蜜环菌液体培养条件优化及降血脂作用的研究 38页

蜜环菌液体培养条件优化及降血脂作用的研究OptimizationofculturemediumandreduceBlood-LIPidofArmillariamellea作者姓名：柳运波领域（方向）：生物制药指导教师：邢述教授类别：工程硕士答辩日期：2015年5月29日 摘要蜜环菌(学名:Armillariamellea)是隶属于真菌界，担子菌门，并且它是名贵药用兰科植物天麻、猪茶生长过程中必不可少的共生菌，蜜环菌在全世界侵染600多种树木，导致树林死亡，造成很大的经济损失。近些年来，蜜环菌的药用价值和荧光特性受到广泛关注。蜜环菌和蜜环菌发酵液与天麻有相似的药理作用，可作用于神经中枢，调节睡眠，增加免疫力等作用[17]。发光性是蜜环菌的重要特征之一，在充足的氧气、适宜的湿度、温度和酸碱度下，生长旺盛的蜜环菌幼嫩部分就会发出白绿色的荧光，这种光是一种冷光，无热感。蜜环菌发光特性已经被用于基因标记和作为生物传感器，国外报道蜜环菌发光特性可以用于环境检测，然而关于蜜环菌生物体发光最优培养活条件的研究确很少。因此找出最优化的培养条件利于蜜环菌的生长和发光对促进蜜环菌产业发展有重要作用。本研究旨在通过探索蜜环菌发酵条件中碳源、温度、PH值、光照对蜜环菌的生长和发光特性的影响，为实现蜜环菌培育做一些基础工作。1、分别以葡萄糖、淀粉、半乳糖、乳糖、蔗糖等不同碳源替代基础培养基中的果糖配制六组发酵培养基，发现蜜环菌在淀粉养基上菌索萌发时间最短，生长速度最快，且菌索发达，对发光强度没有影响，试验证明为淀粉做为碳源是最优的选择。2、将配制好的培养基5ml，加入到直径35mm培养皿中，接种，分别于5℃、15℃、25℃、30℃发酵，对菌丝的发光和生长率进行测量，温度对蜜环菌的生长和发光都有影响，适合菌体生长和发光最佳的温度为25℃。3、将5ml按最佳碳源配制好的培养基，加入到培养皿（35mm）中，接种，在不同的光照周期下进行培养，分别为24小时光照、12小时光照/12小时黑暗、24小时黑暗，光照影响菌丝体发光，但是不影响蜜环菌生长，蜜环菌在不光照的条件下培养发光亮度最高，其次是光照12h的培养条件，最暗的是完全光照的条件下培养。4、将5ml按最佳碳源配制好的培养基，灭菌后，用盐酸或氢氧化钠，培养基内培养液pH分别调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0，然后放I 入到培养皿中（35mm）接种，于25℃避光培养PH值是3.5的时候，最适合蜜环菌发光，PH值是5.5的时候菌丝体发光最弱，PH值是4.5的时候，菌丝体的生长速度最快。5、将提取密环菌多糖150mg/kg、100mg/kg连续喂养高血脂症模型大鼠，不断的检测高血脂症模型大鼠血清中TG、TC及LDL-C的过程中我们可以看出其水平在不断降低。实验结果表证实蜜环菌多糖具有一定的降血脂的作用。关键词蜜环菌、优化培养、蜜环菌发光、降血脂II AbstractArmillaria(scientificname:Armillariamellea)ispartoftheFungi,Basidiomycota,anditisthessentialsymbioticbacteriaofavaluablemedicinalplantsTianmaandgrifola’sgrowthprocess.Inrecentyears,themedicinalvalueandfluorescenceofArmillariaattractedwideattention.Inmedicalfield,itcancalmcenter,improvesleep,enhanceimmunityandregulatenerveandrelatedproductsisaneffectivedrugtreatmentofheadache,dizziness,weaknessandotherdiseases.LuminescenceisoneoftheimportantfeaturesofArmillaria,insufficientoxygen,properhumidity,temperatureandpH,theyoungtenderpartsofvigorousgrowthArmillariawillsendwhiteandgreenfluorescence,thelightisacoldlight.Nothermal,forbacteriainchemicalenergydirectlyintoluminousenergy.Armillarialuminescencepropertieshavebeenusedasgeneticmarkersandbiosensors,foreignreportstheluminescencepropertiescanbeusedtodetecttheenvironment,buttheresearchonArmillariabioluminescenceoptimallivingconditionsisveryfew.SotofindtheoptimalcultureconditionsconducivetothegrowthandlightofArmillaria,fastdevelopmentofhighyieldandhighqualityArmillariabacterialstrainwillplayanimportantroletopromotethedevelopmentoffungusArmillariaindustry.Thisstudyisconductedtoexplorethecultureconditionsincarbonsource,temperature,PHvalue,theeffectoflightonthegrowthofArmillariaandluminescencepropertiestodosomebasicworkfortherealizationofquicklycultivateArmillaria.1.Respectively,substitutethebasalmediumfructosewithglucose,starch,galactose,lactose,sucroseofdifferentcarbonsourcetopreparefivegroupsoffermentationmedium.Wefoundthatinthestarchmedium,rhizomorphgerminationtimeistheshortest,thegrowthisthefastest,andtherhizomorphisdeveloped,thehighestcontentoflipopolysaccharide.Thetestprovedtostarchasthecarbonsourceisthebestchoice.2.Prepareculturemedium5ml,addingto35mmdiameterPetridish,inoculated,respectively,in5℃,15℃,25℃,30℃fermented,measureluminousandthegrowthratIII eofmycelium,thetemperaturehaveasignificantimpactontheluminescentandthegrowthofArmillaria,themostsuitabletemperatureforthegrowthandluminousofArmillariais25℃.3.Prepareculturemedium5ml,addingto35mmdiameterPetridish,inoculated,culturedindifferentphotoperiod,24hlight,12hlight/12hdark,24hdark,lightaffecttheluminousofmycelium,butdoesnotaffectthegrowthofArmillaria.Thehighestluminousbrightnessofarmillariacultureiswithoutilluminationconditions,followedbyillumination12hlightingcultureconditions,thedimmestluminousbrightnessarecompletelylightingculture.4.Prepareculturemedium5ml,pHadjustedto3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0aftersterilization,wasaddedtoa35mmdiameterPetridish,inoculated,cultureinadarkplaceatatemperatureof25℃,whenthePHvalueis3.5,it’sthemostsuitableconditionsforArmillarialuminous,whenPHvalueis5.5.myceliahavetheweakestlightness,whenthePHvalueis4.5,thegrowthrateofthemyceliumisthefastest.5.Armillariapolysaccharideextracted150mg/kg,100mg/kgcontinuousfeedingratmodelofhyperlipidemia,itcansignificantlyreducetheserumofhighfatrats,levelsofTG,TCandLDL-C(P<0.05).ArmillariapolysaccharidealsoincreasestheserumHDL-Clevelsoffatinrats.TheexperimentalresultsconfirmArmillariaTablepolysaccharidehavecertainlipid-loweringeffect.KeywordsArmillaria、optimizetheculture、Armillarialuminous、lipid-loweringIV 目录摘要............................................................IAbstract..........................................................III第一章前言.........................................................11.1蜜环菌生态习性和分布范围.....................................1[5][6]1.2蜜环菌的组织构成.........................................11.2.1菌丝体.................................................11.2.2子实体.................................................1[7]1.3蜜环菌的形态特性...........................................21.3.1假菌核.................................................21.3.2发光性.................................................21.3.3兼性寄生...............................................21.3.4蜜环菌与天麻的共生关系.................................31.3.5好气性.................................................31.4温度和湿度对蜜环菌生长的影响.................................31.4.1温度...................................................31.4.2湿度...................................................31.5蜜环菌的化学成分.............................................31.6蜜环菌多糖的药理作用.........................................41.6.1免疫调节作用...........................................51.6.2降糖作用...............................................51.6.3抗衰老作用............................................61.6.4抗癌作用..............................................61.7蜜环菌多糖培养特性研究现状...................................71.8蜜环菌多糖的毒性.............................................81.9本研究的目的和意义...........................................8第二章不同培养条件对蜜环菌生长和发光的影响........................92.1试验材料.....................................................9V 2.1.1供试菌株...............................................92.1.2PDA培养基.............................................92.1.3试验仪器...............................................92.2试验方法.....................................................92.2.1菌落直径的测量.........................................92.2.2蜜环菌发光测量.........................................92.2.3最适碳源的选择........................................102.2.4最适培养温度的选择....................................102.2.5最适光照周期的选择....................................102.2.6最适PH值的选择.......................................102.3结果与讨论..................................................102.3.1不同碳源对蜜环菌生长和发光的影响......................102.3.2不同温度对蜜环菌生长和发光的影响......................132.3.3不同光照对蜜环菌生长和发光的影响......................152.3.4不同PH值对蜜环菌生长和发光的影响.....................182.4结论与讨论..................................................21第三章蜜环菌多糖的降血脂作用.....................................223.1材料与方法..................................................223.1.1试验材料..............................................223.1.2试验方法..............................................223.2结果与分析..................................................233.2.1蜜环菌多糖对高脂大鼠总胆固醇（TC）的影响..............233.2.2蜜环菌多糖对高脂大鼠甘油三酯（TG）的影响..............233.2.3蜜环菌多糖对低密度脂蛋白（LDL-C）的影响...............243.2.4蜜环菌多糖对高密度脂蛋白（HDL-C）的影响...............243.3小结........................................................25第四章结论.......................................................26参考文献...........................................................27致谢...........................................................29VI 第一章前言1.1蜜环菌生态习性和分布范围蜜环菌(Armillariellamellea)作为一种真菌，它属于担子菌亚门,主要见于森林当中，在适合环境中蜜环菌可以生活数百年，蜜环菌具有可以在黑暗处自主发光的菌丝体和菌丝。蜜环菌和天麻属于共生菌，他可以产生天麻生长所需的营养。[1]经长期研究发现蜜环菌的菌体和发酵液与天麻药理作用极其相似。蜜环菌发光特性已经被用于基因标记和作为生物传感器，国外报道可以用于环境检测。蜜环菌可以引起树木的根腐病，导致树林大面积的死亡，可造成巨大的经济损失。[2][3]蜜环菌分布很广，广布于北美北部和欧洲，国内主要分布于河北、山西、黑龙江、吉林、浙江、福建、陕西、广西、甘肃、新疆、四川、西藏云南、等地均有。[4]1.2蜜环菌的组织构成[5][6]蜜环菌一般有菌丝体和子实体两部分组成的。1.2.1菌丝体蜜环菌的基本结构菌丝体有两种形式；菌丝与菌索，菌丝体呈丝状在电子显微镜下才可看到菌丝间的分隔，它可以为为蜜环菌提供营养，透明无色。菌丝束组成了菌索，它是由菌丝在为适应恶劣环境而生成的，像植物的根一样，表面的菌丝呈黑褐色，紧密的排列着。菌索常见于树根或土壤中，功能多样化，既可输送养分，也能生长分化，形成菌丝体。菌索皮层细胞功能强大，不论在活树还是朽木上，均能侵染和吸收营养，并可分化成侧枝，还可分生出一个完整的菌索，使得蜜环菌能够在自然界中广泛分布。幼嫩的菌索可以发出蓝绿色的荧光。1.2.2子实体蜜环菌子实体就是发育完成的蘑菇，是重要的繁殖器官，一般子实体高6-14厘米，肉质菌盖，早期呈半球形，后期逐渐展平，最后下凹，直径约7-9厘米，1 多呈蜜黄色，表面步以毛状的鳞片，肉质白色。菌柄浅褐色，靠近底部为白色，菌柄形状为细长圆柱形，直径约0.5～2.2厘米，内部纤维松软，后中空，与菌盖同色。菌褶处与菌柄上部连接处有一较厚的菌环，膜质并很软，偶尔呈双环，颜色为白色并有暗色斑点。菌柄上部有环，菌盖表面又呈蜜黄色，因此得名“蜜环菌”。1.3蜜环菌的形态特性[7]1.3.1假菌核蜜环菌能够形成假菌核以保护其菌丝，抵御外部侵略。原理是当蜜环菌菌丝与其他生物体或真菌接触时，逐渐包围并形成假菌核，使得蜜环菌能够包含并消化食物，不受外界环境条件改变的影响。这一功能保证了蜜环菌能够不断繁衍下去。1.3.2发光性蜜环菌(Armillariellamellea)由于其发光特性又被称为亮菌，有研究报道指出蜜环菌是从菌丝发光，发出的光为冷光，没有热度。对它的荧光机理也有报道，刘炳仁等报道称蜜环菌发光是因为含有发光物质矿物元素磷[8]，谭周进等报道称蜜环菌发光是因为含有荧光酶[9]，认为蜜环菌的荧光亮度与氧气、湿度、温度和酸碱度有关。幼时的蜜环菌荧光强，老化的蜜环菌荧光强度弱，温度:12℃～28℃，25℃荧光强度最强，通气充足时发光强[8,3]，40%～70%的空气湿度荧光强度强[13]。张琪林等[12]报道菌丝的发光强度与菌丝的年龄、环境的温度和温度无关，认为与菌丝的死活和通气状况有关，死菌丝无荧光，活菌丝有荧光，通气量大荧光强度强，通气量小荧光强度弱。我们在发酵蜜环菌的过程中发现，这种发光的特性与培育条件和发育的阶段有关，例如温度、PH值、光照都会影响蜜环菌的发光，老化的蜜环菌就丧失了继续发光的能力。蜜环菌发光特性已经被用于基因标记和作为生物传感器，国外报道可以用于环境检测成，然而关于蜜环菌生物体发光最优培养活条件的研究确很少。[9]1.3.3兼性寄生蜜环菌是一种寄生菌。蜜环菌可寄生在活体寄主上，使得寄主连年感病。但2 同时蜜环菌还具有腐生特性，可以分解死树，将朽木转变为营养以供自身吸收，这样不仅增加了土壤的肥力，且也减少了森林病虫害。[7]1.3.4蜜环菌与天麻的共生关系天麻是是异养型兰科植物，没有根也没有叶片，本身没有合成营养的器官，表皮组织具有简单的吸收作用，可以吸收水份和无机盐类，天麻与蜜环菌之间存在着一种非常特殊的共生关系，天麻的表皮消化细胞层具有溶解酶，当蜜环菌菌丝穿过天麻表皮时被分解并吸收，天麻吸收养分。当天麻老化时,蜜环菌又可以吸收天麻体内的营养成分，这种现象叫做“反消化”。[10]1.3.5好气性蜜环菌具有好气性，如果氧气供应，蜜环菌就会停止生长，或生长缓慢。蜜环菌的生长受土壤通气情况的影响非常明显，比如在树根附近的浅层土壤中，空气较为流通，蜜环菌的菌索相应的就比较粗壮，而远离树根相对较硬的土壤，蜜环菌的菌索就比较细小。[11][12]1.4温度和湿度对蜜环菌生长的影响1.4.1温度蜜环菌在6℃-30℃的范围内都能生长，随着温度的升高，生长速度也会加快，一般在18℃-25℃时生长速度最快。研究表明,最适宜的温度可能随条件改变而改变,蜜环菌在培养基中生长的最适宜温度比在土壤中要略高一些。[13]1.4.2湿度蜜环菌对湿度的要求比较高，空气湿度越大，蜜环菌的生长发育越快。蜜环菌的不同部位对空气湿度的要求也不同,子实体对湿度的要求要达到90%~95%，才能生长发育。1.5蜜环菌的化学成分蜜环菌是药用植物天麻的共生菌，天麻具有很多药理作用，是一种珍贵的药材，研究证明蜜环菌菌丝和发酵液具有和天麻相同的药理作用，许多学者对蜜环菌的化学成分和药理作用做了很多研究，袁兴利[14]等报道蜜环菌干燥物用95%乙3 醇冷提，再用闪式提取器提取，得到浸膏，用硅胶、SephadexLH-20柱色谱等，用不同溶剂进行分离纯化，通过对照品和图谱鉴定成分的结构，从蜜环菌发酵培养物中分离鉴定了10个化合物。化合物1～10是第一次从发酵培养物中分离得到的，化合物1～4，6，在蜜环菌菌丝体或菌索中也有报道过的。张庆林【25】等报道从蜜环菌干粉中经过脱脂,水煮沸,稀氢氧化钠提取等方法制得粗多糖，经澳代十六烷基三甲按处理后的得到酸性纯多糖和中性多糖，分子量分别为14000和18000，酸性多糖是由半乳糖,木糖,阿拉伯糖,岩藻糖,鼠李糖组成，其中半乳糖含量最高，其比例为2.8:2.7:1:1.7:1.2，中性多糖是由甘露醇,葡萄糖,半乳糖所组成,比例为1.7:5:1,还含有丰乳糖醛酸。郭顺星等[15]报道，蜜环菌在不同的发育阶段多糖的性质和成分是不相同的，对蜜环菌菌丝体、发酵液、菌索和子实体用石油醚和乙醇等分别进行提取、分离和纯化，采用高效液相色谱法对多糖的组成及摩尔比进行测定，用凝胶渗透色谱法对多糖的分子量进行了测定，采用凝胶色谱法对蜜环菌的多糖的含量进行测定，实验结果显示菌丝体、发酵滤液的多糖均由单一葡萄糖组成;菌索和子实体多糖由葡萄糖和木糖组成，在菌索多糖中葡萄糖与木糖的摩尔比为1∶14,在子实体多糖中葡萄糖与木糖的摩尔比为1∶10，蜜环菌多糖的分子量约为1万～7万，蜜环菌菌丝体多糖含量为11.40%，发酵液多糖的含量为1.885g·(100ml)-1，菌索多糖的含量为1.30%，子实体的含量为3.60%。多糖经水溶后有部分不溶，采用HPLC对水溶性多糖进行了含量检测，菌丝体中水溶性多糖的比例为82.40%、发酵滤液中水溶性多糖的比例为88.60%、菌索中水溶性多糖的比例为92.80%、子实体中水溶性多糖的比例为71.10%。1.6蜜环菌多糖的药理作用蜜环菌的主要活性成分是原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯、多糖、有机酸、甾醇、黄酮，尿嘧啶和甘露醇等，蜜环菌多糖是主要药理活性的成分。近年来，国内外对蜜环菌研究逐渐增多，证明蜜环菌与天麻具有相似的药理作用。现将其活性多糖的药理作用等方面的最新研究进展报道如下。4 1.6.1免疫调节作用王惠国等[16]对蜜环菌多糖的免疫调节活性进行了研究，选取昆明小鼠80只随机分成四组，阴性对照组（生理盐水），阳性对照组（香菇多糖），蜜环菌多糖高剂量组，蜜环菌多糖低剂量组，各组给药14天后，进行免疫活性检测。分别开展了蜜环菌多糖对小鼠吞噬细胞吞噬速率的影响、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、小鼠T淋巴细胞增殖能力、血清溶血素。小鼠吞噬细胞吞噬碳粒实验结果显示，蜜环菌多糖高剂量组，蜜环菌多糖低剂量组小鼠碳粒廓清指数、吞噬CRBC百分率高于阴性对照组（生理盐水）,表明蜜环菌多糖可提高小鼠吞噬细胞的吞噬功能。蜜环菌多糖对小鼠T淋巴细胞增殖能力实验显示阳性对照组（香菇多糖），蜜环菌多糖高剂量组，蜜环菌多糖低剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力(OD值)高于阳性对照组（香菇多糖）,差异具有统计学意义，表明蜜环菌多糖可增强T淋巴细胞的增殖能力。血清溶血素的实验显示阳性对照组（香菇多糖），蜜环菌多糖高剂量组，蜜环菌多糖低剂量组小鼠血清溶血素的水平高于阳性对照组（香菇多糖）,差异具有统计学意义，表明蜜环菌多糖可提高小鼠血清中特异性抗体含量(P<0.05)。以上实验结果表明蜜环菌多糖多靶点调节免疫细胞以及免疫分子，发挥其免疫作用，具有很高的药用价值。1.6.2降糖作用于敏等[17]等对蜜环菌菌索多糖（AMP）对小鼠血糖的影响做了研究，从液体培养菌索提取分离纯化所得两种多糖成分，分别为AMP-1、AMP-2，分别开展了AMP-1、AMP-2对正常小鼠糖耐量的实验和AMP-1、AMP-2对四氧啶糖尿病小鼠血糖影响的实验，在对小鼠糖耐量的实验当中选取小鼠70只随机分为7组，分别为达美康组、AMP-1低剂量组、AMP-2低剂量组、AMP-1高剂量组、AMP-2高剂量组、生理盐水阳性对照组(+)、生理盐水阴性对照组(-)，连续灌胃7天后测定血糖，实验结果显示生理盐水阳性对照组在注射血糖后血糖值一直在快速升高，达美康、AMP-1在小鼠注射血糖30分钟后血糖浓度依然升高不会降低，2h后低于正常组。AMP-2组能在1小时内使小鼠的血糖恢复正常。以上实验结果表明AMP-1可提高小鼠的糖耐量，AMP-2可降低血糖。操玉平[7]等开展了蜜环菌多糖对损伤性胰岛细胞分泌功能的影响实验，取大鼠胰岛素瘤细胞分别在在5 RPMI-1640培养液、5%CO2培养箱中培养，总共分为8组，分别为空白对照组、四氧嘧啶组、不同浓度的AMP-16组，检测不同浓度AMP-1对INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素和C肽分泌量的影响，同时检测细胞存活率。实验结果表明蜜环菌多糖不仅可以促进受损的胰岛素瘤细胞分泌胰岛素还具有C肽保护作用。沈业寿[18]等开展了蜜环菌糖复合物的糖链降解及其对a一葡萄糖普酶的抑制作用的研究，选用了α-葡萄糖苷酶抑制剂分子模型，做了进一步研究其研究结果表明，蜜环菌多糖不但具有抑制活性的作用，而且水解浓度的加大它还可以抑制活性增加。1.6.3抗衰老作用机体在氧化反应中会产生的有害化合物，称为自由基，它强氧化性的特性使得它破坏机体的组织和细胞，能够引起引起慢性疾病和加速人体衰老。超氧化物歧化酶（SOD）则能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢清除自由基。研究证实蜜环菌菌索多糖可以提高超氧化物歧化酶的活性，通过改善自由基代谢达到抗衰老作用。朱显峰等[19]开展了蜜环菌多糖抗氧化活性研究，提取和纯化蜜环菌多糖，测定水溶性多糖含量，分别开展了蜜环菌多糖清除羟基自由基－活性的实验、蜜环菌多糖对O2的清除实验、蜜环菌多糖对DPPH自由基的清除实验。在蜜环菌多糖清除羟基自由基活性的实验中，测定不同浓度的蜜环菌多糖水－溶液和抗坏血酸、TBHQ溶液对羟基自由基清除作用。在蜜环菌多糖对O2的清除实验中测定不同浓度粗多糖水溶液、抗坏血酸和TBHQ溶液对超氧阴离子的清除作用。在蜜环菌多糖对DPPH自由基的清除实验中测定同浓度粗多糖水溶液、抗坏血酸和TBHQ溶液对DPPH自由基的清除作用。张云侠等[23]研究更进一步证实了蜜环菌菌索多糖具有不错的抗衰老性，试验结果显示，蜜环菌菌索多糖不仅可以可显著延长秀丽隐杆线虫在正常培养条件下的生存实时间，不损害其生殖能力；还显著提高秀丽隐杆线虫在氧化应激条件下HSP-16.2和SOD-3的表达。1.6.4抗癌作用Lang等从蜜环菌中发现了一种水溶性多糖，该多糖相对分子质量为4.6×105，是由D-葡萄糖组成，研究发现，该多糖可抑制A549肿瘤细胞，并且作用很强能使肿瘤细胞死亡。对作用机制进一步研究发现，这种水溶性多糖能使肿瘤6 细胞的线粒体膜电位下降，因而使线粒体细胞释放出细胞色素C，并且能够激活caspase-3和caspase-9，使肿瘤细胞死亡。由于不断的对蜜环菌的药理作用进行研究，尤其是蜜环菌的抗衰老、抗癌和调节免疫的作用为蜜环菌为原料制作的药品和保健品提供了理论基石，蜜环菌具有良好的发展前景。[21]1.7蜜环菌多糖培养特性研究现状蜜环菌是珍贵天麻药材的共生菌，而天麻的生长极易受时间和环境条件的影响，其使用也受到限制，蜜环菌的菌丝和发酵液与天麻有相似的药理作用。李立恒等[10]报道对蜜环菌深层发酵条件进行了优化，分别开展了碳氮源种类及浓度、刺激物种类及浓度、pH值、接种量、通气量、搅拌、消泡剂、发酵时间等进行了试验。在筛选碳源的试验中，分别选用蔗糖、大米粉、小麦粉、红薯粉作为碳源进行发酵，还同时对碳源的浓度进行了筛选，试验结果表明红薯粉作为碳源蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高，蔗糖最低。在筛选氮源的试验中，分别选用蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、豆粕粉作为氮源进行发酵，还同时对氮源的浓度进行了筛选，试验结果表明以蛋白胨为氮源时蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高。在筛选外源刺激物及浓度的试验中，分别选用不添加,乙醇,丙酮,土温，作为外源刺激物进行发酵，还同时对外源刺激物的浓度进行了筛选，试验结果表明1%的乙醇作为外源刺激物时蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高。在筛选PH的试验中，分别选用PH5.0、PH5.5、PH6.0、进行发酵，试验结果表明1PH6.0时蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高。在筛选接种量的试验中，分别选用接种量为3%,6%,10%、15%进行发酵，试验结果表明当接种量为10%时蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高。在筛选接种量的试验中发现通气量越多，蜜环菌菌丝含量和多糖含量最高。温钢等[22]对蜜环菌胞外多糖液体发酵培养基的条件进行了优化研究，分别开展了碳源、氮源、无机离子对胞外多糖产量的影响试验。在筛选碳源的试验中，分别选用蔗糖、玉米粉、乳糖、麦芽糖以及可溶性淀粉等作为碳源进行发酵，试验结果表明以蔗糖为碳源时蜜环菌胞外多糖含量最高。在筛选氮源的试验中，分别选用硫酸铵、氯化铵、麸皮、豆饼粉、牛肉膏、酵母粉等进行发酵，试验结果7 表明以豆饼粉为氮源时蜜环菌胞外多糖含量最高。在筛选无机离子的试验中，选用K2HPO4和ZnSO4时对蜜环菌胞外多糖产量显著影响。1.8蜜环菌多糖的毒性于敏等[17]等对蜜环菌菌索多糖（AMP）急性毒性进行了实验研究，取健康小鼠50只随机分为5组，分别为AMP-1低剂量组、AMP-2低剂量组、AMP-1高剂量组、AMP-2高剂量组、生理盐水组，每天各灌胃三次，连续灌胃四天，观察小鼠体重、行为、食欲、二便、皮毛亮度、肠道反应、呼吸情况、瞳孔大小等。连续灌胃7天后未发现小鼠有死亡现象，观察小鼠的一些状况均正常，同时对小鼠的脏器也进行了显微观察，分别将小鼠的胸腺、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏做成石蜡切片，放到高倍显微镜下观察，发现AMP-1低剂量组、AMP-2低剂量组、AMP-1高剂量组、AMP-2高剂量组的组织结构和细胞与生理盐水组相比均无明显变化。实验结果表明蜜环菌菌索多糖（AMP）无急性毒性作用。1.9本研究的目的和意义蜜环菌是一类具有很高经济价值和药理作用的高等真菌，其致病能力强，寄主范围达到600多的种属，可导致树林感染根朽病，造成巨大的经济和生态损失，一直是世界各地的植物病理学家和真菌分类学家的注视的焦点，是名贵中药材猪等和天麻栽培业必需的共生菌。蜜环菌具有很高的药用价值，同时真菌的发光特性已经被用报道于基因标记、作为生物传感器和用于环境的检测，传统的环境检测已经不能满足现代发展的需要，采用发光菌进行环境检测具有简便、准确率高和成本低的优点。为了蜜环菌类用于环境检测，重要的是去研究生物体发光培养条件之间是否有联系，首先要进一步研究生物体发光特性，然后选择最佳的培养条件，适合生物体发光。本研究的目的就是去确定碳源、温度、PH值、光照对蜜环菌的生长和发光的影响，选择最佳的碳源、温度、PH值和光照周期，这对对加强蜜环菌的基础研究以及促进蜜环菌的人工培养和应用研究都具参考价值。8 第二章不同培养条件对蜜环菌生长和发光的影响2.1试验材料2.1.1供试菌株蜜环菌(Armillariamellea)，吉林农业大学提供。2.1.2PDA培养基淀粉20g，蛋白胨1.5g，甲酸溶液0.1g，KH2PO41g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，酵母抽提物1.5g，水1000ml，pH4.5。2.1.3试验仪器Lucy3发光仪郑州安图生物工程有限公司游标卡尺东莞市祥兴仪器有限公司PGX-450C智能光照培养箱上海谷宁实业有限公司SystecV系列立式高压灭菌器德国FA1004B电子分析天平苏州江东精密仪器有限公司Airstream超净工作台（超宽型）新加坡EscoDZ-2BC真空干燥培养箱青岛佳诺实验设备有限公司培养皿（35mm）2.2试验方法2.2.1菌落直径的测量用游标卡尺对菌落直径进行测量，测量时间是上午11点半到下午2点之间，利用十字交叉法，每间隔两天测量一次，并做好记录，直到菌丝体长到培养皿的边缘。2.2.2蜜环菌发光测量用发光仪对菌丝体的荧光进行测量，敏感度设置为35%，测量时间是上午10点到11点半，每间隔两天测量一次，并做好记录，直到菌丝体长到培养皿的边缘。9 2.2.3最适碳源的选择分别以葡萄糖、淀粉、半乳糖、乳糖、蔗糖等不同碳源替代基础培养基中的果糖配制六组发酵培养基，将配制好的培养基5ml，加入到培养皿，接种0.8×0.8cm大小的蜜环菌固体菌块，恒温箱内暗处培养，培养温度25℃，每组设置三个重复，每两天对菌落的直径和发光强度进行测量，根据菌落直径和发光强度确定最佳的碳源。2.2.4最适培养温度的选择按最佳碳源配制好的培养基5ml，加入到培养皿，接种0.8×0.8cm大小的蜜环菌固体菌块，分别将培养液置于5℃、15℃、25℃、30℃恒温箱内暗处培养，每种处理重复三次，每两天记录一次温度，并对菌落的直径和发光强度进行测量，根据菌落直径和发光强度确定最佳的培养温度。2.2.5最适光照周期的选择按最佳碳源配制好的培养基5ml，加入到培养皿，接种0.8×0.8cm大小的蜜环菌固体菌块，分别置于光照培养箱内于不同的光照周期进行培养，光的强度为40W，24h光照、12h光照/12h黑暗、24h黑暗，温度为25℃，每种处理重复3次。每隔两天对菌落的直径和发光强度进行测量，根据菌落直径和发光强度确定最佳的光照周期。2.2.6最适PH值的选择按最佳碳源配制好的培养基，灭菌后用NaOH或HCI分别调至pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0，取5ml加入到培养皿，接种0.8×0.8cm大小的蜜环菌固体菌块，在温度为25℃黑暗处恒温箱内培养，每种处理重复3次。每隔两天对菌落的直径和发光强度进行测量，根据菌落直径和发光强度确定最佳的光照周期。2.3结果与讨论2.3.1不同碳源对蜜环菌生长和发光的影响微生物生长过程中最重要的能源之一就是碳源，不同的菌种可利用不同的碳源，对同一碳源的利用效果也不相同，取决于菌种体内结构。试验选取6种碳源，按照2.2.3方法操作，测定菌落直径和发光强度，最适合蜜环菌生长的是碳源，10 对发光没有影响。表2-1菌丝体生长情况【菌落直径（mm）】葡萄糖淀粉半乳糖乳糖蔗糖果糖10天6.39.61.00.51.36.812天6.812.11.30.91.77.214天7.212.71.81.32.27.716天7.513.82.11.83.68.018天8.114.32.72.35.28.420天9.415.73.02.85.89.822天10.616.93.73.27.011.024天11.717.64.84.28.711.926天12.618.75.95.29.712.828天13.719.96.85.810.913.8图2-1菌丝体生长情况趋势图菌落直径（mm）11 表2-2菌丝体发光情况【光测量值(RLU)】葡萄糖淀粉半乳糖乳糖蔗糖果糖14天25301015351516天9010090951008518天26025523524021024520天25024025025526525522天23522521026027024524天23021522025528523526天24523521023027525028天30528528031030031012 图2-2菌丝体发光情况趋势图光测量值(RLU)2.3.2不同温度对蜜环菌生长和发光的影响温度对蜜环菌生长和发光都有显著的影响，最适合菌丝生长和发光的温度为25℃，蜜环菌在5℃几乎是不生长。表2-3菌丝体发光情况【光测量值(RLU)】15℃25℃30℃0天0008天030010天0703012天30803014天308010016天10015013018天11016013020天11016013022天12030014024天120130014026天15058014013 图2-3菌丝体发光情况趋势图光测量值(RLU)时间（天）表2-4菌丝体生长情况【菌落直径（mm）】15℃22℃30℃6天7107.28天814810天11.5171012天13.518.51214天152013.216天16241418天17251520天202816.822天22321824天2432.518.826天2534.52114 图2-4菌丝体生长情况趋势图菌落直径（mm）时间（天）2.3.3不同光照对蜜环菌生长和发光的影响光照影响菌丝体发光，但是不影响蜜环菌生长。不光照和一天接受12h光照的条件下培养蜜环菌，蜜环菌生长的速度几乎是相同的，但是不接受光照和一天接受12h光照比全天接受光照的生产的速度要快，在接受12h光照的条件下，蜜环菌可以生产出根状菌索，在另外两个培养条件下则不产出。蜜环菌在黑暗的条件下培养发光亮度最高，其次是光照12h的培养条件，最暗的是完全光照的条件下培养。有的研究报道光照对菌丝休的生长率是有影响的，我们的研究光照不影响菌丝体的生长，可能是因为我们所用光的强度和质量是不一样的。15 表2-5菌丝体发光情况【光测量值(RLU)】24h光照12h光照/12h黑暗24h黑暗6天0008天15303010天20754012天207510514天4016016016天07531018天013062020天014055022天013072024天07529026天0759016 图2-5菌丝体发光情况趋势图光测量值(RLU)时间（天）表2-6菌丝体生长情况【菌落直径（mm）】24h光照12h光照/12h黑暗24h黑暗6天810108天1213.513.510天14151512天15171714天17191916天1821.52218天1823.52420天22.52626.522天25.527.527.524天27.531.231.226天3032.532.517 图2-6菌丝体生长情况趋势图菌落直径（mm）2.3.4不同PH值对蜜环菌生长和发光的影响PH值对蜜环菌生长和发光都有显著的影响，最适合蜜环菌生长的PH值是4.5，PH值为6的时候生长最缓慢，PH值为7的时候不生长，蜜环菌在PH值3.5培养到18天之后开始生产根状菌索。PH值是3.5的时候，最适合蜜环菌发光，PH值是5.5的时候菌丝体发光最弱。18 表2-7菌丝体发光情况【光测量值(RLU)】PH3PH3.5PH4PH4.5PH510天01000012天020200014天201804020016天1605001801102018天42075035025010020天610100038024018022天950135025023020024天1000125021022022026天390105038024018028天240700380300100图2-7菌丝体发光情况趋势图光测量值(RLU)时间（天）19 表2-8菌丝体生长情况【菌落直径（mm）】PH3.0PH3.5PH4-4.5PH5PH5.510天79.59.59.59.512天1012121211.214天11.212.512.512.512.516天1214.21514.213.518天13.214.516.2151420天13.5161815.21422天141721.2161524天1518.222171626天161924181728天172026.21918图2-8菌丝体生长情况趋势图菌落直径（mm）时间（天）20 2.4结论与讨论研究表明碳源、碳源浓度、温度、PH值和光照影响蜜环菌的生长和发光，分别开展了试验，筛选出适合蜜环菌的生长和发光最佳的碳源、温度、PH值和光照周期。淀粉作为碳源，可以促进菌丝体的生长率，对发光没有影响，试验证明为碳源最适合蜜环菌生长。分别在5℃,15℃,25℃and30℃培养蜜环菌，每两天测量一次菌落直径和发光强度，筛选出最适合蜜环菌生长和发光的温度为25℃。将配制好的培养基，灭菌后用NaOH或HCI分别调至pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0，加入到培养皿，接种，在25℃避光培养，筛选出最适合蜜环菌生长PH值为4.5和适合发光的PH值为3.5。将蜜环菌分别在不光照、接受全天光照和一天接受12h光照的条件下培养，每两天测量一次菌落直径和发光强度，光照影响菌丝体发光，但是不影响蜜环菌生长，蜜环菌在不光照的条件下培养发光亮度最高，其次是光照12h的培养条件，最暗的是完全光照的条件下培养。21 第三章蜜环菌多糖的降血脂作用3.1材料与方法3.1.1试验材料供试菌株：蜜环菌(Armillariamellea)，吉林农业大学提供。PDA培养基：淀粉20g，蛋白胨1.5g，甲酸溶液0.1g，KH2PO41g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，酵母抽提物1.5g，水1000ml，pH4.5。试剂:高密度脂蛋白（HDL-C）试剂盒中生北控生物科技股份有限公司低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒中生北控生物科技股份有限公司总胆固醇（TC）试剂盒中生北控生物科技股份有限公司甘油三酯（TG）试剂盒中生北控生物科技股份有限公司高脂饲料北京博泰宏达生物技术有限公司实验动物40只昆明大鼠，雌雄各半，体重150～200g，8周龄。试验仪器4-20N台式离心机湖南恒诺仪器设备有限公司722S型可见分光光度计上海光学仪器厂DZ-2BC真空干燥培养箱青岛佳诺实验设备有限公司FA1004B电子分析天平苏州江东精密仪器有限公司SystecV系列立式高压灭菌器德国BS-2F（S）恒温恒湿振荡培养箱上海一恒科学仪器有限公司3.1.2试验方法蜜环菌多糖的提取将配制好的培养基加入三角烧瓶中，121℃灭菌30分钟，调PH值4.5，接种，在温度25℃，转速110rpm摇床培养10d后，收集发酵液然后过滤，离心（3000r/min）后，将上清液取出，加3倍量乙醇静置24小时，过滤，用2倍量无水乙醇将沉淀洗至无还原糖反应，真空干燥，备用。22 大鼠高血脂模型建立将40只大鼠随机分为组，每组10只大鼠，空白组、模型组、高剂量组、低剂量组。空白组喂正常饲料，每只鼠平均每天20g，高剂量组和低剂量组喂高脂饮饲料，同时分别给予蜜环菌多糖150mg/kg和100mg/kg，模型组给予高脂饲料，同时给予空胶囊，所有组均连续喂养25天。测定方法将各组大鼠饲养25天，然后空腹12小时，取眼静脉血，8℃离心10分钟（3000r/min），用试剂盒测定总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）的含量。3.2结果与分析3.2.1蜜环菌多糖对高脂大鼠总胆固醇（TC）的影响各组实验大鼠给药25天后，按照2.2测定方法，对大鼠血清总胆固醇（TG）水平进行测定，结果如下：表3-1大鼠血清总胆固醇（TG）测定结果组别nTC（mmol/L）正常组101.87±0.14**模型组103.91±0.2高剂量组103.01±0.15**低剂量组103.45±0.12*注：与模型组组相比**P<0.01，*P<0.05。通过对比模型组与空白组，模型组中大鼠TC含量显著升高，这就说明大鼠高血脂造型成功，而对比蜜环菌多糖组与模型组，大鼠总胆固醇（TC）水平显著降低，并且与剂量呈线性关系，表明蜜环菌多糖有降低总胆固醇（TC）的作用。3.2.2蜜环菌多糖对高脂大鼠甘油三酯（TG）的影响各组实验大鼠给药25天后，按照2.2测定方法，对大鼠血清甘油三酯（TG）水平进行测定，结果如下：23 表3-2大鼠血清甘油三酯（TG）测定结果组别nTG（mmol/L）正常组100.98±0.19**模型组102.21±0.98高剂量组101.62±0.18**低剂量组101.88±0.2*注：与模型组组相比**P<0.01，*P<0.05。通过对比模型组与空白组，模型组中大鼠TG含量发现甘油三酯（TG）含量显著升高，说这就明大鼠高血脂造型成功，而对比蜜环菌多糖组与模型组，大鼠甘油三酯（TG）水平显著降低，并且与剂量呈线性关系，表明蜜环菌多糖有降低甘油三酯（TG）的作用。3.2.3蜜环菌多糖对低密度脂蛋白（LDL-C）的影响各组实验大鼠给药25天后，按照2.2测定方法，对大鼠低密度脂蛋白（LDL-C）水平进行测定，结果如下：表3-3大鼠低密度脂蛋白（LDL-C）测定结果组别nLDL-C（mmol/L）正常组100.53±0.06**模型组102.05±1.2高剂量组101.52±0.23**低剂量组101.72±0.16*注：与模型组组相比**P<0.01，*P<0.05。模型组与空白组比较，低密度脂蛋白（LDL-C）水平显著升高，说明大鼠高血脂造型成功，蜜环菌多糖组与模型组相比，低密度脂蛋白（LDL-C）水平显著降低，与剂量呈线性关系，表明蜜环菌多糖有降低甘油三酯（TG）的作用。3.2.4蜜环菌多糖对高密度脂蛋白（HDL-C）的影响各组实验大鼠给药25天后，按照2.2测定方法，对大鼠高密度脂蛋白（HDL-C）水平进行测定，结果如下：24 表3-4大鼠高密度脂蛋白（HDL-C）测定结果组别nLDL-C（mmol/L）正常组101.15±0.62**模型组100.91±0.13高剂量组101.04±0.10低剂量组101.02±0.14注：与模型组组相比**P<0.01模型组与空白组比较，高密度脂蛋白（HDL-C）水平显著降低，说明大鼠高血脂造型成功，蜜环菌多糖组与模型组相比，高密度脂蛋白（HDL-C）水平无明显差异。3.3小结建立大鼠高血脂症模型可以选择连续喂养大鼠高脂饲料25天即可。蜜环菌多糖150mg/kg、100mg/kg就可以明显降低高脂大鼠血清TG、TC及LDL-C的水平（P<0.05）。蜜环菌多糖也可以提高高脂大鼠血清HDL-C的水平。实验结果表证实蜜环菌多糖具有一定的降血脂的作用。25 第四章结论本论文以蜜环菌发酵培养条件为主要研究对象，比较不同的碳源、温度、PH值和光照影响蜜环菌的生长和发光，探索蜜环菌的最适培养条件，并得出以下结论：3.1淀粉作为碳源，可以促进菌丝体的生长率，对发光没有影响，试验证明为碳源最适合蜜环菌生长。3.2分别在5℃,15℃,25℃and30℃培养蜜环菌，每两天测量一次菌落直径和发光强度，筛选出最适合蜜环菌生长和发光的温度为25℃。3.3将配制好的培养基，灭菌后用NaOH或HCI分别调至pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0，加入到培养皿，接种，在25℃温度避光培养，筛选出最适合蜜环菌生长PH值为4.5和适合发光的PH值为3.5。3.4将蜜环菌分别在不光照、接受全天光照和一天接受12h光照的条件下培养，每两天测量一次菌落直径和发光强度，光照影响菌丝体发光，但是不影响蜜环菌生长，蜜环菌在不光照的条件下培养发光亮度最高，其次是光照12h的培养条件，最暗的是完全光照的条件下培养。3.5连续喂养大鼠高脂饲料25d，可成功建立大鼠高血脂症模型。蜜环菌多糖150mg/kg、100mg/kg就可以明显降低高脂大鼠血清TG、TC及LDL-C的水平（P<0.05）。蜜环菌多糖也可以提高高脂大鼠血清HDL-C的水平。实验结果表证实蜜环菌多糖具有一定的降血脂的作用。26 参考文献[1]周西贝，蜜环菌优化培养及生物活性的研究，中国知网[2]WeitzHJ,CampbellCD,KillhamK.2002.Developmentofanovel,bioluminescence-based,fungalbioassayfortoxicitytesting.EnvironMicrobiol.,4:422-429.[3]史国生，程春雷蜜环菌多糖的研究进展2014年10月20日第23卷第20期[4]孙立夫张艳华蜜环菌生物种和地理分布概况综述[5]DonnellyDMX,HutchinsonPM.ArmillaneH,aSaturatedSesquiterpeneEsterFromArmillariamellea[J].Phytochemistry,1990,29(1):179-182.[6]陈顺方,祁岑,黄先敏.蜜环菌的生产技术[J].现代农业科技,2009,(14):125-127.[7]白玛央金蜜环菌的研究进展《西藏科技》2010年12期(总第213期)[8]刘炳仁,于瑞兰,刘坤.天麻栽培与加工新技术[Ｍ].北京:科学技术文献出版社,2002.[9]谭周进,谢达平,王征,等.蜜环菌发光条件的研究[Ｊ].激光生物学报,2001,10(3):23～25[10]李立恒，王征，谢达平蜜环菌深层发酵产多糖的研究湖南农业大学学报(自然科学版)2003年10月[11]陈士瑜,陈惠.薛菌栽培手册[M].北京:科学技术文献出版社,2003[12]张琪林李宝平王红蜜环菌荧光条件及机理再研究山西师范大学学报2006年第20卷第1期[13]周昌华,卢进,张兴翠.天麻栽培技术[Ｍ].北京:金盾出版社,2000.[14]袁兴利，闫利华，张启伟，王智民等蜜环菌的化学成分研究中国中药杂志2013年8月[15]陈晓梅,郭顺星,王秋颖,肖培根蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究中国中药杂志2001年6月[16]王惠国，冯宝民蜜环菌多糖免疫调节活性的实验研究[J]陕西科技大学学27 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