黄绿蜜环菌化学成分及生物活性研究 89页

＠矣束Ａ審ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第—所现代大学Ｗ’ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５Ａ身＾■古？＇．＂每■ｉ＇＇；ｓ絶。ｍ除冰：‘３＾’－謹．Ｆ漏聖１雜ｆｃ．圃雜Ｔｍｌ＾ｋ－学科专业微生物与生化药学？Ｍｇ：ｍ作者姓名：马琳＾＇指导教师：：张耀洲Ｆ麵天津大学研究生院ｗ絮墓龍＊媒．２０１５年４月蠢麵．ｔ，‘，：．；身 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研巧成果，除了文中特别加标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：写為七签字日期：父峻年＾月／０日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据语进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编Ｗ供查阅和借阅。同意学校向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）导师签：论文作：名学位者签名、端辜含＾０￥２＞字：１曰日期年長月日：（日签签字期咬年月＞＞哀 黄绿蜜环菌化学成分及生物活性研究StudyonChemicalConstituentsandBioactivityofArmillarialuteo–virens学科专业：微生物与生化药学研究生姓名：马琳指导教师：张耀洲天津大学药物科学与技术学院二零一五年四月 中文摘要黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)隶属于担子菌亚门，层菌纲，口蘑目，口蘑科，蜜环菌属，又名黄蘑菇、金蘑菇。黄绿蜜环菌是一种珍稀野生食药用真菌,具有较高的营养价值。目前，对于黄绿蜜环菌子实体的物质基础研究主要集中在挥发性成分、多糖及外源性凝集素上，黄绿蜜环菌子实体中单体化合物成分的研究仍处于空白。本研究首先以黄绿蜜环菌子实体水提物为原料,采用反相/亲水、反相/正向及反向/反向的二维液相色谱体系建立了分离纯化黄绿蜜环菌子实体中单体化合物的方法。经理化性质及核磁共振等波谱学技术分析后，共鉴定出其中6个化合物，分别为为焦谷氨酸（1）、尿苷（2）、2′-脱氧尿苷（3）、鸟苷（4）、肌苷（5）、腺苷（6）。本研究再将黄绿蜜环菌子实体水提取后的药渣沉淀经丙酮冷浸，得到黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物，采用正相/亲水的二维液相色谱体系进行分离纯化，经理化性质及核磁共振等波谱学技术分析后，共鉴定出3个具有体外抑制肝癌细胞增殖活性的甾醇类化合物，分别为麦角甾醇（7）、3β-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one（8）、(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-one（9）。化合物1~9均首次从黄绿蜜环菌中分离得到。此外，本研究利用抗氧化活性筛选及实时无标记动态细胞分析技术对黄绿蜜环菌子实体水提取物和丙酮提取物进行生物活性检测，通过数据表明：黄绿蜜环菌子实体水提取物Fr.1~Fr.14和丙酮提取物Fr.7~Fr.11，Fr.13~Fr.14均具有显著抗氧化功能，丙酮提取物Fr.7-4，Fr.8-1，Fr.8-4对于肝癌细胞的生长有较好的抑制作用。该研究为黄绿蜜环菌子实体的药理作用研究及资源的进一步开发利用奠定了基础。关键词:黄绿蜜环菌；二维液相色谱；实时细胞活性检测；抗氧化 ABSTRACTArmillarialuteo-virens,belongingtoTricholomataceae,Armillaria,wasalsoknownasyellowmushroom,goldenmushroom.Armillarialuteo-virensisakindofvaluablewildediblefunguswhichisrichofnutritiouscomponentsandhighmedicalvalue.Atpresent,thematerialbasedresearchofArmillarialuteo-virensmainlyconcentratedonvolatilecomposition,polysaccharideandexogenouslectins.HoweverthemonomercompoundofthefruitingbodyofArmillarialuteo-virenswasstillinblank.Inthisstudy,wefirstlydevelopedatwo-dimensional(2-D)preparativeliquidchromatographymethodtopurifyconstituentsfromthewaterextractofArmillarialuteo-virens.UsingseparationmodesuchasRPLC/HILIC,RPLC/NPLCandRPLC/RPLC,sixcompoundswereisolated.Thestructuresofconstituentswereidentifiedaspyroglutamicacid(1),uridine(2),2"-deoxyuridine(3),guanosine(4),inosine(5),adenosine(6)onthebasisofphysicochemicalandspectroscopicanalyses.Secondly,weputtheprecipitationofwaterextractionsoakedwithacetone,thenwegottheacetoneextratofArmillarialuteo-virens.WithseparationmodeNPLC/HILIC,threesterolcompoundswhichhadinhibitingactivityonproliferationofHepG2livercellwereisolatedandpurified.Theirstructureswereidentifiedasergoterol(7)、3β-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(8)、(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-one(9)onthebasisofphysicochemicalandspectroscopicanalyses.AllthecompoundswerepurifiedfromfruitbodiesofArmillarialuteo-virensforthefirsttime.Inaddition,antioxidantactivityscreeningtechniqueandReal-timedynamiccellularanalysis(RTCA)wereusedfordetectingthebioactivityofwaterextractandacetoneextractfromArmillarialuteo-virens.TheresultshowedthatSTW_Fr.1~Fr.14andBT_Fr.7~Fr.11,BT_Fr.13andBT_Fr.14hadsignificantantioxidantactivity,BT_Fr.7-4,BT_Fr.8-1andBT_Fr.8-4havesignificantinhibitionfortheproliferationofHepG2cell.ThisstudycanprovidescientificreferenceforpharmacologicalresearchandfurtherutilizationofwildArmillarialuteo-virensresources.KeyWords:Armillarialuteo-virens;2-D-prepHPLC;RTCA;oxidationresistance 目录中文摘要...................................................................................................................................1ABSTRACT.............................................................................................................................2第一章文献综述...................................................................................................................1引言...................................................................................................................................11.1黄绿蜜环菌概述......................................................................................................11.1.1来源...............................................................................................................11.1.2形态特征.......................................................................................................11.1.3生境分布.......................................................................................................21.2黄绿蜜环菌的化学成分研究..................................................................................21.3黄绿蜜环菌的药理作用研究..................................................................................31.4黄绿蜜环菌的营养保健作用..................................................................................41.5黄绿蜜环菌菌丝体人工培养..................................................................................41.6黄绿蜜环菌的分子生物学研究..............................................................................41.7黄绿蜜环菌药物制剂及保健品研究......................................................................51.8二维分离纯化技术研究进展..................................................................................51.8.1二维液相色谱的原理...................................................................................51.8.2二维液相色谱的分离模式...........................................................................61.9课题研究的目的和意义..........................................................................................7第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究...................................................................92.1实验材料和仪器......................................................................................................92.1.1仪器...............................................................................................................92.1.2试剂与材料...................................................................................................92.2实验方法................................................................................................................102.2.1样品提取.....................................................................................................102.2.2样品溶液的制备.........................................................................................102.2.3一维分离纯化.............................................................................................102.2.5二维分离纯化.............................................................................................102.3结果与讨论............................................................................................................112.3.1样品提取.......................................................................................................112.3.2一维分离纯化.............................................................................................112.3.3二维分离纯化.............................................................................................122.3.4化合物结构鉴定.........................................................................................372.4结论........................................................................................................................38 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究.................................................................40引言.................................................................................................................................403.1实验材料和仪器....................................................................................................413.1.1仪器.............................................................................................................413.1.2试剂与材料.................................................................................................413.2实验方法................................................................................................................413.2.1抗氧化活性筛选.........................................................................................413.2.2抗肿瘤活性筛选.........................................................................................423.3结果与讨论..............................................................................................................433.3.1抗氧化活性筛选结果.................................................................................433.3.2抗肿瘤活性筛选结果.................................................................................45第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究.............................................................484.1黄绿蜜环菌丙酮提取物挥发油的GC-MS分析.................................................484.1.1实验材料和仪器.........................................................................................484.1.2实验方法.....................................................................................................484.1.2.1黄绿蜜环菌丙酮提取物挥发油样品的制备..................................484.1.2.2GC-MS测定条件............................................................................484.1.2.3数据处理........................................................................................494.1.3结果与讨论.................................................................................................494.2黄绿蜜环菌丙酮提取物化学成分的分离纯化....................................................524.2.1仪器.............................................................................................................524.2.2试剂与材料.................................................................................................534.2.3实验方法.....................................................................................................534.2.3.1样品提取..........................................................................................534.2.3.2一维分离纯化..................................................................................534.2.3.3二维分离纯化..................................................................................534.3结果与讨论............................................................................................................544.3.1样品的前处理.............................................................................................544.3.2一维分离纯化.............................................................................................544.3.3二维分离纯化.............................................................................................564.3.4化合物结构鉴定.........................................................................................584.4结论................................................................................................................59第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究.............................................................61引言.................................................................................................................................61 5.1实验材料和仪器....................................................................................................615.1.1仪器.............................................................................................................615.1.2试剂与材料.................................................................................................615.2实验方法................................................................................................................625.2.1抗氧化活性筛选.........................................................................................625.2.2抗肿瘤活性筛选.........................................................................................625.3结果与讨论..............................................................................................................625.3.1抗氧化活性筛选结果.................................................................................625.3.2抗肿瘤活性筛选结果.................................................................................65第六章结论和展望...............................................................................................................70参考文献.................................................................................................................................71发表论文和科研情况说明.....................................................................................................76附录.....................................................................................................................................77致谢.....................................................................................................................................80 第一章文献综述第一章文献综述引言我国是世界上最早认识和利用食用菌的国家,许多古代著作有相关阐述，如菌类的食用烹饪技巧在《齐民要术》中有所记载；各种食用菌的烹食方法、食疗[1]配方、保健应用在《本草纲目》和《农桑经》中有详细的描述。黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)是一种珍稀野生食药用高原特有真菌，但由于高原地理区域的制约和经济条件的落后，当地的居民依旧保持原有的晒干方式对黄绿蜜环菌进行保存，加工方式极其落后，导致黄绿蜜环菌的保健功能一直未能得到充分开发与利用。已有相关研究表明黄绿蜜环菌中包含多种营养物质和活性成分，但关于其单体化合物化学成分和生物活性研究的报道少之又少，本课题利用二维分离纯化技术对黄绿蜜环菌的化学成分进行研究，并进行了抗氧化和抗肿瘤方面的生物活性实验。本研究为黄绿蜜环菌中活性物质的进一步研究及其相关食品、保健品、药品等的开发提供了理论依据。1.1黄绿蜜环菌概述1.1.1来源黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)隶属于担子菌亚门，层菌纲，口蘑目，口[2]蘑科，蜜环菌属，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄金菇等。一般生长于高海拔地区的草地上，夏秋季节生长繁茂。黄绿蜜环菌是一种珍稀的食药兼用真菌，有色泽淡黄、肉质肥厚、口感细腻、脆嫩水分少，味道鲜美等特点。每年7月~9月的中旬期间是黄绿蜜环菌的采菇期，其采菇期与发生量均受到温度与降雨量的影响。黄绿蜜环菌是在青藏高原特有的地理环境和气候条件下而生的一种优良野生食用[2-3]兼药用真菌，是青藏高原一种重要特产，在青海祁连被称为祁连“八宝”之一。1.1.2形态特征黄绿蜜环菌子实体中一般大小适中，菌盖呈展平状或呈扁半球形，直径各不相同，范围在5~15cm之间，菌盖边缘朝内侧卷曲，表皮较干燥并开裂，其纤毛状厚鳞片呈环状排列。新鲜的黄绿蜜环菌有硫磺色或棕黄色的菌盖，晒干后近白1 第一章文献综述色。菌肉肥厚，菌质的香味明显，伤后不会褪色。菌褶颜色与菌盖较为相似，菌褶稍密、总长度不等，呈弯曲生或短延生。菌柄呈白色或淡黄色，内部充实，一般为长3.5~10cm、粗1.2~2cm的柱形，基部常呈膨大状。菌柄的上部为菌环，单层，有黄色鳞片生于菌环的下部。担孢子为淀粉质，将其放于显微镜下呈无色或淡黄色，形状椭圆，表面光滑，直径在4.0~7.8μm之间。菌丝一般生长在pH为[4-5]6.8~7.2的土壤中5~30cm土层，菌丝的锁状联合现象明显。1.1.3生境分布黄绿蜜环菌主要生长在青海、陕西、河北、甘肃、四川等地区海拔3000m~4300m的高山草甸或草地上。在夏秋季节牧草生长时期，黄绿蜜环菌群周围会形成蘑菇圈，蘑菇圈呈条状、带状或不规则圆圈状分布，其蘑菇圈的直径为6m左[6-7]右，圈宽约为0.5m，蘑菇圈上生长的植物繁茂，密度大，植被呈深绿色。王文颖等研究发现，黄绿蜜环菌的生长对草地植被及土壤存在一定影响，黄绿蜜环菌蘑菇生长区域内植物的分布呈圈带状，且有绿色的“带状”出现在蘑菇圈上。其生长区域内植物的特点为：圈上植物群落的物种种类高于圈外，各类群分盖度总和明显高出圈外，且圈上禾本科植物增长特别明显。黄绿蜜环菌的菌丝可与嵩草[8](Kobresia)和高山杂类草等形成菌根。1.2黄绿蜜环菌的化学成分研究黄绿蜜环菌的化学成分十分丰富，将黄绿蜜环菌分别用水、乙醇和石油醚进行提取，经化学实验分析后，结果显示黄绿蜜环菌中有大量的蛋白质、氨基酸、糖类存在，还检测到生物碱成分和少量的有机酸、黄酮、甾体三蔽类、苷类等物[4,8]质，而酚类、挥发油，香豆素萜类成分极少。黄绿蜜环菌具有较高的营养价值，含有种类丰富的维生素，如维生素B1、维生素B2、维生素C，还检测到富含18种氨基酸，其中含量较高的为人体所必需的8种氨基酸。其中赖氨酸的含量可达157mg/100g，它是大脑神经再生的第一限制性氨基酸。精氨酸含量为120mg/100g，它具有促使生成及分泌胰岛素，增强细胞免疫功能的作用。下图为不同产地黄绿蜜环菌所含氨基酸含量的比较。2 第一章文献综述表1-1黄绿蜜环菌氨基酸含量（%）Table1-1AminoacidcontentsinArmillarialuteo–virens(%)氨基酸祁连玛沁泽库氨基酸祁连玛沁泽库赖氨酸1.37421.42571.4651丙氨酸1.38251.37841.4635组氨酸0.23440.67450.7483胱氨酸0.31521.29431.3512苏氨酸0.71830.94821.2385缬氨酸0.93581.08351.1481精氨酸0.64481.35791.6427蛋氨酸0.24152.43972.5657天门冬氨酸2.01842.18542.3858异亮氨酸0.54630.78630.8428丝氨酸1.08891.33531.3353亮氨酸1.28941.5374.1.6841谷氨酸3.28425.69215.6921酪氨酸0.58510.64250.7939脯氨酸0.83820.84270.8427苯丙氨酸0.88360.91831.2528甘氨酸0.81851.37521.3752色氨酸0.73650.83840.8081[10]周劲松等利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对黄绿蜜环菌子实体挥发油的化学成分进行了分析，其成分相对简单，主要是长链不饱和脂肪酸和部分麦[11]角甾醇类化合物,在不饱和脂肪酸中，油酸和亚油酸的含量较高。黄绿蜜环菌还含有多糖成分，提取后经鉴定，主要为阿拉伯吡喃糖和木吡喃[12]糖，该多糖为无味的白色粉末，在冷水溶解性差，易溶于热水。另有实验表明在黄绿蜜环菌中还含有丰富的矿质元素，有K、P、S、Fe、Zn、Cu等17种矿质元素，其中在常量元素中K、P、S的含量较高，而微量元[13]素中Fe、Zn和Cu的含量丰富。[14]焦迎春等对黄绿蜜环菌菌丝粉中的多肽成分进行了研究，分别采用4种体积分数的乙醇对黄绿蜜环菌进行提取，再通过凝胶二次层析进行分离，将提取液进行比较，结果显示为数量较多的小肽均匀分布在体积分数为70%的乙醇提取液中，说明用70%体积的乙醇对黄绿蜜环菌进行提取有较好的效果。1.3黄绿蜜环菌的药理作用研究[15]李世峰等对黄绿蜜环菌的生物活性进行了研究。研究表明，其醇溶相和+-水溶性的粗多糖有抗氧化作用，可较好地清除自由基DPPH·、ABTS·、O2·、·OH；在针对人卵巢癌细胞系HO-8910和人肝癌细胞系7721的抗肿瘤实验中，发现黄绿蜜环菌的乙酸乙酯相和石油醚相有较好的细胞毒作用。另有研究表明，黄绿蜜3 第一章文献综述环菌还能够预防流感、治疗脚气病、治疗神经炎症，对儿童的生长发育有促进作[16-17]用。1.4黄绿蜜环菌的营养保健作用黄绿蜜环菌是可食用真菌，营养成分丰富，包括蛋白质、氨基酸和多种维生素，且多生长于高海拔地区，开发过程中可以相对减少污染。黄绿蜜环菌中含有[18]微量元素硒，硒可以减轻或解除对重金属中的毒副作用，硒能够参与到人体的氧化还原反应中，作为一种谷胱甘肽过氧化物酶的激活剂来控制反应的速度。黄绿蜜环菌中硒含量较高，作为一种安全可靠的保健食品，能够很好地补充人体[19-20]对于硒的需求，具有很好的药用潜力。现今生活水平的日益改善，黄绿蜜环菌作为一种待开发的保健品必将越来越受到人们的重视。1.5黄绿蜜环菌菌丝体人工培养[4]刁治民等针对黄绿蜜环菌菌丝的生理特性和生长所需的营养成分进行了研究，发现碳素物质是黄绿蜜环菌生长的主要营养来源，在培养菌丝时，菌丝对淀粉、单糖、蔗糖、葡萄糖的利用广泛，现对于无机氮源，更优于利用有机氮源，经比较得出，对于牛肉膏、蛋白胨等复合氮源，尿素等单一氮素的利用度稍差；在无机氮源利用度的对比中可知，硝态氮基本上不予利用，利用度很差，相对硝[21]态氮，铵态氮的利用度偏好。[22]王文颖、王启兰等也做过类似实验，在培养基中缺少碳素营养和氮素营养的情况下，黄绿蜜环菌菌丝无法正常生长，而向培养基中添加硫酸镁、硫酸铜、维生素等微量元素，对黄绿蜜环菌菌丝的生长有促进作用。[3]周劲松等研究了两种生长调节剂三十烷醇和肌醇对黄绿蜜环菌菌丝生长的作用与影响。将两种生长调节剂分别应用于菌丝的培养，可知两种生长调节剂[23]都有比较明显的作用，三十烷醇对菌丝生长的促进作用强于肌醇。柳焕章等对菌丝生长过程中的生长温度、PH值等因素做出了探究实验。采用斜面培养黄绿蜜环菌菌丝，分析得出，在温度为10℃~35℃、pH值为4.0~10.0时，菌丝可以正常生长，其中25℃~30℃、PH值为6.0~7.0为黄绿蜜环菌菌丝生长的最适宜温度和PH值。1.6黄绿蜜环菌的分子生物学研究[24]李海波等利用分子手段对黄绿蜜环菌子实体分离组织菌株进行了科学的分类，将rDNA.rrS和rDNA-IGS-l测序技术应用于黄绿蜜环菌的纯培养菌种的4 第一章文献综述分子鉴定中，在核酸序列数据库GenBank同源性检索中与黄绿蜜环菌的5.85/ITS和IGS-1序列进行比较后从而建立起系统发育树。获得的菌种子实体组织分离菌株经数据分析后证明是其纯培养的黄绿蜜环菌菌种。1.7黄绿蜜环菌药物制剂及保健品研究黄绿蜜环菌在保健品应用和药物制剂开发等方面有很大的潜力，可增加相关研究的投入。同时，可以从不同的方面利用黄绿蜜环菌菌丝体及它的代谢产物，如下所述：（1）因为黄绿蜜环菌菌丝体富含营养物质，可以将其配成营养液；（2）黄绿蜜环菌还富含鲜味氨基酸，因此可将其制成鲜味添加剂；（3）黄绿蜜环菌被发现还具有抗肿瘤以及提高免疫力的作用，可以将其制成保健片剂、胶囊及抗肿瘤药物；（4）黄绿蜜环菌还有丰富的胞外代谢产物如类脂化合物、纤维[25]素酶及色素，因此具有应用于工业、农业、食品加工业等方面的巨大空间。随着生活水平的改善，人们也开始越来越注重合理搭配饮食，由于黄绿蜜环菌具有生长区域污染少，营养成分含量高的特点，因此将黄绿蜜环菌研制成新型绿色无污染的保健药品具有广阔的前景，能够将其附加值充分释放出来。1.8二维分离纯化技术研究进展随着研究中对分离纯化精度要求的提高，传统高效液相色谱柱已经无法满足现代研究中对分析和分离纯化的需求，而二维分离纯化技术能够满足峰容量（Peakcapacity）和分辨率的高要求，因此近年来二维分离纯化技术得到了迅速[26]的发展与广泛的应用。1.8.1二维液相色谱的原理二维液相色谱（2DLC）分离技术是将待分离样品，相继通过两个色谱分离[27]机制不同的色谱柱，从而实现更好的分离纯化。二维色谱较之一维色谱具有更广阔的分离空间，也具有更大的峰容量，因为样品若在两个色谱填料中的保留机制相关性越差，则这两种填料分离机制的互补性就越好。要选择合适的二维分离纯化体系，关键是要选择独立无关联的分离机制，即选择两个“正交的”二维体系。在完全正交的二维色谱系统中，系统的峰容量Nc是两个一维独立分离模式中峰容量的乘积，即用式子表示为：12Nc=nc×nc式(1)12式(1)中，nc代表样品组分在第一根色谱柱分离中色谱峰的个数；nc代表样品组分在第二根色谱柱分离中色谱峰的个数。Nc指的是二维分离中所检测到的5 第一章文献综述色谱峰个数的总和。只有在理想情况下式(1)适用，即完全正交，此时二维分离体系具备的峰容量是最大的，但现实中很难达到这样的要求。二维液相色谱系统的分离原理如图1-1所描述，样品组分经过第一维的分离得到了两个色谱峰组分，如果将这个两个色谱峰组分分别进入第二维系统分离后又会分别出现两个色谱峰，该研究结果形象性的描述了在第一维没有得到充分分离的样品在第二维中得到了进一步分离，如果第二维的色谱峰组分还不是纯化合[28]物，则需要进行第三维、第四维等多维分离纯化。图1-1二维分离原理示意图Fig.1-1Schematicplotoftwo-dimensionalseparation1.8.2二维液相色谱的分离模式二维液相色谱分离模式的选择主要是对不同机制的选择，常用的液相色谱分离模式有：正相色谱（NP）、反相色谱（RP）、亲水色谱（Hillic）、离子交换色谱（IEC）、体积排阻色谱（SEC）、亲合色谱（AC）以及手性色谱（Chiral）。分离模式通过两两组合的方式可组成不同的二维分离体系，如正相色谱×反相色谱[29,30][31,32]（NP×RP）、离子交换色谱×反相色谱（IEC×RP）、亲水色谱×反相色[33][34]谱（Hillic×RP）、亲合色谱×反相色谱（AC×RP）、体积排阻色谱×反相色[35,36][37]谱（SEC×RP）、手性色谱×反相色谱（RP×Chiral）。近年来，也有使用[38]相同分离模式组合的二维体系，如反相色谱×反相色谱（RP×RP）、手性色谱[39][40]×手性色谱（Chiral×Chiral）和体积排阻色谱×体积排阻色谱（SEC×SEC）6 第一章文献综述等这些组合方式。特别是亲水色谱×亲水色谱二维色谱（Hillic×Hillic）的快速发[41]展，为解决强极性复杂样品的分离纯化提供可能。1.9课题研究的技术路线和意义黄绿蜜环菌是一种食味和营养俱佳的珍稀真菌，有“宫廷珍品”、“高原黄菇”、“皇室蘑菇”等美称，其中含有非常丰富的氨基酸、维生素B1、维生素C和微量元素等，尤其其中的癌症克星—“硒”的含量异常的高。目前每公斤黄绿蜜环菌干品的市场价已上升到200多元，与能够媲美羊肚菌、松茸。随着人们对健康问题的重视，天然药食资源黄绿蜜环菌因其具有独特的营养价值和保健功能，已越来越具有广阔的开发前景。目前有限的定性研究表明，黄绿蜜环菌中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、生物碱和少量有机酸、黄酮、强心苷、甾体三萜类、苷类、皂苷，挥发油、7 第一章文献综述[8]香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，黄绿蜜环菌具有抗流感、防治神经炎、促[15-17]进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等生物活性，迄今为止，有关黄绿蜜环菌化学[42][17]成分研究主要集中在多糖及外源性凝集素等生物大分子上，还未有关于黄绿蜜环菌子实体的天然小分子化学成分被报道过。所以，对于黄绿蜜环菌生物化学成分与药理活性的关系的研究有待于进一步扩展。本课题将黄绿蜜环菌子实体超低温粉碎后分别用纯水和丙酮进行提取，得到水提取物和丙酮提取物，再通过二维液相色谱法进行分离纯化，得到9种单体化合物。运用正交性较好的不同填料的色谱柱进行二维液相色谱法纯化可大大缩短组分的分离时间，为纯化出更多单体化合物提供可能；同时对不同溶剂的提取物的抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了初步研究，实验的结果表明，黄绿蜜环菌水提取物和丙酮提取物均有很好的抗氧化活性，而丙酮提取物则对肝癌细胞和肺癌细胞的生长有一定的抑制作用。本实验将填充关于黄绿蜜环菌单体化合物研究的空白，可为野生黄绿蜜环菌资源的化学组成、药理作用及其相关食品、保健品、药品等的进一步开发利用提供理论基础。8 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究2.1实验材料和仪器2.1.1仪器AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；8K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；SQW-601三清超微粉碎机（山东三清不锈钢设备有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生物技术有限公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TS-SN-多功能提取浓缩机组（上海顺仪科技有限公司）；SHZ-D（3）型循环式真空泵（上海亚荣生物技术有限公司）；GTR25-1高速冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）；BrukerDPX-400核磁共振仪；制备型仪器：DVT-DAC50(D-PLC601100)制备纯化系统（江苏迪沃特仪器设备科技公司），包括D-P6010高压恒流泵、D-UV6000紫外-可见检测器、DC6000色谱数据系统软件、50mm动态轴向压缩；FLEXATM模块化制备色谱（天津博纳艾杰尔科技有限公司），包括HP-Q-P050二元泵、FL-UV2040紫外可变波长中压检测器，FL-C100B馏分收集器；Milli-Q净水仪（美国密理博公司）。2.1.2试剂与材料黄绿蜜环菌于2013年6月购自青海省祁连县，由中科院西北高原生物研究所王启兰研究员鉴定为Armillarialuteo–virens的子实体。提取分离纯化用用乙醇为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯（天津康科德试剂有限公司）。实验用水为蒸馏水经Millipore纯水器过滤而得；色谱柱为反向C18制备柱（10μm，50mm×250mm，日本大曹株式会社）；InnovalC18制备柱（20mm×250mm，10μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；YMCPackODS制备柱（10μm，20mm×250mm，YMC株式会社）；XIon制备柱（20mm×250mm，10μm，华谱新创科技有限公司）；亲水色谱柱XAmide（5μm，20mm×250mm，华谱新创科技有限公司）；ClickXIon色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，华谱新创科技有限公司）；XAmide色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，华谱新创科技有限公司）。9 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究2.2实验方法2.2.1样品提取称取20.0Kg黄绿蜜环菌子实体粉末，依次按照料液比（提取溶剂水）1:8，-11:6，1:6提取三次，6000r·min离心收集上清液，得400L上清液。将上清液水-1煮浓缩至4L，加16L无水乙醇醇沉处理，6000r·min离心30min后收集上清液于70℃减压浓缩并烘干，得水提物10.70Kg，则提取率约为11.2Kg/20.0Kg=56.0%。2.2.2样品溶液的制备将78.8g样品加入260mL25%MeOH-Water的溶液中进行超声，样品可基本溶解，再加入300mL无水乙醇醇沉，16000rpm、20℃离心20min进行固液分离。将350.0g样品加入25%870mLMeOH-Water的溶液中进行超声，样品可完全溶解，再加入3500mL无水乙醇醇沉，16000rpm、20℃离心20min进行固液分离。因此最终确定为将350.0g样品浸膏加入到250mLMeOH与750mLWater溶液中进行超声溶解，然后加入4L无水乙醇（EtOH）醇沉3h，经6000rpm、20℃离心30min后进行固液分离，收集上清液。上清液经0.45μm微孔滤膜过滤处理后，即得到黄绿蜜环菌水提取物前处理样品溶液。2.2.3一维分离纯化黄绿蜜环菌水提取物前处理样品的一维制备在反向DevoteC18制备色谱柱上进行，通过考察各因素对分离效果的影响，确定了以下分离工艺：检测波长：-1254nm，每次进样体积为4mL，流速：80mL·min。采用流动相：A（0.2%AA-Water），B（MeOH），AA：乙酸。流动相洗脱条件如下：0~10min，5%B~5%B；10~20min，5%B~22%B；20~25min，22%B~95%B；25~25min，95%B~95%B。2.2.4二维分离纯化通过反向色谱模式对黄绿蜜环菌子实体水提取物进行一维制备后得到粗分离组分Fr.1~Fr.14，再利用RP/HILIC，RP/RP或RP/Silica的分离纯化模式分别对黄绿蜜环菌水提取物Fr.1~Fr.14进行二维制备，不同的馏分二维制备过程中选10 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究择的色谱柱、流动相以及梯度条件都不相同。通过二维制备即可得到单体化合物或相对简单的化合物组分。2.3结果与讨论2.3.1样品提取黄绿蜜环菌子实体水提取物样品的提取过程简述如下：黄绿蜜环菌子实体（干燥子实体）→超低温冷冻粉碎（颗粒尺寸小于1000目的粉末）→纯水提取（上清和沉淀）→离心（收集上清）→80%乙醇醇沉处理取→离心（收集上清）→水提取上清→减压干燥→黄绿蜜环菌子实体水提取物。2.3.2一维分离纯化柱材料：反向C18；柱子尺寸：50mm×260mm；流动相：A（0.2%AA-Water），B（MeOH）、AA：乙酸。流动相体系：0~10min，5%B~5%B；10~20min，5%B~22%B；20~25min，22%B~95%B；25~25min，95%B~95%B；检测波长：-1254nm。进样量：4mL；流速：80mL·min。共计制备500针，结束水提醇沉上清反相样品的一维纯化。色谱图如图所示。12345678910111213143000250020001500mV1000500005101520253035RetentionTime(minutes)图2-1水提取物一维制备色谱图Fig.2-1Chromatogramoffirstdimensionalpreparationofwaterextract水提取物一维制备的重复性考察：11 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究360th250th150th100thIntensity50ty1st05101520253035RetentionTime(minutes)图2-2一维制备重复性考察色谱图Fig.2-2Chromatogramofrepeatabilityoffirstdimensionalpreparation从图2-2中可以看出，反向C18制备柱对黄绿蜜环菌水提取物的一维制备比较成功，共制备500针，各制备色谱图间仅有微小差别，总体对于目标组分的制备还是呈现良好的重复性。通过反向色谱柱的制备，一维分离纯化后水提取物可分为14个组分，分别为STW_Fr.1~Fr.14。对收集的Fr.1~Fr.14减压干燥后的各个组分的重量依次为：Fr.1，28.2g；Fr.2，43.4g；Fr.3，51.0g；Fr.4，40.2g；Fr.5，190.5g；Fr.6，200.0g；Fr.7，117.4g；Fr.8，292.6g；Fr.9，275.2g；Fr.10，138.8g；Fr.11，310.0g；Fr.12，163.5g；Fr.13，526.7g；Fr.14，226.0g。2.3.3二维分离纯化黄绿蜜环菌子实体水提取物进行一维制备后得到粗组分Fr.1~Fr.14，再利用RP/HILIC，RP/RP或RP/Silica的分离纯化模式分别对黄绿蜜环菌水提取物Fr.1~Fr.14进行二维制备，具体过程如下：Fr.1在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行二维制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：20.7mg/mL水溶液；检测波长：260nm；制备条件如下：进样量：2.5mL。0~15min，100%B~100%B；15~65min，100%B~5%B；65~75min，5%B~5%B；A：0.2%FA-Water，B：ACN。制备色谱图如图2-3所示。Fr.1中物质较复杂且分布集中，无法在色谱柱XAmide上得到很好的分离。12 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究0.100.080.060.04AU0.020.00-0.02-0.04010203040506070RetentionTime(minutes)图2-3Fr1二维制备色谱图Fig.2-3SecondpreparativechromatogramofFr1Fr.2在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行二维制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：10.0mg/mL乙腈-水（50%ACN与50%Water）溶液；检测波长：260nm；制备条件如下：0-5min，95%B~95%B；5~35min，95%B~40%B；35~36min，40%B~5%B；36~41min，5%B~5%B；A：0.1%FA-Water，B：0.1%FA-ACN。进样量：90.0mg。制备色谱图如图2-4所示，分离度良好，得到化合物Fr.2-1。Fr2-1290.0mg1AU03290.0mgAU10275.0mg1AU0260.0mg1AU01.51.00.0430.0mg0.02AU0.50.00101520253035400.00510152025303540RetentionTime(minutes)图2-4Fr.2二维制备色谱图Fig.2-4SecondpreparativechromatogramofFr.2化合物Fr.2-1纯度分析条件：XIon色谱柱；20%（0.2%FA-Water）：80（0.2%FA13 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究-ACN）100140L50mV0100806040L40mV200-20403020L20mV100048121620RetentionTime(minutes)图2-5Fr2-1纯度分析Fig.2-5PurityanalysisofFr.2-1Fr.2-1纯度分析结果表明其纯度为99.8%。Fr.3在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行二维分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：10mg/mL乙腈水（50%乙腈-水溶液）溶液；检测波长：260nm；制备条件如下：0-10min，100%B~100%B；10~60min，100%B~55%B；60~65min，55%B~5%B；65~70min，5%B~5%B。进样量114.0mg。色谱图如图2-6所示，Fr.3-1分离度良好。Fr3-12114.0mg1AU02114.0mgAU1032114.0mgAU10257.0mgAU101.51.037.0mgAU0.50.01.00.523.0mgAU0.00510152025303540RetentionTime(minutes)图2-6Fr3二维制备色谱图Fig.2-6SecondpreparativechromatogramofFr.3Fr.3-1纯度分析条件：XIon色谱柱；20%（0.2%FA-Water）：80%（0.2%FA-ACN）14 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究12001000800600mV4002000048121620RetentionTime(minutes)图2-7Fr2-1纯度分析Fig.2-7PurityanalysisofFr.3-1纯度分析表明Fr3-1纯度为98.6%。Fr.4在色谱柱：XAmide（亲水色谱柱），色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：25.0mg/mL(50%乙腈水溶液)；检测波长：260nm；制备条件如下：0-10min，100%B~100%B；10~70min，100%B~20%B；70~71min，20%B~5%B；71~81min，5%B~5%B；A：0.1%FA-Water，B：0.1%FA-ACN。进样量：30.0mg。色谱图如图2-8所示，得到Fr.4-1~Fr.4-3，Fr.4-1分离度良好。0.630.0mgFr4-10.4Fr4-3AU0.2Fr4-20.00.630.0mg0.4AU0.20.00.625.0mg0.4AU0.20.00.50.420.0mg0.30.2AU0.10.0-0.10.100.03Fr4-30.025.0mgAUFr4-20.010.000.05-0.01RetentionTime(minutes)-0.02AU50515253545556575859600.00-0.05051015202530354045505560RetentionTime(minutes)图2-8Fr.4二维制备色谱图Fig.2-8SecondpreparativechromatogramofFr.4Fr.4-1与Fr.4-2经XIon色谱柱分析后纯度在90%以上。Fr.4-1纯度分析条件：XIon色谱柱；50%（0.2%FA-Water）：50%（0.2%FA-15 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究ACN）。1008060mV402000246810121416RetentionTime(minutes)图2-9Fr4-3纯度分析Fig.2-9PurityanalysisofFr4-3Fr.4-3纯度分析如图2-9所示，结果表明Fr.4-3纯度为97.7%。Fr.5在色谱柱：XAmide（亲水色谱柱）进行二维分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：49.0mg/mL（50%乙腈-水溶液），检测波长：260nm；制备条件如下：0-5min，100%B~100%B；5~20min，100%B~72%B；20~25min，72%B~5%B；25~35min，5%B~5%B；A：0.1%FA-Water，B：0.1%FA-ACN。进样量：171.5mg。制备色谱图如图2-10所示。6Fr5-3171.5mg4Fr5-1AU2Fr5-2Fr5-40Fr5-362.0Fr5-1171.5mg1.5Fr5-2AU4AU1.0Fr5-40.50.0AU203122.5mg2AU102.01.598.0mg1.0AU0.50.0-0.505101520253035RetentionTime(minutes)图2-10Fr.5二维制备色谱图；Fig.2-10SecondpreparativechromatogramofFr.5Fr.5-1纯度分析条件：XIon色谱柱；A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。0-10min，95%B~95%B；10-30min，95%B~5%B；30-40min，5%B~5%B。16 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究200150100mV500-50048121620RetentionTime(minutes)图2-11Fr5-1纯度分析Fig.2-11PurityanalysisofFr.5-1Fr.5-1纯度分析结果表明，Fr.5-1纯度为98.6%。Fr.5-2纯度分析条件：XIon色谱柱；A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。0-10min，95%B~95%B；10-30min，95%B~5%B；30-40min，5%B~5%B。806040mV200-200510152025303540RetentionTime(minutes)图2-12Fr5-2纯度分析Fig.2-12PurityanalysisofFr.5-2Fr.5-2纯度分析如图2-12，结果表明Fr.5-2纯度仅为75.1%。Fr.5-3纯度分析条件：XIon色谱柱；A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。0-10min，95%B~95%B；10-30min，95%B~5%B；30-40min，5%B~5%B。17 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究600500400300mV20010000510152025303540RetentionTime(minutes)图2-13Fr5-3纯度分析Fig.2-13PurityanalysisofFr.5-3Fr.5-3纯度分析如图2-13，结果表明化合物Fr.5-3不纯。Fr.6在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）进行二维制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：49.6mg/mL(50%乙腈-水溶液)；检测波长：260nm；制备条件如下：0-5min，100%B~100%B；5~35min，100%B~88%B；35~43min，88%B~20%B；43~53min，20%B~12%B；53~55min，12%B~5%B；55~60min，5%B~5%B；A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。进样量：99.2mg。制备色谱图如图2-14所示，共分离得到五个组分Fr.6-1~Fr.6-5。3Fr6-3Fr6-4Fr6-12Fr6-2AU199.2mgFr6-5032AU199.2mg03274.4mgAU103249.6mgAU10051015202530354045505560RetentionTime(minutes)图2-14Fr6二维制备色谱图Fig.2-14SecondpreparativechromatogramofFr.618 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.6-1纯度分析条件：XIon色谱柱；8%（0.2%FA-Water）：92%（0.2%FA-ACN）80060040020%(0.2%FA-Water):80%(0.2%FA-ACN)mV200080060015%(0.2%FA-Water):85%(0.2%FA-ACN)400mV20006004008%(0.2%FA-Water):92%(0.2%FA-ACN)mV20000246810121416RetentionTime(minutes)图2-15Fr.6-1纯度分析Fig.2-15PurityanalysisofFr.6-1Fr.6-1纯度分析如图2-15，结果表明，Fr.6-1纯度为87.0%。Fr.6-2纯度分析条件：XIon色谱柱；8%（0.2%FA-Water）：92%（0.2%FA-ACN）。806040mV2000510152025RetentionTime(minutes)图2-16Fr.6-2纯度分析Fig.2-16PurityanalysisofFr.6-219 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.6-2纯度分析如图2-16，结果表明Fr.6-2纯度为94.2%。Fr.6-3纯度分析条件：XIon色谱柱；60%（0.2%FA-Water）：40%（0.2%FA-ACN）。60504030mV201000246810RetentionTime(minutes)图2-17Fr.6-3纯度分析Fig.2-17PurityanalysisofFr.6-3Fr.6-3纯度分析如图2-17，结果表明Fr.6-3不纯，成分较复杂。Fr.6-4纯度分析条件：XIon色谱柱；10%（0.2%FA-Water）：90%（0.2%FA-ACN）。350300250200mV150100500-50051015202530RetentionTime(minutes)图2-18Fr6-4纯度分析Fig.2-18PurityanalysisofFr.6-420 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.6-4纯度分析如图2-18，结果表明Fr.6-4纯度为99.6%。Fr.6-5纯度分析条件：XIon色谱柱；90%（0.2%FA-Water）：10%（0.2%FA-ACN）。250200150mV100500048121620RetentionTime(minutes)图2-19Fr6-5纯度分析Fig.2-19PurityanalysisofFr.6-5Fr.7在色谱柱InnovalC18上进行第二维分离纯化；色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：2175.2mg，157mL，5%乙腈-水溶剂体系溶解。检测波长：260nm；进样量：10mL。流动相洗脱梯度为：0-30min，1%B~1%B；30~31min，1%B~90%B；31~45min，90%B~90%B；A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。流速：30mL/min。进样量：138.5mg。制备色谱图如图2-20所示。0.8Fr7-30.6Fr7-4138.5mgFr7-10.4AUFr7-20.20.01.00.80.6138.5mg0.4AU0.20.0-0.20.80.6138.5mgAU0.40.20.0051015202530RetentionTime(minutes)图2-20Fr.7二维制备色谱图Fig.2-20SecondpreparativechromatogramofFr.721 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.7按照有图注馏分收集进行制备。同时对比图2-20中三次不同流速的制备情况：可以得出结论：制备过程中流速是可以调节的，对于小尺寸的色谱柱，最佳流速可以用线性放大进行计算，但是直径在50mm以上的色谱柱制备过程中最佳流速需要综合考虑成本、工作量以及分离度三个要素，在该组分的制备过程中通过降低流速、减小洗脱强度实现了该三个要素的合理平衡。Fr.7-1在色谱柱YMCODS上进行再一次分离纯化，色谱柱尺寸：250mm×20mm。检测波长：260nm，流速：8mL/min。流动相洗脱条件：0-17min，5%B~5%B。A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。进样量：2.0mL。制备色谱图如图2-21所示。1.5Fr7-1-1Fr7-1-21.0AU0.52mL0.01.51.0AU0.52mL0.00.80.60.4AU1mL0.20.00.20.2mL0.1AU0.00246810121416RetentionTime(minutes)图2-21Fr7-1制备色谱图Fig.2-21PreparativechromatogramofFr.7-1Fr.7-2在XAmide（亲水色谱柱）进行再一次分离纯化，色谱柱尺寸：250mm×10mm；样品溶液配制：16mL，（90%乙腈-水溶液）；检测波长：260nm；制备条件如下：流动相洗脱梯度A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。0~18min，50%B~50%B；进样量：1.0mL。色谱图如图2-22所示，得到组分Fr.7-2-1，分离度良好。22 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究1.01.0Fr7-2-10.80.80.60.6AU1.0mL0.40.40.2AU0.00.2020406080100120140160RetentionTime(minutes)0.0-0.21.00.80.61.0mL0.4AU0.20.0-0.20.60.4AU0.5mL0.20.00246810121416RetentionTime(minutes)图2-22Fr.7-2制备色谱图Fig.2-22PreparativechromatogramofFr.7-2Fr.7-3在XAmide（亲水色谱柱）进行再一次分离纯化，色谱柱尺寸：250mm×10mm；样品溶液配制：30.0mL，（90%乙腈-水溶液）；检测波长：260nm；制备流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0~15min，90%B~90%B；色谱图如下：Fr7-3-10.50.42.0mL0.30.2Fr7-3-2AU0.10.0-0.10.50.40.32.0mL0.2AU0.10.0-0.10.2mL0.61.0mL0.40.2mLAU0.202468101214161820RetentionTime(minutes)0.003691215RetentionTime(minutes)图2-23Fr7-3制备色谱图；Fig2-23PreparativechromatogramofFr7-3Fr.7-4在XAmide（亲水色谱柱）上进行再一次的制备，色谱柱尺寸：250mm×10mm；样品溶液配制：90%ACN-Water；检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0-25min，95%B~95%B；进样量：1.1mL。色谱图如下：23 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr7-4-10.080.08Fr7-4-20.060.040.06AU0.020.000306090120150180210RetentionTime(minutes)0.04AU1.1mL0.020.000.080.060.04AU1.0mL0.020.0002468101214161820RetentionTime(minutes)图2-24Fr.7-4制备色谱图Fig.2-24PreparativechromatogramofFr.7-4Fr.8在色谱柱InnovalC18上进行第二维分离纯化；色谱柱柱尺寸：250mm×50mm；样品溶液配制：将1gFr.8冷冻干燥粉末与50mLMeOH与150mLH2O溶液混合、超声溶解，明显有不溶样品，通过16000rpm，20℃离心40min，分离上清与沉淀，上清液通过0.45μm有机滤膜过滤后作为制备样品溶液，沉淀尝试用DMSO与MeOH溶解，溶解性良好。检测波长：260nm。进样量：20mL。Fr.8离心上清液制备条件如下：A：0.2%AA-Water，B：MeOH；0-20min，2%B~2%B；20~22min，2%B~90%B；22~30min，90%B~90%B。色谱图如下：Fr8-1Fr8-342AUFr8-220mL032AU120mL042AU20mL0051015202530RetentionTime(minutes)图2-25Fr.8二维制备色谱图Fig.2-25SecondpreparativechromatogramofFr.824 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.8-1二维分离纯化在XAmide(亲水色谱柱）上进行，色谱柱柱尺寸：250mm×10mm；样品溶液配制：40.0mL，（80%乙腈-水溶液），检测波长：260nm；制备条件如下：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0-21min，95%B~95%B；21~31min，95%B~5%B；31~41min，5%B~5%B；20mL水溶解。进样量：1.1mL。色谱图如下：Fr8-1-2Fr8-1-3Fr8-1-121AU1.1mL0321.0mLAU11.0mL021AU0.8mL0210.5mLAU005101520253035RetentionTime(minutes)图2-26Fr.8-1制备色谱图Fig.2-26PreparativechromatogramofFr.8-1Fr.8-2二维分离纯化在XAmide（亲水色谱柱）上进行制备，样品溶液配制：30.0mL，（80%乙腈-水溶液），检测波长：260nm；制备条件如下：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0-30min，97%B~97%B；进样量：0.3mL。色谱图如图2-27所示：Fr8-2-11.21.00.80.6AU0.40.20.00204060801001201401601.21.00.3mL0.80.6AU0.40.20.0051015202530RetentionTime(minutes)图2-27Fr.8-2制备色谱图；Fig.2-27PreparativechromatogramofFr.8-225 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.8-3二维分离纯化在XAmide（亲水色谱柱）上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×10mm；样品溶解至25mL（90%乙腈-水溶液）。检测波长：270nm；制备条件如下：A：0.2%FA-Water，B：ACN，0-10min，100%B~100%B；10~80min，100%B~5%B；80~90min，5%B~5%B；进样量：0.80mL。色谱图如图2-28。Fr8-3-1210.80mLAUFr8-3-202.522.01.5AU1.010.70mL0.5AU0.0051015202530RetentionTime(minutes)021AU0.65mL021AU0.50mL0051015202530RetentionTime(minutes)图2-28Fr.8-3制备色谱图Fig.2-28PreparativechromatogramofFr.8-3Fr.9在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行第二维制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：15.7mg/mL水溶液，检测波长：260nm；制备条件如下：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0-46min，2%B~2%B；进样量：10.0mL。色谱图见图2-29：1.5Fr9-1Fr9-3Fr9-61.0Fr9-2Fr9-5AUFr9-40.510.0mL0.01.51.0AU10.0mL0.50.01.51.05.0mLAU0.50.051015202530354045RetentionTime(minutes)图2-29Fr.9二维制备色谱图Fig.2-29SecondpreparativechromatogramofFr.926 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.9-1二维分离纯化在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×10mm；检测波长：260nm；流速：5mL/min，15.0mL样品溶液（50%乙腈-水溶液），制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN；0-10min，90%B~90%B；10~35min，90%B~72%B；进样量：0.6mL。色谱图如下：0.2Fr9-1-2Fr9-1-10.6mLAU0.10.00.20.6mLAU0.10.00.20.6mLAU0.10.005101520253035RetentionTime(minutes)图2-30Fr.9-1制备色谱图Fig.2-30PreparativechromatogramofFr9-1Fr.9-2二维分离纯化在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；检测波长：流速：8mL/min，20.0mL样品溶液（50%甲醇-水溶液）。检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。0-18min，5%B~5%B；进样量：2.5mL。色谱图见2-31：3Fr9-2-12Fr9-2-2Fr9-2-4AU12.5mLFr9-2-3021AU1.5mL01.51.0AU0.51.0mL0.01.00.5AU0.7mL0.0024681012141618RetentionTime(minutes)图2-31Fr.9-2制备色谱图；Fig.2-31PreparativechromatogramofFr.9-227 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.9-3二维分离纯化在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；检测波长：流速：10mL/min,35.0mL样品溶液（60%甲醇-水溶液）。检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。0-20min，5%B~5%B；10~35min，90%B~72%B；进样量：5.0mL。色谱图如下：Fr9-3-1Fr9-3-20.3Fr9-3-12.640.2AU1.760.10.0AU0.88-0.15.0mLFr9-3-20.002.641.76AU0.885.0mL0.002.251.50AU0.752.5mL0.001.320.88AU0.440.5mL0.00024681012141618RetentionTime(minutes)图2-32Fr.9-3制备色谱图Fig.2-32PreparativechromatogramofFr.9-3Fr.9-4在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；25mL样品溶液（60%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-32min，5%B~5%B；进样量：5.0mL。色谱图如下：Fr9-4-21.510.0mL/min1.0Fr9-4-3AU0.55.0mLFr9-4-1Fr9-4-40.01.51.010.0mL/minAU0.55.0mL0.01.08.0mL/min0.5AU5.0mL0.005101520253035RetentionTime(minutes)图2-33Fr.9-4制备色谱图；Fig.2-33PreparativechromatogramofFr.9-428 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.9-5在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；15mL样品溶液（50%甲醇-水溶液），流速：10mL/min，检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH，0-24min，5%B~5%B；进样量：1.0mL。色谱图如下：Fr9-5-2Fr9-5-1211.0mLAU0211.0mLAU01.51.00.7mLAU0.50.01.51.0AU0.50.5mL0.003691215182124RetentionTime(minutes)图2-34Fr.9-5制备色谱图Fig.2-34PreparativechromatogramofFr.9-5Fr.9-6在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；25mL样品溶液（50%甲醇-水溶液）；流速：20mL/min,检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。0-19min，10%B~10%B；进样量：5.0mL。色谱图如下：Fr9-6-1325.0mLFr9-6-2AU10325.0mLAU103213.0mLAU01.51.01.0mLAU0.50.00.40.30.2AU0.5mL0.10.002468101214161820RetentionTime(minutes)图2-35Fr.9-6制备色谱图Fig.2-35PreparativechromatogramofFr.9-629 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.11在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行第二维制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；样品溶液配制：93.0mg/mL（2%ACN-Water），检测波长：260nm；制备条件如下：流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN，0-20min，5%B~5%B。进样量：5.0mL，色谱图如下：3.02.52.01.57.0mLAU1.00.50.0-0.502468101214161820A3.03.0Fr11-12.52.52.02.01.5AU1.51.00.55.0mLAU1.00.002468101214161820RetentionTime(minutes)0.50.002468101214161820RetentionTime(minutes)图2-35Fr.11二维制备色谱图Fig.2-35SecondpreparativechromatogramofFr.11Fr.11-1在反向色谱柱YMCODS-AQ上进行制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；70mL样品溶液（60%甲醇-水溶液）；检测波长：260nm；制备条件如下：流速：20mL/min，流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH，0-20min，5%B~5%B。进样量：5.0mL。色谱图如下：2.641.765.0mLAU0.880.002.64Fr11-1-11.765.0mLAU0.880.001.320.880.2mLAU0.440.0002468101214161820RetentionTime(minutes)图2-36Fr.11-1二维制备色谱图Fig.2-36PreparativechromatogramofFr.11-130 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.12在色谱柱InnovalC18上进行第二维分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；110mL样品溶液（80%乙腈-水溶液）A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN；0-10min，5%B~5%B；10-30min，5%B~57%B，流速20mL/min。色谱图如下：3000Fr12-1Fr12-2200019.0mLmV1000030002000mV100010.0mL030002000mV10008mL00369121518212427RetentionTime(minutes)图2-37Fr.12二维制备色谱图Fig.2-37PreparativechromatogramofFr.12Fr.12-1在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行再一次的制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；50mL样品溶液（50%乙腈-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN；0-20min，85%B~85%B；20-40min，85%B~5%B；40-50min，5%B~5%B；流速：50mL/min，进样量：8.0mL，色谱图如下，得到组分Fr.12-1-1~Fr.12-1-5。12001000800600mV10.0mL40020001000Fr12-1-3Fr12-1-4Fr12-1-5800Fr12-1-1Fr12-1-2mV6004008.0mL2000600mV4002005.0mL0100mV501.0mL005101520253035404550RetentionTime(minutes)图2-38Fr.12-1二维制备色谱图Fig.2-38PreparativechromatogramofFr.12-131 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.12-1-1在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次的制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；检测波长：260nm；13mL样品溶液（50%甲醇-水溶液）；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-15min,3%B~3%B；流速：8mL/min。1.51.0AU0.54.0mL0.01.5Fr12-1-1-11.00.10AU0.05AU0.53.5mL0.000.00.80.60.42.0mLAU0.20.00.20.1AU0.5mL0.003691215RetentionTime(minutes)图2-39Fr.12-1-1制备色谱图Fig.2-39PreparativechromatogramofFr.12-1-1Fr.12-1-2在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；18mL样品溶液（50%甲醇-水溶液）；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-15min,6%B~6%B；流速：20mL/min。进样量：3.2mL色谱图如下。Fr12-1-2-11.681.123.2mLAU0.560.001.020.681.5mLAU0.340.000.480.320.5mLAU0.160.0003691215Retentiontime(miuntes)图2-40Fr.12-1-2制备色谱图Fig.2-40PreparativechromatogramofFr.12-1-232 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.12-1-3在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；20mL样品溶液（60%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。0-30min，5%B~5%B；流速：10mL/min，进样量：4.6mL。Fr12-1-3-11.080.724.6mLAU0.360.000.510.342.5mLAU0.170.000.150.10AU1.0mL0.050.000246810Retentiontime(minutes)图2-41Fr.12-1-3制备色谱图Fig.2-41PreparativechromatogramofFr.12-1-3Fr.12-1-4在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次分离纯化，色谱柱尺寸：250mm×20mm；25mL样品溶液（60%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-35min，10%B~10%B；流速：10mL/min。色谱图如下：0.1654.6mL0.110AU0.0550.0000.0632.0mLAU0.0420.0210.0000.0181.0mL0.012AU0.0060.0000.0240.0160.6mLFr12-1-4-1Fr12-1-4-2AU0.0080.00005101520253035Retentiontime(minutes)图2-42Fr.12-1-4制备色谱图Fig.2-42PreparativechromatogramofFr.12-1-4Fr.12-1-5在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；50mL样品溶液（60%甲醇-水溶液）；检测波长：260nm；33 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH。0-15min,10%B~10%B；流速：20mL/min。0.1050.0704.8mLFr12-1-5-1AU0.0350.0000.0870.0584.5mLAU0.0290.0000.0720.0483.0mLAU0.0240.00019.8AU13.21.0mL6.60.00481216202428323640444852Retentiontime(minutes)图2-43Fr.12-1-5制备色谱图Fig.2-43PreparativechromatogramofFr.12-1-5Fr.12-2在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行第二次分离纯化，色谱柱尺寸：250mm×20mm；300mL样品溶液（50%乙腈-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-ACN。0-10min,90%B~90%B；10-35min，90%B~5%B；35-45min，5%B~5%B；流速：80mL/min。2500Fr12-2-22000Fr12-2-1mV150018.0mL1000500025002000mV150018.0mL1000500015001000mV10.0mL50000714212835424956RetentionTime(minutes)图2-44Fr.12-2制备色谱图Fig.2-44PreparativechromatogramofFr.12-2Fr.12-2-1在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次的制备，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；23mL样品溶液（50%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；34 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-30min，17%B~17%B；流速：25mL/min。色谱图如下。0.2644.5mL0.176Fr12-2-1-1AU0.0880.0000.2644.5mL0.176AU0.0880.0000.2251.0mL0.150AU0.0750.0000.081.0mL0.04AU0.00051015202530RetentionTime(minutes)图2-45Fr12-2-1制备色谱图Fig2-45PreparativechromatogramofFr12-2-1Fr12-2-2在反向色谱柱YMCPackODS上进行再一次分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；13mL样品溶液（50%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-20min,20%B~20%B；流速：20mL/min。色谱图如下。Fr12-2-2-121Fr12-2-2-2AU4.5mL02.01.51.0AU0.54.5mL0.00.80.60.4AU1.5mL0.20.00.20.10.5mLAU0.0048121620RetentionTime(minutes)图2-46Fr.12-2-2制备色谱图Fig.2-46PreparativechromatogramofFr.12-2-235 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究Fr.13在色谱柱InnovalC18上进行第二维的分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；135mL样品溶液（50%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；制备条件如下：A：0.2%AA-Water，B：MeOH；0-5min，5%B~5%B；5~7min，5%B~12%B；7~57min，12%B~85%B；57~59min，85%B~90%B；59~70min，90%B~90%B。色谱图如下：12345678910111213141516171819200.250.200.15AU0.100.050.00010203040506070RetentionTime(minutes)0.250.200.1510.0mL0.10AU0.050.00010203040506070RetentionTime(minutes)图2-47Fr.13二维制备色谱图Fig.2-47SecondpreparativechromatogramofFr.13在制备色谱中，化合物洗脱形成“苞状”是一种很常见的现象，在分离过程中由于分离难度较大，常常放弃了这部分分离，由于Fr.13组分比较复杂，化合物性质相近，各组分质量较小，未对其进行进一步分离纯化。而现今分离材料发展迅速，可以尝试在其他实验中对这种“苞状”物质进行研究化。Fr.14在色谱柱XAmide（亲水色谱柱）上进行第二维分离纯化，色谱柱柱尺寸：250mm×20mm；160mL样品溶液（50%甲醇-水溶液），检测波长：260nm；流动相体系：A：0.2%FA-Water，B：0.2%FA-MeOH；0-10min，30%B~30%B；10~50min，30%B~95%B；50~60min，95%B~95%B，流速：80mL/min。色谱图如下。36 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究300Fr14-425020010.0mLFr14-1mV150Fr14-3100Fr14-250030025020010.0mLmV150100500300250mV2001507.0mL100500300250200mV1505.0mL100500051015202530354045505560RetentionTime(minutes)图2-48Fr.14二维制备色谱图Fig.2-48SecondpreparativechromatogramofFr.142.3.4化合物结构鉴定对黄绿蜜环菌子实体水提取物的二维分离纯化后，通过理化性质及核磁共振等波谱学技术分析，共从黄绿蜜环菌水提取物中鉴定出6个化合物，分别为化合物1（Fr.5-1）、化合物2（Fr.6-2）、化合物3（Fr.6-4）、化合物4（Fr.9-3-1）、化合物5（Fr.9-6-1）和化合物6（Fr.11-1）。化合物1：分子式为C5H7NO3。无色针状结晶，mp:158~160℃,EI-MS+1m/z:129[M]，101(M-CO)，56(101-COOH)，84(M-COOH)，H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δ：4.06(1H,dd,J=8.8，4.3Hz，H-5)，2.11(2H，t，J=8.2Hz，H-3)，7.91(1H，s，NH)，7.66(1H，dd，J=7.4，8.0Hz，H-10)，1.93(1H，m，H-4β)，12.6(1H，brs，COOH)，8.45(1H，dd，J=7.8，1.5Hz，H-11)，2.30(1H，m，13H-4α)。C-NMR(DMSO-d6，150MHz)δ：24.8(t，C-4)，30.1(t，C-3)，174.9(s，[43]COOH)，54.8(d，C-5)，178.0(s，C-2)。根据以上数据，并与文献数据对照，确定化合物1为焦谷氨酸。化合物2分子式为C9H12N2O6。白色粉末，mp:165~170℃,ESI-MSm/z245+1[M+H]。HNMR(CD3OD,600MHz)δ:8.00(1H,d,J=8.3Hz,H-6),5.70(1H,d,J=8.3Hz,H-5),5.90(1H,d,J=5.0Hz,H-1′),4.18(1H,t,J=5.0Hz,H-2′),4.14(1H,m,H-3′),4.00(1H,m,H-4′),3.73(1H,dd,J=2.8,12.3Hz,H-5′a),3.83(1H,dd,J13=2.3,12.3Hz,H-5′b);CNMR(CD3OD,150MHz)δ:163.1(s,C-4),150.7(s,C-2),140.7(d,C-6),101.7(d,C-5),87.7(d,C-1′),84.8(d,C-4′),73.5(d,C-3′),69.8(d,[8-9]C-2′),60.8(t,C-5′)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物2为尿嘧37 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究啶核苷。化合物3分子式为C9H12N2O5。白色结晶性粉末,mp:162~164℃,ESI-MS+1m/z229.1[M+H]。HNMR(DMSO-d6,600MHz)δ:11.27(1H,brs,H-1),7.85(1H,d,J=8.2Hz,H-4),6.15(1H,dd,J=6.5,7.2Hz,H-1′),5.63(1H,d,J=8.2Hz,H-5),4.23(1H,m,H-3′),3.78(1H,dd,J=7.1,3.8Hz,H-4′),3.55(2H,dd,J=12.1,133.8Hz,H-5′),2.08(2H,m,H-2′);CNMR(DMSO-d6,150MHz)δ:163.8(s,C-4),151.0(s,C-2),141.1(d,C-6),102.2(d,C-5),87.9(d,C-4′),84.7(d,C-1′),71.0(d,[10]C-3′),61.8(t,C-5′),40.0(t,C-2′)。以上数据与文献报道基本一致，鉴定化合物3为2′-脱氧尿苷。化合物4分子式为C10H13N5O5。白色无定型粉末，mp:240~243℃,ESI-MS-1m/z282[M-H],HNMR(DMSO-d6,600MHz)δ:10.63(1H,s,H-1),7.93(1H,s,13H-8),6.52(2H,s,2-NH2),5.69(1H,d,J=5.9Hz,H-1′);CNMR(DMSO-d6,150MHz)δ:156.7(C-6),153.6(C-2),151.3(C-4),135.5(C-8),116.7(C-5),86.3(C-1′),[12]85.2(C-4′),73.7(C-3′),70.3(C-2′),61.4(C-5′),以上数据与文献报道一致，故鉴定化合物4为鸟苷。化合物5分子式为C10H12N4O5。白色粉末，mp:212~213℃,ESI-MSm/z+1269[M+H]。HNMR(DMSO-d6,600MHz)δ:12.39(1H,brs,H-1),8.34(1H,s,H-2),8.07(1H,s,H-8),5.86(1H,d,J=5.6Hz,H-1′),4.49(1H,m,H-2′),4.13(1H,m,13H-3′),3.97(1H,m,H-4′),3.62(1H,m,H-5′a),3.54(1H,m,H-5′b)；CNMR(DMSO-d6,150MHz)δ:157.0(C-6),149.2(C-2),148.7(C-4),141.9(C-8),124.9(C-5),88.3(C-1′),85.9(C-4′),74.1(C-2′),70.5(C-3′),61.6(C-5′),根据以上数据，参[13-14]考文献，鉴定化合物5为肌苷。化合物6分子式为C10H13N5O4。白色粉末，mp:232~234℃,ESI-MSm/z+1268[M+H]。HNMR(DMSO-d6,600MHz)δ:7.64(1H,s,H-8),7.59(1H,s,H-2),6.59(1H,brs,NH2),5.89(1H,d,J=6.5Hz,H-1′),4.65(1H,d,J=5.2Hz,H-2′),4.17(1H,m,H-3′),3.89(1H,d,J=3.0Hz,H-5′),3.65(1H,dd,J=12.5,3.2Hz,H-5′a),133.63(1H,dd,J=12.5,3.2Hz,H-5′b);CNMR(DMSO-d6,150MHz)δ:154.4(C-6),151.9(C-4),151.5(C-2),139.8(C-8),116.6(C-5),89.3(C-1′),87.9(C-4′),75.1[15-16](C-2′),72.5(C-3′),62.6(C-5′)。根据以上数据，参考文献，鉴定化合物6为腺苷。2.4结论本章实验中，以野生黄绿蜜环菌子实体为实验对象，共从黄绿蜜环菌水提取物中分离并鉴定出6个核苷类化合物。38 第二章黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究首先通过离心技术与提取技术相结合的方法用于样品前处理过程中。实验中，对野生黄绿蜜环菌子实体首先通过超低温冷冻粉碎使粉末颗粒在1000目以下，然后通过纯水提取，离心收集上清液，80%乙醇醇沉处理后，经过减压干燥即得到本章实验的黄绿蜜环菌子实体水提取物，再通过RP/Hillic、RP/RP、RP/Silica等分离模式的二维液相色谱技术应用于野生黄绿蜜环菌子实体水提取物化合物的分离与纯化中。从黄绿蜜环菌水提取物中分离出的化合物主要以核苷类为主。关于核苷类化合物的分离，最早是从酵母、动物的生殖细胞中分离得到。核苷类化合物是DNA和RNA的重要组成部分，并参与DNA的代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、基[52]因治疗等多种生物功能。而腺嘌呤核苷广泛存在于虫草等真菌的代谢之中，[53]作为虫草的主要功能成分之一，其含量的高低是虫草制品的重要质控指标。有研究称腺苷能够舒张血管、抑制血小板聚集，可用于研制治疗室上性心动过速[54]的新药。由于黄绿蜜环菌水提取物的提取率约为50%，提取物率高，因此黄绿蜜环菌水提取物的二维分离纯化研究可为其有效成分的大规模工业化制备及进一步的药理研究、相关食品产品开发提供可能。39 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究引言在上一章中，主要对黄绿蜜环菌子实体（Armillarialuteo-virens）水提取物进行了分离纯化研究，分离得到多个化合物。在本章中对黄绿蜜环菌水提取物的生物活性展开研究，内容包含两个部分：抗氧化活性研究及抗肿瘤（人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549）的活性研究。本研究所采用的抗氧化筛选方法是应用实验室前期建立的抗氧化药物筛选模型，是指利用分子生物学的方法将抗氧化反应元件（ARE）和pGL4.17载体重组，将重组质粒转染人胚肾细胞（Hek293），通过观察荧光素酶的活性来判断物质的抗氧化活性。肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。数据表明，中国已经成为世界上第二大癌症高发国，尤其是肝癌、肺癌已成为主要的健康杀手。肺癌发生部位在支气管黏膜上皮，在我国工业大城市及欧州工业发达国家和常见，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性[55]常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肝癌也是我国常见的一种恶性肿瘤，每年新发肝癌患者约六十万，且发病年龄趋于年轻化，其危险性不容忽视，位居我国[56]各种恶性肿瘤死亡率的第2位。因此寻找高效、低毒、选择性强的有临床应用价值的理想的新型抗肿瘤药物是一项长期而艰巨额的任务。目前，实时无标记动态细胞分析技术（RTCA，RealTimeCellularAnalysis）[57-58]法已被广泛应用于抗肿瘤药物活性筛选中。该技术的原理是通过特殊工艺，将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞发生改变，即可引起贴壁电极界面阻抗的改变，且同细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息，如细胞形态变化、伸展、死亡和贴壁等。在本章研究中，通过抗氧化细胞内荧光素酶活性检测及RTCA法抗肿瘤活性筛可得到关于黄绿蜜环菌的生物活性数据，为研究和开发野生黄绿蜜环菌资源提供理论基础。40 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究3.1实验材料和仪器3.1.1仪器iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪（杭州艾森生物有限公司）；HF-90二氧化碳培养箱（香港力康生物医疗科技控股有限公司）；CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；BCM-1000超净工作台（苏州净化仪器有限公司）。3.1.2试剂与材料黄绿蜜环菌制备出的组分Fr.1~Fr.14，E-PlateL8（杭州艾森生物有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；HepG2人肝癌细胞、A549人肺癌细胞（中国科学院上海生化细胞所）；Hek293-ARE细胞（上海细胞研究所）；低糖DMEM培养基（基尔顿生物科技上海有限公司）；特丁基对苯二酚TBHQ（纯度>99%，东莞市广益公司）；环磷酰胺CTX（纯度>99%，东莞市广益公司）；Steady-Glo®荧光素酶检测试剂盒（上海信然生物科技有限公司）。3.2实验方法3.2.1抗氧化活性筛选利用分子生物学的技术，本实验室将抗氧化反应元件（ARE）置于pGL4.17载体荧光素酶（Luc）报告基因的上游，构建了pARE-Luc-Neo重组质粒，然后将重组质粒转染Hek293细胞，建立由ARE调控Luc表达的抗氧化药物筛选细胞模型，为高效筛选抗氧化候选药物提供新的筛选技术，并且在实验中以叔丁基[60]特苯二酚（TBHQ）作为阳性对照。黄绿蜜环菌水提取物抗氧化活性筛选，具体步骤如下：(1)抗氧化细胞内荧光素酶活性检测。当在显微镜下观察到有绿色荧光出现在pEGFP-N1对照组细胞时，用胰酶将pARE-Luc-Neo组细胞消化，平铺于964孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2×10个。在37℃，5%的CO2培养箱中培养24h后，向培养孔中加入25μM的TBHQ，继续培养24h。各培养孔中细胞中荧光素酶的活性通过Steady-Glo®荧光素酶检测试剂盒来测定。(2)准备样品。将Fr.1~Fr.14样品用DMSO配制成50.0mg/mL母液，于-4℃条件下保存。(3)细胞铺板。用胰酶消化经过筛选的Hek293-ARE细胞并计数，计数后将4细胞接种于白色96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2×10个，在37℃，5%41 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究的CO2培养箱中培养24小时。为避免边缘效应，周围孔加入PBS。(4)加入样品。每孔补充培养基，98μl/well。分别加入1-14号样品，每孔加入相应浓度样品，2μl/well。各样品终浓度为50.0μg/mL；每个浓度设3个重复，同时设空白对照组；(5)加阳性对照品。TBHQ（特丁基对苯二酚），作用终浓度如下：5000.0μg/mL、1000.0μg/mL、200.0μg/mL、40.0μg/mL、8.0μg/mL、1.6μg/mL。加入样品以及对照品的细胞培养板放置37℃，5%CO2培养箱，细胞继续培养24h，通过Steady-Glo®荧光素酶检测试剂盒将各培养孔细胞中荧光素酶的活性检测并记录下来。检测步骤如下：首先将白色96孔培养板内旧培养基液轻轻拍掉，加入新培养基，100μl/well，室温平衡20℃，每孔再加入100μL的与孔内培养基体积相等的检测试剂，轻轻混匀后于室温反应10min，保证细胞得以充分裂解。然后使用全波长多功能酶标仪中的Luminometric功能检测各培养孔细胞中的荧光素酶的活性，即检测各孔细胞中荧光素酶与荧光素酶底物作用产生的荧光强度值。应用SPSS20.0统计软件对实验数据进行分析，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义，P<0.01表示差异极显著，具有高度统计学意义。3.2.2抗肿瘤活性筛选黄绿蜜环菌水提取物体外抗肿瘤活性筛选分别使用A549肺癌细胞和HepG2肝癌细胞，在iCelligence仪器上进行，通过iPad无线连接收集数据，数据由RTCACardioSoftware1．0进行控制和采集，依照细胞形态及实时细胞生长曲线分析筛选结果。具体操作过程如下：(1)确认iCelligence测试系统正确连接，37℃、5%CO2培养箱工作正常；(2)将E-PlateL8八孔专用细胞板内按150μL/孔加入培养基，室温放置15min后置于iCelligence测试台上测基线；人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞培养用的培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；(3)将样品组分用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为5.0mg/mL的样品溶液；(4)分别将处于对数生长期的人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基4中，并将细胞浓度调至2.85×10个/mL，得到对数生长期的人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2悬液，并按150μL/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2细胞悬液接种与E-PlateL8八孔细胞板的相应孔中，室温放置30min；42 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究(5)将所述样品溶液（5mg/mL）分两批按每孔加入5μL所述浓度为5mg/mL的样品溶液、然后每孔再补加345μL上述处于对数生长期的人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2悬液于E-PlateL8八孔细胞板的相应孔中，并置于iCelligence测试台上，放入二氧化碳培养箱中开始检测；40h~90h后得到样品组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；(6)根据样品组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定样品组分是否具有体外抑制人肝癌细胞和人肺癌贴壁及增殖活性。(7)应用SPSS20.0软件、RTCACardiosoftware1.0、Excel对数据进行统计学分析，P＜0.05为有差异，有统计学意义。3.3结果与讨论3.3.1抗氧化活性筛选结果黄绿蜜环菌丙酮提取物抗氧化活性筛选以TBHQ为阳性对照物，TBHQ与相对荧光素酶活性标准曲线如下：180000160000140000120000100000800006000040000Relativeluciferaseactivity2000000100020003000400050006000-1ConcentrationofTBHQ(g/mL)图3-1TBHQ与相对荧光素酶活性标准曲线Fig.3-1StandardcurveofTBHQandrelativeluciferaseactivity以TBHQ的浓度（X）作为横坐标，以相对荧光素酶活性（Y）作为纵坐标，2得出标准曲线：y=29.04x-3406.5，r=0.9895。结果表明相对荧光素酶活性与浓-1-1度为0μg·mL~6000μg·mL范围内的TBHQ呈良好的线性关系。黄绿蜜环菌水提取物组分Fr.1~Fr.14在50μg/mL的浓度下，相对抗氧化活性数值如下表所示：43 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究表3-1黄绿蜜环菌水提取物抗氧化筛选结果Table3-1ResultofantioxidantactivityscreeningofwaterexactNO.AveEqualvaluewithTBHQFr.1836.42146.09±0.16Fr.2576.92137.10±0.30Fr.3487.65134.08±0.24Fr.4412.70131.50±0.17Fr.5470.34133.48±0.25Fr.6390.97130.75±0.27Fr.7538.92135.84±0.32Fr.8643.97139.46±0.35Fr.9660.93140.04±0.19Fr.10409.84131.42±0.15Fr.11377.51130.29±0.34Fr.12441.44132.49±0.28Fr.13566.50136.79±0.32Fr.141889.46182.35±0.41Fr.1~Fr.14相对TBHQ抗氧化活性，如图3-2所示：4.23.63.02.41.8TBHQ1.2Relativeluciferaseactivity0.60.001234567891011121314TBHQandFrcation图3-2Fr.1~Fr.14相对TBHQ的抗氧化活性Fig.3-2RelativeluciferaseactivityofFr.1~Fr.14.x±s,n=14.P<0.05,comparedwithTBHQ从图3-2可以看出，样本总量n=15，黄蘑菇水提取物组分Fr.1~Fr.14对44 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究Hek293-ARE细胞中的荧光素酶的表达均具有良好的诱导效果，荧光素酶表达量明显增高。各实验组与TBHQ组比较，具有显著性差异（P<0.01），表明黄绿蜜环菌水提取物一维分离纯化的14个组分均有抗氧化活性，其中Fr.14组在浓度为50μg/mL时，荧光素酶表达量最高，抗氧化作用最显著。3.3.2抗肿瘤活性筛选结果黄绿蜜环菌水提取物组分Fr.1~Fr.14进行抗肺癌（A549细胞）活性筛选，细胞指数与实时动态细胞增殖结果如图3-3，在0~18h内水提取物组分Fr.1~Fr.14作用于A549细胞后细胞生长良好，CI值呈递增趋势，Fr.1~Fr.14对A549细胞的增殖有微弱的促进作用。以0.1%的DMSO作为对照，各实验组与0.1%DMSO对照组比较，不具有统计学差异（P>0.05）。1.6Fr.81.6Fr.8Fr.9Fr.91.4Fr.101.4Fr.10Fr.11Fr.111.2Fr.121.2Fr.12Fr.13Fr.131.01.0Fr.14Fr.140.1%DMSO0.1%DMSO0.80.80.60.6A549CellIndex0.4A549CellIndex0.40.20.20.00.0-0.2-0.2024681012141618024681012141618Time(inHour)-RTCATime(inHour)-RTCA图3-3Fr.1~Fr.14体外抗肺癌活性筛选Fig.3-3LivercancerscreeningofFr.1~Fr.14invitro.x±s,n=14.P>0.05,comparedwith0.1%DMSO．黄绿蜜环菌水提取物组分Fr.1~Fr.14进行抗肝癌（HepG2细胞）活性筛选，细胞指数与实时动态细胞增殖结果如图3-4，CI值呈递增趋势，以0.1%的DMSO作为对照，不具有统计学差异（P>0.05），因此水提取物组分Fr.1~Fr.14对HepG2细胞的增殖无抑制作用。45 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究Fr.1Fr.8Fr.20.40Fr.3Fr.90.6Fr.10Fr.40.35Fr.5Fr.11Fr.60.5Fr.120.30Fr.7Fr.130.1%DMSOFr.140.40.1%DMSO0.250.200.30.150.2HepG2CellIndexHepG2CellIndex0.100.10.050.00.0002468101214160246810121416Time(inHour)-RTCATime(inHour)-RTCA图3-4Fr.1~Fr.14体外抗肺癌活性筛选Fig.3-4LungancerscreeningofFr.1~Fr.14invitro.x±s,n=14.P>0.05,comparedwith0.1%DMSO．黄绿蜜环菌水提取物经二维制备的部分组分抗肿瘤（HepG2细胞、A549细胞）活性筛选，如图3-5、图3-6，结果表明通过与0.1%的DMSO作为对照，在25~40h，除HepG2细胞在Fr.4-2作用下CI值增高，其余实验组CI值逐渐趋于平缓但未有下降趋势，因此这些二维制备的组分对HepG2细胞、A549细胞的的增殖基本无抑制作用（P>0.05）。Fr2-1Fr5-377Fr3-1Fr5-4Fr4-1Fr6-166Fr4-2Fr6-2Fr4-3Fr6-355Fr5-1Fr6-4Fr5-2Fr6-5440.1%DMSO0.1%DMSO3322A549CellIndexA549CellIndex1100-1-105101520253035400510152025303540Time(inHour)-RTCARetentionTime(minutes)图3-5水提取物组分体外抗肺癌活性筛选Fig.3-5Lungancerscreeningofcompoundsfromwaterextractinvitro.x±s,n=14.P>0.05,comparedwith0.1%DMSO．46 第三章黄绿蜜环菌水提取物的生物活性研究Fr2-11.2Fr5-3Fr3-11.2Fr5-4Fr4-1Fr6-11.0Fr4-21.0Fr6-2Fr4-3Fr6-3Fr5-10.8Fr6-4Fr5-20.8Fr6-50.1%DMSO0.1%DMSO0.60.60.40.4HepG2CellIndexHepG2CellIndex0.20.20.00.005101520253035400510152025303540RetentionTime(minutes)RetentionTime(minutes)图3-6水提取物组分体外抗肝癌活性筛选Fig.3-6Liverancerscreeningofcompoundsfromwaterextractinvitro.x±s,n=14.P>0.05,comparedwith0.1%DMSO．黄绿蜜环菌水提取物反相一维制备的组分经过亲水色谱柱分离后的成分还是过于复杂，且组分中的寡糖、单糖含量较高高，糖类是细胞生长过程中的必须物质，与其他生长因子共同作用于细胞的增殖，所以水提取物组分Fr.1~Fr.14通过筛选表现出对人肺癌细胞A549的增殖有微弱的促进作用与其成分间的复杂性是紧密相关的，其作用机制与机理有待进一步深入研究。47 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究4.1黄绿蜜环菌丙酮提取物挥发油的GC-MS分析4.1.1实验材料和仪器仪器：AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SQW-601型超微粉碎仪（山东三清不锈钢设备有限公司）；Varian450-GC/Varian320-MS型气质联用仪（德国Bruker公司）；TTL-DC型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SPE-01型固相萃取仪（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。材料：黄绿蜜环菌于2013年6月采自青海省，由中科院西北高原生物研究所王启兰研究员鉴定。实验所用试剂、溶剂均为分析纯（天津康科德试剂有限公司）。4.1.2实验方法4.1.2.1黄绿蜜环菌丙酮提取物挥发油样品的制备称取100g黄绿蜜环菌样品，超微粉碎后置于萃取罐中，加1000mL丙酮，-1于16℃下冷浸2h，每30min搅拌一次。过滤后将滤液离心15min，6000r·min，合并上清液。用旋转蒸发仪将上清液浓缩至约10mL，温度控制在50℃，再用氮吹仪进一步浓缩至约1mL，得到黄棕色油状物。将1mL样品溶解在6mL正己烷和3mL乙酸乙酯中，进行固相萃取（粒径80μm的高纯硅胶10g）处理。先用30mL乙酸乙酯活化固相萃取柱，30mL正己烷平衡，10mL样品溶液上样，用30mL正己烷淋洗样品，收集淋洗液后减压浓缩至1mL，即得到黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物的挥发油样品。4.1.2.2GC-MS测定条件气相色谱条件：VF-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温：初始柱温50℃保留1min，以8℃·min升至250℃，保留1min；再以10℃·min-7升至280℃，保留5min；柱流量1mL·min；进样口温度250℃；柱前压9.510eTorr；进样量1μL；分流比20:1；载气为高纯氦气。质谱检测条件：电离方式EI：电子能量70eV；离子源温度250℃，接口温度280℃；倍增器电压1.25kV；溶剂延时5min；质量扫描范围33～600amu，48 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究CID气体压力为2.0mTorr。4.1.2.3数据处理定性：利用VarianMSWorkstation6.92、NIST2008标准谱库自动检索各组分质谱数据，鉴定结果由保留指数、检索结果和人工解析图谱共同确定。定量：采用面积归一化法对检测出的成分进行定量分析。4.1.3结果与讨论黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物的挥发油成分利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行分析，所得总离子流图见图4-1。76543GCounts21051015202530Time/min图4-1黄绿蜜环菌丙酮提取物的总离子流图Fig.4-1TotalionchromatogramofvolatileconstituentsinArmillarialuteo–virens通过对色谱峰的NIST08谱库检索、计算保留指数两种方法来共同鉴定黄绿蜜环菌丙酮提取物挥发油的化学成分，共鉴定出33种物质；采用面积归一法计算出各成分的相对百分含量，具体的鉴定结果见表4-1。49 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究表4-1黄绿蜜环菌丙酮提取物中脂溶性成分的GC-MS鉴定结果Table4-1LiposolublecomponentsidentifiedbyGC-MSofacetoneextractsinArmillarialuteo–virens保留相对编号名称分子式匹配概率时间含量结构式No.R.M/F.M(min)%1-Dodecene;110.314C12H240.044917/9171-十二碳烯1-Tridecene;213.792C13H261.704939/9391-十三碳烯Hexadecane313.908C16H340.136944/944十六烷E-14-Hexadecenal416.909C16H30O3.283956/952OE-14-十六烯醛Eicosane516.998C20H420.180952/952二十烷1-(1-Methylethyl)-2-nonylcyclopropane619.294C15H300.101886/8171-(1-甲基乙基)-2-壬基环丙烷3-Eicosene,(E)-719.697C20H403.020953/950E-3-二十烯Heneicosane819.769C21H440.126928/922正二十一烷ONonanoicacid;921.644C16H30O20.343943/938OH壬酸OHexadecenoicacid,Z-11-1021.758C16H30O20.260943/938OHZ-11-十六烯酸1-2-BenzenedicarboxylicOO11acid,butyloctylester21.890C20H30O412.107920/903O邻苯二甲酸丁辛酯On-HexadecanoicO1221.967C10H16O4.106958/957棕榈酸OH2-ethyl-1-laurylalcohol1322.138C14H30O0.033864/8242-乙基-1-十二醇OH11-Tricosene1411-二十三烯22.156C10H20O20.098927/973151-Nonadecene22.229C22H442.066948/9381-二十二烯50 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究续表4-11-Iodo-2-Methylundecane1622.289C12H25I0.103879/8201-碘代-2甲基十一烷ImethyllinoleateO1723.404C19H34O20.191909/902O亚油酸甲酯Nonadecane1823.450C19H400.182887/854正十九烷9,12-OctadecadienoicacidO19(z,z)23.875C18H32O248.155933/927OH亚油酸Trans-13-OctadecenoicO20acid24.312C18H34O29.727920/920OH反式-13-十八碳烯酸(Z)-11-OctadecenoicacidO2124.384C18H34O20.186879/879顺式-11-十八碳烯酸OHn-OctanoicacidO2224.424C15H28O1.030898/891辛酸OH2-Methyl-z,z-3,13-Octadecadienol2324.463C19H36O0.477888/849OH2-甲基-Z,Z-3,13-十八碳二烯醇1-Heneicosanol2424.543C21H44O1.436923/920HO二十一醇(7Z)-hexadec-7-enalO2524.597C16H30O0.327838/8157-十六碳烯醛AcetyltributylcitrateOO2625.120CO20H34O80.190861/825O乙酰柠檬酸三丁酯OOOOODilaurylphthalateO2725.202C32H54O40.196875/849O邻苯二甲酸双十二酯OHeptacosane2825.654C27H560.196878/871正二十七烷Heptacosanol2926.699C27H56O0.74933/933HO正二十七烷醇n-Tetratriacontane3026.752C34H700.118884/884正三十四烷3,5,24-31Trimethyl-tetracontane27.908C43H880.062877/8423,5,24-三甲基-四十烷51 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究续表4-1PhthalicacidOmono-2-ethylhexylesterOH3228.352C16H22O47.264961/961邻苯二甲酸单(2-乙基己O基)酯Octacosanol3328.90C28H58O0.723935/935OH正二十八烷醇本章研究中，通过固相萃取结合气相色谱-质谱分析技术对黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物中挥发油成分进行了化学成分分析、含量测定及结构鉴定。实验结果表明，黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物挥发油中含有比较丰富的脂肪酸、酯类和烯类等化学成分。主要成分是脂肪酸，包括不饱和脂肪酸亚油酸(48.2%)和饱和脂肪酸棕榈酸(4.1%)。不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸，具有维持人体正常生理活动的作用。其中亚油酸是人和动物无法合成的一种物质，必须从食物中摄取。亚油酸具有抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、抑制脂肪积累等作用[59-60]。精制亚油酸经甲醇酯化、加氢制成不饱和脂肪醇，可作为各种表面活性原料，供洗涤剂、化妆品加工生产。而棕榈酸在自然界中分布广泛，可用作医药、颜料等的增溶剂、稳定剂，同样也是合成化妆品成分棕榈酸异丙酯、棕榈酸异辛[61]酯的基本原料。有研究报道棕榈酸还具有抗肿瘤、抗衰老的生物活性。实验结果可为黄绿蜜环菌作为保健资源的深入研究、开发利用提供理论基础和科学依据。4.2黄绿蜜环菌丙酮提取物化学成分的分离纯化4.2.1仪器AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；8K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；SQW-601三清超微粉碎机（山东三清不锈钢设备有限公司）；TS-SN-多功能提取浓缩机组（上海顺仪科技有限公司）；GTR25-1高速冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）；BrukerAvance300核磁共振仪（德国Bruker公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生物技术有限公司）；SHZ-D（3）型循环式真空泵；制备型仪器：DVT-DAC150制备纯化系统（江苏迪沃特仪器设备科技公司），包括D-P6010高压恒流泵、D-UV6000紫外-可见检测器、DC6000色谱数据系统软件、150mm动态轴向压缩；FLEXATM模块化制备色谱（天津博纳艾杰尔科技有限公司），包括HP-Q-P050二元泵、FL-UV2040紫外可变波长中压检测器，FL-C100B馏分收集器；Milli-Q净水仪（美国密理博公司）。52 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究4.2.2试剂与材料黄绿蜜环菌于2013年6月购自青海省祁连县，由中科院西北高原生物研究所王启兰研究员鉴定为Armillarialuteo–virens的子实体。提取分离纯化用丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙醇均为制备级（安徽时联特种溶剂股份有限公司）；实验用水为蒸馏水经Millipore纯水器过滤而得；色谱柱为DAC-150制备柱（10μm，Silica填料，日本大曹株式会社）；XIon亲水制备柱（10μm，10mm×250mm，华谱新创科技有限公司）；XAmide亲水制备柱（5μm，10mm×250mm，华谱新创科技有限公司）；SI色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，江苏汉邦科技有限公司）。XIon色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，华谱新创科技有限公司）；XAmide分析色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，华谱新创科技有限公司）。4.2.3实验方法4.2.3.1样品提取称取20.0Kg黄绿蜜环菌子实体粉末，依次按照料液比（提取溶剂水）1:8，-11:6，1:6提取三次，6000r·min离心收集上清液，得400L上清液。将收集的沉淀（药渣）60℃鼓风干燥得8.33Kg。对8.33Kg水提沉淀于15℃以料液比1:10用丙酮静置提取三次，每次提取15h，离心收集上清液并减压干燥得518.3g丙酮提取物。518.3g丙酮提取物用6000mL20%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解，得浓-1度约为90.0mg·mL制备储液。经0.45μm有机滤膜过滤后，即为黄绿蜜环菌丙酮提取物中待分离纯化的样品溶液。4.2.3.2一维分离纯化黄绿蜜环菌丙酮提取物的样品溶液的一维制备在Silica制备柱（10μm，150-1mm×260mm）上进行，检测波长：260nm；进样量：100mL；流速：700mL·min。采用流动相：A（正己烷），B（乙酸乙酯）；流动相洗脱条件：0~15min，0%B~0%B；15~35min，60%B~60%B；35~50min，100%B~100%B。4.2.3.3二维分离纯化将黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物一维制备的组分通过活性筛选后，将具有抗肿瘤活性的组分进行二维制备。不同的馏分二维制备过程中选择的色谱柱、流动53 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究相以及梯度条件都不相同，二维分离纯化模式主要为Silica/RP，Silica/Hilic等。活性组分Fr.7的二维制备是在XIon制备柱（10×260mm，10μm）上进行，采用流动相：A（正己烷），B（乙酸乙酯）；流动相条件：0~45min，12%~12%B；检测波长：260nm；流速：5mL/min。对活性组分Fr.8的二维制备是在XAmide制备柱（5μm，10×250mm）上进行，采用流动相：A（正己烷），B（乙醇）；流动相条件：0~40min，3%B~8%B；检测波长：260nm；流速：5mL/min。4.3结果与讨论4.3.1样品的前处理黄绿蜜环菌子实体样品的提取过程如下：黄绿蜜环菌子实体（干燥子实体）→超低温冷冻粉碎（颗粒尺寸小于1000目的粉末）→纯水提取（上清和沉淀）→离心（收集沉淀）→丙酮冷浸提取（上清和沉淀）→离心（收集上清）→减压干燥→黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物。通过上述流程，可以明确得出本章分离纯化的对象是植物化学中通常被丢弃的药物提取后的药渣，在前期的预实验中，我们对药渣进行体外细胞实验结果表明，药渣具有抗肿瘤活性。所以本章实验中本着最大限度的利用黄绿蜜环菌这一野生资源的目的，对其子实体经纯水提取后的药渣沉淀又进行了丙酮冷浸提取。为得到黄绿蜜环菌丙酮提取物，主要应用了提取技术和离心技术对样品进行了前处理，首先利用纯水对黄绿蜜环菌子实体进行提取，可以提取出多糖、蛋白以及极性较大的有机天然小分子化合物，然后通过离心技术实现水提取部分化合物与药渣（残渣）的有效分离，通过收集药渣（残渣）并用丙酮冷浸提取，再次通过离心技术收集上清液实现了丙酮提取上清与残渣的高效分离，同时可以除去黄绿蜜环菌中的重金属。提取出的丙酮提取物经过了多次提取与离心分离，是一种比较快捷、高效的样品前处理方式。4.3.2一维分离纯化黄绿蜜环菌丙酮提取物中的化合物极性比较小，预实验中在考察了亲水模式色谱分离材料和正相色谱分离材料对丙酮提取物的分离效果后，选择日本大曹株式会社利用共聚法生产的Silica填料进行一维制备，分离纯化过程在DAC-150制备柱上进行（装填有2.6Kg正相色谱填料）。一维制备色谱图见图4-2，对Fr.9~Fr.14局部放大色谱图如图4-3所示。54 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究Fr74000Fr1Fr4Fr6Fr5Fr235003000Fr32500Fr82000Fr9~Fr14mV15001000500005101520253035404550RetentionTime(minutes)图4-2丙酮提取物一维制备色谱图Fig.4-2Chromatogramoffirstdimensionalpreparationofactoneextract1000Fr9Fr10Fr11Fr12Fr13Fr14900800700600mV50040030020038404244464850RetentionTime(minutes)图4-3一维制备色谱图中38min到50min放大Fig.4-3Localamplificationchromatogramoffirstdimensionalpreparationfrom38minto50min在丙酮提取物一维制备过程中，样品浓度约为90.0mg/mL，进样体量100mL，一针进样量为9g，上样量3.46‰。一维制备过程中按照图4-2和图4-3所示的色谱峰，对丙酮提取物一维制备组分进行收集，从一维色谱图中可以看出黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物中主要含有两个主要组分Fr.4和Fr.7。将收集的Fr.1~Fr.14减压干燥后称重，各个组分的重量依次为：Fr.1，7204.8mg；Fr2，2097.6mg；Fr.3，7717.8mg；Fr.4，116.9g；Fr.5，99.2g；Fr.6，2599.2mg；Fr.7，27.1g；Fr.8，16.7g；Fr.9，3271.8mg；Fr.10，3492.2mg；Fr.11，2166.0mg；Fr.12，4727.2mg；Fr.13，2458.6mg；Fr.14，3180.6mg。从组分Fr.1~Fr.14的重量可知，黄绿蜜环菌子实体一维制备组分的重量与峰55 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究面积的值并无正相关的关系，这是由于一维制备色谱图中存在无紫外吸收的化合物以及所选检测波长并不是所有化合物的最佳检测波长。所以可以得出结论：紫外吸收与该组分的质量之间并无直接的线性正相关关系。4.3.3二维分离纯化对黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物一维制备后，选取了制备量比较大的活性组分Fr.7与Fr.8进行了二维分离纯化。Fr.7的二维制备在XIon制备柱（10mm×250mm，10μm）上进行，Fr7组分以10%正己烷-乙酸乙酯体系溶解。流动相：A（正己烷），B（乙酸乙酯），流动相体系：0~50min，12%B~12%B；50~55min，12%B~100%B；55~60min，100%B~100%B；检测波长：260nm，流速：10mL/min。每针进样量为0.5mL，上样量为4.02‰，制备色谱图见图4-4。Fr7-21.5Fr7-41.02.0mLAU0.5Fr7-1Fr7-3Fr7-50.01.51.02.0mLAU0.50.01.51.02.0mLAU0.50.0051015202530354045RetentionTime(minutes)图4-4Fr.7二维制备色谱图Fig.4-4SecondpreparativechromatogramofFr.7利用HPLC分析二维制备的馏分Fr.7-4的纯度，纯度检测见图4-5，HPLC分析条件：色谱柱：XAmide（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：A：正己烷，B：乙醇；等度条件：0~15min，2%B~2%B；流速：1.0mL/min；柱温：25℃，检测波长：260nm。从图中可以看出化合物Fr.7-4纯度大于95%。通过减压干燥得化合物7(Fr.7-4)，6087.5mg。56 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究0.7Fr.7-40.60.50.4AU0.30.20.10.003691215RetentionTime(minutes)图4-5Fr7-4纯度分析及化合物结构Fig.4-5PurityanalysisandcompoundstructureofFr7-4Fr.8的二维制备在XAmide制备柱（10mm×250mm，10μm）上进行，组分Fr.8以10%乙醇-正己烷体系溶解，流动相：A（正己烷），B（乙醇），流动相洗脱条件为：0~40min，3%B~8%B。检测波长：260nm，流速：10mL/min。每针进样体积1.0mL，上样量1.24‰，制备色谱图见图4-6。0.6Fr8-1Fr8-2Fr8-3Fr8-40.4AU0.21.0mL0.00.6AU0.40.21.0mL0.00.50.40.3AU0.20.5mL0.10.00510152025303540RetentionTime(minutes)图4-6Fr.8二维制备色谱图Fig.4-6SecondpreparativechromatogramofFr.8从图4-6中可以看出，Fr.8进样量为0.5mL时Fr8-3与Fr8-4可以完全无交叉的进行馏分收集，但是工作量将会是当进样量为1.0mL时的两倍，在制备过程中需要综合考虑分离度、工作量以及成本三因素，所以该组分的制备通过加大一倍的样品上样量实现了该三要素的合理平衡。利用HPLC对活性组分Fr.8二维制备的组分Fr.8-1和Fr.8-4分析其纯度，纯57 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究度检测见图4-7。Fr.8-1分析条件：色谱柱：XIon（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：A：正己烷，B：乙醇；等度洗脱条件：0~15min，5%B~5%B；流速：1.0mL/min；柱温：25℃，检测波长：260nm。Fr.8-4分析条件：色谱柱：XAmide（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：A：正己烷，B：乙醇；等度条件：0~15min，3%B~3%B；流速：1.0mL/min；柱温：25℃，检测波长：260nm。从图中可以看出化合物Fr.8-1和Fr.8-4纯度均大于95%。通过减压干燥得到化合物8(Fr.8-1)，472mg；化合物9(Fr.8-4)，277.4mg。320Fr8-4280240200mV1601208040003691215RetentionTime(minutes)800700Fr8-1600500mV400300200100003691215RetentionTime(minutes)图4-7Fr8-1和Fr8-4纯度分析及化合物结构Fig.4-7PurityanalysisandcompoundstructureofFr8-1andFr8-44.3.4化合物结构鉴定通过二维液相色谱法分离纯化，从黄绿蜜环菌丙酮提取物中共分离鉴定得到3个化合物。1化合物7结构鉴定：白色粉末。HNMR(600MHz,CDCl3):δ:5.57(1H,dd,J=5.6,2.4Hz,H-6),5.38(1H,dt,J=5.4,2.6Hz,H-8),5.20(2H,qd,J=15.3,7.7Hz,H-22,H-23),3.64(1H,tt,J=11.2,4.1Hz,H-3),1.20~2.50ppm都是次甲基以及亚甲基质子，共21个H，1.04(3H,J=6.6Hz,H-21),0.95(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.8Hz,H-28),0.84(3H,d,J=6.8Hz,H-26),0.83(3H,d,J=6.8Hz,H-27),0.63(3H,s,13H-18);CNMR(151MHz,CDCl3)δ:141.4(C-8),139.8(C-5),135.6(C-22),132.0(C-23),119.6(C-6),116.3(C-7),70.5(C-3),55.8(C-17),54.6(C-14),46.3(C-9),42.8(C-13,C-24),40.8(C-4),40.4(C-20),39.1(C-12),38.4(C-1),37.0(C-10),33.158 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究(C-25),32.0(C-2),28.3(C-16),23.0(C-15),21.1(C-21,C-11),20.0(C-27),19.7113(C-26),17.6(C-19),16.29(C-28),12.1(C-18)与文献报道的H-NMR和CNMR[62-63]数据一致，确定化合物7为麦角甾醇。1化合物8结构鉴定：白色粉末。H-NMR(400MHz,CDCl3)δ6.04(1H,s,H-6),5.21(2H,t,J=6.2Hz,H-22,H-23),3.68~3.59(1H,m,H-3),1.35(3H,s,H-19),1.05(3H,d,J=6.6Hz,H-21),0.92(3H,d,J=6.8Hz,H-28),0.83(6H,t,J=6.5Hz,H-26,13H-27),0.65(3H,s,H-18);C-NMR(101MHz,CDCl3)δ186.5(C-7),162.2(C-5),161.5(C-9),135.5(C-22),134.0(C-8),132.1(C-23),126.6(C-6),71.8(C-3),53.4(C-17),48.4(C-14),42.9(C-24),42.3(C-13),41.9(C-10,C-4),40.3(C-20),35.5(C-12),34.7(C-1),33.1(C-25),30.5(C-2),29.5(C-16),24.7(C-15),24.6(C-11),23.7(C-19),21.1(C-21),20.0(C-27),19.7(C-26),17.6(C-28),11.9(C-18)与文献113报道的H-NMR和C-NMR数据一致，确定化合物8为3β-hydroxy-(22E,[64]24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one。1化合物9结构鉴定：白色粉末。H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.20(1H,d,J=7.5Hz,H-23),5.16(1H,d,J=8.1Hz,H-22),3.96(1H,m,J=10.8,5.3Hz,H-3),3.21(1H,d,J=4.0Hz,H-11),2.25~2.16(2H,m,H-9,H-20),1.49(3H,s,H-19),0.91(3H,d,J=6.8Hz,H-28),0.84(3H,d,J=3.5Hz,H-27),0.82(3H,d,J=6.7Hz,H-26),130.68(3H,s,H-18);C-NMR(101MHz,CDCl3)δ211.0(C-12),135.3(C-22),132.2(C-23),75.8(C-8),68.7(C-5),68.4(C-3),62.8(C-11),58.9(C-14),56.7(C-17),47.9(C-9),46.1(C-13),43.3(C-10),42.9(C-24),39.9(C-20),39.1(C-6),37.9(C-4),33.1(C-25),29.9(C-2),29.2(C-1),28.1(C-16),24.5(C-7),22.3(C-19),20.9(C-21),20.01(C-27),19.7(C-26),19.2(C-15),17.7(C-28),13.9(C-18)与文献报道的H-NMR13和CNMR数据一致，确定化合物9为(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost[65]-22E-en-12-one。212821282222O1818O20122017232425261112242526191311172319O16191327116214910815282751431015735467HOOO46ergoterolβ-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one59 第四章黄绿蜜环菌丙酮提取物的化学成分研究212822181220242526111723191311691422710815357HHOO46(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-one4.4结论在本章实验中，对植物化学实验中常常舍弃的植物水提沉淀加以利用，力求找到其中的活性成分。首先以黄绿蜜环菌子实体经水提取后的药渣作为原料，用丙酮进行提取，再结合正相/亲水色谱二维分离纯化技术，共从黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物中分离纯化出3种纯度在95%以上的具有体外抑制肝癌细胞增殖的活性化合物。在样品前处理过程中首先使用了离心技术与提取技术，对野生黄绿蜜环菌子实体通过超低温粉碎使粉末颗粒在1000目以下，然后通过纯水提取，离心收集药渣沉淀，对沉淀用丙酮冷浸提取并离心收集上清，减压干燥即得到本章实验的黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物，该方法与传统的醇提取法相比，具有提取物组分成分相对简单、极性范围分布较窄以及样品溶解性好的特点，发展的一维制备方法不需要兼顾多个极性段的化合物。从野生黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物中分离出的化合物主要以甾醇类为主，正是由于本章实验中采用的独特的样品前处理方法，使得后期的分离纯化及化合物的结构鉴定变得相对简单。丙酮提取物样品的一维制备在DAC-150工业制备级色谱上进行，可以大大缩短一维分离纯化的周期，二维制备采用10mm×250mm的亲水色谱制备柱进行纯化，可快速明确活性化合物的结构。由于亲水色谱保留机制与正相硅胶、凝胶具有显著差别，可应用于小极性化合物的分离纯化中，因此建立的正相/亲水二维分离纯化体系，相比较传统的正相硅胶、凝胶反复柱层析等分离方法，具有可在线监测、分离纯化周期短、重复性好等诸多优点。60 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究引言在第四章中，主要对黄绿蜜环菌子实体（Armillarialuteo-virens）丙酮提取物化学成分进行了分离纯化研究，分离得到一维制备组分。本章实验主要对黄绿蜜环菌丙酮提取物的一维制备组分的生物活性展开研究，再选取具有较好生物活性的组分进行第二维分离纯化。生物活性研究包含两个部分：抗氧化活性研究及抗肿瘤（人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549）的活性研究。实时无标记动态细胞分析（RTCA）法，进行体外抗肿瘤活性筛选每个周期只需要40~50h，铺板与加样品操作过程间隔不超过2h，已逐渐应用于药物的高通量、高效率体外抗肿瘤活性筛选中。实验过程中利用电阻数值的变化换算为细胞指数（CellIndex,CI），从而通过CI曲线直观地显现出细胞发生的动态变化。电阻值的大小由以下三个因素决定:每孔里的细胞数量、细胞和细胞的相互作用,细胞与电极板的相互作用的结果和细胞的形态。当细胞贴壁面积增加,电阻值升高,反之细胞凋亡脱落,电阻值下降。通过抗氧化细胞内荧光素酶活性检测及RTCA法抗肿瘤活性筛可得到关于黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性数据，进而为具有抗氧化、抗肿瘤的化合物的分离鉴定提供筛选导向，为研究和开发野生黄绿蜜环菌资源提供理论基础。5.1实验材料和仪器5.1.1仪器iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪（杭州艾森生物有限公司）；HF-90二氧化碳培养箱（香港力康生物医疗科技控股有限公司）；CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；BCM-1000超净工作台（苏州净化仪器有限公司）。SQW-601三清超微粉碎机（山东三清不锈钢设备有限公司）。5.1.2试剂与材料黄绿蜜环菌丙酮提取物制备出的一维组分Fr.1~Fr.14、二维组分Fr.7-1~Fr.7-5、Fr.8-1~Fr.8-4；E-PlateL8（杭州艾森生物有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；HepG2人肝癌细胞、A549人肺癌细胞（中国科学院上海生化细胞所）；Hek293-ARE细胞（上海细胞研究所）；低糖DMEM培养基（基尔顿生物科技上海有限公司）；特丁基对苯二酚TBHQ（东莞市广益公61 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究司）；Steady-Glo®荧光素酶检测试剂盒（上海信然生物科技有限公司）。5.2实验方法5.2.1抗氧化活性研究黄绿蜜环菌丙酮提取物Fr.1~Fr.14进行抗氧化活性筛选，步骤见“3.2.1”。应用SPSS20.0统计软件对实验数据进行分析，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义，P<0.01表示差异极显著，具有高度统计学意义。5.2.2抗肿瘤活性筛选黄绿蜜环菌丙酮提取物体外抗肿瘤活性筛选分别使用A549人肺癌细胞和HepG2人肝癌细胞，以加入0.1%DMSO作为空白对照组，以加入相同浓度的环磷酰胺（CTX）作为阳性对照组，在iCelligence仪器上进行，通过iPad无线连接收集数据，依照细胞形态及实时细胞生长曲线分析抗肿瘤筛选结果。具体操作过程详见“3.2.2”。RTCA系统利用电阻数值换算为细胞指数(CellIndex,CI)作为实验读数指标,当细胞发生动态变化时即引起电阻值变化，用CI曲线来表示。可通过曲线的上升,平台期以及下降直观简明地反映出电极板中细胞的状态。根据样品组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定样品组分是否具有体外抑制人肝癌细胞和人肺癌贴壁及增殖活性。5.3结果与讨论5.3.1抗氧化活性筛选结果黄绿蜜环菌丙酮提取物抗氧化活性筛选以食品级抗氧化剂特丁基对苯二酚TBHQ为阳性对照物，TBHQ与相对荧光素酶活性标准曲线如下：62 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究180000160000140000120000100000800006000040000Relativeluciferaseactivity2000000100020003000400050006000-1ConcentrationofTBHQ(g/mL)图5-1TBHQ与相对荧光素酶活性标准曲线Fig.5-1StandardcurveofTBHQandrelativeluciferaseactivity以TBHQ的浓度（X）作为横坐标，以相对荧光素酶活性（Y）作为纵坐标，2得出标准曲线：y=29.04x-3406.5，r=0.9895。结果表明相对荧光素酶活性与-1-1浓度为0μg·mL~6000μg·mL范围内的TBHQ呈良好的线性关系。黄绿蜜环菌水提取物组分Fr.1~Fr.14的在50.0μg/mL浓度下的荧光强度数值（即荧光素酶活性），如下表所示：表5-150μg/mLFr.1~Fr.14荧光强度表Table5-1Relativeluciferaseactivityof50μg/mLFr.1~Fr.14NO.AveTBHQFr.12332.382027.77Fr.22749.492160.22Fr.33246.661865.77Fr.42017.491960.41Fr.52143.712041.70Fr.67723.282129.13Fr.773022.12120.41Fr.816286.42060.71Fr.912877.001733.40Fr.1012279.702032.78Fr.1114018.702032.39Fr.124455.911871.83Fr.1314284.00Ave：Fr.1451716.402003.0463 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究以TBHQ（特丁基对苯二酚）为参照抗氧化剂，Fr.1~Fr.14体外抗氧化活性在50.0μg/mL浓度条件下与已知抗氧化剂TBHQ的比值如表5-2所示。表5-2黄绿蜜环菌丙酮提取物抗氧化筛选结果Table5-2ResultofantioxidantactivityscreeningofacetoneexactNO.EqualvaluewithTBHQFr.11.16±0.16Fr.21.37±0.07Fr.31.62±0.05Fr.41.01±0.06Fr.51.07±0.09Fr.63.86±0.05Fr.736.46±0.07Fr.88.13±0.03Fr.96.43±0.02Fr.106.13±0.05Fr.117.00±0.02Fr.122.22±0.03Fr.131.16±0.04Fr.141.37±0.03黄蘑菇丙酮提取物Fr.1~Fr.14相对TBHQ抗氧化活性，如图5-2所示：40353025201510Relativeantioxidantactivity5TBHQ001234567891011121314TBHQandFraction图5-2Fr.1~Fr.14相对TBHQ的抗氧化活性Fig.5-2RelativeluciferaseactivityofFr.1~Fr.14comparedwithTBHQ从图5-2的结果可以看出，样品总量n=14，黄蘑菇丙酮提取物组分Fr.1~Fr.1464 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究对Hek293-ARE细胞中的荧光素酶的表达具有良好的诱导效果，均具有抗氧化活性。各实验组与TBHQ组比较得出：分别添加了Fr.7~Fr.11，Fr.13，Fr.14后荧光素酶表达量增高，其中Fr.8，Fr.9，Fr.10，Fr.11，Fr.13组与TBHQ组相比，具有显著性差异（P<0.01），Fr.7组，Fr.14组在浓度为50μg/mL时，诱导荧光素酶表达量显著增高，与TBHQ对照组相比差异极显著（P<0.001），具有高度统计学意义，表明抗氧化活性良好。5.3.2抗肿瘤活性筛选结果对收集的黄绿蜜环菌子实体一维制备组分Fr.1~Fr.14进行体外抗肿瘤活性筛选，RTCA体外抗肿瘤活性筛选方法见“3.2.2”。筛选过程中选择样品组分最终浓度为50μg/mL，BT_Fr1-Fr14抗肿瘤A549细胞活性筛选的细胞指数与实时动态细胞增殖结果见图5-3和图5-4，BT_Fr1-Fr14抗肿瘤HepG2细胞活性筛选的细胞指数与实时动态细胞增殖结果见图5-5和图5-6。Fr.12.1Fr.2Fr.31.8Fr.4Fr.51.5Fr.6Fr.71.20.1%DMSO0.9A549CellIndex0.60.30.0010203040Time(inHour)-RTCA图5-3丙酮提取物Fr.1~Fr.7体外抗肺癌活性筛选Fig.5-3LungcancerscreeningofBT_Fr.1~Fr.7invitro.x±s,n=7.2.4Fr82.1Fr9Fr101.8Fr11Fr121.5Fr13Fr141.20.1%DMSO0.9A549CellIndex0.60.30.0010203040Time(inHour)-RTCA图5-4丙酮提取物Fr.8~Fr.14体外抗肺癌活性筛选Fig.5-4LungcancerscreeningofBT_Fr.8~Fr.14invitro.x±s,n=7.65 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究0.45Fr1Fr20.40Fr3Fr40.35Fr50.30Fr6Fr70.250.1%DMSO0.200.15HepG2CellIndex0.100.050.00-0.050102030405060708090Time(inHour)-RTCA图5-5丙酮提取物Fr.1~Fr.7体外抗肝癌活性筛选Fig.5-5LivercancerscreeningofFr.1~Fr.7invitro.x±s,n=7.0.45Fr8Fr90.40Fr10Fr110.35Fr120.30Fr13Fr140.250.1%DMSO0.200.15HepG2CellIndex0.100.050.00-0.050102030405060708090Time(inHour)-RTCA图5-6Fr.8~Fr.14体外抗肝癌活性筛选Fig.5-6LivercancerscreeningofFr.8~Fr.14invitro.x±s,n=7.从图5-3和图5-4细胞抗肿瘤活性筛选可以直观的看出黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物一维制备收集组分Fr.7、Fr.13具有一定的抑制肺癌细胞A549增殖的活性，CI值曲线呈平缓趋势，说明A549细胞数量逐渐减少，贴壁性降低，以0.1%的DMSO作为对照，具有统计学差异（P<0.05），而从图5-5和图5-6细胞抗肝癌HepG2活性筛选可看出，Fr.7、Fr.8、Fr.9、Fr.10、Fr.11、Fr.13、Fr.14均具有较好的抑制HepG2细胞贴壁的活性，CI曲线呈下降趋势，逐渐平缓，与0.1%DMSO对照组相比，具有显著差异（P<0.01）。体外抗肝癌活性筛选结束时细胞状态照片见图5-7，从图5-7中对照组0.1%DMSO、不具有抗肝癌活性代表组分Fr1以及具有抗肝癌活性组分Fr.7、Fr.8、Fr.13以及Fr.14活性筛选结束时培养孔中细胞生长状态和密集程度同样可以看出黄绿蜜环菌子实体丙酮提取物一维制备组分Fr.7、Fr.8、Fr.13以及Fr.14具有抗肝癌细胞增殖的活性，其中Fr.7抑制作用显著。这一结论与RTCA实时无标记66 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究动态细胞分析法所得细胞指数与实时细胞动态增殖动态图的结果一致。图5-7BT-Fr.1~Fr.14抗肝癌活性筛选结束时代表性的细胞照片Fig.5-7RepresentativecellphotosbytheendoflivercancerscreeningofBT_Fr.1~Fr.14将对肝癌有显著抑制作用的活性组分Fr.7继续进行二维分离纯化，把二维制备的组分Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4以及Fr.7-5进行体外抗肝癌活性筛选，样品组分终浓度为50μg/mL。铺板照片见图5-8，RTCA法抗肝癌细胞HepG2活性筛选结果见图5-9，实验结束HepG2细胞生长状态照片见图5-10。图5-8HepG2细胞铺板照片Fig.5-8PhotosofHepG2cellplanking67 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究Fr7-11.5Fr7-2Fr7-3Fr7-4Fr7-51.20.1%DMSOCTX0.90.6HepG2CellIndex0.30.00510152025303540Time(inHour)-RTCA图5-9Fr.7-1~Fr.7-5体外抗肝癌活性筛选Fig.5-9LivercancerscreeningofFr.7-1~Fr.7-5invitro图5-10Fr7二维制备组分抗肝癌活性筛选结束时细胞照片Fig.5-10CellphotosbytheendoflivercancerscreeningofFr.7-2andFr.7-4从图5-9中可以看出，组分Fr.7-4与0.1%DMSO对照组相比，具有明显的抗肝癌活性（P<0.01），与CTX阳性对照组相比对细胞增值的抑制作用无差异（P>0.05），而Fr.7-1，Fr.7-2Fr.7-3Fr.7-5在50μg/mL的终浓度下基本不具有抗肝癌活性。图5-10中0.1%DMSO对照孔中肝癌细胞明显处于无限增殖状态，这与图5-9中0.1%DMSO所代表的曲线具有一致性。Fr.7-2通过体外抗肝癌活性检测图中说明其不具有抗肝癌活性，这一结论可在图5-10中肝癌细胞增殖情况得以验证。图5-9中Fr.7-4细胞实时增殖曲线表明其具有明显的抑制肝癌细胞贴壁以及增殖的活性，这与图5-10中大部分HepG2细胞凋零、悬浮相吻合。对活性组分Fr.8在二维分离纯化过程中制备的组分Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3以及Fr.8-4进行体外抗肝癌活性筛选，样品组分终浓度为50μg/mL。铺板照片见图5-11，RTCA法抗肝癌细胞HepG2活性筛选结果见图5-12，实验结束HepG2细胞生长状态照片见图5-13。68 第五章黄绿蜜环菌丙酮提取物的生物活性研究图5-11HepG2细胞铺板照片Fig.5-11PhotosofHepG2cellplanking1.00.9Fr8-1Fr8-20.8Fr8-30.7Fr8-40.1%DMSO0.6CTX0.50.40.3HepG2CellIndex0.20.10.0-0.10510152025303540Time(inHour)-RTCA图5-12Fr.8-1~Fr.8-4体外抗肝癌活性筛选Fig.5-12CellphotosbytheendoflivercancerscreeningofFr.8-1~Fr.8-4图5-13Fr.8二维制备组分抗肝癌活性筛选结束时细胞照片Fig.5-13CellphotosbytheendoflivercancerscreeningofFr.8-1andFr.8-2图5-12中肝癌细胞实时增殖曲线表明，Fr.8-1与Fr.8-4具有较好的体外抑制肝癌细胞生长的活性，与0.1%DMSO对照组比较P<0.01，差异极显著，与CTX阳性对照组比较P>0.05，抑制程度无统计学差异。图5-13中可以看出肝癌细胞在添加50μg/mLFr.8-2的环境中长势良好，而在添加50μg/mLFr.8-1的环境中只有少量肝癌细胞贴壁生长，进一步证明了Fr.8-1对肝癌细胞的生长有抑制作用。69 第六章结论和展望第六章结论和展望（1）本研究首先以黄绿蜜环菌子实体水提物离心上清液为原料,采用反相制备色谱和反向/亲水二维液相色谱体系建立了分离纯化黄绿蜜环菌子实体中单体化合物的方法。通过反相制备色谱按照化合物极性将其分成14个组分。通过考察流动相组成、流速和上样量等因素对分离效果的影响，确定了适宜的一维纯化工艺：流动相体系：V(0.2%乙酸-水):V(甲醇)=75:25；流速80mL/min；检测波长254nm；进样体积4mL；进样量744.0mg；柱温为室温。再根据一维组分的特点建立反相/亲水、反向/反向、反向/正向二维液相色谱体系对反相各组分进行分离纯化以制备化合物单体。经高压分析液相分析所分离产物的纯度后，用核磁共振谱等波普学技术确定了6种单体化合物的化学结构。（2）以黄绿蜜环菌子实体水提物离心沉淀药渣为原料，经丙酮提取后采用正相制备色谱和正向/反相或正向/亲水二维液相色谱体系建立了分离纯化黄绿蜜环菌丙酮提取物中单体化合物的方法。通过考察流动相组成、流速和上样量等因素对分离效果的影响，确定了适宜的一维纯化工艺：流动相：V（正己烷）:V（乙酸乙酯）=20:80；流速80mL/min；检测波长260nm；进样量2mL。再根据组分特点建立正向/亲水二维液相色谱体系对反相各组分进行分离纯化以制备化合物单体。通过二维分离纯化后，用核磁共振谱等波普学技术确定了3种单体化合物的化学结构。（3）通过抗氧化实验和实时细胞抗肿瘤活性检测表明：黄绿蜜环菌子实体水提取物成分具有显著抗氧化功能，丙酮提取物成分具有较好的抗肿瘤活性。该研究填补了黄绿蜜环菌单体化合物成分研究较少的空白,为了更好地了解和应用这一药用真菌阐明其化学成分组成、物质基础及资源的进一步开发利用和相关保健食品、药品的开发奠定了基础。有关黄绿蜜环菌抗氧化和抗肿瘤的分子作用机制有待继续深入研究。70 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发表论文和科研情况说明发表论文和科研情况说明期刊论文[1]马琳,张耀洲,党军.黄绿蜜环菌水提取物的化学成分研究[J].中国药科大学学报.[2]马琳,张耀洲,唐楚沉,响应面法优化秦艽中龙胆苦苷的提取工艺研究[J].中成药[3]XiaoqianZhang,LeiJiang,LinMa,LijuanMei,YaozhouZhang.AhighefficientandaccuratemethodforfindingantioxidantchemicalsfromCapsicumannuumL.Analyticalmethods.申请专利[1]一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法及其应用.发明人:张耀洲;马琳;陶燕铎;党军;崔今松.申请号:CN201410040010.8.[2]黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法及其应用.发明人:张耀洲;党军;陶燕铎;马琳;崔今松.申请号:CN201410040146.9.[3]黄蘑菇标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用.发明人:王启兰,党军,陶燕铎,梅丽娟,史强强,顾朋嫒,马琳,李园园.申请号:201310469542.9.[4]黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用.发明人:王启兰,党军,陶燕铎,梅丽娟,史强强,顾朋嫒,马琳,李园园.申请号:201310469545.2.参与的科研项目[1]黄绿蜜环菌中抗肿瘤药物的开发研究[2]两头尖中抗肿瘤药物的开发研究76 附录部分代表性化合物的1H&13C-NMR谱图113附录部分代表性化合物的H&C-NMR谱图212822181220242526111723191319162827141015357HO46113附图1ErgosterolHNMR、CNMR及其结构113Fig.1ErgosterolHNMR、CNMRanditsstructure77 附录部分代表性化合物的1H&13C-NMR谱图212822181220242526111723191311691422710815357HHOO46113附图23β-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-oneHNMR、CNMR及其结构113Fig.23β-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-oneHNMR、CNMRanditsstructure78 附录部分代表性化合物的1H&13C-NMR谱图212822O18O2024252617231112191319O16227141081553746OO113附图3(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-oneHNMR、CNMR及其结构113Fig.3(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-oneHNMR、CNMRanditsstructure79 致谢致谢研究生三年的生活即将结束，这三年来我受益颇多，各个方面都得到了进步和提升。籍此论文完成之际,我要向一直指导、鼓励、帮助我的人——老师、家人和同学致以最诚挚的谢意。首先我要感谢我的导师张耀洲教授对我的指导与教诲，张老师严谨的治学态度和欲将所做研究奉献于人类大健康事业的决心都深深震撼着我。张老师每次的讲话都深刻而富有哲学，每次与老师的交谈也都是心灵的一次洗礼。老师用他的亲身行动来告诉我们做人要勇敢、有责任心、对于自己的理想要坚持不懈地去追求。感谢张老师对我的实验及论文的悉心指导，我才能够顺利完成学业。在我在今后的人生道路上，只有用更真诚的生活态度和脚踏实地的行动才是对张老师最好的回报。在实验工作中,我特别要感谢中科院西北高原所的党军师兄，是他让我看到一个学者对学术的热爱，是他一步步耐心又细致地引导我的实验。当我在实验中遇到困难时，也是他耐心对我讲解，带给我启发，我才能及时地解决问题。感谢李园园、马红和南开大学的韩朝、李上文师弟们在实验过程中对我的帮助与协助，正是有你们我才能克服在实验中的种种困难。感谢顾朋嫒、李聪聪在细胞实验方面的指导与协助。感谢唐楚沉、张晓倩、王丹、孙嘉宸等同学对我生活和工作的鼓励与支持。感谢天津生物医药联合研究院的舒特俊老师、张剑师兄、盖其静师姐对我的指导与帮助。总之感谢全实验室的兄弟姐妹，我很感谢能在这样一个温暖的大集体度过充实而又丰富的研究生生活，我会永远铭记。感谢在我二十余年求学生涯中给予我精神上和物质上极大帮助的父母与亲人。亲人的关心和支持,让我感觉到家的温暖。他们的理解和支持是我努力工作、学习的不竭动力。最后，谨向参加本论文评阅和答辩委员会的全体专家致以最诚挚的谢意！马琳2015年5月80 天津大学硕壬学位论文Ｖ■■－：扣＿巧■＇１．－；．追和】．执■程’：；片．‘＇：．ｉ．．．．ｉ－．．．．■＇．．．．Ｉ二ｊ．．’！ｊ＇一．；苗＇．．．Ｉ－ｊ＇＇沪ｆ。－＊打Ｔ．；■圓＊２０１２２１３０４９＊