜂场。一采样方法：在蜂群中加入张新巢脾，蜂王产卵后记录日期，待工蜂即将羽化出房化将巢脾带回实验室，放入恒温培养箱中使其继续发育。待新蜂出房后，标记蜜蜂若干只（＞１００只），之后随机捉取处于内勤蜂时期的蜜蜂８０只，取其触角、头、胸、腹、足为内勤蜂样本。随机从蜂箱前捉取足部携带花粉团的工蜂８０只左右即为采集蜂样本。每次采样，将采得的蜜蜂在活体状态下用眼科綴分别取其触角、头、胸、腹、足，迅速‘投入液氮中－８０Ｃ保存，在研体中加液氮研磨至粉状，加入装有Ｔｒｉｚｏｌ的ＥＰ管中，至ＲＮＡ提取。１．１．２试验仪器高压灭菌锅ＭＣＳ－３０２０ＳＡＮＹＯ（日本）－Ｆ制冰机ＳＩＭ１２４ＳＡＮＹＯ（日本）微量移液器Ｇｉｌｓｏｎ（芬兰）／和Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（德国）ｐＨ测定仪Ｔｈｅｒｍｏ（美国）超低温冰箱Ｔｈｅｒｍｏ（美国）普通ＰＣＲ扩増仪ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（美国）紫外凝胶成像分析系统Ｂ－ＲＡＤ（）ＩＯ美国实时巧光定量ＰＣＲ仪ＭＸ３０００ＰＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（美国）商速冷冻离也机Ｃｅｎｔｒｉｆｏｇｅ５８１０ＲＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（德国）－０００Ｎ微量核酸蛋白测定仪ＮＤ１ａｎｏＤｒｏｐ（美国）电子天平ＡＲ１１４０上海奧豪斯超净工作台ＢＣＭ－１０００苏州安泰一ＤＥＦ－６２真空干燥箱１０上海恒超纯净水系统ＮＷ１０ＶＦ上海康雷游锅混合器〇以９０１江苏海口－－１１ 恒温水浴锅北京医疗设备厂１．１．３试验试剂Ｔｒｉｚｏｌ大连宝生物工程有限公司（Ｔａｋａｒａ，日本）？ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ大连宝生物工程有限公司（Ｔａｋａｒａ，日本）？ＲＴ－ＰＣＲ工程有限公司ＳＹＢＲ？ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＫｉｔ大连宝生物（Ｔａｋａｒａ，日本）ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ去离子水天根生化科技（北京）有限公司１．２试验方法１．么１溶液的配置ＤＥＰＣ水：用移液器吸取１ｍＬＤＥＰＣ加入１０００ｍＬ蒸馈水中，充分攒拌均匀后，高温高压灭菌。，室温保存〇７５／〇乙醇；Ｗ乙醇与ＤＥＰＣ处理水３：１的体积比进行配置。漠化乙锭储存液（ｌＯｍｇ／ｍＬ）：电子天平称取Ｉｇ漠化乙锭加入到ｌＯＯｍＬ蒸馈水’Ｃ中，磁力揽拌数小时使其完全溶解，装入栋色瓶滴瓶中，４保存。５０Ｘ．？ＴＡＥ缓冲液：Ｔｒｉｓｂａｓｅ１２１ＥＤＴＡ＆９．３．ＬＬｇ，Ｎ２，冰乙酸２８５ｍ，定容至５００ｍ，ｇ高温高压灭菌。１．２．２总ＲＮＡ的提取及检测１．２．２．１ＲＮＡ的提取试验前的准备工作：由于ＲＮＡ酶无处不在，为防止在提取过程中ＲＮＡ被降解，试验前要将所用到的离也管、枪头、枪头盒等器皿均用化１％ＤＥＰＣ水浸泡过夜，然后高。温高巧灭菌，真空干燥箱烘干试验过程中的注意事项：１０００ＲＮＡｓａｅ清：实验前对超净工作台面用１稀释的固相除剂一ＰＥ口，擦拭，严格穿戴白大掛、次性手套和罩操作过程中试剂加取、离也管的开启都要在超净工作台内进行。ｒｚｏｌ试依据所买Ｔｉ剂说明书进行总ＲＮＡ的提取，主要过程如下：’－Ｃ冰撕、溶解于Ｔｒｉｚｏｌ中的样品取出，室温下充分溶解（１）将保存于箱，１２０００ｇ°的离也力４Ｃ离也１０分钟，用移液器小也将红色的上清液移入到新的邸管中，沉淀弃掉。（２）向每个ＥＰ管中依次加入２００咕氯化震荡１５ｓ，使其充分泡合。室温下静‘置３ｍｉｎ，１２０００ｇ离也力４Ｃ离也１５ｍｉｎ。慢慢从离也机中取出，注意不要晃动，此时溶液分为上层无色水相，中间酪氯仿层和底层粉红色有机层三层，ＲＮＡ位于上层无一ＥＰ色水相中。用移液器小必吸取上层无色液体至：新管中，注意不要吸到中间的酷氯仿层。－２－１ ’Ｃ（３）向ＥＰ管中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置ｌＯｍｉｎ，然后４１２０００ｇ离也１０ｍｉｎ，此时可看到ＥＰ管底部有米粒大小的白色沉淀觀倒掉上清液，向卧管中加入１ｍＬ７５％的酒精洗涂沉淀。也力’（４）Ｗ７５００ｇ离４Ｃ离也５ｍｉｎ，倒掉酒精，用白色小枪头将残留的酒精吸－５￣１０ｍｉｎ５０ｘＬＲＮｓｆｒｅ。掉，在通风厨中干燥，最后加的ａｅｅ去离子水充分溶解沉淀｜１．２．２．２ＲＮＡ的检测（１）：。电泳时琼脂糖凝胶电泳检测试验前将电泳槽用ＤＥＰＣ水浸泡过夜，将５叫＾待测１＾乂样晶与１ｉＬ上样缓冲液均匀混合，加到凝胶上样孔中进行电泳，用紫外凝胶＾成像仪观察结果。如果提取的总ＲＮＡ完整无降解，电泳结果可看到Ｈ条清晰的带，分别为１８ｓｒＲＮＡ、２８ｓｒＲＮＡ和５ｓｒＲＮＡ，且２８ｓｒＲＮＡ条带的亮度约为１８ｓｒＲＮＡ的两倍。（２）微量核酸测定仪检测：用微量核酸蛋白测定仪检测所提取的总ＲＮＡ纯度及浓一０Ｄ￣１．８度，般值在２．０之间的说明提取结果较好，大于２．０的，说明ＲＮＡ己部分降解小于１．８的，；说明有蛋白质污染。１．２．３反转录？一按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔＲＴｒｅａｅｎｔｋｉｔ反转录试剂食说明书进行ｃＤＮＡ第链的合成。ｐｇ？总体系为２０咕，包括；ＴｏｔａｌＲＮＡｌＯＯＯｎｇ、５ＸＰｒｉｍｅＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ４＾ｉＬ，余下体积‘’ＲＮ－ｆｔｅｅ去５５用ａｓｅ离子水补充。反应程序为３７Ｃ１ｍｉｎ，８Ｃ５ｓ。１．２．４引物设计根据本实验室前期获得的基因ｃＤＮＡ序列设计相应的巧光定量０引物１，内参基因締Ｗ妒的引物根据西方蜜蜂相应序列（ＸＭ６２５１０〇设计，引物序列＿－见表２１。表２－１巧光定量ＰＣＲ引物－－Ｔａｂｌｅ２１ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒＲＴＰＣ民ｑ基因引物序列产物长度＇＇ｒ－ＧｅｎｅｓＰｉｍｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅ５３Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ（）Ｆ：ＡＧＧＡＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＡＣＧＡＧＡｃｅｒＯｒｌ１１７ｂｐＲ：ＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＦ：ＧＧＡＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡｃｅｒＯｒｃｏ１１８ｂｐＲ：ＣＣＡＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＧＡＦ：ＧＡＴＴＣＣＣＧＡＴＴＧＧｎＴＴＴＧＡＲｐｓｌ８１４９ｂｐＲ：ＣＣＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＴ－－１３ ．１２．５反应条件的优化首先，参照所购的巧光定量试剂盒说明书所建议的反应条件，Ｗ前期反转录合成的ｃＤＮＡ为模板，运用常规梯度ＰＣＲ扩増技术，筛选内参基因和目的基因引物的最佳退火温度和合适的ｃＤＮＡ模板浓度。利用常规ＰＣＲ筛选出来的最佳退火温度和ｃＤＮＡ模板浓度ＰＣＲ一仍需在巧光定量仪上进行验证。确认可行后，方可进行下步试验。１．．２６标准曲线的建立Ｗ前期反转录实验合成的ｃＤＮＡ为模板，依次２倍稀释７个浓度梯度，根据前期优ＰＣＲ，进行巧光定量反应。利用相应的软件分析反应结果化得到的最适试验条件，计算内参基因和目的基因的标准曲线方程、扩増效率、化及决定系数。当目的基因和内参０？１１０％之间＜０．１，且基因引物的扩增效率在９，决定系数化说明引物可用实验结果可Ｗ采用相对定量公式进行分析。１．２．７如心ｗＯｒｃｏ的相对定量分析？反应体系为：总反应体系２０＾１以其中ｃＤＮＡ模板２Ｌ８￥６氏巧６／？扣＆＜：妨ＩＩｎ，９０、ｄｄＨ１ＨＬ，上下游引物（１０ＨＭ）各为０．８曲，ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅＩＩ０．４阵，２〇６呼。反应程序为：％＾预变性３〇８；循环条件９５＾５８，６３１：３〇８４０个循环反应。每个样本重复３次。依据前期实验所做的标准曲线Ｗ及实验所得Ｃｔ值计算相对表达量。１２８．．数据处理与分析ＡＡａ巧光定量ＰＣＲ结果的分析有多种方法，本实验采用的是ｒ法。通过前期目的基因与内参基因的标准曲线的建立确定起始ｃＤＮＡ浓度与反应的Ｃｔ值有较好的线性关系，８１７９［’］目的基因和内参基因的反应平行性较好后，说明试验结果可采用方法（ａ为光－吸收值达到域值所需的循环数－ＡｅＡＡｃｔ；２嘴目的基因相对内参基因的表达量；２为每个试验组的Ａａ与对照组的相对数值）进行分析，计算目的基因相对于内参基因ｍＲＮＡ的相对表达量，并用ＳＰＳＳ软件进行方差分析。－－１４ ２结果与分析２．１总民ＮＡ提取及检测通过微量核酸测定仪对所提取的各组织样本ＲＮＡ的浓度和纯度进行检测，结果显ＲＮＡ的公２６００公２Ｓ０均介￣示（９／．８２．０之间，说明所提取的ＲＮＡ的纯度较，各组织样本于１高。琼脂糖凝胶电泳检测结果，２８ｓ、１８ｓ条带清晰，无明显降解，符合后续试验要求。一化＿＿＿＿＿＿＿Ｉ沒这Ｈ一Ｓ图２－１黄光定量部分样品总ＲＮＡ检测结果－民－巧：ｏａｌｏｍｒａｍｅｓｆｂｒ民Ｔｇ．２１ｅｓｕｌｔｏｆ（ｔＲＮＡｆｒａｔｓｌＰＣ反ｐｐｑ２．２标准曲线的建立－２心ｅｒＣＷ、如ｅｒＯｒｏ两基因与内参基因巧的标准曲线结果如图２。从图中可Ｗ２９９－看出Ｒ值都在０．１之间，说明两，两个目的基因和内参基因对应的标准曲线决定系数基因的ａ值和ｃＤＮＡ起始浓度之间具有良好的线性关系；两目的基因和内参基因的标准，符合试验要求曲线斜率相差较小，说明试验具有较好的重复性，可Ｗ采用公式进行相对定量分析。－１５－ ’’．，ｊ‘Ｉ：‘：藤濡宇．！：：：Ｊ？■？？３。］？．…巧，ｊ麵Ｉ曜？？？？？＊＊？？？２６：’■Ｐ？Ｍ．：｜：＂■ｇ＾．．．ｔｉ．．＊２０ｉ．．■＾＇？？？？？？８１＾：：ＩＤ．１ｔＩ＊ｎｔａｕａｎｔｔｒｅａｔｖｅＩｉｉｌＱｉｙｌｉ（），棘ｗ肿ＷＷＷ抓＊乂脚？蛛蛛＊？ｗ＊？—？＾？－－＊—．％．，—，＇、？－，、，？、，？ｗ，？＊＜＊，，，＇？＜？＞－．．，《＇，—■ｇ｛？ｖｎｗｗｗｊｓ－？ｗ，？＂乂？！？？度’》？一ｉ？５－和７图２２心ｅｒＯｒ／、心ｅｒＯｒｃｏ？／？ｓ７Ｓ的标准曲线Ｆｉ２－２ｖｅｏ＾ＡｃｅｒｒｌｃｅｏａｎｄｓｌＳ．ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒＯＡｒＯｒｃＲｐｇ＾２．３样品护增动力学曲线及嫁解曲线一根据巧光定量ＰＣ民试验技术的要求，，试验需要有Ｈ个层次的校正，为物理校正即添加巧光ＲＯＸ来校正ＰＣＲ反应管与管之间的误差；二为重复校正，即要求至少Ｈ个重复Ｈ为内参基因的校正，用。本研究采用Ｈ个技术重复对；来校正样品间的随机误差心ＪｅｒＯｒＺ、ｖ４ｃｅｒ（＞ｃｏ及巧ｍＲＮＡ的表法进行了相对定量分｜ｆ，部分样品扩増动力学曲＂＂－３。，Ｓ线如图２由图可见，目的基因和内参基因扩増曲线拐点清晰，基线平直形曲线良好。－６－１ ’？ｒｒ巧；邮Ｖ斬．Ｔｉ巧編肺ｉ巧削－．＜ｖｈ論雜皆贈种禪郵灣酵酵晒■：：；：：：：：：１ｉｉｉ；Ｉ青；－．－．．．．…．…．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ｉ；；１Ｙ１１：ＩＩＩ獅ｆ‘：ｓｓ３ｚｔｙ＿＿若＿麻■－；；Ｓ；；Ｉ－ｉ■－ｉ－Ｉ；ＩｉＩＩｉ，ｉ，ｉ，ｉＩｉ，ｉ＇；ＩｉＩ舍；＊．－Ｋ－？１２］４；；ｊ：：４，巧玄２：２１：１．２１；；；４ｗＣｙ－７？７图２３、灰＾６＾仇＜：〇和护（＾的扩增动力学曲线－Ｍｒｅｎｅｓｏｆｙｉｃｅｒ／？７ｓ７＆ＳＦｉ２３ＡｍｔｉｏｎｌｏｔｓｆｂＣＷａｎｄ．ｐｃａｇ，／ｇｐ－、ｒｅｒ化ＣＯ基因及ｗ／Ｓ部分样品扩增的烙解曲线，各图２４为心Ｗ＞７Ａ々，从图中可见一一Ｔｍ峰值，说明在扩增过程中无非特异扩个基因的烙解曲线均为单，扩增产物值均二。増及引物聚体，检测结果均來自于组织中目的基因的扩増产物所结合的巧光信号’．．，绝．．纖場施屯娩Ｚｉ纖圈隱職■ｊ誦隱圍３脑１醒串｜！：．：ｒｒ備Ｉ１／；圓ｒＩＩＩ国＇巧ＩＩｆｌ－－‘Ｋ４巧３Ｓ：ｉ：￡４Ｋ巧玄：ＵＨ巧２ｊＩＴｗ＊ｒ化巧；巧＇－？：：吉Ｉ－－：？■尸＿；；：弯酱旱￣４心ｅｒＯｒ？图２／、如ｅｒＯｍ和雌的扩增炫解曲线－ｃｕｒｖｅｓｏｒｅｎｅｏｆｃｅｒｒｌＡｃｅｒＯｒｃｏａｎｄｉ２４ＤｉｓｓｏｃｉａｔＲｐｓ１８ＦｉｏｎｆｓＡＯｇ．ｇ，－１７－ ２．４内勤蜂和采集蜂的表达特点Ｗ巧ｓ／Ｓ１为校正参数，采集蜂腹部的ＡＱ均值作为相对定量的基准ｐ：＾，根据胃２分析法计算出在内勤蜂和采集蜂不同组织的转录表达情况２－５。，如图相对定量分析结果表明，的转录本在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，且在触角中表达量远高于其他组织，内勤蜂触角的表达量是腹部表达量的１５倍左右；采集蜂触角的表达量是胸部表达量的２０倍左右。在内勤蜂各组织中腹部的表达量仅次于触角，其次是胸部，头部的表达最少；而在采集蜂各组织中，胸部是表达量仅次于触角的组织，而足中的表运最少。另外，在采集蜂各，然后是头部组织的表达量普遍高于内勤蜂。ＩＨＮｕ一＿＾＾化７００－ｊＪ６５０－ＳＯ。：議ｆ３５０：＾＾。１＾■Ｒｏｏｑ＊＊—ＩｊＪｌ。ＡｎＨＴＡｂＬ组织Ｔｉｓｓｕｅｓ图２－５在内勤蜂和采集蜂不同组织的相对表达－Ｆｉ．２５艮ｄａｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏ打５ｒｅ打ｔｓｓｕｅｓｏｆｎｕｒｓｅａｎｒａｅｒｇｐｍＲＮＡｉｎ出瓶ｔｉｄｆｏｇ注：Ａｎ：触角；比头（去除触角）；Ｔ：胸；Ａｂ：腹；＾足；Ｎｕ：内勤蜂；Ｆｏ：采集蜂Ｎｏ化：Ａｎ：Ａｎｔｅｎｎａ；Ｈ：Ｈｅａｄｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｅｎｎａ；Ｔｈｏｒａｘ；Ａｂｄｏｍｅｎ；Ｉ＾：Ｌｅｇｓ；Ｎｕ：Ｎｕｒｓｅ；Ｆｏ：Ｆｏｒａｇｅｒ－－１８ ２．５内勤蜂和采集蜂／＾。６冶／＾０的表达特点Ｗ内勤蜂胸涨４ｃｅＷ＞ｃｏ的表达量为基准，研苑４ｃｅＷ＞ｃｏ在内勤蜂和采集蜂不同组织－的表达情况（图２６）。－６可Ｗ看出从图２，＾ｃｅＷ＞ｃｏ的转录本在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，且在触＾角中的表达量远高于其他组织，其中，内勤蜂触角中／ｃｅｒＯｒｃｏ的表达量是足部表达量的１３４０１０００，倍左右；采集蜂触角中的表达量是头部和脚部表达量的倍左右均差异极显著，，胸部的。在内勤蜂各组织中，足部的表达量仅次于触角其次是头部和腹部巧达最少，，且；而在采集蜂各组织中头部和胸部的表达量仅低于触角两组织中的表达量几乎无差异，其次是腹部，而化中的农达最少。另外，在采集蜂各组织的表达量普遍高于内勤蜂（足部陈外）。＊＊ＮｕＦ曰Ａ１２０００Ｔ］－１１０００ＤＯ＾－１００００腳９０００＾麵ｓｏｏｏ－己．議７〇〇〇：Ｉ麵Ａ？６０００－Ｉ羅巧５０００＾｜ＡｎＨＴＡｂＬ组织Ｔｉｓｓｕｅｓ图２－６灰ｗＯｒｃｏ在内勤蜂和采集蜂不同组织的相对表达Ｆ－ｍＲＮＡｆｉｎｕｆｇ．２６ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡｃｅｒＯｒｃｏｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｒｓｅａｎｄｏｒａｇｅｒ：Ｔ：ＴｈｒａｘＡｂＬ／ｕ注Ａｎ：触角；吐头巧除触角；胸ｏ；：腹；足；Ｎ：内勤蜂；Ｆｏ：采集蜂）Ｎｏ化：Ａｎ：Ａｎ化ｎｎａ；Ｈ：Ｈｅａｄｗｉ化ｏｕｔａｎｔｅｎｎａ；Ｔｈｏｒａｘ；Ａｂｄｏｍｅｎ；Ｉ＾：Ｌｅｇｓ；Ｎｕ：Ｎｕｒｓｅ；Ｆｏ：Ｆｏｒａｇｅｒ－１９－ ３．讨论一一工蜂承担了除产卵外的蜂巢内蜜蜂是种高度社会性生活的屋虫，在个蜂群里，一切工作外的，内勤蜂是蜂群中的幼、青年工蜂个体，主要从事保温、扇风、饲喂幼虫和蜂王、清理巢房、巧实花粉、酿蜜及筑巢等工作；采集蜂是蜂群中的壮年蜂，主要承担着外出采集花蜜、花粉、水和树脂等工作。，Ｏｒｅｏ在中蜂内勤蜂和采集蜂各组织中均有表法本研究结果显示，这与张林雅等报道的Ｏｃｏ在内勤蜂各组织中只在触角和足中表达，而在采集蜂各组织中均有表达有所差ｔ气推测泣可能是由于巧光定量技术对ｍＲＮＡ表达量的差异检测非常灵敏异，采样时间、采样地点Ｗ及试验过程中方法和手法的差异都会对实验结果造成一定的影响。且本试验中Ｏｍ？在内勤蜂的触角和足中的表达较多，头部、胸部和腹部的表达较少，触角中的表达量是头部的１６００倍，是胸部的３５００倍，这使得头部、胸部和腹部的表达量几乎可ＵＬ忽略不计一，因此试验结果整体与张林雅等的报道相致。张林雅等研究发现，中蜂Ｏｃｏ在内勤蜂和采集蜂触角中的表达量均髙于其他组织，且采集蜂中的表达量普遍高于内勤７９一ｔ３致的蜂（足除外），这与本研究的结论也是。在其他昆虫中对獻ＣＯ表达特性的研究也有较多的报道，如爪实魄、棉铃虫、桃蛙候、斜纹夜蛾、中红侧沟虽蜂、家蚕等在这些报道中，化ＣＯ基因或在触角中特异性表达，或在触角中表达量最高，与本研究结ｃｏ一果基本相符。这与Ｏ基因在不同昆虫间的保守性致。对于传统气味受体表达研究的诸多报道显示，大部分传统气味受体在成虫触角中特６３ｓｔｌｔｗＵ异性表达，如烟芽夜蛾掛？パ、家蚕公ｍＣＷ和执ｎＣＷ、苹果褐卷蛾邱从／和邱〇非Ｗ及棉铃虫中巧等１０个传统气味受体基因等。也有部分报道中传统气味受体基因在昆虫触角Ｗ外的其他组织中少量表法，如孔畅仪等对小菜峨Ｈ个普通气味受体基因巧化？６、户Ｊ如０化？７和巧Ｖ化Ｗ八的表达谱的研究显示，Ｈ个基因除在触角中大量表达一ｗｔｉ、。外，在嫁下唇须和头部中也有定量的表达，吻／０ＷＳ在雌蛾腹中也有少量表达杨承远等选取了较多的发育时间点和组织，对家蚕嗅觉受体基因的表达特征进行了较为全面的研究，结果表明家蚕嗅觉受体基因广泛表达于各组织而本研究中心ｅｒＣＷ基因在中蜂内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，且均在触角中表达量最高。由于不同的传统气味受体特异性感受不同的气味分子，因此传统气味受体间具有较大的变异，不同物一种间或同物种不同气味受体基因间的表达特性很难进行比较，这也从侧面反映出不同慶虫对气味分子感受过程的特殊性与复杂性。因采集蜂主要承担外出采集蜂蜜和花粉的工作，而基因在采集蜂各组织中表达普遍高于内勤蜂，推ｉＵｃｅｒＯｒｉ可能与蜜蜂识别花香气味有关。－２０－ ？４．小结ａ－ｍｅＰＣＲｅｒＯＷ本研究采用Ｒｅｌｔｉ技术，对中华蜜蜂内勤蜂和采集蜂不同组织心、ｍＲＮＡ基因的表达特性进行了研究。结果表明，两基因在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，表达规律也较为相似，均在触角中表达量最多，且在采集蜂各组织中的表达量普遍高于内勤蜂一。此研究结果可为两基因的功能研究提供定的参考依据。－２－１ 第Ｓ章ＡｃｅｒＯｒｌ和ＡｃｅｒＯｒｃｏ受体蛋白在中蜂各组织的表达妍究１材料与方法１．１试验样本采集供试样本同样采自山西农业大学动物科技学院实验蜂场。采样方法同第二章。每次采样时，将采得的蜜蜂在活体状态下用眼科綴分别取其触°Ｐ－、足．５ｍＬ８０Ｃ保存。角、头、胸、腹，装入１的Ｅ管中，１．２试验化器及试剂１．２．１试验仪器全功能微孔板检测仪美国伯腾仪器有限公司ＥＰＳ３００电泳仪电源上海天能ＢＧ－ｒＭＩＮｖｅＩ迷你垂直电泳仪北京百晶生物技术ＢＧ－ｂｌｏｔＭＩＮＩ迷你垂直转印仪北京百晶生物技术ＦＯＲＭＡ７００ＳＥＲＥＳ型超低湿冰箱美国ＴｈｅｒｍｏＣｅｎｔｒｉｆｉｉｇｅ５４１５Ｒ型高速冷冻离必机德国ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＮＤ－Ｎａｎｏｄｒｏ１０００型核酸蛋白测定仪美国ｐＭＬＳ－３０２０型全自动蒸汽灭菌锅日本ＳＡＮＹＯＱｋ９０１型游锅仪江苏其林贝尔ＬＸ－２００型迷你离也机江苏其林贝尔ＰＨ５１０型ｐＨ仪美国Ｔｈｅｒｍｏ打化ｅｒＡＲ－１１４０分析天平美国ＯＨＡＵＳＭｉｌｌｉ－超纯水机美国ＴｈｅｒｅＱｒｍｏＭｉｌｌｉＰｏ型ＴＳ－ｈａｋ江苏其林贝尔１ｏｒｂｉｔａｌｓｅｒ－ｎｓｆｅｒｅｎｃｅＴＳ８Ｔｒａｄｅｃｏｌｏｒｉｎｇｓｈａｋｅｒ江苏其林贝尔ＨＤＢ－ＰＬＵＳ型恒温金属浴北京吴诺斯一－ＤＺＦ６２１０型真空干燥箱上海恒ＳＭ－ＦＳＡＮＹＯ１２４型制冰机日本－２２－ １．２．２试验试剂及配方１．２．２．１试验试剂０．４５ｆｉｉｎＮＣ膜武汉博±德生物工程有限公司－ｋＤａｍｋｅｒ工程有限公司１０１７０彩色预染蛋白ａｒ武汉博±德生物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白上样缓冲液５Ｘ（变性）武汉博±德生物工程有限公司ＴＥＭＥＤ武汉博±德生物工程有限公司ＨＲＰ－山羊抗兔ＩｇＧ武汉博±德生物工程有限公司ＨＲＰ－山羊抗鼠ＧＩｇ武汉博±德生物工程有限公司超敏ＥＣＬ化学发光即用型底物武汉博±德生物工程有限公司脱脂奶粉光明牌ＢＣＡ蛋白定量试剂盒武汉博±德生物工程有限公司１．２．２．２溶液配方〇３０／〇Ａｃｒ／Ｂｉｃ（２９．２：０．８）：丙稀醜胺（Ａｃｔ）２９．２ｇ，甲叉双丙稀醜胺（Ｂｉｃ）０．８ｇ，’ｌＯＯｍＬ４Ｃ保。加入双蒸水，揽拌溶解，存’１０％ＳＤＳ：ＳＤＳ５ｇ，溶于５０ｍＬ蒸馈水中，６０Ｃ水浴加热溶解，室温保存。’〇！０／〇过硫酸馈（ＡＰ）；过硫酸钱化Ｉｇ，溶于ＩｍＬ的双蒸水中，栋色瓶装，４Ｃ保一存，周内用完。ｌ．Ｏｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（Ｈ７．５）：Ｔｒｉｓ碱３０．２９２００ｍＬｐｇ，溶于双蒸水中，用浓盐酸调ｐＨ至７．５，最后用双蒸水定容至２５０ｍＬ，４Ｃ保存。１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：ＴｒｉｓＩｔ４５．４２ｇ，２００ｍＬＨ至°调ｐ８．８，最后用双蒸水定容至２５０ｍＬ，４Ｃ保存。０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ６．８）；Ｔｒｉｓ碱１５．１４ｇ，溶于２００ｍＬ双蒸水中，用浓盐酸‘Ｃ。调ｐＨ至６．８，最后用双蒸水定容至２５０，４保存ｍＬ１．７４ｍｇ／ｍＬＰＭＳＦ；ＰＭＳＦ０．０１７４ｇ，溶于ｌＯｍＬ异丙醇中，充分溶解后，分装于°－Ｃ。１．５ｍＬ离也管中，２０保存‘－２０％Ｔｗｅｅｎ－２０：量取２ｒｎＬＴｗｅｅｉｉ２０ｌＯｍＬＣ。，加蒸馈水至，充分混匀后４保存－２３－ 表４－％１聚丙嫌敌胺分离胶（１０％）和巧缩胶（５）配方Ｔａｂｅ－ｒｅｃｅｎｌ４１Ｔｈｅｉｐｅｏｆ１０％ＲｅｓｏｌｖｉｎｇＧｌａｎｄ５％ＳｔａｃｋｉｇＧｅｌ体积（ｍＬｖｏｈｍｉｅｎｉＬ，）（）巧剂１０％分离胶５％浓缩胶Ｒｅａｇｅｎｔｖｎ１０％ＲｅｓｏｌｉｇＧｅｌ５％ＳｔａｃｋｉｎｇＧｅｌ双蒸水（ｄｄＨ２〇）９．９６．８〇３０／〇Ａｃｒ／Ｂｉｃ２９．２：０．８８．３１．７（）１Ｈ－．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ８？６．３（ｐ巧０－．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌＨ６．８１．２５（ｐ）１０％ＳＤＳ０．．２５０１１０％ＡＰ（过硫酸锭）０．２５０．１ＴＥＭＥＤ０．０１００１．Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）２５１０Ｒ２５０考马斯亮蓝溶液；考马斯亮蓝Ｒ２５０化Ｉｇ，冰醋酸ｌＯｍＬ，己醇４０ｍＬ，加蒸馈水定容至１００ｍＬ。Ｒ２５０考马斯亮蓝脱色液：冰醋酸ｌＯｍＬ，己醇４０ｍＬ，加蒸馈水定容至ｌＯＯｍＬ。电泳缓冲液：Ｔｒｉ碱３．０３ｇ，甘氨酸１８．７７ｇ，ＳＤＳＩｇ，加蒸馈水至１０００ｍＬ，溶解后室温保存。：８ｉｓ转移缓冲液．７７Ｔｒ碱３．０３乙醇２００ｍＬ，加蒸馈水至１０００ｍＬ甘氨酸１ｇ，ｇ，，３￣溶解后室温保存，可回收利用５次。ＩＸ５ｍＬ１０丽春红染聽丽春红Ｓ０．１ｇ，冰醋酸，加蒸馈水至０ｍＬ，室温保存。ＴＢＳ缓冲液：１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＬ，ＮａＣｌ８．８ｇ，加蒸馈水至１０００ｍＬ，°Ｃ胆存４。ＴＢＳＴ缓冲ｍＬ２０％Ｔｗｅｅｎ－ＴＢＳ７００ｍＬ。液：１．６５２０，，混匀后使用，现配现用封闭聽脱脂奶粉〇．５ｇ，ＴＢＳＴｌＯｍＬ，现配现用。１３试验方法．１．义１多克隆抗体的制备（１）免疫原制备：根据实验室前期获得的中华蜜蜂心ｅｒＯ／、灰ｅｒＯｃｏ基因ｃＤＮＡ序列查找跨膜序列保守区，设计并合成相应多肤４ｍｇ，纯度＞７５％，将１．５ｍｇ的该多化偶联到ＫＬＨ上，脱盐后作为免疫原；将化５ｍｇ的该多化偶联到ＢＳＡ上，脱盐后作为检测原。（２）免提免疫前抽取新西兰白兔血清ＩｍＬ／只，共２只，留作阴性血清。使用部分合成的免疫原注射到白兔体内进行免疫。初步免疫后进行加强若干次，在免疫后的第２５天取血进行ＥＬ投Ａ或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，第４２天进行终放血。－２４－ ＥＵＳＡ法和Ｗｅｓｅｍ－ｂｏ（３）纯化抗体检测：采用间接ｔｌｔ对最后得到的纯化抗体进行检测。此部分试验委巧京天成生物技术有限公司完成。１．３．２组织蛋白样品的制备一研磨组织前用酒精棉球将试验所需的剪刀、缓子、研鉢和研梓等擦拭遍，并向研。鉢中倒入少许酒精，点燃，待酒精燃尽后冷却备用（１）将ＥＰ管中保存的蜜蜂各组织倒入研体中，向研体中加入液氮研磨至粉末状，＝装于１．５ｍＬ离也管中，并按组织重（ｇ）：蛋白裂解液体积（ｍＬ）１：１０的比例加入相ＰＭ＝ＭＳＦ应量的组织蛋白抽提液，并按ＳＦ溶液：蛋白裂解液１：１０００体积比加入Ｐ溶液（蛋白酶抑制剂。）’－ｍｉｎ（２）冰上静置１３ｈ后，４Ｃ、１２０００离也１０，取其上清液分装于多个小离ｇ’－８０Ｃ冻存备也管中，取少量蛋白样品进行蛋白浓度测定，其余的用。１．３．３蛋白含量的测定采用ＢＣＡ法进行测定，试验原理：在碱性条件下，蛋白质可Ｗ将二价铜离子还原＋＋ｕ为亚铜离子Ｃｕ，Ｃ与ＢＣＡ试剂络合形成紫色物质，送种紫色络合物的吸光值与蛋白浓度成正比。测定该紫色物质在％２ｎｍ处的吸收值，，对照用标准晶绘制的标准曲线即可计算得到所测蛋白的浓度。一ＡｍＬ．ＮａＣｌ（１）标准品浓度梯度配制：取管新的冻干标准品化Ｓ）加入Ｉ０９％溶液２ｍ／ｎ止、１．５ｍ／ｍＬ、１ｍ／ｍＬ、０．７５ｍ／ｍＬ、０．５ｍ／ｍＬ、０．２５ｍ／ｍＬ、，然后依次配制ｇｇｇｇｇｇ０．１２５ｍｇ／ｍＬ和０．０２５ｍｇ／ｍＬ８个浓度梯度。工作撤依据标准品和样品数量：（２）配制，按试剂Ａ：试剂Ｂ为５０１的体积比配制工作液，均匀混合。（３）标准品和样本每个取２５ｎＬ加入％孔板中，然后每孔加入２００叫＾ＢＣＡ工作°液３７Ｃ反应３０ｍｉｎ，待冷却到室温后，用酶标仪设置程序进行测定。，－１．３．４ＳＤＳ聚丙浦醜胺凝胶电泳（１）将厚、薄玻璃板对齐后放入制胶器中夹紧。（２）－ＴＥＭＥＤ混ＩｍＬ按表４１中的配方，配制１０％分离化加入匀后用移液器吸３一／４取混合液，从玻璃板左侧，沿缝隙边缘加入，大概加到玻璃板窩度，然后缓慢加。层水，并，来足平分离胶促进胶的凝固（３）待胶完全凝固（大约半小时），，，冬天可适当延长凝胶时间倒去封胶用的水用滤纸将残留的水吸干。－（４）４１中的，依据表配方，配制５％浓缩胶，摇匀后将玻璃板的剩余空间灌满然－２５－ 后缓慢插入梳子。如果在胶凝固过程中发生缩胶现象要及时补胶。胶凝固时间的长短与温ＭＥＤ一度，促凝剂（ＴＥ、过硫酸镑）的浓度，胶浓度有关。般夏天气湿赢胶凝固速度较化可适当减少加入的促凝剂的量冬天气溫低一，可适当増加促凝剂的量。般胶凝固时一间在３０ｍｉｎ左右最好，凝固速度过快，胶单体分子之间的交联不均，胶较硬易碎，电泳ＴＥＭＥＤ时易烧胶，过慢则易漏胶，通过调整促凝剂和过硫酸镇的量可Ｗ达到要求。５０ｕ（５）准备蛋白样品，根据所测蛋白浓度，按每个组织总蛋白上样量ｇ计算所需各样品的体积，每个样品中加入２Ｌ５ＸＳＤＳ上样缓冲液，上样总体积为１０Ｌ，体积不Ｈｎ°足１０，９５Ｃ１０ｍｉｎ。咕的用双蒸水补齐，混合均匀后恒温金属浴变性（６）待胶凝固后缓慢拔出梳子，放入电泳槽中，在内槽和外槽分别加入电泳缓冲液（内槽液要加满），。。加样时用移液器吸取样品（注意不要吸入气泡）缓慢加入上样孔中（７）电泳：跑浓缩胶时电压为８０Ｖ，待浓缩胶跑完，电压调为１２０Ｖ跑分离胶。一当漠酪蓝即将跑出分离胶时－，停止电泳（新提取的蛋白第次跑胶可用民２５０考马斯亮蓝进行着色，来检测蛋白提取的好坏）。１．．３５转膜．。本试验采用硝酸纤维素膜（ＮＣ膜）作为转膜介质，膜的孔径为０４５ｕｍ（１）将滤纸和硝酸纤维素膜按所需的大小提前哉剪好（裁剪过程中需戴干净的手蒼，避免污染滤纸和硝酸纤维素膜）。剪好的滤纸和硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中一：边轻轻置于转移缓冲液的液面上（注用锡子捏住膜的，使膜缓慢浸湿。若放置速度过快一，膜与水之间容易形成层空气膜，使膜吸水不均匀）。（２）切胶：轻轻攝动玻璃板（薄板朝下，厚板朝上），边燒边向两板缝隙中加入ａｒｅｒ转移缓冲液，ｋ的指示将远离目，使凝胶慢慢的从厚板剥离覆盖于薄板上。根据Ｍ。的蛋白所在位置的胶切掉。余下凝胶，用注射器加足够转移缓冲液浸泡，防止胶干缩一（３）将夹子在加有转移缓冲液的搪瓷盘中打开，黑色的面保持水平。上面依次一放置海绵垫、王层滤纸、凝胶、ＮＣ膜、Ｈ层滤纸、海绵垫，每放置层用玻璃棒来回滚动攒走里面的气泡。（４）最后合上夹子，放入转印槽中，使夹子黒色面对槽的黑色面。转印过程中会一一一ｍｎ产热，需在槽的边放入个冰盒来降温。经条件优化，般用１００ｉ。Ｖ恒压转印７０（５）转印结束后可用ＩＸ丽春红染液染膜５ｍｉｎ（置于脱色摇床上水平摇动）。用水冲洗掉多余染液即可看到转膜情况（也可不做此步）。１．．３日免疫厉应ｍｎｘ２次ＴＥＳＴ洗一（１）转膜结束后，将膜用蒸觸水清洗５ｉ，次，５ｍｉｎ（需置于脱色摇床上水平摇动）。然后封闭液室温封闭２ｈ。－２６－ （２），３ｍＬ，将膜放入抗体解育盒中加入稀释好的抗体，盖紧，用封口膜密封好，°４Ｃ－摇床解育过夜。目的基因依据所测多克隆抗体的浓度，用ＴＢＳＴ将抗体稀释到０．５１－Ａｃｉ／ｍＬｔｉｎ按说明书＾１：３０００的比例稀释。＾ｇ，内参基因ｐ一（３）第二，室温摇床复温１ｈ＜。天，回收抗，用ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｉＰ３次解育二抗：，，目的基因和内参基因均１３０００的比例稀释室溢摇床赔育１．５ｈ。弃去二抗，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎｘ２次，ＴＢＳ洗膜１０ｍｉｎｘｌ次。１．３．７Ｅ化化学发光检测将膜覆于保鲜膜上，结合蛋白面朝上，滴加Ａ液和Ｂ液同体积充分混合的超敏ＥＣＬ化学发光底物－，使液体均匀覆盖整张膜。用蛋白核酸成像仪（ＢＩＯＲＡＤ）的印迹化学发光程序进行检测，选取条带清晰背景低的结果。２结果与分析２．１多克陰抗体检测结果ｃｅｒｒｃｅｒｒ－－ＡＯｌ和ＡＯｃｏ两蛋白多克隆抗体的检测结果如图３１和图３２。由结果可Ｗ，，看出，阳性结果在目的蛋白分子量处条带清晰无杂带阴性结果的相应位置无明显条，说明所制备的抗体确为目的蛋白抗体带，且特异性较好。ＭＭＯＴ＂１００：＾１Ｉ７Ｑｍｍｍ！诵護加＾＾——；式化１：…＾歴戀ｆｉｉｉ‘护：．１：Ｉｒ．‘＇＇－＊，：Ｃ１＾義＾？！雞＾＇＇＾争、卢；、｜巧—《＇’＊入．，＊晦‘：讀．＊＊，＇、＞－１图３ＡｃｅｉＯｒｌ多克隆抗体检测结果－ｎｄｖｅｍＦｉｇｏｓｖｅｅｒｅｓｕｌｒｒｌｃｌｏｎａｎｔｉｂｏｄ．３１Ｔｈｅｉｔｉａ打ｓｅｒｕｔｓｏｆＡｃｅＯｌｌａｔｅｓｔｐｇａｔｉｐｏｙｙ注，右图为阴性结果：左图为阳性结果Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅ〇打ｔｈｅｌｅｆｔｉｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｒｅｓｕｌｔ，化ｅｐｉｃｔｕｒｅｏｎｔｈｅｒｉｇｈｔｉｓｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔ－－２７ 图３－２ＡｃｅｒＯｒｃｏ多克隆抗体检测结果Ｆ－２Ｔｈｅｏｓ打ｅａｔｉｖｅｓｅｒｕｍｒｅｓｕｏｆＡｃｒＯｒｃｏｃｏ打ａａ打ｔｏｄｉｖｅａｎｄ１：ｅｓｔｇ．３ｉｔｉｌｔｓｅｏｌｌｌ化ｐｇｐｙｙ注：左图为阳性结果，右图为阴性结果Ｎｏ１：ｅ：Ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｏｎ化ｅｌｅｆｔｉｓ化ｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｏｎ出ｅｒｉｇｈｔｉｓｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔ２．２蛋白提取效果的检测图３－３为内勤蜂各组织蛋白提取结果的聚丙締醜胺凝胶电泳结果图Ｒ２５０（考马斯亮蓝染色），由图可见蛋白条带清晰，无拖尾，泳道之间无交叉，表明蛋白提化结果较好，可用于后续试验。１２３４５屬一？辆、＊雜？１：致．巧．－Ｐ—：■ｔｉｉｉ，ｆ图３－３内勤蜂各组织蛋白样品聚丙席醜胺凝胶电泳结果（Ｒ２５０考马斯亮蓝染色）－民ｏａｃｒａｍｏｒｅｓｉｓｂｏｕｉｎｍｌｉｎｄｉｆｔｉｓＦｉｇｎｒｓｅ（ｈｅ．３３ｅｓｕｌｔｏｆｐｌｙｙｌｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｔｒｏｔｅｓａｐｅｓｅｒｅｎｔｓｕｅｓｏｆｕｔｐｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＲ２５０ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ）；：：：：：１触角；２头；３；４腹；５足注（去除触角）胸Ｎｏｔｅ：１：Ａｎｔｅｎｎａ；２：Ｈｅａｄｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｅｎｎａ；３：Ｔｈｏｒａｘ；４：Ａｂｄｏｍｅｎ；５：Ｌｅｇｓ－２８－ －２３ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果及分析２１ＡｃｅｒＯｒｌ．３．在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白的相对表达分析－２ＡＯ－图３为ｃｅｒｒｌ在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白表达的ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果图。如图所示ｃｅｒＯｒｌ，且均在胸，Ａ在内勤蜂和采集蜂触角、头、胸、腹、足中均有表达部表达量最高。在内勤蜂中，且，，头部和腹部的表达量远低于胸部两组织之间差异不明显，而触角和足中的表达量很少，触角、头部的；采集蜂中腹部和足中的表达量差异不大表达量最少。１２３４５禱瞒喔一内脑少：伸顿Ｔ／備Ｖ茶＜捆＇；Ｖ：皆蠻儀齡ｒ韦？采集蜂图３－＾ＡｃｅｒＯｒｌ在内勤蜂和采集蜂不同组织的蛋白表达Ｆｉ－Ａｌｒｒｅｎｓｕｅｓｎｕｒａｎｆｏｒａｅｒｇ．３４Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ＳｏｆｃｅｒＯｒｐｏｔｅｉ打ｉｎｄｉｆｆｅｔｔｉｓｏｆｓｅｄｇ注：１；：：４：：触角；２头（去除触角；３胸；腹；５足）Ｎｏ化：１：Ａｎｔｅｎｎａ；２：Ｈｅａｄｗｉ化ｏｕｔａｎｔｅｎｎａ；３：Ｔｈｏｒａｘ；４：Ａｂｄｏｍｅｎ；５：Ｌｅｇｓ２ｃｅｒＯｒｃｏ．３．２Ａ在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白的相对表达分析ｓ－－ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白表达的ｗｅｔｅｍｂｌｏｔ结果如图３３所示。ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂和采集蜂触角、头、胸、腹、足各组织中均有表达，内勤蜂中头部表法量最高，，触角次之，其他Ｈ个组织中表达量差异不大；采集蜂中触角表达量比头部高胸、腹、足的表达量较少。－２９－ １２３４５＇■＾１＿■＞＊—―．？＿＾＾ａｉｉＭ－ｉｆｅｉ＾内勤蜂ｌ－ｉＢ—ＦｉＷ！＾ｊ＇：：’Ｓ；．；ｓ３§１ｌ＇記与赛雖蜗＾｜ｉｌＢＩ晒ｆｅ完｜｜讀ｊ■＂術＇‘勺，‘鶴部、＾＾采集蜂＇＇；晋鄙＇浦攀咖ｆ顏图３－５ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜡和采集蜂不同组织的蛋白表达－ＡｃｅＦ．ＥｘｒｅｓｓｎｓｒＯｒｃｏｒｏｅｉｎｉｎｅｒｅｎｓｓｕ的ｏｆｎｕｒｓｅａｎｄｏｒａｅｒｉｇ３５ｐｉｏｏｆｐｔ出ｆｆｔｔｉｆｇ：１：触角；：：５：注；２头（去除触角；３胸；４腹！足）Ｎｏｔｅ：１：Ａｎｔｅｎｎａ；２：Ｈｅａｄｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｅｎｎａ；３：Ｔｈｏｒａｘ；４：Ａｂｄｏｍｅｎ；５：Ｌｅｇｓ３讨论目前对昆虫嗅觉受体蛋白表达特性的研究报道较少。本研究采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术对中华蜜蜂气味受体基因ＡｃｅｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂和采集蜂各组织蛋白的表达情况进行研究。结果显示，ＡｃｅｒＯｒｌ在均在内勤蜂和采集蜂的胸部表达最多，这与前期对ｍＲＮＡ表达研究的结果不相符。推测原因可能是ＡｃｅｒＯｒｌ基因在表达的过程中发生了转录后调控。胸部是蜜蜂运动的中如，有３对气口，气口向内连接于气口气管，自气口气管分出的分支中有一条伸向腹神经索。在呼吸过程中，胸部氧化代谢的速率较其它组织器官要高得多，，气体交换非常频繁大量的空气通过气口进入气管中，空气中混有各种各样的气味分子和信息素，这些气味分子和信息素会随着空气到达腹神经索，与神经细胞接触，ＡｃｅｒＯｒｌ可能与感受这部分气味分子或信息素有关。也可能ＡｃｅｒＯｒｌ在执行气味受体的功能之外，还具有目前我们未知的功能，这有待于今后对ＡｃｅｒＯｒｌ功能的具体研究來进一步揭示。－３０－ 触角是昆虫的主要嗅觉器官，对ＡｃｅｒＯｒｃｏｍＲＮＡ在昆虫各组织中表达特性的研究报道中，ＡｃｅｒＯｒｃｏ或在触角中特异性表达，或在触角中表达量最多。本研究结果中，Ａｃｅ一ｒＯｒｃｏ，些在采集蜂触角中表达最多内勤蜂中头部的蛋白条带比触角的粗，送可能由于触角中总蛋白量较少，在蛋白提取的过程中蛋白损失较多造成的。因此，本试验结果与前期巧光定量的试验结果一一，Ｗ及其他些相关报道的结果基本致，这也从蛋白水平验证了ＡｃｅｒＯｒｃｏ的表达特性。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ是将聚丙婦酷胺凝胶电泳分离的组织总蛋白转印到ＮＣ膜或ＰＶＤＦ膜，一一然后利用特异性抗体检测目的蛋白的种蛋白检测技术。般在试验过程中要设置阴性对照和内参对照。本试验在前期多克隆抗体制备的检测阶段已做过阴性对照，因此在本试验中未设置阴性对照一。而内参的设置，由于蜜蜂的各组织成份不单，内参基因的表达并不恒定，所Ｗ失去了内参基因的设置意义。因此，本试验只依据ＢＣＡ法测定的各一ｃｅ组织总蛋白浓度，统了各组织的总蛋白上样量，比较了ＡｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ两蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中的表达量。４小结本试验采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术对中华蜜蜂内勤蜂和采集蜂不同组织中ＡｃｅｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ蛋白的表达特性进行了研究。结果表明，两基因在内勤蜂和采集蜂各组织中均一有表达，但表达规律存在定差异。ＡｃｅｒＯｒｌ在胸部表达量最高，而ＡｃｅｒＯｒｃｏ在触角和头部的表达量较高。ＡｃｅｒＯｒｌ蛋白的表达特性与前期巧光定量试验获得的ｍＲＮＡ的表达规律有所差异一，这有待于进步的研究来揭示其原因。－３－１ 第四章ＡｃｅｒＯｒｌ、ＡｃｅｒＯｒｃｏ在中蜂触角中的表达定位１试验材料与方法１１．试验材料１．１．１试验样本采集样本采自山西农大实验蜂场。内勤蜂取自前期试验标记过的蜜蜂，采集蜂直接从蜂箱前采集后足携带花粉的回巢工蜂。１．１．２主要仪器冰冻切片机ＣＭ１８５０Ｌｅｃｉａ德国恒温培养箱ＬＲＨ－２５２０广东医疗器械厂光学显微镜ＢＸ５１型Ｏｌｙｍｐｕｓ日本１．１．３主要试剂包埋剂美国稷花Ｓａｋｕｒａ公司即用型ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒武汉博±德生物公司ＤＡＢ显色试剂盒武汉博±德生物公司４％多聚甲醒固定液武汉博±德生物公司甲醇北京博奥拓达生物科技有限公司甘油北京博奧拓达生物科技有限公司ＣＨ〇Ｎａ，２Ｈ〇梓樣酸Ｈ钢（６ｓ７３２）北京博奧拓法生物科技有限公司，Ｈ０枝樣酸（Ｃ６Ｈ８０７２）北京博奥拓达生物科技有限公司无水艺醇上海双博生物科技有限公司ＮａＣｌ北京博奥拓法生物科技有限公司Ｎａ２ＨＰ〇４北京博奧拓法生物科技有限公司ＮａＨ２Ｐ〇４北京博奧拓法生物科技有限公司Ｈ２０２北京博奥拓法生物科技有限公司二甲苯上海森斐化学品有限公司多聚赖氨酸武汉博±德生物公司－３２－ １．２试验方法１．２．１主要溶液的配置（ＢＳ－Ｎａ１）免疫组化专用Ｐ（ＰＨ７．２７．６）；氯化销８．５ｇ，２ＨＰ〇４２．８ｇ，ＮａＨ２Ｐ〇４〇．４ｇ加入到１０００ｍＬ蒸馈水中，玻璃棒揽拌至完全溶解。？（２）０．０１Ｍ巧樣酸盐缓冲液２Ｈ０）３：梓樣酸兰钢（〔战〇７抓３２、６ｇ朽樣酸（Ｃ６Ｈｓ〇７？加入到也０）化４ｇ１０００ｍＬ蒸馈水中，放入水浴锅中边加热边用玻璃椿揽拌直至完全溶解。１．２．２试验步骚一（１）切片：在载物台上滴滴包埋剂，压平冻好。用尖头镜子将中蜂的触角小也完整取下，置于冻好的包埋剂平面上，滴加包埋剂将其包住，放入冰冻切片机中冻１０ｍｉｎ后切片，切片厚度约５ｎｍ。（２）固定：将粘有切片的载玻片置于４％多聚甲醒固定液中室湿固定３０ｍｉｎ。蒸馈水洗涂３次－，甩干后放入２（ＴＣ冰箱保存，最多可保存２周左右。（３）灭活内源性过氧化物酶：３０％＆〇２与纯甲醇Ｗ１：５０的体积比混合均匀，室温浸泡３０ｍｉｎ。蒸馈水洗涂２次。（４）热修复抗原：将切片浸入配好的巧樣酸盐缓冲液中，用电炉加热至溶液沸腾后断电－－，间隅１０分钟后，重复１次。冷巧后用ＰＢＳ（ＰＨ７．２７．６）洗洛１２次。（５）在组织切片上滴加５％ＢＳＡ封闭液（完全覆盖组织切片），室温封闭３０分钟（若染色背景较高。，可延长封闭时间）甩去多余液体，不洗。°一（６）滴加抗（前期制备的多克隆兔抗）４Ｃ赔ＰＢＳＨ－稀释好的。．２．６），育过夜（ｐ７７洗２分钟Ｘ一３次。（染色强度、背景与抗的稀释度、解育时间和温度有直接关系。）’（７）在载玻片组织上滴加生物素化山羊抗兔ＩｇＧ，３７Ｃ巧育２０分钟。ＰＢＳ－（Ｈ７．２ＸＰ．２７６）洗分钟３次。’ＢＣ－Ｘ４（８）滴加试剂ＳＡ，３７Ｃ反应２０分钟。ＰＢＳ（Ｈ７．２７．６）洗５分钟次（要Ｐ充分洗干净，否则染色背景会高）。（９）ＤＡＢ显色：使用ＤＡＢ显色试剂盒。将试剂盒中Ａ、Ｂ、Ｃ试剂按顺序依次各滴加１滴到ＩｍＬ蒸馈水，混匀后滴加到切片上，室溫下进行显色反应，在显微镜下控一制反应时间－，般３１０分钟，蒸馈水洗徐。（１０）将组织切片依次浸过７０％乙醇、８５％石醇、９５％乙醇、无水乙醇脱水，二甲，最后滴上中性树脂用盖玻片封片苯透明，显微镜下观察并拍照。－３３－ ２结果与分析蜜蜂触角上分布有多种由皮细胞特化而来的化学感受器，其中，板型感器和毛型感ｓｔ’本试验用前期器是最常见的两种感受器，这两种感受器皆与蜜蜂的嗅觉感受相关制备的多克隆抗体，与中蜂触角切片进行免疫组织化学反应，采用蓝色ＤＡＢ染色，阳性结果为蓝色点状或圆盘状，背景为淡藍色。对照组背景为无色或淡蓝色，无明显表达结果，说明试验结果特异性较好。免疫组化结果显示，ＡｃｅｒＯｒｌ和ＡｃｅｒＯｒｃｏ在中蜂触角鞭节中均有表达，且表达位置ｃｅｒＯｒ－均为感器神经元细胞层。Ａｌ的表达结果基本呈圆盘状（图４１中纪色箭头所指），说明ＡｃｅｒＯｒｌ主要在板形感器中表达。对比在内勤蜂和采集蜂中的表达结果，采集蜂触角中圆盘状表达结果多于內勤蜂ｃｅｒＯｒｌ。，说明Ａ在采集蜂触角中的表达多于内勤蜂ｃｅ－而ＡｒＯｒｃｏ在采集蜂触角中的表达结果既有点状（图４２中黑色箭头所指），又有一－些ｃｅｒｒｃｏ圆盘状（图４２中红色箭头所指），点状结果相对较多，说明ＡＯ在板形感器和毛形感器中均有表达一些，但毛形感器中的表达更多的触角中，主要为点；在内勤蜂状表达结果，圆盘状结果较不明显，说明ＡｃｅｒＯｒｃｏ主要在内勤蜂触角上的毛形感器中表达。。并且采集蜂触角中的点状表达结果明显多于内勤蜂－３４－ ，一…＂＇、瓜Ｂｉｔ＾Ａａ＾＼人＇％：女■聋■＼皆ＩＩ４－ｉｒ图１ＡｃｅＯｌ在内勤蜂和采集蜂触角上的定位Ｆｉ４－１ＬｌｉｚｔｉＡＯｌｉｆＡ．ｇ．ｏｃａａｏｎｏｆｃｅｒｒｎａｎｔｅｎｎａｅｏｃ．ｃｅｒａｎａ注；Ａ；ＡｃｅｒＯｒｌ在内勤蜂触角中的阳性表达ａ；ＡｃｅｒＯｒｌ在內勤蜂触角中的阴性表达Ｂ；ＡｃｅｉＯｒｌ在采集蜂触角中的阳性表达ｂ：ＡｃｅｒＯｒｌ在采集蜂触魚中的阴性表达Ｎｏ化：Ａ：ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｌｉｎ化ｅａｎｔｅｎｎａｏｆｎｕｒｓｅａ：Ｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｏｆＡｃｅｒＯｒｌｉｎｔｈｅ３１１１６１１１１过ｏｆｎｕｒｓｅｌＢ：ＴｈｅｏｓｉｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｌｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎ过ｏｆｆｏｒａｇｅｒｂ；Ｔｈｅｐｐ打ｅａｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｏｆ人ｃｅｒＯｒｌｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎａｏｆｆｏｒａｇｅｒｇｐ－３５－ Ａ．靡＇ｒＶ嘉＾ａ＾＇ｒ．７￣＊ｔ．ｗ＃戶＇／－．、＇ｒ心‘／／＾’／。…麵方．ｊ＇Ｉ：／：Ｊ／／图４－２ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂和采集蜂触角上的定位Ｆｉ－ｃａｌｉｚａｉｏ打ｏｆｃｅｒｒｃｏｉｎａｎｅｎｎａｅｏｆＡＣ．ｃｅｒ口巧幻ｇ．４２ＬｏｔＡＯｔ注：Ａ：ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂触角中的阳巧表达ａ：ＡｃｅｒＯｒｃｏ在内勤蜂触角中的阴性表达Ｂ：ＡｃｅｒＯｒｃｏ在采集蜂触角中的阳性表达ｂ：ＡｃｅｒＯｒｃｏ在采集蜂触角中的阳性表达Ｎｏｔｅ：Ａ；ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｃｏｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎａｏｆｎｕｒｓｅａ：Ｔｈｅ打ｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｏｆｃｅｒＯｒｃｏｉｎ化ｅａｎｔｅｎｎａｏｆｎｕｒｓｅＢ：ＴｈｅｏｓｉｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｃｏｉｎ化ｅａｎｔｅｎｎａｏｆｆｏｒａｅｒｂ：ＴｈｅＡｐｐｇ＊ｎｅａｈｖｅｅｘｉｅｓｓｏｎｏｆｃｅｒｒｃｏｎｅａｎｅｎｎａｆｆｏｒａｅｒｇｐｉＡＯｉｔｈｔｏｇ３讨论本研究采用免疫组织化学方法对中华蜜蜂、ＡｃｅｒＯｒｃｏ受体蛋白在工蜂触角ｍＲＮＡ中的表达定位情况进行研究。目前对昆虫嗅觉受体的表达定位研究主要集中在水平上，蛋白表达定位的研究报道相对较少。Ｋｒｉｇｅｒ等采用原位杂交的方法对西方蜜蜂ｍＲＮＡ的表达定位进行了研究，发现基因ｍＲＮＡ主要在工蜂触角边缘的位于板型感器和毛型感器的细胞中表达张林雅等采用免疫英光定位技术研究了ＡｃｅｒＯｒｃｏ受体蛋白在工蜂触角中的表达－３６－ 和定位情况，发现该受体蛋白主要分布在工蜂触角鞭节毛形感器的外部神经元ｗ及板形８２一ｔ３感器的树突神经元中，与本研究结果致。其它昆虫的共受体基因，如公與＞７ｔｓｓ’ＷＷＷａｎｄ等的表达情况也相类似。这与Ｏｒｅｏ作为共受体在种间的保守性相一ｃｅｒＯｏ致。本研究结果中Ａｒｃ在采集蜂触角中的表达结果明显多于内勤蜂，这与之前一ｍＲＮＡ的定量结果相致。目前对传统气味受体的表达定位研究相对较少。Ｍｉｕｒａ等研究发现麻田豆杆野換ｓｓＭ’ｌ－化ｃａＣＷ及ａｓｃａ０３８７个传统气味受体在雄虫的毛型感器和锥形感器中表扭。ｔＷ公ｗＯ／９、公Ｗ０Ｗ５和斯ｗ０４７在家蚕雌虫的大量毛型感器中表达。Ｐａｔｈｅ等利用原位杂交的方法检测到烟草天蛾气味受体ＭｗｘｔｏＯＪ仅在雄蛾触角的毛型感器中表达。本研究中在工蜂触角的板形感器中有较大量的表达。ＡｃｅｒＯｒｌ在采集蜂触角中的一表达结果明显多于内勤蜂，这也与之前ｍＲＮＡ的定量结果相致。４小结本试验采用免疫组织化学技术对中华蜜蜂气味受体基因乂在采集蜂触角上的蛋白表达做了定位分析，从试验结果图中可Ｗ看出两气味受体基因的表达位置相似，均定位在触角感器神经元细胞中，且两受体蛋白在采集蜂触角中的表达均多于内勤蜂。但不同的是，如６＾獻／主要在板形感器中表达，毛形感器中的表达非常少，而一Ａ些，这与ｊｃｒＯｃｏ在板形感器和毛形感器中均有表达，毛形感器中的表达量稍高一致作为共受体的功能相。－３７－ 全文结论ｅｓｅｒｎ－ｂ（１）采用焚光定量ＰＣＲ和Ｗｔｌｏｔ两种技术，对中华蜜蜂传统气味受体基因在内勤蜂和采集蜂各组织中ｍＲＮＡ和蛋白的相对表达量进行研究，结果表明，基因ｍＲＮＡ和蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表法，但表达规律有所不同。心ｅｒＯＷ基因ｍＲＮＡ在内勤蜂和采集蜂的触角中表达量最多，而蛋白却在胸部表达最多。２ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｍ－ｂ（）采用巧光定量ｌｏｔ两种技术，对中华蜜蜂共受体基因在内勤蜂和采集蜂各组织中ｍＲＮＡ和蛋白的相对表达量进行了研究，结果表明，基因ｍＲＮＡ和蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达一，且表达规律基本致一，均在触角中表达量最多。这与之前关于Ｏｒｅｏ基因的研究结果ｒｅｏ致，再次证明了Ｏ在物种间的保守性。（３）采用免疫组织化学技术对两气味受体基因在中蜂工蜂触角中蛋白的表达进行定位分析。结果发现，两受体蛋白在采集蜂触角中的表达均多于内勤蜂，但主要在靠近触角表皮的板形感器的神经元细胞中表达，而在板形感器和毛形感器中均有表达，，且表达量较多这与的共受体身份和功能相对应。－３８－ 参考文献Ｓｃｈｎｅｎ－ｉｄｅｒＤ？虹ｓｅｃｔａｎｔｅｎｎａｅ？ＡｎｎＲｅｖＥｔ１９６４９：１０３１２２．。］…，，２ＢｎｉｙｎｅＭ，ＣｌｙｎｅＰＪ，ＣａｒｌｓｏｎＪＲ．Ｏｄｏｒｃｏｄｉｎｉｎａｍｏｄｅｌｏｌｆａｃｔｏｒｙｏｒａｎ：ｔｈｅＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍａｘｉｌｌａｒｙ［］ｇｇａｌｐ．ｉＶｅｗｍｓｃｆｅｗｃｅｙ１９９９１９ｉ：４５２（Ｍ巧２．ｐ，，ｙ）ｏｎｕ＊３ＫｗＨＷＬｕＴＲｔｌｔｚｌｅｒＭ如。／ｌｆａｃｔｏｒｒｅｓｓ巧ｉｎａｓｔａｔｏｒｙｏｉｎｏｆｔｈｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒ？Ｏ［］，，，ｙｐｏｎｇｇａ＊／汹－ｍｏｓｑｕｉｔｏ妨换的ｅ．／ＶｏｃＡｔｏＭｃ化／庇ｚ［，２００６，１０３（；３６：１３５２６１３巧１．）４ＦｒａｎｃｏＭＤＢｏｈｂｏｔＪＦｅｒｎａｎｄｅｚＫｅｔａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｃｅｌｌｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｔｈｅｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，，，ｙｐ［］ｏｆｉｓｅｘｏｏｎｅ－ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｓｄｕｌｔＭａｎｄｕｃａｔａ．ＰＬＳ２００７２２：２１５２３０．ｇ，，（）５民甘ｔｚｌｅｒＭ，ＺｗｉｅｂｅｌＬＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｏｆｉ打ｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｉｏｎ：ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｃｏｎｃｅｔｕａｌｍｏｄｅｌｓ［］ｇｙｐＪ－．ＪＣｏｍｈｓｉｏ！．２００５１９１７７７７９０．［］ｐ，：Ｐｙ６Ｖｔ民ＣＬａｗｒｅｎｃｅＩＧｅｆ。／．ｏｇＫｏｓｔａｓＩ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆｅｒｏｍｏｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｉｎｓｅｃｔｓＩｎ：［］，，，ｐｈＣｓ－ｏｍｐｒｅｈｅｎｉｖｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅＪ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．２００５；７５３８０３［］－ｖｏｕｔｉｏｎ７ＳａｎｃｈｅｚＧｒａｃｉａＡＶｉｅｉｒａＦＧＲｏｚａｓＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｌｏｆｔｈｅｍａｏｒｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ［］，，ｊｙｇ？ｎｎ併说－２００９３０８８ｉｉｓｅｃｔｓ？好巧ｙ．，１０：２２１．内－工蜂触角感受器的扫描电镜观察化昆虫学１９８９３２２１６６１６９．閒杜芝兰中华蜜蜂祗，（）：ＦｒｏｅｎｍｒｏｃＡｅｗ－ｌｏｗｅｒＤ艮．Ｔｈｅｌｉｐｏｃａｌｉｎｔｉｆａｉｌ：ｓｔｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｉｍｃｔｉｏｎ．化１９９６３１８：１１４例ｐｙ…，，。）［１０］ＦｌｏｗｅｒＤＲ，ＮｏｒｆｌｉＡＣ，ＡｔｔｗｏｏｄＴＫ．Ｍｏｕｓｅｏｎｃｏｇｅｎｅｐｒｏｔｅｉｎ２４ｐ３ｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｌｉｐｏｃａｌｉｎ沁－ｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙ．方ｃＡｅｗｉ斯巧成ｏｗ／ｗｗｊ．１９９１１８０：６９７４ｐ＾獻及份Ｃ，１１ＦｌｏｗｅｒＤＲＮｏｒｔｈＡＣＳａｎｓｏｍＣＥ．Ｔｈｅｌｉａｌｉｎｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｓｅｅｎｃｅｏｖｅｒｖｉｅｗ．［］，，ｐｏｃｐｙｑｕＢ－ｉｏｃｆｉｉｍ巧ｉｏｐｈｙｓＡｃ的．２０００１４８２：９２４，－－ＷＤ；２ＦｕｅｎｔｅｓＰｒｉｏｒＰＪｕｎｇｂｌｔＣＤｏｎｎｅｒ巧ＳｃｈｌｅｕｎｉｎＨｕｂｅｒ民Ｂ（ｉＷ．Ｓｔｒｕｃｔｔｈ。Ｎｏｅｓｋｅｕ，〇ｅｕｒｅｏｆｅ］，，ｇ，－－ｔｈｒｏｍｂｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｔｒｉａｂｉｎ，ａｌｉｏｃａｌｉｎｌｉｋｅｅｘｏｓｉｔｅｂｉｎｄｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｄｅｒｉｖｅｄ７８７ｆｒｏｍａｔｒｉａｔｏｍｉｎｅｐｇ－ｈｕ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９７９４：１１８４５１１８５０ｇ，ｏｚＲｒｎｅｒａｒａｎ－１３ＶｔＲＧＲｙｂｃｓｋｉＬｅｍｅｒＭＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｃｌｏｎｉｎａｎｄｓｅｅｎｃｉｎｇｏｆｌｏｄｏｔｂｉｎｄｉｎｇ，ｙｎ，ｇｑｕｇｅ［］ｇｐｒｏｔｅｉｎｓＧＯＢＰｌａｎｄＧＯＢＰ２ｆｒｏｍ化ｅｔｏｂａｃｃｏｈａｗｋｍｏｔｈＭｉｗ放／ｃａ旅Ｘ拍Ｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｗｉ化ｏ化知’ｎｄ－ｉｎｓｅｃｔＯＢＰｓａｔｈｅｉｒｉｌｅｔｉｄｓ．ｉＶｅＭｙｃ！．１９９１１１２９７２２９８４ｓｇｎａｅｒａ，：ｐｐ饥ｃＫｅｎｎａＭＰＨｅｋｍａ－ｔＳｃａｆｅＤＳＧａｉｎｅｓＰＣａｒｌｓｏｎＪＲ．Ｐｕｔａｔｉｖｅ知７ｃｈｅｒｏｍｏｎｅｂｉｎｄｉｎ口句Ｍ，，，ｐｇｒｅｓｓｅｓｕ－ｒｏｔｅｉｎｓｅｘｄｉｎ江ｂｒｅｇｉｏｎｏｆ化ｅｏｌｆａｃｔｏｒｙｓｓｔｅｍ？成〇／．１９９４２６９：１６３４０１６３４７ｐｐｙ…，１ＰｉｋｉｅｌｎｙＷ，ＨａｓａｎＧ，ＲｏｕｙｅｒＦ，ＲｏｓｂａｓｈＭ．Ｍｅｍｂｅｒｓｏｆａｆａｍｉｌｙｏｆ巧細７ａｕｔａｔｉｖｅ［却Ｃｐ－－ｎｘｂｏｄｏｒａｎｔｂｒｉｒ１２３５ｉｎｄｉｎｇｒｏｔｅｉｓａｒｅｅｒｅｓｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｓｅｔｓｏｆｏｌｆａｃｔｏｙｈａｓ．Ｎｅｕｒｏｎ．１９９４，：ｐｐ４９Ｔｃｏ－１ＢｒｉａｎｄＩｖＮｅｓｏｕｌｏｕｓＣＨｕｅｔＪＣａｋａｈａｓｈｉＭＰｅｍｏＵｅｔＪＣ．Ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｓｉｃｈｅｍｉｃａｌ，ｐ，，，ｐｈｙ［巧Ｐｒｅｃ－ｅｎｍｏｎｅｒａｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆ／；ｗｅＡＳ２过ｏｍｂｉｎａｎｔｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｒｏｔｉｆｒｏｈｅｅ４及／／Ｌ．．ｐｐ，ｐｙｂ（批｜＾）Ｂｏｃｈｅｍ－ｉ．２００１２６８：７５２７６０，ｎＣｌｌｈＷｅｒｉｕｒｈＣＡＶｔ－１７ＤｉｃｋｅｓＪＣａａａｎＦＥｎＷＰＭｏｇＲＧ．Ｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｒｕｅｂｕｓ．，，ｇ，，ｇ［］ｐｙｇｐＧｅｎｅｒｉｃｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｘｕａｌｄｉｍｏｒｐｈｉｓｍ，ａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｕｂｓｅｔｓｏｆｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙｓｅｎｓｉｌｌａ．ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃＬ－１９９８８５５：３０６３１０，ｒｎｄｏｄｓｃｉ故ｓｍａｒｍＨＷａｌｔｅＭＦＤｉｍｉｔｒａｔｏｓＳａＷｏ０？ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｃｌｏ打ｅｓｅｎｃｏｄｉｎｕｔａｔｉｖｅ。糾Ｂ，，ｇｐ－ｕｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅａｎｔｅｎｎａｅｏｆｔｈｅｍａｌａｒｉａｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇｍｏｓｉｔｏＡｎｏｈｅｌｅｓａｍｂｉａｅ．ｐｑ，ｐｇ－ＩｎｓｅｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２００２１１：１２３１３２，１９ＸｕＰＸ，ＺｗｉｅｂｅｌＵａｎｄＳｍｉｔｈＤＰ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｄｉｓｔｉｎｃｔｆａｍｉｌｙｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎａｔｙｐｉｃａｌ［］ｇ－－３９ －ｕｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒｍｏｓｑｉｔｏ虹ｆｅ．／化ｙｅｃ＇Ｍ？／巧如／．２００３，各，－１２６０：５４９５－０－口ＩｓｈｉｄａＹ，ＧｏｍｅｌＡＪ，ＬｅａｌＷＳ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｆｅｍａｌｅａｎｔｅｎｎａｓｅｃｉｆｉｃｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎ］ｐｇｕ－ｒｏｔｅｉｎｉｎ化ｅｍｏｓｉｔｏＣｗｆｅｃ旅沁ｔｅ．ＪＣＡｅｗ抗〇／？２００２２８：８６７８７１ｐｑ如，口。ＩｓｈｉｄａＹ，ＣｈｅｎＡＭ，ＴｓｕｒｕｄａＪＭ，ＣｏｒｎｅｌＡＪ，ＤｅｂｂｏｕｎＭ，ＬｅａｌＷ！Ｓ．Ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇｏｌｆａｃｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｖｅｕ＿ｔｈｅｙｅｌｌｏｗｆｅｒｍｏｓｉｔｏＡｅｄｅｓａｅｔｉ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｔｅｎ，２００４９１：４２６４３１，ｇｙｐｆ，ｑ２．．２００２４５１［巧王桂荣，郭予元，吴孔明昆虫触角气味结合蛋白的研究进展阴昆虫学报，，（）：－１３１１３７．’？ｒａｎ－－ＰｅｌｏｓｉＰ．Ｏｄｏｔｂｉｎｄｉｎｇｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＷｆ．７？ｅｖ．公ｚｏｃＡｅ说．Ｍｏ／瓜〇／．１９９４２９：１９９２２８．口引，，口）ｐ－ｎｂｒａｎｒ２４ＭｏｍｂａｅｒｔｓＰ．Ｓｅｖｅｎｔｒａｓｍｅｍｅｏｔｅｉｎｓａｓｏｄｏｒａｎｔａｎｄｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９９［］ｐｙ，，２％４０－（５４）：７０７７１１．－５Ｈｅｋｍａｔ－ＳｃａｆｅＯＳＧａｉｎｅｓＰｒｏｓｏｉｒｒｏｎＭｃ＆ｅｎｎａＭＰ．ＰｕｔａｔｉｖｅＤｈｌａｅｏｍｏｎｅｂｉｎｄｉｎｔｅｉｓ口，，ｐｐｈ］ｇｐｅｘｒｅｓｓｅａｕｂｔｒｓ－ｄ？公沁ｅ／ｎｐｉｎｓｒｅｇｉｏｎｏｆｈｅｏｌｆａｃｔｏｙｓｔｅｍ．／．／．ＣＡ．１９９４２６９２：１６３４０１６３４７．ｙ，，（苗ｅｎｏｕｅｒＦｅｍｂｅｒｆａｆａｍｉｏｆｕ－ＦｉｋｉｌｎｙＣＷＨａｓａＧＲ．Ｍｓｏｌ？Ｍａｔａｔｉｖｅｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎ口巧，，ｙｙ巧ｐｇｒｏｅ－ｐｔｉｎｓａｒｅｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｄｉｆｅｒｅ打ｔｓｕｂｓｅｔｓｏｆｏｌｆａｃｔｏｒｙｈａｉｒｓ．ＪＶｅＭｒｏｗ，１９９４，１２：３５４９．ｐ（。２７Ｌａｒｓｓ－ｒａｔｉｇｕｅＡａｍａｎａｃｃｉＶｅｌＡ．Ｘｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｌｉａｎｄｂｉｎｄｉｎｓｔｕｄｆａｍｏｔｈ［］，ＣｐＲｏｕｙｙｏ，ｇｇ？－ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙｒｏｔｅｉｎ．Ｊ成〇／ＣＡｅ／ｗ２００２２７７３：３２０９４３２０９８．，，（句ｐ２８ＧｒｅｅｎｅＭＪＧｏｒｄｏｎＤＭ．Ｓｏｃｉａｌｉｎｓｅｃｔｓ：Ｃｕｔｉｃｕｌａｒｈｄｒｏｃａｒｂｏｎｓｉｎｆｏｒｍｔａｓｋｄｅｃｉｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００３［］，ｙ，，４２３％巧３０－３２巧：．－２９－ＬＥｉＮａｇｎａｎｅＭｅｉｌｌｏｕｒＰ，ＣａｉｎＡＨ，ＪａｃｑｕｉｎＪｏｌ．Ｃｈｅｍｏｓｍｓｏｒｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｔｉｅｐｒｏｂｏｓｃｉｓｏｆ［］ｙｙｐＭａｍｅｓｔｒａｒａｓｓａｅｅｍｎ－ｂｉｃ，ＣｈＳｅｓｅｓ２０００２５５：５４１５５３．，，（）３０ＷｍｍｅｒＫＷ，ＩｓｍａｎＭＢ，Ｆｅｎ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｆｏｕｒｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ［］ｇＱｐｐｅｎｅｆｒ■把ｒａｗ化２００５ｓｏｍｔｈｅＥａｓｔｅｒｎｓｐｒｕｃｅｂｕｄｗｏｎｎＣＡｒｏｉｓｗｅＭｒａ７ｗ，１４：ｇ，與與口）２８９－３００．３１ＡｎｈｏｌｔＲＲ５ＭａｃｋａｙＴＲｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃｏｍｐｌｅｘｂｅｈａｖｉｏｕｒｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ，ＮａｔＲｅｖ［］ＱＧｅｗ２００４５－如１１：的８８４９．，，（）３２ＫｉｔａｂａｙａｓｈｉＡＮ，ＡｒａｉＴ，ＫｕｂｏＴ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｉｎｇｏｆｃＤＮＡｆｏｒｐｌＯ，ａｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎ［］’ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｌｅｇｓｏｎ戶巧奇７／。巧６化幻说６曆／７。（Ａｍｅｒｉｃａｎｃｏｃｋｒｏａｃｈ）．獻及ｚｏｃＡ巧ＭＭｏ／方Ｚｏ／，－１９９８２８１０：７８５７９０．，（）ＮＡ－３３ＭａｌｅｓｚｋａＪ？ＦｏｒｅｔＳ．ＳａｉｎｔＲ．Ｒｉｉｎｄｕｃｅｄｈｅｎｏｔｙｅｓｓ甘ｇｇｅｓｔａｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒ汪ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒ［］，，ｐｐｙｒｏｉｎｉｔｈｄｌｔ．ｔｅＣＳＰ５ｎｅｅｖｅｏｐｍｅｎｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｉｎｔｅｕｍｅｎｔｉｎｔｈｅｈｏｎｅｙｂｅｅＡｐｉｓｍｅｌｌｉｅｒａ）Ｄｅｖ，ｐｇ（ｆ－Ｇｅｎｅｓ．Ｅｖｏｌ．２００７２１７３：１８９１９６．，，（）口４ＳｉｍｐｓｏｎＰＪ，ＮｉｇｈｏｍＡ，ＭｏｒｔｏｎＤＢ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆａｎｏｖｅｌｇｕａｎｙｌｙｌｃｙｃｌ报ｅｔｈａｔｉｓｒｅｌａｔｅｄ＾］ｒｅｃｅｐｔｏｒｇｕａｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅｓｂｕｔｌａｃｋｓｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９９，２７４＿＾６：４４４０Ｍ４３５ＲｏｇｅｒｓＭＥ，ＫｒｉｅｅｒＪ，ＶｏｔＲＧＡｎｔｅｎｎａｌＳＮＭＰｓｓｅｎｓｏｒｎｅｕｒｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｒｏｔｅｉｎｓｏｆｌｅｉｄｏｐｔｅｒａ［］ｇｇ（ｐ）ｐｕｅＤ－ｒｏｎ－ｄｅｆｉｎｅａｕｎｉｆａｍｉｌｙｏｆｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＣ３６ｌｉｋｅｔｅｉｓＪ．如／，２００１，４９：４７６１ｑｐ［］＂）３６Ｂｌｏｍｕｉ巧ＧＪＶｏｇｔＲＧＰｈｅｒｏｍＢｉｏｃｈｒａｉＭｏｌＢｉｏｌＬｏ打ｄｏｎ：ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ２００３．［］ｑ，，３９－１４４６．３７ＶｏｓｓｈａｌｌＬＢＳｔｏｃｋｅｒＲＦ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆｓｍｅｌｌａｎｄｔａｓｔｅｉｎＤｒｏｓｏｈｉｌａ．ＡｎｎｕＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ，［，］ｐ—巧３２００７３０５０５．，：３８ＪｉｎＸ，ＨａＴＳ，Ｓｍｉ化ＤＲＳＮＭＰｉｓ泣ｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｍｐｏｎｅｎｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ知ｓｉｔｉｖｉｔｙｉｎ［］ｒｏｓｏａ－Ｄｐｈｉｌａ，ＰｒｏｃＮｔｌＡｃａｄＳｃｉ２００８１０５１０９９６１１００１．，，，－４０－ ｏｇｔＲＧ虹：ＬＩＧｉｌｂｅｒｔｌａｔｒｏＧｉｌｌＳ（ｅｄｓＣｏｍｐｒ浊ｅｎｓｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ口刮Ｖ，ｙｇｙ，ｙ，，）ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ３Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｏｎｄｏｎ：ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ２００５．ｇｙＬ，７巧－８０４．ｒａ－４０ＢｒｅｅｒＨＫｒｉｅＪＲｍｉｎＫ．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍ，１９９０２０７：７３５７４０．［，ｇｅ，，（）］ｇ［４＂Ｆｅｙｅｒｅｉｓｅｎ民５ＫｏｅｎｅｒＪＦ，Ｆａｍｓｗｏ地ＤＥ，知。／？ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇａｃｈｒｏｍｅ－ｙｔｏｃＰ４５Ｇｆｒｏｍａｎｉｎｓｅｅｔｉｅｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｏｆ化ｅｈｏｕｓｅｆｉｙＭ．ｄｏｍｅｓｔｉｅａ？／ＶｏｃＡｔｏ／如。ｄ口］％－沉ｆＣ／＆４．１９８９：１４６５１４６９．，４２ＰｒｅｓｔｗｉｃｈＧＤ，ＶｏｇｔＲＧ，ＲｉｄｄｉｆｏｒｄＬＭ．Ｂｉｎｄｉｎａｎｄｈｄｒｏｌｓｉｓｏｆｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄｈｅｒｏｍｏｎｅａｎｄ［］ｇｙｙｐ－ｍｏ化化ｍ〇ｓｅｖｅｒａｌａｎａｌｏｇｓｂｙｍａｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｅｎｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ化ｅｉｅａ／？Ｊ．ＣＡｅｗ如［］－仿〇／１％６口２：３２３巧３．？，（）ｎ－－－４３ＲｏｇｅｒＭＥＪａｎｉＭＫＶｏｇｔ民ＱＡｏｌｆａｃｔｏｒｓｅｃｉｆｉｃｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｔｈｅｓｈｉｎｘｍｏ化，，ｇ［］ｙｐｐｃａｘ－Ｍａｎｄｕｓｅｔａ．Ｊ公邸及故／１９９９，２０２１：１始５１６３７，（巧４４Ｋａｉｓｓｌｉｎ，ＫＬＯｌｆａｃｔｏｒｅｒｉｒｅｃｅｔｏｒａｎｄｒｅｃｅｔｏｒｅｖｅｎｔｓｉｎｍｏｔｈｓ：ＡｋｉｎｅｔｉｃｍｏｄｅｌＪ．ＣｈｅｍＳｅｎｓｅｓ，［］ｇｙｐｐｐ［］２００－１２６：１２５１５０．，４５ＢｕｃｋＬＡｘｅｌＲ．Ａｎｏｖｅｌｍｕｌｔｉｅｎｅｆａｍｉｌｍａｅｎｃｏｄｅｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｊｔｏｒｓ：ａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｏｄｏｒ，［］ｇｙｙｑｎｉｉＣｅ６５１７５－１８ｒｅｃｏｔｏｎ．．ｌｌ１９９１：７ｇ，，４ＰｅｉｍｉｓｉＥ？Ｆｒｕｉｔｆｌｏｄｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｕｎｄ？成始ｗｅｅ１９９９２８３４０６：１巧９．［巧ｙ，，口）４７ＪｏｎｅｓＷＤ，ＮｕｅｎＴＴ，Ｋｌｏｓｓ目，ＬｅｅＫＪ，ＶｏｓｓｈａｌｌＬＢ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｓｅｃｔｏｄｏｒａｎｔ［］ｇｙ－ｒｅｃｅｔｏｒｅｎｅ２５０ｉｌｌｉｌ．Ｃｗｒ化〇／２００５１５４艮１１９１２１．ａｅｒｏ化ｍｏｎａｒｓｏｆｅｖｏｕｔｉｏｎ，：ｐｇｙｅ，（）？巧－４１１ＣＡＦｏｘＡＮＰｉｔＲＪｆｌ／．Ｇｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｔｏｒｓｉｎ的Ｚ．Ｓｉ２００２［巧曲，ｓ，ｅｄｒｅｃｅ／ｎｗ公ｅｃｅｎｃｅ．，ｐｐｐ拼…，２９８－：１７６１７８．４９Ｗ知－ａｎｎｅｒＫＷＡｎｄＡＲＴｒｏｗｌｌＳＣ／？Ｆｅｌｂｉａｄｅｘｒｅｓｓｉｒａｎｔｒｅｃｅｔｉ［］，ｅｒｓｏｎ）ｅ，。ｍａｅｓｅｐｏ打ｏｆｏｄｏｕｏｒｅｎｅｓｎｐｇ’ｕｔｉｌｋ饼ｎｆｅ／Ｗ／７／化论如／０７—ｔｈｅａｄｌｔａｎｔｅｎｎａｅｏｆｈｅｓｗｏｒｍ公ｘ０．Ｍｏ成ｂ／．２００７１６：１１１９．，ｙ…，［５０］ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＨＭ，ＷａｎｎｅｒＫＷ．Ｔｈｅｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｉｎｔｈｅｈｏｎｅｙｂｅｅ，Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ：－ｅｘａｎｓｉｏｎｏｆｔｈｅｏｄｏｒａｎｔｂｕｔｎｏｔｕｓｔａｔｏｒｒｅｃｅｔｏｒｆａｍｉｌ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．２００６１６１１：１３９５１ｐ，ｇｙ，ｐｙ，（）４０３．口Ｕ８仿巧］〇４１氏Ｋｅ姑进Ｒ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ！ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｏｌｆａｃｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎ／＞０化货瓜７０Ａｆｅ知容做化ｒ阱ｒｏｃ－ＰＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００１９８９３８１９３８５．：，口巧ＯｏｂｒｉｔｓａＡＡ，ＶａｎｄｅｒＧｏ货ｖａｉｌＮａｔｅｒｓＷ，ＷａｒｒＣＧ，ｅｆ。厶Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂａｓ－ｉｓｏｆｏｄｏｒｃｏｄｉｎｉｎｈｅＤｒａｓｏｐＭ。ａｎｔｅｎｎａ．Ａｆｅｗｃ仍．２００３３７：８２７８４１．ｇｔ，５３ＳｍｉｔｈＤＰ．ＯｄｏｒａｎｄｈｅｒｏｍｏｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏａｓｔｅｒ．ＰｕｅｒｓＡｒｃｈｌｒｏｅａｎ［］ｐｇｆｌｇｙＥｕｐＪｌ－ｏｕｒｎａｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏ．２００７４５４５：７４９７５８．ｇｙ，（）－４ＨａｌｌｅｍＥＡ，ＣａｒｌｓｏｎＪＲ．Ｃｏｄｉｎｇｏｆｏｄｏｒｓｂａｒｅｃｅｔｏｒｒｅｅｒｔｏｉｒｅ．Ｃｅ／／．２００６１２５：１４３１６０．口］ｙｐｐ，—ＳＴＳＳｍｒｒｅｃｅ－ｕｃｅｄａ，ｉｔｈＤＰＡ．Ｐｈｅｏｍｏｎｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｓ１１ｃｉｓｖａｃｃｅｎｌａｃｅｔａｔｅｉｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎ［ｙＨｙＤｒｏｓｏｐｈ－ｉｌａ，ＮｅｕｒｏｓｃＬ２００６２６：８７２７８７３３．，５ＳａｋｕｒａｉＴＮａｋａＴＭｉｔｓｕｎｏ扫ｅ／Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆａｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｅｘ［，ｇａｗａ，，句ｔ－ｈｒｏｍｏｎｅ．ａｄｉｐｅｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｅｓｉｌｋｍｏｔｈ５ｏｗ６ｙｘｍｏｎＰｒｏｃＮａｔｌＡｃＳｃＵＳＡ．１０１：１６６５３１６６５８．－７ＭｉｕｒａＮＮａｋａａｗａＴＴａｔｓｕｋｉＳｏｕｈａｒａＫＩｓｈｉｋａｗａＹ．Ａｍａｌｅｓｅｃｉｆｉｃｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｔｏｒ口］，，ｇ，Ｔｊｐｐｃｏｎｓｅｒｖｅｄｔｈｒｏｕ班ｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｅｘｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓｉｎＯｓｔｒｉｎｉａｍｏｔｈｓｐｅｃｉｅｓ．／巧《Ｊ公沁／５Ｗ，２００９５－：３１９３３０．，５ＦｏｘＡＮＰｉｔｔｓＲＪＲｏｂｅｒｔｓｏｎＨＭＣａｒｌｓｏｎ瓜ＺｗｉｅｂｅｌＬＪ２００１．Ｃａｎｄｉｄａｔｅｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｒｔｏｒｓｆｒｏｍ［糾，，，，，ｑ？ｕ－化ｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒｍｏｓｑｉｔｏ如巧？Ａｅ／妨各。说知幻ｅａｎｄｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｂｌｏｏｄ？ｆｅｅｄ－ｉｎ？尸／ｗ化／航！９８２：１４６９３１４６９７．ｇ，（巧－４－１ ５ｌｌｅｍｍｏ－ｗｅａａＥＡＦｏｘＡＮＺｗｉｅｂｌＵＣｌＪＲ２００４．Ｏｌｆａｃｔｉｏｎｉｔｏｒｔｒｆｒｈｕｍａｎ［却Ｈ，，ｅａｒｓｏｎ，：ｓｅｃｅｏｏｓｔ，ｑｕｐｏｄｏｒａｎ－ｔ．Ｎａｔｕｒｅ４２７６９７１：２１２２１３，，（）ｎ－ｕｒａ６０ＢｏｈｂｏｔＪＤＤｉｃｋｅｓＪＣ．Ｉｎｓｅｃｔｒｅｅｌｌｅｎｔｓ：ｍｏｄｌａｔｏｒｓｏｆｍｏｓｉｔｏｏｄｏｎｔｒｅｃｅｔｏｒａｃｔｉｖｉｔＪ．ＰｌｏＳ［］，ｐｑｕｐｙ［］ＣＷ左２０１０５：ｅｌ２１３８．，，［６１ＬａｒｓｓｏｎＭＣ，ＤｏｍｉｎｇｏｓＡＩＪｏｎｅｓＷＤｅｔａｌＯｒ８３ｂｅｎｃｏｄｅｓａｂｒｏａｄｌｙｅｘｒｅｓｓｅｄｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｔｏｒ］，，ｐｐｓｅｎｔｉｌｆｒ－ｅｓａｏＤｒｏｓｏｈｉｌａｏｌｆａｃｔｉｏｎ．ｉＶｃＭＴＯ２００４４３７０３７１４．ｐ，化，６２ＫｒｉｅｇｅｒＪＧｒｏｓｓｅ－ＷｉｌｄｅＥＧｏｂｉＴＤｅｗｅｒＹＭＥａｍｉｎＫＢｒｅｅｒＨ２００４．Ｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎ［］，，，Ｒ，，，ｇｇｃａｎｄｉｄａｔｅｐｈｅｒｏｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎａｍｏ化Ｈｅｌｉｏ化ｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ？／ＶｗＡｔｏＭｃ化／妨１０１：１１８４５（）－１１８５０．［６引ＰｉｔｔｓＲＪ，ＦｏｘＡＮ，ＺｗｉｅｂｅｌＬＪ，２００４．Ａｈｉ＾ｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｃａｎｄｉｄａｔｅｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｂｏｔｈｏｌｆａｃｔｏｒｙａｎｄｇｕｓｔａｔｏｒｙｔｉｓｓｕｅｓｉｎｔｈｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒＡｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１０１：５０５８－５０６３．６４ＫｒｉｅｇｅｒＪ，ＫｌｉｎｋＯ，ＭｏｈｌＣ，ＲａｉｎｉｎｇＫ，ＢｒｅｅｒＨ．Ａｃａｎｄｉｄａｔｅｏｌｆａｃｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｔｙｐｅｈｉｈｌｙ［］ｇ－ｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｃｒｏｓｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｓｅｃｔｏｒｄｅｒｓ．Ｃｏ／ｗ？ＰｈｉｏｌＡ２００３１８９５１９／；ｙｓ：５２６．，，６５ＶｏｓｓｈａｌｌＬＢＨａｎｓｓｏｎＢＳ２０１１．ＡｕｎｉｆｉｅｄｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＳ＾ｔｅｍｆｏｒｔｈｅｉｎｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｏｒｃｏｒｅｃｅｔｏｒ．［］，，５ｙｐＣｈｅｍｎｓｅｓ－Ｓｅ３６：４９７４９８．，，６ｎｇｓｏｎｔｉａＰＳａｎｄｅｒｓｏｎＡＰＣｏｂｂＭＷａｌｄｅｎＫＫＲｏｂｅｒｔｓｏｎＨＭＢｒｏｗｎＳ．Ｔｈｅｒｅｄｆｌｏｕｒｂｅｅｔｌｅｓ［词Ｅ，，ｊ，，ｌａｉｇｅｎｏｓｅ：ａｎｅｘｐａｎｄｅｄｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＴｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａａｅｕｍ？細ｅｃｆ公沁ｃＡｅ／ｗＡｆｏ／２００８３８４－化０／３８７３９７．，：，（）６７ＺｈａｏＹＹＬｒ－ｉｕ巧ＹａｎｇＹｏｕＭＳ．ＰｓＯｒｌ泣ｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂａｓｅｄｅｓｔ［］，Ｑ，ｐｐｅｍｅｎ－ｍａｎａｔ．虹ｓｅｃｔＭｏｌＢｉｏｌ２０１１２０１：９７１０４．ｇ，，（）ｏｍｅｒ－６８ＳａｔｏＫ，ＰｅｌｌｅｒｉｎｏＭＮａｋａａｗａＴｅｔａＬＩｎｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｏｒｙｒｅｃｅｔｏｒｓａｒｅｈｅｔｅｒｉｃｌｉａｎｄａｔｅｄｉｏｎ［］ｇ，ｇｇｇ，ｐｃｈａｎｎｅｗｒ－ｌｓ．Ａｔｏｅ．２００８４５２：１００２１００６．机，ｃｈｅｒｍｆｅｎｄ－６９ＷｉＤＳｃｈｆｅｒＲ技ａｕｅｉＲｔａｌ．王）ｍｓｐｐＡ泌ｚｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｒｅｂｏｔｈｌｉａｎｄａｔｅｄａｎｄ［］，ｊｅｇｊｇｃｃ－－ｉ－１ｙｌｉｃｍｉｃｌｅｏｔｉｄｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ…．Ｖｌａ化化．２００８，４５２：１００７１０１．如。ｒ－７０ＳａｔｏＫＰｅｌｌｅｇｒｉｎｏＭＮａｋａａｗａＴ／？虹ｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｒｅｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃｌｉａｎｄａｔｅｄｉｏｎｊ，，［］ｇｙｇｇｃｈａｎｎｅａｕｒｅ－ｌｓ．Ｎｔ２００８４５２７１９０：１００２１００６．，，（）ｕｅｍｆｅ－７１］ＷｉｃｈｅｒＤＳｃｈａｆｅｒＲＢａｉｎｄＲｅｔａｌ．Ｄｒｏｓｏｈｉｌａｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｔｏｒｓａｒｅｂｏｆｌｉｌｉａｎｄａｔｅｄａｎｄ，，，ｇ［ｐｐｇ－－－…ｃｃｌｉｃｎｕｃｌｅｏｔｉ过ｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｔｉｏｎｄｉａｎｎｅｌｓｔｌ．２００８４５２７１９０：１００７１１．ｙ］，（）’７２ＨａＴＳＳｍｉ化ＤＰ．Ｏｄｏ访ｎｔａｎｄＰｈｅｒｏｍｏ打ｅＲｅｃｅｔｏｒｓｉｎ虹ｓｅｃｔ．巧／Ｃｅ／ＺｉＶ．２００９３：１０．［］，ｐｓ口］ｒａｅｗｒａｓａ，７３ＢｅｎｔｏｎＲｊＳａｃｌｉｓｅＳＭｉｃｈｎｉｃｋＳＷ巧ａｌ．Ａｔｙｉｃａｌｍｅｍｂｒａｎｅｔｏｏｌｏｇｙａｎｄｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃｆｔｉｎｃｔｉｏｎｏｆ［］，，ｐｐ■Ｄｒａｓｏｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｖｉｖｏ口］．化斯〇／，２００６，４：ｅ２０．如ｐ）ＣＷ？４ＮｉｃｈｏｌｓＡＳＬｕｅｇｅ．Ｔｒｂｒｅｎｔ３７ａ／ｎｅ／ａｗｏｓ似ｏｄｏｒａｎｔｒｔ，ａｎｓｍｅｍａｎｅｓｅｇｍｏｆｅｃｅｐｏｒ［７］咖各ｏｔｒｉｂ－－ｓｕｂｕｎｉｔ８５ｂｃｏｎｕｔｅｓ！：〇ｌｉｇａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ打ｓ…？／。记／ＣＡｅ／ｎ．２０１０，２８５（１：１１８５４１１８６２．巧７５ｗａＴＳｋｒｉＴＮｉｈｉｏｋＴｔｌ－ｎａｌＮａｋａａｕａ．Ｉｎｓｅｃｔｓｅｘｈｅｒｏｍｏｎｅｓｉｍｅｄｉａｔｅｄｂｓｉｆｉ，ｓａ，ａｓｃ［］ｇａ，ｅｐｇｙｐｅｃｃｏｍｂ始－ｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｏｌｆａｃｔｏｒｙｒｅｃｅｔｏｒｓ．况２００５３０７：１６３８１６４２．ｐ…，［７６］ＳｃｈａｒｌａｋｅｎＢ，ＧｒａａｆＤＣ，ＧｏｏｓｓｅｎｓＫｊ。／．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇ灼ｌｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｉｎｓｅｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓ－ｕｓｉｎｇｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ：ＴｈｅｈｅａｄｏｆｔｈｅｈｏｎｅｂｅｅＡｐｉｓｍｅｌｌｉｅｒａａｆｔｅｒａｂａｃｔｅｒｉａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｑｕａｎｙ．ｆ＾Ｊ２００８８－．ＪＩｎｓｅｃｔＳｃｉ：１１０．［＼，，ｕａｎｔｉｆｉｃａ－－７ＭｉｃｈａｅｌＷＰ．Ａｎｅｗｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｔｉｏ打ｉｎｒｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ．１７］ｑ…ｃ－ＡｉｄｓＲｅｓ２００１２９９：２００３２００７．，，（）ｖａｋ－８ＬｉＫＪＳｃｈｍｉｔｔｎ了Ｄ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅ知ｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｒｅａｌｔｉｍｅｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ。］，ｇｅｙｑｇｐｇａｎｄ＂化ｅ２Ｊ）ｅｌｔａＤｅｌｔａＣＴＭｅｔｈｏｄＪ．Ｍ姑Ａｏ沁，２００１巧４：４０２４０８．（（））［］，（）－４２－ ７９张林雅，谢冰花，倪翠侠等．中华蜜蜂Ｏｒｅｏ嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位．駐虫学报［］－Ｊ２０１２５５１１：１２４６１２５４．［］，，（）０申建梅胡黎明宾淑英等．Ｊ．瓜实蜡嗅觉受体基因的克隆及表达谱分析度虫学报［，２０１１巧］，，］，２５４３－２６５２７１．（）：．Ｊ．２００巧。张帅，苏宏华等棉铃虫气味受体的克隆与组织持异性表达［昆虫学报，乂，张永军］５５－：７２８７％．２吴孔明苏宏华等．度王挂荣．棉铃虫嗅党受体基因的克隆及组织特异性表达［Ｊ］虫学报，２００５巧］，，，４８－：８２３８２８．３．ｅｏＪ葛星．巧］，张天涛，何康来等桃蛙頓成虫Ｏｒ嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析［］昆虫学报，２０１３，％（３）．４：ＩＩ陈茜．斜纹夜蛾嗅觉的表达谱分析Ｊ．２０１１巧］，吴仲南，杜永均等受体基因［］鼠虫学报，，－５４．：８８１８８６张永军．．巧５帅，苏宏华等中红侧沟蓝蜂非典型气味受体的克隆及纽织特异性表达阴中国农业］张，２００９４２５－：１６３９１６４５．科学，，（）巧巧杨承远．家蚕嗅觉受体基因的结构、表达与功能初探［巧？西南大学，２０１化．ｅｒｒ－ｄｅ８７ＫｒｉｅＪＧｏｓｓｅＷｉｌＥＧｏｂｉ了．Ｃａｎｄｉｄａｔｅｈｅｒｏｍｏ打ｅｒｅｃｅｔｏｒｓｏｆｔｈｅｓｉｌｋｍｏｔｈ及ｍｏｎＪ．［］ｇ，，ｐｐ［］ｒｏｅａｎ－ＥｕＪ２００５２１８２１的２１７６．ｐＮｅｕｍｓｃｉ．：，（）巧糾ＪｏｒｄａｎＭＤ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＡ，ＢｅｇｕｍＯ，。厶ＯｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｒｏｍｔｈｅｌｉｇｈｔｂｒｏｗｎａｐｐｌｅｍｏｔｈＥａｓｏｓｖｉａｎａｚｅｕｃｈｅｍｎｓｅｓ（ｐｉｐｈｙｐｔｔｔ）ｒｅｃｏｇｎｉｉｍｐｏｒｔａｎｔｖｏｌａｔｉｌｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｒｏｄｅｄｂｙｐｌａｎｔｓＪ．ＣＳｅ，ｐ［］２００９３４５－：％３３９４．，（）９刘杨等．孔畅仪．小莱蛾Ｈ个普通气味受体基因的克隆及表达谱机中国农业科学巧］，王桂荣，，２０１４，（９）．９０ＳｌｉｆｅｒＥＨａｎｄＳｅｋｈｏｎＳ义Ｆｉｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ化ｅｓｅｎｓｅ０ａｎｓｏｎ化ｅｆｌａｇｅｌｌｕｍｏｆｔｈｅｈｏｎｅｙｂｅｅ，［］巧－％１Ｊ／ｎ饼／１９６１１〇９３３５１．ｒａＬｉｎｎａｅｕｓ．Ｊ０：於抑，，（）［］９ｌｉ．ＡｔＲｔｒｆｕｒｕｅｅｎＳｕｂｓｔａｎｃｅｕｎｄＳｔｅｒｚｅｌｄｕｆｔｂｅｉｄｅｒ１ＫａｉｓｓｎｇＫＥ，ＲｅｎｎｅｒＭｎｅｎｎａｅｅｚｅｏｅｎ］ｐＱ［Ｈ沁巧－ｏ打ｉｇｂｉｅｎｅＪ．Ｚｖｅｒ／戶及１９６８，４：３５７３６１．［］各妙（）巧马ＶｏｓｓｈａｌｌＬＢ，ＡｍｒｅｉｎＨ，ＭｏｒｏｚｏｖＰＳ，封。Ａｓｐａｔｉａｌｍａｐｏｆｏｌｆａｃｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｏｎｎｎａｅ－Ｄｒａｙ／碱７幻ａｔｅ．Ｃ１９９９９６：７２５７３６．机化，口３］ＭａｌｐｅｌＳ，ＭｅｒｌｉｎＣ，ＦｒａｎｃｏｉｓＭＧ，ｅｆ。／．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗＬｉｄｏｐｔ脚ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｔｈｅ巧？Ｍ。巧姑化ｒＯＲ８３ｂｆａｍｉｌｙＪ．／／ｌｙｅｃ＇Ａｆｏ／＾［］－巧６斯〇／２００８１７５：５８７．，，（）９４ＰａｔｃｈＨＭ，ＶｅｌａｒｄｅＲＡＷａｌｄｅｎＫＫＯ知幻／？ＡＣａｎｄｉｄａｔｅＰｈｅｒｏｍｏｎｅＲｅｃｅｐｔｏｒａｎｄＴｗｏＯｄｏｒａｎｔ［］，，■ｋｍｏ妨－ＲｅｃｅｔｏｒｓｏｆｔｈｅＨａｗｔｈＭｚｗｉｉＭｃ幻ｓｅｘｔｏ口？ＣＡｅ／ｗ，２００９，３４４：３０５３１６．ｐ］（）［９５］ＭｉｕｒａＮ，ＮａｋａｇａｗａＴ，ＴｏｕｈａｒａＫ，ｅｔａＬＢｒｏａｄｌｙａｎｄｎａｒｒｏｗｌｙｔｕｎｅｄｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ？打？於ｃ沁ｃ－ｆｅｍａｌｅｓｈｅｒｏｍｏｎｅｒｅｃｅｔｉｏｎｉｎ化於把ｍｏ化ｓ．／ｆ方ＡｅｗＭ？／成２０１０４０：６４７３．巧ｐｐ饥，－－４３ Ａｂｓｔｒａｃｔｕ－Ｔｈｅｉｎｓｅｃｔｏｌｆａｃｔｏｒｙｓｓｔｅｍｉｓｃｏｍｌｉｃａｔｅｄａｎｄｓｅ打ｓｉｔｉｖｅ，ｗｈｉｃｈｉｓ化ｅｒｅｓｌｔｏｆｌｏｎｔｅｒｍｅｖｏｌｕｔｉｏｎｙｐｇｆｏｒｉｎｓｅｃｔ！：〇ａｄａｐｔ化化ｅｃｏｍｐｌｅｘｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｉｎｓｅｃｔｓｓｅｅｋｆｏｒｆｏｏｄ，ｓｅｌｅｃｔｈａｂｉｔａｔ，坊ｔｃｈａｎｇｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓａｎｄｉｖｅｂｉｒｔｈｔｏｏｆｆｓｎｂｓｅｎｓｉｔｉｖｅｏｌｆａｃｔｏｒ．Ａｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａｉｓｇｐｒｉｇｙｙｐａｎｅｘｃｅ－－ｌｌｅｎｔｎａｔｉｖｅｓｅｃｉｅｓｉｎＣｈｉｎａｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｅｓｏｆｓａｖｉｎｆｅｅｄｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｔａｎｄｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｐ，ｇｇ，，’ｒｅｓｉｓｔｉｎｂｅｅｍｉｔｅａｎｄＡｍｅｒｉｃａｎｉｎｆａｎｔｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｓｖｅｒｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｌｌｉｎａｔｉｎｔｈｅｌａｎｔｓｂｌｏｓｓｏｍｉｎｉｎｇｙｐｏｇｐｇｗｉｎｔｅｒａｎｄｍｏｕｎｔａｉｎａｒｅａｓａｎｄｌａｙｓａｖｅｒｉｍｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｔｈｅ出ｖｅｒｓｉｔｆｌａｎｔｓｉｎＣｈｉｎａ．ｐｙｐｇｙｏｐｃｅｒａｗｆｌｃｅｎｚｗｏｗａｓｃｈｏｓｅｎａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｍａｔｅｒｉａｌｉｎ化６ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｎｚｉｃｅｒＯｒ／ａｎｄｗｅｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ－ａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｍＲＮＡａｎｄｒｏｔｅｉｎｂＲＴＰＣＲｔｒｎｂｌｔｔｉｎａｎｄｉｍｍｉｍｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ．，ｗｅｓｅｏｐｙｑｇｙ－ｍｅｎｅＲｅａｌｔｉＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｅｒｎｏｆＡｃｅｒＯｒｌａｎｄＡｃｅｒＯｒｖｏｍＲＮＡｉｎ５ｐｔｉｓｓｕｅｓｏｆｎｕｒｓｅａｎｄｆｏｒａｇｅｒｂｅｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｒｅｖｅａｌｅｄＡｃｅｒＯｒｌ＾ＡｃｅｒＯｒｃｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｅａｃｈｔｉｓｓｕｅｂｕｔｔｈｅｍｏ巧ｗｅｒｅｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎａ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｅｎｅｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔ，ｇｔｉｓｓｕ的ｏｆｆｏｒａｇｅｒｂｅｅｓｉｓ坊ｌｅｒａｌｌｈｉｇｈｅｒ化ａｎ化ａｔｉｎｎｕｒｓｅ．ｇｙＰｅｔｉｄｅ＇ｔｓｅｐｓｅｇｍｅｎｔｓｏＯｃ巧ＣＷ方心ｅｒＯｃｏｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｓｙｎｈｅｓｉｓｅｄｂａｓｅｄｏｎ化ｅｑｕｅｎｃ故ｏｆｔｈｅｔｗｏｃＤＮＡｇｅｎｅｓｔｏｍａｋｅＰｏｌｙｃｌｏ打ａｌａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ５ｓｓｕｒｅｓｅａｒｃ－ｎｏｔｉｅｓｏｆｎｕｒｓｅａｎｄｆｏｒａｇｅｒｂｅｅｓｗｅｒｅｈｅｄｂｙＷｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｅｃｈｌｏｇｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｒｔｓｎｒｃｏｍａｎｔｈｅｒｏｔｅｉｅｘｅｓｓｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｌｗａｓｈｅｈｉｈｅｔｉｔｈｅｃｈｅｓｔｖＭｌＱＡｃｅｒＯｉｌｙｅｘｒｅｓｓｉｎｈｅａｄｐｐｇ，ｐｏｆｎｕｒｓｅａｎｄｆｏｒａｇｅｒ．Ｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｂｅｅａｎｔｅｎｎａｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡｃｅｉＯｒｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍａｉｎｌｙｉｎｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｓｅｎｓｉｌｌａｌａｃｏｄｅａｎｅａｒｔｈｅａｎｔｅｎｎａｅｅｉｄｅｒｍｉｓｗｈｉｌｅｔｈｅｏｎｅｏｆＡｃｅｒＯｒｃｏｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｏｔｈｉｎｓｅｎｓｉｌｌａｐｐ，ｎｄｗｈｗａｖｅｒｏｃｏ－ｒｔｏｉｔｒｉｈｏｄｅａａｓｅｎｓ姐ａｌａｃｏｄｅａｉｃｈｓｒｅｌａｔｉｔｏ化ｅｌｅｏｆｅｃｅｒａｎｄｉｔｓｆｔｎｃｔｉｏｎ．，ｐｐＷｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｃｅｒＯｒｌａｎｄＡｃｅｒＯｒｃｏｔｏｐｒｏｖｉｄｅｅｒｉｒｘｏｎｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｍｏｆｏｒｒｅｃｅｏｒｏｆｔｈｅｔｈｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｔｈｅｏｒｙｆｏｔｈｅｆｉｔｈｅｒｅｐｌｏｒａｔｉｉｓｌｆａｃｔｏｙｐｔｈｏｎｅｙｂｅｅａｎｄｆｏｒｔｈｅｒｅｖｅｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒｓｕｐｅｒｉｏｒｂｅｅｐｏｌｌｅｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｒａｎａｃｅｒａｎａ；ｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅ；ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ－４５－ 致谢玉心＇指导下完成的本文是在恩师姜锁教授的悉。本论文从选题、试验设计、实施、数据处理到论文写作＇、定稿无不凝聚着思师的大量心血和汁水。导师渊博的知识、严谨求实的治学态度、开拓创新的进取精神使我受益匯浅，是我终生学习的榜样。王年的研究生学习期间恩师及师母李春艳老师在学习、生活、科研等各方面都给予了我板大的，Ｗ最崇高的敬意和心＇的感谢关怀和支持。在此谨向两位老师致衷！祝應导师及家人身，体健康、幸福平安！感谢我的师姐赵慧婷博壬在试验设计、试验数据处理Ｗ及论文写作过程中的指导。同时、岳文斌教授、王钦德教授、呂丽华教授、曹果清教授、，我要非常感谢刘文忠教授任有蛇副教授、张春香副教授、高鹏飞副教授、石磊副教授、乔利英老师、刘建华老师、胡文革老师、在实验中给予我的帮助。感谢遗传育种与繁殖学科点上的各位老师。感谢马卫华师姐、杜海燕师姐、田嵩浩师兄、杨爽师兄Ｗ及师弟师妹王树杰、杜亚丽、潘建芳、邹宇等在学习、试验及生活中提供的帮助。感谢我的同口孟娇，在试验过一一天程中我们互相协作互相帮助起度过了试验生活的每。感谢牛蛟艳、马利、郭，，丽娜、姜晚龙、炼建伟、张国林、赵辉、张静、贾夏丽等同窗好友对我的鼎力相助在，此向你们致Ｗ崇高的感谢！感谢我的家人和朋友多年来对我的支持和鼓励。正是你们默默的关怀和付出，才给＇了我前进的动力Ｉ心的感谢在此致Ｗ我最衷。，最后再次感谢所有关＇与支持我的所有老师、同学和朋友们时向参加论文评，，同审和答辩专家组表示最诚擎的淆意！橋ｍｍ年巧－４７－