浅议利用废糖蜜生产单细胞蛋白的实验研究 63页

桂林工学院硕士学位论文利用废糖蜜生产单细胞蛋白的实验研究姓名：姚毅申请学位级别：硕士专业：市政工程指导教师：曾鸿鹄20080401 桂林工学院硕士学位论文IIIIIlII_摘要广西是我国的产糖大省，拥有丰富的甘蔗糖蜜资源，但长期以来，这些宝贵的糖蜜资源只是用来生产经济附加值较低的酒精产品，且大多数的中小型糖厂由于资金和技术的制约所产生的糖蜜酒精废液一直不能达标排放，这样不仅对环境造成严重的污染而且制约了广西糖业的发展。因此，探索出一条糖蜜废液资源化利用的新路子意义非常重大。单细胞蛋白(Singlecellprotein，简称SCP)指的是单细胞菌体蛋白，其蛋白含量高，营养丰富。在当今世界性饲料蛋白质资源严重不足情况下，尤其是在我国，随着生活水平的不断提高，饲料蛋白已经远远不能满足饲养业发展的需要，开发新的饲料蛋白资源已经成为我国饲料业的重要课题。本研究利用制糖副产物废糖蜜为原料，液体发酵制取单细胞蛋白饲料，探索出具有工业化应用潜力的工艺路线。主要研究内容如下：l、通过实验分别测得甘蔗蜜中还原糖和总糖含量。按还原糖与总氮计算所得的C／N原子摩尔比，从而证明甘蔗糖蜜是用于发酵生产单细胞蛋白的理想原料。2、通过发酵生产SCP的四株菌株性能的测定可知，热带假丝酵母、皮状丝孢酵母、产朊假丝酵母都是生长率快、细胞干重高、粗蛋自含量较高、总产量高的菌株，为利用废糖蜜生产SCP的最佳菌种。3、利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的最佳菌种组合为白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母以l：1：l的比例组合，投菌量为10％，在209／100mL的糖蜜废液中，分别投加硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙，投加量分别为O．39／100mL、0．39／lOOmL和0．69／100mL，调节pH为5．O，在30℃下发酵72h，经过干燥处理，可获得酵母干菌体。4、采用序批次操作，以白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母组成的混合菌种在糖蜜废液培养基中发酵，在4L生物自动发酵罐中进行放大培养，测定了混合菌的生长曲线，并借助手持式糖量计对培养液的糖度随酵母菌生长所产生的变化进行了测定。5、采用Monod模型对混合菌发酵得到了较好的理论论述，并取得了相关的动力学参数，阐明了混合菌发酵的动力学特征。6、废糖蜜是制糖工业的主要废弃物，经稀释、酸化、澄清、投加营养盐后，在最适发酵条件下生产单细胞蛋白，具有很好的经济效益和社会效益、并具有很好的发展前景。关键词：废糖蜜单细胞蛋白酵母菌好氧发酵 桂林工学院硕士学位论文AbstractGuangxi，oneofthelargestsugarproducingprovincsinChina,hasrichresourcesofmolasses．Butforalongtime，thesevaluablemolassesresourceisonlyusedtoproducealcoholproductwhichhaslittleaffixation,andmolassesalcoholliquidproducedbymostofthesesugar-refineryc矗n"treleasestandardbecauseoftherestrictionofthefundandtechnology，Inthisway，itnotonlyhasseriouspollutiontoenvironment，butalsorestrictsthedevelopmentofGuangxiSugar．Soithasgreatsignificancetoexploreanewwayformolassesrecycle．SingleCellProtein(SCP)referstOsingle-cellbacteriaprotein；ithashighproteinandrichnutrition．Withthedevelopmentofthelivingstandardandtheseriousshortageoffodderproteinresourcesintheworld，especiallyinChina,fodderproteinhasbeenfarfrommeetingtheneedsoffarmers，SOthedevelopmentofnewfodderproteinresourceshasbecomeanimportanttopicinOurfodderindustry．Thispaperusedwastemolassesofsugarby—productasrawmaterialtoproducesingle—cellproteinfeedafterliquidfermentation，whichhasexploredaprocessrouteswithpotentialindustrializationapplications．Themaincontentsareasfollows：1．Intheexperiment，thereducingsugarcontentandthetotalsugarcontentshouldbemeasuredandusethereducingsugarandthetotalnitrogentogettheC／N．TheresultshowedthatsugarcanemolassesistheidealrawmaterialstoproduceSCP．2．TheCandidatropicalis，whichhasfastergrowthrate，heavierdrycell，highercrudeproteincontent，andhigherproductionstrainsinproducingSCP，isthebestbacteriatoproduceSCPusingwastemolasses．3．Geotrichumcandidum，CandidatropicalisandCandidautilistotheratioof1：1：1，10％ofbacteria,isthebestwaytoproduceSCPusingwastemolasses．Andin213lg／lOOmLWastemolasses，weput0．39／lOOmLMgS04，0．3edl00mLKHtPO)s，0．69／100mLCa(H2P04)2，underpH5．0。at30℃fermentedfor72hafterDrying，togetdryyeastcell．4．AsequencebatchoperationhasbeenusedtogetthegrowthcurveofMixedbacteriabyfermentingthemixedstrainofGeotrichumcandidum，CandidatropicalisandCandidautilisintheationofmolasseswaste，andenlargetrainingin4Loffermentationtank．Finally，usehand—heldsugarcontentmachinetogetthechangeofsugarcontentofthemediumwiththegrowthofyeast．5．UsingMonodmodel，goodtheoreticalexpositions，correlativekineticparameters，andKineticcharacteristicsofmixedfermentationweregot．n 桂林工学院硕士学位论文6．ThewastemolassesisusedtoproduceSCPafterdiluting，acidificating，clarificating，andnutrienting，whichnotonlyhasgoodeconomicandsocialbenefits，butalsohasagooddevelopmentprospects．Keywords：wastemolasses；SCP；microzyme；aerobicfermentationIII 桂林工学院硕士学位论文研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明独创性声明本人声明：所呈交的论文是我个人在曾鸿鹄副教授指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并致以了谢意。学位论文作者(签字)：i拯签字日期：乙鳇孟．‘：19版权使用授权说明本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。(保密论文在解密后遵守此规定)学位论文作者(签字)：指导教师签字：签字日期：三柚宙．‘．cf兰 桂林工学院硕士学位论文1．1导言第1章概论单细胞蛋白(singlecellprotein简称SCP)亦称微生物蛋白、菌体蛋白，是指细菌、真菌和微藻在其生长过程中利用各种基质，在适宜的培养条件下培养细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白(microbial．protein)。人类利用微生物生产食品已有数千年的历史，而近代采用培养微生物为食物的生产始于德国。当时处于第一次世界大战，为了解决粮食问题，第一次工业化生产SCP作为人类食品fl】。SCP的生产与开发，近20年来受到世晃科技界和工业界的注目【21。从1967--一1981年已召开过三次国际SCP会议，上百家公司、大学和研究所参与开发f31。由于世界人口急增，据估计人口每年增长速度为百分之二以上，但粮食方面仅靠高等植物的传统生产方法，其增长率赶不上世界人口的增加率。同时由于世界经济日趋富裕，生活水平不断提高，对动物蛋白质的需求量增加很快。然而，生产动物蛋白却需要消耗很多植物蛋白，如要获得牛蛋白1需消耗植物蛋白3一-．4；要获得家禽蛋白1需消耗植物蛋白7～10，很不经济。并且有些家禽与人类争粮食。由此可见，粮食不足中最严重的是蛋白质问题。1967年在美国麻省理工大学召开了第一次世界SCP会议，确认了开发SCP是解决粮食饲料的重要途径之一14巧】。广西是全国甘蔗糖业的生产中心，其蔗糖产量已经连续几年位居全国首位。因此在广西每个榨季都会产生大量的制糖副产物——甘蔗糖蜜。甘蔗糖蜜目前在广西区内主要是用于生产附加值较低的酒精产品，但是多数糖厂附设的酒精生产车间规模不大且较为分散，酒精废液处理设施运行效果参差不齐，随着环境管理的严格化，糖蜜酒精废液达标排放的压力下，大多数的中小型糖厂纷纷关闭了酒精车间和酒精生产线。为了能更好地利用甘蔗糖蜜这一重要的资源，进一步提高原料的经济附加值，减少其生产废弃物对环境的污染，研究出一条利用糖蜜资源生产高附加值的单细胞蛋白产品使其变废为宝的新方法已成为当前面临的紧迫任务。1．2单细胞蛋白1．2．1单细胞蛋白的生物学特性微生物细胞中含有丰富的蛋白质，例如酵母菌蛋白质含量占细胞干物质的45％"--55％：细菌蛋白质占干物质的60％"-80％：霉菌丝体蛋白质占干物质的30％"-50％；单细胞藻类 桂林工学院硕士学位论文Ilira如小球藻等蛋白质占干物质的55％～60％，而作物中含蛋白质最高的是大豆，其蛋白质含量也不过是35％"-"40％。SCP的具体特性表现为以下六个方面：1、SCP营养丰富单细胞蛋白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质，如酵母菌体蛋白，其营养十分丰富，人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸外，它具备7种，故有“人造肉”之称。一般成人每天吃干酵母lO--一159，蛋白质的需要量就足够了。微生物细胞中除含有蛋白质外，还含有丰富的碳水化合物以及脂类、维生素、矿物质，因此单细胞蛋白营养价值很高。与黄豆粉相比，蛋白质含量高达15％，而可利用氮比大豆高20％，如添加蛋氨酸则可利用氮达95％以上。2、利用原料广，可就地取材，廉价大量地解决原料问题生产单细胞蛋白的原料来源极为广泛，一般分为四类：一是糖质原料，如淀粉或纤维素的水解液、亚硫酸纸浆废液、制糖的废蜜等；二是石油原料，如柴油、正烷烃、天然气等；三是石油化工产品，如醋酸、甲醇、乙醇等；四是氢气和碳酸气。最有前途的原料是可再生的植物资源，如农林加工产品的下脚料、食品工厂的废水下脚料等。这些资源数量多，而且用后可以再生，还可实现环境保护。3、生产速率高一般蛋白质生产速度同猪、牛、羊等体重的倍增时间成正比。微生物的倍增时间比牛、猪、鸡等快千万倍，如细菌、酵母菌的倍增时间为20,～120h。霉菌和绿藻类为2一-．6h，植物l～2周，牛1～2个月，猪4"-6周。据估计，一头500kg公牛每天生产蛋白质0．4kg，而500kg酵母至少生产蛋白质500kg。4、劳动生产率高生产不受季节气候的制约，易于人工控制，同时由于在大型发酵罐中立体式培养占地面积少。如年产10万吨的SCP工厂，以酵母计，按蛋白质含量45％计算，一年所产蛋白质为45000t。一亩大豆按亩产200蚝计，含蛋白质40％，则一年为80kg蛋白质。所以一个SCP工厂所产蛋白质相当于562500亩土地所产的大豆。5、可以完全工业化生产单细胞蛋白生产比农业生产需要的劳动力少，又不受地区、季节和气候条件的制约，可在占地有限的小设备上进行，不仅数量大，而且质量好，远远超过现有粮食品种的蛋白质。许多国家单细胞蛋白的生产已具有很大的规模，取得了丰硕成果。前苏联年产单细胞蛋白质达数百万吨以上，保加利亚也有几十万吨之多。德国、美国、前苏联、加拿大等国早已用单细胞高活性生物饲料代替了鱼粉。6、单细胞生物易诱变，比动、植物品种容易改良可采用物理、化学、生物学方法定向诱变育种，获得蛋白质含量高、质量好、味美，并易于提取蛋白质的优良菌种。．2． 桂林工学院硕士学位论文1．2．2生产单细胞蛋白的菌种菌种是发酵必不可少的物质。菌种的优良是成功生产菌体蛋白饲料的关键和保证。大量事实表明，微生物发酵法是各种原料加工最为经济的方法。1989年，美国FDA批准了41种认为是安全、有效的微生物，我国农业部于1999年6月公布了啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、纳豆芽抱杆菌等12种可作为饲用微生物。用于生产蛋白饲料的微生物需符合以下条件：>繁殖速度快，茵体蛋白含量高>能较好地同化基质碳源及无机氮源>菌种性能稳定>无毒性和致病性从当前的研究进展来看，一般采用混和菌种发酵较单菌种发酵效果要好，其优势在于多个菌种之间可互相补偿其缺陷，进行协同互生发酵。国内外都从这方面做了大量的尝试和研究，取得了一定的成果。在生产中根据原料和生产条件选择合适的菌种。至今，很少有病毒、立克次氏体、支原体(霉形体)、衣原体、螺旋体和原生动物作饲料微生物的报道，SCP生产的微生物种类选择应从安全性、实用性、生产效率和培养条件等方面考虑。目前用于生产单细胞蛋白的微生物主要包括4大类群，即非致病和非产毒的酵母菌、细菌、真菌和微藻；主要细菌有乳酸菌、粪链球菌、双歧杆菌、光合细菌、芽孢杆菌、纤维素分解菌等；主要酵母有啤酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、解脂假丝酵母等：主要霉菌有根霉、曲霉、青霉和木霉等；主要担子菌有小齿薄耙齿菌及柳叶皮伞，还有大量食用真菌如香菇、木耳等；主要有微型藻、螺旋蓝藻和小球藻等【61。介绍如下：1、酵母菌(Yeast)酵母茵是当前生产单细胞蛋白的微生物类群中最受关注的一类，也是应用最为广泛的一类。它是一种单细胞的真核微生物的的通俗名称，其繁殖方式包括无性繁殖和有性繁殖。无性繁殖方式有芽殖和裂殖，而芽殖是酵母菌最普遍的繁殖方式。酵母具有特有的色、香、味，适口性好，而且发酵过程中酵母菌耐酸能力强，适宜于低pH值培养，不易污染，回收率高。酵母菌蛋白含量高达60％，几乎含所有的氨基酸，尤其是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量高，而且维生素含量也比较丰富。常用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母和白地霉。其中假丝酵母能够同化六碳糖和五碳搪，能忍耐高浓度的S02，菌体中含有高含量的蛋白质，并含有大量的赖氨酸和较多的维生素及许多微量元素。2、霉菌(MoM)霉菌是丝状真菌的统称。构成霉菌营养体的基本单位是菌丝，分为基内菌丝和气菌丝。黑曲霉、米曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、木霉、烟曲霉等真菌可以分泌丰富的酶类，如淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶等，这些酶能够促使原科中淀粉、纤维素等高．3． 桂林工学院硕士学位论文I_分子化合物分解为单糖，供微生物生长需要，且霉菌中菌体蛋白质含量也较高，达到20％---30％。因此在蛋白饲料的生产中这些种类的霉菌广泛使用。3、放线菌(Actinomycetes)放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖的陆生性强的原核生物。放线菌经常用于蛋白饲料的生产，尤其高温放线菌其有很高的分解纤维素和木质素的能力。此外，放线菌在生长过程中可分泌抗生素类物质，抑制肠道中的病原菌，对促进肌体免疫有较好的作用。放线菌的菌体蛋白由含有较高浓度的赖氨酸、色氨酸和含硫氨基酸，营养价值相对较高。4、芽孢杆菌(ThiobalilIus)芽孢杆菌包括胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌等菌株，这类菌可产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤堆素酶等活性较高的酶。此外，由于芽孢杆菌中具有不易致死的芽孢，故饲喂时以活菌状态进入动物的消化系统，可抑制肠道中有害菌的生长繁殖。芽孢杆菌还可减少粪便、消化道中的大肠杆菌数。5、真菌(Eumycete)真菌菌丝生产慢，易受酵母污染，必须在无菌条件下培养，但是真菌的收获分离容易。目前应用较多的有曲霉和青霉，主要利用糖蜜、酒糟、纤维类农副产品下脚料生产单细胞蛋白。法国1985年利用丝状真菌将香蕉转化为高蛋白饲料(发酵后蛋白质含量提高6"-"7倍)，德国科学家采用木屑和镰刀菌以甜菜渣为原料，获得粗蛋白为24％的蛋白饲料。6、藻类(Algae)微藻是一类分布最广、蛋白质含量很高的微量光合水生生物，繁殖快，光能利用率是陆生植物的十几到二十倍。目前，全世界开发较多的是螺旋藻与鱼腥藻。其中螺旋藻繁殖快、产量高，蛋白质含量高达58．5％"-71％，且质量优、核酸含量低，只占干重的2．2％～3．5％，极易被消化和吸收。7、细菌(Bacterium)此外还有很多细菌，包括光合细菌和氢细菌。其原料主要为植物性纤维及石油衍生物(如甲醇和乙醇等)。与其他菌株相比，由病原菌生产的菌体蛋白含有毒物质的可能性较大，因此在加工过程中必须经过处理，确保对食用动物的安全，目前研究较多的细菌为红色光合细菌和自养产碱杆菌。据报道，日本生产的PBS菌液作为鱼类的饲料添加剂己经形成商品化生产。日本海洋微生物株式会社菌种场用PBS养鱼苗，成活率从69．3％提高到95．5％，鱼苗生产率提高了1倍。微生物发酵生产蛋白饲料，关键是菌种，从目前报道的资料【7-13]来看，发酵方式由单一菌种趋向于复合菌株的协同发酵，并且注重不同微生物之间的协同性、互补性，总体上发挥出正组合效应。从组合情况看，菌种应包括纤维分解菌、氮素转化菌、增加适口性的．4． 桂林工学院硕士学位论文菌【14l。霉菌、酵母菌和乳酸菌的组合发酵为多数，这是由于木霉、黑曲霉、根霉等霉菌同化淀粉、纤维素的能力强，可降解秸秆饲料中的结构性碳水化合物，将工业废渣中的淀粉和纤维素降解为酵母能利用的单糖、双糖等简单糖类物质，使酵母得以良好地生长繁殖，而利用乳酸菌产生乳酸等则可改善发酵饲料的适口性。并且，组合菌株发酵增加了发酵中许多基因的功能，通过不同代谢能力的组合，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌来进行复杂的多种代谢反应或促进生长代谢，提高生产效率。此外，在双菌或多菌混合发酵中，酶促作用生成的糖立即被发酵糖的微生物所利用，这样就维持了降解物的浓度，消除了酶合成作用受到的降解物的阻遏作用，也解除了反应终产物对酶的反馈抑制，缩短发酵过程。这些体现了微生物之间的互惠、偏利生等关系。协同发酵形式对各种原料的有效转化、蛋白饲料的品质提高起到了重要的积极作用。1．2．3单细胞蛋白饲料的研究现状生产SCP饲料可利用多种工业废液、农副产品加工下脚料以及植物纤维素。北京市营养源研究所(1982)开始研究用丝甚霉BN99对丁醇废水处理，生产饲料酵母，获得的菌体产率为11．2％，菌体蛋白质含量为30％～50蚶10】。刘禹宏等从产朊假丝酵母、热带假丝酵母、啤酒假丝酵母、扣囊拟内孢霉中诱导筛选出4株理想菌株，利用秸秆和猪、鸡、牛粪为基料进行微生物工程技术处理。结果是：以玉米秸秆为基料生产的酵母饲料，粗蛋白增加44．60％，粗脂肪增加11．1％，粗纤维减少16．O％，无氮浸出物减少1．40％，粗灰分增加18．60％，经奶牛饲喂实验，效果较好，提高秸秆利用率70％；以猪、鸡、牛粪为基料生产的酵母饲料，粗蛋自均高于猪的配合饲料，而粗纤维均低于猪的配合饲料，而且3种饲料生产的酵母饲料中，必需氨基酸种类比较齐全、比例适当，维生素含量丰富，与20"-"90kg猪的饲料需要量比较，均高于饲料标准，是猪的优质全价饲料【15】。据章练红报道，辽宁省淡水产研究所(1987"---1990)，从分离的10株酵母中选育出2株(LDS8l、LD882)，以淀粉废水为原料，与引进的5株饲料酵母进行培养，生产出蛋白质含量为65"-"87％的饲料酵母【l引。顾代芳等报道，盐城市农业微生物制剂厂从酵母菌株中选育出6株能同化淀粉，蛋白质和维生素，具有很高酶活性，总体水平互补性好的酵母菌株，利用农副产品及加工废弃物生产酵母活性蛋白。通过动物饲养实验，适当添加钙、磷，能部分或完全取代进口鱼粉。由于其含有消化酶等多种活性成分，可以提高动物的基础消化率，使动物的抗病能力增强，死亡率降低Il¨。谢建坤等采用Yl、Y2、Y3三个互为拮抗的酵母菌株与菜籽饼混合发酵，毒素硫代葡萄糖苷降解率为60％～80％，蛋白质含量提高约12％，含17种氨基酸，占总量的45．5％，优于山东腾县以豆饼为原料生产的活性高蛋白饲料118】。刘军研究了以醋渣为主要原料，经酵母AS21617固态发酵生产蛋白饲料，使醋渣粗蛋白从7．9％提高到22．66％，粗纤维10％t19J。 桂林工学院硕士学位论文利用各类植物秸秆、壳类、糖渣类和木屑等废弃物的纤维素资源主要是生产霉菌菌体蛋自。用曲霉、木霉、青霉、根霉发酵，其中绿色木霉使用较多，或单纯利用霉菌生产SCP，或以霉菌和酵母菌等混合发酵生产SCPt20l。据郗丽兰报道，埃及用哈茨木霉(Trichoaermaharzianum)接种于稻秆，生产出粗蛋白含量高达32．8％的菌体蛋白饲料12¨。王沁等利用黑曲霉(Aspergillusnigerz／25)酶解稻草产糖培养酵母ASl1374，SCP转化率达到23％，且蛋白质含量高，氨基酸组成齐全，含动物必需氨基酸田J。李飞等对青霉素菌体蛋白营养价值及其应用效果进行评定，分析结果表明，其含粗蛋白为41．oo％、钙1．44％、总磷11．1％、代谢能水平为9．96J／g。经饲喂实验，在蛋鸡全价料中添加3％、5％、7％青霉素菌体蛋白，可获得不低于玉米一豆粕口粮的生产成绩【23。。万海清等以黑益霉、康宁木霉为出发菌株，经紫外线诱变，用纤维素等培养基对黑曲霉、木霉及他们的诱变株进行筛选，确定出黑曲霉为生产单细胞蛋白的优良菌种。以纤维素为唯一碳源进行发酵，产物中干菌体蛋白质含量38．85％，纤维素利用率71．78％061。钟启平报道，中国科学院冶金研究所用溜曲霉似，tamariiN0827)发酵甜菜粕，产品粗蛋白达25％,---27％，产品回收率达70蚶24也6。。多种菌同时发酵生产蛋白饲料时，这些菌在适宜的条件下互相促进，共同生长，不断繁殖，从而生产出高质量的多菌种活性蛋白饲料。白坤等用黑曲霉、酵母菌和放线菌，以纤维素为原料共发酵生产出含多种维生素、多种活性酶、多种氨基酸和多种微量元素的活性蛋白饲料，喂养畜禽可以提高动物的抗病力，降低死亡率，并且提高饲料中营养物质的利用型27】。侯红萍筛选出5株菌：l株曲霉菌、2株酵母菌、2株乳酸菌，三种菌共同发酵。产物营养成分明显高于单菌株发酬弱J。蔡皓等利用几株微生态制剂用菌株：白链霉、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌及光合细菌，对混合废弃物蛋白源进行发酵生产活性蛋白饲料，蛋白质的消化率从发酵前的75．9％提高到发酵后的91．2％。饲料发酵后呈黑褐色，带酒香酸味，口感较好【291。王立新等从供试菌种中优选出2株酵母菌、2株乳酸菌、2株黑曲霉、2株绿色木霉，对以花生壳和麦草为主的粗饲料进行多菌种双重发酵处理，发现粗纤维降解率达46．21％，粗蛋白含量提高16．93％。用其饲喂育肥猪，猪的生长速度提高6．2％(P>0105)，饲料转化率和经济效率分别提高了7．86％和45，86％001．吴绵斌等利用木糖渣，以Aspergillus疗枇，．ZU．11和CandidautilisATCC9256固态发酵生产饲料蛋白。纤维素降解率达67．7％，蛋白增加率为6．22％。干基中蛋白质含量由3．56％提高到20．02％，且含有较高活力的纤维素酶川。赵启荚等利用黑曲霉、产朊假丝酵母和白地霉对酱渣2次发酵，生产蛋白饲料，产品粗蛋白含量在实验室条件下可达39，5％，小试和中试分别达到39．3％和37．2％。粗纤维含量比原料本身下降了33．8％p_2】。20世纪60年代中后期，菌体蛋白的生产在利用传统原料的同时，开始利用石油、天然气等碳氢化合物：20世纪70年代末，石油价格上涨，国内许多厂家用乙醇、甲醇生产菌体蛋白，但成本较高，现在主要是利用工农业废弃物和纤维素资源生产菌体蛋白【331。在利用石油类资源和乙醇生产菌体蛋白方面：石油酵母的粗蛋白含量一般在60％以上，比其．6． 桂林工学院硕士学位论文它酵母高lO个百分点左右。作为蛋白营养源，介于进口鱼粉与大豆之间，其中赖氨酸含量与鱼粉接近，蛋氨酸或含硫氨基酸明显偏低。石油酵母粗脂肪含量高(一般高达10％以上)，在细胞质中以结合型存在，非常稳定，利用率高，可作为优质的热能来源，优于鱼粉。从微量元素成分分析，石油酵母铁含量比鱼粉高，维生素B12和碘的含量较少ml。石油酵母作为唯一的蛋白源成功地用于始重40kg的猪饲料中，结果增重提高，而饲料消耗并未增加。据SalabHlMIEs2mail报道，在家禽日粮中添加以一paraffinica(用Clparaffnica酵母在石蜡培养基上生产SCP商品名)，结果表明，该产品不但对家禽的生长和产蛋无副作用，而且能改善试验组肉仔鸡和产蛋鸡的健康水平，降低其早期生长阶段因立克次氏病所引起的死亡率。以假丝酵母(Candidaspl)发酵乙醇生产的SCP，代替常规蛋白质的5％、10％或15％添加于日粮中，试验鸡的采食量和饲料转化率未见明显差异，且代替常规蛋白质15％的试验组产蛋量比对照组增加11．8％。但为避免较高水平的此种SCP对鸡群健康和产蛋持续时间的不利影响，推荐用量不能高于15％【35J。1．2．4单细胞蛋白的应用单细胞蛋白作为饲料蛋白，已被世界广泛应用。例如用假丝酵母及产朊酵母作为菌种，利用亚硫酸废液或石油生产酵母菌体，可用于牲畜饲料。用它喂养家禽、家畜，效果好、生长快；奶牛产奶多，鸡产蛋率增高，并能增强机体免疫力。以酵母茵和假丝酵母菌生产的单细胞蛋白，可直接用作人的食品。由于单细胞蛋白氨基酸组成齐全，因此，常作为营养强化剂而添加到食品中，用以提高各类产品的蛋白质生物价格。由于单细胞蛋白中维生素、矿物质含量丰富，因此常用于补充许多食物所需全部或部分的维生素和矿物质。此外，单细胞蛋白在食品加工中也有着重要作用。它能提高食品的物理性能，例如：把活性干酵母加入意大利烘饼中可提高其延薄性能，把食用酵母以1％～3％的比例加入肉制品中可提高肉与水及脂肪的结合能力。它还能提高食品的风味，例如：酵母的浓缩蛋白质具有显著的鲜味，已被广泛作为饲料、肉汁等食品的增香剂。1．2．5发酵生产单细胞蛋白的原料发酵生产单细胞蛋白的原料非常丰富，主要有以下四个大类：第一大类是利用工农业废弃物，包括造纸废液、味精废液、豆腐废水、甘蔗糖蜜废液、有机废水、啤酒混合废液等；第二类是工业下脚料，包括柑橘渣、马铃薯渣，木薯渣、醋渣、甜菜粕、糖渣、玉米淀粉渣、葡萄渣、青霉菌渣等：第三类是利用石油类资源和乙醇生产SCP：第四类是利用植物纤维素类生产SCP，纤维素原料是巨大的资源，包括各类植物的秸杆、皮、壳、芯、林业废弃物。总的来说，生产菌体饲料的原料既安全廉价且易于获得从目前的研究进展来 桂林工学院硕士学位论文看，主要有以下几种：(1)各类农产品废渣废水农产品及其加工产品的种类丰富多彩，同时产出的下脚料也越来越多，如酿造、果汁等产业，出现的废渣、废水在国内大多不加处理就废弃，既污染环境又浪费资源，这些废渣、废水中含有较丰富的碳源和其它营养元素，只要补充氮源和生长因子，通过固态发酵或深层液体发酵均可生产菌体蛋白饲料。殷月兰等人用绿色木霉、白地霉、产朊假丝酵母、米曲霉进行混菌发酵后，三七糠中纤维素明显降低，蛋白质含量得以提高，并平衡了氨基酸的组成，显著提高了三七糠的饲用价13副。刘军以酿造厂剩余的醋渣为原料，接种酵母菌，经过初步研究，得到其适宜的发酵工艺条件，使醋渣的粗蛋白从7．90％提高至22．66％粗纤维含量下降10％左右，改变了醋渣的适口性【37。。将甜菜渣晒干粉碎后，接入黑曲霉固态发酵3天，蛋白质含量由原来的9．8％提高至25．43％，氨基酸含量普遍上升，尤其是赖氨酸含量是玉米的近2倍。而以醋糟为原料，经碱化处理后，接入10％纤维分解菌和酵母菌共同发酵，醋渣的营养价值明显得到改善。麦芽根是啤酒工业的主要副产物，随着啤酒产量和消费的增加，其产量随之增加。经研究发现，麦芽根中营养物质较为全面和丰富，适于做生产菌体蛋白饲料的发酵基质。张西宁通过黑曲霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母进行混合协同固态发酵酱渣，并较为系统地研究了发酵所需要的适宜条件【38J赵启美等人筛选出产酶丰富的黑曲霉、产朊假丝酵母、扣囊拟内孢霉为发酵菌种，在pH值为5．5，经72h，10％接种量发酵可得到蛋白质含量高的饲料产品【3哪。陈学林等人将先进的生物技术应用于浓香型白酒废糟中，开发出新型菌休蛋白饲料，经过不断努力，进行小批量试制后，取得了关键性突破，使废糟的粗蛋白从15％提高至28％左右，粗纤维降低约2％；氨基酸含量得到明显提古14州。而王桂妮等人在关于食品工业麦料生产饲料酵母的研究进展中提到味精加工后的废水中含有一定的碳源、氮源，在其中加少量氨水，用热带假丝酵母发酵，操作方便、工艺简单，发酵产品具有浓曲香味，干酵母产率可达lOg／L14¨。钟世博等人以热带假丝酵母和绿色木霉为菌种固态发酵酒糟，并在酒糟中添加谷壳作疏松剂，在30"C培养48h，使发酵产物的粗蛋白从27．50％增加到41．480％1421。而以啤酒糟作主要原料，黑曲霉米曲霉、异汉逊氏酵母共同发酵来生产蛋白饲料效果也较好。除以上所述，动物的毛皮、血水及皮革粉等也可作为菌体蛋白饲料的生产原料。蔡皓等人就以这些原料制作生物活性蛋白饲料，发酵菌种为乳酸菌、芽孢菌，酵母菌、白链菌和光合细菌，接种量40,4(每种菌株各占20％)，发酵温度为30℃经4d发酵后，饲料呈黑褐色，带酒香酸味，乳酸菌和酵母菌含量达到最高【431。可以看出，用于生产菌体蛋白饲料的原料丰富多彩，种类繁多。在实践中，根据当地资源和生产情况。选择合适的原料，生产出品质好、营养价值高的蛋白饲料。对繁荣经济，促进畜牧业发展具有实际意义和社会意义。用这些原料生产蛋白饲料有其突出的优越性：①来源丰富、持久：②发酵后，污染物．g． 桂林工学院硕士学位论文有所降低；③有利于降低生产成本；④有利于化废为宝，使资源充分利用。在世界原料紧张的情况，开发此类产品能产生巨大的经济效益。(2)淀粉及淀粉附产品1公顷马铃薯所产的饲料蛋白约等于5公顷土地所产的大豆，可以看出，用淀粉作原料生产蛋白饲料是经济可行的。各个国家相继展开此方面的相关研究。加拿大用烟曲霉在45。C液体深层发酵，经24h后，木薯糊可得到249产品，产率达到60％用马铃薯渣生料发酵生产蛋白饲料，采用二次发酵工艺，以酵母菌和霉菌为发酵剂，可以显著提高蛋白质的产量ⅢJ。而在木薯渣生料中接入根霉和酵母菌发酵后生产单细胞蛋白(SCP)，发酵温度在28℃，添加0．5％尿素，pH自然，可以使产物中的粗蛋白含量从3．9％提高至22，43％[451。(3)作物秸杆我国的秸杆资源十分丰富，每年达5．7亿吨以上，但用于词料的部分不足10％，这不仅污染环境且浪费了资源。秸杆属纤维素材料，主要由纤维素(30％"--50％)、半纤维素(15％～30％)和木质素(10％"--20％)构成，其粗纤维、粗灰分高，粗蛋白含量低，加之容积大，适口性差，因此提高秸杆的营养价值成了摆在人们面前的一个重要课题。半个多世纪以来，各国的科学家对此问题作了艰苦的探索，核心问题还是在于生物技术的应用。国外十分重视利用秸杆制作蛋白饲料，而国内在90年代才得以重视。目前，我国正在努力尝试以秸杆为原料来生产菌体蛋白饲料。据报道采用直接法利用秸杆中纤维素和半纤维素发酵生产单细胞蛋白饲料的生产工艺即秸杆经汽爆处理后，加水浸泡、过滤，可用其滤液经深层发酵为饲料酵母。残渣可通过固态发酵生产菌体蛋白，产品均可以达到一定标准，张伟心等人进行了混合苗发酵玉米秸杆生产菌体蛋白饲料的研究，其原理在于采用产生纤维素分解酶的菌体与酵母菌共同发酵，可降低原料中粗纤维含量，提高蛋白质含量。研究过程中筛选出了酶活性较高的AS．3．3030，用作混合菌菌株，分别同白地霉(GeotrichumCandidium)、产朊假丝酵母(CeudrdaUtilis入酿酒酵母(SaccLaromgces)和热带假丝酵母(Candidatropilalls)，以不同组和进行混菌种发酵，得出AS．3．3030与自地霉、酿酒酵母三株菌共同发酵，产物中粗蛋白的含量达到最高，又在正交试验的基础上优化出发酵的最佳条件为：料水比1：1．2，接种量为10％，起始pH值为5．5，发酵时间5天，经分析发酵产物表明：粗纤维比发酵前降低了57．6％，粗蛋白增加了36．19％1461。王成华等人报道用汽爆秸杆(70％)，配以豆糟(10％)、酒精(10％)，加4％(NH。)zSO,、10．2o／6KH：PO。为固态发酵培养基，接种里氏木霉和热带假丝酵母，经过扩大培养，正交试验，得出最佳发酵条件为：加水量为干基的2．5倍，最佳初始pH为6—7，培养时间96h，温度25--一30"C，接种量为15％，接种比例2：3，可得到蛋白质含量较高的发酵产物f4”。对秸杆进行球磨、酸处理，5％氨水多种不同的预处理方法，接种黑曲霉和产朊假丝酵母，共同发酵后分析得出，经过球磨处理的秸杆，发酵产物的蛋白质含量最高，且产朊假丝酵母在黑曲霉己生长20h后再接入效更佳1481。．9． 桂林工学院硕士学位论文其中甘蔗糖蜜在广西，具有强大资源优势，然而，目前甘蔗糖蜜在广西主要用与生产酒精。其原因是建设酒精车间投资少、技术水平要求低、生产设备简单，项目易于马上投产。但从近几年的情况来看。由于国内酒精产量90％是用淀粉作原料生产的，北方大量的陈化粮(玉米等)、薯类用于酒精生产，市场竞争十分激烈，利润越来越低，而酒精废液治理的压力却越来越大。因此广西很有必要对利用糖蜜为原料的低附加值产品转向高附加值产品作结构性的调整[491。因为用糖蜜生产某些高附加值产品，具有淀粉原料所没有的优势和特点，而生产酒精，大有大材小用之弊。并且糖蜜酒精废水的处理难度非常大，处理成本较高，广西目前各糖蜜酒精厂的污水都不能达标排放，严重污染了环境。利用糖蜜发酵生产单细胞蛋白，是对再生资源的合理利用。无论在保护环境方面，还是在资源开发方面对广西来说都是非常有意义的。1．2．6单细胞蛋白的开发利用前景单细胞蛋白在饲料和食品工业中有着极重要的作用。单细胞蛋白具有如此奇妙的功能，其开发和生产在我国更具有广阔的前景。我国现在单细胞蛋白年产仅数千吨。上海酵母厂通过特异生物技术培育成能富积微量元素的微生物，如硒酵母、锌酵母等。我国是农业大国，食物结构以植物蛋白为主，动物蛋白的摄入量与欧美各国相差悬殊，为了提高人民群众的体质，SCP单细胞蛋白的开发与生产为解决人类食品和饲料问题开辟了新的途径。1．3甘蔗糖蜜的特点和资源化应用现状1．3．1甘蔗糖蜜的特点广西是我国的重要的产糖区，根据最新的统计资料，在2007／2008榨季，截至08年3月底，广西累计己入榨甘蔗6193万吨，产糖765万吨，已经连续13年稳居全国第一。制糖过程中大概会产生3％,---40／o的废糖蜜，因此每年产生的糖蜜数量非常巨大。甘蔗糖蜜是一种棕黄至黑褐色的浓稠液体，是制糖工业生产过程中的副产物。其成分依原料甘蔗的质量及制糖工艺的不同而不同。糖蜜一般，占榨量2％-4％。含有蔗糖(约30％)、转化糖(约20％)、胶体(约10％)和灰分(约15％)详见表1．1，长期以来用作发酵工业中的碳源150J。 桂林工学院硕士学位论文表1．1糖蜜的主要成分1．3．2废糖蜜的资源化应用现状及技术一、发酵生产乙醇和酵母用糖蜜作为原料发酵乙醇，既可大幅度降低原料成本，又能够满足生产的要求【51】。各产糖国的大多数糖厂以这种方式处理糖蜜。我国中型以上的糖厂乙醇的流程中(见图1．1)，糖蜜不断地被泵入发酵罐中。成熟的醪液以同样体积连续流入蒸馏工段，以回收乙醇。由于采用了固定化技术，酵母只在发酵周期开始时接种，可以长时间地循环使用。发酵液通过3—7个发酵罐串联进行连续发酵。不论采用何种方式生产乙醇废醪液的治理均是值得关注的问题。镣棠排气液1一种母培养罐，2一发酵罐，3一酵母沉淀箱，4一酵母酸化箱，5～酵母暂贮定量箱，6一成熟醪沉淀箱，7一沉渣箱，8一沉渣暂贮箱，9一沉清后醪液箱，lo-c02回收洗涤器。图1．1印度Praj公司的糖蜜连续发酵流程糖蜜含有特别适合于酵母繁殖的成分，是生产酵母的优选原料，选用不同功能的菌株可以生产药用酵母、食用酵母和饲料酵母等产品，英国、古巴以及中国均有企业建成糖蜜酵母生产线，主要产品为活性干酵母产量为500"--5000t／d。二、制各柠檬酸、L一赖氨酸和冰醋酸等 桂林工学院硕士学位论文m柠檬酸是一种市场价值颇高的微生物制品，主要来源是蔗糖或糖蜜经Aspergillusnige，菌的发酵，固定化发酵技术的应用提高了柠檬酸的产率【521，若添加一些金属离子或矿物质到糖蜜中，可以将柠檬酸的产率再提高1．4％~1．9％t531。此外，蔗渣同样也可以用于固定化发酵以获得柠檬酸。广西赖氨酸厂利用糖蜜生产L2赖氨酸系列产品，现已达到3000t／a的规模，产品分为饲料级、食品级和药用级3类，发酵产酸率月平均达到8．1％～9．4％，月平均总收率超过90％。此外，国内已相继开发成功由糖蜜制备天门冬氨酸、衣康酸、VD和完全降解薄膜等产品的相关技术和工艺。三、焦糖色素焦糖色素是当今世界使用量最大的一种天然食用色素，占食用色素总量的90％。焦糖色素常用蔗糖和葡萄糖作原料，也可用糖蜜制成，该产品可广泛用于软饮料、烘焙食品、酿造制品、熏腌制品等食品及药品加工中，能使食品具有可乐和黑啤酒两种特殊的色泽。由于焦糖色素具有防光性，还能提高调味成分的抗氧化作用和乳化作用，阻止在软饮料中形成“絮凝"物质等。糖蜜酵母培养液经离心机分离酵母后，取上层的红棕色废醪液，由吸附树脂柱富集焦糖色素【54J。四、乙醇废醪液的治理乙醇废醪液是产糖区最主要的高浓度污染源，呈酸性。其COD和BOD都很高，若直接排入江河中将严重破坏生态平衡。废醪液可以通过厌氧生物消化、需氧生物消化、蒸发浓缩后焚烧等方法处理【55】。其中，厌氧生物消化是处理废醪液较为有效的方法【55】：将废醪液在冷却到32—35℃后送入消化器中进行厌氧细菌混合培养，消化时间根据进料时的BOD值和COD值和细菌的生长情况而变化，一般为5—15d，约90％的BOD值和大约65％的COD值可除掉。这种方法的好处是能产生生物气体(CH4和C02的混合气体)，这种气体对于乙醇厂的锅炉作为燃料生产蒸汽是有价值的。此外，废醪液循环使用(见图1．2)也可有效控制糖厂乙醇车间对环境的污染【561，通过对废醪液的生物聚集处理不仅可以减少46％的工业用水，而且可降低60％的废醪液排放。由于废醪液含有粗蛋白和许多酵母残体以及Cu，Zn，Fe，Mn等，国内有学者研究用气浮法处理，并使出水pH值接近中性(6．0～6．5)，COD去除率达45％。浮渣经脱水后蛋白质的含量在30％以上可用作饲料【57】。 桂林工学院硕士学位论文1．4酵母菌发酵技术简介1．4．1酵母菌发酵技术现状图1。2废醪液循环系统分目前己知的酵母菌数目远低于细菌。迄今为止，真正重视酵母菌的研究也不过区区百年历史。与细菌相比，包括分类等方面的研究积累不足，使酵母菌在应用方面还存在许多未知领域，具有很大的潜力p副。数千年来，人们利用酵母菌的发酵能力来进行酿酒，而在现代工业中，酵母还可以用来生产甘油、食用酵母、饲料酵母、石油脱蜡、发酵生产有机酸、酶制剂等。由于酵母细胞中富含核糖核酸、细胞色素、辅酶A等，所以它也是制药工业中的重要的原料15％21。酵母细胞的广泛用途使得废水处理过程中酵母细胞的再利用可以借鉴发酵行业的丰富经验。中科院微生物所李明霞【58,61,63]等人从全国不同地区的各类基物上分离了三千株酵母，共代表25属。研究表明：无孢子酵母在全部酵母中占绝大多数，其中假丝酵母Candida在各类基物上始终占绝对优势；土壤中酵母种类很广泛；从甜果表皮及花朵(有花蜜)。上分离到许多酵母，特别是在蜜饯和盐腌食品等渗透压较高的环境，也能分离到酵母菌，这些酵母茵基本上在10％NaCL或50％高糖培养基上都能生存。在海水中则能分离到红酵母等酵母菌。来自油田的土壤中分离到的包括解脂假丝酵母Candidalipolytica和热带假丝酵母Candidatropicalis等在内的9种假丝酵母。酵母菌的分布情况表明，经过长期自然选择，酵母菌对高糖环境、高碳环境(如石油等)、高渗透压环境等具有较强的适应性，这使其 桂林工学院硕士学位论文有可能应用于高浓度有机废水的处理。现代发酵工业中部分酵母菌可利用的碳源与相应的产品如表I．2所示。表1．2部分酵母菌的可利用碳源与用途【删酵母菌可利用的碳源种类非常广泛，使其有可能应用于不同有机废物的治理。施珊畔l等人采用酵母菌固定化技术发酵废糖蜜生产酒精。添加单浓度稀糖蜜，在工业生产环境下连续运作生产酒精共120天，其中发酵产酒99天，正常条件下的发酵周期为12h，单位发酵体积的乙醇生产能力平均为6．2lg／L·h。成熟醪液乙醇含量平均9．44％(v／v)，转化率为93．7％，不仅处理了废水，而且进一步回收了资源。此外，假丝酵母菌能通过单端、双端、次端氧化途径将烷烃经醇和醛单端氧化成相应的脂肪酸，并可以进一步通过p氧化系统氧化成醋酸，或者直接渗入细胞的类脂中16引。正因为如此，酵母菌可以利用C13≈18为主体的正烷烃、液体石蜡、正癸烷发酵生产脂肪酸、玻拍酸、癸二酸【67瑚】。酵母菌中的假丝酵母属(Candida)。红酵母(Rhodotorula)和汉逊氏酵母属(Hansrnula)都含有许多分 桂林工学院硕士学位论文解脂肪的菌种。除此以外，酵母菌还可以利用咖啡废水、造纸废水亚硫酸盐废液、蔗糖等生产酒精等产品岬~7引。早期酵母菌对有机废水的处理主要表现为利用有机废水生产单细胞蛋白(Single．Cell．proteinSCP)。第二次世界大战时期，由于蛋白质大量缺乏，利用石油生产单细胞蛋白的工作受到相当程度的重视，并逐渐拓展到有机肥料再利用领域。如造纸行业亚硫酸盐废水、酒精废水等。1967年～1981年间举行的3次国际单细胞蛋白会议就己确认开发SCP是解决粮食饲料短缺的重要途径之一74J。利用有机废水生产SCP不仅可以回收营养丰富的SCP，同时还可以在一定程度上降低有机物的污染，从而实现废水的资源化，一时间成为研究热点。国外广泛开展了利用造纸工业亚硫酸盐废液及其他农业废弃物生产单细胞的研究与实践【75~771，其中加拿大Waterloo大学M．Moo．Youngl78I等人所开发的Waterloo单细胞蛋白生产工艺因其操作简便而得以广泛推广。J．S．Koh[79】贝U开展利用油脂生产SCP的研究工作。在国内，上海有机化学研究所‘80】等单位从60年代就致力于石油脱蜡并生产单细胞蛋白的研究。为了提高SCP的产量，诱变育种等生物技术也被应用到生产中去。然而在20世纪70年代末期，西方国家一度中止了利用石油烃类生产SCP的研究和生产，即使是利用农业废物作为原料生产SCP在经济上的生命力也曾受到质疑。推测有如下原因：(1)采用烃类作为原料，成本较高：(2)整个生产过程采用无菌生产，增大了投资和运行成本：(3)采用单一菌种在对数生长期生产，菌种的选择以获得较高的得率、细胞具有较高的蛋白质含量、氨基酸含量是否均衡作为指标，使有机底物的利用并不充分，处理出水仍是高浓度有机废水，或者说有机物并没有尽可能的转化为菌体。尽管SCP生产和研究出现了停滞现象，但在研究过程中积累的经验和知识为后面有机废水处理的进一步研究奠定了良好的基础。1．4．2酵母菌发酵技术发展趋势随着全世界对生活缓急高质量的日益关注，人们对有机废水特别是高浓度有机废水的处理提出了更高的要求，要求以尽可能简单的工艺、尽可能低的成本处理有机废水，在废水处理过程中应尽可能回收有价成分，即有机废水的资源化。酵母菌处理技术即代表了这一发展方向，这项技术继承了SCP工艺的基本特征，但与该工艺又有所不同，主要表现为：(1)原料方面：由大量的石油化工原不可再生料转向以利用木材废料、秸秆、蔗糖、各种废水等可再生资源。(2)在工厂设置方面：由大型场转向小型厂，以适应比较分散的农林原料，便于运输和集中。(3)在生产工艺方面：由单一生产单细胞蛋白转向综合治理三废，改善生态环境，并取得廉价的原料。(4)在设备方面：由高技术项设备简化投资，可小规模投产，适于推广。 桂林工学院硕士学位论文1．5资源化应用甘蔗糖蜜方案的提出1．5．1微生物蛋白的开发和利用微生物蛋白主要是指细菌、酵母以及藻类等单细胞生物体，目前已公认单细胞蛋白在为世界提供蛋白质方面起着重要的补充作用。单细胞蛋白具有较高的营养价值。十多年来，国内外己对单细胞蛋白的生产进行了深入细致的研究和开发工作，目前已有许多生产动物饲料的单细胞蛋白工厂投入生产，还有许多工厂正在建设。人们利用多种资源特别是非食用资源和废弃资源作原料，通过微生物的作用，以工业方式生产了大量单细胞蛋白。利用废弃物(如糖蜜酒精废液等)生产单细胞蛋白具有很多优点，它不仅变废为宝，使资源充分利用，而且也利于环境保护，降低污染物的BOD值，同时利用废弃资源生产单细胞蛋白还有利于降低成本。因此，从目前国内外形势来看，用废弃资源生产单细胞蛋白已成为主要趋势。1．5．2资源化处理糖蜜废液方案的提出本项目对广西风糖鹿寨制糖有限公司的甘蔗糖蜜废液进行发酵提取单细胞蛋白。通过测定发酵过程中发酵液中微生物的含量和蛋白质的产量，确定最佳发酵工艺。建立相关动力学模型，进而确定提高SCP产量的废水资源化利用的技术。方案技术路线如图1．3所示。话蜜成分的测定JL资发髓料废塘种的选的—"蜜的择及菌收取样种性能集撇1．6本课题研究目的和主要内容1．6．1课题来源图1．3方案技术路线本课题来源于项目，项目名称为：制糖、淀粉、造纸工业“三废"治理技术研发与示范，课题名称为：糖蜜有机废液资源化应用研究(广西壮族自治区科学技术厅资助项目， 桂林工学院硕士学位论文项目编号：桂科攻0592003—3；起止时间：2005．1-2007．7)。1．6．2研究目的微生物发酵蛋白饲料，就原料种类而言是多种多样的。本文利用甘蔗糖蜜废液进行发酵生产单细胞蛋白，实现废糖蜜的资源化利用。研究目标就是确定利用废糖蜜发酵生产SCP的最佳菌种的组合，以及最佳的发酵工艺并构建发酵的微生物动力学模型，为糖蜜废液发酵生产SCP的产业化提供依据。1．6．3主要内容根据本次研究课题的研究特点，采用目前较新的方法资源化利用糖蜜有机废液，利用甘蔗糖蜜废液进行发酵生产单细胞蛋白，实现废糖蜜的资源化利用。本次研究采用了广西风糖鹿寨制糖有限责任公司的糖蜜废液进行实验。为了达到高效利用糖蜜废液的最终目的，并使研究成果更具实用性，本次研究内容和重点制定如下。l、系统调查国内外糖蜜废液资源化利用技术，分析现阶段糖蜜废液制取的蛋白饲料存在的问题；定量分析糖蜜废液中主要成分。2、进行甘蔗糖蜜废水发酵生产SCP的可行性分析。3、发酵过程中对生产SCP的菌种的选择。4、甘蔗糖蜜废液发酵生成SCP最佳工艺条件优化。5、混合菌种生长曲线的分析测定。6、研究甘蔗糖蜜废液发酵提取SCP的动力学模型，包括菌体生长动力学模型、甘蔗糖蜜消耗动力学模型，为优化控制发酵过程和生化反应器的研制提供依据。7、对利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的技术经济分析及发酵产品的食用安全性和营养性的测定。 桂林工学院硕士学位论文●t第2章糖蜜成分的测定及菌种的选择实验2．1引言废糖蜜含有大量的酵母可以利用的可发酵性糖。因此，其是一种可以被利用的资源，随着糖蜜的产量日益增加和畜牧业、养殖业的发展，进行利用废糖蜜开发蛋白饲料的研究是非常必要的【8¨。利用废糖蜜生产单细胞蛋白，不仅能提高废糖蜜的附加值，而且还可以充分利用废弃物，有效地保护环境的同时，可为糖厂带来较高的经济效益。但用于生产SCP的菌种很多，如用于淀粉原料和纤维素原料生产SCP的有白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、酿酒酵母等。微生物发酵生产蛋白饲料，菌种是关键。作为微生物蛋白饲料的生产菌种。其原则为：①对所要处理的饲料原料作用要大；②菌种细胞及代谢产物对动物无毒无副作用：③对其他菌株不拮抗；④繁殖快、性能稳定、不易变异；⑤对环境适应性强。作为SCP生产菌，除了要具有无生理毒性的最基本特征外，菌体生长速度、生物量、菌体蛋白含量等特性是影响生产率的最主要因素悼引。因此，发酵生产SCP选择菌种时，一定要进行菌种性能测定。2．2实验材料实验菌种详见表2．1。表2．1实验菌种实验仪器详见表2．2。 桂林工学院硕士学位论文表2。2主要仪器甘蔗糖蜜：广西凤糖鹿寨制糖有限责任公司。主要试剂：蒽酮试剂、硫脲、葡萄糖标准溶液、麦芽汁培养基、盐酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸铵、氢氧化钠、牛肉膏、蛋白胨。2．3实验方法2．3．1废糖蜜成分的测定1)总糖含量的测定【83】①试剂葸酮试剂：称取0．29葸酮和lg硫脲(阻氧化剂)置于烧杯中，缓慢加入lOOml浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液。将其贮存于棕色瓶中，最好现配现用。葡萄糖标准溶液：先配成lmg／mL的葡萄糖溶液，再分别吸取l、2、4、6、8、lOmL分别置于lOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线。可得10、20、40、60、80、lOOmg／L的葡萄糖系列浓度。 桂林工学院硕士学位论文②测定方法a．分别取葡萄糖标准溶液lmL，用蒸馏水稀释至2．0mL，作为标准样。b．准确称取lg甘蔗糖蜜，稀释定容至100mL，121℃，灭菌30rain后取lmL再用蒸馏水稀释至2mL，作为待测样。c．向所有样品中沿壁加5mL冷的蒽酮试剂，混匀，100"C水浴准确加热10min，取出在流水中冷却20min，测OD620。d．用标准曲线法求出甘蔗糖蜜中的总糖含量，见图2．1。Y=0．010x+O．033R2=0．97271．2lO．8o茧0．6oO．4O，20图2．1蒽酮法测定总糖的标准曲线2)甘蔗糖蜜中还原糖测定【84l：3，5一二硝基水杨酸法3)甘蔗糖蜜中总氮的测定185J：凯氏定氮法4)甘蔗糖蜜中灰分的测定【85】：硫酸灰化法5)甘蔗糖蜜COD的测刘85】：微波消解法6)甘蔗糖蜜S04之的测定【85】：质量法2。3．2糖蜜废水的空曝气试验因废水的成分十分复杂，为了证明甘蔗糖蜜中的有机物主要是通过生物降解得以去除，在此进行了废水的空曝气试验。在1000mL的容器中加入600mL的稀释后甘蔗糖蜜(与水体积比1：50)，对其空曝气，进气量为1．0mL／min，培养40h，T=28"C，每8h取样一次，测定COD、pH的变化，从而验证甘蔗糖蜜废液中是否有大量的挥发性物质。2．3．3菌种性能的测定～、实验流程 桂林工学院硕士学位论文废糖蜜一加水稀释一酸化澄清一加营养盐一投加菌种发酵离心一干燥一单细胞蛋白(1)废糖蜜加水稀释：将废甘蔗糖蜜和水按体积比1：l稀释，稀释后糖度达到Brix45左右。(2)酸化澄清：加l+9盐酸，混合均匀，静止12h，取上清液，用离心机进～步分离水中的固体悬浮物，而后调节上清液的pH值至4．5。(3)加营养盐：冷却后，加入一定量的磷酸盐、铵盐。(4)发酵：接种量为0．69湿菌体每800mL，接种后，在恒温震荡培养箱中100r／min进行酵母培养。发酵液离心分离，烘干后即得单细胞蛋白。二、培养基的制备麦芽汁【861：将大麦洗净，温水浸泡12h左右，装入铺有纱布的托盘内，25。C恒温催芽24--一48h。麦芽生长到麦粒的2倍时停止。将发芽大麦烘干，研磨成麦芽粉。1份麦芽粉加入4倍水，65"C恒温水浴4"-5h自行糖化，直至糖化完全。糖化液经过12层纱布过滤，如果滤液浑浊，可用鸡蛋清沉淀(每1L滤液加1个鸡蛋清：在20mL水中加入1个鸡蛋清用玻璃棒搅拌调匀至产生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，将滤液静置片刻，过滤)。用手持糖量计检测糖化液糖度，将滤液用蒸馏水稀释到糖度为Brixl4，自然pH值。115。C(0．1Mp)高压灭菌20min后冷却，4。C保存备用。摇床液体培养基【87】：麦芽汁，115"C高压灭菌20min，用滤纸过滤，去除杀菌过程中形成的不溶物，然后用蒸馏水调节至Brixl4，装至三角瓶中，115‘C高压灭菌15min，备用。固体培养基【88】：麦芽汁，2％琼脂，加热融化后，补充失水，115℃杀菌备用。三、菌种的活化方法冷藏的菌种接种在麦芽汁固体培养基试管鞋斜面上，在恒温培养箱中培养48h，温度为30℃。四、菌种的富集培养无菌条件下分别将活化的热带假丝酵母、白地霉、皮状丝孢酵母、产朊假丝酵母接种与装有50mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中。然后置于恒温摇床培养，转速为105r／min，温度为30。C，培养时间为48h。测定方法：1)细胞浓度测定方法．21． 桂林工学院硕士学位论文采用平皿菌落计数法【891。每12h取样一次，无菌操作台上进行稀释，涂布。菌种的稀释度均为10一、10—6、10_‘、10～、10—9和lO一10，四种菌种的平板接种量均为lmL。2)菌体生物量(以细胞干重表示)测定方法1901量取细胞培养液50mL，用离心机离心分离，转速为4000r／min，离心15min。离一th,之后用蒸馏水反复水洗离心，去除培养基成分，将湿菌体置于干燥箱中在105℃下烘干至恒重，然后称重。3)粗蛋白的测定【9l】：使用蛋白质测定仪进行测定。2．4结果与讨论2．4．1糖蜜成分的测定分析取一定量处理后的甘蔗糖蜜分别测定还原糖、总糖、总氮、灰分和硫酸根含量，结果见表2．3。表2．3甘蔗糖蜜成分还原糖总糖总氮灰分还原糖(C)／总糖(C)／S04。(W／W)％(W／W)％(W／W)％(W／W)％总氮(N)总氮(N){m∥1’31．2l48．000．98．6117．9521．5352000由表2．3可知，经过预处理的甘蔗蜜中灰分含量较多，高达8．61％。还原糖含量为31．21％，总糖含量为48．oooA。804之含量也是相对较高，达到了52000mg／L。用凯氏定氮法测得总氮含量为O．9％。按还原糖与总氮计算所得的C／N原于摩尔比为17．95，按总糖与总氮计算所得的C／N原于摩尔比为21．53。由于总氮中包含可利用氮与非可利用氮，所以若以还原糖作为甘蔗糖蜜中的可发酵性糖或转化糖，应以甘蔗糖蜜中的还原糖与可利用氮相比来计算甘蔗糖蜜的C／N原子摩尔比，故对发酵过程中有影响的C／N的原子摩尔比实际上应大于17．95。2．4．2废水的空曝气实验结果通过实验可以发现，空曝气过程中COD变化相对不大，可知曝气不会造成废水中大量有机物的挥发。但废水的pH值在曝气过程中呈上升状态，可能是在长时间的曝气过程中糖蜜废水中有一些微生物将水中部分易降解的有机酸类物质分解的结果，结果见图2．2。 桂林工学院硕士学位论文苎竺!!竺I=—l。HIm!!!!!苎^奇E、-，凸oU1陷20018500018I蝎0018．姗18．姗1842001840001838∞2．4．3菌种性能的测定081624324048时阃(h)图2．2COD和pH的空曝气变化一、菌种细胞浓度与时间的关系微生物量(细胞的总重量)通常与细胞数目成正比(图2．3)。微生物的生长经历了适应期、缓慢增长期、对数增长期、稳定增长期、衰亡期五个阶段。以产朊假丝酵母为例，O一12h为适应期，12—24h为缓慢增长期、24--60h为对数增长期，60--96h为稳定期，96h以后为衰亡期。从图2．3中可以看出72h后四株菌株的细胞浓度基本都达到最大值。此时，产朊假丝酵母的细胞浓度对数为20．57，即细胞浓度达8．57×108。产朊假丝酵母的适应期最短，增长速度最快，其次是热带假丝酵母和皮状丝孢酵母，细胞浓度最低的是白地霉。^×三、-，籁‘藤g血巅翟器25501224364860728496时间(h)菌体干重与时间的关系图2．3茵种细胞浓度与时间的关系图+白地霉-．IN-热带假丝酵母+皮状丝饱酵母q卜产朊假丝酵母Zt876543210 桂林工学院硕士学位论文不同菌株的生长稳定期有所差异(见图2．4)。生长稳定期后，茵体干重都趋于最大。生产单细胞蛋白可在菌体的生长稳定期结束发酵。如产朊假丝酵母的生长稳定期在48—84h，其在培养84h后菌体干重可达到0．32939／49mL，菌体生物量最大。其次是热带假丝酵母，可达到0．3156g／49mL。白地霉和皮状丝孢酵母的细胞干重分别为0．2461g／49mL和0．2811g／49mL。热带假丝酵母的最终菌体干重和产朊假丝酵母相当，说明其在到达稳定期后从基质中获得碳源的能力和产朊假丝酵母相当，从而合成了与其相当的菌体。：昌o"≤凹V恻H-壁昂O1224364860728496时间(h)图2．4菌体干重与时间的关系+白地霉--I-热带假丝酵母+皮状丝饱酵母q卜产朊假丝酵母三、粗蛋白含量用凯式定氮仪分别测定四株菌株细胞的粗蛋白含量(表2．4)。由表2．4可见，总体来说，四珠菌种的蛋白质含量都是比较高的，其中皮状丝饱酵母的粗蛋白含量明显高于其他三种菌种，其次是热带假丝酵母和白地霉，产朊假丝酵母的蛋白质含量最低。表2．4四株菌株的细胞粗蛋白含量(％)四、菌体蛋白产量综合分析各个菌种的微生物量及其粗蛋白含量可以得出菌体的蛋白质产量(表2．5)。热带假丝酵母的蛋白质产量最高达到了0。1539／49mL，其次是皮状丝饱酵母和产朊假丝酵母，白地霉蛋白产量最低。热带假丝酵母是比较理想的单一菌种发酵生产SCP茵体，其生长速度和蛋白质含量都较高。％o沥卫坫■∞OmOm0nOm 桂林工学院硕士学位论文表2．5四株菌株的蛋白质产量(g／49mL)五、各菌种的特征观察描述不同种类的酵母菌，对其培养过程中在培养基、平板菌落和镜检照片有着各自不同的性状，对这四珠菌的生长情况观察其性状分别如下：l、白地霉白地霉在28"--"30℃的麦芽汁中培养24h，会产生白色的、呈毛绒状或粉状的膜。具有真菌丝，有的分枝，横隔或多或少。繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链，孢子呈长筒形、方形，也有椭圆或圆形，末端钝圆。在400倍显微镜下，观察在麦芽汁培养基中接种48h后各菌种的形态图(图2．5)。菌丝为有横隔的真菌丝，有的为二叉分支。菌丝宽3"---"7p．m。菌丝成熟后断裂成单个或成链、长筒形、末端钝圆的节孢子。在平板上其菌落呈平面扩散，生长快，扁平，乳白色，短绒状或近于粉状，有同心圈可放射线，有的呈中心突起。在液体培养时生白醭，毛绒状或粉状。图2．5白地霉2、产朊假丝酵母产朊假丝酵母在28,--．,309C的麦芽汁中培养24h，开瓶有浓郁的酒香，管底有白色菌体沉淀。在400倍显微镜下，观察在麦芽汁培养基中接种48h后菌种的形态图(图2．6)，在镜检照片中，菌体的形态特征清晰可见。产朊假丝酵母的细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为(3．5"--"4．5)lam×(7～13)larn。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝。 桂林工学院硕士学位论文图2．6产朊假丝酵母3、皮状丝孢酵母皮状丝孢酵母在28～30℃的麦芽汁中培养24h，开瓶有浓郁的清香，瓶底有白色菌体沉淀。在400倍显微镜下，观察在麦芽汁培养基中接种48h后菌种的形态图(图2．7)，在镜检照片中，各菌体的形态特征清晰可见。皮状丝孢酵母无性繁殖为多边牙殖，细胞圆形、卵圆形或腊肠形，大小约3．4—4．5×7．13微米，无有性孢子，不产生色素，菌落为乳白色，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。图2．7皮状丝孢酵母4、热带假丝酵母热带假丝酵母在28"--"30℃的麦芽汁中培养24h，原本清澈的麦芽汁以十分混浊，瓶底有白色菌体沉淀。在400倍显微镜下，观察在麦芽汁培养基中接种48h后菌种的形态图(图2．8)，可见，菌种正处在生长旺盛期，成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。 桂林工学院硕士学位论文2．5本章小结图2．8热带假丝酵母通过实验可知，甘蔗糖蜜中还原糖含量为31．21％，总糖含量为48．00％。按还原糖与总氮计算所得的C／N原于摩尔比为17．95，是生产单细胞蛋白的理想碳源：曝气不会造成废水中大量有机物的挥发，废水的pH值在曝气过程中上升，可能是在长时间的曝气过程中糖蜜废水中有一些微生物将水中部分易降解的有机酸类物质分解的结果；发酵对生产SCP的四株菌株性能的测定可知，热带假丝酵母和皮状丝孢酵母在糖蜜废液培养基中能够较快适应，是生长率快、粗蛋白含量较高、产蛋白量较高的菌株，是利用糖蜜生产单细胞蛋白理想的菌种。 桂林工学院硕士学位论文3．1引言第3章发酵条件的研究糖蜜由于其廉价易得而广泛用于面包酵母生产、氨基酸和酒精发酵等发酵-[-业t921。在糖蜜废水中培养饲料蛋白质的关健，是筛选能在废水中快速生长的菌种以及探明相应的培养调件。为此，本实验采用白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母为菌种，以甘蔗糖蜜废液做培养基来培养饲料蛋白质，对菌种及优化其培养条件进行了优选实验，旨在进一步提菌体蛋白的产量。3．2实验材料3。2．1试验菌株见表2．1。3．2．2实验原料甘蔗糖蜜：广西凤糖鹿寨制糖有限责任公司。3．2．3实验设备见表2．2。3．3实验方法3．3．1培养基的制备1)斜面培养基【92】：麦芽汁(稀释至10。BX)，葡萄糖2％，酵母膏O．5％，琼脂2％，自然pH，115"C灭菌30min。2)一级种子培养基【92】：成分同种子培养基，不加琼脂，115℃灭菌30min。3)驯化种子培养基‘92]：糖蜜废液50％，pH5．0，115℃灭菌30min。4)发酵培养基‘92】：糖蜜废液50％，加少量氮源、磷源、自然pH。 桂林工学院硕士学位论文3．3．2培养方法培养过程：斜面种子活化12"-24h一--级种子培养24---36h卅1[化种子培养48---72h一摇瓶发酵培养。摇瓶培养条件：在恒温振荡培养箱中接入混合菌种，30。C，140r／min进行酵母培养72h。菌体生物量测定方法【州：量取细胞培养液50mL，用离心机离心分离，后经过预处理(见图3．1)[93】，去除培养基成分，恒重，然后称重。转速为4000r／min，离心15min。离心之将湿菌体置于干燥箱中在105。C下烘干至菌』白泥竺碱性菌土自泥竺弱碱量体蛋白泥竺干净菌体蛋白泥3．3．3发酵工艺的选择实验图3．1预处理工艺流程发酵的糖蜜原料分为两种，即灭菌和不灭菌。在液态发酵培养基中分别接入白地霉、热带假丝酵母、产朊假丝酵母和皮状丝孢酵母，接种量为10％，在28．30。C、自然pH值下发酵72h，发酵后分析产物的微生物量。不灭菌液态发酵工艺：废糖蜜及其他辅料一混均一接种一发酵一分析测试灭菌液体发酵工艺：废糖蜜及其他辅料一混均一灭菌(加热到80--90"(2维持lh)一接种一发酵一分析测试3．3．4混合菌种发酵实验在废液培养基中按照不同组合接入白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母，菌种投加量为10％，各菌种之间的比例为1：1，各菌种组合方式为：热带假丝酵母+白地霉、热带假丝酵母+皮状丝孢酵母、热带假丝酵母+产朊假丝酵母、热带假丝酵母+白地霉+皮状丝孢酵母、热带假丝酵母+白地霉+产朊假丝酵母、热带假丝酵母+皮状丝孢酵．．29．． 桂林工学院硕士学位论文母+产朊假丝酵母和热带假丝酵母+白地霉+皮状丝孢酵母+产朊假丝酵母。在28．30"C、自然pH值下发酵72h，研究分析混菌种发酵产物。3．3．5不同投菌比例的发酵实验为了确定白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母之间的合适配比，各种菌按不同配比的接种与废液培养基中，接种量为10％。在28．30"(2、自然pH值下发酵72h，发酵后分析产物的微生物量。3．3．6不同投菌量的发酵实验投菌量对实验结果有一定的影响，故在100mL废液培养基中分别接入5％、10％、15％和20％的混合菌种，各菌种投加比例为1：1：1。在28．30"C、自然pH值下发酵72h，发酵后分析产物的微生物量。3．3．7不同浓度基质的发酵实验废糖蜜中含有大约50％左右的可发酵性糖，浓度过高会抑制酵母菌的生长和发酵。但浓度过小，可发酵性糖的酵母转换率过低。因此，分别取糖蜜糖浓度为5．0％，8．0％，10．0％，20．0％，25．O％的培养基，其他成本不变，在28·30"0、自然pH值下发酵72h，发酵后分析产物的微生物量。3．3．8培养基不同pH的发酵实验废糖蜜稀释后，加酸进行澄清除杂，稀糖蜜的pH对酵母的生长不会产生影响。其生长最适pH值可通过实验确定。用稀HCL和NaOH溶液分别调节发酵废液的pH值至4．0、4．5、5．0、5．5、6．0和7．0，而后接入混合菌种，接种量为10％，在28．30"C，自然pH值条件下发酵72h，发酵后产物洗净烘干分析测试。3．3．9不同温度条件下的发酵实验在不同的温度条件下进行发酵试验，以确定最适的培养温度，在培养基中混合菌种的接种量为10％，分别在10"C、20"C、30"(2、35"C和40"C，pH自然条件下发酵72h，产物洗净烘干分析测试。 桂林工学院硕士学位论文3．3．10氮源的选择实验氮源对真菌的生长繁殖有着重要的作用，是合成菌体中蛋白质和核酸的主要原料，其来源有两方面：培养料自身的含氮物质和外界加入的含氮物质。一般来说，外界加入的氮源对微生物生长有更明显的作用。添加不同水平的氮源及其添加量，在28．30*(2、自然pH值下发酵72h，发酵后分析其对的微生物量的影响。3．3．”无机盐的选择实验在废液培养基中加入不同水平的硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙，混合菌种的接种量为10％，在28．30。C，自然pH值条件下发酵72h，研究其发酵结果。3．4结果与讨论3．4．1发酵工艺的确定培养基灭菌和不灭菌对发酵产物中微生物量有一定的影响，研究结果见图3．2。匡匾垂夏圃，、0．茸昌0．＼如二0．蓦o．菇0．0l、自地霉2、热带假丝酵母3、皮状丝孢酵母4、产朊假丝酵母图3．2不同发酵工艺对发酵产物的影响废糖蜜培养基在灭菌后经混合菌发酵产生的菌体蛋白明显高于未经过灭菌的废液培养基。这可能是因为灭菌后废液培养基中的与酵母菌有竞争关系其他微生物杀灭给存菌种的生长提供了更好的发酵环境。也可能是糖蜜废液在高温环境下，其中部分难被酵母菌利用的物质分解为易被酵母菌利用的物质，至使产量均明显增高。因此，在实际的生产中建议对培养基的处理使用灭菌工艺。 桂林工学院硕士学位论文3．4．2菌种组合的确定为确定不同种类的酵母菌组合，在同一环境条件下生长相互关系，找出最佳的菌种组合。在废液培养基中按照不同的组合接入白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产朊假丝酵母的混合菌种，研究混合菌种发酵产物的微生物量。实验结果见图3．3。：E曷。备V删S划器1234567不同菌种组合对酵母产量的影响注：1一热带假丝酵母+白地霉2一热带假丝酵母+皮状丝孢酵母3一热带假丝酵母+产朊假丝酵母4一热带假丝酵母+白地霉+皮状丝孢酵母5一热带假丝酵母+白地霉+产朊假丝酵母6一热带假丝酵母+皮状丝孢酵母+产朊假丝酵母7一热带假丝酵母+白地霉+皮状丝孢酵母+产朊假丝酵母图3．3不同菌种的组合对发酵产物的影响由图3．3可见，在不同的组合菌种中，热带假丝酵母、白地霉和产朊假丝酵母混合发酵得到的产物微生物量最高，从发酵后物料的表现状况来看，这三种菌混合发酵，培养瓶瓶口布满洁白的菌丝，有浓郁的酒香及白地霉特有的芳香气味。这可能是由于霉菌同化淀粉、纤维素的能力强，可将废液中的淀粉和纤维素降解为酵母能利用的单糖、双糖等简单糖类物质，使酵母得以良好地生长繁殖，实现生物转化蛋白饲料的效果。采用两种或两种以上微生物发酵，体现了微生物之间的互惠、偏利生等关系。该发酵形式对各种原料的有效转化、蛋白饲料的品质提高起到了积极重要的作用。3．4．3混和菌种比例的确定在废液培养基中按照不同的菌种比例接入自地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母的混合菌种，投菌量为10％，研究混合菌种发酵产物的微生物量。实验结果见图3．4。 桂林工学院硕士学位论文Eo旧＼∞卿S划罄0．7O123456不同的菌种配比注：l—l：2：22一l：2：l3一l：1：24一l：l：l5—2：l：16--l：l：2图3．4不同的菌种配比对发酵产物的影响由图3，4可以看出，当白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母之间的比例为1：l：1时，起发酵后微生物量达到最大。从发酵结果来看，若接入白地霉过多，则发酵料有较浓的霉味，使得饲料的香味和色泽受到一定的影响。若接入的自地霉过少，则分泌的纤维素分解酶、淀粉酶等酶不足，不利于废糖蜜的分解，分解出的葡萄糖和其他可发酵性糖过少，导致热带假丝酵母和产朊假丝酵母的繁殖效率降低。因此，恰当的接种比例使各微生物在发酵过程中具有良好的协同作用。3．4．4投菌量的确定投菌量对实验结果有一定的影响，在液体培养基中接入不同量的白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母混合菌种(1：l：1)进行发酵后，发酵产物中微生物量见图3．5。0．7，、0．舌0．∞≥0．豳}0．蓊0．黎0．O5％lo％15％20％不同的接种比例图3．5不同的接种量对发酵产物的影响．33— 桂林工学院硕士学位论文随着接种量的增加，酵母菌体的产量也随之增加，接种量过低，当发酵结束时培养基中对生物量还没有达到最大。由图3．5可见用15％和20％的接种量发酵后，二者微生物量相差不大。从经济角度和生产实践的需要来看，接入量为15％为理想的投菌量。3．4．5糖蜜废液最佳稀释浓度的确定水是微生物细胞的重要组成成分，在代谢中占有重要的地位。其主要作用包括作为机体内一系列生理生化反应的介质。代谢物只有先溶于水，才能参与反应。营养物质的吸收、代谢产物的排泄都需通过水，特别是微生物没有特殊的摄食器官和排泄器官，这些物质只有溶于水才能通过细胞表面。水能有效地吸收代谢释放的热量、并将热量迅速地散发出来，从而有效地控制细胞的温度。微生物的生命活动离不开水。微生物需在水活度为O．63．0．99之间的环境中生长。培养基中添加溶质会造成水活度下降。超过一定程度后，生长在低水活度的微生物就需要做更多的功来获取水，从而导致生长速率下降。培养基水分不够导致发酵环境干燥时，会导致微生物代谢停止，处于休眠状态，严重时会引起脱水，蛋白质变性，甚至死亡。因此，合理的固液比是发酵产物积累的基础。组合菌种在不同浓度的培养条件下，测试分析其发酵产物的微生物量。实验结果见图3．6。：量o≮∞V悯H．垃璃051015202530糖蜜浓度g／100ml图3．6不同的糖蜜浓度对发酵产物的影响过高或过低的含水量都影响到酵母菌的生长和繁殖。由图3．6可见随着稀糖蜜浓度的增加，干酵母的产量逐渐增加。当糖蜜浓度到达209／L时干酵母的收获量最大，也就是说，培养基糖蜜浓度达至U20vJL时对于复合菌种的生长最为有利。高浓度的培养基中也许是底物浓度较大，影响到了发酵液的溶解氧；含水量过低的话影响力菌体的能量代谢，抑制了混合菌的生长，导致其蛋白产量降低。因此，最适发酵的糖蜜浓度为20叽。蛎o∞■历卫坫■％O仅0nOnOnOm 桂林工学院硕士学位论文3．4．6发酵废液最佳pH的确定微生物必须在定的酸碱度环境中才能正常地进行生长繁殖。通常用pH值来表示酸碱度。pH值对微生物繁殖的影响主要体现在引起细胞膜上的电荷性质的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，进一步影响了细胞组织正常物质代谢的进行。当低于最低或超过最高pH值时，微生物的继续生长受阻，甚至于引起培养物的死亡。每一种微生物都有其生长的最适宜pH值和一定的pH值适宜范围很多微生物在pH4．0～10．0之间可以生长。另外发酵基质中微生物的繁殖生长时，由于其代谢作用也会改变环境中的pH值。在不同pH条件下进行发酵，发酵产物微生物量有较大的变化，见图3．7。：后曷＼?删霹刊蓉O．60．504’。"蠢二—通．1_|】图3．7不同pH值对发酵产物的影响图3．7可见混合菌种适宜在微酸性的环境下生长，其pH在4．5～5．5的条件下微生物量的变化不明显：当初始pH大于6时，粗蛋白含量逐渐降低；当培养基为中性或碱性条件时，微生物量明显减少。pH升高，菌体生长和繁殖速度降低。在显微镜下可见，菌体变形，甚至出现细胞碎片。可见pH接近中性或微碱，破坏细胞膜透性，使内外物质渗透加大，引起细胞自溶。但混合茵适应pH值为中性。因此，选择发酵液初始pH为5．0。此时废液发酵获得的微生物量最多。3．4．7菌种最佳发酵温度的确定温度是影响有机体存活与生长的重要因素之一。在微生物发酵过程中，温度对其的影响主要体现于两个方面：1、随着温度的升高，微生物细胞的生物化学速率和生长速率均加快；2、微生物菌体中核酸、蛋白质都对温度极其敏感，尤其是蛋白质，过高的温度可使蛋白质初步变性，维持其高级结构的作用力受到不同程度的破坏，使得微生物繁殖速度有所降低，温度过低又抑制了酶的活性，蛋白质的合成速度降低。因此，温度过高、过低 桂林工学院硕士学位论文均不利微生物的生长【95961。因此分别设计5个不同温度进行发酵实验，对发酵物的微生物量进行测定，其结果绘图如下图3．8。0．60．5{0．锄咖0·和器O．01020304050温度(℃)图3．8不同的温度对发酵产物的影响v／随温度升高菌体的繁殖速度加快，SCP含量增加，当温度上升到一定程度，若继续升高，SCP含量急速降低。这可能是温度过高引起菌体细胞生长减缓，重者可引起细胞死亡或自溶。当温度超过了30℃时，超过了酵母菌的最适生长温度，干酵母获得量开始下降，因此，菌种的最适发酵温度为30"0。3．4．8氮源的选择氮源对微生物的生长繁殖有着重要作用，是合成菌体中蛋白质和核酸的主要原料，其来源有两个方面：培养料自身的含氮物质和外界加入的含氮物质。一般来说，外界加入的氮源对微生物的生长有更明显的作用。采用有机氮源和无机氮源进行试验，因素水平设计见表3．1，结果见表3．2。表3．1试验因素水平＼＼因子A(尿素)B(硝酸钠)C(蛋白胨)D(酵母膏)水平＼(g／L)(叽)(虮)(g／L)O0．30．61．0OO．30．61．0OO．30．61．0o们％∽l234 桂林工学院硕士学位论文表3．2氮源试验表头设计与试验结果试验号尿素硝酸钠蛋白胨酵母膏试验结果(g／L)(g／L>(g，L)微生物量(gt50mL)0．4211O．44430．5160．464l0．47350．52280．35280．35390．4501O．35190．4212O．37120．41850．38520．47580．44741．84551．7031．59441．78960．461380．425750．398600．447400．062781．76321．76641．7374I．63660．44080．44160．434350．409150．032451．81251．73641．76741．88440．453130．434l0．441850．47110．0371．59251．66681．78881．88440．39813O．41670．44720．47110．073T=6．9325Y=0．4333由表3．2可以看出，影响干酵母产量的因素主次顺序是D>A>C>B，即影响因素主次顺序是酵母膏>尿素>蛋白胨>硝酸钠。由正交试验结果可以看出混合发酵的最佳氮源是酵母膏。3．4．9无机盐的选择无机盐是微生物发酵过程中的生长刺激因子，微生物生长必不可少的营养物质，它为机体生长提供必要的金属元素，维持了细胞的稳定性，能调节和保持细胞的渗透压平衡，可以控制细胞的氧化还原电位，从而提高生物活性。适量的有效无机盐可以促进微生物的快速繁殖。在某些情况下，没有一定的无机盐存在，微生物的生长非常缓慢，甚至不长。广东微生物研究所研制的4320菌体饲料时发现，若只加氮源不加过磷酸钙或其它无机盐类，4320菌种在琼脂平板上不能生长，反之即使不加氮源，只加过磷酸钙，4320仍然能够生长嗍。这足以说明无机盐对微生物生长的促进作用。实验结果见图3．9。-37．．123432I2l434l2l23434l2432l2I4312342l434l2432l2341234l234l234l，ll234123456789m¨坨B¨：2临均琦均l234早平平●L硒岛‰‰即舻妒即R 桂林工学院硕士学位论文1II|，、日o∞＼∞咖{S酬幕OO．1O．20．30．4O．5O．60．7微量元素添加量(g／lOOml)图3．9不同微量元素及添加量对发酵产物的影响图3．9硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙的最佳添加量分别是0．39／lOOmL、O．39／lOOmL和0．69／lOOmL。M92+是各种酶的激活离子，M92+的存在有助于提高酶的活性f971，对蛋白质的合成有较好的促进作用。从图3．9可看出，随着硫酸镁用量的增加，其粗蛋白含量呈显增加趋势。Ca2+也是酶的激活因子。从图3．9分析出，ca2+的加入可提高菌体中蛋白质的合成速度，添加0．5％的过磷酸钙得到产品中粗蛋白含量最高。K+是细胞中重要的阳离子之一，是许多酶的激活剂，可促进碳水化合物的代谢。钾还与细胞膜的透性有密切关系，对维持细胞正常的渗透压作出了贡献。磷酸根离子是合成菌体核酸骨架的重要物质，也是许多重要辅酶的组成部分，参与糖类物质代谢中的磷酸化过程后迅速被同化为含磷的有机化合物微生物可以从无机磷化合物中获取磷，进入细胞后迅速被同化为含磷的有机化合物【9s1，从图3．9的结果看出，随着磷酸二氢钾的加入量增加，发酵产物中，蛋白质的含量也增加，这与微生物代谢有一定的关系。3．5本章小结(1>利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的最佳菌种为自地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母以1：1：1的比例组合，投菌量为15％，在209／lOOmL的糖蜜废液中，分别加硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙至0．39／lOOmL、0．39／lOOmL和0．69／1OOmL，调节pH为5．O，在30"(2下发酵72h，经过干燥处理，可最大限度地获得酵母干菌体。(2)发酵结束后，将发酵液离心水洗后菌体蛋白液如图所示3．10，将菌体蛋自液中恒温干燥箱中105"(2干燥至恒重，可得褐色的菌体蛋白如图3．11所示，并同时产生令人愉 桂林工学院硕士学位论文悦的面包香。这主要是由酵母细胞中不仅含有氨基酸，还含有糖份等其它有机物质，在对菌体蛋白液浓缩干燥的同时，氨基酸与糖份等其它有机物质共热发生了美拉德反应，增加了复合氨基酸的色度，致使经浓缩干燥后的单细胞蛋白呈褐色。图3．10预处理后的菌体蛋白液图3．11烘干后的菌体粗蛋白(3)废糖蜜始制糖工业的主要废弃物，经稀释、酸化、澄清、加营养盐后，在最适发酵条件下生产单细胞蛋白，具有很好的经济效益和社会效益、并具有很好的发展前景。 桂林工学院硕士学位论文_--IIB第4章组合菌生长的动力学研究4．1引言酵母是一类单细胞微生物，其结构简单，属于真菌类。由于酵母具有个体大、蛋白质含量高、杂食性强、易分离、易培养、代谢产物多、综合利用广等特点，在现代工业技的发展和人们对养殖业要求的不断提高及酵母菌具有的众多生理功能，酵母在饲料工业中得到了广泛应用圈l。因此，以混合菌株为研究对象，对其以甘蔗糖蜜为原料发酵生产单细胞蛋白进行了研究，了解混合酵母菌在糖蜜废液中的生长周期，掌握其最佳生长阶段并探讨了相关发酵动力学参数，为进一步放大实验和单细胞蛋白的工业化生产提供理论依据。4．2实验材料4．2．1试验菌株见表2．1。4．2，2实验原料甘蔗糖蜜废液，由广西凤糖鹿寨制糖有限公司提供。4．2，3实验设备生物发酵罐(BioTECH一2002型，上海保兴生物设备工程有限公司)。其他设备见表2．2。4．3实验方法4．3，1培养基的制备1)斜面培养基：麦芽汁(稀释至104BX)，葡萄糖2％，酵母膏0．5％，琼脂2％，自然pH，115℃灭菌30min。2)一级种子培养基：成分同种子培养基，不加琼脂，115"C灭菌30min。3)驯化种子培养基：糖蜜废液50％，pH5．0，115"C,X菌30min。4)发酵培养基：糖蜜废液浓度20％，加少量氮源、磷源、pH调节至5．0。 桂林工学院硕士学位论文I_●_4，3．2培养方法1)菌种培养过程：斜面种子活化12～24h一一级种子培养24～36h一驯化种子培养48～72h--摇瓶发酵培养。2)4L自动生物发酵罐分批培养：三种菌投加比例为l：l：1，按15％的接种量接入灭菌完毕装有3L发酵液的自动生物发酵罐中，发酵期间主要控制参数有：①培养基接种后设定为lOOrpm，发酵过程与溶氧联动，保持空气流量为6L／rain，根据溶氧要求在100~400rpm之间变动。当发酵液溶氧降至30％以下时，提高转速以增加溶氧；②培养温度恒定为30"(2。4．3．3分析方法1)菌体生物量的测定：比浊法199}将721型分光光度计波长调整到460nm，预热30min。以未接种的废液培养基液稀释50倍后校正比色计的零点。在不同的时间取样后，分别用无菌移液管从培养瓶中吸取培养液lmL，用无菌水稀释50倍后，在460nm的波长下测定OD460值。2)培养液糖度的测定：参照食品科学糖度的测定，使用手持糖量计对酵母菌培养液不同培养时间进行糖度测定。3)细胞干重的测定【蚓：量取细胞培养液50mL，用离心机离心分离，转速为4000ffmin，离心15min。离心之后经过预处理(见图3—1)【93]，去除培养基成分，将湿菌体置于干燥箱中在105"(2下烘干至恒重，然后称重。4)COD的测定185J：重铬酸钾法4．4试验结果及讨论4．4．1试验结果及分析微生物生长周期不同，代谢过程和生理状况不同，就蛋白质的转化而言，可能会影响转换所需要的酶的活性和胞内含量。因此使培养物的细胞数和生理状态达到最佳，就要测定混合菌的生长周期。以残糖浓度和生物量为指标，测定优化培养基的混合菌生长曲线，并确定最佳培养时间，并通过两个指标的变化确定混合菌种的最佳生理状态。 桂林工学院硕士学位论文mm自动发酵罐分批培养法生产单细胞蛋白，每隔4h从发酵罐的取样口中，取出一定量的发酵液，测定其残糖浓度、菌体OD值和发酵液的COD，并利用发酵罐的在线检测，读出发酵液pH值，将他们绘制成曲线。自动生物发酵罐分批培养过程曲线如图4．1和图4．2所示。Q帛◇矿母◇◇毋◇小◇爷毋◇时间(h)图4．1茵体生长曲线及糖度的变化巨至匹固654挈3乱210Q％◇咿争◇◇◇◇母毋毋毋◇时间(h)图4．2培养液COD、pH变化曲线161412，、10罨趟强絮舔80000700006000050000茜40000S30000只U20000o100000由图4．1和图4．2可见，在自动生物发酵罐分批培养过程中，由于菌种事先没有进行活化，所以培养过程的初期的0—16h为菌体延滞期，此时发酵液中，菌体浓度维持在很低水平，并呈下降趋势，这是混合茵在环境改变后的表现出来的一个适应阶段，适应环境的菌体继续生存，不适应环境的菌体死去，而残糖浓度变化量很小。从20h后，进入了对数生长期，由于培养基中营养物质充分，温度、pH、含氧量较适宜菌体的生长要求，生长76543210n0O0o∞寸oo 桂林工学院硕士学位论文不受限制，菌体浓度开始快速上升，同时由于菌体迅速利用碳源产酸，使得发酵液pH值不断下降，在这期间，菌体耗氧大量增加，生物发酵罐中的溶氧电极指示发酵液中的溶氧浓度迅速下降，至60h时，菌体浓度较高，培养液密度加大，溶解氧相对减少，再加上菌体的生存空间减少，抑制物质增多和部分细胞老化等原因，使菌体的生长速率下降，从而进入了稳定期，此时，发酵液生物量以趋于最大，菌体千重达到了239／L，废液中的残糖浓度稳步下降，但其pH值稍微上升，这可能是由于菌体开始分解、吸收利用死亡菌体蛋白质后产生碱性物质而导致的结果，也可能是菌体产有机酸的速度小于发酵液中有机酸挥发速度造成的结果。4．4．2发酵过程动力模型的建立动力学实验数据如表4．1所示： 桂林工学院硕士学位论文越爨段零半州雾州暴●‘U。毯《彀屦峰掸醐滁辩I。U。趔蛏霹呕翠划霉州器I。U¨趟蛏半鞘S删器；。U司。越嵌蜉咯螟墒埔称罄，。U。爆之∞岔⑦岔rqlnN●_r_-_岔N口oo∞●●_o●一一-_r_●、o、、眵暑卜N卜口N寸卜N●呐I。c、qn∽寸I，、心3、f"d寸U’一∞n∞寸oOc-、|∽屺∞o卜∞oOoc-q寸●寸∞卜oa、凸口d≥o。oCn∞P～卜__f1nV)Nt"qln心noo卜n≤蚧∞岔●_∞弋r●l6I．之●N●-．一n卜n-_口∞n●_气中N寸小∞卜N●_o●_n寸∞卜N-l_V、lntnNc_、卜＼上寸∞卜L，、岔rq●_●一ol之。No寸∞-_o●一--_ono一o、—，n也岔心n卜oo-_、"Nno●一∞寸口"一o∞●_卜＼o卜oo∞西●bDo。●一v、卜凸●一n口16二卜∞oo∞岔口o、■寸”∞寸’_oo卜"_寸Nt，、∞卜∞岔西●lU·Nrqc、qNr、|NboNt"xlN、-／＼了。oNn●_西寸∞寸Nan寸rqN，_g艺寸-_ot"-口or、|No／、、■onq’oI，、on们o∞N卜寸●_全∞n-_lU·t"NN●bo●d●叫’_●_-Ho-_●_-_，_-_●一●_、■∞n叼寸∞fq叭心∞o卜oo。ooc-q寸U。寸∞卜●a⑦岔boNrqN●Nr、|C,lrqNc’qNc-、|N／、、■-nN．nn∞nN●oU·N-_o●_-_●一●_-．_●_b0．+≯矗蓦。寸∞rq岣o寸∞t"N寸lnn∞卜越一寒繇禽株扑R臀．【．寸《 桂林工学院硕士学位论文在混合菌发酵过程中，其反应体系中动力学行为表现为：①微生物的生长：②培养基中基质的消耗。因为批式培养的生长动力学过程复杂，很难用简单的数学表达式表达整个生长过程。若微生物生长速率只受单一底物浓度影响，可用如下关系表达式表示对数生长期、减速期和静止期的生长规律。即可将Monod方程作为生长动力学模型{1011：。=等⋯e跏一·矗·c(4．1)‘一鲁=击肾去∞e=去～。矗，ec4∞式中：‘一微生物生长速率5‘一培养基中基质的消耗速率；C一微生物自然生长的质量浓度：CJ一培养基基质的质量浓度，mg／L,Ks～Mood常数，rng／L；甜一微生物比生长速率，d一；“嘣一在饱和浓度中微生物的最大比增长速率，d一；y加一单位基质微生物产率系数，若定义基质的比消耗速率为：单位质量微生物单位时间内基质的消耗量，则有：l1C．舻百t2百‘瓦t2瓦嘣2i‰。百茜若定义基质的最大比消耗速率为：lgs眦。——’‰xYJ／j则有：用俨表示，(4。3)筘。鲈一‘乏j专∽4’铲筘一‘若专‘q(4．5)通过实验确定Ks、“一和gJ一的值，然后求解微分方程。对于基质消耗速率方程，由于引入产率系数可消去一个变量，既有：C，一c“=J，m(q—Cs)(4．6)将式(1)改写为：肛芑钏榔’矗㈤7，肛专钏榔’i志¨·7)将(4．7)式後l数整理得： 桂林工学院硕士学位论文g：墨．上+上0甜。越C，甜m缸根据实验数据，在不同时段内作如下近似处理：；，；—AC—x△C．(4．8)冬：量．±+上‘”嘲Cs材皿戤由c。～～C，／，，作图，图为一条直线，回归系数r=O．985。结果表明，培养基中基质降解过程中微生物的生长符合Monod方程。由图4．3所确定的动力学参数为：Ks=85365914，弘一=--4．08×104因此有效微生物的生长动力学模型为：p“082刈0一’万‰“．9)1nn，1，，^●』、。⋯o．’‘oJjU’)7l叶O图4．3否。～一C一，／一r，关系曲线根据动力学实验数据表4．1和式(4．6)确定儿，，的平均值为：yxfs-0．191进而得到：筘一2-2．136×10峭因此可以得到培养基基质的降解动力学模型为：‘：一2．136×10-3．——生』2一。C，一85365914将模型计算值与实验数据点进行比较，生长动力学模型的和底物消耗模型的最大相对误差为分别为9．5％和7．9％，平均相对误差为分别为3．33％和4．95％。表明实验结果与动力学模型值基本吻合。O0O跚加∞的们{；；∞m． 4．5本章小结J＼∞咖j霉划器2322．4桨越蛏彝世4045505560657075时间(h)图4．4微生物生长动力学模型与实验数据的拟合曲线广IL020406080100发酵时间(h)图4．5糖蜜消耗动力学模型与实验数据的拟合曲线(1)批式操作虽然操作方式原始，效率比较底。但其能保障每批培养液中无杂菌和其他微生物的干扰，从而保证发酵产品质量的安全行，因此在实际应用中是比较理想的发酵方式。(2)本实验采用光电比浊法，以白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母组成的混合菌种在糖蜜废液培养基中发酵，测定了混合菌的生长曲线，并借助手持式糖量计对培养液的糖度随酵母菌生长所产生的变化进行了测定。结果表明，混合菌发酵进行前期生长速度缓慢，20h后进入对数生长期，60h后生长趋于稳定期，到60h时生物量达到最高，为239／L。并且随着酵母菌的生长，培养液的营养被消耗，导致培养液的糖度有所降低；而后培养液的糖度又有回升的趋势，通过多重复试验测定，此结果是正确的。至于糖度回升的原因还有待于进一步的研究，初步认为是!工一林一 桂林工学院硕士学位论文酵母菌细胞壁含有的多糖类随着酵母菌的生长，达到衰亡期，酵母细胞壁破碎自溶释放出来所致。(3)采用Monod模型对混合菌发酵得到了较好的理论论述，并取得了想关的动力学参数，阐明了混合菌发酵的动力学特征。 桂林工学院硕士学位论文第5章发酵的技术经济分析和单细胞蛋白的食品安全性测定5．1利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的技术经济分析糖蜜在广西主要用于生产酒精，其原因是建设酒精车间投资少、技术水平要求低、生产设备简单，项目易于上马投产。但从近几年的情况来看，由于国内酒精产量90％是用淀粉作原料生产的，北方大量的陈化粮(玉米等)、薯类用于酒精生产，市场竞争十分激烈，利润越来越低，而酒精废液治理的压力却越来越大。因此，广西很有必要对利用糖蜜为原料的低附加值产品转向高附加值产品作结构性的调整。因为用糖蜜生产某些高附加值产品，具有淀粉原料所没有的优势和特点，而生产酒精，大有大材小用之弊【4们。糖蜜生产酵母及酵母深加工产品是发酵行业公认的最好用途之一，这是因为糖蜜是酵母制造中不可缺少及替代的优质原料，由于糖蜜中除含有糖分外，还含有酵母菌体生长繁殖所需的生物素及氮、磷、钾和微量元素，以致国内外高达900／0的酵母产品都是用糖蜜生产的，这就是我国各地的酵母生产企业纷纷到产糖大省广西购买糖蜜的原因，显然，生产酵母的经济效益很好。由于生产1吨酵母所需的原料糖蜜(5吨)与酒精接近。而酵母及其系列产品的价值为酒精的3．7倍，目前酒精的市场价格为0．45万元∥吨而干酵母的市场价格为1．2万元，吨至于酵母提取物则更高达到了2万元／／吨。此外，生产1吨酵母所产生的废液COD总量也与酒精接近。处理成本差不多。显然将糖蜜用于生产酵母及酵母提取物是可取的。5．2单细胞蛋白的食品安全性评价饲料作为人类食物链中的重要一环，其质量与人类健康和食品安全紧密相关；特别是近年来由饲料质量安全问题引起的食品安全危机频发，造成了人们的恐慌。而采用不同的饲料原料，特别是质量不同的蛋白质原料，不仅影响饲料产品和畜产品的质量水平，而且决定了饲喂动物时饲料的实际营养价值，为此，专门对本次试验的发酵产品食品的安全性和营养价值做了专门检测。本次试验的发酵产物即单细胞蛋白的食品安全性，通过了桂林市产品质量监督检验所的鉴定，经检测该产品符合国家《饲料卫生标准》GBl3078．2001标准鱼粉类要求(检测报告见附件)。其营养成份通过广西壮族自治区分析测试研究中心的的检测(检测报告见附件)，数据显示发酵产物样品的蛋白质含量为47．8％，氨基酸含量达到了40．34％，并且所含氨基酸种类齐全，且与进口鱼粉所含所含氨基酸种类和含量接近(见表5．1)，特别是它 桂林工学院硕士学位论文包含了人体所需的八种必备的氨基酸，即赖氨酸(Lyb)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ilc)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Try)和苯丙氨酸(Phe)非常适合与生产人畜可食用单细胞蛋白。表5·1单细胞蛋白与进口鱼粉氨基酸种类与含量比较(mg／1OOmL))．50． 桂林工学院硕士学位论文II6．1结论第6章全文总结本论文对白地霉、热带假丝酵母、皮状丝孢酵母和产阮假丝酵母发酵甘蔗糖蜜生产单细胞蛋白饲料进行了研究，主要内容为混合菌发酵菌种组合的确定、发酵工艺条件的优化初探和发酵过程的数学模型和动力学模型的建立，得到以下结论。(1)通过实验测得甘蔗蜜中还原糖含量为31．21％，总糖含量为48．oo％。按还原糖与总氮计算所得的C／N原于摩尔比为17．95，是生产单细胞蛋白的理想碳源：曝气不会造成废水中大量有机物的挥发，废水的pH值在曝气过程中上升，可能是在长时间的曝气过程中糖蜜废水中有一些微生物将水中部分易降解的有机酸类物质分解的结果。证明甘蔗糖蜜是用于发酵生产单细胞蛋白的理想原料。(2)通过发酵生产SCP的四株菌株性能的测点可知，热带假丝酵母是生长率快、细胞干重高、粗蛋白含量较高、总产量高的菌株，为利用废糖蜜生产SCP的最佳菌种。(3)利用废糖蜜发酵生产单细胞蛋白的最佳菌种为白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母以l：1：1的比例组合，最佳投菌量为lO％，在209／100mL的糖蜜废液中，分别加硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙至O．3∥100mL、0．39／100mL和0．69／100mL，调节pH为5．O，在30℃下发酵72h，经过干燥处理，可获得酵母干菌体。(4)批式操作虽然操作方式原始，效率比较底。但其能保障每批培养液中无杂菌和其他微生物的干扰，从而保证发酵产品质量的安全行，因此在实际应用中是比较理想的发酵方式。(5)采用光电比浊法，以白地霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母组成的混合菌种在糖蜜废液培养基中发酵，在4L生物自动发酵罐中进行放大培养，测定了混合菌的生长曲线，并借助手持式糖量计对培养液的糖度随酵母菌生长所产生的变化进行了测定。结过表明，混合菌发酵进行前期生长速度缓慢，20h后进入对数生长期，60h后生长趋于稳定期，到60h时生物量达到最高，为239／L。并且随着酵母菌的生长，培养液的营养被消耗，导致培养液的糖度有所降低；而后培养液的糖度又有回升的趋势，通过多重复试验测定，此结果是正确的。至于糖度回升的原因还有待于进一步的研究，初步认为是酵母菌细胞壁含有的多糖类随着酵母菌的生长，达到衰亡期，酵母细胞壁破碎自溶释放出来所致。(6)采用Monod模型对混合菌发酵得NT较好的理论论述，并取得了相关的动力学参数，阐明了混合菌发酵的动力学特征。 桂林工学院硕士学位论文III|(7)废糖蜜始制糖工业的主要废弃物，经稀释、酸化、澄清、加营养盐后，在最适发酵条件下生产单细胞蛋白，具有很好的经济效益和社会效益、并具有很好的发展前景。6．2本文的主要创新点本论文重点针对甘蔗搪业的副产物甘蔗糖蜜的资源优势及其发展潜力，畜牧业、饲料行业、以及甘蔗糖蜜的处理和综合利用现状，根据甘蔗搪蜜原料特征，利用酵母菌进行混合协同发酵，通过对培养基以及相关发酵工艺参数的研究，确立较为理想的发酵工艺，并建立微生物发酵数学模型，根据此工艺能利用甘蔗糖蜜生产得到营养价值较高的发酵饲料产品，为甘蔗糖蜜的综合利用开辟了一条新的途径，对甘蔗糖业、畜牧业以及环境可持续发展意义重大。(1)筛选出了对甘蔗糖蜜利用率高的白地霉GIM2．69、热带假丝酵母AS2．637和产阮假丝酵母菌As2．81，根据各菌种利用甘蔗糖蜜的特点和优势提出混合菌发酵生产单细胞蛋白。(2)经研究优化出混合菌发酵的最佳工艺条件，粗蛋白含量可达到47．8％。(3)建立起来混合菌发酵的动力学模型。6．3存在的问题本研究是混合菌种发酵甘蔗糖蜜生产单细胞蛋白的初探。由于时间条件等原因，还有许多工作有待进一步完善。(1)发酵过程中由于实验室设备条件的限制，每次发酵过程中发酵条件控制起来相对困难。本实验的发酵工艺的相关数据，毕竟是通过实验室摇瓶发酵和小型发酵罐实验获得的，要进行SCP的产业化成产，还要进一步在大型发酵罐上进行发酵放大研究。(2)由于时间所限，未进行动物营养实验，建议以后进一步进行动物营养对比实验，与普通植物蛋白饲料进行饲养效果比较和适口性评定。 桂林工学院硕士学位论文Ill致谢本论文是在导师曾鸿鹄副教授悉心指导下完成的。三年来，在学习上，导师曾鸿鹄副教授和导师组其他成员给予了我很大的指导和帮助。他们对事业的执著、对人生的豁达、对工作的认真严谨，将深深地影响着我。他们渊博的学术知识、严谨的治学态度和高尚的品德将使我终生受益。在此，特向各位教授致以最衷心的感谢和崇高的敬意!在论文的完成过程中得到了给水排水工程教研室陆燕勤老师、魏彩春老师、黄海涛老师、黄明老师、曹长春老师和实验室张力老师、张萍老师、李艳红老师、梁延鹏老师、梁美娜老师的大力帮助，环境工程教研室朱义年老师、廖雷老师、王敦球老师、成官文老师、李金城老师的支持和帮助，得到了赵敏师姐、赵芯师姐、沈运跃师弟和张璇师妹等同学的帮助，在此一并致谢!感谢各位老师这三年来给我的关心和帮助。感谢我的朋友和家人在论文完成过程中对我的帮助和支持，以及这三年来对我学习上的鼓励。最后，再次感谢所有帮助过我的老师和朋友! 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