蜂蜜和蜂王浆中多种杀螨剂残留检测方法研究 82页

硕士学位论文论文题目：蜂蜜和蜂王浆中多种杀螨剂残留检测方法研究作者姓名曾银欢学科专业应用化学指导教师莫卫民教授吴俐勤副研究员所在学院化学工程学院提交日期2015年04月 ZHEJIANGUNIVERSITYOFTECHNOLOGYDISSERTATIONFORMASTERDEGREETHEDETERMINATIONMETHODSOFMULTI-ACARICIDERESIDUESINHONEYANDROYALJELLYWRITTENBYZengYinHuanSUPERVISEDBYProf.WeiMinMoProf.LiQinWuCollegeofChemicalEngineeringZhejiangUniversityofTechnologyHangzhou,P.R.ChinaApril2015 浙江工业大学学位论文原创性声明本人郑重声明；所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加Ｗ标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者签名：曰期：＾古年＾月？曰脅３学位论文版权使用授权书，本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密□，在年解密后适用本授权书。２、不保密岛＾＂＂（请在上相应方框内打Ｖ）■作者签名；脅告良＾日期：＾在年＾月日导师签名：刖月：為月曰６＾ 蜂蜜和蜂王浆中多种杀螨剂残留检测方法研究摘要本文主要研究多种杀螨剂在蜂蜜和蜂王浆中残留检测方法，建立了高效液相色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中10种杀螨剂残留量的检测方法和高效液相色谱-串联质谱法检测蜂王浆中10种杀螨剂残留量的检测方法。目前国内研究较多的是多种农药残留以及蜂蜜中抗生素及兽药残留，对蜂蜜和蜂王浆中杀螨剂这一类药物残留及检测方法的文献匮乏，因此，对多种杀螨剂在蜂蜜和蜂王浆中的残留检测方法进行开发和制定相应的检测标准显得很有必要和意义，以期对我国的农产品检测标准作出相应的补充和为蜂蜜和蜂王浆的出口提供检测依据。1.快速测定蜂蜜中多种杀螨剂的高效液相色谱-串联质谱方法。以蜂蜜为基质，采用超声辅助-分散液液微萃取技术，高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)为检测手段，建立了一种同时检测10种杀螨剂类药物（四螨嗪，喹螨醚，吡螨胺，噻螨酮，乙螨唑，蝇毒磷，哒螨灵，克螨特，螺螨酯和唑螨酯）残留的快速有效的方法。在电喷雾正离子扫描模式检测10种杀螨剂，采用基质标定量。10种杀螨剂在0.1-100µg/L范围内线性良好，四螨嗪、喹螨醚、噻螨酮、乙螨唑、螺螨酯的定量限（S/N=10）为3.0µg/kg；蝇毒磷、哒螨灵、克螨特的定量限为1.5µg/kg；吡螨胺的定量限为2.0µg/kg；唑螨酯的定量限为I 2.5µg/kg。10种杀螨剂在10、50、100µg/kg三档加标浓度下，回收率在72%-107%之间，相对标准偏差RSD<12%。在100个实际蜂蜜样品检测中，四螨嗪的检出率是9%，喹螨醚的检出率是5%，吡螨胺的检出率是16%，噻螨酮的检出率是12%，乙螨唑的检出率是2%，蝇毒磷的检出率是10%，哒螨灵的检出率是3%，克螨特的检出率是5%，螺螨酯的检出率是8%，唑螨酯的检出率是1%。2.蜂王浆中多种杀螨剂残留量高效液相色谱-串联质谱检测方法的建立以蜂王浆为基质，建立同时检测10种杀螨剂类药物包括四螨嗪，喹螨醚，吡螨胺，噻螨酮，乙螨唑，蝇毒磷，哒螨灵，克螨特，螺螨酯，唑螨酯残留的高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法。样品经过提取净化，液相色谱分离，三重四级杆串联质谱分析，在多反应监测(MRM)模式下进行特征母离子和子离子的信号采集，根据保留时间、母离子和子离子进行定性分析。在0.1-200µg/L线性范围内，峰面2积与添加浓度的线性关系良好，相关系数（r）＞0.99。在5、10、50、100µg/kg添加水平下，十种杀螨剂的平均回收率在73%-107%之间，相对标准偏差在0.9%-12.5%之间，检出限为0.25-1.0µg/kg，定量限为0.75-3.9µg/kg。在10个蜂王浆样品中，有1个克螨特检出。关键词：蜂蜜，蜂王浆，杀螨剂，分散液液微萃取，液相色谱-串联质谱，残留II THEDETERMINATIONMETHODSOFFENPYROXIMATERESIDUESINHONEYANDROYALJELLYABSTRACTTheobjectiveofthispaperwasresearchinganewmethodfordetection,confirmationandquantificationof10acaricidesresiduesinhoneyandroyaljelly.Methodsweredevelopedandvalidatedforthedeterminationof10acaricidesinhoneyandroyaljellybyliquidchromatography-tandemmassspectrometry(LC-MS/MS),respectively.Methodsforthemulti-residueofpesticidesandthedeterminationofantibioticshavebeensuccessfullyreported.However,researchpapersconcerningthedeterminationofacaricidesinhoneyandroyaljellyareverylimited.Theresultsofthisworkfilltheblankofthethestandardsfortheagro-productsinourcountryandprovideascientificbasisforthevalidationoftheexporthoney.1.Arapidhigh-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(HPLC-MS/MS)methodhasbeendevelopedforthedeterminationoftenacaricides(Clofentezine,Fenazaquin,Tebufenpyrad,III Hexythiazox,Etoxazole,Coumaphos,Pridaben,Propargite,Spirodiclofen,Fenpyroximate)inhoneywithultrasonic-assistantdispersiveliquid-liquidmicroextraction(DLLME).Thequalitativeandquantitativeanalysisfortheanalyteswerecarriedoutunderthemulti-reactionmonitoring(MRM)modewithpositivemodeinmatrix-matchedstandardmethod.Undertheoptimalconditions,thecalibrationcurveswerelinearintherangeof0.1-100µg/Lfor10acaricides.Thelimitesofquantitation(LOQs)were3.0µg/kgforclofentezine,fenazaquin,hexythiazox,etoxazoleandspirodiclofen,1.5µg/kgforcoumaphos,pridabenandpropargite,2.0µg/kgfortebufenpyrad,and2.5µg/kgforfenpyroximate.Theblankhoneysamplespikedinthreeconcentrationsat10、50、100µg/kg,therecoveriesrangedfrom72%to107%,withtheralativestandarddeviationslessthan12%.Amongthedeterminationof100honeysamples,thedeterminativeratewere9%forClofentezine,5%forFenazaquin,16%forTebufenpyrad,12%forHexythiazox,2%forEtoxazole,10%forCoumaphos,3%forPridaben,5%forPropargite,8%forSpirodiclofen,1%forFenpyroximate.2.Ananalyticalmethodforthedeterminationof10acaricidesbyLC-MS/MSinroyaljellywasdeveloped．Intheprocedure，thesampleswereextractedandpurificated,thenseparatedbyliquidchromatographicandtandemmassspectrometryanalysis.MassspectralacquisitionwasappliedwithmultiplereactionmonitoringoftwodiagnostictransitionIV reactions.Thequalitativeanalysiswasbasedontheretentiontime，theprecursorionandtwoproductions.Thelinearrangeswerefrom20.1-200µg/Lfor10acaricidesandthecorrelationcoefficients(r)wereallgreaterthan0.99.Theblankroyaljellysamplespikedinfourconcentrationsat5、10、50、100µg/kg,therecoveriesrangedfrom73%-107%,andtheralativestandarddeviationsrangedfrom0.9%to12.5%.Thedecisionlimitsrangedfrom0.25to1.0µg/kg,andthedetectioncapabilitiesrangedfrom0.75to3.9µg/kg.ThePropargitewasdetectedinoneroyaljellysamplesamong10samples.KEYWORDS:honey,royaljelly,acaricide,DLLME,Liquidchromatography-tandemmassspectrometry,multi-residuesV 目录摘要.............................................................................................................................................IABSTRACT...................................................................................................................................III缩略词表.........................................................................................................................................III第1章绪论....................................................................................................................................11.1蜂产品质量安全现状........................................................................................................11.2蜂产品的污染来源............................................................................................................21.2.1蜂产品中兽药残留..................................................................................................21.2.2蜂产品中的农药残留.............................................................................................31.2.3蜂产品中的重金属残留.......................................................................................31.2.4蜂产品中的掺杂使假和造假问题.........................................................................31.2.5蜂产品中的生物性污染..........................................................................................41.3杀螨剂研究概况综述.........................................................................................................41.3.110种杀螨剂化学性质及分子结构.........................................................................41.3.2国内外杀螨剂残留标准.........................................................................................81.3.3杀螨剂残留的影响..................................................................................................81.4蜂产品中多残留检测分析手段........................................................................................91.4.1样品前处理方法......................................................................................................91.4.2检测技术................................................................................................................111.5研究内容及意义...............................................................................................................151.5.1研究内容................................................................................................................151.5.2研究意义................................................................................................................15第2章蜂蜜中多种杀螨剂的残留方法研究...............................................................................172.1实验方法..........................................................................................................................172.1.1实验仪器...............................................................................................................172.1.2实验材料................................................................................................................172.1.3化学试剂................................................................................................................172.2试验方法...........................................................................................................................172.2.1标准溶液的配制....................................................................................................172.2.2样品预处理............................................................................................................182.2.3色谱质谱条件.......................................................................................................182.3结果与分析.......................................................................................................................192.3.1流动相的选择........................................................................................................192.3.2样品稀释倍数的优化...........................................................................................202.3.3蜂蜜水取样体积...................................................................................................202.3.4萃取剂与分散剂选择...........................................................................................212.3.5萃取剂与分散剂体积的确定................................................................................222.3.6超声时间的优化...................................................................................................232.3.7离心转速的优化...................................................................................................242.3.8蜂蜜的基质效应....................................................................................................242.3.9方法的线性范围与检出限....................................................................................252.3.10方法回收率与精密度..........................................................................................262.3.11方法的适用性实验.............................................................................................27I 2.4实际样品检测..................................................................................................................282.5小结..................................................................................................................................38第3章蜂王浆中多种杀螨剂的残留方法研究...........................................................................403.1实验材料和仪器...............................................................................................................403.1.1试验仪器................................................................................................................403.1.2实验材料和化学试剂............................................................................................403.1.3化学试剂................................................................................................................413.2实验方法...........................................................................................................................413.2.1标准溶液的配制....................................................................................................413.2.2样品提取................................................................................................................413.2.3样品净化...............................................................................................................413.2.4色谱质谱条件.......................................................................................................413.3结果与分析.......................................................................................................................423.3.1提取试剂的确定...................................................................................................423.3.2流动相的选择.......................................................................................................423.3.3萃取柱的选择........................................................................................................423.3.4洗脱试剂的选择...................................................................................................433.3.5洗脱速率的选择....................................................................................................443.3.6基质效应与方法的线性范围、检出限................................................................453.3.7方法回收率与精密度............................................................................................453.4实际样品检测...................................................................................................................463.4.1样品定性定量方法................................................................................................463.4.2实际样品检测.......................................................................................................463.5小结..................................................................................................................................57第4章结论与展望......................................................................................................................594.1课题主要创新点...............................................................................................................594.2绩效评价..........................................................................................................................604.3需进一步完善的内容.......................................................................................................60参考文献.........................................................................................................................................61致谢............................................................................................................................................69攻读学位期间发表的文章.............................................................................................................70II 缩略词表英文缩写中文名称FAO联合国粮农组织EPA美国环保局WTO世界贸易组织CFR《联邦法典》LLE液液萃取DLLEM分散液液微萃取SPE固相萃取法MSPD基质固相分散萃取USE超声波辅助提取超声萃取GPC凝胶渗透色谱MAE微波辅助萃取ECD电化学检测器FPD火焰光度检测器NPD（TSD）氮磷检测器GC气相色谱HPLC高效液相色谱GC-MS气相色谱质谱法GC-MS/MS气相色谱串联质谱法HPLC-MS/MS高效液相色谱串联质谱法C18十八烷基键合硅胶III LOD检测限LOQ定量限MRL最大残留限量RSD相对标准偏差SIM选择离子监测MRM多反应监测模式IV 第1章绪论1.1蜂产品质量安全现状蜂产品是营养全面的天然保健品，它不仅有调节机体生理机能，提高免疫力，增强体质，消除疲劳，美容、抗衰老等功能，还能作为中药辅料治疗和辅助治疗[1]多种顽疾，从而使人健康长寿。我国自加入WTO之后，随着经济形势的快速发展,科技水平也在不断提高和进步，同世界各国的交往贸易也越来越多，蜂产[2]品的出口市场也越来越大；随着生活水平的不断提高，人们对健康饮食的要求[3]越来越高，对蜂产品的需求逐渐增大，同时对蜂产品质量的要求也越来越高。中国养蜂业发展迅速，据2008年联合国粮农组织（FAO）的统计数据显示，总蜂群数量在1949年为50万群，到2008年已经发展到870万群。据统计，目前中国是世界第一养蜂大国，拥有世界蜂群数量的1/8。我国蜂产品不仅要满足[3][4-6]国内工业、医药、保健的需要之外，还出口世界各国，其中蜂蜜、蜂王浆、[7-9][10]蜂蜡、蜂花粉是我国出口蜂产品中的主要出口产品。近年来，我国出口国外的蜂产品频频受阻，其很大原因是我国蜂产品中的质量问题，如2003年氯霉素超标事件。为了限制发展中国家蜂产品的涌入，发达国家利用其技术优势，对我国蜂产品实施技术性贸易壁垒和反倾销制裁，如欧盟、美国、日本等国对蜂蜜[11]中的兽药残留制定了严格的限量要求，使我国蜂蜜出口受阻，出口形势严竣。[12]蜂螨是寄生于蜂体或蜂群中的一种寄生虫。目前，世界上都很关注蜂病，蜜蜂的巢虫、幼虫病、中囊病及西蜂的蜂螨、爬蜂病、幼虫病、白头蛹等都是蜂[13][14,15]群中易发的蜂病，蜂病的发生严重影响蜂产品的产量与质量。我国是一[16,17]个养蜂大国，却不是养蜂强国。在20世纪90年代以前，有机磷和有机氯杀虫剂如杀虫脒、双甲脒等，都被用于蜂箱中杀螨。此外一些天然生物农药、中草药、化学药物、西药中抗生素类、消毒杀虫剂等均被作为蜂药用于蜜蜂的防病治病上。用药的剂型种类众多，施药方法各异，管理工作滞后等原因，造成了我国蜂药市场混乱的局面。有文献报道，蜂群中应用的部分杀螨剂比蜂螨本身对蜜[18]蜂的危害更严重。而某一杀螨剂的长期使用则引起了蜂螨的抗药性、影响幼蜂生长和蜂产品残留污染等一系列问题。目前，在养蜂业中，多种抗生素和抗菌药的大量使用也是造成蜂产品质量安[19]全问题的一大原因。氯霉素可引起人再生障碍性贫血，四环素类等抗生素则1 是使人们在治疗疾病时对抗生素药物产生耐药性，出现过敏症状、"四环素牙"及[14]致癌、致畸、致突变的危害；喹诺酮类药物是我国蜂蜜生产过程中的禁用药物。因此，近年来，不论国内还是国外蜂产品市场都对抗生素和抗菌在蜂产品中残留关注较多。1.2蜂产品的污染来源[20]蜂产品是蜜蜂的产物，是人们公认的自然保健品。但是我国的蜂产品的生产是以家庭为单位的小农生产，一般都是到了花期，蜂农在户外进行作业，这种在在自然环境中生产蜂产品的过程，容易使蜂产品受到不同来源的污染物污染。蜂产品污染的原因可归为三点：其一，随着社会的高度现代化发展大量废弃排放，对植物、水、环境等造成污染，从而间接导致蜂产品中污染物含量的增加；其二，为防治虫害而向蜜源植物喷农药，蜜蜂可能会采集含有农药残留的花蜜，从而间接造成蜂产品的污染；其三，也是最主要的原因，是由于蜂农在养蜂过程中为防治害虫及蜂病盲目用药造成的。这些药物绝大多数为西药，因其价格便宜而被广泛使用。同时，因生产方式、能力和水平的局限，以及为了赚取更多的利益，人们往往一味追求生产高产量的蜂产品，压榨蜜蜂的劳动果实，让蜜蜂一直劳作，导致蜜蜂抵抗自身疾病及外界虫害的能力降低。蜜蜂只要一有病，有些蜂农就不管所用药物危害程度而胡乱用药，从而增加蜂产品中药物残留的概率。其污染源主要有以下几个方面：1.2.1蜂产品中兽药残留许多世纪以来，蜜蜂被驯化，蜜蜂酿蜜，筑下的蜂巢为人类提供了一个重要的碳水化合物来源和食物甜味剂。蜜蜂像所有的生物一样，会感染疾病和害虫。随着养蜂产业化的发展，蜂农为了保证蜂产品的产量，养蜂过程中发生的一些疾[21]病，采用抗生素治疗或化学疗法。这使得兽药的使用量也越来越多，但长期超标使用导致药物在蜂产品中残留，人们通过摄入蜂产品，间接摄入兽药，部分药物在人体内积累，危害人类的身体健康；同时，蜂产品中残留超标药物，影响[22]蜂产品的出口贸易，给蜂农带来经济损失。蜂螨一直是在世界范围内都有巨大危害的一种病害，蜜蜂杀螨剂为促进科学家为了防治这一世界范围内的病害而开发的产品。为促进养蜂业的健康发展，杀螨剂的出现，为防治蜂螨疾病发挥一[12]定的作用。但是，也同样带来一个问题，就是杀螨剂长期使用和抗生素、抗2 菌药物一样，对环境和人体都会产生不良作用，蜂箱中寄生螨也会因此对所用杀螨剂产生抗药性。为了除螨效果和经济方面的考虑，增加喷沙杀螨剂的用量，长期如此，导致恶性循环。由于很多杀螨剂都是脂溶性的，蜂箱里的蜂蜡、蜂蜜、蜂胶等都会受到污染物的污染，尤其是这些杀螨剂易进入蜂蜡并残留下来，这使得杀螨剂的残留也成了影响蜂产品质量的一个主要污染源了。1.2.2蜂产品中的农药残留养蜂生产中，蜜粉源植物是蜜蜂主要食物来源。为了防治作物病虫害，促进作物生长，农民使用有机氯、有机磷等除草剂以及植物生长调节剂喷洒于农作物[23-26]，而这些物质残留在植物中，蜜蜂在采蜜期就会被带回蜂巢，污染蜂产品，消费者再购买这种被污染过的蜂产品，长期摄入，就会危害人类身体健康。1.2.3蜂产品中的重金属残留科技发展提高了人们的生活水平，但却使人类陷入了环境危机的漩涡。人类活动导致环境中的重金属如铅、汞、镉和钴等含量增加，超出正常范围，且重金属具有富集性，在环境中难以降解，蜜蜂采集了这些已被重金属污染的水分，或采集了厂矿和高速公路附近等环境污染严重地方的蜜源植物，都会使蜂产品造成[27]重金属污染。重金属能够在生物体内积累，而人们摄入被重金属污染过的蜂产品，随着时间的累计，重金属也会在人体内部积累，达到身体最大承载量时，就会危害到人体机能正常工作，危害健康。因此，蜂产品的重金属污染也引起研究者的广泛关注。1.2.4蜂产品中的掺杂使假和造假问题蜂蜜有较高的营养价值，主要含有果糖和葡萄糖，其含量比在0.76-1.86之间，这个范围，为不法商人提供了机会，部分不法商受到益驱使而制假售假，利[28]用麦芽糖醇或果葡糖浆冒充蜂蜜卖给消费者，或者换个名字比如蜂蜜浓缩浆，欺骗消费者;一些工厂将杨树胶冒充蜂胶低价出售给假冒产品加工商，经过再次包装后上市销售，造成了蜂胶市场假冒伪劣产品越来越多，这种行为严重阻碍了蜂产品市场朝着规范健康的方向发展，破坏了正常的市场秩序，也给鉴别和检测[29]蜂产品掺假问题带来困难。掺有蔗糖、葡萄糖、果葡糖浆等掺假物的蜂蜜，虽然外观与真蜂蜜相似，但却破坏了天然蜂蜜的营养价值。这种掺假蜂蜜和蜂胶以天然蜂产品的形式投放市场，坑骗消费者以获取暴利，破坏了诚信的市场秩序，[28]也损坏了我国出口天然蜂产品的声誉。3 1.2.5蜂产品中的生物性污染生物、微生物和寄生虫等是造成蜂产品生物性污染的主要原因。水不仅是人不可缺少的生存条件，也是蜂群生存繁衍的重要条件，为了满足其生活繁殖需要，蜂群每天需要从外界采回充足的水，若水源中含有致病微生物寄生虫等，或是蜂产品在生产、运输、包装任意环节中受到生物污染，就会滋生细菌，造成蜂产品品质下降。1.3杀螨剂研究概况综述1.3.110种杀螨剂化学性质及分子结构目前，氟胺氰菊酯是唯一在我国蜂蜜中登记使用的杀螨剂，有文献报道称大[30]蜂螨已经对氟胺氰菊酯产生了抗性。日本食品列表中规定氟胺氰菊酯是蜂蜜[27]禁用药物。据报道，近几年在我国蜂蜜的检测中，氟胺氰菊酯已很少被检出，这说明我国在蜜蜂养殖中，为了防治常见的蜂螨疾病，其他杀螨剂很可能已被用于替代氟胺氰菊酯，治疗蜂螨疾病。唑螨酯已被美国作为临时登记杀螨剂，允许使用在蜜蜂中。针对这个问题，我们筛选了10种在我国其他作物上登记的杀螨[32-34][35][37]剂，在养蜂过程中可能会使用的杀螨剂：四螨嗪，喹螨醚，吡螨胺，[37-39][40,41][42-44][45-48][49-51][52-54]噻螨酮，乙螨唑，蝇毒磷，哒螨灵，克螨特，螺螨酯，[55-57]唑螨酯。其结构式及分子式见表1-1，其物理性质及用途见表1-2。表1-110种杀螨剂的结构式与分子式杀螨剂结构式分子式CAS名称NN四螨嗪C14H8Cl2N474115-24-5NNClCl喹螨醚C20H22N2O120928-09-84 吡螨胺C18H24ClN3O119168-77-3噻螨酮C17H21ClN2O2S78587-05-0乙螨唑C22H25F2NO2153233-91-1蝇毒磷C22H25F2NO256-72-4哒螨灵C19H25ClN2OS96489-71-3炔螨特C19H26O4S2312-35-8OClO螺螨酯C21H24Cl2O4148477-71-8ClOO唑螨酯C24H29N3O41118125 表1-210种杀螨剂的物理性质杀螨剂名用途物理性质称纯品为红色晶体，熔点182.3℃(工业品四螨嗪是四嗪类杀螨剂，属高效、低毒-3182～186℃)，蒸气压为13×10Pa，25℃时广谱杀螨剂，用于防治苹果和其他果树树冠在不同溶剂中的溶解度为：二氯甲烷37g/kg，上的螨虫类。四螨嗪环己烷1.7g/kg，乙醇0.5g/kg，氯仿50g/L，丙酮9.3g/L，苯2.5g/L，己烷1g/L，水<1mg/L。对光、热、空气稳定。纯品为晶体，熔点为70～71℃。溶解性喹螨醚属喹唑啉类杀螨剂，适用于杏为：水0.22mg/L，丙酮400g/L、乙腈33g/L、仁、苹果、柑橘、棉花、葡萄和观赏植物上。喹螨醚氯仿大于500g/L、己烷33g/L、甲醇50g/L、异丙醇50g/L、甲苯50g/L。吡螨胺是吡唑酰胺类杀螨剂，对人、鸟纯品为白色结晶，熔点.61～62℃，蒸气和蜜蜂毒性低，对作物安全，用于防治苹果、-6-3压2.66×10Pa(25℃)、0.01079×10Pa柑橘、梨、桃和扁桃上的叶螨和全爪螨，茶吡螨胺(40℃)，能溶于丙酮、甲醇、氯仿、乙腈、树的神泽叶螨，蔬菜上的各种螨类(如棉叶苯等大多数有机溶剂；在水中溶解度为螨、红叶螨和神泽叶螨)，棉花上的叶螨和小2.8mg/L。爪螨。纯品为白色晶体，无味熔点108～噻螨酮是一种噻唑烷酮类杀螨剂，以触-6108.5℃，蒸气压3.4×10Pa(20℃)。20℃时杀作用为主，用于防治苹果红蜘蛛等。溶解度为：丙酮160g/L，甲醇20.6g/L，乙腈噻螨酮28.6g/L，二甲苯362g/L，正己烷3.9g/L，水0.5mg/L。50℃贮存3个月稳定，在酸碱性介质中能水解，对热稳定。乙螨唑纯品外观为白色晶体粉末，熔乙螨唑属于二苯基恶唑啉衍生物，主要点：101.5~102.5℃；分解温度293℃；蒸气防治苹果、柑橘的红蜘蛛，对棉花、花卉、乙螨唑-6压(25℃)：7.0×10Pa；正辛醇/水蔬菜等作物的叶螨、始叶螨、全爪螨、二斑KowLogP=5.59(25℃)；溶解度(g/L,20℃)：叶螨、朱砂叶螨等螨类也药效。6 -5水中7.04×10，丙酮中309.4，甲醇中104.0，二甲苯中251.7。纯品为无色晶体。熔点95℃，相对密度蝇毒磷系非内吸性杀虫剂，在蜂蜜养殖-4蝇毒磷（20/4℃）1.474。蒸气压（0.133×10Pa）中，被广泛用于螨虫防治。（20℃）。纯品为白色无味结晶固体。熔点111～112℃，相对密度1.22(20℃)，蒸气压-30.25×10Pa(20℃)。溶解度为：丙酮460g/L，哒螨灵为广谱、触杀性杀螨杀虫剂，用二甲苯390g/L，苯110g/L，正辛醇63g/L，乙于棉花、柑橘、果树等经济作物上防治螨类哒螨灵醇57g/L，环己烷320g/L，己烷10g/L，水害虫。0.012mg/L。在50℃贮存3个月，在一般条件下贮存2年，在大多数有机溶剂中均稳定，对光不稳定。原药为黄褐色黏稠液体。相对密度炔螨特为广谱性杀螨剂，对若螨和成螨1.14(25℃)，160℃分解。易溶于丙酮、甲醇、均有特效，适用于棉花、果树、茶树等作物炔螨特乙醇、苯等大多数有机溶剂，在水中溶解度上的螨类防治。仅0.5mg/L。中性溶液中稳定，常温下存放2年不会影响质量，不能与强酸、强碱混合。外观白色粉状，无特殊气味，熔点：螺螨酯的有效成份是季酮螨酯，适用于-794.8℃，20℃蒸气压3×10Pa，20℃密度用来防治对现有杀螨剂产生抗性的有害螨3螺螨酯1.29g/cm。溶解性（20℃）：正己烷中20g/L，类，用于柑桔、葡萄等果树和茄子、辣椒、二氯甲烷中>250g/L，异丙醇中47g/L，二甲番茄等茄科作物的螨害治理。苯中>250g/L，水中0.05g/L。原药为白色或灰黄色结晶粉末，无味，唑螨酯为中毒杀螨剂品种，适用于多种熔点为99.3-101.7℃,25℃时蒸汽压为植物上防治红叶螨和全爪叶螨。唑螨酯0.0075MPa，唑螨酯难溶于水(20℃）：水中的溶解度为0.015mg/L，在一些有机溶剂的溶解性较好(25℃)：甲醇15g/L，丙酮150g/L，7 氯仿1197g/L，二氯甲烷1307g/L，在酸性和碱性条件下稳。1.3.2国内外杀螨剂残留标准美国、日本和欧盟一直以来都是我国蜂蜜主要的出口国家和地区，目前均对蜂蜜中唑螨酯的残留量制定有最大残留限量值。美国《联邦法典》(CodeofFederalRegulation，CFR)第40篇第180章（40CFR180）“原料农产品中的农药残留限量及豁免物质”规定了蜂蜜中农药残留限量标准，唑螨酯的残留限量为0.1mg/kg。日本从2006年6月1日起正式实施新的进口食品列表制度，表中规定唑螨酯的残留限量是0.005mg/kg。现在欧盟制定的蜂蜜中唑螨酯的残留限量标准是0.01mg/kg。2007年美国环保署(EPA)已制定法规，批准唑螨酯可以作为蜂巢使用的杀螨剂，规定蜂蜜中唑螨酯残留时限。除了对唑螨酯这种杀螨剂的规定之外，还对其他杀螨剂制定限量。日本规定蜂蜜中双甲脒的残留限量为0.2mg/kg，蝇毒磷的残留限量为0.1mg/kg，甲黎嘧胺的残留限量为1mg/kg。瑞士规定了蜂蜜中溴螨酯的最高残留限量为0.1mg/kg、蝇毒磷的最高残留限量为0.05mg/kg，氟胺[58]氰菊酯的最高残留限量为0.05mg/kg。2006年,我国农业部标准(NY/T1243-2006)对蜂蜜中以上这3种杀螨剂规定了最高残留限量(MRLs),氟胺氰菊酯为0.05mg/kg,氟氯苯氰菊酯为0.01mg/kg,溴螨酯为0.1mg/kg。现在[59]EU4412012法规中欧盟制定的蜂蜜中唑螨酯的残留限量标准是0.01mg/kg。我国关于蜂蜜的食品安全国家标准是GB14963-2011，新标准中3.4污染物限量规定：污染物限量应符合GB2762的规定，农药残留限量应符合GB2763及相关规定。在GB2763-2012中，对杀螨剂在食品上的最大残留量有明确规定，但是这些数据仅仅是在油料及油料制品，蔬菜和水果上的最大残留量，在蜂蜜产品上还没有明确的最大残留量规定。1.3.3杀螨剂残留的影响杀螨剂是一类有毒化学物质，在蜂群中长期大量使用，会对蜜蜂及蜂产品安[60]全产生危害。杀螨剂的药害残留问题，一方面表现在药物残留，一些药物由于残存于蜂蜜中，不易分解，当人体摄入含药物的蜂蜜时，在体内会逐渐积累引8 起病变，另一方面它会干扰人体化学信息传递，阻碍器官生理功能的正常发挥，[61]使神经系统功能失调。因此杀螨剂残留严重威胁着人类的健康，同时困扰蜂产品贸易和养蜂业的健康发展。1.4蜂产品中多残留检测分析手段多残留检测是一种在短时间内，对多种目标物进行监管的有效程序，主要分为样品前处理方法和仪器测定方法。1.4.1样品前处理方法[62]样品的前处理是影响药物多残留分析结果的关键环节。它一般包括从样品中残留目标物的提取、提取液的浓缩和提取液净化等步骤，其目的是将检测样品处理成适合测定的检测溶液，使经处理后的样品更适合分析仪器测定的要求，提高分析准确度和精密度。分析物的提取是基于目标物自身的不同的物理化学性质(如极性,溶剂亲和力，分子量和分子大小等)，提取分析物是准确测定目标物浓度的前提，因此，合适的提取溶剂是至关重要的。索氏提取、液液分配、柱层析净化等是传统的样品前处理技术；现代样品前处理主要使用的技术有分散液液微萃取、固相微萃取技术、微波辅助萃取技术、凝胶层析、加速溶剂提取、超临界流体萃取、QuEChERS等技术。液液萃取（Liquid-liquidextraction,LLE）是常用于样品中目标组分与基质的分离的技术，其提取过程是根据目标组分在两相之间的分配达到平衡，从而达到纯化目标组分、消除基质干扰的目的。有时也会通过改变提取溶剂的pH，来提高萃取率。这种前处理方法操作简单，但提取过程中使用大量有机试剂，且耗时。分散液液微萃取技术(Dispersiveliquid-1iquidmicroextraction，DLLEM)是一种新型液相微萃取技术。该方法仅在分散剂的作用下，使用微量的萃取剂均匀分散在溶液中形成乳浊液，由于萃取剂和目标分析物的接触面积很大，所以可以达到很高的富集倍数和萃取效率，还具有操作简单、成本低、回收率高、富集倍数[63][64]高、对环境友好等优点。ConstantinosK.Zacharis等采用分散液液微萃取技术结合气相色谱串联质谱测定蜂蜜中的有机氯农药，其平均回收率在75%-119%[65]之间，相对标准偏差＜20%。HuaixiaChen等采用分散液液微萃取技术结合高[66]效液相色谱串联质谱测定蜂蜜中的氯霉素和甲砜霉素。YingWang等采用分散9 液液微萃取技术结合高效液相色谱测定蜂蜜中的三嗪类药物。固相萃取法(SolidPhaseExtration,SPE)也是是一种常用的净化技术，在样品前处理中应用比较广泛。它有两种净化样品的途径：一是保留杂质，待测组分不被保留而自然流出；二是先使待测物完全保留在柱上，干扰杂质随样品溶剂或淋洗液洗出，然后再洗脱待测物。SPE法与传统的液-液萃取相比，其优点是所需有机溶剂少，不产生乳化现象，样品用量小，回收率高，精密度好等；其局限[67]性是，洗脱共提物较多而且富集倍数有限。AkikoKaihara采用SPE方法进化[68]蔬菜水果大米基质。RocíoCazorla-Reyes用气相串联质谱和超高压液相色谱串联质谱同时检测尿样中极性非极性农药，用C18柱净化处理，二氯甲烷洗脱，回[69]收率为60-120%，RSD≤25%。CristinaBlasco用液相色谱离子阱串联质谱分析蜂蜜中有机磷及氨基甲酸盐类杀虫剂，采用OasisHLB柱净化,回收率在72-100%之间，相对标准偏差低于20%，检测限是0.010-0.646mg/kg。朱兴江采[70][51]用中性氧化铝固相萃取柱净化测定了蔬菜水果中的唑螨酯残留。袁烁等用NH2固相萃取柱净化，检测草莓中13种农药。王金芳等用SUPELCLEANLC-18[71]柱净化葡萄酒基质，测定16种农药。基质固相分散萃取(Matrixsolid-phasedispersionextraction,MSPD)是一种结合样品匀浆、提取、净化等相关的分析技术。在MSPD的处理过程中，将样品与固相萃取材料一起研磨，固相萃取材料上结合的有机相能够将样品完全分散到固相萃取材料表面，增加了样品萃取的表面积。MSPD具有提取净化效率高，耗时短、节省溶剂等优点，但主要的缺点是方法不易标准化有待发展其自动化过程[72][73]。杨愿愿等使用N-丙基乙二胺键合固相吸附材料(PSA)和C18吸附剂净化，[74]测定柑橘中四螨嗪的残留量。朱莉萍等利用PSA、Ｃ18与石墨碳黑混合吸附剂[75]粉末净化，测定蔬菜及其制品中５种农药残留。BeatrizAlber等采用基质固相[76]分散净化，测定蜂蜜中多种农药残留。SherolAcostaRodrigues等也采用基质固相分散技术净化洋葱基质。凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography,GPC)是按分子的大小进行分离的一种色谱技术，洗脱剂通过多孔性凝胶固定相，将注入色谱柱中的样品进行洗脱分离，使得样品按分子大小依次被洗脱出来。其分离效果的好坏取决于其分子的大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异，因此存在不完全分离，溶剂用量大，10 [77]连续处理样品能力慢，试剂耗费多等缺点。丁葵英等采用凝胶渗透色谱净化，[78]高效液相色谱-串联质谱法检测辛辣蔬菜中咪鲜胺等7种农药残留。蒋治国等采用在线凝胶渗透色谱/气相色谱-串联质谱法测定蔬菜中49种农药残留组分，其加标回收率为66%-114%，相对标准偏差为0.4%-16.8%。超声波辅助提取技术（UtrasonicSolventExtraction，USE）又称超声提取，是由溶剂萃取技术与超声波技术结合形成的新技术，利用超声提高了溶剂萃取的[79]效率。张王兵等采用超声辅助－化学发光法测定环境样品中哒螨灵。微波辅助萃取（Microwave-assistedextraction，MAE）是根据不同物质吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中，达到提取的目的。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）是2003年[80]Anastassiades等开发建立的，其实质上是将传统的液液萃取、分离和基质固相分散技术相结合的前处理方法。该方法溶剂使用量少，减少实验人员接触有害溶剂的可能性，且方法操作的简易，回收率高，测定结果准确，成为多残留物分析[81]的首选方法之一。李芳等利用QuEChERS方法前处理，测定蔬菜中17种农[82]药残留。LaureWiest等在2011年发表了用改进过的QuEChERS方法前处理，LC-MS/MS和GC-MS/MS测定蜂蜜，蜜蜂和花粉中的80种污染物。该方法回收60-120%。蜂蜜中双甲脒检测限为0.3ng/g，定量限为4.3ng/g；四螨嗪检测限为1.0ng/g，定量限3.9ng/g，噻螨酮检测限0.1ng/g，定量限4.0ng/g。在10ng/g、30ng/g、[83]60ng/g三种添加浓度的回收率为70-120%之间。Zaneta在2013年发表关于的波兰北部来自蜂房的蜂蜜中30种农药残留，用QuEChERS方法提取，用液相色谱-串联质谱LC-ESI-MS/MS检测，其中唑螨酯检测限为1.23ng/g，定量限为3.69ng/g，高浓度回收率为92.7%，低浓度回收率为108.1%，线性范围为23.69-22.2ng/g（r=0.979）1.4.2检测技术薄层色谱法(TLC)实质上是以固态吸附剂（如硅胶、氧化铝等）为担体，水为固定相溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。TLC由于其灵敏度不高，操作费时，已经不能适应现代农药检测发展的要求。11 气相色谱法（Gaschromatographic，GC）是以气体作为流动相的色谱技术。文献报道凡是沸点大约在500℃，分子量在400以下的农药，都能用GC分析测定。选用GC进行分析测定时，检测器和色谱柱的选择非常重要。用于GC的检测器主要有电子捕获检测器（ECD）、火焰光度检测器（FPD）和氮磷检测器（NPD）等。由于GC对沸点高或热稳定性差的农药不能进行分离检测，需进行衍生化处理来降低其沸点或提高其热稳定性，这样就限制了GC的应用。GC作为多组分农药残留分析的主要仪器之一,具有较高的分离性能、灵敏度和选择性。通常与不同类型不同灵敏度的检测器联用，在分析不同种类化合物时具有各自的优势。[84]SN0691-1997出口蜂产品中氟胺氰菊酯残留量检测方法中，试样碱化后用正己烷-丙酮提取，提取液经浓缩后用乙腈和正己烷进行液液分配法净化，使被测物进入乙腈层。乙腈再浓缩，用正己烷溶解残渣定容，溶液供气相色谱法测定，[85]外标法定量。薛晓峰等采用气相色谱电子捕获检测器同时检测蜂蜜中溴螨酯、蝇毒磷、氟胺氰菊酯和氟氯苯氰菊酯，蜂蜜样品用水溶解后经正己烷-二氯甲烷提取，OasisHLB固相萃取柱萃取净化，正己烷-二氯甲烷洗脱吹干后，用内标溶[86]液定容。谭韩英，仇厚援，张志恒，吴莉宇，王强用气相色谱法测定蜂王浆中氟胺氰菊酯残留量，以乙腈为提取溶剂，用Florisil固相萃取柱净化，采用GC-[87]ECD测定，检测蜂王浆中氟胺氰菊酯的残留量。EmmanouelKarazafiris用固相萃取法和气相色谱（ECD）对蜂王浆中的农药残留进行检测，用乙腈+水（1+1）提取，ElutC18净化，乙酸乙酯、正己烷洗脱。高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，是一种以液体为流动相的色谱法，它可以分离检测极性强、分子量大的离子型农药，尤其适用于对不易气化或受热易分解农药的检测。色谱柱有C8柱、C18柱、氨基柱、硅胶柱等，反相的C8、C18柱已较多的用于农残检测中。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，速度快。HPLC小孔和微孔色谱柱的发展应用不仅大大提高了HPLC的灵敏度和高效性，而且减少了样品和溶剂的用量，使HPLC更易与其它技术结合使用。HPLC检测器有紫外检测器、荧光检测器等，检测器种类较气相色谱少，灵敏度不如气相色谱高。但是，液相色谱柱与气相色谱取长补短，12 成为当前农药残留检测的主要手段。液相色谱只能通过保留时间对药物进行定量定性，多残留分析要求目标物在色谱柱上基本分开，通过保留时间来定性定量。对于复杂基质检测，可能出现假阳性样品，需要用质谱进行确证，有一定的局限性。对多种杀螨剂的残留检测，运用高效液相色谱法文献较少。[88]GB/T5009.173-2003中对梨果类，柑桔类试样中的噻螨酮经甲醇提取，硫酸钠水溶液盐析，石油醚萃取，干燥浓缩，过PT-硅镁吸附剂型小柱净化，用带[89]紫外检测器的高效液相色谱仪测定。戴华，黄志强，陈新焕在2000年发表的蜂蜜中氟胺氰菊酯残留量的HPLC测定方法论文中，采用微量化样品处理技术处理蜂蜜样品，残留物经正己烷-丙酮提取后，进行液液分配净化，反相液相色谱法测定，检测波长256nm，外标法定量。测定低限为0.005mg/kg，回收率大于85%，变异系数小于3%。色质联用法由于其既具有色谱技术的分离效能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，已被用于蜂蜜中农药残留的定性和定量测定。目前利用的色质联用技术主要有气相色谱-质谱(Gaschromatography-massspectrometry,GC-MS）、高效液相色谱-质谱法（Highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS）、气相色谱串联质谱（Gaschromatographytandemmassspectrometry，GC-MS/MS）和液相色谱串联质谱法(Liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)，均可以测定蜂蜜中杀虫剂、杀螨剂、抗生素及其分解产物的残留。GC-MS是将气相色谱仪与质谱仪串联起来，成为一个整体使用的检测技术。它既具有的分离性能，又能准确鉴定化合物结构，可达到同时定性、定量检测的目的。GC-MS用于多残留分析，其优点：一是其灵敏度远远超过其他方法，样品的用量不断降低；二是质谱是目前唯一可以确定分子式的方法，而分子式对推测结构至关重要，能在多种残留物同时存在的情况下，对其进行定量定性分析[90]。但是，质谱法的不足是仪器结构复杂，价格较高，在进行复杂分子的结构分析时，对分子空间构型和各种结构单元的联结方式的准确区分与判断存在局限性。[91]GB/T19648-2006水果和蔬菜中500种农药和相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法，试样用乙腈匀浆提取，盐析离心后，取上清液，经固相萃取柱13 净化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脱农药及相关化学品，用气相色谱-质谱仪检测。[92]农业部781号公告-8-2006蜂蜜中双甲脒的残留量测定气相色谱-质谱法，将试样用PH=11.0的氢氧化钠水溶液溶解，试样中残留的双甲脒（及代谢物2,4-二甲基苯胺）用正己烷提取，离心后，取上层有机相，浓缩后用气质联用仪分析，外[93]标法定量。GB/T18932.10-2002，蜂蜜用甲醇+水提取，经过OasisHLB固相萃取柱萃取净化后，用气相色谱/质谱仪选择离子检测方式直接测定，外标法定量。[94]金珍等将蜂蜜试样用乙酸乙酯提取剂超声提取、Florisil硅藻土色谱柱净化，[95]采用选择离子监测（SIM)方式下的GC-EI/MS分析。E.Korta采用GC-MS的SIM模式检测蜂蜡中四种杀螨剂（溴螨酯，杀虫眯，螨吡胺，毒虫畏），甲醇提[96]取，十八烷基硅烷的SPE柱净化。苏建峰等采用溶剂转移气相色谱质谱法和选择洗脱气相色谱法测定大蒜中289种农药多残留中，样品用乙腈水溶液提取，盐析分配，溶剂转移和固相萃取（SPE）净化后进行GC-MS分析，采用SIM模式，外标法定量。LC-MS联用仪(Liquidchromatograph-massspectrometer，LC-MS)通常指高效液相色谱仪与质谱仪的在线联用。与GC-MS相似,液相色谱作为质谱的特殊进样器，LC-MS适合于热不稳定、难挥发等农药残留的快速定性和定量分析。一般而言，凡可用高效液相色谱进行残留分析的农药品种都可以采用LC-MS的方法。但是，LC的最佳分离条件的选择往往会受到质谱仪的限制。在实际分析过程中，要综合考虑各方面的因素，确定最后采用的分离检测模式和方法。[97]GB/T20769-2008利用乙腈匀浆提取水果和蔬菜中450种农药，盐析离心，Sep-PakVac柱净化，用乙腈+甲苯（3+1）梯度洗脱，液相色谱串联质谱仪测定，[98]外标法定量。GB/T20771-2008用二氯甲烷提取蜂蜜中486种农药，经固相萃取柱净化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脱，液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。[99]AnnaSannino用液相色谱串联质（LC-ESI-MS/MS）检测加工的水果和蔬菜中的杀虫剂，其中喹螨醚，唑螨酯，噻螨酮，吡螨胺经过无氯溶剂进行液液分配提取，直接用LC-MS/MS梯度洗脱分析检测，回收率为76-106%，RSDs≤15%。[100]LaureWiest等在2011年发表了用改进过的QuEChERS方法前处理，LC-MS/MS和GC-MS/MS测定蜂蜜，蜜蜂和花粉中的80种污染物。该方法定量添加回收实验浓度在10ng/g时，回收率为60-120%。14 1.5研究内容及意义1.5.1研究内容通过查阅相关文献及对实际养蜂场及养蜂人员的用药调查，确定蜂蜜和蜂王浆中可能存在杀螨剂残留。研究蜂蜜和蜂王浆中十种杀螨剂药物残留的提取，净化方法和液相色谱串联质谱检测技术，建立蜂产品中多种杀螨剂药物的残留检测方法。在以上研究的基础上，将方法进行标准化研究，研究方法准确度、精密度、灵敏度等。研究主要内容包括：1.以蜂蜜为研究对象，10种杀螨剂为分析目标物，通过对分散液液微萃取前处理技术中分散剂及萃取剂种类及体积、超声时间等条件进行优化，高效液相色谱-串联质谱法的色谱柱、流动相、进样量等仪器条件的探讨，建立蜂蜜中杀螨剂多残留的痕量检测方法。2.以蜂王浆为研究对象，10种杀螨剂为分析目标物，通过对样品提取溶剂和提取方法的选择优化、净化过程中固相萃取柱的选择以及相应淋洗液、洗脱剂的选择和比例优化，以及高效液相色谱-串联质谱法的色谱柱、流动相、进样量等仪器条件的探讨，建立蜂王浆中杀螨剂多残留的痕量检测方法。3.对我国多个蜂蜜和蜂王浆样品进行适用性试验，包括5-100μg/kg的浓度范围内添加回收试验，考察回收率、变异系数等参数验证方法的可靠性和准确性。1.5.2研究意义我国是蜂蜜和蜂王浆出口大国，在出口的过程中尤其是加入WTO（WorldTradeOrganization）后，美国、日本和欧洲作为我国蜂产品的主要的出口地区纷纷对蜂产品提出更多的蜂产品药物残留标准，采取各种限制措施，致使我国蜂产品出口量在新的标准下呈现下降趋势。由于我国蜂农在长期的用药过程中，滥用药物，对蜂产品造成一定污染，药物残留也严重超出出口国的标准。国内对蜂蜜和蜂王浆残留检测还没有标准检测方法，在出口监控设置的检出限越来越低的情况下，提出开展我国蜂产品中杀螨剂残留检测方法和标准化研究是科学合理和十分迫切的。为制定国家或行业标准提供技术支撑，提高我国对蜂王浆类产品质量安全监控能力。15 16 第2章蜂蜜中多种杀螨剂的残留方法研究2.1实验方法2.1.1实验仪器高效液相色谱仪：配备四联泵、脱气泵、二极管阵列检测器、荧光检测器、自动进样器、柱温箱，美国Thermo公司；质谱仪：TSQQuantumMassSpectrometerSyster型，美国Finnigan公司；LunaC18色谱柱（150mm×2.0mm,5µm，美国Phenomenex公司）；可调微量移液器：10µL、100µL、100-1000µL，芬兰EPPENDOR公司；螺口自动进样瓶：2mL，美国Agilent公司；离心机：ThermoScientific公司；超声波清洗器：KQ-250B型，昆山市超声仪器有限公司；电子天平(千分之一)：德国赛多利斯公司；分析天平(十万分之一)：德国赛多利斯公司；-1快速混匀器：IKAMSlMinishaker，3000r·min，德国LKA-worker公司；旋转蒸发仪：BüchiR205型，瑞士步琪有限公司。2.1.2实验材料蜂蜜样品：市场购买；杀螨剂标准品：四螨嗪(Clofentezine),喹螨醚（Fenazaquin），吡螨胺（Tebufenpyrad），噻螨酮（Hexythiazox），乙螨唑（Etoxazole），蝇毒磷（Coumaphos），哒螨灵（Pridaben），克螨特（Propargite），螺螨酯（Spirodiclofen），唑螨酯（Fenpyroximate）标准溶液购置北京世纪奥科生物技术有限公司，浓度均为100mg/L，体积1.0mL；2.1.3化学试剂乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；二氯甲烷、三氯甲烷（分析纯，上海化学试剂有限公司）；微孔过滤膜(AgelaTechnologies，0.22µm)；溶剂过滤膜(上海兴亚材料净化厂，0.22µm)；水(Millipore超纯水仪,超纯)。2.2试验方法2.2.1标准溶液的配制准确称取标准溶液1.0mL，甲醇溶解定容于10mL的容量瓶，即配制为浓度17 为10mg/L的标准储备液。置于4℃条件下避光保存。2.2.2样品预处理称取5g蜂蜜样品，用200mL去离子水配制成25g/L（w:v=1:40）的蜂蜜水溶液，平衡15min以上。准确移取5.0mL（精确至0.01mL）25g/L的蜂蜜水溶液于15mL离心管中，加入0.5mL乙腈,1.0mL二氯甲烷，涡旋1min，超声15min使其进行乳化，形成水-分散剂-萃取剂的乳浊液体系，再涡旋1min，在7000r/min的转速下离心5min，转移下层，氮吹至干，残渣用乙腈定容至1.0mL,过0.22µm滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定。2.2.3色谱质谱条件色谱条件：柱温：室温；进样量：5µL；流动相：甲醇-5mmol/L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸），体积比90:10，流速：0.2mL/min。质谱条件：电离方式ESI(+),毛细管温度为350℃；喷雾电压4500V；鞘气流量0.7L/h;辅助气流量0.2L/h；碰撞气为氩气。检测方式为多反应检测（MRM）方式扫描，监测离子对和参数见表2-1，其溶剂色谱图如图2-1。表2-110种杀螨剂质谱参数杀螨剂离子对碰撞能E/eV保留时间tR/min四螨嗪303．0/138.0*,303.0/102.014,333.30喹螨醚307.0/131.0*,307.0/146.039,286.32吡螨胺334.0/145.0*,334.0/117.024,283.84噻螨酮353.0/228.0*,353.0/168.021,354.47乙螨唑360.0/141.0*,360.0/304.027,134.48蝇毒磷363.0/226.9*,363.0/306.927,162.98哒螨灵365.0/147.0*,365.0/309.034,165.83炔螨特368.0/175.0*,368.0/231.014,314.50螺螨酯411.0/313.0*,411.0/71.017,295.04唑螨酯422.0/366.0*,422.0/214.023,384.96*quanitificationionpairs18 RT:0.00-10.02SM:7G2.98NL:7.61E4100m/z=226.40-227.40F:+cESIsid=10.00SRMms2363.000[210.899-210.901,50226.899-226.901,306.899-306.901]MS13-STD-25PPB3.30NL:2.28E4100m/z=137.50-138.50F:+cESIsid=10.00SRMms2303.000[101.999-102.001,50137.999-138.001]MS13-STD-25PPB3.84NL:4.67E4100m/z=144.50-145.50F:+cESIsid=10.00SRMms2334.000[116.999-117.001,50144.999-145.001]MS13-STD-25PPB4.47NL:1.17E4100m/z=227.50-228.50F:+cESIsid=10.00SRMms2353.000[167.999-168.001,50227.999-228.001]MS13-STD-25PPB4.48NL:3.04E5100m/z=140.50-141.50F:+cESIsid=10.00SRMms2360.000[140.999-141.001,50303.999-304.001]MS13-STD-25PPB012345678910Time(min)RT:0.01-10.02SM:7G4.50NL:5.19E4100TICF:+cESIsid=10.00SRMms2368.000[174.999-175.001,50230.999-231.001]MS13-STD-25PPB4.96NL:2.28E4100m/z=365.50-366.50F:+cESIsid=10.00SRMms2422.000[213.999-214.001,50365.999-366.001]MS13-STD-25PPB5.04NL:1.25E4100m/z=312.50-313.50F:+cESIsid=10.00SRMms2411.000[70.999-71.001,50312.999-313.001]MS13-STD-25PPB5.83NL:8.50E4100m/z=146.50-147.50F:+cESIsid=10.00SRMms2365.000[146.999-147.001,50308.999-309.001]MS13-STD-25PPB6.32NL:5.26E4100m/z=130.50-131.50F:+cESIsid=10.00SRMms2307.000[130.999-131.001,50145.999-146.001]MS13-STD-25PPB12345678910Time(min)图2-110种杀螨剂混标浓度为25µg/L的色谱图2.3结果与分析在本研究中,分散液液微萃取技术与液相色谱串联质谱技术联用萃取富集蜂蜜样品中的10种杀螨剂.选择最佳的流动相比例，是的目标分析物有较好峰形及分离度。为了得到最佳的萃取条件,考察影响萃取效率的一些实验参数:样品稀释倍数及取样量、萃取剂和分散剂的类型、萃取剂和分散剂的体积、超声时间。2.3.1流动相的选择为了得到更好地响应和峰形，考虑流动相的不同组成和比例，首先用甲醇和乙腈作为流动相比较，结果表明甲醇作为流动相时峰形更为尖锐，响应更好。流19 动相A中加入不同比例的甲酸和乙酸作为比较时，甲酸和乙酸在三种浓度+（0.05,0.1,0.2%，v/v）下，[M+H]峰形和分辨率都有提高，都能够大大减少保留时间，但是也导致更多的共流物和一些杂质，离子抑制效应明显加强。通过加入三种浓度（5,10,20mmol/L）的甲酸铵缓冲溶液和乙酸铵缓冲溶液，乙酸铵能够得到很好地响应和合适的保留时间，通过加入乙酸铵盐离子抑制效应得到补偿，考虑到乙酸铵在乙腈中有限的溶解度，最后确定加入5mmol/L的浓度，故最后确定流动相为甲醇和甲酸（0.1%,V/V）醋酸铵（5mmol/L）水溶液作为流动相等度洗脱（90/10V/V）。2.3.2样品稀释倍数的优化蜂蜜的稀释倍数决定了分散液液微萃取方法对目标分析物的提取效率。本实验分别配制浓度为10g/L、25g/L、50g/L、100g/L的四档蜂蜜水浓度，并对其进行添加浓度为100µg/kg的回收试验，其回收率如图2-1所示，25g/L的蜂蜜水浓度其回收率最好，当蜂蜜水浓度升高时，其回收率会降低，高于100g/L时，10种杀螨剂的回收率R＜60%，这是由于高浓度蜂蜜水溶液粘度大影响了有机相微珠的沉降，蜂蜜水浓度越高，其乳化程度就越差；而低浓度的蜂蜜水，稀释倍数较大，部分目标物的回收率较低，因此综合考虑，选用25g/L的蜂蜜水为最佳浓度。图2-2不同浓度蜂蜜水溶液中10种杀螨剂的回收率2.3.3蜂蜜水取样体积在优化蜂蜜水取样体积时，我们预先配置好浓度为25g/L的蜂蜜水，分别取20 样5.0mL、10.0mL、15.0mL、20mL，对其进行5次平行试验，其结果如下图2-2所示，在分散剂萃取剂一定的情况下，取样量越大，其回收率反而降低，其原因可能是萃取剂量不足，在取样量5mL时，10种杀螨剂回收率都高于70%，最终，确定最佳取样体积为5mL.图2-3不同体积蜂蜜水溶液中10种杀螨剂的回收率2.3.4萃取剂与分散剂选择在分散液液微萃取中，分散剂的主要作用是将萃取剂均匀的分散在水相中，形成极细的小液滴以增大萃取比表面积。因此分散剂必须既能溶解萃取剂又能同溶水相互溶。为了选择合适的分散剂，我们比较了甲醇和乙腈两种实验室常用的试剂，甲醇与二氯甲烷产生乳化现象不明显，乙腈的分散效果更好，最终确定，乙腈作为分散剂。为了得到好的分析结果，选择合适的萃取剂是非常重要的，在DLLM中萃取剂应该密度大于水且能萃取目标分析物，且不影响后续分析。对于分散液液微萃取（DLLME）来说，萃取剂应具备的条件如下：(1)不易溶于水且密度比水大；(2)能够萃取目标分析物；(3)有较好的色谱行为或易蒸发除去。常用的萃取剂有氯苯、二硫化碳、二氯甲烷、氯仿、离子液体等。在本实验研究中，在空白的蜂蜜基质中添加10种杀螨剂（加标浓度为100µg/kg）用于实验条件优化。取5mL蜂蜜水，分别以密度大于水且不溶于水的二氯甲烷和三氯甲烷为萃取剂，乙腈为分散剂，萃取剂与分散剂体积分别为2.0mL和0.5mL，分别进行5组平行实验，21 测定不同分散萃取体系下目标物的回收率，回收率结果如图2-3所示。从图2-3可知，二氯甲烷作为10种杀螨剂的萃取剂时，其回收率大于70%，而三氯甲烷作为萃取剂，哒螨灵的回收率反而降低，因此，选择二氯甲烷作为本实验的萃取剂。图2-410种杀螨剂在不同萃取剂下的回收率2.3.5萃取剂与分散剂体积的确定萃取剂与分散剂的体积直接影响样品回收率。过多的提取剂会造成浪费，提取剂不足不能把目标物完全提取出来。本实验中，在空白的蜂蜜基质中添加10种杀螨剂（加标浓度为100µg/kg）用于实验条件优化。取5mL蜂蜜水，以不同体积的二氯甲烷（0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL）和分散剂（0.0、0.5、1.0mL）为萃取体系，根据不同体积的分散剂与萃取剂，建立正交试验，考察其回收率。由实验结果可知，当无分散剂时，相当于传统的液液分配，回收率低于70%，当分散剂体积为0.5mL时，回收率高于70%，继续增大分散剂的体积，部分杀螨剂的回收率低于70%，故选择分散剂体积0.5mL（如图2-4所示）。当分散剂为0.5mL，萃取剂逐渐增加，当增加至1.0mL时，回收率（R）>77%,精密度RSD<15%，继续增加萃取剂体积，回收率增加不大（如图2-5所示）。最终选择萃取剂体积为1.0mL，分散剂体积为0.5mL作为最佳分散剂和萃取剂体积。22 图2-5不同分散剂(乙腈)体积下杀螨剂的回收率图2-6分散剂0.5mL时,不同萃取剂体积下杀螨剂的回收率2.3.6超声时间的优化为了使分散在水相中的离子液体充分沉聚，其他条件不变的情况下，考察了离心时间对萃取效果的影响。液液微萃取技术，是利用萃取剂快速注入水-分散剂中，产生萃取剂微珠，加大有机萃取剂微珠和水样之间相接触面，而超声辅助，有助于加快分析物在两相之间的转移，从而有助于萃取剂微珠对目标分析物的萃取。本实验考察超声时间5min、10min、15min、20min、25min、30min，其结果如图2-6所示。以二氯甲烷和乙腈为萃取体系，10种杀螨剂的回收率在5-15min，随着时间的增加，回收率增加，15min以后，回收率基本不变，故选择15min为最佳超声时间。23 四螨嗪喹螨醚吡螨胺噻螨酮乙螨唑蝇毒磷哒螨灵克螨特螺螨酯唑螨酯100%90%80%70%回收率R60%50%40%30%051015202530t/min图2-7不同超声时间下杀螨剂的回收率2.3.7离心转速的优化离心转速的影响，我们考虑了转速范围2000-8000rpm/min。转速在2000-7000rpm/min的范围，10种杀螨剂的提取回收率总体上来说有提高，7000-8000rpm/min，提取回收率基本影响不大。最终，我们选取7000rpm/min的转速作为最佳条件。2.3.8蜂蜜的基质效应在液相色谱电喷雾电离质谱法中，一般认为可能源于待测组分与生物样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争．其竞争结果会显著地降低（离子抑制）或增加（离子增强）目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确度．对于在蜂蜜基质中所开发的方法，利用基质匹配校准曲线是为了补偿该基质的效果，即，在蜂蜜基质中所研究的杀螨剂信号抑制或增强。基体效应的影响，以两档加标浓度（50.0µg/kg和75.0µg/kg）进行了实验。通过基质匹配校准曲线和溶剂标曲线计算回收率，如表2-2。整体来说，通过对回收率的比较，蜂蜜基质对十种杀螨剂的残留检测的信号是起抑制作用，采用基质匹配校准曲线，其回收率在70%-101%之间，符合回收率的标准，因此采用基质匹配校准曲线进行定量分析。24 表2-2基质匹配校准曲线和溶剂标曲线计算回收率添加浓度R,基质匹配校准曲线杀螨剂Rs,溶剂标曲线回收率µg/kg回收率5065%95%四螨嗪7552%88%5062%70%喹螨醚7535%87%5065%78%吡螨胺7546%91%5077%83%噻螨酮7566%87%5056%77%乙螨唑7526%70%5067%80%蝇毒磷7551%92%5089%96%哒螨灵7565%101%5078%88%炔螨特7553%95%5065%86%螺螨酯7558%87%5077%88%唑螨酯7558%87%2.3.9方法的线性范围与检出限取混合标准储备液，以蜂蜜基质提取液配制成一系列标准曲线，采用上述最佳萃取条件以及色谱条件进行分析测定，以各目标化合物的质量浓度c为横坐标，仪器响应峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，分别以S/N=3、S/N=10确定检出限（LOD）及定量限（LOQ），10种杀螨剂的线性范围、相关系数、检出限结果见表2-3。结果如表2-3所示：在0.1-100µg/L线性范围内，各目标物25 线性关系良好。表2-3杀螨剂的基质标准曲线方程，相关系数，检出限和定量限线性范围LODLOQ2杀螨剂基质标准曲线相关系数（r）(µg/L)w/(µg/kg)w/(µg/kg)四螨嗪0.1-100y=14414x+457680.99791.03.05喹螨醚0.1-100y=32565x+1.1×100.99601.03.05吡螨胺0.1-100y=39799x+1.8×100.99480.62.0噻螨酮0.1-100y=10043x+387850.99281.03.055乙螨唑0.1-100y=2.4×10x+7.0×100.99301.03.05蝇毒磷0.1-100y=65777x+1.5×100.99830.51.55哒螨灵0.1-100y=81266x+1.1×100.99620.51.55炔螨特0.1-100y=37902x+1.3×100.99250.51.5螺螨酯0.1-100y=12683x+270170.99711.03.0唑螨酯0.1-100y=20684x+396800.99640.832.52.3.10方法回收率与精密度为了保证定量的准确性，采用本实验优化的试验方法，分别在空白的蜂蜜样品中进行加标浓度实验，测定10种杀螨剂在三档加标浓度（10µg/kg，50µg/kg和100µg/kg下的回收率，每个浓度做7个平行。实验结果见表2-4.表2-4杀螨剂的回收率和精密度(n=7)10µg/kg50µg/kg100µg/kg杀螨剂RecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSD四螨嗪77%±3.5%4.5%93%±6.4%6.9%95%±2.7%2.8%喹螨醚83%±5.3%6.4%92%±7.2%7.8%98%±4.5%4.6%吡螨胺85%±2.0%2.3%84%±1.8%2.2%85%±3.2%3.8%噻螨酮101%±8.2%8.1%87%±5.5%6.3%91%±2.3%2.5%乙螨唑72%±4.5%6.3%82%±2.5%3.1%81%±3.5%4.3%蝇毒磷95%±2.6%2.7%85%±10.1%11.9%86%±1.6%1.9%哒螨灵88%±4.3%4.9%89%±2.5%2.8%95%±1.2%1.3%炔螨特74%±3.8%5.1%92%±7.2%7.8%100%±6.7%6.7%螺螨酯103%±12.2%11.8%86%±5.8%6.8%97%±4.5%4.6%唑螨酯93%±6.2%6.7%95%±2.5%2.6%98%±2.0%2.0%从表2-4可知，在加标浓度为100µg/kg时，其回收率为81%-100%，相对标准偏差RSD为1.3%-6.7%；在加标浓度为50µg/kg时，其回收率为72%-95%，相对标准偏差RSD为2.2%-11.9%；在加标浓度为10µg/kg时，其回收率为26 72%-103%，相对标准偏差RSD为2.3%-11.8%。方法的准确度与精密度满足蜂蜜中多种杀螨剂的残留测定要求。2.3.11方法的适用性实验分别取洋槐蜜、枣花蜜、枇杷蜜、油菜蜜进行适用性试验，每种蜂蜜各添加10、50、100µg/kg三档浓度，各个浓度进行五次重复试验，按照实验步骤由高效液相色谱串联质谱测定，得到最终实验结果如表2-5。由表可知次试验方法测得洋槐蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在75%-110%之间，相对标准偏差RSD为1.6%-7.7%；枣花蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在74%-99%之间，相对标准偏差RSD为2.5%-12.9%;枇杷蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在77%-101%之间，相对标准偏差RSD为3.3%-11.1%;油菜蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在76%-104%之间，相对标准偏差RSD为2.1%-10.9%。由此看出本方法适用于一般品种的蜂蜜检测，有很好的适用性和重复性。表2-5杀螨剂的适用性试验数据添加浓度洋槐蜜枣花蜜枇杷蜜油菜蜜杀螨剂RecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSDµg/kg1075%4.9%80%5.0%77%3.4%82%5.6%四螨嗪5089%6.0%97%3.2%89%5.1%86%2.1%10090%3.1%84%5.9%91%4.1%97%5.0%1079%4.5%95%3.7%94%5.2%93%4.3%喹螨醚5085%6.4%91%8.9%91%5.9%104%4.2%10093%3.2%98%4.5%85%2.3%93%5.1%1082%3.3%88%5.4%83%5.9%95%6.4%吡螨胺5084%4.1%87%3.2%79%4.1%86%3.2%10093%4.5%97%2.7%89%3.2%94%5.4%1084%7.1%93%8.2%90%2.3%95%4.6%噻螨酮5087%5.7%96%6.1%84%3.5%93%4.9%100110%3.7%88%4.3%91%5.3%107%3.5%1081%7.3%86%3.3%88%4.1%83%3.6%乙螨唑5090%2.9%84%5.4%89%4.2%93%4.7%10092%1.6%92%5.2%95%4.3%99%3.8%1085%7.7%74%3.4%79%5.1%83%4.5%蝇毒磷5083%2.9%87%7.9%89%10.9%94%7.5%10087%4.1%99%4.1%83%5.2%91%4.9%27 1087%5.9%85%12.9%87%11.1%92%8.8%哒螨灵5093%6.1%89%5.1%93%5.5%91%4.8%10096%4.2%93%3.9%99%4.1%87%3.1%1079%4.1%81%2.5%80%5.6%87%4.3%炔螨特5082%3.5%89%7.9%85%5.1%93%4.9%100103%5.1%90%4.3%93%6.7%104%7.3%1083%4.8%89%4.4%101%6.5%76%5.9%螺螨酯5085%6.3%86%5.9%83%8.3%96%7.6%10090%3.2%93%6.3%92%4.9%98%5.9%1083%6.7%75%4.5%79%4.7%87%6.1%唑螨酯5093%3.7%86%4.3%93%4.3%97%7.5%100103%2.2%97%6.1%88%6.1%94%6.8%2.4实际样品检测将上述方法用于100个蜂蜜样品的测定，称取5.00g蜂蜜样品，经过2.2.2中前处理方法，液相色谱串联质谱进样进行分析，其测定结果如表2-6所示。由表2-6可知，10种杀螨剂均有检出，其中吡螨胺和噻螨酮两种杀螨剂检出率最高，这使得我们对杀螨剂的使用应更加关注，可见对杀螨剂在蜂产品残留的研究是有重要意义的。表2-6实际样品检出情况杀螨剂检出个数检出率检出浓度最大检出浓度最小四螨嗪99%41.708.08喹螨醚55%21.438.40吡螨胺1616%34.518.01噻螨酮1212%38.738.21乙螨唑22%13.984.11蝇毒磷1010%27.497.16哒螨灵33%16.768.51炔螨特55%18.483.53螺螨酯88%28.188.63唑螨酯11%9.089.08实验图谱表明处理后的样品能够很好地去除样品杂质，下图2-8-图2-17分别为10种杀螨剂标准溶液、加标样品和空白样品的色谱图。28 c图2-8(a)蝇毒磷浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图29 c图2-9（a）四螨嗪浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图30 c图2-10（a）吡螨胺浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图31 c图2-11（a）噻螨酮浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图32 c图2-12（a）乙螨唑浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图33 c图2-13（a）炔螨特浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图34 c图2-14（a）唑螨酯浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图35 c图2-15（a）螺螨酯浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图36 c图2-16（a）哒螨灵浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图37 c图2-17（a）喹螨醚浓度为6.25µg/L标样色谱图；（b）加标浓度为50µg/kg的色谱图;(c)空白样品图的色谱图2.5小结本文建立了超声辅助分散液液微萃取结合液相色谱-串联质谱同时测定了蜂2蜜中10种杀螨剂的检测方法。线性相关系数r均大于0.99，蜂蜜中添加浓度在10-100µg/kg的范围内回收率为72%-107%之间，相对标准偏差在1.3%-11.8%之间，表明本方法在蜂蜜的基质中有很好的重复性和重现性。到目前为止在蜂蜜中38 杀螨剂制定了最大残留限量的只有蝇毒磷和唑螨酯，而我国只有蝇毒磷有最大残留限量，相对国外最严苛的日本食品列表的规定，目前唑螨酯在蜂蜜中的限量标准为5μg/kg，本实验唑螨酯的检出限为2.5μg/kg，蝇毒磷的检出限为1.5μg/kg，能够满足要求，进一步拓宽了国家检测要求。对四种蜜种进行方法适用性试验，洋槐蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在75%-110%之间，相对标准偏差RSD为1.6%-7.7%；枣花蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在74%-99%之间，相对标准偏差RSD为2.5%-12.9%;枇杷蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在77%-101%之间，相对标准偏差RSD为3.3%-11.1%;油菜蜜在加标浓度为10、50、100µg/kg时，其回收率在76%-104%之间，相对标准偏差RSD为2.1%-10.9%。在100个实际蜂蜜样品检测中，四螨嗪的检出率是9%，喹螨醚的检出率是5%，吡螨胺的检出率是16%，噻螨酮的检出率是12%，乙螨唑的检出率是2%，蝇毒磷的检出率是10%，哒螨灵的检出率是3%，克螨特的检出率是5%，螺螨酯的检出率是8%，唑螨酯的检出率是1%。该方法前处理简单快速，试剂用量少，对环境污染小、效率高、成本低，精密度高，稳定性好，检出限能满足蜂蜜中已有杀螨剂的检测需求，同时对未有设立最大残留限标准的杀螨剂的测定，提供参考。39 第3章蜂王浆中多种杀螨剂的残留方法研究高效液相色谱-串联质谱技术将液相色谱和质谱二者的优点结合，质谱分析通过将目标物分子离子化过程，得到不同质量的离子碎片，达到分离效果，再进行各个离子峰强度测定。高效液相色谱的高分离性能和质谱的高选择性、高灵敏度结合，逐渐取代了分辨率不高的液相色谱和分析对象少的气相色谱串联质谱，此技术将成为药物分析领域常用的分析工具。近年来发展迅速，已广泛应用于食品安全检测领域。本章节根据高效液相色谱和三重四级杆质谱联用技术进行定性定量分析研究。3.1实验材料和仪器3.1.1试验仪器（1）液相色谱-串联质谱仪：液相戴安UltiMate3000，TSQQuantumMassSpectrometerSystem（美国Finnigan-Thermo公司）；（2）HeraeusbiofugeprimoR离心机（美国ThermoFisherscientific公司）；（3）KQ-100B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；（4）移液枪（20-200µL，500-5000µL，EppendorfResearch公司）；（5）BS224S型电子天平（0.1mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；（6）自动浓缩仪（BüchiR205型，瑞士步琪有限公司）；（7）电子天平（0.001g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；（8）涡旋混合器(TALBOYS公司)；（9）氮吹仪(AUTOSCIENCE,MTN-2800D)；（10）可调式移液器(witegGERMANY)；3.1.2实验材料和化学试剂蜂王浆样品：市场购买；杀螨剂标准品：四螨嗪(Clofentezine),喹螨醚（Fenazaquin），吡螨胺（Tebufenpyrad），噻螨酮（Hexythiazox），乙螨唑（Etoxazole），蝇毒磷（Coumaphos），哒螨灵（Pridaben），克螨特（Propargite），螺螨酯（Spirodiclofen），唑螨酯（Fenpyroximate）标准溶液购置北京世纪奥科生物技术有限公司，浓度均为100mg/L，体积1.0mL；固相萃取柱：HLB（60mg/3mL、150mg/3mL），美国Waters公司，ENVI-1840 （60mg/3mL）色谱柱：LunaC18色谱柱（150mm×2.0mm,3µm，美国Phenomenex公司）3.1.3化学试剂甲醇（色谱纯，美国Merck公司）;乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮（分析纯，上海化学试剂有限公司）；微孔过滤膜(AgelaTechnologies，0.22µm)；溶剂过滤膜(上海兴亚材料净化厂，0.22µm)；无水氯化钠(江苏强盛化学股份有限公司，分析纯)；水(Millipore超纯水仪,超纯)。3.2实验方法3.2.1标准溶液的配制配制方法如同2.2.1。3.2.2样品提取称取蜂王浆试样2.00g于50mL离心试管中，加入10mL去离子水，振摇均匀，使蜂王浆试样充分溶解。加入20mL乙腈，4g氯化钠，振摇均匀，涡旋混合1min，以7000r/min的转速离心3min，将上层有机相收集于浓缩瓶中，继续加入乙腈20mL，重复上述操作一次，合并上层有机相，乙腈溶液在旋转蒸发仪上以40℃旋转蒸发至近干，用5mL的乙腈-水（20+80）溶液分三次溶解残渣。3.2.3样品净化将HLB固相萃取柱进行活化，用5mL乙腈预洗萃取柱，再用去离子水5mL预洗。将上述溶解样品以0.5mL/min的速度过柱，用乙腈-水（20+80）溶液3*2.5mL进行淋洗，弃去淋洗液，再用5mL乙腈进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，流动相定容至1.0mL。过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。3.2.4色谱质谱条件色谱条件：柱温：室温；进样量：5µL；流动相：甲醇-5mmol/L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸），体积比90:10，流速：0.2mL/min。质谱条件：电离方式ESI(+),毛细管温度为350℃；喷雾电压4500V；鞘气流量0.7L/h;辅助气流量0.2L/h；碰撞气为氩气。检测方式为多反应检测（MRM）方式扫描，监测离子对和参数见表3-1。41 表3-110种杀螨剂质谱参数杀螨剂离子对碰撞能E/eV保留时间tR/min四螨嗪303.0/138.0*,303.0/102.014,332.99喹螨醚307.0/57.0*,307.0/161.020,155.81吡螨胺334.0/145.0*,334.0/117.024,283.51噻螨酮353.0/228.0*,353.0/168.021,354.05乙螨唑360.0/141.0*,360.0/304.027,134.12蝇毒磷363.0/226.9*,363.0/306.927,162.75哒螨灵365.0/147.0*,365.0/309.034,165.25炔螨特368.0/175.0*,368.0/231.014,314.09螺螨酯411.0/313.0*,411.0/71.017,294.59唑螨酯422.0/366.0*,422.0/214.023,384.54*定量离子对3.3结果与分析3.3.1提取试剂的确定综述文献，10种杀螨剂的提取试剂常选用甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二[66,69,98,101-103]氯甲烷和乙酸乙酯等。针对蜂王浆基质里面含有大量蛋白质因素，为了使蛋白质的沉降且对目标物有较好的提取效率，最终选用乙腈作为10种杀螨剂的提取试剂。3.3.2流动相的选择用甲醇和水作为流动相进行试验，峰型不好且拖尾严重，为减少拖尾，在流动相中加入酸性抑制剂，尝试了在水中加入不同比例的甲酸和乙酸铵，对色谱条件进行优化，最后确定在水中加入含体积分数0.1%的甲酸和2mmol/L的乙酸铵，采用Luna-C18柱进行试验获得的峰较对称，拖尾效应小。3.3.3萃取柱的选择根据文献查阅10种杀螨剂在反相色谱柱上均有一定的保留，因此，本实验选取了实验室常用HLB、ENVI-18柱作为固相萃取柱进行净化处理。将相同浓度的混合标准溶液分别过ENVI-18和HLB固相萃取小柱，测定其对10种杀螨剂的萃取效果。实验过程中，不同浓度的标准溶液分别过HLB（60mg/3mL柱，ENVI-18(60mg/3mL)，三种浓度下的回收率比较，结果如表3-2所示，HLB（60mg/3mL）固相萃取柱回收率均高于其他型号的固相萃取柱。选择HLB柱42 净化蜂王浆基质。表3-2不同浓度和柱子的回收率比较ENVI-18HLB杀螨剂0.050.10.20.050.10.2四螨嗪50%66%64%86%91%93%喹螨醚46%56%52%87%92%83%吡螨胺63%78%79%83%81%89%噻螨酮58%59%61%80%78%91%乙螨唑60%75%63%81%83%86%蝇毒磷73%95%90%83%82%85%哒螨灵29%39%30%80%80%81%炔螨特45%58%46%76%82%82%螺螨酯57%69%65%78%88%92%唑螨酯83%82%82%98%84%86%3.3.4洗脱试剂的选择（1）淋洗过程，分别选用甲醇+水（2+8，3+7，7+3,8+2，9+1）、甲醇、乙腈+水（2+8，3+7,7+3,8+2，9+1）、乙腈不同的淋洗溶液进行试验，结果表明，甲醇+水（2+8，4+6）作为淋洗溶液时，目标物不被洗脱，随着甲醇比例的增大，目标物被洗脱下来。乙腈+水（2+8）作为洗脱溶液时没有目标物被洗脱，但是当乙腈比例加大到乙腈+水（3+7）比例时有目标物被洗脱，对比用甲醇和乙腈作为洗脱溶剂时发现洗脱相同浓度的唑螨酯农药甲醇所需的溶剂量大于乙腈的溶剂量，本着净化过程能够最大限度地减少杂质干扰，最终选取乙腈+水（2+8）作为淋洗溶液。（2）洗脱过程，根据杀螨剂在HLB柱上有较好的吸附和解吸特性，试验选择有较好的洗脱效果又能最大限度地减少杂质干扰的洗脱液。分别用甲醇和乙腈进行洗脱，改变乙腈与水的比例对柱子进行淋洗，比例越大，洗脱效果越强，在实验过程中，用甲醇洗脱10种杀螨剂时所需洗脱体积量高于乙腈洗脱，因此选择乙腈洗脱。洗脱溶剂量过小不能够全部将目标物洗脱下来，造成损失，溶剂量过大时易将固相萃取柱中的杂质带进仪器，选择合适的洗脱剂用量能够将唑螨酯完全洗脱，并能够最大限度的去除杂质。以1mL为每次的洗脱剂用量，进行洗脱试验，其淋洗曲线如图3-1所示。43 图3-1淋洗曲线结果表明，在前5mL洗脱过程中，目标物洗脱量逐渐增加，当洗脱液大于5mL后，回收率基本稳定，综合考虑洗脱液用量和杂质干扰情况，最后以5mL洗脱液用量为宜。3.3.5洗脱速率的选择以乙腈作为洗脱液，洗脱液体积设为5mL，洗脱流速分别设为0.2、0.5、1.0、2.0mL/min，收集洗脱液氮吹至干，流动相定容，超高效液相色谱进样，考察洗脱速率对洗脱效率的影响，实验结果如下图3-2所示。四螨嗪喹螨醚吡螨胺噻螨酮乙螨唑蝇毒磷哒螨灵克螨特螺螨酯唑螨酯100%90%80%70%60%回收率50%40%30%20%0.20.512mL/min图3-2流速对洗脱效率的影响由图3-2可知，洗脱剂流速很大程度上影响着洗脱效率，随着洗脱剂流速加44 大，洗脱效率降低，且下降程度随着流速的增加越来越明显，从洗脱效率和洗脱时间综合考虑本实验最终选择0.5mL/min的流速最为最终的洗脱速度。3.3.6基质效应与方法的线性范围、检出限基质效应是一个很广泛的概念,它几乎存在于所有的样品中,因为检测样品的“周围的物质”，不可避免地影响到目标分析物的检测。近年来，液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)发展迅速，在生物样品分析中发挥了极大作用,但LC-MS普遍存在基质效应。在串联质谱法样品分析中,基质效应影响数据的准确性是一个不能忽视的问题，即如何消除或减弱基质效应的影响。本实验为了减小基质效应对实验准确度的影响，采用基质标准曲线法定量。取混合标准储备液，以蜂王浆基质提取液配制成一系列标准曲线，以各目标化合物的质量浓度c为横坐标，仪器响应峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，分别以S/N=3、S/N=10确定检出限（LOD）及定量限（LOQ），10种杀螨剂的线性范围、相关系数、检出限结果见表3-3。结果如表3-3所示：在0.1-200µg/L线性范围内，各目标物线性关系良好。2表3-3杀螨剂的基质标准曲线方程，相关系数(r)，检出限和定量限线性范围相关系数LODLOQ杀螨剂基质标准曲线2(µg/L)（r）w/(µg/kg)w/(µg/kg)四螨嗪0.1-200y=13011x+1226.40.99191.03.9喹螨醚0.1-200y=87671x+352610.99300.251.0吡螨胺0.1-200y=85573x+895440.99930.250.75噻螨酮0.1-200y=25946x+230330.99720.82.5乙螨唑0.1-200y=2.9E+5x+2.9E+50.99800.250.75蝇毒磷0.1-200y=1.3E+5x+1.5E+50.99550.51.5哒螨灵0.1-200y=54373x+901490.99830.250.75炔螨特0.1-200y=37992x+1.1E+50.99600.61.8螺螨酯0.1-200y=28751x+7874.70.99800.662.0唑螨酯0.1-200y=93599x+863780.99890.3413.3.7方法回收率与精密度为了保证方法定量的准确性，采用本实验优化的试验方法，分别在空白的蜂王浆样品中进行加标浓度实验，测定10种杀螨剂在四档加标浓度（5µg/kg，10µg/kg，50µg/kg和100µg/kg下的回收率，每个浓度做7个平行。实验结果见表3-4.45 表3-4杀螨剂的回收率和精密度(n=7)5µg/kg10µg/kg50µg/kg100µg/kg杀螨剂RecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSD四螨嗪76%±1.4%1.9%73%±4.9%6.7%81%±5.5%6.8%91%±3.4%3.7%喹螨醚88%±8.7%9.9%91%±7.3%8.0%84%±7.9%9.4%93%±2.8%3.0%吡螨胺93%±5.2%5.6%82%±1.0%1.2%89%±5.6%6.3%96%±3.0%3.1%噻螨酮80%±5.7%7.1%89%±8.6%9.7%96%±9.2%9.6%90%±7.7%8.6%乙螨唑80%±6.2%7.8%87%±1.4%1.6%82%±0.8%1.0%83%±4.2%5.1%蝇毒磷73%±2.0%2.8%100%±4.5%4.5%96%±8.8%9.2%85%±0.8%0.9%哒螨灵81%±9.0%11.1%94%±7.1%7.5%83%±5.6%6.7%98%±5.9%6.0%克螨特107%±8.3%7.8%97%±2.2%2.3%85%±3.9%4.6%91%±8.5%9.3%螺螨酯85%±10.6%12.5%84%±4.9%5.8%89%±6.4%7.2%78%±0.9%1.2%唑螨酯95%±1.7%1.8%87%±5.3%6.1%94%±11.4%12.1%80%±1.8%2.3%从表3-4可知,加标浓度为5µg/kg时，其回收率范围是73%-107%，相对标准偏差RSD为1.8%-12.5%；加标浓度为10µg/kg时，其回收率范围是73%-100%，相对标准偏差RSD为1.2%-9.7%；加标浓度为50µg/kg时，其回收率范围是81%-96%，相对标准偏差RSD为1.0%-12.1%；加标浓度为100µg/kg时，其回收率范围是78%-96%，相对标准偏差RSD为0.9%-9.3%。结果表明：该实验方法的准确度与精密度满足蜂王浆中多种杀螨剂的残留测定要求。3.4实际样品检测3.4.1样品定性定量方法通过对样品峰保留时间与标准物质的保留时间相比，确定样品中杀螨剂的保留时间和岀峰位置，以及通过二级质谱的离子碎片对比综合对样品进行杀螨剂药物的定性。本实验采用基质标准曲线法对10种杀螨剂药物进行定量处理。将样品的峰面积值代入到基质标准曲线方程中，计算可得到各自的浓度。3.4.2实际样品检测将上述方法用于10个蜂王浆样品的测定，称取2.00g蜂王浆样品，经过3.2.2中前处理方法，液相色谱串联质谱进样进行分析，只有一个蜂王浆样品有药物检出，检出目标分析物是克螨特，其浓度为3.43µg/kg。图3-3分别为（a）（b）（c）分别为炔螨特的标准溶液图、检出样品图和定量离子定性离子图。图3-4至图3-1346 是（a）杀螨剂的标样色谱图;(b)加标色谱图;(c)空白样品图的色谱图。abc图3-3(a)炔螨特的标准溶液、(b)炔螨特检出样品图和(c)定量离子定性离子47 c图3-4（a）蝇毒磷浓度为50μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为25µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图48 c图3-5（a）四螨嗪浓度为50μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为25µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图49 c图3-6（a）吡螨胺浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图50 c图3-7（a）噻螨酮浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图51 c图3-8（a）炔螨特浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图52 c图3-9（a）乙螨唑浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图53 c图3-10（a）唑螨酯浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图54 c图3-11（a）螺螨酯浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图55 c图3-12（a）哒螨灵浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图56 c图3-13（a）喹螨醚浓度为10μg/L的标样色谱图;(b)加标浓度为5µg/kg的色谱图;(c)空白蜂王浆样品的色谱图3.5小结本章节实验采用液相色谱串联质谱对蜂王浆中10种杀螨剂残留进行测定，分别对前处理方法和色谱条件进行了选择和优化，10种药物在0.1-200µg/L范围内的2线性相关系数r均大于0.99，检出限范围为0.25-1.0µg/kg，定量限为0.75-3.9µg/kg。空白蜂王浆样品在加标浓度为5µg/kg时，其回收率范围是73%-107%，相对标准偏差RSD为1.8%-11.1%；加标浓度为10µg/kg时，其回收率范围是73%-100%，相对标准偏差RSD为1.2%-9.7%；加标浓度为25µg/kg时，其回收率范围是81%-96%，57 相对标准偏差RSD为1.0%-12.1%；加标浓度为50µg/kg时，其回收率范围是78%-96%，相对标准偏差RSD为0.9%-9.3%。对于已有最大残留限量标准的杀螨剂来说，检出限能满足要求。对10个蜂王浆样品进行检测，其中有一个样品检出炔螨特，其浓度为其浓度为3.43µg/kg。58 第4章结论与展望本研究以蜂蜜和蜂王浆为研究对象，10种杀螨剂为分析目标物，开发出满足日常检测需要和国外标准限量的残留检测方法。1.以蜂蜜为研究对象，10种杀螨剂为分析目标物，通过对蜂蜜样品前处理方法条件的选择优化如分散剂与萃取剂的种类和体积、超声时间以及高效液相色谱-串联质谱法的色谱柱、流动相、进样量等仪器条件的探讨，建立蜂蜜中杀螨剂多残留的痕量检测方法，在0.1-100μg/L的浓度范围内添加回收实验，考察了回收率和精密度等参数验证方法的可靠性和准确性，建立了满足日常分析要求的残留分析方法。2.以蜂王浆为研究对象，10种杀螨剂为分析目标物，通过对蜂王浆样品提取溶剂和提取方法的选择优化、净化过程中固相萃取柱的选择以及相应淋洗液、洗脱剂的选择和比例优化，以及高效液相色谱-串联质谱法的色谱柱、流动相、进样量等仪器条件的探讨，建立蜂王浆中杀螨剂多残留的痕量检测方法在0.1-200μg/L的浓度范围内添加回收实验，考察了回收率和精密度等参数验证方法的可靠性和准确性，建立了满足日常分析要求的残留分析方法。3.应用本实验建立的方法，对实际样品进行测定，有部分样品中检出杀螨剂药物残留。对方法进行回收率、精密度和适用性考察，结果均满足实验室标准要求，填补了我国蜂蜜和蜂王浆杀螨剂药物残留检测方法的空白，应对了欧盟监控和日本肯定列表的要求，满足国内外市场监测技术指标要求，对拓展国内蜂蜜和蜂王浆监督普查、抽查有一定启发意义。4.1课题主要创新点(1)国内首次开发出高效液相色谱-串联质谱法快速检测蜂蜜中的10种杀螨剂残留量方法，具有开拓性的意义。(2)建立高效液相色谱-串联质谱法检测蜂王浆中的10种杀螨剂残留量方法，具有开拓性的意义。(3)运用开发的方法对全国各地主要品牌的蜂蜜进行杀螨剂残留的检测，有部分样品中检出杀螨剂药物残留。该方法填补了杀螨剂药物在我国蜂蜜和蜂王浆中药物残留检测方法的空白。59 4.2绩效评价(1)利用液相色谱流动相的不同组成和质谱检测器的优点能够将10种杀螨剂进行分离和检测。利用流动相与组分间的亲和作用力，提高柱的选择性，改善分离度，更好地解决分离困难的问题。(2)建立蜂蜜及蜂王浆中多种杀螨剂残留检测方法，对蜂蜜和蜂王浆实际样品进行检测，在蜂蜜中发现目标物，在蜂王浆中只检出炔螨特。可见对蜂产品中杀螨剂使用的监管和残留检测仍有待加强，而杀螨剂残留，值得我们进一步研究。(3)开发的方法检测限较低，所要求仪器的灵敏度和前处理过程净化程度较高，其线性范围、检测限、回收率均符合要求。4.3需进一步完善的内容(1)鉴于本实验研究过程中，发现有目标物残留在蜂蜜和蜂王浆的现象，更进一步的加大检测品种范围，如对蜂蜡、蜂王浆冻干粉、蜂花粉等样品进行目标物的检测，进行更系统的目标物在蜂产品中的方法研究，使各个方法的适用于更低含量的目标物检出，并使方法的操作性增强。（2）对蜂王浆样品的检测应扩大数量，初步了解目前在蜂产品中存在的杀螨剂。(3)实验中发现存在蜂产品中的杀螨剂，需要对其进行风险评估，检测不同地区，不同品种的蜂产品，了解目前杀螨剂残留对人健康的危害程度，及时发现可能出现的风险。60 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致谢三年的研究生生活即将结束，三年来，在我的学业和生活上得到了很多人的帮助和支持。首先非常感谢我的导师莫卫民和吴俐勤老师，在我的硕士研究生期间去浙江省农业科学院见习的机会，并且帮助我完成毕业论文。衷心的感谢莫卫民老师三年来用他宽容大度的胸怀，给予我很多鼓励和帮助。感谢吴俐勤老师三年来在学习上和生活上的关心帮助，老师严谨求学的精神、活跃的思维方式和敬业精神都深深地感染着我，谢谢老师对我课题的指导和知识的传授。论文完成之际，谨向两位老师表达最衷心的感谢。同时，本课题完成于浙江省农业科学院质量标准研究所，在这里我得到了所里领导的关心和帮助，在此表示感谢。在我的论文完成期间，得到了实验室钱鸣蓉和章虎老师的指导帮助，谢谢你们；实验室的同事方丽珍、徐杰、同学吴慧珍和师妹周靓静的无私帮助，谢谢你们。最后，向我的父母和家人表示深深的感谢。69 攻读学位期间发表的文章[1]曾银欢，周靓静，吴慧珍，陈志民，徐杰，方丽珍，莫卫民，吴俐勤.分散液液微萃取/液相色谱串联质谱法快速测定蜂蜜中10种杀螨剂[J].分析实验室，2015，02:216-221.[2]李丽，吴俐勤，莫卫民，陈志民，王方莉，曾银欢，钱鸣蓉.液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中唑螨酯残留量[J].分析实验室，2014，33(2):244-248.70