新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应 56页

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关于学位论文原创性和使用授极的声巧，独立进行科学研究所本人所呈交的学位论文，是在导师指导下、帮助和做出重要贡献的个反得的成果。对在论文研究期间给予指导由本人承担。。本声明的法律责任人或集体，均在文中明确说明本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同电子意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和论。本人授权山东农业大学可臥将本学位版，允许论文被查飼和借阅从采用影印、缩印文的全葬或部分内容编入有关数据库进行检索，可论文，同时授权中国科学技术或其他复制手段保存论文和汇编本学位录到》并向社信息研究所将本学位论文收《中国学位论文全文数据库会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名导师签名ｏ．茲ｋ．＇日期：＞＇少 符号说明H:Hour,时mL:Milliliter,毫升LC50:Medianlethalconcentration,致死中浓度LD50:Medianlethaldose,致死中量℃:Centigrade,摄氏度mg:Milligramme,毫克g:Gramme,克s:Second,秒L:Liliter,升-1-1r•min:Rotate•minute,转每分钟AChE:Acetylcholinesterase,乙酰胆碱酯酶GSTs:Glutathione-S-transferase,谷胱甘肽-S-转移酶CarE:Carboxylesterases,羧酸酯酶Pro:Protein,蛋白质OD:Optialdensity,光密度-6μg:10gMicrogram,微克-6μL:10LMicrolitre,微升-1-6-1μmol•L:10mole•L,微摩尔每升UV:Ultra-violet,紫外U:ActiveUnit,酶活力单位EDTA:Ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸nAChR:nicotinicacetylcholinereceptors,烟碱型乙酰胆碱受体CCD:ColonyCollapseDisorder,蜂群崩溃失调病PER:ProboscisExtensionResponse,喙伸反应 目录中文摘要.....................................................................................................................................IABSTRACT...........................................................................................................................III1引言........................................................................................................................................11.1蜜蜂概述.............................................................................................................................11.1.1蜜蜂的生物学特性..........................................................................................................11.1.2蜜蜂的价值......................................................................................................................11.1.3蜜蜂现状..........................................................................................................................21.2新烟碱类杀虫剂.................................................................................................................31.2.1作用机制..........................................................................................................................31.2.2新烟碱类杀虫剂市场及应用..........................................................................................41.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的影响.........................................................................................41.4农药对蜜蜂的风险评价体系.............................................................................................51.4.1美国国家环保局（USEPA）..........................................................................................61.4.1.1农药对蜜蜂的急性毒性研究.......................................................................................61.4.1.2半田间风险研究...........................................................................................................61.4.1.3田间风险研究...............................................................................................................61.4.2欧美和欧盟-地中海植物保护组织（EPPO）...............................................................71.4.2.1毒性数据与试验...........................................................................................................71.4.2.2暴露评价.......................................................................................................................71.4.2.3风险评价.......................................................................................................................71.4.3我国农药对蜜蜂的风险评价..........................................................................................81.5研究的目的和意义.............................................................................................................82材料与方法............................................................................................................................92.1供试药剂、材料和方法.....................................................................................................92.1.1供试生物及标准化..........................................................................................................92.1.2试验药剂..........................................................................................................................92.1.3主要仪器设备................................................................................................................102.1.4主要化学试剂.................................................................................................................10I 2.1.5试验方法.........................................................................................................................112.1.5.1接触毒性试验.............................................................................................................112.1.5.2经口毒性试验.............................................................................................................122.1.5.2.1小烧杯法..................................................................................................................122.1.5.2.2饲喂管法..................................................................................................................122.1.5.3吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性.................................................................................132.1.5.4生化测定.....................................................................................................................132.1.5.4.1羧酸酯酶活性的测定...............................................................................................132.1.5.4.1.1试剂的配制...........................................................................................................142.1.5.4.1.2标准曲线的制备...................................................................................................142.1.5.4.1.3酶源的制备...........................................................................................................152.1.5.4.1.4羧酸酯酶比活力测定...........................................................................................152.1.5.4.2乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定........................................................................152.1.5.4.2.1试剂的配制...........................................................................................................152.1.5.4.2.2标准曲线的制备...................................................................................................152.1.5.4.2.3酶源的制备...........................................................................................................162.1.5.4.2.4乙酰胆碱酯酶比活力的测定...............................................................................162.1.5.4.2.5结果与计算...........................................................................................................162.1.5.4.3谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的活力测定............................................................172.1.5.4.3.1试剂的配制...........................................................................................................172.1.5.4.3.2酶液的制备...........................................................................................................172.1.5.4.3.3谷胱甘肽-S-转移酶活力测定..............................................................................172.1.5.4.4酶源蛋白质含量测定..............................................................................................182.1.5.4.4.1试剂配制................................................................................................................182.1.5.4.4.2蛋白质标准曲线的制备.......................................................................................182.1.5.4.4.3酶源制备...............................................................................................................182.1.5.4.4.4酶源蛋白质含量的测定.......................................................................................182.1.6数据处理.........................................................................................................................183结果与分析..........................................................................................................................193.1七种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性.......................................................19II 3.1.1中毒症状观察.................................................................................................................193.1.2参比物质试验结果........................................................................................................193.1.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂急性毒性试验结果................................................................193.1.3.1新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性接触毒性..................................................................193.1.3.2新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性经口毒性.................................................................203.1.4风险性评价....................................................................................................................213.2不同剂型不同含量的吡虫啉对蜜蜂的急性毒性...........................................................223.2.1不同含量不同剂型的吡虫啉对蜜蜂急性接触毒性试验............................................223.2.2不同含量不同剂型的吡虫啉对蜜蜂的急性经口毒性................................................233.3不同试验方法下吡虫啉对蜜蜂的急性毒性....................................................................243.4吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性及亚致死剂量的确定...................................................253.5亚致死剂量的的吡虫啉对蜜蜂幼虫的影响....................................................................263.5.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫及蛹生长发育的影响............................................263.5.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫主要解毒酶、靶标酶的影响................................273.5.2.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹羧酸酯酶比活力的剂量效应.....................273.5.2.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹乙酰胆碱酯酶比活力的剂量效应.............273.5.2.3亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹谷胱甘肽-S-转移酶比活力的剂量效应....284讨论.......................................................................................................................................294.1七种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性评价...............................................294.2不同剂型不同含量吡虫啉对蜜蜂的急性毒性...............................................................294.3不同试验方法下吡虫啉对蜜蜂的急性毒性...................................................................304.4吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性.......................................................................................314.5亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫的影响.......................................................................314.5.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫和蛹生长发育的影响............................................314.5.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫和蛹解毒酶和靶标酶的影响................................325全文结论...............................................................................................................................33本研究的创新之处..................................................................................................................35参考文献..................................................................................................................................36攻读硕士期间发表论文情况..................................................................................................45III 山东农业大学硕士学位论文中文摘要蜜蜂是自然界中最重要的传粉昆虫，在能为许多植物授粉的同时，也获得自身赖以生存和繁殖的食料—蜂蜜和花粉，蜜蜂授粉产生的效益比蜂产品自身的价值高5~12倍。蜜蜂所具有的经济效益、社会效益和生态效益对于农业生产和维护生态系统的生物多样性具有重要而深远的意义。目前国内外已经有许多关于杀虫剂对蜜蜂影响的研究性报告。研究内容一方面集中在实验室、半大田以及大田条件下杀虫剂与昆虫的剂量效应关系；另一方面则集中在杀虫剂对蜜蜂的生长发育、行为和生理等方面的亚致死效应，并逐渐成为研究的重点。随着新烟碱类杀虫剂广泛应用，此类杀虫剂对传粉昆虫尤其是对蜜蜂的影响越来越受到人们重视。为了综合评价此类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性，本研究选取了生产中常用的7种新烟碱类杀虫剂，评价了这几种药剂对蜜蜂的急性毒性及风险性。并选取代最具表性的品种—吡虫啉，研究了不同剂型、不同生测方法条件下吡虫啉对蜜蜂的急性毒性的影响。使用亚致死剂量的吡虫啉处理3日龄蜜蜂幼虫，研究其急性毒性效应并确定了亚致死剂量。获得了亚致死条件下，吡虫啉对蜜蜂幼虫体重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率等指标的影响，并研究了亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂体内解毒酶、靶标酶的剂量效应。以期为新烟碱类杀虫剂的合理使用和开展蜜蜂保护提供理论依据。本研究得到如下结果：1．吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺对蜜蜂都存在较高的毒性和风险性。啶虫脒、噻虫啉拥有对蜜蜂急性毒性低毒和低风险性的优点。烯啶虫胺风险性虽比噻虫啉、啶虫脒高，但远低于世界范围内应用最广泛的品种—吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺，具有很好的市场应用前景。2.不同剂型的吡虫啉对意大利蜜蜂的急性经口LC50（48h）值介于3.552~15.928mga.i./L之间，总体上毒性表现出微乳剂>乳油>可溶液剂>悬浮剂>可湿粉>原药>水分散粒剂的规律。急性接触LD50（48h）值介于0.101~0.250a.i.µg/只之间，不同剂型间急性毒性试验结果相差不大。3.以97%吡虫啉原药为测试对象，采用微量点滴法获得接触LD50（48h）=0.101μga.i./蜂，小烧杯法得到经口LC50（48h）=12.599mga.i./L，饲喂管法获得经口LD50（48h）=0.0289μga.i./蜂。I 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应4.吡虫啉对3日龄蜜蜂幼虫的致死中浓度（LC50）为8.193mg/100g饲料，确定了亚致死剂量为：LC5=1.175mg/100g饲料，LC10=1.804mg/100g饲料，LC20=3.303mg/100g饲料。5.随着亚致死浓度不断提高，幼虫平均死亡率提高，平均幼虫重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率均呈现出减小的趋势。6.羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶均参与吡虫啉在蜜蜂幼虫体内的代谢，随剂量的变化表现出明显的剂量效应。待幼虫排便发育成蛹，剂量效应趋于不明显。其可能原因是，吡虫啉及代谢产物在蜜蜂体内的半衰期为25h，待幼虫排便化蛹，转化为水溶性物质，由排便排出体外，靶标酶、解毒酶活力逐渐恢复至正常水平。关键词：新烟碱类杀虫剂；意大利蜜蜂；急性毒性；风险性；幼虫生长；解毒酶；靶标酶II 山东农业大学硕士学位论文AbstractInnaturebeesarethemostimportantpollinators.Theynotonlypollinatemanyplants,butalsofortheirownsurvivalandreproductionoffood—honeyandpollen.Beepollinationbenefitsgeneratedhigherthantheirvalueof5to12times.Beehaseconomic,ecologicalandsocialbenefitsforagriculturalproductionandmaintenanceofbiologicaldiversityofecosystemshaveimportantandfar-reachingsignificance.Therehavebeenmanyresearchreportsontheimpactofpesticidesonbeesathomeandabroad.Ononehand,theresearchfocusedoninthelaboratory,halffieldandfieldundertheconditionofthepesticideandinsectdoseeffectrelationship;Ontheotherhand,focusonthegrowthanddevelopmentofpesticidestobees,behaviorandphysiologicalaspectsofsublethaleffectsandthengraduallybecomethefocusofresearch.Withthewidespreadapplicationofneonicotinoidpesticides,suchpesticidesforpollinatinginsects,especiallytheinfluencetobeeshastakespeoplemoreandmoreattention.Foracomprehensiveevaluationofsuchpesticidesonbeetoxicityandrisk,thepapertakessevenkindsofneonicotinoidscommonlyusedintheproductionandevaluatethetoxicityofdifferentkindsofsuchpesticidestobeesandrisk.Selectedrepresentativespecies-imidacloprid,studiedthedifferentformulationsimidaclopridandbioassaymethodsmethodfortheinfluenceoftheacutetoxicitytobees.Sublethaldosesofimidaclopridtreatmentbee3rdinstars,studytheacutetoxicityeffectanddeterminethesublethaldoses.Obtainedundertheconditionofsublethal,imidaclopridforbeelarvae,pupaweightrate,averagerateofpupaweight,featherandtheinfluenceoftheindexsuchasthesuccessrateofdevelopment.Andstudiedthesublethaldosesofimidaclopridonbeedetoxificationenzymesinthebodyandthedoseeffectoftargetenzyme,soastotheproperuseofthenewneonicotinoidinsecticidesandprovideatheoreticalbasisforthebeestoprotect.Theresearchresultsareasfollows:1.Thelargestmarketshareintheproductionofthreevarieties:imidacloprid,thiamethoxamandclothianidinhavehigherriskoftoxicitytobees.Acetamiprid,thiacloprid,althoughmarketshareisrelativelysmall,butithastheadvantageoflowtoxicitytobeesacutetoxicityandlowrisk.Nitenpyram,islessthantheriskofthiacloprid,acetamipridhigh,butmuchlowerthanimidacloprid,thiamethoxamandclothianidin,hasgoodmarketIII 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应prospects.2.Differentformulationsofimidaclopridmelliferaacutetoxicity.AcuteoralLC50(48h)between3.552~15.928mgai/L,theoverallexhibitME>EC>SL>SC>WP>TC>WDG.Toxicitywithimproveddispersionofthedosageformisraised.AcutecontactLD50(48h)valuesrangedfrom0.101~0.250aiμg/bee.Acutetoxicitytestresultsbetweendifferentdosageforms.3.97%imidaclopridastestsubjects,usingmicro-dripmethodtoobtaincontactLD50(48h)=0.101μgai/bee,asmallbeakerlaworalLC50(48h)=12.599mgai/L,byfeedingtubemethodoralLD50(48h)=0.0289μgai/bee.4.CleartheacutetoxicityofimidaclopridonbeelarvaeLC50=8.193mg/100gdiet.Thesublethaldosesare:LC5=1.175mg/100gdiet,LC10=1.804mg/100gdiet,LC20=3.303mg/100gdiet.5.Withsublethalconcentrationscontinuetoincrease,theaveragemortalityrateoflarvaeincreasedaveragelarvalweight,pupationrate,averagepupalweight,growthrateandsuccessrateofemergenceshowingdecreasingtrend.6.CarEAchEGSTswereinvolvedinthedegradationofimidaclopridonbeelarvae,alongwiththechangeofdoseshowedobviousdoseeffect.Forlarvaldevelopmentofpupa,defecatedoseeffectisnotobvious,thepossiblereasonisthatimidaclopridinbeesallmetabolitesinthebodyhasahalf-lifeof25h,imidaclopridanditsmetabolitesbydefecateeductionbodyoutside,detoxificationenzymeactivityreturnstonormallevels.Keywords:Neonicotinoidinsecticides；ApismelliferaL.；Acutetoxicity;Risk;Thegrowthoflarvae;Detoxifyingenzymes;TargetenzymeIV 山东农业大学硕士学位论文1引言1.1蜜蜂概述1.1.1蜜蜂的生物学特性蜜蜂是节肢动物门、昆虫纲、膜翅目、细腰亚目、针尾部、蜜蜂总科、蜜蜂科、蜜蜂亚科、蜜蜂属昆虫。蜜蜂属于社会性昆虫，通常以群体为单位生活。一个强健蜂群，一般有1只蜂王、几百到上千只雄蜂和几万只工蜂组成。蜂王是由受精卵发育而来的，生殖器官发育完全的雌性蜂。蜂王享有自幼虫开始，终生享用蜂王浆、受众工蜂拥戴的待遇，它在蜂群中承担繁殖后代、维持蜂群正常秩序的职能。工蜂也是由受精卵发育而来的雌性蜂,但由于自幼虫第三日开始，便被工蜂饲喂花蜜和花粉的混合饲料，加上蜂房的限制，生殖器官发育不完全。在蜂群中工蜂个体最多，工作也最为繁重，负责饲喂幼虫、清理巢房、筑巢泌蜡、采集蜜粉、保卫蜂巢、给蜂王和雄蜂喂食等工作。雄峰是蜂群中的雄性个体，是由未受精卵发育而来，不负责巢内工作，只负责与处女王进行交尾，完成生殖行为。雄蜂属于季节蜂，在外界粉蜜源丰富，蜂群强壮具备分蜂条件的春夏季节，蜂群中往往有大量的雄蜂；当秋季外界粉蜜源枯竭，蜂群准备越冬时，雄蜂往往被驱逐出蜂群，冻饿而死。蜂王、工蜂和雄蜂三型蜂分工合作、高效组合共同维持一个有序的整体（王承赋，2007）。蜜蜂属于完全变态昆虫，一生经过卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段。工蜂卵期3天，幼虫期6天，蛹期12天，整个发育期为21天。在采集和繁殖季节，工蜂既要负责采集花蜜，又要负责哺育幼蜂和蜂王，劳动强度较大，其寿命多在40天以下；在北方越冬期，由于没有参加采集和哺育幼虫的活动，工蜂生理上保持年轻的状态，寿命最长可达3~5个月，甚至6~7个月之久（葛凤晨等，1997）。蜂王卵期3天，幼虫期5.5天，蛹期7.5天，从卵到成蜂发育期为16天，蜂王由于整个生育期均以蜂王浆为食，再加上工蜂的精心照料，寿命最长可达8年以上，生产上多利用1~2年蜂王产卵高峰期的蜂王，以保证蜂王具备旺盛的产卵力，维持蜂群群势强盛，达到高产目的。雄蜂卵期3天，幼虫期6.5天，蛹期14.5天，整个发育期为24天，雄蜂的唯一职能是负责与处女王交尾，交尾后不久便死去（黄文诚，1995）。1.1.2蜜蜂的价值蜜蜂是一种重要的经济昆虫。我国是世界上第一大养蜂大国，约有蜂群820万群，占世界的八分之一，蜂蜜年产量为30万吨，蜂王浆年产量3000多吨，此外还有蜂胶、蜂1 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应花粉等大量蜂产品，每年仅蜂产品一项产生的市场效益就有几十亿元（杨俊，2012）。除此之外，蜜蜂最大的贡献在于其是自然界中传粉昆虫种类最多、数量最大的类群，约73%的作物传粉由蜜蜂类昆虫完成。甚至对于大多数种子植物而言，蜜蜂是唯一的传粉昆虫类群。此外，自然界许多濒危植物必须通过蜜蜂的授粉才能完成其种系的延续，因此蜜蜂对自然界生物多样性的保护和生态平衡的维持具有非常重要的意义（李捷等，2007）。研究证实，蜜蜂授粉后能使油菜增产12%～15%，棉花增产18%～41%，向日葵增产20%～64%，苹果增产32%～52%，黄瓜增产76%，紫花苜蓿增产300%～400%（刁青云等，2012）。我国有研究者通过评估蜜蜂授粉的36种作物，认为蜜蜂授粉每年给中国农业生产贡献3042.20亿元，相当于全国农业总产值的12.30%（刘朋飞等，2011）。也有美国研究显示，蜜蜂每年为美国农作物授粉价值达189.6亿美元，为蜂产品价值的143倍（Levin,1984）。此外，据联合国粮农组织农业和消费者保护部估计，每年蜜蜂为全球农作物的授粉价值就接近2000亿美元（AgricultureandConsumerProtectionDepartmentMagazine,2005）。蜜蜂所具有的经济效益、生态效益和社会效益对于农业生产和维护生态系统的生物多样性具有重要而深远的意义（罗术东等，2009）。1.1.3蜜蜂现状根据蜜蜂的体型、颜色、筑巢方式以及分布的不同，蜜蜂被分为大蜜蜂、小蜜蜂、黑色大蜜蜂、黑色小蜜蜂、西方蜜蜂和东方蜜蜂六个种（席芳贵，1995）。西方蜜蜂是目前世界上饲养的主要蜂种，遍布世界各地。东方蜜蜂野生的较多，人工饲养量少于西方蜜蜂，主要分布在中国、印度、日本、朝鲜和东南亚各国以及西伯利亚等地。我国从19世纪末引入西方蜜蜂。目前，西方蜜蜂已发展为我国养蜂业的主力蜂种（葛凤晨等，1997），饲养的蜜蜂主要是意大利蜜蜂、中华蜜蜂、卡尼鄂拉蜂、东北黑蜂等品种。意大利蜜蜂由于其性情温顺，产卵力强，分蜂性若，能维持大群，采集力强，善于利用大宗蜜源，产浆量高的特点，成为我国饲养的主要蜂种（葛凤晨等，1997）。蜜蜂由于外出从事采集活动，需经常暴露在有害物质环境中。并且与其他昆虫相比，蜜蜂基因组中缺乏能够编码解毒酶的基因，这使得蜜蜂更容易受到杀虫剂的危害（Claudianosetal,2006）。近年来，随着杀虫剂的大量使用，蜜蜂中毒的事件屡见报到（高新云等，2007；褚忠桥等，2014），养蜂业遭受巨大损失的同时，也使得一些作物得不到授粉而品质和产量下降，农业生产一定程度上受到影响（代平礼等，2009）。2006年冬到2007年春，美国、加拿大、法国、德国、瑞典等国相继出现蜂群大量减少的情况，科学家们称之为蜂群崩溃失调病（ColonyCollapseDisorder,CCD）。如美国2 山东农业大学硕士学位论文在2006~2007年约有65.1~87.5万群蜂消失，甚至引发了农作物授粉的危机（Johnsonetal.,2007）。蜂群表现为：蜂群中大量的成年工蜂短时间内突然在巢外失踪，蜂箱内或蜂箱周围找不到蜜蜂尸体，只剩下正常产卵的蜂王、一些未成年的幼蜂和大量蜜粉残留于巢脾内；没有盗蜂现象发生，同时也没有典型的害虫危害症状；蜂箱外面看上去也完好无恙，没有表现出任何异常迹象（HayesJ.etal.,2007；Oldroydetal.,2007；Stokstad,2007；罗其花，2008）。引起蜂群衰退的因素有很多，其中农药的大量使用被认为是一个重要诱因，如早在1993年，法国西南部就发现用吡虫啉处理向日葵种子后导致大量蜜蜂死亡的情况，并在后来取消其在向日葵上的使用。Frazier等从108份蜂花粉中检测出46种不同的农药及6种农药代谢产物，其中在l份样品中最多检测出17种农药，平均每份样品中检出5种农药，只有3份样品中未检测出农药残留，由此可见农药已对蜜源造成了广泛而严重的污染，势必会影响蜜蜂的健康（代平礼等，2009）。CCD研究小组通过对病蜂样本进行117种化学药物的过滤检测，最终新烟碱类杀虫剂被列为头号嫌疑（StokstadE.,2007）。有研究表明，农药除直接杀死蜜蜂外，还可能会对蜜蜂的行为、生长发育、繁殖、记忆、学习、免疫等方面造成影响（郑志阳等，2009）。低剂量的吡虫啉虽不会导致蜜蜂直接死亡，但是会伤害蜜蜂的神经系统，导致蜜蜂迷失方向，最终无法回巢而死在野外（DecourtyeAetal.,2004）。2012年3月，在欧洲开展的一项研究发现，在蜜蜂饲料里加入亚致死剂量的噻虫嗪杀虫剂，导致大约1/3以上的蜜蜂迷失方向，无法返回蜂巢（HenryMetal.,2012）。1.2新烟碱类杀虫剂新烟碱类杀虫剂是继拟除虫菊酯类杀虫剂之后，杀虫剂历史上又一次重大突破（EFSA,2013）。自20世纪90年代投放市场以来，新烟碱类杀虫剂以其对刺吸式口器害虫优异的防效得到广泛应用，并成为防治棉蚜、叶蝉、飞虱等害虫的首选药剂（Nauenetal.,2005;Jeschkeetal.,2008）。1.2.1作用机制新烟碱类杀虫剂具有独特新颖的作用方式，它是一种烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinicacetylcholinereceptors,nAChR）激动剂（NishimuraKetal.,1994;ZwartRetal.,1994;NagataKetal.,1998）。乙酰胆碱是昆虫脑内重要的兴奋性神经递质，乙酰胆碱与nAChR+α亚基上特异位点结合后，nAChR的构象发生改变，离子通道打开。细胞膜内外Na、+++K的离子浓度梯度导致Na内流、K外流，细胞膜去极化，从而形成动作电位。研究表3 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应明，新烟碱类杀虫剂对昆虫的nAChR有高亲合力，能够与昆虫神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体选择性地结合，但不被乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）分解，导致昆虫的神经系统受过度兴奋，最终致昆虫死亡。昆虫的乙酰胆碱受体与哺乳动物的乙酰胆碱受体的结构具有差异，新烟碱类杀虫剂对昆虫神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体不仅显示了高选择性亲和力，而且还具有特殊的物理化学特性，例如非电离性和中等的水溶性等。这种差异导致新烟碱类杀虫剂对哺乳动物低毒但对许多类的昆虫表现出高毒作用（MillarNSetal.,2007;周婷等，2013）。1.2.2新烟碱类杀虫剂市场及应用新烟碱类杀虫剂对哺乳动物毒性较低，并且与高毒高残留的有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂不存在交互抗性，并且此类杀虫剂良好的内吸性，既可以用作茎叶处理，也可以作为土壤、种子处理，与有机磷、氨基甲酸酯、沙蚕毒素类杀虫剂混用后有增效和杀虫杀螨的效果（张国生等，2004），此类杀虫剂广泛应用于生产中。目前，商品化的主要品种有吡虫啉（imidacloprid）、噻虫啉（thiacloprid）、噻虫嗪（thiamethoxam）、啶虫脒（acetamiprid）、呋虫胺（dinaotefuran）、噻虫胺（clothianidin）、烯啶虫胺（nitenpyram）、氯噻啉（imidaclothiz）、氟啶虫酰胺（flonicamid）、砜虫啶（sulfoxaflor）、哌虫啶等品种（刘长令，2002）。新烟碱类杀虫剂在市场销售中保持高速增长。2005~2010年新烟碱类杀虫剂年均增长率高达11.4%。2010年新烟碱类杀虫剂销售额为26.55亿美元，占世界农药市场的6%，占世界杀虫剂市场的21.8%。其中吡虫啉的市场位列新烟碱类品种之首，占36.9%，其后依次为噻虫嗪34.1%、噻虫胺14.3%、啶虫脒6.8%、噻虫啉4.0%、其他3.9%（张敏恒等，2012）。1.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的影响随着新烟碱类杀虫剂广泛应用，新烟碱类杀虫剂导致蜜蜂中毒的现象屡有发生（高新云等，2007），人们逐渐意识到此类杀虫剂对蜜蜂等传粉昆虫潜在的威胁。早在1999年，法国因吡虫啉导致蜜蜂中毒事件而禁止其在向日葵上的使用，但由于农药对蜜蜂生长、发育、繁殖等亚急性、慢性毒性方面研究技术和方法的落后，内吸性农药导致蜜蜂死亡没有切实研究证据，因吡虫啉仍在许多国家大规模使用。事实上，在新烟碱类杀虫剂进入市场不久，其在花粉、花蜜等的残留便已对蜜蜂等授粉昆虫带来了诸多危害（Suchailetal.,2001;Bonmatinetal.,2005;Maximetal.,2010）。4 山东农业大学硕士学位论文蜜蜂可以通过摄入含新烟碱类杀虫剂的食物、筑巢材料（树胶、蜡质等）受到影响，直接接触药剂喷雾过程中的雾滴，接触喷洒过药剂的土壤、植物等，吸入被污染的空气等途径受到新烟碱类杀虫剂的影响（EFSAPPR,2012）。新烟碱类杀虫剂被广泛应用于茎叶、种子和土壤处理，其中近年来最重要的用途为种子包衣，约占此类杀虫剂总使用量的60%（Jeschkeetal.,2011）。新烟碱类杀虫剂拥有良好的内吸性，可在植物组织中转运。Tapparo等（2011）在由新烟碱类杀虫剂处理过的种子发育成的植物的吐水液滴中，检测到浓度高达346mg/L的吡虫啉、146mg/L的噻虫嗪和102mg/L的噻虫胺，如此高浓度的残留将导致误食的采集蜂急性致死。采集蜂将带有新烟碱类杀虫剂的花粉、花蜜、吐水液滴等带回蜂巢，经加工后变成被污染的蜂粮，用其饲喂幼虫和幼蜂后，极有可能发生亚致死效应。尽管不会直接导致蜜蜂个体死亡，但会引起其行为和生理机能的改变，进而造成蜂群更加脆弱，最终导致整群蜜蜂覆没（蔺哲广等，2014）。有研究者利用蜜蜂喙伸反应（ProboscisExtensionResponse,PER）观察蜜蜂嗅觉学习能力，结果发现经过吡虫啉处理的蜜蜂其嗅觉学习技能都明显降低（庄育祯等，2007）。此外，还有证据显示，饲喂新烟碱类杀虫剂的蜂群，群势没有什么显著变化，但蜂王产卵量及幼虫和蛹的数量明显减少（宋怀磊等，2010）。科学家认为，亚致死剂量的新烟碱类杀虫剂不会直接导致蜜蜂死亡，但会作用于蜜蜂的记忆系统，使蜜蜂不能返回巢穴。此外，英国伦敦科学会的一项研究显示，烟碱类杀虫剂与寄生真菌相互作用，会增强杀虫剂的药效（袁德华，2008）。有关新烟碱类杀虫剂对蜜蜂影响的研究主要集中在成年蜜蜂，而幼虫数量的下降或许对蜂群健康的影响更为严重（Decourtyeetal.,2010）。有研究显示，若蜜蜂在幼虫阶段摄入0.04ng的吡虫啉，其成年后学习能力便会受到影响（Yangetal.,2012）蜜蜂幼虫接触到如此低剂量的杀虫剂是极有可能的，但其是否会对蜂群健康产生长期不良影响尚未明确。高剂量新烟碱类杀虫剂对蜜蜂造成急性中毒，低剂量新烟碱类杀虫剂虽没有造成蜜蜂直接死亡，但也会对蜜蜂的生殖、生长发育和工蜂采集等行为产生消极影响。基于此方面原因，2013年5月末，欧委会作出最终决定，自2013年12月开始，对拜耳及先正达生产的三种新烟碱类种子处理农药在欧盟国家内采取限制使用。1.4农药对蜜蜂的风险评价体系鉴于蜜蜂具有重要的经济和生态价值，对于农业生产和维护生态系统的生物多样性5 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应具有重要而深远的意义。因此科学的评价农药对蜜蜂的风险性对于保护生态系统平衡，从源头上控制高风险农药对蜜蜂的潜在影响成为新农药开发中不可或缺的一部分。1.4.1美国国家环保局（USEPA）USEPA有关农药对蜜蜂的暴露评价没有定量或者定性的论述，通常直接应用农药的急性接触毒性来评定其对蜜蜂的风险，同时通过研究该农药的叶面残留毒性，分析叶片残留农药对蜜蜂的危害和影响（林小丽等，2008）。1.4.1.1农药对蜜蜂的急性毒性研究1996年，美国环保局农药及有毒物质预防办公室（USEPAOPPTS）颁布农药及其他有毒物质对蜜蜂的急性接触毒性试验准则（USEPAOPPTS,1996）。准则中规定，用微量点滴器局部点滴单一剂量经溶剂溶解后的待测农药，计算48hLD50及95%置信限。USEPA关于农药对蜜蜂的毒性评价等级共分为3级：LD50<2.00μg/蜂的为高毒农药；2.00μg/蜂≤LD50≤11.0μg/蜂的为中毒农药；LD50>11.0μg/蜂的为低毒农药（USEPA,2008）。当农药对蜜蜂的急性接触毒LD50＜11.0μg/蜂时，需要进行更高层次的半田间和田间试验研究（Clevelandetal.,1997）。1.4.1.2半田间风险研究半田间风险研究即为叶面残留农药对蜜蜂的影响评价，是指以推荐浓度施用于受试农作物，定期采样，磨碎后对蜜蜂进行暴露处理，记录受试蜜蜂中毒症状及24h蜜蜂的死亡数、暴露4h和试验结束后的死亡率、死亡剂量水平和时间。当叶片上的农药残留毒性＜7h（即施药7h后，叶面残留农药不会对蜜蜂产生急性毒性影响），为低风险，反之为高风险，需要进行下一步的田间风险评价研究（林玉锁，2006）。1.4.1.3田间风险研究按照最大风险化原则，模拟田间最大推荐量和实际施用农药的真实情况，如使用频率、使用剂量及施药方法等进行施药。采用“Todd-Trap”（Atkinsetal.,1970）、“Modifide-Gary-Trap”（Garyetal.,1960）等蜜蜂死亡估算装置来估算蜜蜂的死亡率，并进行相关酶学分析、毒性症状的观察和环境残留分析等补充性试验。最终把受试物质与参比物质（一般为水）引起蜜蜂死亡率的数据进行统计学上的对比。如果有明显差异，则表明田间条件下，会对蜜蜂产生危害。由于缺乏统一的标准，田间试验较难以实现（林小丽等，2008）。USEPA农药对蜜蜂的风险评价体系是一个从实验室到半田间再到田间、从简单到复杂、从理想条件到实际条件，循序渐进逐步推进的实验体系。对我国建立农药对蜜蜂6 山东农业大学硕士学位论文的风险评价体系具有很高的借鉴价值。1.4.2欧美和欧盟-地中海植物保护组织（EPPO）目前，应用最多、最完善的农药对蜜蜂的安全性评价体系是由欧美和欧盟-地中海植物保护组织（EPPO）提出的，EPPO在20世纪50年代就已经开展了农药对蜜蜂的生物毒性的测试方法以及安全性风险评价的技术的研究，并制定了蜜蜂急性毒性的测试技术导则，而且提出了比较完整的农药对蜜蜂生物安全性评价的体系（卜元卿等，2009）。该体系包括毒性数据与试验（DataRequirementsandTesting）、暴露评价（ExposureAssessment）及风险性评价（RiskAssessment）等部分（FauconJPetal.,2005；EPPO,2001；Oomenetal.,1992）。1.4.2.1毒性数据与试验急性毒性试验（AcuteToxicitytoBee）：测定供试农药对蜜蜂急性毒性，以LD50/LC50表示（以有效成分计）。孵化试验（BeeBroodFeedingTest）：研究昆虫生长调节类农药对蜜蜂蜂卵孵化产生影响。残留试验（ResidueTest）：研究作物上残留农药对蜜蜂致死、行为等产生影响。高层次试验（HigherTierTest）：在模拟条件或田间条件下，研究农药或受农药污染的蜂蜜或花粉对蜜蜂行为、种群存活率和生长等方面影响。内吸性农药试验（TestingofSystemicPlantProtectionProducts）：测定内吸性性农药对蜜蜂的急性经口毒性值。代谢产物试验（MetaboliteTesting）：通常农药母体的代谢物不需进行蜜蜂毒性试验，但当代谢产物性质较为活泼时要测定代谢物对蜜蜂生物毒性。1.4.2.2暴露评价根据农药使用方式和类型将其分为喷雾类农药和内吸性农药两类，喷雾类农药的暴2露风险是根据其田间最大使用量（ga.i./hm）作为评价依据：内吸性农药则根据其在植物特定组织如花粉、花蜜中的含量作为暴露风险评价依据。1.4.2.3风险评价2风险商评价（HazardQuotient）：根据农药的田间推荐使用量（ga.i./hm）与其对蜜蜂的LC50/LD50（µga.i./蜂）的比值。HQ阈值为50，当HQ值大于50时，则表示受试农药对蜜蜂具有高风险，还应进行高层次蜜蜂风险评价。7 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应高层次风险评价（HigherTierRiskAssessment）：由专家根据受试农药的性质、使用方式、暴露途径、蜜蜂死亡数和中毒后的异常行为等进行综合评价。1.4.3我国农药对蜜蜂的风险评价我国作为农业大国，也是农药生产和使用的第一大国，并没有较为完善的农药对蜜蜂的安全性风险评价体系。1989年我国前国家环保总局组织编写了《化学农药安全评价试验准则》（蔡道基，1989），仅规定了实验室农药对蜜蜂急性毒性测定方法。检测农药对蜜蜂的急性经口毒性的方法为“小烧杯法”，该方法已经被广泛的应用在我国农药制剂的登记试验中。模拟环境的毒性试验和野外毒性试验仍为空白，更没有系统的风险评价体系，具体表现在缺乏亚急性、慢性测试技术、评价体系过于单一，缺乏立体多层次试验（卜元卿等，2009）。2014年10月10日，国家质量监督及检验检疫总局、国家标准化管理委员会在北京召开新闻发布会，批准《化学农药环境安全评价试验准则》，将我国普遍采用的“小烧杯法”改为经济合作与发展组织（OECD）推荐的“饲喂管法”，并于2015年3月11日起实施（刘刚，2014）。新准则虽将进一步提高我国农药环境风险评估和安全管理的科学水平，但也只规定了实验室内农药对蜜蜂的急性毒性测定方法，没有完整的农药对蜜蜂的风险评价体系。而且，化学农药对蜜蜂的危害不仅仅表现在急性毒性方面，还表现在慢性毒性和亚致死效应等方面（罗术东等，2009）。因此，我国应提高农药尤其是内吸性农药对蜜蜂生长、发育、繁殖等方面影响的测试技术、深入、全面的生物毒性试验方法的建立，加强农药对蜜蜂毒性机理的研究，提高农药环境生物安全性风险评价的可靠性和科学性（卜元卿等，2009）。1.5研究的目的和意义随着新烟碱类杀虫剂在世界范围内广泛应用，其抗性增长及对环境生物尤其是对蜜蜂等传份昆虫的影响也越来越受到人们的重视。世界多个国家和组织已开始对此类杀虫剂的环境风险进行评估，并建立起了一套风险评价体系。我国农药对蜜蜂的风险评估主要集中在单一的急性毒性试验方面。缺乏亚急性、慢性测试技术、评价体系缺乏立体多层次试验。目前国内外已经有许多关于新烟碱类杀虫剂对蜜蜂影响的研究性报告，研究内容一方面集中在实验室（于伟丽等，2013）、半大田（刘建宇等，2013）以及大田条件下杀虫剂与昆虫的剂量效应关系，即各种杀虫剂的毒力测定试验；另一方面则集中在杀虫剂8 山东农业大学硕士学位论文对蜜蜂的生长发育、行为和生理（宋怀磊等，2011；孟丽峰，2013；吴艳艳等，2014）等方面的亚致死效应，并逐渐成为研究的重点。本研究测定了常用新烟碱类杀虫剂品种对蜜蜂的急性毒性及风险性。选用了新烟碱类杀虫剂中应用最广泛、最具代表性的品种——吡虫啉作为测试对象。研究吡虫啉不同剂型对蜜蜂的急性毒性。亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫生长发育和生理生化反应的影响。通过研究生产者常用的新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性，为实际生产中合理选择农药品种提供理论依据；通过研究不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急性毒性，指导生产中合理选择剂型及施药方式；通过研究亚致死剂量下，吡虫啉对蜜蜂体内解毒酶的影响，了解吡虫啉在蜜蜂幼虫体内的解毒机制。综合所有试验数据及结论，为评价新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的风险性评估做数据支持。2材料与方法2.1供试药剂、材料和方法2.1.1供试生物及标准化试验蜜蜂蜂种为意大利蜜蜂（ApismelliferaL.），购于山东省泰安市泰山区省庄镇羊娄养蜂场。在室外自然条件下人工控制饲养于山东农业大学农药环境毒理研究中心院内，期间不接触任何药剂。在蜂箱门口放置水瓶，用脱脂棉塞瓶口，蜜蜂通过脱脂棉吸取水分，避免蜜蜂饮用不干净水源，影响蜜蜂体质，并在蜂箱门口放置粗盐颗粒，供蜜蜂采食。在巢内缺乏饲料而外界又无充足的蜜源时，给蜂群补充饲喂，以维持蜂群应有的饲料储备量。当外界蜜源较差，又需要刺激蜂王繁殖的积极性，则需要每天傍晚进行奖励饲喂。生物测定试验于试验前1d收集蜜蜂，饲养于试验蜂笼内，饲喂50%蔗糖水，放置在人工气候室试验环境中保持24h适应期，适应期结束后剔除死亡或表现异常的个体，选择大小一致、活泼、健康的成年工蜂作为试验测试的标准蜂。用于蜜蜂急性经口毒性试验的蜜蜂，需在试验前2h停止饲喂。2.1.2试验药剂20%吡虫啉可溶液剂10%呋虫胺可溶液剂5%啶虫脒乳油50%噻虫胺水分散粒剂21%噻虫嗪悬浮剂48%噻虫啉悬浮剂20%烯啶虫胺水剂97%吡虫啉原药9 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应10%吡虫啉可湿性粉剂5%吡虫啉乳油30%吡虫啉微乳剂70%吡虫啉水分散粒剂600克/升吡虫啉悬浮剂98%乐果原药以上供试药剂均由山东农业大学农药环境毒理研究中心提供。2.1.3主要仪器设备SAYTORIUS型万分之一电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司UV-2201型紫外分光光度计日本岛津公司KQ-500DB型数控超声波清洗器昆山市定山湖检测仪器厂水浴恒温振荡器江苏太仓医疗器械厂CR22型高速冷冻离心机日本日立公司XW-80型旋涡混合器上海第一医学院仪器厂LQP-B-4型制冰机上海安亭科学仪器厂DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司SPX型智能生化培养箱宁波江南仪器制造厂EppendorfResearch系列移液器Eppendorf中国有限公司24孔细胞培养板JETBIOFIL公司48孔细胞培养板JETBIOFIL公司Burkard手动微量点滴仪英国Burkard公司华图S500电子温湿度记录仪深圳市华图测控系统有限公司亚都YC-D204加湿器中山市亚都之星电器有限公司亚都C300B除湿机中山市亚都之星电器有限公司空调、二氧化碳钢瓶及减压阀、不锈钢蜂笼、饲喂器、烧杯、玻璃棒、镊子、容量瓶、胶头滴管、面罩、防护服、起刮刀、喷壶、蜂刷、医用纱布、脱脂棉、擦镜纸、无菌水、保鲜盒、移虫针等。2.1.4主要化学试剂磷酸氢二钠（Na2HPO4）分析纯上海化学试剂公司磷酸二氢钠（NaH2PO4）化学纯上海试剂二厂碘化硫代乙酰胆碱（Asch）化学纯上海试剂一厂碳酸氢钠（NaHCO3）分析纯济南化工厂还原型谷光甘肽（L-GSH）分析纯上海酵母厂10 山东农业大学硕士学位论文二硫双对硝基苯甲酸（DTNB）化学纯上海试剂三厂十二烷基硫酸钠（SDS）分析纯Sigma公司α-萘酚（α-naphthol）化学纯上海化学试剂公司毒扁碱（Eserine）进口分装上海化学试剂公司考马斯亮蓝G-250进口分装上海化学试剂公司牛血清白蛋白（BSA）进口分装上海伯奥生物科技有限公司无水乙醇（ethylalcoholabsolute）分析纯天津凯通化学公司乙二胺四乙酸（EDTA）分析纯国药集团化学试剂有限公司丙酮（C3H6O）分析纯天津大茂化学试剂厂吐温-80（Polysorbate）分析纯天津凯通化学公司N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分析纯天津凯通化学公司α-醋酸萘酯（α-NA）分析纯上海试剂一厂固蓝B盐（FastblueBsalt）进口分装Fluka公司1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）分析纯Sigma公司丙三醇（Glycerol）分析纯天津凯通化学公司D-葡萄糖（D-Gluooseanhydrous）进口分装上海源叶生物科技有限公司D-果糖（D-Fructose）进口分装上海源叶生物科技有限公司酵母抽提物（YeastExtract）进口OxoidLTD.公司食盐（NaCl）食用盐山东岱岳制盐有限公司蜂王浆自产山东农业大学动物科技学院桃花峪试验蜂场2.1.5试验方法2.1.5.1接触毒性试验参照《化学农药环境安全评价试验准则》（国家环境保护部，2011），采用微量点滴法。通过预试验确定最高存活浓度和最低致死浓度。在预试验浓度的基础上，以一定的级差（级差小于2.2）设定4~6个浓度，用丙酮将药剂配制成系列浓度，将度过适应期的蜜蜂用二氧化碳麻醉约4min，迅速用微量点滴器将药液点滴在蜜蜂的中胸背板处，点滴量为1.0µL/蜂，蜂身晾干后转入试验蜂笼内，用50%蔗糖水饲喂。每个处理3个重复，每个重复20只蜜蜂，并设置对照组。本试验选用丙酮做溶剂进行农药对蜜蜂急性接触毒性试验测定（所有药剂配制过程均保证有效成分在丙酮中的溶解度大于所配制的药液浓度），在溶解过程中部分农药制11 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应剂无法完全溶解于丙酮，会出现悬浮剂产生絮状沉淀，水分散粒剂无法崩解的现象。因此在急性接触毒性试验中所有药剂配制过程均用超声波助溶30min，保证药剂有效成分溶解到丙酮中。点滴过程取用上清液作为点滴液。2.1.5.2经口毒性试验2.1.5.2.1小烧杯法参照《化学农药环境安全评价试验准则》（国家环境保护部，2011）中的小烧杯法，并稍加改进。在预试试验的基础上，以一定的级差（级差小于2.2）设定4~6个浓度，用蒸馏水将药剂稀释成系列浓度，将系列浓度药液分别与50%蔗糖水以1:1等体积混合，装入10mL小烧杯中，杯内浸渍0.3~0.5g脱脂棉，保证药液不流出，并能在试验期间保持湿润。杯口向下倒置于试验笼上方的纱网上，蜜蜂通过网眼取食。将饥饿2h处理的蜜蜂用二氧化碳麻醉，随机分配到蜂笼内。每个处理3个重复，每个重复20只蜜蜂，并设置对照组。2.1.5.2.2饲喂管法参照OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals（Honeybees,AcuteOralToxicityTest）和中华人民共和国国家标准GB/T21812-2008（OECD,1998；中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2008），将不同剂量的供试物分散在蔗糖溶液中，用以饲喂成年工蜂，并对药液的消耗量进行测定，药液消耗完后饲喂不含供试物的蔗糖溶液。以一定的级差（级差小于2.2）设定4~6个浓度，将吡虫啉原药用5.000mLN,N-二甲基甲酰胺溶解后，加入0.2g吐温-80，充分搅拌溶解后，加入50%蔗糖水溶液，使用超声波助溶，转移至25mL容量瓶，最后用50%蔗糖水定容，然后用50%蔗糖水将母液稀释成系列浓度（为保证试验体系中有效成分均匀分散，所有系列浓度稀释液均使用超声波助溶）。将试验用标准蜜蜂引入试验蜂笼内，然后在饲喂器内加入200µL含有不同浓度供试物的50%蔗糖水溶液，待蜜蜂取食完后并，将食物容器取出，换不含供试物的蔗糖水进行饲喂。并对食物的消耗量进行测定。以不含药剂处理为空白对照，以最高浓度稀释液中不含药剂的其他组分为溶剂对照。每个处理3次重复，每个重复10只蜜蜂。将染毒处理的蜜蜂置于人工气候室内，控制温度23~25℃，相对湿度50%~70%，微光条件。药剂处理后24、48h记录并观察试验蜜蜂中毒症状和死亡数，用DPSV13.5统计软件处理数据，得到LC50、LD50和95%置信限。12 山东农业大学硕士学位论文2.1.5.3吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性参照Vandenberg等的配方，按照蜂王浆50%、无菌水37%、葡萄糖6%、果糖6%、酵母抽提物1%组成的幼虫基本食物（basiclarvaldiet,BLD）（Vandenbergetal.,1987），饲料配制好后4℃保存，并在3天内饲喂，超过3天，饲料需重新配制。查阅Thee-PesticideManualVersion5.0得知，吡虫啉在水中溶解度为0.61g/L（20℃）。配制600mg/L的吡虫啉水溶液，使用超声波助溶，使之完全溶解。用吡虫啉溶液代替37%的无菌水，配制系列浓度为22.2、11.1、5.55、2.775、1.3875mg/100g饲料的BLD。每处理3次重复，每个重复48只幼虫。试验前，向蜜蜂巢箱中间插入1张空脾，将蜂王限定在空脾上产卵。12~18h后，检查产卵情况，并将产卵巢脾移入继箱中。孵化期为3天，第4天将幼虫用移虫针转移至盛有人工饲料的48孔细胞培养板中。幼虫放置在温度34.5℃，15.5%甘油水溶液（相对湿度95%）的保鲜盒中，保鲜盒放置于生化培养箱内。每日将剩余饲料吸走，并更换新鲜饲料。因自然界蜜蜂发育过程中，前3日，食物为工蜂分泌的蜂王浆（葛凤晨等，1997），难有机会直接接触到外界化学农药。故前3日饲喂正常饲料，从第4日开始，饲喂有毒饲料，持续染毒，直至化蛹。试验开始后，每天观察并记录幼虫成活情况，及时移除死亡个体，小心吸出剩余饲料，更换新鲜饲料，直至化蛹。用DPSV13.5计算毒力回归方程计算LC50及95%置信限，根据毒力回归方程确定LC5、LC10、LC20、LC50作为亚致死剂量。根据最终饲料中吡虫啉的剂量，求出所需600mg/L的吡虫啉水溶液的量，然后配制成系列浓度，每日更换饲料，在第6天末或第7天初，开始有幼虫直立或观察到排便现象时，取所有处理一组重复中的幼虫，测量体重，记录死亡数。将幼虫用液氮速冻，放入-80℃超低温冰箱中保存，用于酶液制备。细胞培养板提前用75%酒精浸泡消毒，70℃烘干，将剩余幼虫转移到24孔细胞培养板中并在孔中铺4层以上灭菌的擦镜纸，保持光滑面向上。保持温度34.5℃，盛有饱和NaCl水溶液（相对湿度75%）保鲜盒内。保鲜盒放置于生化培养箱中，待3d排便后，取所有处理一组重复，测定蛹重，记录化蛹数量。将蛹转移到新的化蛹室，直至羽化。2.1.5.4生化测定2.1.5.4.1羧酸酯酶活性的测定13 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应参照Van（1962）的方法，以α-醋酸萘酯作为底物，在反应体系中加入乙酰胆碱酯酶的专性抑制剂毒扁豆碱，在30℃和pH7.0的条件下，经酶的作用下发生水解反应，生成α-萘酚，α-萘酚与显色剂坚固蓝B盐反应生成成深蓝色物质，可在600nm处比色。以酶量为自变量，OD值为因变量，根据标准曲线计算出每毫升酶液生成α-萘酚数，再由蛋白质含量测定，计算出羧酸酯酶比活力。2.1.5.4.1.1试剂的配制（1）0.04mol/LpH7.0的磷酸缓冲液：0.04mol/LNa2HPO4·12H2O和0.04mol/LNaH2PO4·2H2O按61：39的比例混合。-4（2）1×10mol/Lα-萘酚：称取α-萘酚0.01442g，先用少量丙酮溶解，再用0.04mol/L-2-2磷酸缓冲液定容至10mL，得到10mol/L的α-萘酚。再取1.000mL10mol/L的α-萘-4酚，用缓冲液定容至100mL即为1×10mol/Lα-萘酚。-1（3）0.03mol·Lα-醋酸萘酯：称取0.5586gα-醋酸萘酯用丙酮溶解并定容至100mL（需避光保存）。-4-3（4）1×10mol/L毒扁碱溶液：0.0275g溶于100mL丙酮中，得1×10mol/L的毒扁豆碱，再从中取10mL使用蒸馏水定容到100mL。-4-1-4（5）3×10mol/L底物：取0.03mol·Lα-醋酸萘酯1.000mL加1×10mol/L毒扁碱1.000mL，加0.04mol/LpH7.0磷酸缓冲液98mL（加入毒扁豆碱的作用是抑制AchE），现配先用。（6）显色剂：5%十二烷基硫酸钠溶液和1%固蓝B盐溶液以5：2的比例混合，现配现用。2.1.5.4.1.2标准曲线的制备表1羧酸酯酶标准曲线的制备Table1PreparationofCarEstandardcurves试剂试管编号NumberofcuvetteReagents0123456-4-11×10mol·Lα-萘酚（mL）00.20.40.81.21.62.0-10.04mol·L磷酸缓冲液（mL）6.05.85.65.24.84.44.0显色剂（mL）1111111将含有底物、缓冲液和显色剂的各试管震荡混合后，室温反应30min，600nm下14 山东农业大学硕士学位论文测OD值，重复3次取平均值。以α-萘酚（μmol）为横坐标，OD值平均值为纵坐标，作标准曲线。2.1.5.4.1.3酶源的制备选整只幼虫或蜜蜂蛹2头，于匀浆器内，加入0.04mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），在冰浴条件下匀浆，匀浆液于4℃，高速冷冻离心机10800r/min下离心20min，取上清液，定容到10mL离心管中以此作为酶液。2.1.5.4.1.4羧酸酯酶比活力测定-4（1）试管内加入5.000mL3×10mol/L底物，25℃温育5min。（2）加1.000mL酶液，对照加1.000mL缓冲液。（3）将各试管30℃水浴震荡30min。（4）每只试管加入1.000mL显色剂，混匀后在室温下放置30min，颜色稳定后，600nm下测OD值，重复3次。根据标准曲线计算出反应生成α-萘酚的量，除以30min，再除以加入酶液体积（1.000mL）得到每毫升酶液每分钟水解的α-醋酸萘酯的量（μmol/min/mL）。再根据蛋白质含量（mg/mL），换算成每毫克蛋白质每分钟水解的α-醋酸萘酯的量（μmol/min/mL/mgPr.），即为酶的比活力。2.1.5.4.2乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定2.1.5.4.2.1试剂的配制(1)0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液：0.1mol/LNa2HPO4·12H2O和0.1mol/LNaH2PO4·2H2O按81：19的比例混合。(2)0.075mol/L碘化硫代乙酰胆碱：21.67mg/mL，用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，现用现配，防止水解。-2-2-1(3)1×10mol/L二硫双硝基苯甲酸液（DTNB溶液）（含1.8×10mol·L碳酸氢钠）：39.6mgDTNB和15mgNaHCO3用10mL0.1mol/L磷酸缓冲液溶解定容。-3-2(4)1×10mol/L毒扁碱：先配制10mol/L丙酮液（27.5mg/10mL丙酮），用时用蒸馏水稀释10倍。-3(5)1×10mol/L谷胱甘肽溶液：称取3.07mg谷胱甘肽，用水溶解定容至10mL。2.1.5.4.2.2标准曲线的制备15 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应表2乙酰胆碱酯酶标准曲线的制备Table2PreparationofAChEstandardcurves试剂试管编号NumberofcuvetteReagents0123450.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液（mL）2.62.52.42.21.81.0-31×10mol/L谷胱甘肽（mL）00.10.20.40.81.6缓冲液+DTNB（1：2）（mL）0.10.10.10.10.10.140℃水浴振荡5min-31×10mol/L毒扁碱（mL）0.50.50.50.50.50.5412nm下测OD值，每处理重复3次以谷胱甘肽（μmol）量为横坐标，OD值为纵坐标，作出标准曲线。2.1.5.4.2.3酶源的制备取蜜蜂幼虫或蛹于匀浆器内，加入2mL0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液，在冰浴条件下匀浆，匀浆液于4℃，10800r/min下离心20min，取上清液作为酶源。2.1.5.4.2.4乙酰胆碱酯酶比活力的测定表3乙酰胆碱酯酶比活力测定中各试剂含量Table3ThecontentofeachreagentintheAChEactivityreagent试剂试管编号NumberofcuvetteReagents0123450.1mol/LpH7.4磷酸缓冲液（mL）2.62.52.42.32.22.1酶液（mL）00.10.20.30.40.5Asch+DTNB（1：2）（mL）0.10.10.10.10.10.140℃水浴振荡5min-31×10mol/L毒扁碱（mL）0.50.50.50.50.50.5412nm下测OD值，每处理重复3次2.1.5.4.2.5结果与计算以酶量（mL）为自变量，OD值为因变量，酶液经蛋白质含量测定得出的每毫升酶相当的蛋白质含量（μg/g），根据标准曲线计算乙酰胆碱酯酶比活力16 山东农业大学硕士学位论文2.1.5.4.3谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的活力测定参照Habig（1974）的方法，以CDNB（1-氯-2，4-二硝基苯）为底物，在GST的催化下，与GSH（谷胱甘肽）生成谷胱甘肽-S-芳基复合体，在340nm处有最大吸收峰。2.1.5.4.3.1试剂的配制（1）66mmol/LpH7.0磷酸缓冲液（含2mmol/LEDTA）：66mL0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲加34mL重蒸馏水加0.058gEDTA。（2）50mmol/L谷胱甘肽：0.154g谷胱甘肽用缓冲液溶解定容于10mL容量瓶，现配先用。（3）0.03mol/LCDNB：先配成0.1mol/LCDNB。CDNB0.2025g用丙酮溶解定容于10mL容量瓶中，避光保存，使用时取3.000mL再用丙酮稀释至10mL，即为0.03mol/L，现配现用。2.1.5.4.3.2酶液的制备同2.1.5.4.1.3。2.1.5.4.3.3谷胱甘肽-S-转移酶活力测定表4谷胱甘肽转移酶比活力测定中各试剂含量Table4ThecontentofeachreagentinmensurationofGstEactivity试剂对比石英杯样品石英杯ReagentsComparedsilicacupSilicacupofsample66mmol/L磷酸缓冲液（mL）2.62.4谷胱甘肽（mL）0.30.30.16%CDNB（mL）0.10.1酶液（mL）00.2将以上试剂立即混匀，在27℃水浴条件下反应5min后，用分光光度计于340nm下，每30s记录一次OD值，记录5min内OD变化值，求出每分钟吸光度变化，每处理重复3次。GSTs活力单位（μmol/min）=（ΔOD340·v）/（ε·L），其中ΔOD340为每分钟光吸收的变化值（ΔOD340/min），v为酶促反应体积（3mL），ε为产物的消光系数0.0096L/（μmol·cm），L为溶液光程（即比色皿的宽度1cm）。GSTs比活力（μmol/min/mgPro.）=酶活力单位/酶液蛋白质含量17 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应2.1.5.4.4酶源蛋白质含量测定参照Bradford（1976）记述的考马斯亮兰蓝G-250染色法测定。2.1.5.4.4.1试剂配制（1）考马斯亮蓝G-250试剂：称取考马斯亮蓝G-2500.1g，溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（w/v）的磷酸，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容，过滤后方可使用。（2）牛血清白蛋白标准溶液：称取0.1g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg/mL的原液。（3）0.04mol/L磷酸缓冲液：0.04mol/LNa2HPO4·12H2O和0.04mol/LNaH2PO4·2H2O按61：39的比例混合。2.1.5.4.4.2蛋白质标准曲线的制备表5蛋白质标准曲线的测定Table5Mensurationofstandardcurveofprotein试剂试管编号NumberofcuvetteReagents012345-11000μg·mL牛血清白蛋白(mL）00.20.40.60.81蒸馏水（mL）10.80.60.40.20蛋白质含量（μg）02004006008001000准确吸取上述各试管中溶液0.1mL于试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，25℃水浴2min，595nm下测OD值，每处理重复3次。以牛血清白蛋白的含量(μg)为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线。2.1.5.4.4.3酶源制备同2.1.5.4.1.3。2.1.5.4.4.4酶源蛋白质含量的测定吸取酶液0.1mL于试管中，对照管中则加入0.1mL0.04mol/L磷酸缓冲液，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，25℃恒温水浴下放置2min，在595nm下比色测OD值。重复3次，取平均值，根据标准曲线计算出蛋白质含量，除以0.1即为每毫升酶液中蛋白质含量（μg/mL）。2.1.6数据处理采用MicrosoftExcel2003软件进行数据处理，采用DPSV13.5统计软件进行回归分析和方差分析（Duncan’s新复极差法）。18 山东农业大学硕士学位论文3结果与分析3.1七种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性3.1.1中毒症状观察经染毒处理的蜜蜂很快表现出中毒症状，剂量越高，表现出症状越早，症状越明显。主要表现为中毒初期表现为兴奋异常、乱飞乱撞、摇摆等中毒症状，随时间延长，蜜蜂逐渐行动迟缓，身体不协调，失去平衡侧倒挣扎、无法正常爬动，直至死亡。死亡的蜜蜂表现出农药中毒的典型症状：身体蜷缩，双翅展开。高浓度组出现的中毒症状较早，且相对明显。3.1.2参比物质试验结果以乐果为参比物质，24h接触LD50值为0.138µga.i./只，95%置信限为0.132~0.145µga.i./只。处在《化学农药环境安全评价试验准则》（国家环境保护部，2011）要求的范围（0.10~0.30µga.i./只）之内，证明该批次的生物试材符合试验要求，试验体系符合要求，试验结果准确可靠。本批次生物试材既可以用于急性接触毒性试验，也可以用于急性经口毒性试验。3.1.3新烟碱类杀虫剂对蜜蜂急性毒性试验结果3.1.3.1新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性接触毒性7种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性接触毒性试验结果见表6。噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、烯啶虫胺、啶虫脒、噻虫啉LD50（48h）值分别为0.0261、0.0315、0.0492、0.101、0.727、6.099、70.239µga.i./只。依据《化学农药环境安全评价试验准则》（国家环境保护部，2011）农药对蜜蜂急性接触毒性按LD50的大小划分标准。7种新烟碱类杀虫剂中噻虫啉为低毒，啶虫脒为中毒，噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、烯啶虫胺均为高毒。其中，噻虫啉对蜜蜂急性接触毒性最低，LD50（48h）值为70.239µga.i./只，噻虫嗪毒性最高，是噻虫啉的2767.8倍。噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、烯啶虫胺、啶虫脒毒性分别为噻虫啉的2388.5、1508.9、695.4、100.7、11.7倍。19 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应表67种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性接触毒性试验结果(48h)Table6Resultsofsevenkindsofneonicotinoidinsecticidesacuteexposuretoxicitytobees毒性LD50(95%置信限)/毒性等级药剂名称毒力回归方程(y=)倍数2RLD50(95%FL)ToxicityPharmacynameTheregressionequationToxic-1(µga.i.·bee)Levelmultiples21%噻虫嗪悬浮0.02618.1689+2.0010x0.9616高毒2767.8剂(0.0216~0.0322)50%噻虫胺水分0.03159.1346+2.7540x0.9714高毒2388.5散粒剂(0.0276~0.0356)10%呋虫胺可溶0.04927.5339+1.9369x0.9785高毒1508.9液剂(0.0405~0.0596)20%吡虫啉可溶0.1017.1802+2.1940x0.9592高毒695.4液剂(0.0852~0.121)20%烯啶虫胺水0.7275.2578+1.8593x0.9585高毒100.7剂(0.594~0.924)5%啶虫脒6.0993.4248+2.0059x0.9654中毒11.7乳油(4.756~8.690)48%噻虫啉悬浮70.2391.7291+1.7713x0.9744低毒1剂(57.090~89.685)3.1.3.2新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性经口毒性表7七种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性经口毒性试验结果(48h)Table7ResultsofsevenkindsofneonicotinoidinsecticidesoralexposuretoxicitytobeesLC50(95%置信限)药剂名称毒力回归方程(y=)毒性等级毒性倍数2RLC50(95%CL)PharmacynameTheregressionequationToxicityLevelToxicmultiples-1(mga.i.L)0.12750%噻虫胺水分散粒剂6.8687+2.0812x0.9444剧毒2970.0(0.106~0.155)0.24021%噻虫嗪悬浮剂6.1409+1.8400x0.9507剧毒1559.1(0.196~0.293)0.25510%呋虫胺可溶液剂6.0789+1.866x0.9521剧毒1475.2(0.209~0.319)3.17020%烯啶虫胺水剂4.0663+1.8634x0.9574高毒118.4(2.605~3.951)6.24720%吡虫啉可溶液剂3.2269+2.2286x0.9649高毒59.6(5.263~7.551)56.1675%啶虫脒乳油1.2455+2.1461x0.9547中毒6.6(47.012~69.100)372.18848%噻虫啉悬浮剂0.5148+1.7447x0.9743低毒1(300.925~481.162)7种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性经口毒性试验结果见表7。噻虫胺、噻虫嗪、呋20 山东农业大学硕士学位论文虫胺、烯啶虫胺、吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉LC50（48h）值分别为0.127、0.240、0.255、3.170、6.247、56.167、372.188mga.i./L。依据《化学农药环境安全评价试验准则》（国家环境保护部，2011）农药对蜜蜂急性经口毒性按LC50的大小划分标准。7种新烟碱类杀虫剂中噻虫啉为低毒，啶虫脒为中毒，吡虫啉、烯啶虫胺为高毒，噻虫嗪、呋虫胺、噻虫胺均为剧毒。其中，噻虫啉对蜜蜂急性经口毒性最低，LC50（48h）值为372.188mga.i./L，噻虫胺毒性最高，是噻虫啉的2970.0倍。噻虫嗪、呋虫胺、烯啶虫胺、吡虫啉、啶虫脒的毒性分别是噻虫啉的1559.1、1475.2、118.4、59.6、6.6倍。3.1.4风险性评价以上试验结果均是在实验室条件下测定得到的新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性结果，而实际应用还应考虑施药方法、施药器械、施药量、施药时间等因素的影响，故不能客观的反映实际田间施用条件下该类药剂对蜜蜂的影响（罗术东等，2009）。目前经济合作与发展组织（OECD,2005）、联合国粮农组织（FAO,1989）、欧洲和地中海植物保护组织（EPPO,2000）等均采用危害商（hazardquotients,HQ）值来初步判断农药2对蜜蜂的生态风险。HQ值为农药田间推荐用量（AR）（ga.i./hm）与农药对蜜蜂急性经口或接触LD50（µga.i./只）值的比值。HQ=AR/LD50OECD环境理事会认为（EPPO,2000），HQ值越高，农药对蜜蜂的风险性越高，如果HQ值小于50，则认为农药对蜜蜂无害，反之越高，风险性越大。HQ<50时，农药对蜜蜂为低风险；HQ在50～2500时为中等风险；HQ>2500时为高风险（EPPO,2003）。表87种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂接触危害商(HQ)值Table8Sevenkindsofneonicotinoidinsecticidesonbeesexposurehazardquotient(HQ)48h接触LD50田间推荐用量药剂名称危害商(HQ)值ContectLD5048hFieldRecommendeddosagePharmacynameHazardquotient-1-2(µga.i.·bee)(ga.i.·hm)21%噻虫嗪悬浮剂0.026154~78.82069.0~3019.210%呋虫胺可溶液剂0.049260~1501219.5~3048.850%噻虫胺水分散粒剂0.031545~601428.6~1904.820%吡虫啉可溶液剂0.10115~60148.5~594.120%烯啶虫胺水剂0.72730~9041.3~123.85%啶虫脒乳油6.0999~31.51.5~5.148%噻虫啉悬浮剂70.23936~720.5~1.0注：田间推荐量为查阅中国农药信息网已登记农药的推荐用量(其中10%呋虫胺可溶液剂正在登记)。因本试验中，急性经口毒性试验采用小烧杯法，得到的是农药对蜜蜂的致死中浓度21 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应（LC50），且无法得知蜜蜂的取食量，故无法得到经口LD50，本文采用急性接触毒性试验48hLD50计算HQ值（见表8）。不同有效成分因登记作物、防治对象、推广区域等不同而田间推荐用量呈现出一个较大的范围。因此本文在计算HQ值时，按照已登记的相同含量、相同剂型的同一有效成分田间推荐用量的最大范围来计算。从表3可以看到，7种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的接触HQ值。根据OECD环境理事会和EPPO，48%噻虫啉悬浮剂、5%啶虫脒乳油对蜜蜂接触危害商值均远小于50，2种药剂在田间施用条件下对蜜蜂为低风险；20%烯啶虫胺水剂对蜜蜂接触HQ值为41.3~123.8，在田间施用条件下，该药剂对蜜蜂为低风险或中等风险；20%吡虫啉可溶液剂、50%噻虫胺水分散粒对蜜蜂为中等风险，且噻虫胺的风险性大于吡虫啉；10%呋虫胺可溶液剂、21%噻虫嗪悬浮剂对蜜蜂风险性较高，为中等风险到高风险。3.2不同剂型不同含量的吡虫啉对蜜蜂的急性毒性3.2.1不同含量不同剂型的吡虫啉对蜜蜂急性接触毒性试验不同含量、不同剂型的吡虫啉对蜜蜂急性接触毒性试验结果如表9所示。试验结果显示，随着处理时间的延长，处理后24、48hLD50值逐渐减小，毒性增高。相同处理时间，LD50值也不同。48h毒性最低的为600克/升吡虫啉悬浮剂，LD50（48h）值为0.250µga.i./只，97%吡虫啉原药、5%吡虫啉乳油、20%吡虫啉可溶液剂、30%吡虫啉微乳剂、10%可湿性粉剂、70%吡虫啉水分散粒剂急性接触毒性分别是600克/升吡虫啉悬浮剂的2.5、1.6、1.6、1.5、1.4、1.3倍。依据《化学农药环境安全评价试验准则》农药对蜜蜂急性接触毒性按LD50的大小划分标准，97%吡虫啉原药、5%吡虫啉乳油、20%吡虫啉可溶液剂、30%吡虫啉微乳剂、10%吡虫啉可湿性粉剂、70%吡虫啉水分散粒剂、600克/升吡虫啉悬浮剂对蜜蜂急性接触毒性均为高毒。（见表9）表9不同含量不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急性接触毒性试验结果Table9Imidaclopriddifferentamountsanddifferentformulationofacuteexposuretoxicitytestresultstobees染毒回归方程（y=）LD50（95%置信限）毒性等级毒性倍数药剂名称2时间TheregressionRLD50(95%FL)ToxicityToxicityPharmacyname-1Time（h）equation（µga.i.bee）LevelMultiples0.373245.5444+1.2722x0.9557--（0.247~0.760）97%吡虫啉原药0.101487.1802+2.1940x0.9592高毒2.5（0.0852~0.121）22 山东农业大学硕士学位论文0.271245.8778+1.5481x0.9612--（0.200~0.431）5%吡虫啉乳油0.153486.3249+1.6228x0.9659高毒1.6（0.122~0.202）0.264246.0256+1.7740x0.9601--20%吡虫啉可溶（0.215~0.334）液剂0.161486.4204+1.7931x0.9607高毒1.6（0.129~0.198）0.562245.4986+1.9894x0.9102--30%吡虫啉微乳（0.426~0.846）剂0.172486.7839+2.3318x0.9676高毒1.5（0.144~0.203）0.514245.4778+1.6516x0.9632--10%吡虫啉可湿（0.386~0.782）性粉剂0.182486.5787+2.1308x0.9854高毒1.4（0.151~0.217）0.321245.9346+1.89448x0.9778--70%吡虫啉水分（0.265~0.400）散粒剂0.193486.4685+2.0574x0.9822高毒1.3（0.157~0.232）1.525244.7970+1.1081x0.9725--600克/升吡虫啉（0.856~4.906）悬浮剂0.250485.7853+1.3049x0.9345高毒1.0（0.190~0.330）3.2.2不同含量不同剂型的吡虫啉对蜜蜂的急性经口毒性不同含量不同剂型的吡虫啉对蜜蜂急性经口毒性试验结果如表10所示。不同剂型不同含量的吡虫啉由于制剂生产过程中采用不同的乳化剂、分散剂、润湿剂、溶剂、填料等，造成不同剂型在水中分散程度不同，造成毒性也有差异。试验结果显示，随着处理时间的延长，处理后24、48hLC50值逐渐减小，毒性增高。相同处理时间，LC50值也不同。48h毒性最低的为70%吡虫啉水分散粒剂，LC50（48h）值为15.928mga.i./L，97%吡虫啉原药、10%可湿性粉剂、600克/升吡虫啉悬浮剂、20%吡虫啉可溶液剂、5%吡虫啉乳油、30%吡虫啉微乳剂急性接触毒性分别是70%吡虫啉水分散粒剂的1.3、1.3、2.0、2.5、2.6、4.5倍。依据《化学农药环境安全评价试验准则》农药对蜜蜂急性经口毒性按LC50的大小划分标准，30%吡虫啉微乳剂、5%吡虫啉乳油、20%吡虫啉可溶液剂、600克/升吡虫啉悬浮剂、10%吡虫啉可湿性粉剂、97%吡虫啉原药、70%吡虫啉水分散粒剂对蜜蜂急性经口毒性均为高毒。（见表10）23 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应表10不同含量、不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急性经口毒性试验结果Table10ImidaclopriddifferentamountsanddifferentformulationoforalexposuretoxicitytestresultstobeesLC50（95%置信限）回归方程（y=）毒性等级毒性倍数药剂名称染时间LC50(95%CL)2TheregressionRToxicityToxicity-1PharmacynameTime（h）（mga.i.L）equationLevelMultiples14.61242.2148+2.3914x0.9231--（11.185~21.886）30%吡虫啉微乳剂3.552483.9593+1.8904x0.9807高毒4.5（2.818~4.327）9.811243.0226+1.9938x0.9674--（7.892~13.101）5%吡虫啉乳油6.093483.5395+1.8609x0.9677高毒2.6（5.008~7.560）25.730242.0871+2.0652x0.9047--20%吡虫啉可溶液（16.504~58.170）剂6.247483.2269+2.2286x0.9649高毒2.5（5.263~7.551）15.297242.9026+1.7705x0.9638--600克/升吡虫啉悬（12.376~19.812）浮剂7.904483.2923+1.9020x0.9791高毒2.0（6.366~9.590）29.312242.0888+1.9844x0.8661--10%吡虫啉可湿性（22.097~44.800）粉剂12.001482.8559+1.9867x0.9590高毒1.3（9.984~14.665）30.309242.5775+1.6351x0.8254--（22.106~49.234）97%吡虫啉原药12.559482.8494+1.95700.9661高毒1.3（10.411~15.471）45.147241.9768+1.8271x0.9020--70%吡虫啉水分散（30.226~89.736）粒剂15.928483.1399+1.5473x0.9656高毒1.0（12.5762~21.458）3.3不同试验方法下吡虫啉对蜜蜂的急性毒性分别按照微量点滴法、小烧杯法、饲喂管法做97%吡虫啉原药对蜜蜂的急性毒性。不同试验方法下吡虫啉对蜜蜂急性毒性如表11所示：试验结果显示，随着处理时间的延长，处理后24h、48h，LC50、LD50值逐渐减小，毒性增高。不同试验方法，LC50、LD50值也不同。微量点滴法48hLD50值为0.101µga.i./只，小烧杯法48hLC50值为12.559mga.i./L，饲喂管法48hLD50值为0.029µga.i./只。依据《化学农药环境安全评价试验24 山东农业大学硕士学位论文准则》农药对蜜蜂急性接触毒性按LD50的大小划分标准，不论采用哪种试验方法，吡虫啉对蜜蜂均为高毒。表11不同生测方法吡虫啉对蜜蜂的急性毒性试验结果Table11DifferentbioassaymethodimidaclopridacutetoxicitytestresultstobeesLC50/LD50（95%置信限）试验方法染毒时间回归方程（y=）毒性等级2RLC50/LD50（95%CL/FL）bioassaymethodTime（h）TheregressionequationToxicityLevel-1-1（mga.i.L、µga.i.bee）0.373245.5444+1.2722x0.9557-（0.247~0.760）微量点滴法0.101487.1802+2.1940x0.9592高毒（0.0852~0.121）30.309242.5775+1.6351x0.8254-（22.106~49.234）小烧杯法12.559482.8494+1.9570x0.9661高毒（10.411~15.471）0.0329249.9333+3.3263x0.8348-（0.0281~0.0402）饲喂管法0.0289489.9061+3.1878x0.9691高毒（0.0245~0.0346）3.4吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性及亚致死剂量的确定利用吡虫啉浓度的对数值做（x）轴，幼虫的死亡率的机率值为（y）轴，得到毒力回归方程为y=3.2185+1.9506x，（见图1）根据毒力回归方程求得LC5=1.175mg/100g饲料，LC10=1.804mg/100g饲料，LC20=3.303mg/100g饲料，LC50=8.193mg/100g饲料。图1吡虫啉对意大利蜜蜂幼虫的毒力回归曲线Figure1Imidaclopridtoxicityregressioncurvetobeelarvae25 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应3.5亚致死剂量的的吡虫啉对蜜蜂幼虫的影响3.5.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫及蛹生长发育的影响表12亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹体重的影响Table12EffectofSublethaldosesofimidaclopridontheweightofApismelliferaL.larvaeandpupae平均平均发育成功浓度试平均死幼虫平均化死亡死亡率化蛹率蛹重羽化率率mg虫亡率重化蛹数蛹率数MortalitPupatioPupaEclosioDevelopme/100g饲料数MortalitWeigPupatioPupatioDeatynrateweignratentsuccessconcentratiTotayhofnnh%%h%rateonl%larva%(g)%(g)24000.223------CK00.2002400-2291.67--87.522400-2083.33-90.075.02428.330.190------LC0.1652414.178.33-1875.0--(1.175)70.83524312.5-1666.67-68.7545.8324312.50.174------LC100.1424416.6713.89-1666.67--(1.804)64.58624312.5-1562.5-53.3333.3324416.670.169------LC200.1324520.8318.06-1354.17--(3.303)850.024416.67-1145.83-45.4520.83241354.170.147------LC500.1324937.547.22-833.33--(8.193)029.17241250-625.0-33.338.33注：化蛹率=化蛹个数/1日龄幼虫数；羽化率=成蜂数/化蛹数；发育成功率=成蜂数/1日龄幼虫数。经LC5~LC50亚致死剂量的吡虫啉处理蜜蜂幼虫后，记录化蛹和死亡情况，测定幼虫及蛹重如表12所示。当使用浓度为LC5、LC10、LC20、LC50的带吡虫啉的BLD饲喂蜜蜂3d后，蜜蜂死亡率分别为8.33%、13.89%、18.06%、47.22%，平均幼虫重量为0.190、26 山东农业大学硕士学位论文0.174、0.169、0.147g，化蛹率为70.83%、64.58%、50.0%、29.17%，平均蛹重为0.165、0.146、0.138、0.130g，羽化率为68.75%、53.33%、45.45%、33.33%，发育成功率为45.83%、33.33%、20.83%、8.33%。随着亚致死浓度不断提高，幼虫平均死亡率提高，平均幼虫重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率均呈现减小的趋势。3.5.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫主要解毒酶、靶标酶的影响3.5.2.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹羧酸酯酶比活力的剂量效应使用LC5~LC50剂量的吡虫啉饲喂蜜蜂幼虫后，羧酸酯酶变化趋势如图2所示。羧酸酯酶在LC5~LC20范围内被激活，剂量为LC5~LC20与对照相比，差异性显著（p<0.05）。当剂量达到LC10时出现最大值，其酶比活力为对照的1.47倍。当剂量达到LC50时，羧酸酯酶活力下降，达到被抑制状态，为对照的0.86倍。而对于蜜蜂的蛹，其羧酸酯酶比活力明显低于幼虫中酶活力，其中CK组幼虫羧酸酯酶活性为蛹的1.58倍。随着吡虫啉致死浓度的变化，蜜蜂蛹羧酸酯酶比活力变化不大，5%水平差异不显著。0.03）0.025蜜蜂幼虫蜜蜂蛹0.02mol/min/mg/Pro.羧酸酯酶比活力μ（0.0150.010.0050CKLC5LC10LC20LC50吡虫啉致死浓度图2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹羧酸酯酶比活力影响Figure2EffectofSublethaldosesofimidaclopridontheactivitytheCarEofApismelliferaL.larvaeandpupae3.5.2.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹乙酰胆碱酯酶比活力的剂量效应使用LC5~LC50剂量的吡虫啉饲喂蜜蜂幼虫后，乙酰胆碱酯酶变化趋势如图3所示。乙酰胆碱酯酶在LC5~LC50范围内相比对照组被抑制。吡虫啉在LC5的剂量下，就对乙酰胆碱酯酶的活性产生了抑制，其后，剂量为LC10时，随着浓度的增加，活力有所提高，随着浓度增加，乙酰胆碱酯酶活力继续下降，至LC50时，出现最大抑制，为对照组的0.46倍。对于蜜蜂蛹，则表现出相似的变化规律，总体呈现出被抑制状态，但随27 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应浓度变化的剂量效应已不明显，且5%水平差异不显著。0.03蜜蜂幼虫）蜜蜂蛹0.025比活力0.02AChEμmol/min/mgPro.（0.0150.010.0050CKLC5LC10LC20LC50吡虫啉致死浓度图3亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹乙酰胆碱酯酶比活力影响Figure3EffectofSublethaldosesofimidaclopridontheactivitytheAchEofApismelliferaL.larvaeandpupae3.5.2.3亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹谷胱甘肽-S-转移酶比活力的剂量效应0.0350.03）0.0250.02蜜蜂幼虫比活力蜜蜂蛹0.015GSTsmol/min/mgPro.μ0.01（0.0050CKLC5LC10LC20LC50吡虫啉致死浓度图4亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫、蛹谷胱甘肽-S-转移酶比活力影响Figure4EffectofSublethaldosesofimidaclopridontheactivitytheGSTsofApismellifera.Llarvaeandpupae使用LC5~LC50剂量的吡虫啉饲喂蜜蜂幼虫后，谷胱甘肽-S-转移酶变化趋势如图4所示。谷胱甘肽-S-转移酶在LC5~LC10范围内被激活，剂量为LC5与对照相比，差异性28 山东农业大学硕士学位论文显著（p<0.05）。当剂量达到LC5时出现最大值，其酶比活力为对照的1.75倍。当剂量达到LC20、LC50时，谷胱甘肽-S-转移酶活力下降，出现被抑制状态，为对照的0.83、0.67倍。在剂量为LC5~LC50时，随吡虫啉致死浓度提高，酶活力逐渐降低，酶逐渐由激活状态变为抑制状态。而对于蜜蜂的蛹，GSTs的活力高于幼虫重酶的活力，为幼虫的1.96倍。酶活力随剂量变化无明显变化，5%水平差异不显著。4.讨论4.1七种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性评价近年来，新烟碱类杀虫剂在农化市场中快速增长，2010年新烟碱类杀虫剂销售额占到世界农药市场的6%，占世界杀虫剂市场的21.8%（张敏恒等，2012）。市场份额最大的3个品种依次为吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺，不论是室内毒力测定还是考虑到大田实际推荐用量，对蜜蜂都存在较高的毒性和风险性。因此在生产实际中用药的时候，应根据害虫发生种类和发生情况合理选择农药品种，尽量避免应用这3个品种。如果必须使用，则应避开大片蜜源区、需要昆虫授粉的虫媒植物，选用毒性相对较低的剂型，合理选择施药时间、施药器械、注意施药当天风力和风向，以最大限度降低3种杀虫剂对蜜蜂的危害。其他品种，如啶虫脒、噻虫啉虽市场份额相对较少，但却拥有对蜜蜂急性毒性低毒和低风险的优点，作为农药管理者，应综合考虑生态效益和经济效益间的关系，合理调控市场中此类杀虫剂的比例，指导农民合理用药。值得注意的是，20%烯啶虫胺水剂在急性毒性中虽表现出高毒，但由于其田间推荐剂量相对较小，在风险性评价中，其风险性虽比噻虫啉、啶虫脒高，但也远低于目前应用最广泛的3个品种。尤其是自2009年7月1日以来，防治水稻害虫的主要农药品种氟虫腈的禁用（孙竹君，2009），而烯啶虫胺对稻飞虱具有较好的防效（肖汉祥等，2013），许多害虫对新烟碱类杀虫剂的主打品种吡虫啉等具有了一定程度的抗性（李燕芳等，2013），因此烯啶虫胺作为氟虫腈的替代品之一也是值得推荐使用的产品。4.2不同剂型不同含量吡虫啉对蜜蜂的急性毒性本试验中，比较了不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急性接触毒性和经口毒性。在急性接触毒性试中，不同含量不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急性接触LD50（48h）值介于0.101~0.250a.i.µg/只之间，毒性最高的是97%吡虫啉原药，最低的是600克/升吡虫啉悬浮剂，毒性最高的是最低的2.5倍；在急性经口毒性试验中，不同含量不同剂型吡虫啉对蜜蜂的急29 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应性经口LC50（48h）值介于3.552~15.928mga.i./L之间。毒性最高的是30%吡虫啉微乳剂，最低的是70%吡虫啉水分散粒剂，毒性最高的是最低的4.5倍。本研究中，接触毒性试验采用丙酮溶解，取上清液点滴在蜜蜂中胸背板处，故不同剂型间毒性相差不大。600克/升吡虫啉悬浮剂毒性最低原因可能悬浮剂加入丙酮后，产生絮状沉淀，故有效成分较难完全溶解于丙酮中，导致毒性偏低。经口毒性试验中，其毒性强弱顺序为微乳剂>乳油>可溶液剂>悬浮剂>可湿粉>原药>水分散粒剂，这与朱忠林等研究结果基本一致（朱忠林等，2003）。总体表现为液体制剂毒性强于固体制剂，微乳剂毒性强于乳油，水分散粒剂毒性最低。因微乳剂体系中表面活性剂含量较高（明亮等，2007），同样浓度的微乳状液比乳油有效成分分散度高，粒子超微细，对生物体的渗透能力强，导致毒力高（姚长滨，1998；陈福良等，2003）。原药采取先用丙酮溶解，然后用0.2%吐温-80水溶液稀释的方法，这样可能乳化分散效果欠佳，导致其毒性弱于大部分商品化的剂型。高品质的悬浮剂作为一种水基化的剂型，其药效要优于同品种的可湿性粉剂，基本与乳油相差不大（凌世海，1999）。其可湿粉、水分散粒剂由于体系中颗粒较大，分散度比液体剂型低，故毒性较低。同时，对于蜜蜂毒性较高的有效成分，剂型的差异对其影响比较小；而对于毒性本身较低的有效成分，由于剂型差异导致助剂不同或者理化性质的差异，从而使得不同剂型表现出毒性差异（赵帅等，2011）。因此，在大田中使用此种药剂时，应合理选择剂型和产品，选择对蜜蜂毒性相对低的剂型，并严格控制用量，尽可能减少这些药剂对蜜蜂等环境生物的危害。4.3不同试验方法下吡虫啉对蜜蜂的急性毒性由于试验人员、实验条件不同，吡虫啉对蜜蜂的LD50存在较大的差异，经口毒性多在0.0037~0.081µga.i./只之间，接触毒性多位于0.049~0.242.6µga.i./只之间(Nauenetal.,2001;Schmucketal.,2001)，本试验结果与上述报道一致。孟丽峰（2013）报道利用小烧杯法吡虫啉对蜜蜂急性经口LC50值为7.15mg/L，吴凌云等（2005）报道吡虫啉对蜜蜂急性经口LC50为11.2mg/L、9.33mg/L、8.25mg/L。本试验中，由于采用吐温-80乳化分散吡虫啉原药，可能会存在原药乳化分散效果欠佳，试验期间内药剂分层等现象出现，故而导致毒性较上述文献报道的结果要低，但均在同一毒性范围。1989年我国前国家环保总局组织编写了《化学农药安全评价试验准则》（蔡道基，1989），检测农药对蜜蜂的急性经口毒性的方法为“小烧杯法”，该方法已经被广泛的30 山东农业大学硕士学位论文应用在我国农药制剂的登记试验中。与此同时，世界许多国家和国际组织则采用OECD推荐的“饲喂管法”，而且该方法测定结果在生态风险评价中可以作为农药对蜜蜂风险性评价的依据（杨艳霞等，2008）。“小烧杯法”与“饲喂管法”区别在于：饲喂管法中，蜜蜂只能通过口器接触药剂，而且，接触时间较短（4~6h）；小烧杯法中，蜜蜂接触药剂的途径相对复杂，除了口器接触之外，蜜蜂还可以同构足或身体其他部位接触药剂，如果，药剂具有较强的挥发性，其熏蒸毒力也会成为蜜蜂接触药剂的方式，并且蜜蜂接触药剂的时间长达48h。因此小烧杯法放大了田间应用条件下药剂对蜜蜂的毒害作用，对于农药的推广是不利的。此外，小烧杯法无法体现出特殊药剂对蜜蜂的毒性，如趋避作用、拒食作用等特殊作用方式，均无法通过小烧杯法得到体现。这对于科学评价农药对环境生物的风险性是不利的。2014年10月10日，国家质量监督及检验检疫总局、国家标准化管理委员会在北京召开新闻发布会，批准《化学农药环境安全评价试验准则》，准则取消了普遍采用的“小烧杯法”改为OECD推荐的“饲喂管法”，并于2015年3月11日起实施（刘刚，2014）。新准的颁布必将为我国农药对环境生物的安全性评估体系的健全与发展，提供有力的支持。4.4吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性由于饲喂幼虫的饲料相对较为粘稠，加上饲喂量较少，较难准确测量体积。且蜜蜂幼虫的取食量也比较难以确定，故本实验中采用配制一定浓度的带毒饲料，让幼虫自由取食的方法。目前，杀虫剂的亚致死剂量还没有一个严格和统一的界定，一般把不引起试验对象死亡，但对其正常的行为或生理活动有亚致死效应的剂量称之为杀虫剂的亚致死剂量（宋怀磊，2010）。亚致死剂量作为一个范围并没有确切的值，不同的研究目的和研究方法采取的亚致死剂量也不尽相同（Liuetal.,1996;Pedersenetal.,1997;Delpuechetal.,1999;宋怀磊等，2011）。本实验采用LC5、LC10、LC20、LC50作为亚致死剂量。4.5亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫的影响4.5.1亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫和蛹生长发育的影响本研究经LC5、LC10、LC20、LC50亚致死剂量吡虫啉处理蜜蜂幼虫，随浓度的提高，幼虫平均死亡率提高，平均幼虫重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率均呈现减小的趋势。不同于自然条件下的蜂群，卵、幼虫和蛹由哺育蜂专职饲喂，一旦幼虫出现31 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应发育异常，工蜂往往会将异常的幼虫、卵和蛹遗弃（Katzavetal.,2003）。孟丽峰（2013）的研究发现，使用LC5的吡虫啉饲喂蜂群后，蜜蜂卵的孵化率显著降低，但对蜜蜂化蛹率无影响。本研究中，经吡虫啉处理的蜜蜂幼虫和蛹体重均有不同程度的降低。研究表明：个体大的蜜蜂飞翔距离远，能为更多的花授粉，而且授粉的质量高。个体小的蜜蜂飞行距离近，采集能力弱，寿命短，而且个体小的蜜蜂其表面积和体积比更大，受杀虫剂等不良化学药剂影响更大（Brittainetal.,2011）。Decourtye等（2010）、Abbott等（2008）用5~300μg/kg的吡虫啉饲喂蜜蜂后，发现蜜蜂幼虫发育历期延长，Wu等（2001）发现蜂巢中残留的新烟碱类农药使成年工蜂寿命平均缩短4天。因此，经亚致死剂量的吡虫啉处理后，蜜蜂幼虫和蛹体重的降低，将会对蜜蜂整个群势的发展产生及其不利的影响，这些都在一定程度上造成了蜜蜂数量的减少。4.5.2亚致死剂量的吡虫啉对蜜蜂幼虫和蛹解毒酶和靶标酶的影响由于蜜蜂体内的解毒酶活性随着季节、蜂群、年龄的不同而存在一定的差异（Smirleetal.,1987;Smirleetal.,1989），为避免这些因素造成的影响，本实验所用蜂群为姊妹王群，蜂王为2013年秋季培育。试验生物处理均在2014年5~6月份完成，此时期，气候条件良好，外界粉蜜源充足，蜂王产卵能力强，无蜂螨危害，蜂群处于强盛期。细胞色素P450（P450）、羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是昆虫体内普遍存在的三种重要的解毒酶，这三种酶在昆虫内源化合物的合成、信号转导、外源化合物、农药代谢等方面起着重要的作用。羧酸酯酶，谷胱甘肽-S-转移酶是常用来检测昆虫对农药制剂抗性的酶，以此来观测昆虫对外来物质分解转化的能力，从而了解昆虫分解该药剂的途径。乙酰胆碱酯酶是神经毒剂常用的靶标酶，可以检测农药制剂是否对昆虫的神经系统有致毒作用（张锐，2013）。已有研究显示，P450是蜜蜂代谢花粉、花蜜中外源化合物的主要酶（Johnsonetal.,2012）。孟丽峰（2013）研究发现，饲喂吡虫啉对蜜蜂体内的细胞色素P450的比活力作用最大，显著高于对照组。活体增效试验页表明，加入P450的专性抑制剂胡椒基丁醚（PBO），对吡虫啉具有增效作用。由于时间和材料限制，本研究未涉及亚致死剂量的吡虫啉对P450的剂量效应研究。羧酸酯酶是生物体内重要的水解酶，在有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂代谢中起着重要作用。对吡虫啉产生抗药性的害虫研究证明，抗吡虫啉的棉蚜品系体内羧酸酯酶比活力明显高于敏感品系（潘文亮等，2003）。本研究也显示，亚致死剂量的吡虫啉处理蜜32 山东农业大学硕士学位论文蜂幼虫后，羧酸酯酶比活力在一定范围内先被激活，随剂量提高，超出酶所能代谢的程度后，逐渐被抑制。这与邱高辉等（2008）、潘文亮等（2003）研究结果一致：抗吡虫啉桃蚜和麦长管蚜主要抗性机制是多功能氧化酶和羧酸酯酶活性增强。这充分说明羧酸酯酶在蜜蜂体内吡虫啉代谢中起着重要作用。谷胱甘肽-S-转移酶主要存在于细胞质中，主要通过催化亲电基团与谷胱甘肽（GSH）结合而达到解毒目的（Enayatietal.,2005）。蜜蜂的谷胱甘肽-S-转移酶主要存在于脂肪体、中肠、马氏管等组织。吡虫啉在蜜蜂体内的半衰期为5h，其在蜜蜂体内代谢可先氧化裂解成6-氯烟酸，然后进一步氧化去硝基，最后羟化成4-羟基吡虫啉、5-羟基吡虫啉和4,5-二羟基吡虫啉（Suchailetal.,2004）。所有代谢产物的半衰期为25h。本研究试验结果显示，经不同剂量吡虫啉处理后，蜜蜂幼虫GSTs活性先被激活，后被抑制，因此GSTs也参与吡虫啉解毒的某个阶段。GSTs存在于蜜蜂生长发育的各个时期，卵期活性最低，成蜂活性最高，呈递增趋势（Papadopoulousetal.,2004）。本试验中，蛹GSTs活性高于幼虫活性，与上述研究结果一致。本试验结果还显示，羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶均表现出幼虫期具有典型的剂量效应，而进入化蛹阶段则比活力随浓度变化趋于平缓。可能存在的原因是，吡虫啉在蜜蜂体内所有代谢产物的半衰期为25h（Suchailetal.,2004）。蜜蜂在幼虫期肠道是封闭的，在6日龄进入化蛹阶段时，会排出废物，最终化蛹。蜜蜂幼虫经过3d的排便化蛹，期间亚致死剂量的吡虫啉被体内代谢酶转化成水溶性物质，经排便排出体外。蜜蜂蛹内已无处理药剂，解毒酶活力恢复正常水平。吡虫啉作用于乙酰胆碱受体，竞争乙酰胆碱酯酶的结合位点。因此蜜蜂接触吡虫啉后，必然会对乙酰胆碱酯酶产生影响。本实验结果表明，亚致死剂量的吡虫啉处理后，蜜蜂幼虫乙酰胆碱酯酶均处于抑制状态，酶活力表现出先升高，后降低的趋势，存在明显的剂量效应。这与高效氯氰菊酯对德国小蠊体内乙酰胆碱酯酶活性结果一致（赵志刚等，2009），与孟丽峰（2013）研究结果也一致。当蜜蜂化蛹后，其剂量效应趋于不明显。5.全文结论随着农药等化学品大量使用，越来越多的副作用开始出现，伴随人们的环保意识的增强，越来越多的学者将注意力集中到了化学品对自然界生物安全性方面。蜜蜂是环境生物污染的指示器，化学品对蜜蜂的毒性是化学品环境评价的不可或缺的一项。33 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应1．通过测定生产中常用的新烟碱类杀虫剂品种吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、啶虫咪、烯啶虫胺、噻虫啉、呋虫胺的室内急性毒性及考虑大田推荐量的风险商值，市场份额最大的3个品种：吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺对蜜蜂都存在较高的毒性和风险性。啶虫脒、噻虫啉虽市场份额相对较少，但却拥有对蜜蜂急性毒性低毒和低风险的优点。烯啶虫胺风险性虽比噻虫啉、啶虫脒高，但也远低于目前应用最广泛的3个品种，因此具有很好的市场应用前景。2.明确了不同剂型的吡虫啉对意大利蜜蜂的急性毒性。急性经口LC50（48h）值介于3.552~15.928mga.i./L之间，急性接触LD50（48h）值介于0.101~0.250a.i.µg/只之间。急性接触毒性试验结果相差不大，其原因是使用丙酮做溶剂，与不同剂型分散性无关。急性经口毒性试验中，表现出微乳剂>乳油>可溶液剂>悬浮剂>可湿粉>原药>水分散粒剂的毒性规律。毒性随剂型分散度提高而提高。在大田中使用此种药剂时，应合理选择剂型和产品，选择对蜜蜂毒性相对低的剂型，并严格控制用量，尽可能减少这些药剂对蜜蜂等环境生物的危害。3.明确了吡虫啉原药微量点滴法、小烧杯法、饲喂管法对蜜蜂的急性毒性试验结果。微量点滴法接触LD50（48h）=0.101μga.i./只，小烧杯法经口LC50（48h）=12.599mga.i./L，饲喂管法经口LD50（48h）=0.0289μga.i./只。微量点滴法与饲喂管法为国际普遍接受的试验方法，我国农药对蜜蜂的安全性评价体系较为简单，《化学农药环境安全评价试验准则》的实施，将推动我国农药环境安全性评价发展。4.获得了吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性及亚致死剂量。LC5=1.175mg/100g饲料，LC10=1.804mg/100g饲料，LC20=3.303mg/100g饲料，LC50=8.193mg/100g饲料。5.明确了亚致死剂量下的吡虫啉对蜜蜂幼虫体重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率等指标的影响。随着亚致死浓度不断提高，幼虫平均死亡率提高，平均幼虫重、化蛹率、平均蛹重、羽化率和发育成功率均呈现减小的趋势。6.明确了亚致死剂量下吡虫啉对羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶的剂量效应。三种酶均参与吡虫啉在蜜蜂幼虫体内的降解，待幼虫排便发育为蛹，剂量效应不明显，可能原因是，吡虫啉在蜜蜂体内所有代谢产物的半衰期为25h，吡虫啉及其2代谢产物均由排便排出体外，解毒酶活力恢复正常水平。34 山东农业大学硕士学位论文本研究的创新之处1.通过筛选生产中常用的新烟碱类杀虫剂及以吡虫啉为例，相对全面的评价了此类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险性。2.明确了吡虫啉对蜜蜂幼虫的急性毒性及亚致死浓度范围。3.初步测定不同浓度农药吡虫啉对意大利蜜蜂幼虫及蛹体内主要解毒酶、靶标酶的影响，研究了吡虫啉对这几种酶的剂量诱导效应。35 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新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性评价及亚致死效应致谢本论文是在恩师姜兴印副教授的悉心指导下完成的。三年来，恩师在学习、生活和做人成才上给予我无微不至的关怀和谆谆教导。从论文的选题到试验的实施直至论文成稿，无不倾注了他的心血，他不辞劳苦，给予我苦心栽培以及无私的指点和帮助。值此论文完成之际，特向姜老师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！同时感谢山东农业大学动动物科技院胥保华老师、王颖师兄、吴在富师兄在蜜蜂幼虫人工养殖方面给予我无私的帮助和指导，帮助我克服饲养过程中出现的问题。山东省泰安省庄镇市羊楼养蜂场王继辰师傅教授我蜜蜂习性、处理分蜂、治螨、移虫等日常饲养技术，这都是保障课题研究的重要条件，在此向王师傅表示诚挚的谢意。感谢山东农业大学农药环境毒理研究中心提供一个让我学习和试验的平台，让我对GLP实验室建设有了比较深刻的认识，感谢环境毒理研究中心所有老师和员工，在学习和试验中给我的帮助。在课题研究和论文撰写过程中，王开运教授、王金信教授、刘峰教授、慕卫副教授、朱鲁生教授、路福绥教授、姜林教授、李丽芳副教授、薛超彬副教授、夏晓明副教授和乔康老师提出了许多宝贵意见，林琎老师提供了试验仪器。在课题中，已毕业张锐师兄在蜜蜂急性毒性试验技术方面给予我莫大的帮助，刘富圆师兄、刘勇师兄、李配师姐、许青青师姐提出了许多宝贵意见并给予很多关怀和帮助；实验室研究生袁传卫、程传英、殷万元、张风文、芦勇、李刚、卜成成在试验和生活上给予了许多帮助，本实验室实习学生也给予了很多帮助。父母、家人及朋友在求学期间给予了我莫大的物质支持和精神鼓励，使我得以顺利完成学业，在此一并衷心致谢！谨向帮助和关心过我的各位老师和同学表示衷心地感谢！季守民2015年6月44 山东农业大学硕士学位论文攻读硕士期间发表论文情况*1.季守民,程传英,袁传卫,周秀玲,姜兴印.7种新烟碱类杀虫剂对意大利蜜蜂的急性毒性及风险评价[J].农药,2015,54(4):625~629.45