用主蛋白-1特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和掺假蜂蜜的elisa技术研究 63页

分类号：Ｓ８９６．１单位代码：１０３３５密级：开＿学号：Ｕ２１３０：３５硕壬学位论文论文题目用主蛋白－１特异性＃抗检测媛王浆新鲜麼和捻假搂壤的ＥＬＩＳＡ枝术巧巧英文题目ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＲｏｙａｌＪｅｌｌｙＦｒｅｓｈｎｅｓｓａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄＨｏｎｅｙｂｙＥＬＩＳＡＷｉｔｈａＨｉｇｈｌｙＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎ－ｔｉａｐａｌｂｕｍｉｎ１，ＭａｊｏｒＲｏｖａｌＪｅｌｌｙＰｒｏｔ：ｅｍ１Ａｎｔｉｂｏｄｙ作者姓名王一然指导教师沈立荣教按学科（专业）食品科学所在学晓生物系统工趕与食晶科学举院提交日期二零一五年卡一巧 分类号：Ｓ８９６．１单位代码：１０３３５１密级；１１２３０３５：公开学号硕壬学位论文论文题目用主蛋白－１特吞牲多抗检测峻王浆新给度和椿假蜂壌的ＥＬＩＳ乂技术研究英文题目ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＲｏｙａｌＪｅｌｌｙＦｒｅｓｈｎｅｓｓａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄＨｏｎｅｙｂｙＥＬＩＳＡＷｉｔｈａＨｉｇｈｌｙＳｐｅｃｉｆｉｃ－ｎｎＡｎｄａｐａ化ｉｉｍｉ１，ＭａｊｏｒＲｏｙａｌＪｄｌｖＰｒｏｔｅｉ１Ａｎｄｂｏｄｖ—然作者姓《王指导教师沈立荣教授学科（专业）食品科学所在学院生物《统工程与食品科学学院提《日期二零一五年十一月 用主蛋白－１特异性多抗检测峻王浆新鲜度和撫假蜂蜜的ＥＬＩＳＡ技水巧究戀＇也论文作者签名：ｉ指导教卿签名：Ｗ：刘松柏论文评阅人１评阅人２：徐海若评阅人３：郑高利４隐名评阅人：评阅人５：答辩委员会主席：郑裔利委员１：燒械委员２：高其康３：委员沈立荣委员４：委员５：曰：２０１５．１２．９答辩期＿ 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本入在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加政标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人臣经发表或撰写过的研究成果，化不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。一与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一－日期日学位论文作者签名：也签字：年月２Ｊ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘。，允许论文被查阅和借阅本人授权浙江大学可Ｌ义将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可！＾乂采用影巧、缩巧或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）一学位论文作者签名：＾导师签名：■立ｆ曰签字曰期：＂年月？ 本研究承蒙２７８国家自然科学基金项目（编号：３１１８４）杭州市重大科技创新项目：２０１３１８１２Ａ２５）（编号资助 －浙江大学巧±学位论文用主蛋白１特异性《抗检测蜂王浆新鲜度和惨假蜂蜜的ＥＬＩＳＡ技术研究目录胃录Ｉ致谢ＩＩＩ摘要ＡｂｓｔｒａｃｔＩＶ一章绪论１第１１ＪＰ１１．蜂王浆中关键蛋白ＭＲ的功能１２２．当前蜂王浆品质评价与新鲜度检测指标及方法１．２．１基于美拉德反应产物的检测２１２４．２．基于蛋白质结构与含量的检测１．２３５．基于其他物质的检测１．３品质评价与惨假鉴定５蜂蜜１．３１６．稳定性碳同位素比率法检测技术１．３．２利用光谱技术鉴别蜂蜜摸假６１．３（７．３核磁共振法ＮＭＲ）１４７．３．利用蜂蜜的元素姐成分析．３．８１５酶活力测定．８１４研究的目的、意义及技术路线１．４１、８．研究的目的意义１．４２９．研究内容二－１ＥＬＩＡ检测１第章基于主蛋白特异性多抗的王浆新鱗度夹成法Ｓ０２１．１材料、试剂与设备０２丄１１实验材料０２丄２实验试剂及耗材１０２丄３实验设备１０２丄４实验试剂的配制１１２．２实验方法１２２．２．１特异性抗体抗体（ＳＰＪ）的设计与制备１２１２．２２双抗体夹知ＥＬＩＳＡ６．反应条件优化２．２．３双抗体夹瓜ＥＬＩＳＡ标准曲线绘制１６２．２．４夹记法与间接法ＥＬＩＳＡ比较１７．１７２．２５用双抗体夹瓜法检测蜂王浆新鲜度．２２．６数据分析１７２．３结果与分析１８２－．１ＭＲＪＰ１２１．３特异牲抗体ＳＰ的恃性及效价８２＇心法条件优化１９．３．２双抗体夹２．３．３双抗体夹记法测定ＭＲＪＰ１含量标准曲线２１ －ＥＬ白ＩＳＡ浙江大学硕±学位论文巧主蛋１特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和惨假蜂蜜巧技术研究２３／．４心法与夹々法比较２１．双抗体夹２３５＇。法检验蜂王浆新鲜度２４．．双抗体夹２４５－讨论２Ｓ－ＰＡＧＥ电ＲＪＰ１含量２７第王章基于ＳＤ泳技术的蜂蜜Ｍ测定３．１７材料、试剂与设备２３丄１２７实验材料３丄２实验试剂２７３丄３实验设备２８３丄４实验试剂的配制２８３２实验方法２８．３．２．１蜂蜜样品巧处理２８－３２２ＳＤＳＰＡＧＥ泳及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ２８．．电分析－３２３ＳＰＡＧＥ电２８．．播假蜂蜜ＳＤ沫分析－．２４ＤＰＡＧＥ电２９３．商品蜂蜜ＳＳ沫分析３．２５２９．数据分析３．３２９结果与分析－．３１ＰＡＧＥ电２９３．己知蜜源蜂蜜的ＳＤＳ咏检测结果３－．３．２ＳＤＳＰＡＧＥ电３０援假蜂蜜珠分析－３．ＳＤＳＰＡＧＥ电泳３２．３３未知蜂蜜分析３．４讨论３３第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测研究３４‘４．１材料、试剂与设备３４４丄１实验材料３４４丄２实验试剂及耗材３４４丄３实验设备３４４丄４实验试剂的配制３５４．２实验方法３５４．２．１蜂蜜样品预处理３５４．２Ｓ３５．２ＥＬＩＡ分析４２．３脱色蜂蜜ＭＲＪＰ％．１含量分析４２４３６．．蜂蜜人为惨假实验鉴定４．２．５商品蜂蜜样品真伪判别３６４．２．６数据分析３６４．３结果与讨论３６４．３．１用ＥＬＩＳＡ法分析蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量％４．３．２搂假蜂蜜的ＥＵＳＡ检测巧．品品的真伪判别３９４．３３商蜂蜜样４．４讨论４０第五章结论与展望４２ －ＥＬＩＳＡ浙江大学硕±学位论文用主蛋白１特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和惨假蜂蜜的技术巧究５１４２．本研究主要研究成果５．２主４２要创新点ｔ３研究展望４３参考文献４４Ｐ＃录４９５０作者简介及科研成果 －研究浙江大学硕去学位论文用主蛋白１特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和惨假蜂蜜的ＥＬＩＳＡ技术致谢！值此论文完成之际，我要由衷地向诸多老师和同学表达无法言喻的深深谢意没有、一他们在我学习、生活上给予的长期关记与支持，将不可能有我今天这值得铭记的时刻的到来！感谢导卿沈立荣教授在学习和研究过程中给予我的指导和关怀。本论文是在沈教授、，从论文的选题、实验操作到论文的撰写等各个方面的悉记指导下完成的实验构思，。、导师言传身教，付出了大量的柏血导师高瞻远瞩的科学视角对科学无私奉献的精神，Ｌ工作作。义及严谨热忱的风令我受益匪或，并将是我终身学习的榜样在此，对沈老师两年多来对我学习和生活的关怀与教育致Ｌ义最真擎的感谢和最崇高的敬意！在本课题的研究中，受到了许多老师和同学的关瓜和帮助。感谢浙江大学生工食品、学院的所有老师，在我研究生期间给予的帮助和支持。感谢实验室师兄师姐师弟师抹、、们在实验过程中给我的帮助。感谢柳丹丹师姐李玫雖师姐于张颖师姐在实验设计和、、实验方法上给我提出的宝贵建议，感谢辛晓辕擢量地里热臣、堪迪等同学在学习和、一生活上给我的帮助和关把。感谢同窗好友平曰里的关记、帮助和鼓励，给了我家般的温暖，在生活和精神上对我的支持和鼓励，让我学业和科研的完成上更加顺利。谢谢你一！们伴我度过了这段难忘的岁月，在此并向他们表示衷记的感谢和美好的祝愿感谢我的父母和家人对我在求学阶段的默默支持与关记，是他们给予了我最大的勇！气和毅力，使我在困难和挫折面前坚定信念，祝福他们健康如意＾１最后，向参加论文评阅、评议及答辩委员会的专家和教授们致义诚擊的谢意。王一然二零一五年十月于浙大紫金港Ｉ －ＥＬＩＳＡ浙江大学硕±学位论文用主蛋白１特异性多化检测蜂王浆新鲜度和捧假蜂蜜的技术研究摘要工蜂由头部营养腺、，蜂王浆是由（包括脑后腺咽下腺和上顯腺等）分泌的乳状物质ｌＭＲＪＰｌ）是它含有丰富的生物活性成分，具有多种生理活性和营养保健功能，主蛋白（含量最高的蛋白质组分，是蜂王浆的关键功能组分、。蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然巧物质。据Ｗ往研究报道，蜂蜜中含有蜜蜂自身分巧的ＭＲＪＰ１蛋白。本文通过研究，建立了采用ＭＲＪＰ１特异性抗体检测蜂王浆和蜂蜜中的ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测新方法，并通过对蜂王浆和蜂淫中的ＭＲＪＰ１含量分析，进行了产品质量鉴别。主要结果如下：１立双抗体夹知法ＥＬＩＡ检测ＭＲＪＰ１含量的新方法（）建ＳＳＰ－在原有ＭＲＪＰ１特异性多克隆抗体１的基础上，采用根据ＭＲＪＰ１蛋白序列新设计ＪＰ１－－的ＭＲ特异性多肢，制备了新的特异性多克隆抗体ＳＰ２，对ＳＰ２添加了辣根过氧化酶ＨＲＰ－－２－－－ＳＰ。，ＳＰ１，Ｗ，标记（）然后为捕获抗体酶标抗体ＨＲＰＳＰ２为检测抗体建立了双抗体夹瓜ＥＬＩＳＡ检测方法。经对双抗体夹瓜每步反应作条件优化，得到最佳反应°‘’Ｃ反ＣＣ反条件：包被捕获抗体，３７应２ｈ５％，４，４；脱脂巧粉封闭过夜；加入抗原’°应过夜；加入酶标抗体，３７Ｃ反应２ｈ；加入ＴＭＢ显色液，３７Ｃ反应１５ｍｉｎ。２ＥＬＩＳＡ（）间接法和夹瓜法检测方法优势比较ＩＭＲＪＰ１含量比较、采用间接法和夹心法ＥＬＩＳＡ分别进行了，包括：检测范围重复性、－－精确度。结果表明：间接法检测范围为１５．５帖／ｍＬ，样品回收率在７７．９６％１７８．９７％，变－记法检测范围在２－２１．．１０Ｌ其系数在．２２％９３９％；双杭体夹５帖／ｍ，样品回收率在－－９２１．７，２．７５％１．４。，，．７４％００２％变异系数２％表明相对于间接法化ＩＳＡ夹也法具有准确度高、重复性好，能满足快速检测条件的化点。３ＥＬＩＳＡ（）双抗体夹记法检测蜂王浆新鲜度’建立了用双抗体夹瓜ＥＬＩＳＡ检测蜂王浆新鲜度的方法。将新鲜蜂王浆置于４０Ｃ下放置０、７、１４、＊、２１、２８３５ｄ后，然后双抗体夹公ＥＬＩＳＡ法分别检测不同处理时间样品的Ｓ－ＰＡＧＥ电泳结果作对比验证ＭＲＪＰ１降解程度，并与间接法法ＥＵＳＡ和ＳＤ。结果显示，‘鲜王浆中ＭＲＪＰ１在４０Ｃ下储存后明显除解，且与保温时间成正相关。４ＪＰ－１ＳＰＡＧＥ电泳检测（）蜂蜜中ＭＲ含量的ＳＤＩＩ －１特异性多抗检测巧王浆新鲜度和惨假蜂蜜巧ＥＬ浙江大学硕±学位论文用主蛋白ＩＳＡ技术研究ＳＤＳ－ＰＡ畑电泳实验对蜂蜜祥品进行，用ＩｍａｇｅＪ软件分析ＭＲＪＰ１电泳条带灰度，Ｗ一ＭＲＰＭＲＪＰ１１定浓度的标准品为指示蛋白，佑算蜂蜜中Ｊ含量。在洋槐蜜中按比例加入玉米糖浆－，分析ＳＤＳＰＡＧＥ电泳条，电泳条带灰度比与理论值接近带灰度，结果表明用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电涂分析鉴定己知蜜的真伪具有可行性。分析了１０个未知蜜源的商品蜂蜜样品，根据电泳条带预判真伪，显示５个样品为真蜂蜜、２个属惨假蜂蜜、３个属可能援假蜂蜜。５ＲＪＰ１ＥＬＩＳＡ（）蜂蜜中Ｍ含量的检测分别对６种己知蜜进行间接法和夹瓜法ＥＬＩＳＡ分析，同时对蜂蜜进行脱包处理，验证蜂蜜颜包对结果的影响，结果表明浅色蜜用间接ＥＬＩＳＡ法可不经脱色处理，深色蜜用间接ＥＬＩＳＡ法需经脱色处理，采用双抗体夹瓜法可省略脱色过程，结果较准确。（６品蜂蜜真伪的ＥＬＩＳＡ检测）渗假蜂壁和商ＬＳ在洋槐蜜中按叱例惨入玉米糖浆，再用双抗体夹记ＥＩＡ法检测惨假洋槐蜜中的ＭＲＪＰ１含量。结果表明，洋槐蜜中玉米糖浆含量与ＭＲＪＰ１含量成负相关Ｓ，证实ＥＬＩＡ法鉴别惨假蜂蜜可行。在此基础上，对来自澳口市场的１０个未知蜂蜜样品进行了ＥＬＩＳＡ检ｉ－巧，ＳＤＳＰＡ畑电。ｊ并与泳结果进行了比较结果显示，两种检测方法的结果比较类似。ＪＰ－关键词ＭＲ１，ＥＬＩＳＡ，ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，蜂王浆，新鲜度，蜂蜜，惨假ＩＩＩ 白－ＥＵＳ浙江大学硕±学位论文用主蛋１特异性《抗检测蜂王浆新鲜度和惨假蜂蜜的Ａ技术研究ＡｂｓｔｒａｃｔＲｏａｌｅｌｌＪｉｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｔｈｅｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌａｎｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｂａｃｋｏｆｔｈｅｈｅａｄｌａｎｄｓｙｊｙ（Ｒ）ｙｇ（ｇｇ，ｌａｎｄｓａｎｄｍａ打ｄ化ｕｌａｒｌａｎｄｓｗａｌｌｏｗｅｔｃ．ｏｆｗｏｒｋｅｒｂｅｅｈｅａｄ．Ｔｈｅｍｉｌｋｓｕｂｓｔａｎｃｅｉｓｒｉｃｈｉｎｇｇ，）ｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，ａｎｄｈａｓａｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｍａｊｏｒｒｏｙａｌｊｅｌｌｙｒｏ１ｉ１ＭＲＪＰｌ）ｔｈｔｔ化ｉｎｔｉｋｆｕｔｉｌｔＲＪ．；ｅｎ（ｅｍｏｓａｂｕｎｄａｎｒｏｃｏｍｏｎｅｎｓａｅｎｃｏｎａｃｏｍｏｎｅｎｏｆｐ，ｐｐ，ｙｐＨｏｎｅｙｉｓａｋｉｎｄｏｆ打ａｔｕｒａｌｓｗｅｅｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｂｒｅｗｅｄｗｉｔｈｈｏｎｅｙｄｅｗｏｆｐｌａｎｔｓｃｏｌｌｅｃｔｂｙｈｏ打ｅｙｂｅｅｓ，ａｎｄｂｏｕｎｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏ打ｓｆｒｏｍｈｏ打ｅｙｂｅｅｓ．ＭＲＪＰｌｅｘｉｓｔｓａｌｓｏｉｎｈｏｎｅｙ．了ｈｉｓ－ｓｔｕｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＭＲＪＰｌｉｎＲＪａｎｄｈｏｎｅｂｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｓａｎｄｗｉｃｈｙｙｙｙＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｂｌｌｏｗｓ：１．ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｄｅｔｅｃｔｉｎｇＭＲＪＰｌｃｏｎｔｅｎｔＡｓｅｃ－ｐｉｆｉｃｐｏｌｙｃｌｏｎｅａｎｔｉｂｏｄｙｏｆＭＲＪＰｌＳＰ２ｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔ：ｈａｎａｎｎｏｕｎｃｅｄ（）－ｈ．Ａｃｅｍｉｃａｌｌｓｎｔｉｈｅｓｉｚｅｄｏｌｅｔｉｄｅａｎｄｌａｂｅｌｅｄｗｉ１：ｈｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｅｒｏｘｉｄｅｓＰｐｙｐｐ，ｙｙｐ（ＨＲ）－ｗａｂ－ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｓｅｓｔａｌｉｓｈｅｄｗｉｌ；ｈａｎｏ也ｅｒｏｌｃｌｏｎｅａｎｔｉｂｏｄＳＰ１ｙｐｙｙ＊化－－ｅ巧ａｂ．ｌｉｓｈｅｄｉｅｖｉｏｕｓｌａｓｃａ１：ｕｒｅａｎｔｏｄａ打ｄＨＲＰＳＰ２ａｓｄｅｔｅｃｔｉｎａｎｄｂｏｄＴｈｅｂｅｓｔ（ｐｙ）ｐｙｇｙ°ｄ－ＣＯ打ｉｔｉｏｎｓｆｏｒｅａｃｈｓｔｅｗｅｒｅＳＰ１ａｔ３７Ｃｆｏｒ２ｈｂｌｏｃｋｉｎｉｔｈ５％ｓｋｉｍｍｉｌｋ：ｃｏａｄ打ｗｐｇ，ｇ°°＂ｉｈｔａｔ４ＣｔｉｎａｎｔＣ－－Ｃｏｖｅｒｎｃｏａｉｅｎｏｖｅｒｎｉｈｔａｔ４ｃｏａｔｉｎＨＲＰＳＰ２ａｔ３７ｆｏｒ２ｈ．，ｇ，ｇｇｇ呂－２．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡａｎｄｔｈｅｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｈｅ＊ＴｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭ民ＪＰｌｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄａｎ过ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｎｒａｎｅｒｅｅａｔａｂｉｌｉｔａｃｃｕｒａｃｏｆｔｈｅｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｏｍａｒｅｄ．，ｇｇ，ｐｙ，ｙｐＴｈｌｔｆｏ－ｅｒｅｓｕｓｗｅｒｅａｓｌｌｏｗｓｔｈｄｔｔｉｍｔｈｌ５．５／ｍＬａｎｄ：ｅｅｅｃｎｇｒａｎｇｅｏｆｅａｃｈｅｏｄｓｗｅｒｅｉ｜ｇ＊２－ｍＬ－－．５１０ｉ／ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｒａｔｅｗｅｉｅ７７．９６％１７８．９７ａｎｄ９２．７４％１００．７２％ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆ％；；ｙ｜ｇ〇〇〇＂－－ｖａｒｉａｔｉｏｎｗｅｒｅ２．２２１９３９／〇ａｎｄ２．７５／＾）１２．４／．Ｔｈｅｒｅｓｌｔｓｓｈｏｉｈｅａｃａｎｄ％．〇ｕｗｅｄａｈｇｒａｃｃｕｉｙｒｅｅａｔａｂｉｌｉｔｏｆｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄａｎｄａ技ｓｔｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄ．ｐｙ３．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｓｈ打ｅｓｓｏｆｒｏｙａｌｊｅｌｌｙｂｙｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ八ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｆｒｅｓｈｎｅｓｓｏｆＲＪｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｆｒｅｓｈｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｐ°ｔｏＣ＊＇ｓｒｅｄ０７１４２１２８ａｎｄ３５ｄａｓｕｎｄｅｒ４０，ｉｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．ＴｈｅｄＩａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＭ民ＪＰｌｏｆ，，，，ｙｐｙ巧１：ｈｅ６ＲＪｓａｍｐｌｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔ：ｅｄ．Ｔｈｅｎ忱ｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ，ｉｎｄｉｒｅｃｔＳＳＳ－ＥＬＩＡａｎｄＤＰＡＧＥａｎａｌｓｉｓｗｅｒｅｃｏｍａｒｅｄａｎｄｖａｌｉｄａｔｅｄｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｉｔｗａｓｒｏｖｅｄｙｐ，ｐｙｐ化＊ａｔＭＲＪＰｌｄｅｒａｄｅｄｕｒｉｎｓｔｏｉａｅａｎｄｄｅｒａｄａｔｉｏ打ｒａｔｅｓｏｆ民Ｊｗａｓｏｓｉｔｉｖｅｌａｓｓｏｃｉｅａｔｅｄｗｉｔｈｇｇｇ，ｇｐｙ化ｅｓｔｏｒａｅｄａｓ．ｇｙＩＶ －浙江大学硕古学位沦文用主蛋白１特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和＃假蜂蜜的ＥＬＩＳＡ技术研究化£ＭＲＪＰ１ｃｏｎ化ｎｔ－４ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｉｎｈｏｎｅｗｉｔｈＳＤＳＰＡＧＥ．ｆｙＴｈＭ民ＪＰｌｔｔ－ｅｃｏｎｅｎｉｎｈｏｎｅｗａｓｍｅｓｕｒｅｄｂＳＤＳＰＡＧＥａｎｄｌｈｌｌｙｙ；ｅｇｒａｙｓｃａｅｖａｕｅｓｗ巧ｅａｎａｌｚｅｄｂＩｍａｅＪｒｏｒａｍ．Ｕｓｉｎ化ｅｕｒｉｆｉｅｄＭＲＪＰｌａｓｌ：ｈｅｓｔａｎｄａｒｄｏｒｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｙｙｇｐｇｇｐｐ，ＭＲＪＰｌｃｏｎｔｅｎｔ．ｉｎｈｏｎｅｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄ．Ｃｏｍｓｒｕｗａｓｍｉｘｅｄｗｉｔｈａｃａｃｉａｈｏｎｅｎｒｏｏｒｔｉｏ打ｙｙｐｙｉｐｐＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｔｒｏｏｅｓｉｓａｎａｌｓｓｏｓｅｔｔｔｈｅｓｃａｅｖａｕｅｓｗｅｒｅｓｔｔｈｌｅｃｐｈｒｙｉｆｈｏｗｄｈａｇｒａｙｌｌｃｏｎｓｉｅｄｗｉｄｉｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｔｈｅＭＲＪＰｌｃｏｎｔｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈｉｓｍｅｌ：ｈｏｄｔｏｉｄｅ打ｔｉｆｙａ山ｈｅ打ｔｉｃｉｔｙｉｌ．Ａｎａｉｌ１ｌｈｌｏｆｈｏｎｅｙｋｎｏｗｎｎｅｃｔａｒｓｏｕｒｃｅｓｉｓｆｅａｓｂｅｌｙｓｓｒｅｓｕｓｏｆ０ｃｏｍｍｅｒｃｉａｏｎｅｙｓａｍｐｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ５ｓａｍｐｌｓａｒｅｒｅａｌｈｏｎｅｙ，２ｓａｍｐｌｅｓａｒｅｆａｋｅａｎｄ３ｓａｍｐｌｅｓｍｉｇｈｔｂｅｆａｋｅ．５ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭＲＪＰｌｃｏＭｅｎｔｉｎｈｏｎｅｉＳＡ．ｙｗ化ＥＬＩＴｈｅｃｏｎｋｎｔｓｏｆＭＲＪＰｌｉｎ６ｈｏｎｅｙｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｅ１：ｅｃｔ：ｅｄｗｉｔｈｂｏ化ｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡａｎｄｄｗ化＊ｓａ打ｉｃｈＥＬＩＳＡＩｉｆｉｍｌｈｅｌｉｈｌｌ．打ｏｒｄｅｒ化ｖｅｒｅａｃｔｏｆｃｏｏｒｌ：ｄｅｃｏｏｒｚｅｄｏｎｅｓａｍｅｗｅｉｅａｓｏｙ，ｐｙｐ－－ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ化ａｔｌｉｈｔｃｏｈｈｏｕｌｄ打ｏｌｈｏｕｌｄｌｏｒｅｏｎｅｓｔｄａｒｋｃｏｏｒｅｄｈｏｎｅｓｂｅｇｙ，ｙｄｅｃｏ．ｉｈｆｅｃｌｏｒｉｚｅｄｆｏｒｉ打ｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡＨｏｗｅｖｅｒｓａ打ｄｗｃｈＥＬＩＳＡｗａｓｌｉｔｌｉｎｔｅｄｂｈｏｎｅｃｏｌｏｒ，ｇｙｙｙａｎｄｓｈｏｗｅｄａｈｉｇｈｅｒａｃｃｕｒａｃｙ．６Ａｕｔｅｎｔｉｃｉｔｉｄｅｎｔｃａｔｏｎｏｆｏｎｅｗｉ化ＥＬＩＡ．ｈｙｉｆｉｉｈｙＳＣｏｍｓｙｒｕｐｗａｓａｄｄｅｄｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｌｙｔｏａｃａｃｉａｈｏ打ｅｙ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅ打ｔｓｏｆＭ民ＪＰｌｉｎｈｏ打ｅｙｗｅｒｅ比ｅｎｄｅｔｅｃ化ｄｗｉｔｈｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ化ｅＭ民ＪＰｌｃｏｎ化ｎｔｉｎｈｏｎｒｙｗａｓｎｅａｔｉｖｅｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔ：ｈｅｐｒｏｏｒｔｉｏｎｏｆｃｏｍｓｒｕｉｎｈｏｎｅｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｇｙｐｙｐｙ，ＥＬＩＳＡｔｏｉｄｅｎｔｉｆａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄｈｏｎｅｉｓｆｅａｓｉｂｌｅ．ＴｈｅａｎａｌｓｉｓｏｆＭＲＪＰｌｃｏｎｂｎｔｓｏ打１０ｙｙｙｃｏｍｍｅｒｃ－ｉａｌｈｏｎｅｓａｍｐｌｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｒｅｓｕｌｔｆｂｒｍＳＤＳＰＡＧＥｉｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｌ：ｈａｔｙｆｒｏｍｓａｎｄｗｈＥＬＳＡ．ｉｃＩｒｓＭＲＪＰｌＳＤＳ－ＰＡＧＥＥＬＩＳＡ民ｌＫ巧ｗｏｄｏｙａＪｅｌｌＦｒｅｓｈｎ巧ｓＨｏｎｅＡｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔ，，，ｙ，，ｙ，ｙＶ 浙江大学硕±学位论文第一章绪论第一章绪论蜂王浆和蜂蜜是两种深受欢迎蜂产品，蜂王浆（民ｏｙａｌＪｅｌｌｙ，ＲＪ），又称王浆和蜂乳，￣曰是５１５龄工蜂由头部营养腺、咽下腺和上朝腺等）分泌的特殊白色乳状（包括脑后腺。蜂王浆是蜂王和３日龄内工蜂幼虫的专用食料物质，同时也是蜂王区别于工蜂的关键一食物，是种天然营养保健品方国损等１９９４，主。（，）蜂王浆功能众多要与其所含的生物２－－￣活性成分有关。其主要成分包括蛋白质（１１５％）、碳水化合物（１０１６％）、脂类（３￣６、．４２％）Ｗ固醇激素、维生素％）王浆酸（１及类、游离氨基酸等成分Ｒａｍａｄａｎｅｔ吐（１２０。巧、蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜分巧物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。我国是蜂蜜生产和出口大国，２０１２年产量达到４５．１６万吨，占世界蜂蜜口。总产量的１／４，２０１３年出１２５，占。蜂蜜．万屯世界蜂蜜贸易量的１／４蜂蜜搂假的主要手段是加入糖浆冒充蜂蜜，严重影响了蜂产品行业秩序，侵化了消费者的权益。－－－－１０楚基２癸滿酸（王浆酸，１０ＨＡＤ）是蜂王浆所特有的成分，具有抗菌、增强免疫－力等生物活性，１０ＨＤＡ含量是目前我国和国际标准中衡量蜂王浆品质的主要指标。但有研究显示－ＨＤＡ１－，在长期储存过程中，蜂王浆种的１０含量非常稳定，０ＨＤＡ不能作为指示蜂王浆新鲜度的指标（Ａｎｔｉｎｅｌｌｉ等２００３，ＭＲＪＰＨＫａｍａｋｕｒａ，）代表王浆新鲜度的主要是，２０１１）。但迄今为止，各国学者先后采用光谱技术等进行了蜂王浆新鲜度评价，用同位素比。李法检测蜂蜜真伪的研究但所用仪器昂贵，方法复杂，准确度不高。为此，我们建立的用ＭＲＪＰ１特异性抗体ＥＬＩＳＡ检测蜂王浆新弊度等新方法研究Ｓｈｅｎｅｔａｌ２０１５），（，并发展了用ＭＲＪＰｌ特异性抗体ＥＬＩＳＡ检测蜂楼假蜂蜜的新方法。１．１蜂王浆中关键蛋白ＭＲＪＰ１的功能蜂王浆中水溶性蛋白，即王浆主蛋白（Ｍａｏｒ民ｏｙａｌＪｅｌｌｙＰｒｏ化ｉｎｓ，ＭＲＪＰｓ）占鲜王浆ｊ一４６％－８９％ＪＰＪＰ－９中总蛋白质的。目前已知ＭＲｓ属于同家族，共有九种蛋白（ＭＲｌ），－ＤＲＪＰＭＲＪＰ分子量为４９８７ｋａ。其中Ｍｌ是含量最为丰富的蛋白，占ｓ的５０％左右。Ｋ一ａｍａｋｕｒａ于２０１１年在《Ｎａｔｕｒｅ》首次报道，蜂王浆中种５７ｋＤａ蛋白（即ＭＲＪＰ１）是蜜蜂幼虫发育成蜂王的关键活性成分ａｍａｋｕｒａ２０１１。（Ｋ，）１ 浙江大学硕±学位论文第一章绪论Ｋａｍａｋｕｒａ（２０１１）发现，ＭＲＪＰ１随温度和时间的増加会明显降解。他利用ＭＲＪＰｓ对温’Ｃ度敏感的特性，将在４０下储存７、１４、２１、３０ｄ的鲜王浆分别喂养西方蜜蜂（４口ｋ°ｗｅ化ｅｍ４０Ｃ７－王／）幼虫，结果只有鲜王浆喂养的幼虫发育成为蜂王，在下储存３０ｄ的’’Ｃ浆会减慢幼虫生长发育，经４０Ｃ储存３０ｄ的王浆喂养的幼虫最终发育成工蜂。而在４０３０ｄＪＰ、储存的王浆中加入ＭＲ１可Ｋ缩短发育时间谱加羽化成虫体重和巧棠体积，且增加的程度与加入的ＭＲＪＰ１含量成正比。当加入２％ＭＲＪＰ１时，四龄幼虫可发育成蜂王。ＪＰ１。Ｋ这证明ＭＲ是决定蜜蜂级型分化的决定性因子同时，ａｍａｋｕｒａ对果裙进行对比实验，、结果用王浆喂养的果蛇与用酪蛋白和普通饲料喂养的果蜡相比，繁殖能力强个体大、寿命长、发育时间短，这证明ＭＲＪＰ１对生物特征的影响是跨物种的。，ＭＲＪＰ、、。多项研究显示１具有抗疲劳促细胞分裂抗癌、降低胆固醇等功能Ｋａｍａｋｕｒａ等对蜂王浆改善小鼠运动后生理疲劳进行了组分与功能关系分析，确定蜂王浆对小鼠的抗疲劳作用与王浆新鲜度有关，其功能随ＭＲＪＰ１降解而降化（Ｋａｍａｋｕｒａｅｔａｌ，２００１）。随后对原代培养的大鼠巧细胞的生理研究影响发现，ＭＲＪＰｌ能显著刺激巧细胞ＤＮＡ合成，其促细胞分裂活力具有剂量效应（Ｋａｍａｋｕｒａｅｔａｌ，２００２）。很多研究表明，ＭＲＪＰ１在无血清下可＾乂促进细胞分製，是促细胞分裂因子，可Ｌ义用于开发无血清细胞培２００８－ｅｌｉｖＲＪＰ１养技术巧ｉｒｅｎｅｔＳａｌａｚａｒＯｏｅｔ２００５。礼；礼）在大肠杆菌中重组表达的Ｍ具有促进晶吞嗤细胞釋放肿瘤细胞坏死因子ＴＮＦａ，提高肝细胞增殖作用，在有充足血清的煤介中能刺激人淋巴细胞生长（Ｍａｊｔａｎｅｔ吐２００６）。Ｋａｓｈｉｍａ发现ＭＲＪＰ１与胆汁酸、牛黄胆ＪＰ酸结合能力强，在与酪蛋白作对比的实验中显示，ＭＲ１可明显增加大鼠肝脏胆汁酸水－３Ｋｉｍａｅｔａｌ２０１４。平，与降血脂药物谷绘醇相比降血脂效果更明显（ａｓｈ，）（１．２当前蜂王浆庇质评价与新鲜度检测指标及方法１．２．１基于美拉德反应产物的检测、、蜂王浆在储存过程中会发生褐变，表现为黏度增大颜龟变深蛋白质降解等，影－－－－化。５５ｈｄｒｏｘｍｅｔｈｌ２ｒａｌｄｅｈｄｅ响了蜂王浆产品的质量和营养价值碁甲基綠藤，（ｙｙｙｙ－－－－以赖氨酸是两种美拉德反应的重要中间产物巧血ｅＨＭＦ）和ＳＮ２吹喃甲基ｒｓｄｏｂｌｅｒｅｔａｌ，２００７；Ｌｏｃａｓｅｔａｌ，２００８），在食品质量检测中作为检测褐变程度的指标（Ｍｏｒａｌｅｓｅｔａｌ，２００９．）２ 浙江大学硕ｉ学位论文第一章绪论目前５名甲基祿醒常作为蜂蜜（ｄｅＲｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔ吐２００４；Ｖｉｎａｓｅｔａｌ，１９９２）、果汁（郭善一广等２０１０、乳制品李志军等２０１２，近年来也作为中药、，）（，）等食品新绛度的项主要指标之一２００８２００５在国内受到关注（了霞等。Ｃｉｕ山中药复方等活性指标，；耿放等，）等建立了反向高效液相色谱法－ＨＰＬＣ）－（ＲＰ检测蜂王浆中５楚甲基慷醇含量，并发现新鲜蜂王浆和‘－＝‘ｉ４５－Ｃ储存的蜂王浆中楚甲基樣酪含量低于检出限（ＬＯＤ０．１３ｋ）Ｃｌｔａ２０１３，ｍｉｕｕｅｌｇｇ（，）一－经过进步研究发现，在室温条件下蜂王浆中的５楚甲基穗酪含量随储存时间递増（Ｃｉｕｌｕｅｔ吐２０１５），因此其建议ＨＭＦ含量可Ｌ义作为检测蜂王浆新鲜度的指标。－－－ｅＮ２－心赖氨酸ｆｔ吹喃甲基（ｉｒｏｓｉｎｅ，鞭氨酸）是美拉德反应前期评价食品营养损失程度的重要化合物，作为检验食品品质巧指标己有４０余年巧ｒｂｅｒｓｄｏｂｌｅｒｅｔａｌ２００７，目前广，）应用于检验乳制品许国庆等２０１４、蛋类Ｈｉｄａｌｏｅｔ２００６，（，）（ｇ吐）等食物品质的常用指标２００４年国际标准化纽织（ＩＳＯ）正式认定采用寓子对反相高效液相包谱法测定乳和乳制品中扣ｒｏｓｉｎｅ含量（２００４。Ｍａｒｃｏｎｉ分析了１０餘市售进口蜂王浆样品（ＣＲＪ）和５化蜂农直）采的新鲜蜂王浆样品（ＦＲＪ）的ｆｉｉｒｏｓｉｎｅ含量（ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｔｅｉｎ）和蛋白质含量（％ｗｂ），ＦＲＪｆｌｉｒｏｓｎｅ．７ｌｒｏｔｅｉｎ，４６６ｍ／ｌｒｏｔｅｉｎ，中ｉ平均含量为４１ｍｇ／ＯＯｇｐ其中最高为．ｇＯＯｇｐ最低为３７．１ｍ／ｌＯＯｒｏｔｅｉｎ；ＣＲＪ中化ｒｏｓｉｎｅ平均含量为７３．６ｍ／ｌＯＯｒｏｔｅｉｎ，其中最高为ｇｇｐｇｇｐ１１３±１．２３ｍｌｒｏｔｅｎ，最低为４７．３ｍ１００ｒｏｔｅｎ。ＦＲＪ中化ｒｏｓｎｅ．３ｇ／ＯＯｇｐｉｇ／ｇｐｉｉ含量显著低于’ＣＲＪ中的含量，可能是由储存时间和／或墙存条件所致。将蜂王浆分别置于４Ｃ和室温条１０ｏｓｎｅ含，ｉ件下保存个月，扣ｒｉ量均随时间延长而增加室温条件保存的蜂王浆中扣ｒｏｓｎｅ°＇Ｃ保存的样品认为扣１＾含量增加程度远大于４１０５１１６等，因此其；可义作为评价蜂王浆新鲜度Ｍａｒｃｏｎｉｅｔ２００２的指标。Ｍｅｓｓｉａ等研究了冻干蜂王浆的稳定性吐），发现将蜂王浆冻干保（ｉｎ存并不能有效减缓美拉德反应进程，化ｒｏｓｅ含量增加的程度远高于新鲜蜂王浆，冻干蜂王浆中由２４．６ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｔｅｉｎ（初始）增加为２２０．５ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｔｅｉｎ（１个月后），至第１４４．４ｍ／１００ｒｏｔｅｉｎ王浆中由１ｍ／１ｒｏｔｅｉｎ）１８个月增加至０ｇｇｐ，而新鲜蜂８．０ｇ００ｇｐ（初始増加力４５．０ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｔｅｉｎ（１个月后）和４８７．４ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏ化ｉｎ（１８个月后）。同时还发ｉａｔ２００５Ｗｔｒ－ＭＭｅｓｓｅｉＬＣ现。ｃｈｏｗｓｋＳ，蜂王浆的褐变是在王台中就开始的（吐）ｙｙ等利用＂ｒｏｓｎｅ－测蜂王浆中扣１Ｃ建立了检ｉ含量的方法，并比较分析了５５份分别储存于８和°°°＋Ｃ的品－２／＋５，１８Ｃ下扣ｒｏｓｉｎｅ含量较稳定＋２＋５Ｃ下由２．１ｍ蜂王浆样，／０ｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｈｉｎ（初始）増加为４１．３ｍｇ／ｌＯＯｇｐｒｏｔｅｉｎ（Ｗｙｔｒｙｃｈｏｗｓｋｉｅｔａｌ，２０１４）。３ 浙江大学硕±学位论文第一章绪论１．２．２基于蛋白质结构与含量的检测－蛋白质是蜂王浆中的主要活性物质，占王浆干重的３０％５０％，在储存过程中，蜂王浆中的蛋白质随时间降解，引起蛋白质结构的改变和含量的下降。ＦＴ化）二傳里叶变换红外光谱法（是研究蛋白质级结构的有效方法，具有样本量小、无需试剂、无损、、准确等优点，目前广泛应用于动植物及其产品的鉴别（洪庆红等快速，２００５；毛晓丽等，２０１１；孙素琴等，１９９９；赵贤德等，２０１４。拉曼光谱分析（Ｒａｍａｎｓｅｃｔｒａ））ｐ可Ｗ在定性分析被测物质成分的化学结构及化学键变化的同时定量检测食品中某些成分、、、的含量，具有无报无需预处理、灵敏度高，、快速的特点在分析化学药学食品科学等领域得到了广泛应用陈健等，２００７；郭世语等，２０１３；朱科学等，２００９。吴黎明等利（）用ＦＴ化研究了蜂王浆在储藏过程中蛋白质二级结构的变化，发现在储存期间，蜂王浆中ａ－曝旋结构减少－－－蛋白质的，Ｐ折叠结构增加，且ａ螺旋结构减少的程度与Ｐ折叠结构増°°°’一２８－加的程度基本致，蛋白质结构变化受温度影响Ｃ＞１６Ｃ＞４Ｃ＞１８Ｃ，在２８Ｃ‘’’Ｃ下Ｃ－Ｃ和６４１８，同Ｉ１的变化程度显著离于和时发现蜂王浆储藏中醜胺带即蛋白质－－４７ｉｉ４、基团的变化是整个谱图中最大的，蜂王浆红外光谱的１６ｃｍ与其他个峰１５４１ｃｍ－－－ｉｉｉ１４０９ｃｍ、１２４７ｃｍ、１０５４ｃｍ的相对峰强与储存时间存在良好的线性关系黎明等巧，－－２０ｉｉ０９ａ２００９ｂｔｉｌｉｓ４吴黎明等。Ｔａｒａｎ５５ｃｍ５６ｃｍ，）等发现蜂王浆红外光谱的１与化相对；－４－峰强可Ｗ反映储存过程中蛋白质的降解程度，同时发现蜂王浆在Ｃ和２０Ｃ下最多可储存７周和２１周，在室温下蛋白质的稳定性可维持３ｄ（Ｔａｒａｎｔｉｌｉｓｅｔａｌ，２０１２）。、毛细管凝胶也泳（ＣＧＥ）具有高分辨率、快速、高效等特点，非常适合分析分离ＤＮＡ、蛋白质等大分子物质、，在药学、临床医学生命科学等领域作为分析手段得到了广《的应用连冬生等２０１０２００５２０１２。ＣＧＥ；；赵丽媛等（，张鬼等，，）吴亚君等利用对不同储存温度下蜂王浆中水溶性蛋白质进行了分离测定，在２０个蛋白质组分中，６号峰和１８一Ｌ号峰反位的样品指征与主成分分析结果致，认为这２个蛋白组分可义作为蜂王浆新鲜一２１度的指示峰，但该实验并没有进步对这个蛋白组分进行鉴定（吴亚君等２０３。，）研究发现、，蜂王浆中的多种蛋白质在储存过程中会随时间降解，其中ＭＲＪＰ１Ｍ民ＪＰ４、ＭＲＪＰ５等蛋白质均可作为检测蜂王浆新鲜度的指标红城等２００７Ｋａｍａｋｕｒａｅｔ（张，；一－ａｌ２００１Ｌｉｅｔａｌ２００８Ｚｈａｏｅｔａｌ２０Ｂ。ＰＡＧＥ法，但此方；，；般最常用的检测手段为ＳＤＳ，，）法不具有特异性，因此需开发可识别各种蛋白的特异性的方法。沈立荣等通过分析比对一ＪＰ１蜂王浆主蛋白家族成员的氨基酸序列，设计了种对ＭＲ具有特异性的抗体，可用于４ 浙江大学硕ｉ学位论文第一章绪论ＭＲＪＰ１特异性检测，建立了酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）测定ＭＲＪＰ１含量的方法，并ＲＪＰ一１ｔ２０１５用此方法分析Ｍ随时间的降解程度，结果与之前各研究结果致（Ｓｈｅｎｅａｌ。，）Ｙｃｈ１＾ａｍａｕｉ等设计的ＭＲＪＰｌ特异性抗体特异性较好，同样可乂作为快速检测蜂王浆新鲜ｇ度的特异性指标（Ｙａｍａｇｕ化ｉｅｔ吐２０１３）。１．２．３基于其他物质的检测蜂王浆中含有２０余种游离氨基酸，张娟等分析了蜂王浆中２１种游离氨基酸含量在不°－同温度下储存随时间的变化，在室温储存时苏氨酸含量减少最多２０Ｃ时苏；在氨酸含°－Ｃ量变化最大；甲硫氨酸和组氨酸在２０是含量较稳定，室温下至第５２．５％１天分别下降１１７４％，３０．５００％，Ｌ和．至第天分别下降乃％和４．因化推测甲琉氨酸和组氨酸含量可乂作为蜂王浆新鲜度的指标（张媚等２００８。，）Ｓ攝酸腺苦（ＡＴＰ）、二攝暖腺苦（ＡＤＰ）和单蹲酸腺普（ＡＭＰ）是蜂王浆中的微量组分（ＸｕｅＸＦ等，２００９）。通过分析蜂王浆中ＡＴＰ及其代谢产物的水平发现，蜂王浆中的ＡＴＰ随储存时间代谢途径与其他生物组织和食物中相似，代谢路径依次为ＡＴＰ、ＡＤＰ、ａｍｐ、肌普（ＨｘＰ）、次黄谭吟（化），、单游酸肌昔（ＩＭＰ）其中Ｈｘ在新鲜蜂王浆中未检出，因此ＡＴＰ及其代谢产物的水平可ａ作为检测蜂王浆新鲜度的指标（ＺｈｏｕＬ等，２０２ＷＡ）Ａ）Ｌ、Ｈ、、１）。ｕ等又增加了腺苦（ｏ和腺噪吟（ｊ作为研究指标，提出ＸＨｘＲｘＡｏＡｉ之和与所有指标之和的比例（Ｆ值）作为蜂王浆新鲜度的标准，研究发现，Ｆ值与化ｒｏｓｉｎｅ含量、储存时间和储存温度均存在良好的线性关系，可利用Ｆ值推算在不同储存条件下蜂王浆的生化年龄（Ｗｕｅｔａｌ，２０１５）。魏文挺（魏文挺，２０１４）发现蜂王浆与盐酸的显色反应可Ｗ反应蜂王浆的新鲜度，显色＊＊ｌＯｍｉｎ内颜色肉暇即可分辨，用：Ｕｂ包度系统表示颜包数据，根据因数ａ和ｂ可将蜂王一。浆的新鲜度进行分级，此方法对单蜜源的蜂王浆枪测更显著、现有检测方法普遍所用设备昂贵操作复杂，需要专业人员操作、分析，因此亟需一、种简单快速的检测方法。１．３蜂蜜品质评价与渗假鉴定＂ＧＨ／Ｔ１８７９６－２０１２《》根据中华人民共和国行业标准蜂蜜对于蜂蜜真实性的描述，蜂’’Ｌ蜜中不得添加任何当前明确或不明确的添加物；如果在蜂蜜中添加其它物质乂蜂蜜，不应５ 浙江大学硕击学位论文第一章绪论’’－４植物ＢＴ１．１或蜜作为产品名称或名称主词；碳糖含量采用Ｇ／８９３２的方法试验时，试验＂－４结果Ｘ植物糖的百分含量不得大于７。２０１２由于蜂蜜棱假对人体的危害程（蜂蜜中碳）（）Ｌ度低，难义引起社会的重视，而且蜂蜜惨假成本低廉，不法商贩Ｗ此牟得利益，严重扰乱了市场秩序。、玉米糖浆、最常见巧蜂蜜惨假方式是加入果葡糖浆甜菜糖浆等，尤其用大米糖浆＾１ＬＸ检测勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风味亮全可乂通过欧盟标准，难。１３．１稳定性碳同位素比率法检测技术一稳定性碳同位素比值是指在某物质中碳的两种同位素的比值，由于Ｃ３植物和Ｃ４一植物的殘循环途径不同，造成植物中２（Ｓ１Ｃ）不同，，６Ｃ１３Ｃ／１Ｃ３般情况下Ｃ２植物１３〇〇－２８…２２－２０？为／〇。／〇〇，Ｃ４植物的ＳＢＣ方％。１０％〇。所有的蜜源植物都属于Ｃ３植物，玉米、Ｃ４－、Ｃ３植ＧＨ／Ｔ１８２０２《甘薦等是植物，甜菜大米是物。行业标准７９６１蜂蜜》中要求采１８９３２－－－用ＧＢ／Ｔ．１２００２规定的亦法（元素分析同位素比值质谱法，ＥＡＩＲＭＳ）对蜂蜜真实性进行鉴定，该方法能够检测蜂蜜中的Ｃ４植物糖含量（２００２。）－－ＭＳＣａｂａｎｅｒｏ等开发了液相色谱同位素比率质谱联用（ＬＣＩＲ）的方法。该实验针对－、葡萄糖、５１３Ｃ进行分析３Ｃ、蜂蜜样品中的藤糖果糖和蛋白质的，发现ＡＳ１果糖葡萄糖［］－－ＡＳ１３Ｃ、ＡＳ１３果糖薦糖荀糖薦糖可Ｗ指示梭假蜂蜜中的外源糖类，此方法可有效［］Ｑ葡］识别出Ｃ３糖（甜菜糖）和Ｃ４糖（薦糖、蔑糖糖浆、Ｉｓｏｇ山ｃｏｓｅｓｙｒｕｐ、高果玉米糖浆）ｔＣａｂａｎｅｒｏｅａｌ２００６。（，）－－费晓庆等采用液相色谱／元素分析同位素比值质谱联用法ＩＲＭＳ）（ＬＯＥＡ对国内蜂，根据测定得到的３８个纯正蜂蜜样品的５３Ｃ，蜜梭假情况进行了对比研究１值结果与－－〇灯ｒｏ．ｂａｎｅ等所得结果相近，提出了纯正蜂蜜样品的要求：顧Ｃ蛋白质蜂蜜三０９５／〇〇，Ｉ；］－－０？－Ｍ－．６４％〇０ＥＡＥＡＲＭＭ１３Ｃ果糖葡萄糖］在．５３％〇之间。用建立的ＬＣ／ＩＲＳ与ＩＳ对比分［－１５０ＬＣ／ＥＡＩＲ２０１１。析个蜂蜜样品，结果ＭＳ方法对惨假蜂蜜的检出率更高费晓庆等（，）１３．２．利用光谱技术鉴别蜂蜜惨假饥民－－近红外光谱分析）和傳里叶变换拉曼光谱法（ＦＴＲａｍａｎ）是（进行蜂蜜援假鉴别研究中常用的两种方法。６ 浙江大学硕＋学位论文第一章绪论陈兰珍等利用Ｎ化与ＤＰＬＳ化学计量学方法结合建立了５组数学模型，ＷＣ４植物糖？检测结果为判定依据，样本巧别准确李为％．９６％９３．７５％，其中有王个模型的识别准确率达到１００％（陈兰珍等，２００８）。Ｋｅｌｌｙ等利用ＮＩ民检测搂入甜菜糖浆和高果玉米糖浆的蜂蜜样品，结合ＳＩＭＣＡ分类法鉴定蜂蜜真伪，并利用ＰＬＳ法巧测惨假水平，结果表明，该ｌｌｌ２００６方法能快速识别蜂蜜中的甜菜糖浆和高果玉米糖浆（Ｋｅｅｔａ。ｙ，）李水芳等研究了利用拉曼光谱快速鉴定蜂蜜中甜菜糖浆惨假的可行性，利用拉曼光－，ＰＬＳＬＤＡ模型，该模型的频测总正９５４％谱结合化学计量学方法建立了确李为．李水芳（等２０１２。，）１．３．３核磁共振法（ＮＭＲ）Ｂｒｔ一二ｅｅｌｌｉ等利用维和维核碰共振法，结合多变量统计分析，检测蜂蜜中渗入不同浓－ＮＭＲ对采度的糖浆，准确率达到９５．２Ｂｅｒｔｅｌｌｉｅｔａｌ２０１０。Ｓｉｔｅｒｉ％，ｐ等利用ｌＨ自全球范围（）巧的８００余个蜂蜜样品进行分析，结果在２００余份样品中发现了糖浆成分（Ｓｐｉｔｅｒｉｅｔ吐２０１５。）１．４．３利用蜂蜜的元素组成分析ＩＣＰ－ＭＳ）结合主成吴招斌等利用电感福合等离子体质谱法，（分分析和判别分析测２０Ｍ、ＳＢ、ＮｉＳｂ、Ｃ定洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中种矿物质元素含量，筛选出ｇｒ、ａ、ｒ和Ｎａ７种矿物质元素，建立判别模型，该模型对蜂蜜品种鉴别准确率为９０．３％（吴招斌等，２０１５）。在前期样本量足够的情况下，推测该方法对于蜂蜜梭假的鉴别具有可行性。桂茜曼等利用－ＭＳ测定大米糖浆和纯正ＩＣＰ蜂蜜中坤的含量，发现纯蜂蜜与大米糖浆１１＾，５／ｋ中的坤元素含量相差〇倍乂上纯蜂蜜中坤含量均低于１帖ｇ，确定蜂蜜中坤含量超、过１５ｌ／ｋ大米糖浆滲假蜂蜜。此方法准确度精密度较窩，可用于蜂蜜中大米糖浆＾ｇｇ为的梭假鉴别桂茜曼等，２０１４）。（７ ｔ江大学硕±学位论文第一章绪论１．３．５酶活力测定ＧＨ／Ｔ１８７９６－２０１２《》２行业标准蜂蜜要求蜂蜜的淀粉酶活性不小于（１％淀粉溶液）‘—／ｍＬ／ｈ，并规定采用ＧＢＭ８９３２《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》进行［（ｇ）］分析。鲍会梅等研究发现，纯正蜂蜜在温度较高的储存过程中淀粉酶值随时间逐渐下降，在化温条件下淀粉酶值基本不变，而假蜂蜜的淀粉酶值基本不受温度和时间的影响鲍会（梅２０１０。，，，）但来源不同的蜂蜜淀粉酶活性差异较大易出现假阳性和假阴性结果化较，耗时，某些不法商贩在惨假过程中加入工业淀粉酶因此此方法难Ｗ作为鉴别蜂蜜真伪的判定依据。－－张金连从蜂蜜中的３葡荀糖苦酶入手，采用分光光度法分析不同来源蜂蜜中葡萄（Ｐ糖昔酶的活力－，及不同储存条件和储存时间下Ｐ葡荀糖普酶活力的变化，随着储存温度－的变化和储存时间的延长，葡萄糖普酶活力变化较小，在不同储存条件下比较稳定Ｐ；向油莱淫中加入大米高果糖浆－，Ｐ葡萄糖普酶活力随大米高果糖浆比例的增加呈线性下－降。因此推测蜂蜜中葡荀糖普酶活力可Ｌ义作为检测蜂蜜真伪的有效指标（张金连Ｐ，２０１２。）、但是，现有检测蜂蜜真巧的方法普遍从外源添加物为目标，所用设备昂贵操作复一杂，准确率不高，般毎种手段只能鉴别特定添加物，需要多种方法联用才能有效判断；而实际上蜂蜜中的酶是蜂蜜自有的，但酶活力不稳定，而且人工添加的酶无法鉴定，不能作为有效的检测手段。１４、．研究的目的意义及技术路线１．４．１研究的目的、意义我国是蜂王浆生产和出口大国，占世界总产量的９０％Ｌ乂上。目前国际上并没有成熟－的蜂王浆质量评价体系，国际上最力通用的指标只有ＨＤＡ，，１０含量而研究表明蜂王－浆的各种生物活性在不同储存条件下会随时间下降，极易变质，而１０ＨＤＡ含量在储存中基本稳定，因此亟需完善的蜂王浆质量评价体系。８ 浙江大学巧±学位论文穿—章绪论本实验室已在前期研究中建立了蜂王浆老化模型，并初步开发了间接法ＥＬＩＳＡ快速一检测蜂王浆新鲜度的方法。本实验将进步探究了蜂王浆新鲜度的夹记法ＥＬＩＳＡ检测，为今后国内外建立蜂王浆质量评价体系提供理论依据。我国是蜂蜜生产和出口大国，２０１３年出口蜂蜜１２．５万吨，占世界蜂蜜贸易量的１／４。，市场上蜂蜜产品梭假现象严重。根据２０１４年２２６日但有由于经济利益驱动１月中国蜂产品协会《关于２０１４年网售蜂蜜抽检结果的通报》报道，其抽检的２８个化次标称蜂蜜的产品中有１３批次被检出非蜂蜜物质，这物质主要为糖浆。但现行国家标准和行业标准鉴－定蜂蜜真伪主要依据为果糖、葡萄糖和薦糖含量、碳４植物糖含量Ｗ及淀粉酶活性等指－、法等检测搂假植物成分和蜂蜜成分标，文献中己有用光谱法同位素葡萄糖普酶活力的方法报道，这些方法主要针对擦假方式进行鉴别，需要多种方法联用才能有效判断蜂蜜的真伪。－根据国外最新报道和我们近年研究发现，蜂蜜中蛋白质含量约０．０５０７９％，．蜂蜜中５７ｋＤＪＰｌ比ｉｉｋｌ所含分子量为的王浆主蛋白ＭＲ较稳定巧ｌｏｖａｅｔａ２０１０，不，）仅是检测蜂王浆质量的生物标志，也是检测蜂蜜质量的可靠生物标志，因此可Ｗ作为检验蜂蜜挨假的指标。ＭＲＪＰ１的ＭＲＪＰ１的本实验将通过提取与电咏检测方法研究，蜂蜜中含量的间接法和夹记法ＥＬＩＳＡ检测方法研究，包括用自主研发的ＭＲＪＰ１特异性抗体和ＭＲＪＰ１标准蛋白一建立标准曲线，对照物《种纯蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的标定，糖浆添加比例与ＭＲＪＰ１含量的相关性分析，最后通过市场购买的各种蜂蜜样品进行验证的方法，建立标准的检测方法，。预期将为鉴别蜂蜜真伪与惨假提供非常有效的检测巧方法在很大程度上弥补现有标准和研究报道的不足，为今后国内外蜂蜜检测提供可靠依据。１．４．２研究内容ＭＲ、（１）基于Ｊｎ的夹吃法ＥＵＳＡ方法的建立（２）夹记ＥＬＩＳＡ检测蜂王浆巧鲜度方法的建立（４）基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳技术的蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量测定５）ＩＳＡ方法和夹记ＥＬＩＳＡ方法捡测蜂蜜中ＭＲＪＰＩ含量方法的建立（间接ＥＬ６ＳＤＳ－ＰＡＧＥＥＬＩＳＡ（）基于电泳和方法预判蜂蜜真伪９ 二－、浙江大学硕壬学位论文第章基于主蛋白１特存性多抗的王浆新鲜度夹也法ＥＬＩＳＡ检测第二章基于主蛋白－１特异性多抗的王浆新鲜度夹瓜法ＥＬＩＳ乂检测（ＥＵＳＡ－酶联免疫吸附测定）利用了抗原抗体特异性反应，在临床诊断和食品安全控制等领域有着广泛佐用。在前期研究中ＪＰ１，，本实验室己设计了ＭＲ特异性多克隆抗体－ＰＡＧＥ电咏和间接ＥＬＩＳＡ法快速检测并建立了采用ＳＤＳ蜂王浆新＃度的方法，获得发明２０一１５专利（沈立荣等，，，）。为提高检测的灵敏度在原有抗体的基础上本章增加了种新的特异性抗体，建立了双抗体夹记法，并对此方洁进行了验证。２．１材料、试剂与设备２丄１实验材料’－８０Ｃ保新鲜蜂王浆由杭州碧于天保健品有限公司提供。，存ＭＩＵＰ１由采用超速离＾法制得（柳丹丹，２０１３。）（ＳＰ－ＪＰ１３５９－３７０ＥＡＬＰＨＶＰＩＦＤ）捕获抗体１）由本实验室制得（针对ＭＲ序列位多肤ＩＫ制备的特异性抗体（柳丹丹，２０１３）。２丄２实验试剂及耗材’二－、、、、Ｎ试剂：十烧基續暖销Ｔｒｉｓ甘氨酸、丙烁醜胺过硫酸镇Ｎ，甲叉双丙锦骄胺ｅｓｃｏ），、甲醇、考马斯亮蓝、乙醇（国药集团化学试剂有限公司），（Ａｍｒ冰醋酸－、ＨＲＰ、ＴＭＢ显色液ＴＥＭＥＤ（北京鼎国昌盛生物技术有限公司（碧玄天生）羊抗兔抗体、二二、、、物技术，、、）氯化销氯化钟攝酸氨纳蝶酸氨卸碳酸钢碳酸氨納浓硫暖（国药集团化学试剂有限公司）。耗材：硝酸纤淮素膜（ＰＡＬＸ）９６３５９０（Ｃｏｓｔａｒ）。，孔醇标板．２．１３实验设备ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭｋ３酶标化（Ｔｈｅｒｍｏ），电子分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ），高记机２＾３１Ｈａｍｂｕｒｇ（ｅｎｄｏ）－ｅｒｆ，冰箱（杭州华日枉冰賴有限公司，ＪＭ２５０Ａ（ｐｐ）小型数显电泳仪大连竟迈１０ 第二章基于主蛋白－浙江大学硕生学位论文１特异性《抗的王浆新鲜度夹把法ＥＬＩＳＡ检测－－生物科技有限公司，ｂｌｏｔＭｉｎｉ（ＢｉｏＲ）ＬｔＭ１００５）微型电转移系统Ｔｒａｎｓａｄ，扫描仪ａｓｅｒＪｅ（Ｈｐ）。２丄４实验试剂的配制２丄４．１多竞隆抗体制备的试剂（１）碟酸盐缓冲液（祀Ｓ，Ｈ７．２）储存液（ｌ〇ｘ）ＮａＣｌ８．５，ＫＣｌ０．２，ｐｇｇ°．２Ｎａ２ＨＰ〇１２．８５．Ｃ４比Ｏｇ，ＫＨ２ＰＯ４０２７，加入脏２Ｏ定容至１００ｍＬ，置于４保存备用。ｇ使用时稀释１０倍配制成ＰＢＳ工作液。２７．５００ｍ（）抗体洗脱液称取甘氨酸ｌｄＨ〇Ｈ值到２．７，ｇ，溶于１２，用浓盐酸调节ｐ’４Ｃ保存备用。２丄４．２ＥＬＩＳＡ试剂（１）碳酸盐缓冲液（ＣＢＷＮａ２Ｃ〇３１．５９ｇ，ＮａＨＣ〇３２．９３ｇ，ｄｄＨ２〇９５０ｍＬ，调节°ＣｐＨ值至乂６，力Ｐ（１批２〇定容至１０００ｍＬ，４保存；（２ＰＢＳ缓冲液中加入５％脱脂奶粉）封闭液；（３（ＰＢＳＴｗｅｅｎ－）洗涂液）ＰＢＳ缓冲液中加入０．０５％Ｔ２０；（４）显包终止液（２ＭＨ２ＳＯ４）于９００ｍＬｄｄＨ２〇中缓缓加入１００ｍＬ浓出Ｓ〇４，°４Ｃ保存。２丄４－．３ＳＤＳＰＡＧＥ电泳试剂’１０２９ＮＮ－１比０中（巧％丙烁斬胺丙贿敌胺、至甲基双丙稀就胺１、，ｇ，ｇ溶于（充分溶解，调节ｐＨ＜７，用ｄＨ２〇定容至ｌＯＯｍＬ，滤纸过滤２次，置于標色瓶中室温保存；二ｉｌｌｌｆ（２１０％ｏｄｕｍａｕｒｓｕａｔｅ，ＳＤ１０ＳＤＳ，用９０ｍＬ）十烧基硫酸巧（ｓｙ糾称取ｇｄ也Ｏ中充分溶解，加热助溶，恢复至室温后用浓ＨＣｌ调节Ｈ至７．２，用ｄＨ〇１００ｐ２定容至ｍＬ，室温保存；（３）１０％过硫酸按称取于０．１过硫酸按，溶解于１ｍＬ地２〇中；ｇ．（４１．５ｍｏｌ化ＴｒｉｓＣｌＨ８８．１７ｒｉｓ，８０ｍＬｄＨ２〇，ＨＣ１）ｐ称取１ｇＴ用充分溶解用浓（刮调阳至８．８，加地２〇定容至１００ｍＬ，室温保存；’５１．０ｍ〇ｙＬＴｒｉｓＣｌＨ６．８２．１１Ｔｒ（）称取１ｉｓ，用８０ｍＬ地２Ｏ充分溶解，用浓（ｐ）ｇＨＣ１调ｐＨ至６．８，加地２〇定容至ｌＯＯｍＬ，室温保存；１１ 二章基于主连白－、浙江大学硕±学位论文第１特异性多抗的王浆新鲜度夹记法ＥＵＳＡ检测ｘ打－（６）ｌｉｓ甘氨酸电泳缓冲液称取３０３ｓ，１４４ＩＤ，．ｇＴｒｉ．ｇ甘氨乾ｇＳＳ用姐２〇定容于至１０００ｍＬ。９－（７）考马斯亮蓝染色液称取１．０ｇ考马斯亮蓝Ｒ２５０，４５０ｍＬ己醇ｌＯＯｍＬ冰醋，４５０ｍＬｄＨ酸，２〇混合均匀，室温保存，；ｌ，ｌＬＬＨ（８）脱色液ＯＯｍＬ甲醇ＯＯｍ冰醋酸，８００ｍｄ２〇；ｘ’（９）２ＳＤＳ凝胶加样缓冲液１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣＩＨ６．８，２００ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ｐ）ＤＴＴ，４％ＳＤＳ，０．２％澳醋蓝，２０％甘油；（）．（１０）１２％ｄＨ〇１．６ｍＬ．ｙＬｉｌ．．分离胶２，３０％丙炼酿胺２ｍＬ，１５ｍ〇ＴｒｓＣｐＨ８８１３ｍＬ，（）〇０００５０ＴＥＭＥＤ４Ｌ１％ＳＤＳ５，！／〇过硫酸锭，，阵阵ｙｎ．１０７ｍＬ，３００１６５，１０ｍｏｌＬＴｉｓＣｌＨ６（）５％（比０．％丙嫌號胺．ｍＬ．／ｒ浓缩胶（ｐ刮〇０．１２５ｍＬ，１０％ＳＤＳ１０，１０／〇过硫酸按１０ＴＥＭＥＤ１，。阵阵阵２丄４．４ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ试剂（１）转膜缓冲液称取Ｔｒｉｓ３．０３，甘氨酸１４．４，甲醇２００ｍＬ、用燕僧水溶解ｇｇ，定容至１０００ｍｂ（２）ｌ〇ｘＴＢＳ缓冲液称取Ｔｒｉｓｌ２．：ｌｇ，Ｎａｃｌ４０ｇ，用ｄＨ２０定容至５００ｍＬ，使用时用地２〇稀释；（３）１０Ｌｘ－洗缘液取０ｍｌＯＴＢＳ，用ｄＨ２〇稀释至１０００ｍＬ，加入Ｔｗｅｅｎ２０１ｍＬ，混匀；（４）封闭液将ｌ〇ｘＴＢＳ缓冲液稀释至ｌｘ，加入脱脂奶粉至终浓度为５％。２２．实验方法－２．１２．２特异性抗体抗体（ＳＰ的设计与制备）ＭＲＪＰ１的特异性序列５６－７０根据义献检索结果得到针对：位多肤ＹＤＹＫＮＮＹＰＤＩＤ）Ｙａｍａｕｃｈ－（ＳＣＥＳｉ２０１３，该序歹リ与ＳＰ１（ｇ等，）原有抗体所对应的多肤５９－，ＫＥＡＬＰＨＶＰ圧Ｄ）无重复的连续序列。用该序列的合成多肤免疫大白（序列３３７０位Ｉ－－－兔，得到巧的ＭＲＪＰ１特异性抗体ＳＰ２。经理论分析预测，抗体ＳＰ２与原有抗体ＳＰ１可ＪＰ１Ｉ心结构与ＭＲ构成夹。２．２．１．１多克隆抗休的制备制备过程由上海强耀生物科技有限公司完成。１２ 二－１ＥＬ浙江大学硕±学位论文第章基于主蛋白特异性多杭的王浆新鲜度夹也法ＩＳＡ检测航－１ＬＨ偶联（偶联剂为。（）化学合成多肤，多肤与ＫＳｕＳＭＣＣ），作为免疫杭原用ＰＢＳ稀释为Ｉｍ／ｍＬｇ（２）分別于第１、１５、２９、４３山取１ｍＬ抗原加入１ｍＬ福氏完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，免疫２只新西兰白兔；’（３）第巧３，颈动脉取血。兔血４Ｃ静置过夜，ｌＯＯＯＯｒｐｍ、４Ｃ离，Ｃ：３０ｍｉｎ，收集血清０．４５ｕｍ，滤膜过滤；４Ｒ，（）多肤连接到活化的Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋｅｓｉｎ上制备抗原亲和柱；１ＢＳ（５）亲和柱用０倍柱体积Ｐ平衡，流尽溶液；（６）血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿液；１０（７）用倍柱体积ＰＢＳ平衡，流尽溶液；，Ｉ（８）加入抗体洗脱液，分管收集洗脱液毎管ｍ。ｎｍ波长Ａ１ＰＢＳ。（９）检测２８０下洗脱液的吸光度，２８０大于．０的组分合并，用透析２ＥＬＩＳＡＳＰ－２２．２丄检测抗体效价ＥＬ－采用间接ＩＳＡ法检测ＳＰ２多克隆抗体效价，具体方法如下：（１）包被：将ＭＲＪＰ１用ＣＢＳ缓冲液稀释至１帖／ｍＬ，按１００阵／ｗｅｌｌ加入到９６孔酶°标板，４Ｃ过夜。（２）洗板：弃尽包被液，每孔加入２００叫＾ＰＢＳＴ，置于平板摇床上洗漆５ｍｉｎ，洗板５次；’３）：２００３７Ｃ反应１．ｈ（封闭每孔加入咕封闭液，５；４法２（）洗板：方同（）；°一５－：Ｂ，１（）加入抗用ＰＳ将ＳＰ２多克隆抗体按梯度稀释每孔加入００叫３７Ｃ反应Ｉｈ１：１，空白兔血清（０００）为对照；２（６）洗板：方法同（）；二抗ＰＢＳＨＲＰ－ｌ２５０（７）加入酶标：用将羊抗兔Ｗ：稀释，（根据抗体说明书操作）’°毎孔加入１００阵，３７Ｃ反应３０ｍｉｎ；８：２（）洗板方法同（）；°２００ＬＴＭＢ（９）显色：每孔加入ｉ显色液（按试剂盒说明书操作），３７（：避光反应＾１５ｍｉｎ；１：１＾（０）终止显色每孔加入５０＾冬止液；１１：立，５０ｎｍ、６３０ｎｍ。（）读数即置于酶标仪上读取４处的吸光值１３ 、二－章基于主蛋白１ＥＬ浙江大学硕±学位论文第特异性多抗的王浆新鲜度夹记法ＩＳＡ检测２－．２丄３Ｗｅｓ化ｒｎＢｌｏｔ栓测抗休特异性Ｄ－对新鲜蜂王浆做ＳＳＰＡＧＥ电泳，湿法转移至硝酸纤维豪（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅＮＣ）膜上，－用ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ对所得多克隆抗体进行特异性分析，具体方法如下：－１ＤＰＡＧＥ（）ＳＳ电泳ａ：１２：．，３Ｌ，１．５ｍｏｌ／Ｌ．配制分离胶％分离胶加吐０１６ｍＬ０％丙稀就胺２．０ｍ〇－ＨＴｒ．１．３１Ｄ５０ＴＥＭＥＤｉｓＨＣｌ（８８）ｍＬ，０％ＳＳ５０Ｌ１０／〇过硫酸镇４ｐ＾，阵，阵；ｂ．配制浓缩胶．７１５ｌＬ；５％浓缩胶：ｄｄ比Ｏ０ｍＬ，３０％丙巧酣胺０．６ｍＬ，．Ｏｍｏｌ／Ｔ－ＨＣＨｒｉｓｌ（ｐ６．８）０．１２５ｍＬ，１０％ＳＤＳ１０，１０％过硫酸按１０，ＴＥＭＥＤ１；咕咕阵°Ｃｃ：ＰＢＳ将ｌＬ１ｒｍ、４．样品预处理及加样用蜂王浆配制成Ｏｍｇ／ｍ，２０００ｐ离记３０°°ｍｉｎ，２ｘ蛋白上样缓冲液与等量的上清液混匀００Ｃ加３ｍｉｎ１２０００ｒｍ、４Ｃ，１热变性，ｐ离１０ｒａｉｎ，取上清液，毎孔加样１０咕；ｄ：７Ｖ跑浓缩，１１Ｖ跑分离．电泳０胶０胶；ｅ．染色：用染色液颤色２ｈ；ｆ．脱色；用脱仓液脱包至条带清晰。（２）Ｗｅｓｔｅｍ－Ｂｌｏｔａｉ．转膜：担泳结宋后，将凝胶、ＮＣ膜、６张滤纸在转移缓冲液中平衡１５ｍｎ，将￡层滤纸、，、ＮＣ膜分离胶和王层滤纸依次装入夹子中转移池中注满转穆缓冲液，湿法转移，转移条件为恒电流２００ｍＡ，转移２ｈ；’ｂ．封闭：将膜置于封闭液中，４Ｃ过夜；－．５５ｍＣ洗膜；用ＴＢＳＴ缓冲液洗珠３次，每次ｉｎ；一一－ｄ．加入抗溶液（ＳＰ２多克隆抗体用ＴＢＳＷ１：１００００稀释，扼将膜浸入）中在室温下水平摇床上膊育１．５ｈ；－５：ＴＢ１ｅ．洗膜用ＳＴ洗涂３次，毎次０ｍｉｎ；ｆ二抗二抗溶液（ＨＲＰ－ＴＢ１１．加入：将膜浸入酶标羊抗兔用ＳＷ：０００稀释，在室）溫下水平摇床上膊育１．５ｈ；．洗膜：同ｅｇ；ｈＤＡＢ显色Ａ液Ｂ液ＩｍＬ．染色：加入液５０），，（咕，室温下避光染色至条带清晰加入水终止染仓，嗦干后扫描。１４ 二－浙江大学硕±学位论文第章基于主蛋白１特异性多化的王浆新鲜度夹｜心法ＥＬＡＩＳ检测２．２丄４抗体标记辣根过氧化物巧１（）抗体标记辣根过氧化物酶－２取ＳＰ多克隆抗体，用过娜酸钥法添加辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记，具体方法如下：’ａ．称取２ｍｇＨＲＰ溶解于０．５ｍｌ地２０中，加入０．５ｍｌ新配的０．０６ＭＮａＩ０４溶液，４Ｃ避光３０ｍｉｎ；ｂ．上液中加入１６０ｍＭ的己二醇０．５ｍｌ，室温３０ｍｉｎ；ＣＳＰ－．上液中加入２多克隆抗体２ｍｇ，混匀；‘ｄ．将上述溶液装入透析袋中，置于２０００ｍｌ的化０５ｍＭＣＢＳ中透析，４Ｃ攪拌过夜；°ｅ．透析液吸至１５ｍｌ的离记管中，加０．２ｍｌ新配的５ｍｇ／ｍｌＮ姐扣液，混勾，４Ｃ下放置２ｈ；°°ｆ．加入等量的饱和硫酸按溶液，４Ｃ下放置３０ｍｉｎ，４０００ｒｐｍ、４Ｃ离记２０ｍｉｎ，弃上清，巧干；°Ｃ—ｇ．将沉淀溶于少量ＰＢＳ中，装入透析袋中，用ＰＢＳ透析，４过夜（中途换ＰＢＳ次）；’Ｉｈｍ、Ｃ．将透析液中液体吸至离。管中，４０００ｒｐ４离扣２０ｍｉｎ，将上清液巧出，加’－Ｃ等量甘油，混匀，２０保存备用。２）ＨＲＰ－ＳＰ－２（效价检测－ＳＰ２抗体采用直接ＥＵＳＡ法检测ＨＲＰ效价，具体方法如下：ａ．包被：将ＭＩＵＰ１用ＣＢＳ缓冲液稀释至１帖／ｍＬ，按１００叫Ｖｗｅｌｌ加入到９６孔酶标’板，４Ｃ过夜；ｂ．洗扳：弃尽包被液，毎孔加入２００ｎＬＰＢＳＴ，置于平板摇床上洗涂５ｍｉｎ，洗扳５次；°Ｃ：２００，的Ｃ．５ｈ．封闭每孔加入阳封闭液反拉１；．ｄ．洗扳：方法同２２丄２（２）；－－－－ｅ．ＳＰ２ＰＢＳ）ＨＲＰＳＰ２加入ＨＲＰ：用将多克隆抗体按梯度稀释，每孔加（１得到的巧’入ｌＯＯｕＬ，Ｃ反应Ｉｈ，空白兔血清（１：１０００）为对照；ｆ．２２丄２２洗扳：方法同．（）；１５ －１ＥＬ浙江大学硕±学位论文第二章基于主蛋白特异性多抗的王浆新鲜度夹吃法ＩＳＡ检测°Ｃｇ．显色：每礼加入２００阵ＴＭＢ显色液（按试剂盒说明书操作），３７避光反应１５ｍｉｎ；ｈ．终止显包：每孔加入５０｜ｉＬ终止液；ｉ４５０ｎｍ６３０ｎｍ．读数：立巧置于酶标仪上，读取、处的吸光值。２．２．２双抗体夹记ＥＬＩＳＡ反应条件优化ｋＸＳＰ－１抗体为捕获抗体－ＳＰ－２，ＨＲＰ抗体为检测抗体，建立双抗体夹把检测ＭＲＪＰ１浓度的方法，并对双抗体夹记法的毎步反应进行优化筛选。双抗体夹，心法的具体步躁如下：ａＳＰ－１－：ＳＰ１２０１ＣＢＳ１：１００００，．包被捕获抗体将《克隆抗体刮用Ｗ稀释（柳丹化Ｗ１００ｌｉＬ／ｗｅｌｌ加入９６孔酶标板；ｂ．封闭：每孔加入２００咕５％脱脂巧粉；Ｃ．洗扳：弃尽包被液，毎孔加入２００ｈＬＰＢＳＴ，置于平板摇床上就缘５次，每次５ｍｉｎ；ｄ．加入抗原：用ＰＢＳ将ＭＲＪＰ１稀释为１峭／ｍＬ和５帖／ｍＬ，Ｗ１００阵／ｗｅｌｌ加入９６孔酶标板；－－ｅ．加入酶标抗体：用ＰＢＳ将２．２丄４ＨＲＰＳＰ２抗体Ｗ１０００００得到的：１稀释，１－ｉＬ／ｌｌ９６孔酶标扳ｗｅ加入；ｌｆ．，２００＾ＰＢＳＴ，５洗扳：弃尽包被液每孔加入叫置于平扳摇床上洗缘次，毎次５ｍｉｎ；°Ｃｇ．显色：每孔加入２００叫＾ＴＭＢ显色液（按试剂盒说明书操作），３７避光反应１５ｍｉｎ；ｈ．：５０止液终止显包毎孔加入ｎＬ终；ｉ４、６３０。．读数：立巧置于酶标仪上，读取５０ｎｍｎｍ处的吸光值２．２．３双抗体夹沁ＥＬＩＳＡ＃准曲线绘制用ＰＢＳ将ＭＲＪＰ１按梯度稀释，用２．２．２建立的方法进行检测，每个浓度设３个平行。ＪＰ１－ＷＭＲ浓度为橫坐标，ＯＤ４５０ＯＤ６３０为纵坐标，绘制ＭＲＪＰ１含量标准曲线。１６ －第二章基于主蛋白Ｉ浙江大学硕去学位论文１特异性《抗的王浆新鲜度夹。法ＥＬＩＳＡ检测２２，．４。法与间ＥＬＩＳ乂比．夹接法较２．．２．４１捡测范围叱较将Ｍ民ＪＰ１稀释为不同浓度，分别用夹记ＥＬＩＳＡ法和间接化ＩＳＡ法检测。ＷＭＲＪＰ１－浓度为横坐掠，〇〇４５０〇〇６３０为纵坐标绘图，得到ＭＲＪＰ１含量标准曲线的检测范围。２．２．４．２实验重复性比较在检测范困巧一，将ＭＲＪＰ１稀释为定浓度，分别用夹记ＥＬＩＳＡ法和间接ＥＬＩＳＡ法检＝巧！，，每组３。，１分次独立实验个平行根据标准曲线计算出ＭＲＪＰ１浓度的测定值并计、算出平均值、标准差、变异系数和样品回收率，Ｌ义此比较间撞法双抗体夹吃法的优缺点。２．２．５用双抗体夹记法栓测蜂王浆新鲜度２．２．５．１蜂王浆老化祥胚蜂王浆老化样品采用如下方法处理：°０Ｃ－－将蜂王浆置于４恒温储存，毎隔７ｄ取出部分并储存于８０ｒＨ，分别ＷＡ编号，’－Ｈ的样品力在４Ｃ下恒温储存第、７、、、即编号Ａ００１４２１２８、３５ｄ的蜂王浆。样品取’一出后均置于－８０Ｃ储存Ｗ待进步鉴定。李玫靖２０１４（，）２－．２．Ｓ．２ＳＤＳＰＡＧＥ电沫检验°：ＰＢＳ１Ｌ，１２ｍＣ离记样品预处理及加样用将老化蜂王浆配制成０ｍｇ／ｍ０００ｒｐ、４＂Ｃ‘３０ｍ、Ｃｉｎ，２ｘ，１００３ｍ，１２０００４蛋白上样缓冲液与等量的上清液混匀加热变性ｉｎｒｐｍ，心１０ｍｉｎ２０离，取上清液，毎孔加样咕；具体方法同２．２．１．３。用ＩｍａｇｅＪ软件分析电泳条带灰度。２＜心法．２．５．３双抗体夹栓测老化蜂王浆中ＭＲＪＰ１降解程度用ＰＢＳ将老化处理的蜂王浆样品稀释至标准曲线检测范围，用２２．２．建立的方法检测２０ＭＲＪＰ１降解程度，并与间接法检测所得结果巧玫路１４姆行对比。２．２．６数据分析所得数据用ＤＰＳ软件、ＩｍａｇｅＪ软件和Ｅｘｃｅｌ软件进行统计分析。１７ 二－浙江大学硕去学位论文第章基于主蛋白１特异性多抗的王浆新鲜度夹也法ＥＬＩＳＡ检测２．３结果与分析２－．３．１ＭＲＪＰ１特异性抗体ＳＰ２的特性及效价－一２２－Ｗ蜂王浆为抗原，所制ＳＰ多克座抗体为抗，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果见图１。由图可－５７ｋＪＰ知，ＳＰ２抗体能清楚识别分子量约Ｄａ的蛋白质ＭＲ１蛋白，即，此结果与文献基本一－２ＪＰ１致，证明此ＳＰ抗体对ＭＲ具有较好的特异性。１２９７．４ｉｉｐＭｇ——、＂ＭＲＪＰ５６６．２偷幽Ｉ－——ＭＲｒＪＰ３ＭＭｎｎ＾ＭＲｊｐｉＷｔｍ—ＭＲＪＰ２４２－１３１．０ｍｍ？．如２０．１ＡＢ２－１ＳＤＳ－ＰＡＧＥＳＰ－２ｅｓｔｅ图蜂王浆的分析和抗体特异性的Ｗｒｎｂｌｏｔ栓测－－ｗＦｉｇ．２１ＳＤＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＪａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳＰ２ａｎｔｉｂｏｄｙｉｔｈＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｓｙｉｓ－ＭＡ蜂王浆ＳＤＳＰＡＧＥ电，２，泳，１为标准蛋白质分子量ａｒｋｅｒ为新鲜蜂王浆箭头所示为。Ｂ为Ｗｅｓｔｅｍｂｏｔ，ＲＪＰ１。蜂王浆中几种标志性蛋白质ｌ印迹图箭头所示为Ｍ－ＷＳＤＳＧＥｌ１ＡＰＡａｎａｓｉｓｏｆＲＪＬｓｔａｎｄａｒｄｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ．Ｌａｎｅ２ＲＪ．ｔｂｌｔｌｉ．ａｎｅ，，（巧ｅｓｅｒｎｏａｎａｓｓ（）ｙｐｙ－ｏｆＲ．ＪｂｙＳＰ２－ＬＩＳＡ法检测未加Ｐ－２Ｓ抗体效价，２１。方差分析结果显示用Ｅ酶标的结果见表，稀２００００－Ａ显著高于空白血清对照释倍的抗体的Ａ４５０６，与空白兔血清之比大于２，因此３０，－ＳＰ２抗体的效价大于１：２００００。－－－ＬＩＳＡ法检测酶ＨＲＰＳＰ２抗体效价，２２。方差分析结果显示用Ｅ标结果见表，稀释５０００－ＳＰ－２－Ａ倍的ＨＲＰ抗体的Ａ４５０高于空白血清对照，与空白兔血清之比大于２６３０显著，－－，ＨＲＰＳＰ２抗体的效价大于：５０００。因此１１８ 第二章基于主蛋白－渐江大学硕去学位论文１特异性《抗的王浆新鲜度夹也法ＥＬＩＳＡ检测－２－１ＳＰ２ＥＬ表多克隆抗体抗体效价的ＩＳＡ分析ｂ－－Ｔａｌｅ２１Ｔｔｔｉｏｆ２ｔｉｂｉｅｒｃｏｍｐａｒａｏｎＳＰａｎｂｏｄｙｙＥＬＩＳＡＡ－Ａ稀释倍数４５０６３０与空白对照比值Ａ２０００１．６３０±０１１％２３．９８．Ｂ４００００７３３±０．０８６７１０７８．．８５００００．７０４±０．０６１２１０．３６＋Ｅ１０００００．４８４０．０４２１７．１１Ｄ２０００００．２６３±０．０２９９３．８６Ｅ４０００００．１５３＋０．０１４９２．２５Ｅ０．０６８±００７９空白兔血清．０＊Ｋ〇０１．／表２－２辣根过氧化酶标记ＨＲＰ－ＳＰ－２抗体效价检测Ｔａｂ－－－ｌｅ２２ＴｉｔｅｒｃｏｍｐａｒａｔｉｏｎｏｆＨＲＰＳＰ２ａｎｔｉｂｏｄｙｂｙＥＬＩＳＡＡ－Ａ稀释倍数４５０６３０与空白对照比值Ａ１００００．４１３±０．０４０８６．２６Ｂ２００００．３１３±０．００８７４．７４＋＾５００００．２１３０．０２４１３．２３±。０６６１空白兔血清０．０．００７＊ｐ＜０．０１２．３．２双抗体夹记法条件优化－－－ＬＳＰ１？义抗体为捕获抗体，酶标抗体ＨＲＰＳＰ２为检测抗体，建立双抗体夹心检测－Ｍ民ＪＰ１浓度的方法，实验条件筛选优化结果见图２２。结果显示，图Ｅ结果叱较理想，不－Ａ同浓度间Ａ４５０６３０相差较大，吸光度随浓度的增加而上升。根据优化结果，最佳的反应’°３７－１２ｈ５，４入抗原条件为：ｒ包被捕获抗体ＳＰ；％脱脂巧粉Ｃ封闭过夜，４Ｃ反；加’ＲＰ－ＳＰ－２３７Ｃ２ｈ应过夜。；加检测抗体Ｈ，反应１９ ００《（《（（＿賽？＿００ａ３０３ｈ．）｝｝｝＞逛山Ｓ＂＂＂ｖ？＂ｓ占占占占０ｐｎ．含？０ａ：？？：：：々Ｏ．啼寸Ｔ运０Ｊ３。这一Ｊ望。－Ｗ０Ｖ一Ｃ寸＿３？３３ｐ含Ｍ。占Ｐ。ｚ１１／．３Ｔ，ＺＷ。Ｔ．蔓苗８Ｊ兵Ｕ：】游：二Ｊ占０巧３。诚Ｗ巧巧！．鸣含．０Ｎ＞白ｏｉ．怒．換－＾＾勺一２３ｄ。ｗｓｄｄ。责＞ｓｓ｜０－０Ｉｌ．含＿０ｄｄ氏＂羣含－含勺．１公Ｈ１＼古工正责正含坦ｗＷ如－＼｛ｓ击｝山ＩＵＵ１１ｃＩ．含；？．ｕ浮’．－＾－〇ｓＰ公ｏＲｌ！．？ｊＢ蓋巧ｓ一ｕ五００ｌ巧ｊＩｊｌ９ｌ８Ｂ８如－ＳＤｓ８０里迟專巧§這穿巧Ｃ？。石？－．．．．？？．．．？Ｏ占Ｓ３－０。巧１０００００００Ｕ占３Ｃ苗。ＮＷＷ－ＮＰ寸８０Ｉ〇腳Ｉ－Ｃ々－ＵＶｔｏ－＂＾Ｖ０ＷＪ々ｓ。３Ｊ這巧在ａ）３Ｊ巧ｔ。占奇寸Ｐ）ｓ进Ｊ巧奇Ｕ巧＿含０雌」兵Ｕ｝Ｊ＇０ｗ兵Ｊ３石３．Ａｌ巧．挪巧Ａ￡哥Ｓ３３ＯＳ巧ｃＧ。＞〇皂１＼ｎ００Ｃ３０ｓ＿０話Ｓ．ｇ０戈＜ｆ｝§？省ｓ一苗咎ｌ寸Ｔ＼１ｕ＾一華－己｜看Ｃ曰昔Ｂ９Ｖ＾山§巧１０／０Ｌｕ養Ｓ０＾？０Ｗｐ诚ｓｕ昔；Ｔ均ｊＵｕ如白—苗１皂。占言ｐｕ焉ｇ—岭Ｓｆ０＞ｓ焉ｓ寶货０的ｃ，８。ｒ０＼．ｖ占０＊ｒｏ＂ｓ亏．ｓ．ｗ。０？Ｚ孩钱Ｎ占。ＯＳｐ。ｎ－占Ｎ１０Ｎ々＊０ｕＪ寸３Ｉ』ｉ。含＼；Ｏ：ｓ．ｃ巧Ｊ气ｊ１与３這寸。１ｎＩｄｍ占１０战ｌｓＰ３背。０ＡＩＪ。０＼兵一．Ｍ－＇０：ＵＣ’■．妓Ｊ一．Ｊ兵Ｊ奇？Ｏ巧３００３兵｛９提ＷＡＡ芸芸等巧ＳＯ巧Ｏ〇１８Ｓ器９离磅Ｕ巧３．？？．‘Ａ＞－．．．，ＪＩ巨０〇００１０００３当当当０当ｌＵ巨ＵＳＵ的Ｊ口０Ｉ－ＷＩＷ巨当＊Ｖ＂Ｖｗ２６ＳＳ〇Ｓ１励ｃＰＰｓＰ〇ＪＩＩｐ／ＳｌＳ巨ｏ〇Ｓｄｓ＾〇０００ｓ〇／〇０／＇家毒００ｕ／〇ｊ皂＾０．＾＾／山１９－＾０Ｕ占电占电＾Ｓ０Ｏ方ＪＪ１Ｓ占｛．含＊０ＱｕＭＭＭＭ方．？ｐＳＷｇ泛寸寸ＴｐＵＵＳｕｍｏｕ城０／ｊＳＰ立己０．＿如ｑＵＰ。００Ｗ召立？ＯＯ０：ＴＪｏ．正占Ｊ＞ｌ云Ｇ六ｑｑ云０Ｎ－？３？．占占占０Ｉ占＊．鸣含？０Ｏ占ＪＮ．的蹇孩Ｊｋ１：：ｋ：．Ｐ０这Ｏ１Ｊ这Ｊ這０．含＊０３ｐＰ。ｐ．．以。１１遷兵００三兵兵兵１一Ｉ，’，’０■＊０巧巧苗一Ｓ．．ｄ田０ｓＩ０三一Ｉ｜＋９９ｌＩ—９－－尝這這等巧０這９导Ｓ皆ｄｄｓｓ责安．．．．？．？？．．Ｒ责靈１００００１００００巧幼Ｓ站普ｕＵ皆０Ｉ腳脚８万苗－ＱＩ名Ｐ＂＂《巧寫导巧巧Ｖ０Ｓ０｝８。ｓ。。 －浙江大学顷壬学位论文第二章基于主蛋白１恃异性多抗的王浆新辑度夹＞。法化ＩＳＡ检测２．３．３双抗体夹记法测定ＭＲＪＰ１含量标准曲线、ＬＳＰ－－－Ｘｌ抗体为搞获抗体，ＨＲＰＳＰ２抗体为检测抗体，采用２．３．２所建双抗体夹记法，４５０ｎｍ１－测定、６３０ｎｍ处的吸光值。然后，ＷＭＲＪＰ浓度为橫坐标，Ａ４５０Ａ６３０为纵坐标建２立ＭＲ－＝＝ＪＰ１浓度标准曲线（见图２３），建立回归方程为：ｙ０．０８７２Ｘ＋０．２９８７，Ｒ０．９９７４１。１．２１▲１．。０．８Ｊ１Ｓ－＾０？６＝０．０８７２Ｘ＋０．巧８７ｙＲ－０．９９７４０—．４＾—０２ｉｉ＾＾ｆ．０２４６８１０浓度ｉｊｇ／ｍＬ图２－３ＭＲ双抗体夹记法检测ＪＰ１浓度标准曲线－ＦｌｂｔｈｅｔｆｂｄｈＥＬｉｇ２３Ｃａｉｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆ：ｃｏｎｓｉｎｒｉｔｉｏｎｏＭＲＪＰ１巧ｎｗｉｃＩＳＡｙ、２，．３．４双抗体夹吃法与夹心法比较２．３．４．１标准曲线的有效范围将ＭＲＪＰ１稀释为不同浓度，分别用建立的夹沁法和间接法测定４５０ｎｍ、６３０ｎｍ处吸－Ａ光值，ＷＭＲＪＰ１浓度为横坐标，Ａ３０，ＭＲＪＰ１含量４５０６为纵坐标绘图得到检测苑围见－４－－图２。由图可知，间棲法在１５．５帖／ｍＬ范围内线性关系最佳，双抗体夹记法在２．５１０ｉ／ｍＬ范围内线性关系最佳，显示双抗体夹把法检测上限比间接法要宽。＾ｇ２１ 、二－浙江大学硕壬学位论文第章基于主蛋白１恃异性＃抗的王浆新鲜度夹记法ＥＬＩＳＡ检测ＡＢ２．Ｓ１２一—．＇—－＾Ｉ＇＜１ｒ００Ｊ０ＯＪ０．４０６０．８１３７９１１１３１５．５００２ａ４０．５０．６１２．５５７．５１０１２．Ｓ浓ＳＭｇ／ｍＬ巧度ＩＭｌ（ｇ／图２－４间接法及夹记法检测范困Ａ间Ｂ山、接法检测范围；夹法检测范围Ｆ－ｒａＥＬＩＡＥＬＩＡｉｇ．２４ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｎｅｏｆｉｎｄｉｒｅｃｔＳａｎｄｓａｎｄｗｉｃｈＳｇ＾ＥＬＴ（Ａ）ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆｍｄｉｉｅｃｔＩＳＡ（Ｂ）ｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｎｅｏｆｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ；ｇ２．３．４．２重复牲、准确性验证２４５０ｎｍ０ｎｍ在标准曲线检测范围内选择个浓度，分别用间接法和夹记法测定、６３－５－ＭＲＪＰｌ浓度的测定值，结果如表２、２６处吸光值，根据建立的标准曲线计算表所示。－其中，间接法Ａ４５０Ａ３０重复性，，６较差毎次独立实验需要同时建立新的标准曲线巧一每次独立实验需对应个标准曲线。Ｅ次独立间接法实验显示，样品回收率在。７７－－．９６％１７８．９７％之间，变异系数在２．２２％１９．３９／〇之间。而夹也法样品回收率在－－％７４％１００．７２，２．７５１２．４，说明夹记法比间接法准确度要高、．％之间变异系数在％％之间重复性好。２２ ／晨资．也６〇’资绝当／８２。．〇ｓ另６０＜／１／’ｓＪ窝会０ｏ面１￡３ｏ９ｎ６６画一３家６．．巧〇０該９０＂＂ｓ战斯３／０’骇０巧＆ａ龄蛛ｏ３＂０ｌｓ．６。喻０货々＼Ｓ’份价０ｓ０银＾寸々棟Ｔ１￥媒．内寸ｏ仪ＨＪ６．Ｗ〇＋Ｕ￡爱Ｉ若雙／６９＋ｘ１ＪＳ１ｚ培’挪ｌ’巧二００ｓｕｓｓ《坚雙／‘型３ｒｏｌ化。ｏ卷望Ｊ／〇－Ｕ普迴６ｓ＂ＸＪ１／８迴－巧ｇ／六？ｕＳＳ／／９巧ｖ／，中二１？＾巧恤八ｊｓ０６ｒ中Ｉ＾１ｇ＜＜中Ｓ９６．＾｜Ｉｓ６０１硝１资ｏ．〇巧‘〇＂山／山皂〇０Ｌ＂牺１含０＆海ｐ资寸。ｊＺ回１一０ｓ８＆々超Ｍ尝＼／，，￡Ｉ０Ｎ８古Ｄ。６６驾Ｐ答型Ｃ画己該３．ｒｏ￡０斬ｗ擊ＵＺ成〇８，答＋０／．侧型〇Ｚ８〇乂／化Ｚ１＾含接！孩柳粉＋窝１０吉》６吉成０寸型等‘《占０＼Ｚ資．占０ＴＺ＾０塔０吨１是ｒ一ｌ￡ｆ空三Ｊ＂型ｐ蝴Ｕ６．雙。钱〇１二人〇ｓ／８」雙？３１＂＠Ｉ霄ｄ＊立视ＪＺ岂擊二０５六型山ｕ９ｚ雙」ｌ巧ｌｚ＠／‘‘口５Ｉ餐？。霄３ｇｏ一若６ＩｅＣＴ。口巧６笔Ｉ，巧Ｊ＇樂ＴＯ一内５ＡＣ迴ｕ萬０ｃ三６Ｏ君ｌ家－６逝Ｊ／ｓ０．＂ｏ迴Ｉ６．！Ｓ帮３ｏ０寸ｌ〇ｗ６０应？巧ｓ９ｓ．Ｐ二一八＆／？‘０中＊帮＂ｐＨ山￡９ｕ寸６ｊ」望＂１中中ｄ＆１成ｃｌ＂３公Ｕ々占。．Ｕ。￡０。Ｕ雌齊Ｉ。Ｈ５１－兵ＨＺ．系１＋Ｚ价．Ｖ＾ｓ当％Ｌ９寸貧－．６Ｎ６另娘－础義寸．１０〇Ｎｃ‘９ｒ画ｗ／Ｏ’山＋３ｌ尝。０＋Ｉ９￡ｃ６》ｌ＋ｑ．ｒａ国ＳＥ０叛ｊＨ９幻．月＂１９咪〇８￡ａ’六／Ｓ．８〇〇０化３Ｔ０滅．０＂Ｈ粉－８＾＾岂成０ｈ８口０Ｘ爲’Ｓ＾０ＺＪ吨９ＷＷ＾游ｐ粉號Ｊ６｛柳８Ｈ巨￡逗§堪Ｉ巧雙／６寒｜Ｎ勢Ｓ１＜ＪＮ。’刪Ａ１Ｕ々。卷三０５笔Ｉ９卷ｓ餐／ｒ‘二均ｕｇｏ０均Ｓ卷立公巧ｕ衣ｏＪＪ／馬Ｏ￥９．馬ｓ／Ｊ迴６．３迴９Ｕ當Ｓ／０々Ａｕ禾Ａ／．ａｓ９Ｊ齊’材Ｓ／８齊ｖ’＞／？密嚮＇３ｓ６３＃中三０寸棘和望棘ｕＣ中０＾ｑ＾皆ＪＰ抓迴，２迴Ｊ２３ｑｇ！％未ｌ／一的淮２呈准＇《ｔ１ＢＭＢ３望朝＾蝴ｕ凑＊＊＊＊ 二－＇浙江大学硕±学位论文章基于主蛋白１法ＥＬＡ第特异巧多杭的王浆新鲜度夹记１Ｓ检测２．３．５双抗体夹记法趁验蜂王浆新鲜度°－ＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析４０Ｃ恒温品用Ｓ下经过处理不同天数的蜂王浆样，结果如图２４ＭＲ°ＪＰ１ＪＰＲＪＰＭＲＪＰ５等所示。结果显示，ＭＲ、２、Ｍ３、蛋白在４０Ｃ加温处理后均有大量降解Ｊ－ＰＡ加电，其中ＭＲＪＰ３、ＭＲＰ５在处理２８ｄ后几乎完全降解，用ＳＤＳ泳方法不可检出；用ＩｍａｇｅＪ软件分析ＭＲＪＰ１电泳条带灰度，ＭＲＪＰ１，在第７、１４、２１、２８、３５ｄ，ＭＲＪＰ１３８５３、５、，含量分别下降为．０％、．０％９．８％６２．７％、７２．２％（；次独立试验见附录－６１）。－ＤＳ－ＰＡＧＥ品中的ＭＲＪＰ１用Ｓ检测加温老化处理蜂王浆样含量，结果（如图２６）显°示、１、２１、、ＲＰ１、，经４０Ｃ老化处理的鲜王浆在第７４２８３５山ＭＪ含量分别下降３７．０％５５．５％、６０．１％、６１、２０１４．８％６７．９％。此结果与文献中采用间接化ＩＳＡ法恃玫雖，）所得结果相似。ＡＢ１２３４５６０７１４２１２８３５－邸４含．２。■■圓圓？１１｜｜图２－５加温处理蜂王浆ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测结果’－－ＣＡＳＤＳＰＡＧＥ、，电泳图；１６４００７、１４、２１、２８３５ｄ的蜂王浆ＢＭＲＪＰ１降解率加温处理第；°Ｆ－－ｉ２５ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｉＲＪｉｓｕｎｄｅ４Ｃｒｉｎ３５ｄａｓｇｌｙｓｓｏｆｐｒｏｔｅｎｓｔｏｒｅｄｒ０ｄｕｇ０ｔｏｙ°－－ＡＳＤＳＰＡＧＥＫｓｕｌｔｓＬ．民ｌｌｌｔ４０Ｃｆｒ０７１４２１２８３５ｄａＢ（：ａｎｅ１６ｏａｅｓｏｒｅｄａｔｏｓ（）ｙ，，，，，；）ｊｙｙｒａｎ－ＤｅｄａｉｏｒａｔｅｓｏｆＭＲＪＰｌｉｎｒｏａｌｅｌｌｂＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｃｒｅｓｅｎｔｅｄａｓｇｔｙｙｙｙｐｊ＝ｉＳＤｎ３．ｍｅａｎ（）２４ 二－１浙江大学硕壬学位论文第章基于主蛋白特异性多抗的王浆新辑度夹Ｉ。法ＥＵＳＡ检测Ａ０７１４２１滋３５ＢＬ０ｒ／〇Ｑ８－／１接。６－霧ｉＴｍｉ／ｉ－，＿＿ＩＩ‘ＳＬ５么５丈５４５５５色５＾ｄ天数ＭＲＪＰ１含量％°图２－６４０Ｃ加温处理蜂王浆中ＭＲＪＰ１降解率‘Ｃ－Ａ４００、７、１４、、加温处理第．２１２８３５ｄ的蜂王浆中ＭＲＪＰ１降解率ＥＬＩＳＡ法与；Ｂ双抗体夹成ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电殊法相关性分析＂Ｆ－ｄａｔｔｆｄｅｉｇ．２５ＤｅｇｗｉｏｎｒａｅｓｏＭＲＪＰ１ｉｎＲＪｕｎｒ４０Ｃ（Ａ）ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆＭＲＪＰｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎｒｏｙａｌｊｅｌｌｙｓｔｏｒｅｄａｔ４０Ｃｆｏｒ０，７，１４，２１，２８，３５ｄａｙｓ；ＢＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｅｎｓｉｔｖａｌｕｅｒａｔｉｏｏｆＭＲＪＰｌｂＩｍａｅ！ｒｏｇｒａｍａ打ｄｔｈｅＣＯ打ｔｅ打ｔｏｆ（）ｙｙｇｐｅｗＥＬＡＭＲＪＰｌｉｎｒｏｙａｌｌｌｂｙｓａｎｄｉｃｈＩＳｊｙ２．４讨论从Ｍ民－ＪＰｌ序列选择特异性氨基酸序列ＳＧＥＹＤＹＫＮＮＹＰＳＤ瓜（ＭＲＪＰｌ序列５６７０位），ＳＰ－２ＭＲＪＰ１ｌｔ合成多肤，制备成特异性抗体。经Ｗｅｓｔｍｂｏ检测，该抗体对蛋白具有较好ＭＲＪＰｌ序列－ＩＫＥＩＦＤ的特异性。本实验室前巧设计抗体针对３巧３７０位（ＡＬＰＨＶＰ），与ＭＲＪＰ家族其他成员均无３个政上连续的重复片段，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ印迹图中仅有ＭＲＪＰｌ蛋白对应条带（柳丹丹，２０１３，也具有较巧的特异性。）－－比对分析２个多肤序列可见－，ＳＰ２和ＳＰ１位置分别位于ＭＲＪＰｌ氨基酸序列的％７０３５９－３７０３００１＾位和位，两者相距个乂上氨基酸残基，距离较远，两者化无重复序列，符合双抗体夹记ＥＬＩＳＡ法设计原则，因此理论上具有可行性。通过实验验证，建立了利用双抗体夹记法ＥＵＳＡ检测ＭＲＪＰｌ含量的巧方法。、法的重复性本章对叱分析间接法和夹记、灵敏度和准确率，总结了两种方法的优势和缺陷：２５ 二－浙江大学硕±学位论文第章基于主蛋白１特异性多抗的王浆新鲜度夹也法ＥＬＩＳＡ检测１（）间接法读数重复性差，每次独立实验需要同时建立新的标准曲线，即毎次独立一记法重复性更好一实验需对拉，在个标准曲线；双抗体夹段时间内多次独立性实验可一、对应同标准曲线。由于ＭＲＪＰ１提纯困难、成本高（柳丹丹采用２４５０００ｇ离记５ｈ３００００Ｉ心３０ｍｇ离ｉｎ、２４５０００ｇ离记５ｈ），而合成或重组表达的ＭＲＪＰ１样品无糖基化，分子量比天然的ＭＲＪＰ１分子量小，２０１０），不，因（张礫文能作为标准品而选择双抗体＾夹於法可！乂节约ＭＲＪＰ１使用量，降低成本。２），，（间接法可在１天内完成实验达到了快速检测的目的；双抗体夹记法耗时长准确率更离、重复性更好。一０－８（３）在多次重复实验时发现，间接法般在片ｇ／ｍＬ范围内存在线性关系，其中一－－ｌ５５Ｌ范Ｉ、。双。法１Ｌ范．＿ｉ／ｍ围内线性关系最佳重复率更高抗体夹般在ｌ０ｘ／ｍ围内｜ｇ｜ｇ－存在线性关系，其中２．５１０ｇ／ｍＬ线性关系最佳。ｎ４一－（）Ｉ心法时ＡＡ使用双抗体夹，同４５０６３０可能对应不同浓度的样品，实验时需耍将一同样品稀释不同倍数レ乂确保最终检测浓度在标准曲线检测范围内。本章实验所用捕获杭体为实验室原有抗体，检测抗体则通过文献查阅进行选择，两ＳＡ法一种抗体均为兔多克隆抗体，双抗体夹记ＥＬＩ般比间接法灵敏度更高，在本实验中一没有体现，可能与抗体同源有关。在未来的研究中，可进步研究：一－（１）ＳＰ１、对抗体添加萌标记，作为检测抗体，进步作夷敏度、精确度重复性等差异叱较；２）、（设计非同源的多克隆抗体，如鼠抗鸡抗，避免杭体间交叉反应，提鳥灵敏度、精确度和重复性；３（）设计开发单克隆抗体，与多克隆抗体所建方法进行比较，提高灵敏度精确度和重复性。２６ 第；章基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电化技术的蜂蜜ＭＲＪＰ化江大学硕±学位论文１含量测定第王章基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电冰技术的蜂蜜ＭＲＪＰ１含量测定现有鉴别蜂蜜真伪的方法通常Ｗ搂假物质为目标，主要通过分析外源添加物的特征进行鉴别，５５ｋＤａ，ＪＰ１，。研究发现蜂蜜中含有分子量为的蛋白质即蛋白质是ＭＲ它属ＳＳ－于蜜蜂腺体的分泌物。本章实验通过ＤＰＡＧＥ电泳，结合ＩｍａｇｅＪ软件分析了蜂蜜中的ＭＲＪＰ１含量，并进行人为接假方法验证，对未知蜜源的商品蜂蜜进行了真伪分析。３．１材料、试剂与设备３丄１实验材料ＭＲＪＰ１标准品：实验室前期采用超速离记法制得柳丹丹，２０１３）；（洋槐蜜：杭州碧于天保健品有限公司提供，产地东北；狼牙刺蜜，：浙江大学动物科学学院惠赠产地山西；百花蜜：浙江大学动物科学学院惠赠，产地福建：冬青蜜：浙江大学动物科学学院惠赠；、麥花蜜，化把蜜：海盐昇蜂养蜂专业合作社提供产地浙江；商品蜂蜜：澳口大学惠赠，蜜源未知；玉米糖浆：市售。３．１．２实验试剂’－、Ｔｒ、、、、试剂：十二烧基蹟酸巧ｉｓ甘氨酸丙炼斬胺过硫酸按Ｎ＾甲义双丙炼骑、（胺（Ａｍｒｅｓｃｏ），冰醋酸、甲醇考马斯亮蓝、乙醇国药集团化学试剂有限公司），ＴＥＭＥＤ（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）。耗化硝暖纤维素膜。（ＰＡＬＬ）２７ 浙江大学硕±学位论文第￡章基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳Ｐ技术的蜂蜜ＭＲＪ１含量测定３．．１３实验设备Ｓａ－ｒｔｏｒｉｕｓ）ＪＭ２５０括子分析天平（，小型数显电沫仪Ａ（大连竞迈生物科技有限么司），－ｂ－微型电转移系统ＴｒａｎｓｌｏｔＭｉｎｉ（ＢｉｏＲａｄ）Ｌｔ１００。，扫描仪ａｓｅｒＪｅＭ５（Ｈｐ）３丄４实證试剂的配制－３．１．４．１ＳＤＳＰＡＧＥ电泳试剂２１４．同．．３３丄４．２ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ反应试剂同２丄４．４３．２实验方法３．２．１蜂蜜样品巧处理°Ｃ’将已知６种蜂蜜样品用ｄ＆ＯＷ质量比１：１稀释，４袖提过夜，然后１２０００ｉｐｍ、４Ｃ３０ｍｉｎ离记，取上清液，得蜂蜜水提液。３－ＰＡＧＥＷｅＢｌ．２．２ＳＤＳ电泳■及ｓ化ｒｎｏｔ分析－取蜂蜜水提液，作ＳＤＳＰＡＧＥ电涂检测。电泳浓缩胶与分离胶浓度分别为５％和－Ｘｉ１２％Ｔｒｓ。２蛋白上样缓冲液与等量的蜂蜜水提液混匀，；电泳缓冲系统为甘氨唆缓冲液’’１Ｃ加热３＇００ｍｉｎ，１２０００ｒｍ、４Ｃ离心１０ｍｉｎ，取上清液１０变性ｐ，毎孔加样咕？ＷＭＲＪＰｌ（ｌｍｇ／ｍＵ为指示蛋白。具体步報同２．２丄３。用ＩｍａｇｅＪ软件分析电泳条带灰度。－、ＰＡＧＥ电泳对洋槐蜜冬青蜜进行ＳＤＳ，湿法转移至ＮＣ膜，进行ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析，具体步骚同２．２丄３。３－．ＰＡＧＥ电．２３渗假蜂蜜ＳＤＳ泳分析’ＬＣ在洋槐蜜中按比例加入玉米糖浆，混匀，用ｄＨ２０Ｘ质量比，４１：１稀禪抽提过夜，’－２０００ｒ、４Ｃ＇心３０ｍ然后１ｐｍ离ｉｎ，取上清液，作ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测，用ＩｍａｇｅＪ软件－ＳＤＳＰＡＧＥ电泳方法同３．２．２分析电泳条带灰度。２８ 浙江大学硕去学位论文ＳＤＳ－ＰＡＥ电泳第互章基于Ｇ技术的蜂蜜ＭＲＪＰ１含量测定－３．２．４商品蜂蜜ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析－－ＣＷ５，Ｃ１２１６，蜜），３２．１，３２．２取商品蜂蜜（编号Ｗ１源未知按．所述方法处理按．Ｓ－ＰＡＧＥ所述方法进行ＳＤ电泳分析，用ＩｍａｇｅＪ软件分析电化条带灰度，预判未知蜂蜜真伪。３．２．５数据分析所得数据用ＩｍａｇｅＪ软件和Ｅｘｃｅｌ软件进行统计分析。３．３结果与分析３－．３．１己知蜜源蜂蜜的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测结果根据文献报道，蜂蜜中分子量为巧ｋＤａ的蛋白质是ＭＲＪＰ１，来源为遵蜂工蜂分泌物（Ｂｉｌｉｋｏｖａｅｔａｌ，２０１０）。１义ＭＲＪＰ１为标准分子量蛋白质Ｍａｒｋｅｒ，６种蜂蜜中蛋白质的一ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电化结果见３－１。用Ｉｍ巧ｅＪ软件分析电咏条带灰度，第泳道ＭＲＪＰ１上样量５品泳道中５７ｋＤａ为帖，分别测定各蜂蜜样分子量为蛋白条带灰度，将该灰度与泳道１标准ＭＲＪＰ１的灰度相比，推算得到各蜂蜜样品中ＭＲＪＰ１含量（￡次独立试验，见附录６－２ＲＪＰ１含－１，３））推算各蜂蜜样品中Ｍ量（表。２９ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳Ｐ浙江大学硕壬学位论文第兰章基于技术的蜂蜜ＭＲＪ１含量测定誦ＩＬｆｌｉｐ３－１ＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｓ化ｒｎＢ图已知蜜源蜂蜜的电泳及Ｗｌｏｔ分析－－Ｆｌｌｈｆｉｇ．３１ＳＤＳＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｏｔａｎａｙｓｉｓｏｆｏｎｅｙｓａｍｌｅｓｏｋｎｏｗｎｎｅｃｔａｒｓｏｕｒｃｅｓｐ－－－－－ＡＰ－：ＳＤＳＡＧＥ电泳１Ｍ艮ＪＰｌ２洋槐蜜３冬青蜜４狼牙刺蜜，意蜂５巧花蜜，中蜂；；；：；６－－Ｗ－－桃化蜜，７，。ＢｔｅｒｎＢｌｔ，１２。中蜂；赛花蜜意蜂：ｅｓｏ印透图冬青蜜；洋槐蜜－ａｓＡＳＤＳＰＡＧＥ打ａｌｓｉｓｏｆ．ｎｅｌ１Ｌｏ打ｅａ打ｅ（６ｋｎｏｗ打ｈｏ打ｅＬａ．ＭＲＪＰａ打ｅ２．ａｃａｃｉａｈｏｎｅＬａｎｅ３．ｉｌｅｘｈＬ４．）ｙｙ，ｙ．ｙ．Ｓｏｈｏｒａｄａｖ－ｉｄｉｉｈｏｎｅｙＬａｎｅ５．ｏｌｆｌｏｒａｌｈｏｎｅＬａｎｅ６．ｌｏｕａｔｈｏ打ｅＬａｎｅ７．Ｃｈｉｎｅｓｅｄａｔｅｈｏｎｅｙ．ｐ．ｐｙｙ，ｑｙ．ｌｆａｃａｉｈｉｌｈ丄ａｎｅｈｏｎｅｉ（ＢＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔａ打ａｓｉｓｏｃａｏｎｅａｎｄｅｘｏｎｅｌ．ｉｌｅｘＬａｎｅ２．ａｃａｃａｈｏｎｅ．）ｙｙｙ．ｙｙ表３－１根据犯Ｓ－ＰＡＧＥ电泳条带灰度分析蜂蜜中ＭＲＰｌＪ含量Ｔａｂ－－ｌｅ３１ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＲＪＰｌｉｎｈｏｎｅｙｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＳＤＳＰＡＧＥｒａｓｃａｌｅｏｇｙ每孔證肌含量样品歷Ｐ１含量与Ｍ民ＪＰｌ灰度之叱ｍｇ／Ｍｇｇ＿ＭＲＪＰｌ１１１５洋槐蜜０．５５０．６２０．６１２＋．１９１．１＋０．０．９７０９８冬青蜜０．８２１．１７１．０７５．１０±０．９１２．０４±０．３６＋＋．５２狼牙刺蜜０．５９０：０．５９２．８２０２６１１．．３０．０８０．２４．３６０．４２０．４６８±０９百花蜜０１．６９±０．６．１０４０乂２０４９±±比把蜜．５．２．７５０．３４１１０．１４才．０＋０．３８０．４５．４１２．０７０．８３±．参花蜜０．１９０００８３－．３．２惨假蜂蜜ＳＤＳＰＡＧＥ电沫分析－－－按出例在洋槐蜜中添加玉米糖浆２），ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析结果见图３３，（图３用－－－ＩｍｅＪ３２（兰次独立试验。２巧软件分析电泳条带灰度分析结果见表，见附录６３）由表３可知，在己知蜜中添加玉米糖浆，Ｗ纯蜂蜜为对照，分析电泳条带灰度，可Ｌ义推算蜂蜜－ＰＡＧＥ攘假程度。结果表明用ＳＤＳ电泳鉴别蜂蜜真伪具有可行性。３０ 浙江大学硕击学位论文ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电ＲＪＰ第兰章基于泳技术的蜂蜜Ｍ１含量测定〇０７：＼１０：３５：５３：７〇：ＨＭ３－２图按叱例攘假的洋槐蜜（洋槐蜜：玉米糖浆）Ｆ－ｉｇ３２Ａｃａｃｉａｈｏｎｅａｎｄａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄｈｏｎｅａｄｄｅｄｃｏｒｎｓｒｕｉｎｏｒｏｒｔｉｏｎｓｙｙｙｐｐｐ薩－图３３惨假蜂蜜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析－１５：玉米糖浆洋槐蜜１０：０、７：３５：５、３：７、０：１０、－－Ｆｉ３２ＳＤＳＰａｎａｓｉｓｏｆｔｔｅｇ．ＡＧＥｌｙａｄｕｌｅｒａｅｄｈｏｎｙ１－ｒｔＬａｎｅ５ｉｏａｃａｉｈｔｒｎｓｕ１０：０７３５：５７０：１０．Ｐｏｉｏｎｏｆｃａｏｎｅｏｃｏｒｏｆ：３：ｐｙｙｐ，，，，表３－２惨假蜂蜜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳灰度分析＊－－ｓｃａｂ２ＳＤＳＰＡＧＥｒａａｌｉｆｋｅｒｈＴｌｅ３ｌｅａｎａｓｓｏａｄｕａ化ｄｏｎｅｇｙｙｙ胃ｔＷｆｄ灰度比率理论值洋槐蜜：玉米糖浆＾％１０１Ｉ１１：０．９７．．．．７１：３０．７化００４０６０７０８８５２５：５０．４９±０．０４０１０．５０．５８．３：７０．３３±００３２４０．３０．３９１００：００１未检出３１ 浙江大学硕击学位论文第￡章基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳技术巧蜂蜜ＭＲＪＰ１含量测定３－．３．３未知蜂渣ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析－对未知蜂蜜进行，结果见图３４ＩｍａｅＪ；用ｇ软件分析电泳条带－灰度，Ｗｌｍｇ／ｍＬＭＲＪＰｌ为对照，结果见表３３。１２３４５６１２３４５６？’＇坤Ｉ．’点呼狂＼＼ｆ＇韻Ｍ曲Ｗ．—：－？ｙＨＥｙｓｓｉ５｜ｉＢｍ…＇■；Ｖ識’＾－■ｗＰｉ＂…ｉｉｒｉｈｉｉｗＪ邮＂動ｉＭＭ３－４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电图商品蜂蜜ｉ永结果－－－－．ＭＲＪＰ．．．Ａ：ｌｌ；２６Ｗ１Ｗ６；Ｂ：ｌＭＲＪＰｌ２６Ｃ１２Ｃ１６。；－－Ｆｉｇ．３３ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｓｉｓｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｈｏｎｅｓａｍｌｅｓｙｙｐ－ｎｅ－－Ｗ－ＡＬａｎｅｌ．Ｌａ２６．Ｗ１６Ｌａｎｅｌ．ｌＬａｎｅ２６．ＣＭＲＪＰｌＭＲＪＰ１２Ｃ１６（），；巧）’表４－５商品蜂蜜电涂条带灰度分析Ｔａ－－ｍｂｌｅ４５ＳＤＳＰＡＧＥｒａｓｃａｌｅａｎａｓｉｓｏｆｃｒｉｌｌｅｓＩｍａｅＪｇｙｌｙｏｍｍｅｃａｈｏｎｅｙｓａｐｂｙｇ￣￣毎孔ＭＲＪＰＩ含量ＭＲＪＰ１样品与ＭＲＪＰｌ灰度比率真伪鉴别ｍｇ／ｇ１ＭＲＪＰｌ１５２Ｗ１０．７２３．６０１．４４真３Ｗ２０．９９４．９６１．９８真４Ｗ３０１．６．３３．６７０７可能惨假５Ｗ４０．３６１．８２０．７３可能惨假６Ｗ５１１．３６．８５．８９２真７Ｃ１２１．１８５．９２．３６真８ＣＩ３未检出＃假９Ｃ１４０．０．５１２．５５１２可能惨假１０Ｃ１５未检出惨假１１Ｃ１６真＾＾对样品真伪进行预判，Ｗ１、Ｗ２、Ｗ５、Ｃ１２、Ｃ１６可初步判定为真蜂蜜，Ｃ１３、Ｃ１５一可初步判定为授假蜂蜜，Ｗ３、Ｗ４、Ｃ１４由于信息不全面，不能准确判断，需进步验证分析。３２ 渐江大学硕主学位论文第兰章基于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳技术的蜂蜜ＭＲＪＰ１含量测定３．４讨论一ＢＵ、ｉｋｏｖａ等研究了蜂花粉花露和５种单蜜源的蜂蜜，发现蜂蜜中存在分子量约为５５ｋＤａ，的蛋白，发现这种蛋白在花露中不存在，在蜂花粉和蜂蜜中均存在用完整的ｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｋｌ检测，这种蛋白为ＭＲＪＰ１蛋白ＢｉｌｏｖａｅｔａＭＲＪＰ１蛋白制备多克隆抗体，经Ｗｅ（，２０１０。张金连对１７种未经加工的天然蜂蜜和１８种经加工处理的市售蜂蜜进行了）－ＳＤＳＰＡ畑电泳分析，，发现５５ｋＤａ蛋白是所有被测蜂蜜样品中共有的依蜜源不同其含５５，ＲＪＰ１量差异较大，收集ｋＤａ蛋白进行ＬＴＱ质谱分析结果表明该蛋白可能为Ｍ（张金连２０１２。，）一ＪＰ完整的ＭＲＪＰ１蛋白制备的多克隆抗体不能单识别ＭＲ１蛋白，而能识别ＭＲＪＰｓ家族中所有蛋白（柳丹丹，２０１３），本实验使用巧抗体可特异识别ＭＲＪＰ１蛋白，证明蜂蜜中分子量为巧ｋＤａ的蛋白质为ＭＲＪＰ１蛋白，补充了Ｂｉｌｉｋｏｖａ的结果。—６ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶蛋白条带灰度分析ＭＲＪＰ１为本巧究对种蜂蜜进行了。Ｗ定浓度的对照和标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ，根据蜂蜜５５ｋＤａ附近条带灰度与ＭＲＪＰ１条带灰度之出，推算蜂蜜样品中ＭＲＪＰ１含量，作为半定量检测结呆具有可行性。在洋槐蜜中按比例加入玉米糖，，浆，分析电泳条带灰度与纯洋槐蜜电泳条带灰度之比结果与搂假化例相近表明用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳灰度分析＆知蜜源蜂蜜援假程度具有可行性１０。对种商品蜂蜜进行一－ＭＲＪＰ１为对照和标准蛋白ＭａｒｋｅｒＳＤＳＰＡＧＥ由泳分析Ｌ，根据灰度推算，乂定浓度的ＭＲＪＰ１含量，其中２个样品未检化任何蛋白条带，可Ｌ义判断为假蜂蜜；５个样品的ＭＲＪＰ１ＪＰ１ＪＰ１，条带颜色深，推算ＭＲ含量较高，判断为真蜂蜜；３个样晶的ＭＲ条带颜色较浅一ＭＲＪＰ１含量较化，由于缺少样品蜜源信息，不能准确判断，需要进（与百花蜜接近）步验证分析。３３ 浙江大学硕壬学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测研究第西章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳ乂检测研究Ｄ－ＰＡＧＥ蛋白电泳ＳＳ和蛋白条带灰度检测方法通常作为只能作为半定量手段，存在一定局限性，对蛋白偏化的样品含量难Ｗ检测。为此，本章开展了通过ＥＬＩＳＡ方法法分析蜂蜜中的ＭＲＪＰ１含量，建立了定量栓测蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的方法探索，并通过人为搂假验证所建方法，对商拓蜂蜜样品进行了真伪分析。４．１材料、试剂与设备４丄１实验枯料ＭＲＪＰ１标准品Ｉ。法制得２０１３：实验室前期采用超速离柳丹丹，）；（洋槐蜜：杭州碧于天保健品有限公司提供，产地东北；狼牙刺蜜；珊江大学动物科学学院惠瞻，产地山西；百花蜜，：浙江大学动物科学学院豪赠产地福建；冬青蜜：浙江大学动物科学学院惠赠；．枕化蜜麥巧蜜：海盐昇蜂养蜂专业合作社提供，产地浙江；，商品蜂蜜样品：澳口大学惠赠蜜源未知；玉米搪浆：市售。４丄２实验试剂及耗材－、试剂；ＨＲＰ羊抗兔抗体、ＴＭＢ显包液，、攝酸（碧云天生物技术）氯化钢氯化钟二二、碳酸制、碳酸氨纳氨销、攝酸氯钟、浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司）ｓｔ耗材：９６孔酶标扳３５９０（Ｃｏａｒ）４丄３实验设备、ｋａｎＭｋ３＇心Ｍ山ｔｉｓ酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ），电子分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ），离机＾ＷｌＨａｍｂｕｒｇ），。（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ冰箱（杭州华日电冰箱有限公司）３４ 浙江大学硕壬学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测研究４．１．４实验试剂的配制４．１．４．１ＥＬＩＳＡ反应试剂２丄４．２同。４．２实骆方法４２１．．蜂蜜样馬预处理姐’〇Ｗ１１４Ｃ抽１２０００ｍ、４将蜂蜜样品用２质量比：稀释，提过夜，然后ｒｐｒ离把３０ｍｉｎ，取上清，得蜂蜜水提液。４．２．２ＥＬＩＳＡ分析分别用ＣＢＳ和ＰＢＳ稀释蜂蜜水提液至标准曲线检测范围，间接ＥＬＩＳＡ方法操作同２．２．７记ＥＬＩＳＡ方法具体操作步骤如下，夹：－ａ．包被捕获抗体：将ＭＲＪＰＳＰ１２０１３Ｓ１：１００００１多克隆抗体（柳丹丹，）用ＣＢ稀°Ｃ释，ＷＯ〇／ｗｅｌｌ９６，３７２ｈｌｎＬ加入孔酶标扳解育；’ｂ．４Ｃ封闭：毎孔加入２００＾５％脱脂巧粉，过夜叫；Ｃ．洗板：弃尽包被液，毎孔加入２００叫＾ＰＢＳＴ，置于平板摇床上就緣５次，毎次５ｍｉｎ；ｄ．加入抗原：用？８８将蜂蜜水提液稀释至标准曲线检测范围，＾１００＾１７？纽加入９６‘孔酶标板，４Ｃ过夜；ｅ－－．加入酶标抗体：ＰＢＳ将２２丄４ＳＰ２：１０，１００用．得到的ＨＲＰ抗体Ｗ１００稀释‘Ｖｗｅｌｌ口入９６３７Ｃ反ｈ力，应２叫酶标板；ｆ．洗板：弃尽包被液，毎孔加入２００叫＾ＰＢＳＴ，置于平扳摇床上洗缘５次，每次５ｍｉｎ；ｇ．显包：毎孔加入２００ｉＬＴＭＢ显仓液（按试剂盒说明书操作），３７＾避光反应＾１５ｍｉｎ；ｈ５０．终止显包：每孔加入叫Ｊ冬止液；Ｌ读数：立即量于酶标仪上，读取４５０ｎｍ、６３０ｎｍ处的吸光值。３５ 浙江大学硕±学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰｌ含量的ＥＵＳＡ检测研究４．２．３脱仓蜂蜜ＭＲＪＰ１含量分析由于蜂蜜祥品的颜色差异较大，为消除颤色对检测时的干扰，对蜂蜜样品进行脱色处理，方法如下：取蜂蜜水提液，按００Ｖｗｌｌ９６，４５０ｎｍ１叫ｅ加入孔板用酶标仪读取处读数。’＝Ｃ取蜂蜜水提液，按体积：５１（活性炭，４，１２ｒｍ、质量：ｍ＾ｇ）加入过夜处理０００ｐ’４Ｃ离记３０ｍｉｎ，取上清，得到脱仓蜂蜜水提液。按４．２．２方法分析脱色蜂蜜水提液中ＭＲＪＰ１含量。４．２．４蜂蜜人为搂假实验鉴定’Ｃ，按比例加入玉米糖浆，充分混匀，用ｄＨ〇ｌＭ质量比１１，４取洋槐蜜２：稀释抽提‘、过夜，然后１２０００ｒｐｍ、４Ｃ离，心３０ｍｉｎ，取上清液。按４．２．２所述双抗体夹记化ＩＳＡ方法对捧假蜂蜜进行检验。４．２．５商馬蜂蜜样品真伪判别、、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、、、将来自澳口，蜜源未知的蜂蜜样品１Ｗ２Ｃ１２Ｃ１３（编号Ｗ°°Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６）用姐２〇Ｗ质量比１：１稀释，４Ｃ抽提过夜，然后１２０００ｒｐｍ、４Ｃ离记３０ｍｉｎ，取上清液，按４．２．２所述双抗体夹仿ＥＬＩＳＡ方法对样品进行检验。４．２．６数据分析所得数据用ＤＰＳ软件和Ｅｘｃｅｌ软件进行统计分析。４．３结果与讨论４．３．１用ＥＬＩＳＡ法分析蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量分别用间撞法和夹记法检测蜂蜜和脱色蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量，同时制作标准曲线，将曲线－－结果代入标准，计算得到蜂蜜样品中ＭＲＪＰ１含量，结果见表４１。结合ＳＤＳＰＡＧＥ４－２电泳结果分析，结果如图所示。蜂蜜颜色根据４５０ｎｍ处吸光度由浅至深依次为枕化（０．０４６７）、狼牙刺蜜（０．０４８３）、洋槐蜜（０．０５６）、百花蜜（０．０７１）、麥花蜜（０．１０５７）蜜，３６ 浙江大学硕生学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＡ１Ｓ检测研究品见图４－１，，蜂蜜样。结果未明巧龟蜂蜜颜色对结果影响不大间接法和夹把法均可直接检测，，；深仓蜂蜜颜色对结果影响较大采用间接法检测需经脱包处理夹也法则可直接检测。愧樂冬片酱＇聲化並１１化酱狼才则樂化化巧图４－１６种已知蜂蜜样品Ｆ－ｋｎｏｉｇ．４ｌＳｉｘｋｉｎｄｓｏｆｈｏｎｅｙｓａｍｌｅｓｏｆｗｎｎｅｃｔａｒｓｏｕｒｃｅｓｐ＊－１ＥＬ法检测蜂蜜ＲＰｌ表４ＩＳＡ中ＭＪ含量－Ｔａｂｌｅ４１ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＲＪＰｌｉｎｈｏｎｅｙｂｙＥＬＩＳＡａｎａｌｙｓｉｓ蜂蜜水提ＭＲＪＰｌ含量ｍｇ／ｇ蜂蜜品种液４５０ｎｍ间接法夹，心法处读数未脱色处理脱色处理未脱色处理脱色处理±±０洋槐蜜０．０５６１．０９４±０．０９２１．１６４０．０６２１．１３０．０６９１．０９３±０．０１６＂＋＋＋０．０９５７４．２７９±０．５４４１．２５７０．０７８．．１．．１冬青蜜１８８９０１２３８５９０２１＊＊＊＊＋＋．．０．．．．百花蜜００７１１０５９±０．０７４．５；？２００３９０．５８５±００２４０５１５００２７＊＊０±Ｕ±＋＋狼牙刺蜜．０４８３０．９３９０．０９３３７０．０９４．９６０．０４２１．１３８０．０１１５４＂±＋０．０４６７１±０．１２６０７±０化化蜜．１０８０．０５３１１６３．０５８１．２５３００３９．．０７６．＂＂＋０１０５７．２５．．．０５６０．７．０１７０．１０４±０．０４２参花蜜．１４±００７２１００３±００５０８备注：＝２＝记法标准曲线＝（Ｕ间接法标准曲线ｙ０．０９３５Ｘ＋０．０５０７，Ｒ０．９９３２３，ｐ＜０．０１；夹ｙ０．０８４Ｘ＋２０＝２９７２，Ｒ０．９９６８４＜００１．．，ｐ＊＊２（）表示来脱色与脱色样品有显著性差异Ｎｏｔａｔｉｏｎｓ；＊＝２＝１Ｃａｎｖｏｆｌｏｎｎｒ．．．（）ｌｉｂｒａｔｉｏｃｕｒｅＭＲＪＰｃ化ｔｂｙｉｎｄｉｅｃｔＥＬＩＳＡｉｓｙ００９３５Ｘ＋００５０７，民０９９３２３．２＝＝＜０ＣａＨｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｎｂｄｗｉｃｈＳｉｓ０．０８０．２９７２，Ｒ０．９９６８４．．０１．ＭＲＪＰｌｃｏｎ化ｔｙｓａｎＥＬＩＡ４ｘ＋ｐｙ＊＊２ｍｅａｎｓａｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｏｒｉｉｎａｌｈｏｎｅｓａｍｌｅｓａｎｄｄｅｃｏｌｏｒｉｚｅｄｈｏｎｅｓａｍｌｅｓ．（）ｇｇｙｐｙｐ３７ 撫忠震海廣Ｖ日ＳＩ￥ｈ資扫ｐ．。若酬却ｉｄ８ｓ。ｆ０．ｄ；薑Ｉ夺山娜皆口邀＜ＣＪ－Ｗ佩福Ｑ回Ｗ？Ｉ斌？３？？祷Ｃ畜＊ＴＯ＜ｗｌ－ｌ山縣ｉ＾ｐ響苗！Ｉ！妄－＇邏迴ＩＤ栗Ｃ８泛窝ｒｏ．ｗ．．５１！｜昏出齡、＜爲ｗｌ－每ｌ山２Ｓ山空．乃！ｉ０Ｅ石》也ｆ；一ＷＪｄ！Ｆ＞－一ｓＣ￣ａｓ＞ｃｌ瞬．．＇聲ｕｃ画嫂ｊ＊嘗？Ｅ」？．与Ｑ５ｓ防嗦ｌｕｌＤ？，这■嫂Ｉｎｗ＊載ａＩ起Ｊ『Ｉ，也Ｎ五一８ｓ－．．：々扛Ｓ＾：受養ｏ可画ｃｏ－ｓｒａ空」８：：．ｍ０。：ｃｌ琴＾巨－．０严■ｆ〕一－々ｌ边０正－Ｍ＊ｓ？ｓ＞ｉＳ＾．Ｔ■ｌＷ聲＊垣ｌ挪中广Ｏ暗Ｓｓ８．．Ｓ批一！１ｐ节ＴＡ条 浙江大学硕±学位论义第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测研究４．３．２惨假蜂壁的ＥＬＩＳＡ检测将洋槐蜜和玉米糖浆按比例混合，用夹记法检测４５０ｎｍ和６３０ｎｍ处巧光值，将样品－ＡＡ，ＪＰ１４５０６３０代入标准曲线计算得出搂假蜂蜜中ＭＲ含量，Ｌ乂纯洋槐蜜的计算值作为理－论值对照，结果如表４４所示。当样品理论值为Ｏｍｇ／ｇ时，在标准曲线检测范围外，误差＇００－４Ｉ为１％可知，采用夹心法检测蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量，并Ｗ此推测惨假程度具有。由表４可行性。４－２ＭＲ表惨假洋槐蜜中ＪＰ１含量分析Ｔａｂ－ｌｅ４２ＴｈｅＭＲＪＰｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄａｃａｃｉａｈｏｎｅｙｓｂｙＥＬＩＳＡ惨颗比例ＭＲＪＰｌ含ｆｔｍｇ／ｇ误差％（蜂蜜：玉米糖浆）计算值理论值＋１０：０１．０９３００．０５６８７３０．７±００２７４．：５７９．０７６５１０．９５：５０．５１９８±０．０２３４０．５４６５４．９＋３．．：７０２８５２００２１２２７９１３０（Ｕ．００．１＋．０：１０４０００７７２０１００００．４．．３３商品蜂蜜样品的真伪判别ＪＰｌ－用夹记ＥＬＩＳＡ法检测蜜源未知的商品蜂蜜样品中ＭＲ含量，结果如表４３所示。－ＰＡＧＥ电泳条结合ＳＤＳ，Ｗ１、Ｗ２、Ｗ５、Ｃ、带灰度分析对样品真伪进行鉴别１２Ｃ化可１、、Ｗ４、Ｃ１４由于信息不全面初步判定为真蜂蜜，Ｃ３Ｃ１５可初步判定为棱假蜂蜜，Ｗ３，一不能准确判断。，需进步验证分析３９ 浙狂大学硕壬学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＵＳＡ检测研究、－３沁ＥＬ－表４夹ＩＳＡ法和ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析鉴别商品蜂蜜样品真伪Ｔａｂ－－ｌｅ４３ＩｄｅｎｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｏｏｍｍｅｒｃｉａｏｎｅｓＥＬＩＳＡａｎｄＳＤＳＰＡＧＥｔｈｅｙｆｃｌｈｙｂｙＭＲＪＰ－ｌ含量计算值ＳＤＳＰＡＧＥ预判值样品真伪鉴别真伪鉴别ｍ／ｍ／ｇｇｇｇＷ１１．４２％±０．０１５８真１．４４真＋Ｗ２Ｌ８７１４０．１３２７真１．９８真Ｗ３０．２３的±．．０００４３可能惨假０６７可能惨假Ｗ４０．２４８０±０．００３８可能搂假０．７３可能惨假Ｗ５２．７９１０±００１９４２Ｊ６．真真＋Ｃ１２２８９１９．０２５４真２．３６真．０Ｃ１３０．２３２７±０．０１５４惨假未检出惨假１９＋０．０１Ｃ１４１．３２９４可能惨假１．０２可能惨假Ｃ１５０．１９７６＋０．０１５２惨假未检化惨假Ｃ＋１６２．巧％０．０３１７真２．１８真４４．讨论ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳灰度分析鉴别蜂本研究第Ｓ章建立了蜜真伪的方法，该方法可作半定量分析，不能对结果进行准确定量分析。Ｂｉｌｉｋｏｖａ的研究中同样建立了间接ＥＬＩＳＡ检测蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的方法巧ｉｌｉｋｏｖａ幻ａｌ，２０１０），ＭＲＪＰｌ标准物质采用Ｓｉｍｕ出（２００１）的方法提取。该研究有两个缺陷：（１）研究中采用重组表达ＭＲＪＰ１蛋白制备的抗体，经过实验验证，该抗体不能在ＭＲＪＰ家族中特异性识别ＭＲＪＰｌ（柳丹丹，２０１３）；（２）该研究缺少蜂蜜颜包对结果影咱的验证。ＭＲＪＰ－－证Ｍ民ＪＰ家族中特异性识本研究利用ｌ特异性杭体ＳＰ１、ＳＰ２，经验，均能在ＲＪＰ１Ｂｉ别Ｍ，弥补了ｌｉｋｏｖａ研究的缺陷。本章实验分别利用间接法和夹瓜法检测蜂蜜中的ＭＲＪＰｌ含量，并验证了颜色对检测结果的影响。结果表明深色蜂蜜的颜包对于间接法检测结果影响很大，采用间接法检测ＭＩＵＰ１，浅色蜂蜜可直接检测深包蜂蜜中含量需对蜂蜜进行脱色处理；颜色对双杭体夹记ＥＬＩＳＡ法检测结果影响较小，利用双抗体夹也法检测蜂蜜中ＭＲＪＰｌ含量可不经过脱包４０ 化江大学巧±学位论文第四章蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的ＥＬＩＳＡ检测研究处理。基于本研究建立的双抗体夹Ａ法，高度渗假蜂蜜或纯假蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量在检测范困外，误差率接近１００％。本研究仅１＾义６个已知样品进行检测分析６，所用方法在个样品内进行惨假分析结果可信，可初步判断从ＭＲＪＰ１含量作为检测蜂蜜真伪其有可行性，为建立新的蜂蜜真伪检测。标准提供了理论依据本章实验用所建方法对未知蜂壁样品进行了真伪预判分析，由于缺少样品蜜源、产地等信息，预判结果与实际结果无法对比验证，需要得到样品的详细信息及其它方法所得检验结果对本章结果进行验证。蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量随产蜜时间、产地、蜂种和蜜源变化很大，本实验得到的结果具有局限性，在未来的研究中、、，，应广泛收集不同时间产地蜂种和蜜源植物的蜂蜜样品建立相关数据库，确定毎种天然蜂蜜中ＭＲＪＰ１的最低含量，在数据库基础上建立分析方法。，并制定相关标准４１ 浙江大学硕±学位论文第五章结论与展望第五章结论与展望５．１本研究主要研究成果ＭＲ１－２（１）制备了ＪＰ特异性多克隆抗体抗体ＳＰ，对此抗体添加辣根过氧化物酶标记ＨＲＰ－－ＳＰ－ＳＰ２）１，ＲＪＰ１（，与原有抗体结合开发了特异性检测Ｍ含量的双抗体夹瓜ＥＬＩＳＡ方法。’ＳＡ法ＳＰ－Ｃ双抗体夹记ＥＬＩ最佳反应条件为：包被捕获抗体１，３７反应２ｈ；５％脱脂‘’°－－奶粉，４Ｃ封闭过Ｃ反应过夜２，７Ｃ反应２，４加入酶标抗体ＨＲＰＳＰ３孩加入抗原；°ｈ；加入ＴＭＢ显色液，３７Ｃ反应１５ｍｍ。２－５比较了双抗体夹记法与间接法的优缺点．５（）。本研究中间接法最佳检测范围为１Ｌ＇－＇／ｍ，夹心法２．５１０／ｍＬ。法重复性、最佳栓测范围；夹更好准确度夏高胆ｎｇ；间接法用一时较短，可Ｗ作为快速检测手段，但重复性般，毎次独立实验需建立新的标准曲线，一一浪费ＭＲＪＰ１标准品把法耗时长，但重复性好，可Ｌ义段时间内使用同标准曲线，；夹节省ＭＲＪＰ１标准品。３ＥＬＩＳＡ捡测分析了蜂王浆中ＭＲＪＰ１随时间降（）用所建双抗体夹也法解程度，结一－ＰＡＧＥ电咏分析所得结果果与间接法和ＳＤＳ致。４ＳＤＳ－ＰＡＧＥＩＪＰ）ｍａｅＪ１（建立了电泳结合ｇ软件进行灰度分析预判蜂蜜中ＭＲ含量的方法。对己知蜂蜜进行人为惨假，用ＩｍａｇｅＪ软件分析电泳条带灰度，结果与理论值接近，证明方法具有可行性。、ＥＬ立ＥＬＩＡ法和夹ＡＩＳＡ法检测ＲＪＰ１含量的新方法，（５）建了间接Ｓ蜂蜜中Ｍ其中间接ＥＬＩＳＡ法对澡包蜜可达到快速检测的目的，深色蜜需要脱佐处理；夹记法可基本排除颜色对结果的影响。ＬＩＳＡ法（６）用所建夹记Ｅ检测了惨假蜂蜜和商品蜂蜜，进行蜂蜜真伪鉴别。结果与ＤＳ－ＰＡ畑担Ｓ泳灰度分析结果基本相符，证明用所建化ＩＳＡ鉴别授假蜂蜜可行。２５．主要创新点１）ＳＡ。（建立了双抗体夹ＥＬＩ检测ＭＲＪＰ１含量的方法４２ 浙江大学硕±学位论文第五章结论与展望２立ＥＬＩＳＡ检测ＭＲＪＰ１降解（）建了双抗体夹程度的方法。３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳ＩｍａｇｅＪ（建立了与软件结合预判蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量Ｌ义鉴别蜂蜜真伪的方洁（４立了间接ＥＬＩＡ和夹记化ＩＳＡ检测蜂蜜中ＭＲＪＰ１含量的方法，并Ｗ建立方）建Ｓ法鉴别蜂蜜真伪的新方法。５．３研究展望、１同源的ＭＲＪＰ１，法的灵（）制备非特异性多克隆抗体或单克隆抗体提高双抗体夹成敏度和精确度。（２）收集不同产地、时间、蜜源、蜂种的蜂蜜样品，建立每种蜂蜜ＭＲ评１含量数据－库。建立ＳＤＳＰＡＧＥ电泳、ＥＬＩＳＡ法结合数据库鉴别蜂蜜真伪的方法。４３ 浙江大学硕１学位论文参考文献参考文献－．１０４４２８８．食品科技２００：２８．川鲍会梅真假蜂蜜理化指标的分析阴，，口］沈立荣，柳丹丹，于张颖，肖发，李玫雜，张環文．蜂王浆主蛋白ＭＲＪＰ１特异性抗体及其制－－备方法与Ｅｌａ．３０５９１３５Ａ２０１３０４２４．ｉｓ定量检测町浙江：ＣＮ１０，－肖凯军林福兰．２００７１２：５５４５５８．Ｐ］陈健，，拉曼光谱在食品分析中的应用町食品科学，，［４］陈兰竣，赵静，叶志华，钟艳萍．蜂蜜真伪的近红外光谱鉴别研究［叮光谱学与光谱分析，２００８２５６５－２１１：％８．，口］方国楠方建生，田树革．蜂王浆成分及其分析方法研究进展［Ｊ］．中国乳品工业，１９％０６：２７８－２％．－６费晓庆，沈．液相色谱／元素分析同位素叱值质谱联用法鉴定蜂蜜惨假，吴斌崇辖，等［］－９．．色谱２０１１２：１５１饥，，％１）７－－－耿敢王喜军．５楚甲基２慷酪书Ｍ中药复方中的研究现状及相关药效探讨．［］口巧在的世界科学技术－２００５７６５２－５６中医药现代化：．，，（）８桂茜霎林宏．Ｊ．，下涛，等坤含量测定在蜂蜜梭假鉴别中的应用食品安全质量检测［］，［］２０１４－１０１５．学抵：３００８３０，（）２０１０３１２３口］郭善广．：，仇农学苹果浓缩汁非酶褐变动力学及影响因素町食品科学，，（）７９－８３．１０Ｐｌｉ．李玫雖．蜂王浆主蛋白（ＭＲＪｓ）超滤分离及重纽抗菌化Ｒｏａｓｉｎ利用技术研究阳］浙［］ｙ江大学，２０１４．１１李水芳．．［，单杨，尹永，等拉曼光谱法快速鉴别蜂蜜中惨入甜莱糖浆的可行性研究机］１４－中国食品学报２０１２Ｕ（６；８１５３．，，）［１２］李志军，仇凯，李宇栋，等．ＨＭＦ及其在乳制品质量评价研究中的应用［Ｃｙ／中国乳制２０－品工业协会第十八次年会论文集．１２：１４７１５２．－江太学１．王浆主蛋白ＭＲＪＰ１分离测定及对细胞的促生长作用研究Ｄ．浙２０１３．，［引柳丹丹［］．ｍ艮直接鉴别植物生药材．Ｍ孙素琴１９９９１９，张宣秦竹，等光谱学与光谱分析，，［］，叫４－（）：５４２５４５．１５魏文挺．基于蜂王浆与盐酸显色反应和脂肪酸组成的蜂王浆质量控制研究Ｄ．浙江大［］［］学，２０１４．４４ 浙江大学硕生学位论文参考文献１６．二吴黎明ｉｅｒ，周群周蓝，等蜂王浆不同胆存条件下蛋白质级结构的Ｆｏｕｒ［］，变换红外２０８２－光谱研究口］．１：．光谱学与光谱分析，０９，２％８７）１７吴亚君．．，刘鸣畅，赵方圆，等采用毛细管凝胶电泳技术检测蜂王浆新鲜度［Ｊ］食品与［］２０１３巧４１６１－发酵工业１６６：．，，（）１８吴招斌．，陈芳，巧兰珍，等基于电感精合等离子体质谱法和化学计量学鉴别蜂蜜品［］－种研究Ｊ．化谱学与光谱分析２０１５１２１７２２２：．［］，，（）．＜］９许国庆：八第二届全国牛，赵慧，李克杰，等乳与乳制品中糖氨酸含量的测定方法［］［］＂＂奶精细化管理高峰论坛堅金字保灵杯奶牛养殖效益与牛巧晶质安全提井学术研讨会－论文集．２０４２２６１１：５７．，北京－２０－ＳＰＡＧＥ．张金连．基于葡萄糖昔酶活力与ＳＤ电泳图谱的蜂壁真伪鉴别研究［Ｄ］浙江［］Ｐ大学２０１２．，［２１］张娟，曾志将．不同胆存温度和时间对蜂王浆中游离氨基駿的影响［Ｊ］．江西农业大学２００８６－学报：９９７９９９．，，３０（）口２］张蝶文．中华蜜蜂ＡｃｃＭＲＪＰｌ在大肠杆菌及甲醇毕赤酵母中的表达及营养功能的研究Ｄ２０１０．］．浙江大学［，２３张鬼，杨秉呼，梁乾德，等．毛细管凝胶电泳法测定血浆中的癌泰得Ｊ］．色谱，２００５，２［］［３３－３７７４．：７４（）Ａｎ－－－－２４ｔｉｎｅｌｌｉＪＦ，Ｚｅｇｇａ打ｅＳＤａｖｉｃｏ民ｅｔａｌ‘Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ（ＥｌＯｈｒｏｘｄｅｃ２ｅｎｏｉｃ，，）ｙｄｙ［］ａｃ－ｉｄａｓａｆｒｅｓｈｎｅｓｓａｒａｍｅｔｅｒｆｏｒｒｏａｌｅｌＩＪＦｏｏｄＣｉｓｔｒ２００３：８．ｐｙｊｙ．ｈｅｍｙ８０１５８９［］，，（）［２引ＢｅｒｔｅｌｌｉＤ，ＬｏｌｌｉＭ，Ｐａｐｏ扣Ｇ，ｅｔａ］．Ｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆＨｏｎ巧ＡｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎｂｙＳｕｇａｒＳｙｒＵ－－－ｕｐｓｓｉｎｇＯｎｅＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌａｎｄＴｗｏＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＨｉｇｈ民ｅｓｏ］ｕｔｉｏｎＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃ－％ＲｅｓｏｉｉａｎｃｅＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒ２０１０５８１５：９５０１．［］ｙ，，８４ｇ（）２６ＢＵＡｏｖａＫＳｉｍｕｔｈＪ．ＮｅｗＣｒｉｔｅｒｉｏｎｆｏｒＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＨｏｎｅ：ｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ民０［，ｙ］ＱｌＰ化ｉｎＡａｌｂｕｍｉ打１ｅＥＬＩＳＡＪ．ｋａｌＪｅｌｒｏｐｉ打ＨｏｎｙｂｙＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｒｉｃｕｕｒａｌａｎｄＦｙｙ［］ｇＣｈ－ｏｏｄｅｍｉｓｔｒ２０１０５８１５８７７６８７８１：．ｙ，，（）２７ＣａｂａｎｅｒｏＡＩ民ｅｃｉｏＪＬＲｕｅｒｅｚＭ．Ｌｉｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈｃｏｕｌｅｄｔ：ｏｉｓｏｔｏｅｒａｔｉｏ，，［］ｐｑ呂ｐｙｐｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｌｍａｓｓｓｐｙ：ＡｎｅｗｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｎｈｏｎｅｙａｄｕｈｅｒａｔｉｏｎｃｋｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｊｏｕｒｎａｏｆ［］－ＡｒｃｕｌｔｕｒａａｎｄＦｏｏｄｅｍｉｓｔ２００６５４２６：７９．ｉｌＣｈｒ９１９７２７ｇｙ，，（）２８Ｃ－－－ｉｕｌｕＭＦａｒｒｅ氏ＦｌｏｒｉｓＩｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ５ｈｄｒｏｘｍｅｔｈｌ２ｆＵｒａｌｄｅｈｄｅｉｎ［］，，，ｙｙｙｙｒｏａｌｅｌｌｂａｒａｉｄｒｅｖｅｒｓｅｄｈａｓｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄＪ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２０１３ｙｊｙｙｐｐ［］ｙ，，－５１９：５０１０５０１３．（）２９＊ＣｉｕｌｕＭＦｌｏｒＩｈｉＶｔａｌＡＰｏｓｓｉｌｅＦｅｓｈｎｅｓｓａｆｒ民ａ］ＪｅｌｌｉｓＮｕｒｃＭｅ．ｂｉＭｒｋｅｒｏｏ：［］，，，ｙｙ４５ 浙江大学硕壬学位论文参考文献Ｆｏ－－－ｒｍａｔｉｏｎｏｆ５Ｈｙｄｒｏｘｍｅ化ｌ２ｆｕｒａｌｄｅｈｄｅａｓａＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＳｔｏｒａｅＴｅｍｅｒａｔｕｒｅｙｙｙｇｐ－ａｎｄＴｉｍｅＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒ２０１５６３４９５．１６：４１９０１［］ｇｙ，，（）３０－ＭＥｒｂｅｒｓｄｏｂｌｅｒＨＦＳｏｍｏｚａＶＦｉｉｌ．ｏｒｔｅａｒｓｏｆｆｕｒｏｓｎｅＦｏｒｔｅａｒｓｏｆｕｓｎａＵａｒｄ［］，ｙｙｙｙｇｒｅａｃｔｉｏｎｒｏｄｕｃｔｓａｓｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆｉｔｉｌｌｉ．ｌｌｐｔ：ｈｅｎｕｔｒｏｎａｑｕａｔｙｏｆｆｏｏｄｓ［Ｊ］ＭｏｅｃｕａｒＮｕｔｒ－ｉｔｉｏｎ＆ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈ２００７ａ５１４４２３４３０．：，，（）－３１ＧＢ１８７９６２００５．２０１２．］，蜂蜜［问－－３Ｂ／Ｔ１８９３２．１２００２４．２００２＾Ｇ．，蜂蜜中碳植物糖含量测定方法稳定碳同位素叱率法间［３３Ｈ．ｉｄａｌｏＡ民ｏｓｓｉＭＰｏｍｅｉＣＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｅｕｉｖａｌｅｎｔｅａｅｔｈｒｏｕｈｆｕｒｏｓｉｎｅｇ，，ｐｑｇｇｇｇ［］－ａｎａ．ｌｓｉｓＪ．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒ２００６９４４：６０８６］２ｙ，，［ｙ（）］－３４ＩＳＯ９２００４．ｆｉ．．２１８３２乳制品ｕｒｏｓｎｅ０，乳和含量的测定离子对反栖高效液相包谱法巧］［］０４．［３５］ＫａｍａｋｕｒａＭ．民ｏｙａｌａｃｔｉｎｉ打ｄｕｃｅｓｑｕｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ至〇ｈｏｎｅｙｂｅｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７３７３４８－：４７８４８３．（）＊３６ＫＭＦｕｋｕｓｈ－ａｍａｋｕｉｍＭ．Ｉ打ｈｉｂｉｔｉｏｉｆｉｃｄｅｄｔｉｋＤａｔ：ｅｉｎｉｉａａｎｏｆｓｐｅｃｒａａｏｎｏｆ５７ｒｏｎ［］，ｇｐｒｏｙａｌｊｅｌｌｙｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅｂｙ幻ｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏ化ｃｈｎ－ｏｌｏａｎｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２００２６６１：１７５１７８ｇｙｙ，，（）＊－＿３７Ｋａｍａｋ．ｉｆｔｖｅｎ：ｉｉｌｕｉａＭＳｕｅ打ｏｂｕＮＦｕｋｕｓｈｉｍａＭＦｓｅｋＤａｒｏｌｅｎｎｒｏａｌｅｌｅｎｈａ，，［］ｙｐｙｊｙｎｃｅｓｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｉｍａｒｃｕｌ山ｒｅｄｒａｔｈｅａｔｏｃｔｅｓａｎｄｉ打ｃｒｅａｓｅｓａ化ｕｍｉｎｒｏｄｕｃｔｉｐｐｙｐｙｐｏｎｉｎ１：ｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｓｅｒｕｍＪ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｈｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍａ打ｉｃａｄｏ［］ｐｙ２００２８２４８６５－８７４ｎｓ１．：，，（）３８ＫａｓｈｉｍａＹＫａ打ｅｍａｔｓｕＳＡｓａｉＳｅｔａＬＩｄｅｎｔｉ巧ｃａｔｉｏｎｏｆａＮｏｖｅｌＨｏｃｈｏｌｅｓｔ；ｅｒｏｌｅｍ［］，，，ｙｐｉｃＰｒｏｔｅｉ打Ｍａｏｒ民ｏａｌＪｅｌｌＰｒｏｔｄ打１Ｄｅｒｉｖｅｄ打ｏｍ民ｏａｌＪｅｌｌＪＰｉＯ打２０１．ｏｓｅ，ｊｙｙ，ｙｙ［］，４９８１３．：，（）３９ＫｅｌｌＪＤ，ＰｅｔｉｓｃｏＣ，Ｄｏｗ打ｅＧ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆ打ｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄｔｒａｎｓｆｌｅｃｔａｎｃｅｓｅｃｔｒｏｓｃｏ［］ｙｙｐｐｙｔｏｄｅｔｅｃｔａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆＩｒｉｓｈｈｏｎｅｙｂｙｂｅｅｔｉ打ｖｅｒｔｓｙｒｕｐａｎｄｈｉｇｈｆｒｕｃｔｏｓｅｃｏｍｓｒＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅａｒＩｎｆｒａｒｅｄＳｅｃｔｒｏｓｃｏ２００６１４１３９．］ｐｙ：ｙ叩［ｐ，，口）［４０ＭａｔａｎＪ，ＫｏｖａｃｏｖａＥ，ＢＵ＾ｏｖａＫ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｉｒＱｉｎｕｎｏｓｔｉｍｕｌａ１ｘ）ｒｅｆｆｅｃｔｏｆ１：ｈｅｒｅｃｏ］ｊｙ＊－－ｍｂｉｎａｎｔａｐａ化ｕｍｉｎ１ｍａｏｒｈｏｎｅｂｅｅｒｏａｌｄｌｒｏ化ｉｎｏｎＴＮＦａｌｈａｌＪ．Ｉｔｉｅｅａｓｅ［］ｎｊｙｙｊｙｐｐＩｈａｌ２００６６２２６９－２７８ｍｍｕｎｏｒｍａｃｏ．；ｐ，，（）［４１］ＭａｒｃｏｎｉＥ，ＣａｂｏｎｉＭＦ，ＭｅｓｓｉａＭＣ，ｅｔａｌ．Ｆｕｒｏｓｉｎｅ：ａｓｕｋａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇ＇ｔｈｅｆｒｅｓｈｎｅｓｓｏｆｒｏａｌｅｌｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｉａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒ２００２５ｙＵｇ，ｙ、ｊ］ｙ０－１０２２８２９．（）；８２５４２Ｍ－ＭｅｓｓｉａＭＣＣａｂｏｎｉＭＦａｒｃｏｎｉＥ．Ｓｔｏｒａｅｓｌｉｌｉｔｆｆｄｉ：ａｂｔａｓｓｅｓｓｍｅｎｏｒｅｅｚｅｒｅｄｒｏ［，，］ｇｙｙ４６ 浙江大学硕去学位论文参考文献ａ－ｌｅｌｌｂｆｕ阳ｓｉｎｅｄｅｔｅｒｍｉｉｉａｔｉｏｎＪ．ＪＡｒｉｃＦ日ｏｄＣｈｅｍ２００５５３１１４４４０４４４３ｙｙ：ｇ：．ｊ，，（）［］４３－ＭｏｒａｌｅｓＳａｎｚＭＬＭａｒｔｉｎａｌｖａｍｚＰＪｅｔａｌ．ＣｏｍｂｉｎｅｄｕｓｅｏｆＨＭＦａｎｄｆｌｉ乂ｉｒｏｓ打ｅ［），］ｔｏａｓｓｅｓｓｆｒｅｓｈｈｏｎｅｕａ．ｈｅｌｉｔＪＪｏｕｒｎａｌｏｆｔＳｃｉｅｎｃｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅ２ｙｑｙ［，］ｇ－．００９：１１，８９（８）３３２３３８４４ＲＭＦＡ－－ａｍａｄａ打ｌｈａｍｄｉＡＢｉｔｉｉｉ．ｏａｃｖｅｃｏｍｏｕｎｄｓａｎｄｈｅａｈｈｒｏｍｏｔｎｒｏｅｒｔｅｓｏｆ［］，ｇｐｐｇｐｐ－扣ｒｏａｌｅｌｌＡｉＪＪｏｌｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＦｏｏｄ２０１２４１３９：ｒｅｖｅｗ．ｕｒｎａｏｓ：．ｙｊｙ［，，）］（４５Ｓａ－Ｐａｚ－ＶｌｌｉｉｌａｚａｒｏｌｉｖｏＬＡｏｎｚａｌｅｚ．Ｓｃｒｅｅ打ｉｎｏｆｂｉｏｏｉｃａａｃｔｖｉｔｅｓｒｅｓｅｎｔｉｎｈｏｎｅ［］，ｇｇｇｐｙｂｅｅＡ－ｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｒｏａｌｅｌｌＪＴｏｘｉｃｏｌＩｎＶｉｔｒｏ２００５１５：６４５６５１．（ｐｙｊｙ．９），，（［］）４６ＳｈｅｎＬＲＷａｎＹＲＺｈａｉＬｅｔａｌ．Ｄ巧ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｏａｌｅｌｌｆｒｅｓｈｎｅｓｓｂＥＬＩＳＡ］，，，［ｇｙｊｙｙｈ－ｗｉｔｉ１ｍａｌ１ｉ１ｉＪＪｉ化ａｈｉｌｓｅｃｆｉｃａｎａａ化ｕｍｍｏｒｒｏａｄｌｒｏ；ｅｎａｉｉｔｂｏｄ．ｏｕｇｙｐｐ，ｊｙｊｙｐｙ［］—２０－ｍａｌｏｆＺｈｅｉａｎＵ打ｉｖｅｒｓｉｔＳｃｉｅｎｃｅＢ１５１６２：玉５５１６．ｊｇｙ，６，（）４７Ｓｉｉｉｍ山ｈＪ．Ｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｅｓｏｆ化ｅｍａｎｐｒｏ化ｉｎｏｆｈｏ打ｅｙｂｅｅＡｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａＬｒｏａｌ（ｐ）［］ｙｊｅ－ｌｌＪＡｉｄｏｌｏｉ２００１３２０１：６９８０．．ｐｇｅｙ［］，，（）［４８］Ｓｐｉ化ｒｉＭ，ＪａｍｉｎＥ，ＴｈｏｍａｓＦ，ｅｔａｌ．Ｆａｓｔａｎｄｇｌｏｂａｌａｕｔ：ｈｅｎｔｉｃｉｔｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｈｏｎｅ－ＮＭ民Ｊ－ｕｓ．Ｆｉ２０］５１８９６６６．ｉｎ〇ｒｏｆｉ］ｍｏｏｄＣｈｅｍｓｔｒ：０ｙｇ）Ｈｐｇ［］ｙ，，４９Ｔａｒａｎｔｌｉｌｌ．ｉｓＰＡ、ＰａａｓＣＳＡｉｓｓａｎｄｒａｋｉｓＥｅｔａＭｏｎｉｔｏｒｉｎｏｆｒｏａｌｅｌｌｒｏｔｅｉｎｄｐｐ，，ｇｙ［］ｊｙｐｒ－ｅａｄａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｓｔｏｒａｅｕｓｒｉｅｒｆｏｉ打化ｓ．ｏｕｉｎＦｏｕｔｒａｎｓｒｍ３巧过ＦＴＩ民ｅｃｔＪ〇ｓｃｏＪＪｇｇｇｇ（）ｐｐｙ［］－ｒｎａｌｏｆＡｉｃｕｌｐｌｔｕｒａ民巧ｅａｒｃｈ２０１２５１２：１８５１９２．，，（）＊５０ＶａｓＰＣａｍ－ｉｌｌｏＮＣｒｄｏｂａＭＨｅｔａｌ．ｉｍｌｔａｎｅｏｓｕｃｈｒｏｍａｔｏａｃａｎａ］ｉｎｏＳｕｕｌｉｉｄｉｈｉ，ｐ，，［］ｑｇｐ＇－－－ｓｉｓｏｆ５ｈｄｒｏｘｍｅｔｈｌ２ｆｌｕａ］ｄｅｈｄｅａｎｄｍ巧ｈｌａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｉｎｈｏｎｅＪＦＣｙ（ｙｙｙ］．ｏｏｄ）ｙｙｙ［ｈ－ｅｍｉｓｔｒ１９９２４４１６７７２．：ｙ，，（）Ｗｅｉｉ５１ＷｕＬＭｉ乂ＤｕＢｅｔａＬＦｒｅｓｈｎｅｓｓｄｅｔｅｒｍｎａｔｏ打ｏｆｒｏａｌｅｌｌｌｚｉｎｄｅ，，ｂｙａｎａ［ｙｊｙｙｇ］－ｃｏｍｏｓｉｉＬｗｐｉｔｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆａｄｅｎｏｓｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＪ，ｌＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏ［］ｇｙ，２０－１５６３１：５０４５１０．，（）５ＷＹＴＲＹＣＨＯＷＳＫＩＭＰＡＩＳＳＥＪ－ＣＡＳＡＢＩＡＮＣＡＨｅｔａｌｓｓｆｒｏ０化州ｔｏｌ．Ａｓｓｅａ，，，［马ｙｊ＊—ＭｔｔＪＨＩＬＩＣＬＣＳｄｅｅｒｍ．ＩｌＰｅＵｆｒｅｓｈ打ｅｓｓｂｉｎａｉｏｎｏｆｆｕｒｏｓｉｎｅｎｄｕｓｔｒｉａＣｒｏｓａｎｄｙｙ［］ｐ－ｒｏｄｕｃｔｓ２０１４６２０．；３１３３１７，，（）［５３］ＸｕｅＸＦ，ＷａｎｇＦ，ＺｈｏｕＪＨ，ｅｔａｌ．Ｏ打ＨｎｅＣｌｅａｎｕｐｏｆＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄＳｏｌｖｅ打ｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ＇＇ｆｏＤ－－ｓｒｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｄｅｎｏｓｉｎｅ５ＴｒｉｈｏｓｈａｔｅＰＡｄｅｎｏｓｉｎｅ５Ｄｉｈｏｓｈａｔｅｐｐ（ＡＴ），ｐｐ＇－ＡＭｈｏｈａＭＰ民－ＡＤＰａｎｄｄｅｎｏｓｌｉｉｉｎｅ５ｏｎｏｓｔｅｉｎｏａＪｅｌｌＵｓｎＨｈＰｅｒｆｏｒ），ｐｐ（Ａ（）ｙｙｇｇｍａｎｃｅＬ．ｌ２００９ｉｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈＪＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｑｇｐｙ，［］ｇｙ，５７１－１４４５０５．（）：５００口４］ＹａｍａｇｕｃｈｉＫ，ＨｅＳ乂Ｌｉ７乂ｅｔａｌ．ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭａｊｏｒ民ｏｙａｌＪｅｌｌｙＰｒｏｔｅｉｎ１ｉ＊民－ｎＦｌＪｌｌＥＬｉｎｋｅｄｉｅｓｈｏｙａｅｙｂｙＩｎｄｉ化ｃｔｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙＪ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ［］４７ 浙江大学硕击学位论文参考文献ｉ－Ｂｉ．ｉｏ化ｃｈｎｏｌｏａｎｄ技ｏｃｈｅｍｓｔｒ２０１３７７６：１１０１３１２ｇｙｙ，，（）３？５５ＺｈＬＸＸＦＺｈｏＪＨｅ－ｏｕｕｅ，ｕｔａｌ．ＦａｓｔＤｅｔ：ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｄｅ打ｏｓｉｎｅ５Ｔｒｉｈｏｓｈａｔｅ］，，［ｐｐ（ＡＴＰ）ａｎｄＩｔｓＣａｔａｂｏｌｈｅｓｉ打民ｏｙａｌＪｅｌｌｙＵｓｉｎｇＵｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａ打ｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ－．ｆｒｉｃｕｌｈｅｍ．ａｈＪＪｏｕｒｎａｌｏＡｌｔｕｒａａｎｄＦｏｏｄＣｉｓｔｒ２０１２６０３６：８９９４８９９９ｐｙ，，）［］ｇｙ（４８ 浙江大学硕壬学化论文附录附录１２３４５６１２３４５６１２３４５６．５鞭浑和香产屯；ＭＲＪＰ５｜一＇ＭＰ－Ｗ２鄉軒婚Ｓｔ鲜ｔ辦ｆＳｆｊ器招二滅離賺爆．ＩＷ＾ｍ．＇‘劫■＇＇；一詞．．＿＿＿＿＿＿＿＿图６－１加温处理蜂王浆ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测结果１２３４５６７１２３４５６７１２３４５６７；．ｎｎｍｍｍｕｍ图６－２６种己知蜂蜜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测结果１２３４５１２３４５１２３４５。＾？＾山吗ｕｍｌ＾ｇｉ１明广嘲＾ｍｈＢ選ＨＪＬｊｈＩ图６－３按叱例惨假洋槐蜜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测结果４９ －浙江大学硕±学位论文用主蛋白１特异性多抗检测蜂王浆新鲜度和慘假巧蜜的ＥＬＩＳＡ技术研究作者简介及科研成果作者简介一，汉，１，，。王然，女族％９年１１月出生籍贯黑龙江省哈尔滨市中共团员－２００５－２００８年就读于哈尔滨师范大学附属中学２００８２０１２；年就读于浙江大学生物系统工工１２－程与食品科学学院，程专业，２０２０１５食品科学与获学击学位；年就读于浙江大学生物系统工程与食品科学学晓，食品科学专业，硕去研究生。攻读硕±学位期间发表论文及申请发明专利情况１ｅｎＬＲＷａｎＹＲＺｈａｉＬｅｔａ．ｔｔｌｌＩｔｈＳｈｌＤｅｅｒｍｉｎａｉｏｎｏｆｒｏａｅｌｆｒｅｓｈｎｅｓｓｂＥＬＳＡｗｉａ［］，ｇ，，ｙｊｙｙｉ－１ｈｉｈｍａｌ１Ｊｏｌｓｅｄ行ｃａｎｔａａ化ｕｍｉｎｏｒｒｏａｌｅｌｒｏ化ｉｎａｎｔ化ｏｄｕｒｎａｌｏｆｇｙｐｐ，ｊｙｊｙｐｙ［叮－Ｚｈｅ－ｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔＳｃｉｅｎｃｅＢ２０１５１６２：１５５１６６．ｇ，ｊｙ，（）王一于张颖然等．王浆主蛋白（ＭＲＪＰｓ氏肝细胞的促增殖作用及其机制凹，堪迪，）对张町浙２０４－江大学学报（农业与生命科学版）１５１１：７１４，，（）一：沈立荣王．电Ｐ，然，崔量，张畅，葛化良，李玫雜，于张颖泳胶蛋白条带检测蜂］发明专利Ｐ－－王浆新鲜度的建立方法和应用．浙江０４３１６５８７Ａ２０１５０１２８；ＣＮ１．，［］４一一．发明专利：沈立荣王，李玫姬，然，谭量量，金凤，了美会，陈正贤科中华蜜蜂抗菌肤［］－－Ａｃｃ民ｏａｌｉｓｉｎ．《克隆抗体的制备方法及用途浙江：ＣＮ１０３０４４５４９Ａ２０１３０４１７．ｙ們，５０