基于稳定同位素及矿质元素的蜂蜜品种鉴别研究 59页

密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文基于稳定同位素及矿质兀素的蜂蜜品种鉴别研究ClassificationofHoneysAccordingtoTheirFloralOriginsUsingStableIsotopicandElementalCompositions硕士研究生：吴招斌指导教师：赵静研究员申请学位类别：农业推广硕士专业领域名称：食品加工与安全培养单位：中国农业科学院蜜蜂研究所中国农业科学院研究生院2015年5月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文基于稳定同位素及矿质元素的蜂蜜品种鉴别研究ClassificationofHoneysAccordingtoTheirFloralOriginsUsingStableIsotopicandElementalCompositions硕士研究生：吴招斌指导教师：赵静研究员申请学位类别：农业推广硕士专业领域名称：食品加工与安全培养单位：中国农业科学院蜜蜂研究所中国农业科学院研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationClassificationofHoneysAccordingtoTheirFloralOriginsUsingStableIsotopicandElementalCompositionsM.S.Candidate：WuZhaoBinSupervisor：Prof.ZhaoJingDegree：MasterofAgriculturalExtensionSpecialty:FoodProcessingandSafetyMay2015 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年/月/日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容a研宄生签名时间：sc年6月/曰 中国农此科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目基于稳定同位素及矿质元素的蜂蜜品种鉴别研究食品加工与论文作者吴招斌专业研究方向蜂产品质量与安全安全指导教师赵静培养单位（研究所、中心)蜜蜂研究所姓名职称单位专业签名评中®水户斜穿挪铒蜣斯減m0-阅人tm答教授中国农业大学食品科学—主哉席农业部农产品质量安全农产品质量与食物廖超子研究员中心安全中国农业科学院农业质邱静研究员量标准与检测技术研究食品科学答所中国农业科学院动物营养与饲料科张军民研究员辩北京畜牧兽医研究所学中国农业科学院董捷研究员食品科学Z委蜜蜂研究所员_______________________会议记录（秘书）拍)爲论文答辩时间地点斗5月21121嘐终所劣^义室^ 摘要中国幅员辽阔，气候多变，不同蜜源植物的蜂蜜因其产量、口感上不同，其经济价值也存在一定差异。因此，市场上存在以低价蜜冒充高价蜜的现象。蜂蜜品种鉴别方法主要有常规理化指标、光谱分析方法和质谱分析方法等单一方法，这些鉴别技术具有一定局限性。近年来，稳定同位素技术和矿质元素技术在食品和农产品种类鉴别中得到广泛的应用。因此，本文利用碳、氢、氧稳定同位素技术和矿物元素技术并结合化学计量学手段鉴别蜂蜜品种。多种技术相结合能够完善与拓宽蜂蜜品种的鉴别方法，从而能为农产品种类鉴别提供方法上的借鉴。本文分为以下四个部分：1．基于蜂蜜中碳及其蛋白碳稳定同位素技术鉴别蜂蜜品种。研究不同品种蜂蜜中碳与蜂蜜1313蛋白碳稳定同位素比值，发现所有蜂蜜样品中δC值分布分散，而其蛋白δC值分布集中。相关性分析表明葵花蜜和洋槐蜜中蜂蜜与蜂蜜蛋白的相关性系数均高于0.8。方差分析及多重比较1313结果显示，所有品种蜂蜜δC值均存在显著差异；部分品种蜂蜜蛋白δC值也有所差异。说明碳稳定同位素可作为鉴别蜂蜜品种的有效参考指标。2．基于蜂蜜中氢及其氧稳定同位素技术鉴别蜂蜜品种。方差分析及多重比较结果表明，六218218个蜂蜜品种中δH及其δO具有显著性差异；蜂蜜δH与δO散点图结果表明所有蜂蜜品种均218能较好的分类，且同一品种的蜂蜜聚集程度较好。因此，利用δH及其δO均可用于鉴别蜂蜜品种。说明氢、氧稳定同位素可以作为鉴别蜂蜜品种的有效参考指标。3．基于电感耦合等离子体质谱技术测定蜂蜜中多种矿质元素的含量。利用电感耦合等离子体质谱法测定六个蜂蜜品种。结果表明，该方法的检出限及回收率均满足实验要求，因此，该方法具有可行性。同时，所有蜂蜜品种中K、Na、Ca、Mg和Fe的含量均高于1mg/kg，Mn、Cu、Sr和Ba的含量在0.1～1mg/kg的范围内,而其他痕量元素的含量均低于100μg/kg。4.基于蜂蜜中碳、氢、氧稳定同位素数据与矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种。对六个蜂蜜品种中碳、氢、氧稳定同位素结合矿质元素的主成分分析分析结果表明，椴树蜜、葵花蜜和苕子蜜13218三个品种能够明显的区分，油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜三个品种不能明显的区分。δCh、δH、δO、K、Ca、Cu、Sr和Ba是鉴别蜂蜜品种的特征元素。应用判别分析对蜂蜜中碳、氢、氧稳定同位素和矿质元素等24个指标进行蜂蜜品种鉴别。稳定同位素、矿质元素、同位素与矿质元素相结合对蜂蜜品种的交叉验证判别率分别为71.4%、81%和88.1%。通过比较三种不同方法，稳定同位素和矿质元素相结合的方法其交叉验证判别率最高，说明根据稳定同位素结合矿质元素可以鉴别蜂蜜品种。关键词：蜂蜜；稳定同位素技术；电感耦合等离子体质谱技术；化学计量学方法；品种I AbstractInchina,therearevarioustypesofhoneyaccordingtotheirsourcesandconstitutions.Becauseofthelargedifferenceinthepricesandyieldsaswellasthequantitydemandamongdifferentvarietiesofhoney,honeyproductshavefrequentlybeentheobjectoffraudinChineseandinternationalmarkets.Toguaranteefairplayinmarketsandcombatproductfraud,weneedappropriateandreliablemethodstodeterminethelegitimacyofbotanicaloriginsofhoneyinthemarkets.Severalmethodshavebeenappliedinidentifyingthebotanicaloriginsofhoneyincludingphysicochemicalparameters,spectralanalysisandmassspectrumanalysismethod.However,thelimitationsofthesemethodincludeunreliabilityandexpertise.ThisstudywascarriedoutusingthreemethodsincludingIRMS,mineralelementsandthecombinationofIRMSandICP-MSmethodcombinedwithchemometricstoclassifyhoneyaccordingtotheirfloralorigins.ThecombinationofIRMSandICP-MSmethodcouldimprovethedetectiontechnologyofthefloraloriginsofhoney.Theoretically,thisapproachcouldbeappliedtootherfoodproducts.Thispaperwasdividedintofourparts:1.Thefloraloriginsofhoneywereidentifiedbasedonthestableisotopesofcarbonanditsproteinofcarbon.Accordingtothestudyofdifferentvarietiesofstableisotoperatiosofcarbonanditsprotein,1313itwasfoundthattherangeoftheδCofhoneywasscattered.However,therangeofδCofhoneyproteinwasrelativelyconcentrated.Correlationanalysisshowedthatthecorrelationcoefficientoftuftedvetchhoneyanditshoneyproteinwasabove0.8.Atthesametime,thecorrelationcoefficientofacacia13honeyanditshoneyproteinwasabove0.8.TherearetheδCoftuftedvetchhoneyandacaciahoneyrepresentedthedifferencebetweenvarietiesofhoney.Analysisofvarianceandmultiplecomparison13resultsshowedthattheδCofdifferentvarietiesofhoneyweresignificantlydifferet.Atthesametime,13theδCofsomehoneyproteinwerealsosignificantdifferences.Carbonstableisotopecouldbeusedasreferenceindexofclassifyinghoneyaccordingtotheirfloralorigins.2.Thefloraloriginsofhoneywereidentifiedbasedonthestableisotopesofhydrogenandoxygen.218AnalysisofvarianceandmultiplecomparisonresultsshowedthattheδHandδOofsixvarietiesof218honeyhadsignificantdifference.ScatterplotoftheδHandδOdiscoveredthatallvarietiesofhoney218canbedistinguished.Therefore,theδHandδOofhoneycouldidentifythebotanicaloriginsofhoney.218TheδHandδOcanbeusedasreferenceindexofclassifyinghoneyaccordingtotheirfloralorigins.3.Mineralelementscontentinthehoneyweremeasuredbyinductivelycoupledplasmamassspectrometry(ICP-MS).TheresultsshowedthemethodofICP-MSwasfeasibletodeterminethecontentofmineralelementshoney.Itshowedthatthedeterminationmethodofdetectionlimitandtherecoveryratecanmeettherequirementsoftheexperiment.ThecontentsofK,Na,Ca,MgandFeinhoneyweremorethan1mg/kg.ThecontentsofMn,Cu,SrandBainhoneywereintherangeof0.1~1mg/kg.Thecontentsoftheothertraceelementsinhoneywerelessthan100μg/kg.Thecontentofheavymetalelementsinhoneywerelessthan100μg/kg.II 4.ItwerebasedonthecombinationofIRMSandICP-MSmethodstoclassifyhoneyaccordingtotheirfloralorigins.Principalcomponentanalysiswascarriedoutonthesixvarietiesofhoney.Lindenhoney,sunflowerhoneyandtuftedvetchhoneycouldbeobviouslydistinct.Rapehoney,acaciahoney13218andjujubehoneywerenotinobviousdistinctions.TheδCh,δH,δO,K,Ca,Cu,SrandBawere1313218usedtoidentifythefloraloriginsofhoney.TheδCh,δCp,δH,δO,Na,MgandKcontentof24indicatorswereappliedforclassifyinghoneyaccordingtotheirfloraloriginsinlineardiscriminantanalysis.Thecrossvalidationdiscriminantrateoftheisotopetechnology,mineralelementsandthecombinationofIRMSandICP-MSinhoneywere71.4%,81%and88.1%，respectively.Therefore,thecombinationofIRMSandICP-MSmethodswereprovedtobethemosteffectiveandaccurateapproachforclassifyinghoneyaccordingtotheirfloralorigins.Keywords:Honey;IRMS;ICP-MS;Chemometric;FloraloriginsIII 目录第一章引言............................................................................................................11.1蜂蜜概论...........................................................................................................11.1.1蜂蜜的定义及其应用................................................................................11.1.2蜂蜜品种及品质现状................................................................................11.2蜂蜜品种鉴别方法的应用进展.......................................................................21.2.1花粉形态学分析法....................................................................................21.2.2理化指标分析方法....................................................................................21.2.3质谱法........................................................................................................31.2.4光谱法........................................................................................................41.2.6多种技术融合法........................................................................................71.3研究目的及意义...............................................................................................71.4研究主要内容...................................................................................................813第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值......................................................92.1样本来源...........................................................................................................92.2主要试剂与仪器.............................................................................................102.2.1主要试剂..................................................................................................102.2.2主要设备与仪器......................................................................................102.3样品预处理.....................................................................................................102.3.1蜂蜜样品..................................................................................................102.3.2蜂蜜蛋白样品..........................................................................................102.4碳稳定同位素测定.........................................................................................112.5数据处理.........................................................................................................112.6结果与分析.....................................................................................................11132.6.1蜂蜜及其蛋白δC范围.........................................................................11132.6.2蜂蜜与其蛋白δC值相关性分析.........................................................122.6.3蜂蜜品种差异性分析..............................................................................16IV 2.7本章小结.........................................................................................................16218第三章氢、氧稳定同位素测定蜂蜜中δH和δO的比值................................183.1样本来源.........................................................................................................183.2试剂与仪器.....................................................................................................183.2.1主要试剂..................................................................................................183.2.2主要仪器..................................................................................................193.3样品预处理.....................................................................................................193.4氢及氧稳定同位素测定.................................................................................193.4.1氢稳定同位素测定..................................................................................193.4.2氧稳定同位素测定..................................................................................193.5数据处理.........................................................................................................193.6结果与分析.....................................................................................................202183.6.1不同蜂蜜品种中δH、δO差异性分析...............................................202183.6.2不同蜂蜜品种中δH和δO相关性分析.............................................203.7本章小结.........................................................................................................21第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量.................224.1样本来源.........................................................................................................224.2试剂与仪器.....................................................................................................234.2.1主要试剂..................................................................................................234.2.2主要仪器..................................................................................................234.3样品预处理.....................................................................................................234.4仪器测定.........................................................................................................244.5结果与分析........................................................................................................244.5.1方法检出限及回收率..............................................................................244.5.2测定结果..................................................................................................254.6本章小结.........................................................................................................27第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种.............285.1样本来源.........................................................................................................28V 5.2实验方法.........................................................................................................295.3数据处理.........................................................................................................295.4结果与分析.....................................................................................................295.4.1稳定同位素结合化学计量学鉴别蜂蜜品种..........................................295.4.2矿质元素结合化学计量学鉴别蜂蜜品种..............................................305.4.3稳定同位素数据与矿质元素数据融合进行主成分分析......................315.4.4稳定同位素数据与矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种..........................335.4.5三种不同方法蜂蜜品种判别率..............................................................335.5本章小结.........................................................................................................35第六章全文结论.....................................................................................................36参考文献.....................................................................................................................38致谢.....................................................................................................................44作者简历.....................................................................................................................45VI 图目录13图2.1蜂蜜δC的频率分布直方图......................................................................1213图2.2蜂蜜蛋白δC的频率分布直方图..............................................................121313图2.3椴树蜜δC值与椴树蜜蛋白δC值的相关性.........................................131313图2.4葵花蜜δC值与葵花蜜蛋白δC值的相关性.........................................131313图2.5苕子蜜δC值与苕子蜜蛋白δC值的相关性.........................................141313图2.6油菜蜜δC值与油菜蜜蛋白δC值的相关性.........................................141313图2.7洋槐蜜δC值与洋槐蜜蛋白δC值的相关性.........................................151313图2.8枣花蜜δC值与枣花蜜蛋白δC值的相关性.........................................152图3.1不同蜂蜜品种中δH的值...........................................................................2018图3.2不同蜂蜜品种δO的值..............................................................................20218图3.3蜂蜜δH和δO同位素散点图..................................................................21图5.1蜂蜜主成分分析图.......................................................................................32图5.2第一主成分的载荷因子...............................................................................32图5.3第二主成分的载荷因子...............................................................................32VII 表目录表2.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点................................................................1013表2.2蜂蜜及蜂蜜蛋白的δC值...........................................................................16表4.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点................................................................23表4.2各个元素的空白值、检出限及回收率........................................................24表4.3不同蜂蜜品种的各个矿质元素的含量........................................................26表5.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点................................................................28表5.2稳定同位素的判别分析的分类结果............................................................30表5.3矿质元素判别分析的分类结果...................................................................31表5.4矿质元素和稳定同位素组合判别分析的分类结果...................................33表5.5三种不同方法蜂蜜品种判别率....................................................................35VIII 缩略表英文缩写英文全称中文名称IRMSIsotopeRatioMassSpectrometer稳定同位素质谱InductivelyCoupledPlasmaMassICP-MS电感耦合等离子体质谱SpectrometryInductivelyCoupledPlasmaOptical电感耦合等离子体发射光谱ICP-OESEmissionSpectroscopyPCAPrincipalComponentAnalysis主成分分析LDALinearDiscriminantAnalysis线性判别分析OrthogonalPartialLeastSquaresOPLS-DA正交偏最小二乘法-判别分析DiscriminantAnalysisBack-PropagationArtificialNeuralBP-ANN反向传播人工神经网络NetworkPartialLeastSquaresDiscriminantPLS-DA偏最小二乘法-判别分析AnalysisSoftIndependentModelingOfClassSIMCA簇类软独立模型AnalogySVMSupportVectorMachine支持向量机MLPMultiLayerPerceptron多次传感器RFRandomForest随机森林IX 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1蜂蜜概论1.1.1蜂蜜的定义及其应用蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或活体植物的分泌物或吸吮活体植物的昆虫的排泄物，带回巢房中储存，并加入自身分泌的特殊物质进行转化，沉积，脱水致成熟的天然甜物质（CAC，1981）。现代科学表明蜂蜜至少含有200多种物质，是一种过饱和糖类化合物（Muratetal.,2007;Alvarezetal.,2009）。主要含有65%糖类（葡萄糖与果糖）、18%水分和少量的蛋白质、黄酮类化合物、酶、游离氨基酸、有机酸、无机酸、矿物质、微量元素、维生素和香气化合物等（Necemer,etal.,2009），其中许多物质为人体代谢所必需。同时，由于蜂蜜具有很高的营养价值受到越来越多消费者的青睐。蜂蜜曾经被认为是一种食药两用的佳品，可以用来治疗烫伤，肠胃疾病，哮喘，伤口的感染，皮肤溃烂和防止冻伤等药物功效以及具有延年益寿的食物功效。早在秦汉时期，《神农本草经》中记载将蜂蜜称为：“石饴”、“石蜜”、“岩蜜”等，并把“石蜜、蜂予、蜜蜡”列为上品，同时，指出其具有“治邪气，安五脏诸不足，益气补中、止痛解毒、除百病、和百药，久服强志轻身，不老延年，多服久服不伤人”的功效。到了明清时期，关于蜂蜜的记录就更多了，例如李时珍的《本草纲目》，对蜂蜜的性质和应用作了更为详尽的描写：“蜂蜜，其入药之功有五：清热也，补中也解毒也；润燥也，止痛也。生则性凉，故能清热；熟贝口性温，故能补中；甘而和平，故能解毒：柔而孺泽，故能润燥；缓可以去急，故能止心腹肌肉疮疡之痛；和可以致中，故能调和百药而与计草同功”（张婷婷等,2010）。现代科学研究表明：蜂蜜具有消除自由基（Muratetal.,2007）、消炎（Allenetal.,1991；Bogdanov,1997；Zeinaetal.,1997；Fahey,2002；Kilicogluetal.,2006）、抗肿瘤（Hamzaogluetal.,2000）、防止肠道感染（Chatterjeeetal.,1978；Jeddaretal.,1985；Osatoetal.,1999），降低心血管疾病（Yaghoobietal.,2008）等功效。蜂蜜中高糖物质能够促进钠和水在肠道中吸收（Chatterjeeetal.,1978）。同时，蜂蜜中低聚糖能够促进肠道内的双歧杆菌和乳酸杆菌菌群数量的增加（Sanzetal.,2005）。总而言之，蜂蜜由于其纯天然的特性、范围应用广泛性、具有很高的药用价值和营养价值而受到越来越多消费者的青睐。1.1.2蜂蜜品种及品质现状中国幅员辽阔，蜜源植物分布较广，但是蜂蜜的产量具有较明显的差异性。例如产量较高的蜜种有洋槐蜜，枣花蜜，荆条蜜和油菜蜜等；而且气候环境因素，蜜蜂饲养和生产加工方法的不同，所以蜂蜜的产量和品质也有所差异。同时，也有些蜜源植物具有地域性，如南方的龙眼蜜和东北的椴树蜜等；有些蜜源植物具有特殊性如党参蜜、枸杞蜜、野菊花蜜、五味子蜜和益母草蜜等。同时，由于其不同品种蜂蜜的气味，颜色，口感等感官特性的不同导致其价格具有很大的差异。对于颜色较浅，气味较好的蜂蜜如荔枝蜜和槐花蜜等蜜种相比其他蜜种的价格较高（陈兰珍,1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言2010）。不同蜂蜜品种的感官特性就具有一定差异性。即使相同蜂蜜品种的地域上的差异性导致其品质也具有差异性。例如洋槐蜜主要分布在山东、河南、陕西和山西等地。虽然都属于洋槐蜜，但是其口感、颜色、矿质元素的含量等指标都具有一定的差异性。目前我国蜂蜜质量安全状况现象较为突出，主要表现为:（1）品种不真实：人为将品质较优的蜜（如椴树蜜和洋槐蜜）中掺入价格低廉、来源丰富、质量较差的蜜（如油菜蜜等）中以获利,出现蜂蜜品种混乱的现象;（2）掺杂造假:有些不良商家利用复杂多样的手段直接利用果葡糖浆、淀粉和高果糖浆等物质对蜂蜜进行搀杂造假，造成了其销量高于产量的怪异现象；（3）品质不佳：我国很多蜂农频繁的进行取蜜而不愿意生产成熟蜜,然后由厂商收购并对这种不成熟蜜进行加工以降低水分含量以此满足相关标准。例如《中国食品质量报》2010年7月27日报道安徽省多地区近年来蜂蜜掺假现象严重，掺假蜂蜜曾一度占据市场销售蜂蜜50%的份额。2010年11月14日,屮央电视台《每周质量报告》栏目报道了浙江省宁波市多家蜂产品企业以次充好、生产销售假蜂蜜。《中国食品报》2011年4月11日报道广西地区蜂蜜抽检合格率竟不到5成。总而言之，虽然我国蜂蜜具有种类多、产量高和外贸出口量大等优势，但是目前我国蜂蜜存在一系列问题如价格低廉，质量及品质不稳定和安全状况不能保证等因素，使我国与世界蜂业强国具有一定差距。1.2蜂蜜品种鉴别方法的应用进展1.2.1花粉形态学分析法花粉形态学分析法（Louveauxetal.,1978）是通过识别和量化蜂蜜花粉粒的沉积物和数量来进行鉴别。通常认为只要从一种植物采集花粉的比率>45%就认为是这种类型蜂蜜。然而这种方法需要具备专门数花粉粒的知识。同时，此分析过程是耗时，要求也具有良好数据判读的技巧。同时，分析的结果可能不具备可靠性和客观性，特别是如草莓树蜜等以少量花粉为特征的蜂蜜。结果由于花粉形态学分析具有困难性，需要注重寻找特定的化学标记证明蜂蜜植物源。1.2.2理化指标分析方法通过分析蜂蜜的电导率、水分含量、颜色、糖分、酸度、灰分含量、碳水化合物（如果糖，葡萄糖，蔗糖等）、PH、淀粉酶值和氨基酸等理化指标来进行蜂蜜品质的研究，从而对蜂蜜进行品种鉴别研究。Mateo等人（1998）利用15个理化指标（电导率，颜色和水分含量等）分析七种不同类型的西班牙商品蜜，选取电导率，颜色和水分含量等指标作为变量，运用判别分析能将所有的葵花蜜、桉树蜜、花露蜜和其他90%的蜂蜜品种都能够进行正确的区分，蜂蜜样品整体判别率高达95.7%。同时，发现电导率，颜色，水分含量，果糖和蔗糖等5种因素能够成为鉴别蜂蜜品种的特征指标。Devillers等人（2004）选取13个理化指标（水分、电导率、pH值等）分析7种不同品种的469个蜂蜜样品。利用主成分分析，选取4个主成分。然后通过逐步判别分析，以电导率，PH值，游离酸度，果糖，葡萄糖和棉籽糖为变量取得判别率为100%。说明这七种理化指标（电导率，PH值，游离酸度，果糖，葡萄糖和棉籽糖）能够鉴别七个不同蜂蜜品种。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Corbella等人（2006）利用理化指标（水分、pH值、电导率、5-羟甲基糠和颜色）结合化学计量学对6个乌拉圭蜂蜜品种进行鉴别。利用主成分分析和线性判别分析得出电导率,水分活度和pH值是能够用来鉴别蜂蜜植物源，而且超过80%的蜂蜜样品（牧场类、柑橘类、酒神菊属）具有正确分类。Bentabol等人（2014）利用理化指标（水分含量、电导率、pH值等）和糖类化合物（果糖、蔗糖、松三糖等）对西班牙特定花粉数量很少的9个单花蜂蜜品种进行鉴别。研究表明，所有的理化指标和糖类化合物，除淀粉酶值外，其他参数的平均值都具有显著差异。运用单变量统计分析和理化指标(水分含量、酸度、电导率、果糖、蔗糖和松三糖)能够鉴别所有蜂蜜品种。Kus等人（2014）利用总酚含量、抗氧化活性剂、色差度对六种波兰的单花蜂蜜进行品种鉴别和数据评估。总酚含量、颜色、抗氧化活性与前人报道的欧洲蜂蜜其值范围相接近。蜂蜜颜色的范围从浅黄色到深琥珀色。黑荞麦蜜因含有更高的酚含量所以表现更高的抗氧化活性。色差度有助于鉴别蜂蜜品种，例如石楠花蜜和荞麦蜜。然而，对于大多数蜜种还是无法进行鉴别。1.2.3质谱法1.2.3.1气相色谱质谱法气相色谱质谱法是一种耗时少、费用低的、适合常规分析蜂蜜样品的技术。Aliferis等人（2010）利用气相色谱质谱法分析不同植物源及地源蜂蜜中挥发性成分。其结果结合正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS™-DA），簇类软独立模型（SIMCA）以及正交偏最小二乘法层状聚类分析（OPLS™-HCA）三种化学计量学的方法。分析结果表明利用OPLS™-HCA对于鉴别蜂蜜植物源具有较低的误判率，在单花蜜中挥发性物质中主要成分有酚类、萜类化合物和脂肪族化合物，依据蜂蜜地源能够鉴别柑橘蜜和百里香蜜。同时，利用气相色谱质谱法能鉴别不同蜂蜜品种中不同挥发性成分。1.2.3.2液相色谱质谱法液相色谱质谱法的定性定量能力强、灵敏度高、适用范围广等诸多优点，液相色谱质谱法在蜂蜜溯源分析中被广泛使用。Bertoncelj等人（2011）利用液相色谱质谱法（LC-DAD-ESI/MS）分析斯诺文尼亚的七种不同蜂蜜品种中的黄酮类化合物。蜂蜜样品中黄酮类化合物通过固相萃取法进行分离，然后利用LC-DAD-ESI/MS进行分析。以黄酮中的杨梅酮、毛地黄酮、槲皮黄酮，柚皮素酮、芹黄素酮、山奈酚酮、松属素酮、白杨素酮和高良姜酮作为参考物,短叶松酮是利用保留时间、紫外光谱和质谱质谱数据得到。两个非黄酮类化合物顺式-反式脱落酸和顺式-顺式脱落酸同样被鉴别。分析结果不能表明任何特殊化合物作为这些斯诺文尼亚的蜂蜜的标记物。虽然判别分析对这些蜂蜜品种的判别率高达85%，但是要进一步分析更多蜂蜜样品鉴别蜂蜜中蛋白标记物。Silvio等人（2013）利用超高液相色谱四级阱质谱鉴别塞尔维亚的44个单花蜜。不同品种的蜂蜜样品：洋槐蜜，葵花蜜，椴树蜜，罗勒属蜜、荞麦蜜、油菜蜜和秋麒麟草属蜜。所有蜂蜜中均存在黄酮类化合物、柯因、生松素和高良姜精。对香豆酸在罗勒蜜、荞麦蜜和秋麒麟蜜未被检出，葵花蜜中含有大量的五倍子酸，荞麦蜜中含有芹黄素。利用模式识别模型（主成分分析）对样品进行鉴别。高液相色谱四级阱质谱技术被证明是一种有效的鉴别酚酸中不明显的化合物、衍3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言生物和黄酮类化合物的技术。1.2.3.3稳定同位素质谱法稳定同位素法是根据同位素丰度的差异将不同来源的物质区分。稳定同位素法在蜂蜜的真伪鉴别中应用广泛（Padovan,2003；Simseketal.,2012)。目前，同位素技术已逐渐的应用于农产品的分类和溯源中。但是目前文献鲜有报道利用稳定同位素法鉴别蜂蜜品种的文献，特别是氧稳定同位素进行鉴别蜂蜜品种。Kropf等人（2010）利用稳定同位素法和X射线荧光光谱分别对斯洛文尼亚的柠檬蜜、洋槐蜜和栗花蜜中主要成分和碳、氮稳定同位素进行分析。分析结果表明，通过游离酸含量、脯氨13酸和蜂蜜蛋白的δC比值可以鉴别洋槐蜜与其他蜂蜜品种，柠檬蜜中电导率和灰分比其他蜂蜜品种含量差异显著，通过S含量、K含量和S/Ca比率等参数可以鉴别栗花蜜与其他蜂蜜品种。柠檬蜂蜜的判别率达到100%，而洋槐蜜和栗花蜜的判别率相对较低，分别为98.2%和94.6%。1.2.3.4电感耦合等离子质谱法电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）是近年来发展迅速，在痕量及更低水平下进行分析元素含量的一种新兴的分析技术,具有较宽的动态线性范围、较快的分析速度、较低的检出限、可同时测定多种矿质元素等特点，在食品，农产品等方面受到广泛的应用。Maria等人（2008）利用电感耦合等离子体质谱法测定微量元素（Al、B、Cr、Mn和Ni），利用火焰原子吸收法测定主要元素Ca、K、Mg、Na、Cu、Fe和Zn。聚类分析表明蜂蜜植物源与它们的化学组成相关。同时，发现油菜蜜比甘露蜜具有更低含量的Mn、Al、Cu、K、Fe和Ni，而且甘露蜜含有更高的元素含量使其能反映出蜂蜜的来源。Batista等人（2012）利用电感耦合等离子体质谱法分析42种化学元素包括Al、Cu、Pb、Zn、Mn、Cd、Tl、Co等。利用三种判别工具和两种属性选择工具，证明可以利用数据挖掘技术鉴别蜂蜜植物源。使用支持向量机（SVM）、多层感知器（MLP）和随机森林法（RF）三种化学计量学方法可以清晰地鉴别蜂蜜植物源。同时，利用化学计量学中的选择性工具将四十二个变量缩减成只有五个变量。Chen等人（2014）利用矿质元素含量结合化学计量学来鉴别蜂蜜品种。研究包括洋槐蜜、椴树蜜、油菜蜜和荆条蜜中12种矿质元素的163个蜂蜜样品。主成分分析用前四个主成分使得变量减小10个，解释了93.06%的总体变量。偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和反向传播神经网络模型（BP-ANN）建立分类模型。其模型的总体判别率及交叉验证判别率均较高且BP-ANN的模型好于PLS-DA。通过用42个蜂蜜样品作为独立的数据集测试BP-ANN模型。研究结果表明：椴树蜜、荆条蜜和油菜蜜的预测率为100%。然而，一个洋槐蜜被误判为油菜蜜而使其判别率为92.3%。因此，蜂蜜中矿质元素结合化学计量学是一种强有力的鉴别蜂蜜品种方法。1.2.4光谱法1.2.4.1红外光谱法红外光谱法是根据不同物质选择性的吸收红外光区的波段不同进行结构分析，其分析速度快，样品不需要前处理和准确度高等优点广泛应用于食品工业中（陆婉珍,2007）。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Kaspar（2006）利用傅利叶中红外光谱衰减全反射法鉴定已经利用传统方法如理化指标，花粉和感官分析鉴别过的11种单花蜜与杂花蜜。运用主成分分析和线性判别分析的化学计量学手段评估光谱模型，利用贝叶斯原理进行错误率计算，利用分类与验证不同蜂蜜类型的错误率范围为0.1%-8.3%。研究表明傅利叶中红外光谱衰减全反射法是一种有利用价值的鉴定蜂蜜植物源与质量控制的工具，可能成为一种鉴别蜂蜜地源的工具。Bertelli等人（2007）利用漫反射傅里叶中红外光谱结合多元统计的方法鉴别蜂蜜品种。82-1种蜂蜜样品在4000～600cm的扫描范围内，经过一阶导和二阶导光谱数据处理，采用主成分分析，整体判别分析和分类树分析法，通过判别分析和分类树分析分类准确率接近100%。从而说明中红外光谱技术能够用来鉴别蜂蜜的品种。Chen等人（2012）利用近红外光谱法结合化学计量学鉴别中国五个蜂蜜品种（槐花蜜，椴树蜜，油菜蜜，荆条蜜和枣花蜜），建立马氏距离判别分析和BP神经网络两种模型鉴别蜂蜜品种。实验结果表明，通过马氏距离分析法建立模型，其总体判别率为87.4%，交叉验证率为85.3%。然而神经网络模型的总体判别率和交叉验证率分别为90.9%和89.3%。故利用BP神经网络模型对五个品种的判别率均较高，从而说明近红外光谱结合化学计量学能够鉴别中国蜂蜜品种。1.2.4.2荧光光谱法荧光光谱法是利用某些物质分子受光照射时所发生的荧光特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法，具有速度快、取样量少、非破坏性、灵敏度高、重现性好等优点，已经发展成为一种十分重要而且有效的光谱分析手段。近年来，研究者将荧光光谱与蜂蜜化学成分特征和品质属性相结合进行品种和产地鉴别。Kaspar（2006）利用正面荧光光谱法鉴定已经利用传统方法鉴别的11种单花蜜与多花蜜（共计371个样品）。共采集4组不同的光谱数据集进行数据分析，利用主成分分析和线性判别分析进行光谱模型的评估，利用贝叶斯原理进行错误率的评估，研究发现光谱数据集错误率范围为0.1%～9.9%，而结合两个光谱数据集其范围为0.1%～7.5%，错误率均较低。这也说明正面荧光光谱法是一种具有前景的鉴别蜂蜜植物源技术，也可用于鉴定蜂蜜产地。1.2.4.3分光光度计法分光光度计法具有耗时少、客观性和准确性等优点已经广泛应用于食品工业中。Tuberoso等人（2014）对欧洲不同地区的17个不同品种的305个蜂蜜样品进行吸光度测定和数据分析。通过吸光度平均值进行蜂蜜品种的初步鉴别。层序聚类分析表明按照其吸光度能够鉴别蜂蜜品种。主成分分析，特别是利用三维主成分分析，更能清晰的呈现17种蜂蜜样品的分离程度。因此，吸光度是一种简单而有效的鉴别蜂蜜品种的有效工具。1.2.5其他方法1.2.5.1核磁共振法核磁共振法所需要样品量少，处理过程简单，是一种可选择用来鉴别复杂化合物结构的一种方法。Consonni等人（2012）利用碳谱和氢谱分析五种意大利蜂蜜中糖类化合物的86个样品。分析19种包括果糖、葡萄糖、龙胆二糖、异麦芽糖、曲二塘、麦芽糖、麦芽酮糖、蜜二糖、黑曲5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言霉糖、异麦芽酮糖、蔗糖、松二糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽三糖、蔗果三糖、麦芽三糖、松三糖、棉子糖和麦芽四糖的糖类化合物。利用主成分分析分析核磁谱图光谱区显示在4400和5700ppm处，果糖的信号在4050ppm，发现了样品有明显的聚集趋势。主成分得分图中利用糖类物质的平均值可以鉴别蜂蜜品种。OPLS-DA模型进一步确认该结论。OPLS-DA模型同样也能够分别鉴别杂花蜜与高山杂花蜜和都来自高纬度的高山杂花蜜和杜鹃花蜜的区别。从而说明核磁共振法可以通过分析蜂蜜中的糖类化合物进行蜂蜜品种鉴别。Elisangela等人（2012）运用核磁氢谱信息分析来自圣保罗的桉树蜜、柑橘蜜、甘蔗蜜、野花蜜蜂蜜、商品蜜和掺假蜂蜜。结果表明运用PCA和层状聚类分析（HCA）结合氢谱数据已经能使一些相同品种的样品自然聚集。野花蜜中较高浓度的苯基丙氨酸和酪氨酸。柑橘蜜有较高含量的乳酸。酒神菊蜜的氢谱与柑橘蜜和桉树蜜较为相似。蔗糖蜜的氢谱上的一些信息与柑橘蜜和桉树蜜较为相似，同样也含有苯基丙氨酸和酪氨酸。掺假蜂蜜含有羟甲基糠醛，柠檬酸和乙醇。KNN、SIMCA和PLS-DA数据分析已经正确将蜂蜜的品种进行正确分类，但是PLS-DA在分类中更具有较好的效果。KNN、SIMCA和PLS-DA预测商品蜜的判别率分别为66.7%、22.2%和72.2%。主成分分析同样能鉴别出掺假蜂蜜并确定其含有的化合物。说明核磁共振技术可以鉴别蜂蜜品种。1.2.5.2流变仪法流变仪是一种新型的检测仪器，可以用来测定物质流变特性；从而说明粘度与物质之间的关系。Wei等人(2010)利用流变仪鉴别五种来自宜春的商品蜜以及五个不同产地的洋槐蜜。利用四种模式识别技术（主成分分析、聚类分析、偏最小二乘法和支持向量机制法）鉴别蜂蜜的品种和产地。利用支持向量机制法鉴别不同品种和地源的蜂蜜样品，其判别率均较高。利用三种回归模型（主成分回归、偏最小二乘法回归和支持向量机回归）分析结果表明支持向量机结合径向量机函数对蜂蜜的判别效果更有效。从而说明流变仪法结合模式识别技术能够对蜜源及地源进行较快较好的鉴别。1.2.5.3X射线法X射线法是一种快捷、高效和廉价的处理方法，不需要任何额外的物化参数结合可进行数据分析。Necemer等人（2009）利用全反射x射线法对斯洛文尼亚的三年（2004、2005和2006）采集的264个蜂蜜样品进行矿质元素结合化学计量学进行品种鉴别。通过利用四个关键性元素（Cl、K、Mn和Rb）和应用主成分分析和正规化判别分析能够准确地鉴别蜂蜜品种。结果表明利用全反射x射线法结合化学计量学能够鉴别蜂蜜品种。1.2.5.4免疫印迹法蜂蜜中蛋白质来源于花粉（Whiteetal.,1991；Baueretal.,1996），也有学者认为与蜜蜂采蜜时残留下的酶有关（Edelhauser,1989）。但是蜂蜜中蛋白含量很低。免疫印迹技术具有较高的灵敏性，能够识别蜂蜜中蛋白。Maria等人（2002）将蜂蜜蛋白作为一种蜜源植物化学标记物，利用培育葵花蜜和桉树蜜的6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言多克隆抗体的花粉粒鉴别蜜源植物。通过免疫亲和性纯化其免疫球蛋白，利用免疫印迹实验测定其分子量。结果表明葵花蜜蛋白和含有葵花蜜花粉的分子量分别为36和33千道尔顿，而桉树蜜蛋白为38千道尔顿。结果表明：该技术能够利用花粉分析鉴别不同蜂蜜品种，在鉴别葵花蜜和桉树蜜之间具有与其他类型的蜂蜜更少的交叉反应，以及具有更好的灵敏度。同时，说明免疫印迹方法开拓一种新方法鉴别蜂蜜品种，也作为对于花粉分析方法的一个补充鉴别蜂蜜植物源。1.2.6多种技术融合法由于单一的技术或因素提供相对不完整，不全面，不统一的数据结果。这容易导致判别模型对于样品评价的误判率增加，同时也造成了未知样品的误判率提高。因此，应用多种融合技术能够提高模型的准确率和可靠性，进而提高未知样品的判别率。目前，多种融合技术已经逐渐的应用到蜂蜜的分类和溯源中。Pisani等人（2008）利用ICP-OES和ICP-MS测定来自意大利不同品种的51个蜂蜜样品中的23种化学元素的含量。测定结果发现K、Ca、Na和Mg是大量元素且含量分别为1195mg/kg、257mg/kg、96.6mg/kg和56.7mg/kg；除了Ba、Cu、Mn和Ni微量元素的含量均低于100μg/kg。结果表明，这些蜂蜜品种具有较好的品质。同时，具重金属元素例如As、Cd、Pb和Sb对蜂蜜植物源的归类具有显著的影响，而且一些地理因素和地质元素也影响蜂蜜的化学元素组成。Karabagias等人（2014）利用55种挥发性成分，9种理化指标对希腊119个单花蜂蜜样品（松树蜜、百里香蜜、冷杉蜜和香橙花蜜）和14个不同地区的较好品质的杂花蜜结合多元方差分析和线性判别分析等化学计量学的方法进行蜂蜜品种的鉴别。结果表明应用蜂蜜中的40个变量（30个挥发性成分和10个理化指标）就能够较好的区分不同品种的蜂蜜。如果单独用挥发性化合物或者理化指标的判别率也较高。从而说明，多变量的分析是一种有效的工具判别不同品种的蜂蜜。Francesca等人（2015）收集了3大类的蜂蜜（杂花蜜、洋槐蜜和栗花蜜）共计184个蜂蜜样品，利用主成分分析提高花粉学形态分析法的鉴别率。结果表明利用化学计量学的方法结合花粉学形态分析法能够很好的鉴别蜂蜜的品种，鉴别率达到85%。为进一步提高蜂蜜品种鉴别率，拉曼光谱法和化学计量学同样被应用。结果表明拉曼光谱法能够完全鉴别不同蜂蜜品种。1.3研究目的及意义随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，食品安全和质量控制问题已经引起消费者广泛关注。食品真实性是食品安全和质量控制中一个非常重要的环节。通常来说，食品来源掺假和以次充好是影响食品真实性的两个主要因素。蜂蜜作为一种从植物采集且由蜜蜂自身产生的纯天然物质，由于其具有很高的营养价值和药用价值受到许多消费者的青睐。然而，由于部分蜂农和商家掺假造假蜂蜜，严重损害了消费者的利益，导致对蜂蜜知识了解浅薄的消费者不敢贸然购买。目前对于消费者而言，蜂蜜品种来源真实性比蜂蜜掺假问题更受关注。不同蜂蜜品种对人体具有不同的保健功效。同时，蜂蜜价格与品种的关系更加密切。这都将影响消费者的购买意向和蜂蜜的贸易量。因此，有必要开展蜂蜜品种鉴别研究，为保证蜂蜜真实性提供方法上的参考，从而保护消费者利益和蜂业健康发展。随着仪器分析技术和信息技术的发展，人们对蜂蜜品种研究越来越深入。然而，由于不同蜂7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言蜜品种的复杂性、地源的差异性以及受采收季节、加工、储存等不确定性的影响，不同蜂蜜品种主要成分含量差异不显著。传统蜂蜜品种鉴别手段具有局限性，容易造成蜂蜜品种标识混淆和市场价格混乱。质谱法和光谱法等单一的技术提供相对不完整、不全面、不统一的数据结果，容易导致判别模型对于未知蜂蜜样品评价的误判率增加。尤其对我国而言，鉴别蜂蜜品种的研究仍处于发展阶段，为维护消费者和生产蜂蜜企业的利益，保护我国蜂蜜进出口贸易，鉴别蜂蜜品种仍然需要更加准确、可靠、科学、便捷和高效的分析方法。本课题针对蜂蜜品种鉴别，开展基于稳定同位素质谱法、电感耦合等离子质谱法以及上述两种方法数据融合进行深入研究。旨在论证上述三种方法对蜂蜜品种鉴别的可行性，以期将为鉴别蜂蜜品种提供方法上的参考。同时，完善和拓宽蜂蜜品种的检测技术，从而为农产品种类的鉴别提供方法上的借鉴。1.4研究主要内容本论文利用两种分析技术并结合化学计量学方法鉴别椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜六个品种。主要分为以下四个内容：（一）利用碳稳定同位素技术测定蜂蜜及其蛋1313白δC比值，比较不同蜂蜜品种δC比值差异性；（二）利用氢、氧稳定同位素技术测定蜂蜜中218218δH和δO比值，比较不同蜂蜜品种中δH和δO比值差异性；（三）利用电感耦合等离子体质谱技术测定蜂蜜中多种矿质元素的含量，证明该方法可以用来鉴别蜂蜜品种；（四）基于化学计量学手段结合上述数据鉴别蜂蜜品种，主要有：1.稳定同位素法结合化学计量学鉴别蜂蜜品种；2.电感耦合等离子体质谱法结合化学计量学鉴别蜂蜜品种；3.稳定同位素数据与矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种。8 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值13第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值1213碳元素主要由C和C两种稳定同位素组成。由于植物光合作用（固定碳方式的不同），131312导致不同类型植物的δC（即C/C）具有差异性。植物可通过C3途径（卡尔文循环）、C4途径和景天酸代谢（CAM）途径共三种途径固定CO2（李沈轶等，2010）。C3植物利用1，5-二磷酸核酮糖羧化酶催化1，5-二磷酸核酮糖羧化，与CO2反应产生3个3-磷酸甘油酸分子，最终13形成碳水化合物。利用上述途径进行光合作用的植物称为C3植物，其δC值的变化在-22‰～-33‰。例如大部分的水果和谷物均属于C3循环。C4植物利用磷酸烯醇丙酮酸羟基酶来固定碳的光合作用方式，形成一种碳4化合物草酰乙酸，因此称为C4途径。例如，糖类和玉米属于C413循环植物，其δC值的变化范围为-9‰～-20‰；某些植物采用景天酸光合代谢途径（CAM），能13够进行C3途径和C4途径的两种作用方式，它们的δC介于C3植物和C4植物之间，如菠萝、仙人掌等植物（孙丰梅，2009）。植物碳同位素组成不仅与植物光合作用方式有关，还受到外界环境因素影响。如光照时间、温度、湿度、土壤含水量、大气压及大气中CO2的碳同位素组成等因素，导致不同分布区域及13不同种类植物其δC值存在差异性。目前，稳定同位素法逐步应用于鉴别蜂蜜的植物源及地源。稳定同位素法已经成功的应用于鉴别掺假蜂蜜。不法商贩经常使用廉价的高果糖浆进行蜂蜜掺假。对于生物生理过程和化学反应的变化，生物体内主要生物元素的稳定同位素的自然丰度影响较小。大量文献报道碳稳定同位素分析法可以用来检测蜂蜜中是否加入其他糖类。由于单独使1313用蜂蜜的δC值不能完全确定是否添加了C4植物糖，所以引入了测定蜂蜜蛋白的δC值来共同测定。因此，未掺假的蜂蜜中，其蜂蜜与蛋白之间的差值较小，而在掺假的蜂蜜中，其蜂蜜与蛋白之间的差值较大。近年来，蜂产品市场出现许多掺杂造假，品种标识混乱等不良现象，严重影响消费者对购买蜂产品的信心。因此，有必要开展蜂蜜品种鉴定研究，为鉴别蜂蜜品种提供一些方法上的参考，以保护消费者的利益,维护蜂产品的市场秩序。鉴别蜂蜜品种传统的方法有测定蜂蜜pH值、糖类、氨基酸、蛋白质、理化指标、酚类化合物或芳香化合物等方法（陈兰珍等,2008；Mărghitaşetal.,2009），红外光谱法、色谱法、电子鼻法和核磁共振法等近些年兴起的检测技术用于鉴别蜂蜜品种，许多研究报道通过稳定同位素法鉴别蜂蜜真假，但是利用稳定同位素法鉴别我国蜂蜜品种研究鲜有报道。本研究利用稳定同位素法13测定蜂蜜及其蛋白δC的比值，以期为蜂蜜品种鉴别提供一种参考技术。2.1样本来源本实验的184个蜂蜜样品均直接来源于不同地区蜂场，包括椴树蜜（23个）、葵花蜜（16个）、苕子蜜（17个）、油菜蜜（52个）、洋槐蜜（49个）和枣花蜜（22个）。采样时间均为2012年～2014年。表2.1统计不同蜂蜜品种的样品区域及特点。9 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值表2.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点Table2.1Thesamplingregionsandcharacteristicoftheunifloralhoneys.蜂蜜的品种地源特点个数椴树蜜东北地区浅黄剔透，白色结晶23葵花蜜内蒙地区金黄色，无结晶16苕子蜜云南地区浅琥珀色，白色结晶17油菜蜜云南地区白色,白色结晶52洋槐蜜陕西省浅白色,无结晶49枣花蜜陕西省琥珀色,无结晶222.2主要试剂与仪器2.2.1主要试剂13钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、硫酸（H2SO4）、橄榄油标准物质（δC=-30.031‰）、咖啡因标准13品（δCPDB=-27.771‰）。2.2.2主要设备与仪器Flash2000型DeltavThermoFinnigan同位素质谱仪（美国ThermoFisherScientific）、CR22G高速离心机（日本HIMAC公司）、Milli-Q型纯水器（美国Millipore公司）、万分之一电子分析天平（Satorius公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）。2.3样品预处理2.3.1蜂蜜样品称取约1g的蜂蜜样品于10mL的离心管中，加水至10mL，移取3µL至8mm×5mm的锡杯中。移取300µg的橄榄油标准品和300µg的咖啡因标准品于8mm×5mm锡杯中作为蜂蜜样品检测的标准样品。样品均包成小球状，放入96孔的盘中（酶联免疫板），供碳同位素分析。2.3.2蜂蜜蛋白样品称取10~12g的蜂蜜样品于50mL的离心管中，加入5mL水混匀。在一支20mL量筒中加-1入2.0mL10%钨酸钠溶液和2.0mL0.335mol·L硫酸溶液，迅速混匀后，加到上述盛有蜂蜜样品的离心管中，混匀。置于80℃水浴中加热不少于30min，在加热过程中每间隔5~10min旋转混合离心管中内容物20s，直到有絮状物析出。以水注满离心管并混合后，在4℃下以转速为3410r/s下离心5min，倒掉上层清液，再以约50mL水充分洗涤沉淀物并离心，如此反复洗涤沉淀物5次，最后倒干上清液，将含有沉淀蛋白质的离心管置于75℃烘箱中干燥3h以上。称取上述烘干的蛋白质3.0mg，于8mm×5mm锡杯中，密封备用（AOAC,1995）。称取300µg的橄榄油标准物和300µg的咖啡因标准品于8mm×5mm锡杯中，密封备用，作为蜂蜜蛋白质样品检测的标10 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值准样品。样品均包成小球状，放入96孔的盘中（酶联免疫板），供蜂蜜碳蛋白同位素分析。2.4碳稳定同位素测定蜂蜜样品放入8mm×5mm的锡杯中，密封，通过自动进样器进入元素分析仪氧化柱中，蜂蜜样品中碳元素在960℃的条件下转化为CO2。离子源将CO2样品中的原子、分子电离成为离子，质量分析器将离子按照质荷比大小分开，以离子检测器测量，记录离子流强度，以橄榄油标准品1313的δC值和咖啡因标准品的δC值作为参考标准，得出质谱图。最后通过数据处理系统进行计13算，测得样品中δC比值。计算公式为:δx=(R样品/R标准-1)×1000δx是以样品相对参考物质的同位素比值进行表达，单位为‰。R样品和R标准分别代表样品13和参考物质的C绝对数值。2.5数据处理数据分析软件采用SPSS17.0版本进行方差分析和多重比较，采用Origin9.0版本进行相关性分析。2.6结果与分析132.6.1蜂蜜及其蛋白δC范围1313图2.1表示蜂蜜δC的频率分布直方图，其中横坐标表示蜂蜜δC的值，纵坐标表示蜂蜜1313样品个数。图2.2表示蜂蜜蛋白δC的频率分布直方图，其中横坐标表示蜂蜜蛋白δC的值，13纵坐标表示蜂蜜蛋白样品个数。从图2.1和图2.2可得，蜂蜜的δC值范围是-29‰～-22‰，主13要分布在-25‰～-23‰。蜂蜜蛋白的δC值范围是-28‰～-22‰，主要分布在-25‰～-23‰。而分1313布在-23‰以下的蜂蜜δC值较少，同样的，分布在-23‰以下的蜂蜜蛋白δC值较少。1313从蜂蜜与蜂蜜蛋白分布范围可知，蜂蜜的δC值分布范围较大，蜂蜜蛋白的δC值分布范围较集中。研究表明（Whiteetal.,1989;Guleretal.,2014），在蛋白酶作用下，蛋白质生成氨基酸和肽，氨基酸需要在特定条件下发生反应才能生成碳水化合物，微生物才能利用此碳水化合物产1313生二氧化碳。该反应过程比葡萄糖及果糖反应慢得多。因此，蜂蜜蛋白的δC值范围比蜂蜜δC值范围窄（李沈轶等，2010）。11 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值60504030样品个数20100-30-29-28-27-26-25-24-23-22-2113蜂蜜δC13图2.1蜂蜜δC的频率分布直方图13Figure2.1FrequencyhistogramofδCofhoney7060504030样品个数20100-30-29-28-27-26-25-24-23-22-2113蜂蜜蛋白δC13图2.2蜂蜜蛋白δC的频率分布直方图13Figure2.2FrequencyhistogramofδCofhoneyprotein132.6.2蜂蜜与其蛋白δC值相关性分析131313通过研究蜂蜜δC值与蜂蜜蛋白δC值的相关性，从而判断能否仅用蜂蜜δC值能表征蜂1313蜜品种之间的差异。同时，也能判断蜂蜜中δC值与蜂蜜蛋白中δC值变化规律是否一致,即判断它们对蜂蜜植物源的判断结果是否一致。132.6.2.1椴树蜜与椴树蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.3表示椴树蜜δC值与椴树蜜蛋白δC值的相关性，其中横坐标表示椴树蜜δC的值，13纵坐标表示椴树蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.7746x-5.1046,其相关系数为r=0.6313。13相关性分析表明：由于相关系数绝对值小于0.8，不能仅用椴树蜜δC值表征椴树蜜之间的差异。1313同时,也说明椴树蜜中的δC值与椴树蜜蛋白中的δC值变化规律不一致,用它们对椴树蜜来源的判断结果具有差异性。12 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值y=0.7746x-5.1046-24r=0.6313的值C13δ-25椴树蜜蛋白-26-26.5-26.0-25.5-25.013椴树蜜δC的值1313图2.3椴树蜜δC值与椴树蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.3ThecorrelationofδCvaluesoflindenhoneywithitsprotein132.6.2.2葵花蜜与葵花蜜蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.4表示葵花蜜δC值与葵花蜜蛋白δC的相关性，其中横坐标表示葵花蜜δC的值，13纵坐标表示葵花蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.9977x+0.7704,其相关系数为r=0.8239。13相关性分析研究表明：由于相关系数的绝对值大于0.8，不能仅用葵花蜜δC值就能表征葵花蜜1313之间的差异。同时,也说明葵花蜜中的δC值与葵花蜜蛋白中的δC值变化规律相一致,用它们对葵花蜜来源的判断结果具有一致性。-23y=0.9977x+0.7704r=0.8239的值C-2413δ葵花蜜蛋白-25-26-25-2413葵花蜜δC的值1313图2.4葵花蜜δC值与葵花蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.4ThecorrelationofδCvaluesofsunflowerhoneywithitsprotein132.6.2.3苕子蜜与苕子蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.5表示苕子蜜δC值与苕子蜜蛋白δC的相关性，其中横坐标表示苕子蜜δC的值，13纵坐标表示苕子蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.3268-16.1911,其相关系数为r=0.4507。13相关性分析研究表明：由于相关系数的绝对值小于0.8，不能仅用苕子蜜δC值就能表征苕子蜜13 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值1313之间的差异。同时,也说明苕子蜜中的δC值与苕子蜜蛋白中的δC值变化规律不一致,用它们对苕子蜜来源的判断结果具有差异性。y=0.3268-16.1911r=0.4508-24的值C13δ苕子蜜蛋白-25-26-25-2413苕子蜜δC的值1313图2.5苕子蜜δC值与苕子蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.5ThecorrelationofδCvaluesofvetchhoneywithitsprotein132.6.2.4油菜蜜与油菜蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.6表示油菜蜜δC值与油菜蜜蛋白δC的相关性，其中横坐标表示油菜蜜δC的值，13纵坐标表示油菜蜜蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.1130x-30.1743,其相关系数为r=-0.1865。13相关性分析研究表明：由于相关系数的绝对值小于0.8，不能仅用油菜蜜δC值就能表征油菜蜜1313品种之间的差异。同时,也说明油菜蜜中的δC值与椴树蜜蛋白中的δC值变化规律不一致,用它们对油菜蜜来源的判断结果具有差异性。-26.0y=-0.1130x-30.1743r=-0.1865-26.5的值C13δ-27.0油菜蜜蛋白-27.5-29-28-27-2613油菜蜜δC的值1313图2.6油菜蜜δC值与油菜蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.6ThecorrelationofδCvaluesofrapehoneywithitsprotein132.6.2.5洋槐蜜与洋槐蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.7表示洋槐蜜δC值与洋槐蜜蛋白δC的相关性，其中横坐标表示洋槐蜜δC的值，13纵坐标表示洋槐蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.8030x-4.8132,其相关系数为r=0.5493。14 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值13相关性分析研究表明：由于相关系数的绝对值小于0.8，不能仅用洋槐蜜δC值就能表征洋槐蜜1313品种之间的差异。同时,也说明洋槐蜜中的δC值与洋槐蜜蛋白中的δC值变化规律不一致,用它们对洋槐蜜来源的判断结果具有差异性。-23的值C13-24δy=0.8030x-4.8132-25r=0.8089洋槐蜜蛋白-25-24-23-2213洋槐蜜δC的值1313图2.7洋槐蜜δC值与洋槐蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.7ThecorrelationofδCvaluesofacaciahoneywithitsprotein132.6.2.6枣花蜜与枣花蜜蛋白δC值相关性分析131313图2.8表示枣花蜜δC值与枣花蜜蛋白δC的相关性，其中横坐标表示枣花蜜δC的值，13纵坐标表示枣花蜜蛋白δC的值。其方程分别为：y=0.4382x-13.8615,其相关系数为r=0.6313。13相关性分析研究表明：由于相关系数的绝对值小于0.8，不能仅用枣花蜜δC值就能表征枣花蜜1313品种之间的差异。同时,也说明枣花蜜中的δC值与椴树蜜蛋白中的δC值变化规律不一致,用它们对枣花蜜来源的判断结果具有差异性。-23.6y=0.4382x-13.8615r=0.5493-23.8的值C13-24.0δ-24.2枣花蜜蛋白-24.4-23.5-23.013枣花蜜δC的值1313图2.8枣花蜜δC值与枣花蜜蛋白δC值的相关性13Figure2.8ThecorrelationofδCvaluesofjujubehoneywithitsprotein13因此，经上述分析，葵花蜜和洋槐蜜与其各自蛋白δC值的相关系数高于0.8，属于高度相1313关；这说明蜂蜜中的δC值与蜂蜜蛋白中的δC值变化规律一致，用它们对蜂蜜植物源的判断15 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值结果基本相同。然而，椴树蜜，苕子蜜，油菜蜜和枣花蜜中的蜂蜜与蜂蜜蛋白的相关性系数均低1313于0.8，这说明蜂蜜中的δC值与蜂蜜蛋白中的δC值变化规律不一致，用它们对蜂蜜植物源的13判断结果基本具有差异性。因此，葵花蜜和洋槐蜜能仅用蜂蜜蜂蜜δC值就能表征蜂蜜品种之间差异。2.6.3蜂蜜品种差异性分析13表2.2统计各个蜂蜜品种及其蜂蜜蛋白的δC值。从表2.2可以计算出，在六种蜂蜜中,同种1313蜂蜜δC平均值与其蜂蜜蛋白δC平均值的差值在0.05‰～0.73‰范围之间（即Ch平均值-Cp平均值的绝对值）；研究表明（Rogersetal.,2014），蜂蜜与蜂蜜蛋白之间的碳同位素差值在1‰1313以内，则蜂蜜为不掺假的蜂蜜；因此，由于本实验六种蜂蜜δC平均值与其蜂蜜蛋白δC平均值的差异值小于1‰，验证选取的蜂蜜均为不掺假蜜种，也说明蜂蜜品质较好。13通过方差分析及多重比较的结果表明（显著水平P<0.05）：不同蜂蜜品种中δC存在显著差异，其中椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜之间均具有显著性差异,蜂蜜中13δC平均值的排列顺序为；枣花蜜（-23.43‰）>洋槐蜜（-23.93‰）>葵花蜜（-24.61‰）>苕子13蜜（-25.14‰）>椴树蜜（-25.90‰）>油菜蜜（-27.67‰）。同样地，某些蜂蜜蛋白中δC值也具有差异性。在蜂蜜蛋白中，油菜蜜蛋白与其他五个品种蜂蜜蛋白具有显著性差异；椴树蜜蛋白与其他五个品种蜂蜜蛋白具有显著性差异；苕子蜜蛋白与其他五个品种蜂蜜蛋白具有显著性差异；油菜蜜蛋白与其他五个品种蜂蜜蛋白具有显著性差异；枣花蜜蛋白与其他五个品种蜂蜜蛋白具有显著性差异；葵花蜜蛋白与洋槐蜜蛋白无显著性差异，但各自均与剩下的四种蜂蜜蛋白有显著性差异。对于蜂蜜蛋白平均值、排列顺序而言：葵花蜜蛋白（-23.93‰）>槐花蜜蛋白（-23.98‰）>枣花蜜蛋白（-24.13‰）>苕子蜜蛋白（-24.41‰）>油菜蜜蛋白（-25.05‰）>椴树蜜蛋白（-25.17‰）。1313因此，可以利用蜂蜜δC值鉴别蜂蜜品种。同样的，蜂蜜蛋白δC值可以用于鉴别部分蜂蜜品种。13表2.2蜂蜜及蜂蜜蛋白的δC值13Table2.2ThestatisticalresultsofδCvaluesofhoneyandhoneyproteinCh平均值（‰）Cp平均值（‰）指标Ch范围（‰）Cp范围（‰）±标准偏差（‰）±标准偏差（‰）ab椴树蜜-26.86～-25.07-25.90±0.65-26.46～-23.25-25.17±0.81bd葵花蜜-26.08～-23.78-24.61±0.64-25.44～-22.59-23.93±0.92cc苕子蜜-26.60～-23.99-25.14±0.95-25.57～-23.12-24.41±0.69da油菜蜜-28.95～-25.97-27.67±0.84-27.95～-25.91-27.05±0.51fd洋槐蜜-24.99～-22.04-23.93±0.61-27.95～-22.39-23.98±0.68ecd枣花蜜-23.88～-22.62-23.43±0.31-24.55～-23.51-24.13±0.251313注：Ch代表蜂蜜δC值，Cp代表蜂蜜蛋白δC值。右上脚标准的小写字母表示差异显著（P<0.05）2.7本章小结利用碳稳定同位素质谱法分别测定椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜、枣花蜜中蜂16 13中国农业科学院硕士学位论文第二章碳稳定同位素测定蜂蜜中δC的比值131313蜜及其蛋白的δC值。六种蜂蜜中同种蜂蜜δC平均值与蜂蜜蛋白的δC平均值的差异在130.05‰～0.73‰之间，说明验证这六个蜂蜜品种均未掺假，所以这些蜂蜜品质较好。蜂蜜中δC13值范围是-29‰～-22‰，主要分布在-25‰～-23‰。蜂蜜蛋白中δC值范围是-28‰～-22‰，主要13分布在-25‰～-23‰。而分布在-23‰以下的蜂蜜δC值较少。同样的，分布在-23‰以下的蜂蜜131313蛋白δC值较少。从蜂蜜与蜂蜜蛋白分布范围可知，蜂蜜蛋白的δC值范围较集中，蜂蜜的δC13值范围较大。蜂蜜中δC平均值的排列顺序为；枣花蜜（-23.43‰）>洋槐蜜（-23.93‰）>葵花蜜（-24.61‰）>苕子蜜（-25.14‰）>椴树蜜（-25.90‰）>油菜蜜（-27.67‰）。对于蜂蜜蛋白平均值的排列顺序而言：葵花蜜蛋白（-23.93‰）>槐花蜜蛋白（-23.98‰）>枣花蜜蛋白（-24.13‰）>苕子蜜蛋白（-24.41‰）>油菜蜜蛋白（-25.05‰）>椴树蜜蛋白（-25.17‰）。相关性分析结果表明椴树蜜、苕子蜜、油菜蜜、枣花蜜中蜂蜜与其蛋白的相关系数低于0.8，1313可以说明它们蜂蜜中δC值与其蜂蜜蛋白中δC值变化规律具有差异性。葵花蜜和洋槐蜜中蜂1313蜜与其蛋白的相关系数高于0.8，可以说明它们蜂蜜中δC值与其蜂蜜蛋白中δC值变化规律具13有一致性。因此，葵花蜜和洋槐蜜用蜂蜜δC能表征蜂蜜品种之间的差异。13方差分析及多重比较的结果表明，不同品种蜂蜜δC值均存在显著差异；同样地，某些蜂蜜131313蛋白δC值也有所差异。这表明蜂蜜δC值可以用于鉴别蜂蜜品种，蜂蜜蛋白δC值可以用于1313鉴别部分蜂蜜品种。说明蜂蜜δC值对蜂蜜品种鉴别具有可行性，可为蜂蜜品种与δC之间的关系提供理论依据。17 218中国农业科学院硕士学位论文第三章氢、氧稳定同位素测定法蜂蜜中δH和δO的比值218第三章氢、氧稳定同位素测定蜂蜜中δH和δO的比值123水分子是由氢元素和氧元素组成,它们是示踪水分子循环最科学的同位素。H、H、H是氢21161718元素的三种稳定同位素。氢稳定同位素比值常用H/H表示。0、0和0是氧元素的三种稳定1816同位素,氧稳定同位素比值常用0/0表示。研究表明（郭波莉，2007；Caminetal.,2015），水中稳定性同位素比值在水循环中主要受因物理条件如雨水凝结、蒸发等变化及混合作用引起同位素分馏作用而产生规律性的变化。目前，稳定同位素技术已逐渐的应用到农产品的分类和溯源中。Liu等人（2015）为了调查13152稳定同位素（δC、δN和δH）对小麦籽粒中的地域，丰收年份的影响，收集了270份2011到2013年收成的中国不同地区的小麦籽粒，其中包括10类不同基因型的小麦籽粒。结果表明稳1315定同位素δC和δN的比值由地区、基因型、收成年份和他们之间的交互作用（地区×基因型、2基因型×年份、地区×年份和基因型×地区×年份）所影响，δH显著地被小麦籽粒的地区，基因型、13152收成年份和地区×年份所影响。地区影响小麦籽粒对于δC、δN和δH占整体因素的47.57%、58.02%和27.96%。同时，有研究表明了蜂蜜H、C、N和S稳定同位素与地源之间具有一定的关系，Schellenberg等人（2010）为了研究蜂蜜是否在不同气候和地理特点下能够利用稳定同位素比值来鉴别蜂蜜地理来源,从20个欧洲地区的516个真实蜂蜜样品中的H、C、N和S的稳定同位素比值。由于蜂蜜中含有少量的N和S，所以利用蜂蜜蛋白获得测量这些稳定同位素数据。H稳定同位素比值的平均值与其当地的降雨量和地下水中的H稳定同位素有关。气候因素影响C稳定同位素的比值。地理位置（浪花效应）和表面土壤影响S同位素的比值。结果表明：蜂蜜中四种稳定同位素C、N、H和S能应用于蜂蜜的溯源。利用典型判别分析能够使C和S同位素在蜂蜜品种之间实现最大判别率；七个地区样品的正确判别率大于70%；我国幅员辽阔，蜂蜜的植物来源千差万别，而植物类型是影响氢氧同位素组成的主要因素。此外，蜂蜜在不同产地间的地理、气候条件具有较大的差异性，直接影响蜂蜜植物源所属产地的土壤中中氢氧稳定同位素组成，从而间接影响蜂蜜氢氧稳定同位素的组成。然而，关于蜂蜜氧稳定同位素与蜂蜜品种之间的关系，国内外文献鲜有报道。3.1样本来源参照第二章。3.2试剂与仪器3.2.1主要试剂2182δH和δO的标准物质为V-SMOW（ViennaStandardMeanOceanWater）。δH的质控为EMA221818P1（δH=-25.3‰）和EMAP2（δH=-87.80‰）、δO的质控为USGS43（δO=14.11‰）和EMA1818P1（δO=20.99‰）和EMAP2（δO=26.9‰）。18 218中国农业科学院硕士学位论文第三章氢、氧稳定同位素测定法蜂蜜中δH和δO的比值3.2.2主要仪器参照第二章。3.3样品预处理称取80ug的蜂蜜蛋白样品放入中8mm×5mm的小银杯中,包成小球状,放入96孔的盘中（酶218联免疫板），供分析δH和δO。在测定之前，样品和标准品均放在实验室的平衡架上，在室温条件下平衡96h以上。3.4氢及氧稳定同位素测定3.4.1氢稳定同位素测定蜂蜜样品利用稳定同位素质谱仪在1420℃的高温下分解成H2、N2和CO气体，然后经过80℃的纯化柱，利用孔径为5A的分子筛除去N2和CO气体，得到纯净的H2，进入稳定同位素质谱仪(IRMS)中进行测定。载气He的流量为100ml/min，样品在载气作用下的流量为50ml/min。3.4.2氧稳定同位素测定蜂蜜样品氧同位素测定：通过自动采样器送入高温元素分析仪（TC-EA）。蜂蜜样品利用稳定同位素质谱仪在1420℃的高温下电离为CO气体，然后经过柱温为90℃的气相色谱柱，最后进入稳定同位素质谱仪（IRMS）中进行测定。载气He气流量为70ml/min，标准气体为CO。计算公式为:δx=(R样品/R标准-1)×1000δx是以样品相对参考物质的碳和氢同位素比值进行表达，单位为‰。R样品和R标准分别代218表样品和参考物质的稳定同位素绝对数值。δH和δO的标准物质为V-SMOW（ViennaStandard22218MeanOceanWater）。δH的质控为EMAP1（δH=-25.3‰）和EMAP2（δH=-87.80‰），δO的181818质控为USGS43（δO=14.11‰）和EMAP1（δO=20.99‰）和EMAP2（δO=26.9‰）。分析218的精确度分别为δH≦2‰和δO≦0.2‰。3.5数据处理实验数据应用SPSS17.0版进行方差分析及多重比较，利用Origin9.0版本作盒状图。盒状图能够直观地看出每个体系的全部观测值，表示指标的集中趋势。图中有一条从最高数值到最低数值的竖线,这就是盒状图中的“须”。封闭盒子的上下两横向直线为上下四分位数,即数据有四分之一的数目大于上四分位数，在盒子的上端。另外有四分之一的数目小于下四分位数，在盒子的下端。有一半数目在中间封闭盒子的范围内。盒子的中心横线是数据的中位数。盒子的中心点是数据的平均值（郭波莉，2007）。19 218中国农业科学院硕士学位论文第三章氢、氧稳定同位素测定法蜂蜜中δH和δO的比值3.6结果与分析2183.6.1不同蜂蜜品种中δH、δO差异性分析22图3.1表示不同蜂蜜品种中δH的值，其中纵坐标表示不同蜂蜜品种δH的值。图3.2表示18182不同蜂蜜品种δO的值，其中纵坐标表示不同蜂蜜品种δO的值。蜂蜜δH平均值的排列顺序18为洋槐蜜>枣花蜜>苕子蜜>葵花蜜>椴树蜜>油菜蜜（如图3.1）。蜂蜜δO平均值的排列顺序为枣花蜜>苕子蜜>油菜蜜>洋槐蜜>葵花蜜>枣花蜜>椴树蜜（如图3.2）。通过方差分析和多元比较结218果表明（显著水平（P<0.05）），不同蜂蜜品种中δH均具有显著差异。不同蜂蜜品种中δO也具有显著性差异。0-20-40H2-60δ椴树蜜-80葵花蜜苕子蜜-100油菜蜜洋槐蜜枣花蜜2图3.1不同蜂蜜品种中δH的值2Figure3.1TheδHvaluesofhoneysamplesaccordingtofloralorigins.5040O3018δ20椴树蜜葵花蜜苕子蜜10油菜蜜洋槐蜜枣花蜜18图3.2不同蜂蜜品种δO的值18Figure3.2TheδOvaluesofhoneysamplesaccordingtofloralorigins.2183.6.2不同蜂蜜品种中δH和δO相关性分析2182图3.3表示蜂蜜δH和δO同位素散点图，其中横坐标表示不同蜂蜜品种δH中的值，纵坐18218标表示不同蜂蜜品种中δO的值。从图3.3可以直观地看出：不同蜂蜜品种中δH和δO具有很大差异，它们对不同蜂蜜品种的区分效果非常明显并且各自品种呈现聚集趋势。22其中，油菜蜜中δH在六个品种蜂蜜中最低，其分布于坐标轴的最左方。洋槐蜜中δH在六18个蜂蜜品种中最高，其分布于坐标轴的最右方。椴树蜜的δO的值在六个蜂蜜品种中最低，其20 218中国农业科学院硕士学位论文第三章氢、氧稳定同位素测定法蜂蜜中δH和δO的比值18分布于坐标轴的最下方。枣花蜜的δO的值在六个蜂蜜品种中最高，其分布于坐标轴的最上方。苕子蜜较为分散，且与枣花蜜有轻微的重叠。葵花蜜分布于其他五个蜂蜜品种的中部。研究表明：蜂蜜中H稳定同位素比值的大小是由其植物源在光合作用和呼吸作用中吸收及运输水分的能力所决定。O稳定同位素比值的大小同样受到其植物源吸收空气中的CO2和H2O的能力所决定。不同蜂蜜植物源光合作用与呼吸作用的能力不一样（Farquhar，1989）。因此，这些分析结果表明，可以利用H和O稳定同位素鉴别蜂蜜品种。椴树蜜50葵花蜜苕子蜜45油菜蜜洋槐蜜40枣花蜜35）‰30（O2518δ201510-90-80-70-60-50-40-30-202δH（‰）218图3.3蜂蜜δH和δO同位素散点图218Figure3.3ScoreplotofδHvsδOisotoperatiosofhoneysamples.3.7本章小结本实验利用稳定同位素质谱法分别测定椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、枣花蜜和槐花蜜2182中δH和δO。蜂蜜δH平均值的排列顺序为洋槐蜜>枣花蜜>苕子蜜>葵花蜜>椴树蜜>油菜蜜。18蜂蜜δO平均值的排列顺序为枣花蜜>苕子蜜>油菜蜜>洋槐蜜>葵花蜜>枣花蜜>椴树蜜。2方差分析及多重比较的结果表明：六个蜂蜜品种中δH具有显著性差异，表明这六个蜂蜜品218种中δH可鉴别蜂蜜品种。同样地，六个蜂蜜品种中δO平均值有显著性差异，表明六个蜂蜜18218品种δO可鉴别蜂蜜品种。同时，说明蜂蜜δH值和δO值对蜂蜜品种鉴别具有可行性且效果218较好，可为今后关于蜂蜜品种与δH值和δO值之间的关系提供理论依据。218通过δH与δO做散点图，结果表明所有蜂蜜品种均能较好的分散开，且同一蜂蜜品种的218聚集程度较好。因此，可以利用蜂蜜中δH和δO结合鉴别蜂蜜品种。21 中国农业科学院硕士学位论文第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量众所周知，蜂蜜具有丰富的营养物质以及药用价值。其中某些特性是由蜂蜜中的矿质元素所决定。而蜂蜜中矿质元素又取决于蜂蜜品种。蜂蜜矿质元素的来源不是由蜜蜂自身的组织所产生，而是取决于蜂蜜所采集的植物花蜜或花粉所决定。蜂蜜中含有许多矿质元素，其中包括许多常量、微量及痕量的矿质元素都是人体饮食所必需。主要有K、Ca、Na、Mg、Fe和Mg等常量元素，同样的还有Mn、Si、B、Sn、Ba、Mo、Cr、Pb、Cd、Al、Ag和As等微量和痕量元素。2蜜蜂活动主要是距离蜂箱半径为2～3km的范围内搜索蜜源植物。因此，蜂蜜可提供关于其搜索区域有价值的信息。由于蜂蜜是蜜蜂的产物，酿造蜂蜜时很难进行人为的干扰。所以其品质也不会因为此过程而受到影响或改变。因此，矿质元素可以用来进行蜂蜜产地溯源（Mariaetal.，2008）。近些年，食品真实性问题已经引起了许多消费者的广泛关注。蜂蜜品种的真实性同样受到重视。对于消费者而言，蜂蜜品种与其营养价值、药用价值和独特气味都具有重要意义。蜂蜜矿质元素的含量同样可以表明蜜源植物和其周围土壤的质量。这些参数能够清晰地表明蜂蜜的品种与来源，这些元素可以为消费者提供必要的信息。因此，矿质元素可作为一个重要鉴别蜂蜜品种特征。电感耦合等离子体质谱技术具有较快分析速度，较低的检出限，能够同时测定多种矿质元素等优点（王强等，2013）。由于该技术在近些年的快速发展，在酒类、谷物、蔬菜等食品和农产品领域已经得到广泛应用（Nardietal.,2009;Ariyamaetal.,2007）。蜂蜜中矿质元素含量较低但其种类多，利用ICP-MS进行测定能够达到要求。Chudzinska等人（2010）利用电感耦合等离子体质谱法测定来自波兰三个不同品种的55个蜂蜜样品（甘露蜜、荞麦蜜和油菜蜜）的多种矿质元素，利用化学计量学的手段（聚类分析和主成分分析）对矿质元素含量进行分析，聚类分析表明蜂蜜能够按照品种进行很好的分类。主成分分析将用4个主成分解释77.19%的总体变量。第一主成分与K、Al、Ni和Cd有关。研究表明主成分分析和聚类分析不仅是较好的鉴别蜂蜜真假工具，而且还能够较好的鉴别蜂蜜品种。他紧接着又分析140个蜂蜜样品（甘露蜜、荞麦蜜和油菜蜜）中15种矿质元素（Al、B、Ba、Ca、Cd、Cr、Cu、K、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Sr和Zn）。采用有监督的模式识别技术（线性判别分析与分类分析及回归树状分析）进行鉴别蜂蜜品种以及寻找蜂蜜相应的标记物。分析结果表明：线性判别分析对鉴别蜂蜜品种的判别率为100%。此外，矿质元素也能鉴别蜂蜜地源（Chudzinskaetal.,2011）。本章利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法对不同蜂蜜品种中20种矿质元素进行测定，明确利用ICP-MS法对我国蜂蜜进行品种鉴别的可行性。4.1样本来源本实验的184个蜂蜜样品均直接来源于不同地区蜂场，包括椴树蜜（23个）、葵花蜜（18个）、苕子蜜（17个）、油菜蜜（52个）、洋槐蜜（52个）和枣花蜜（22个）。采样时间均为2012年～22 中国农业科学院硕士学位论文第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量2014年。表4.1统计不同蜂蜜品种的样品区域及特点。表4.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点Table4.1Thesamplingregionsandcharacteristicoftheunifloralhoneys.蜂蜜的品种地源特点个数椴树蜜东北地区浅黄剔透，白色结晶23葵花蜜内蒙地区金黄色，无结晶18苕子蜜云南地区浅琥珀色，白色结晶17油菜蜜云南地区白色,白色结晶52洋槐蜜陕西省浅白色,无结晶52枣花蜜陕西省琥珀色,无结晶224.2试剂与仪器4.2.1主要试剂优级纯硝酸（HNO3）（德国SIGMA-ALDRICH公司）、1μg/L调谐液（Ce、Co、Li、Y、Mg和Ti）（美国Agilent公司）、多元素标准贮备液:1000mg/L（Fe、K、Ca、Na和Mg），100mg/L（Sr）、10mg/L（Be、Al、V、Cr、Mn、Co、Cu、Zn、As、Se、Ag、Cd、Sb、Ba、Pb、Th和U）（美国Agilent公司）、内标液（Er）（1mg/L）（美国Agilent公司）、Milli-Q型纯水器（美国Millipore公司）。4.2.2主要仪器7500cx型电感耦合等离子质谱仪（美国Agilent公司）、载气和辅助气体是纯度不低于99.99%高纯氩气、电热板消化炉（北京普立泰科公司）、Milli-Q型纯水器（美国Millipore公司）、实验所用的容量瓶、消化管和进样管先用超纯水洗涤干净，利用50%的硝酸浸泡24小时，超纯水冲洗三次去除瓶壁残留的酸液，最后用超纯水浸泡3小时再用超纯水清洗两次，烘干备用（王勇,2014）。4.3样品预处理称取约1.0g样品,置于50mL的消化管中,加入10mL优级纯硝酸，每个样品做3个平行，静置过夜进行预硝化。按照消解温度程序70℃10min，120℃20min，180℃30min，200℃40min进行升温消解。程序升温达到180℃后需要不停观察，赶酸至1mL左右，取出消化管，经室温冷却后用超纯水多次冲洗消化管，合并洗涤溶液至25mL容量瓶，并用水定容，摇匀，备用，样液用0.45μm滤膜过滤至经过硝酸浸泡清洗的离心管内，待上机测定。同时，配备试剂空白溶液3份（仅不称取蜂蜜样品，其他步骤与蜂蜜样品湿法消解过程完全一致）。在该批样品测定结果中扣除空白处理的测定值，以避免接触材料和消化过程中的污染影响最终的测定结果。23 中国农业科学院硕士学位论文第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量4.4仪器测定通过对矩管位置，载气流速等参数进行仪器条件优化,使仪器灵敏度，分辨率等各项指标达到测定要求：射频发生器1500W、载气氩气流速0.93L/min、补充气氩气流速0.16L/min、采样深度7.9mm、雾化室温度2℃、矩管水平位置0.5mm、矩管垂直位置-0.7mm、蠕动泵流速0.1rps、碰撞反应氦气流量4.0mL/min、冷却气氩气流速15L/min、生需动泵0.3rps（吴招斌等,2015）。三次重复测定，外标法进行定量。以Er作为内标，当内标元素的RSD大于5%时，要重新调整仪器参数，重新测定样品。4.5结果与分析4.5.1方法检出限及回收率表4.2统计不同蜂蜜品种中20种矿质元素中各个元素的空白值、检出限及回收率。为检测方法的准确度，对样品进行加标回收实验，各个元素的加标量如表所示，每个样品做3个平行实验。实验数据表明：回收率在90.2%～109.9%，平均回收率良好，能满足测定要求。表4.2各个元素的空白值、检出限及回收率Table4.2Blank,detectionlimitsandrateofstandardadditionrecoveryofelements样品量测得量元素空白值检出限加标量回收率（%）(mean±SD)(mean±SD)Na(mg/kg)0.180.0485035.01±0.8583.55±0.2397.08Mg(mg/kg)0.270.0055513.26±1.2718.28±2.01100.4K(mg/kg)0.980.23500515.4±0.271027.32±0.89102.3Ca(mg/kg)0.380.125021.11±0.575.05±0.7107.8Fe(mg/kg)0.150.00320.52.04±1.262.53±1.8198Cr(μg/kg)0.350.125021.35±1.9174.12±2.08105.5Mn(μg/kg)0.530.2350195.31±0.36241.95±0.5793.28Co(ug/kg)0.0380.01256.03±0.4110.82±0.195.8Ni(μg/kg)0.880.43519.86±0.3724.37±1.3190.2Cu(μg/kg)0.750.4650115.24±1.82160.59±2.4490.7As(μg/kg)0.0630.02558.85±0.2913.46±0.2192.2Se(μg/kg)0.0690.02852.39±1.457.35±0.4199.2Sr(μg/kg)0.470.3550825.86±1.91874.09±0.3696.46Mo(μg/kg)0.390.26512.25±1.0217.63±0.81107.6Ag(μg/kg)0.0550.0140.50.15±0.120.69±0.14108Cd(μg/kg)0.0420.0370.50.68±0.961.15±1.7794Ba(μg/kg)0.480.2550131.85±1.31186.8±1.77109.9Tl(μg/kg)0.0190.0110.51.35±1.651.83±0.3196Th(μg/kg)0.0250.0160.50.83±1.321.35±0.37104U(μg/kg)0.0310.0150.51.45±1.211.99±1.4510824 中国农业科学院硕士学位论文第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量4.5.2测定结果表4.3统计椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜中矿质元素的平均值及其标准偏差。在本研究中，K、Na、Ca、Mg和Fe是大量矿质元素，其平均值超过1mg/kg。这些蜂蜜品种中大量矿质元素含量平均值高低为K>Na>Ca>Mg>Fe。Mn、Cu、Sr和Ba的矿质元素含量大概在0.1～1mg/kg的范围内，而其他痕量元素含量低于100μg/kg。然而，不同文献数据可能呈现不同的结果，许多研究表明不同蜂蜜品种受到其化学成分的影响。同时，不同的前处理方法（例如：微波消解法、干法消化法和湿法消化法）和不同的分析技术可能会影响实验结果。蜂蜜中K元素含量与前人研究其含量具有一致性结论（Mariaetal.,2008;Pohl,2009;Bilandžišetal.,2014;Chenetal.,2014），均为含量最丰富的元素。在六个蜂蜜品种中，枣花蜜中K元素含量最高，然后为椴树蜜、葵花蜜、洋槐蜜、油菜蜜和苕子蜜。在六个蜂蜜品种中20种矿质元素，Na元素含量是其次丰富的矿质元素（Pohl，2009）。Na元素含量高低为枣花蜜>葵花蜜≈椴树蜜>油菜蜜>苕子蜜≈洋槐蜜。在六个蜂蜜品种中20种矿质元素，Ca元素含量是第三丰富的矿质元素。其含量高低为枣花蜜>油菜蜜≈葵花蜜>洋槐蜜>苕子蜜>椴树蜜。在六个蜂蜜品种中20种矿质元素，Mg元素含量是第四丰富的矿质元素，其含量高低为枣花蜜>葵花蜜>油菜蜜>椴树蜜>洋槐蜜>苕子蜜。在六个蜂蜜品种中20种矿质元素，Fe元素含量是第五丰富的矿质元素，其含量高低为枣花蜜>苕子蜜>油菜蜜>洋槐蜜>椴树蜜>葵花蜜。枣花蜜是这六种蜂蜜中颜色最深。研究表明，蜂蜜中矿质元素含量与其颜色有关，特别是与大量元素含量有关。即颜色较深蜂蜜中矿质元素的含量比颜色较浅蜂蜜中矿质元素含量高。因此，枣花蜜中K、Na、Ca、Mg和Fe含量均是最高。所有蜂蜜样品中，痕量元素的含量都低于1mg/kg。说明中国蜂蜜的品质较好，特别是重金属元素如As和Cd含量特别低。椴树蜜在这六个蜜种中的Cr、Mo和TI的含量最高，Se在苕子蜜的含量中是最高。25 16.03±11.77200.97±48.5219.02±20.6719.92±17.69186.76±124.18102.02±508.2745.21±252.2494.84±61.8463.88±70.99平均值标准偏差±油菜蜜0.67±0.533.04±14.1814.85±3.2630.74±19.482.63±2.2314.27±21.992.78±3.9441.55±44.1910.03±8.872.82±2.4911.7±9.620.14±0.1475.58±77.154.57±3.370.92±1.091.23±1.02162.76±65.17339.95±124.77120.64±154.62120.78±93.52平均值标准偏差±9±4.83苕子蜜0.5±0.457.13±3.678.73±7.553.22.73±1.155.14±1.813.77±1.161.13±0.870.17±0.1534.1±21.450.43±1.520.01±0.020.19±0.1221.06±13.43137.18±45.9320.26±10.51109.66±62.1332.74±18.1765.12±16.4532.17±24.34平均值电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量26第四章标准偏差±葵花蜜67.01±20.8817.76±5.07642.7±328.829.86±21.661.49±0.8817.32±12.22.48±4.8323.82±10.39274.1±90.76.14±6.712.48±1.6210.05±9.090.12±0.120.49±0.71100.67±58.30.05±0.070.45±0.331.48±1.09不同蜂蜜品种的各个矿质元素的含量202.82±67.87914.17±550.21平均值4.3表Table4.3Themultielementresultsoftheunifloralhoneys.1.4标准偏差±椴树蜜5.25±3.931.95±3.5822.32±91.06±2.82±4.832.64±1.950.18±0.280.18±0.20.04±0.110.3±0.6764.26±26.8313.03±4.1921.4±25.6888.91±33.01347.3±162.713.86±12.322.44±84.281589.99±534.11923.94±493.16245.72±199.59平均值中国农业科学院硕士学位论文部标准偏差全±13.69±7.912.56±6.692.94±5.872.61±1.949.9±9.630.22±0.890.47±0.66.08±40.560.6±1.471.19±1.3649.65±40.16764.39±777.5221.68±21.5719.54±14.61411.68±392.0147.18±268.11142.19±119.1416.49±132.77134.28±142.38643.75±1089.63平均值g)g)元素Na(mg/kg)Mg(mg/kg)K(mg/kg)Ca(mg/kg)Fe(mg/kg)Cr(μg/kg)Mn(μg/kg)Co(ug/kg)Ni(μg/kg)Cu(μg/kg)As(μg/kSe(μg/kg)Sr(μg/kg)Mo(μg/kg)Ag(μg/kg)Cd(μg/kg)Ba(μg/kg)Tl(μg/kg)Th(μg/kg)U(μg/k 中国农业科学院硕士学位论文第四章电感耦合等离子体质谱法测定蜂蜜中多种矿质元素的含量4.6本章小结本实验利用电感耦合等离子体质谱法分别测定椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、枣花蜜、洋槐蜜中的Na、Mg、K、Ca和Fe等20种矿质元素含量。测定方法检出限及回收率均满足实验要求，其回收率在90.2%～109.9%。表明电感耦合等离子体质谱法对蜂蜜品种鉴别具有可行性。六个蜂蜜品种中K、Na、Ca、Mg和Fe矿质元素含量均最高，其含量高低为K>Na>Ca>Mg>Fe。Mn、Cu、Sr和Ba的含量在0.1～1mg/kg。其他痕量元素（如As和Cd）低于100μg/kg。椴树蜜中Cr、Mo和TI的含量最高，苕子蜜中Se的含量最高。蜂蜜中矿质元素与其颜色有关，特别是与大量元素含量有关。深色蜂蜜矿质元素含量比浅色蜂蜜高。其中，枣花蜜是六个蜂蜜品种中颜色最深。27 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种单一技术提供的数据结果具有不完整性、不全面性和不统一性等特点。容易导致函数模型对于样品误判率增加。因此，利用两种或多种技术融合能够提高模型的准确性和可靠性。目前，稳定同位素及其矿物元素组合已逐渐的应用到农产品的分类和溯源中。Zhao等人（2013）利用C、N稳定同位素和23种矿质元素相结合鉴别中国四个省份牛肉。结果表明喂养西藏地区牛的草饲料主要类型是C3植物。利用玉米饲料喂养山东地区和黑龙江地13区的牛，其牛肉δC的含量上有差异性。其中这两个产地的牛肉的23种元素中有18种元素具有显著差异性。采用主成分分析和判别分析等化学计量学的手段进行实验数据处理，在牛肉样品中发现鉴别牛肉产地的八个关键指标。在判别分析中，回代检验率和交叉验证判别率均为100%。研究证明稳定同位素和矿质元素相结合能够鉴别牛肉产地。Ariyama等人（2012）为鉴定日本市场上流通的大米来源进行研究。在这个研究中，用高分8786辨率的电感耦合等离子体质谱仪来测定Sr/Sr和Pb的同位素比值及多种矿质元素Al、Fe、Co、Ni、Cu、Rb、Sr和Ba含量。通过基于三种化学计量学方法的分析比较，可以确定大米地理来源。在10倍的交叉判别的条件下，预测率大概为97%。结果表明多种元素的含量结合化学计量学可鉴别大米地理来源。然而，基于稳定同位素与矿物元素组合对蜂蜜品种的鉴别在文献中鲜有报道。本研究分别在稳定同位素和矿物元素鉴别蜂蜜品种可行性基础上，利用化学计量学手段比较稳定同位素、矿物元素及其此二者互相结合的判别率，分析它们三者各自对蜂蜜品种的判别情况，旨在探索鉴别蜂蜜品种更为有效方法。5.1样本来源本实验的126个蜂蜜样品均直接来源于不同地区蜂场，包括椴树蜜（22个）、葵花蜜（18个）、苕子蜜（20个）、油菜蜜（26个）、洋槐蜜（18个）和枣花蜜（22个）。采样时间均为2012年～2014年。表5.1统计不同蜂蜜品种的样品区域及特点。表5.1不同蜂蜜品种的样品区域及特点Table5.1Thesamplingregionsandcharacteristicoftheunifloralhoneys.蜂蜜的品种地源特点个数椴树蜜东北地区浅黄剔透，白色结晶22葵花蜜内蒙地区金黄色，无结晶18苕子蜜云南地区浅琥珀色，白色结晶20油菜蜜云南地区白色,白色结晶26洋槐蜜陕西省浅白色,无结晶18枣花蜜陕西省琥珀色,无结晶2228 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种5.2实验方法参照第二章、第三章和第四章。5.3数据处理分析软件采用Matlab7.9版本进行主成分分析和SPSS17.0版本进行线性判别分析。主成分分析（PCA）是在尽量减少有效数据信息的情况下进行数据集的减维压缩，尽可能最大限度的保留原始变量。主成分分析能够解释数据集的变量（Konstantinosetal.,2010;Robertoetal.,2012;Mariavittoriaetal.,2011;Paulpetal.,2005）。线性判别分析（LDA）线性判别分析是一种监督模式下的化学计量学方法，是对各个已知样品中多种变量观测值建立线性判别函数，然后以判定线性判别函数对具体研究对象和未知样品进行判别的一种多元统计的化学计量学方法（Bongetal.,2013;Dasaetal.,2013）。为了能够验证模型的稳定性及能力，留一法的交叉验证判别分析被采用。在这个测试中，用已经的样品当做未知的样品去验证建立的模型。一个样品从数据集中移除，每个样品依次重复这个过程，可以通过已知样品来源进行模型的重复计算出其判别率（Heatonetal.,2008;Kellyetal.,2008）。5.4结果与分析5.4.1稳定同位素结合化学计量学鉴别蜂蜜品种1313218利用线性判别分析对蜂蜜中δCh、δCp、δH和δO的含量进行蜂蜜品种的鉴别。表5.2统计利用线性判别分析后稳定同位素的判别分析的分类结果。在椴树蜜回代检验中，一个椴树蜜被误判为洋槐蜜，一个椴树蜜被误判为枣花蜜。在葵花蜜回代检验中，两个葵花蜜被误判为苕子蜜，两个葵花蜜被误判为枣花蜜。在苕子蜜回代检验中，一个苕子蜜被误判为椴树蜜，七个苕子蜜被误判为葵花蜜，两个苕子蜜被误判为洋槐蜜，六个苕子蜜被误判为枣花蜜。在油菜蜜回代检验中，一个油菜蜜被误判为苕子蜜，两个油菜蜜被误判为枣花蜜。在洋槐蜜回代检验中，两个洋槐蜜被误判为苕子蜜，一个洋槐蜜被误判为枣花蜜，在枣花蜜回代检验中，四个枣花蜜被误判为椴树蜜，一个枣花蜜被误判为苕子蜜。在椴树蜜交叉验证判别中，一个椴树蜜被误判为洋槐蜜，一个椴树蜜被误判为枣花蜜；在葵花蜜交叉验证判别中，两个葵花蜜被误判为苕子蜜，两个葵花蜜被误判为枣花蜜；在苕子蜜交叉验证判别中，有一个苕子蜜被误判为椴树蜜，七个苕子蜜被误判为葵花蜜，两个苕子蜜被误判为洋槐蜜，六个苕子蜜被误判为枣花蜜；在油菜蜜交叉验证判别中，一个油菜蜜被误判为苕子蜜，两个油菜蜜被误判为枣花蜜；在洋槐蜜交叉验证判别中，两个洋槐蜜被误判为苕子蜜，一个洋槐蜜被误判为枣花蜜，在枣花蜜交叉验证判别中，五个枣花蜜被误判为椴树蜜，三个枣花蜜被误判为苕子蜜。29 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种表5.2稳定同位素的判别分析的分类结果Table5.2ClassificationresultsOfdiscriminantanalysisofstableisotope预测组成员品种椴树蜜葵花蜜苕子蜜油菜蜜洋槐蜜枣花蜜椴树蜜2000011葵花蜜0142002回代苕子蜜174026检验计数油菜蜜0012302洋槐蜜0020151枣花蜜4010017椴树蜜2000011葵花蜜0142002交叉苕子蜜174026a验证计数油菜蜜0012302洋槐蜜0020151枣花蜜50300145.4.2矿质元素结合化学计量学鉴别蜂蜜品种利用线性判别分析对蜂蜜中Na、Mg、K、Ca、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Ag、Cd、Ba、Ti、Th和U的含量来进行蜂蜜品种的归类。表5.3统计利用线性判别分析后矿质元素的判别分析的分类结果。在椴树蜜回代检验中，三个椴树蜜被误判为苕子蜜。在葵花蜜回代检验中，两个葵花蜜被误判为洋槐蜜。在苕子蜜回代检验中，苕子蜜中没有被误判。在油菜蜜回代检验中，一个油菜蜜被误判为苕子蜜，四个油菜蜜被误判为洋槐蜜。在洋槐蜜回代检验中，一个洋槐蜜被误判为苕子蜜，三个洋槐蜜被误判为油菜蜜。在枣花蜜回代检验中，枣花蜜中没有被误判。在椴树蜜交叉验证判别中，三个椴树蜜被误判为苕子蜜。在葵花蜜交叉验证判别中，两个葵花蜜被误判为洋槐蜜。在苕子蜜交叉验证判别中，苕子蜜没有被误判；在油菜蜜交叉验证判别中，一个油菜蜜被误判为葵花蜜，两个油菜蜜被误判为苕子蜜，六个油菜蜜被误判为洋槐蜜。在洋槐蜜交叉验证判别中，两个洋槐蜜被误判为苕子蜜，七个洋槐蜜被误判为油菜蜜。在枣花蜜交叉验证判别中，一个枣花蜜被误判为葵花蜜。30 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种表5.3矿质元素判别分析的分类结果Table5.3Classificationresultsofdiscriminantanalysisofmineralelement预测组成员品种椴树蜜葵花蜜苕子蜜油菜蜜洋槐蜜枣花蜜椴树蜜1903000葵花蜜0160020回代苕子蜜0020000计数检验油菜蜜0012140洋槐蜜0013140枣花蜜0000022椴树蜜1903000葵花蜜0160020交叉苕子蜜0020000计数验证油菜蜜0121760洋槐蜜002790枣花蜜01000215.4.3稳定同位素数据与矿质元素数据融合进行主成分分析对椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜、枣花蜜六个品种进行主成分分析。图5.1表示蜂蜜主成分分析图，其中横坐标表示第一主成分，纵坐标表示第二主成分。蜂蜜品种中椴树蜜、葵花蜜和苕子蜜三个品种的重叠程度较低，能够被明显的区分。油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜三个品种重叠程度较高，不能被明显的区分。其中，椴树蜜的第一主成分均为正值，第二主成分有正值有负值；葵花蜜的第一主成分有正值有负值，第二主成分均为正值；苕子蜜的第一主成分与第二主成分有正值与负值；油菜蜜的第一主成分均为正值，第二主成分有正值和负值；洋槐蜜的第一主成分和第二主成分均有正值与负值；枣花蜜的第一主成分和第二主成分均有正值与负值。图5.2表示第一主成分的载荷因子，其中横坐标表示蜂蜜中稳定同位素和矿质元素中24个指标，纵坐标表示第一主城分的载荷因子。第一主成分中K、Ca、Cu、Sr和Ba的载荷系数较高，所以第一主成分综合了这五个指标的信息。图5.3表示第二主成分的载荷因子，其中横坐标表示蜂蜜中稳定同位素和矿质元素中24个指标，纵坐标表示第一主城分的载荷因子。第二主成分中13218δCh、δH、δO和Mn的载荷系数较高，所以第二主成分综合了这四个指标的信息。这也验证13第二章论述蜂蜜蛋白中δC值不能鉴别蜂蜜品种具有正确性。13218因此，δCh、δH、δO、K、Ca、Cu、Sr和Ba是蜂蜜品种分类的特征元素。为了更好鉴别蜂蜜品种，采用线性判别分析的化学计量学手段鉴别蜂蜜品种。31 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种6椴树蜜葵花蜜4苕子蜜油菜蜜洋槐蜜2枣花蜜0PC2-2-4-6-4-3-2-1012345PC1图5.1蜂蜜主成分分析图Figure5.1Principalcomponentanalysisofplotofhoney(PC1vsPC2)0.40.30.20.1loadingsonPC10-0.1ChCo2H18ONaMgKCaFeCrMnCoNiCuAsSeSrMoAgCdBaTiThU指标图5.2第一主成分的载荷因子Figure5.2LoadingsofthevariablesforPC1.0.30.20.10-0.1loadingsonPC2-0.2-0.3ChCp2H18ONaMgKCaFeCrMnCoNiCuAsSeSrMoAgCdBaTiThUvariables图5.3第二主成分的载荷因子Figure5.3LoadingsofthevariablesforPC2.32 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种5.4.4稳定同位素数据与矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种1313218利用线性判别分析对蜂蜜中δCh、δCp、δH、δO、Na、Mg、K、Ca、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Ag、Cd、Ba、Ti、Th和U的含量进行蜂蜜品种鉴别。表5.4统计线性判别分析对矿质元素和稳定同位素组合的判别分析的分类结果。在椴树蜜回代检验中，一个椴树蜜被误判为苕子蜜。在葵花蜜回代检验中，一个葵花蜜被误判为苕子蜜。在苕子蜜回代检验中，苕子蜜没有被误判。在油菜蜜回代检验中，一个油菜蜜被误判为苕子蜜，在洋槐蜜回代检验中，洋槐蜜没有被误判。在枣花蜜回代检验中，枣花蜜被没有误判。在椴树蜜交叉验证判别中，三个椴树蜜被误判为苕子蜜，在葵花蜜交叉验证判别中，一个葵花蜜被误判为苕子蜜，一个葵花蜜被误判为洋槐蜜。在苕子蜜交叉验证判别中，一个苕子蜜被误判为油菜蜜。在油菜蜜交叉验证判别中，一个油菜蜜被误判为葵花蜜，三个油菜蜜被误判为苕子蜜。在洋槐蜜交叉验证判别中，三个洋槐蜜被误判为苕子蜜，一个洋槐蜜被误判为油菜蜜。在枣花蜜交叉验证判别中，一个枣花蜜被误判为苕子蜜。表5.4矿质元素和稳定同位素组合判别分析的分类结果Table5.4Classificationresultsofdiscriminantanalysisofmineralelementandstableisotope预测组成员品种椴树蜜葵花蜜苕子蜜油菜蜜洋槐蜜枣花蜜椴树蜜2101000葵花蜜0171000回代苕子蜜0020000计数检验油菜蜜0012500洋槐蜜0000180枣花蜜0000022椴树蜜1903000葵花蜜0161010交叉苕子蜜0019100计数验证油菜蜜0132200洋槐蜜0031140枣花蜜00100215.4.5三种不同方法蜂蜜品种判别率表5.5统计六个蜂蜜品种分别在稳定同位素技术、矿质元素技术以及稳定同位素数据和矿质元素数据融合的不同方法的回代检验率和交叉验证判别率。六个蜂蜜品种基于单一稳定同位素技术的总体回代检验率为73.8%，其中椴树蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为90.9%，葵花蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为77.8%，苕子蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为20%，油菜蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为88.5%，洋槐蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为83.3%，枣花蜜基于单一稳定同位素技术的回代检验率为77.3%。六个蜂蜜品种基于单一稳定同位素技术的总体交叉验证判别率33 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种为71.4%，其中椴树蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为90.9%，葵花蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为77.8%，苕子蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为20%，油菜蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为88.5%，洋槐蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为83.3%，枣花蜜基于单一稳定同位素技术的交叉验证判别率为63.6%。六个蜂蜜品种基于单一矿质元素技术的总体回代检验判别率为88.9%，其中椴树蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为86.4%，葵花蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为88.9%，苕子蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为100%，油菜蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为80.8%，洋槐蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为77.8%，枣花蜜基于单一矿质元素技术的回代检验率为100%；六个蜂蜜品种基于单一矿质元素技术的总体交叉判别率分别为81%；其中椴树蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为86.4%，葵花蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为88.9%，苕子蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为100%，油菜蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为65.4%，洋槐蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为50%，枣花蜜基于单一矿质元素技术的交叉验证判别率为95.5%；六个蜂蜜品种基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合对蜂蜜品种的总体回代检验率为97.6%，其中椴树蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为95.5%，葵花蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为94.4%，苕子蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为100%，油菜蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为96.2%，洋槐蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为100%，枣花蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率为100%。六个蜂蜜品种基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合对蜂蜜品种总体交叉验证判别率为88.1%，其中椴树蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为86.4%，葵花蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为88.9%，苕子蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为95.5%，油菜蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为84.6%，洋槐蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为77.8%，枣花蜜基于稳定同位素数据与矿质元素数据融合的交叉验证判别率为95.5%。稳定同位素数据与矿质元素数据融合弥补线性判别分析在稳定同位素的应用对苕子蜜在回代检验率和交叉验证判别率中判别率过低的缺点。稳定同位素数据与矿质元素数据融合弥补线性判别分析在矿质元素的应用对洋槐蜜在交叉验证判别率过低的缺点。因此，与单一稳定同位素技术和单一矿质元素技术相比较而言，稳定同位素数据与矿质元素数据融合对鉴别蜂蜜品种的回代检验率和交叉验证判别率均是最高，即其误判率是最低。说明稳定同位素数据与矿质元素数据融合对蜂蜜品种的鉴别效果最好，故可以利用稳定同位素数据和矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种。34 中国农业科学院硕士学位论文第五章基于碳、氢、氧稳定同位素与矿物元素相结合鉴别蜂蜜品种表5.5三种不同方法蜂蜜品种判别率Table5.5Classificationofhoneysamplesindifferentbotanicaloriginsandpercentageofobservationscorrectlyclassified.预测组成员椴树蜜葵花蜜苕子蜜油菜蜜洋槐蜜枣花蜜整体单一稳定同位素技术回代检验率90.9%77.8%20%88.5%83.3%77.3%73.8%交叉验证判别率90.9%77.8%20%88.5%83.3%63.6%71.4%单一矿质元素技术回代检验率86.4%88.9%100%80.8%77.8%100%88.9%交叉验证判别率86.4%88.9%100%65.4%50%95.5%81%稳定同位素和矿质元素组合回代检验率95.5%94,4%100%96.2%100%100%97.6%交叉验证判别率86.4%88.9%95.5%84.6%77.8%95.5%88.1%5.5本章小结本章对椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜六个蜂蜜品种中稳定同位素数据与矿质元素数据融合进行主成分分析。其中椴树蜜、葵花蜜和苕子蜜三个品种分布比较分散，能够明显区分。油菜蜜，洋槐蜜，枣花蜜三个品种分布比较集中，不能明显区分。第一主成分中K、13Ca、Cu、Sr和Ba的载荷系数较高，所以第一主成分综合了这五个指标的信息。第二主成分中δCh、21813δH、δO和Mn的载荷系数较高，所以第二主成分综合了这四个指标的信息。结果可得δCh、218δH、δO、K、Ca、Cu、Sr和Ba是鉴别蜂蜜品种的特征元素。13218应用线性判别分析对蜂蜜中δCh、δH、δO、Na、Mg、K、Ca、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Ag、Cd、Ba、Ti、Th和U进行蜂蜜品种鉴别。利用单一稳定同位素技术的回代检验率和交叉验证判别率分别为73.8%和71.4%；利用单一矿质元素技术的回代检验率和交叉验证判别率分别为88.9%和81%；利用稳定同位素数据与矿质元素数据融合对蜂蜜品种的回代检验率和交叉验证判别率分别为97.6%和88.1%。稳定同位素数据与矿质元素数据融合弥补线性判别分析在单一稳定同位素的对苕子蜜回代检验率和交叉验证判别率过低的缺点；同样地，它也弥补在单一矿质元素中对洋槐蜜交叉验证判别率过低的缺点。与单一稳定同位素技术和单一矿质元素技术相比较而言，稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率和交叉验证判别率均是最高，表明稳定同位素数据与矿质元素数据融合对鉴别蜂蜜品种效果显著。因此，稳定同位素数据与矿质元素数据融合能够成功地应用于蜂蜜的品种鉴别。35 中国农业科学院硕士学位论文第六章全文结论第六章全文结论本论文通过稳定同位素质谱技术和电感耦合等离子体质谱技术，测定椴树蜜、葵花蜜、苕子1313218蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜六个不同蜂蜜品种中δCh、δCp、δH、δO、Na、Mg、K、Ca、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Ag、Cd、Ba、Ti、Th和U的含量。比较稳定同位素法、矿质元素法、稳定同位素数据与矿质元素数据融合三种方法鉴别蜂蜜品种的判别准确率。结果表明稳定同位素数据与矿质元素数据融合对上述六个蜂蜜品种判别准确率最高。说明稳定同位素数据与矿质元素数据融合对蜂蜜品种的鉴别具有可行性。13131.根据六个蜂蜜品种中δC及其蛋白δC差异，表明碳稳定同位素质谱法鉴别蜂蜜品种具有可行性。利用碳稳定同位素质谱分别测定椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜131313中蜂蜜及其蜂蜜蛋白δC。六个蜂蜜品种中同种蜂蜜间δC平均值与蜂蜜蛋白的δC平均值的差异在0.05‰～0.73‰之间，验证所选取的蜂蜜不掺假。同时，也说明这六个蜂蜜品种品质较好；1313其中蜂蜜蛋白δC范围较集中，蜂蜜δC范围较分散。相关性分析表明葵花蜜和洋槐蜜中蜂蜜13与其蛋白的相关系数高于0.8。因此，葵花蜜和洋槐蜜用蜂蜜δC能表征蜂蜜品种之间的差异。13方差分析及多重比较的结果表明，不同蜂蜜品种中δC均存在显著差异；大部分蜂蜜蛋白之间存13在差异，但是葵花蜜蛋白与洋槐蜜蛋白没有差异。表明蜂蜜δC可以用于鉴别蜂蜜品种，蜂蜜蛋13白δC值可以用于鉴别部分蜂蜜品种。碳稳定同位素质谱法对蜂蜜品种鉴别具有可行性。2182.根据六种不同植物源蜂蜜中δH及其δO差异，表明氢、氧稳定同位素质谱法鉴别蜂蜜218品种具有可行性。方差分析及多重比较的结果表明，六个蜂蜜品种中δH及其δO均具有显著218性差异。通过δH与δO做散点图，结果表明所有蜂蜜品种均能较好的区分，且同一蜂蜜品种218聚集程度较好。因此，利用δH及其δO均可用于鉴别蜂蜜品种。3.根据不同蜂蜜品种中矿质元素含量差异，表明电感耦合等离子体质谱法鉴别蜂蜜品种具有可行性。本实验利用电感耦合等离子体质谱法分别测定椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、枣花蜜、槐花蜜中的Na、Mg、K、Ca和Fe等20种矿质元素含量。测定方法回收率为90.2%～109.9%，满足实验要求。六个蜂蜜品种中K、Na、Ca、Mg和Fe含量均最高，其含量高低为K>Na>Ca>Mg>Fe。Mn、Cu、Sr和Ba的含量在0.1～1mg/kg的范围内,而其他痕量元素（如As和Cd）低于100μg/kg。椴树蜜中Cr、Mo和TI的含量最高，苕子蜜中Se的含量最高。4.对椴树蜜、葵花蜜、苕子蜜、油菜蜜、洋槐蜜和枣花蜜六个品种中稳定同位素数据与矿质元素数据融合进行主成分分析。六个蜂蜜品种中椴树蜜、葵花蜜和苕子蜜三个品种能够明显区分。油菜蜜，洋槐蜜，枣花蜜三个品种分布比较集中，不能明显区分。其中第一主成分中K、Ca、Cu、132Sr和Ba的载荷系数较高，所以第一主成分综合了这五个指标的信息。第二主成分中δCh、δH、1813δO和Mn的载荷系数较高，所以第二主成分综合了这四个指标的信息。从以上分析可知δCh、21813δH、δO、K、Ca、Cu、Sr、Ba是鉴别蜂蜜品种的特征元素。应用线性判别分析对蜂蜜中δCh、218δH、δO、Na、Mg、K、Ca、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Ag、Cd、Ba、Ti、Th和U进行蜂蜜品种鉴别。利用单一稳定同位素技术进行线性判别分析的回代检验率和交叉验证判别率分别为73.8%和71.4%；利用单一矿质元素技术进行线性判别分析的回代检验率和交叉验证判别率分别为88.9%和81%；利用稳定同位素数据与矿质元素融合进行线性判别分析36 中国农业科学院硕士学位论文第六章全文结论的回代检验率和交叉验证判别率分别为97.6%和88.1%。稳定同位素数据与矿质元素融合弥补线性判别分析在单一稳定同位素的应用中对苕子蜜回代检验率和交叉验证判别准确率过低的缺点。该方法也弥补线性判别分析在单一矿质元素的应用中对洋槐蜜交叉验证判别率过低的缺点。与单一稳定同位素技术和单一矿质元素技术相比较而言，稳定同位素数据与矿质元素数据融合的回代检验率和交叉验证判别率均是最高，表明稳定同位素数据与矿质元素数据融合鉴别蜂蜜品种效果显著。因此，稳定同位素数据与矿质元素数据融合能够成功地应用于蜂蜜品种鉴别。37 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.陈兰珍,叶志华,赵静.蜂蜜品种鉴别技术研究进展[J].食品科学，2008,29(3)：494-498.2.陈兰珍.蜂蜜品质近红外光谱评价技术研究[博士学位论文].北京：中国农业科学院，2010.3.郭波莉.牛肉产地同位素与矿质元素指纹溯源技术研究[博士学位论文].北京：中国农业科学院，2007.4.郭波莉,魏益民，潘家荣.同位素指纹分析技术在食品产地溯源中的应用进展[J].农业工程学报，2007,23(3)：284-289.5.李沈轶，胡柳花，隋丽敏，等.利用内标碳同位素比率法研究蜂蜜中植物糖浆[J].食品工业科技，2010,31(7)：365-370.6.陆婉珍.现代近红外光谱分析技术[M].北京:中国石化出版社,2007.7.孙丰梅.应用稳定同位素进行牛肉溯源的研究[博士学位论文].北京：中国农业科学院，2009.8.王强,薛晓峰,赵静.质谱检测技术在蜂蜜溯源分析中的应用[J].中国农业科技导报,2013,15(4):42-47.9.王勇.蜂胶植物源和产地识别技术研究[硕士学位论文].北京：中国农业科学院，2014.10.吴招斌,陈芳,陈兰珍,等.基于电感耦合等离子体质谱法和化学计量学鉴别蜂蜜品种研究[J].光谱学与光谱分析，2015,35(1):217-222.11.张婷婷,常萍湖,侯远鑫,等.蜂蜜的历史沿革与现代应用.中国中医药远程教育,2010,8(11):264-265.12.AliferisK.A.,TarantilisP.A.,HarizanisP.C.etal.Botanicaldiscriminationandclassificationofhoneysamplesapplyinggaschromatography/massspectrometryfingerprintingofheadspacevolatilecompounds[J].FoodChemistry,2010,121(3):856-862.13.AllenK.L.,MolanP.C.,ReidG.M.AsurveyoftheantibacterialactivityofsomeNewZealandhoneys[J].JournalofPharmacyandPharmacology,1991,43(12):817-822.14.AlvarezS.,TulipaniS.,RomandiniS.,etal.Contributionofhoneyinnutritionandhumanhealth:areview[J].MediterraneanJournalofNutritionandMetabolism,2009,3(1):15-23.15.AOAC.OfficialMethodsofAnalysis.Nr.44.4.18:C-4PlantSugarsinHoney,991.41,16th,ed.,AOACInternational,Arlington,Virginia,1995,USA.16.AriyamaK.,AoyamaY.,MochizukiA.,etal.DeterminationofthegeographicoriginofonionsbetweenthreemainproductionareasinJapanandothercountriesbymineralcomposition[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2007,55(2):347-354.17.AriyamaK.,ShinozakiM.,KawasakiA.,etal.Determinationofthegeographicoriginofricebychemometricswithstrontiumandleadisotoperatiosandmultielementconcentrations[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2012,60(7):1628-1634.18.BatistaB.L.,RochaB.A.,RodriguesJ.L.,etal.Multi-elementdeterminationinBrazilianhoneysamplesbyinductivelycoupledplasmamassspectrometryandestimationofgeographicoriginwithdataminingtechniques[J].FoodResearchInternational,2012,49(1):209-215.38 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中国农业科学院硕士学位论文参考文献Chemistry,2013,61(29):7055-7060.43 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢本论文是在赵静研究员和陈兰珍副研究员的悉心地指导下顺利完成。从论文选题、实验安排，实验材料收集、实验操作、数据处理到论文撰写，两位老师都给予的我很大的启发与帮助。在测定矿质元素实验中，由于实验测定结果不理想，在两位老师的精心指导下，发现消解温度的不合理，并及时改正。在JournalofAgriculturalandFoodChemistry（农业食品化学杂志）投搞中，两位导师细心地给我做出指导，提供修改方案。目前该文章已经接收。在生活中，两位老师的嘘寒问暖让我在远离家乡的环境中感受到了温暖。在行为上，两位老师对科研的探索精神让我深深的敬佩，也从他们身上学到了作为一个科研人员应具备的素质。由此，向赵静和陈兰珍两位导师表示深深的敬意。感谢农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）的李熠主任和吴黎明研究员，吴黎明研究员在提供蜂蜜样品予以很大的帮助。感谢检测中心的薛晓锋老师、周金慧老师、黄京平老师、王鹏老师、张金振老师、陈芳老师、金玥老师。尤其感谢薛晓锋老师和周金慧老师在实验技术和论文撰写给予的指导帮助，同时，薛晓锋老师和周金慧老师让我这三年科研生活充满了乐趣。感谢陈芳老师和王鹏老师对蜂蜜元素实验上给予我很大的帮助，让我从中避免走很多弯路。感谢中国农业科学院质量标准与检测技术研究所的赵燕老师，她细心的教会我如何使用稳定同位素质谱仪以及解答各类的专业问题。同时，感谢毛雪飞老师在矿质元素部分给予数据支持和方法建立。感谢清华大学林光辉老师在同位素方法与数据解析给予的专业指导。同时，感谢林光辉老师在英文论文写作和审稿意见回复给予的很大帮助。感谢王强师兄，在他的身上，我看到了他对科研的探索精神。感谢王勇师兄，他在电感耦合等离子体质谱的实验中给予我很大帮助。感谢我的研究生同学魏月，郭伟华和靳三省，是他们与我一起度过了研究生三年丰富多彩的研究生生活。感谢我的师妹杨娟在稳定同位素测定实验中给予我很大的帮助。感谢国家国际科技合作专项项目合作（2012DFA31140-05)、国际原子能机构（IAEA）合作项目（16567-RO）、公益性行业（农业）科研专项经费（S201203046）和国家蜂业产业体系CARS-45对本论文的资助。感谢硕士期间所有帮助过我的老师们和同学们。最后感谢我的家人，是他们在我的求学生涯中一直支持和鼓励我。因为你们的支持我才能走到今天。吴招斌2015年5月20号44 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：吴招斌性别：男出生年月：1989.04.30籍贯：福建省泉州市教育背景：2012.9-2015.6中国农业科学院蜜蜂研究所专业：食品加工与安全学历：农学硕士2008.9-2012.6福建农林大学食品科学学院专业：食品质量与安全学历：工学学士发表文章：**1.ZhaobinWU，LanzhenChen，JingZhao,etal.ClassificationofChineseHoneysAccordingtoTheirFloralOriginsUsingElementalandStableIsotopicCompositions[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2015(DOI:10.1021/acs.jafc.5b01576)(JCR分区：一区)**2.吴招斌，陈兰珍，赵静,等.基于电感耦合等离子体质谱法和化学计量学鉴别蜂蜜品种研究[J].光谱学与光谱分析,2015,35(1):217-222.(SCI)3.吴招斌，陈兰珍，赵静，等.现代分析技术在蜂蜜品种鉴别中的研究进展[A];第十届海峡两岸蜜蜂与蜂产品学术研讨会暨首届全国蜂产业高峰论坛论文集[C];2013年.45