化学发光法用于评价蜂蜜对dna氧化损伤保护能力及其机理研究 55页

：７分类号：０６５７学校代码１０６９密级：２００６８８：公开学号１２２．ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：硕士学位论文＇ＭＡＳＴＥＲＳＤＩＯＮＩＳＳＥＲＴＡＴ化学发光法用于许价蜂蜜对ＤＭ氧化损伤保护能力及其机理研究：：：：：：；／：１、：”＇：‘厂：：．，‘＞／．‘…－Ｗ？，．ｉｆ，ＶＶｙ学科名称：分析化学作者：徐盼指导老师：曹伟教授西北大学学位评定委员会—二０五年 ＡＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＥｖａｌｕａｔｉｏｎｔｈｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡＤａｍａｇｅＥｆｆｅｃｔｏｆＨｏｎｅｙａｎｄｉｔｓＭｅｃｈａｎｉｓｍＡｕｔｈｏｒ：ＰａｎＸｕＭｅｎｔｏｒ：ＷｅｉＣａｏＰｒｏｆｅｓｓｏｒＦｅｉＮｉｅＬｅｃｔｕｒｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ／ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｒｃｈ３０２０１５， 西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：＃＾指导教师签名：年６月／＞日年６月日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：彳６２＾年月，日 化学发光方法用于评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力及其机理研究摘要一种保健性食品蜂蜜作为，其抗氧化能力以及ＤＮＡ氧化损伤保护能力的研宄对深入认识并开发其保健功效具有非常重要的意义。本论文研究了八批次蜂蜜的抗氧化能力及其对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力；建立了评价ＤＮＡ氧化损伤的流动注射化学发光新方法，应用于荞麦蜂蜜、龙眼蜂蜜、槐花蜜、油菜蜜等四种蜂蜜的保护ＤＮＡ氧化损伤能力的评价：；对其保护机理也进行了初步研宄。全文共分为四章，主要内容如下１．综述了ＤＮＡ氧化损伤的研宄进展。２．采用流动注射化学发光法研宄了八批次蜂蜜试样的抗氧化能力，即对超氧阴离子＂（Ｏｒ）自由基、经基自由基ＧＯＨ）和过氧化氢三种活性氧物质的消除能力，并比较了八批次蜂蜜试样的抗氧化能力。实验结果表明：荞麦蜂蜜对三种活性氧物质都具有较强的清除能力。－３－．基于ＣＵＳＯ４Ｈ２Ｏ２ＤＮＡ化学发光体系产生强的化学发光信号，建立了评价ＤＮＡ氧化损伤的化学发光新方法，并用该方法评价了不同蜂蜜样品对ＤＮＡ氧化损伤的保护２＋能力：，探讨了该化学发光体系的发光机理。结果表明Ｃｕ与Ｈ２Ｏ２组成的类芬顿试剂对ＤＮＡ造成氧化损伤的过程中产生发光信号，而蜂蜜的加入可以有效的保护ＤＮＡ氧化损伤，因而发光信号被抑制；比较发现，实验中四种蜂蜜试样，其中养麦蜂蜜对ＤＮＡ。氧化损伤的保护能力最强，可能是因为该蜂蜜含有更多酷酸的原因４．利用凝胶电泳、酶联免疫分析、原子力显微镜、圆二色光谱以及电化学等手段，初步研究了ＤＮＡ的氧化损伤以及蜂蜜对其损伤过程的保护机理。结果表明，Ｈ２Ｏ２在＋Ｃ２ｕ的催化作用下，产生的轻基自由基可以将ＤＮＡ的双螺旋结构切割成开环结构或者一些片段结构－ＯＨｄＧ等，导致其构象发生变化并生成８氧化损伤产物；蜂蜜中抗氧化物质的加入一定程度影响了ＤＮＡ的结构，从而缓解了ＤＮＡ受轻基自由基的氧化损伤的程度一些还原性物质可以通过直接消耗过氧化氢或和芬顿试剂中的金属离；且蜂蜜中的Ｉ 。子进行络合，从而减少了经基自由基的生成，抑制了氧化损伤关键词：化学发光，ＤＮＡ氧化损伤，蜂蜜，保护机理１（ ＡＣｈｅｍＵｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＥｖａｌｕａｔｉｏｎｔｈｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡＤａｍａｇｅＥｆｆｅｃｔｏｆＨｏｎｅｙａｎｄｉｔｓＭｅｃｈａｎｉｓｍＡｂｓｔｒａｃｔＨｏｎｅｙｉｓａｎａｔｕｒａｌｈｅａｌｔｈｆｏｏｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎａｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔａｎｄｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｙｐｅｆｅｃｔｓｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆｈｏｎｅｙａｓａｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｍｅａｎｉｎｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉａｔｉｎｉｔｓｈｇｇｇｇｈｅａｌｔｈｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｓｄｅｅｐｌｙ．ＴｈｅａｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｅｆｅｃｔｓｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆ８ｂａｔｃｈｅｓｈｏｎｅｙｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｓｉｎｔｉｉｉｓａｅｒ．ＡｎｏｖｅｌｐｐｐｆｌｏｗｉｎｅｃｔｉｏｎｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒａｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅａｂｉｌｉｔａｎｄｊｙＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｈｏｎｅｙｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄｉｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆＢｕｃｋｗｈｅａｔｈｏｎｅＬｏｎａｎｈｏｎｅＡｃａｃｉａｈｏｎｅａｎｄＲａｅｈｏｎｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｉｔｓｒｏｔｅｃｔｉｖｅｙ，ｇｙ．ｙｐｙ，ｐｍｅｃｈａｎｉｓｍｗａｓａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｆｕｌｌｔｅｘｔｉｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｃｈａｐｔｅｒｓ，ｔｈｅｍａｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１ＲｅｖｉｅｗｔｈｅｒｏｒｅｓｓｏｆＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｅ．，ｐｇｇ２ｅａｎｏｘｗｅｒｅｍｅａ－Ｔｈｔｉｄａｔｉｖｅａｂｉｌｉｔｏｆ８ｂａｔｃｈｅｓｈｏｎｅｓｕｒｅｄｕｓｉｎＩＣＬｍｅｔｈｏｄ．，ｙｙｇＦＮａｍｅｌｙ，ｔｈｅｓｕｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｓｃａｖｅｎｉｎａｂｉｌｉｔｙｈｄｒｏｘｌｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｉｎａｂｉｌｉｔａｎｄｐｇｇ，ｙｙｇｇｙｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔＢｕｃｋｗｈｅａｔｈｏｎｅｙｈａｓｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎＲＯＳｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｈｏｎｅｙｓａｍｐｌｅｓ，３Ａｎｏｖｅｌｆｌｏｗｉｎｅｃｔｉｏｎｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ，ｊ－ＣＵＳＯ－ＨＯＤＮＡ４２２ｓｙｓｔｅｍ．ＡｎｄｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｈｏｎｅｙｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣＵＳＯ－Ｈ２Ｏ２－ＤＮＡｓｓｔｅｍｗａｓｖｅｅｍｅｎａｒｅｓｓｓ４ｙｉｎｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｅｘｒｉｔｌｕｌｔｈｏｗｔｈａｔａｐｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｈｅｎｏｍｅｎｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｐＤＮＡａｎｄＦｅｎｔｏｎｌｉｋｅｒｅａｇｅｎｔｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｎｄＨ２Ｏ２，ｔｈｅｓｉｇｎａｌｏｆｔｈｅｓｙｓｔｅｍｗａｓＩＩＩ 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目录ｍｍＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｌｌ－ｍｒｎｍｉｔ１１１．１ＤＮＡ氧化损伤概述１．２本论文研究内容及其意义６．教Ｍ６二－ＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价第章ＦＩ１３２．１弓１３２．２实验部分１４２．３结果与讨论１７２．４２０捕２０第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研究２５３．１弓胃２５｜３２５．２实验部分３．３结果与讨论２７３３１．４结论参考文献３２第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究３５４３５．１弓ＩＷ４．２实验部分３５４．３结果与讨论３９４４２．４詩減４３攻读硕士学位期间取得的科研成果４５ｍ４７Ｖ 西北大学硕士学位论文第一章绪论１．１ＤＮＡ氧化损伤概述１１１ＤＮＡ．．氧化损伤脱氧核糖核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ＤＮＡ）又称去氧核糖核酸，是两条互相配对并紧密结合的长链组成具有双螺旋结构的分子。ＤＮＡ是存储、复制和传递信息的主１】［。要物质基础，是遗传物质的载体。可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作对机体的生命正常代谢活动起的作用巨大。２一［］有氧呼吸生物在正常的呼吸过程中，细胞内会形成定含量的活性氧自由基（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）。ＲＯＳ是指具有含氧的不成对电子的基团或其他含氧—１物质，包括：超氧阴离子（Ｏｒ）、轻基自由基（ＯＨＯ、单线态氧（０２）、过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）３［］？研究表明：中、高浓度的ＲＯＳ通过细胞应激反应诱导细胞调亡，并发现了自由基与４细胞信号转导之间［】的内在关联。机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平５［］衡。低浓度的ＲＯＳ对细胞的增殖和分化具有积极意义。超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）和谷胱甘肽过氧化物酶；以及维生素Ｅ－ｅ、维生素Ｃ、胡萝卜素、微量元素硒等构成了体内的抗氧化防御体系（ＡｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖＰ６一Ｄｅｍ［］ｅｆｅｎｓＳｙｓｔｅ）。正常生理条件下，抗氧化防御体系把体内产生的ＲＯＳ控制在定的范围内，使得体内ＲＯＳ的产生和消除处于平衡状态。但是当机体发生病变或者抗氧化酶合成出现问题，会导致ＲＯＳ的含量超出正常值。平衡被打破，就会出现氧化应激这８＿９［］些自由基反应活性很强、ＲＮＡ，，能和体内的大分子物质如蛋白质、ＤＮＡ发生反应一定的损伤造成。ＲＯＳ对ＤＮＡ所造成的损伤，我们称之为ＤＮＡ氧化损伤。ＤＮＡ氧化损伤（ＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ）是指由体内代谢产生的活性氧自由基或外源性化学物质使ＤＮＡ上碱基或脱氧核糖产生化学反应，使得ＤＮＡ的完整性和功能性遭到破坏。ＤＮＡ氧化损伤产生的后果严重，因此，ＤＮＡ氧化损伤的研究成了广大的科研人员的研宄热点。１．１．２ＤＮＡ氧化损伤过程诱导形成ＤＮＡ氧化损伤的因素有很多种。按照其来源可以分为：内源性和外源性。内源性的包括：信号传递过程和新陈代谢相关物质，和发炎部位的活性氧自由基１ 第一章绪论４－１１９［］外源性的有：化学药品、重金属、药物、烟草、紫外线等。这些物质会导致机体产生氧化应激进而体内产生大量的ＲＯＳ。在ＲＯＳ中，２２［］可以在产生部位与周围的物质发生反应？。０Ｈ可以和化学活性最强是经基自由基，它２３［】ＤＮＡ的四种碱基（见图１．１）反生反应有加成、电子转移和脱氢。轻基自由基可以和一？噴呤和瞎唾的双键发生加成反应个Ｈ２－－。在胸腺嘧唾的甲基上吸收，形成脱氧核糖９－ｉ－Ｉ２４－＊［］－Ｈ二级速４９＞＜１０ＭＳ上的两个Ｃ键。扩散控制的率常数为。经基自由基具有亲电。、性质，所以它常常攻击电子密度最高部位经基自由基常在鸟嘿呤和腺噴呤的Ｃ４Ｃ５２５［］－０Ｈ－－和Ｃ８位加成，形成对应的Ｃ４、Ｃ５０Ｈ和Ｃ８０Ｈ加合物？而这些含有经基的加合物会和氧气发生反应Ｐ，速率各不形同。轻基自由基可以和胸腺哦唆和胞瞎定的Ｃ５和Ｃ６Ｃ５－０Ｈ加合６０％位置的双键发生加成反应产物的概率是，胞啼，其中形成胸腺啼徒２６［］Ｐ－定Ｃ５０Ｈ加合产物的概率是８７％。经基自由基还会和ＤＮＡ的含糖部分发生反应，－形成糖损伤。ＤＮＡ碱基和蛋白质在有轻基自由基存在条件下也会发生反应，形成ＤＮＡ一蛋白交联。产生系列的ＤＮＡ氧化损伤产物。图１．２列出了部分ＤＮＡ碱基修饰产物。０ＮＨ２、人，人人Ｚ。人人。ｕａｎｉｎｅａｄｅｎｉｎｅｇｍｔｈｙｉｎｅｃｔｏｓｉｎｅｙ图１．１ＤＮＡ的４种械基的结构式２ 西北大学硕士学位论文。。ＨＨ／／々。人Ａ：。入七。人為。人又。人入。人入－ｒｏｘ－－５ｈｙｄｙ６５－ｈｙｄｒｏｘｍｅｔｈ－ｙｙｌ－－－－５ｉｏｍａｃｎ－ｒｔｉｌ５ｄｏｍｉｒｒｕｒａｃｕｈｙｄｉｏｔｈｍｉｎｅｔｈｉｎｅｌｃｏｌ５６ｄｉｈｄｒｏｔｈｍｉｎｅｙｙ，ｙｙｇｙｙｙｕｒａｃｉｌＮＨ２ＮＨＮＨ２ｚＱＯ１１众。ｘ；ｉ：。ｘ；ｉ：：：ｘａ．乂人＾－－－５－－－５ｈｄｒｏｘ５６５６ｄ’ｉｈｄｒｏｘｙｙ，ｙｙ－ｔｏｃｔｏｓｍｅｌｃｏｌｅ－ｉｎ５－－ｔｉｏｎ５ｈｄｒｏｘｃｔｏｓｉｎｅｈｄｒｏｘｃｙｓｉｎｅｙｇｙｕｒａｃｉｌｍｔｈｙｌｈｙｄａｎｌｏｈｙｄｒｏｈｙｄａｎｙｙｙｙｙＮＨＨ２２Ｎ２，『ｊｎ－Ｖｏ＂ｈＶＨｊ入ｕ入ｃ人Ａ人Ｖ斤ｒＶ＞＃ＨＮ＾ＭＮ＾ＮＮＨ。Ｎ人人人Ｎ．ｆｊ＾厂Ｈ。Ｎ＾－－－ｈｄｏｘｉｎｅ２ｈｄｒｏｘａｄｅｎｉｎｅ－８ｈｄｒｏｘｉＳｙｒａｄｅｎｙｙ８ｈｄｒｏｘａｄｅｎｉｎｅ２－ｈｄｒｏｘａｄｅｎｉｎｅｙｙｎｅｙｙｇｕａｎｙｙｙＮＨ２１１ＪＬ＾ＮＨＣＨＯＯ＂＂ｙＳＸＴ：：＜Ｚ＾Ｚ＼＝ｙＨｎＮＮＨＮ２２＾、ＨＮＮＨ２２６－ｄ－－－－ｉａｍｉｎｏ４ｈｄｒｏｘ５－ｈｙｄｒｏ－６ｈｙｄ－，ｙｙ５ｒｏｏｘａｚｏｌｏｎｅｆｏｎｎａｍｉｄｏｐｒｉｍｉｄｉｎｅｃｔｏｓｉｎｅｙｙ图１．２部分舰氧化损伤产物的结构式１．１．３ＤＮＡ氧化损伤的危害：ＲＯＳ会把生物大分子现代医学表明，尤其是ＤＮＡ作为攻击的靴分子，从而造成氧化损伤。ＤＮＡ中的脱氧核糖和碱基是主要的攻击对象，从而造成碱基修饰、糖损伤、２７一ＤＮＡ－蛋白交联［］、单链或双链断裂等各种类型的损伤，形成系列的ＤＮＡ氧化损伤产２８物［］。这些损伤会导致ＤＮＡ结构和功能的变化，会致使染色体稳定性和基因的准确性受到严重的影响，如果这些损伤要是未能正确的或及时的修复就很有可能诱发基因突变，进而导致癌症及各种疾病的发生，给生物体健康带来了巨大的隐患。－－－－－－１．１．４ＤＮＡ氣化损伤的标志物８ＯＨｄＧ－Ｂ－－－ｕ－８轻基脱氧鸟票呤（８ｈｙｄｒｏ：ｘｙ２ｄｅｏｘｙｇａｎｏｓｉｎｅ，８ＯＨｄＧ）是ＤＮＡ氧化损伤产物一２９Ｇ［］ＲＯＳ中的轻基自由基ＣＰ］中之，它是攻击鸟嘌呤碱基的８位而形成的。体内产生－的８经基脱氧鸟嘆呤会引起基因错配而诱导基因突变。它还与癌细胞基因表达有密切关 第一章绪论Ｐｌ］。医：联，导致形成肿瘤学发现帕金森综合症、癌症、糖尿病、大脑动脉硬化、心脑３２４１［］也和ＲＯ血管疾病、阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈病以及衰老Ｓ引起的ＤＮＡ氧化损伤－有着十分密切的关系。因此，细胞核ＤＮＡ和线粒体ＤＮＡ中的８ＯＨｄＧ含量变化能够很好的反映体内的ＤＮＡ氧化损伤状况８－ＯＨｄＧ是大ＤＮＡ氧化。所以家普遍认可的损４２４３伤标志物［］，它之所以可以作为ＤＮＡ氧化损伤的标志物，主要是由于它形成途径单一ＤＮＡ氧化损伤方可形，形成后在体内性质稳定性，，仅细胞内的成而且不会再次参“４６［］。与代谢，也不受个体饮食的影响－１．１．５８ＯＨｄＧ的检测方法－（ＨＰＬＣ－）１、高效液相色谱电化学分析法ＥＣＤＨＰＬＣ－ＥＣＤ法是检测８－ＯＨｄＧ含量的常用方法，该方法灵敏度高、分析速度快、需－样量少、选择性好，对组织细胞的ＤＮＡ、血清、血楽和尿液中的８ＯＨｄＧ都可以检测，４７４９５Ｇ－［１［］８－ＯＨｄＧ－ＨＰＬＣＥＣＤ是目前测定使用比较广泛的方法。Ｌｉ和Ｓｏｎｇ采用ＨＰＬＣＥＣＤ法对比研宄了低剂量的粒子辐射对小鼠造成的ＤＮＡ氧化损伤，结果表明辖射的小鼠肝脏５ｉ［】－ＯＨｄＧ－和尿液中８水平明显升高。Ｋｉｏｄｅ和Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ等人用ＨＰＬＣＥＣＤ法测定了人血清８－ＯＨｄＧ的含量－－ｍＬ中，他们测定后发现正常人的血清中的８ＯＨｄＧ的含量范围是１７０／，ｐｇ－检出限低（ｌＯ／ｍＬ）、重现性好（２．２７．１％）。但是该方法需要预处理、测定耗时，而ｐｇ且仪器昂贵难以作为常规分析手段。２、气相色谱／质谱联用分析方法（ＧＣ／ＭＳ）ＧＣ一／ＭＳ法是种将气相色谱技术和质谱相结合的方法，既可以分离纯化，又可以５２［ｕｅｚ和Ｊｕｒａｄｏ８－ＯＨＧｕａ的ＧＣ／ＭＳ法分析物质结构。Ｒｏｄｒｉｇ＾人建立了测定，他们为比较－两种不同的酶的活性，分别用酶对ＤＮＡ进行水解，然后测定其中８ＯＨＧｕａ的含量。该方理复杂－法测定前需要衍生化，并且由于衍生化步骤会使鸟嘿呤氧化成８经基脱，样品处氧鸟噴呤，使得测定结果偏高。３２３２３、ｐ后标记法（ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎ）ｐｇ８－ＯＨｄＧ测定方法后标记法是目前灵敏度最高、应用最为广泛的。该方法的基本’－步骤是首先将完整的ＤＮＡ降解为脱氧３单核苷酸，然后在Ｔ４多聚核苷酸激酶的作用下，４ 西北大学硕士学位论文’’’３２Ｐ标记到单核苷酸的５－二将端，使之形成３，５磷酸核苗；再采用多向薄层层析（ＴＬＣ）３２５３［】分离出Ｐ标记的ＤＮＡ加合物最后通过放射性的量来定量８－ＯＨｄＧ。Ｍｕｌｌｅｒ和；５４Ｆ［］ａｒｏｉｎｂｉ等人研宄了柴油废气颗粒对小鼠的损伤，采用该方法测定了小鼠血液中８－ＯＨｄＧ含量，结果发现；长期处在柴油废气颗粒环境中的小鼠比正常情况的小鼠体内５５ｔ］－Ａｒｉ等人先对样品进行了微量薄层层析处理的８ＯＨｄＧ含量明显要高。Ｇｕｐ＿ｆ，然后３２Ｐ后标记法８－ＯＨｄＧ的＜采用测定了雌性小鼠组织中含量，该方法灵敏度高（１７－－８ＯＨｄＧ／ｌＯｄＧ）、用样量少（１１０ｉ）。该方法使用的放射性元素会对实验人员身体造［ｇ成损害，实验废弃物处理不当还会污染环境。４、高效毛细管电泳法（ＨＰＣＥ）１＾£￡－＾￡具有分析时间短、选择性好等优点，广泛用于测定８ＯＨｄＧ。Ｚｈａｎｇ等人５［力先对尿液进行了ＳＰＥ处理－，然后釆用毛细管电泳法测定了８０Ｈ（ｉＧ含量。Ｚｈａｎｇ等人建－－－ＣＥＥＤ－ＯＨｄＧ的水２立了ＳＰＭＥＭＩＭＣ法来测定尿液中８．６平，该方法检出限低（１一－ｍｏｎｍｏｌ／Ｌ）、线性范围宽（０．０１１．５０ｌ／Ｌ）。要想进步提高检出限，ＨＰＣＥ和ＥＤ联合使ｎ用是不错的选择。该方法测定前需要对样品进行复杂预处理，分析时间长。５、酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）ＥＵＳＡ法的原理是应用单克隆抗体检测加合物的技术。它的优点是重复性好、样品一处理简单、测定时间短、无需昂贵仪器，是种很有应用价值的方法Ｕｈｒｉｇ和６ｉＫｎｏｂ［Ｉｌｏｃｈ等研宄员为了研究食用黑树莓和口腔癌症风险之间的关系，通过长期观测测－黑树莓消除ＲＯＳ的能力试者尿液中８ＯＨｄＧ的含量，来评价。该方法的不足之处是干扰ＥＬＩＳＡ法的因素较多，交叉反应导致测量结果偏高。－表．１８ＯＨ（ＩＧ检教法的比较１常用的Ｉ方方法优点缺点ＨＰＬＣ－ＥＣＤ灵敏度高、检出限低需预处理，仪器昂贵ＧＣ／ＭＳ灵敏度高、方法稳定需衍生化，前处理复杂３２ｐｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ灵敏度高放射性污染ＨＰＣＥ检测速度快、样品处理简单需预处理，耗时ＥＬＩＳＡ特异性强、灵敏度高干扰因素多，结果偏高５ 第一章绪论１．２本论文研究内容及其意义目前，体外研宄ＤＮＡ氧化损伤，大多数方法都是通过分析损伤产物而建立起来的。一８－ＯＨｄＧ的含量些问题这些方法虽然可以测定，但是也存在，样品需要复杂的预处理、分析时间长、污染环境，精密度不高、大部分仪器昂贵难以作为常规分析手段、无法实一。、现在线快速检测等。如表１．１所示因此建立种分析速度快灵敏度高、操作简单、连８－ＯＨｄＧ的续检测分析方法迫在眉睫。本论文建立了高效评价ＤＮＡ氧化损伤的化学发光方法，利用轻基自由基在损伤ＤＮＡ过程中发光现象，评价了蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力。该方法操作简单、样品无需预处理、干扰少、灵敏度高、可在线快速测定。该方法在蜂蜜、饮料、茶叶浸取液等液体保健品的各种抗氧化能力的评价和对ＤＮＡ氧化损伤保护能力评价，以及抗氧化食物的开发等方面有一定的应用前景。全文分为四章，主要内容如下：１．在综述中详细阐述了ＤＮＡ氧化损伤的产生原因、损伤过程、巨大危害以及ＤＮＡ氧化损伤产物的检测方法。２．、釆用流动注射化学发光法研宄了不同蜂蜜的抗氧化能力，即超氧阴离子自由基轻基自由基和过氧化氢三种活性氧的清除能力，比较了荞麦蜂蜜、龙眼蜂蜜、槐花蜂蜜、油菜蜂蜜四种蜂蜜的抗氧化能力。３．建立测定了评价ＤＮＡ氧化损伤的流动注射化学发光新方法，并将其成功用于评价蜂蜜的ＤＮＡ抗氧化能力，并对发光机理进行了研究。４．运用多种方法探究了蜂蜜的保护对ＤＮＡ氧化损伤的机理。参考文献［１］ＲＩＣＨＡＲＤＳＭ．ＨｏｗＤｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｉｓＧｅｎｅｔｉｃＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ？［Ｊ］．ＳｔｕｄＨｉｓｔＰｈｉｌＢｉｏｌ＆ＢｉｏｍｅｄＳｃｉ，２００１，３２（４）：２５２ｅｂｅｌｓｔｕ．．ｅｒＩｉｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＳｉｎａｉｎｉｎｌｓｅｒＨｏｘｉａ：ＵｓｅｏｆＨｐＫＨＭｅｌｌ．Ｍ．ＭｔｌＰａｎｔＵｎｄ［］，ｇｇｙｐＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ａｎｄＲｅａｃｔｉｖｅＮｉｔｒｏｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ（ＲＮＳ）（Ｍ］／／ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎａｎｄＮｉｔｒｏｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓＳｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｌａｎｔｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒｎｅｒｎａｎａ－ＩｔｔｉｏｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ２０１５：６３７７，６ 西北大学硕士学位论文３ＷＩＳＥＭＡＮＨ．ＨＡＬＬＩＷＥＬＬＢ．ＤａｍａｅｔｏＤＮＡｂＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎａｎｄＮｉｔｒｏｅｎ［］，ｇｙｙｇｇＳｐｅｃｉｅｓ：ＲｏｌｅｉｎＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＤｉｓｅａｓｅａｎｄＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｔｏＣａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｏｕｒｎａｌ６－１９９３１３Ｐｔｌ：１７２９ｊ，，（）４ＭＩＫＫＥＬＳＥＮＲ．Ｂ．ＷＡＲＤＭＡＮＰ．ＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｏｆＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎａｎｄ［］，ｇｙｙｇ－ｎａＮｉｔｒｏｅｎａｎｄＲａｄｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄＳｉｇｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｅｎｅ２００３ｇｇ，，－２２３７：５７３４５７５４（）５ＪｉｓｕｎＬ．ＳａｍａｎｔｈａＧ．ＪｉａｎｈｕａＺ．ＡｕｔｏｈａＭｉｔｏｈｏｎｄｒｉａａｎｄＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｅｓｓ：［］，，ｐｇｙ，ｃｔｒ－Ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋａｎｄＲｅｄｏｘＳｉｎａｌｉｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２０１２４４１２：５２３５４０ｇｇ，，（）［６］ＸｕＪ．，ＷａｎｇＹ．Ｔ，，ＷａｎｇＸ．Ｙ．，ｅｔａｌ．ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｏｆＨ－ｉｈＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＳｏｙｂｅａｎＭｅａｌＰｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＨｉｈＰｒｅｓｓｕｒｅｓＣ／／ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｔｅｒｉａｌｓｇｇ［］ｅｓｅａｒｃｈ－２４Ｒ，２０１５１０９２：１１１５，５９７ＲａｉｎｓＪ．Ｌ．ＪａｉｎＳ．Ｋ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＩｎｓｕｌｉｎＳｉｎａｌｉｎａｎｄＤｉａｂｅｔｅｓＪ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌ［］，，ｇｇ，［］Ｂ－ｉｏｌｏａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１１５０５：５６７５７５ｇｙ，，（）［８］ＳｃｈｕｍａｃｋｅｒＰ．Ｔ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓｉｎＣａｎｃｅｒ：ＡＤａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅＤｅｖｉｌ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒｃｅ－ｌｌ２０１５２７２：１５６１５７，，（）ｔ９ＫｌａｉｍｉＪＥＫａｍｅｎｄｕｌｉｓＬＭ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｏｘｉｄａｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｃａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｉｓＪ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．［］ｇ，［］ｇａｒｍａｃｏ－Ｐｈｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ２００４４４：２３９２６７，，１０ｃＣｏｒｄＪ－ｗｅｅｎＲｅｎ．Ｍ．ＯｘｅｎｄｅｒｉｖｅｄＲａｄｉｃａｌｓ：ＡＬｉｎｋｂｅｔｅｒｆｕｓｉｏｎＩｕｒａｎｄ［］ＭｙｇｐｊｙＩｎｆｌａｎｉｉｎａｔｏｎｅｒａｔｏｎｒｏｃｅｅｓ１７－ｉＣ／／Ｆｄｅ：２ｉｄｉｎｇ．９８７４６２４０２４０６［］ｐ，（）１１ＣａｄｅｔＪＤｏｕｋｉＴ”ＲａｖａｎａｔＪ．Ｌ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅｌＧｅｎｅｒａｔｅｄＢａｓｅＧａｍａｅｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＤＮＡ［］”ｙｇＪ－，ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１０４９１：９２１［］ｇｙ，，（）１２ＡｌｔｉｅｒｉＲＧｒｉｌｌｏＣ．ＭａｃｅｒｏｎｉＭ？ｅｔａｌ．ＤＮＡＤａｍａｅａｎｄＲｅａｉｒ：ＦｒｏｍＭｏｌｅｃｕｌａｒ［］，，，ｇｐＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｏＨｅａｌｔｈＩｍｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆ｒｅｄｏｘｓｉｎａｌｉｎ２００８１０５：ｐ［］ｇｇ，，（）８９１－９３８１３ＤｅＢｏｎｔＲ？ＶａｎＬａｒｅｂｅｋｅＮ．ＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎＨｕｍａｎｓ：ＡＲｅｖｉｅｗｏｆ［］，ｕａｎ－ｉａｉｖｓｉｓＱｔｔｔｅｄａｔａＪ．Ｍｕｔａｅｎｅ２００４１９３：１６９１８５［］ｇ，，（）ｃｏ－１４ＲｉＤ．ＭａｒｔｍＧｏｎｚａｌｅｚＡＤｉａｚＳｅｔａｌ．ＨｅａｖＭｅｔａｌｓＧｅｎｅｒａｔｅＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｎ［］，””ｙｙｇｅＳｐｅｃｉｅｓｉｎＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌａｎｄＡｑｕａｔｉｃＣｉｌｉａｔｅｄＰｒｏｔｏｚｏａＪ，ＣｏｍａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄ［］ｐｙ７ 第一章绪论ｍａｃｏ－ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｒｔＣ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏ＆Ｐｈａｒｌｏ２００９，１４９：９０９６Ｐｇｙｇｙ，（１）１５ＫｒｕｋｏｖａＮ．Ａ？ＤｕｂｏｖｓｋｉＩ．ＭＣｈｅｒｔｋｏｖａＥ．Ａ．ｅｔａｌ．ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＨａｂｒｏｂｒａｃｏｎ［］ｙ，ｙ”，ＨｅｂｅｔｏｒＶｅｎｏｍｏｎＴｈｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＰｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅＳｙｓｔｅｍ，ＴｈｅＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓａｎｄＥｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎＩｎＴｈｅＨａｅｍｏｌｙｍｐｈｏｆＧａｌｌｅｒｉａＭｅｌｌｏｎｅｌｌａｅｒｎａｏｆｓ－ＬａｒｖａＪ．Ｊｏｕｌｉｎｓｅｃｔｈｉｏｌｏ２０１１５７６：７９６８００［］ｐｙｇｙ，，（）１６ＯｌａｄｅｎＴ．ＢｌａｕＮ．ＲａｍａｅｋｅｒｓＶ．Ｔ．ＥｆｅｃｔｏｆＡｎｔｉｅｉｌｅｔｉｃＤｒｕｓａｎｄＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎ［］ｐ，，ｐｐｇｙｇ－Ｓｐｅｃｅｓｎｏａｅｃｅｏｒｅｅｎｄｅｎ－ｅａｈｒｏｆｒａｎｓｒｉＯＦｌｔＲｅｐｔ１ＦＯＬＲｌＤｔ５ＭｅｔｈｌｔｔｒｄｏＩａｔｅＴｏｔＪ．（）ｐｙｙｐ［］Ｍｏｔｃｓａｔ－ｌｅｃｕｌａｒｅｎｅｉｎｄｍｅａｂｏｌｉｓｍ，２０１０１０１１：４８５４，（）ｇ－１７ＳｒｉｖａｓｔａｖａＲＫ．Ｓｉｎ．Ｐ．ＰｒａｓａｄＳ．Ｍ．ＣｏｍａｉｂｉｌｉｏｆｃｏｒｂａｅＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＣｃｌｅ］，ｇｈＶ，ｔｔｙＡｓｔｙ［ｐＥｎｚｍｅｓａｎｏｂａｃｅａｏｗＡｎｄＨ－ｏｓｕｒｅｓＩｎＣｔｒｉａＡｉｎｓｔＬｉＵＶＢＥｘＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｙｇｇｈｐ，ｙＥｘｐｏｓｅｄｔｏＬｏｗａｎｄＨｉｇｈＤｏｓｅｓｏｆＣｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ［Ｊ］．Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｆｅ－ｔ２０１２８３：７９８８ｙ，，１８Ｐｒｉｅｍ＾Ｈ．ＬｏｆｔＳ．ＫｌａｒｌｕｎｄＭｅｔａｌ．ＥｆｅｃｔｏｆＳｍｏｋｉｎＣｅｓｓａｔｉｏｎＯｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡ［］，，，ｇ＇Ｍｏｄ－－－－－ｉｆｉｃａｔｉｏｎＥｓｔｉｍａｔｅｄｂ８ｏｘｏ７８ｄｉｈｙｄｒｏ２ＤｅｏｘｕａｎｏｓｉｎｅＥｘｃｒｅｔｉｏｎ．ｙ，ｙｇ［Ｊ］Ｃａｒｃ－ｉｎｏｅｎｅｓｉｓ１９９８１９２：３４７３５１ｇ，），（１９ＬｏｆｔＳ．ＰｏｕｌｓｅｎＨ．Ｅ？ＶｉｓｔｉｓｅｎＫ．ｅｔａｌ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄＵｒｉｎａｒｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆ［］，，，ｙＥ＇－－－ｍａｎ８ｏｘｏ２ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅＡＢｉｏｍａｒｋｅｒｏｆＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡＤａｅＩＵｒｂａｎＢｕｓＤｒｉｖｅｒｓ，ｇ，Ｊ，ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／ＧｅｎｅｔｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ１９９９４４１１；［］ｇｙ，，（）１－１１９［２０］ＫｌａｉｍｉｇＪ．Ｅ？，ＫａｍｅｎｄｕｌｉｓＬ．Ｍ．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓｉｎＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］，Ａｎｎｕ．ｅｖｈａｒｍａｃｏ－ｌｏｘｉｃｏ：Ｒ．Ｐ．Ｔｌ２００４４４２３９２６７，，［２１］ＶａｌｋｏＭ．，ＲｈｏｄｅｓＣ．Ｊ．，ＭｏｎｃｏｌＪ．，ｅｔａｌ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｓ，ＭｅｔａｌｓａｎｄＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓＩｎ－－Ｏｘ－ｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄＣａｎｃｅｒＪ］．Ｃｈｅｍｉｃｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ２００６１６０：１４０［ｇ，，（１）２２ＪｅＪ，Ｙ．ＰａｒｋＰ．Ｊ．ＫｉｍＳ．Ｋ．ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｏｆＡＰｅｔｉｄｅＩｓｏｌａｔｅｄＦｒｏｍＡｌａｓｋａ［］，，ｙｐＰｏｌｌａｃｋＴｈｅｒａｒａｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａＦｒａｍｅＰｒｏｔｅｉｎＨｄｒｏｌｓａｔｅＪ．ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈ（ｇ）ｙｙ［］ｎｔｅｒｎａｔ－Ｉｉｏｎａｌ２００５３８１：４５５０，，（）２３朱圣姬．三峡大学学张德莉，罗光富等自由基与ＤＮＡ氧化损伤的研宄进展Ｊ．［］，，［］－报：自然科学版２００５２６６：５６３５６７，，（）８ 西北大学硕士学位论文２４ｔａｒｅｅ－ｒａｄ－ＲｅＣｉｃａｌｉｎｃｅｄＤＮＡＤａｍａｅａｎｄａｉｒ，ｅｒｌｉｎ：Ｓｒｉｎｅｒ］ＶｏｎＳｏｎｎｇ．ＦｄｕｇＩｔｓｐＭＢｇ［［］ｐ，２００６２５Ｄ－ｉｚｄａｒｏｌｕＭ．ＪａｒｕａＲＢｉｒｉｎｃｉｏｌｕＭ．ｅｔａｌ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｉｎｄｕｃｅｄＤａｍａｅｔｏＤＮＡ：［］ｇ，ｇ，ｇ，ｇＭｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ１，２［Ｊ］．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００２，３２（１１）：１１０２－１１１５２６ＤｉｚｄａｒｏｌｕＭ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅｌｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡＤａｍａｅ：ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓＲｅａｉｒａｎｄＤｉｓｅａｓｅＪ．［］ｇｙｇ，ｐ［］ａｎｃｅｒ－Ｃｌｅｔｔｅｒｓ２０１２３２７１：２６４７，，（）＂＂２７ＢｉｌｌｅｎＤ．ＳｏｎｔａｎｅｏｕｓＤＮＡＤａｍａｅａｎｄＩｔｓＳｉｎｉｆｉｃａｎｃｅＦｏｒｔｈｅｎｅｌｉｉｂｌｅｄｏｓｅ［］ｐｇｇｇｇ－ＣｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｎＲａｄｉａｔｉｏｎＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＪ．ＲａｄｉａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１９９０１２４２：２４２２４５ｙ［］，，（）［２８］ＬｉｎｄｅｒＭ．Ｃ．ＴｈｅＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＣｏｐｐｅｒｔｏＤＮＡＤａｍａｇｅａｎｄＤａｍａｇｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｉｎＨｕｍａｎｓＪ．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［］，２０１２７３３１－：８３９１，（）２９高瑞霄姚朱华－ＯＨｄＧ与糖尿病性动脉粥样硬化相关性的研究进展［］，邵红霞．尿８，Ｊ－．天津医药３７９：８０９８１１［］，２００９，（）３０ＢｒｅｔｏｎＣ．Ｖ．ＫｉｌｅＭ．Ｌ．ＣａｔａｌａｎｏＰ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＧＳＴＭｌａｎｄＡＰＥｌＧｅｎｏｔｅｓＡｆｅｃｔ［］，，，ｙｐＡｒｓｅｎ－ｉｃｉｎｄｕｃｅｄＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｒｅｓｓ：ｅｅａｔｅｄｅａｓｕｒｅｓＳｕｄＪ．Ｅｎｖｉｒｏｎｅａｌｔｈ２００７６：ｔＡＲｐＭｔｙ［］Ｈ，，３９３－［１］米贤文．ＤＮＡ损伤生物标志物８经基脱氧鸟苷检测新方法及其应用研究［Ｊ］３２Ｓａｌｎｉｋｏｗ？ｉｋｏｖｉｃｈＡ．ｅｎｅｉｃａｎｄｉｅｎｅｉｃｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｅａｌａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｉｓ［］Ｋ，ＺｈｔＧｔＥｐｇｔＭＭｔＣｇａｎｄＣｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｎｉｃｋｅｌ，Ａｒｓｅｎｉｃ，ａｎｄＣｈｒｏｍｉｕｍＪ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｉｎ［］ｔｏｘ１－ｉｃｏｌｏ２００７２１：２８４４ｇｙ，，（）３３Ｋ－［］ｉｋｕｃｈｉＹ．ＹａｓｕｈａｒａＴ．ＡｇａｒｉＴｅｔａｌ．Ｕｒｉｎａｒ８ＯＨｄＧＥｌｅｖａｔｉｏｎｓｉｎａＰａｒｔｉａｌＬｅｓｉｏｎ，，；ｙＲａ＇ｔＭｏｄｅｌｏｆＰａｒｋｉｎｓｏｎｓＤｉｓｅａｓｅＣｏｒｒｅｌａｔｅＷｉｔｈ．ＢｅｈａｖｉｏｒａｌＳｙｍｐｔｏｍｓａｎｄＮｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌＤｏａｍ－ｉｎｅｒｉｃＤｅｐｌｅｔｉｏｎＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｈｓｉｏｌｏ２０１１２２６５：１３９０１３９８ｐｇ［］ｐｙｇｙ，，（）３４ＹａｎｏＴＳｈｏ－ｉＦ．ＢａｂａＨ．ｅｔａｌ．ＳｉｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｔｈｅＵｒｉｎａｒ８ＯＨｄＧＬｅｖｅｌａｓａｎ［］”ｊ，，ｇｙｔ－ＯｘｉｄａｉｖｅＳｔｒｅｓｓＭａｒｋｅｒｉｎＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＰａｔｉｅｎｔｓＪ．ＬｕｎＣａｎｃｅｒ２００９６３１：１１１１１４［］ｇ，，（）３５ｓｈｉｔａＹａ－Ｍｏｒｉ．ＷａｔａｎａｂｅＭ．ＨｉｒａｈａｒＩ？ｅｔａｌ．Ｌｅｖｅｌｏｆ８ＯＨｄＧｉｎＤｒａｉｎｅｄＤｉａｌｓａｔｅ［］，，，ｙＡｐｐｅａｒｓｔｏＢｅａＭａｒｋｅｒｏｆＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＤａｍａｇｅＩｎＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＤｉａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 第一章绪论ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙａｎｄＲｅｎｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅ，２０１２，５：９３６ＢｏｒｏｗｓｋＢ．ＷａｒｎｅｒＪ．ＭａｔｓｏｎＷ”ｅｔａｌ．Ｆ１４８０ＨｄＧｉｓＮｏｔａＢｉｏｍａｒｋｅｒｆｏｒ［］ｙ，，＇ＨｕｎｔｉｎｔｏｎｓＤｉｓｅａｓｅＬｅｓｓｏｎｓＦｏｒＦｕｔｕｒｅＢｉｏｍａｒｋｅｒＳｔｕｄｉｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇ；［］ｇｙ，＆－ＮｅｕｒｏｓｕｒｅｒＰｓｃｈｉａｔｒ２０１２８３Ｓｕｌ１：Ａ２５Ａ２６ｇｙｙｙ，，（ｐｐ）－－３７ＳｅｒｄａｒＭｅｒｔｏａｎｔ－ＳｌｕＥ．ＵｉｋＭ．ｅａｌ．Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆ８ｈｄｒｏｘ２ｄｅｏｘｕａｎｏｓｉｎｅ［］”ｇ，ｙ，ｐｙｙｙｇ８－ＯＨｄＧＬｅｖｅＭａｓ（）ｌｓＵｓｉｎｓＳｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒａｎｄＵｒｉｎｅＡｌｂｕｍｉｎＣｒｅａｔｉｎｉｎｅＲａｔｉｏａｓａｇｐＰｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＮｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，４６（１０）：－１２９１１２９５［３８］ＯｒｓｕｃｃｉＤ，，ＭａｎｃｕｓｏＭ．，ＣａｌｄａｒａｚｚｏｌｅｎｃｏＥ？，ｅｔａｌ．ＶａｓｃｕｌａｒＦａｃｔｏｒｓａｎｄＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｏｅａ＇Ｄｓｆｕｎｃｔｉｏｎ：ＡＣｅｎｔｒａｌＲｌｉｎｔｈｅＰｔｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒｓｄｉｓｅａｓｅＪ．Ｃｕｒｒｅｎｔｙｇ［］ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕ－ｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈ２０１３１０１：７６８０，，（）ａＸ．ｅａｌｘｉｄａｉｖｅＳｅｓｓａｎｄｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｉｏｎｉｎ３９Ｗｎｇ．ＷａｎｇＷ．，ＬｉＬ，ｔ．ＯｔｔｒＭｉｔｏＤｙｆｉｉｎｃｔ［］，＇ｏｃｈｅａ－ＭｏＡｌｚｈｅｉｍｅｒｓｄｉｓｅａｓｅＪ．Ｂｉｉｍｉｃａｔｌ．ＢｉｏｈｓｉｃａＡｃｔａＢＢＡｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆ［］ｐｙ（）Ｄ１４０－ｉｓｅａｓｅ２０１４８４２８：１２１２４７，，（）４０ＣｉａｎｃａｒｅｌｌｉＩ．ＤｅＡｍｉｃｉｓＤ？，ＤｉＭａｓｓｉｍｏＣｅｔａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＩｎｔｅｎｓｉｖｅＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ［］，”Ｎｅ＇ｅｕｒｏｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎｏｎＮｅｕｒｏｎａｌＯｘｉｄａｔｉｖＤａｍａｅＩｎＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈＨｕｎｔｉｎｔｏｎｓＤｉｓｅａｓｅｇｇｎｃ－Ｊ．Ｆｕｔｉｏｎａｌｎｅｕｒｏｌｏ２０１４：１６［］ｇｙ，４１ＳｈｕｋｌａＳＳｒｉｖａｓｔａｖａＪＫＫａｎｗａｌＲｅｔａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｔａｔｕｓｉｎ［］，，，－ｈｉｈｒｉｓｋｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｓｕｂｅｃｔｓＪ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２０１３７３８Ｓｕｌｅｍｅｎｔ：９ｇｐｊ［］，，（ｐｐ）＇ｎａ－－－４２ＫａｓａｉＨ．ＡｌｓｉｓｏｆａｆｏｒｍｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅ８ｈｄｒｏｘｙ２ｄｅｏｘｕａｎｏｓｉｎｅａｓ［］ｙ，ｙｙｇ，ｓｔｒｅｎｅａｃｈＲｓａｍａｒｋｅｒｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｓｓｄｕｒｉｎｇｃａｒｃｉｎｏｓｉｓＪ．ＭｕｔｔｉｏｎＲｅｓｅａｒ／ｅｖｉｅｗｇ［］－ｉｎＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１９９７３８７３：１４７１６３，，（）＇－－－－？ＶｌａｃｈｏｉａｎｎｉｉｏｔａｋｉｓＣ８ｈｄｒｏｘｄｅｏｘｕａｎｏｓｍ８：ａ４３ＶａｌａｖａｎｉｄｉｓＡＴ．Ｆ．２ｅＯＨｄＧ［］，ｇｙｇ（），ｙｙＣｒｉｔｉｃａｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｏｆＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓａｎｄＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ［］ｃ－ｓｉｅｎｃｅａｎｄｈｅａｌｔｈＰａｒｔＣ２００９２７２：１２０１３９，，（）＇－－－４４ＫｕｏＨｅａｎａｒｙ－ｓｎｅ．Ｗ．ＣｈｏｕＳ．Ｙ．ＨｕＴＷｔｌ．Ｕｒｉ８ｈｙｄｒｏｘｙ２ｄｅｏｘｕａｎｏｉ８ＯＨｄＧ［］，，，ｙｇ（）ｍｏｒｈｓｓｔａｎｃｅ－ｍｄＧｅｎｅｔｉｃＰｏｌｙｉｓｍｉｎＢｒｅａＣｒＰａｔｉｅｎｔｓＪ．ＭｕｔａｔＲｅｓ２００７６３１：６２６８ｐ［］，，－４５．梅素容，王鹏／ＭＳ法测定尿中的８经基脱氧鸟苷Ｊ．华中科技大［，吴釆樱等ＧＣ］［］１０ 西北大学硕士学位论文学学报－，２００６，３４５：１１８１２０６４（）－－４６．梅索容，蔡凌霜，姚庆红等毛细管电泳柱未端安培检测癌症患者尿中８经基脱［］Ｊ－．２００３２４１１：１９８８９氧鸟苷［］高等学校化学学报，，（）７１９４７ＩｎａｂａＹ．ＫｏｉｄｅＳ．ＹｏｋｏａｍａＫ．ｅｔａｌＤｅｖｅｌｏｅｎｔｏｆＵｒｉｎａｒ［］，，ｙ，ｐｍｙ－－－ｕｎｏｓ－８ｈｙｄｒｏｘ２ｄｅｏｘａｉｎｅ（８ＯＨｄＧ）ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＭｅｔｈｏｄＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＳＰＥＪ．ｙｙｇ［］ｕｒｎａ－Ｊｏｌｏｆｃｈｒｏｍａｔｏｒａｈｉｃｓｃｉｅｎｃｅ２０１１４９４：３０３３０９ｇｐ，，（）－ａｃ＿４８ＬｉｕＥ”ＮｏｅＢｒａｎｄｏｎＳ．Ｐｒｔｉｃｅ２４：Ｒｉｄｅｔｈｅｚａｘｉｓ：ＦｉｎｄＥｌｅｍｅｎｔａｌＦｏｒｍｓＴｈｅｎ［］ｐｐ，Ｐ－ｌａｙｗｉｔｈＳｃａｌｅＪ．ＩｍａｉｎａｔｉｏｎＦｉｒｓｔ：ＵｎｌｏｃｋｉｎｔｈｅＰｏｗｅｒｏｆＰｏｓｓｉｂｉｌｉｔ１６４１６９［］ｇｇｙ，［４９］ＷａｎｇＴ．Ｃ，ＳｏｎｇＹ．Ｓ？，ＷａｎｇＨ，ｅｔａｌ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡＤａｍａｇｅａｎｄＧｌｏｂａｌＤＮＡｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＦｏｌａｔｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎＣｈｒｏｍａｔｅＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎＷｏｒｋｅｒｓＪ，ｇ［］－Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ：ｈａｚａｒｄｏｕｓｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，２１３４４０４４６Ｌ－［５０］ｉＹ．Ｓ？ＳｏｎＭ．ＦＫａｓａｉＨ．ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＴｈｒｅｓｈｏｌｄＬｅｖｅｌｏｆ８ＯＨｄＧａｓ，ｇ”，ＯｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡＤａｍａｇｅＥｌｉｃｉｔｅｄｂｙＬｏｗＤｏｓｅＩｏｎｉｚｉｎｇＲａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＧｅｎｅｓａｎｄＥｎｖｒｏｎｍｅｎ－ｉｔ２０１３３５３：８８９２，，（）５１ＫｏｉｄｅＳ？ＫｉｎｏｓｈｉｔａＹＩｔｏＮｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＳｅｒｕｍ［］，””－－ｈｄｒｏｘ－－ｄｅｏｘｎａｎｏｓ８ｂ－ｅｄａｓｅ８ｙｙ２ｙｇｉｎｅＯＨｄＧｙＨＰＬＣＥＣＤＣｏｍｂｉｎＷｉｔｈＳｏｌｉｄＰｈ（）ｃｒｏｍａｔｏｒａ－ＥｘｔｒａｔｉｏｎＳＰＥＪ：．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｈＢ２０１０８７８２３２１６３２１６７）［］ｇｙ，，（）（ｐ５２Ｒｏｄｒ－ｉｕｅｚＨ．ＪｕｒａｄｏＪ？ＬａｖａｌＪ．ｅｔａｌ．ＣｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅＬｅｖｅｌｓｏｆ８Ｈｄｒｏｘｘｉａｎｉｎｅｉｎ［］ｇ，，，ｐｙｙｇＤＮＡａｓＭｅａｓｕｒｅｄｂｙＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈＭａｓｓＳｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＦｏｌｌｏｗｉｎＨｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｇｐｙｐｇｙＤＮＡｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＦｒｏｔｅｉｎｏｒＦｏｒｍｉｃａｃｉｄＪ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ２０００ｐｇＰ［］，，２８－１５：ｅ７５ｅ７５（）—５３．３２Ｐ后标记法检测ＤＮＡ加合物研宄进展Ｊ．中国公共［］姚群峰，徐顺清，周宜开［］２０００１６－卫生１１）：１０４５１０４７，，（［５４］ＭｕｌｌｅｒＡ．Ｋ．，ＦａｒｏｍｂｉＥ．Ｏ？，ＭｏｌｌｅｒＲ，ｅｔａｌ．ＤＮＡＤａｍａｇｅｉｎＬｕｎｇＡｆｔｅｒｏｒａｌＥｘｐｏｓｕｒｅｔｏＤｉｅｓｅｌＥｘｈａｕｓｔＰａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＢｉＢｌｕｅ？ＲａｔｓＪ．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌａｎｄｇ［］Ｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＭｕｔａｅｎｅｓｉｓ２００４５５０１：１２３１３２ｇ，，（）Ｇｕａ－５５ｔＲ．Ｃ．ＡｒｉｆＪ．Ｍ．Ａｎｉｍｒｏｖｅｄ３２ＰｏｓｔｌａｂｅｌｉｎＡｓｓａＦｏｒｔｈｅＳｅｎｓｉｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ［］ｐ，ｐｐｇｙ－Ｊｔｉ２００１１４８ｏｆ８ｏｘｏｄｅｏｘｕａｎｏｓｉｎｅｉｎＴｉｓｓｕｅＤＮＡ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｏｘｃｏｌｏ：ｙｇ［］ｇｙ，，（）１１ 第一章绪论９５－１９５７［５６］ＺｈａｎｇＰ．，ＬｉａｎＫ．，ＷｕＸ”ｅｔａＬＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＯｘｉｄａｔｉｖｅＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ＇－ＤａｍａｅＢｏｍａｒｋｅｒｒｏ－－ｄｅｏｘｕｓｉｉｅｎｔｈｅｏｆｅｕｅｍｃｅｎｇｉ８ｈｙｄｘｙ２ｙｇａｎｏｉｉＵｒｉｎｅＬｋｉＣｈｉｌｄｒｂｙＭｉｃｅｌｌａｒＥｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃＣａｉｌｌａｒＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈＡ２０１４ｐｙｇｐｙ［］ｇｐｙ，，－１３３６：１１２１１９５７ＺｈａｎＳ．ＳｏｎＸ－ＺｈａｎＷｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＬｏｗＵｒｉｎａｒ［］ｇ，ｇ，ｇ”ｙ－－＂ｕ８ｈｙｄｒｏｘｙ２ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅＥｘｃｒｅｔｉｏｎＷｉｔｈＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄＭｏｌｅｃｌａｒｌｙＩｍｒｉｎｔｅｄＭｏｎｏｌｉｔｈＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＭｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＪ．ＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｐ［］，２０－１３４５０：２６６２７０，５８ＹａｎｏＴｅａｎｃａｎｃｅｏｆｅｒｎａ－ｅｖｅａｓａｎ．ＳｈｏｉＦ．ＢａｂａＨ．ｔｌ．ＳｉｉｆｉｔｈＵｉｒ８ＯＨｄＧＬｌ［］，ｊ，，ｇｙｅｒ－ＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＭａｒｋｅｒｉｎＬｕｎＣａｎｃｅｒＰａｔｉｅｎｔｓＪ．ＬｕｎＣａｎｃ２００９６３１：１１１１１４ｇ［］ｇ，，（）［５９］ＰａｔｅｌＰ．Ｒ．，ＢｅｖａｎＲ．Ｊ．，ＭｉｓｔｒｙＮ．，ｅｔａｌ．ＥｖｉｄｅｎｃｅｏｆＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ＇－８ｈｄｒｏｘ－２－ｄｅｏｘｉａｎｏｓｉｉｒｉｎｒｅｅｉｃａｏｉｎｅｎＨｕｍａｎＵｅＪ．ＦＲａｄｌＢｉｌｏａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅｙｙｙｇ［］ｇｙ，２００７４２４－：５５２５５８，（）［６０］ＺｈｅｎｇＪ．，ＩｎｏｇｕｃｈｉＴ．，ＳａｓａｋｉＳ．，ｅｔａｌ．ＰｈｙｃｏｃｙａｎｉｎａｎｄＰｈｙｃｏｃｙ池ｏｂｉｌｉｎｆｒｏｍＳｐｉｒｕｌｉｎａＰｌａｔｅｎｓｉｓＰｒｏｔｅｃｔＡａｉｎｓｔＤｉａｂｅｔｉｃＮｅｈｒｏｐａｔｈｂｙＩｎｈｉｂｉｔｉｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＪ．ｇｐｙｇ［］ｅｒｃａｎＪｏｕｒｎａ－ＡｍｉｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏＲｅｕｌａｔｏｒＩｎｔｅｒａｔｉｖｅａｎｄＣｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏｇｙｇｙ，ｇｐｙｇｙ，２０－１３３０４２：Ｒ１１０Ｒ１２０，（）６１Ｕｈｒｉ．Ｋ．ＫｎｏｂｌｏｃｈＴ．Ｊ．ＣａｓｔｏＢ．Ｃ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆＡｄｈｅｒｅｎｃｅａｎｄＥｆｉｃａｃ：［］ｇＬ，，，ｙａ－ＭｏｄｕｌｔｉｏｎｏｆＢｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆＤＮＡＤａｍａｇｅｉｎａＰｈａｓｅｌｂｔｒｉａｌｏｆＰｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌＯａｌＣａｎｃｅｒＰａＬｏｎ－ｔ－ｔｔｔＪｔｉｅｎｔｓｏｎａｇｅｒｍＦｏｏｄｂａｓｅｄＰｒｅｖｅｎｉｏｎＳｕｄｙｗｉｈＢｌａｃｋｒａｓｐｂｅｒｒｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ［］Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０１３７３８－４６Ｓｕｌｅｍｅｎｔ：４６８０８０，，（ｐｐ）１２ 西北大学硕士学位论文第二章ＦＩ－ＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价２．１引言正常的生理条件下，呼吸作用产生的ＲＯＳ和抗氧化体系对ＲＯＳ的消除处于平衡状态。但是当内源性或外源性物质侵入机体后，平衡被打破，导致ＲＯＳ在体内过剰，该现象称为氧化应激大量的ＲＯＳ会攻击生物大分子，造成严重的损伤，导致糖尿病、４＿癌症［、、帕金森综合症等多种疾病一种营养价值很髙的天然甜味食物蜂蜜是，深受消费者喜爱。它含有大约２００种８］［物质，主要包括葡萄糖和果糖等糖类、氨基酸、有机酸、酶、维生素、矿物质和水等９［］。、、研究表明：酷酸类黄酮类维生素、类胡萝卜素等物质是蜂蜜中主要的抗氧化剂ｉＧ［］。，它们在体内外都有十分显著的抗氧化活性因此蜂蜜具有促进抑菌、促进伤口愈合、治疗胃溃癌和预防多种疾病的作用。目前评价蜂蜜抗氧化活性大多是通过下面这些指标来反映蜂蜜抗氧化活性的。这些方法主要包括：ＤＰＰＨ自由基消除能力、ＡＢＴＳ自由基消除能力、对氧自由基的消除能力（ＯＲＡＣ法）、脂质过氧化抑制作用、还原能力、总抗氧化能力、对ＤＮＡ氧化损伤的１４［］等保护作用、对ＲＯＳ的消除能力。评价的方法主要有：高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）、分１５＿２６［］光光度法、化学发光法（ＣＬ）电子自旋共振法（ＥＳＲ）、电化学和焚光光谱法。在、、、众多的消除活性氧自由基的评价方法中，化学发光以其灵敏度高仪器简单操作方便２７＿３。［］样品无需预处理等优点，受到研宄者的广泛关注。－，本章采用化学发光法评价了蜂蜜对三种ＲＯＳ的消除能力：即用连苯三紛鲁米诺．化学发光体系评价了蜂蜜对超氧阴离子自由基Ｃｏ－（Ｏｒ）的消除能力，用（ＩＩ）／ＥＤＴＡ鲁米诺化学发光体系评价了蜂蜜对经基自由基ＧＯＨ）的消除能力－，用鲁米诺过氧化氢化学发光体系研究了蜂蜜对过氧化氧的消除能力。分别计算出蜂蜜对这三种ＲＯＳ的ＩＣ５０值（ＩＣ５０值为蜂蜜对某种自由基的抑制率５０％时，蜂蜜的浓度），并根据ＩＣ５０值的大小比较了各种蜂蜜的抗氧化活性。１３ 第二章Ｆ－ＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价Ｉ２．２实验部分２．２．１试剂－２ｉ＿＞＜鲁米诺（１．０１０ｍｏｌＩ／）储备液ｍａ公司，分析纯）０．４４２８：称取鲁米诺（美国Ｓｉｇ－－ＬＯ２５０ＮａＯＨ溶液（２５ｍＬｌ．ＯｍｏｌｍＬ的。ｇ，先用溶解，再用超纯水定容于容量瓶中避光保存。实验中所需的低浓度溶液可由此溶液用超纯水稀释获得。－２－ｘ－连苯三酷（１．０１０ｍｏｌＬ０储备液：称取０．１２６１连苯三酌（天津市科密欧化学ｇ－？－，用ｌ．ＯＯｍＬ的ＨＣ．０ｍｏｌＬ至试剂有限公司，分析纯）１（１）溶解，然后用超纯水定容１００ｍＬ。低浓度的连苯三酷溶液用超纯水稀释即可。－ｂｅｄｆｏｒｄ过氧化氢溶液现配现用。实验中所用的超纯水均由ＭｉｌｌｉＱ（Ｍｉｌｌｉｏｒｅｐ，，ＭＡＵＳＡ）。，超纯水机制备得到２．２．２仪器ＩＦＦＭ－Ｄ型流动注射化学发光仪（西安瑞迈电子科技有限公司，中国）是由具有高精度的双禱动栗数控宽调速注射进样系统和光电检測器组成，聚四氟乙稀软管ＰＴＦＥ一（，０．８ｍｍｉ．ｄ．）连接实验装置的各个组件。个石英玻璃盘管（２５ｃｍ，２．０ｍｍｉ．ｄ．）构成了仪器的流通池。它放置在光电倍增管（ＰＭＴ）上面。流通池和光电倍增管置于完全密封避光状态。检测到的发光信号被计算机收集和处理。２．２．３蜂蜜试样的处理分别在宁夏、陕西、广西、江苏、四川等地釆集了荞麦蜂蜜、龙眼蜂蜜、槐花蜂。蜜和油菜蜂蜜等四种共８个样品，每个样品分不同时间取了８个批次，进行相关实验－ｉ－。蜂蜜详细信息见表２．１称取５蜂蜜试样用超纯水溶解后配制成浓度为０．１ｍＬ的蜂ｇｇ°蜜试样溶液。放置在４Ｃ冰箱中保存备用。表２．１蜂蜜试样信息试样编号／名称／产地信息试样编号／名称／产地信息Ｓ１荞麦蜂蜜（中夏银川）Ｓ２养麦蜂蜜（陕西靖边）Ｓ３龙眼蜂蜜（福建潭州）Ｓ４龙眼蜂蜜（广西南充）Ｓ５槐花蜂蜜（陕西宝鸡）Ｓ６槐花蜂蜜（陕西安康）Ｓ７油菜蜂蜜（江苏东台）Ｓ８油菜蜂蜜（四川江油）１４ 西北大学硕士学位论文２．２．４超氧阴离子自由基消除能力的测定３１一运用鲁米诺－连苯三紛体系［］来测定系列蜂蜜试样对超氧阴离子自由基的消除能力＝。连苯三酷在ｐＨ１０．２的碳酸盐缓冲溶液中自氧化生成超氧阴离子，活拨的超氧阴离子和鲁米诺发光试剂作用发光。实验中按照图２．１所示连接流路，将各个管路用蒸馆＂＾－ｘｍｏ．三紛溶液（６ｌ水清洗干净后，插入到相应的溶液中，连苯．３１０Ｌ０和鲁米诺溶液－ｘ－３ｍｏ（１．０１０ｌＬ０在續动菜的输送作用下先混合，然后由六通进样阀将上述混合液注＝入到碳酸盐缓冲溶液（ｐＨ１０．２）中，最后和试样溶液混合，记录发光信号Ｉｓ。以水作为空白溶液代替样品溶液可得空白。Ｉ。ＰａＦｂＷ＠－：ｚｉ＝＞ｆｙ￣￣ＰＣＩ２１图．流动注射化学发光分析评价超氧明离子自由基洧除能力示意图Ｐ：螺动栗，Ｖ：六通进样阀，Ｆ：混合器，Ｗ：废液Ｄ：检测器ＰＣ：电脑ａ试样ｂ碳酸缓冲溶液，Ｃ鲁米诺溶液，ｄ连苯三紛一按照上述实验方法Ｉ，测定空白时的化学发光信号为。和系列不同浓度的蜂蜜样品的化学发光信号为Ｉｓ，各个化学发光信号数据分别测定３次，取其平均值记录。可利用下式计算发光信号的抑制率，％）＝（ｌ－Ｉ）／ＩｏＸｌＯＯ％（２抑制率（ｏｓ．１）以化学发光抑制率为纵坐标，可绘制出样品的抑制率曲线，，样品的浓度为横坐标然后求得对应的ＩＣ５０。２．２．５轻基自由基消除能力的测定２＋３２－－［］在本实验中用ＣｏＥＤＴＡ鲁米诺－过氧化氢体系来评价蜂蜜试样消除轻基自由２＋基能力－ＥＤＴＡ－。同样按照２．１所示连接流路进行实验，首先，Ｃｏ鲁米诺溶液和碳酸盐＿ｉ＝缓冲溶液（０．１ｍｏｒＬｐＨ９．０）通过混合器混合，由六通进样阀将混合液注入到缓冲溶ｌ液中，再通过混合器和试样溶液混合。当以水替代样品溶液时的发光强度为空白ｏ，注１５ 第二章ＦＩ－ＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价入样品时的发光信号为Ｉ。抑制率计算如公式（２．１）。ｓ２．２．６过氧化氢消除能力的测定３３】－［在实验中釆用Ｈ２Ｏ２鲁米诺体系来评价蜂蜜消除过氧化氢的能力。按照图２．１所＂＿＿＾ｉｉ．。＞＜１０）和过ｎｏ示连接流路鲁米诺溶液（ｌｍｏＬＬ氧化氢溶液（０．１５ｉｌＬ）通过混合器＿ｉ＿＝混合．０５ｍｏｌＬＨ９．４）中，此，借助六通进样阀将上述混合液注入碳酸盐缓冲溶液（０ｐ时发生化学发光反应，以样品为水时的发光强度为空白Ｉ。，以注入样品时的发光强度为Ｉｓ。过氧化氢消除能力的计算公式如（２．１）所示。２．２．７蜂蜜中总酣酸（ＴＰＣ）及总黄酮（ＴＦＣ）含量的测定１．蜂蜜中ＴＰＣ含量的测定３４［】蜂蜜中ＴＰＣ含量的测定采用的是福林粉比色法。（１）标准曲线的绘制＿ｉ２＊，，ｍＬ的原（１ｉｎｍＬ分别移取０．０，０．，０．４，０．６，０．８１．０１．２儿茶酸标准品溶液０．ｇ）ｉ于７个容量瓶中，然后依次加入１ｍＬ的福林酷显色剂、５ｍＬ的碳酸钠溶液（１ｍｏｌｔ），５－混合均勾。再用超纯水定容。摇匀后在室温避光条件下放置６０ｍｉｎ。在ＵＶ７１ＧＤ分光光度计上测定７６０ｎｍ处的吸光度。以吸光度对浓度作图得到标准曲线。（２）蜂蜜中总酷酸的测定－ｍＬ的福林酌显色ｍＬ的．０１ｍＬＯ试样和１移取１蜂蜜溶液（０剂混勾，然后加ｇ－ｉ－至入５ｍＬ的碳酸钠溶液（１ｍｏｌＬ），定容１０ｍＬ，混合均勾。室温避光条件下放置１ｈ。５－记录ＵＶ７１ＧＤ分光光度计７６０ｎｍ处的吸光度。２．蜂蜜中ＴＦＣ含量的测定３５ＴＦＣ含量的测定［］蜂蜜中釆用的是丛等人报道的方法。（１）标准曲线的绘制ｉ．ｍｍＬ分别移取０，１，２，３，４，５ｍＬ声丁标准品的溶液（０．２ｍｇｌ／）到２５的容＂＇ｍＬ的－ｍ量瓶中，每瓶依次加入６超纯水和１ｍＬ的ＮａＮ０２（２５Ｌ，混勾放置６ｉｎ后加ｇ）－ｉ－ｉ．．５０Ｌ混勾后再放置６ｍｉｎ。接着加入１０ｍＬＮａＯＨ２２Ｌ，加入１ｍＬＡｌ（Ｎ０２）３（ｇ），（ｇ）水至刻度摇匀，放置１５ｍｉｎ，然后分光光度计上记录５１０ｎｍ处的吸光度。以Ａｓｉｏｎｍ为纵坐标、声丁的浓度为横坐标作图。（２）蜂蜜中黄酮的提取和测定１６ 西北大学硕士学位论文－ｉ．－量取１００ｍＬ蜂蜜试样（Ｏ．ｌｇｍＬ）到己经装好ＸＡＤ２大孔树脂（北京北实纵横＝４０＞＜２ｃｃｍｉｎ）中，先用２００ｍＬ的Ｈ２科技发展有限公司）的玻璃管（ｐ．０的盐酸淋洗，再用３００ｍＬ的超纯水淋洗用于除去糖类等极性化合物，最后用２００ｍＬ的甲醇溶液洗脱至无色，并将收集液在旋转蒸发仪上于４（ｒｃ条件下减压，得到黄酮提取物。再用甲醇定ｉ３．容至１０ｍＬ。移取黄酮提取物的甲醇溶液ｍＬ，然后加入１ｍＬ的ＮａＮ０２２５Ｉ／混合（ｇ）摇勾，后续步骤与上述绘制标准曲线的步骤相同。得到黄酮提取液在５１０ｎｍ处测定其吸光度。２．３结果与讨论２．３．１超氧阴离子消除能力的测定＿所有的蜂蜜对连苯三酷－鲁米诺体系中产生的超氧阴离子＿（０２）自由基具有很强＿３ｉｘ．ｍ的消除能力。从图２．２可以看出，当蜂蜜浓度均为ｌｌ０ｇｌ／时，８批蜂蜜试样对超氧阴离子的抑制率都在８６．１０％以上。其中Ｓ１蜂蜜试样对超氧阴离子的抑制率高达９１．９５％。从８批蜂蜜试样的ＩＣ５０值中可以看出（见表２．２），Ｓ８的ＩＣｓｏ值最大，是最小ＩＣｓｏ值的２．３倍。龙眼蜂蜜的平均ＩＣｓＧ值最小，ＩＣｓＧ值最大的槐花蜂蜜是它的１．８９倍，这说明了龙眼蜂蜜比槐花蜂蜜具有更强的超氧阴离子消除能力。按ＩＣ５Ｇ值从小到大的顺＞＞＞序，对四种蜂蜜排序，它们的排序依次是：龙眼蜂蜜养麦蜂蜜油菜蜜槐花蜜。因此，龙眼蜂蜜是所研究的４种蜂蜜中消除超氧阴离子能力最佳的蜂蜜，荞麦蜂蜜位居第二。１２０００－．９０００－■Ｃ６０００－■。■３０００－■ＢＳ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４Ｓ５Ｓ６Ｓ７Ｓ８图２．２蜂蜜试样消除超氧阴离子自由基能力－３．－ｘ图中Ｂ为空白组，Ｓ１Ｓ８为实验组。８个蜂蜜试样的浓度均为．ＯｌＯｍｌＡｌｇ１７ 第二章Ｆ－ＩＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价２．３．２经基自由基消除能力的测定２＋一－－所有的蜂蜜对ＣｏＥＤＴＡ鲁米诺体系产生的轻基自由基都有定的消除能力。从＿３ｉｘ－图２．３中可以看出，当蜂蜜浓度均为ｌｌＯｇｍｌ／时，８批蜂蜜试样对轻基自由基的消除作用差异很明显。养麦蜂蜜对轻基自由基的消除作用显著，它的抑制率高达７８．５５％，１而龙眼蜂蜜和槐花蜂蜜作用甚微，对经基自由基消除能力都不足％。蜂蜜对轻基自由基消除能力的ＩＣｓｏ值列在表２．２中，从表中可以看出养麦蜂蜜的ＩＣ５０值最小，槐花蜂蜜的ＩＣｓｏ值最大。槐花蜂蜜的ＩＣｓｏ值是荞麦蜂蜜的８．１７倍。根据ＩＣｓｏ值从小到大的顺序＞＞＞对四种蜂蜜排序：依次是荞麦蜂蜜油菜蜜龙眼蜂蜜槐花蜜。所以，荞麦蜂蜜对轻基自由基的消除作用尤其突出。１－０００，丨ｉ／ｉ°ＢＳ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４Ｓ５Ｓ６Ｓ７Ｓ８２图．３蜂蜜试样消除轻基自由基能力－３－ｉ－图中Ｂ为空白组－。ｌＯｘｌＯｍＬｏ，Ｓ１Ｓ８为实验组８批蜂蜜试样的浓度均为．ｇ２．３．３过氧化氢消除能力的测定Ｈ－实验中釆用２Ｏ２鲁米诺体系来评价蜂蜜试样消除过氧化氢的能力。从图２．４中可知，在浓度相同条件下，所有的蜂蜜都对过氧化氢有较强的消除能力。其中Ｓ１蜂蜜试５０样对过氧化氢的抑制率高达９６．％。根据ＩＣ５０值从小到大的顺序蜜排序，，对四种蜂＞＞＞它们依次是：荞麦蜂蜜油菜蜂蜜龙眼蜂蜜槐花蜂蜜。根据排序可知，荞麦蜂蜜是所研宄４种蜂蜜中消除过氧化氢能力最强的蜂蜜。１８ 西北大学硕士学位论文３２００１２４００－＿－！１６００■＾Ｊｊ：Ｌ°ＢＳ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４Ｓ５Ｓ６Ｓ７Ｓ８图２．４蜂蜜试样消除过氧化复能力３ｉＢ－Ｓ８ｘ＿图中为空白组，Ｓ１为实验组。８批蜂蜜试样的浓度均为１．０ｌ（ｒｇｍＬ／。２２８表．批蜂蜜试样抗氧化能力的比较＂－－＂－＂＾ｉ＾－＇＾＇－－ｍＬＨ－试样ＩＣ）ｌＯｍＬＩＣ５ｏＯＨｌＯＩＣｓｉＯａｌＯｍＬ５０（Ｏｒ（ｇ）（）（ｇ）ｏＣ）（ｇ）５１１．．１８００３９８０．９９４１．２２０．６３１．４８５２１．２５１．２２１．９７５３１．１３４．０５４．７３０．９９１３．９１３．５９５４０．８５１３．７６２．４５５５１．９３４．４３４．８４１．８７５．１５４．６６５６１．８７．８５４．４７５７１７２４．１３２４２．．５２２５１．８２．６２．５８１．９８１．１１２．０８一附注１．２２Ｓ１和Ｓ２：第三列的数据（如１）是第列连续两列对应数据（如分别对应的ＩＣｓＧ１．１８，５１．２）的平均值。其余相同。２．３．４蜂蜜对ＲＯＳ消除能力与ＴＰＣ和ＴＦＣ的关系蜂蜜中总酷酸和总黄酮的含量测定结果见表２．３。８批蜂蜜试样的总酷酸含量差异较大。从表２．３中可看出，Ｓ１蜂蜜试样的总酷酸含量是最高的，Ｓ５蜂蜜试样的总酷酸最低。而８批蜂蜜试样的总黄酮的含量差异不是很大。Ｓ１蜂蜜试样总黄酮的含量也是８最高的，Ｓ蜂蜜试样的总黄的含量是最小的。１９ 第二章Ｆ－ＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价Ｉ表２．３绛蜜试样中的总紛酸和总黄醑含釐－－’样品总酷酸含量？＇ｉ（ｎｇｇ）总黄酮含量（ｐｇｇ）±５１１５４５±１１２８．１２．８５２１２０４±６７２４．１±４．２５３４１０±５８１５．６±４．２５４５８８±５８１５．４±４．２５５１８２±７１３．５±７．８５６２４０±７５１２．９±２．８５７３２９士３４１１．７±４．２５８３１７±３８１０．１±３．５附注１：表中数据表示为平均值±标准偏差２．４结论本章利用流动注射化学发光分析法研宄了蜂蜜的抗氧化活性，评价了八批蜂蜜试样对超氧阴离子、轻基自由基和过氧化氧的消除能力，并且对八批蜂蜜试样的这三种抗氧化能力进行了比较。实验结果表明：在消除轻基自由基和过氧化氢的体系中，荞麦蜂蜜均表现出了优异的消除能力。在消除超氧阴离子体系中，荞麦蜂蜜对超氧阴离子的消除能力仅次于龙眼蜂蜜。因此，总体上来说，荞麦蜂蜜具有较强的抗氧化能力，该能力和蜂蜜的总酹酸含量密切相关。这项研究工作将为深入的研究蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护作用提供科学的依据。参考文献［１］ＣａｂｉｓｃｏｌＥ”ＴａｍａｒｉｔＪ．，ＲｏｓＪ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓｉｎＢａｃｔｅｒｉａａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤａｍａｇｅｂｙｅａｃｅｎｓｒｎ－ＲｔｉｖｅＯｘｙｇＳｅｃｉｅＪ．ＩｎｔｅａｔｉｏｎａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０１０３１：３８ｐ［］ｇｙ，，（）２ＡｅｌＫ”ＨｒｔＨ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｅｃｉｅｓ：ｅｔａｂｏｌｉｓｍＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓａｎｄＳｉｎａｌ［］ｐｉｐＭ，，ｇ－Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｏｎｎｎｕｖ，ｌａｎｉｏｌ：ｔ［Ｊ］．Ａ．ＲｅＰｔＢ？２００４５５３７３３９９，，３ＳｃｈｉｅｂｅｒＭＣｈａｎｄｅｌＮ．Ｓ．ＲＯＳＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎＲｅｄｏｘＳｉｎａｌｉｎａｎｄＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＪ，［］”ｇｇ［］２０ 西北大学硕士学位论文Ｃｕｒｒｔ－ｅｎＢｉｏｌｏ２０１４２４１０：Ｒ４５３Ｒ４６２ｇｙ，，（）４ＢａｔｕｍａｌａｉｅＫ．ｖｉｓｔ．ＹｕｓｏｆＫ．Ｍ．ｅａｌ．ｈｅｎｉｏｘｉｄａｎｔｆｅｃｏｆｈｅａｌａｓｉａｅｌａｍ［］，ＱＲ，，ｔＴＡｔＥｔｔＭｙｎＧｔＨｏｎｅｙｏｎＰａｎｃｒｅａｔｉｃＨａｍｓｔｅｒＣｅｌｌｓＣｕｌｕｒｅｄＵｎｄｅｒＨｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓＪ，［］Ｃｔ５－１ｌｉｎｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１４１４２：１８９５，，（）［５ＳａｎｄｅｒｓＬ．Ｈ．ＧｒｅｅｎａｍｒｅＪ．Ｔ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅＤａｍａｅｔｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎＨｕｍａｎ］，ｙｇＰａｒｋｉｎｓｏｎＤｉｓｅａｓｅａｎｄｔｈｅＲｏｔｅｎｏｎｅＭｏｄｅｌＪ，ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１３［］ｇｙ，，６２－：１１１１２０６Ｚ￣［］ｉｅｃｈＤ，ＦｒａｎｃｏＲ．ＰａａＡ．ｅｔａｌ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎＳｅｃｉｅｓＲＯＳＩｎｄｕｃｅｄＧｅｎｅｔｉｃ，，ｐｐ，ｙｇｐ（）ａｎｄＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎＨｕｍａｎＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓＪ．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ［］ａｎｄ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＭｕｔａｅｎｅｓｉｓ２０１１７１１１：１６７１７３ｇ，，（）［７］ＤｅｖｏｓＤ”ＭｏｒｅａｕＣ．，ＤｅｖｅｄｊｉａｎＪ．Ｃ．，ｅｔａｌ．ＴａｒｇｅｔｉｎｇＣｈｅｌａｔａｂｌｅＩｒｏｎａｓａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ＇Ｍｏｄａｉｎａｒｋｉｎｓｏｎｓｄｉｓｅａｓｅｎｉｏｘｉｄａｎｅｄｏｘｓｉｎａｌｉｎ－ｌｉｔｙＰＪ．Ａｔｔｓ＆ｒ２０１４２１２：１９５２１０［］ｇｇ，，（）８ＲａｍａｎａｕｓｋｉｅｎｅＫＳｔｅｌｍａｋｉｅｎｅＡ．，ＢｒｉｅｄｉｓＶ．ｅｔａｌ．ＴｈｅｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＡｎａｌｓｉｓｏｆ［］”，ＱｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎＬｉｔｈｕａｎｉａｎＨｏｎｅｙ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，１３２（３）：５４４－１１５４８ＭＡ－９ｌｖａｒｅｚＳｕａｒｅｚＪ．，ＧｉａｍｉｅｒｉＲＢａｔｔｉｎｏＭ．ＨｏｎｅａｓａＳｏｕｒｃｅｏｆＤｉｅｔａｒｙ［］ｐ，ｙＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｒＳｔｒａｃｔｕｒｅｓＢｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔａｎｄＥｖｉｄｅｎｃｅｏｆＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｅｃｔｓＡａｉｎｓｔｕｍａｎ，ｙＨｇｎｔ－ＣｈｒｏｎｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｍｅｄｉｃｉｎａｌｃｈｅｍｉｓｔｒ２０１３２０５：６２１６３８ｙ，，（）［１０ＥｒｅｕｗａＯ．０”ＳｕｌａｉｍａｎＳ．Ａ”ＡｂＷａｈａｂＭ．Ｓ．Ｈｏｎｅ：ＡＮｏｖｅｌＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＪ．］ｊｙ［］ｅｃｕｅｓ－Ｍｏｌｌ２０１２１７４：４４００４４２３．，，（）－１１常丹，周梦遥．蜂蜜抗氧化成分的研究进展［Ｊ．中国蜂业１１：４０［］］，２０１０，６１（）３８［１２］ＣｉｍｐｏｉｕＣ？，ＨｏｓｕＡ”ＭｉｃｌａｕｓＶ．，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＦｌｏｒａｌＯｒｉｇｉｎｏｆＳｏｍｅＲｏｍａｎｉａｎＨｏｎｅｙｓｏｎｔｈｅＢａｓｉｓｏｆＰｈｙｓｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓＪ．Ｓｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ［］ｐＡｃｔａ－ＰａｒｔＡ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｅｃｔｒｏｓｃｏ，２０１３１００：１４９１５４ｐｐｙ，（）［１３］ＯｕｃｈｅｍｏｎｋｈＳ？ＬｏｕａｉｌｅｃｈｅＨ．ＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒＰ．ＰｈｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄ，，ｙ－ＰｏｌｌｅｎＳｅｃｔｒｕｍｏｆＳｏｍｅＡｌｅｒｉａｎＨｏｎｅｓＪ．ＦｏｏｄＣｏｎｔｒｏｌ２００７１８１５２ｙ：５８ｐｇ［］，，（）１４王远贾歌王萌等．蜂蜜抗氧化活性研究进展Ｊ．食品与发酵工业２０１４７：０２３［］，，，［］，，１５ＷｕＬ．ＤｉｎＸ．Ｐ．ＺｈｕＤ．Ｎ．ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｏｎｔｈｅＲａｄｉｃａｌＳｃａｖｅｎｅｒｓｉｎｔｈｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ［］，ｇ，，ｙｇ 二Ｆ－第章ＩＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价ｍａ－ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＦｏｒｍｕｌａＳｈｅｎｇｉＳａｎｂｙＨＰＬＣＤＡＤＣｏｕｐｌｅｄＷｉｔｈＣｈｅｍ－ＭＳ／ＭＳｃａｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＣＬａｎｄＥＳＩＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｂｉｏｍｅｄｉｌ（）［］ｐａｎａｌｓ－ｉｓ２０１０５２４：４３８４４５ｙ，，（）［１６］ＤｉｎｇＸ．Ｐ．ＷａｎＸ．Ｔ．ＣｈｅｎＬ．Ｌ？ｅｔａｌ．ｕａｌｉｔａｎｄＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ，ｇ，，ＱｙｙｕｓＬｅａｖｅ－－ｗＣｒａｔａｅｓＵｓｉｎｇｏｎｌｉｎｅＨｉｈｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｒａｈｉｔｈＤｉｏｄｅｇｇｐｑｇｐｙＡｒｒａｙＤｅｔｅｃｔｏｒＣｏｕｐｌｅｄｔｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｆｏｏｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１０［］，，－１２０３９２９９３３（）：１７］ＭｉｓｈｒａＫ．ＯｈａＨ？ＣｈａｕｄｈｕｒＮ．Ｋ．ＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｒａｄｉｃａｌＰｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆ［，ｊ，ｙｐｓｃｒｉｅｖｉｅｓｕｏｏｄｅｍｉｓＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓＵｉｎｇＤＰＰＨａｓｓａ：ＡｔｉｃａｌＲｗａｎｄＲｅｌｔｓＪ．ＦＣｈｔｒ２０１２ｙ［］ｙ，，１３０４－：１０３６１０４３（）［１８］ＰｙｒｚｎｓｋａＫ？ＰｋａｌＡ．ＡｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＤｉｈｅｎｌｉｃｒｌｈｄｒａｚｌＤＰＰＨ）ｏｙ，？ｐｐｐｙｐｙｙｙ（ｔＥｓｔｉｍａｔｅｔｈｅＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＣａｐａｃｉｔｙｏｆＦｏｏｄＳａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０１３，５（１７）；４２８８－４２９５［１９］刘志东，郭本恒，王荫榆．抗氧化活性检测方法的研究进展［Ｊ］．天然产物研究与开２００８２０３－发：５６３５６７．，，（）２０ＴｓｕｒｕｏｋａＳ．ＴａｋｅｕｃｈｉＫ．ＫｏａｍａＫ．ｅｔａｌ．ＲＯＳＥｖａｌｕａｔｉｏｎｆｏｒＳｅｒｉｅｓｏｆＣＮＴｓＵｓｉｎ［］，，ｙ，ｇｔｈｅＥＳＲＭｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＣＮＴＭｏｐｈｏｌｏＣ／／ＴｅｃｈｎｉｃａｌＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅｇｙ［］ｇｎｏｔｅｃｈｎｏ－２０１３ＮＳＴＩＮａｌｏｏｎｆｅｒｅｎｃｅａｎｄＥｘｏＮＳＴＩＮａｎｏｔｅｃｈ２０１３．２０１３３：ｇｙＣｐ，，４４９－４５２［２１］ＴｓｕｒｕｏｋａＳ．，ＴａｋｅｕｃｈｉＫ．，ＫｏｙａｍａＫ．，ｅｔａｌ．ＲＯＳＥｖａｌｕａｔｉｏｎＦｏｒａＳｅｒｉｅｓｏｆＣＮＴｓａｎｄＴｈｅｉｒＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓＵｓｉｎｇａｎＥＳＲＭｅｔｈｏｄＷｉｔｈＤＭＰＯ［Ｃ］／／ＪｏｕｍａｌｏｆＰｈｙｓｉｃｓ：ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅＳｅｒｉｅｓ．ｌＯＰＰｕｂｌｉｓｈｉｎ２０１３４２９１：０１２０２９ｇ，，（）［２２］汪德清，沈文梅，田亚平，等．黄苗有效成分对氧自由基清除作用的ＥＳＲ研究［Ｊ］．６－生物化学与生物物理进展１９９２３３：２６０２６２（，，）２３ＧｕｏＳｔ－．ＢｅｚａｒｄＥＺｈａｏＢ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｅｃｏｆＧｒｅｅｎＴｅａＰｏｌｈｅｎｏｌｓｏｎｔｈｅＳＨＳＹ５Ｙ［］，”ｙｐ－Ｃｅ－ｌｌｓＡｇａｉｎｓｔ６ＯＨＤＡＩｎｄｕｃｅｄＡｐｏｐｔｏｓｉｓＴｈｒｏｕｇｈＲＯＳＮＯＰａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌａｎｄｅ－ＢｉｏｌｏＭｅｄｉｃｉｎ２００５３９５：６８２６９５ｇｙ，，（）２４ＰｒａｂｈａｋａｒａｎＶ．ＡｒｅｓＣ．Ｇ．ＲａｍａｎｉＶ．ＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙｍｅｒＥｌｅｃｔｒｏｌｔｅＭｅｍｂｒａｎｅ［］，ｇ，ｇｙ２２ 西北大学硕士学位论文ＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎＭｉｔｉｇａｔｉｏｎＵｓｉｎｇｉｎＳｉｔｕＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１０９（４）：－１０２９１０３４２５ＪａｎｅｉｒｏＰ／ＢｒｅｔｔＡ！Ｍ／Ｏ．ＣａｔｅｃｈｉｎＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＯｘｉｄａｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｓＪ．Ａｎａｌｔｉｃａ［］，［］ｙｃｈ－ｉｍｉｃａａｃｔａ２００４５１８１：１０９１１５，，（）２６］ＣｈｅｎＷ．Ｚｈｕ．Ｘｉａ．ｅｔａｌ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎＳｅｃｉｅｓＳｃａｖｅｎｉｎＡｃｔｉｖｉｔａｎｄＤＮＡ［，Ｑ，Ｑ，ｙｇｐｇｇｙＰｒｏｔｅｃｔｉｎＥｆｅｃｔｏｆＦｒｅｓｈａｎｄＮａｔｕｒａｌｌＦｅｒｍｅｎｔｅｄＣｏｃｏｎｕｔＳａＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄｇｙｐ［］Ｂ－ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２０１１３５５１３８１１３８８：ｙ，，（）２７ＧｕｏＳ．Ｄｅｎ．ＸｉａｏＪ．ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｖｉｔａｎｄＰｒｅｖｅｎｎ［ｔｉｔｉＤＮＡ］，ｇＱ，，ｙｇＤａｍａｇｅＥｆｅｃｔｏｆＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅｅｘｔｒａｃｔｓｂｙＣｈｅｍｉｌｘｉｍｍｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［］ａｒ－ｇｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｏｄｃｈｅｍｉｓｔｒ２００７５５８：３１３４３１４０ｙ，，（）［２８］ＴｉａｎＢ”ＸｕＺ．，ＳｕｎＺ．，ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＥｆｆｅｃｔｓｏｆＶａｒｏｔｅｎｏｉｄｓＦｒｏｍＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓＴｈｒｏｕｇｈＴａｒｅｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＤＮＡｇ，，ＤａｍａｅＡｎａ－ｇｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｈｓｉｃａＡｃｔａ（ＢＢＡ）ＧｅｎｅｒａｌＳｕｂｅｃｔｓ２００７ｐｙｊ，，１７７０６２－（：９０９１１）２９Ｈｉｒａｙａｍａ０ＴａｋａｉＭ＿，ＨｕｋｕｍｏｔｏＫ”ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｂ［］”ｇｙｙＣｈｅ－ｉｎｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪ．Ａｎａｌｔｉｃａｌｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１９９７２４７２：２３７２４１［］ｙｙ，，（）［３０］ＧｅｏｒｇｅｔｔｉＳ．Ｒ．，ＣａｓａｇｒａｎｄｅＲ．，ＤｉＭａｍｂｒｏＶ．Ｍ．，ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤｉｆｅｒｅｎｔＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｂｔｈｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄＪ．ＡＡＰＳＰｈａｒｍＳｃｉｙ［］，２００５２－３：１１１１１５，（）３１ＧｕｏＡＺ－Ａ．ＧＷａｎ．Ｙ．ＡｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＰｒｏａｌｌｏｌｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｓａｆｏｒ［］”ｇｙｇｙｅｒｏｘ－ＳｕｐｉｄｅＤｉｓｍｕｔａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙＪ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９８９，３：５４５７［］３２ＧｉｏｋａｓＤ－．Ｌ？ＶｌｅｓｓｉｄｉｓＡ．Ｇ？ＥｖｍｉｒｉｄｉｓＮ．Ｐ．ＯｎｌｉｎｅＳｅｌｅｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔａｎ［］，ｉｏｘｉｄｔｓ，Ｆｒｅｅ－ｒａｄｉｃａｌＳｃａｖｅｎｉｎＡｃｔｉｖａｓｅｄ－ｇｇｉｔｙＢｏｎＣｏＩＩ／ＥＤＴＡｍｄｕｃｅｄＬｕｍｉｎｏｌ（）ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｂｙＦｌｏｗＩｎｊｅｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｃｈｉｍｉｃａａｃｔａ，２００７，５８９（１）：５９－６５３３ＨｕＴ．Ｘ．ＣｈｅｎＪ．Ｗ．ＸｕＪ．Ｙｅｔａｌ．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＹｉｍＺｈｉｏｌｓａｃｃｈａｒｏｅｔｉｄｅａｎｄ［］，，”ｐｙｐｐＧａｎｏｄｅｒｍａＬｕｃｉｄｕｍＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎＳｃａｖｅｎｇｉｎｇＲＯＳＪ．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｈｙｓ．Ｓｉｎ［］ｐ，２３ 第二章Ｆ－ＩＣＬ法用于蜂蜜的抗氧化能力评价１９９２２４５４６５－：４７０，（）－３４曹讳．ＦｏｌｉｎＣｉｏｃａｌｔｅｕ比色法Ｊ．食品与发酵工１索志荣测定蜂蜜中总酌酸的含量［］［，－业２００４２９１２：８０８２，，（）３５．丛海迪郑毅男．锻树蜜总酸酸和总黄酮含量测定及抗氧化活性研究［Ｊ现代农［］，］９－业科技２０１０：３１３４，，２４ 西北大学硕士学位论文第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研究３．１引言生物体处于氧化应激状态下，产生过多的自由基会对ＤＮＡ等生物大分子造成氧化－损伤，主要包括碱基修饰、糖损伤、ＤＮＡ蛋白交联、单链或双链断裂等各种类型的损－２［１］－伤。ＤＮＡ氧化损伤程度多用检测其损伤产物８ＯＨｃｌＧ的含量来评价，科学研究证实由于ＤＮＡ氧化损伤而造成体液中８－ＯＨｄＧ的水平的变化和癌症、大脑粥样硬化、阿尔３＂？［］兹海默、糖尿病等疾病密切相关。因此，ＤＮＡ氧化损伤评价引起了研究人员的极大兴趣。化学发光法是基于化学反应过程中发光强度和待测物浓度在一定条件下成线性关系的原理而建立的一种分析方法。该方法具有操作简单、灵敏度高、可在线快速连续测８９定等优点［力［１［］，已被用来评价植物种子、植物提取物、中药等对ＤＮＡ氧化损伤的保护１０［］能力。但是目前建立的化学发光体系存在体系复杂、化学发光弱等问题，为此，我们一－建立了－Ｈ２Ｏ２ＤＮＡ化学发光体系种新型的ＣＵＳＯ４，其组成更简单、发光信号更强，并将其应用于蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护作用的评价中。本章我们运用该化学发光体系比较了蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力的大小，并对该体系的化学发光机理进行了研究。３．２实验部分３．２．１仪器实验中所用仪器列在表３．１。２５ 第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研究表３．１实驗仪器信息仪器型号厂家流动注射化学发光仪分析－Ｄ西安瑞迈电子科技有限公司ＩＦＦＭ紫外分光光度计ＵＶ２５５０日本岛津公司紫外分光光度计ＵＶ７５１－ＧＤ上海分析仪器总厂Ｈ计ＰＨＳ－３Ｅ上海仪电科学仪器股份有限公司ｐ３．２．２试剂原儿茶酸、槲皮素、，丁为优级纯，亚硝酸钠、硝酸银、氢氧化钠、硫酸铁、硫酸亚铁、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氧二钠、磷酸二氢钠、醋酸钠、硫酸铜、甲醇、盐酸、－Ｍ醋酸、过氧化氢均为分析纯。实验中配制溶液的水均是由ＭＵｌｉＱ（ｉｌｌｉｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｐ，ｂｅｄｆｏｒｄＭＡＵＳＡ）净化得到。，，精确称小牛胸腺ＤＮＡ（西格玛奥德里公司，美国纯）０．０１５０溶解在磷酸，优级ｇ－－°ｉｉ２．＝．ＤＮＡ盐缓冲液中（０．０ｍｏｌＬＨ７．４３００ｘｍＬ，Ｃ，ｐ），配制成浓度为的溶液储存在４ｉｇ冰箱中备用。３．２．３样品制备“”实验样品与２．２．３部分的相同。３．２．４ＤＮＡ氧化损伤保护能力的测定２＋在本实验中－－，我们运用ＣｕＨ２０２ＤＮＡ体系，评价了不同蜂蜜试样对ＤＮＡ氧化损伤保护能力。实验中按照图３．１所示连接流路，用超纯水清洗各个管路，将软管插入－２＋＿４ｉ到相应的溶液中，ＤＮＡ（３ｎｇｍＬ０和Ｃｕｌ．ＯｘｌＯｍｏｂＬ通过混合器混合，由六通（）－２－ｘ－进样阀将混合溶液注入到样品溶液中，最后和过氧化氢（１．０１０ｍｏｌＬ０溶液混合，反应立即发生。以样品流路为水的化学发光强度为空白Ｉ。，以蜂蜜试样溶液注入时的化学发光强度为Ｉｓ。２６ 西北大学硕士学位论文＾ｂｖｌＭＦＷＣＵｍ－ｍｐ＾＋３－图．１ＣｕＨｉＯｉＤＮＡ体系流动注射示意图ａＤＮＡ碳酸盐缓冲液，ｂ硫酸铜溶液，Ｃ蜂蜜试样，ｄ过氧化氢溶液３．３结果与讨论３．３．１化学发光条件的选择一系列的实验来优化实验条件我们做了，实验中考察了体系的流路、催化剂、各反应物的浓度和介质的选择等因素。（１）流路：流路对于流动注射化学发光方法至关重要。为了获得最大的化学发光，。３．１所示的流路时信号实验中我们设计了多种不同流路方式当我们采用图，ＤＮＡ和２＋Ｃｕ充分的混合，接着注入到超纯水的载流或者试样的载流中，最后和过氧化氢溶液混合。釆用该流路，体系能够快速产生较强的发光信号。所以后续实验均采用该流路。２＋（２）催化剂：经典的芬顿试剂是由过氧化氢和Ｆｅ构成的。许多的过渡金属也可＂＿１２２＋２＋２＋＋３＋［］２以催化芬顿反应。例如Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ。在本实验中，我们研究了２＋２＋３＋２＋Ｆｅ、Ｃｕ和Ｆｅ三种离子对体系的催化作用。结果发现：在碱性条件下Ｃｕ对体系的２＋３＋２＋２＋催化作用强于Ｆｅ和Ｆｅ。因此我们选择了Ｃｕ作为体系的催化剂。在Ｃｕ浓度范围为－５－＾２＋ｘ？ｘ１．０１０１．０１０考察了其催化能力，试验中发现体系的化学发光信号随着Ｃｕ２＋４－？ｘ－，但当Ｃｕ浓度再增加，化学发光信号不再变化。所以ｌｌＯｍｏｌＬ浓度的增加而变大．Ｏ２＋的Ｃｕ作为最优化的催化剂浓度。（３）过氧化：过氧化氢在芬顿试剂中用于产生轻基自由基氢的浓度，因此过氧化－２－氢的浓度对于化学发光的强度有很显著的影响ｘ－ｘ１。实验中我们考察了ｌ．ＯｌＯ１．０１０ｉｍｏｈｌ／范围内的过氧化氢的浓度。结果发现在该范围内化学发光信号随着过氧化氢的浓２＿ｉｘｍｏ．度增加而变大。当过氧化氢的浓度为１．０ｌ（ｒｌＬ时，体系发光强度已经很强足以用。浓度再高的话，化学发光太强。所以试验中我们选择于分析测定，会造成信号溢出２７ 第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研宄＿２＇＇ｘｍｏ－１．０ｌ０ｌＬ的过氧化氢进行后续实验。（４）反应介质：反应介质关系到体系能否发生化学反应，直接影响到体系能否产＿ｉ＊０－生发光。在实验中对缓冲溶液的种类和Ｈ值进行了考察．１０ｍｏｌＬ醋酸醋ｐ，分别在－＝－ｉ＝５、二－磷酸氢二钠缓冲溶液（酸钠缓冲溶液（ｐＨ．２）０．２０ｍｏｌＬ磷酸氯钠ｐＨ７．３）和１＝０－．１０ｍｏｂ１／碳酸钠碳酸氢铀缓冲溶液（ｐＨ９．２）中考察了发光信号受反应介质的影响。－碳酸氢钠缓冲溶液时实验中发现采用碳酸钠，体系的发光信号和抑制率都比较大。所－以后续实验选择的是ｐＨ为９．２的碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液。２＋（５－－）ＤＮＡ浓度：ＤＮＡＣｕＨ２０２体系的化学发光信号与ＤＮＡ的浓度成正比关＿５＿６＿ｉ＊３＞＜？＞＜系，化学发光强度和ＤＮＡ的浓度在１．１０１．０１０ｇｍＬ范围内存在线性关系。后６－ｉ－＞＜续实验中，为了考察蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用，我们选择３ｌ（ｒｍＬ的ＤＮＡｇ进行实验，这主要由于ＤＮＡ浓度太高，会造成信号溢出，此浓度下的化学发光大小适宜，且蜂蜜对此信号均为抑制，故ＤＮＡ无需选更大浓度。３．３．２８批蜂蜜试样对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力的比较一系列浓度的蜂蜜试样在上述优化的实验条件下，将蜂蜜的储备液逐级稀释配置，３。并按照．２．４所述试样方法以及图３．１所示的仪器连接示意图进行实验评价了蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力。以蜂蜜试样ＤＮＡ氧化损伤抑制率对蜂蜜浓度作图，得图３．２。据此我们计算出了每个蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的ＩＣｍ）。从图中可以看出，蜂蜜试样。对ＤＮＡ氧化损伤的ＩＣ５０值槐花蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的ＩＣｓｏ值的平均值最大，为＂＾－ｉ２ｘ－Ｉ。１．１０ｍＬｏ荞麦蜂蜜的最小槐花蜂蜜的平均Ｃ５（）值是荞麦蜂蜜的１．８倍。依据同ｇ＞＞＞：种蜂蜜试样ＩＣ５０值的平均值的大小，由小到大依次是养麦蜂蜜油菜蜜龙眼蜂蜜槐花蜜。四种蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤都有很强的保护能力，但荞麦蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力更加的突出。２８ 西北大学硕士学位论文＿ｄａ０？ｌＯＯ？１０］１）．扣８０８０．８０／Ｚ＇ＳＯ６０．戶６０／．２５／■，－§／５４Ｉ－Ｓ－５＝ｆｘｍＬ１８３ｌＱ．３－－＾．Ｖ，１／１０ｍｌＣＳＣＭＯｍＬＩ５，０？１０／ｍＬ４０？Ｖ１４０，ＩＶｇ｜４５聞５肌＂＾｜声＾ＢＪｉ．２０ｆ２０ｆ２０２０／ＩＪ？‘ｏ＇‘０．；０？０］０２４６各１００２４６１００２４６８ｔＱＪ０２４６８１０｜Ｃｏｎｃｅｎｌ／＂＾ｔｒａｔｉｏｎ（ｘＯｍＬＣｏｎｃｔｒａｉｘＯＬｇ）ｅｎｔｏｎ（ｌｇ／ｍ）ｏｎｃｅＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｘｌＯ／ｍｌ）Ｃｎｒａｔｘ（ｇｔｉｏｎ１０ｇ／ｍＬ｛）ｅ伽１０。？？？ｆｌＯＯ，ｈ１００］ｊ｜１抑即．８０Ｃ／Ｈ／ｃ／的＾印．－＾＝ｍｆｃ＝１．２．ｍ／ＫｔＵＷＱｌｌ１１０ｇ／ＬＩ＂．｜ｆ。．］■如？４如／＾／Ｃ＝？－５４０１么１０ｎＬ４０＝／況Ｖ！／ｉｃ７，３．１０ｇ／ｍＬＩ／ｉ／Ｉ＾＿－２０＝２０．／２０Ｂ２０／ｊｆ０？ｏＩ０－ｆ０Ｊ｜２４６８１０６２４６８１００２４６８１００２４８８１０Ｐｃｏｎｃｅｎｔ＂＇＾ｒａｔｉｏｎｘｉｏ／ｍＬ＾（ｇ）ｍｘＣｏｔｒｔｉｃｅｎｒａｔｏｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ１０／ｍＬｎｃｅｎａｏｎＣｏｎｔｉＯ／ＬＭｇ（ｇ））图３．２８批蜂蜜试样对ＤＮＡ氧化损伤保护作用能力Ｃａ到ｈ对应试样Ｓ１到Ｓ８）２＋３３３－Ｈ０－ＤＮＡ体．．Ｃｕ２２系的反应机理研究３ＣＫ）ａ■ｋ｛：ｄ跡－ＪＱｍｍ０５０１００１５０２００Ｔｉｍｅ（ｓ）２＋图３－０－ＤＮＡ．３ＣｕＨ２２体系的动力学曲线－７－－－－－．ｉ〗ｉ２＋５ｉ．－ＤＮＡ３－－ａ．３ｘｌＯＨ０３＋．３ｘ１０ｌＬＣｕ３．３ｘ１０ｍｌｂ：（ｍＬ）２２（ｍｏ）ｏＬ：ａ蜂蜜。ｇ（）；２５００－１－／！２０００＼ｙ＊？§＾．＼５００ｉ／§／＼－－０００－＿５１Ｌ＿／“ｗ＼５００Ｊ＼、？！薩ｎ－＾＾４００４５０５００６５０６００Ｗａｖｅｌｅｒ＾Ｕｉ（ｎｍ）２＋３４Ｃｕ－Ｈ０－ＤＮＡ体系的化学发图．２２光光谱－－－－？－＇＾－ｉ＾＾ｉＤＮＡｍＬＨｍｏｘ－１．１０ｘｌＱ０ｘ０ｌ．ＯｌＩ／Ｃｕ．ＱｌＱｍｏｌＩ／，ｇ；２２，；Ｍ２９ 第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研究＊Ｃ．０．６０４ＷＡ１ＢｘＩ？ａ０３＼．ｐ八＼■■广。＼Ｅａ１Ａ．４涛０１ｅ．２ｃｌ＼：：：＼广：＾Ｉ＼Ｉ※Ｉ０－＾－１。．ｒ．１ｖ＾１义｜％＼０．ｎ：．０ｌ＿：＾＾＾ｏｎｎ．２５０３００３５０２５０２７５３００３２５２５０３００３５０４００４５０５００ｖｅｌｅｎＷａｔｈｎｍｍＷａｖｅｌｅｎｇ）Ｗｖｅｌｅｎｔｈｔｈｎｍ（ａｇ（ｎ）ｇ（）２＋－－图３．５ＣｕＨ２０２ＤＮＡ体系中相关物质的紫外可见光谱＂？ｉ２＋＂＾＇＇＂＇－－Ａｘ．ｘｘＬ：ＤＮＡ１ｌＯｌ／和不同浓度Ｃｕ的反应（ａ０１．０１０ｍｏｌＬＩ．５ｌ（Ｈｍｏｌｄ．５ｇｍ）＾ｂ，；ｃ，；，（；＂＾－＂＇ｉ＾＇２ｍｏ．ｘ－．０ｘｌ０ｌＬｅ２．５１０ｍｏｌＬ；，）－＾－－＾＂＇－＾＂＇＂＇ｂ０ｘ．ｉｘ－－ｘＢ：不同浓度的Ｈ２Ｏ２溶液（ａ０１．１０ｍｏｌＬｃ，１．５ｌ０ｍｏｌＬｄ，２．０ｘ１０ｍｏｌＬｅ，２．５１０＾；，；；；－＂－＂－ｉ２＋＾ｉ＜＾－ｉｍｏＬｕｘｍｏ＊ｘ１．ｌ０ＬＤＮＡｌ在Ｃ０ｌ的催化作用下和１．５ｌＯｍｌ／反应。插图为该图的局部放大。）（）（ｇ）－？－＂－＂＇ｉ＋＾＇＇＇．２－－ｘ－ｘ－ｘｘＣｍＬＣ．ＯｌＯｍｏｌＬＨ０ｌ．ＯｌＯｍｏｌＬｂ：．ＯｌＣＨ：ａ：ＤＮＡ１．５１０ｕ（ｌ）２２（）；槲皮素（ｌ（ｇ）＂＇ｍｏ－：＋ｌＬｃａｂ）；２＋３－－图．３显示的是ＣｕＨ２０２ＤＮＡ体系的化学发光光谱。Ｈ２Ｏ２溶液注入到ＤＮＡ和２＋Ｃｕ溶液混合液中，化学反应立即开始，化学发光信号从基线到到达顶峰仅用了２．５秒。１００秒左右化学发光峰回落至基线。当蜂蜜试样加入后，化学发光峰值显著降低，１５０秒后化学发光信号回到基线。从图３．４中，我们看到体系化学发光的最大发射在４７５ｎｍ处。然而，在焚光光谱图中并未找到对应位置的焚光发射峰。在图３．５Ａ中，我们可以看到在２６０ｎｍ处ＤＮＡ典型的吸收峰，见曲线ａ。随着铜离子的加入，该处的吸收峰增２＋－１３１４ｅ［】大如曲线ｂ到ｏ这是由于Ｃｕ可以和ＤＮＡ相互作用，发生增色效应，而使得ＤＮＡ的双螺旋结构受到严重的影响。当不断增加的过氧化氢和铜离子，由于发生芬顿反应，ＤＮＡ在２６０ｎｍ处的吸收峰有所降低，如图３．５Ｂ所示。这是由于芬顿反应导致的ＤＮＡ氧化损伤，７９ｎｍ３．５Ｃ；当槲皮素加入到体系中槲皮素原来３处的特征吸收峰消失。如图２＋－所示－ｒｏｗｎ。实验结果表明槲皮素参与了ＣｕＨ２０２ＤＮＡ体系的化学反应。据Ｂ和Ｋｈｏｄｒ２＋１５１６［］Ｂ二［］等人报道，，环含有邻位轻基的黄酮能够和Ｃｕ发生络合反应，刘莉华等人报道黄酮Ｂ环的酌经基的数目跟它的抗氧化活性密切相关，抗氧化活性随着酷轻基数目的增丨７［】报道称多而最强。高文波在，酸酸类物质消除自由基的性质跟它的结构所含有的子结构和官能团有密切关系，如轻基、儿茶酷基团等都有助于提供电子，具有很好的还原能３０ 西北大学硕士学位论文力。还指出酷酸也具有螯合金属离子的作用。由于蜂蜜中含有丰富的酷酸和黄酮类物质，２＋２＋当它处在Ｃｕ－Ｈ２０２－ＤＮＡＣｕ体系，酔酸和黄酮都能够和发生螯合作用，而且对过氧。３．５Ｃ中的３７９ｎｍ处吸收峰的消失，就跟螯合物形成的有关化物具有消除能力或许图，或者酸酸和黄酮类物质的氧化有关联。芬顿试剂中没有了催化剂，过氧化氢几乎不会对ＤＮＡ造成损伤。从而起到保护作用。３．３．４蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力和蜂蜜中ＴＰＣ和ＴＦＣ含量的相关性蜂蜜抗氧化能力和对ＤＮＡ氧化损伤保护能力与蜂蜜中ＴＰＣ和ＴＦＣ含量的相关性３．２。ＩＣ５０Ｈ０正相关结果，列在表中从表中可以看出，和ＩＣ５Ｏ２２）存在很强的，ＩＣ５ＯＨ２０２（（）和ＩＣｓｇＯＯＨ）也存在很强的正相关。而ＩＣ５（）（Ｈ２０２）和ＩＣＳＧＯＯＨ）都和蜂蜜的ＴＰＣ呈很强的负相关。这说明蜂蜜中的总紛酸含量越高，它对轻基自由基和过氧化氢消除能力就越强，同时对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力也越强。表３．２绛蜜抗氧化能力和ＤＮＡ氧化损伤保护能力的相关性分析结果（ｐｅ腿相关性）－－－ＴＰＣＴＦＣＩＣ５ｏ０２ＩＣ５ｏ（ＯＨ）ＩＣｓｏＯｆｃＣｈＩＣ５０（））ＴＰＣ１＂ＴＦＣ０．９６９１－ＩＣＯ－５０２０．１７６０．００２１（）＊－－ＯＨ－０６０８１ＩＣ５ｏ（）０．７５３．０．６１９＊＊Ｈ－－ＩＣ５ｏ２０２０．７２３０．５３６０．４９６０．８１７１（）＂－－ＩＣ５００．６４３０．４８８０．６０５０．６８６０．８６２１＊附注１：．在０．０５７ｊＣ平（双侧）上显著相关，在０．０１水平（双侧）上显著相关。表中ＩＣ５０表示：蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力３．４结论２＋Ｕ－Ｈ－实验发现Ｃ２０２ＤＮＡ体系可以产生强的化学发光，并成功的运用该体系研究ＤＮＡ氧化损伤，快速准确、连续在线评价了蜂蜜试样对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力。实验中发现所有的蜂蜜试样均对ＤＮＡ氧化损伤表现出了很好的保护作用，其中荞麦蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用最强。通过测定蜂蜜中的成分发现，蜂蜜的抗氧化能力和３１ 第三章评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光新方法研究保护ＤＮＡ氧化损伤能力与总酷酸的含量密切相关，总紛酸和总黄酮呈正相关性，它们的含量越多，蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用越强。该方法有助于预测抗氧化剂的抗氧化活性和对ＤＮＡ氧化损伤保护能力，开发新的抗氧化食物；有助于快速批量的对蜂蜜、饮料、茶叶浸取液等液体保健品的各种抗氧化能力的评价以及产品的评级。参考文献＂＂１ＢｉｌｌｅｎＤ．ＳｏｎｔａｎｅｏｕｓＤＮＡｄａｍａｅａｎｄｉｔｓｓｉｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｔｈｅｎｅｌｉｉｂｌｅｄｏｓｅ［］ｐｇｇｇｇｃｏｎｒｏｖｅｒｓ－ｔｉｎｒａｄｉａｔｉｏｎｒｏｔｅｃｔｉｏｎＪ］．ＲａｄｉａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１９９０１２４２：２４２２４５ｙ，（）ｐ［，’ｒｃｅｒｅａｒｏｍａｉｎｅｍｏｄｅｌｉｎａｏｕｂｅ－ｓｔｒａｎｄ２ＰｉＢ．ＤＤＡｎｄＡ．Ｄ．ＣｈｔＲｔＤＮＡＤｌＢｒｅａｋｓＪ．Ｃｅｌｌ［］，ｇ［］，２０１－１１３１５２６：３４４３５４，（）－Ｗｕ．．ｉｏｕＣ．Ｃ．．Ｙ．ｅｔａｌ．ｉｎｒ８ＯＨｄＧ：ＭａｒｋｅｒｆＯｘｉｄａｉｖｅｒｅｓｓｏ３ＬＬＣｈ，ＣｈａｎｇＰＵｒａＡｏｔＳｔｔ［］，，ｙＤＮＡａｎｄＡＲｉｓｋＦａｃｔｏｒｆｏｒＣａｎｃｅｒＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄＤｉａｂｅｔｉｃｓＪ．ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ，［］Ａｔ３３９１－ｃａ２００４：１９，，（）［４］ＥｔｏｈＴ．，ＩｎｏｇｕｃｈｉＴ．，ＫａｋｉｍｏｔｏＭ”ｅｔａｌ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＡＤ（Ｐ）ＨＯｘｉｄａｓｅ－ＳｕｂｕｎｉｔｓＮ０Ｘ４ａｎｄ２２ｈｏｘＩｎｔｈｅＫｉｄｎｅｙｏｆＳｔｒｅｔｏｚｏｔｏｃｉｎｉｎｄｕｃｅｄＤｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓａｎｄ，ｐｐ．ｐＩｔｓｒｅｖｅｒｓｉｂｉｔｙＢｙＩｎｔｅｒｖｅｎｔｉｖｅＩｎｓｕｌｉｎＴｒｅａｔｍｅｎｔＪ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｉａ２００３４６１０：［］ｇ，，（）－１４２８１４３７５ＺｈａｎＣ？ＮｅｓｔｏｒｏｖａＧ．ＲｉｓｓｍａｎＲ．Ａ？ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ［］ｇ，，，＇＇－－２－ｕａｎｏｓ８ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｉｎｅｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒｓＴｒａｎｓｅｎｉｃＭｏｕｓｅＵｒｉｎｅＵｓｉｎｇＣａｉｌｌａｒｇｐｙｅｃｏｈｏｒｅｓ－Ｅｌｔｒｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓ２０１３３４１５：２２６８２２７４ｐｐ，，（）＇ｒｎｉｋＭｏｆ－ｈ－－ｄｓ６ＳｅｒｄａＭ？ＳｅｒｔｏｌｕＥＵａ．ｅｔａｌ．Ｃｏｍａｒｉｓｏｎ８ｒｏｘ２ｅｏｘｕａｎｏｉｎｅ［］，ｇ”ｙ，ｐｙｄｙｙｇ８－ＯＨｄＧＬｅｖｅｔｒｔＡｌｂｕｍｉｎＣＲａｔｉｏＡｌｓＵｓｉｎＭａｓｓＳｅｃｏｍｅｅｒａｎｄＵｒｉｎｅｒｅａｔｉｎｉｎｅｓａ（）ｇｐＰｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＮｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，－４６１０：１２９１１２９５（）［７］ＫｒｅｄｙＨ．Ｍ．，ＨｕａｎｇＤ．，ＸｉｅＢ．，ｅｔａｌ．ＦｌａｖｏｎｏｌｓｏｆＬｏｔｕｓ（Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ，Ｇａｅｒｔｎ．）ＳｅｅｄＥｉｃａｒａｎｄＴｈｅｉｒＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＰｏｔｅｎｔｉａｌＪ，ＥｕｒｏｅａｎＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｐ［］ｐｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ２０１０２３１３：３８７３９４，，（）［８］ＺｈａｏＬ”ＺｈａｏＧ”ＤｕＭ．，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆＳｅｌｅｎｉｕｍｏｎＩｎｃｒｅａｓｉｎｇＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＳｃａｖｅｎｇｉｎｇ３２ 西北大学硕士学位论文Ａｃｔ－ｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＥｘｔｒａｃｔｓＦｒｏｍａＳｅｅｎｒｉｃｈｅｄＭｕｓｈｒｏｏｍＳｐｅｃｉｅｓｏｆＴｈｅＧｅｎｕ－ｓＧａｎｏｄｅｒｍａ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８２２６３：４９９５０５，，（）［９］ＷａｎｇＱ．Ｌ，ＬｉｎＭ？，ＬｉｕＧ．Ｔ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎａｔｕｒａｌｉｓｏｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ［Ｊ］．ａｎｅｓｅｏｕｒｎａｏｆｈｒｍ－Ｊａｐｌａａｃｏｌｏ２００１８７１：６１６６ｐｇｙ，，（）ｊ１０ＣａｏＥｅｒｏｎ－－ｍＭａＷ．Ｈ？ＺｈａｎＪ？ｔａｌ．ＰｈｅｎａｎｔｈｌｉｅＣｕｃｏｍｌｅｘｅｄｉａｔｅｄ［］”，ｇ，ｐｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆＤＮＡａｎｄｉｔｓｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｐ［］ｏｆ－ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏＢ：６６８ｙｇｙ：Ｂｉｏｌｏ，１９９８４４１）３ｇｙ，（１１ＳｔａｄｔｍａｎＥ．Ｒ．ＯｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＦｒｅｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓａｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎｓＢ［］ｙＲａｄ－ｉｏｌｙｓｉｓＡｎｄＢｙＭｅｔａｌｃａｔａｌｙｚｅｄＲｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，，６２－１：７９７８２１（）１２ＨａｌｌｉｗｅｌｌＢ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎＳｅｃｉｅｓａｎｄＴｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｓｔｅｍＭ／／Ｆｒｅｅ［］ｙｇｐｙ［］Ｒａｄ－ｉｃａｌｓｉｎｔｉｉｅＢｒａｉｎ．ＳｒｉｎｅｒＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒ１９９２；２１４０ｐｇｇ，＇－１３ｅｉｚｍａｎｒ．ＢｉＬｉａｎｄｏｓｉｄｅ：ａＮｏｖｅｕｉｌｄｉｎｃｋＦｏｒｏｄｉｆｉｎＷＨ．ＴｏＹ２２ｉｎｅｌＢＢｌｏＭ［］，，ｐｙｒｉｄｇｇｙｇ－ｘｅｅｍｅＤＮＡｗｉｔｈＩｎｔｒａｄｕｐｌｅｘＭｅｔａｌＣｏｍｌｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈＡｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｐ［］ｙ，２００－１１２３１４：３３７５３３７６，（）［１４］ＡｑｍａｎｄＦ．，ＭｏｈａｎｉＢ？，ＡｈｍａｄＳ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ，ＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＩｎｔＴ－ｔｔｅｒａｃｉｏｎｏｆＣＤＮＡｗｉｈＡＮｅｗＢｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅＤｅｒｉｖｅｄＣｕＩＩＣｏｍｌｅｘＪ．（）ｐ［］Ｅｕｒｏｅａｎｒｎａ－ｐｏｕｌｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｃｈｅｍｉｓｔｒ２００５４０１１：１１０３１１１０，（）ｊｙ，１５ＢｒｏｗｎＪ．ｒ．ＨｉｄｅｒＲ．ｅｔａｌ．ＳｒｕｃｕｒａｌＤｅｅｎｅｎｃｅｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｎｅｒａｃｉＫｈｏｄＨｔｔｄＦＩｔｔｏｎｓ［］，，，ｐ２＋ｗｉｔｈＣｕＩｏｎｓ：ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴｈｅｉｒＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓＪ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８３３０：［］ｊ，，１１７３－１１７８１６刘莉华宛晓春．黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的研究进展Ｊ．安徽农［］，（综述）［］－业大学学报２００２２９３：２６５２７０，，（）［１７］高文波翁国斌．绿茶多酸抗氧化作用及其机制研究进展Ｊ．国际药学研宄杂志，［］，２００９－３６５：３３２３３５，（）３３ 第三章用于评价蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护能力的化学发光分析新方法研究３４ 西北大学硕士学位论文第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究４．１引言ＤＮＡ氧化损伤对生物体的危害很严重，出现碱基错配、ＤＮＡ单链断裂和双链断－１７［］－、裂、碱基修饰物、ＤＮＡ蛋白交联等现象，会导致基因突变、诱发肝癌直肠癌、胃癌、帕金森综合症、阿尔兹海默、大脑粥样硬化等多种疾病蜂蜜是由蜜蜂采集花蜜或从植物活体分泌物与自身特殊的物质结合，经过酸造产１２一［］。蜂蜜还可用于治疗资伤、肠胃生的天然甜物质，是种营养价值很高的天然保健品－１３１５［］、疾病哮喘、伤口感染、皮肤淸疡等疾病，这可能归因于良好抗氧化活性以及对ＤＮＡ氧化损伤的保护能力。周娟等人用琼脂糖凝胶电泳实验证实荞麦蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤能力的保护作１７［］ＤＮＡ用。陈伟军等人建立了评价椰汁对氧化损伤保护能力的分析方法。但是蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤保护作用的机制目前尚不清楚。本章借助了原子力显微镜、圆二色谱和方波伏安法手段，用来研宄蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用，旨在揭开蜂蜜保护ＤＮＡ氧化损伤的机理。４．２实验部分４．２．１仪器伩器信息见表４．１３５ 第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究表４．１实驗伩器信息仪器型号厂家一电脑三恒多用电泳仪电源ＤＹＹ－１１北京六仪器厂８－ＯＨｄＧ酶联免疫试剂盒小鼠南京建成生物工程研究所９６底酶标板４２５９２ＣｏｍｉｎＩｎｃｏｒｏｒａｔｅｄ孔平ｇｐ－超纯水净化系统ＭｉｌＨＱＭｉｌｌｉｐｏｒｅ紫外分光光度计ＵＶ２５５０日本岛津公司焚光分光光度计Ｆ４５００日本日立公司ｅ－凝胶成像系统ＧｌＤｏｃＸＲＢｉｏＲａｄＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ原子力显微镜ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ８ＢｒｕｋｅｒＮａｎｏＩｎｃ超声波清洗器ＫＱ－３００ＤＥ昆山市超声仪器有限公司电化学工作站ＣＨＩ６０４Ｄ上海辰华仪器有限公司水浴锅ＨＨ４常州国华电器有限公司一ＤＹＣＰ－３电泳槽１ＣＮ北京六仪器厂酸标仪Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯＴｅｃａｎＨ计ＨＳ－３Ｅ上海仪电科学仪器股份有限公司ｐｐ４．２．２试剂ｐＢＲ３２２质粒ＤＮＡ（日本宝生物医药公司，日本，ｐｒｅｍｉｕｍｒａｄｅ）ｇ电泳缓冲液的储备液ｘＴｒｉＮａＥＤＴＡ＊２Ｈ（ｌＯＴＡＥ）配制方法：称取４８．４ｓ碱，２２０７．４ｇｇ于ＩＬ的烧杯中，向烧杯中加超纯水约８００ｍＬ，充分溶解搅拌均勾，加入１１．４２ｍＬ的冰乙酸，搅勾后用ＮａＯＨ调节ｐＨ至８．０，加超纯水定容至１Ｌ，室温保存。４．２．３谅脂糖凝胶电泳实验为了验证蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用，我们做了琼脂糖凝胶电泳实验。实验中我们选取养麦蜂蜜为蜂蜜试样的代表。，以质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ为氧化损伤对象我们用ｐＢＲ３２２ＤＮＡ做了琼脂糖凝胶电泳实验。称取０．８ｇ琼脂糖于盛有１００ｍＬ－－ｉｉｘ－－ｍｍｏ－ｉ的核酸电泳缓冲液（ＴＡＥ，ｌＯＴＡＥ为４０ｍｍｏｌＬＴｒｉｓ碱和２０ｍｍｏｌＬ乙酸１ｌＩ／的ＥＤＴＡ混合液，）的锥形瓶中，放置在微波炉上加热至琼脂糖融化状态，摇勾。得到０．８％的琼脂糖凝胶。趁热向小锥形瓶中倒入大约２０ｍＬ琼脂糖凝胶，并加入１ｉＬ的ｊ３６ 西北大学硕士学位论文°ｇｏｌｄｅｎｖｉｅｗ摇勾。将冷却至６５Ｃ左右的琼脂糖凝胶混匀小心的倒入插好梳子的内槽玻。璃板上，胶液缓慢均勾展开，直到整个表面形成均匀平整无气泡的胶层待凝胶完全凝。ｘｘ固后，小心的将梳子取下内槽移至电解槽，加入ＩＴＡＥ电泳缓冲液（将ｌＯＴＡＥ用水稀释１０倍后获得）至没过胶板。－ｉ＂＇．－１Ｌ０．５的ＢＲ３２２１Ｌｌ％ｖ／ｖ，Ｌ１ｎｕｎｌｎ（）ＤＮＡ、（，）的Ｈ２Ｏ２、１ｐ硫酸铜ｏＬｎｇｎＬｐｎ（）－ｉ－和不同浓度的荞麦蜂蜜试样（２６ｉＬ０．１０ｍＬ分别用磷酸盐缓冲溶液（５０ｍｍｏｂｉＡ，４，＾，ｇ）°＝ｐＨ７．０）将体积补充到１５ｉＬ。恒温水浴锅３７Ｃ温育３０ｍｉｎ。然后在塑料纸上滴ｌ［ｉＬ的［ｌｏａｄｉｎｂｕｆｆｅｒ。５０Ｖｇ，混勾后用移液枪加到制好的凝胶板凹槽内电泳的电压设置为，电泳时间为Ｉｈ。运用ＧｄＤｏｃＸＲ凝胶成像系统拍照，并用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件（ｖｅｒｓｉｏｎ４．６．２，Ｂ－ｉｏＲａｄＣｏ．ＵＳＡ，）做了灰度分析。４定体系中的８－．２．４酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）测ＯＨｄＧ－－２＋－－—－Ｘ７－ｉＸ５ｉＸ３．ｉＤＮＡ１．０１０ｍＬ，Ｃｕ３．０１０ｍｏｌＩ／和Ｈ２０２３．０Ｋ）ｍｏｌＬ各取１（ｇ）（）（）ｍＬ混合均匀。－，室温放置３０分钟移取４０ｐＬ试样到９６孔平底酶标板，接着精确移取抗８Ｌ到５０Ｌ链霉亲和素－辣根过氧化酶轻基脱氧鸟昔抗体１０ｐ微孔中，再移取ｎ。将酶标板放置在水浴锅中３７ｒ保温６０分钟。弃去液体，接着用稀释后的洗漆液将酶标板洗漆５次。°每个孔中加入５０ｎＬ的显色剂Ａ，然后加入５０ｎＬ的显色剂Ｂ。震荡摇勾。３７Ｃ避光显色１０分钟。每个孔中加入５０１１＾的终止液，此时溶液从蓝色变成黄色。最后在酵标仪上４５０＾ｎｍ处测定各孔的吸光一。，其浓度为横坐标度以系列标准溶液的吸光度为纵坐标，作图－得到标准曲线。所有的吸光度数据均要扣除空白值（空白组不加试样，抗８轻基脱氧鸟－苦抗体，链霉亲和素辣根过氧化酶，只加显色剂Ａ和显色剂Ｂ和终止液，其余操作步骤相同。）。４．２．５ＡＦＭ实验原子力显微镜是一种用于研究固体材料表面结构的分析仪器，同时也是研究活细胞实时观察，大分子形貌的三维图像的有力工具。因此，为了研究ＤＮＡ生物分子在芬顿反应产生的轻基自由基的作用前后的形貌的变化以及蜂蜜中成分的加入对其的影响，我们用ＡＦＭ来研宄这些问题。用刀片勞开有玻璃光泽的云母片（１８ｍｍ＞＜１３ｎｕｎ），获得新鲜的表面，将该云母片＿２ｉｘ＊浸泡在氯化镁溶液（１．０ｌＯｉｎｏｌＩ／）约２０ｍｉｎ。镊子取出云母片，自然风干备用。移３７ 第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究－取１００ｉＬ小牛胸腺ＤＮＡ溶液（０．１７ｉｎｉＬＯ滴涂在上述处理过的云母片上，自然条ｔｔｇ＿ｉ件下瞭干，该组作为空白组。小牛胸腺ＤＮＡ（０．１７ｎｇＴｎＬ）中加入Ｈ２Ｏ２的浓度依次为－７－＂－＂＂－ｉ＇２＋５ｘｍｏ－ｘ＾．ｘ＾ｍｏ－ｘｍｏ．５１０ｌＬＭｌＯｍｏｌＬ５１０ｌＬ，Ｃｕ浓度均为３１０ｌｌＡ混合均匀放，置ｌＯｍｉｎ，然后分别移取１００ｉＬ该混合液滴涂在云母片上，。这三组［自然条件下瞭干＿－３－ｉ。在氧化损伤组溶液中分别加入原儿茶酸溶液（５＞＜１０ｍｏｌＬ）作为氧化损伤组，混合均匀放置１０ｍｉｎ，然后分别用移液枪移取１００混合液滴涂在云母片上，此三组作为对照组。自然条件下瞭干。然后将制备好的样品，放在ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ８原子力显微镜下，采用轻敲模式获取ＤＮＡ的形貌信息。４．２．６ＳＷＶ实验方波伏安法（ＳＷＶ）是在ＣＨＩ６０４Ｄ电化学工作站（上海辰华仪器有限公司，中国）上进行的，实验中采用三电极系统，修饰了的玻碳电极（ＧＣＥ）为工作电极，铀丝（Ｐｔ）电极作为对电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ为参比电极。（１）电极预处理：－Ａ玻碳电极表面用ａ３（０，ｂ０．０５ｍ）抛光至镜面用超纯水清洗然后放在无水＾；－乙醇和超纯水中超声处理各ｉ５ｍｉｎ在铁氰化钾溶液（Ｏ．ｌＯｍｏｌｌ）中，做循环伏安扫描；当峰电位差在０．０７Ｖ以内，则认定电极清洗干净；再用超纯水冲洗干净。瞭干备用。（２）玻碳电极（ＧＣＥ）的修饰和测定：－ｉ分别移取１０ｎＬ小牛胸腺ＤＮＡ溶液（３０ｎｇｍＬ）滴涂在４支预处理过的ＧＣＥ表面，自然晾干。得到４支ＤＮＡ／ＧＣＥ电极。实验开始前，电化学工作站需预热２０ｍｉｎ。ＣＥ电极为工作电极一／ｔ测定时修饰的Ｇ，ＡｇＡｇＣｌ为参比电极，Ｐ丝电极为对电极。将Ｈ＝支ＤＮＡ／ＧＣＥ电极直接浸在氮气除过氧的ＰＢＳ溶液（ｐ７．４）中做方波伏安扫描。另两支ＤＮＡ／ＧＣＥ电极先分别浸在两个不同浓度的芬顿反应中２０ｓ，然后浸在氮气除过氧的一＝ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中做方波伏安扫描。最后支ＤＮＡ／ＧＣＥ电极，滴涂１０１１＾原儿茶＾＇一－ｘ－酸溶液（１．０１０２ｍｏｌＬＯ修饰得到支ＰＡ／ＤＮＡ／ＧＣＥ电极，并在ＰＢＳ中做方波伏安？扫描。电位范围扫描都是０１．０Ｖ，得到方波伏安曲线。４．２．７ＣＤ实验圆二色（ＣｉｒｃｕｌａｒＤｉｃｈｒｏｉｓｍ，ＣＤ）光谱通过测量生物大分子的圆二色性从而得到一，是简便、快捷、灵敏的研究生物大分子结构的手段之生物大分子的结构信息，我们３８ 西北大学硕士学位论文采用圆二色谱法研究ＤＮＡ在被蜂蜜保护前后的结构变化情况。将待测溶液加入石英比色皿中，在２（ｒＣ条件下扫描获得ＣＤ谱，扫速设定为１００ｎｍ／ｍｉｎ，，带宽为２ｍｎ扫描圈数为１０次。实验数据用Ｃｈｉｒａｓｃａｎ仪器控制和数据分析软件处理得到。４．３结果与讨论（１）琼脂糖凝胶电泳实验结果和ＥＬＩＳＡ实验结果２＋ＳＡＣＵ－－ＤＮＡ体系反应的终产物做了研究用ＥＬＩ法对Ｈ２０２，实验结果表明：该体２＋？系产物中含有ＤＮＡ氧化损伤标志性产物一８－ＯＨｄＧ。这说明了Ｃｕ和Ｈ２Ｏ２产生的０Ｈ２＋－－－能对ＤＮＡ造成氧化损伤，产物中有８ＯＨｄＧ。ＣｕＨ２０２ＤＮＡ体系的琼脂糖电泳实验ＤＮＡ４１结果如图４．１时．Ｌ０）超螺旋结构的ＤＮＡ的含量是７６．２４％所示。仅有，（见图，（结果如图４．２），当过氧化氢和硫酸铜的加到ＤＮＡ溶液中以后，超螺旋结构的ＤＮＡ＿２含量降低了２８．９６％（见图４．１，Ｌ１）。养麦蜂蜜（１．３ｘｌ０加入后，ＤＮＡ的超螺旋结构恢复到了６９．１６％（见图４．１，Ｌ２），而且ＤＮＡ的超螺旋含量随着蜂蜜浓度的增＿２－ｉ°－３＞＜１加而增大。当荞麦蜂蜜浓度为．９０ｍＬ时，ＤＮＡ的超螺旋结构的含量达到７０．４５／＾ｇ（４１Ｌ４。：见图．，）实验结果表明荞麦蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤具有很强的保护能力，而且蜂蜜浓度越大保护能力越强。＊＾１２３４．１１１＿ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｌ４１图．琼脂糖凝胶电泳实验结果－ｉＬａｎｅ正常的．００５ＤＮＡＤＮＡＬａｎｅ１０５ＤＮＡ＋１Ｌ１１ｉＬ１０ｍｍｏｌＬ：．空：．的％Ｈ２０２＋．ｎｇ（白组）；ｎｇｎｊ的－ｉＬ－４０．ＣｕＳ０ＤＮＡ氧化损伤模型组ａｎｅ２．５ＤＮＡ＋＋１Ｌ１．＋４）：１ｌＬ的ｌ％Ｈ２０２的０ｍｍｏｌＬＣ（ＵＳＯ４；｜ｉｇ＾ｎ－ｉ２４’依次加入６ｉＬ０．１（）ｍＬ荞麦蜂蜜（蜂蜜保护组，，＾ｇ）３９ 第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究表４．２琼脂糖凝胶电泳实验灰度分析结果ＤＮＡ形态０空白１模型２Ｃ１３Ｃ２４Ｃ３（）（）（）（）（）±１±２士士±１２３６１９．．．５５．２开环／线性（％）．７．５２．７２．１５３０８４０．５４２９５７０．４７２９８７６２４±１１９４７２８±２１５６９．１６士０．５４７０．４３士０．４７７０．４±１２８超螺旋ＤＮＡ（％）．．．．５．－－－－－Ｃ２‘ｉ２－ｍＬｉｘ２－１Ｃ２和Ｃ３浓度分别是１．３ｘ１０ｍＬ２．６ｘ１０３．９１０ｍｌＡ表中数据结果是平行３，的ｇ，ｇ，ｇ组实验结果的平均值。（２）ＡＦＭ实验结果Ｈ國國■■■Ｈｉ图４．２不同程度轻基自由基诱导的ＤＮＡ氧化损伤的ＡＦＭ图－－－－．２＋ｘ５ｉ７＞２＋０１７ｘ－ｌＢ－ｍｏ．－Ｈｘ－－－ＡＤＮＡｍＬ：ＤＮＡＣｕ３ｌＯＬＯ２５ｌ０ｍｏｌＬＣ：Ｂ：ＤＮＡｕ：．ｌ２Ｃ（｜ｇ）；（）（）；－－－６ｉ２＋６－ｘｍｏ．Ｄ－－ｘ－Ｈ２Ｏ２１１０Ｌ：ＤＮＡ１Ｌ１ｌ）ＣｕＨ０５０ｍｏｌ（；２２（）ＡＡＡＦＭ图图４．２是ＤＮ在云母片上的，从图中可以看出，当ＤＮＡ堆积在云母基底表面“”时，基底表面呈现出许多高低起伏的小山，而随着过氧化氢的加入和其浓度的增加“”，图４．２ＢＣＤ中的小山的数目逐渐减少，这也意味着由于ＤＮＡ被损伤而使其三维结构被破坏；形貌发生很大的变化。当抗氧化剂加入后，ＤＮＡ三维结构被破坏的一程度有所缓解，这表明抗氧化剂有定的保护作用。（３）ＳＷＶ实验结果”４０ 西北大学硕士学位论文－６３．５ｘ１０■。－ｚ：：？－乂ｙ１．５ｘ１０－６－１．０ｘ１０＂＇—￣￣—￣—Ｉ．■‘．．．５Ｉ．０ｘ１００．２０．４０．６０．８１．０Ｅ／Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣＩ＾＾４ｕ－Ｈ－ＤＮＡＷＶ曲图．３蜂蜜中原儿茶酸加入到ＣｚＯｚ体系的Ｓ线２＋－５－＇－ｉｘ－－ＤＮＡ／ＧＣＥｂＤＮＡ／ＧＣＥ３１０ｌＬ－０ａ电极入Ｃｕ．０２ｍｍｏｌＬ，电极浸ｍｏ过氧化氢浓度ｃ，；（）（）；，２＋－５＂＇－＇－－／ｘ１ｍ－ＤＮＡＧＣＥ电极浸入Ｃｕ３０ｏｌＬ过氧化氧浓度００３ｍｍｏｌＬＰＡ／ＤＮＡ／ＧＣＥ．ｄ电极（）（）；，浸－＂２＋５ｉ－＇ｕ３ｘ．－入Ｃ（１０ｍｏｌＬ／）过氧化氢浓度（０．０３ｍｍｏｌＬ）为了探宄蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理，运用方波伏安法来研宄ＤＮＡ修饰的玻碳电极的电化学行为０７５Ｖ一。从图４．３中可以看出在．有个峰，该峰是鸟噪呤失去２个电子被氧化产生的信号。随着芬顿试剂的浓度增加，该氧化峰的峰电流显著下降。这８－ＯＨｄＧ可能是由于部分鸟噪呤损伤后形成，导致ＤＮＡ双链结构中鸟噪呤减少，所以电流值下降。当蜂蜜中原儿茶酸加入后，峰值大幅增高，几乎恢复到未被损伤之前的程１８［］度。这是由于蜂蜜中的黄酮类物质直接消除了芬顿试剂产生的自由基。（４）ＣＤ实验结果２２０２４０２６０２８０３００３２０２２０２４０２６０２８０３００３２０ｈＷａｖｅｌｅｎｇｔｈｎｍＷａｖｅｌｅｎｇｔｎｍ（）（）２＋－０－图４．４蜂蜜中謝皮素加入到ＣｕＨ２２ＤＮＡ体系的ＣＤ图－＂－－．ｉ２＋４－ｉ．ｉ２＋－－ａ－ｘ－Ａ：ＤＮＡ２４ｍＬ：ＤＮＡＣｕｌｌ０ｍｏｌＬ０．１ｍｏｌＬｃ：ＤＮＡＣｕ图：（ｎｇ）ｂ过氧化氢（过氧化；（）ｎ）；４１ 第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究－２＋＂＇ｉ－－０ｍｏ０．４ｌＬｄ：ＤＮＡＣ．８ｌＬ氢（ｎｍｏ）；ｕ过氧化氢（ｎ）；－－－ｉ＞ｉ－－Ｂ２４Ａ２４ｉＬ－２４图：ａ：ＤＮＡｉｎＬｂ：ｂｎｃ：Ａｃ２４ｉｎＬｄ：Ａ图ｄ槲皮素（ｎｇ）；图槲皮素（Ｍｇ）；图槲皮素（ｎｇ）；（－ｉＨｇｍＬ）由于ＤＮＡ特殊的双螺旋结构，分别在ＣＤ谱上的２４６ｎｍ处和２７５ｒｎｎ处可以得到一一。。这是Ｂ－ＤＮＡ的典型特征个负峰和个正峰见图４．４Ａ，其中２７５ｎｍ的正峰与碱基堆积和核苷酸的成键状况有关。随着过氧化氧浓度增大，产生轻基自由基增多，导致ＤＮＡ的损伤更严重。在ＣＤ谱图上ＤＮＡ的负峰显著减小，正峰逐渐减小。２４６ｎｍ处的负峰减小程度明显，这可能是由于经基自由基和ＤＮＡ作用导致电子跃迀偶极矩发生变化。蜂蜜中的槲皮素加入后５５ｎｍ，２８５ｎｍ．４Ｂ）。且，２处出现负峰处出现正峰（见图４和同浓度下的芬顿试剂作用下的谱图对比发现，加了槲皮素的ＣＤ谱发生右移，且负峰１９［］和正峰位置和大小发生变化。这可能是由于槲皮素的加入，导致ＤＮＡ构象的改变，或许是槲皮素能够进入到ＤＮＡ双螺旋结构的大沟中，使得ＤＮＡ免遭损伤。４．４结论２＋的催化作用下过氧化氢在Ｃｕ，产生的经基自由基可以将ＤＮＡ的双螺旋结构切割成开环或者ＤＮＡ的片段。这从琼脂糖凝胶电泳实验图中可直观看到，甚至还会将ＤＮＡ一２＋８－ＯＨｄＧ氧化得到，它已经用ＥＬＩＳＡ检测出来。这说明ＤＮＡ在过氧化氢Ｃｕ的催化。作用下，对ＤＮＡ造成的氧化损伤严重ＤＮＡ氧化损伤的构象变化在ＡＦＭ图中可明显看出，加入抗氧化剂后，ＤＮＡ的形貌学发生了改变，这从ＡＦＭ图中可以看出。从ＳＷＶ可以看出，电化学信号有所恢复。ＣＤ谱图中ＤＮＡ构象的变化也有明显变化。当蜂蜜中的抗氧化物质加入后，化学发光明显减弱。从紫外光谱图中，可以看出蜂蜜能介入反应，或许会导致反应中间体的减少。从ＡＦＭ图中可以看出ＤＮＡ的结构一定的恢复，在ＳＷＶ图中峰电流接近ＤＮＡ在ＧＣＥ表面的响应，在ＣＤ图中可以看出，一定程度影响了ＤＮＡ的结构抗氧化物质的加入，从而保护了ＤＮＡ免受经基自由基的氧化损伤。达到了保护ＤＮＡ氧化损伤的作用。黄酮类物质可以和过氧化氧反应，还可以与金属离子进行络合，减少轻基自由基的生成，从而保护了ＤＮＡ的氧化损伤。４２ 西北大学硕士学位论文参考文献［１］ＫｒｓｔｏｎＴ．Ｂ？ＧｅｏｒｉｅｖＡ．Ｂ．ＰｉｓｓｉｓＲｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓａｎｄＤＮＡＤａｍａｅｙ，ｇ，，ｇｉｎａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｉｓｕｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｅｃｕｌａｒＨｕｍａｎＣＪ，ＭｔａｔａｎｄＭｏｇ［］ｅｃａｎｓｍｓａｅｎｅｓｓ２０７－ＭｈｉｏｆＭｕｔｇｉ１１１１１：１９３２０１，，（）２ＲｏｂｅｒｔｓＳ．Ａ，ＳｔｅｒｌｉｎＪ．ＴｈｏｍｓｏｎＣｅｔａｌ．ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＹｅａｓｔａｎｄｉｎＨｕｍａｎ［］，ｇ，ｐ”ＣａｎｒｉｓｅｒｏｍａｍａｅＳ－ｉｎｌｅａｎｄＤＮＡｉｏｎｓｅｃｕｒｃｅｃｅｒｓＣａｎＡＦＤｇｄＬｏｎｇｇｓｔｒＲｅＪ．Ｍｏｌｌａｌｌｇ［］，－２０１２４６４：４２４４３５，（）３ＫｏｍｈａｕｓｅｒＡ－ｔ－Ｌ．ＵＶＩｎｄｕｃｅＤＮＡＰｒｏｅｉｎＣｒｏｓｓｉｎｋｓｉｎＶｉｔｒｏａｎｄｉｎＶｉｖｏＪ，［］［］ｃｈｅｍ－Ｐｈｏｔｏｉｓｔｒｙａｎｄｈｏｔｏｂｉｏｌｏ１９７６２３６）：４５７４６０ｐｇｙ，，（４ＣｈａｍａｎＪ．Ｒ．ＴａｌｏｒＭ．Ｒ．Ｇ．ＢｏｕｌｔｏｎＳ．Ｊ．ＰｌａｉｎｔｈｅＥｎｄＧａｍｅ：ＤＮＡ［］ｐ，ｙ，ｙｇ－Ｄｏｕｂｅ－ｌｅＳｔｒａｎｄＢｒｅａｋＲｅａｉｒＰａｔｈｗａＣｈｏｉｃＪ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｅｌｌ２０１２４７４：４９７５１０ｐｙ［］，，（）－ｔ－－［５］ＴａｌｈａｏｕｉＩ．ＣｏｕｖｅＳ．，ＩｓｈｃｈｅｎｋｏＡ．Ａ．，ｅａｌ．７８ｄｉｈｒｏ８ｏｘｏａｄｅｎｉｎｅａＨｉｈｌｙ，，ｙｄ，ｇＭｕｉｃｃｉｓｒｅａｉｅｒｉｃｈｉａａｎｄａｎｉｓｍ－ｔａｇｅｎＡｄｄｕｔｒｅｄｂＥｓｃｈＣｏｌｉＨｕｍＭａｔｃｈＳｅｃｉｆｉｃ，ｐｙｐ－Ｕｒａｃｉｌ／ｔｈｍｉｎｅＤＮＡｌｃｏｓｌａｔｅｓＪ，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ２０１２：ｋｓｌｌ４９ｙｇｙｙ［］，ｇＷｕ－６Ｌ．Ｌ．ＣｈｉｏｕＣ．ＣＣｈａｎＰ．Ｙ．ｅｔａｌ．Ｕｒｉｎａｒ８ＯＨｄＧ：ａｍａｒｋｅｒｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｔｏ［］，，ｇ，ｙＤＮＡａｎｄａｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｆｏｒｃａｎｃｅｒａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｓＪ．ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，［］，２００４３３９－１：１９，（）－－ｍｅｄ［７ＡｎｅｌａＭａｒｔｉｎｅｚＣＧｏｏｄｍａｎＣＢｒｕｍａｈｉｍＪ．ＭｅｔａｌｉａｔｅｄＤＮＡｄａｍａｅａｎｄｃｅｌｌ］ｇ””ｇｇｄｅａｔｈ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｓｅｕｅｎｃｅｓＪｅａｏｍ２０１４．Ｍｔｌｌｉｃｓ，，ｑ［］，，－６８：１３５８１３８１．（）８ＨａｉｉｓＭ．Ｃ．ＹａｏｋｎｅｒＢ，Ａ．ＴｈｅＡｉｎＳｔｒｅｓｓＲｅｓｏｎｓｅＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｅｌｌ２０１０４０２：［］ｇ，ｇｇｐ［］，，（）３３３－３４４Ａ－ＴｒａｃｈｏｏｔｈａｍＤｌｅｘＪＨｕａｎＰａｒｅｎａｎｃｅｒｅｓＲＯＳｍｅｄａｅ９．ａｎｄｒｅ．．ＴｔｉＣｌｌｂｙｉｔｄ［］，，ｇｇｇＣＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ：ＡｒａｄｉｃａｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｐｐｒｏａｃｈ？［Ｊ］，ＮａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００９，８７５７９－５９１（）：１０Ｓｈｕｋｌａ．ｓｈｒａａｎｘｄａｔｉｖｅｅｓｓｉｎｅｕｒｏｄｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｖａｎｃｅ［］ＶＭｉＳ．Ｋ．ＰｔＨ．Ｃ．ＯｉＳｔｒＮＪ．Ａｄｓ，，ｇ［］ｉｎｈａｒｍａｃｏｌｏｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ２０１１ｐｇ，， 第四章蜂蜜对ＤＮＡ氧化损伤的保护机理探究－［１１］ＣｏｌｏｔｔａＦＡｌｌａｖｅｎａＰＳｉｃａＡ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＴｈｅＳｅｖｅｎｔｈＨａｌｌｍａｒｋ，，，ｏｆ－Ｃａｎｃｅｒ：Ｌｉｎｋｓｏｅｎｅｉｃｎｓｔａｂｉｌｉａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｓ２００９：１ｔＧｔＩｔｙＪ．Ｃｇｉ３０７０７３１０８１［］，，（）［１２］王锦梅．洋槐蜜，油菜蜜和荆条蜜花源标识物的确定及应用［Ｄ］．西北大学，２０１４［１３］ＣｉｍｐｏｉｕＣ．，ＨｏｓｕＡ”ＭｉｃｌａｕｓＶ．，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＦｌｏｒａｌＯｒｉｇｉｎｏｆＳｏｍｅＲｏｍａｎｉａｎＨｏｎｅｙｓｏｎｔｈｅＢａｓｉｓｏｆＰｈｓｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｅｒｔｉｅｓＪ．ｙｐ［］ＳｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａＡｃｔａＰａｒｔＡ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２０１３，１００：１４９－１５４［１４］ＯｕｃｈｅｍｏｕｋｈＳ”ＬｏｕａｉｌｅｃｈｅＨ．，ＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒＰ．ＰｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄ－ＰｏｌｌｅｎＳｅｃｔｒｕｍｏｆＳｏｍｅＡｌｅｒｉａｎｈｏｎｅｓ．Ｆｏｏｄｒｏｌ２００７８１：２ｐｇｙ［Ｊ］Ｃｏｎｔ，１）５５８，（１５常丹周梦遥．Ｊ．２０１０１１：［］，，徐瑞哈，等蜂蜜抗氧化成分的研究进展［］中国蜂业，（）３８－４０１６ＺｈｏｕＪ．ＬｉＰ．Ｃｈｅｎ．ｅｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆｅｃｓｏｆＢｕｃｅａｏｎｅｙＮ．ＥｔｋｗｈｔＨｏｎＤＮＡＤａｍａｅ［］，，ｇ，ｇＩｎｄｕｃｅｄｂＨｄｒｏｘｌＲａｄｉｃａｌｓＪ．ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏ２０１２５０８：ｙｙｙ［］ｇｙ，，（）２７６６－２７７３１７ＣｈｅｎＷ．Ｚｈｕ．Ｘｉａ．ｅｔａｌ．ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｅｎＳｅｃｉｅｓＳｃａｖｅｎｉｎＡｃｔｉｖｉｔａｎｄＤＮＡ［］，Ｑ，Ｑ，ｙｇｐｇｇｙＰｒｏｔｅｃｔｉｎＥｆｅｃｔｏｆＦｒｅｓｈａｎｄＮａｔｕｒａｌｌＦｅｒｍｅｎｔｅｄＣｏｃｏｎｕｔＳａＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄｇｙｐ［］ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ－Ｂｙ２０１１３５５：１３８１１３８８，，（）［１８］孟庆华．天然黄酮类化合物清除自由基机理及其应用进展Ｊ］．云南民族大学学报［－然科学版）：（自，２０１２，２１（２）７９８３１９］ＨｅｇｄｅＡ．ＨＰｒａｓｈａｎｔｈＳ＿Ｎ？ＳｅｅｔｈａｒａｍａａＪ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＦｌａｖｏｎｏｉｄｓ［”，ｐｐｗｉｔｈＣａｌｆＴｈｙｍｕｓＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｄｂｙＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｊｏｕ－ｒｎａｌｏｆｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ２０１２６３：４０４，，ｐ４４ 攻读硕士学位期间取得的科研成果攻读硕士学位期间取得的科研成果１．期刊论文＞徐盼；聂菲；程妮；曹炜。新型化学发光方法用于评价ＤＮＡ氧化损伤及反应机Ｊ－理．光谱学与光谱学分析２０１４３４１０：４３５４３６［］，（）＞ＦｅｉＮｉｅＰａｎＸｕＷｅｉＣａｏ．ＡＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＥｖａｌｕａｔｉｏｎｔｈｅ；；ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＤＮＡＯｘｉｄａｔｉｖｅＤａｍａｇｅＥｆｆｅｃｔｏｆＨｏｎｅｙ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２．学术会议论文＞徐盼；轰菲；程妮；曹炜。新型化学发光方法用于评价ＤＮＡ氧化损伤及反应机理，Ｃ．２０１４．１０第十八届全国分子光谱学学术会议［］２＋＞卜敏；李治；徐盼；聂菲。原位合成石墨烯构置新型Ｒｕ（ｂｐｙ）３固相电化学发光传感器的研宄，第十二届全国电分析化学学术会议［Ｃ］．２０１４．４３．参与重大科研项目＞国家自然科学基金：蜂蜜花源粉类标记物与酷类对ＤＮＡ氧化损伤的保护机制（项１目编号：３２７２５１０）＞教育厅重点实验室计划项目：基于新型功能材料的高灵敏生物传感器研究（项目编号：１１ＪＳ０８０）４．发明专利＞轰菲一。．；徐盼；路凯；郑健斌种可控焚光石墨稀量子点的制备方法［Ｐ］中国专利２０１４１０８２８３６４．９４５ 致谢致谢。三光阴似箭，岁月如梭年时光，匆匆流过。记得三年前我怀揣着梦想来到了古一城西安，为自己是西北大学分析科学研宄所的员而感到光荣。而今天我的研究生生涯。即将结束，三年间我受益匪浅在此，衷心感谢曾经支持和帮助过我的老师和同学们。、特别感谢分析科学研究所所长郑建斌教授，郑老师渊博的科学知识严谨的治学态度、精益求精的工作作风、诲人不倦的良师风范都深深感染和激励着我。除此之外，郑老师还时常教导我做人做事，也使我受益终生。在此，谨向郑老师致以崇高地敬意和衷心地感谢。特别感谢我的导师曹讳教授对我工作的悉心指导，生活上的关心和帮助。曹老师渊博的知识和忘我的工作态度深深感染着我，不断鞭策我前行。在此向曹老师致以衷心地感谢和深深地敬意！。、特别感谢聂菲老师，本论文是在聂老师的悉心指导下完成的从选题实验方案的选择、撰写和修改无不凝结着聂老师的大量心血和汗水。轰老师的谅谆教诲和鼓励，我将铭记终生。在此，谨向聂老师致以崇高地敬意和衷心地感谢。衷心感谢杨鹰老师、李简老师、李延老师、盛庆林老师、宁晓辉老师、汤宏胜老师、张欣老师和化工学院食品工程系高慧老师、王毕妮老师、程妮老师和邓建军老师给予的热心帮助！、支持和鼓励感谢王锦梅师姐、路凯师兄、李治师兄、刘江涛师兄、张天龙师兄、武倩、韩娟、张赛、李博强、王鹏鹤、张明瑛、盛丽雯、高钧、许琳、赵静、孙政等同学和化工学院食品工程系周厚报、王远、贾歌、孙甜、杜冰、王萌、黄庆媛、贺琼、胡伟博等同学在实验及生活上给予的关心和帮助！感谢在百忙之中审阅我论文以及参加论文答辩会的各位专家。、最后，深深感谢我的家人和朋友所给予我精神上的支持鼓励和无私的关爱！徐盼二零一五年三月于西北大学分析科学研宄所４７