升麻中环菠萝蜜烷型三萜化合物抗肿瘤活性及作用机制研究 82页

，也京甘＾皆聲促，中因聲３刮令獻硕±研究生学位论文北京协和医学院研究生院 学校代码：１００２３学号：Ｓ２０１２００９００３硕±学位论文升麻中巧凌萝蜜統型兰祗化合物抗脾瘤活性及作用机制硏究Ｓｔｕｄｏｎｔ－ｉｅｓｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｙｃｌｏａｒｔａ田ｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＣｉｍｉｃｉｆｕａｏｅｔｉｄａＬ．ｇｆ所院；药用植物研究所姓名：孙海燕指导教师：陈四保研究员导师小组：张冬梅副研究员学科专业：生药学研究方向：天然药物化学论文完成日期：２０１５年５月论文答辩日期：２０１５年６月４号 北京协和医学院硕±研究生毕业论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进斤的研巧工作及取得的研究成果。除了文中将别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研充所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。＇、学位论文作者签名：巧鸿＾签字日期：州年６月ｒ日＞学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解北京协和医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权北京协和医学院可Ｗ将学位论文的全部或部分、、内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）為。／Ｖ学位论文作者签名：外為秦导师签名；签字日期：年月日签字日期：Ｔ年／月日《兴［＾学位论文作者毕业后去向：工作单位卖话；通讯地址邮编：Ｉ 北京协和医学院硕止研巧生毕业论文摘要’传统中药升麻（Ｃ７／ｍｃｚｗａｏｅ化妃！Ｌ／ｇ／．）中含有大量环疲萝蜜院型Ｈ荫类成分，研巧表明该种植物来源的环葱萝蜜烧型Ｈ荫类化合物在体内外对多种肿瘤细胞均具有增殖抑制作用。然而前人的研巧多集中在对该类化合物的分离和结构鉴定上，本论文旨在对从升麻中分离的此类化合物ＳＭ３０６及ＳＭ３０８开展抗肿瘤机制研巧。主要研究结果如下：－１．化合物ＳＭ３０６抑制乳腺癌细胞ＭＣＦ７细胞的增殖活性及机制研究。ＭＴＴ实验及克隆形成实验结果表明Ｍ３０６对ＭＣＦ－７细胞具有显著的增殖抑制作用，一Ｐ－／Ｉ染色分析发现ＳＭ３０６能够诱导ＭＣＦ７细胞周期阻滞于ＧｓＭ期，进步Ｗｃｃ－检测发现蛋白ｙｌｉｎＢｌ和ｐＣＤＫｌＣＴｈｒ）水平下调可能参与ＳＭ３０６诱导的细胞周期阻滞。Ｈｏｅｃｈｓｔ巧２５８染色观察及ＰＩ／ＡｎｎｅｘｉｎＶ双染分析表明ＳＭ３０６一－７ＳＭ３０６作用细胞可Ｗ诱导ＭＣＦ细胞发生调亡。进步研巧发现后，细胞线粒体膜电位降低、Ｃａｓｐａｓｅ９及ＰＡＲＰ被剪切活化，促调亡蛋白Ｂａｘ水平上调而抗调亡蛋白Ｂｃ－ｔｅｒｌ２水平下调，同时磯酸化的Ａｋ（Ｓ４７３和Ｔｈｒ３０８）一－被抑制，提示ＳＭ３０６经线粒体途径诱导ＭＣＦ７细胞调亡。进步Ｗｅｓｔｅｒｎ－－ｂ－ａｆｌｏｔｉｎｇ检测表明，ｐＥＲＫｌ／２及上游主要调控蛋白ｃＲ水平均发生下调，ｐａｆ－提示Ｒ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路参与ＳＭ３０６诱导的ＭＣＦ７细胞调亡。２．化合物ＳＭ３０８诱导肝癌耐药细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自幢流损伤和调亡的机制研巧。首先ＭＴＴ实验表明该化合物对ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞显示出较好的増ｐ殖抑制活性，并且饥饿处理可显著提高其对细胞的增殖抑制作用。采用ＭＤＣ染色观察酸性囊泡，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测自踐相关蛋白如ＬＣ３、Ｂｅｃｌｉｎ一１，Ａｔ５ＳＭ３０８处理后细胞出现了。ｇ的含量变化，结果表明大量自隆体进步采用ＬＣ３Ｔｕｒｎｏｖｅｒ实验对细胞自隨流进行评化并且Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白作为自隨选择性降解底物其水平增加，表明ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自嗤流。采用透射电镜观察细胞亚显微结构，发现大量包裹有未能降解内容物的单层膜结构即自駿溶酶体积累于细胞中－，通过ＤＱＢＳＡ实验检测发现ＳＭ３０８抑制了细胞溶酶体的降解活性。更重要的是，ＳＭ３０８处理细胞Ｉｈ后ＰＩ３ａ和－Ａｋｅｒ４７３ＰＢＫ／Ａｋ激酶Ｐ１１０ｐｔ（Ｓ）水平均明显上调，说明ｔ信号通路被活化。并且我们使用ＰＩ３Ｋ抑制剂ＬＹ２９４００２或者Ａｋｔ的ｓｉＲＮＡ处理细－６２／Ｓ１胞时，ＳＭ３０８导致的ＬＣ３ＩＩ的累积量减少，同时ＰＱＳＴＭ蛋白作为自礎性降解底物其含量也发生降低，即抑制ＰＩ３Ｋ和Ａｋｔ可１＾＾减轻ＳＭ３０８对细ｔ胞自隨流的抑制，表明ＰＤＫ／Ａｋ通路的的活化参与ＳＭ３０８对细胞自暖流的ＩＩ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文抑制过程中。此外，ＰＩ／ＡｎｎｅｘｉｎＶ双染分析及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测等结果表明ＳＭ３０８可能通过内源性线粒体途径诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡。并且与单独使用ＳＭ３０８处理细胞相比，采用饥饿处理或者用Ｒａｐａｍｙｃｉｎ抑制ｍＴＯＲＷ增强细胞自隨启动后，ＳＭ３０８诱导的细胞潤亡明显增强，表明ＳＭ３０８弓Ｉ起的自晚流损伤促进细胞发生调亡。综上所述，本研巧探讨了升麻中环疲萝蜜掠型Ｈ荫类化合物抗肿瘤作用。机制，为此类化合物作为抗癌药物的研巧开发和临床应用提供理论依据关键词：升麻；环疲萝蜜婉型Ｈ跑类化合物；调亡；自隨流；信号通路ＩＩＩ 北京协和医学院硕古研究生毕业论文Ａｂｓｔｒａｃｔ‘Ｐｒｅｖｉｏｕｓｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｈａｖｅｄｅｍｏ打ｓｔｒａｔｅｄ化ａｔＣ７／ｍｃ抑各。成£化ｆａＬ．ｃｏｎｔａｉｎｅｄｐｌｅｎｔｙｏｆｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｗｈｉｃｈｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｖｅｄｔｏｈａｖｅｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ０打ｓｅｖｅｒａｌｃａｎｃｅｒｓ／内ａｎｄｍｖ／护０．Ｈｏｗｅｖｅ。ｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｓｅａｒｃｈｍａｉｎｌｙｆｏｃｕｓｅｄｏ打ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｄｅ打ｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ｒａｔｈｅｒｔ化－ｌｏｔｔｔｕｄｉｅｓｔｔｈｔｔｈａｎｂｉｏｇｉｃａｌａｃｉｖｉｙｓ．ＯｕｒｓｕｄｙａｉｍｅｄｅｘｐｌｏｒｅｅａｎｉｕｍｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄＳＭ３０６ａｎｄＳＭ３０８ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＣｉｍｉｃｉｆｕｇａｏｅｔｉｄａＬ．ｆＴｈｅｗｏｒｋｈａｓｂｅｅｎｄｏｎｅａｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ＴｈｅｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｏｕｎｄＳＭ３０６ｏ打ｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｇｙｐｌｉｎｅｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙａｎｄｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｓａｙ．Ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｓｅｄｓ打ｃａｎｒｏｗｔｈ－－ＳＭ３０６ｈｏｗｉｇｉｆｉｔｇｉｎｈｉｂｉｔｉｏ打ｏ打ＭＧＦ７ｃｅｌｌｓｉ打过ｄｏｓｅａｎｄ－ｔｉｍｅｄｅｐｅ打ｄｅｎｔｍａｉｍｅｒ．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＳＭ３０６ｉｎｄｕｃｅｄａｒｅｍａｒｋａｂｌｅＧ／Ｍａｒｒｅｓｔａｃｃｏｍａｎｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏ打ｏｆｃｃｌｉ打Ｂ１ａｎｄ＾，ｐｙｈｏｓｈｏ－ＣＤＫｌＴｈｒｌ６１ｌｅｖｅｋ．Ｗｅａｌｓｏ妃ｕｎｄｔｈａｔＳＭ３０６ｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｐｐ（）ｍｏｃｈｏ打ｄｒａ－ｍｅｄｅｄａｏｔｏｓ－ｃｓｓｉｔｉｉａｔｐｐｉｓｉｎＭＣＦ７ｃｅｌｌｓｗｈｉｈｗａｕｏｒｔｅｄｂｔｈｅ，ｐｐｙｉｎｃｒｅａｓｅｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓ，ｃｏｌｌａｐｓｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ａｃ－ｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＣａｓａｓｅ９ａｎｄＰＡＲＰａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆＢｃｌ２ａｎｄＢａｘｌｅｖｅｌｓａｓｗｅｌｌａｓｐ，，ｔｈｅ－ｄｅｃｒｅａｓｅｄｌｅｖｅｌｓｏｆＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８ａｎｄＳｅｒ４７３）．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎＳＭ３０６ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆＥＲＫｌ／２ａｎｄＲａｆｓｕｅｓｔｉｎｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｐｐｙ，ｇｇｇｏｆＲａ－ＭＣＦ－ｆＴＭＥＫ／ＥＲＫｓｉｇｎａｌｉｎａｔｈｗａｉｎＳＭ３０６ｉｎｄｕｃｅｄａｏｔｏｓｉｓｉｎ７ｇｐｙｐｐｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄＳＭＢ０８０打ａｕｔｏｐｈａｇｙｌｅｖｅｌｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎＨ巧Ｇ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ｆｉｒｓｔｌｙｗｅｆｏｕｎｄ化ａｔＳＭ３０６ｓｈｏｗｅｄ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏ打ＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｕｎｄｅｒｓｔａｒｖａｔｉｏｎｔＴ－ｃｏｎｄｉｉｏｎ．ｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＬＣ３ｌｅｖｅｌｓａｎｄＭＤＣｓｔａｉｎｅｄａｃｉｄｉｃｖａｃｕｏｌｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＬＣ３Ｔｉｉｍｏｖｅｒａｓｓａｙａｎｄｔｈｅｂｌｏｃｋｉｎｇｏｆｐ６２化ＱＳＴＭｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＳＭ３０８ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ也ｅａｕｔｏｈａｉｃｆｌｕｘｉｎＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｎ化ｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏ。ｏｆｐｇｐａｕｔｏｌｓｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈ泣ｓｉｎｌｅｍｅｍｂｒｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｉ打ｕｎｄｉｅｓｔｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｗａｓｙｇｇｇｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｂＭ．Ｆｕｒｔｈｅｎｎｏｒｅｔｈｅｒｏｔｅｉｎｄｅｒａｄａｔｉｏ打ａｃｔｉｖｉｔｏｆｌｓｏｓｏｍｅｓｙＴＥ，ｐｙｇｙｔｅｄａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ－ｗａｓｉｎｈｉｂｉｂＤＱＢＳＡａｓｓａ．Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｌｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅ，ｙｙｇｙ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰ巧Ｋ／ＡｋｔｓｉｎａｌｌｉｎａｔｈｗａａｆｔｅｒＳＭ３Ｇ８ｔｒｅａｔｍｅｎｔＭｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｇｇｐｙ，ＩＶ 北京协和医学院硕古研究生毕业论文ｒｅＡ－ｔｒｅａｔｉｎｅｎｔｏｆＰ巧Ｋｉｎｈ化ｉｌ；ｏｒｏｒＡｋｔｓｉ艮ＮＫｓｃｕｅｄａａｉｎ巧ＳＭ３０８ｉｎｄｕｃｅｄｐｇａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘｄｉｓｒｕｔｉｏｎｒｏｖｉｄｉｎｏ巧ｉｂｉｌｉｔｆｏｒＰＩ３Ｋ／Ａｋｔａｔｈｗａｐ，ｐｇａｐｙｐｙＩｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｉｎｈ化ｉｔｉｏ打ｏｆａｕｔｏｈａｉｃｆｌｕｘｂｃｏｍｏｕｎｄＳＭ３０８．ｎａｄｄｉｔｉｏｎｐｇｙｐ，ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｃｒｔｅｉｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＳＭ３０８ｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅａｏｐｔｏｓｉｓｉｎＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｐｐ，ｓｔａｒｖａｔｉｏ打ｃｏｎｄｋｉｏ打ｏｒｍＴＯ氏ｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｓｔｒｏｎｈｓｉｏｌｏｉｃａｌｉｎｃｉｕｃｅｒｏｆ，ｇｐｙｇａｕｏｈａｏｂｖ－ｔｐｉｏｕｓｌｅｎｈａｎｃｅｄＳＭ３０８ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌａｏｔｏｓｉ义Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｇｙ，ｙｐｐｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．ｐＩｎｓｕｍｍａｒｙｗｅｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｔｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｃｌｏａｒｔａｎｅ，ｇｙｔｒｉｔｅｒｅｎｏｉｄｓａｎｄｒｏｖｉｄｅｓａｒａｔｉｏｎａｌｅｆｏｒ也ｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｍｅ打ｔａｓｗｅｌｌａｓｐｐｐｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｃｌｏａｒｔａｎｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓａｓ泣ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｅｕｔｉｃａｅｎｔｆｏｒｙｐｇｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ；Ｃ／／ｗ／ｃ／抑ｇｆｌ於ｅｆ／姑Ｌ．；ｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘ；ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ；Ｖ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文主要缩略词对照表＾ｍｍｉｍ＾ｍｍ—＇＇■＇＇‘。＇：＇＊Ｓ：離＊＊Ｖ三吉皆；；也＊＿ｒｗ－去中啤忠－．．％：／相辣韓ＩｌｉａＴ心ＶＡＰＳａｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌ枯化过硫酸敕Ａｌｔｇａｕｔｏｐｈａｇｙｒｅａｔｅｄｇｅｎｅｓ自職和关基因－－Ｂｅｌ２Ｂｃｅｌｌｌｍｈｏｍａ２Ｂ细胞淋四瘤基因２ｙｐＢａｘＢｃ－ＸＢ－２ｌ２ａｓｓａｃｉａｔｅｄｒｏｔｅｉｎｃｌ相义Ｘ蛋白ｐ区ＡＦＡ１ｂａｆｉｌｏｍｃｉｎＡ１Ｌｌｉ弗洛霉素ｙＢＣＡｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ唾晰甲酸ＢＳＡｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ牛血清蛋白Ｃａｓｐａｓｅｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ半｜ｊ光氮酸蛋白酶ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＣＣＣＰｃａｒｂｏｎｌｃａｎｉｄｅ鑛基氛化间氯苯膝ｙｙ－化ｍｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｄｒａｚｏｎｅｙｙＣＤＫｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ周期蛋白依赖性蛋白激酶ＤＭＳＯｄｉｍｅｔｈｌｓｕｌｆｂｘｉｄｅ二甲基亚讽ｙＤＯＸｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ多柔比星，阿霉素ＤＴＴｄｉ比ｉｏ化ｒｅＵｏｌ二硫苏糖醇ＥＣＬｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ化学发光ＥＤＴＡｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｅａｃｉｄ乙二胺四芒酸ＥＲＫｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ细胞外信号调节激酶ＦＢＳｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｍｍ胎牛血清ＦＩＴＣｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ打ｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｇｌｙｃｉｎｅ异硫氛西受焚光素〇ＩＣｓｏ５０／〇ｉｎｈ化ｉｔ：ｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ半数抑制浓度ＨＲＰｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ辣根过氧化物酶－２－ＬＡＭＰｌｙｓｏｓｏｍａｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅ溶酶体膜相关蜜白２ｐｒｏｔｅｉｎ２ＭＤＣｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ单丹（横）醜戊二胺ＭＤ民ｍｕｌｔｉｄｍｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ多药耐药ＭＴＴｔｅｌｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ四甲基偶氮嗤盐ＮＰ－４０ｎｏｎｉｄｅｔＰ４０乙基苯基聚乙二醇ＶＩ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文０Ｄｏｐｌｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ光密度值ｏ－ｍｅｒａ－ＰＡＲＰｌｙＡＤＰｒｉｂｏｓｅｏｌｓｅ多聚ＡＤＰ核糖聚合酶ｐｐｙＰＢＳｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ憐酸盐缓冲液ＰＣＤｐｒｏｇｒｅｓｓｃｅｌｌｄｅａ出程序性细胞死ｔＰＩｒｏｉ出ｕｍｉｏｄｉｄｅ挪化Ｂ比膊ｐｐＰＭＳＦｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ苯甲基横醜氣ＰＶＤＦｏｌｖｉｎｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ聚偏二氣Ｚｉ締ｐｙｙＲＮａｓｅＡｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡ核糖核酸酶ＡＳ．Ｄ．ＳｔａｎｄａｒｄＤｅｖｉａｔｉｏｎ标准差ＳＤＳｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅ巧１ｓａｌｆａｔｅ十二綻基橫酸钢ｓａｉＲＮＡｓｍｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ小分子干扰ＲＮＡ－－－ＴＢＳＴｓ－ｅｒｅｄａｎｅｗｅｅｎｔｒｉｂｕｆｆｓｌｉｔ２０缓冲清洗液＇＇＇ＴＥＭＥＤＮＮ＾ｍｅａｍ－Ｎ，ＮｔｅｔｒａｔｈｌｅｔｈｌｅｎｅｄｉＮＮＮ＾四甲基乙二胺，，ｙｙ，，ｅｉｎＴｒｉｓｔｒｉｓｈｄｒｏｘｍｅｔｈｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＨ籍甲基氛基甲烧（ｙｙｙ）ＴＳＣ１／ＴＳＣ２ｔｕｂｅｒｏｕｓｓｃｌｅｒｏｓｉｓｃｏｍｐｌｅｘ结节性硬化症复合物１／２ＶＩＩ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文目录摘要ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＩＶ主要缩略词对照表ＶＩ一一第章升麻中种新环藻萝蜜挽型三荫类化合物ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ－７细胞调亡及其机制的嚇１１１前言１１１．程序性细胞死亡１．２Ｍｔ１２１１１．．调亡分子机制２Ｃ化ａｓｅ３１．．２ｐ家族－１．２．３Ｂｃｌ２家族与线粒体３１２５３．．４、ＪＮＫ亡４与调ｐ１．３升麻中环液萝蜜烧型Ｈ荫类成分研究现状６１．４研究目的及意义７２实验材料与方法７２７．１实验材料２丄１细胞株７２丄２药品及试剂７２丄３实验仪器９１０２丄４主要试剂配置方法２．２实验方法１２２．２．１２１细胞培养．１３２２．２肿瘤细胞体外增殖抑制实验２．２．３克隆形成实验１３２２４ｅｃｓ３３２５１３．．Ｈｏｈｔ８染色观察２．２．５ＰＩ单染法检测细胞周期１３２－１４．２．６ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ／ＰＩ双染法捡测细胞调亡２．２（１４．７线粒体膜电位ＭＭＰ）的检测２．２．８Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹法１４２．２１７．９统汁学分析３实验结Ｓ１７３．１ＳＭ３０６具有较好的体外抗肿瘤活性１７３．１．１体外细胞毒性筛选１７－３丄２ＳＭ３０６明显抑制ＭＣＦ７细胞的克隆形成能力巧－３．２ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞发生周期阻滞巧－３１ＳＭ３０６Ｆ／．２．诱导ＭＣ７细胞周期阻滞于ＧｓＭ期巧３．２．２ＳＭ３０６对周期相关蛋白水平的影响２０Ｆ－２０３．３ＳＭ３０６诱导ＭＣ７细胞发生调亡Ｓ－３２．３．１Ｍ３０６诱导ＭＣＦ７细胞染色质凝集０３－．３．２ＳＭ３０６引起ＭＣＦ７细胞调亡率増加２１３．３．３ＳＭ３０６对调亡标志性蛋白ＰＡＲＰ的影响２２Ｖ川 北京协和医学院硕±研究生毕业抢文３．４ＳＭ３０６激活线粒体调亡信号通路并抑制Ａｋｔ蛋白的磯酸化２３－３．４２３．１ＳＭ３０６引起ＭＣＦ７细胞线粒体膜电位下降３．４．２ＳＭ３０６对线粒体调亡信号通路相关蛋白水平的影响２３３．５ＳＭ３０６抑制民ａｆｉＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路２４４２５第二章升麻中环疲萝蜜烧型Ｈ稚类化合物ＳＭ３０８巧导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流损伤及调亡的机制研巧巧２９１前言－２９１１ｇ唆１丄１自隨的定义及分类巧１３．１．２自喧相关蛋白０３细胞自幢活性的检测１１丄３．１２自瞻相关信号通路扣１３３７．ｇ嗟损伤与疾病．４１研究目的及意义姑２实验材料与方法巧２．１实验材料３９２丄１细胞株３９２丄２药品及试剂３９２４０．１．３实验仪器２．１．４主要试剂配置方法４０２．２实验方法４１２．４１．２１细胞培养２２．２４１．肿瘤细胞体外增殖抑制实验２ＡＶ－ＴＣ．２．３ｎｎｅｘｉｎＦＩ／ＰＩ双染法检测细胞调亡４１２．２．４ＭＤＣ染色观察４１２．２．５细胞亚显微结构观察４１２．２．６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹法４１２．２．７ｓｉＲＮＡ转染４２２．２．８细胞免疫巧光分析４２２．２．９统计学分析４２３实验结果４２３１Ｓ０８Ｇ２／ＡＤＭ细胞具有显著的增殖抑制作用４２．Ｍ３对Ｈｅｐ３．２ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自嗤流损伤４４３１／ＡＤ４．２．ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２Ｍ细胞出现ＭＤＣ染色呈阳性的酸也裹泡４３．２．２ＳＭ３０８对ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞自喧相关蛋白水平的影响４５ｐ３．２．３ＳＭ３０８ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流４６抑制ｐ３／４７．２．４ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２ＡＤＭ细胞自睡溶酶体中包裹物的降解３．２．５ＳＭ３０８抑制Ｈ巧Ｇ２／ＡＤＭ细胞溶酶体的酶活性４８３．３ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路异常活化与ＳＭ３０８诱导的细胞自蹈流损伤的相关性４９３３．１ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞ＰＢＫ／Ａｋｔ信号通路异常活化４９３．３．２抑制ＰＩ３Ｋ可减捏ＳＭ３０８对ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流的抑制５０ｐＩ３．３．３ＡｋｔｓｉＲＮＡ预处理可减捂ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流的抑串Ｊ５１３５２．４ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞发生调亡ＩＸ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文３１２５２．４．ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ／ＡＤＭ细胞调亡率的影响３２ＳＭ３０８５２．４．对调ｔ：相关蛋白水平的影响３ａｉＨ２ＤＭ．４．３泛Ｃｓａｓｅ抑巧Ｃａｓａｓｅ８ＳＭ３０８ｅＧ／Ａｐｊ剂和ｐ抑制剂对抑制ｐ细胞增殖臟响５３３．５ＳＭ３０８诱导细胞自隨流损伤与其诱导的细胞调亡的相关性５４４５６２４．１ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ／ＡＤＭ细胞自嗟流损伤的探讨扣４．２ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路异常活化与ＳＭ３０８诱导的细胞自隨流损伤的相关性探讨５７４．３ＳＭ３０８诱导细胞自隨流损伤与其诱导的细胞调亡相关性探讨５８第Ｈ章研巧创新点及展望６１１．１研究创新点６１．２６１１研究展望６２附录６９致谢７０：，啤Ｘ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文第一章升麻中一种新环薇萝蜜焼型呈常类化合物ＳＭ３０６ＭＣＦ－７细胞稠ｆ诱导：及其机制的研究１前言１．１程序性细胞死亡程序性细胞死亡的生理功能涉及到形态的发生、姐织器官稳态的维持和有害细胞的清除。程序性的细胞死亡（ＰｒｏｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈＰＣＤ）主要包ｇ，括调亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ），自嗟性细胞死亡（Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｃ如ｄｅａｔｈ）和程序性坏死Ｐ一（ｒｏｇｒａｍｍｅｄｎｅｃｒｏｓｉｓ）。送Ｈ种程序性细胞死亡方式可能联合在起决定肿瘤细胞的生死，调亡和程序性坏死的启动无疑会诱导细胞的死ｔ，而自隧的一把双刃剑发生则是，正常水平的自峰可Ｗ有利于肿瘤细胞括抗调亡，而异Ｗ常的自幢会导致细胞的死亡。１．２调亡Ｐ１调ｔ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）属于Ｉ型ＰＣＤ，于１９７２年被Ｋｅ打等人首次提出，细胞发生调亡时表现出细胞体积的收缩，核质浓聚和片段化，细胞膜泡的产Ｐ１生和细胞间、细胞与基质连接的缺失等形态学的改变。生物化学上的改变主要包括染色体ＤＮＡ被剪切成片断化的核小体，磯脂酌丝氨酸外翻和其他ｙ细胞内容物被特异性酶水解等。１２．１．调ｔ：舒化制调亡是细胞死亡的主要方式，研究表明参与细胞调亡的主要通路有外源６，一一［性通路死亡受体通路（图１．１）巧内源性通路线粒体通路（图１．２）＼ＴＮＦａ、ＦａｓＬ等配体与ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ等细胞膜上的死亡受体结合可化微活外源性通路。Ｆａｓ／ＦａｓＬ复合物可Ｗ通过Ｆａｓ受体的胞内段招募ＦＡＤＤ（ｄｅａｔｈｄｏｍａ－ｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｒｏｔｅｉｎ）ＦＡＤＤ可ＣｓＤＩｇｐ，！＾结合ａｐａｓｅ８形成ＳＣ８［１ｄｅａ－（ｔｈｉｎｄｕｃｉｎｇｓｉｎａｌｌｉｎｃｏｍｌｅｘ）。由于Ｆａｓ受体与配体结合后会聚集，ｇｇｐ使得ＦＡＤＤ／Ｃａｓｐａｓｅ８的局部浓度增高，Ｃａｓｐａｓｅ８发生自我剪切并活化活化的ＣａｓｐａｓｅＳ可Ｗ诱导线粒体内的细胞色素Ｃ释放并活化Ｃａｓｐａｓｅ９，后者１ 北京曲和医学院硕±研究生毕业论文促进Ｃａｓｐａｓｅ３活化。另外活化的Ｃａｓｐａｓｅ８可直接活化Ｃａｓｐａｓｅ３，最终导致细胞调多种因素如物理化学因素的作用可Ｗ使得线粒体膜的通透性－增大，ａｆ１、ａｓａｗ９，使得细胞色素Ｃ从线粒体内释放到胞浆内并与ＡｐＣｐＩＷ形成调亡复合体激活Ｃａｓａｓｅ９，后者激活Ｃａｓａｓｅ３从而促进细胞调亡。ｐｐｆ早节Ｔ＾揣片：－＂蜡馬献廷释说器沪Ｉ种墙月哉但聲化－巧啄马：＞魚马９＠＼Ｌ１／Ｃｅｌ扣＂ｕｙ／夺？＼＾＾ＭｔｍｆａｆｗｗＰｔｏｂｎＯＮＡＦｔ？ｑｍ？ｎＭ？〇ｎＣＮｏｍｉｍＣｏｏｄＴｉＵＢｎＱｊＡｐｏｐｔｏｓｉｓ图１．１死ｔ受体调亡途径（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｉｎ／）ＯｏｆｌｌｈＳｔｉｍｕｌｉ【一ｗｗＦ一ＡＳＩａ詢？￥ｕｔｒｖｖ？Ｆ．ｃ＊〇ｒ？＾．ｈ．ＷＧｉｉ．ｆｗｔＦａｃｌｏｎ．Ｃｔｏｏｎｖａ？ｃ．ｙｙｙ、１切ｉ＼１蠢為鑽＃＊＂ｎ０ｒＡｐｏｐｔｏｓｉｓ？〇ｔｏ＊？Ｓ＊Ｍ＊２ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文图１．２线粒体调亡途径（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ／）１．２．２Ｃａｓａｓｅ家族ｐＣａｓａｓｅ（ｃｓｔｅｉｎｙｌａｓａｒｔａｔｅｓｅｃｉｆｉｃｒｏｔｅｉｎａｓｅ）称为含半化氨酸的天冬ｐｙｐｐｐ氨酸蛋白水解酶，其与真核细胞的调亡密切相关，调亡相关信号通路最终均会激活Ｃａｓａｓｅ３等。各种Ｃａｓｐａｓｅ都富含半脫氨酸，被激活后能够识别至少ｐＵＵ－－（Ｐ４－Ｐ３Ｐ２Ｐ１）。魄蛋白中的四个氨基酸，并在天冬氨酸残基后进行剪切人类的Ｃａｓｐａｓｅ家族包括１４个Ｃａｓｐａｓｅ蛋白，根据Ｃａｓｐａｓｅ功能及其在Ｃａｓｐａｓｅ级联反应中的位置可分为调亡启始者、调亡效应者和参与炎症反应的Ｃａｓｐａｓｅ。前者包括Ｃａｓｐａｓｅ２、Ｃａｓｐａｓｅ８、Ｃａｓｐａｓｅ９和Ｃａｓｐａｓｅ１０；调亡效应者包括Ｃａｓａ说３、Ｃａｓｅ６和Ｃａｓｐａｓｅ７，而Ｃａｓｐａ化１、Ｃａｓｐａｓｅ４、Ｃａｓｐａｓｅｐｐ犯口［］５、Ｃａｓｐａｓｅ１３和Ｃａｓａｓｅ１４等主要参与炎症反应。Ｃａｓｐａｓｅ８和Ｃａｓｐａｓｅ１０ｐ一ａ般由外源性调亡通路激活，而Ｃｓｐａｓｅ９和Ｃａｓｐａｓｅ２由内源性通路激活。ａ一起始者Ｃｓｐａｓｅ的激活方式般为自身活化，如当Ｆａｓ受体受到ＦａｓＬ激活后，ＦＡＤＤ会招募Ｃａｓｐａｓｅ８酶原，后者形成二聚体（Ｃａｓｐａｓｅ８单体没活性）并ｔＷ发生自我剪切活化。当线粒体外膜通透化时，ＣｙｔＣ从线粒体膜间隙中释ｆ－ａｓａｓｅａｓａｓｅ二聚体并自身剪切活放到胞浆并与Ａｐａ１和Ｃｐ９结合，Ｃｐ９形成ＵＷ一化。效应者Ｃａｓｐａｓｅ的活化般称为转活化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），活化的起始者Ｃａｓｐａｓｅ８、Ｃａｓｐａｓｅ９可从活化Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ７；活化的Ｃａｓｐａｓｅ３＂［ａ］可队激活Ｃｓｐａｓｅ６、Ｃａｓｐａｓｅ８和Ｃａｓｐａｓｅ９。１－．２．３Ｂｃｌ２家族与线糕体一－Ｂｃ－－ｌ２家族蛋白分为两类，类称为ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ蛋白，包括Ｂｄ２、－－－－ＸＬ）Ｂｃｌ、Ｂｃｌｗ和Ｍｃｌｌ，送些蛋白包含多个Ｂｄ２同源结构域（ＢＨｄｏｍａｉｎ；一－ＢＢａｄ另类称为ｒｏａｏｔｏｔｉｃ蛋白ｉｄ、、Ｂ化、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、，包括Ｂｉｍ、ｐｐｐ一Ｂｍｆ个Ｂｄ－２同源结构域即ＢＨ３、ＢＮＩＰ３、Ｈｒｋ和Ｍｕｌｅ，这些蛋白包含ｄｏｍａ－ｒ－ａｏｏｃｉｎＢＨ３ｏｎｌｒｏｔｅｉｎ，ｏｔｔｉ白还包括Ｂａｋ和Ｂａｘ，这，称ｙ另外ｐｐｐ蛋ｐＵｑ－两个蛋白含有ＢＨｌ、ＢＨ２和ＢＨ３ｄｏｍａｉｎ。具有ＢＨｄｏｍａｉｎ的Ｂｃｌ２家族１７１［－ｏｎ蛋白可Ｗ形成异源二聚体。ＢＨ３ｌｙ蛋白是线粒体调亡的感应者，－－ｏｎ－ＢＨ３ｌｙ蛋白可Ｗ通过Ｂ拟结构域与Ｂｃｌ２等ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ蛋白结合而抑制ｔＷ后者并直接或间接激活Ｂａｘ或Ｂａｋ，从而诱导细胞调亡。通过转录水平的－ｏｎ调节、亚细胞定位和翻译后修饰等机制，Ｂ战ｌｙ蛋白可Ｗ被多种对细胞有、害的刺激所激活，如ＤＮＡ断裂生长因子缺乏等。例如，当ＤＮＡ发生断裂ＢＨ３－ｏｎ时，ｐ５３被活化并进行核转位，最后通过转录调控的方式上调ｌｙ蛋白３ 化京协和医学院硕七研巧生毕业论文１９［】Ｐｕｍａ－－和Ｎｏｘａ的表这。Ｂｉｄ（ＢＨ３ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｄｅａｔｈａｇｏｍ巧）的激活－－ｓａｓｅ８－是通过Ｃａｐ的剪切形成ｔＢｉｄ，Ｂａｄ（Ｂｃｌ２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅａｔｈｒｏｍｏｔｅｒ）ｐｐ０ｉ则是通过磯酸化而被激活。Ｂａｘ与Ｂａｋ是线粒体调亡途径的效应者Ｊ，因为敲除Ｂａｘ和８化可＾？阻断ｌ一ｔＷ调亡反应。目前Ｂａｘ与Ｂａｋ如何被激活依然是个具有争议的话题。研究者提出了两种可能的激活方式一一，种称为直接激活，另种是间接激活。根１８［］据直接激活模式ｍ－ａ可ａｋ，Ｂｉ、ｔＢｉｄ和Ｐｕｍ直接作用于Ｂａｘ巧Ｂ，导［Ｕ致－Ｂａｄ与ＢａｋＢａｄ与Ｂｉｍ、ｔＢｉｍ不发生同源或异源多聚体，并诱导润ｔ而ｒｏ－ｓｕｒｖａｘｏ－ｓｕｒｖｖａｖａｌ蛋白同，它只能通过抑制ｐｉｌ蛋白而使得Ｂ／Ｂ沁脱离ｐｒｉ３－ｏｎ的束缚。间接激活模式认为，ＢＨｌｙ蛋白激活Ｂａｘ或Ｂａｋ不是通过直接结合Ｂａｘ或Ｂａｋ的方式与多种ｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ，而是通过ｐ蛋白结合并抑制后者Ｂａｋ－ｓｕｒｖ的作用来使得预激活的Ｂａｘ或从Ｐｒｏｉｖａｌ蛋白中释放出来，从而诱导细胞经线粒体途径发生调亡。另外，当Ｂａｘ和Ｂ化处于非激活状态时其Ｎ末端隐藏在蛋白内，而被激活时蛋白会发生构象改变，暴露出蛋白的Ｎ末端Ｐ１１。但是由于Ｂａｘ和Ｂ沁获得预先激活状态的机制还不明确，所ＷＢａｘ与一Ｂａｋ如何调控线粒体调亡途径依然需要进步的研究。线粒体外膜通透化（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＭＯＭＰ）会使得许多促调亡蛋白（如ＣｙｔＣ和Ｓｍａｃ）释放到胞浆中，这是线粒体潤亡途径的重要事件。Ｂａｘ与Ｂａｋ双敲除的细胞在经受星抱菌素、紫外照射、生长因子剥夺、ＤＮＡ损伤和内质网应激时也不会发生线粒体外膜通透化送提示Ｂ沁和Ｂａｘ参与了线粒体外膜通透化的过程。活化的Ｂａｘ和Ｂａｋ会通过产生寡聚物在线粒体外膜形成孔，导致线粒体外膜通透化，使２３［１得处于线粒体内外膜间隙的ＣｙｔＣ和Ｓｍａｃ释放到胞浆，胞浆中的ＣｔＣｙ则可Ｗ促进Ｃａｓｐａｓｅ９的活化，进而诱导细胞调亡。１．２．４ｐ巧、ＪＮＫ与调它ｒｏ－ｓｕｒｖ－当细胞处于应激状态时，ｐ５３可Ｗ结合并抑制ｐｉｖａｌ蛋白即ＢｃｌｘＬ４Ｐ１ｃ－和Ｂｌ２的作用，诱导细胞线粒体外膜通透化和随后的调亡（图１．３）。事Ｐｓｉ－ｉｕｋＪ冰义以化＾和ＢｃｌｘＬＢ实上，Ｃｈ等人发现５３可ｉｌａｘｐｐｌ将６复合物中的ｃ－也ｉｄ与Ｂａｘ置换出来，解除ＢｌｘＬ对它们的抑制。结构学研究和其他生物２４２６—［’１学方法也证实了Ｂｃｌ－ｘＬ和Ｂｄ－２可Ｗ与Ｐ巧结合。Ｂａｋ般会与Ｍｃｌ－ｌ结合并定位于线粒体外膜ｒｏ－ａｏｏ巧也可Ｗ直接结合ｔｔｉｃａｋ，，Ｐｐｐｐ蛋白Ｂ并ｃ－使其脱离Ｍｌｌ的抑制。另外，细胞处于应激时，细胞核内的ｐ５３首先转录－激活Ｐｕｍａ的表化Ｐｕｍ－ａ可ｙ■与ＢｄｘＬ结合而解除胞浆中ＢｃｌｘＬ对ｐ５３的４ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文Ｐ＾束缚，使得ｐ５３可Ｗ激活胞浆中的Ｂａｘ，Ｂａｘ则在线粒体膜上形成孔，促进线粒体通透化。／■＝入Ｍ＾ｙ－图１．３Ｗ参与线粒体（ＢｉｏｃｈｔＢＡｔＢＢＡｐ调亡途径ｉｍｉｃａｅｉｏｈｙｓｉｃｓｃ；ａｐ（＾）Ｂ－ｉｏｅｎｅｒｅｔ２００９１７８７５：１４４２０．）ｉｃｓ４ｇ，，（）ＩＮＫ－（ｃＪｕｎ氨基末端激酶）在死亡受体介导的外源调亡途径和线粒体内源调亡途径中起着重要的作用（图１．４）。ＪＮＫ可Ｗ通过转录激巧某些转录因ｒｏ－ａｏ－子而上调ｐｐｐｔｏｔｉｃ蛋白的表达和通过憐酸化修饰线粒体上的Ｂｄ２家族蛋白而调节其活性，进而激活调亡相关的信号通路。ＪＮＫ被ＭＡＰＫＫ（ＭＫＫ４、Ｐ８］ＭＫＫ７）－憐酸化激活后会转位进入细胞核，并磯酸化和转录激活ｃＪｕｎ。－－磯酸化的ｃＪｕｎ会促使ＡＰ１（ａｃｔｉｔｏｒｒｏｔｅｒｖａｉｎｌ）的形成，后者促进ＴＮＦｃｕｐＦａｓ－Ｌ和Ｂａｋ的转录。有研究认为ＪＮＫ对于中枢神经系统神经元的调亡是需＞要的，过表达核转位相关结构域缺失的ＪＮＫ可＾１抑削营养缺乏导致的神经元１２［＼长春花碱和紫杉醇诱导的乳腺癌细胞调亡也同样依赖于调亡ＪＮＫ的激ＰＷ活和核转位。ＪＮＫ除了通过转录调节来促进细胞调亡外一，它还可Ｗ通过憐酸化调节些Ｂｃ－２ｌ家族成员的活性并调节它们在线粒体上的定位等方式诱导线粒体外ＰｉｓｌＰｉ膜通透化，从而促进细胞发生调亡（图１．４）。Ｋｈａｒｂａｎｄａ和Ｃｈａｕｈａｎ等人的研究表明细胞ＤＮＡ断裂等因素诱发细胞调亡时，ＪＮＫ会转位到线粒体－？－／＾ＪＮＫ上。１和ＪＮＫ２的ＭＥＦ细胞受到ＵＶ诱导调亡时，从细胞线粒体释放到细胞浆的ＣｙｔＣ明显低于正常的ＭＥＦ细胞，这表明细胞调亡时ＣｙｔＣ的释－ａ诱导的Ｈｅ放受到ＪＮＫ的调控。在ＴＮＦｌａ细胞调亡中ＪＮＫ，能够通过非依赖于ＣａｓｐａｓｅＳ的方式剪切Ｂｉｄ，产生２１ＫＤａ片段大小的Ｂｉｄ，后者可Ｗ转５ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文Ｐ３１ｒｏ－ａｏ位到线粒体上，并促进ｐｐｐｔｏｔｉＣ蛋白Ｓｍａｃ从线粒体内释放。ＴＲＡＦ２／ＣＩＡＰ１复合物能抑制Ｃａｓａｓｅ８的活化，而由ＪＮＫ诱导的Ｓｍａｃ释放ｐ能够抑制ＴＲＡＦ２／ＣＩＡＰ１复合物的形成，由此形成的正反馈促进外源调亡信号通路的转导。在ＵＶ诱导ＨＥＫ２９３Ｔ细胞调亡过程中，ＪＮＫ能够对Ｂｉｍ和Ｂｍｆ进行磯酸化修饰，使它们脱离ｄｙｎｅｉｎ／ｍｙｏｓｉｎＶ复合物的抑制，随后磯酸口４Ｂ］化的ｉｍ和Ｂｍｆ能激活Ｂａｘ或Ｂａｋ。，进而促进细胞调亡口ＩＴＴ…－ｔｒ…９＾＾＾ｉｆＣＣｓｃａｄｅＩＡｃｔｖａｔｉｏｎｏａｓｐａｓｅａ琴／＞＾一．ｍ＂倫抑ｄｒｉａＴｒａｎｓａｃｔＷａｔｉｏｎｏｆＫｓ＾９—一／／内％Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ＿Ｐ＊Ｌ■ｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃＧｅｎｅｓ１－．４ＪＮＫ调亡的调节（Ｏｎｃｏｌｏ２００８２７４８图参与：６２４５６２５１．）ｇｙ，，（）１．３升麻中环薇萝蜜烧型兰聰类成分研究现状＇升麻为毛良科植物大Ｓ叶升麻ＣＶ／ｗｃ抑ｇｏＡｅｒａｃ柄於妃？Ｋｏｍ．，兴安升麻’＇＇＇ａ成成！ｗｃｏ［打＞ｗＨｊｉｘｚ．Ｍａｘｉｍ．或升押＂ｃｆｗＪｏｅ侃ｂＬ．的干燥根ｑ於各（）麻打／沪／茎。升麻具有清热解毒，，升举阳气的作用民间多用于治疗风热头痛、咽喉４３１１Ｈ祗及其昔类肿痛、子宫脱垂等症状。升麻中的化学成分主要包括、酪酸－类及其衍生物、色原剛及挥发油成分等，其中９１９环渡萝蜜烧型Ｓ萌类化合，物属于升麻属植物的特征性成分一。本课题组前期从升麻中分离得到系列一９－１９环泼萝蜜院型Ｈ荫类化合物，这类化合物在体外对肿瘤细胞均具有定，的增值抑制作用。前期研究表明该类化合物能选择性地杀伤肿瘤细胞如肝癌细胞、肝癌耐药株细胞及人早幼粒白血病细胞ＨＬ６０等，使肿瘤细胞发生Ｇｃｄｃ２Ｘ－２蛋２／Ｍ期阻滞并抑制及ＣＯ白的表达，从而诱导肿瘤细胞发生调亡房中则－７、年寅等研究发现此类化合物能显著地抑制ＭＣＦ细胞及其耐－药株细胞的增殖活性：ＲＴＰＣ民结果表明ｐ５３及Ｂａｘ蛋白表达水平增高，导ＰＷ致线粒体膜电位降低，Ｃａｓｐａｓｅ级巧反应诱导细胞澗亡。最近该课题组又６ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文从升麻属中分离得到新的环燕萝蜜烧型王荫类化合物，并且利用英光素酶报告基因检测发现其对Ｗｎｔ信号通路具有较强的抑制活性此外，Ｓａｍｕｅｌ义巧Ｕ等对从黑升麻中分离得到的此类化合物进行研究，发现其能通过调节ＰＳ１ＲＡＮＫＬＴＮＦ－ａ。及引导的信号通路抑制破骨细胞生成，从而防止骨质流失１．４研巧目的及意义癌症亦称为恶性肿瘤，已成为威胁全世界人民健康的头号杀手，因此寻找能有效治疗癌症的药物已迫在眉睫。天然产物Ｗ其结构多样性、低毒副作ｔｗｉ用等特点已成为寻找具有潜在治疗癌症药物的主要来源。传统中药（ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅＴＣＭ）在癌症治疗中发挥着巨大作用，许多，从传统中药中分离得到的化合物己发展成为有效地抗癌药物如长春碱和紫杉醇等系列化合物。因而从传统中药中寻找具有抗肿瘤作用的先导化合物己ＩＷ－７成为研巧热点。本课题主要乳腺癌细胞ＭＣＦ细胞为研巧对象，对课题组从升麻中分离得到的新环藻萝蜜糕型三荫类化合物ＳＭ３０６进行体外抗脾瘤活性评价－，重点研究化合物ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞发生调亡的分子机ｉ制，＾ｌ期３０６。＾为ＳＭ发展为抗郭腺癌药物先导化合物提供科学依据２实验材料与方法２．１实验材料２．１．１细胞巧－７）人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）、人乳腺癌细胞（ＭＣＦ、人前列腺癌细胞冲巧）及人宫颈癌细胞（ＨＥＬＡ）均购自ＡＴＣＣ公司，人肝癌耐药型细胞株（ＨｅＧ２／ＡＤＭ）由香港中文大学冯国培正常乳腺上皮细胞ｐ教授赠予，人－（ＭＣＦ１０Ａ）购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。２．１．２药脉及试剂ＳＭ３０６由香港理工大学深圳研究院刘稽落硕±提供（图２．１），其纯度为°９８％ＤＭＳＯ２５ｍＭ－２０，将其溶于并配置成母液浓度为Ｃ保存备用。，于７ 北京协和医学協硕±研究生毕业论文ＯＡＣ－－－－－－）－－芭醜基）图２．１ＳＭ３０６结构（２５０乙醜基７８３ＣｈＭ，去氨升麻醇（２口比喃木糖昔）ＲＰＭＩ－４０ＭＥＭ、胎牛血清（ＦａｔａｌＢｏｖｉｎｅＳ１６、ＤｅｒｕｍＦＢＳ）、膜蛋白酶，－链霉素购于美国Ｇｏ和青ｉｂｃ公司－－－－四甲基偶氮嗤盐（３４５ｄｉｍｅ也ｌａｚｏ２１２５－ｔｔｒａｚｏｌｉｕｍ化ｉｌｄｉｈｅｎｌｅ（，）ｙ，＾）ｐｙｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ）、二甲基亚讽（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ巧２５８＇＇－－－－－－－－－５－ｔ－２（２（４ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）（４ｍｅｈｄｌｉｅｒａｚｉｎｌ）５ｂｉｌＨｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ｝ｐｐｙ，，ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、舰化Ｐ比晚（ｐｒｏｉｄｉｕｍｉｏ出ｄｅＰＩ）、核糖核酸酶Ａｐ：（ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡＲＮａｓｅＡ）、鑛基氛化间氛苯腺（Ｃａｒｂｏｎｌｃｙａｎｉｄｅ，ｙ－－－ｍｃｈ－ｌｏｒｏｈｅｎｌｈｄｒａｚｏｎｅＣＣＣＰ、００ｉｏｎＲ、乙ｐｙｙ）曲拉通Ｘ１（ＴｒｔＸ１００），ｐ琉基－ｍｅｒｃａｍａ公司醇（ｐｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）均购于美国Ｓｉｇ十二烧基赎酸钢（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）购于美国Ａｍｅｒｓｈａｍ公司Ａｎｎ－ｅｘｉｎＶＦＩＴＣ试剂盒购于上海碧吉天生物研究所＇＇乙帰醜胺－过硫酸锭（ａｍｍｏｎｉｕｍｅｒｓｕｌｆａｔｅＡＰＳ）、３０％聚、ＮＮＮＮｐ，，，，四ｉ甲基二乙胺－Ｍａｒｋｅｒ（ＮＮＮｒＮｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｅｔｈｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅＴＥＭＥＤ）、预染，，，ｙｙ，科及考马斯兰染料购于美国Ｂ－Ｒａｄ公司ｉｏ多柔比星（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，Ｄｏｘ）购于美国Ｍｅｒｃｋ公司＇＇－－－－－ＪＣ１（５５６６Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｌｒ３ｔｅｔｒａｅｔｈｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｌｃａｒｂｏｃａｎｉｎｅ，＼，，，３ｙｙｙｌｏ出ｄｅ）购于美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｎｉｎｉｃａｃｉｄ）蛋白定量试剂盒购于美国Ｔｈｅｒｍｏ公司蛋白酶抑制剂购于德国罗氏公司０．４５卿１孔径聚偏二氣乙婦（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜购于美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司安怡脱脂奶粉购于恒天然乳品（广州）有限公司、牛血清蛋白（ｂｕｌｌｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）购于美国Ｐｒｏｌｉａｎｔ公司８ 北京胁和眩学院硕±研究生毕业论文化学发光检测系统电化学发光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）反应液胸于美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司显影液和定影液购于中国柯达股份有限公司其他未注明试剂均购自美国Ｓｉｇｍａ公司ｅｓｔｅｒｎｂｏｔｔ．１Ｗｌｉｎｇ中所用抗体见表２表２．１本研究所用抗体淸单ｃｙｃｌｉｎＢｌＭｏｕｓｅ４１３５ＣＳＴ巧ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＣＤＫｌＭｏｕ化９１１６ＣＳＴＯＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ｉｅｉ－ＣＤＫＴｈｆＲ１ｌａｂｂｉｔ９１４ＣＳＴｅｖｅｒｌＭＡＵＳＡｐ（）巧ｙ，，）Ｃａｓｐａｓｅ９Ｒａｂｂｉｔ９５０２ＣＳＴｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ巧）ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ９Ｒａｂｂｉｔ９５０１ＣＳＴ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）Ｂｃ－ｔ７０ｌ２Ｒａｂｂｉ２８ＣＳＴｅｖｅｒｌＭＡＵＳＡ巧ｙ，，）ＢａｘＲａｂｂｉｔ５０２３ＣＳＴ巧ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＡｋｔＲａｂｂｉｔ４６９１ＣＳＴ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）３〇８－ＡｋＴｈＲａｔ５ＣＳＴｔｒｂｂｉ２９６ｅｖｅｒｌＭＡＵＳＡｐ（）巧ｙ，，）＂３－ＡｋｔＳｅｒＲａｂｂＢｉｔ４０６０ＣＳＴｅｖｅｒｌＭＡＵＳＡｐ（）（ｙ，，）ＰＡＲＰＲａｂｂｉｔ９５４２ＣＳＴ巧ｅｖｅｒｉｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＣｌｅａｖｅｄＰＡＲＰＲａｂｂｉｔ９５４４ＣＳＴ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）－ＥＲＫＲａｂｂＭＡｉｔ４３７０ＣＳＴＢｅｖｅｒｌＵＳＡｐｙ，（，）－ｃ－ＲａｆＲａｂｂＭＡｐｉｔ９４２１ＣＳＴｅｖｅｒｌＵＳＡ巧ｙ，），－ａｃＭＡＰｔｉｎＭｏｕｓｅ４９６７ＣＳＴＢｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ〇，）－Ｇｏａ－－ＨＲＰｔＡｎｔｉｍｏｕｓｅＩＧ７０７６ＣＳＴｅｖｅｒｌＵＳＡｇｙ，巧，ＭＡ）－－－ＭＡＨＲＰＧｏａｔＡｎｔｉｒａｂｂｉｔＩＧ７０７４ＣＳＴＢｅｖｅｒｌＵＳＡｇ（ｙ，，）２．１．３实验仪器电子天平（Ｂｓ２１０ｓ）购于德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司、（５８１０ＲＥ离屯机／５４１７）购于德国ｐｐｅｎｄｏｒｆ公司９ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文蒸汽压力灭菌器购于英国Ａｓｔｄｌ公司超净工作台购于新加坡Ｅｓｃｏ公司Ｃ０２培－－养箱（２４２４２）购于美国ＳｈｅｌＬ化公司倒置显微镜（ＣＫＸ４１）购于日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司酶标仪（ＭＫ３）购于芬兰ＴＥＣＡＮＧｅＮｉｏｓ公司ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ型流式细胞仪购于Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司凝胶电泳和电转系统购于美国Ｂｏ－Ｒａｄｉ公司－加热磯为揽拌器（ＭＳＨ－２０Ａ）、恒温水浴仪（ＷＢ６）、超声波清洗器（ＷＵＣ－Ｄ２２Ｈ）均购于韩国ＤＡＩＨＡＮ公司ｅｃ－超纯水系统（ＤｉｒｔＱ５）购于美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司２．１．４主要试剂巧置方法－１ＲＰＭＩ１６４０培养基）－０１称取１．４ＲＰＭＩ６４０２．０ＮａＨＣ〇９００ｍＬ去ｇ粉末和ｇ３粉末，溶于离子？至水中，攒拌使其充分溶解，调ｐＨ值至７．２７．４，定容１０００ｍＬ。过滤除菌一－链霉素溶液并验菌。加入定量ＦＢＳ及青，使其最终浓度（体积分数）分别为１０％胎牛血清和１％双抗，于４化保存备巧。ｘ２）ｌＰＢＳ溶液（磯酸盐缓冲液）０．称取．２０ＫＣ１、８０ＮａＣＫ０．２０ＫＨＰＯ和１．．％ｇＮａｓＨＰＯ１２化〇，ｇｇｇ２４ｉ９００ｍＬ￣溶于去离子水中，７．２７．４，攒拌使其充分溶解调ｐＨ值至，最终定容至ｌＯＯＯｍＬ。过滤除菌，于４化保存备用。３ＭＴＴ溶液（５ｍ／ｒａＬ））ｇ称取０．５ｇ粉末，溶于９０ｍＬＰＢＳ溶液中，充分攒拌至溶解之后定容至１００ｍＬ４化避光保。，过滤除菌，于存４）Ｄｏｘ溶液一称取定量Ｄｏｘ并溶于ＰＢＳ溶液中，，祸旋充分溶解使其终浓度为２０°－２０Ｃ避光保存ｍＭ。，于３ＣＣＣＰ溶液一称取定量ＣＣＣＰ并溶于甲醇溶液中，，祸旋充分溶解使其终浓度为２０ｍＭ－２０化避光。，于保存６）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染液称取０．０１ｇＨｏｅｃｈｓｔ巧２５８粉末，溶于１ｍＬＤＭＳＯ溶液中，祸旋充分溶°解，使其终浓度为ｌＯｍｇ／ｍＬ，于４Ｃ避光保存。７ＰＩ溶液）１０ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文称取化ＯｌｇＰＩ粉末，溶于ＳｍＬＰＢＳ溶液中，祸旋充分溶解，使其终浓°２ｍ／ｍＬ４Ｃ避光保。度为ｇ，于存８）ＲＮａｓｅＡ溶液称取Ｏ．ＯｌｇＲＮａｓｅＡ粉末，溶于ＩｍＬ去离子水中，锅旋充分溶解，使其°０ｍＬ－终浓度为１ｇ／ｍ，于２０Ｃ保存备用。９ＪＣ－）１溶液称取适量ＪＣ－１紛末并溶于ＤＭＳＯ溶液中，祸旋充分溶解，使其终浓度＊＾为５ｍＭ，于４（：避光保存。１０蛋白酶抑制剂溶液）一ｘ片蛋白酶抑制剂溶于１ｍＬ去离子水并充分溶解（２〇蛋白酶抑制剂），－ｘ０片磯酸酶抑制剂溶于．１ＩｍＬ去离子水并充分溶解（２〇憐酸酶抑制剂），Ｍ苯甲基横醜氣（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ化ｒｉｄｅ，ＰＭＳＦ）溶于异丙醇，０．１Ｍ二硫苏糖醇（ｄｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌＤＴＴ）和０．１Ｍ原讽酸纳溶于去离子水，分别于，°－２０Ｃ保存备用。１１）ＲＩＰＡ裂解液分别称取０ｓ．ａ．石二胺四石酸（ｅ化ｌｅｎｅ．０６Ｔｒｉ碱、００５８５ｇＮＣｌ和００１％ｇｙｇ出ａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｅａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）及０．１７８５ｇ焦磯酸钢溶于９ｍＬ去离子水中，０－．１ｍＬ１００７．５１０并加入曲拉通Ｘ，调班至，定容至ｍＬ，分装后置于°４Ｃ保存备用一，临用前按定比例加入蛋白酶抑制剂。１巧４Ｘ下层胶缓冲液分别称取９０．８ｇｒｉｓ碱和２．０ＳＤＳ粉末，溶于４５０ｍＬ去离子水中，充Ｔｇ分溶解后，调ｐＨ至８乂并定容至５００ｍＬ，于４化保存备用。１３４Ｘ上层胶缓冲液）分别称取３０．３ｇＴｒｉｓ碱和２．０ＳＤＳ粉末，溶于４５０ｍＬ去离子水中，充ｇ°分溶解后，调ｐＨ至６．８并定容至５００ｍＬ，于４Ｃ保存备用。１４１０％ＡＰＳ）称取１．０ｍｇＡＰＳ溶于９ｍＬ去离子水中，充分溶解后定容至１０ｍＬ，配－２０％保存备用成１０％（Ｗ／Ｖ）的溶液，于。１５）口．５％分离胶配置一Ｘ制备：取４下层胶缓冲液１．３５ｍＬｍＬ块胶的量，与２．３聚两稀醜胺和１．４５ｍＬ去离子水混合，再向其中加入１０％ＡＰＳ％．７ｎＬ和ＴＥＭＥＤ６．０阵，漏合均匀后加入制胶板中。１６４．５％分离胶配置）１１ 北京协和医学院硕±巧巧生毕业论文一４Ｘ上制备：取层胶缓冲液０．５ｍＬ０．３ｍＬ聚丙稀醜胺和块胶的量，与１．２ｍＬ去离子水混合ＡＰＳ１５ＴＥＭＥＤ２．５，再向其中加入１０％阵和咕，海合均匀后加入制胶板中。Ｘ１７）５上样缓冲液〇ｒｓ－（、５ｍＬ５、２ｍＬ１０〇分别移取０．６ｍＬＴｉＨＣＬｐＨ６乂１Ｍ）０％甘油／ＳＤＳ－、ＩｍＬｌ％漠酪蓝、０．９ｍＬ去离子水和Ｏ．ＳｒａＬｐ琉基立醇，混合均匀后＂分装，于４Ｃ保存备用。Ｘ１巧１０电泳缓冲液分别称取１４４．０氨基乙酸、３０．３Ｔｒｉｓ碱和１０．０ＳＤＳ粉末，溶于９００ｇｇｇ至‘ｍＬ去１０００ｍＬ４Ｃ保存备用。在离子水中，揽拌至充分溶解，定容，于Ｘ使用前用去离子水稀释成Ｉ电泳缓冲液。１９）电转缓冲液分别称取１８．７６ｇ甘氨酸、３．０３ｇＴｒｉｓ和１．０ｇＳＤＳ粉末，溶于８００ｍＬ去离子水中，加甲醇至ｌＯＯＯｍＬ，室温存放。２０ＴＢＳ－Ｔ－－－清洗液（打ｉｓｂｕｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅＴｗｅｅｎ２０））分别称取８．７６６ｇＮａＣｌ和１．２１１４ｇＴｒｉｓ碱，溶于９００ｍＬ去离子水中，调－￣混匀后定容至Ｈ至７．６０．５０．８ｍＬＴｗｅｅｎ２０ｌＯＯＯｍＬｐ，加入，充分，室温存放。２１）封闭液一根据需要取定量的ＢＳＡ或者脱脂奶粉ＢＳ－Ｔ，溶于事先配好的Ｔ清洗５％Ｗ／Ｖ４化保存备用）。液中，充分溶解得（）的封闭液，于（使用不超过三次２２５％结晶紫染液）称取５结晶紫粉末，溶于％ｍＬ无水乙醇，混匀，定容至１００ｍＬ，室ｇ温存放。２．２实验旅２．２．１细胞培养ＭＣＦ－７ＨｅＣＪ２ＨｅＧ２／ＡＤＭＷ及ＰＣ３细胞１０％，ｐ，ｐ使用含有胎牛血清、％双抗的ＲＰＭ－６４０培０％胎牛血清、１％双抗１Ｉ１养撤ＨＥＬＡ细胞使用含有１的ＤＭＥＭ培养液，均在３７乂、含有５％Ｃ０２的培养箱中进行培养。待细胞生长至７０％至８０％时，吸去培养液并用ＰＢＳ清洗，加入约１ｍＬ０．２５％膜酶进斤消化，待细胞变圆后加培养液终止消化，转移到１５ｍＬ离也管中，１０００ｉｐｍ离也３ｍｉｎ，弃上清并使细胞重悬于培养液中，取适量细胞悬液进行传１２ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文ＨｅＧ２一代培养。在ｐ／ＡＤＭ细胞传代过程中，需要向培养液中加入定量的ＭＧ２ＭＣＦ－Ｄｏｘ．２ＨＡＤＭ１０Ａ细胞的〇ｎ，用于维持ｅ／细胞的抗药性特点。）ｐＷ１培养条件详见参考文献。２．２．２肿瘤细胞体外增殖巧制实验４一Ｘ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（０．８１〇／孔）接种于９６孔板中，并设置对照组与实验沮，每组设置６个复孔，培养２４ｈ后用不同浓度的药物处理细胞。继续培养２４ｈ或４８ｈ后，向每孔中加入浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ溶液，共解育４ｈ后弃掉上述含有ＭＴＴ的培养基，并向每孔中加入１００阵的ＤＭＳＯ溶液故溶解形成的甲琐结晶产物。使用酶标仪检测其在４９０ｎｍ＝波长处的光吸收值。细胞存活率可按下式进行计算：细胞存活率实验组Ｘ平巧ＯＤ值／对照组平均ＯＤ值１００％２．２．３克隆形成姚一Ｘ５．５１〇／孔）接种于６孔板中取对数生长期的细胞，按定细胞数量（２，并设置对照沮与实验组，，培养２４ｈ后用不同浓度的药物处理细胞继续培养４８ｈ后０．２５％膜酶消化细胞，用培养液重悬得单细胞悬液。对单细胞悬，用液计数，并按每孔６００个的细胞浓度将细胞重新接种于６孔板中，继续培养１２天。弃去培养液，用预冷的ＰＢＳ清洗细胞，４％的多聚甲醇固定细胞３０ｍｉｎ后，，使用１％的结晶紫染色５ｍｉｎ对每孔形成的细胞团进行计数２．２．４Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２洗染色观察一５Ｘｌ〇Ｖ？Ｌ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（２．）接种于６孔板中，并设置对照组与实验组，培养２４ｈ后用不同浓度的药物处理细胞。继续培养４８ｈ后，弃掉细胞培养液，用预冷的ＰＢＳ清洗细胞，加入４％的多聚甲酵并°°于４Ｃ固定３０ｍｉｎ，之后加入１０惦／ｍＬ的Ｈｏｅ沈Ｓｔ３３２５８染液，于３７Ｃ恒温培养箱中避光染色１５ｍ虹。用预冷的ＰＢＳ清洗细胞后，在倒置显微镜下观察细胞核形态变化。２．２．５巧单染法检测细胞周期５一Ｘ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（２．５１〇／孔）接种于６孔板中，并设置对照组与实验组，培养２４ｈ后用不同浓度的药物处理细胞。继续培养２４ｈ或４８ｈ后，消化收集细胞，用预冷的ＰＢＳ清洗细胞后于２０００ｒｐｍ离也１３ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文°３ｍｉｎ八％乙醇于４Ｃ固。，用预冷的定细胞过夜于次日重新离也收集细胞，１ＬＲＮａＰＢＳ溶并用终浓度为０．０２ｍｇ／ｍＬＰＩＷ及０．ｍｇ／ｍｓｅＡ的５００咕液重°恳细胞，于３７Ｃ恒温培养箱中避光染色１５ｍｉｎ，３００目筛网过滤上述细胞＝息液之后，用ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ型流式细胞仪检测ＤＮＡ含量（Ｅｘ４８８ｎｍａｎｄＥｍ＝２０６ｎｍ）。采用ＭｕｌｔｃｌｅＡＶ。ｉｃｙ软件对数据进行分析－２．２．６ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测细胞调ｔ：５一Ｘ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（２．５ｌＯ／孔）接种于６孔板中，并设置对照组与实验组。继续，待细胞贴壁后加入不同浓度的药物处理细胞培养３６ｈ后，消化收集细胞，用预冷的ＰＢＳ清洗细胞后于２０００ｒｐｍ离也３－ｍｉｎ有５咕ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ和３ＰＩ的５００战ＰＢＳ溶液重悬细胞，，用含咕°于３７Ｃ恒温培养箱中避光染色１５ｍｉｎ，３００目筛网过滤上述细胞悬液之后，ｅａｓｔｅｅｘ－Ｆ用ＧｕａｖａｙＣｙ型流式细胞仪检测细胞调亡率的变化（ＡｎｎｉｎＶＩＴＣ：＝＝化＝＝Ｅｘ４８８ｎｍａｎｄＥｍ５２５ｎｍＥｘ４８８ｎｍａｎｄＥｍ６２０ｎｍ。巧〇？１〇７．６，）采用软件对数据进行分析。２．２．７线粒体膜电位（ＭＭＰ）的检测一２５Ｘ１〇．５／取对数生长期的细胞，按定细胞数量（？Ｌ）接种于６孔板中，并设置对照组与实验组，待细胞贴壁后加入不同浓度的药物处理细胞。继续２４ＰＢＳ２０００ｍ离屯、培养ｈ后，消化收集细胞，用预冷的清洗细胞后于ｒｐ３°５ＵＪＣ－１的５００阵ＰＢＳ溶液重悬细胞７ｍｉｎ，用终浓度为叫，于３Ｃ恒温培养５ｍｉｎ００目筛网过滤上述细施悬液之后，用Ｇｕａｖａｅａｓｔｅ箱中避光染色１，３ｙＣｙ＝ＪＣ－１Ｅｘ４８８型流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位（ＭＭＰ）的变化（聚合物：ｎｍ＝－＝４Ｅｍ＝Ｓｎｍ７ａｎｄＥｍ５７５ｎｍ，ＪＣ１单体：Ｅｘ８８ｎｍａｎｄｎ）。采用巧ｏｗＪｏ．６软件对数据进行分析。２．２．８Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹法＂细施总蛋白的提取：一６５Ｘ１〇／取对数生长期的细施，按定细胞数量（１．孔）接种于１００ｍｍ培养皿中，并设置对照组与实验组，待细胞贴壁后加入不同浓度的药物处理细胞。待药物作用特定时间后，消化收集细胞于１５ｍＬ离也管中，２０００巧ｍ３ｍｎＰＢＳ清洗细胞至１．５址离也管中于２０００ｒｍ离也ｉ后用预冷的，转移，再ｐ一、３ｍＲＩＰＡ离屯ｉｎ得细胞沉淀。按定比例向其中加入含有蛋白酶抑制剂的１４ 北京协和眩学院硕－上研巧生毕业论文一裂解液，充分混匀，冰浴３０ｍｉｎ并每隔１０ｍｉｎ疯旋次，冰浴完成后于°°４、－Ｃ１４０００巧ｍ离屯１５ｍｉｎ，把上清液转移至新的离也管中，储存于８０Ｃ备，用。２）细胞蛋白样品的定量：按照ＢＣＡ蛋白定量试剂盒的说明，配置不同浓度的标准蛋白溶液如５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ矛日２０ｍｇ／ｍＬ。根据蛋白标准品及样品的数一量，定量的反应液Ａ及反应液Ｂ，使其按５０１取：的比列混合形成工作液，避光备用。在９６孔板中设置标准品组及蛋白样品组，各浓度组均设置３个复孔。在蛋白样品组对应空中先后加入９＿ｉＬ去罔卡水及ｌａＬ蛋白样品，在｜｜ｆｅ准品细■中加入１０ｉＬ蛋白材；准品，之后向各孔中分别加入２００ｉＬ工作液｜｜。于３７吧恒温培养相中脾育３０ｍｉｎ，用酶标仪检测其在５７０ｎｍ波长处的吸光值。依据各标准蛋白溶液的浓度及其对应的吸光值的平均值（表２．２），绘制标准曲线（图２．２）。根据栋准曲线对应的回归方程，计算出样品浓度及上样量为３５ｕｇ时所需的各蛋白样品的体积。表２．２标准蛋白浓度及吸光度值蛋白浓度（ｍｇ／ｍＬ）５１０１５２０平均吸光度（ＯＤ）０．３６２０．５９００．８０７１．０１５－１．５｜ｒ／０－护．５０－．０１１１１１Ｉ０５１０１５２０２５虽白浓度（ｍｇ／ｍＬ）图２．２标准蛋白浓度曲线２＝Ｒ＝９９６０．９ｙ０．０４３５ｘ＋０．１４９２巧聚丙絲醜胺凝胶电泳胶的制备：１５ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文－参照ＢｉｏＲａｄ凝胶模具说明书将玻璃板固定于灌胶模具上。根据需要往玻璃板中间的空隙中灌入浓度为１２．５％或８％的分离胶，灌至玻璃板顶部约１．５ｃｍ处时灌入去离子水封边，待其凝固后（约３０ｍｉｎ）倒掉去离子水并用滤纸吸干，灌入浓度为４．５％的浓缩胶，迅速插入梳子（１０孔），等待其凝固（约３０ｍｉｎ）。样品的制备：６、向０．ｍＬ的离屯管中分别加入经蛋白定量计算所需的蛋白样品量、４咕Ｘ一上样缓冲液（５），再加定量的去离子水补至每个样品的总体积为２０叫１００化高温煮沸约５ｍｉｎ，放置于冰上冷却备用。上样；将上述制备好的样品及蛋白Ｍ一ａｒｋｅｒ按定顺序加入上祥孔中。电泳：设置电泳程序，Ｗ６０Ｖ恒压进行浓缩胶电泳（约３０ｍｉｎ），待漠酪蓝跑至分离胶財，Ｗ１２０Ｖ恒压进行分离胶电泳，直至漠酶蓝跑至分离胶底部时停止电泳。４）湿法转膜：首先根据胶的大小剪裁滤纸和ＰＶＤＦ膜，将滤纸置于湿转缓冲液完全湿润，ＰＶＤＦ膜置于甲醇中活化约３ｒａｉｎ。根据待转移的蛋白分子量大小进行切胶，按照黑底板、海绵、滤纸、凝胶、ＰＶＤＦ膜、滤纸、海绵和白底板的先后顺序放好并枉走中间的气泡。将上述制备完成的的兰明治夹层结构放入事先加入湿转缓冲液的转膜槽中，根据目巧蛋白分子量大小设置转膜电流和转膜时间。巧免疫学检测：将上述转膜完成的ＰＶＤＦ膜置于封闭液（５％脱脂牛奶）中室湿封闭约一－ＩｈＴＢＳＴ清洗液洗膜３１０ｍｉｎ／），封闲完成后用次（次，再放入相应的抗４吃溶液中（１：１０００５％ＢＳＡ解育过夜。于次日取出膜并，稀释）进行解育，ＴＢＳ－Ｔ３（１０用清洗液清洗次ｍｉｎ／次），之后将膜与辣根过氧化物酶标记的相应二抗（－Ｔ（１；２０００，５％ＢＳＡ稀释）共脖育Ｉｈ室温），取出膜并用ＴＢＳ清洗液清洗３次（１０ｍｉｎ／次）。将ＥＣＬ化学发光液（Ａ液和Ｂ液等体积泡合）￣３ｍ与ＰＶＤＦ膜共赔育２ｉｎ，在暗室中进行曝光、显影、定影，对胶片上的条带进行扫描并保存。１６ 北京协和医学院硕±研充生毕业论文２．２．９统计粉析所有实验结果均用ＭｅａｎｉＳ．Ｄ．表示，两独立样本之间的比较采用ｔ检验法（双尾法）进行统计学分析，且所有实验数据均采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０统计软件进行处理，化戶＜化〇５为具有明显统计学差异。３实验结果３．１ＳＭ３０６具有较好的体外抗肿痛棘性３．１．１体外细胞奉巧筛选我们采用ＭＴＴ实验对ＳＭ３０６的体外细胞毒性进行检测。实验结果表明，３０６－７Ｇ２ＳＭ对ＭＣＦ、Ｈｅｐ化、Ｈｅｐ／ＡＤＭ及ＨＥＬＡ细胞均具有明显的增殖抑制作用（表３．１ＳＭ３０６处理细胞２４ｈ后Ｉ３０．３２±０．７９），，其对应的Ｃｓｏ分别为Ｍ、４０７３±１４６Ｍ、３３．６６±３．６４Ｍ４１．２５±０２３Ｍ，ＳＭ３０６Ｈ．．ｉｉ和．处理细ｆ［ｎ胞４８ｈ后，其对应的１（：５〇分别为２７．８１±１．２９ｌＭ、３５．６５±１．１７１、２９．６１±＾畔０．２６＾Ｍ和３５．７３±２．１５ｎＭ。而对于ＰＣ３细胞，ＳＭ３０６则无明显抑制作用，且该化合物对肝癌耐药型钢胞的细胞毒性强于敏感型肝癌细胞，提示其在治疗耐药性邮瘤细胞方面具有较大潜力。同时，其对人正常乳腺上皮细胞－０Ｉ７８ＭＣＦ１Ａ处理４８ｈ的Ｃｓｏ为．６３±３．２６ｌＭ，提示该化合物般够选择性杀＾－呈明显的伤肿瘤细胞。基于ＳＭ３０６对ＭＣＦ７细胞具有较强的杀伤作用，组剂量依赖性３０６Ｆ－７（图３．１）本实验主要针对ＳＭ化合物对ＭＣ细胞的増殖抑制作用及调节机制进行深入研究。－７表３．１ＳＭ３０６对ＭＣＦ、Ｈｑ）Ｇ２、ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ、邸ＬＡ及ＰＣ３细胞的增殖抑制作用Ｔａｂｌｅ３．１ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄＳＭ３０６ｏｎｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＭＣＦ＾ＨｅｐＧ２，ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ，ＨＥＬＡａｎｄＰＣ３ｃｅｌｌｓ．－７Ｈｅ２Ｇ２ＭＣＦｐＧＨｅｐ／ＡＤＭＨｅＬａＰＣ３ａＳＭ３０６２化３０．３２±０．７９４０７３ｄ＝１．４６３３．６６±３．６４４１．２５±０．２３＞５０．（ＩＣｓｏ，ｍＭ）４８ｈ２７．８１±１．２９３５．６５±１．１７２乂６１±０．２６３５．７３＝ｂ２．１５＞５０ｂＤｏｘ（ＩＣｓ〇，片Ｍ）４８ｈ４．０７主１．３３３．８０±０．９５１４３．４７±４．７６４．６２±１．３７５．５２ｉｌ．１９ａ±Ｄ＊〇ａｔａａｒｅＭｅａｎｓＳ．．ｏｆ化ｉｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｅｒｉｍｅｎ化．ｐｂＯｏｘｗａｓｕｓｅｄ过ｓｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．ｐ１７ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文－１２００２４ｈ一－■４８ｈＩ１００Ａｐｒｉ｜ｆ｜ｎＵＩＩＩＩＩＩＩＩ０１０２０２５３０４０５０５ＳＭ３０６ｉｉＭ）Ｄｏｘ（ｆｉＭ）＼３－图．１ＳＭ３０６对乳腺癌细胞ＭＣＦ７细胞的増殖抑制活性。Ｆ－ｉｒｅ３．１．ＧｒｏｗｔｈｔｉｔｏｕｎｄＳＭ３０６ｉｎＭ７ｃｅ．ｇｕｉｎｈ化ｈｏｒｙａｃｉｖｙｏｆｃｏｍＣＦｌｌｓｐＣｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＳＭ３０６１０ｔｏ５０ｊＭｆｏｒ２４ｈ（｜）ａｎｄ４８ｈ，ｔｉｈｅｎｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．Ｄｏｘａｔ５｜ｉＭｗａｓｕｓｅｄａｓａｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．ｐ３丄２ＳＭ３０６明显抑制ＭＣＦ－７细胞的克隆形成能为一ＳＭ３０６－７采用克隆形成实验，进步研究对ＭＣＦ细胞的增殖抑制作用。－７实验结果表明，用不同浓度的ＳＭ３０６处理ＭＣＦ细胞４８ｈ后，其对应形成３．２）的细胞克隆团数明显降低，且呈显著的剂量依赖性（图。ＣＴＬ２０｜ｉＭ－５００１画瞬严ｉ３０１２００－ｒ心１圓ｉ－联？Ｉ．识禱ｂＨ圓Ｓ＿＼口０６３Ｍ３０６对ＭＣＦ－图．２Ｓ７细胞克隆形成能力的影响。１８ 北京协和医学院硕击研究生毕业论文Ｆｒｅ３－ｉ．２ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０６ｏｎ化ｅｃｏｔｎｃａｔＭ７ｇｕｌｏｎｙｆｏｒｍａｉｏｐａｃｉｙｉｎＣＦｃｅｌｌｓ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅ打ｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＳＭ３０６ｆｏｒ４８ｈ，６００ｃｅ－ｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｏ打ｔｏ６ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓｆｏｒａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｃｏｌｏ打ｙｆｏｒｍａｔｉｏｎａｆｔｅｒ１２＊＊＜＊＊＊戶ｄａｙｓ．Ｐ０．０１＜０．００１ｃｏｍａｒｅｄｗＵｈｃｏｎｔｒｏｌ．，ｐ３－．２ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞发生周期阻滞３－．２．１ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞周期阻滞于期用不同浓度的ＳＭ３０６化合物处理ＭＣＦ－７细胞特定时间后，对细胞进行ＰＩ－染色，利用流式细胞仪对ＭＣＦ７细胞周期的变化进行检测。实验结果表明，经ＳＭ３０６处理２４ｈ后的细胞，其Ｇ２／Ｍ期所占的细胞比率呈明显的剂量依赖性增加，最离浓度（３５ｙＭ）处理的细胞出现明显的亚二倍体调亡峰。经ＳＭ３０６处理４８ｈ后，细胞仍存在ＣＶＭ期阻滞的现象但不明显，此时，，其亚二倍体调亡峰所占的细胞比率逐渐增加随着药物处理浓度的增加，提－７ＧＭＭ３０６诱导ＭＣＦ细胞周期阻滞于／期之后，细胞逐渐走向调亡示Ｓ２（图３．３）。兰ＣＴＬ２０３０ｌｉＭ３５ｉＭＤｏｘ＾ＳＵＪｊＪｋｌＭ■？ｒＪＬ？《ｆ＂—■ｎ—■ａｗ？、＊■■■＊－ｓ．Ｔ？Ｉ．－、？—巧—１Ａｆｃｔ一■！，ｒｆｌ＞ＴＷ＾？？Ｗ１１—ＬＬＵＬＬＬｙ＾ｙ．■．．￣－，＊＊—－＂＂—．Ｖ一？＊ＩＳ心ｌ＊ｉ？一．Ｗｉｌ？■■■：？＊Ｊ；ｒｉＩｆＴｌ１ＩＴ：？？＂，ｉ．？ＫＭ＞｜ｆ．ｌＩｉｅＩＭＷ？ＴＰＷｌｇ一—■—＊ＤＮＡＣｏｎｔｅｎｔ３ＭＣＦ－图．３ＳＭ３０６对７细胞周期的影响Ｆｌｕ－ｇｉｒｅ３．３ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０６ｏｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆＭＣＦ７ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｓｅｘｐｏｓｅｄ化ｉｎｄｉｃａｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＳＭ３０６ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｉｘｅｄｗｉｔｈ７５％ｅｔｈａｎｏｌ，ａｖｅｒｎｉ呂ｈｔｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＰＩｆｏｒ３０ｍｉｎａ打ｄｔｈｅｎｆｌｏｗｃｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｓｉｓｗａｓ，，ｙｙｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｏｆｉｌｅｓ．Ｄｏｘａｔ５ｉＭｗａｓｕｓｅｄａｓａｐｐ｜ｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．ｐ１９ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文３．２．２ＳＭ３０６对周期相关蛋白水平的影喃为了探讨ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ－７细胞周期阻滞于Ｇ２／Ｍ期的分子机制，我ｅｓＭＣＦ－们采用Ｗｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ实验对７细胞周期相关蛋白水平进行检测。实验Ｍ３０６ＭＣＦ－７Ｂｌ结果表明，经不同浓度的Ｓ处理细胞后，巧ｃｌｉｎ蛋白水平呈明盈的时间和剂量依赖性降低，，同时我们发现细胞周期蛋白依赖性蛋白激ｃｃｎ－ｅｅｎｄｅｎｔｋ酶１（ｉｎａｅＤＫ１，ｙｌｉｄｐｓ１）水，Ｃ平明显被抑制更重要的是作为ｉｗＣＤＫ／ｃｙｃｌｉｎ复合物活性的主要正调控者，于Ｔｈｒ位点礙酸化的ＣＤＫ１水平也明显发生下调（图３．４）。这些结果提示ＣｌｉｎＢ１ＤＫ１，巧及Ｃ蛋白均参与到ＳＭ３０６诱导的细胞Ｇｓ／Ｍ期阻滞的过程中。３５＾￣￣￣￣￣￣ＳＭ３０６ＣＴＬ２０３０３５４０＾ＭＣＴＬ１２＾＾４８ｈ＇ＣＤＫ勸一一ｍ１？」ｍｍｍｍｍｍｍＩ？Ｉｎ＂ｉ６ｉ－ＣＤ巧？㈱ｐｉａ？Ｉ卿ｗ？一ＩＩＣｙｃｌｉｎＢｌｍｍｍｍｍｍｍｍ？Ｍ？ｍｍｍｍ－ｔａｃｉｎＰ图３．４ＳＭ３０６对周期相关蛋白水平的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．４Ａｈｅｒａｔｉｏｎｓｉｎ化ｅｌｅｖｅｌｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｇｕｌａｈｒｐｒｏｔｅｉｎｓａｆｔｅｒｅｘｏｓｕｒｅ３０６－ｐ化ＳＭｉｎＭＣＦ７ｃｅｌｌｓ．ＡｆｔｅｒＳＭ３０６ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏｔａｌｃｅｌｌｌｓａｔｅｓ，ｙｔＤＫｌ－ｌＴｈｌ６１Ｂ１ｗｅｒｅｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＣＤＫｒａｎｄｃｃｌｉｎ，ｐ（）ｙ—ｌｅｖｅｌｓｕｓｉｎｇｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｃｏｎ吐ｏｌ．ｐＰｇ３ＭＣＦ－．３ＳＭ３０６诱导７细雕发生调亡－３．３．１ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细施染色质纖用不同浓度的ＳＭ３０６ＭＣＦ－７化含物处理细胞特定时间后，对细胞进行Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，通过倒置巧光显微镜观察经ＳＭ３０６处理的细胞核形态，变化。与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比药物处理组的细胞核经染色后呈明显的高亮状态，说明染色质发生凝集，并且在高浓度药物组（３０ｌｉＭ和３５Ｍ）有调亡小体｜ｎ出现（图３．５）。２０ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文曲ｉｌ曲３５ｉＭＤｏｘ｜■ｎｍｎｍ曲窗３－圍．５ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞潤亡的形态学变化Ｆ－ｉｇｕｒｅ３．５ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｈｅｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＣＦ７ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＳＭ３０６．Ａｆ－ＨｏｔｅｒＳＭ３０６化ｅａｔｍｅｎｔｆｂｒ４８ｈＭＣＦ７ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｈｈｅｃｈｓｔ３３２５８．，民ｅｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｉｍａｅｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｅ２０〇ｘｗｉｔｉｈｐｇｐ（）ｔｈｅｒｅｄａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｃｅｌｌｓｈｒｉｎｋａｇｅａｎｄｎｕｃｌｅａｒｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｄｏｘａｔ５［ｉＭｗａｓｕｓｅｄａｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．３Ｍ３０６－．３．２Ｓ弓庵ＭＣＦ７细胞调ｔ：輔加－７ｎｅｘ－对ＭＣＦ细胞进行ＡｎｉｎＶＦＩＴＣ和ＰＩ双染色，利用流式细胞仪检测经不同浓度ＳＭ３０６处理后细胞调ｔ率的变化。检测结果屋示，ＳＭ３０６处理细胞４８ｈ后，随着药物处理浓度的增加细胞总的稠亡率逐渐增加，同时也出一定量的细胞坏死＾现。在最高浓度药物组，早期调亡细胞（Ａｎｎｅｘｉｎ＼Ｐｒ）的比率增加到１８．９％，晚期调丘细胞（ＡｎｎｅｘｉｎＶｉＰｒ）的比率则増加到１８．０％（３６）Ｓ－图．，提示Ｍ３０６能够诱导ＭＣＦ７细胞发生调亡。２１ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文ＩＣＴＬ２０ｌｉＭ３０３５Ｄｏｘ０）￣－－－－＊苗Ｓ４？５７．５Ｔ＊ｌｉ！？Ｆ１Ｌ＂＇，口？．Ｃ１＊１？ｐ］１ｐ１，｜Ｉ］１｜ｔｏｍ？？｝？５１＊％巧化＂Ｍｔｔｆ％ＳｔｎＵ１ｋＩ化７化口＂這ｍ－ｗ—．．：３＝：．．．■，巧，．．■：共ｃＩ？＜０？繼喜少。’茫汇＊■＇＊，－＊－＊＊＇＇＊？＊＊。．（，？＂‘！，１＂ＩＩ，！〇？，ｅ１０＇ＳＩ。；ｃ１６ＳＩＢ！Ｉ？ｏ＊巧，８，＂ＩＵ。？，Ａｎｎ－ｅｘｉｎＶＦＩＴＣｒｅｅｎ打ｕｏｓｃｅｎｃｅｇ３ＭＭ－图．６ＳＭ３０６对：Ｆ７细胞澗亡率的影响＂ｕｒｅ３－Ｆｉｇ．６ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０６０打ａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｏｆＭＣＦ７ｃｅｌｌｓ．ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｏｔｏｓｉｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂＡｎ打ｅｘｉｎＶ７ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｐｐｙｇｆｏ－７ｃｅａｓｓａａｆｔｅｒＳＭ３０６ｔｒｅａｔｍｅｎｔｒ３６ｈ．ＭＣＦｌｈａｒｖｅｙｌｓｗｅｒｅｓｔｅｄａｎｄｓｔａｉｎｅｄ－ｉｔｈＰＩａｎｄＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣｉ１５ｍｎｏｗｃｔｏｍｅｔｒｗ打ｄａｒｋｎｅｓｓｆｏｒｉｆｏｌｌｏｗｅｄｂ，ｙ打ｙｙａｎａｌｓｉｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｙｉｓ．Ｄｏｘａｔ５ａＭｗａｓｕｓｅｄａｓａｏｓｔ．｜ｐ３．３．３ＳＭ３０６对调ｔＰＡＲＰ的影响：标志性蛋白一为了进步验证ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ－７细胞发生调亡ＭＲＰ蛋白，我们对水平进行检测，并甘ＰＡＲＰ蛋白作为细胞调亡核也成员脫天蛋白酶Ｃａｓｐａｓｅ一的切割底物，其剪切活化形式被认为是细胞调亡的个重要指标。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ实验结果显示，经ＳＭ３０６处理之后细胞内的ＰＡＲＰ蛋白水平呈时间及剂量依赖性降低，而其剪切活化形式即ＣｌｅａｖｅｄＰＡＲＰ的量呈时间及剂量依赖性的增高（图３．７）。４３５＾￣￣￣￣￣￣￣￣￣ＳＭ３０６ＣＴＬ２０３０３５４＾ＭＣＴＬ１２２４３６４＾ＰＡＲＰ＊獅ｍｍ４Ｍ必６ＣｅａｖｅｄＰＡＲＰ－一ｍｔｍｒｎｌ３－ａｃｔｉｎ｛图３．７ＳＭ３０６对ＰＡＲＰ蛋白水平的影响Ｆｉｇｉｕｅ３．７ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰＡＲＰａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＳＭ３０６ｉｎ－７Ｍ３０６ＭＣＦｃｅｌｌｓ．ＡｆｔｅｒＳｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｈｅｃｅｌｌｌｓａｔｅｓｗｅｒｅｓｕｂｅＵｅｄｔｏＷｅｓｔｅｒｎ，ｙｊｂ－ｌｏｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎ比ｅｉｎｄｉｃａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｇｇｐｃｏｎｔｒｏｌ．２２ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文３．４ＳＭ３０６激活线粒体调ｔ：信号通路并抑制乂ｋｔ蛋白的磯酸化３－．４．１ＳＭ３０６弓旭ＭＣＦ７细胞线粒体膜电位下降为了探究线粒体相关功能是否参与ＳＭ３０６诱导的ＭＣＦ－７细胞调亡，我－们首先对细胞进行ＪＣ１染色，利用流式细胞仪检测经不同浓度ＳＭ３０６处理后细胞内线粒体膜电位的变化。检测结果显示Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，与，药物处理组中线粒体膜电位较高的细胞所占的比例逐渐降低（从６８．７％到５５．９％），３－并呈现较好的剂量依赖关系（图．８），说明ＳＭ３０６处理使ＭＣＦ７细胞线粒体受到损伤，引起膜电位下降。ＣＴＬ２０ｉＭ３０Ｍ３５ＣＣＣＰＩｉｎ？未ＩＩ１Ｉ＞Ｉ’：二二：：ｒ１气＾＾矛气＇＂Ｉ１＇Ｉ／Ｉ／／，０，＂ｉ－￣＂？Ｉ■Ｗ１。？■■■Ｉ＂？■■Ｉ■？■■■■ＩＩｒ■＂■，■■Ｉ？ＴＴＩ＂■，■■■■Ｔ＂＂…■■■■＜■Ｉ—｜■｜ｆ，、，＂？、，＇、、＇＇，—？■＊＊＊？、々，＊？＊＇＇＞１Ｉｔｉｉ，，ｉｉｉ？？？〇？０，ｏｉ〇？ｒ？，？ｌｏ，？ＩＩ＂？，ｏ〇？〇ｔｒｔｏ）？－ＪＣ１ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ３－图．８ＳＭ３０６对ＭＣＦ７细胞线粒体膜电位的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．８ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０６ｏｎｍｈｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａ打ｅｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｐ－７ｃｅＭＣＦｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｈｈｎｄｃａｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ２４ｈｔｉｉｉｏｎｓｆｏｒｄｅａｃｈｅｄ，ｃｅ－ｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＪＣ１ａｎｄｓｕｂｅｃｔｅｄｔｏｆｌｏｗＧｏｍｅｔｒｉｃａｎａ．ＰｊｅｌｙｓｉｓＣＣＣａｔ２０ｉＭｗａｓｕｓｅｄａｓａｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎ化ｏｌ．｜ｐ３．４．２ＳＭ３０６对线粒体调亡信号通路相关蛋白水平的影响为了检测细胞线粒体受损是否引发Ｃａｓａｓｅ级联反应而诱导细胞发生调ｐ亡，我们对相关蛋白水平进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测，发现Ｃａｓｐａｓｅ９被剪切活化，其活化形式口ｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ９水平呈明显时间、剂量依赖性增加。由于Ｂｃ－ｌ２家族蛋白对线粒体功能起着重要的调控作用ｔ，我们对细胞内抗调蛋白Ｂｃ－２Ｂｌ及促调亡蛋白ａｘ水平也做了检测，发现经ＳＭ３０６处理后促调亡ａｘＭ３０６明显下调了－蛋白Ｂ水平升高，而Ｓ抗调亡蛋白Ｂｄ２水平。同时，磯酸化的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３和Ｔｈｒ３０８）水平也呈时间、剂量依赖性的下调，而Ａｋｔ原形的水平却无明显变化（图３．９）。２３ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文４８ｈ３５Ｍｍ￣￣￣￣￣￣ＳＭ３０６ＣＴＬ２０＾卿ＭＣＴＬ１２２４３６４８ｌｉ？Ｃａｓａ化９ｐＣｌｅａｖｅｄＣａｓａｓｅｍａｍ９ｐＢ－？＾一一—ｃｌ２？由？ＩＢ—＊ａｘＩＨＭｍｍ、ｒ；８＂－〇一－，…一一Ａｋｔ＾舍？一ｐ＾＂４。《■■■？？■■■？■＿ＡｋｔＰＡｋｔ＾ｌｉＰ＾１＾ｍｔｍＩ－ａｃｔｉｏｎＰ图３．９ＳＭ３０６对潤亡相关蛋白水平的影响＊ＭＦｒｅ３．９巨ｔｏｆ３０６ｏｎ６ｏｆａｔｓｓｏｔｉｇｕｆｆｅｃｓＳ化ｌｅｖｅｌｓｐｏｐｏｓｉａｓｃｉａｅｄｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐ－７ｃｅｓ．ｅｒ３０６ｅａｍｅｎｔｔｅｃｅｓｔｅｓｒｅｅｒｍｅｄｗｉｔｈＭＣＦｌｌＡｆｔＳＭｔｒｔｈｌｌｌａｗｅｒｆｏ，ｙｐＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎａｎａｌｓｉｓｕｓｉｎｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉ打ＳｔＣａｓａｓｅ９Ｃｌｅａｖｅｄｇｙｇｐｇｐ，ｓａｅ９Ｂ－２ＢａｘＡｋｔ－－ＣａｐｓｃｌａｎｄＡｋｔＴｈｒ３０８ａｎｄＳｅｒ４７３ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．ａｃｔｉｎ，，，ｐ（），ｐｙＰｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ．３．５ＳＭ３０６制Ｒａｆ抑／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通略越来越多的研究表明，在肿瘤细胞中，民ａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路会发生异常活化，而阻断这条通路可从诱导细胞走向调亡为了研巧ＳＭ３０６是否会参与调控民ａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路，我们对该信号通路相关蛋白水平进行检测。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验结果显示，磯酸化的ＥＲＫ１／２蛋白水平呈时间和剂量依赖性的降低，同时作为ＥＲＫ１／２上游主耍的调控蛋白，磯酸化蛋白－ｃ－Ｒａｆ水平也明显发生下调民ａｆＭ３０６诱／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路参与ｐ，提示Ｓ－７３导的ＭＣＦ细胞调亡（图．１０）。４３５ｎＭ￣＾￣￣￣￣￣￣￣ＳＭ３０６ＣＴＬ２０３０３５４〇７１２２４３６４８ＴｉＭＣＴＬ，？Ｐ－ＥＲＫ巧ｓｍ＾Ｉ義麵ＩＩｔＩＰ－ｃ－Ｒａｆ？９ｉｇ？藝？麵一Ｉ｜－ａｃｔｉｏｎＰ２４ 北京协和医学院硕：ｔ：研究生毕业论文－ＭＥＫ３１图．０ＳＭ３０６对ＭＣＦ７细胞Ｒａｆ／／ＥＲＫ信号通路相关蛋白水平的影响图３．１０ＥｆｅｄｓｏｆＳＭ３０６ｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙａｓｏｃａ－ｓｉｔｅｄｒｏｔｅｉｎｓｉｎＭＣＦ７ｃｅｌｌｓ．ＡｆｔｅｒＳＭ３０６ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｈｅｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅｐ，ｓｕｂｅｃ－ｔｅｄｔ；ｏＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎａｎａｌｓｉｓｕｓｉｎｔｈｅｉｎｄｉｃａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．３ａｃｔｉ打ｗａｓｊｇｙｇ（ｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｃｏｎｔｒｏｌ．ｇ４讨论’２００一１年版中国药典部规定：升麻为毛貴科植物大Ｈ叶升麻０＞ｍｃ诉片ｅｒ幻ｃ／ｅＺ／ｏ化ＸＫｏｍ．，兴安升麻ＣＺ／Ｋ切／＂护Ｉ沈抓Ｗｃｏ（Ｔｕｒｃｚ．）Ｍａｘｉｍ．或升麻Ｇ’ｒａｃ矿Ｍｇａ／ｏｅ化／ａＬ．的干燥根茎。升麻传统上有抗炎、抗镇痛、退热等作用ＷＩ。前期研巧表明升麻干燥根茎中含有大量的环渡萝蜜烧型Ｈ荫类化合物４３。此类化合物为升麻植物的特征性成分，同时己有相关研究表明此类化合ｗｓ一ｗｉ物在体内外对多种肿瘤细胞均展现出定的增殖抑制活性。然而，前人的研究大多集中在对此类化合物的分离和结构鉴定方面，而不是对其生物活一－性进行深入研巧１９环泼萝蜜焼型。本课题姐前期从升麻中分离得到系列９，一ＳＭ３０６Ｈ捣类化合物。对具，其中包括个新化合物有细胞毒作用的这类化一合物结构分析显示Ｃ－３位连接个糖配体，使化合物局部极性增加；连接于Ｄ环的侧链多出现商度氧化Ｗ增加脂溶性，从而有利于化合物透过生物细胞４９ｔｌ膜而发挥细胞毒作用。对ＳＭ３０６化合物的体外细胞毒性筛选发现，该化－７合物对ＭＣＦ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２／ＡＤＭＷ及ＨＥＬＡ细胞均显示出较好的的増一殖抑制活性ＳＭ３０６能对ＭＣＦ－７细胞的増殖，而且克隆形成实验进步表明起到长期抑制作用－。同时，其对人正常乳腺上皮细胞ＭＣＦ１０Ａ处理４８ｈ的ＩＣ５０值明显高于上述肿瘤细胞，提示该化合物具有发展成为抗肿瘤先导化合物的潜力。。大量的参考文献表明，细胞周期失调是人类产生癌症的主要特征肿瘤细胞中多积累了大量的突变，有坚突变使得肿瘤细胞组成性分泌促有丝分裂ＤＰ’Ｗ信号，而对抗有丝分裂信号的应答则产生缺陷，导致细胞无限制的増殖。另外，肿瘤细胞内存在的基因不稳定性１＾＾及染色体不稳定性加重了肿瘤细胞２９Ｐ’１的恶化程度并使其积累了更多可遗传的突变表型。由细胞周期对细胞増殖的调控主要受细胞周期备时相的检验点（浊ｅｃｋｐｏｉｎｔｓ）控制。这些检验点主要对细胞周期中ＤＮＡ的合成及染色体的分离等过程的缺陷进行检测，检验点的激活能够调节细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（ＣＤＫ）的活性，进而诱ｓｔｗ导细胞周期阻滞。细胞周期发生阻滞时，细胞会启动相应的修复系统，从２５ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文而阻止细胞把ＤＮＡ损伤等缺陷传递到子细胞中。其中，ＤＮＡ损伤检验点能一够保护细胞免受来自内源或外源性的具有基因毒试剂的危害，如些化学试剂、离子福射、细胞内物质或者药物代谢的副产品等，这些物质大多引起遗ＰＳ１ＤＮＡ发生传物质发生各种改变。如果由于过度损伤或者与细胞周期检验点或者ＤＮＡ修复机制相关的基因发生突变，则细胞会启动相应的调亡程序而走向死亡，或者ＤＮＡ损伤的大量积累使得细胞获得新的遗传信息而产生致瘤性。在哺乳动物细胞周期调控中，Ｇ２／Ｍ期阻滞的发生较普遍，其中ＣＤＫ１蛋白与Ｂ型周期蛋白形成的复合物活性是引发细胞由细胞分裂间期到分裂ｃｃ－ｃｃ期进程所必须的。ＣＤＫ１优先跟ｙｌｉｎＢ１和ｃｙｃｌｉｎＢ２结合，ＣＤＫｌｙｌｉｎＢ复合物能从多方面发挥作用调控细胞由Ｇ２期向Ｍ期转变，事实上，研究发现在哺乳动物细胞中该复合物能够磯酸化７０多种蛋白质，其作用的底物涉－及到多种生物学过程、ＨＭＧＩ蛋白等）、，如染色质的浓缩（憐酸化组蛋白核膜的解体（憐酸化各种核纤层蛋白、核纤层蛋白Ｂ的受体［＾及核孔复合体口６］等），其它的作用底物包括微管结合蛋白如胞质动力蛋白、ｍａｐ旧等。ＣＤＫＩ的活性可受到Ｗｅｅｌ及Ｍｙｔｌ激酶的调控，Ｗｅｅｌ和Ｍｙｔｌ激酶通过磯酸化ＣＤＫ１上Ｔｙｒｌ５和Ｔｈｒｌ４位点的氨基酸残基而抑制ＣＤＫ１的活性，并通过ｃｄｃ２５Ｃ等磯酸酶使相应位点去磯酸化而被激活－，同时，ＣＤＫ１的Ｔ环上一ｒ１－有保守的苏氨酸孔ｌ６可被磯酸化而对ＣＤＫｌｃｙｃｌｉｎＢ复合物的活性起Ｐ７１ＳＭ正调控作用。我们首先对细胞进斤ＰＩ单染，通过流式细胞仪检测经３０６处理的细胞周期变化，结果表明ＳＭ３０６能够促使Ｇ２／Ｍ期所占的细胞比例呈一剂量依赖性増加。进步通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测发现经ＳＭ３０６处理细胞＾后ｃｙｃｌｉｎＢｌ蛋白水平发生下调，Ｔｈｒ位点憐酸化的ＣＤＫ１水平也明显被抑－ｃｃ／制，说明ＣＤＫｌｙｌｉｎＢ复合物失瓶导致细胞阻滞在Ｇ２Ｍ期，退出了有一丝分裂－。但对于ＣＤＫ１巧ＣｌｉｎＢ复合物的相关底物是否发生失活还需要进步验证。一细胞调亡是种程序性死亡的方式，是细胞用于控制其増殖及针对细胞一ＤＮＡ损伤做出应答的机制之。大量研巧表明，肿瘤细胞调亡通路的激活５８［］ＳＭ３０６能够有效地抑制癌症的发展和恶化。我们的研究发现，经处理细胞后，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色结果表明细胞核具有较明显的调亡特征，包括细胞核染色呈高亮状态、染色质发生凝集并边缘化，高浓度药物处理姐出现调亡－Ｆ小体等现象。同时，我们对药物处理的细胞进行ＡｉｍｅｘｉｎＶＩＴＣ和ＰＩ双染色，通过流式细胞仪检测发现ＳＭ３０６能够引起细胞的早期和晚期调亡率发生显著増加，我们，且呈剂量依赖性。ＰＡＲＰ的剪切是细胞调亡的重要指标２６ 北京协和医学院硕上－研巧生毕业论文通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测ＰＡＲＰ蛋白水平的变化发现ＳＭ３０６能够诱导－ＡＲＰ蛋白－ＭＣＦ７细胞内Ｐ发生剪切活化。上述结果说明ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞发生调亡。细胞在受到内外界因素刺激时会后动调亡程序，与调亡相关的信号通路比较复杂并涉及到多种类型的调节蛋白，调亡机制主要包括内源性和外源性调亡信号通路。外源性调亡信号通路主要由Ｆａｓ死亡受体介导，当死亡刺激信号存在时，Ｆａｓ配体（ＦａｓＬ）与膜上的Ｆａｓ结合形成ＦａｓＬＦａｓ复合物，该复合物的激活促进其下游相关蛋白的活化，其中包括含有与Ｆａｓ相关的死亡结构域蛋白及Ｃａｓｐａｓｅ８和Ｃａｓｐａｓｅ１０等在有些细胞中Ｃａｓｐａｓｅ８的激ａ一活可引起下游Ｃｓｐａｓｅ级联反应而引起细胞死亡，而在另些细胞中Ｃａｓｐａｓｅ８可（＾＾刀割促调立蛋白Ｂｉｔ导致线粒体中细胞色素Ｃ的释放进而诱导细胞ｃ－调亡ｌ２家。内源性调亡信号通路主要由Ｂ族蛋白介导细胞线粒体外膜通透性的改变ａｆ－ａｓａｓｅ，细胞色素Ｃ释放入胞浆与Ａｐ１结合，Ｃｐ９被剪切活化并ｗ一ｔｉａｓａｓｅ－进步激活Ｃｐ３，最终引起细胞调亡。Ｂｃｌ２家族蛋白由促调ｔ：蛋白－－ａｘ－如Ｂ、Ｂａｋ、ＢｃｌＸｓ和Ｂｉｄ等和抗调亡蛋白如Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ等构成，其ｆＷｃ－生物学效应主要依赖Ｂｌ２和Ｂａｘ蛋白之间的平衡。我们前期＾通过线粒体膜电位检测发现ＳＭ３０６能够引起ＭＣＦ－７细胞线粒体膜通透性发生改ｔ蛋白Ｂｃ－Ｃａｓａｓｅ９ｌ２亡蛋白变，ｐ被剪切活化，同时抗调水平下调，促调Ｂａｘ水平升商。房中则等在研巧环燕萝蜜烧型兰巧类化合物抗肿瘤活性时也ＭＣＦ－７细胞发生＊发现该类化合物能诱导线粒体介导的细胞涧亡，田泽等研Ｐｓ，４８ｌ究表明该类化合物能诱导其它类型的肿瘤细胞发生调亡。这些研究与我们的研究结果一致，提示该类化合物对肿瘤细胞的调亡诱导作用与轴胞类型无关。丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Ａｋｔ也称作蛋白激酶Ｂ（ＰＫＢ），主要介导由生长因子、细胞因子及其它细胞外刺激引起的胞内下游信号传导，Ａｋｔ的异常失活或者激活常发现于多种复杂的疾病中如２－型糖尿病及癌症等，其在调节细胞生长、细胞代谢及细胞迁移等方面扮演者重要角色、増殖、血管增生Ａｋｔ蛋白被广泛做为抗癌药物的作用觀点，Ａｋｔ激活能够直接磯酸化促调亡ａｄｅｒ－－蛋白Ｂ的Ｓｉ％位点，该磯酸化位点有利于Ｂａｄ与１４３３蛋白结合使得Ｂａｄ从下游祀蛋白复合物中解离而失活同时Ａｋｔ可通过调节转录因子ＦＯＸＯ和ｐ５３的活性而抑制Ｂａｄ的表达，Ｐ且滞Ｂａｄ介导的细胞调亡。Ａｋｔ激３Ｂｃ－活也可Ｗ磯酸化说Ｋ蛋白，进而调节ｌ２家族蛋白的生物活性，通过抑制Ｃａｓｐａｓｅ９的活化抑制细胞调亡。同时，Ｋａｎｄｅｌ等喃究表明Ａｋｔ能通过直接磯酸化ＤＮＡ损伤检验点相关激酶Ｃｈｋｌ巧ｅｒ２８０）而抑制检验点的功能，２７ 北京协和医学院硕古研究生毕业论文导致即使在ＤＮＡ受损的情况下Ａｋｔ的活化同样能够促使细胞从Ｇ２期向ＭＭｔｌ期转化。基于上述我们对ＳＭ３０６诱导的细胞Ｇ２／Ｍ阻滞及线粒体途径的调亡，我们推测Ａｋｔ蛋白有可能参与ＳＭ３０６诱导的细胞调ｔ：。我们的实验结果显示Ａｋｔ蛋白两种活化形式（Ｔｈｒ３０８和Ｓｅｒ４７３）的水平均发生了下调，而其原形的水平无明显变化。然而，我们的数据只是盈示了ＳＭ３０６处理细一胞能使Ａｋｔ蛋白失活，其失活在ＳＭ３０６诱导的细胞调亡中的作巧还需进步的实验验证和探讨。相关报道表明Ｒａｆ／ＭＥＫ／巨ＲＫ信号通路能够介导细胞外信号从生长因子Ｗ２ｌ受体传递至转录因子Ｊ。ＣｈａｎＦ（＾ｌ控制细胞的生存和增殖ｇ等的研究表明ＲａｆｉＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路相关蛋白尤其是艮ａｆ蛋白能够调节细胞周期相关蛋Ｍｔｌ白如Ｃｄｋｓ、ｃｙｃｌｉｎｓ及ｐ２１Ｃｉｐｌ等的活性，从而调控细胞周期的进程。Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路也－Ｊａｆ可ｌ＾ｌ直接调控细胞调亡，其中Ｒｌ蛋白的活化６７［］在Ａｋｔ依赖的抗调亡效应中扮演者重要角色。Ａｋｔ的活化激活了Ｒａｆ－１并ａｆ－ａｄ使其转位至线粒体膜，线粒体上的Ｒ１通过磯酸化Ｂ，从而抑制了Ｂａｄ６８ｔ的促调亡功能，ＭｉｒｏｓｌａｗＭａｊｅｗｓｋｉ等媛现在Ａｋｔ组成性表达的３２ＤｃＢ晉－髓前体细胞中，通过加入上游抑制剂Ｗ抑制Ｒａｆ１的激活可Ｗ明显促进因生长因子缺失而引起的细胞调ｔ。同时，ＥＲＫ１／２蛋白是细胞促存活信号通路ｆＷ相关蛋白，通过抑制ＥＲＫ１／２的活性有助于细胞走向澗亡。我们的实验结ｆ－果显示ＥＲＫ１／２及Ｒａ１蛋白的憐酸化水平巧下调，提示ＳＭ３０６诱导的细胞民ａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫＲａｆ－发生调亡可能与信号通路相关，而对于１的失活是否与ＳＭ３０６抑制Ａｋｔ的活性有关，及在ＳＭ３０６诱导的细胞洞亡中Ａｋｔ是否参ａｆ一与调控Ｒ／ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路相关蛋白等问题还有待于进步的研巧。综合上述实验结果一，我们从升麻中分离得到种新环藻萝蜜烧型呈跑类化合物ＳＭ３０６－，首次发现ＳＭ３０６能够在体外显著抑制乳腺癌细胞ＭＣＦ７的增殖，并初步阐明了其作用机制。ＳＭ３０６通过调节ｃｙｃＩｉｎＢｌ及ＣＤＫ１的活性阻滞细胞周期于Ｇ２／Ｍ期，线粒体内源性途径及Ａｋｔ的磯酸化介导细胞调亡发生，并首次闻述了ＲａｆｉＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路在ＳＭ３０６诱导的细胞调ｔ：中的作用。这些均为ＳＭ３０６发展成为治疗乳腺癌的先导化合物提供理论依据。２８ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文第二章升麻中环渡萝蜜焼型兰賴类化合物ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自儀流损伤及调ｔ：的机制研巧：１前言１．１白嘘１．１．１自晚的定义及分类口自莖（ａ山ｏｐｈａｇｙ）是指施浆中的物质包裹受损的细胞器等被输送至溶酶体而发生降解的生物学过程。自唆主要包括Ｈ种类型：巨自幢（ｍａｃｒｏａｕｔｏｈａ）、微自帷（ｍｃｒｏａｕｔｏｈａ）ｐｇｙｉｐｇｙ和分子伴侣介导的自隨（ｃｈａ－ｐｅｒｏｎｅｍｅ出ａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙ）。分子伴侣介导的自嗤指胞浆中的蛋白质通过直接跨溶酶体膜而进入溶酶体内一，被溶酶体的酸性水解酶降解，缴＾过程的完成需要伴侣蛋白帮助待降解蛋白去折叠一；微自随则是部分胞浆成分借助溶酶体膜的向内凹陷，从而进入溶酶体腔内完成降解过程；巨自随即常说＂＂的自晚则是研巧最广泛最深入的一种自趨形式。从醇母到哺乳动物细胞，自礎过程都比较保守，该过程均由＾种特殊的细胞器即自嘘体介导一。在自隨诱发阶段，从个小的囊状结构即隔离膜开始，通过隔离膜的延伸一，包围着部分胞浆成分最终形成完整的双层臟吉构，即一形成自帷体（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）；自隨体进行系列的成熟过程，包括与内含体或者溶酶体融合，其中自噓体与内涵体融合形成ａｍｐＭｓｏｍｅ，ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ和ａｍｐｈｉｓｏｍｅ与溶酶体融合形成自睡溶酶体（ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ），一将包裹的物质成分与自嗤体内层膜同被溶酶体中的水解酶水解，水解产生的氨基酸及其他小分子释放入胞浆供机体再利用。具体的自隨过程如图１．１。我们常用自嗟泡（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅｓ）来代指ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ、ａｍｐｈｉｓｏｍｅ和ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ。在电镜下，自喧泡可看成是内含有胞浆成分或者细胞器（如核糖体、内质网和线粒体等）的由膜泡组成的结构，；从形态方面自隨泡可一进步被分成早期／起始型自嘘泡（ｅａｒｌｏｒｉｎｎｉｔｉａｌａｕｔｏａｉｃｖａｃｕｏｌｅｓＡＶｉ）ｙｐｈｇ，和晚期／降解型自隨泡（ｌａｔｅｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅｓ，ＡＶｄ），ＡＶｉ中主要包含形态上完整的胞浆成分或者细胞器，而ＡＶｄ主要包含己经部分降解的胞浆组分。实际上，自喔体及自随体与内含体融合但未开始降解的结构２９ 北京协和医学院硕上‘研究生毕业论文均称为ＡＶｉ，ａｕｔｏｌｓｏｓｏｍｅ和ａｍｈｉＡＶｄ。ｄ而：ｙｐｓｏｍｅ则成为并且有研究表明ＡＶ７２１富含溶酶体相关蛋白及酶成分，而ＡＶｉ中溶酶体相关成分的含量则较低。ＥｎｄｏｓｏｍａｌＭｕ巧ｉｖｅｓｉｃｕｌａｒＬｙｓｏｓｏｍｅｖｅｓｌｉｃｅｓ色ｎｄｏｓｏｍ污。。。＠◎ＰｈａｏｈｏｒｅＡｕｏｈａｓｏｍｅｔｏｓｏｓｏｍｅｇｐｔｐｇｏＡｍｐｈｉｓｏｍｅＡｕｌｙＩｓｏｌａｔｉｏｎＥａｒｌ／ｉｎｉｔ／ｙｉａｌＬａｔｅｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅＡＶｄｍｅｍｂｒａｎｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅＡＶｉＡＶｄ（）（）图１．１哺乳动物细胞中自唆体的形成及成熟过程（Ａｕｔｏｈａ２００５１１：ｐｇｙ，，（）－１１０．）１丄２自礎相关蚕白自隨的执行过程涉及到一系列进化上保守的基因产物，如Ａ巧蛋白，这些蛋白是隔离膜及自嗤体的形成所必需的（关键性蛋１２白及其功能如图．所示）。自唆体的形成过程主要包括两个步驟：成核阶段及隔离膜的延伸阶段。其中，化Ｋ／Ａｔｌｇ激酶复合物，自幢特异性的ＰＤｋ复合物，ＰＩ３Ｐ效应蛋白（）及其相关蛋白是成核阶段所必须的，然而，Ａｔｇｌ２及ＬＣ３／Ａ巧８相关复合物则参与到隔离膜的延伸过程。除此之外，自嗤发生过程中还涉及到自随体与溶酶体融合、溶酶体的酸化、溶酶体的降解等相关蛋白的调节。并且研巧发现，在哺乳动物细胞中大多数Ａ巧蛋白定位在隔离膜上（如ＵＬＫ１／２、Ａｔｇｌ３、ＦＩＰ２００、ＡｔｇｌＯｌ、Ｂｅｃｌｉｎｌ、Ａｔｇｌ４、ＬＣ３、Ａｔｇｌ２Ｗ及Ａｔｇｌ６Ｌｌ等）ｔｎｉ而非完整的自唆体。到目前为止，己知只有微管相关蛋白轻链３（ＬＣ３，酵母中Ａｔｇ８的同源物）存在于自唆体膜上，因此，该蛋白被广泛用做自隨体的标记分子。随着自嗤过程中相关蛋白的发现与鉴定，使得对自嗤的检测及有针对性地调控自礎（如敲除或敲低自嗤相关基因，抑制自喧相关蛋白表达）的发生成为可能。３０ 北京协和医学院硕丄－－硏巧生平业论文Ｎｕｄｅａ＾ｉｏｎＳ鮮ＭａｍｍａｌｉａｎＰｒｏｔｅｉｎＹｅａｓｔＯｉｔｔｄｏＦｅａｔｕｒｅｇＵＬＫ／Ａｌｇｌｏｏｍｐｋａ＾ＵＬＫ１．Ｕ１Ｋ２ＡＳｇｌ柏ｒｔｅｉｎＩｄｎａｓｅ．ｈｏａｔ々ｒ４ａｔｅｄｂ巧Ｔ朋Ｃ，ｐｐ＞ｙＡｉｇ。公９。巧。ｈｏｒｉｅ巧ｔｄｂｎＶＴ（成Ｃ，啤ｙｙＲ－Ｐ２议ｅａｆｏｒＪ＜！ｙ２ＢｎｄＡｉ！Ｓ街出ｌＨｇ３－Ａｉｇｌｄｌｎ；ｅｆａｃＳｓｗｉｃｈＡｔ巧ｇ－Ａ１７．２＆．３１ｉｎｔｅｒａｆ＾ｓｖｔｉｔｈＡ￡１３＾ｇｉ＊Ｃ－伽ＣＯ讯ｐｔｅｘｓ－ｌ齡阳ＰＩ３Ｖｐ６３４Ｖｐ３４Ｐ巧ｋｉｎａｓｅｒｏａｅｐＪＳＯＶｐｓ巧Ｋ＾＾ｆｌｄｙ＆ｅ＜＾１ＶｐａＳＫＶＡｔＢＨ３－ｏｎｆｒｅ＾ｓｆｅｊ．ｋ＾ａｄｓＢｃｌ－２辦ｙｐＡ１４ａ－ｓｅｃ折。ｓＨｎ巧ｌｇｌ４Ａｌｇ巧ｈｉｉｊｇｙｐｒｎｆａ—ｎｅｍａＡｂｖｅｄｎｌ１，＾？偷‘Ｂｉ１ｓ－＾ｓｆｉＡｔｎ：＾ＫｗＡｎｇｉ２ｌｌｅ？ａａｔｉ＾１８ｉａｉ＾ｙＡｒａｎｓｍ？ｍｂｆａｎｅｆ〇ｇ＊ｓｔｆＳＴ＾ｇｐ－１－ｎｎｓＷｉｎｒＫｅｆＰｆｔ４Ａ＾８Ｉ＾＾Ｐｂｄｉｇｉｐ－巧－ｒａＤＦＧＰ１阁户３＾＜ｔｅｄ｜地巧说ｐ－ＴＶＭＰ１ｒａｎｓｍｅｍｒｔｅｉｎｔａｎｅＫ〇￥曰ｏｎｇａｃｏｎＳ化ｐ＊－ｃｏｎ１ｕａｎｓｓｅｍ１巧ＵｂＡｔｇ２＾ｔＡＩ９２Ａｔｉ＾ｎ＾ｉｋｅｃｏ＜巧的ｔｏｊｇｙｇｑ，＾ｇＡ．ｍｅｌ？Ａ７￡ｋｅｅｎｚｇ＾１ｌｉｙＡｌｇ记ＡｌｇｌＯ技嘶８ｅｎｚｙｍｅＡｔｇＳＡｔｇＳＣｏｎｕａｔｅｄｂＡｊｇｙ巧。ＡｔｇｔｆｉＬｌＡｔｇｌ６Ｈｏｍｏｄｖｒｉｉｅｔｒ．ＨｅｒａｃｔｅｗｉｔｈＡｉｇＳ＊２－－－ｔｔ．ＡＰｕｒａｉｔｕＬＣ３／ＡｇＳｃｏｎｕ９ａｉＱｎａｓｆｉｆｎｌＣ３ＧＡＴＥ１６Ｇ＾＾ｉｌＡｉｃｔ８Ｕｂｉｑｎｋｅ．ｃｏｎａｔｅｓｔｏｉｙ（）ｊｇｉ＊－＾ｍｗｎｊｍＡ！ｉｊｉｒｔｉｎｇ４Ａ０Ａｉ於ＬＣ３／Ａｇ３Ｃａｈ＾ｏｔａｓｅ，ｄｅｃｏｇｅｅ＾ａ／Ａ－ｍｅＪ？Ａ＾７￡ａｅｎｚｇ１ＩｋｙｌＷ－化０ｅｎｚｍＡ游ｇ３巧ｙｓｅ２０－图１．２参与哺乳动物自嗟形成的关键性蛋白（Ｃｌｌ１０１４０３：３１３３２６．，，（））１．１．３细胞自嗟活性的检测１丄３．１自儀体数量的撞测：该法是最传统的检测自嗤发生的方法。事实上透射电镜法，哺乳动物的自唆现象最早是在利用透射电镜观察溶酶体的时候被发现的，在超微结构水平上，我们可清楚地看到由双层膜包裹的内含未降解的胞浆组分的自唆一些细胞器结构体，在自隨体中常发现，如线粒体、内质网碎片等。这种方法能够较直接、方便地辨别出自幢体，然而却很难从胞内所有膜性结构中辨别出自嗟溶酶体。自嗟溶酶体源于自隨体与溶酶体的融合，具有双层膜结构，并且内含有处在不同降解阶段的胞浆组分。在早期降解阶段，仍能较容易地辨认出其中的内容物来源于胞浆成分，但如果降解进展得过快，我们就很难辨认出其内容物的来源，更重要的是，透射电镜很难把自嗟溶酶体与细胞内吞产生的膜性结构区分开，因此，透射电镜虽然是观察自随体的有为工具，７４但其在与自隨相关的功能性研巧方面存在着自身的局限性［１巧光显微镜法：哺郭动物细胞自隨相关蛋白ＬＣ３作为自隨体的标志分子，其在体内存在多种形式。初级ＬＣ３合成后经Ａｔｇ４等蛋白在其Ｃ末端处一－－－理后转变为胞浆型ＬＣ３ＩＬＣ３Ｉ３ＩＩ，，会与ＰＥ结合转变为膜型ＬＣ后者专性地与自隨体内外膜结合，并在自隨体与溶酶体融合后被降解而存在较低浓３－度的ＬＣ含量，可ＬＣ３融合蛋白在细胞。因此Ｗ通过巧光显微镜观察畑Ｐ－中的定位来观察自唆体，其中弥散在胞浆中的巧光为ＬＣ３Ｉ型蛋白，而较强３１ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文一－的点状英光为ＬＣ３ＩＩ型蛋白即自嗤体。但是该方法本身也存在定的漏洞；虽然自隨的激活可Ｗ引起点状巧光数目的增加，但即使细胞处在正常状态一。下，细胞内也会出现定数量的点状巧光，即细胞本底水平的自隨ｅｓｔｅｒｎＬＣ－Ｉ生化检测法；最常用的生化检测法是利用Ｗｂｉｏ扣ｎｇ检测３型－向ＬＣ３－ＩＩ型的转变。在聚丙締醜胺凝胶电泳中，虽然ＬＣ３ＩＩ的实际分子量－Ｗｅｓ大于ＬＣ３Ｉ的分子量，但前者的极端亲水性使其移动得较化通过ｔｅｒｎ７５ｔ１－ｂｌｏｔｉｎｇ对ＬＣ３ＩＩ型进行半定量分析即可反映自幢体的数量。然而，研究－表明并不是所有的ＬＣ３－ＣＩＩ型都定位在自噓体膜上，并且有壁Ｌ３ＩＩ型的产生似乎不依赖于自幢的发生，比如Ｍａｔｓｕｉ等在Ｂｅｃｌｉｎ１缺失的胚胎干细胞中、ＲＮＡｉ介导的Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇｌ３、Ａｔｇｌ４及Ｖｐｓ３４等蛋白表达被抑制的细胞中７６’７７ｔ均检测到了ＬＣ３－ｌＩＩ型的表达Ｌ１．３．２自隨流的检测事实上，在任意时刻自隨体的数量仅是用于衡量自嗟体的产生与自礎体－、Ｃ后续与溶酶体融合降解的动态平衡，换言之，蛋白Ｌ３ＩＩ最终在自幢溶酶一－－体中被降解３ＩＩ。因此，ＬＣ３ＩＩ表达的增加并不定表明自幢被激活，ＬＣ表：自随的激活达的增加可Ｗ源于两种相反的情况，自隧的下游反应被阻止（如溶酶体与自隨体的强合被抑制或者自隨溶酶体中内容物的降解受抑制）。因此，有必要采取相应的方法对本底水平的自懂、自唆的诱导激活、自晦上游＂＂及下游反应的抑制等这几种现象进行区分。自幢流（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘ）可用一于监测自唆体形成、自罐性底物至溶酶体的运转及自唆底物的降解等系列动态过程（如图１．３），与检测自隆体的数量相比，自睡流的检测是用于评估Ｓ７９Ｐ’３自隨活性较准确可靠的方法。３２ 北京协和医学院硕上研究生毕业论文Ａ绞巧度粉！ｍｅ公；位々。曲＂电》〇众Ｉ—……＊ｔｍＡＰ？心－！．、ａｒＡ＾－ｒＶ！ｍｉ？一■＾ｒ…ＬＵＸ；知龄‘Ｖｊ孩分化ｃｒｉｏｎｔＢ－ｓａ，獲Ｉ咨ｔｆｖａｔ私次巧《，ａ好巧ｍｃＨｔ）ｆｙｔＭＡｆ＊Ａ４．—￣—學巧＇爱叩冷＾ｒＴ—ｌａＰＷＵＭＳＢＥＲ—－＇？＊、ｍＡＦａｌｆｌｕｘ／：＾ｒ…■建＾？—丫手个下言爭和嚇Ｃ这Ｕ口ｐｒ＆々巧１〇灼巧ｔｕｐｓｔｒＡ巧ｍ寒ｔ々供々右ｓｎ３＊ｔｏｒ＞了沒。＂。。记。？》《＊巧，ｊＨ＃ｉ＊％９味〇来巧？》Ｗ＇ＧｍｂＷｈｆｊｊＡＸＦ＿＃ＩＭＡＰＩＵＸｉＩＩＬ４：＾．４：０忌ＬｔｐｐｒｅＡｓｌｏｎ公１ｄ包ｗｎ色ｉｊｎｅＡｍＳｔ々吟备ｍ公＊＞ｍ９ｎ？．ｊｒｔ〇ｐ＾＞ａｔ留ｏｉｉ！ｙｓｏ？ｏｆ（々ｇｍｏｗ知ｏＩＭＡ￥？Ａｉ．成ＸＶ．’￣＂￣？、：ＳＨＪｉ方忌ｒ［｜＇—■■－－Ｊ舍‘＃－ｉ子ＩｔＩ４Ｉ’妨。＇：－一．，妹￣。佛．－＾￣。础？町＊。（投ｊｊｇｙ９＆ｕＴｗＴｘ邮ａｃ＾ｃ削松ｉｈ＊＞＾、；０，秘ＡＰＡ＊ｇ、＾ａ；＾ＡＣ成。ｙ＊—ｊｊ－１３Ｃｅｌｌ２０１０１４０３：３１３３２６图．自唆的发生过程（。，，（）ＬＣ３翻转实验检测ＬＣ３的翻转是目前用于检测自嗤流的主要方法，３－该实验方法主要依据ＬＣＩＩ蛋白在自唆溶酶体中的降解来判断自隨流的强度。首先使用溶酶体功能抑制剂（如抑制溶酶体酸化或抑制自隨体与溶酶体的融合：氯化较、氯哇、己佛罗霉素等，抑制溶酶体酶的活性如Ｅ６４ｄ及ｅｔｔ－－ｐｐｓａｉｎＡ），ＬＣ３ＩＩ的降解则受到抑制，导致ＬＣ３ＩＩ的大量聚集。在存在和－不存在溶酶体功能抑制剂预处理的情况下，通过比较各处理样品之间ＬＣ３ＩＩ表达量的差异，，即可判断各处理样品自唆流的强度。例如在非饥饿状态下３－ＩＩ经氯哇预处理的细胞与未经其预处理的细胞相比，其ＬＣ水平是増加的，－然而，在饥饿状态下ＬＣ３ＩＩ水平増加的强度要比非饥饿状态下大很多，这说明在饥饿状态下，细胞的自晦流水平是増强的－ＩＩ检测ＬＣ３及选择幢底物的降解在自曠被激活的巧期阶段，细胞形－成大量的自喔体，因而ＬＣ３ＩＩ水平是增加的，但随着自隨激活的延长（如饥２－，３ＩＩ饿超过个小时）自喔体与溶酶体发生融合，自隨体内外膜上的ＬＣ被溶酶体酶降解导致ＬＣ３－ＩＩ。比如蛋白水平降低，在长期处于饥饿状态的细胞－内，通过流式细胞仪检测ＧＦＰ信号发现胞浆中Ｗ及细胞核中的ＧＦＰＬＣ３信号均明显降低。因此可通过蛋白免疫印迹分析或者流式细胞术分析对细胞中的ＬＣ３水平进行相对定量，依据ＬＣ３水平与自唆流水平负相关进而判断自嗤流的强度。此外，通过检测其它自嗟相关底物的水平也常用于检测自嗤流，６２。６２ｐ蛋白是其中研究最多的底物蛋白在自晦发生过程中，ｐ蛋白通过直３３ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文接结合ＬＣ３被选择性地包裹进入自隆体，最终被有效地降解。因此，细胞内ｐ６２总蛋白水平与自巡流水平负相关，该检测方法的应用似乎更具有普遍性，但是对于Ｐ拍蛋白是否只通过自晦途径降解－，或者部分通过泛素蛋白酶体降一８３’心３解途径完成降解，还需要进步研究。检测ｍＲＦＰ－ＧＦＰ－ＬＣ３转运及降解该检测方法主要依据溶酶体能使标签蛋白ＧＦＰ－ＬＣ３中ＧＦＰ的巧光信号发生巧灭。ＧＦＰ可在细胞中稳定表达并对溶酶体酶有一定抗性，但是溶酶体中较低的ｐＨ环境能使其巧光信号发生一ＦＰ－ＬＣ３至溶酶体的转运巧灭而较难用于追踪Ｇ。而另种红色巧光蛋白如ＲＦＰ－、ｍＣｈｅｒｒｍＲＦＰＬＣ３ｙ在溶酶体酸性环境下能发出较稳定的羡光，因此融合蛋白的紅色巧光信号可Ｗ较容易地在自隨溶酶体中检测到。利用这两种－－巧光蛋白的不同特性，Ｋｉｍｕｒａ等设计了含有ｍＲＦＰＧＦＰＬＣ３串联结构的质粒，通过转染这种质粒，自晚体因其中的ｍＲＦＰ及ＧＦＰ都比较稳定而发出黄色巧光，自噓溶酶体则因其ＧＦＰ会被巧灭而发出红色焚光。因此，如果细胞自隨流增强，点状的黄色及红色英光数量应同时增加，如果自随体与溶酶体的融合受阻，则只有黄色巧光的点数増加，依次来判断自嗤流强度的变化－８４８６［］〇ＧＦＰ－ＬＣ３裂解实验虽然在溶酶体的酸性环境中，ＧＦＰ的蒙光信号会巧灭－，但通过蛋白免疫印迹法仍能将测到ＧＦＰ蛋白，ＧＦＰＬＣ３融合蛋白随自帷体转运至溶酶体后会被部分降解而产生游离的ＧＦＰ片段，ＧＦＰ片段较融合蛋白更能稳定地存在于自隨溶酶体中。因此ｉ，可利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｎｇ技术及抗ＧＦＰ蛋白的抗体对自幢溶酶体中游离的ＧＦＰ片段进行检测，从而间接地反映细胞自隨流的强度。然而，现阶段该方法主要用于对醇母细胞（表达ＧＦＰ－Ａｔｇ８融合蛋白）自旌流进行检测，在哺现动物细胞上的应用还受到８８一７定限制ｔ’Ｗ。检测长寿命蛋白的降解通过检测长寿命蛋白质的降解来检测自隨流的方法于１９７０年发展而来，是最传统的检测自随流的方法。首先，使细胞处于含有同位素标记通常为１４Ｃ或者３Ｈ标记的鄉氨酸或亮氨酸的氨基酸（）中持续培养（数小时至几天），用Ｗ标记细胞内的长寿命蛋白，接着用不含同位素标记的氨基酸脖育细胞一段时间Ｗ清洗掉被放射性同位素标记的短寿命蛋白质，这些短寿命蛋白质主要通过蛋白酶体降解。用自隨激活剂处理细胞后，通过检测细胞上清液中释放的己降解蛋白质的放射活性，来反应细胞自尴流活性。为了确保检测到的已降解蛋白来源于自嘘性的降解，通常在－－ＭＡ有无自唆抑制剂（如３ｍｅ化ｌａｄｅｎｉｎｅ３）存在的前，比较ｙ，提下样品之间其蛋白降解率的差异，用Ｗ评价由自隆引起的长寿命蛋白的降解。３４ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文１２．自嗟相关信号通路从酵母到哺乳动物细胞，ｍＴＯＲ蛋白（Ｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ）是典型的自嗦负调控因子。饥饿条件下，ｍＴＯ民的活性被抑制，激活了自幢相关蛋白如Ａｔｇｌ３、ＵＬＫ１及ＵＬＫ２的表达，从而诱导自唆的发生。针对通过ｍＴＯ艮介导的细胞自隆相关信号通路，现总结如下：膜岛素样生长因子与膜岛素样生长因子受体（ＩＧＨ巧结合是调节一ｍＴＯＲ活性最重要的信号通路之。相关信号通过受体本身的酪氨酸激酶活Ｉ性激活下游效应蛋白，如膀岛素受体底物ＲＳ１及化Ｓ２，后者通过激活Ａｋｔ抑制ＴＳＣ１／ＴＳ巧复合物的活化ＴＳＣ１／ＴＳＣ２复合物又对ｍＴＯ民蛋白起到负性调控的作用。通过这种方式，膜岛素样生长因子受体ＩＧＦ１ｍＴＯ民（巧激活而抑制自噓的发生。相反，当外界营养不充足时，该通路可诱导自随的发生。抑癌基因ｐ５３在多种癌症中均存在突变现象，其可Ｗ通过ｍＴＯＲ相关信号通路正性或负性调节自礎的活性。外界刺激因素能够激活胞内ｐ５３的表达并增加其稳定性，ｐ５３通过激活ＡＭＰＫ诱导自尴，同时可上调蛋白ＰＴＥＮ（磯酸酶及张力蛋白同源蛋白）的表达，ＰＴＥＮ通过负性调节Ａｋｔ及ＴＳＣＩ一ｅｍ的活性而激活自随。另方面，Ｆｌｉｎｇ等研究表明通过遗传或化学手段抑９９０＾，制ｐ５３的活性也可１＾｜诱导细胞发生自懂１在极端饥饿的条件下，ＧＴＰａｓｅ通过影响ｍＴＯ民在溶酶体中的定位起到调节ｍＴＯＲ活性的作用。营养缺乏时，ｍＴＯＲＣｌ复合物与溶酶体分离，使得ｍＴＯＲ活性受到抑制，但是ｍＴＯＲＣｌ复合物仍与溶酶体保持１系，紧密围绕在溶酶体周围的微管组织中也（ＭＴＯＣ）促使溶酶体向自隨体方向移动，并增强自跑体与溶酶体的融合；当细胞重新获得营养时，溶酶体及相关联的ｍＴＯＲＣ一ｌ复合物移向细胞膜，这过程是实现ｒａＴＯＲＣｌ复合物的激活进而ＰＵ降低自隨体的形成所必须的步骤。在饥饿条件下，细胞中腺昔单磯酸激活蛋白激酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｈｏｈａ－ｍｏｎｏｐｓｐｔｅａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡＭＰＫ）同样可Ｗ通过负性调节，ｍＴＯＲＣｌ复合物的活性诱导自晦的发生。细胞处于饥饿状态时，ＡＭＰ／ＡＴＰ的比值升高促使ＬＫＢ１激活胞内腺巧单憐酸激活蛋白激酶活性，进而调控ＰＳｌｍＴＯＲＣｌ复合物的活性。同时，有报道表明转录生长因子Ｐ激活激酶－－（－ＡＭＰＫｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅ１ＴＡＫ１）也酶ｇｇ，属于激３一［９］的种。但对于ＡＭＰＫ的激巧是否足Ｗ激活细胞自隨，或者还需要独立一点目前还不清楚于该信号之外的其它信号参与激活自尴，这。ｍＴＯＲ非依赖的相关信号通路总结如下：３５ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文肌醇单磯酸酶（ＩＭＰａｓｅ）介导ｍＴＯＲ非依赖的自唆信号通路，肌醇单憐酸酶能催化膜上的ＰＩＰ２成分而产生ＩＰ３。ＩＰ３作为第二信使可Ｗ负性调控自隆的活性，具体机制可｜＾＾概括为：首先，１口３与內质网膜上的１？３受体结合，促使巧离子从内质网腔中释放入胞浆，胞浆中的巧离子激活Ｃａｌｐａｉｎ家族蛋白酶的活性，后者不仅可Ｗ直接抑制自嗤，还可Ｗ通过切割并活化Ｇ蛋白中而间接地抑制自礎的发生一的Ｇｓａ，产生大量的Ｃａｍｐ，从。临床上些治巧神经性疾病的药物如氯化裡ＩＰ３的产、卡马西平及丙戊酸盐等即是通过抑制生而促进自隨的发生，达到治疗该类疾病的目的。同时，Ｖｉｃｅｎｃｉｏ等研究表ＩＰ３＞Ｂｅｃｎ１明受体也可＾１与ｌｉ结合，通过抑制自唆体的形成阶段而抑制自唾的发生。然而，ＩＰ３也可＾＾通过其它机制激活自赌，如胞浆内较低的ＩＰ３水平降低了巧离子由内质网腔流入线粒体中的量一，这在定程度上损伤了线粒体的呼吸作用，使线粒体产能作用受到影响，从而通过ＡＭＰＫ途径介导线粒体自唆的发生ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１据报道在哺现动物细胞中，Ｗ及胞浆中巧离子浓度的增加均参与到由内质网应激（ＥＲｓｔｒｅｓｓ）引起的自隨过程中。胞浆中大量错误折叠蛋白的聚集Ｗ及蛋白酶体活性的降低使得内质网腔中大量积累错误折藝及未折叠的蛋白，最终引起内质网应激反应。Ｋｏｕｒｏｋｕ等研究表明，在鼠胚胎肿瘤细胞及鼠胚胎成纤维细胞中，内质网应激反应能够上调Ａｔｇｌ２蛋白的－表这３ＩＬＣ３－ＩＩＬＣ３、促进ＬＣ型向型的转换及增加细胞中呈阳性的囊膜的数量，从而诱导自晚发生。Ｋｏｕｒｏｋｕ等通过分子生物学手段下调ＰＥＲＫ的表达Ｗ及对ＰＥＲＫ下游範蛋白ｅＩＦ２ａ的磯酸化位点进行突变，观察其鼠细胞内自隨水平的变化－ｅａ，结果显示ＰＥＲＫＩＦ２信号通路是细胞自随过程中Ａｔｇｌ２蛋白的表达上调及ＬＣ３的转换所必须的－ｅＦ２ａ信号通路把，即ＰＥＲＫＩ内质网一应激与自幢联系在起。与上述结果相反，Ｉｍａｉｚｕｍｉ及其合作者的研究结果－－显示ＩＲＥ１ＴＲＡＦ２ＪＮＫＰＥＲＫ通，在内质网应激反应中信号通路而非路是鼠胚胎成纤维细胞中自路发生所必须的一种通路介。可Ｗ看出，不管是上述哪导内质网应激引起的自隨，其理论依据都是通过抑制相关通路而观察细胞自隧体数量的减少，但是如果想真正确定这两条通路在内质网应激引起的自嗤中的作用，还需要在自晚功能层面上进行评估，如对自嗤体的成熟阶段及胞９７’内长寿命蛋白的降解等进行分析Ｉ一活性氧自由基（ＲＯＳ）是类能够氧化蛋白、脂类及ＤＮＡ的具有较高活性的小分子，作为信号分子，ＲＯＳ能够调节待氧化靴物质的生物活性。越来越多的数据表明艮０Ｓ在自隨激活中的必要作用，但其具体的激活机制还不完全清楚。由于线粒体是ＲＯＳ的主要来源，作为清除民ＯＳ的主要手段，３６ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文线粒体自隨的激活己经成为研究的重点。民０Ｓ主嬰碰过转录及转录后水平对自隨进行调节。在缺氧情况下，缺氧诱导因子（ＨＩＦ１）被激活，从而引起ＢＮＩＰ３ＮＩＸ的Ｂｅｃ１Ｂ－２Ｂ转录ｌｉｎｃｌ，ｅｃｌｉｎ及，其蛋白产物能与竞争化地结合Ｆ０Ｘ０３１得到释放而促进自唾体的形成。同时，氧化应激能够激活转录因子及核因子ＮＲＦ２，前者通过刺激ＬＣ３及ＢＮＩＰ３的转录而激活自旌，而后者能够上调Ｐ拍的表达，ｐ６２又可通过正反馈方式调节ＮＲＦ２的转录，并在帮助ｓｗｗｉ待降解蛋白转运至自隨体中起重要的调节作用。１．３自嗟损伤与疾病自噓发生的各个阶段的功能失调均可Ｗ引起自嗤损伤，这其中包括自嗟体的形成受抑制，自喧体与溶酶体无法融合，自蹈溶酶体内酶的功能活性存在缺陷等因素，。并且自赌发生的早期、晚期阶段受损对细胞内自幢相关的ｉｅ２Ｉｌ’Ｗ囊泡的数量具有相反的影响；抑制自隨体的形成过程导致自隨性囊泡。数量的降低，而阻断自隨后期阶段的进程使得囊泡的数量极大地增加对后期自唆进程的阻断主耍表现在两个方面：阻断自嗤体与溶酶体的融合导致了细胞内自嗟体的积累，而存在缺陷的溶酶体酶活性导致仍含有未ｉ解内容物的自略溶酶体的积累（如图１．４所示）。对于自隨流的损伤，其典型的特征类似于发生在自隨晩期阶段的受损现象一：异常的大型自趟性囊泡的积累。方一，，过多的囊泡之间发生面，损伤的自瞻流延长了这些囊泡的寿命另方面ｉＷｔ融合，形成了比细胞核还大的膜结构并占据了大部分胞质空间。Ｎｏｒｍａｌａｕ化ｐｈａ扮，慕（做＇柿謝＇．ｉｙ师化巧ｌａｗｎＤｅｆｅｃｔｉｖｅａｕｔｏｈａｐｇｙ＇’ｒｎｏｄｆｃ巧？馈娩＾拓巧？ｖ乂Ｃ义奶《１５！％．￥！的气护（＾＼泌巧余ａｉ械灼沛ｅＩｊ｜：；可當瀉、？化錢巧＇、絲／＇务少；护料乂／兴Ｖ；么乃品沁Ｉ的？＊雌鑽、髮發节喊邮化量輪。ｏｆｆｉｓｋ泡ｏｆ１声妨饥從！｛）ｂ化！獻。ｏｆｐｒｏＵ鸿ｔｉｃｗｉｄｈ？ｌｉｔｏｐｈａｉｇｏｓｏｍｅｓｄｅｇｒ这ｄａ巧ｏａｏｈａ２０－图１．４自噓流损伤的两种主要机制（Ａｕｔｐｇｙ１２８４：４４５５４４．），，（）３７ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文越来越多的研究表明自隆损伤与各种疾病的发生有关。在脑組织中，错误折叠蛋白质的大量积累可，如［＾１引起较普遍的神经退行性疾病阿尔茨海默症、帕金森症等，大量研巧表明在这些疾病模型中，其自嘘发生过程中的特定阶段存在缺陷。阿尔茨海默症为例，在患者退化的神经元中聚集着大量一的溶酶体相关的囊泡ＡＤｒｅｓｅｎｉｌｉｎ－ｌＰＳｌ生，进步研宛发现，相关蛋白ｐ（）发了突变－ｓｅ至，导致了溶酶体内蛋白水解酶活巧失活（ＰＳ１通过转运ｖＡＴＰａ溶酶体膜上而调控溶酶体的酸性），从而影响了蛋白质的稳态及神经元的功能。研巧发现，通过分子遗传学手段恢复溶酶体的功能后，ＡＤ鼠模型的病理状１Ｗ况及认知缺陷得到了明显改善。一ｔ克罗恩病是种肠道炎症性疾病，研究发现由于自隧相关蛋白Ａｇｌ６Ｌ的突变抑制了自隨体的形成，因而引起自幢受损，产生持续性的炎症反应。Ｄａｎ一ｏｎ病是种Ｘ连锁显性遗传性疾病，其病因主要是溶酶体膜相关蛋白ＬＡＭＰ－２－的突变引起，目前己经发现二十多个ＬＡＭＰ２基因突变位点。ＬＡＭＰ－２的突变抑制了自帷发生过程中由胞质动力蛋白介导的自旅体与溶酶、体的融合，导致了也肌骨骼肌等组织细胞内大量的自懂体沉积，最终引起也肌病变。同样在膜腺炎患者中，ＦｏｒｔｕｎａｔｏＦ等也观察到较多且体积较大的自礎体的累积－２，实验结果表明，其机制也可能是ＬＡＭＰ蛋白表达水平的降低抑制自幢溶酶体的形成。也肌糖原沉积病（Ｐｏｍｐｅ出ｓｅａｓｅ）是由Ｐｏｍｐｅ在９一１３２年提出，是种先天性疾病。该病是由糖原合成和分解代谢中所需的ａ－葡萄糖巧酶的缺陷引起，使得糖原无法分解成葡萄糖而累积在溶酶体中。另一方面，糖原的代谢受损导致了细胞内能量供应不足而激活细胞自隆。ＩＩ型粘脂胆积症一（ＭｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓｔｙｐｅＩＩ）是种致命的溶酶体储存障碍性疾病，－－－患者溶酶体相关酶Ｎ－乙醜基１憐酸转移酶（ＧｌｃＮＡｃｈｏｓｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｐｐ，间ｃＮＡｃ－ＰＴ基因发生突变），造成溶酶体的酸性水解酶无法进入溶酶体中而被＂＂无法被降解分泌到细胞外，最终导致从自隨体运至溶酶体中的货物而积累在溶酶体中ＷＷＷ。１．４研巧目的及意义原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤么一二位，居于恶性肿瘤死亡的第，由于肝癌早期缺乏典型的临床表现，发现时多处于中晚期。化疗作为中晚期的主要治疗手段其效果不佳，肿瘤细胞的多药耐药现象是化巧失败的主要原因，并且已经成为肝癌治巧成功与否的关键性限制因素。因此在天然产物中寻找低毒高效的抗癌耐药先导化合物己成为必然趋势。本课题主要对升麻来源的环疲萝蜜烧型Ｈ萌类化合物ＳＭ３０８进行抗肿瘤活性研究，重点阐述其３８ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文诱导肝癌耐药细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流损伤和调亡的分子机制，旨在为化合物ＳＭ３０８发展成为抗肝癌候选新药提供理论依据。２实验材稱与方法２．１实验材料２．１．１细胞株人肝癌耐药型细胞株（ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ）由香港中文大学冯国培教授赠予。２．１．２药品及试剂ＳＭ３０８由香港理工大学深圳研究院刘落稽硕±提供（图２．１），其纯度为°９８％ＤＭＳＯ２５ｍＭ－２０，将其溶于并配置成母液浓度为，于Ｃ保存备用。ＩＩ．０ＯＡｃ＼ｈＩＯＨ＇余２－－－－－－－－图．１ＳＭ３０８结构２５０乙醜基７８去氮升麻醇３０Ｄ邮喃木糖昔（，Ｐ）ＭＤＣ、ＢＡＦＡ１和ＬＹ２９４００２购于美国Ｓｉｇｍａ公司Ｒａｐａｍｙｃｉｎ购于广州市齐云生物技术有限公司（进口分装）Ｄ－ＢＳＡ于Ｑ贝勾ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂和Ｃａｓｐａｓｅ８抑制剂购于上海碧云天生物研究所ｌｏｆｅｃｔａｍｎｅｖｉｅｎｉｐｉ２０００赌于美国虹ｔｒｏｇ公司ＡｋｔｓｉＲＮＡ试剂盒购于上海吉玛公司Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ中所用抗体见表２．１其它药品一、抗体及试剂同第章３９ 北京协和医学院硕止研究生毕化论文表２．１本研究所用抗体清单巧Ｉ—＾；ｎｉｉ———ａ—ＬＣ３Ｒａｂｂｉｔ４１０８ＣＳＴ（Ｂｅｖ针１乂ＭＡ，ＵＳＡ）Ｂｅｃｌｉｎ１Ｒａｂｂｉｔ３４９５ＣＳＴｅｖｅｒｌＭＡＵＳＡ巧ｙ，，）５ＲａｂｂｔＮＢ－Ａｔｉｌ１０５３８１８Ｎｏｖｕｓ（Ｌｉｔｔｌｅ化ｎＣＯＵＳ八）ｇ，，Ｒａ－ｂｂｉｔＮＢＰ１４８３２０ＮｏｖｕｓＣＵｔｔｅｔｏｎＣＯＵＳＡ）ｐ６２ｌ，，Ｃａｓｐａｓｅ３Ｒａｂｂｉｔ９６６２ＣＳＴ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ３Ｒａｂｂｉｔ９６６４ＣＳＴ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＰＩＳＫｉｎａｓｅｐ１１ＯａＲａｂｂｉｔ４２５５ＣＳＴＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡＵＳＡ（，）２４４８－ｍＴＯ民ＳｅｒＲａｂｂＭＡｉｔ２９７１ＣＳＴｅｖｅｒｌＵＳＡｐ（）巧ｙ，，）－７０ｓ６ｋＲａｂｂＴＭＡｉｔ９２３４ｅｖｅｒｌＵＳＡｐｐＣＳ巧ｙ，，）２丄３实验仪器透射电镜（ＰＨＩＬＩＰＳＴＥＣＮＡＩ）购于荷兰飞利浦公司激光扫描共聚焦显微镜化ＳＭ５１０）购于德国ＣａｒｌＺｅｉｓｓＪｅｎａ公司２丄４主要试剂配置方法１ＭＤＣ溶液）一称取定量的ＭＤＣ粉末溶于ＤＭＳＯ溶液中，混匀，使其终浓度为５０ｍＭ，于４化避光保存备用。２ＢＡＦＡｒ溶液）一称取定量的ＢＡＦＡ１粉末溶于ＤＭＳＯ溶液中，混匀，使其终浓度为１００ｍＭ，于４％避光保存备用。３ＤＱ－ＢＳＡ溶液）一取瓶己分装的Ｄ－ＢＳＡ粉末（ｍｍＬＰＢＳ溶Ｑ１ｇ），溶于１液中，超声充分溶解，／ｍＬ。使其终浓度为Ｉｍｇ，于４化避光保存４０ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文２．２实验方法２．２．１细胞培养ｅ／－ＨｐＧ２ＡＤＭ细胞使用含有１０％胎牛血清、１％双抗的ＲＰＭＩ１６４０培养８０％液，在３７＼：、含有５％Ｃ〇２的培养箱中进行培养。待细胞生长至７０％至融合时，膜酶消化收集细胞并使细胞重悬于培养液中，取适量细跑悬液进行一传代培养。在细胞每次传代过程中．２，需要向培养液中加入定浓度的Ｄｏｘ１（叫ＶＩ），用于维持ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞的抗药特性。２．２．２肿痕细胞体外増殖抑制实验具体操作方法参照第一章进行－２．２３ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＴＴＣ／ＰＩ双＾５＾＾检测细胞调亡具体操作方法参照第一章进行２．２．４ＭＤＣ染儲察５一ｘ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（２．５ｌＯ／孔）接种于６孔板中，并设置对照组与实验组，待细胞贴壁后用ＳＭ３０８处理细胞不同时间，弃去培养液并用ＰＢＳ缓冲液清洗２次，向每孔中加入含有ＭＤＣ的５００咕ＰＢＳ＂缓冲液（使ＭＤＣ终浓度为５０山如。于３７Ｃ细胞培养箱中僻育２０ｍｉｎ左右，＇用ＰＢＳ缓冲液清洗２次，在倒置显微镜下进行观察。２．２．５细飯显微结构观察一Ｘ取对数生长期的细胞，按定细胞数量（１．５１０Ｖ孔）接种于１００ｍｍ培养皿中，并设畳对照姐与实验组，待细胞贴壁后用ＳＭ３０８处理细胞不同时间，弃去培养液并用膜酶消化收集细胞，ＰＢＳ缓冲液清洗细胞３次，向细胞。中缓慢加入４％戊二酸，于４吃固定过夜次日用ＰＢＳ缓冲液清洗细胞，经１％俄酸浸透Ｉｈ，己醇两砸进斤梯度脱水，６１８环氧树胶包埋，超薄切片－机切片并制成铜网，经３％醋酸轴拘橡酸铅双染色后，于透射电镜下进行观察。２．２乂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹法具体操作方法参照第一章进行４１ 化京协和医学院硕±研究生毕业论文２．２．７ｓｉＲＮＡ转染一５ｘ取对数生长期的细胞．〇ｌ〇Ｖ６０ｍｍ，按定细胞数量（孔）接种于培￣养皿中，待细胞贴壁长至７０％８０％融合时，使用１；９〇（６（化抽１１６２０００（体积比１：１００）向ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞中转染人源Ａｋｔ（２００ｎＭ）及对照ｓｉＲＮＡ。转染３０ｈ后向其中加入ＳＭ３０８处理不同时间Ｗ进行后续其他实验。用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测转染效率。２．２．８细胞免疫巧光分析取对数生长期的细胞一，按定细胞数量孔）接种于共聚焦小皿中。，，并设置对照组和实验组待细胞贴壁后用ＳＭ３０８处理细胞不同时间弃去培养液并用事先温浴的ＰＢＳ缓冲液清洗细胞２次，向其中加入１ｍＬ含有Ｄ－ＢＳＡ。Ｑ（１０帖／ｍＬ）的无血清培养液，继续培养３ｈ弃去培养液并用ＰＢＳ缓沖液清洗细胞，４％的多聚甲醒室温固定约１５ｍｉｎ，ＰＢＳ缓冲液清洗＝＝ｘｍｉ６２０ｎｍ。细胞，５９０ｎＥｎ）于激光共聚焦显微镜下对样品进斤观察（Ｅ，２．２．９统计学分析所有实验结果均用Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．表示，两独立样本之间的比较采用ｔ检验法（双尾法）进行统计学分析，且所有实验数据均采用ＧｒａｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０统ｐ计软件进行处理，１＾１尸＜化〇５为具有明湿统计学差异。３实验结果３．１ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞具有显著的増殖抑制作用通过ＭＴＴ实验检测发现，ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞具有显著的增殖一抑制作用，且存在明显的剂量依赖性和定的时间依赖性（图３．１）。ＳＭ３０８处理ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞２４ｈ和４８ｈ对应的半数抑制浓度ＩＣ５０分别为２４．巧±１．０２ｕＭ、２２．８８±０．７６ｉＭ。｜＾４２ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文１Ｗ２４ｈ］【＋４抓８０－＾６。．！＾８：＼－５０－４８－４－－．６４４４．２．．．ＳＭ３０８ＣＯ打ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｌｇ（ｍｏｌ／ｌ）图３．１ＳＭ３０８对化ｐＧ２／ＡＤＭ细胞的增殖抑制作用Ｆｉｇｕｒｅ３．１ＧｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｏｆｃｏｍｏｕｎｄＳＭ３０８ｉｎＨｅＧ２／ＡＤＭｙｐｐｃｅｌｌｓ＇Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉ也ｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄＳＭ３０８ｆｏｒ２４ｈａｎｄ４８ｈ，化ｅｎｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．在实体瘤组织中，由于血供不足造成的其局部营养缺乏及缺氧现象普遍存在，是肿瘤微环境的主要特征。首先２ｈ，我们采用１的饥饿处理来模拟肿瘤微环境，ＭＴＴ实验检测发现经饥饿处理的细胞对化合物ＳＭ３０８的敏感性更强，用不同浓度ＳＭ３０８处理细胞口ｈ后，经饥饿处理的细胞存活率明显低于含有完全培养甚的细胞存活率（图３．２）。Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ１２〇Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍｉ６０－ｉ＼４０－ｉ－２００５１０１５２０２５３０ＳＭ３０８ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（［ｉＭ）图３．２不同营养条件下ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞的增殖抑制作用＂Ｆｉｇｕｒｅ３．２Ｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉ１：ｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｕｔｒｉｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｍｏｕ打ｄＳＭ３０８ｆｏｒ１２ｈｕｎｄｅｒｃｏｍｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍｏｒｐｐ４３ 北京愤和医学院硕±研巧生毕业论文ｓｔａｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ１：ｈｅｎｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂＭＴＴａ巧ａｙ．Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ，ｙＣＯ打ｄｉｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｓｔｒｏ打ｇｈｓｉｏｌｏｉｃａｌｉ打ｄｕｃｅｒｏｆａｕｔｏｈａ．ｐｙｇｐｇｙ３．２ＳＭ３０８诱导Ｈｑ）Ｇ２／ＡＤＭ细胞自噓流损伤义２．１ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞出现ＭＤＣ染色呈阳性的酸性囊泡由图３．２可知，饥饿处理可Ｗ显著提高ＳＭ３０８对ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞的增ｐ殖抑制作用。由于饥饿可Ｗ促进细胞自隧ＳＭ３０８是否，因此我们对调控Ｈ一ｅＧ２／ＡＤＭ细胞自燈进行探讨。做为种嗜酸性染色剂，甲丹横醜尸胺ｐ（ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ，ＭＤＣ）可用于标记细胞内的酸性结构。我们利用倒置显微镜观察经ＳＭ３０８处理细胞后ＭＤＣ染色情况，结果表明不同浓度ＳＭ３０８作用于ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞２４ｈ后ｐ，细胞内出现大量点状英光，且巧光强度呈剂量依赖性的增加（图３．３）。同样２４ＭＳＭ３０８作用于细胞ｐ化ＰＧ２／ＡＤＭ细胞Ｉｈ、３ｈ、６ｈ和１２ｈ后，其巧光强度逐渐增强（图３．４），说明ＳＭ３０８作用后ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞内出现大量酸性囊泡。■■ＣＴＬ１５扛■■２４２６图３．３ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞出现酸性囊泡Ｆｉｇｕｒｅ３．３ＴｈｅａｐｅａｒａｎｃｅｏｆｌａｒｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｃｉｄｉｃｖａｃｕｏｌｅｓａｆｔｅｒＳＭ３０８ｐｇｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＦｏｌｌｏｗｉｎｅｘｏｓｕｒｅｔｏＳＭ３０８ｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔＣＯ打ｃｅｎｔｒａｔｉｏ打ｓｆｏｒ２４ｈｇｐ，Ｈ〇ｑ）Ｇ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔ；ｈＭＤＣ５０ｊＭｆｏｒ２０ｍｉｎａｔ３７Ｃ．（｜）４４ 北京协和医学院硕±研充生毕业论文ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭＤＣｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｅｐｌＯＯｘ．（）■■■ＣＴＬ１ｈ３ｈ６ｈ１２ｈ图３．４ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞出现酸性囊泡Ｆｉｇｕｒｅ３．４ＴｈｅａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｃｉｄｉｃｖａｃｕｏｌｅｓａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ妨口〇５１１［６１：ｏＳＭ３０８２４ｆｂｒｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｉｍｅ（，〇ＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗＵｈＭＤＣ５０ｉＭｆｏｒ２０ｍｉｎａｔ３７Ｃ．ｐ（｜）ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭＤＣｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｚｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｅｙｐｘｌＯＯ．（）３．２．２ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自噓相关蛋白水平的影响一ＬＣ３ＬＣ３３－Ｉ常被用做自瞻的标志物，胞浆型（即ＬＣ）酶解掉小段多狀而转变为自瞻体膜型（即ＬＣ３ＪＩ）标志着自幢体的形成。我们通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ实验检测２４＾ｉＭＳＭ３０８作用于Ｈｅｐ＾／ＡＤＭ细胞不同时间后自略相－关蛋白含量的变化，在ＳＭ３０８处理细胞３ｈ后，ＬＣ３ＩＩ型增强并随着时间的延长其含量逐渐增多（图３．５），即细胞自嗟体数量増加，这提示ＳＭ３０８有可能诱导细胞自晦的发生。但研究表明，当细胞的自赌流受到抑制的时候，７９［１３－ＭＬＣＩＩ含量同样会累积，这提示我们Ｓ３０８也有可能抑制细胞自燈流。此外，我们还发现ＳＭ３０８处理细胞３ｈ后，Ｂｅｃｌｉｎ１的含量开始下降且呈显著的时间依赖性，Ａｔｇ５的含量无明显变化（图３．５）。４５ 北京协和Ｅ学院硕±研巧生毕业论文ＳＭ３０８０１３６１２２４ｈ（）＊ＬＣ３－＾ＩＩ＝—＊－＊ＢｅｃｌｉｎｌＡｔｇ５ｆｌＭＩ£ＨｔｉＣＭＩｉＨＨｉ？－ａｃｔｉｎ＊ｉＭｉ＜Ｐ？ｈ９？ｍｐ＾ｍｍｐｗｍ？ｉ？ｍｐ３图．５ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自幢相关蛋白水平的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．５ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭ３０８Ｓｏｎ出ｅｌｅｖｅｌｓｏｆａｕｔｏｈａｒｅｕａｔｏｒｔｐｇｙｇｌｙｒｏｅｉｎｓｐｉｎＨＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ＇ＡｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｈｅｃｅｔ巧ｌｌｌｓａｅｓｗｅｒｅｅｒｆｏ，ｙｐｒｍｅｄｗｈｈＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｓｅｃｉｆｉｃａｒＵｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔＬＣ３Ｂｅ１ｇｐｇ，ｃｌｉｎ，Ａｔ５ｒｅｓｅｃｌ－ｇ，ｐｔｉｖｅ．ａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｌｏａｄｙＰｖｅｄａｓａｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ，３．２．３ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞白隨流－自駿发生是个动态的过程一，ＬＣ３ＩＩ含量升高即自噓体数量的增加并不定代表自瞻流水平的増强，自瞻体数量的增加可Ｗ源于两种相反的情况：自嗟被激活或者自嗟的下游反应受损伤〔如溶酶体与自隆体的融合被抑制或者７９自幢溶酶体中内容物的降解受［抑制）１因此，我们采用ＬＣ３Ｔｕｒｎｏｖｅｒ实验对细胞自儀流进行评价。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｉｏ扣ｎｇ检测结果表明，在自隨抑制剂ｂａｆｌｉｉｏｍｙｃｎＡ１（阻止自隧体甘溶酶体的融合过程）存在的情况下，与未经Ｍ３０８Ｓ处理的细胞相比－，经ＳＭ３０８处理的细胞其ＬＣ３ＩＩ型的积累量并未增３．６）。加（图在自隨发生过程中－，Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白通过直接结合ＬＣ３ＩＩ被选择性地包裹进入自喧体而最终被降解，因此细胞内Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白水平的降低反映细胞自蹈性降解能力的増强。我们的检测结果发现ＳＭ３０８处理细胞６ｈ后细胞内６２／ＳＱＳＴＭＩ蛋白水平明显增加（图３Ｐ．７）。这些结果均说明ＳＭ３０８抑制了ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自幢流。４６ 北京协扣防学院硕止？研究生毕业论文ＢＡＦＡ－＋－１＋ＳＭ３０８＋＋ＬＣ３－Ｉ／ＩＩＷ－■■■ａｃｔｉｎ＊■ｐ＇图３．６ＳＭ３０８对ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞Ｉｌ晦流的抑制作／ＨｐＦ＇ｉｇｕｉｅ３．６ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｆｌｕｘａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｉｎｃｕｂａｔｅｄｉｎｆｕｌｌｍｅｄｉｕｍｏｒｗｋｈ２４｜ｉＭＳＭ３０８ｆｏｒ１２ｈｉｎ化ｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｒａｂｓ州ｃｅｏｆｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１巧ＡＦＡｌ，５０ｎＭ，化ｅｃｅｌｌ）ｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｓｉｓｕｓｉｎｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｙｇｐａａ－ｇｉｎｓｔＬＣ３．ｐａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ．ＳＭ３０８０１３６１２２４ｈ（）？？ｍｍｐ６２－ａｃｔｉｎｐｗｍｍｍｍ图３．７ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞瞻流的抑制作用Ｆｉｇｕｒｅ３．７ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｈａｆｌｕｘａｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｐｇｙＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ａｆｔ巧ｅｘｐｏｓｕｒｅ化ＳＭ３０８ｆｏｒ化ｅｉ打ｄｉｃａｔｅｄｔｉｍｅ，化ｅｃｅｌｌｌｓａ化ｓｗｅｒｅｓｕｂｅｃ化ｄｔｏＷｅｓ化ｒｎｂｌｏｔｔｉｎａｎａｌｓｉｓｕｓｉｎ化ｅｉｎｄｉｃａ化ｄａｎｙｂｏｄｉｅｓｙｇｙｇ，ｊ－ａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ．ｐ３．２．４ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自旌洛酶体中包裹物的降解一Ｍ为了进步验证Ｓ３０８作用于ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞后，细胞自礎流受到ｐ抑制，我们通过透射电镜观察细胞业愚微结构的变化（图３．８）。正常ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞其细胞膜和核膜均完整，且线粒体较丰富。经２４ｎＭＳＭ３０８作用于细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞６ｈ后，细胞中出现了包裹有大量未能降解内４７ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文容物的单层膜结构即自幢溶酶体一（纽色箭头所示），其中可清楚地看到个完整的线粒体包裹在自隨溶酶体中（黄色箭头所示。）而在雷帕霉素（民ａｍｃｉｎ）处理的细胞中（阳性对照）发现的大量自隨溶酶体其大部叩ｙ，分己完成对包裹物的降解，自幢溶酶体内呈现空泡状。嚷逢醜麵圓圍３８ＳＭ３０８Ｈ图．对ｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞超微结构的影响＾Ｉ３．８ｌｔｔｔｔ／ＡＤｉｇｕｒｅＵｌｒａｓｒｕｃｕｒａｌａｌｅｒａｉｏｎｓｏｆＨｅｐＧ２ＭｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＳＭ３０８．ＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉ化ＳＭ３０８ｆｏｒ６ｈ，ａｎｄｕｌｔｒａｓｔｍｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＴＥＭ．Ａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅｓｗｉｌ：ｈａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏ打ｏｆｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎａｔ４０Ｍｗｔｔｒ．ｌａａｓｕｓｅｄａｓａｏｓｉｉｖｅｃｏｎｏｌ｜ｐ３．２．５ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞溶酶体的酶活性一Ｄ－ＢＡ是ＢＯＤ－ＱＳ种标记有红色巧光染料ＩＰＹＴＲＸ的牛血清蛋白衍生物。受激发波激发后，由于过多的染料标记使得巧光发生自我巧灭，而当Ａ被降解后ＢＯＤ－－ＢＳＩＰＹＴ民Ｘ可发出强巧光。ＤＱＢＳＡ会在溶酶体中积累并ＥＰ－Ｘ巧光片段－被其中的蛋白水解酶水解而释放出ＢＯＤＹＴＲ，因此ＤＱＢＳＡ可通过检测细胞内蛋白水解酶活性来衡量溶酶体的功能。我们通过ＤＱ－ＢＳＡ与细胞进行共解育，在共聚焦显微境下观察其发出的巧光信号，结果表明与Ｃｏｎｔｒｏｌ沮化及饥饿处理姐相比，经ＳＭ３０８处理的细胞内发出的巧光强度明显较弱（图３．９），提示ＳＭ３０８处理使Ｈ巧Ｇ２／ＡＤＭ细胞溶酶体的酶活性受损。４８ 北京执和医学院硕±研究生毕业论文ＣＴＬＳＭ３０８Ｓ化ｒｖａｔｉｏ打ｍ图３．９ＳＭ３０８对Ｈｅｐ化／ＡＤＭ细胞溶酶体酶活性的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．９Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｌｙｓｏｓｏｍａｌｐｒｏ化ｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒＳＭ３０８化ｅａｔｍ州ｔｉｎＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．ＡｆｔｅｒＳＭ３０８ｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ１２ｈ，ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｗａｓｈｅｄｔｗｉｃｅｗｉｔｈＰＢＳａｎｄｔｈｅ打ｉ打ｃｕｂａｔｅｄｉ打ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＤ丘ＳＡ＾１０〇（°ｉｇ／ｍｌｆｏｒ３ｈａｔ３７Ｃ．Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｈｅｎｆｉｘｅｄａｎｄｉｍａｅｄｗｉｔｈｃｏｎｆｏｃａｌ［）ｇｍｉｃｒｏｓｃｏ６３〇ｘ．Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｒｏｖｉｄｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｐｙ（）ｐｔｌｙｓｏｓｏｍａｌａｃｉｖｉｔｙ．３．３ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路异常活化与ＳＭ３０８诱导的细胞自處流损伤的相关性３．３．１ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路异常活化Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验结果盈示，２４ｊｉＭＳＭ３０８处理细胞１ｈ后ＰＩ３激酶ＰｌｌＯａ（ＰＤＫ催化亚基）和憐酸化的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）的水平均明显上调（图３．１０）。这些结果提示ＳＭ３０８作用于ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞Ｉｈ后ＰＧＫ／Ａｋｔ信号ｐ通路即被活化。ＳＭ３０８０１３６１２２４ｈ（）？ｌ増？麵会Ｉ幽■？一＾巧ＢＫｐｌＯａ細！＾ｓ＂＂３－—＇ｐＡｋｔ（■ＨＶ＾ｍｍ０Ｗ＞ｍｍｍｍ－Ｐａｃｔｉｎ３１０ＭＰＩＡｋｔ信号图．Ｓ３０８对３Ｋ／通路相关蛋白的影响４９ 孔京协和医学院硕±研究生毕业论文Ｆｉｇｕｒｅ３．１０ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０８０打ｔｉＫｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｆｉｔ！ｌｅｖｅｌｓｏｆＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ＊ＭａｔｈｗａｙｉｎＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｅｘｏｓｕｉｅ化Ｓ３０８ｆｏｒ化ｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｉｍｅｐｐ，ｔｈｅｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｄｅｄｔｏＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ呂ａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇ１；ｈｅｉｎｄｉｃａｔｅｄａｎｔ－ｉｂｏｄｉｅｓ．ａｃｔｔｒｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉ打ｃｏｎｏｌ．Ｐｇ３．３．２抑制ＰＩ３Ｋ可减轻ＳＭ３０８对Ｈｑ）Ｇ２／ＡＤＭ细胞自隨流的抑制ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路在癌症发生中参与重要的信号调节过程。对于ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路对细胞自隨调节的研究多集中在其对自隨发生早期的调ｉ控［ｗ，良ＰＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通过激活下游靴蛋白ｍＴＯ民而负调控自隆早期的发生。而ＰＤＫ／Ａｋｔ对自幢后期（自隆化与溶酶体的融合Ｗ及融合之后的降解等过程）的调控研究得比较少ＳＭ３０８可，。由于Ｗ抑制细胞自嗟流所Ｗ我们在此探讨该通路的活化是否参与调控ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自隆流的抑制过程。我们首先采用ＰＩ３Ｋ抑制剂ＬＹ２９４００２预处理细胞，利用ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇＹ－Ａｋ实验检测发现，单独使用Ｌ２９４００２处理的细胞其ｐｔ（Ｓｅｒ４７３）蛋白水６２。Ｍ３０８－Ａｋｔ平下降，并且ｐ蛋白水平下降单独使用Ｓ处理细胞时，ｐ－（Ｓｅｒ４７３）、ＬＣ３ＩＩ和ｐ６２蛋白水平均明显上升。而与单独使用ＳＭ３０８相比，－ＬＹ２９４００２与ＳＭ３０８共同处理的细胞其ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）和ＬＣ３－ｎ蛋白水平发生明显下调，６２蛋白水ＰＩ３Ｋ可ｐ平发生微略下调，说明抑制Ｗ减轻ＳＭ３０８对细胞自唆流的抑制（图３．１１）。提示ＰＩ３Ｋ的激活参与调控ＳＭ３０８对ＨｆｅＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流的抑制。ｐＳＭ３０８－－＋＋ＬＹ０２－＋－２９４０＋Ｓｅｒ４＂－ｐＡｋｔ—Ｉ麵ｍｍｍ■ＬＣ３－Ｉ／ＩＩ。ｐ？？－■…ｗｉｉｎａｃｔｉｎＰ５０ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文图３．１１抑制ＰＩ３Ｋ对ＳＭ３０８诱导的细胞自幢流损伤的影响＾Ｉ３１１ＥＩ３Ｋｉｇｕｒｅ．ｆｅｃｔｓｏｆＰｉｎｈｉｂｉＵ）ｒｏｎ化６ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆａｉｒｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘｉｎｄｕｃｅｄｂｙＳＭ３０８．ＡｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＳＭ３０８ｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｒｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＬＹ巧４００２（５｜ｉＭ）ｆｏｒ１２ｈ，ｔｏｔａｌｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｅｄｆｏｒ化ｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ－ｉｎｄｉｃａｔｅｄｒｏｔｅｉｎｓｕｓｉｎｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ａｃｔｉｎｗａｓ化ｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｐｇｐＰｇｃｏｎｔｒｏｌ．３．３．３Ａｋｔｓ瓜ＮＡ预处理可减轻ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自曠流的抑制虽然上述抑制ＰＩ３Ｋ可Ｗ减巧ＳＭ３０８对自幢流的抑制，Ａｋｔ作为其下游主要调控蛋白是否涉及其中依然需要证明。我们使用ＡｋｔｓｉＲＮＡ转染细胞，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ实验检测细胞自嗟流的变化。结果思示，单独使用ＡｋｔＳ－－ｉＲＮＡ处理的细胞其Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）蛋白水平下降ＬＣ３ＩＩｐ，蛋白水平上升，并且ｐ６２蛋白水平下降，表明沉默Ａｋｔ后ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞肩动自幢，自嗟流增强ＳＭ３０８－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）ＬＣ３－ＩＩ。单独使用处理细胞时，ｐ和蛋白水平显著上升，ｐ６２蛋白水平微略上升。而与单独使用ＳＭ３０８相比，ＡｋｔｓｉＲＮＡ与ＳＭ３０８－Ａｋ７３）ＬＣ－ＩＩ６２共同处理的细胞其ｐｔ（Ｓｅｒ４、３和ｐ蛋白水平均发生明显下调，说明沉默Ａｋｔ后ＳＭ３０８对细胞自隧流的抑制明显减轻（图３．１２）。提示Ａｋ－ｔ３０８Ｈ２ＤＭｔ或者ｐＡｋ的激活参与调控ＳＭ对ｅｐＧ／Ａ细胞自幢流的抑制。ＳＭ３０８－－＋＋－—＋－＋ＮＣＡｋｔｓｉＲＮＡＳｃｒ＂３－Ａｋ胃■ＩＩ－？一ｍｍｔ一ｐ－ＬＣ３Ｉ／ＩＩ６２ｒｎａｍｍｍｐ３－ａｃｈｎ｜３１２ｔ民ＮＡＭ图．Ａｋｓｉ预处理对Ｓ３０８诱导的细胞自隧流损伤的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．１２ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡｋｔｓｉＲＮＡｏｎｔｈｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘ３０８Ｈ２ＤＭｉｎｄｕｃｅｄｂｙＳＭ．ｅｐＧ／Ａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉ化ｓｉＲＮＡａａｉｎｓｔｐｇＡｋｔｏｒｗｉｌ：ｈａｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）ｓｉＲＮＡｆｏｒ３０ｈ．Ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅ１：ｈｅｎｅｈｈｅｒｇ５１ 北京栅和医学院硕±研究生毕业论文ｔｒｅａｔｅｄＷ地ＳＭ３０８２４ｖｌｏｒｕｎｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ１２ｈ（叫）．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｉｎｄｉｃａｔｅｄｒｏｔｅｎ－ｐｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ａｃｔｉ打ｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｏａｄｐＰｌｉｎｇｃｏｎｓｏ．ｌ３．４ＳＭ３０８诱导Ｈｑ）Ｇ２／ＡＤＭ细胞发生调亡３．４．１ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡率的影响对ＨｅＧ２／ＡＤＭｎｅｘ－细胞进行ＡｎｉｎＶＦ打ＣＰＩｐ和双染色，利用流式细胞仪检测ＳＭ３０８对化ＰＧ２／ＡＤＭ细胞调亡率的变化。检测结果表明，不同浓度ＳＭ３０８处理细胞２４ｈ、４８ｈ后，细胞早期调ｔ和晚期调亡呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性增加（图３．１３）。ＡＣＴＬ２２２４＼Ｍ２６＼ｘＭ＂‘ｔｙＩｒ：Ｉ！＂？Ｗ．Ｉ誤＊Ｉ。？旨｜。。！：：。．，，，，苗巧ｌｓ、，，，Ｊ，；■。ＵＩ，Ｉ试，，Ｉ．＇＇Ｓ，１＊Ｉ＾＂＂，，１’ＩＩ’？＊。Ｉ０，ｔ。ｃ，，Ｓｉ）ＶｉＶ．７，扩Ｔ？，ｙ￣￣＂…？心；；＊Ｉ）ｒｔ吊＾１勇；客ＩＩＩ＇＂■＿！：：：＾Ｉｌ；＾ｒｉ吻？９，，《。ｓ－，１｜？＊，ｉ０１＊？１．｜＼ｓ？，，０ｉａ％：＂＂、［ｔｕＭｍ］■，．Ｊ｜叫＾。＇’＊’＊‘。＇，１＂，ｌ，１ｃ＊ｓａｆｌ，９。ｉ１０１０ｃＩ＂Ｉｔｔ。＾Ｖ７户ｉｉ？！？？＊ｆｆｃｒｔｕｍＭＫＷＷｍｉＪｉＡｉＭ，【ｉＢａＭＴｗ—ＣＭＣ＊Ｗ？心０＇ＭｒｒｔＭ？ａｒ＊ｔ？Ｌ）＜ｈｌｋＨＢ＊ｐｕ（ｉ＞Ｍａ３ＨＫ？Ｄ—ｎＦｊＭｔｕｖ＂ＭＭｕ，ｇ９ｙＡｎｎｅｘ－ｉｎＶＦＣｒｅｅｎｆｕｏｓｃｅｎｃｅＩＴｇｌ３１３图．ＳＭ３０８对曲ｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡率的影响Ｆｉｇｕｒｅ３．１３ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０８ｏｎａｐｏｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｏｆＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．ｐｐＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎ呂ａｓｓａａｆｔｅｒｅｘｏｓｕｒｅｙｐ化比ｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＳＭ３０８ｆｏｒ２４ｈ（ｐａｎｎｅｌＡ）ａｎｄ４８ｈ（ｐａｎｎｅｌＢ）．Ｃｅ－ｌｌｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄａｎｄｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＰＩａｎｄＡｎｎｅｘｎＶＦＩＴＣｉｉｎｄａｒｋｎｅｓｓｆｏｒ１５ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｆｍｉｎｌｏｗｃｌｔｉ：ｏｍｅｒａｎａｌｓｓ＇，ｙｙｙｙ３．４．２ＳＭ３０８对调ｔ：相关蛋白水平的影响Ｃａｓｐａｓｅ级联反应在诱导细胞调亡过程中发挥着重要作用，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ实验结果表明２４ｉＭＳＭ３０８作用于ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞２４ｈ，｜ｐ后Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ９蛋白被剪切活化，同时，ＰＡＲＰ的剪切活化形式Ｃｌｅａｖｅｄ５２ 北京协和医学院硕Ｌ研巧生毕业论义ＰＡＲＰ也在ＳＭ３０８作用２４ｈ后开始出现（图３．１４）。提示化合物ＳＭ３０８作用于ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞２４ｈ后细胞出现调亡。ＳＭ３０８０１３６１２２４ｈ（）Ｃａｓｐａｓｅ３ｗｍｕｔｍｍｍｍｍｍｒｎｍ極》当ａｓａｅ■Ｃｓ９；＇＂＇齡＊＊■■麵＇ｎｗｉ？＂？？？ｐ：响Ｉｒａｉｃｍ＞＇麻ｍ一．一一ｆｉｆｉｉｌａｉｉｉ１１ＡＩＪｕｒＡＫＪｒ＇、＜…由－ａｃｍｍｍｍｍｐｔｉｎｍｍｍｍｍ图３．１４ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡相关蛋白水平的影响＇ＭＦ３１４Ｅｆｔ３０８ｌｌｉｉｔｔｉｉｇｕｒｅ．ｅｃｔｓｏｆＳｏｎ也ｅｅｖｅｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｓａｓｓｏｃａｅｄｒｏｅｎｓｐｉｎＨｅＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｅｘｏｓｕｒｅ１２４ＭＭ３０ｔｔｔ：０ｉＳ８ｆｂｒｔｉｈｅｉ打ｄｉｃａｅｄｉｍｅｈｅｐｐ，｜ｃｅｌｌｌｓａｔｅｓｗｅｒｅｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇ１：ｈｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｙｐａｎｔｏｄ￣ｉｅｓａｃｔｉ打ｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｃｏｎｔｒｏｌ．ｉｂ．Ｐｇ３．４．３泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂和Ｃａｓｐａｓｅ８抑制剂对ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞増殖的影响一Ｍ为了进步探讨Ｃａｓｐａｓｅ活化在Ｓ３０８介导的ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞死亡中的作用ａｓａｓｅ－ＶＡＤ－，我们采用ＭＴＴ法检测泛Ｃｐ抑制剂（ＺＦＭＫ）预处理后ＳＭ３０８对Ｈ２Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ可显巧Ｇ／ＡＤＭ细胞存活率的影响，结果表明著地括抗ＳＭ３０８对细胞的増殖抑制作用。Ｃａｓｐａｓｅ８是外源性调亡途径的执行８Ｚ－旧ＴＤ－ＦＭＫ）ＭＴＴ检者，我们使用Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂（预处理细胞，测结ＳＭ３０８处理Ｚ－圧ＴＤ－ＦＭＫＳＭ３０８果表明与单独使用细胞相比，与共同处理对细胞的存活率影响无明显差别（图３．１５）。提示内源性线粒体途径可能介导ＳＭ３０８诱导的化ＰＧ２／ＡＤＭ细胞调亡，而外源性死亡受体途径在ＳＭ３０８诱导的ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡中几乎不起作用。５３ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文－１２０１ｎ技１－１郎－１００－－挑－＾一１＾赛８０皇－６。－６０１ＩＩ－－ｉ４。！４。圓Ｊ－－２０２０－Ｌ＾—？■Ｉ？—０Ｉ■０＾ＩＩＩ冷＜Ｔ图３．１５泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂和Ｃａｓｐａｓｅ８抑制剂对ＳＭ３０８抑制ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞增殖的影响Ｆ－ｉｕｒｅ３１５ＥｆｔＣＣｉｉｂｈｔｈｇ．ｅｃｓｏｆａｎａｓａｓｅａ打ｄａｓａｓｅ８ｎｈｉｔｏｒ〇打ｔｅｒｏｗｐｐｐｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄＳＭ３０８ｉｎＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓ．ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ－ｃｅｔｔｔｌｌｓｗｅｒｅｒｅａｅｄｗｉｈＳＭ３０８ｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｒｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｎＣａｓａｓｅｏｒｐｐＣａｓｐａｓｅ８ｉｎｈｉｂＵｏｒ（２０＾Ｍ）ｆｂｒ４８ｈ，ｔｈｅｎｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙＭＴＴ＊ａｓｓａ．戶＜０５ｃｏｍ１ｔ．ｙ．０ｐａｒｅｄｗｉ：ｈｃｏｎｒｏｌ３．５ＳＭ３０８诱导细胞自嗟流损伤与其诱导的细胞调亡的相关性为了探讨ＳＭ３０８引起的细胞自嗤流损伤与其诱导的细胞潤亡之间的相Ｗｂｌｉ关化我们采用饥饿处理诱导细胞自瞻的启动，通过ｅｓｔｅｒｎｏｔｔｎｇ检测在饥饿处理的条件下ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡的影响。结果显示饥饿处理增强细胞自隨后促进了？紀的降解，而饥饿条件下８＼１３０８（２４＾ｉＭ）处理的细胞其ｐ６２水平并没有下调，更重要的是在饥饿条件下ＳＭ３０８处理细胞３ｈ后ＰＡＲＰ蛋白明显被剪切活化，强于ＳＭ３０８单独处理组，表明饥饿处理明显地増强了ＳＭ３０８诱导的Ｈ巧Ｇ２／ＡＤＭ细胞调亡（图３．１６）。同时，与ＳＭ３０８单独处理组相比，用Ｒａｐａｍｙｃｉｎ抑制ｍＴＯ民诱导自唆的肩动后，ＳＭ３０８引起的Ｃａｓｐａｓｅ３活化和ＰＡＲＰ的剪切也显著增强，表明民ａｐａｍｙｃｉｎ处理细ＳＭ３０８３１胞同样增强了诱导的细胞调亡（图．７）。这些结果提示当用饥饿处５４ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文理细胞，或者用民叩ａｍｙｃｉｎ抑制ｍＴＯ民时，自幢启动增强，细胞内产生的大量自嗤体加重了溶酶体的负荷，再加上ＳＭ３０８作用于细胞后溶酶体的降解一，，从而能力受损，自隨溶酶体不断累积致使细胞自略流的损伤进步增强加剧了细胞的调古。——Ｓ化ｒｖａｔｉｏｎ＋＋－ＳＭ３０８－＋＋当咖捕ＰＡＲＰｉｆｌｌｋｉＭＭｉＣ＾ｌｅａｖｅｄＰＡＲＰ｜｜＿ａｍ＾ｇｌ－ａｃｔｉｎ編ＢＭＨｐＩｉｌｌＰＰＩＩｍ图３．１６饥饿处理对ＳＭ３０８诱导的细胞澗亡的影响＊２ＡＤＭＥｆｔｓＭ１ａｏｔ；ｏｓｉｓｏｆＨｅＧ／ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅＦｉｇｕｒｅ３．１６ｅｃｏｆＳ３０８ｏｎ：ｈｅｐｐｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｔｔｔｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｌ；．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｔｒｅａｔｅｄｗｉ化２４ｐａｕｏｐｈａｇｙｉ打ｄｕｃｅｒＳａｒｖａｉｇ（）ｉＭＳＭ３０８ｆｂｒ３ｈｕｎｄｅｒｃｏｍｅｔｅｍｅｄｕｍｏｒｓ１；ａｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ化ｅｃｅｌｌｌｉ，［ｐｌｙｓａｔｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｈｈＷｅｓｔｅｒｎｂｉｏ行ｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｉｎｄｉｃａ化ｄａｎｔ化ｏｄｉｅｓ．－ｃｏｎｔｒｏａｃｔｉ打ｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌ．ｌｏａｄｉｎｇＰ—ＳＭ３０８—牛＋——＋牛ＲａａｍｃｉｎｐｙＣａ齡‘簡ｓｐａｓｅ３Ｉ？■欄ＣｌｅａｖｅｄＰＡＲＰｍｍｍｊ｜－Ｉ？ＬＣ３／ＩＩＨＪｆｌ．｜－ａｃｍｐｔ誦翊■顯图３．１７民ａｐａｍｙｃｉｎ预处理对ＳＭ３０８诱导的细胞稠亡的影响Ｈｇｕｒｅ３．１７ＥｆｅｃｔｓｏｆＳＭ３０８ｏｎ出ｅａｐｏＵ）ｓｉｓｏｆＨｅｐＧ２／ＡＤＭｃｅｌｌｓｉｎｌ：ｈｅｐｅ打ｃｅｏｆｈＲｉｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｆｔｅｒｅｘｏｓｕｒｅ！；〇ＳＭＳ０８ｒｅｓａｕｔｏｐａｇｙｉｎｄｕｃｅｒａａｍｃｎｐｐ（ｐｙ）ｅｏｆＲａａｍｃｉｎｆｂｒ２４ｈｔｏｔａｌｃｅｌｌｌｓａｔｅｓｗｅｒｅｉ打化ｅａｂｓｅｎｃｅｏｒｐｒｅｓｅｎｃｐｙ，ｙ５５ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文ｍｍｕｎｏｂｏｔｅｄｆｏｒｉｌｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆＣａｓｐａｓｅ３ａｎｄＣｌｅａｖｅｄＰＡＲＰｌｅｖｅｌｓｕｓｉｎｇｓｅｃ－ｐｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐａｃｔｉｎｗａｓｓｅｒｖｅｄａｓａｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ．４｝寸论４．１ＳＭ３０８诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞白處流损伤的探巧自隨（本文指巨自睡）是细胞内进化上极为保守的催化过程，指细胞中的蛋白质一、细胞器Ｗ及病原体被包裹在起形成自随体最终与溶酶体融合而被降解的全过程，前期大量研究表明自隧在多种疾病的发病机制中扮演者重要角色，如神经退行性疾病、病原体感染、衰老及癌症发生等。自唆在癌症中的作用主要依赖于肿瘤类型、发展阶段及其遗传特点等方面。在细胞发生应激如缺氧、营养缺陷Ｗ及某些药物治疗等情况，细胞诱导自懂发生促进细胞生存，而在特定情况下，细胞启动的持久过量的自隨应答往往导致ｕｕ’ｉｗ细胞发生自隧性死ｔ即ＩＩ型程序性死亡。基于在调节细胞生存及死亡中的双重作用，自隨己经成为癌症的主要治疗靴点。然而这种双重作用使得自礎研究在临床中的应用仍面临许多挑战，因此有必要对自懂诱导肿瘤细胞死亡过程中的关键调控事件及分子机制进行深入研究。我们对从升麻中分离的环藻萝蜜烧型Ｈ萌类化合物ＳＭ３０８进巧体外细胞毒性筛选发现，该化合物对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞显示出较好的的增殖抑制活性，并且饥饿处理可显著提高ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞的増殖抑制作用。由于饥饿可Ｗ促进细胞自唆，因此我们对ＳＭ３０８是否调控ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自唆进行探讨。巧光染料ＭＤＣ可用于标记细胞内的酸性结构，初步检测发现ＳＭ３０８作用于ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞比后细胞内即出现绿色英光，且英光强度呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性増加，提示ＳＭ３０８作用于ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞后，细胞内的酸性囊泡增多。通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测发现３０８处理细胞３ｈ－，在ＳＭ后，自隨标志性蛋白ＬＣ３ＩＩ型开始出现并且含量逐渐增加，而自隨相关蛋白Ｂｅｃｌｉｎ１的含量开始下降且呈显著的时间依赖性－，Ａｔｇ５的含量无明显变化。自嘘体膜型ＬＣ３ＩＩ含量的增加从蛋白水平上证明ＳＭ３０８处理细胞３ｈ后，细胞内自旌体数量开始増加，说明ＳＭ３０８有可能促进了细胞自唆体的形成，但不排除细胞自隨流受到抑制而使得自隨体降解受到抑制的可能性。一Ｃ进步我们采用Ｌ３Ｔｕｒｎｏｖｅｒ实验对细胞自曠流进行评价。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明，在自隆抑制剂ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１（阻止自礎体与溶酶体的融合过程）存在的情况下，与未经ＳＭ３０８处理的细胞相比，经ＳＭ３０８处５５ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文－理的细胞其ＬＣ３ＩＩ型的积累量并未増加。在自隨发生过程中，Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１３－ＩＩ蛋白通过直接结合ＬＣ被选择性地包裹进入自睡体而最终被降解，因此细胞内Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白的水平的降低反映细胞自嘘性降解能力的增强。我们的检测结果发现ＳＭ３０８处理细胞６ｈ后明显增加了细胞内Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白的水平。这些结果均说明ＳＭ３０８抑制了ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自旌流。一我们进步通过透射电镜观察细胞亚显微结构的变化，结果发现２４ｎＭＳＭ３０８作用于细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞６ｈ后，细胞内出现包裹有未能降解内容物的单层膜结构即自隨溶酶体，而阳性对照组细胞中大多是已完成对包裹物降解的自嘘溶酶体，这堅现象提示ＳＭ３０８导致大量未能降解内容物的自懂溶酶体积累于细胞。ＺｈａｏｈｕｉＷａｎｇ等通过透射电镜观察经苦参碱处理的一ＳＧＣ７９０１细胞时也发现了类似的现象，进步研究发现苦参碱破坏了溶酶体ｓｗｉ的酸性及溶酶体酶活性进而阻止了自睡性底物的降解。ＷｅｎＹｕｅ等发现盐霉素能通过抑制溶酶体酶的降解活性而抑制乳腺癌干细胞的自隨流，最终引ｗｑ起乳腺癌干细胞调亡率的增加。由此，我们推测ＳＭ３０８也有可能影响溶酶体的功能。前期大量的研巧发现溶酶体损伤能够使自嗤性底物无法降解最终导致ｗｓ－ｗｉ一－细胞自礎流受抑制。ＤＱＢＳＡ是种牛血清蛋白衍生物，其会在溶酶体中积累并被其中的蛋白水解酶水解而释放出可被激发产生紅色巧光的ＢＯＤＩＰＹ－－ＴＲＸ片段ＢＳＡ，我们通过ＤＱ实验来检测溶酶体内蛋白水解酶活性。与Ｃｏｎｔｒｏｌ组细胞相比，经ＳＭ３０８处理的细胞内发出的巧光强度明显较‘一弱，提示ＳＭ３０８处理ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞抑制了溶酶体的降解活，送点接与前人的研巧相符。然而我们的实验只是初步证实了细胞内溶酶体的降解活一性受到抑制，其具体的分子机制有待于进步探讨。组织蛋白酶（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）做为溶酶体酶的主要组成部分，，其在溶酶体行使降解功能时起重要作用研究发现枠木酸的糖基化衍生物Ｂ１０抑制Ｕ８７ＭＧ细胞自隨流时，细胞内溶酶ｔｉｗ体的完整性受损导致组织蛋白酶Ｚ和Ｂ释放入胞浆，最终引起细胞死亡。一。因此，下步拟对溶酶体内组织蛋白酶如Ｄ和Ｂ的活性进行检测４．２Ｐ巧Ｋ／Ａｋｔ信号通路异常活化与ＳＭ３０８诱导的细胞自處流损伤的相关性探讨，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路在癌症发生中参与重要的信号调节众所周知，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路能够调节许多重要的生物学过程，包括细胞增殖、细胞周期、细胞骨架结构、细胞膜泡运输Ｗ及葡萄糖转运等过程在本研究中我们发现ＳＭ３０８作用于细胞１ｈ后Ｐ巧激酶Ｐ１１０ａ和磯酸化的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）５７ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文水平巧明显上调，说明该信号通路被活化。对于ＰＤＫ／Ａｋｔ信号通路对细胞自隨调节的研究多集中在其对自随发生早期的调控，即ＰＢＫ／Ａｋｔ通过激活ｉｌｌｉｗ心，，ｔ１下游祀蛋白ｍＴＯＲ而负调控自隆早期的发生。而ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ对自隨后期（自唆体与溶酶体的融合Ｗ及融合之后的降解等过程）的调控研究得比较少。在前期研究中我们知道ＳＭ３０８抑制溶酶体的降解活性，使得细胞自懂流受到损伤，那么ＰＤＫ／Ａｋｔ通路的活化与ＳＭ３０８诱导的细胞自懂流损伤之间是否存在联系呢？为了探讨这个问题，我们使用Ａｋｔ的ｓｉＲＮＡ预处理细胞，观察细胞自隨流的变化。实验显示，使用Ａｋｔ的ｓｉＲＮＡ处理细胞后，－Ａｋ－ｐｔ（Ｓｅｒ４７３）蛋白水平下降，ＬＣ３ＩＩ蛋白水平上升，并且ｐ６２蛋白水平下降，说明沉默Ａｋｔ后ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞启动自旌，自唆流增强。单独使用－ＳＭ３０８－Ａｋ处理细胞时，ｐｔ（Ｓｅｒ４７３）和ＬＣ３ＩＩ蛋白水平湿著上升，ｐ６２蛋白水平微略上升。与单独使用ＳＭ３０８相比，当Ａｋｔ的ｓｉＲＮＡ与ＳＭ３０８共－Ａｋ－同处理细胞时ｔＳｅｒ４７３）、ＬＣ３ＩＩ６２蛋白水平均发生明显下调。，ｐ（和ｐ证明沉默ＡｋＳＭ３０８对细胞自跑流的抑ｋ－ｔ后，制明显减轻，表明Ａｔ或者ｐＡｋｔ的激活参与调控ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自曠流的抑制。类似的现象也２２ｍＵ’在ＹｉｎｇｅｉＺｈａｎｇ等惭研究中发现，Ａｋｔ蛋白的敲除极大地降低了因高脂饮食导致的鼠也肌细胞自唆流损伤，从而起到保护也肌细胞的作用。同时，我们也使用了ＰＩ３Ｋ抑制剂ＬＹ２９４００２化理细胞，其对ＳＭ３０８诱导的细胞自一唆流损伤的影响与沉默Ａｋｔ所产生的影响致。因此我们推测ＳＭ３０８作用于细胞后ＰＤＫ／Ａｋｔ通路的活化参与ＳＭ３０８对细胞自幢流的抑制。但是对于ＰＤＫ／Ａｋｔ是通过下游哪些关键性蛋白来调控细胞自喔流的抑制等问题，还有待于后续实验研巧。４３ＳＭ３０８诱导细胞自嗟流损伤与其诱导的细施调亡相关性探ｉ寸此外，我们对化合物ＳＭ３０８能否诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞发生调亡进行检测，发现不同浓度ＳＭ３０８处理细胞２４ｈ和４８ｈ后，细胞总的调亡率呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性增加；Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃａｓｐａｓｅ９Ｗ及调亡标志蛋－白ＰＡＲＰ均发生剪切活化时－，泛Ｃａｓ（ＺＶＡＤＦＭＫ）可Ｗ显；同ｐａｓｅ抑制剂著地抬抗ＳＭ３０８对细胞的增殖抑制作化而Ｃａｓｐａｓｅ８作为外源性调亡途径的执行者制剂Ｚ－－ＩＥＴＤＦＭＫ未能括ＳＭ３０８对细胞的增殖抑制作用，其抑抗，说明ＳＭ３０８可能通过内源性线粒体途径诱导ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调ｔ。调亡作为一种细胞主要的死亡方式，其与自嗤的关系比较复杂。在营养ｉＭｔｌ缺乏等环境下自礎能够促进细胞的存活，抑制自隨促进细胞发生调亡，５８ 北京协和医学院硕－上研巧生毕业论文ｎｓｎｔ’ｗ然而有研充发现在某些情况下，过度自晚能促进邮瘤细胞调亡。那么，自嗦流抑制能否促进细胞调亡呢？ＳＭ３０８引起的细胞自巡流抑制与其诱导的调亡之间又有什么联系呢？本研巧前期发现ＳＭ３０８抑制溶酶体的降解功能而使ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自隨流受损，而溶酶体的降解功能失常会导致溶酶体无法将其包裹的内容物降解为氨基酸等营养物质Ｗ供细胞再利用，在外界营养供应不足的情况下这对于细胞的生存是非常不利的。对于肿瘤沮织而言，其主要依靠周围正常组织的血液循环系统供给氧气和营养物质，随着肿瘤的快速增长，新生血管开始形成，但其远不能满足快速增殖的肿瘤组织的２７ｉ２８Ｕ’需求ｌ，致使肿瘤组织处于缺血缺氧状态，此时肿瘤细胞需要增强自隨来维持生存，因此功能正常的溶酶体对脚瘤细胞的生存发挥着重要作用。我们采用不含血清的培养基处理细胞１２ｈ模巧肿瘤微环境并观察ＳＭ３０８对ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞的増殖抑制能力，ＭＴＴ结果表明与使用完全培养基处理的细胞相比，经饥饿处理（诱导自踐的启动）的细胞显著增强了对化合物ＳＭ３０８的敏感性ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎ表明在细胞营养缺乏情况下，同时，Ｗｇ检测结果，ＳＭ３０８（２４Ｍ）处理细胞３ｈ后ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞即发生ＰＡＲＰ的剪切活化，ｎｐ２４而在同样浓度药物作用下，用含完全培养基培养的细胞在药物处違ｈ后才一ＳＭ３０８Ｒａａｍｃ出现调亡现象。进步研究发现，与单独处理组相比，用ｐｙｉｎ抑制ｍＴＯ民增强自隨的启动后，ＳＭ３０８引起的Ｃａｓｐａｓｅ３活化和ＰＡＲＰ的剪切也显著増强，，提示调亡的增加。据此我们推测当用奶饿处理细胞或者用Ｒａｐａｍｙｃｉｎ抑制ｍＴＯＲ时，自峰启动増强，细胞内产生的大量自隨体加重了溶酶体的负荷，再加上ＳＭ３０８作用于细胞后溶酶体的降解能力受损，自嗟溶酶体不断累积一，致使细胞自随流的损伤进步増强，从而加剧了细胞的调亡。这些结果均表明ＳＭ３０８导致的自隧流损伤促进ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞发生ｐ一调亡。类似的现象也在ＰＧｏｎｚａｌｅｚ等的研究中发现，种枠木酸衍生物Ｂ１０一能够引起Ｕ８７ＭＧ细胞溶酶体通透性发生改变，导致细胞自唆流受损，进ａｓａｓｅ步研巧发现溶酶体酶释放入胞浆，并通过作用于Ｃｐ底物诱导细胞发生ＵＷ调亡。因此我们推测ＳＭ３０８诱导的ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞调亡也有可能与细胞溶酶体酶的相关功能有关系一，但还需要进步研究来验证我们的推测。一３０８总而言之，我们首次发现升麻中种环盤萝蜜烧型Ｓ荫类化合物ＳＭ能够降低溶酶体的降解活性，导致巧癌耐药细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ细胞自幢流损。伤，并且ＳＭ３０８引起的自幢流损伤促进细胞发生调亡更重要的是，化合物ＳＭ３０８能够异常激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路，初步研究表明ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的活化参与ＳＭ３０８对细胞自唆流的抑制过程中（图４．１）。５９ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文ＳＭ３０８／｜＼＾ＬｓｏｓｏｍａｌｄｅｒａｄａｔｉｏｎＰＩ３ＫｙｇＣａｓｐａｓｅｓＩａｃｔｉｖｉｔｙ令ＡｋｔｔＡｔｏｓＡｕｏｈａｉｃｆｌｕｘ１ｏｐｉｓｐｇｐ图４．１ＳＭ３０８抗肿瘤作用的可能信号通路图ａ提示抑制作用）６０ 北京协和医学院硕±研巧生毕业论文第兰章研究创新点及展望１．１研究创新点一－１）首次揭示升麻中种新环藻萝蜜掠型Ｈ荫类化合物ＳＭ３０６诱导ＭＣＦ７细胞调亡的分子机制，为该化合物发展成为抗肿瘤候选药物提供理论依据。２首次发现升麻中一３０）种环薇萝蜜掠型Ｈ萌类化合物ＳＭ８能够降低溶酶体的降解活性，导致肝癌耐药细胞ＨｅｐＧ２／ＡＤＭ自晦流损伤，并且ＳＭ３０８引起的自唆流损伤促进细胞发生调亡。３首次发现化合物ＳＭ３０８能够激活ＰＢＫ７Ａｋｔ信号通路，并且初步研巧表）明ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的的活化参与ＳＭ３０８对细胞自峰流的抑制过程中。４）首次报道环薇萝蜜烧型Ｈ萌类化合物能够诱导细胞自隨流损伤，为该类化合物与自隨流相关性研巧提供新的研究实例。１．２研巧展望然而，我们的研究尚存在Ｗ下问题需要解决：１化合物ＳＭ３０８具体作用靴标在哪里？）２化合物ＳＭ３０８具体通过何种机制抑制溶酶体的降解活性？）？３细胞自晦流受损伤是如何促进细胞发生调亡的）４为什么化合物ＳＭ３０８作用于ＨｅＧ２／ＡＤＭ细胞Ｉｈ后ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路）ｐ即被活化？气ＰＩ３Ｋ７Ａｋｔ通路的活化如何参与到ＳＭ３０８对细胞自幢流的抑制过程中，其具体的调节机制是什么？６１ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文参考文献。ｕｙａｎ，ＳｈｉＺ，ＺｈａｏＳ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈａｔｈｗａｙｓｉｎｃａｎｃｅｒ：ａＫｖｉｅｗｏｆ］ＯｇＬｇｐａｏｔｏｓ－ｉｓａｕｔｏｈａａｎｄｒｏｒａｎｉｃｒｏｓｉｓＪｅｌｌｒｌ祇ｒｔｏｎ２０２４５：４４９８ｍｅｄ打ｅ．ＣＰｏａｉ１８７．ｐｐ，ｐｇｙｐｇ，，巧）［］２ｅｒｒＪＦＷｌｉｅＡＨＣｕｒｒｉｅＡ民ｗ－ｎＫ．Ａｓｓ：ａｓｃｏｏｃａｌｈｅｎｏｍｅｎｏｎｗｄｅｉｎ］ｌｏｔｏｉｂａｉｂｉｌｉｉｔｈｉｒａ［，，ｇｇｇｙｐｐｐ４２３９ｉｌｉｃａｔｉｏ打ｓｉｎｔｉｓｓｕｅｋｉ打ｅｔｉｃｓ．良ｒｉｔｉｓｈｏｕｒｎａｌｏｆｃａｎｃｅｒ１２６．ｍ口］，９７２：ｐｊ，（）Ｋ．ｒａｎｄ化ｓｒｓｅｉｓｈｉｄａＹａｍａｕｃｈｉＯＯｔｓｕＫＣｏｓｓｔａｌｋｂｅｔｗｅｅｎａｕｔｏｈａａｏｉｓｉｎｈｅａｔｄｉａｓｅＰ］Ｎ，ｇ，ｐｇｙｐｐ－Ｔ．Ｃｉｌｉ２００８３５１？ｒｃｕａｔｏ打民ｅｓｅａｒｃｈ１０３４：３４３．［］，，（）４ＭａｒｔｉｎＳＪ，Ｇｒｅｅ打Ｄ民．Ｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏ打ｄｕｒｉｎａｏｔｏｓｉｓ：ｄｅａｔｈｂｙａｔｈｏｕｓａｎｄｃｕｔｓ？Ｊ．［］ｇｐｐ［］－Ｃｅｌｌ１９９５８２３３４９３５２．，，（）：－ｅａｅｅｃｕｗｅｍｅｎｏｈｅｎＧＭＳｕｎＸＭＦｅａｍｈｅａｄＨｔｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｌａｒｍｏｌｌａｒｉｈｔｆｒａｔｓｏｆ口，，，］ＣｇｇｇＤＮＡｉｓ过ｋｅｙｃｏｍｍｉｔｅｄｓｔｅｐｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ＂］？ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，－１７５．巧（２：５０１６）６ＤｉｘｉｌｉｉＡｓｈｋｅｎａｚｉＡｔＶＭ．Ａｏｔｏｓｉｓｃｏｎｔｒｏｂｄｅａｔｈａｎｄｄｅｃｏｒｅｃｅｔｏ巧Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔｏｎｏｎ［］，ｐｐｙｙｐ［］ｐ－２２．ｉ打ｃｅｌｌｂｉｏｌｏ１９９９ｎ：５５２６０ｇｙ，，（）７ＭｏｈａｍａｄＮＧｕｔｉｅｒｒｅｚＡＮｕｎｅｚＭｔａｌ．ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｔｔｉｃａｔｈｗａｓＪ．Ｂｉｏｃｅｌｌ２００５［］，，，ｅｐｏｐｏｐｙ［］，，２９２－：１４９６１１．（）岡ＷａｊａｎｔＨ．ＴｈｅＦａｓｓｉｇｎａｌｉｎａｔｈｗ：Ｍｏｒｅ化ａｎａａｒａｄｉｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６５５巧：ｇｐ巧ｐｇ［７］（）５－１６３１的６．９ＬｉＨＺｈｕＨＸｕ－ＪＢＤＣｅｔａｌ．ＣｌｅａｖａｅｏｆＩｂｃａｓａｓｅ８ｍｅｄｉａｔｅｓｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄａｍａｅ［］，，，ｇｙｐｇ９８４４９－ｉｎｔｈｅＦａｓｐａｔｈｗａｙｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓＪ．Ｃｅｌｌ１９９４：１５０１．［］，，（）ＫｒｏｅｍｅｒＱＧａｌｌｕｚｚｉＬ，ＢｒｅｎｎｅｒＣ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｉｉｉ打ｃｅｌｌｄｅａｔｈｐＰｈｗ２００７８７－１９９１６３．．ｙｓｉｏｌｏｉｃａｌ民ｅｖｉｅｓ：阴ｇ，，（）；［１１］ＳｈｉＹＧ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃａｓｐａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏ灯ｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ２００２－Ｃｌｌ９３：４巧４７０．，，（）１２ＢｔｒｉｈｔＫＭＳａｌｖｅｅｎＧＳ．ｌｌｏａ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｔｉｔｉｏｎＪＣｒｒｅｎｔｉｉｉｎｃｅ［］ｇ，ｓｓｏｆｃａｓｐａｓｅａｃｖａ［］ｕｏｐｎｏｎ－ｂｉｏｌｏｇ２００３１５６：７２５７３１．ｙ，，（）－Ｎａｔ１３ＳａｌｖｅｓｅｎＧＳＤｘｅｌｉｘｉｔＶＭ．Ｃａｓａｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＴｈｅｉｎｄｕｃｅｄｒｏｉｍｉｔｍｏｄｌＪ．Ｐｒｏｃ［］，ｐｓｐｙ［］－ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９９？＞６２０：１０９６４１０９６７．，，（）１４ＰｏＣＴｉｍｍｅｒＪＳｅｒａｎｄｉＳｅｔ－ｉＪ［］ｏａｌ．Ｔｈｅａｏｔｏｓｏｍｅａｃｔｉｖａｔｅｓｃａｓａｓｅ９ｂｄｉｍｅｒｉｚａｔｏ打［］，ｐ，，ｐ，ｐｐｐｙｒ２００６－２７５ＭｏｌｅｃｕｌａＣｅｌｌ２２２：２６９．，，（）１５ＥａｍｓｈａｗＷＣＭａｒｔｉｎｓＬＭＫＨ．Ｍａｍｍｌｉｓａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｔｉｔｉｏｎ，，ａｕｆｍａｎｎＳａａｎｃａ，ｃｖａ，［］ｐｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓＪ．Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，６８（１：［］）３８３－４２４．－１６ＢｒｕｎｅｌｌｅＪＫＬｅｔａ．ｕｒｎａｉＡ．ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｏｔｏｓｉｓｂｔｈｅＢｃｌ２ｆａｍｉｌＪＪｏｌｏｆ［］，ｐｐｙｙ［］－ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ２００９１２２４：４３７４４１．，，（）１７ＤａｎｉａｌＮＮＫｏｒｓｍｅｙｅｒＳＪ．Ｃｅｌｌｄｅａｔｈ：ＣｒｉｔｉｃａｌＣＯ打ｔｒｏｌｏｉ打ｔｓ．Ｃｅｌｌ２００４１１６２：，，，［］ｐ口］（）２０５－２１９．１８ＬｉｎｄｓｅｎＴ民ｏ巧ＡＪＡａ－ｔＫｉｎｌＴｈｅｃｏｍｂｎｅｄｉｎｃｏｎｒＢｃ２ｆａｍＵ巧．ｉｆｉｔｉｓｏｆｏａｐｏｐｔｏｔｉｃｌ，，ｇ，ｐｙ［］ｍｅｍｂｅｒｓＢａｋａｎｄＢａｘａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｎｏｒｍａｌｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｌｅｔｉｓｓｕｅｓＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｐ［］Ｃｅ－ｌｌ２０００６６：１３８９１３９９．，，（）６２ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文１９ＮａｋａｎｏＫＶｏｕｓｄｅｎＫＨＡ．．ＰＵＭａｎｏｖｅｌｒｏａｏｔｏｔｉｃｅｎｅｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂ巧Ｊ［］，，ｐｐｐｇ，ｙＰ［］－ｌｅｃｕｌａｒ２００ＭｏＣｅｌｌ１７３：６８３６９４．，，（）口０ＺｈａＪ，ＨａｒａｄａＨ，ＹａｎＥ，ｅｔａｌ．ＳｅｒｉｎｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆｄｅａｔｈａｏｎｉｓｔＢＡＤｉｎｒｅｓｏｎｓｅ化］ｇｐｐｙｇｐ－－－－ｓｕｒｖｉｖａｌｆａｃｔｏｒｒｅｓｕｌｔｓｉｎｂｉｎｄｉｎ化１４３３ｎｏｔＢ（ＸＸＬＪ．Ｃｅｌｌ１９９６８７４：６１９６２８．ｇ，，［］（）［２１］Ｙｅｔｈｏ打ＪＡ，Ｅｐａ打ｄ民Ｆ，ＬｅｂｅｒＢ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｒｆａｃｅｔｒｉｇｇｅｒｓａｒｅｖｅｒｓ化ｌｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｉ打Ｂａｘ打ｏｒｍａｌｌｙａ巧ｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．－Ｊｏｕｒｎａ２７８．ｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２００３４９：４８９３５４８９４１ｇｙ，，（）［２巧ＷｅｉＭＣ，ＺｏｎｇＷＸ，ＣｈｅｎｇＥＨ义ｅｔａｌ．ＰｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃＢＡＸａｎｄ技ＡＫ：Ａｒｅｑｕｉｓｉｔｅｇａｔｅｗａｙｍｎ－化１巧２ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏａ打ｄｄｅａｔｈＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５５１７：７２７７３０．［］，，（）２３ＷａｎＸＤ．Ｔｈｅｅｘａｎｄｉｎｒｏｌｅｏｆｍｋｏｃｈｏｎｄｒｉａｉ打ａｏｔｏｓｉｓ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ，［］ｇｐｇｐｐＵ］ｐ２００－１１５２２２９２２．，（）：２９３３２ｏｌｌＵＭ．Ｐ巧ｈａｓａｄｉｒｅｃｔａｏｔｏｅｎｉｃｒｏｌｅａｔ化ｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．巨ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄ［叫Ｍｐｐｇ［叮－ｌｅｃｕｔ２００４１２ＭｏｌａｒＭｕａｅｎｅｓｉｓ４４３：２６１６．ｇ，，（）２５ＣｈｕｋＥｗａｎａＴｕｃｈｒ－ＨＬ５３ｍｅｄｉＪＫｕＢｏｉｅａｙｅｓｅｔａｌ．ＤｉｒｅｃｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＢａｘｂｉａｔｅｓ［］ｐ，，，ｙｐａｍｅｍｂＪｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌｒａｎｅｅｎｎｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｏｔｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４３０３５６６０：ｐｐ［，，ｐ］（）－１４１０１０１０．２６ＳｏｔＢＦｒｅｕｎｄＳＭＦｔＡＲ．Ｃｏｍａｒａｔｉｖｅｂｉｏｈｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ５３ｗｉｔｈｔｈｅ［］，，ｅｒｓｈｐｐｙｓｐｒｏ－ａ－－ｔｏｔｉｃＢＡＫａｎｄｔｈｅａｎｔｉａｔｏｔｃＢＩｖｘＬＪＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｏｃａｅｍｉ２００７ｐｏｐｐｏｐｉＣ．ｌｉｌＣｈｓｔｒ，ｐ［］ｇｙ，２８２４０２９－：１９３２９２００．（）ｈ－２７ＣｉｕｋＫｌｌｌｉＪＥＢｏｕｃｈｉｅｒＨａｅｓＬｕｗａｎａＴｅｔａｌ．ＰＵＭＡｃｏｕｅｓｔｈｅｎｕｃｅａｒａｎｄｃｔｏａｓｍｃ［］ｐ，ｙ，，ｐｙｐｒｏａｏ２００５－１７ｐｐｐｔｏｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５３？Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９５７４１：１７３２３５．ｐ口］，，（）２ＤａｖｅｒＡＰ．ｉｓ民Ｊ．ＳｉｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈＪＮＫｏｕｏｆＭｋｉｎａｓｅｓＪＣｅｌｌ２０００１０３２：［句ｇｇｐ［］，，（）２３９－２５２．［２９］巧ｏｒｋｂｌｏｍＢ，ＶａｉｎｉｏＪＣ，ＨｏｎｇｉｓｔｏＶ，ｅｔａｌ．ＡｌｌＪＮＫｓｃａｎｋｉｌｌ，ｂｕｔｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｓｒＪｕｒｎａ２００８２８－ｃｉｔ：４７ｉｃａｌｆｏｒｎｅｕｒｏｎａｌｄｅａｔｈ．ＪｏｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２８３１９７０１９１３．，，［］ｇｙ（）口０ＫｏｌｏｍｅｉｃｈｕｋＳＮ，ＴｅｒｒａｎｏＤＴ，ＬｌｅＣＳ，巧ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｓｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｓｏｆｍｉｃｒｏｔｕｂ山ｅ］ｙｇｇｐｙ－－－ｉｎｈ化ｉｔｏｒｓｖｉ打ｂｌａｓｔｉ打ｅａｎｄＴａｘｏｌｉｎｄｕｃｅＪＮＫｄｅｅｎｄｅ灯ｔ化１１ｄｅａｔｈｂｕｔｔｈｒｏｕｈＡｉ１ｄｅｅｎｄｅｎｔｐｇ？哀ｐ－－ｒｅｓｅｃｖ－ａｎｄ：１ＡＰｌｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｉｅｌＪ，ＦｅｂｓＪｏｕｒｎａｌ２００８２７５１８８９８９９．ｐ，ｐｙ，，［］巧）口。ＫｈａｒｂａｎｄａＳ，ＳａｘｅｎａＳ，ＹｏｓｈｉｄａＫ，ｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＳＡＰＫ／ＪＮＫ化ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｎｄ－ＤＮＡｆｒｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＢｄｘ：Ｌｉｎｒｅｓｏｎｓｅ化ｄａｍａｅＪ．ＪｏｕｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ２０００（）ｐｇ［］ｇｙ，，２７５２４３３－：１９１９４３３．（巧ｈａｕｈａｎ－口马ＣＤＬｉＧＨｉｄｅｓｈｉｍａＴｅｔａｌ．ＪＮＫｄｅｅｎｄｅｎｔＫｌｅａｓｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｒｏｔｅｉｎ，，ｋ，ｐｐＳｍａｃ，ｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ（ＭＭ）ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０－１７５９３２００３２７８：１７巧６．，（）－３Ｄｅｎｔａｌ－义Ｒｅｎ式ＹａｎＩ．ＡＪＮＫｄｅｔｔｈｗａｉｓ巧ｉｒｒＴＮＦｉｃｅｄ口］ｇｇｖ，ｅｐｅｎｄｅｎｐａｙｑｕｅｄｆｏａ打ｄｕ－ａｏｔｏｓｉｓＪ．Ｃｅｌｌ２００３１１５１：６１７０．ｐｐ［］，，（）［３４］ＬｅｔａｉＡＢａｓｓｉｋＭＣＷａｌｅ打ｓｋＬｅｔａｌ．ＤｉｓｔｉｎｃｔＢＨ３ｄｏｍａｉｎｓｅｉｔｈｅｒｓｅ打ｓｉｔｉｚｅｏｒａｃｔｉｖａｔｅ，，ｙ，ｍｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｔｏｓｉｓｓｅｒｖｉｎａｓｒｏｔｏｔｅｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｓ．Ｊ．Ｂｌｏｏｄ２００２１００１１：ｐｏｐｇｐｙｐｐ［］，，（）２００ａ－２００ａ．［３５］ＴｉａｎＺ，ＹａｎｇＭＳ，ＨｕａｎｇＦ，ｅｔａｌ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｔｈｒｅｅｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍｒ－ｃ：ｉｍｉｃｉｆｏａｄａｈｕｉｃａＪ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔ２００５２２６１６５７５．ｇ［］，，（）口巧ＦａｎｇＺＺ，Ｎｉａｎ义ＬｉＷ，巧ａｌ．ＣｙｃｌｏａｒｔａｎｅＴｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＣｉｍｉｃｉ扣ｇａｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｅＡｐｏｔｏｓｉｓｏｆＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓＭＣＦ７ｖｉａ５３ｄｅｅｎｄｅｎｔＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＳｉｎａｌｉｎｐ（）ｐｐｇｇ－Ｐａｔｈｗａ．ＰｈｔｏｔｈｅｒａＲｅｓｅａｒｃｈ２０１１２５１：１７２４．ｙ阴ｙｐｙ，，（）６３ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文３７ＺｈｕＤ－ＦＺＧ－ＬＬ－ＭａｈｕＫｏｎｅｔｌ．ＣｃｌｓＲＣｉｉ］ｌｏａｒｔａｎｅＧｃｏｓｉｄｅｆｒｏｍｔｈｅｏｏｔｓｏｆｍｃｉｆｕａ，，［，ｇｙｙｇｆｏｅｔｉｄ过ｗｔｔｎａｔｎｈＡ！？ｔｕｅｃｔｉｈＷｎＳｉｇｌｉｎＰａｈｗａＩ化ｉｔｏｒｃｔｉｖｉｔ？Ｎａｒａｌｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｂｉｏｒｏｓｉｎｇｙｙｙ［］ｐｐｐｇ，－２０１５５２：６１６７．，（）［３８］ＱｉｕＳＸ，ＤａｎＣ。ＤｉｎｇＬＳ，ｅｔａｌ．Ａｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅｆｒｏｍｂｌａｃｋｃｏｈｏｓｈ也ａｔｉｎｈ化ｉｔｓｏｓ化ｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇＲＡＮＫＬａｎｄＴＮＦａｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍＢｉｏｌ，２００７，７－：８６９１４８６０．（）３９ＤｉａｓＤＡＵｒｂａｎＳ民ｏｅ巧ｎｅｒＵ．Ａｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｎａｔｕｒａｌｒｏｄｕｃｔｓｉｎｄｒｕｄｉｓｃｏｖｅｒ［］，，ｐｇｙ－Ｊ．Ｍｅｔａｂｏ２０１２２２：］ｌｉｔｅｓ３０３３％．［，，（）４０ＭａｎＳＧａｏＷＷｅｉＣｅｔａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃ巧ｄｒｕｓ扛ｏｍ化ａｄｉｔｉｏｎａｌｔｏｘｉｃＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉ巴ｉｎｅｓＪ．［］，，，ｇ［］－Ｐｈｔｏｔｈｅｒ２０１２２６１１４１．ｙＲｅｓ０：４９４６５，，（）［４１］ＹｏｋｏｙａｍａＴ，ＭｉｙａｚａｗａＫ，ＮａｉｔｏＭ，ｅｔａｌ．ＶｉｔａｍｉｎＫ２ｉｎｄｕｃｅｓａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｓｉｌｔａｎｅｏｕｓｌｉｎ１Ａｔ．ｍｕ州ｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ．ｕｏｈａ２００８４５：６巧６４０ｙ口］ｐｇｙ，，（）［４：２ＣｈａｎＦＭ，ＳｔｅｅｌｍａｎＬＳ，ＳｈｅｌｔｏｎＪＱｅｔａｌ．Ｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｃｃｌｅｒｏｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ］ｇｇｙｐｇ＂ａｔｓｉｂｔｈ民ａｓ／Ｒａ￡ＭＥＫ／ＥＲＫａｔｈｗａＩｎｔ２００３ｏｓｅＪＯｎｃｏｌ２２３：４６４８０ｐｏｐｙ．９．ｐｙ口］，，（）４Ｐｈ＇Ｍｅ［３ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎＣＲａｒｍａｃｏｏｅｉａｏｆｔｈｅＰｅｏｌｅｓＲｅｕｂｌｉｃｏｆＣｈｉｎａＭ，Ｃｈｉｎａｄｉｃａｌ］ｐｐｐ［］Ｓｃｉｅ打化Ｐｒｅｓｓ，２０１０．［４４］ＮｉａｎＹ）ＺｈａｎｇＹＬ，Ｃｈｅ打ＪＣ，ｅｔａｌ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅ打ｔｓｆｒｏｍｔｈｅｒｏｏｔｓｏｆＣｍｉ２－ｉｉｃｉｆＵｇａｆｏｅｔｄａ．［Ｊ］．ＪＮａｔＰｒｏｄ２０１０７３：９３９８．，，（）［４５］ＮｉａｎＹ，ＺｈａｎｇＸＭ，ＬｉＹ，ｅｔａｌ．ＣｙｃｌｏａｒｔａｎｅｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍｔｈｅａｅｒｉａｌｐａｒｔｓｏｆＣｉｍｉｃｉｆｕｇａ－ｆｏｔｉｄａ１４８ｅＬｉ打打ａｅｕｓＪ．Ｐｈｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１７２ｌ２：１４１１．［］ｙｙ，２０，ｙ＾）巧４６ＴｉａｎＺＹａｎＭＨｕａｎＦｅｔａｌ．Ｃｔｏｔｏｘｉｃｒｅｅｃｃｏａｒｎｅｉｔｅｒｅｎｏｓ［］ｉｔｔｈｌｔａｔｒｉｄｆｒｏｍ，ｇ，ｇ，ｙｙｏｆｙｐＣ－ｉｍｉｃｉｆｕａｄａｈｕｒｉｃａＪ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ２００５，２２６１；６５７５．ｇ［］，（）４７ｈｏｕ－ＴｉａｎＺＺＬＨｕａｎＦｅｔａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒａｃｔｉｖｉｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ］，，［，ｇｙ２５－ａｎｈ－－０－－－ｎａｍａｓｙｃｉｒｏｃｉｍｉｇｅｎ＜ｄ３ｂｅｔａＤｘｙｌｏｒａｎｏｓｉｄｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＳｏｕｌｉｅａｖａｇｉｔａ〇打ｈｅａｔｏｐｙｐＪｒ１７５－５５１．．ＡｎｔｉｃａｎｃｅＤｒｕｓ２００６：５４５［］ｇ，，（）４ＦａｎＺＮｉａｎｔ．ｌｔｔｒｔｅｒｆｉｉｃａｕｎｎｎｉｉＹＬｉＷｅａｌＣｃｏａｒａｎｅｉｅｎｏｉｄｓｒｏｍＣｍｉｆｂａｅｎｓｓｎｄｕｃｅ［別ｇ，，，ｙｙＺｐｇｃｅ－ａｏｔｏｓｉｓｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｌｌｓ（ＭＣＦ７ｖｉａ５３ｄｅｅｎｄｅｎｔｍｉ化ｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｙ［Ｊ．ｐｐ）ｐｐｇｇｐ］Ｐｈ－ｙｔｏ化ｅｒ民ｅｓ２０１１，２５〇）：１７２４．，４９刘稽稽陈胜填化学成分及其抗肿瘤活性研究进展町中南药学２０１２［］，，陈四觀升麻，，－１１０：５３５８．（）［５０］ＭａｌｕｍｂｒｅｓＭ，ＢａｒｂａｃｉｄＭ．Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓｉｎｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎ：化ｃｙｃｌｅｏｒｎｏｔｔｏｃｙｃｌｅ：ａｃｒｉｔｉｃａｌｄｅｃ－ｉｓｉｏｎｉｎｅｒＪＮｔＲｉＣａｅｒ２００１３２２３ｃａｎｃ，ａｕｒｅｅｖｅｗｓｎｃ１：２２１．［］，，（）－－５ａｓｓａｕｅＪ．ｒｅ２００４１５．Ｇ１ｃｅｌｌｃｃｌｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃａｎｃｅｒ？！Ｎａｔｕ４３２７０：２９８３０６．［ＵＭｇｙ［］，，（）松－５２ｉｓｔａｎＭＢＢａｒｔｅｋＪ．ＣｅＵｌｅｃｈｅｃｋｏｉ打ｓａｎｄｃａｎｃｅｒＪ．Ｎａｅ２００４４３２７０１５：，ｃｙｃｔｔｕｒ，，［］ｐ［］（）－３２３３１６．口３］Ｋ叩ｓＧＪＰＬ，ＷｅａｖｅｒＢａＡ，ＣｌｅｖｅｌａｎｄＤＷ．Ｏｎ也ｅｒｏａｄ化ｃａｎｃｅｒ：Ａｎｅｕｌｏｉｄａｎｄ化ｅｐｙｍｏｃ－ｃｈｅｃｋＪＮｒｅＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００５５１７７８５．ｉｔｔｉｏｉｎｔ．ａｔｕｉｅｗｓ０：７３ｐ［］，，（）Ｍａ－４］ｌｕｍｂｒｅｓＭａｒｂａｃｉｄａｌｉａｎｌｉｄｅｄｅｎｔｋｉ凸ａｄｉＢｉｏｃｈｅｉｌ口，ＢＭ．ＭａｍｍｃｙｃｎｐｅｎｓｅｓＪ．Ｔｒｅｎｓｎｍｃａ［］－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２００５３０１１：树０６４１．，，（）５５ＢａｒｔｅｋＪＬｕｋａｓＣＬｕｋａｓＪＣｈＤＮＡＳｈ泌ｅＪ．民］．ｅｃｋｉｎｏｎｄａｍａｅｉｎＮａｔｕｒｅｅｖｉｅｗｓ［，，ｇｇｐ［］－２００４５１０．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌＢｉｏｌｏ：７９２８０４ｇｙ，，（）５６Ｕｂ－ｅｒｓａｘＪＡ，ＷｏｏｄｂｕｒＥＬｕａｎＰＮｅｔａｌ．ＴａｒｅｔｓｏｆｔｈｅｃｃｌｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅＣｄｋｌ［］ｙ，Ｑｇ，ｇｙｐＪｕｒｅ２００３－．Ｎａｔ４２５０：８５９％４．［，，］巧％）６４ 北京栅和医学晓硕±研巧生毕业论文口７ＮｏｒｂｕｒｙＣ，ＢｌｏｗｔＮｕｒｓｅＰ．Ｒｅｕｌａｔｏｒｈｏｓｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ３４ｃｄｃ２ｒｏ化ｉｎｋｉｎａｓｅｉｎ］ｇｙｐｐｐｐｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅＥＭＢＯｊｏｕｒｎａｌ，１９９１，１０（１１）：３３２１．［５８ＣｈｅｎＬＷａｎＸ，ＺｈａｎＪ，巧ａｌ．Ｔａｒｅｔｉｎａｏｔｏｓｉｓｓｉｇｎａｌｉｎａｔｈｗａｙｓｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａ］ｇｇｇｇｇｐｐｇｐｐｙ－ＪｉｉＸｕｅＺｉ．ＺｈｏｎｈｕａＢｎＬａＺｈ２００９３８：６３９６４２．［］ｇｇ，，巧）５９ＺａａｔａＪＭ，ＰａｗｌｏｗｓｋｉＫ，Ｈａａｓ巨，ｅｔａｌ．Ａｄｉｖｅｒｓｅｆａｍｉｌｏｆｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｔｕｍｏｒ［］ｐｙｐｇｎｅｃｃ－ｒｏｓｉｓｆａｔ加ｒｅｃｅｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＧｈｅｍｉｓｔｒ２００１ｐ，［］ｇｙ，－２７６２６２４２．：２４２４２５２（）＊６０ＳＬＫｏｒｓｍｅＪ－ｃｏｒｒａｎｏｅｒＳ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｔｏｃｈｒｏｍｅｃｌｔｔｉＢＣＬｉｅｅａｓｅｂｒｏａｏ：ｏｃ２［］／ｙｙｙｐｐｐ－ｆａｍｒｓＪＢ．ｉｌｍｅｍｂｅ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｏｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２００３３０４３：４！３７４４４ｙ［］ｐ，，（）＊＊－６１ＲｅｅｄＪ２ｆａｍｉｏＣ．Ｂｄｉｌｒｏｎｓ：ｉｅｕｌａｔｏｒｓｏｆａｏｓｉａｎｄｃｈｅｉｎｏｉｅｓｉａｎｃｅｉｎｈｅｍａｏｌｏｉｃ［化ｔｓｓｔｔ］ｙｐｇｐｐｇ４－巧ｍａｌｉｎａｎｃｉｅｓＪ．ＳｅｍｉｎＨｅｍａｔｏｌ１９９７３４Ｓｌ５：９．ｇ［］，，（ｕｐｐ）［６马ＭａｎｎｉｎｇＢＤ，Ｃａｎｔｌ巧ＬＣ．ＡＫＴ／ＰＫＢｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｎａｖｉｇａｔｉｎｇｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００７，－１２９７：１２６１１２７４．（）巧３］ＤａｔａＳ氏ＤｕｄｅｋＨ，ＴａｏＸ，ｅｔａｌ．ＡｋｔｐｈｏｓｐｈｏｉｙｌａｔｉｏｎｏｆＢＡＤｃｏｕｐｌｅｓｓｕｒｖｉｖａｌｓｉｇｎａｌｓ化－－化ｅｉｒ７：２２４ｃｅｌｌｉｎｔｒｉｎｓｃｄｅａｔｈｍａｃｈｍｅＪ．Ｃｅｌｌ１９９９１２３１１．ｙ，，（［］）６４Ｋａｎｄｅｌ巨Ｓ，ＳｋｅｅｎＪ，ＭａｅｗｓｋｉＮ，ｔａｌ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡｋｔ／ｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢｏｖｅｒｃｏｍｅｓａ［］ｊｅｐＧ２／ＭｃｅｌｌｃｙｃｌｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＮＡｄａｍａｇｅ［Ｊ］，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，－７８４２２２２：７８３１１．（）６ｉｎＦＷＳｋｅｅｎＪＨａＮｅｔａｌ．Ｉｎｈ化ｉｔｉｏｎｏｆＣｈｋｌｂａｃｔｉｖａｔｅｄＰＫＢ／Ａｋｔ．ＣｅｌｌＣｃｌｅ［引Ｋｇ，，ｙ，ｙＵ］ｙ，－２００４３５．：６３４６３７，（）’６ＣｈＦＳ－－ａｎｔｅｅｌｍａｎＬＳＭｃｃｕｂｒｅＪＡ．ＲａｆｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｃｃｌｅｒｏｒｅｓｓｉｏｎｉｒｉｈｕｍａｎＴＦ１［Ｗｇ，，ｙｙｐｇ－ｈｅｍａｃ２２２ｔｏｏｉｅｔｉｃ：ｅｌｌｓＪ．ＣｅｌｌＣｃｌｅ２００２１３：０％．ｐ，，［］ｙ（）＊－ＺｈＡｄ－－－６７ＫａｕｆｍａｎｎｅＲｏｒｉｅｚＶｉｃｉａｎａＵｌｉｃＭｉ［］ｌｒｉｃｈＥｅｔａ．Ｓｕｉｅｓｓｏｎｏｆｃｎｄｕｃｅｄ，ｇｕ，ｐｐｙａｏｔｏｓ－ｉｓｂＲａｓｓｉｎａｌｌｉｎｔｈｒｏｕｇｈＰＩ３ＫａｎｄＰＫＢＪ．Ｎａｔｕｒｅ９９７３８５６６：５４４５４８．ｐｐｙ，１１ｇｇ（）［］，（巧＇ｏｗ－－６８ｅｗｓｋｉＭｓｋａＳｋｏｉｓｋａＭＳａＭａＮｉｅｂｏｒｌｏｍｏｎｉＰｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏ打ｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＲａｆ１，，，［］ｊ－Ａｆｔｓｔ．ａｎｃｅｒＣ１ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｅａｎｔｉａｏｔｏｔｉｃｅｅｃｏｆＡｋＣＲｅｗａｒｃｈ１９９９５１２：２８２８９．ｐｐ［ｎ，，％）Ｉ－ｕａｎ＞ＷａｎＪＸｉＨｔａｌ．ＭＡＰＫｉｌｉｔｈｕｌａｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｉｌｉｔ巧引Ｙ，ｇ，ａｏ，ｅｓｇｎａｎｇａｗａｓｒｅｔｒａｍｅｄａｅｄｐｙｇａｏｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎｉｎｈｕｍａｎｈｅａｔｏｂｌａｓｔｏｍａｃａｎｃｅｒｃｅ＂ｓＪ．ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌｐｐｙｐ［］，２０－６８１３５３．：６２，７０ＤｕｎｎＷＡ，Ｊｒ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｕｔｏｈａ：ｆｏｒｍａｔｉｏ打ｏｆｔｉｌｅａｕｔｏｈａｉｃｖａｃｕｏｌｅ［］ｐｇｙｐｇ－Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌ臥ｏｌｏ１９９０１１０６：１９２３１９３３．［ｌｇｙ，，（）［７１］ＤｕｎｎＷＡ，Ｊｒ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎ化ｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆ化ｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅＪ１９９０１１０６１９３５－１９４５，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．，，：［］（）２＋７２ＤｅｃｕｅｒｅＪＰ，ＢｕｌｔｙｉｉｃｋＱＰａｒｓＪＢ．ＡｄｕａｌｒｏｌｅｆｏｒＣ＆ｍａｕｔｏｈａｒｅｕｌａｔｉｏ打．Ｃｅｌｌ［］ｙｐｙｐｇｙｇ阴Ｃ－ａｌｃｉｕ２０１１５０３２４２２ｍ，，（）：５０．３ＬｏｎａｔｔｉＡ，ＴｏｏｚｅＳＡ．ＶｅｓｉｃｕｌａｒｔｒａｆｉｃｋｉｎａｎｄａｕｔｏｈａｏｓｏｍｅｆｏｒｍａｔｉｏｎＪ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈ１７］ｇｇｐｇ［］Ｄ－ｉｆｆｅｒ２００９１６７：％６９６５．，，（）７４Ｅ－ｓｋｅｌｉｎｅｎＥＬ．Ｔｏｂｅｏｒｎｏｔ化ｂｅ？Ｅｘａｍｌｅｓｏｆｉｎｃｏｒｒｅｃｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｈａｉｃ［］ｐｐｇｃｏｍａｒｔｍｅｎｔｓｉｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｐｐｙ肌Ａｕ２－ｔｏｈａ２００８４２巧２６０．ｐｇｙ，，（）：７５ＫｌｉｏｎｓｋＤＪ，ＡｂｄａｌｌａＦＣ，ＡｂｅｌｉｏｖｉｃｈＨ，ｅｔａｌ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｕｓｅａｎｄｉｎｔｅｒｒｅｔａｔｉｏｎｏｆ［］ｙｐ－ａｓｓａｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎａｕｔｏｈａＪ．Ａｕｔｏｈａ２０１２８４：４４５５４４．ｙｇ，，ｐｇｙ［］ｐｇｙ（）６５ 北京协和医学院硕：ｂ研究生毕业论文Ｋ－７６ＩｔａｋｕｒａＥｉｓｈｉＣＩｎｏｕｅＫｅｔａｌ．Ｂｅｃｌｉｎ１ｆｏｒｍｓｔｗｏｄｉｓｔｉ打ｃｔｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉＵ）！３ｋｉｎａｓｅ［，，，］ｐｐｃｏｍｌ２ｌｅｘｅｓｉｔｈｌｉａｎＡｔｌ４ａｎｄＵＶＲＡＧ［Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｏｆｔｈｅＣｅｌ２００８１：ｗｍａｍｍａｇ］ｇｙ，，１９ｐ（）５－；３６０７２巧．７７ＭａｔｓｕｉＹ，ＴａｋａｉＨ，Ｑｕｅｔａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｒｏｌｅｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｈｅｈｅａｒｔｄｕｒｉｎｉ％ｈｅｍｉａａｎｄ［］ｇ义ｇＡＭＰ－ｒｅｅｒｆｕｓｎａｃｖａｒ１ｎｍｅｄｉＪ．ｐｉｏ：ｒｏｌｅｓｏｆｔｉｔｅｄｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｎｄＢｅｃｌｉｎｉｉａｔｎｇａｕｔｏｈａ［ｐｐｇｙ］－ＣｉｉｒｃｕｌａｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ２００７１００６：９１４９２２．，，（）７ｕｋｏｖｓｋａａＡＳＧｕｋｏｖｓｋｙＩ．Ａｕｔｏｈａａｎｄａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．ＡｍＪＰｈｓｉｏｌＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ［巧Ｇｙ，ｐｇｙｐ饥ｙＬ－ｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌ２０１２３０３（９Ｇ９９３Ｇ１．：００３ｙ，，）＇７９ＭｉｚｕｓｈｉｍａＮ，ＹｏｓｈｉｍｏｒｉＴ，Ｌｅｖｉｎｅ目．Ｍｅｔｈｏｄｓｉ打ｍａｍｍａｌｉａ打ａｕｔｏｐｈａｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ．Ｃｅｌｌ，［］ｇｙ］２０１０１４０３－；３１３３２６．，（）＂＂８０民ｕｂｉｎｓｚｔｅＣＣｒｖｏＡＭａｖｋｕｍＢｔｌＩｒｃｈａｕｒＪ．［］ｉｎＤｕｅ民ｉａｒｅａ．打ｓｅａｏｆａｎｔｏｈａｏｍｏｍｅ化，，，ｐｇ［］ｕａ２００９５５－Ａｔｏ：５８５５８９ｐｈ．ｇｙ，，（）－８１ＴａｎｉｄａＩｎｅｍａｔｓｕＩｋｅｕｃｈｅ．ｕｎｏｖｔＭｉｉＮＵｎｏＴｅｔａｌＬｓｏｓｏｍａｌｔｒｅｒｂｕ打ｏｔａｃｅｌｌｕｌａｒｌｅｖｅｌ［］，ｇ，，ｙ，，ｉＪＡｈ２００５１２８４－１ｏｆｅｎｄｏｅｎｏｕｓＬＣ３ｓａｍａｒｋｅｒｆｏｒａｕｔｏｈａ．．ｕｔｏａ：９．ｇｐｇｙ［］ｐｇｙ，，（）＊巧２ｏｒｋｏＱＬａｍａｒｋＴ，ＢｒｅｄｉＡ，ｅｔａｌ．６２／ＳＳＴＭＩ抗ｒｍｓｒｏｔｅｉｎａｒｅａｔｅｓｄｅｒａｄｅｄｂ］巧ｙｐＱｐｇｇｇｇｙ－ａｕｔｏｈａａｎｄｈａｓａｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｈｕｎｔｉｎｔｉｎｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏ，ｐｇｙｐｇ［］ｇｙ２００５７１４－：６０３６１４１．，（）３ＨｅＣ。ＫｌＪ．ｅｕｈｉｉｌｉＰｔｈｗａｓｏｆｔ．巧ｉｏｎｓｋＤＲｌａｔｉｏ打ＭｅｃａｎｓｍｓａｎｄＳｎａｎａＡｕｏｈａ］ｙｇｇｇｙｐｇｙ口］Ａｎｎｕａ民２００９４－ｌｅｖｉｅｗｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ：６７９３．，，口）Ｎｌｄｉｉ８４Ｂａｍｔｏ打ＥＴＷＧｏｅｍａｎｓＣＧｉｒａｎａ打Ｄｅｔａ．Ｔｈｅｎａｍｃｓｏｆａｕｔｏｈａｖｓｕａｌｉｚｅｄｉｎ［］ｐ，，ｊ，ｙｐｇｙｖｅ－ｒｉ／ｏ．ｌｉｃｅｌｌｓＦｒｏｍａｕｔｏｈａｏｓｏｍｅｆｏｍａｔｉｏ打化ｆｕｓｏ打ｗｉｔｈｅｎｄｏｌｙｓｓｏｍｅｓ］Ａｕｔｏｈａ２００５ｐｇ口ｐｇｙ，，－１１：２３３６．（）ＫａＡ－８５ｔａａｍａＨｅｔａ．ｔＹａｍａｍｏｔｏＭｉｚｕｓｈｉｍａＮｌＧＦＰｌｉｋｅｒｏｔｅｉｎｓｓａｂｌｙａｃｃｕｍｕｌａｔｅ山［］ｙ，，，ｐ－ｌｓｏｓｏｍｅｓＪｅｒｕｃｎｄＦｕｎｃ２００８；ｙ．ＣｌｌＳｔｔｕｒｅａｔｉｏｎ３３１１１２．［］，，（）［８６］ＫｉｍｕｒａＳ，ＮｏｄａＴＴ，ＹｏｓｈｉｍｏｒｉＴ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆ也ｅａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｍａｔｕｒａｔｉｏ打ｐｒｏｃｅｓｓｂｙａ－－打ｏｖｅｌｒｅｏｒｔｅｒｒｏｔｅｉｎｔａｎｄｅｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｔａｅｄＬＣ３Ｊ．Ａｕｔｏｈａ２００７３５：４５２４６０．ｐ，，，（ｐｇｇ［］ｐｇｙ）［８７］ＧａｏＷ，ＤｉｎｇＷＸ，ＳｔｏｌｚＤＢ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙｂｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ－ｃａ．ｌｃｉｕｍＪ．Ａａ２００８４６：７５４［ｕｔｏｐｈｇｙ，％１］，（）Ｍ－８ｓｏｋａｗａＮＨａｒＹｌｒａｃｃＵｎｅｏｉｚｕｈｉｍａＮ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅＵｉｎｅｓｗｉ化ｔｅｔｒｅｕｌａｔｅｄ［糾Ｈ，ａ，ｓｙｇａｕｔｏｈａａｎｄａｒｏｌｅｆｏｒａｕｔｏｈｉｎｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｃｅｌｌｓｉｚｅＪ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２００７，５８１１５：ｐｇｙｐ＾ｇ［］（）２６２３－２６２９．９ＦｌｅｍｉｎＡＮｏｄａＴＹｏｓｈｉＴｅｔａｌＣｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｕｌａｔｏｔｈｉｌｉｌ巧］ｍｏｒｉ．ｒｓｏｆａｕｏａａｓｂｏｏｃａｇ，，，ｐｇｙｇ－ｒｏｂｅｓａｎｄｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｓＪ．ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏ２０１１７１：９１７．ｐ，，ｐｐ［］ｇｙ（）巧０］ＴａｓｄｅｍｉｒＥ，ＭａｉｕｒｉＭＣ，ＧａｌｌｕｚｚｉＬ，ｅｔａｌ．民ｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｂｙｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐ５３［Ｊ．－２００８１０６．ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ：６７６６８７，，（）［９１］ＫｏｒｏｌｃｈｕｋＶＩ，ＳａｉｋｉＳ，ＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇＭ，ｅｔａｌ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓｃｅｌ山ｌａｒ＊ｎｕＢ２０－４６０ｔｒｉｅ打ｔｉｅｓｐｏｎｓｅｓＪ，ＮａｔＣｅｌｌｉｏｌ，１１，１３（４）：４訂．［］［９２］Ｓｈａｗ化Ｊ，巧ａｒｄｅｅｓｙＮ，ＭａｍｉｎｇＢＤ，巧ａｌ．ＴｈｅＬＫＢｌｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅ巧ｏｒｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓ－ｎａｌｉｎＪ．Ｃａｎｃｅｒ２００４６１：１９ｍＴＯ民ｓｉ［］Ｃｅｌｌ９乂ｇｇ，，（）－９３ＭｏｍｃｉｌｏｖｉｅＭＨｏｎＳＰＣａｒｌｓｏｎＭ．ＭａｍｍａｌｉａｎＴＡＫｌａｃｔｉｖａｔｅｓＳｎｆｌｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎ［］，ｇ，ｐｅａｓ－ｙｔａｎｄｈｏｓｐｈｏｒｌａｔｅｓＡＭＰａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｖｉｔｒｏＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌｐｙ［］ｇＣｓｒ２００６２８１３５－ｈｅｍ：２５３：３２５４３ｉｔｙ６３．，，（）’９４ｉｌｌｉａｍｓＡＳａｒｋａｒＳＣｕｄｄｅｔａｌ．ＮｏｖｅｌｒｅｔｓｆｏｒＨｕ打ｔｉｎｔｏｎｓｄｉｓｅａｓｅｉ［Ｗ，ｏ打Ｐｔａｎａｎ］，，ｇｇ－ｈａｒｅｌ－ｍＴＯＲｉｌ４５ｉｎｄｅｅｎｄｅ打ｔａｕｔｏａｔｈｗａＪ．ＮａｔｕＣｈｅｍｉｃａ目ｏｏ２００８５：巧３０５．ｐｐｇｙ，，ｐｙ［］ｇｙ（）５６ 北京协和医学院硕±研究生毕业论文［９５］ＣａｒｄｅｎａｓＣ，Ｍｉｌｌｅｒ艮Ａ，Ｓｍｉｔｈ！，ｅｔａｌ．ＥｓｓｅｎｔｉａｌＫｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓｂｙ２＋－ｃｏｎｓｔｉｖｒｒｆｅ化ｉｔｉ．ｅｌｌ２０１０１４２２：２７０２８３．ｉｔｕｔｅＩｎｓＰ３ｅｃｅｔｏＣａ化細ｓｒｍｏｃｈｏｎｄｒａ［ＪＣｐ，，）］（９６Ｊ４５－ｒＷｃ：ｅｎｃｉｏＨＯｒｔｉｚＣＣｒｉｏｌｌｏＡｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｎｏｓｉｔｏｌｌｔｉｓｈｏｓｈａｔｅｒｅｃｅｔｏｒｒｅｕｌａｔｅｓ［］，，，，ｐｐｐｇａｕｕｒａｃｒ２００９１－１７ｔｏｈａｔｈｒｏｈｉｔｓｉｎｔｅｔｉｏｎｗｉｔｈＢｅｃｌｉｎ１Ｊ，ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅ６７：１００６１０．ｐｇｙ，，ｇ［］（）－ｕｒｖ９７ＯａｔａＭＨｉＳＩＳａｉ化Ａｅｔａｌ．Ａｕｔｏｈａｉｓａｃｔｉｖａｔｅｄｆｏｒｃｅｌｌｓｉｖａｌａｆｔｅｒｅｎｄｏｌａｓｍｉｃ［，ｎｏ，，］ｇｐｇｙｐ－ｒｅｔ．ｕａｎｄｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓＪＭｏｌｅｃｌａｒＣｅｌ山ｌａｒＢｉｏｌｏ２００６２６２４：９２２０９２３１．［］ｇｙ，，（）－－９８ＴａｆＶｌｌｉｔｉｉｒｓｉｎｄｃｅｄａｔｏｈａＩ１６ｃｚＺＪｉａｎＷｉｒｉｎＨＷｅｔａ．Ｒｅａｔｏ打ｏｆｓａｒｖａｔｏｎａｎｄｖｕｕｕ［］ｙ，，，ｇｕｇｇｐｇｙｂｙｔｈｅｅＩＦ２ａｋｉｎａｓｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００２，９９１：１９（Ｍ９５．（）■－ｈａｎＦ艮ＭＳｈＬＡ．Ｍ９９ＺｏｓｃｈＭａｒｃｅｉｍｏｄａｅｔａｌｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｕｔｏｈａｉ］，，ｓａｎ［ｇＨ，ｐｇｙ＊Ｈ－－ｕｎａｌＦ１ｄｅｅｎｄｅｎｔａｄａｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｉｅｓｏｎｓｅ化ｈｙｏｘｉａＪ．ＪｏｒｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｐｐｐｐ［］ｇｙ，２００８２８３１６－：１０８９２１０９０３．，（）１００ＪａｅｎｅｆｏｒｒｉｎＡＬａｍａｒｋＴＳ０ｔｔｅｍＥｅｔａｌ．６２／ＳＳＴＭｌｉｓａｔａｒｅｔｔａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，，，［］ｊｐＱｇｇｐ－ＮＲＦ２ａｎｄｃｒｅａｔｅｓ过ｏｓｉｔｉｖｅｆｅｅｄｂａｃｋｌｏｏｂｉｎｄｕｃｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＫｓｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｄｒｉｖｅｎｅｎｅｐｐｙｇｐｇ－２２５９１ｉｉｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｌＣｈｉｔｒ２０１０２８５２９２２５７６．ｔｒａｎ化ｒｐｔｏｎＪ．Ｊｏｕｒｃａｅｍｓ，，（）：［］ｇｙ［１０１］ＫｏｍａｔｓｕＭ，ＫｕｒｏｋａｗａＨ，ＷａｇｕｒｉＳ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｕｔｏｐｈａｇｙｓｕｂｓｔｒａｔｅｐ６２ａｃｔｉｖａｔｅｓｈｅｉｖｅｔｒｒｉｔｉｆ化Ｎｒｆ２ｔｈｈｉ打ａｔｉｔｉＫｌＪ．ＮａｔＣｅｌｌＢｉｌｔｓｔｒｅ巧ｒｅｓｐｏｎｓａｎｓｃｐｏｎａｃｒｒｏｕｇｃｖａｏ打ｏｆｅａｐ［］ｏ，２０１０１２３－：２１３２２３．，（）－１０２ＫｌｉｏｎｓｋＤＪ．ＣｏｍｉｎｓｏｏｎｔｏａｏｕｒｎａｌｎｅａｒｏｕＴｈｅｕｄａｔｅｄｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｕｓｅａｎｄ［］ｙｇｊｙｐｇ＊－ｒ１１ｉｎｔｅｒｉｅｔａｔｉｏｎｏｆａｓｓａｓｆｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎａｕｔｏｈａ？Ａｕｔｏｈａ，２０４１００：１６９韦１６９？ｐｙｇ，ｐｇｙ［＂ｐｇｙ。）ｈａｉｔｈｔｈｉｆｄｉａＣｅｌｌ００８１１０３ＬｅｖｉｎｅＢＫｒｏｅｍｅｒＧ．Ａｕｔｏｎｅａｏｅｎｅｓｓｏｓｅｓｅ．乃３２１：［］，ｐｇｙｐｇＵ］，（）２７－４２．１０４Ｍａｒｅ打ｉｎｏｖａＯＡＨｅｒｍａｎｎＫＦｒｅ打ｃｈＳＷｅｔａｌ．Ｉｍａｉｒｅｄａｕｔｏｈａｉｃｆｌｕｘｍｅｄｉａｔｅｓａｃｉｎａｒ［］，，，ｐｐｇｃｅｌｌｖａｃｕｏｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｔｒｓｉｎｏｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉ打ｒｏｄｅｎｔｍｏｄｅｌｓｏｆａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓＪ．ｙｐｇ［］４－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎ２０１３１２３４：１８４１８４４．ｇ，，（）１ｍａＡ约．Ａｔ０５Ｌ说ＪＨＹｕＷＨＫｕｒａｌＬｓｏｓｏｍａｌＰｒｏｔｅｏｌｓｉｓａｎｄｕｏｈａＲｅ姐ｒｅＰｒｅｓｅｎｉｌｉ打，，，［］ｙｙｐｇｙｑ－－１ａｎｄＡｌｉｌＰＳ１ＭＪＣ１０１４１７１１４１．ＡｒｅＤｉｓｒｕｔｅｄｂｚｈｅｅｒＲｅａｔｅｄｕｔａｔｉｏｎｓ．ｅｌｌ２０：６Ｕｌ９１ｐｙｍ［］，，（）１０ａｎＤ８ＳｔａｖｒｉｄｅｓｏｈａｎＰＳ巧ａｌ．艮ｅｖｅｒｓａｌｏｆａｕｔｏｈａｄｓｆｕｎｃｔｉｏ打ｉｎｔｈｅ［巧Ｙｇ，巧Ｍ，ｐｇｙｙＲＮＤ＇ＴＳｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒｓｄｉｓｅａｓｅａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓａｍｌｏｉｄｐａｔｈｏｌｏｉｅｓａｎｄｍｅｍｏｒｙｇＣｙｇｄｅｆ－ｉｃｉｔｓＪ．Ｂｒａｉｎ２０１１１３４巧１：２５８２７７．［］，，（）［１０７］ＳｔａｐｐｅｎｂｅｃｋＴＳ，ＲｉｏｕｘＪＤ，ＭｉｚｏｇｕｃｈｉＡ，ｅｔａｌ．Ｃｒｏｈｎｄｉｓｅａｓｅ：ａｃｕｒｒｅｎｔｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏ打－ｇｅｎｅｔｉｃｓａｕｔｏｈａａｎｄｉｍｍｕｎｉｔＪ．Ａｕｔｏｈａ，２０１１，７４：３５５３７４．，ｐｇｙｙ［］ｐｇｙ（）［１０巧Ｔａｎａｋａ乂ＧｕｈｄｅＱＳｕｔｅｒＡ，ｅｔａｌ．ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｉｃｖａｃｕｏｌｅｓａｎｄＬＡＭＰ－－ｄｅｆｉ－ｏａｔｈｉｉＮｔｕｒ２０００４０６６７９８９０２９０６．ｃａｒｄｉｏｍｉｎ２ｃｅｎｔｍｃｅ［Ｊ］，ａｅ：ｙｐｙ，，（）ｒｅｆｅｘｏｃ１０９ＫｏｉｋｅＨＳｔｅｅＭＭｅｌｄｏｌｅｓｉＪ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｆｅｃｔｓｏｆｅｔｈｉｏｎｉｎ：ｂｌｏｃｋａｄｅｏｔｏｓｉｓａｎｄ［］，Ｌｙａｅａｒａｎｃｅｏｆｈａｃｅｄｅｃｅｌｌｕｌａｃｉ．Ｐｈｓｉｏｌ９８２ｐｐｃｒｉｎｏｐｈａｇｙａｎｄａｕｔｏｒｅｒｎｅｒｏｓｓ［Ｊ］ＡｍＪ，１，２４２４：ｐｇｙｐｙ（）Ｇ巧７－３０７．１１－０ＲａｂｅｎＮＰｌｏｔｚＰＢｒｎｅＢＪ．ＡｃｉｄａｌｈａｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｌｃｏｅｎｏｓｉｓｔｅＩＩ，，ｙｇｙ（ｇｙｙｐ，［］ｐｇｏｍｅ２００２－Ｐｐｄｉｓｅａｓｅ）．ＣｕｒｒＭｏｌＭｅｄ，，２２：１４５１６６．口］（）１１１ＣｈｅｎＳＮＲｅｈｍａｎＳＫＺｈａｎＷｅｔａｌ．Ａｕｔｏｈａｉｓａ化ｅｒａｅｕｔｉｃｔａｒｅｔｉｎａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕ，，，［］ｇｐｇｙｐｇｇ－－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＪｉｉｉｔｉｈｉＡｔＲｉＣ２０１００６２２２０２２９．ＢｏｃｈｍｃａＥＢｏｓｃａｃａｅｖｅｗｓｏｎｍｉｃ巧１８：．［］ｐｙ，（）１１２ｈｉＮＬｅｖｉｎｅＢＣｕｅｒｖｏＡｅｔａｌＡｕｔｏｈａｆｉｔｓｄｉ巧泌ｅｔｈｒｏｕｇｈｃｅｌｌｕＭｉｚｕｓＭｌａｒｍ过，，，ｇｈ［］ｐｇｙ－ｒｅ２００８７－ｓｅｌｆｄｉｅｓｔｉｏｎＪ．Ｎａｔｕ４５１１８２：１０６９１０７５．ｇ，，［］（）６７ 北京协和展学院硕ｄｒ研究生毕业论文１１３ＹｕＡＡＳｕＨ民ＴＧＶ－１［］Ｌｌｖａｅｔａｌ．ｅｇｕｌａｔｉｏ打ｏｆａｎＡｂｅｃｌｉｎｒｏｒａｍｏｆａｕ化ｈａｇｉｃｃｅｌｌｄｅａｔｈ，，，ｐｇｐ－－ｂｃａｓａｓｅ８Ｊ．Ｓｃ２００４３０４１５．ｉｅｎｃｅ６７：１５０００２ｙｐ［］，，巧巧１Ｌｅａｒｒｖｖａ１ｕｍＪＪＢａｕｅｒＤＥＫｏｎＭｔｌ．ＧｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＫｕｌａｔｉｏ打ｏｆａｕｔｏｈａａｎｄｃｅｌｌｓｕｉｌ［叫，，ｇ，ｇｐｇｙ－ｉｎ化ｅ油ｓｅｎｃｅｏｆ巧ｏｐｔｏｓｉｓＪ．Ｃｅｌｌ２００５１２０２：２３７２４８．］，，［（）１１５ＷａｎＺＨＺｈａｎＪＷａｎｅｔａｌ．Ｍａｔｒｉｎｅ过ｎｏｖｅｌａｕｔｏｈａｉｎｈｉｂｈｏｌｏｃｋｓｔｒａｆｉｃｋｉｎ［］ｇ，ｇ，ｇ乂，ｐｇｙ。ｂｇｍａ－ａｎｄｔｌｃｖａｆｌｌｏｅａｓｅａｒｃ打ｏｉ１２８ｔｈｅｒｏｅｏｔｉｃａｔｉｔｉｏｎｏｓｏｓｏｒｔｓ？Ｃｉｅｎｅｓｓ２０１３３４：１１３８．ｐｙｙｐ口］ｇ，，（）［１１６］ＹｕｅＷ，ＨａｍａｉＡ，ＴｏｎｅｌｌｉＧｅｔａｌ．Ｉｎｈ化ｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃｆｌｕｘｂｙｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎｉｎｂｒｅａｓｔ－ｅｒｏｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｌｌｉｎｔｅｒｆｅｅｉ化也ｒｕｉｋ／ｅｎｉ化ｒｃｅｌｓｒｓｗｅｉｍａｉ打ｔｅｎａｎｃｅＪ．Ａｔｏｈａ２０１３９５：ｐｇ［］ｐｇｙ，，（）７１４－７２９．Ｈ７ＭａＸＷＷｕＹＪｉｎＳＢ別ａｌ．ＧｏｌｄＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＩｎｄｕｃｅＡｕｔｏｈａｏｓｏｍｅＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ［］，乂，ｐｇｔｈｒｏｕｈＳｉｚｅ－Ｄｅｅｎｄｅ打ｔＮａｎｏａｒｔｉｃｌｅＵｔａｋｅａｎ过ＬｓｏｓｏｍｅＩｍａｉｒｍｅｎｔＡｃｓＮａｎｏ２０１１ｇｐｐｐｙｐ师，，５－１１：８６２９８６３９．（）１１８ＧａｌｅｚＰＭａｄｅｒＩＴｃｈｏｇｈａｎｄｉａｎＡｅｔａｌ．Ｉｍａｉｒｍｅｎｔｏｆｌｓｏｓｏｍａｌｉｎ化ｒｉｔｂｙＢＩＯａ［］ｏｎｚ，，ｊ，ｐｙｇｙ，ｌｙｃｏｓｌａｔｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｏｆｂｅｔｕｌｉｎｉｃａｃｉｄｌｅａｄｓｔｏｌｓｏｓｏｍａｌｃｅｌｌｄｅａｔｈａｎｄｃｏｎｖｅｒｔｓａｕｔｏｈａｇｙ，ｙｐｇｙＤ－ｉｔ．１２１ｎｏａｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌｒｏｃｅｓｓＪＣｅｌｌｅａｔｈＤｉ瓶ｒ２０９１３；３７１３４６．，，：ｐ［］巧）１１ＬｕＪＭａｎｎｉｎＢＤＣａｎｌｅＬＣＴａｒｅｔｉｎｅＰＩ３Ｋ－Ａｋａｈｗａｉｎｒ９ｏ；［，ｔ，ｔｈｔｔｈｕｍａｎｃａｎｃｅ］，ｇｙｇｇｐｙ民ａａｎｄｒｏ２００６２７－２６ｔｉｏｎａｌｅｍｉｓｅ？Ｃｅｌｌ１３：２０．ｐ的，，（）１２０ＢｅｔｚＣＨａ．Ｗｅｒｅａｔｔｌｌ］ｌｌＭＮｈｉｓｍＴＯＲａｎｄｗｈｉｓｉｔｄｏｉｎｈｅｒｅ？Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌＢｉｏｏ，，［ｇ［］ｇｙ２０４３－１３２０３：５６５７４．，（）－－１２。ＭａｉｕｒｉＭＣＺａｌｃｋｖａｒＥＫｉｍｃＷＡ巧ａｌ．Ｓｅｌｆｅａｔｉｎｇａｎｄｓｅｌｆｋｉｌｌｉｎ：ｃｒｏｓｓｔａｌｋｂｅｔｗｅｅｎ，，，ｇ［ｏｅＢ－ａｕｔｏｈａａｎｄａｔｏｓｉｓ？Ｎａｔｕｒｅ民ｅｖｉｅｗｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｌｉｏｌｏ２００７８９：７４１７５２．ｐｇｙ，，ｐｐ…ｇｙ（）ＸＸＨＨｉ－１２２ｕｕａＹＮＮａｉｒＳｌ．Ａｋ２ｋｎｏｃｋｏｒｅｓｅｒｖｅｓｉｉｈｆａ［］，ｔａｔ山ｃａｒｄａｃｆｕｎｃｔｉｏ打ｎｈｔ，，ｅｐｇ出ｅ－ｒｒｅｔｉｎｄｕｃｅｄｏｂｅｓｉｔｙｂｒｅｓｃｕｉ口ｃａｒｄｉａｃａｕｔｏｈａｏｓｏｍｅｍａｔｕａｔｉｏｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａＣｌｌｙｇｐｇ町２０１３５２－Ｂｉｏ．ｌｏ３：２１２１２ｇｙ，，（）［１２３］ＺｈａｎｇＹＭ，ＸｕＸＨ，民ｅｎＪ．ＭＴＯ民ｏｖｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄａ山ｏｐｈａｇｙｆｌｕｘｉｎｏｂｅｓｅｅａｒ－ｈｔｓ：ＡｉＪｔ２０１３：；３１．ｄｉｃｅｙｓｓｅｐｂｌｙ？．Ａｕｏｈａｇｙ９９９９４ａ［］ｐ，，巧）４Ｌｉ１２ＷａｎｇＫ，ｕＲ，ＬｉＪＹ，ｅｔａｌ．ｕｅｒｃｅｔｉｎｉｎｄｕｃｅｓｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｕｔｏｈａｉｎａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ；［］Ｑｐｐｇｙｇ－－－－ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＡｋｔｍＴＯＲａｎｄｈｏｘｉａｉｎｄｕｃｅｄｆａｃｔｏｒｌａｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎＪ］．Ａｕｔｏｈａ，ｙｐｇ［ｐｇｙ２０１－：６９７８．１７９９６，（）ｒｅｆｏｒｄＹｃｏｌ．ｒｉｂｒＣｔｔｉｉｔ１２５ＢａＭＤＰａｒｋＭＡ，ａｕｂＡｅｔａＳｏａｆｅｎＥｎｈａｎｃｅｓＰｅｍｅｔｅｘｅｄｏｏｘｃ［］，，ｙｙｒ－ＤｔｈｏｕｈａｎＡｕｔｏｈａ＞ｅｎ．ｃｉｅｎｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｉｎＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２０１１７１１４：ｇｐｇｙｑ…，，（）４９５５－４９６７．２６Ｚ１ＫａｏｏｒＶ，ａｈａｒｉｅｖａＭＭ，ＤａｓＳＮ，ｅｔａｌ．Ｅｒｕｆｂｓｉｎｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｉｎｄｕｃｅｓａｏｔｏｓｉｓａｎｄ［］ｐｙｐｐｂｄｅｋ－ａｕｔｏｐｈａｇｙｙｍｏ山ａｔｉｎ化ＡｔｍＴＯＲｓｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｉｎｏｒａｌｓｕａｍｏｕｓｃｅＵｃａｒｃｉｎｏｍａＪ．ｇｇｇｐｙｑ［］２０１２３１９ｌ３９－４８ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ：．＾，（）１２７ＭａＳＣｈａｎＫＷＨｕＬｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ打ｏｆｔｕｍｏｒｉｅｎｉｃｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ［］，，，ｇｓｒｏｏ１７２５４２－ｔｅｍ／ｒｏｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｌ２００７３２：２巧６．ｐｇ口］ｇｙ，，（）＋［１２巧ＳｏｎｇＹＪ，ＺｈａｎｇＳＳ，ＧｕｏＸＩ＾，ｅｔａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ化ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆＣＤ１３３ｌｉｖｅｒ－ｍｃｅｌ．ｃａｎｃｅｒｓｔｅｌｓｉｎｔｈｅｈｏｘｉｃａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｄｅｒｉｖｅｄｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＪＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｙｐｐ［］，２０１７０－８１１３巧９：．，（）６８ 北京协和医学院硕：ｉｒ研巧生毕业论文附录攻读硕±期间发表、待发表文章；＊１．孙海燕．，刘稽落，陈四保升麻中环费萝蜜烧Ｈ巧化学成分及其抗肿瘤活－２性的研巧．命爲游学０１５１３３：３４２％．，２，（）－－－－－２－Ｄｏｎ．ＨａｉｖａｎＳｕｎ、ＢｅｉｂｅｉＬｉｕＪｉａｎａｎＨｕＬｉｉａＸｕＳｈｕｎｗａｎＣｈａｎｍｅｉ，ｙｇ，ｊ，，ｇ＊Ｚｈａｎｇｅｎ－ｃａｅａｎｄＳ－打ｅｗｃｃｏａｒａｎｅｅｒｅｎｏｏｍ，ＷｉＹ．ｉｂａｏＣｈｅｎ．ＡｙｌｔｔｒｉｔｐｉｄｆｒＣＶ／ｗｌ－／ｃｚｗｇ幻ｅ化沁ｉ打ｄｕｃｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｏｔｏｓｉｓｉ打ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｓＭＣＦ７／於，ｐｐｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫｐａｔｈｗａｙ．ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＭａｎｕｓｃｒｉｐｔＮｕｍｂｅｒ；２６９０３３３０９１４５９６０３，ｉｎｐｒｅｓｓ．（ＩＦ：２．３４）Ｙｕ－Ｈ－－－－Ｗｕ－３．ｉｎＧｕｏａｉｖ泣ｎＳｕｎ，Ｃｈｉｏ打ＣｈａｎＢｅｉｂｅｉＬｉｕＪｉａｎｈｏ打Ｓｈｕｎｗａｎｑｇ，，，，ｇ＊ＫＷＡｎ－－ａｎＤａｎｉＭｏｋＫ．ＴＺｈｉＹｕＣｈｅｌ．．ｆｅｍｅｅ．Ｗｓｅｌｉｎ．ａｎｄＳｉｂａｏＣｈｅｎ．，，，ｇＡｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇａｃｔｉｖｉ巧ｏｆＣｅｎｔｉｐｅｄａｍｉｎｉｎａｅｘｔｒａｃｔｏｎ苗ｎａｓｏｈａｒｎｅａ－ｐｙｇｌｃａｒｃｉｎｏｍａＣＮＥ１ｃｅｌｌｓ．ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ．ＭａｎｕｓｃｒｉｐｔＮｕｍｂｅｒ：２一１１７７７１８８５１４４７３３ｉｎｒｅｓｓ．ＩＦ；２．３４（共同第作者），ｐ（）Ｘ＞＊ＪｅｎＭＦＬｅＩＺｈｕｏＺＪＨＹｅｎＺＳＺｈａｎＤＭＹｅ４．Ｈｕ乂ＣｈｉＳｕｎ，ＣｈＳｈｉＺ，，，，，ｇ，＊ＷＣ－ＭＢ－巧Ｂｕｆａｌｔｏｓｓｏ１ｃｅｌｌｔｈｒｏｕａｃｔｖａｔｏｎｏｆ．ｉｎｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｉｆＭＤＡｇｈｉｉＪＮＫ／Ｗａ－ｐｔｈｗａ．／ｏＭｉＴｉａ／１／／；成１橡￥．２０１５４：４７５３．ｐｙ，口）５．ＺｈｅｎｊｉａｎＺｈｕｏ，ＪｉａｎｙａｎｇＨｕ，ＭｉｎｆｅｎＣｈｅｎ，ＸｕｅｐｉｎｇＬｅｉ，ＬｉｊｕａｎＤｅｎｇ，ＮａｎＹａｏ，＊＊ＱｕｎｌｏｎｇＰｅｎ，ＨａｉｖａｎＳｕｎ，ＷｅｎｃａｉＹｅ足ＤｏｎｍｅｉＺｈａｎ．％＼ｉｌａｎｔｈｏｎｅｇｇｇｔＨｕｈｔｉｉｎｄｕｃｅｓＧ〇／Ｇｉｃｅｌｌｃｃｌｅａｒｒｅｓａｏｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓ７ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｒｏｗｈｎｙ，ｐｐｇｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｃｅｎｃｅｏｒｔｓ．．ｎｒｅａｒａｉ．ＳｉｔｉｆｉＲｐＩＦ；５０７８（Ｉｔｏｎ）（）ｐｐ的 北京协和医学院硕±研究生毕业论文致谢在本论文即将完成之际，谨向曾给予我指导和帮助的人们表示最诚擎的感谢！衷也感谢导师陈四保研巧员这Ｈ年来在学习及生活上给予的关怀，从论文选题、实验设计到论文撰写等各方面，都离不开导师的指导和付出。他严谨求实的治学态度，谦虚谨慎的学者风范，执著忘我的工作态度及和璃宽容的待人之道，永远值得我们学习。恃别感谢壁南大学药学院叶文才教授及张冬梅副研究员在我的学习工作和生活中给予的指导和关怀，尤其是张冬梅副研究员在实验方面给予的指、导和帮助，我将铭记于屯。感谢香港理工大学深圳研究院Ｊｏｙｃｅ、刘落稽和宋文娇等在我的生活和实验中提供的各种帮助。感谢香港理工大学深圳研究院Ｗ及暨南大学药学院提供的优越的技术平台和科研环境，使我的实验得Ｗ顺利进行。感谢国家自然科学基金（Ｎｏ．８１３７３Ｗ３）、国家自然科学青年基金（Ｎｏ．８１３０３２０３）化及深圳市基础研究项目（ＪＣＹＪ２０１２０６１８１７３４Ｕ２４４）给予的资金支持。感谢药用植物研究所研巧生处彭勇レ、林佳和刘俭老师ッ及许利嘉老师，感谢他们不厌其烦地帮我解决生活及工作上的各种问题，感谢２０１２级硕±一一生活！班的同学们，回忆与你们在起的研，仍然觉得满满的幸福感谢豊南大学药学院的师兄师姐Ｗ及师弟师妹们在我的生活和实验中提供的各种帮助，特别感谢胡坚杨同学，是你在我的实验最最困难的时候给了我极大的支持与鼓励，是你让我单调枯燥的求学路变得那么充实那么有意！义。谢谢你们在暨南大学给我留下的种种美好最后，特别感谢我的父母和我的哥哥，你们的支持和不离不弃是我今生最大的财富！。在此希望你们永远健康快乐至此，Ｈ年的研巧生活给我留下来太多太多的感动，感谢在这最美好的王年时光有你们的陪伴。我会不断鞭策自己必中的梦想不断前行！，为孙海燕２０１５年５月２０号７０