蜜蜂性别决定基因csd互作因子的筛选及初步鉴定 61页

■－．？一、■分类号：Ｓ８９１学校代巧：１０４１０密级：学号：０２０２０１２２０１山袜成《葦犬聲硕女＃隹讼Ａ儀蜜蜂性别决定基因ｃｓｄ互作因子的筛选及初步鉴定Ｓｃｒｅｅ打ｉｎｇａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉ打ｔｅｒａｃｔｉｎｗｔｈｔｈｅｃｏｍｍｅｎｔａｒ—ｇｉｐｌｅｙｓｅｘｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｅ（ｃｓｄ）ｑ专Ａｐｉｓ曲ｅｌｌｉｆｅｒａ申请人：李淑云指导教师：颜伟玉副教授王子：ｆｅ副研究员学科专业：特种经济动物饲养所在院（所）：动物科学与技术学院论文提交日期—：二０五年六月。：．．■．．＇．一＇－■．－－＇：１．、－／？．Ｖ一．．’．＇’心－．古－产■：．．辛：：Ｋ．、冉．：？．．．．’．■＞．，． 独创性声巧本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，遮过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农－－。研业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材料与我同对本究做出，。的志都论中说表谢意被查贡献同在文作了明确的明并示了如有严重優犯他人识产权的行为，本人应有的任。知由承担责咬，：Ｌ学位论文作者亲笔签名日期论使提权的说文用明本人全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权完送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可公布论文的全部或部分内、。容，可用印缩印或其他复制手段保存论文采影，。保密在年解密可适本权后用书＾保密本论文属不学位于不保，＾＂＂Ｖ（请在框内）方打学巧论义作者亲筆籍名：ｋ日期ｄ庐。签：：指名期导教师亲笔日 本论文得到国家蜂产业技术体系项目（No.CARS-45-KXJ12）、国家自然科学基金（No.31060327/No.31260524）资助。ThisworkwassupportedbytheEarmarkedFundfortheChinaAgriculturalResearchSystem(No.CARS-45-KXJ12)andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31060327andNo.31260524). 目录摘要...............................................................................................................1Abstract............................................................................................................II第一章文献综述.............................................................................................11.1生物常见的性别决定方式.........................................................................................11.2昆虫性别决定的常见模式.........................................................................................21.3果蝇性别分化的分子机制.........................................................................................21.3.1体细胞分化..........................................................................................................21.3.2剂量补偿..............................................................................................................31.3.3种系分化..............................................................................................................41.4膜翅目性别决定的几种假说.....................................................................................41.5蜜蜂性别决定分子机制.............................................................................................51.5.1蜜蜂csd(complementarysexdetermine)基因.....................................................61.5.2蜜蜂fem(feminizer)基因.....................................................................................71.5.3蜜蜂tra2(Amtra2:Apismelliferatransformer2)基因.........................................71.5.4蜜蜂dsx(Amdsx:Apismelliferadoublesex)基因................................................81.6本论文研究.................................................................................................................8第二章酵母双杂交法筛选与csd互作的基因.............................................92.1引言.............................................................................................................................92.2材料与方法.................................................................................................................92.2.1实验材料..............................................................................................................92.2.2实验方法............................................................................................................102.3结果与分析...............................................................................................................172.3.1构建初级文库...................................................................................................172.3.2酵母文库质量检测............................................................................................182.3.3酵母双杂交互作基因的筛选............................................................................192.4讨论...........................................................................................................................22第三章蜜蜂pabp2基因的克隆及原核表达...............................................243.1引言...........................................................................................................................243.2材料与方法...............................................................................................................243.2.1实验材料............................................................................................................243.2.2实验方法............................................................................................................253.3实验结果...................................................................................................................283.3.1RNA质量检测...................................................................................................283.3.2蜜蜂pabp2基因PCR扩增...............................................................................293.3.3重组质粒(pabp2/pEASYT1)滞后检验..............................................................29i 3.3.4蜜蜂pabp2的序列分析....................................................................................303.3.5重组质粒pabp2-PET15b的鉴定......................................................................323.3.6PABP2蛋白诱导表达.......................................................................................333.4讨论...........................................................................................................................33第四章蜜蜂rbp1基因和rbp7基因的克隆及原核表达............................354.1引言...........................................................................................................................354.2材料和方法...............................................................................................................354.2.1实验材料............................................................................................................354.2.2实验方法...........................................................................................................364.3结果与分析...............................................................................................................374.3.1PCR产物...........................................................................................................374.3.2序列分析............................................................................................................384.3.3蜜蜂RBP蛋白表达..........................................................................................424.4讨论...........................................................................................................................43第五章结论与展望.......................................................................................445.1主要结论...................................................................................................................445.2研究展望...................................................................................................................44参考文献.........................................................................................................45硕士期间参与发表和投稿的论文.................................................................52致谢...............................................................................................................53ii 摘要蜜蜂无特异的性染色体，主要靠性等位基因csd的不同组合形式决定性别。当蜜蜂具有两个不同的csd等位基因时发育成雌蜂，具有一个或两个相同的等位基因时发育为雄蜂。csd基因编码的蛋白含一个SR结构域，属于SR类型蛋白。本论文主要研究与蜜蜂csd基因互作的相关蛋白及其功能。本研究以意大利蜜蜂36h受精卵的cDNA构建酵母双杂交文库，将csd基因的编码区克隆到pGBKT7载体上，构建诱饵质粒，转化到AH109酵母菌中，表达BD-X蛋白。将文库克隆到载体pGADT7上，转化到Y187菌中，表达AD-Y蛋白。将BD-X与AD-Y蛋白共同培养，通过酵母基因组中报告基因的激活情况筛选与csd互作的蛋白。结果筛选出两个含RRM结构域的蛋白：Pabp2和Fusilli。通过基因组序列预测分析表明fusilli含一个3648bp的ORF，预测其蛋白含1215个氨基酸残基，羧基端含3个RRM结构域；pabp2含一个687bp的ORF，预测其蛋白含228个氨基酸残基，羧基端含有一个RRM结构域。本实验还对蜜蜂pabp2进行克隆及原核表达。结果显示该基因含8个外显子，7个内含子，边界均符合GT-AG法则；其ORF为687bp，编码的蛋白为228aa，其分子量为25.73kDa，该蛋白羧基端含一个RRM结构域。蜜蜂Pabp2蛋白与其他昆虫的同源蛋白进行BLAST分析表明，与蚂蚁、按蚊、果蝇、家蚕、伊蚊同源蛋白的相似性分别为98%、80%、78%、78%、74%。通过原核表达诱导出约为25.73kDa的Pabp2蛋白。最后对蜜蜂rbp1、rbp7基因(Amrbp1,Amrbp7)进行克隆及原核表达。结果克隆出Amrbp1的三种剪切形式，命名为Amrbp1-R1、Amrbp1-R2、mrbp1-R3，各自的ORF为393bp、501bp、489bp，编码的蛋白分别为130aa、166aa、161aa，分子量分别为14.97kDa、19.29kDa、18.83kDa；Amrbp1-R1含5个外显子，4个内含子；Amrbp1-R2、Amrbp1-R3均含7个外显子，6个内含子；蜜蜂RBP1蛋白与其他昆虫的同源蛋白相似性分析表明，与寄生蜂、红火蚁、伊蚊、家蚕、果蝇、按蚊的同源蛋白的相似性分别为96%、93%、80%、78%、78%、68%。本实验克隆出Amrbp7的两种剪切形式，分别命名为Amrbp7-P1、Amrbp7-P2，ORF分别为486bp、501bp，编码的蛋白大小分别为161aa、166aa，分子量分别为18.65kDa、19.29kDa；Amrbp7-P1含5个外显子，4个内含子；Amrbp7-P2含有6个外显子、5个内含子；蜜蜂RBP7蛋白与其他昆虫同源性蛋白经BLAST分析表明，与寄生蜂、红火蚁、家蚕、:果蝇、伊蚊、按蚊同源蛋白的相似性分别为89%、81%、71%、67%、67%、54%。Amrbp1、Amrbp7蛋白都含有一个RRM及SR结构域。通过原核表达诱导出大小约为20kDa的RBP1蛋白。关键词：蜜蜂；csd基因；酵母双杂交；克隆；原核表达1 AbstactHoneybeehavenospecificsexchromosomes,theirgenderwasdeterminedbydifferentcombinationofallelesofthecomplementarysexdetermination(csd)gene.Differentalleleswilldevelopintofemale,onealleleortwoofthesamealleleswilldevelopintomale.ThecsdgeneencodeaproteincontainwithSRdomain,belongstoSRtypeprotein.Thisthesismainlystudiedtheproteinswhichinteractedwithcsdgene.Used36hfertilizedeggsofApismelliferaofcDNAtoconstructyeasttwohybridlibrary.ThecodingregionofcsdgenewasclonedintothepGBKT7carriertoestablishthebaitplasmid,convertedtoAH109saccharomycetesandexpressedtheBD-Xprotein.ClonedtheyeasttwohybridlibraryintothecarrierpGADT7,changedtotheY187yeastandexpressedtheAD-Yprotein.BD-XandAD-Yproteinwereculturedtogether,thenscreentheproteinswhichinteractedwithcsdbythesituationofactivationofthereportgeneinyeastgenome.TheexperimentfiltratedtwonewApismelliferaprotein,Pabp2andFusilliwithRNA-bindingdomain.ThebeegenomesequenceanalysisshowedthatforecastfusilligenecontainanORFof3468bp,codingaproteinof1215aa,withthreeRRMdomainsintheC-terminal;forecastpabp2genecontainanORFof687bp,codingaproteinof228aa,withaRRMdomainintheC-terminal.Theexperimentclonedthepabp2geneofApismelliferaandinduceditsprokaryoticexpression.Theresultshowedthatthegenecontained8exonsand7introns,theirboundaryareaccordwithGT-AGrule;Thepabp2genecontainanORFof687bp,codingaproteinof228aa,themolecularweightof25.73kDa,withaRRMdomain.Theblastresultasfollows:theidentitywithCamponotusfloridanus,Anophelesgambiae,Drosophilamelanogaster,Bombyxmori,Aedesaegyptiare98%,80%,78%,78%,74%respectively.WealsoinducedaproteinPabp2about25.73kDabyprokaryoticexpression.FinallyweclonedAmrbp1andAmrbp7geneandinducedtheirprokaryoticexpression.TheresultsshowedthatAmrbp1containedthreealternativesplicingformsrespectivelynamedAmrbp1-R1,Amrbp1-R2,Amrbp1-R3.TheORFare393bp,501bp,489bprespectively.Theirproteinare130aa,166aa,161aarespectively.Themolecularweightare14.97kDa,19.29kDa,18.83kDarespectively.Amrbp1-R1contained5exonsand4introns.Amrbp1-R2andAmrbp1-R3included7exonsand6introns.BlastresultshowedthattheidentitywithNasoniavitripennis,Solenopsisinvicta,Aedesaegypti,Bombyxmori,Drosophilamelanogaster,Anophelessinensisare96%,93%,80%,78%,78%,68%respectively.ThisstudyclonedtwoformsofAmrbp7genewerenamedAmrbp7-P1andAmrbp7-P2.TheORFare486bp,501bprespectively.TheproteinofII 161aa,166aarespectively.Themolecularweightare18.65kDa,19.29kDarespectively.Amrbp7-P1contained5exonsand4introns.Amrbp7-P2contained6exonsand5introns.BlastresultshowedthattheidentitywithNasoniavitripennis,Solenopsisinvicta,Bombyxmori,Drosophilamelanogaster,Aedesaegypti,Anophelessinensisare89%,81%,71%,67%,67%,54%respectively.Amrbp1andAmrbp7arecontainedaRRMandaSRdomain.WealsoinducedaproteinRBP1about20kDabyprokaryoticexpression.Keywords:Apismellifera;complementarysexdetermination(csd)gene;yeasttwohybrid;clone;prokaryoticexpressionIII 第一章文献综述自然界中，几乎所有的高等生物及少数低等动物都存在两性现象。高等动物两性的生殖器官不同，高等植物两性的花蕊有差异。对于高等动物，除了解剖学中两性性腺的差异比较大，在生理、性状、行为、表型等各方面都存在差异；而对于具有两性[1]性状的低等生物如微生物只有生理上存在差异。两性发育主要有两种途径：性别决定和性别分化。性别决定是在性别分化前指导性腺发育的方向，一般由性染色体或特定的基因决定，是生物体的内在决定机制，一般很少受外界环境的影响，也称性别决定的初级阶段；性别分化是两性性腺在基因、激素、酶、外界环境等各因素的作用下，[2]使生物体表现为两性性状的过程，也称性别决定的次级阶段。1.1生物常见的性别决定方式生物性别决定的方式多种多样，主要分为两大类，一类由环境决定，称为ESD(environmentalsexdetermination)；另一类由遗传因素决定，称为GSD(geneticsexdetermination)。ESD：温度为主要的环境决定因子，称为TSD(temperaturesexdetermination)，TSD[3]普遍存在于两栖类、爬行类和某些鱼类。TSD分为三种类型：高温产雌、低温产雄型（FM型），例如欧洲泽龟；高温产雄、低温产雌型（MF型），例如美国短吻鳄；[4-5]高、低温都产雌，中间温度产雄（FMF型）。动物胚胎发育过程中存在一个温度敏感期TSP(temperaturesensitiveperiod)，处于该时期的胚胎易受外界温度的影响，性[6]激素发生改变从而影响性腺发育。中国林蛙为典型的ESD型动物，其生存温度范围较大，低温利于产雌，高温利于产雄；在15°C~25°C时，雌雄比例受温度影响最[7]大。除温度外，营养、种群密度等也影响子代性别。例如蜜蜂，蜂王和工蜂都来自于受精卵，且1-3日龄幼虫的食物相同，之后继续食用王浆的幼虫发育成蜂王，生殖[8]腺发育完全；食用蜂粮的幼虫发育成工蜂，卵巢退化。GSD为最普遍的性别决定方式，遗传因素主要是染色体和基因。植物两性由显隐性基因决定，单个或多个基因相互连锁来决定。玉米和黄瓜均为雌雄同株不同花，[9][10]玉米主要通过TS2基因决定性别，黄瓜则由F、A和M三个基因共同决定。大多数生物通过性染色体决定，主要有两种：(1)XY型：雄为异型配子XY，雌为同型配子XX。Y染色体是性别决定的关键因素，即只要存在Y染色体，无论X染色体数量的多少，其后代都发育成雄性。哺乳动物Y染色体上的SRY基因(Sexdetermination[11]regioninYchromosome)对雄性发育起关键作用。双翅目昆虫由Y染色体上的雄特[12]异决定因子M决定。(2)ZW型：大部分禽类及鳞翅目昆虫都属于该类型，雄为同[13]型配子ZZ，雌为异型配子ZW。禽类与哺乳动物的两条性染色体结构相似，W染[14]色体含特异基因FET1(female-specificexpressiontranscriptionfactor)和ASW(avian[15]sex-specificW-lingked)，在卵巢发育中起重要作用。鳞翅目昆虫性别决定的关键因[16]子是W染色体上的雌特异基因fem(feminizer)。1 有些生物的性别决定并不完全遵循上述方式，如蟑螂、蝗虫、虱子、蟋蟀等缺乏Y染色体；含一条X染色体为雄性，两条X染色体为雌性，属于XO型。果蝇含一套完整的性染色体，但其性别取决于性染色体X与常染色体A的比值，当比值为1时发育成雌蝇，为0.5时后代为雄蝇，Y染色体为雄性发育所必须的，但不是主要的[17]决定因素。蚂蚁、蜜蜂等膜翅目和缨翅目昆虫无特异的性染色体，依靠常染色体的倍性来决定后代性别，当为单倍体(16条染色体)为雄性，当为二倍体(32条染色体)[18]为雌性。1.2昆虫性别决定的常见模式[19]昆虫种类众多，至今已有上百万种，为动物界最大的一个类群。昆虫对人类的生存与发展具有一定的影响，有些昆虫具有一定的社会、经济效益，比如蜜蜂和家蚕等；也有些昆虫危害着农牧业、人类的健康，比如蝗虫、蚊子等。性别为重要的生物性状，一直是人们研究的重点。掌握昆虫的性别决定机制是至关重要的，对于经济昆虫可通过性别控制使其按着有利的方向发展，为人类带来更多经济效益；对于有害昆虫，通过性别控制来消灭它们，使其对人类的危害降到最小。大部分昆虫具有性染色体，如果蝇，同型配子XX为雄性，异型配子XY为雌性；家蚕则相反，同型配子ZZ为雌性，异型配子ZW为雄性。少部分昆虫缺乏性染色体，[18]通过常染色体倍性来决定后代性别，比如膜翅目和缨翅目等。不同品种其决定性别的起始信号也不同，例如果蝇属的起始信号为X:A；而双翅目的其他昆虫，其关键因素是Y染色体上的雄性决定因子。同一品种的不同品系也有差异，例如家蝇，自然品系的家蝇性染色体不明显，雄性决定因子位于常染色体上；标准品系的位于Y染[20]色体上。1995年Wilkins提出性别级联假说，果蝇性别决定的遗传通路是以阶梯式的级联形式实现的，相关基因从级联的底部逐步加入到顶部，与自然选择的多途径假[21]说不同。果蝇的性别级联形式是X:A→sxl→tra/tra2→dsx/ix→terminalgene。在其他昆虫体中也发现sxl和dsx的同源基因，例如地中海实蝇、家蝇、昆士兰果蝇、家蚕[21,22,23]和按蚊等。Sxl是果蝇的主开关基因，在雌雄个体中通过不同的剪切形式起作用，但在其他昆虫体中sxl表达无性别特异性；相比sxl，dsx更加保守，各昆虫体内的同源基因转录的蛋白同源性较高，功能也相似。这再一次验证了性别级联理论，基因是从底部向顶部一步步加入，即底部基因更保守，级联顶部基因加入的时间更晚。1.3果蝇性别分化的分子机制1.3.1体细胞分化果蝇决定性别的原始信号是性染色体X与常染色体A的比值(X:A)，一般情况下，X:A=1为雌性，X:A=0.5为雄性。当X:A>1，发育成超雌；0.5F发育成雄性；在二倍体中，2F>M[52]发育成雌性；这一假说无法解释纯和位点产生二倍体雄性。Kerr对该假说进行完善和补充，他提出M位点也有部分基因(m)具有累加效应，单倍体中，M+m>F为雄性；二倍体纯合体中M+2m>2F，发育成二倍体雄性；二倍体杂合体2F>M+m1+m2[53]发育成雌性。(3)受精性别决定(FSD:fertilizationsexdetermination)：Whitting通过研究金小蜂(Nasoniavitripennis)的多倍体菌株提出的，在该菌株中，雌性为二倍体或三倍体，雄性为单倍体或二倍体；由此个体性别并不由胚胎倍性决定而视受精情况而定，[54]未受精胚胎发育成雄性，反之则为雌性。该机制也普遍实用于其他膜翅目昆虫，比如蜜蜂。(4)多位点假说(multiple-locushypothesis)：Crozier依据单位点性别决定(sl-CSD)及基因平衡学说提出单倍二倍体生物的性别通过多个性位点决定，不同位点可形成有活性的杂聚物(heteropolymers)，相同位点则无法形成；单双倍性生物体中，膜翅目、[55]螨虫都可能存在多个性位点，甲壳虫只有单个性位点。(5)母体效应性别决定(MESD:maternaleffectsexdetermination)：Crozier提出胚胎的细胞核及细胞质成分决定个体的性别，单倍体胚胎中，细胞质占主要成分（母体效应）发育成雄性；二倍体[56]胚胎中，雌位点效应高于母体效应发育成雌性。(6)综合假说：蜜蜂的性别除受雌雄决定因子影响外，还受控制雄性因子表达的基因的影响；当存在该基因，纯合子发育成雄性；当不存在该基因，纯合子发育成雌性；这很好地解释了海角蜜蜂孤雌产雌[57]的现象。(7)基因印迹性别决定(GISD:genomicimprintingsexdetermination)：父本位点含不同的印记阻止母本发育，未受精胚胎的常染色体具有―母本印记‖发育成雄性；[58]受精胚胎含―父本印记‖的常染色体发育成雌性。寄生蜂的雄蜂含一个独特的常染色体(PSR:paternalsexratiochromosome)，雌蜂中并没有发现该染色体；杂交实验证明胚[59]胎的性别与父本PSR有直接作用，缺乏PSR的胚胎发育成雌性。(8)蜜蜂自身调控假说：蜂群中的雌雄比例可能受蜂王、工蜂调控，蜂王通过产受精或未受精卵来决定子代性别，产卵主要受巢房的大小、外界环境及其自身状况等因素影响；工蜂通过筑造不同巢房及释放信息素辅助蜂王对群势的掌控，同时也通过饲喂幼虫、清除雄蜂幼[60]虫来进行蜂群雌雄比例的调控。1.5蜜蜂性别决定分子机制蜜蜂作为重要的经济昆虫，早在7000多年前人类就已发掘并利用，蜜蜂的性别一直是大家研究的焦点。最早由Swarmmerdan通过解剖学开启了三型蜂的基本性别5 [61]模式（蜂王、工蜂为雌性，雄蜂为雄性）。Dzierzon首次发现雄蜂来自未受精卵，[62]为单倍体；雌蜂来自受精卵，为二倍体，这是最早提出关于蜜蜂性别决定的理论。Wilson研究昆虫染色体与性别决定的关系，发现蜜蜂与其他昆虫不同，不存在性染[63]色体。Woyke发现蜂群存在二倍体雄蜂，为受精卵，近亲交配时其数量大大增加；自然蜂群中二倍体雄蜂数量少不是因为其无生存能力，而是在幼虫期被工蜂清掉，这[64]一发现对Dzierzon理论具有挑战性。自Whiting提出性位点以来，蜜蜂性别决定的分子机制便成为研究的重点。蜜蜂通过性位点等位基因的组合形式来决定子代性别，两个不同的等位基因发育成雌蜂，一个或两个相同的等位基因发育成雄蜂。自2003年Beye克隆出蜜蜂性别决定基因，[65]开启了蜜蜂性别决定的基因层面的研究。1.5.1蜜蜂csd(complementarysexdetermine)基因Beye等人克隆的蜜蜂csdcDNA序列长度为1453bp，包含一个1158bp的ORF，编码385个氨基酸残基，该基因含9个外显子、8个内含子；其编码区分成三个区域，[65,66]命名为区域1、2、3(region1,2,3)(如图1-2)。区域3包含三种结构域：富含精/丝氨酸区(RS:arginine-serine-richdomian)、高变异区(HVR:hyper-variableregion)、富含脯氨酸区(P:proline-richdomian)。蜜蜂csd基因含多种等位基因，目前已发现51种，其中西方蜜蜂(Apismellifera)、大蜜蜂(Apisdorsata)、东方蜜蜂(Apiscerana)为15、19、[67]17种。csd的剪切形式并不丰富，雌雄两性的剪切形式相同，不同等位基因的剪切[66]形式也相似。虽然不同的等位基因来自同一性位点，但它们的序列变异性较大，主要来自于羧基端的区域3，主要由HVR区决定；高变区序列差异主要由天冬氨酸(N:asparagine)/酪氨酸(Y:tyrosine)即(N)1-4/Y的形式引起的，不同等位基因的重复次数不同，一般为5-25次；尽管不同等位基因编码的氨基酸序列有一定的差异，但预测[68]的等电点相同。csd在1~30h卵中开始转录，在雌雄蜂中及不同时期(卵、蛹、幼虫)其转录物无明显差异；在合胞体时期(0~12h卵)其转录物未发挥活性，12h之后，csd转录物发挥活性，并贯穿于整个发育过程；两个不同的csd等位基因激活SR蛋白的活性，启动雌性发育；一个或两个相同等位基因无法激发相应蛋白的活性，形成一个[37]非活性蛋白导致雄性发育。CSD蛋白结构与果蝇TRA蛋白(DmTRA)结构相似，羧基端都含有RS结构域和[69]P-rich结构域，DmTRA缺乏HVR结构域。大量研究表明含RS结构域的蛋白参与蛋白与蛋白间的相互作用，对调控前体mRNA(pre-mRNA)的剪切及新陈代谢具有重[70]要作用。含RS结构域的蛋白分为两种，一种是其氨基端含RRM结构域，称为SR蛋白；另一种不包含RRM结构域，称为SR相关蛋白，CSD与DmTRA都属于SR相关蛋白；SR相关蛋白能形成多聚体蛋白(multimericproteins)，通过特异剪切参与调[71]控个体发育。Dmtra与Dmtra2相互作用，共同参与雌性剪切，DmTRA2蛋白含[37]RRM结合域，那么蜜蜂也应该存在一个具RNA结合功能的蛋白与CSD相互作用参与性别决定。根据SR蛋白的RS结构域和P-rich结构域一般具有蛋白质结合功能，RS结构域序列的差异调节蛋白间的互作，同时影响SR相关蛋白的有效剪切，所以6 研究蜜蜂CSD蛋白与其他蛋白的互作机制应集中在其羧基端的RS结构域和P-rich[72]结构域。图1-2A:csd基因结构B:CSD蛋白结构（引自cho2006）Figure1-2A:DiagramofthecsdstructureB:DiagramoftheCSDproteinstructure1.5.2蜜蜂fem(feminizer)基因2008年Hasselmann克隆出蜜蜂另一个重要的性别决定基因fem，位于csd上游区域的12kb处，也位于性位点(SDL)上；fem为csd的旁系同源物，两者编码的氨基[73]酸序列相似性很高。Fem、CSD都为SR相关蛋白，Fem的氨基端有个额外的RS结构域，但缺乏CSD中的高变区域；fem与果蝇tra(Dmtra)结构相似，但缺乏Dmtra的一个30aa的保守序列；fem与Dmtra的转录子都存在可变剪切，fem能保持其原始的性别决定功能，但其新的功能受csd选择牵连效应的影响，CSD直接调控fempre-[74]mRNAs雌性剪切。Fem为蜜蜂性别决定通路的第二个关键基因，其转录子为性特异性剪切产物；雌性fem基因含有10个外显子，9个内含子；雄性fem含有12个外显子，11个内含子[73](如图1-3)。雌雄fem转录子都含有相同的5`端未翻译区域（UTR），但下游外显子不同；雄特异fem转录子保留一个完整的外显子3，包含一个终止密码子，使转录提前终止；雌蜂只含部分外显子3，终止密码子被剪切掉，形成一个完整的ORF，翻[73]译成403aa的特异活性蛋白，诱导雌性发育。图1-3雌性和雄性fem基因结构图Figure1-3Diagramofmaleandfemalesplicingdiagramofthefemgenestructure1.5.3蜜蜂tra2(Amtra2:Apismelliferatransformer2)基因Tra2基因最早发现于果蝇中，是果蝇重要的性别决定基因，位于果蝇性别决定[37]级联的第三级联。2006年Dearden提出蜜蜂中也可能存在果蝇tra2(Dmtra2)的种间7 [75]同源物Amtra2。2012年Nissen克隆并分析了Amtra2基因的功能，Amtra2为Dmtra2同源物，其转录物为可变剪切，但并不是性特异性剪切。Amtra2与Dmtra2结构相似，含两个RS结构域，在两RS结构域间含有RBD(RNA-bindingdomain)结构域，RBD[76]由80-90个氨基酸构成，并形成一个类似于βαββαβ管状结构，同属于SR蛋白。Dmtra2转录子翻译成3种蛋白形式，各形式序列差异主要是第一个RS结构域的序列[77]长度不同；Amtra2转录子翻译成6种蛋白形式，它们的差异在于第一个RS结构域的序列长度不同以及第二个RS结构域有个别丝氨酸的差异；所有昆虫TRA2都含有保守的RBD结构，含有两个RS结构域，但RS结构域的序列高度分化，说明这些结构域比RBD结构域进化更快；tra基因的同源性与物种系统进化有关，膜翅目之间[76]的序列同源性为82-85%，膜翅目与双翅目序列同源性61-68%。Dmtra2具有性特异性剪切，雌性Dmtra2与Dmtra共同参与dsxpre-mRNAs雌性剪切，雄性Dmtra2[37]负反馈调节影响睾丸发育，进而影响精子形成。Amtra2基因转录物早于csd转录，在蜜蜂的合胞体期已大量存在；Amtra2大量存在于蜜蜂的胚胎期和蛹期，不同变体在不同时期的表达量有差异；Amtra2无性特异性剪切，通过不同的蛋白变体参与Amdsx和fem转录子的性特异剪切；同时Amtra2是蜜蜂的胚胎发育的必不可少的基[76]因。1.5.4蜜蜂dsx(Amdsx:Apismelliferadoublesex)基因dsx基因位于多细胞动物中性别决定级联的底部，为最保守的性别决定基因之一，[78]通过可变剪切编码性特异转录子。蜜蜂存在果蝇dsx(Dmdsx)种间同源物Amdsx，2006年Cristino首次分离了Amdsx的一个443bp的cDNA片段，卵和幼虫体中都存在Amdsx，编码一个转录因子，包含一个DMDNA结合区域（DM结构域命名由来：DM[79]最先发现于果蝇DSX和线虫MAB-3中），参与性别决定基因表达，其转录子受csd[80]基因的调控。Dmdsx在雌雄个体中都翻译蛋白，翻译成DSX-F蛋白时启动雌性发育，翻译成DSX-M蛋白启动雄性发育；Amdsx的具体作用机制还有待研究。除以上4种主要的基因之外，参与蜜蜂性别决定的基因还有很多，例如ix，fru，[80]dpn，dsf，run，bab和scr等。1.6本论文研究本论文运用酵母双杂交技术初步筛选出与蜜蜂CSD蛋白相互作用的两个蛋白(Fusilli,Pabp2)，并对这两个基因预测的序列进行结构分析；同时运用该预测序列进行引物设计，对pabp2基因进行克隆及原核表达。最后本论文克隆了蜜蜂rbp1和rbp7基因，并分析其基因结构及预测的蛋白结构，以及它们与其他昆虫同源物的相似性分析，并对这两个基因进行原核表达。本论文的研究结果为进一步了解蜜蜂csd基因与其他基因的相互作用提供了一个基础，为进一步了解蜜蜂性别决定的分子机制提供了部分理论基础，同时也为SR相关蛋白的蛋白间互作提供有力的例证。8 第二章酵母双杂交法筛选与csd互作的基因2.1引言蜜蜂无特异的性染色体，其性别由性位点上的csd等位基因不同组合形式来决定的，杂合子为雌蜂，半合子或纯合子为雄蜂。CSD蛋白的C端含有一个SR结构域，但缺乏RRM结合域，属SR相关蛋白，与果蝇TRA(DmTRA)蛋白结构相同，功能相似。Dmtra、Dmtra2(含RRM结构域)相互作用，共同参与果蝇性别调控。研究表明SR家族蛋白中RS结构域对RNA剪切及调控具有重要作用，RS结构域中的丝氨酸[81]是很多蛋白激酶的底物，具有磷酸化修饰作用，参与调控蛋白与蛋白的相互作用。由此推测作为缺乏RRM结构域的SR家族蛋白，CSD可能参与其他蛋白的相互作用来实现对蜜蜂性别的调控。两蛋白间的相互作用一直是通过生化技术（例如免疫共沉淀和分馏）的方法研究，直到1989年Fiels和Song提出酵母杂交技术，为蛋白互作机制的研究提供了新的方[82]向。该技术充分利用GAL4的蛋白优势，主要分为两部分：N端结合特异DNA和C端激活转录活性。将已知（诱饵）蛋白X克隆到pGBKT7载体中，转化到AH109酵母菌中，表达出融合蛋白X；将文库克隆到载体pGADT7中，转化到Y187菌中，形成融合蛋白Y，将两种蛋白菌株共同培养形成结合子。若X与Y蛋白能相互作用可形成蛋白复合体，则能激活酵母细胞基因组中报告基因的活性，进而筛选出与目的蛋白X互作的蛋白Y。本实验以意大利蜜蜂的受精卵为材料，构建cDNA文库，通过酵母双杂交筛选出与csd相互作用的蛋白，同时通过基因组序列推测出这些基因的序列及蛋白序列，进行结构及同源性分析，为蜜蜂csd的作用机制及其性别决定机制提供进一步依据，同时为SR家族蛋白间的互作提供更多示例。2.2材料与方法2.2.1实验材料2.2.1.1实验样本江西农大蜜蜂所饲养的意大利蜜蜂36h的受精卵100-200粒作为一个样。2.2.1.2实验用具超净工作台、电子天平、研钵、制冰机、紫外分析仪、蒸汽灭菌锅、水浴锅、电泳仪和电泳槽、PCR仪、恒温摇床、恒温培养箱、PH计、玻璃皿、锥形瓶等。2.2.1.3实验试剂氯仿、苯酚、异丙醇、无水酒精、葡萄糖、琼脂糖、冰乙酸、甘油、琼脂粉、牛血清蛋白(10μg/μL)、Gelstain、Trizol、DEPC、Tris、Tryptone、Nacl、Kcl、Mgcl2、.YeastExtract、NaAc3H2O、NaOH、OligotexmRNAKits(mRNA分离试剂盒)(Qiagen)、Oligo(dT)(5.97nmole/OD)、dNTP(10mM)、MMLV(200μ/μL)、第一链Buffer、Primer(309 pmol)、DTT、第二链buffer、RI(50μ/μL)、E.coli.DNALigase(10μ/μL)、E.coli.DNAPolymerase、5×MMLVbuffer、Na2EDTA、RNaseH(2μ/μL)、T4DNAPolymerase(200μ/μL)、AdapterBuffer、attB1Adapter(1μg/μL)、T4DNALigase(1U)、pDONR222(250ng/μL)、ProreinaseK、BPClonaseII、DH10B、pGADT7、DH5α、Y187、AH109、DMSO、Kananmycinsultfate、Ampicillinsodiumsalt、分离柱分离试剂盒、质粒提取试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等。2.2.1.4试剂配置DEPC水：DEPC与ddH2O按1:1000比例配置，摇床震荡1.5天，灭菌。75%酒精：无水酒精与ddH2O按3:1比例配置，混合均匀。50×电泳缓冲液(TAE)：24.2gTris、3.72gNa2EDTA、5.71mL冰乙酸溶于100mLddH2O。1%琼脂糖电泳胶：2g琼脂糖、200mL1×TAE中，加热溶解，加入20μLGelstain染料，混匀。5MNaOH：20gNaOH、80mLddH2O，充分溶解，ddH2O定容到100mL。3MNaAc(PH5.0)：40.8gNaAc.3H2O、50mLddH2O，溶解完全，冰醋酸调PH到5.2，ddH2O定容到100mL。0.5MEDTA(PH8.0)：18.61gNa2EDTA、80mLddH2O，溶解完全，5MNaOH调PH到8.0，ddH2O定容到100mL。SOC培养基：2gTryptone、0.5gYeastExtract、0.058gNacL、0.018gKcL、0.095gMgcl2、0.36g葡萄糖溶于100mLddH2O，高压灭菌。固体培养基：1gTryptone、0.5gYeastExtract、1gNacl、1.5g琼脂粉溶于100mLddH2O，高压灭菌。0.1MDTT：15.4mgDTT，溶于1mLddH2O。YPDA培养液：50gYPD、500mLddH2O，溶解完全，加0.3g腺嘌呤，混匀，定容到1000mL。YPD：10gYeastExtract、20gTryptone、20g葡萄糖溶于500mLddH2O中，5MNaOH调PH到5.8，ddH2O定容到1L，高压灭菌。YPDA：10gYeastExtract、20gTryptone、20g葡萄糖、2g腺嘌呤、20g琼脂糖、500mLddH2O，混匀，NaOH调PH为5.8。SD/-Leu：6.7gSD琼脂糖、0.69gDO/-Leu、500mLddH2O，溶解，定容到1L，高压灭菌。（其他平板按此类似方法配置）注：文中所用的ddH2O均为灭菌的双纯水2.2.2实验方法2.2.2.1初级文库的构建2.2.2.1.1总RNA的提取取意大利蜜蜂36h左右的受精卵100-200粒，置于EP管中，放于液氮中保存，提取RNA。步骤如下：10 ①样品置于含液氮的研钵中研磨至粉末状，转移到含1mLTrizol的EP管中。震荡混匀，室温放置5min。13000rpm、4°C低温离心10min。②移取上清液，加入200μL氯仿，混匀，温育至分层。13000rpm、4°C低温离心10min。③移取上清液(避免吸入中间白色层)，加氯仿至1.2mL，混匀，温育至分层。13000rpm、4°C低温离心10min。④移取上清液(避免吸入中间白色层)，加500μL异丙醇，缓慢混匀(上下颠倒混匀)，室温放置10min。13000rpm、4°C低温离心15min。⑤弃上清液，加1mL75%乙醇，剧烈震荡，充分洗涤白色沉淀(RNA)。8000rpm、4°C低温离心6min。⑥重复步骤⑤。⑦弃上清液，快速离心，吸干EP管中的水，风干3min。⑧30-40μLDEPC水溶解RNA。溶解完全的RNA置于-80°C保存。注：以上步骤均在超净工作台中完成，并注意操作过程中避免RNA酶的污染。所用EP管为1.5mLEP管，且所有的EP管、枪头、试剂等均为无RNA酶。提取的RNA经核酸蛋白测定仪测定浓度及A260/A280比值初步鉴定RNA质量；同时用1%的凝胶电泳进一步检测。2.2.2.1.2mRNA的分离按照OligotexmRNAKits(Qiagen)试剂盒的操作步骤进行mRNA分离，1%的琼脂糖电泳进行质量检测。2.2.2.1.3cDNA第一条链的合成(1)加入8μLmRNA、3μLOligo(dT)、18.5μLDEPC水，混合均匀，PCR仪反应(70°C,5min)。(2)反应结束后，放于冰上5min。(3)加入1μLRI、10μL5×MMLVbuffer、8μLdNTP、1.5μLMMLV，混合均匀，PCR反应(42°C,1h;75°C,5min)。2.2.2.1.4cDNA第二条链的合成与末端补平试剂体积μL单链cDNA105×第二链Buffer15dNTP3DEPC水68E.coli.RNaseH1E.coli.DNALigase1E.coli.DNAPolymeraseI2TotalVolume100(1)按上述表格分别加入各成分，混合均匀，16°C反应2h（若cDNA长度大于3kb，时间延长到3-4h）。11 (2)70°C水浴10min（灭活）。(3)反应液置于冰上终止反应，结束第二条链的合成。末端补平：(1)加入2μLT4DNAPolymerase、6μLdNTP、2μL牛血清蛋白。(2)按苯酚、氯仿、异戊醇为25:24:1的比例分别加入80μL苯酚、76.8μL氯仿、3.2μL异戊醇，共160μL，轻轻混匀，抽提。3000rpm离心5min。(3)移取上清液，加入同等体积的3MNaAc(PH5.0)及两倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，室温放置3min。13000rpm离心10min，弃液体。(4)加入0.5mL70%乙醇，洗涤DNA沉淀。(5)弃液体，风干，18μLDEPC水溶解DNA。2.2.2.1.5cDNA与接头连接cDNA18μL5×AdapterBuffer10μLattB1Adapter10μL0.1MDTT7μLT4DNALigase5μLTotalVolume50μL16°C连接16-24h。2.2.2.1.6cDNA的分级分离按照分离柱试剂盒的一般步骤进行cDNA的分离，舍弃<500bp的样品，合并>500bp样品，用等体积的3MNaAc(PH5.0)及无水乙醇沉淀DNA，70%的无水乙醇洗涤，9μLDEPC水溶解DNA（筛选片段较大的DNA，利于片段的插入及cDNA文库的构建）2.2.2.1.7cDNA与载体pDONR222的连接cDNA9μLpDONR2221μLBPClonaseII4μLDEPC水6μLTotalVolume20μL25°C反应16-20h。除蛋白酶：①加2μL蛋白酶K、20μLddH2O，混匀，50°C水浴20min。②加50μL苯酚、48μL氯仿、2μL异戊醇，混匀(萃取2min)。③离心(4°C,13000rpm,5min)。再次萃取上清液。④离心(4°C,13000rpm,5min)。上清液加入等体积NaAc(3M,PH5.0)与无水乙醇。⑤离心(13000rpm,10min)。弃上清，70%无水乙醇洗涤沉淀两次。⑥风干，10μLDEPC水溶解。12 2.2.2.1.8重组质粒电转化①DH10B感受态细胞冰上解冻5min。②移取5μL重组质粒于1.5mLEP管中，与电极杯(0.1CM)冰上预冷。③加入100μLDH10B感受态细胞，轻弹混匀，冰上反应20min。④开启电转仪进入Manual模式，调电压到2.1kv。混合液移取到电极杯底部。⑤电极杯接到电转化仪上，2mLSOC培养基将细胞重悬转移到新EP管。⑥摇床震荡(37°C,200rpm,1h)，使菌体复苏。⑦制平板：80μLX-gal、20μLIPTG(0.5M)、80μLSOC培养基混合均匀，均匀涂布在平板上。⑧200μL菌液涂板，其余菌液与甘油等体积混合，保存在-80°C备用。⑨平板置于37°C恒温培养箱中倒置培养12h。观察菌落，计算阳性克隆（白斑）和阴性克隆（蓝斑）的数量，计算重组率。2.2.2.1.9cDNA文库库容量的检测文库菌液制备①制备SD/-Leu平板，每块平板加入80μLX-gal、20μLIPTG(0.5M)，并取200μL菌液涂板。②恒温培养箱(30°C)倒置培养3-5天观察菌落情况。③将长有菌落的平板放在4°C预冷2-3h后加入4mL预冷的YPDA培养液，使其均匀覆盖菌体表面。④用无菌玻璃棒将菌落全部刮入装有YPDA培养液的锥形瓶中，用少量的YPDA培养液洗涤培养皿表面的菌落。⑤混匀液体，计数板检测菌落的密度。所有菌落的数量构成原始文库。检测滴度32①用YPDA培养液按1:10、1:10、1:10稀释成菌液A、B、C。②取三块SD/-Leu平板，分别取100μL的A、B、C菌液涂板。③平板倒置于30°C恒温培养箱中培养5-6天。④计算每块平板的菌落数，计算滴度。滴度为：菌落的总数×稀释的倍数×1000/涂板体积。库容量为：菌落的总数×稀释的倍数×转化菌液总体积×1000/涂板体积。2.2.2.1.10重组片段大小检测挑选SD/-Leu平板的25个阳性克隆子进行PCR反应体系为(20μL)：3‘-primer1μL5‘-primer1μLPCRMix10μLddH2O8μL反应条件为：95°C预变性2min；95°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸2min，循环25次；72°C再次延伸10min；4°C保存1h。13 2.2.2.2酵母文库的构建2.2.2.2.1质粒与pGADT7载体的连接①取200μL初级文库菌液均匀涂于平板上，恒温培养箱倒置培养(37°C,12h)。②挑取阳性克隆(白斑)，摇床震荡(37°C,180rpm,10h)。③提取质粒(详细步骤参照康为质粒小提试剂盒)。④连接反应：质粒DNA10μLpGADT71μLLRMix4μLddH2O5μLTotalVolume20μL25°C连接20h。2.2.2.2.2重组产物沉淀按2.2.2.1.7步骤，进行萃取、沉淀和洗涤，10μLDEPC水溶解沉淀。2.2.2.2.3电转化具体步骤参照2.2.2.1.8。2.2.2.2.4库容量的检测具体步骤参照2.2.2.1.9。2.2.2.2.5重组片段大小检测具体步骤参照2.2.2.1.10。2.2.2.3csd互作基因的筛选2.2.2.3.1csd-pGBKT7重组质粒的构建蜜蜂csd基因扩增，回收目的条带，与载体pEASYT1连接后转化，筛选阳性克隆子，提取阳性质粒。将阳性质粒及pGBKT7载体分别用EcoRI酶、BamHI酶进行双酶切，酶切产物进行连接转化，筛选阳性克隆，提取质粒，重组质粒(csd-pGBKT7)送全式金公司测序。（1）采用NCBI中csd基因序列，设计引物，上下游引物分别加入EcoRI和BamHI酶切位点、引物序列分别为：csd-F：GAATTCATGAAACGAAATATATCAcsd-R：GGATCCTCATTGATGCGTAGGTCC（划线部分为酶切位点）PCR反应体系（50μL体系）：2μLcDNA、1μLcsd-F、1μLcsd-R、5μL10×buffer、3μLdNTP、1μLpfu酶、37μLddH2O，混合均匀反应程序：预变性(94°C,5min)；变性(94°C,30s)，退火(55°C,30s)，延伸(72°C,90s)，循环30次；再次延伸(72°C,10min)；4°C保存。（2）与pEASYT1载体连接(5μL)：4μL回收产物、1μLpEASYT1载体轻弹混匀，25°C反应20min。14 （3）双酶切(10μL)：质粒DNA/pGBKT74μL(0.2~0.5μg)EcoRI酶0.5μLBamHI酶0.5μL10×Kbuffer1μLddH2O4μL37℃反应3h，产物用1%凝胶验证，回收目的条带。（4）酶切产物连接(10μL)：pGBKT71.5μL目的片段3μLT4buffer1μLT4连接酶0.5μLddH2O4μL轻轻混匀，16°C连接12h。2.2.2.3.2AH109酵母菌株（诱饵菌株）的制备①挑取AH109菌株在YPDA板上划线，恒温培养箱(30°C)倒置培养4-5d。②挑选几个直径较大的菌落(约3mm)，接种到含YPDA培养液(3mL)的大试管中，恒温摇床震荡(30°C,250rpm,10h)。4③按1:10重新接种培养，5μL菌液加入到50mL新的培养液中，恒温摇床震荡(30°C,250rpm,17-19h)，至菌体处于生长稳定期（OD600约0.15~0.3）。④离心(2000rpm,6min)，弃上清，100mLYPDA培养基悬浮沉淀。⑤恒温摇床培养(30°C,250rpm,4h)，至OD600约0.4-0.5。⑥离心(2000rpm,6min)，弃上清，30mLddH2O悬浮沉淀。⑦离心(2000rpm,6min)，弃上清，用1.5mL1.1×TE/LiAc重新悬浮沉淀。⑧离心(13000rpm,1min)，去上清，用600μL1.1×TE/LiAc溶解沉淀。Y187菌株（文库菌株）按类似方法制备。制备好的菌株放于-80°C保存。2.2.2.3.3诱饵质粒（csd-pGBKT7）转化到AH109酵母菌按照酵母转化手册的操作方法进行转化，步骤如下：(1)YeastCarrierDNA变性处理：沸水煮5min，冰浴10min；重复一次。(2)加入0.1μgcsd-pGBKT7质粒、50μLAH109酵母菌、5μLYeastCarrierDNA(已变性)、0.5mLPEG/LiAc，轻轻混匀。(3)30°C水浴0.5h，每10min上下颠倒混匀一次。(4)加入20μLDMSO混匀，42°C水浴15min，每5min轻轻混匀一次。(5)12000rpm快速离心20s，弃上清，加入0.8mLYPDplus，悬浮沉淀。(6)摇床震荡(30°C,220rpm,1-1.5h)。(7)快速离心(12000rpm,30s)。弃上清，加1mLNaCl(90%)，悬浮沉淀。(8)取100μL混合液，均匀涂在SD/-Trp平板上，恒温培养箱(30°C)倒置培养3-5d。文库质粒转化到Y187酵母菌的步骤同上。2.2.2.3.4csd-pGBKT7自身激活的鉴定各取100μL上述转化液均匀涂布在一缺(SD/-Trp)、二缺(SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp、SD/-Leu/-Trp)、四缺(SD/-His/-Leu/-Ade/-Trp)平板上，恒温培养箱中(30°C)倒置培养3-5d，观察菌落生长情况。将AH109酵母菌作为阴性对照，均匀涂在四缺15 平板上，观察菌落生长情况。将53-pGBKT7&T-pGADT7作为阳性对照，均匀涂在四缺平板上，观察菌落生长情况。2.2.2.3.5csd-pGBKT7毒性的检验将空载体质粒pGBKT7与重组质粒csd-pGBKT7分别转化到二缺(SD/-Trp)平板上，恒温箱(30°C)倒置培养4d，观察两者的菌落生长情况。每块平板挑取1-2个较大的白斑接种到含Kan的SD/-Trp液体培养基(50mL)中，恒温摇床震荡培养(30°C,220rpm,20h)。测两种菌液的OD值。2.2.2.3.6杂交配对①取csd-pGBKT7质粒菌接种到50mL的液体培养基(SD/-Trp)中，恒温摇床(30°C,16-20h)培养，至菌液OD600值约0.8。②离心(1300rpm,5min)，弃上清，5mL液体培养基(SD/-Trp)悬浮沉淀(确保细胞的8密度>10/mL)。③温水浴解冻1mLY187文库菌液(文库-pGADT7)，与5mLAH109诱饵菌(csd-pGBKT7)混合均匀，转移到含50mL的2×YPDA(Kan:50μg/mL)培养液的锥形瓶中。④恒温摇床震荡培养：30°C、40rpm摇荡21-23h(利于细胞与细胞的杂交)。⑤取菌液观察杂交效果(显微镜下看到三叶草型说明杂交成功)。⑥离心(1300rpm,5min)，用0.5×YPDA(Kan:50μg/mL)培养液洗两次。⑦10mLddH2O悬浮沉淀。200μL菌液均匀涂板(SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade，40μLX-gal)，30°C倒置培养4-5d。⑧挑取阳性克隆子，在平板(SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade/,40μLX-gal)上划线。⑨为避免假阳性的影响，重复⑦⑧步骤。2.2.2.3.7酵母质粒的提取挑取阳性克隆子，接种于5mL的四缺(SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade)培养液中，恒温摇床培养(30°C,220rpm,12h)。按照酵母质粒小提试剂盒的操作步骤提取质粒。2.2.2.3.8文库质粒的分离酵母质粒转化到DH5α感受态细胞中，均匀涂在LB(Amp)平板上，恒温箱倒置培养(37°C,12h)，取阳性克隆子摇菌，提取文库质粒(X-pGADT7)（按质粒小提试剂盒步骤）。2.2.2.3.9回转验证将X-pGADT7文库质粒与csd-pGBKT7诱饵质粒运用LiAc法共同转入到酵母AH109感受态细胞中，均匀涂在含X-gal的四缺平板(SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade)上，恒温箱30°C培养4d，挑取阳性克隆子，重新划在四缺板(含X-gal)上，继续培养，观察平板菌落情况。同时设阴性和阳性对照，阴性对照为：X-pGADT7与M-pGBKT7、M-pGBKT7和csd-pGBKT7；阳性对照为：X-pGADT7和53-pGBKT7、X-pGADT7和Lam-pGBKT7（以上阴性对照已证明无相互作用，阳性对照有相互作用）。16 2.2.2.3.10分析阳性菌落回复杂交确定的阳性克隆子摇菌，提取质粒，质粒送全式金公司测序，序列进行重组，并进行blast分析验证，验证正确的序列进行相关分析，预测基因的氨基酸序列，并对该蛋白结构进行结构域预测，以及同源性比对，从而确定与csd互作的蛋白的序列信息。2.3结果与分析2.3.1构建初级文库2.3.1.1RNA的提取意蜂受精卵提取的总RNA经核酸蛋白测定仪测定，A260/A280为2.011，初步判定RNA质量较好。琼脂糖电泳检验结果可见三条很清晰的条带（图2-1），从上到下分别为28S、18S、5S，其中28S的条带最亮，大约为18S条带的两倍，5S的条带比其他两条条带都弱，说明提取的RNA完整性较好，质量较高，可用于进行下一步实验。图2-1意蜂受精卵总RNA电泳图M：DNA标样(12000bp)1：总RNAFig.2-1ElectrophoregramoftotalRNAofApisfertilizedeggsM:DNAmark(12000bp)1:totalRNA2.3.1.2mRNA的分离运用OligotexmRNAKits分离mRNA，琼脂糖电泳检测。结果显示在500bp以上区域有弥散性条带，可见mRNA质量较好，满足构建文库的需要。17 图2-2mRA电泳图M：DNA标样(12000bp)1：mRNAFig.2-2ElectrophoregramofmRNAM:DNAmark(12000bp)1:mRNA2.3.1.3初级文库质量检测6重组菌液转化涂板，通过平板上菌落数量得到初级文库的库容量为9.6×10CFU。挑取25个克隆子进行PCR检测其重组片段大小，发现所有插入片段均处于1000bp以上，表明这些克隆子均为阳性克隆，且重组率为100%（如图2-3）。从图可知这些克隆子大部分分布在1000~1650bp之间，4个分布在1650~2000bp间，5个分布在2000~3000间，重组子插入片段的平均长度约1.5kb，可见插入片段较长，为构建cDNA文库提供较好的条件。图2-3初级文库电泳图M：DNA标样(12000bp)1-25：PCR扩增Fig.2-3ElectrophoregramofprimarylibraryM：DNAmark(12000bp)1-25：PCRamplificationof25recombinant2.3.2酵母文库质量检测文库菌液扩大培养提质粒后与载体pGADT7连接，在平板上培养。通过库容量67的一般计算方法得到酵母文库的库容量为4.5×10CFU、总库容量为1.35×10CFU。取26个克隆子进行PCR反应，经电泳检测，结果如图2-4，所有的克隆子插入片段大小均在1kb以上，平均长度约为1.5kb，重组率为100%，可见质粒连接效果较好，DNA片段筛选的也较好，利于后续文库构建。18 图2-4酵母文库电泳图M：DNA标样(12000bp)1-26：26个重组子PCR扩增Fig.2-4ElectrophoregramofyeastlibraryM:12000bpDNAmark1-26:PCRamplificationof26recombinant2.3.3酵母双杂交互作基因的筛选2.3.3.1csd基因扩增对意蜂csd基因序列进行引物设计，引物添加BamHI、EcoRI酶切位点，进行PCR扩增，结果如图2-5，1000~2000bp间有条较亮的条带，约为1300bp，由于csd基因长度约为1300bp，可见该条带即为目的片段。回收条带，与pEASYT1载体连接、转化后测序验证，所测序列与NCBI中序列进行BLAST比对，结果发现序列相似性100%，表明目的条带连接正确。图2-5csd基因的PCR扩增M：DNAmark(5000bp)1-2：PCR产物Fig.2-5PCRamplificationofcsdgeneM:5000bpDNAmark1-2:PCRproduct2.3.3.2重组质粒csd-pGBKT7的构建csd-pEASYT1与pGBKT7载体分别双酶切(BamHI和EcoRI)，连接、转化、涂板、提质粒，提取的重组质粒csd-pGBKT7经双酶切和测序验证，酶切验证如图2-6，可见两条带，大小约为1300bp、5000bp，可见分别为目的条带和载体条带，表明重组质粒构建正确；测序结果经BLAST比对，与蜜蜂csd相似性100%，序列分析表明无突变序列；证明重组质粒csd-pGBKT7构建成功。19 图2-6重组质粒csd-pGBKT7双酶切鉴定M：DNAmark(5000bp)1-2：csd-pGBKT7质粒双酶切Fig.2-6Theidentificationofdoubledigestionofrecombinantplasmidcsd-pGBKT7M:5000bpDNAmark1-2:doubledigestionofcsd-pGBKT7plasmid2.3.3.3csd-pGBKT7自身激活的验证将csd-pGBKT7转化到AH109菌中，涂板，设阳阴对照，通过菌落的生长情况判断csd-pGBKT7诱饵蛋白的自激活功能。结果表明，阴性对照无菌落生成，阳性对照菌落生长正常，证明酵母菌以及制作的平板正常。重组质粒除了在一缺(SD/-Trp)平板上有白色菌落，其他平板均无菌落，说明csd-pGBKT7诱饵质粒自身不能激活AH109酵母菌Ade、His、leu报告基因，即csd-pGBKT7无自激活功能，可用于下一步的杂交筛选实验。AH109阴性对照(四缺板)53-pGBKT7&T-pGADT7阳性对照(四缺板)AH109negativecontrol53-pGBKT7&T-pGADT7positivecontrolcsd-pGBKT7转化AH109(四缺板)csd-pGBKT7转化AH109(一缺板)csd-pGBKT7conversttoAH109csd-pGBKT7conversttoAH109图2-7csd-pGBKT7的自激活验证图Fig.2-7Theverificationdiagramofself-transcriptionalactivationofcsd-pGBKT720 2.3.3.4csd-pGBKT7毒性的检验将空载体pGBKT7、csd-pGBKT7质粒转化到AH109菌中培养4d，观察比较两者菌落的生长状况（图2-8）；挑取较大克隆子在菌液中培养20h，测两者的OD值。结果发现两平板菌落生长情况差异不大，两者OD值都达到0.8左右，表明诱饵蛋白csd-pGBKT7无毒性，可进行下一步的筛选实验。pGBDKT7转化到AH109（SD/Trp）csd-pGBKT7转化AH109(SD/Trp)pGBDKT7conversttoAH109（SD/Trp）pGBDKT7conversttoAH109(SD/Trp)图2-8csd-pGBKT7毒性检测图Fig.2-8Thetoxicitytestfigureofcsd-pGBKT72.3.3.5回转验证将X-pGADT7/csd-pGBKT7(文库质粒/诱饵质粒)；X-pGADT7/M-pGBKT7、M-pGBKT7/csd-pGBKT7(阴性对照)；X-pGADT7/53-pGBKT7、X-pGADT7/Lam-pGBKT7(阳性对照)进行培养(如图2-9)，结果表明文库质粒/诱饵质粒及阳性对照具有正常的克隆菌长出，阴性对照无菌斑长出。图2-9X-pGADT7/csd-pGBKT7回转验证图PC1、PC2分别为阳性对照X-pGADT7/53-pGBKT7、X-pGADT7/Lam-pGBKT7NC1、NC2分别为阴性对照X-pGADT7/M-pGBKT7、M-pGBKT7/csd-pGBKT7TG1、TG2、TG3均为实验组X-pGADT7/csd-pGBKT7（文库质粒/诱饵质粒）Fig.2-9ThefigureoftherotaryvalidationofX-pGADT7/csd-pGBKT72.3.3.6文库的筛选将X-pGADT7/csd-pGBKT7共同转入酵母菌中培养，挑取较大阳性克隆重新划板，取阳性克隆培养，重新涂板，重复3-5次。选择在实验组具有蓝斑出现，对照组21 无斑或没有蓝斑出现的质粒为阳性质粒。经过初步筛选，得到6个阳性克隆子，它们可能与csd基因相互作用，参与蜜蜂性别决定。将上述6个阳性克隆进行测序。分析其预测的蛋白序列结构，发现只有两个蛋白含RRM结构域，经过BLAST比对，发现这两个蛋白分别为Fusilli和PABP2。提取这两个克隆的质粒，通过酵母双杂交进行回转验证表明它们均能与csd基因互作。对这两个基因预测的序列进行分析，结果表明fusilli基因含一个3648bp的ORF，预测的蛋白含1215个氨基酸残基，其分子量约为138.2kDa，对Fusilli蛋白结构进行分析，发现在其羧基端含3个RRM结构域；pabp2基因含一个687bp的ORF，预测的蛋白含228个氨基酸残基，其分子量大小约为25.73kDa，对PABP2蛋白结构进行分析，发现在其羧基端含有一个RRM结构域。图2-10Fusilli和Pabp2蛋白结构Fig.2-10ThestructuresofFusilliandPabp2protein2.4讨论酵母双杂交自1989年Fiels、Song提出以来，发展迅速，是目前研究蛋白互作应用最为广泛的一门技术。相较于传统蛋白研究方法（免疫共沉淀、交联法、分馏法等），具很多优势：操作更为简便，灵敏度更高，效用性更好。该技术主要在五方面得到运用：(1)发现与目标蛋白互作的新蛋白(2)获得蛋白互作时起主要作用的结构域或活性位点(3)研究具有药性作用的小分子多肽(4)寻找调控蛋白间互作的化合物(5)有利于[83]蛋白间互作图谱的构建。酵母双杂交技术最初是用来研究体内已知蛋白的相互作用，目前此运用逐渐扩展，如Kiston发现SV40的T抗原与R6、P53蛋白的互作，[84]从而揭示了SV40的作用机理，为原癌基因的研究提供了重要信息。获得新蛋白是该技术的特性，目前已被广泛运用，如Staudinger运用该技术筛选出小白鼠PKC蛋[85]白互作的新蛋白PICK1。该技术也用于昆虫新基因的研究，如王永虎运用该技术筛选出与家蚕BR-C(Broadcomplex)蛋白互作的RACK1、Serl、Fib-H、eiF3g、RpS16[86]蛋白等。可见酵母双杂交已经是一门较为成熟且应用广泛的技术。本论文运用该技术筛选出与蜜蜂csd互作的Fusilli、PABP2蛋白。据Beye研究发现蜜蜂csd在蜜蜂合胞体形成之后即胚胎12h之后才开始转录发挥作用，胚胎36h[65]时转录活性最高，是研究其作用机制的重要时机。CSD为SR家族蛋白，但缺乏RRM域，是DmTRA较远的同源物；Dmtra与含RRM结构的Dmtra2共同作用，参[37]与Dmtra的剪切调控；由此可推断出蜜蜂csd也必然与含RRM结构域的基因共同作用。Fusilli和PABP2蛋白都具有RRM结构域，满足与csd互作的条件，初步断定参与csd的相互作用。22 [87]2001年Wakabayashi-Ito克隆果蝇fusilli(Dmfusilli)并分析其功能。Dmfusilli编码的蛋白(DmFusilli)为967aa，与人类的hnRNPF和H同源，含有3个80aa的RNA[88]结合域(RBD)，参与RNA的特异性结合，从而参与RNA的剪切调控。蜜蜂Fusilli蛋白结构与果蝇相似，也含3个RBD，可能参与调控csd基因性别决定作用机制或者是辅助csd基因对其他基因的调控从而参与到性别决定机制。hnRNPF和H是高度相关蛋白，参与pre-mRNA的剪切，在c-src、b-tropomyosin基因的可变剪切中起重[89,90]要作用。在果蝇的基因组序列中，发现fusilli与人类hnRNPF和H是最相关的基因，意味着fusilli参与某些基因的可变剪切。蜜蜂fusilli基因与果蝇的fusilli基因同源性很高，我们推测蜜蜂fusilli基因参与某基因pre-mRNA的可变剪切，但蜜蜂csd基因的可变剪切并不丰富，由此推测fusilli基因可能是通过参加与csd相关的其它基因的可变剪切来间接影响csd基因。Wakabayashi-Ito发现果蝇fusilli在卵巢中的营养细胞和卵泡细胞的特定阶段均有表达，参与卵子形成；同时fusilli也能参与调控DER[91]通路的三个基因(nudel,pipe,windbeutel)的RNA的表达；fusilli基因是胚胎背腹模型形成的母性基因，参与胚胎发育，除此之外还参与胚胎发育的其它过程；在胚胎形成过程中，fusilli突变或失活都会导致胚胎致死。FusilliRNA不存在卵母细胞或早期胚胎中，fusilli突变体的胚系克隆体在背腹模型中并不起母性效应，表明fusilli的母[88]性效应不依赖于胚系基因的表达。作为果蝇fusilli的同源体，蜜蜂fusilli基因应该也有类似的这些功能，但其的具体作用机制以及与csd基因相互作用的具体机理还需要进一步的实验验证。Pabp2基因的相关研究进展在下一章进行论述。23 第三章蜜蜂pabp2基因的克隆及原核表达3.1引言3`端加尾是Pre-mRNA加工成成熟的mRNA的必要步骤，3`端加尾主要是添加[92]200-250nt的poly(A)尾巴。Pabp2(poly(A)-bindingproteinII)是哺乳动物mRNA加工形成正确3`尾巴的多聚腺苷酸化因子的必要基因，同时也参与调控poly(A)尾巴的[93-94]长度。1995年Nemeth克隆了牛科动物的pabp2基因，发现其蛋白含有一个保守[95]的RNP类型RRM结构域。1999年Benoit克隆了果蝇的pabp2基因，为哺乳动物[96]pabp2的同源物；果蝇Pabp2蛋白也含有一个类似于RNP类型的RNA结合域。果蝇Pabp2高度保守，含3个结构域，第一个为类似螺旋卷曲结构域，其同源性最高，[97]可能参与PABP2的低聚反应及同/异型蛋白间的互作；第二为RNP型的RRM结构域，与牛科动物同源性很高；第三个为精氨酸富含结构域，是果蝇和哺乳动物最为保[96]守的区域，参与RNA结合。在不同发育时期Pabp2通过使用不同的可变poly(A)[95]位点形成多种RNA形式，同时该基因也可通过自身来进行调节。pabp2基因存在于果蝇各组织及各发育时期，它能参与大多数mRNA的多聚腺苷酸化，同时对果蝇[96]的发育也起重要的作用。Pabp2对于Pre-mRNA的加工起重要作用，对果蝇的发育也起一定作用。本实验发现蜜蜂中也存在pabp2的同源基因，并对此进行了克隆及进行原核表达，发现该基因含有一个RRM结构域，为蛋白间的互作提供一定的理论基础，同时为与csd基因互作的研究提供前期准备。3.2材料与方法3.2.1实验材料3.2.1.1实验样品江西农大蜜蜂所饲养的意蜂，2~4日龄幼虫提取RNA。3.2.1.2感受态细胞和载体Trans1-T1PhageResistant、TransBL21(DE3)、pEASY-T1、PET15b。3.2.1.3实验仪器压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子天平、研钵、雪花制冰机、电泳仪和电泳槽、电泳仪电源、PCR仪、恒温摇床、恒温培养箱、PH计、玻璃皿、锥形瓶、生化培养箱、超低温冰箱、紫外分析仪、紫外成像系统、恒温恒水槽、恒温干燥箱、迷你双垂直电泳槽、恒温培养振荡器、离心机、快速混匀器、微波炉，水浴锅等。3.2.1.4实验试剂氯仿、苯酚、异丙醇、无水酒精、葡萄糖、琼脂糖、冰乙酸、甘油、琼脂粉、Trizol、DEPC、Tris、Tryptone、Nacl、Kcl、Mgcl2、YeastExtract、dNTPMixture(2.5mM)、2+Oligo(dT)(5.97nmole/OD)、10×LATaqbuffer(含Mg)、taq酶、NdeI(10U)、24 BamHI(10U)、10×FDbuffer、T4DNALigase(200μ/μL)、10×T4DNALigaseBuffer(250mM)、6×DNAloadingbuffer、2000bpDNAladder、MMLV(200μ/μL)、1kbDNAladder、BluePlusProteinMarker(14.4~116kDa)、TEME、IPTG、甲醇、Acrylamid、EDTANa2、Gelstain、Tryptone、YeastExtrat、Nacl、Agarpowder、Bis-acrylamide、Ammoniumpersulfat、SDS、浓盐酸、Tris、甘氨酸、考马斯亮蓝R250、2-羟基乙醇、溴酚蓝、高纯度质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等。3.2.1.5试剂配制DEPC水：DEPC与ddH2O按1:1000配置，摇床1.5d摇匀，灭菌。75%酒精：无水酒精与ddH2O按3:1配置，混合均匀。50×电泳缓冲液（TAE）：24.2gTris、3.72gNa2EDTA、5.71mL冰乙酸溶于100mLddH2O。1%琼脂糖电泳胶：2g琼脂糖、200mL1×TAE，加热溶解，加入20μLGelstain染料，混匀。1×TAE(电泳缓冲液)：24.2gTris、3.72gEDTANa2、5.71mL冰乙酸、ddH2O定容5000mL。LB液体培养基：2.5gTryptone、1.25gYeastExtrate、2.5gNacl、ddH2O定容250mL，高压灭菌30min。LB固体培养基：2.5gTryptone、1.25gYeastExtrate、2.5gNacl、3.75gAgarpowder、ddH2O定容250mL，高压灭菌30min。30%丙烯酰胺：29.2gAcrylamide、0.8gBis-acrylamide溶于100mLddH2O。10%过硫酸铵(APS)：0.1gAmmoniumpersulfate溶于1mLddH2O（现配现用）。10%SDS：10gSDS溶于100mLddH2O。Tris-HCl(1.5M,PH8.8)：18.15gTris溶于80mLddH2O，浓盐酸调PH到8.8，ddH2O定容100mL。Tris-HCl(1.0M,PH6.8)：12.11gTris溶于80mLddH2O，浓盐酸调PH到6.8，ddH2O定容到100mL。5×SDS电泳缓冲液：15.1gTris、94g甘氨酸、5gSDS、1000mLddH2O溶解。2×上样缓冲液：2mL50%甘油、0.5mL2-羟基乙醇、1mL1%溴酚蓝、2mL10%SDS、1mLTris-HCl(0.5M,PH6.8)、ddH2O定容10mL。染色液：1g考马斯亮蓝R250、100mL冰醋酸、250mL异丙醇、ddH2O定容1000mL，滤纸过滤。脱色液：80mL乙酸、250mL甲醇、ddH2O定容1000mL。3.2.2实验方法3.2.2.1总RNA的提取意蜂的2~4d幼虫提取RNA，步骤及质量检测同第二章2.2.2.1.1。25 3.2.2.2反转录(1)小EP管中移取8μLRNA，离心，PCR仪上反应(70°C,5min)，反应结束后立即冰浴5min。(2)按以下反应体系加入个样品（注：buffer,oligo(dT),dNTP提前解冻）RI（RNA酶抑制剂）1μLdNTP8μL5×RTbuffer10μLDEPC水18.5μLoligo(dT)3μLMMLV1.5μL注：RNA酶抑制剂(RI)第一个加，用枪头单个混匀，保证RNA免受降解。MMLV反转录酶易失活，应最后一个加入试管底部混匀。(3)震荡混匀，快速离心，PCR仪上反应（42°C,1h;75°C,5min）。(4)反应结束后，50μLDEPC水稀释，混匀保存在-20°C冰箱备用。3.2.2.3PCR扩增cDNA4μL10×LATaqbuffer2.5μLdNTP2μL正向引物1μL反向引物1μLddH2O14.2μLLA酶0.3μLTotal25μL反应程序：94°C预变性3min；94°C变性30sec，56°C退火45sec，72°C延伸90sec，循环35次；72°C再次延伸10min；4°C保存。PCR产物进行1%凝胶电泳，切胶回收。引物pabp2-F:AGTTTGTAGAATTGTGAAGTGTTGApabp2-R:AATTCCAATACAATATATTAAAACGGpabp2-exp-F:AGCCATATGTCTGAATCGGATCTTTTAGCTpabp2-exp-R:CCGGATCCTAATACGGCATATAATATCCTpabp2-F/pabp2-R为pabp2基因克隆所用的引物，pabp2-exp-F/pabp2-exp-R为原核表达克隆所用的引物，其中划线部分为酶切位点。3.2.2.4PCR产物回收胶回收步骤按康为琼脂糖凝胶回收试剂盒步骤进行。3.2.2.5连接、转化连接：取4μL目的片段与1μLpEASY-T1载体混合均匀，25°C连接20min。连接产物进行转化。26 转化(1)5μL连接产物与50μLTrans1-T1感受态细胞轻轻混匀后，冰浴30min。(2)42°C水浴40s(热应激)，立即冰浴2min。(3)加入500μLLB液体培养基，恒温摇床震荡(37°C,200rpm,60min)。(4)LB平板：LB固体培养基(含100mg/mLkan)倒入培养皿中，10-15min凝固，加入40μLx-gal、8μLIPTG的混合液，涂匀，置于37°C培养箱中充分吸收。(5)200mL菌液均匀涂板，37°C倒置培养12h。3.2.2.6阳性质粒的提取挑取白斑进行扩大培养，恒温摇床震荡(220rpm,37°C,12h)；菌液提取质粒，提取步骤参照康为质粒提取试剂盒。通过1%凝胶进行电泳，滞后的质粒送全式金公司测序验证。3.2.2.7重组质粒的构建3.2.2.7.1双酶切PET15b3μLPCR产物10μL10×FDbuffer2.5μL10×FDbuffer2.5μLNdeI1μLNdeI1μLBamHI1μLBamHI1μLddH2O12.5μLddH2O5.5μLTotal20μLTotal20μL37°C酶切3-7h，时间延长可使酶切完全。酶切产物进行1%琼脂糖电泳，回收目的条带。3.2.2.7.2连接PET15b1μL目的片段3μL5×T4DNAligasebuffer2μLT4DNAligase1μLddH2O3μL16°C连接10h，连接产物即为重组质粒pabp2-PET15b。3.2.2.7.3重组质粒转化、阳性质粒的提取步骤同3.2.2.5和3.2.2.6。3.2.2.7.4重组质粒PCR、双酶切验证PCR验证步骤如3.2.2.3，双酶切验证步骤同3.2.2.7.1。验证为正确的重组质粒相对应的菌液送全式金公司测序。3.2.2.8pabp2基因的原核表达3.2.2.8.1pabp2-PET15b的转化(1)5μLpabp2-PET15b重组质粒与100μLBL21(DE3)混合均匀，冰浴20min。(2)42°C水浴100s(热激)，立即冰浴5min。(3)500μLLB液体培养基，震荡(37°C,200rpm,60min)。(4)200μL菌液均匀涂板，37°C倒置培养12h。27 3.2.2.8.2PABP2蛋白诱导表达(1)阳性质粒接种于5mL的LB培养液(含50mg/mLkan)，震荡培养12h(37°C,220rpm)。(2)按1:50接种于5mLLB培养液中，震荡培养2h(37°C,220rpm)，至OD600为0.4~0.8。(3)加入IPTG至终浓度为1mM，诱导蛋白表达(35°C,220rpm,4h)。对照样品：取BL21(DE3)感受态细胞震荡培养，至OD600为0.4~0.8。3.2.2.8.3SDS-PAGE电泳制备样品①1mL菌液离心，弃上清。②200μL预冷PBS洗涤菌体。③100μLddH2O悬浮菌体，加入100μL2×上样缓冲液，混合均匀。④100°C沸水中煮10min，是蛋白充分变性。⑤样品恢复室温后离心。SDS-PAGE电泳(1)制备15%的分离胶1.1mLddH2O、2.5mL30﹪丙烯酸胺、1.3mLTris-Hcl(1.5M,pH8.8)、50μL10%APS、50μL10%SDS、4μLTEMED，混合均匀，移入到电泳板中(约4mL)，立即用ddH2O封胶（使胶体压至同一水平面），静置1h左右（胶充分凝固），倒出ddH2O，滤纸吸干残留的ddH2O。(2)制备3%的浓缩胶1.7mLddH2O、420μL30%丙烯酰胺、310μLTris-Hcl(1M,PH6.8)、25μL10%APS、25μL10%SDS、3μLTEMED，混合均匀，转移到电泳板中(约1mL)，使胶体至短板边缘，立即插入合适的梳子，静置1h（胶体凝固），拔出梳子，用ddH2O清洗胶孔（彻底清除孔内的气泡）。(3)取10μL蛋白样品和10μL对照样，5μL的低分子量蛋白mark进行电泳。内外槽中分别加入1×电泳缓冲液，里槽缓冲液没过胶，外槽可低于内槽2-5cm。接通电源，先用20mA电流、80V电压稳定电流，待样品刚跑过浓缩胶时(约20min)，改变电流为40mA，电压为120V，直到样品跑到胶体接近底部边缘结束电泳（约2h）3.3实验结果3.3.1RNA质量检测幼虫RNA经过两种方式进行质量检验：核酸蛋白测定仪测得浓度为1267ng/μL，A260/A280比值为2.021，初步断定RNA质量较好；经1%的琼脂糖电泳进一步检验28 RNA质量，结果如图3-1，RNA有三条带，从上自下依次是28S、18S、5S，其条带亮度依次减弱，且28S的亮度约18S的两倍，证明提取的RNA结构性完整，质量较好，可用于进行实验。图3-1意蜂幼虫总RNA电泳图M：DNA标样（12000bp）1：总RNAFig.3-1ElectrophoregramoftotalRNAofApislarvaM:DNAmark(12000bp)1:totalRNA3.3.2蜜蜂pabp2基因PCR扩增根据西方蜜蜂基因组序列设计用于扩增pabp2基因编码区的引物，对蜜蜂幼虫cDNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3-2，从该图中可看出在750-1000bp处约为800bp左右有一明显的条带，大小与根据基因组序列预测的pabp2基因编码区接近，可见此条带为目的条带。图3-2蜜蜂pabp2基因PCR扩增图M：2000bpmark1：扩增产物Fig.3-2ThePCRamplificationfigureofpabp2geneofApisM:2000bpmark1:theAmplificationproducts3.3.3重组质粒(pabp2/pEASYT1)滞后检验将回收的PCR产物与pEASYT1载体进行连接、转化、挑取阳性克隆子扩大培养并提取重组质粒(pabp2/pEASYT1)，将该质粒进行电泳，与未插入目的片段的蓝斑29 进行对比，结果如图3-3，重组质粒相比于空载体质粒有明显的滞后，可见该目的片段已插入目的片段。图3-3重组质粒(pabp2/pEASYT1)滞后检验1：空载体pEASYT1质粒2-3：pabp2/pEASYT1质粒Fig.3-3Thelagtestofrecombinantplasmid1:carrierplasmidpEASYT12-3:recombinantplasmidpabp2/pEASYT13.3.4蜜蜂pabp2的序列分析初步鉴定滞后重组质粒送全式金公司测序，序列及其推导的氨基酸序列如图3-4。蜜蜂pabp2基因全长为813bp，包含一个687bp的ORF，编码的蛋白为228aa，其分子量为25.73kDa，等电点为5.70；该基因含8个外显子和7个内含子，两者边界均符合GT-AG法则。对PABP2蛋白结构进行分析，结果表明其氨基端含一个类似螺旋卷曲结构域(coiled-coillike)(44~78bp)及一个RRM结构域(101~173bp)，羧基端含两个lowcompleity(低复杂性)区域，分别是富含精氨酸/甘氨酸(190~205bp)、富含精氨酸(211~222bp)的区域；将蜜蜂PABP2与其他昆虫的同源蛋白序列进行相似性比对结果表明同源性较高，可见pabp2基因较为保守。比对结果为：与膜翅目蚂蚁、双翅目按蚊、果蝇、伊蚊、鳞翅目家蚕分别为98%、80%、78%、74%、78%。30 图3-4蜜蜂pabp2基因序列图箭头代表PCR引物序列，方框代表推测的氨基酸的卷曲结构，灰色阴影区域代表RRM结构域，下划线代表富含精氨酸/甘氨酸区域，波浪线代表富含精氨酸区域，*代表终止密码子。Fig.3-4Thesequencediagranofpabp2ofApismelliferaArrowsshowthePCRprimers,boxedindicatethecoiledcoilstructureofdeducedaminoacidsequence,GreyshadedareashowtheRRMdomain,underlineshowthearginine/glycinerichregion,breaklineshowthearginine-richregion，asteriskshowthestopcodon..图3-5蜜蜂pabp2基因及其蛋白结构图Fig.3-5Thestructureofpabp2geneanditsprotein31 图3-6蜜蜂pabp2基因与其它昆虫中同源基因的氨基酸序列比对图黑色表示一致的序列，灰色表示相似的序列，横线表示RRM结构域Fig.3-6TheaminoacidsequencealignmentbeweenApisPabp2andhomologousproteinsofotherinsectsBlackblockshowthesamesequence,grayblockshowthesimilarsequence,horizontallineshowthestructureofRRM3.3.5重组质粒pabp2-PET15b的鉴定重组质粒pabp2-PET15b经电泳初步检验后进行PCR及双酶切再次鉴定，PCR鉴定结果表明在750-1000bp处有一条亮的条带，由蜜蜂pabp2基因为828bp，可见该条带为目的基因；双酶切结果有两条带，一条约850bp，目的条带；另一条约5400bp，为载体质粒，结果表明重组质粒构建无误。正确的重组质粒送全式金公司正反向测序，序列分析表明无突变，序列比对到ncbi同源性为100%，证明重组质粒pabp2-PET15b构建成功。图3-7重组质粒PCR鉴定图3-8重组质粒双酶切鉴定M：DNA标样1-2：PCR产物M：DNA标样1-2：pabp2-PET16b酶切产物Fig.3-7PCRtestofrecombinantplasmidFig.3-8ThedoubledigestionofrecombinantplasmidM:2000bpDNAmark1-2:PCRproductM:2000bpDNAmark1-2:enzyme-digestedproduct32 3.3.6PABP2蛋白诱导表达重组质粒pabp2-PET15b转化到BL21(DE3)中，用IPTG进行蛋白诱导，以BL21(DE3)菌液蛋白作为对照样与诱导菌共同进行SDS-PAGE电泳，结果如图3-9，发现在29.0kDa处有一条明显很亮的条带，由我们克隆的蜜蜂pabp2基因序列可推预测出该蛋白分子量为25.73kDa，PET15b载体目的片段约4kDa，目的蛋白大概为29kDa，即如图红箭头所标。图3-9蜜蜂pabp2-PET15b的诱导表达1：pabp2-PET15b诱导2：BL21（DE3）M：蛋白标样（14kDa-100kDa）（红色箭头指示为目的蛋白）Fig.3-9Thediagramofinducedexpressionofpabp2-PET15b1:theinducedofpabp2-PET15b2:BL21（DE3）M:14kDa-100kDaproteinsample（redarrowforthepurposeofprotein）3.4讨论PABP2是一个重要的聚腺化因子，它参与poly(A)尾巴长度的调节，当poly(A)[98]尾巴达到250aa时，其延伸率变得缓慢或停止；且PABP2与poly(A)尾巴代谢有关。目前在牛科动物、人类、老鼠中都分离了pabp2，牛科动物PABP2蛋白为306aa，分子量为33kDa，在其氨基与羧基端间含有一个RNP类型的RNA结合区域，这三种物[95,99,100]种中PABP2高度保守。本实验克隆了蜜蜂pabp2基因，包含一个687bp的ORF，预测蛋白包含228个氨基酸残基，与蚂蚁大小一致，同时与果蝇、家蚕等的氨基酸残基数相差不大；通过氨基酸同源性比较分析表明该基因较保守，与其他昆虫的同源性较高，与蚂蚁、按蚊、果蝇、埃及伊蚊、家蚕一致性为98%、80%、78%、74%、78%，蜜蜂pabp2基因为果蝇pabp2的同源基因，表明蜜蜂pabp2为保守基因，与先前的研[94,95,96,99]究一致。蜜蜂pabp2基因含8个外显子及7个内含子。其蛋白结构特点与果蝇的一致，在氨基端(44~78bp)含一个35nt的类似卷曲螺旋结构域，为最保守的一个区域，可能参与PABP2蛋白的低聚或齐聚反应，也可能参与PAP的调停或者与PAP[97,101,102]蛋白互作，也可能参与同型或异型蛋白间的互作；在氨基、羧基端间33 (101~173bp)含有一个RRM结构域，该区域包括73个氨基酸残基，是大多数物种PABP2蛋白的最普遍的特征，具有RNA结合作用，为其他蛋白的互作提供结合位点；羧基端含两个lowcompleity(低复杂性)区域，分别是富含精氨酸/甘氨酸(190~205bp)、富含精氨酸(211~222bp)结构域，在果蝇中这段区域与哺乳类的保守性最高，在蜜蜂中这段区域与伊蚊、按蚊和背蚁的序列完全一致，再一次证明该区域保守性很高，该[96]区域具有RNA结合作用，为RRM结构域提供更多基础。果蝇pabp2基因广泛存在于各组织中，能参与大多数mRNA的多聚腺苷酸化；果蝇Pabp2为胚胎的母性基因，在该基因活性开始于受精卵形成之前；果蝇pabp2基[96]因大量存在于果蝇发育的各个时期，对果蝇的发育起重要的作用，对于蜜蜂pabp2基因这些相关类似功能还需进一步实验。蜜蜂的CSD蛋白属于SR蛋白，但缺乏RRM结构域，该蛋白需要与其他蛋白共同作用才能完成一系列的性别决定过程。PABP2蛋白含典型的RRM结构域及类似螺旋卷曲结构、富含精氨酸结构域，为csd基因提供RNA结合位点，可见pabp2基因极有可能与csd基因相互作用，利于其对蜜蜂性别的决定，但具体的作用机制还需要进一步实验验证。34 第四章蜜蜂rbp1基因和rbp7基因的克隆及原核表达4.1引言[103,104]对于rbp基因在遗传中起关键作用的研究最早是在果蝇中开展的。1992年[105]前RBP被认为是重组酶，主要是研究rbp生化作用及遗传特性。先后有研究发现[106,107,108]RBP能抑制基因表达。Brou研究发现RBP通过与病毒性细胞蛋白互作调控[109]基因表达。哺乳动物RBP含有一个RRM结构域，通过隔离病毒感染来抑制成熟[110]细胞的基因表达。近年来Eastman发现RBP能参与果蝇Notch信号转录通信，给[111]基因表达与果蝇发育间提供桥梁作用。Olave研究了RBP的抑制转录作用机制，发现RBP与两个转录辅助因子(dTAFII110,TFIID)相互作用，dTAFII110与RBP有相同的结构域，该结构域参与dTAFII110与TFIIA互作，RBP与TFIIA的互作会阻碍[112]与dTAFII110的互作。1992年Kim克隆了果蝇rbp1基因(Dmrbp1)，RBP1蛋白含一个RRM、一个SR结构域、一个富含甘氨酸结构域，该蛋白在果蝇的所有阶段及所有组织中均有表达，[113]rbp1能激活基因剪切也能进行剪切位点的选择。1995年VolkerHeinrichs发现Dmrbp1含两个目标基序(重复区域、富含嘌呤及多腺嘧啶的雌特异3"剪切位点区域)，[114]Dmrbp1对dsxpre-mRNA有效剪切的调控主要靠这两个基序实现。1997年Heinrichs再一次验证Dmrbp1是通过识别dsxpre-mRNA上的目标序列来参与dsxpre-mRNA可变剪切的调控；同时发现其SR结构域及富含甘氨酸结构域能参与蛋白间的互作，Dmrbp1是通过与TRA和TRA-2共同作用来参与性别决定因子dsx的可[115][116]变剪切。2003年Bayer发现Dmrbp1对于果蝇的正常的变态发育具有重要作用。2010年王子龙等人克隆出家蚕的rbp1基因(Bmrbp1)，为Dmrbp1的同源基因，Bmrbp1具有4种不同剪切形式，其中有两种形式含有RRM域和RS域，另两种只含有RRM[117]结构域，不同剪切形式在不同的组织中表达也有差异。本实验通过蜜蜂基因组序列预测其rbp序列，设计引物，对该基因进行克隆及原核表达。本实验已分离出了rbp1基因的三种剪切形式，rbp7基因相对rbp1基因具有更多的剪切形式，但本实验扩出形式。这些实验结果为研究蜜蜂rbp基因的作用机制迈出了第一步，为蜜蜂性别决定机制研究提供部分理论基础。4.2材料和方法4.2.1实验材料4.2.1.1实验样品使用第三章所用的cDNA。4.2.1.2感受态细胞与载体Trans1-T1PhageResistant、TransBL21(DE3)、Rosetta、pEASY-T1、PET15b。35 4.2.1.3实验仪器同第三章3.2.1.3。4.2.1.4实验试剂与配置同第三章3.2.1.4和3.2.1.5。4.2.2实验方法4.2.2.1引物的设计从NBI中下载果蝇rbp基因(Dmrbp)的氨基酸序列，与蜜蜂的蛋白数据库进行Blast比对，得到相应的同源体蛋白及相应的核苷酸序列。将核苷酸序列与NCBI中的蜜蜂转录组数据库进行Blast比对找到该基因所对应的的转录组序列，根据找到的转录组序列利用primerpremier5.0进行引物设计。将果蝇rbp基因与蜜蜂基因组序列进行同源性比对分析发现Dmrbp1在蜜蜂中存在两个同源体，分别为Amrbp1和Amrbp7基因，通过转录组序列分析发现这两个基因存在多种剪切形式。设计的引物送上海生工生物技术有限公司合成。Amrbp1Amrbp1-F1:5"-ATTTGATGCCAACTTTTTAGCT-3"Amrbp1-F2:5"-TTATATACAACAATGTTGCAAATG-3"Amrbp1-F3:5"-TTGTGGATGTTAATTTCTAATCAG-3"Amrbp1-R:5"-CATTGTGTATATATTTCTTTCGCA-3"Amrbp1-exp-F:AGCCATATGTCACGTTATCGTGAATGGGATAmrbp1-exp-R:CCGGATCCTAACGTCTGTCACGGGAATCCAmrbp7Amrbp7-F1:5"-GGCCACGGAAGAAGATTAACGC-3"Amrbp7-F2:5"-CGTTATATACAACAATGTTGCAAATG-3"Amrbp7-F3:5"-ACGCTACATACGCCACCATTTT-3"Amrbp7-F4:5"-TGAGAGATCAACATGGTGACGC-3"Amrbp7-R1:5"-TGGCCTAAGTCGACATATTTTACCG-3"Amrbp7-R2:5"-TTTTACTATAATCATTATTTCGACCGA-3"Amrbp7-exp-F:AGCCATATGAGCATTTCTACTTGTGCAGTTAmrbp7-exp-R:CCGGATCCTAACGTCTGTCACGGGAATCCAmrbp1-exp-F/Amrbp1-exp-R和Amrbp7-exp-F/Amrbp7-exp-R用于原核表达克隆所用的引物，划线部分表示酶切位点。4.2.2.2PCR扩增按照25μL的体系进行：依次加入4μLcDNA、2μLdNTP、1μL上游引物、1μL下游引物、2.5μL10×LATaqbuffer、14.2μLddH2O、0.3μLLATaqDNAPolymerase。混合均匀后快速离心，放于PCR中反应。36 PCR程序为：94°C预变性3min；94°C变性30sec，50°C/57°C退火45sec，72°C延伸1min，循环30次；72°C再次延伸10min；4°C保存1h。Amrbp1基因分别用Amrbp1-F1/Amrbp1-R、Amrbp1-F2/Amrbp1-R、Amrbp1-F3/Amrbp1-R三对引物进行PCR扩增，扩增的退火温度为50°C。为了更容易扩增出Amrbp7基因的多种剪切形式，本实验利用巢式PCR对Amrbp7基因进行扩增，第一轮PCR运用幼虫cDNA作为模板，分别使用Amrbp7-F1/Amrbp7-R1、Amrbp7-F2/Amrbp7-R1两对引物进行第一轮扩增，之后运用第一轮扩增产物（4μL）作为模板，分别使用Amrbp7-F3/Amrbp7-R2、Amrbp7-F4/Amrbp7-R2进行第二轮扩增，两轮PCR的退火温度都为57°C。（注：第二轮扩增所用的模板必须与对应的引物一致）4.2.2.3PCR产物回收及连接转化步骤同第三章3.2.2.4和3.2.2.5。4.2.2.4阳性质粒提取同第三章3.2.2.6。4.2.2.5构建重组质粒同第三章3.2.2.7。4.2.2.6RBP蛋白诱导同第三章3.2.2.8。4.3结果与分析4.3.1PCR产物Amrbp1、Amrbp7存在多种剪切形式，通过不同的形式进行引物设计。Amrbp1设计三对引物，Amrbp7设计两轮各两对引物(巢式PCR)，以幼虫cDNA为模板，进行PCR扩增。图4-1中标示的1、2、3泳道分别为以Amrbp1-F1/Amrbp1-R、Amrbp1-F2/Amrbp1-R、Amrbp1-F3/Amrbp1-R为引物的扩增结果，三条带均为800bp左右，与预测的结果一致；如图4-2标示的1、2泳道为槽式电泳的最终结果，分别为Amrbp7-F1/Amrbp7-R1→Amrbp7-F3/Amrbp7-R2和Amrbp7-F2/Amrbp7-R1→Amrbp7-F4/Amrbp7-R2扩增的结果，各得到一条700bp左右的条带，与预测的大小一致。37 图4-1Amrbp1基因扩增图4-2Amrbp7基因扩增M：2000bpmark1-3：扩增产物M：2000bpmark1-2：扩增产物Fig.4-1TheamplificationofAmrbp1geneFig.4-2TheamplificationofAmrbp7geneM:2000bpmark1-3:theAmplificationproductsM:2000bpmark1-4:theAmplificationproducts4.3.2序列分析本实验克隆出Amrbp1三种形式，命名为Amrbp1-R1、Amrbp1-R2、Amrbp1-R3，大小分别为696bp、790bp、771bp；序列分析结果显示：Amrbp1-R1包含一个393bp的ORF，其蛋白含130个氨基酸残基，分子量为14.97kDa，等电点(pl)为11.60；含5个外显子，4个内含子。Amrbp1-R2包含一个501bp的ORF，预测的蛋白含166个氨基酸残基，分子量为19.29kDa，等电点为(pl)为11.85；含7个外显子，6个内含子。Amrbp1-R3含有一个489bpORF，其蛋白含162个氨基酸残基，分子量为18.83kDa，等电点(pl)为11.85；含7个外显子，6个内含子。对这三种形式的蛋白结构进行分析发现它们具有共同的结构域，氨基酸含有一个RRM结构域，羧基端含有一个RS结构域。将这三种形式的蛋白序列与其他昆虫的同源蛋白进行BLAST比对，发现Amrbp1-R1、与其他物种同源蛋白的相似性最高。结果为Amrbp1-R1与寄生蜂(Nasoniavitripennis)、红火蚁(Solenopsisinvicta)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、家蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、果蝇(Drosophilavirilis)、中华按蚊(Anophelessinensis)的同源性分别是96%、93%、80%、78%、78%、73%、68%。本实验克隆出Amrbp7的两种剪切形式，命名为Amrbp7-P1、Amrbp7-P2，大小分别为646bp、651bp。序列分析结果表明：Amrbp7-P1包含一个486bpORF，预测的蛋白含161个氨基酸，分子量为18.65kDa，等电点(pl)为10.99；含5个外显子，4个内含子。Amrbp7-P2包含一个501bpORF，预测的蛋白含166个氨基酸，分子量为19.29kDa，等电点(pl)为11.90；含6个外显子，5个内含子。对这两种形式的蛋白结构进行分析发现它们氨基酸都含有一个RRM结构域，羧基端都含有一个RS结构域。将这两种形式的蛋白序列与其他昆虫的同源蛋白进行BLAST比对，结果表明Amrbp7-P2与其他物种同源蛋白的相似性最高。Amrbp7-P1分别与寄生蜂(Nasoniavitripennis)、红火蚁(Solenopsisinvicta)、家蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、果蝇(Drosophilavirilis)、中华按蚊(Anophelessinensis)的同一性为89%、81%、71%、67%、67%、62%、54%。38 图4-3蜜蜂rbp1基因序列图箭头代表PCR引物序列，灰色阴影区域代表RRM结构域，波浪线代表富含RS区域，*代表终止密码子。Fig.4-3Thesequencediagransofrbp1ofApismelliferaArrowsshowthePCRprimers,GreyshadedareashowtheRRMdomainstructure,breaklineshowtheRSregion,asteriskshowthestopcodon.39 图4-4蜜蜂rbp7基因序列图箭头代表PCR引物序列，灰色阴影区域代表RRM结构域，波浪线代表富含RS区域，*代表终止密码子。Fig.4-4Thesequencediagransofrbp7ofApismelliferaArrowsshowthePCRprimers,GreyshadedareashowtheRRMdomainstructure,breaklineshowtheRSregion,asteriskshowthestopcodon.40 图4-5蜜蜂rbp1基因及蛋白结构图Fig.4-5ThestructureofAmrbp1geneandprotein图4-6蜜蜂rbp7基因及蛋白结构图Fig.4-6ThestructureofAmrbp7geneandprotein图4-7Amrbp1-R1蛋白序列同源性比较图黑色表示一致的序列，灰色表示相似的序列，横线表示RRM结构域.Fig.4-7TheaminoacidsequencealignmentbeweenApisrbp1geneandhomologousgenesofotherinsectsBlackblockshowthesamesequence,grayblockshowthesimilarsequence,horizontallineshowthestructureofRRM.41 图4-8Amrbp7-P2蛋白序列同源性比较图黑色表示一致的序列，灰色表示相似的序列，横线表示RRM结构域.Fig.4-8TheaminoacidsequencealignmentbeweenApisrbp7geneandhomologousgenesofotherinsectsBlackblockshowthesamesequence,grayblockshowthesimilarsequence,horizontallineshowthestructureofRRM.4.3.3蜜蜂RBP蛋白表达将重组质粒Amrbp/pEASYT1及载体PET15b分别用NdeI、BamHI酶进行酶切，回收目的条带，用T4连接酶将Amrbp/pEASYT1、PET15b酶切条带进行连接、转化，提取重组质粒Amrbp-PET15b。将该重组质粒进行PCR验证，结果扩增出目的条带；再一次用NdeI、BamHI酶进行双酶切验证，结果切出两条目的条带，一条约5700bp，另一条约700bp；将两次验证正确的重组质粒进行测序，结果表明该重组质粒序列正确，且无突变，表明构建的重组质粒正确。将重组质粒Amrbp-PET15b利用IPTG进行诱导，经SDS-PAGE电泳检测其蛋白表达（图4-9，Amrbp1利用BL21(DE3)感受态细胞，诱导出含量较高的蛋白，如箭头标志，其蛋白大小约为24kDa，与理论大小一致，表明诱导正确。而Amrbp7无论是运用BL21(DE3)还是Rosetta感受态细胞都没诱导明显表达的蛋白。42 图4-9Amrbp1和Amrbp7蛋白诱导表达红色箭头为Amrbp1目的蛋白Fig.4-9TheinducedexpressionoftheproteinofAmrbp1andAmrbp7RedarrowforthepurposeofAmrbp1protein4.4讨论Amrbp1和Amrbp7都为果蝇Dmrbp1的同源基因，且含有相同的蛋白结构域，RRM和RS域，他们的功能也具有相似性。先前研究表明Dmrbp1广泛存在于果蝇的各组织中，且在不同的阶段都有大量表达，Dmrbp1既能激活其他基因的剪切功能，同时也能选择剪切位点，Dmrbp1通过与DmTRA及DmTRA2共同参与果蝇dsxpre-mRNA的有效剪切，Dmrbp1的SR结构域与富含甘氨酸区域能参与蛋白间的互作[113,114,115]，由此我们提出Amrbp1、Amrbp7具有类似的功能，它们可能通过与csd基因相互作用来参与蜜蜂的性别决定，也有可能与其他基因共同作用来参与csd基因的pre-mRNA剪切，具体作用机制还需要进一步实验。Bayer发现Dmrbp1对于果蝇正常变态发育具有重要作用，Amrbp1、Amrbp7是否在蜜蜂的变态发育起作也需更多实[116]验验证。家蚕rbp1基因的不同剪切形式在不同的组织及不同阶段中表达量不同，那么Amrbp1、Amrbp7不同剪切形式是否也有类似功能差异，还需要进一步进行定[117]量实验分析。果蝇Dmrbp1与哺乳动物的rbp1基因同源，先前的研究表明哺乳动物rbp具有抑制相关基因表达、参与基因间互作及传递基因表达与发育的Notch信号等功能，Amrbp1、Amrbp7作为Dmrbp1的同源物，可能也存在这些功能，但具体作用机制还需进一步实验验证。43 第五章结论与展望5.1主要结论（1）用酵母双杂交技术初步筛选出两个与csd基因互作的基因(pabp2,fusilli)，这两个基因编码的蛋白结构中都含有RRM结构域（RNA结合区域）。（2）完成蜜蜂pabp2基因的克隆及其原核表达，该基因具有8个外显子，7个内含子；蜜蜂pabp2包含一个687bp的ORF，蛋白为228aa，该蛋白分别含有一个类似螺旋卷曲、RRM、富含精氨酸/甘氨酸、富含精氨酸结构域；与果蝇同源性很高，为78%。同时通过原核表达诱导出约为25.73kDa的PABP2蛋白。（3）完成蜜蜂rbp1和rbp7基因的克隆及原核表达。Amrbp1含三种剪切形式，其ORF分别为393nt、501nt、489nt，蛋白分别为130aa、166aa、161aa。Amrbp7目前只克隆出两种剪切形式，其ORF分别为486nt、501nt，蛋白为161aa、166aa。这两种基因不同形式的蛋白结构都含有RRM及RS结构域。与果蝇的同源性都较高，分别为78%和67%。通过原核表达诱导出Amrbp1蛋白，大小约为15kDa。（4）蜜蜂csd基因作为SR家族蛋白，参与蛋白与蛋白间的互作。本实验表明蜜蜂pabp2、fisilli、rbp1、rbp7基因均含有RRM结构域，均有可能参与csd基因间的互作。5.2研究展望（1）本实验通过酵母双杂交技术初步筛选出两个含有RRM结构域的蛋白与csd基因互作，还需通过进一步的细胞内实验验证它们与csd蛋白的互作。（2）本实验只完成pabp2基因和rbp基因的克隆，关于其功能研究以及在蜜蜂各组织和各时期的表达量还需要做进一步研究。（3）除了pabp2及rbp基因外，可能还存在其它基因（比如tra2）能够与csd基因互作，对这些基因与csd基因的互作还需要进一步研究。（4）csd和fem都为蜜蜂重要的性别决定机制，这两个基因是如何通过与其它基因的相互作用或者是多种基因参与作用还需要深入研究。对这些相关基因的研究将为蜜蜂性别决定机制提供更多的理论基础，同时也为SR家族蛋白的互作提供更多例证。44 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硕士期间参与发表和投稿的论文[1]李淑云,王子龙,颜伟玉.蜜蜂性别决定相关基因的研究进展[J].蜜蜂杂志,2015,02:6-10.[2]甘海燕,李淑云,曾志将,颜伟玉.中华蜜蜂二倍体雄蜂人工培育及形态测定[J].中国农业科学,2014,22:4533-4539.（与甘海燕为同等贡献作者，即同为一作）[3]GanHai-yan,LiShu-yun,WangZi-Long,WuXiao-Bo,ZengZhi-Jiang,YanWei-Yu*.MorphologyandtranscriptomedifferencesbetweenthehaploidanddiploiddronesofApisceranacerana.PLOSONE杂志在投[4]吴小波,王子龙,李淑云,颜伟玉,曾志将。中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质组比较分析，江西农业大学学报[5]吴小波,李淑云,颜伟玉,曾志将。意大利蜜蜂性成熟雄蜂与刚出房雄蜂的差异蛋白质组分析,江西农业大学学报[6]吴小波,王子龙,李淑云,甘海燕,刘浩,颜伟玉,曾志将。羽化和性成熟时中华蜜蜂蜂王和雄蜂转录组分析。昆虫学报，2014,57(8):905-913[7]张飞,甘海燕,李淑云,曾志将,吴小波*.蜜蜂仿生免移虫育王技术的初步研究,黑龙江畜牧兽医,2013,10:144-14652 致谢时光如梭，岁月荏苒，转眼三年的研究生生活即将过去。感谢江西农业大学给我们营造了一个美丽的生活环境、优良的学习氛围，让我们在这尽情地挥洒青春的汗水，抒写记忆的诗篇。在即将毕业之际，曾经的欢声笑语、辛勤奋斗的身影都历历在目。首先我要衷心的感谢那可亲可敬的曾志将教授，是他给我们创造了一个美好的科研平台—蜜蜂研究所。自入研究所三年以来，无论是生活上还是学习上都给予我无微不至的关怀和帮助，从论文课题的选取到实验过程遇到的问题他都给予细心的帮助。他认真严谨的科研态度、执着的科研精神、勤奋的工作态度以及良好的生活习惯都潜移默化的影响着我。他那平易近人、乐观积极的性格给了我们自信和勇气，使我们不断的成长和进步。其次我要真挚的感谢导师颜伟玉、王子龙老师，是他们在我实验遇到问题时能给与及时地帮助。无论是实验方法还是实验操作过程中，都能给我很多建设性的意见，使我在一次次的实验尝试中取得成功。也是他们让我明白了无论是实验还是工作中都要学会用心，学会思考，学会通过不断的条件优化来达到最好的效果。他们严谨细致、精益求精的工作态度让我深切体会了认真二字。同时我也要感谢吴小波老师、张丽珍师姐在实验和学习上给与的帮助和关心。感谢师兄王文祥、田柳青和师姐王欢、甘海燕，潘其忠、刘浩、师妹邹垂彬、易瑶，郭亚惠和师弟周林斌、黄晓、袁安、李游等实验室人员在研究生期间给与的帮助与关心，使我有这么一段完美而又圆满的生活。最后，感谢曾经帮助过和教育过我的所有老师和同学。同时也特别感谢我的家人们这么多年给予我生活上、精神上和学习上的各种支持与帮助。最终感谢评审专家们给与我论文审阅付出的时间和汗水。值此论文完成之际，诚挚地感谢所有帮助关心过我的老师、同学、朋友们，愿您们生活美好幸福！53