探究利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料的研究 64页

广西大学硕士学位论文利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料的研究姓名：徐雅飞申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：伍时华;童张法20070526 利用甘蔗着．甘蔗糖蜜生产裳醇饲料的研究利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料的研究摘要本文针对广西甘蔗糖业的发展优势，其副产物甘蔗渣、甘蔗糖蜜综合利用现状及其发展潜力，根据微生物学及发酵工程理论，采用微生物固态发酵技术，研究利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料，获得具有较高饲用价值的甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料，生产过程中不产生“三废”，为甘蔗渣、甘蔗糖蜜的综合利用开辟了一条新的途径，对甘蔗糖业、畜牧业、饲料行业以及环境可持续发展意义重大。主要研究内容和研究成果如下：1根据对相关纤维素降解微生物的报道和研究，从烂草堆、经年堆积的腐烂树叶、腐土、腐木等处采集的样品中分离得到8株疑似目的菌株。然后分别采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂平板识别法、滤纸条崩解试验，以及在蔗渣麸皮培养基上的固体发酵产酶鉴定试验，最后从中筛选得到一株分解纤维素能力较强的真菌，根据初步鉴定的结果，确定该菌为木霉属(乃，曲。幽懈．sp)真菌，并以木霉卜，标识。其黄曲霉毒素鉴定试验证实该菌不产黄曲霉毒素，可以作为发酵饲料的生产菌种。最后对木霉T-1固态发酵产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶以及13一葡萄糖苷酶的酶促反应条件，如反应pH值，反应温度，反应时间等因素进行初步研究。2通过对原料蔗渣的粉碎粒度，发酵培养基蒸煮处理对发酵产纤维素酶的影响试验研究，确定取过30目筛粉碎蔗渣，制成发酵培养基，121℃高温蒸煮60min后的发酵产酶效果较为理想。3利用筛选所获得的木霉T-1与酵母菌等微生物混合发酵，研究生产甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料工艺。以发酵物料中蛋白质、游离氨基酸、可溶性还原糖作为评价指标，进行了酵母菌种类、木霉T-1和酵母菌的接种方式、发酵培养基的组成、料水比、甘蔗糖蜜及其在培养基中的添加量， 利用甘蔗鲁、甘蔗糖’蜜生产冀．j}饲料的研究木霉卜1和酵母菌各自接种量、北京棒杆菌及其接种量等因素的试验研究，初步确定甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料的生产工艺。确立了由20％木霉T-1、10％扣囊拟内孢霉酵母1803(Endomycopsisfibuligera)和1O％北京棒杆菌10178(Corynbacteriumpekinense)组成的微生物混合协同发酵体系；接种时首先接种木霉T_1，24h后再同时接种其它两菌的液体种子；固态发酵培养基组成为：蔗渣：麸皮：豆饼----5：3：2；(NH．)：sO。1％，KH。P0．0．2％，热酸法处理甘蔗糖蜜20％，料水比1：4．0，121℃高温蒸汽灭菌60min。根据上述工艺所得甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料分别含有9．21％可溶性还原糖、25．45％蛋白质以及7．46％游离氨基酸，蛋白质和游离氨基酸含量分别比原料培养基提高了81．40％和83．24％；粗纤维含量从原来的43．95％降为21．71％，降解率50．600％0；每克60。C烘箱干燥产品中所含活菌数为7．92×1010cfu／g；所得产品具有较好的产品外观和风味，具有较高的饲用价值，适合用作饲料饲喂草食动物。本文在评价发酵工艺时，除考察发酵饲料中蛋白质含量外，还同时考察了其可溶性还原糖、游离氨基酸含量，发酵前后产品粗纤维含量及其降解率、产品所含活菌数等指标。同时在测定蛋白质含量时排除了物料中可能存在的部分无机氮对测定结果的影响，测定所得蛋白质含量在一定程度上代表了产品的真蛋白含量，从而能更全面客观的衡量产品的营养价值，评价发酵工艺，确定相关工艺参数。关键词：甘蔗渣甘蔗糖蜜微生物发酵饲料lI 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗藿．甘蔗糖’；生产袅翻}饲料的研究STUDYONTHEPRODUClNGOFFERMENTEDFEEBBYUSEINGSUGARCANEBAGASSESANDMOLASSESABSTRACTAccordingtothedevelopmentofthesugarindustryinGuangximunicipality,theabundantandpotentialby—productsofsugarcanebagassesandmolassesfromsugarindustryandtheirfull一utilization．thetechnologyofproducingoffermentedanimalfeedfromsugarcanebagassesandmolassesviamicrobialfermentationwasstudied，andtheidealanimalfeedstuffwithnodisposalhasbeenobtainedbysolidstatemicrobiaIco—fermentation．Itbreaksanewwaytomakethefulluseofsugarcanebagassesandmolasses．Anditissignificanttothecontinuabledevelopmentonsugarindustry,stockbreeding．fbedindustry,andtheenvironment．Andthemainworkanditsresultsale鹊follows：Firstly,accordingtothereportsandtheprogressesonthecellulolyticmicroorganism,8speciesofstrainsareseparatedfromthenaturalenvironment．Carboxymethylcellulosesodiumagarplaterecognition，filterpapercollapsingtesting，andcellulaseproducingtestingbysolidstatefermentationonthemediawhicharemainlycomposedbysugarcanebagassesandWheatbranarecarriedout．Onespecieoffilamantousfunguswhichcandecomposecelluloseonanrelatively—highscalewasscreened．Tllisstrain．geneticallyconsideredtobeonespeciesofTrichoderma．sp．andsignedasT-1．nisvalidatedtobesafeandinnoxiousbytheaflatoxintestification,andcanbeusedtoproducefermentedanimalfeed．Furthermore，thetemperature，pHvalueandtimeforreactionwhichmayaffecttheenzymaticreactionforeellulase，includingfilterpaperenzyme，carboxymethyl-cellulaseand3-gIucosacch缸馘，producedbvT-1onsolidstatefermentation,areinvestigated．Secondly,thepre-treatmentofsugarcanebagassesisstudiedinthissection．Aftertheresearchonparticlesizeofcrushedbagassesandsteam-boilingtimeforbagassesandthefermentationmedia,thesuitableparticlesizeofsugarcanebagassesisunder0．60mm，andthemediashouldbesteam-boiledfor60minat121"Cbeforeinoculating．Thirdly,thetechnologyofmixed—fermentationforproducingoffermentedfeedfromsugarcanebagassesandmolassesbyT-1withsomecertainspeciesofstrainaremainlystudied．Andtheproteincontent，solublereducingsaccharidecontentanddissociativeamino111 ／--西大掌硕士掌位论，：利用甘蔗澶、甘蔗糖，；生产裳醇饲料的研究acidcontenthavebeentakenastheevaluation．Byscreeningtherightspeciesofstraincombinationandtheirowninoculums，thefermentationmediaanditsidealcomposition,molassesanditscontentaddedinthemedia,aswellassomeotherreferredfactors，thetechnologyforproducingfermentedfeedfromsugarcanebagassesandmolassesareestablished．11圮detailsareasfollows：Amixedstrainsystemforco-fermentation,including20％T-1，10％Endomycopsisfibuligera1803and10％Corynbacteriumpekinense10178，isestablished,T-1shouldbeinoculated24hbeforetheother2strainsinoculated．Thefermentationmediaarecomposedofsugarcanebagasses：wheatbran：beancake25：3：2，(NH4)2S04l‰KH2P04O．2‰hot-acid-treatedmolasses20％，theproportionofdriedmaterialtowateris1：4．0．andthemediashouldbeequablymixedandsterilizedat121℃for60minbeforeinoculating．Takingthetechnologyreferredabove，thefermentedproductcontains9．21％solublereducingsaccharide．25．45％proteinand7．46％dissociativeaminoacid．BothoftheproteincontentandthedissociativeRillinoacidcontenthavebeenincreasedbv81．40％and83．24％respectively,andtIlecrudefiberWasreducedfrom43．95％to2l，71％．Meanwhile，thedriedfinishedproductiscoloury,flavorfulandnutritive，thereategreatamountoflivingstrainsexistinginthefinishedproductwhichmayimprovetheabsorbanceofnutrientintheanimal’Sdigestivesystem．Whenevaluatingthenutritionofthefermentedfeedobtained。notonlytheproteincontent，butalSOthesolublereducingsaccharide，thedissociativeaminoacid，thecrudefibercontentanditslivingstrainsexistinghavebeenconsideredanddetermined．Andsomeorganicnitrogenintheproductmaybehavebeeneliminatedondeterminingoftheproteincontent，whichCanbeindicatethetruelevelofproteinCOntentsomehow．A11ofthesehavebeenmakethenutritionalValReevaluationmuchmoreroundlyandimpersonaUy．KEYWORDS：sugarcanebagasses；molasses；microorganism．fermentation；animalfeedIV 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：利坼吾≯吵年名月7日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：面即时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作者签名：黼导师签名孵b月5日| 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗涪、甘蔗糖’蜜生产量酵饲料的研究1．1引言第一章绪论随着人民生活水平的提高，人们对肉奶蛋的需求越来越大，从而有力地推动了养殖业的发展，但同时也加剧了养殖业发展与饲料资源相对不足的矛盾，如何开辟新的饲料资源，提高饲料利用率成为人们普遍关心的问题。粮食短缺、能源紧张及环境污染的日趋严重是世界各国所面临的难题。通过对可再生资源物质的转化作用，在有利于生态平衡及其可持续发展的条件下同时解决这三个问题的清洁产业正成为一种新的工业生产方式而备受各国的重视。植物纤维素类物质是地球上储量最丰富，且可再生的有机物资源，地球上每年约产生2000亿吨左右植物纤维素类有机物，如何转化并利用这一巨大资源以提供人们所需的能源和产品是世界上许多国家正在积极探索的课题[1-3l。开发利用纤维素类原料生产动物饲料以支持畜牧业的发展，不仅可以节约传统饲料资源，而且可以改善生态环境，形成农业的良性循环，促进农业的可持续发展14划。蔗渣作为一类大量存在的天然纤维质的重要资源，它的再生利用研究亦备受关注。广西是全国甘蔗糖业的生产中心，甘蔗糖业是广西最大的农产品加工行业，也是广西的优势和支柱产业，其蔗糖产量已经连续几年位居全国首位16-71。根据最新的统计资料，在2006／2007榨季，截至07年3月底，广西累计已入榨甘蔗4728万吨，产糖597万吨，预计本季将产糖650万吨，约占全国的60％左右116-81。而蔗渣是甘蔗糖厂最大宗的副产物，一股其产量约占原料甘蔗的24％。27％，因此每年榨季都会产生上千万吨的甘蔗渣【6，9】。目前90％的甘蔗渣被用作燃料，用于糖厂锅炉发电和供应蒸汽，剩余lO％的甘蔗渣主要被用于造纸以及生产动物饲料等[6-71。虽然蔗渣直接燃烧是处理蔗渣最简洁快速的方法，但是蔗渣直接燃烧既浪费蔗渣资源，又会产生大量C02等温室气体，对空气和自然环境造成严重的污染，因此蔗渣资源的合理开发利用问题亟待解决[10-t3j。蔗渣一般含干物质90％．92％，其中粗灰分2％．3％，粗纤维44％-46％，粗脂肪0．7％，粗蛋白质1．5％，无氮浸出物42％。其粗纤维中又约含46％的纤维素，25％半纤维素、20％的木质素，以及约9％的其它物质【7,91。蔗渣是一种含木质纤维素的糖厂加-r苗Jj产物，由于其中含有较多的木质素，直接用蔗渣饲喂动物可引起动物消化系统的损伤和紊乱。现国内只限于用蔗渣来喂牛、羊等反刍动物，且用量不超过牛日粮的20％。也 利用甘蔗薏、甘蔗糖蜜生产裳醇饲料的研究因此限制了甘蔗渣作为饲料原料的开发和利用U,12-14]。采用微生物多菌种混合固态发酵工艺，适当的降解部分蔗渣纤维，同时提高发酵产品的基础蛋白质含量以及氨基酸含量等营养组成，扩大其饲喂范围，提高其在日粮中的饲喂比例，从而为拓展饲料资源、降低饲料成本探索了一条新途径。1．2甘蔗渣处理方法甘蔗渣是一种纤维质特别是木质素含量很高的糖厂加工副产物，一般除反刍动物外很难被动物所利用。因此要利用甘蔗渣生产动物饲料最好首先对甘蔗渣进行适当的预处理，提高动物体对其的利用率。目前常用的预处理方法可归结为以下几类：1．2．1物理处理法通过粉碎、蒸煮、膨化、高压蒸汽裂解及辐射等方法处理蔗渣。主要是为了降低蔗渣结晶度、破坏其木质素与纤维素及半纤维素的结合层，提高纤维素降解率，同时降解部分纤维素类物质生成寡糖或二糖、单糖等物质[12-13,151。粉碎是最简单也最常用的处理方法：高压蒸汽裂解处理蔗渣，可以有效的破坏蔗渣纤维，处理后的蔗渣还原糖浓度明显提高【【”。巴西圣马提糖厂将蔗渣置于180"C间歇反应锅中蒸汽处理7min-10min，蔗渣消化率从15％提高到60％；巴西圣保罗大学农学院采用高温高压(200℃．220℃，16—18kg／cm2)膨化处理甘蔗渣作牛、羊、鱼的饲料【61。物理法操作简单，但对设备要求较高，能耗大，因而使其应用受到极大的限制。1．2．2化学处理法化学处理法，主要是利用酸、碱、有机溶剂处理甘蔗渣，使其纤维素和半纤维素部分降解并除去木质素。常用的化学处理法主要有碱化处理、氨化处理和酸化处理。碱化处理是利用碱溶液处理蔗渣，使蔗渣细胞壁变松散，纤维素、半纤维素与木质素之间的化学键被打断，使纤维素和半纤维素等易被微生物进攻并利用。目前常用的碱液主要有Ca(OH)2、NaOH等。有报道秸秆经过碱化处理后，有机物质的消化率和粗纤维消化率可分别提高25％和20％以上。Ca(‘OI-Iu)2和NaOH碱化处理蔗渣，蔗渣纤维和木质素均有不同程度的降解，而且干物质和粗纤维消化率均随Ca(O102浓度的递增而逐次提高。在波多黎哥，于室温条件下用2％烧碱处理蔗渣24h，其木质素含量可降低50％左右【16．20l。氨化处理有液氨氨化法，氨水氨化法和尿素氨化法。氨化处理蔗渣一方面可使木质索和纤维素之间的酯键断裂，纤维素部分水解膨胀，反刍动物瘤胃液易于渗入，从而提高蔗渣的消化率；另一方面，氮化作用使氨吸附在秸秆上，氨随蔗渣进入反刍动物的瘤胃，其中微生物利用氨合成微生物菌体蛋白质。同时氨化处理蔗渣还可改善蔗渣的适口性，因而可提高动物对蔗渣的采食量和利用率。臧金灿等报道氨化处理秸秆粗蛋白从32 利用甘蔗疆．甘蔗糖蜜生产裳酵饲辑的研究％_4％提高到8％以上，可大大改善秸秆的营养价值，消化率也可提高20％以上，其适口性明显改善，总营养价值提高一倍左右【⋯7J9l。采用稀酸处理方法，处理效果较好，温度高所需处理时间较短，处理后半纤维素水解成单糖进入水解液，纤维素的平均聚合度下降，反应能力增大。The-AnHsu等研究了在IOOL的不锈钢中用稀酸处理纤维素类物质，发现半纤维素能被有效地水解，纤维素的可消化度达80％。化学处理法操作较简单，但是酸碱溶液对设备的腐蚀性大，同时化学处理法处理蔗渣的原料损失较厉害，而且若处理液处理不当，必然会带来处理废液的二次污染问题，这些在一定程度上也都限制了化学法的应用。1．2．3物理一化学处理法物理一化学处理法主要综合物理法和化学法的优点，弥补其不足。如化学试剂处理与粉碎、蒸煮或汽爆等物理法的复合处理法。例如在原料中加入不同比例的NaOH和Ca(OH)2，然后进行汽爆处理，消化率可达80％左右16,D,16-17,20]。从技术角度着，物理一化学处理法不失为一种较理想的蔗渣处理方法。"．2．4生物处理法生物法处理蔗渣主要是利用酵母，细菌、放线菌、霉菌等微生物处理甘蔗渣，使蔗渣部分降解成易于被动物体利用的糖类物质，同时通过微生物的代谢活动生成蛋白质、氨基酸、还原糖等营养物质，使处理后蔗渣的适口性、产品风味和营养价值得以明显改善。例如，在蔗渣中接种可利用纤维素类物质的微生物，如木霉、青霉等，对降解蔗渣纤维意义显著，同时若接种酵母菌等具有产单细胞蛋白能力的微生物，可提高蔗渣蛋白质等营养物质含量。另外添加纤维素酶等降解酶类，可提高蔗渣的酶解糖化率【2-3-ZO,JT,21-301．1．3纤维素及其降解1．3，1纤维素结构纤维素(cellulose)是植物细胞壁的主要组成成分，是由D·六环葡萄糖经IS-1，4糖营键连接而成的直链多糖。纤维素分子的化学结构示意图见图1．1L1,6,2031-331。。阵CH20玲H≮CH20FH闸．CH20H“Ⅱ．图1-1纤维素分子化学结构示意图Fig．1-lTheslructureofcellulose3 利用甘蔗鲁、甘蔗糖，；生产量醇饲料的研究x射线衍射研究认为纤维素是由葡萄糖残基组成的晶格构成，由这些晶格组成的结晶区和无定形区共同组成了纤维素。晶格中邻近的葡萄糖残基的两羟基之间形成氢键，如图2．2所示。在纤维素中，氢键主要是横向的链锁，从而使纤维素问的结合力增加。在纤维素无定形区，仅亲水的羟基部分为氢所束缚。无定形区内纤维素链分子的排列不规则。间隙较多，彼此间结合力较弱，酶分子能在其中自由渗透，因而易于水解【1’9瑚l。纤维素分子／Q＼广＼户＼产／VHVHV纤维素分子图1-2两纤维素分子之间的氢键结合Fig．1-2Thehydrogenbondsoftwocellulosemolecules半纤维素(hemicellulosc)，是由许多不同的单糖聚合而成的杂多糖，包括葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖与半乳糖等。其聚合度一般为150．200，分子链很短，有较短的分支。不同来源的半纤维素在糖分组成和结构方面存在差异，蔗渣半纤维素主要由p—D一木糖基以1，4糖苷键构成主链，a-L邛可拉伯糖基以1，3糖苷键连接到木糖基的C3上形成支链，还有D．葡萄糖醛酸基以1，2糖苷键连接到木糖基的C2上[1,7,9,29,31t331。木质素(1ignine)是一类酚酸多聚体混合物，是由苯丙烷及其衍生物为基本单位构成的高分子芳香醇，也是是植物细胞壁的主要成分之一，主要存在于细胞次生壁和初胞间层中。但不是简单地沉积于细胞壁聚糖之间，而是常常与其他部分如半纤维素，纤维素结合或聚合在一起，极不容易分开，一般不能被家畜所利用。而且木质素的存在，还会影响微生物对纤维素和半纤维素的降解。1．3．2纤维素酶的组成纤维素酶是能水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种水解酶类组成的一个复杂酶系，主要来自于真菌和细菌，根据其性质纤维素酶大致可以分为三类12-3,州11：1．3．2．1葡聚糖内切酶葡聚糖内切酶(endo-1,4-8-D-glucanase，简称EG)，或称Cx酶、CMC酶，主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解p．1，4．糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。它的主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等；1．3．2．2葡聚糖外切酶葡聚糖外切酶(exo一1，4一f3一D—glucan娥，简称CBH)，或称c1酶，是纤维素酶系中4 利用甘藤涪、甘蔗糖薯}生产袁醇饲料的研究的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它作用于纤维素线状分子的末端，能从纤维素链的非还原性末端切割，水解B．1，4，糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，生成可溶性纤维糊精和纤维二糖。1．3，2．3B一葡萄糖苷酶p一葡萄糖苷酶(p．1，4．glucosidase，简称BG)，或称纤维素二糖酶，它能水解纤维素二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖。虽然它不能直接作用于纤维素使其降解，但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物对反应的抑制作用，从而加快反应速度。1．3．3纤维素的降解机理纤维素酶作为一组多组分酶系，主要包括葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶以及B．葡萄糖苷酶，纤维素的降解过程是这三种酶协同作用的结果。～般认为，c1酶作用于不溶性纤维表面，使形成结晶结构的纤维素长链分子开裂，长链分子末端部分发生游离，从而使纤维素易于水解，成为可被Cx酶解的形式；Cx酶则作用于经外切酶活化的纤维素，随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的B．1，4．寡聚物，分解其13-1,4一糖苷键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖，同时形成Cl酶需要的新的游离末端；C1酶从这些多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，再由B一葡萄糖苷酶进一步将纤维二糖和纤维三糖水解成动物机体可利用的葡萄糖[29-411。其基本降解模式如下图所示：纤维素旦无定形纤维素要纤维二糖!二竺竺兰兰璧葡萄糖1．4微生物发酵生产蔗渣饲料1．4．1微生物发酵生产蔗渣饲料优点(1)微生物生长繁殖速度快，一些微生物每隔0．5h-lh其产量就能加倍，可以实现大规模的连续化、自动化生产，且占地面积少，对气候的依赖性小，可以不受自然条件的限制；(2)容易对微生物菌种进行遗传育种处理，以获得所需的改良菌种；(3)微生物菌体蛋白质含量商，其菌体干重中约含有40％．80％的粗蛋白质，氨基酸组成齐全，对提高发酵饲料营养价值具有显著意义；(5)微生物可利用的生产原料具有来源广泛，价格低廉等优点。如糖、淀粉、纤维素等副产物，以及其它有机、无机原料都可作为微生物发酵饲料的生产原料。微生物发酵生产蔗渣饲料操作简便，制作成本低，同时在发酵过程中产生并积累的代谢产物如氨基酸，有机酸，醇，醛，酯，维生素，微量元素等不仅可以增加饲料的适121性，而且对增强动物抗病力及促进其生长发育都具有显著的促进作用(1021勰42-451，其巨大的经济意义及社会意义使微生物蛋白饲料成为人们研究的热点。 耳Ⅱ用甘蔗涪，甘蔗精蜜生产袅酵饲料的研究1．4．2生产发酵蔗渣饲料常见的微生物菌种由于甘蔗渣中含有大量的纤维素，利用微生物发酵生产蔗渣饲料一方面必须具有能降解蔗渣纤维的菌种，同时为丰富产品的营养成分的含量和组成，提高其营养价值，必须含有其他能够如单细胞蛋白产量高，或产蛋白酶或淀粉酶的微生物菌株以及能够产一定赖氨酸、蛋氨酸等动物必须氨基酸的菌种。目前报道的许多霉菌，如木霉属(绿色木霉，康宁木霉、里氏木霉等)、黑曲霉、青霉等，以及还有少量的细菌，如纤维单孢菌等都具有较强的产纤维素酶能力，降解蔗渣纤维；另外再利用酵母菌等具有较强的产蛋白质能力的菌株，以蔗渣降解所产单糖、二糖等物质为原料生长繁殖，可消除纤维素酶的葡萄糖反馈抑制，互惠共生共同促进蔗渣纤维素降解并达到发酵蔗渣营养增富的目的【10,29,42-451。表1．3为一些利用纤维质原料生产营养增富发酵饲料的常用微生物菌种12-3A0．23．26-27，29-3s]。表1-3利用纤维质原料发酵生产饲料的常用微生物Tablel-3Themicroorganismalwaysusedtoproducefermentedfeedwithcellulosicwaste绿色木霉(Trichodermaviride)里氏木霉(Trichodermareesei)康氏木霉(Trichodermakoningi)黑曲霉(．4spergillus月iger)青霉(Penicillium)白腐菌(White-rotfugus)纤维单孢菌(Cellulanonas)纤维粘菌属(Cytophaga)细菌芽胞杆菌属(Bacillus)小单孢菌(Micromonospora)纤维放线菌(一．Cellulosae)热带假丝酵母(Candidatropicalis)啤酒酵母(Saccharomycsecerevisiae)产朊假丝酵母(Candidautilis)扣囊拟内孢霉酵母菌(Endomycopisisfibuligera)自地霉(Geotrichumcandidura)1．4．3微生物发酵生产蔗渣饲料的研究进展蔗渣是甘蔗糖厂最大宗的蓟产物，其中含有大量的纤维素，特射是含有较多的木质素，直接用作饲喂动物可引起动物消化系统的损伤和紊乱。将甘蔗渣经过适当的预处理，再利用微生物多菌种混合协同固态发酵技术处理蔗渣，提高其营养价值、改善其适口性，得到较易被动物消化利用的具有较高饲用价值的发酵饲料。这一方面可实现蔗渣低成本、无二次污染的综合利用，另一方面为拓展饲料资源、降低饲料成本探索了一条新途径。对促进广西乃至全国甘蔗糖业、畜牧业的发展以及缓解环境压力等方面都具有极其重要的意义。目前国内外许多学者已经傲了很多相关的研究和探索，并取得了丰硕的成果。巴西于八十年代初就开始进行生产甘蔗渣饲料方面的相关研究，他们在通过化学法、物理法6 广西，‘掌硕士掌位论文利用甘蔗涪、甘蔗糖蜜生产生醇饲韩的研究和生物发酵法处理和制备甘蔗渣饲料等方面积累了丰富的实践经验。目前巴西利用甘蔗渣做饲料的工艺已经比较成熟，应用效果较好№】，美国学者S．Matsuoka将接种纤维素分解菌、产硝酸盐微生物、淀粉及蛋白质降解微生物、木质素降解微生物的麸皮、米糠混合培养物与蔗渣混合发酵，成功地获得一种高消化率的饲料，该技术已申请了美国专利1251。日本某项技术中用多种纤维菌共发酵甘蔗渣后纤维素降低60％，粗蛋白和粗脂肪提高了数倍“”。原轻工业部甘蔗糖业科学研究所于1985年首次以蔗渣，糖蜜和尿素为原料，研究成功“甘光1号”饲料，用于养牛效果显著{461，Mommcr等利用CaO和糖蜜制成饲料舔砖用于饲喂奶牛等动物效果显著14‘”。Timothyp等用纤维分解菌与固氮菌混合发酵蔗渣可明显提高蔗渣的降解率[271。美国塔而维那畜牧技术研究所将氨化蔗渣高压(1000kg／cm2)蒸爆后拌入酵母发酵，发酵产物干燥研磨粉碎后用作饲料，其蛋白含量提高8％．11％左右。原民主德国用蔗渣、稻壳等原料培养球盖菇属侧耳属残孔菌属真菌得到优质可消化的蛋白饲料。加拿大将蔗渣、木屑经NaOH处理后培养毛壳真菌可形成含45％蛋白的蛋白饲料l媳’9．22，37j。1．5糖蜜及其在饲料领域的综合利用糖蜜作为一种物美价廉的饲料原料，糖蜜适口性好，易被动物消化吸收，含糖量一般在38％．42％之间，此外还含有较多的生物素、泛酸以及维生素等物质。糖蜜还具有提高饲料适口性，降低粉尘，提高饲料颗粒质量等优点【『7’枷。然而因糖蜜作为极其粘稠的液体，对其贮藏、运输以及添龆工艺及技术等都具有较高的要求，这在一定程度上限制了它的应用。有实验表明在猪饲料中加入糖蜜以代替等量的能量饲料，猪的摄食量增加9％．12％。英国农业部所做的一项实验表明，在肉鸡饲料中添加2％的糖蜜，鸡日增重明显提高。另外在欧洲许多厂家都用糖蜜来降低粉尘，改善颗粒饲料质量，其添加量最高可达5％。在奶牛日粮中添加部分糖蜜，可以促进瘤胃微生物的消化能力，提高日粮干物质的采食量，在泌乳早期奶牛日粮中添加糖蜜，将会在很大程度上缓解“能量负平衡”现象。以糖蜜为碳源，尿素为氮源，同时添加其他物质压割两成的尿素糖蜜舔砖自上世纪80年代开始就在世界各国广泛流行，被农民亲切的称为“牛羊的巧克力”。蒋振山报道用以糖蜜为基础配方的饲料喂养奶牛，牛奶产量增加，牛奶的品质也得以改善，蛋白质和酪蛋白都有不同程度的增加。1915年，德国首次实现了以糖蜜为原料的食用酵母工业化生产，吸引了世界各国的科技及工业界的关注与探索，英国、古巴、中国等国均有企业相继建成糖蜜酵母生产线，目前糖蜜酵母生产工艺已经较成熟。李大鹏调节酸化澄清稀糖蜜pH值至4．5，然后加入0．06％KH2P04，O，03％NH4CI，然后接种热带假丝酵母，30℃发酵18h后于燥获得饲料酵母于菌体。剩用耱蜜发酵生产酵母单细胞蛋白可弥补常规蛋白饲料资源的不足，不失为一条酵母综合利用的良好途径【7．4¨2J。7 利用甘蔗潼．甘蔗糖蜜生产毫酵饲料的研究1．6微生物发酵生产蔗渣饲料研究中存在的问题甘蔗渣中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素，根据Wordrop对蔗渣纤维素、半纤维素以及木质素在细胞壁中的物理形态的电子显微镜观察结果认为，纤维素以微纤维的形态存在于细胞壁中，有较高的结晶度，是植物的骨架物质；半纤维素分布在微纤维之间或结晶不完善的微纤维之中成为填充物质；而木质素则是包围在微细胞纤维之间形成胞间层的主要物质【1t让9’31031。因此在实际应用中，由于蔗渣中纤维素微晶结构的存在和半纤维素．木质素层对纤维素的包围与粘合作用，水分难以渗入，纤维素酶不能与基质充分接触，酶解作用缓慢，从而影响纤维素的酶解率。纤维索酶生产成本高，生产技术不成熟，酶解效率低等因素也影响了纤维类物质的降解和利用。同时单一微生物菌种产纤维素酶酶系不全，活性低、降解效果不理想，以及酶系易受降解产物阻遏等都限制蔗渣的降解和综合利用。提高微生物菌种产酶活力和产酶水平及其稳定性：改变蔗渣原料的纤维的结构，提高其对酶的敏感性：以及设计合理的发酵工艺路线等是微生物发酵生产蔗渣饲料研究的重点。1．7本论文的研究工作及内容简介，．7．1论文选题背景本文针对广西甘蔗糖业的发展优势及其副产物综合利用现状及发展潜力，畜牧业、饲料行业的发展现状，根据甘蔗渣、甘蔗糖蜜的原料特征，利用纤维素降解菌和酵母等微生物菌种进行混合协同固态发酵，以获得具有较高饲用价值的甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料，该生产过程不产生“三废”，为甘蔗渣、甘蔗糖蜜的综合利用开辟了一条新的途径，对甘蔗糖业、畜牧业、饲料行业以及环境可持续发展意义重大。1．7．2技术路线丰口试验方粟筛选发酵蔗渣饲料菌种——+分开种子培养l甘蔗糖蜜+l混备接种lfl甘蔗渣l产品检测图卜3本论文拟采用的技术路线和试验方案Fig．1-3Technicalrouteandschemewillbeusedinthepapal" 利用甘蔗洼、甘蔗糖警}生产量酵饲料的研究1．7．3本论文的研究内容本课题来源于广西科学基金项目“利用甘蔗糖蜜、甘蔗渣清沽生产发酵饲料的研究”。本论文主要内容如下：(1)从自然环境中筛选具有较强产纤维素酶能力的微生物菌种，初步研究其在以甘蔗渣做主要原料的固态培养基上发酵产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC．酶以及B．葡萄糖苷酶的酶活力。(2)原料蔗渣预处理方法研究，主要研究粉碎、蒸煮等常规简易物理处理法预处理甘蔗渣的效果，确定较为合理、简单的蔗渣预处理工艺。(3)利用筛选所获得的降解纤维素菌株，与酵母菌等微生物混合培养协同固态发酵，利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料。根据产品蛋白质、游离氨基酸、可溶性还原糖、粗纤维含量等指标，对固态发酵培养基、微生物菌种及其接种方式、接种量等因素进行试验研究。确定较为理想的利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产发酵饲料的生产工艺，获得具有较高饲用价值的发酵饲料。9 广西大掌硬士掌位论文利用甘蔗渣．甘蔗糖‘蜜生产冀，喇}饲料·的研究第二章降解蔗渣纤维素菌种的筛选自然界中的微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物等都是微生物主要的生活繁殖场所，其中就包括大量具有产纤维素酶或具有较强的降解纤维素能力的微生物，如各种真菌、放线菌及细菌等，他们在～定条件下能产生纤维素酶，降解纤维素类物质。迄今为止，国内外已经有大量关于产纤维素酶或降解纤维素菌株的研究及相关报道，其中研究较多的是真菌中的木霉属(Trichoderma)、黑曲霉属(Aspergillusniger)、青霉(Penicillium)等微生物。它们能够产生大量的纤维素酶，并将其分泌到细胞外分解纤维素，从而促进纤维素的降解[2A4J．1-33,3孓4"。本文有针对性的选择滤纸、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)做为限制性碳源，通过简单快速的筛选手段从土壤中筛选出具有一定产纤维素酶能力的菌株，并对其进行简单初步的分类鉴定以及黄曲霉毒素鉴定试验[531，确保其安全不产毒素。最后再对该菌固态发酵所产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶及B．葡萄糖苷酶酶促反应条件对纤维素酶酶活力的影响进行简要的试验研究。2．1实验材料2。1．，主要仪器实验主要仪器如表2．1所示。表2-1主要仪器Table2-1MaininstrumentsusedinthischapterlO g-西犬掌硕士学位论文44用甘蔗涪、甘蔗糖蜜生产鬟蝴料的研究2．1．2主要试剂实验主要试剂如表2．2所示。表2-2主要试剂Table2-2Mainreagentsusedinthischapter主要试剂生产厂家虎红琼脂培养基(B．IL)琼脂粉(B．R．)细菌学蛋白胨(B．＆)牛肉浸膏(B．IL)氢氧化钠(A．tL)硫酸铵(A．R．)羧甲基纤维素钠(A．R．)n水杨酸营(B．R．)3,5．二硝基水杨酸(c．R．)磷酸二氢钾(A．R．)氯化钠(A．R．)葡萄糖(A．1乙)注射用硫酸链霉素硫酸镁(A．&)盐酸(A．R．)柠檬酸三钠(A．R．)柠檬酸(A．R．)酒石酸钾钠(A．R．)无水亚硫酸钠(A．IL)苯酚(A．1L)新华201定量滤纸广东环凯微生物科技公司广东环觊微生物科技公司中国医药集团上海化学试剂公司广东台山粤侨试剂塑料有限公司广东台山化工厂上海青东化工厂FlukaCompany上海润捷化学试剂有限公司广东汕头市西陇化工厂天津市科密欧化学试剂开发中心山东鲁抗医药股份有限公司广东台山粤侨试剂塑料有限公司广东省廉江市爱廉化学试剂有限公司广东台山粤侨试剂塑料有限公司天津市科密欧化学试剂开发中心广州化学试剂厂广东台山粤侨化工厂杭州富阳特种纸业有限公司2，1．3菌种及原料菌种：从自然环境中采集的腐土、朽木以及植物腐叶等样品中分离筛选获得；甘蔗渣来自广西石龙糖业有限公司，于燥后粉碎过18目筛；市售麸皮。2．1．4培养基2．1．4．1斜面保藏培养基；PDA琼脂培养基。2，1．4．2分离纯化培养基：虎红琼脂培养基。 广西大掌硕士掌位论戈利用甘蔗涪．甘蔗糖蜜生产裳酵饲料的研究2．1．4．3筛选培养基羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂培养基：CMC-Na109，(NH4hS0449，I(Jq2P0429，MgS04．7H200．59，蛋白胨lg，琼脂209，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。滤纸条培养基：0qH4hS04lg，KH2P04lg，MgS04．7H20O．79，NaCIO．59，蒸馏水1000mL，pH自然，按3mL，试管的量准确分装后灭菌，新华201定量滤纸条6xlcm(单独灭菌，烘干，接种前再分别加入)，121℃高压蒸汽灭菌30rain。固态发酵产酶培养基(无机盐以及料水比以干料质量比计)：甘蔗渣：麸皮=7：3，(NH4)2s04l％，KH2P040．2％，料水比=1：4．5，每500mL三角瓶中分别含lOg培养基干料，搅拌混合均匀后以9层纱布封口，121℃高压蒸汽灭菌60min。2．1．5相关溶液lmg／mL葡萄糖标准溶液：准确称取100rag葡萄糖(预先在105。C干燥至恒重)，加水溶解定容至100mL，充分混匀后备用(可于4"C冰箱中保存15d左右)。3，5一二硝基水杨酸(DNS)试剂：准确称取182．09酒石酸钾钠，并溶于500mL蒸馏水，加热(曼50℃)，于热溶液中分别加入6．393，5～二硝基水杨酸、2mol／L氢氧化钠溶液262mL、5．09结晶苯酚、5．Og无水亚硫酸钠，搅拌至溶解完全，冷却后蒸馏水定容至1000mL，充分混匀后贮于棕色试剂瓶中，室温放置一周后使用。0．05mol／L柠檬酸缓冲液(pH4．5、pH5．0)：准确称取相应质量的柠檬酸和柠檬酸钠，以蒸馏水溶解，分别配置成0．05mol／L的柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液，然后将两则混合，并以酸度计分别调节pH值至pH4．5和pH5．0。0．50％CMC．Na溶液：准确称取O．509CMC-Na，用0．05mol／L，pH5．0的柠檬酸缓冲液溶解并定容至100mL，充分混匀，于4℃冰箱储存备用。O．50％水杨酸苷溶液：准确称取o．509水杨酸苷，用0．05mol／L，pH4．5的柠檬酸缓冲液溶解定容至100mL，充分混匀，于4℃冰箱储存备用。 利用甘蔗蕾．甘蔗糖蜜生产裳醇饲料的研究2．2实验方法I叶舭一一r试叫三目的芎株筛选—，{LcMc平板识别鉴定lL复筛一固态发酵产酶鉴定试验j+2．2．2样品采集基于本实验的目标旨在寻找并筛选能降解纤维素的菌株，因此根据微生物的生态分布样品应来自于富含纤维素降解菌的自然环境中。本实验先后3次从柳州野外采集腐烂树叶、朽木堆、土壤等环境中样品，放入预先备好的无菌袋中包扎后带回实验室备用。2．2．3衡株分离纯化将采集的各样品分别转移至无菌三角瓶，每瓶加入50mL无菌水，加玻璃珠充分振荡使样品与水充分混合，将菌体分散，静置，取混合菌悬液用无菌水稀释成适宜的稀释度。取适宜的稀释菌液0．1mL涂布于虎红琼脂培养基平板上，28℃恒温培养，待平板上长出可疑菌落后，立即挑取，于虎红琼脂培养基平板上分离直至获得典型单菌落【451。并将其接种至新鲜PDA试管斜面，28"C恒温培养备用。2．2．4初筛2．2．4．1滤纸条筛选试验滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维素材料，在纤维素酶的水解作用下，滤纸会变绒、交薄，一方面通过对其形态变化的观察可以定性分析菌株分解能力的高低；另一方面滤纸水解后会产生还原糖，可以此来表示一纤维素酶系总的糖化力。滤纸条崩解试验具体操作如下： 利用甘蔗涪．-"d-蔗糖蜜生产嚣，醇饲料的研究(1)菌悬液制备将2．2．3初步分离纯化所得菌种到的各PDA斜面培养物用适量无菌生理盐水洗涤并稀释，制成适宜菌体浓度的菌悬液(菌体浓度至108．109d"／mL)。(2)接种每支滤纸条试管培养基中投入一块lcmX6cm规格的无菌干燥定量滤纸条，然后分别取O．1mL菌悬液接种至各滤纸条培养基中，同时做一组空白对照(即接种O．1mL无菌生理盐水至滤纸条培养基中，其它处理方法与试验组一致)，于28"(2培养箱恒温培养7d，测定滤纸条失重以及滤纸培养基中还原糖含量，以评价各菌分解滤纸纤维的能力。(3)滤纸条失重测定将培养7d后的滤纸条从各滤纸条试管培养基中取出，用水轻轻洗涤，烘干后称重，比较培养前后滤纸条重量，计算滤纸条失重率(％)。mio。mi滤纸条失重率(％)=——×100mio其中mio，mi分别为接种前后的滤纸条重量(4)还原糖含量测定将培养7d后的滤纸条从培养基中取出，用蒸馏水轻轻洗涤，洗液与滤纸培养基试管中残留液体合并后定容至10mL，混匀后离心(4000rpm／min，10min)备用。取lO支20mL刻度试管并按0-9编号，向各管中加入离心上清液lmL，再加入1．5mLDNS试剂，混合均匀后于沸水浴保持5min后取出冷却，加水定容至20mL，混匀后于754紫外可见分光光度计上进行比色。调波长至540nm，以0号管作为空白样品调零点，测出1-9号管的光窜度值。对照葡萄糖标准曲线求出葡萄糖含量G，然后计算求出样品中还原糖含量p“。2．2．4．2e孵平板识别鉴定试验羧甲基纤维素(CMC)是纤维素的衍生物，且比纤维素更易被纤维素酶水解，因此产纤维素酶的菌株应该能够利用CMC，在CMC平板培养基上能够良好的生长。将2．2．3分离纯化所得各菌株分别接种到以CMC-Na作为限制性碳源的CMC-Na琼脂平板培养基上，28’C恒温培养，密切观察各菌的生长情况。2．2．5复筛根据本文试验研究的要求，筛选所得的微生物菌株必须能够利用蔗渣中所含有的大量纤维类物质。与初筛定性选择原则不同的是复筛最好能定量的反映各微生物菌株利用蔗渣纤维的能力。因此复筛试验选择以蔗渣和麸皮作为主要原料制成固态发酵培养基，14 利用甘蔗箍、甘蔗糖蜜生产生酵饲料的研究测定初筛所得各微生物菌株在蔗渣麸皮固态发酵培养基上固态发酵所产纤维素酶酶活力，根据测定所得酶活水平筛选出较为理想适宜的降解纤维素菌株。2．2．5．1菌悬液制备：同2．2．4．1。2．2．5．2固态发酵按20％(WW，以培养基干料重计)的接种量，接种2mL菌悬液至固态发酵培养基中，搅拌均匀后，于28。C生化培养箱恒温静置培养，培养期间须定时翻料。2．2．5．3测定纤维素酶活力所用样品溶液制备取发酵湿物料60"C烘干后，准确取19于物料，加入O。15mol／L的氯化钠溶液15mL，充分混合后于40℃恒温水浴保持lh，滤纸过滤，水洗滤渣，滤液合并后定容至20mL，混合均匀备用。2．2．5．4纤维素酶活力测定2．2．5．5降解纤维素菌株的筛选根据各菌株在复筛发酵产酶过程中测定所得各对应纤维素酶活力水平及其稳定性等因素，从中筛选出较为合适理想的目的菌株。2．2．6分析方法2．2．6．1还原糖测定还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3，5．二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3．氨基．5．硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比，利用分光光度法在540hm波长下测定光密度值【541，对照葡萄糖标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。其反应式如下：02N+还原糖}+糖酸3,5一二硝基水杨酸(黄色)3-氨基．5硝基水杨酸(棕红色)(1)葡萄糖标准曲线的绘制取6支20mL刻度试管并按1．5编号，分别加入葡萄糖标准溶液、蒸馏水和1．5mLDNS试剂。将各管中液体混合均匀，于沸水浴中准确加热5min，取出并迅速冷却，蒸馏水定容至20mL，混匀后于540nto处以0号管作为参比调零点，测出l-5号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(rag)为横坐标，作图，绘制标准曲线。一仗 g-西大掌司仕掌位论文利用甘蔗涪、甘蔗糖蜜生产裴甸}饲辛¨由研究(2)还原糖含量测定根据540nm波长下样品的光密度值，对照葡萄糖标准曲线求出相应的葡萄糖含量G，然后求出各样品对应的还原糖含量。还原糖含量(mg)=葡萄糖含量G(rag)×样品定容总体积V(mL)反应液中样品溶液加入量v(mL)2．2．6．2纤维素酶酶活力测定纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一种多组分复杂酶系的总称，主要来自于真菌和细菌。根据其性质纤维素酶可以大致分为三类：包括Cx酶或CMC酶、c1酶以及p一葡萄糖苷酶，它们在降解纤维素的过程中存在协同作用。CMC酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解洳l，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素；cl酶是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它作用于纤维素线状分子的末端，从纤维素链的非还原性末端切割水解p一1，4糖苷键，生成可溶性纤维糊精和纤维二糖等物质；B．葡萄糖苷酶能水解纤维素二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖。虽然它对纤维素无作用，但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物对酶促反应的阻遏作用，从而促进纤维素的降解反应速度155．581。不同来源的纤维素酶，其组成及各组分的比例有较大的差异，同时纤维素酶作用的底物以及影响酶活力的因素，如反应时间、反应温度、反应pH值等也比较复杂，因此目前纤维素酶活力测定方法尚未实现标准化。根据目前纤维素酶活力测定方法的研究报道，本文拟分别测定滤纸酶、CIVIC酶以及B．葡聚糖苷酶酶活力，以此来表征各菌固态发酵产纤维素酶系的酶活力水平。(1)实验原理纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5．二硝基水杨酸(DNS)还原，生成棕红色的氨基化合物，该化合物在540nm波长处有最大光吸收，且在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，根据比色法测定所得还原糖生成的量就可测定纤维素酶的酶活力。(2)滤纸酶酶活力测定取4支洁净干燥的20mL刻度试管，编号后各加入2-2．5_3制备所得的样品溶液O．5mL和1．5mL0．05mol／L，pH4．5的柠檬酸缓冲溶液，向1号管中加入1．5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照比色调零用。将4支试管同时在45℃水浴中预热5min一10min，再分别加入新华定量滤纸50mg，45"C水浴中保温lh后取出并立即向2、3、4号管中加入1．SmLDNS溶液以终止酶反应，摇匀，然后将各管置于沸水浴中准确16 r-西大掌硕士掌位论文利用甘晨}鲁，甘蔗糖鲁；生产基翻E饲料的研究保持5min后取出，迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL并充分混匀，以l号管溶液为空白对照比色调零，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量。(3)CMC酶酶活力测定取4支洁净干燥的20ral刻度试管，编号后各加入1．5mLO．50％CMC．柠檬酸缓冲溶液，并向1号管中加入1．5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照比色调零用。将4支试管同时在45"C浴中预热5min-10min，再分别入2．2．513制备所得的样品溶液O．5mL，45"C水浴中保温1h后取出，立即向2、3、4号管中加入1．5mLDNS溶液以终止酶反应，摇匀，然后将各管置于沸水浴中准确保持5min后取出，迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL并充分混匀，以l号管溶液为空白对照比色调零，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄塘含量。(4)B一葡萄糖苷酶酶活力测定取4支洁净干燥的20mL刻度试管，编号后各加入1．5mLO．50％水杨酸苷．柠檬酸缓冲溶液，并向1号管中加入1．5mLDNS溶液以钝化酶，作为空自对照比色调零用。将4支试管同时在45"C水浴中预热5min．10min，再分别加入2．2．5．3制各所得的样品溶液O．5mL，45"C浴中保温1h，取出后立即向2、3、4号管中加入1．5mLDNS溶液以终止酶反应，摇匀，然后将各管置于沸水浴中准确保持5min后取出，迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL并充分混匀，以I号管溶液为空白对照比色调零，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量。(5)酶活力单位定义：根据实际情况以及具体实验设计，本论文定义每h催化水解底物生成1imaol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位U。(6)酶活力计算公式：葡萄糖含量(mg)x酶液定容总体积(mL)×5，56酶澍o(U／g)=反应液中酶液IJn．量(mL)×样品重(曲×时问(h)2．2．7目的菌株鉴定2．2．7．1菌落形态及菌株显微结构观察将筛选所得菌株分别点种至PDA平板培养基上，28℃恒温培养，观察菌落生长速度、大小、形状、颜色、有无可溶性色素产生等培养特征哪!。挑取少许该制成湿室载片，28"C恒温培养后镜检，观察其显微结构哪!。17 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗鲁．"la-蔗糖蜜生产戋酵饲韩的研究2．2．7．2毒素鉴定将待测菌株接种子PDA培养基平板的中央，于28℃暗处培养3d．4d。当发现菌丝体生长旺盛，分生孢子开始少量出现时，取出培养皿，不打开皿盖，置于125W的紫外灯下检查。如果菌丝体出现亮蓝紫色荧光(培养基本身无荧光，里暗灰色)，就是能产生黄曲霉毒素的菌株【591。如荧光强度不明显，结果有怀疑时，可将培养皿再放培养箱继续培养24小时，重复上法检查。2．3实验结果与讨论2．3．1葡萄糖标准曲线绘制根据2．2．6．1提供的标准曲线绘制方法，各管对应葡萄糖含量(mg)和540nm波长处对应的吸光值A，见表2．3。表2-3葡萄糖标准曲线的绘制Table2-3Protractingofglucosestandardetll、，e以各管葡萄糖含量(mg)为横坐标，对应吸光值A为纵坐标作图，得到葡萄糖标准曲线，如图2—2所示。葡萄糖标准曲线及其回归方程为：y=1．5982x(x的单位为rag)，线性相关系数R2=O．9975。00．20．40．6o．8l1．2Contentofglucose(rag)图2-2葡萄糖标准曲线Fig．2-2Standardculweofglucose182M坨¨Mouu￡qJ20《 ／-．-西大掌硕士掌位论文利用甘蔗整．甘．1l[．U--蜜生产袅酵饲辑的研究2．3。2菌株分离纯化及初筛将从烂草堆、菜地、经年堆积的腐叶、腐土、腐木等处采集的样品进行平板涂布、划线分离纯化，最后从中分离得到8株疑似菌株，具体描述如表2-4。表2-4菌株分离纯化结果Table2-4Strainscparatndfromnaturalenvironment菌株编号菌落形态描述菌落呈同心轮辐射状，初为白色絮状，后转绿色或黄绿色，培养60h左右菌落几乎覆盖整个PDA平板表面，并能继续沿皿壁生长，白色菌丝体绿色孢子，茁落背面无色；亮白色絮状菌落，菌丝体可覆盖整个PDA平板表面，但长速较慢，菌落背面无色；菌落圆形，黑色孢子密集分布于PDA平板表面，菌落背面无色：菌落圆形，边缘白色绒状，初为白色，后逐渐转为灰色或青灰色，菌落背面无色，有褶；菌落呈圆形，初为白色，后逐渐转为灰色，菌落一般呈青灰色或烟灰色，背面呈黄色：菌落呈圆环形，褐色孢子稀疏分布于平板菌落表面，菌落背面无色；菌落呈同心轮辐射状，初为白色绒状，后转暗绿色。生长到3d左右菌落几乎覆盖整个PDA平板表面，菌落背面无色；F-$菌落星圆形，较厚，边缘整齐，菌落表面晕黄绿色，背面黑色，有褶。将上述分离纯化得到的8株菌株进行滤纸条崩解试验和CMC-Na琼脂平板识别等初筛鉴定试验，具体初筛鉴定结果见表2．5。表2-5茵株初筛鉴定情况Table2-5Identificationandfirstlyscreeningofstrainseparatedfromnaturalenvironment··注：“一”表示未检出；“x”表示菌株在该培养条件下不生长。根据各菌株在PDA平板上菌落形态，初步认为这8种菌均属于丝状真菌类。其中F．1生长速度最快，CMC-Na平板在接种的24h后便明显长出菌落，60h左右菌落几乎布满整个平板表面，而其余各菌生长相对较缓。初筛发现F-2、F．6、F．8在CMC-Na琼脂平板上培养10d后仍没有生长，同时对应的滤纸条培养基中的滤纸形态完好。从表2．5可知，除F．2、F．6，F．8外，其余各菌株都能不同程度地分解滤纸纤维素并产生还原19¨M”¨MⅣⅣ 广西大掌硕士学位论文利用甘蔗羞．甘蔗糖蜜生产发酵饲料的研究糖，其中尤以F．1、F-4的效果最明显。因此，根据初筛试验结果，选择F-I，F-3，F-4，F．5、F．7这5种菌株进入随后的复筛试验研究。2．3．3复筛产酶鉴定2．3．3．1单独培养发酵产酶试验分别接种F-1，F．3，F．4，F，5、F．7至蔗渣麸皮固态发酵产酶培养基，从培养72h后测定培养期间5种菌各自所对应的纤维素酶(包括滤纸酶、CMC酶以及B一葡萄糖苷酶)酶活力，对应的滤纸酶、CMC酶以及B一葡萄糖苷酶酶活力分别见图2-3～2．5。607296120144168192216240264288312324Culturetlme(h)图2-3滤纸酶活力随培养时间变化图Fig．2-3Filter-paper-enzymeactivityduringfermentation607296120144168192216240264288312324CuIturethmoI)图2-4cMc酶活力随培养时问变化图Fig．2-4Carboxymethyl-cellulaseactivityduringfermentation瑚咖啪锕枷瑚。一掣n)茸≯≈Wu萤撕咖啪鲫枷瑚窜n)备州当譬彗蚤∞ g-西大掌硕士掌位论文利用甘蔗洼、甘蔗糖蜜生产袁翻E饲料的研究∞72961201441681922162402642勰312324Culturetime(h)图2-5B～葡萄糖苷酶活力随培养时间变化图Fig．2-5p-glucosacchamseactivityduringfermentation图2．3～2．5分别表示了不同培养时间F．1，F．3，F-4，F．5、F．7这5种菌在蔗渣麸皮培养基上发酵产滤纸酶、CMC酶以及B一葡萄糖苷酶的酶活力。结果显示复筛发酵产酶鉴定结果所反映出的5菌性质与初筛结果基本吻合。目前通常认为CMC酶活力在一定程度上可表征内切葡聚糖酶酶活力，而滤纸酶则可表征一纤维素酶体系总的维素酶活力，它可反映三类酶组分的协同作用。从图2．3、2-4可知，在上述5菌间，F．1的滤纸酶和CMC酶酶活力最高，尤其是滤纸酶活力，培养192h时F．1的滤纸酶活力达975．6504U／g，而且在整个测定周期内其滤纸酶和CMC酶活力一直要远高于其它4菌。但由图2．5发现F．1的B．葡萄糖苷酶酶活力较低，而5者间F．4的B一葡萄糖苷酶活力最高。故选F-I、F．4混合培养进行发酵试验，并与单菌培养相比较，考察混合发酵对整个酶系的酶活水平影响，确定合适的微生物菌种。2．3．3．2单菌培养与混合培养发酵产酶试验分别按相同的接种量接种F．1，F-4以及F-1和F-4的等比例混合菌液至固态发酵培养基，测定3组对应的滤纸酶、CMC酶以及D．葡萄糖苷酶酶活力，结果见图2-6～2．8。1200—1000掣已800扫{6枷00宣瑚06072961201441681922162402642稿312324Culturethin(h)图2-6单茵与混合培养的滤纸酶活力随培养时间变化图Fig．2-6Filter-paper-enzymeactivityduringfermentationaboutseparatedandmixecl．culture2l伽舢姗㈣o拿n)茸}口*§裔盘 利用甘蔗整．甘蔗糖蜜生产生醇饲料的研究1200霉1000暑800壹600＆400』}2000∞7296120144168192216240264288312324Culturetin∞(h)图2—7单茵与混合培养的例c酶活力随培养时间变化图Fig．2-7Carboxymethyl—cellulaseactivityduringfermentationaboutseparatedandmixedculture舢@5000兽4000专姗g2000营10000607296120144168192216240264288312324Culturethne(h)图2-8单茸与混合培养的p一葡萄糖苷酶活力随培养时阈变化图Fig．2-813-glucosaeeharaseactivityduringfermentationaboutseparatedandmixedculture由图2-6～2．8可知，F．1和F-4两株霉菌混合培养较单菌培养发酵产纤维素酶，整个纤维素酶系的酶活力水平并无显著的提高或改善，相反，两者混合培养发酵产滤纸酶以及B．葡萄糖苷酶酶活力都低于单菌培养。与设想的利用两者各自的产酶优势，混合培养，以促进整个体系的发酵产酶能力及水平相悖。这也说明微生物混合培养发酵时，各微生物间的相互关系极其复杂，实验中葡萄糖对纤维素酶的抑制作用及霉菌间对碳源的竞争或抑制作用，可能都会限制其利用蔗渣纤维发酵产纤维素酶。。基于本实验的目的菌株必须具有比较强的产纤维素酶或降解纤维素的能力，而且希望目的菌株最好还具有适应性强、生长繁殖快等特点。综合考虑上述各因素，根据现有的筛选试验结果，最终选择F．1作为出发菌株，进行下一阶段发酵试验研究。2．3．4菌株鉴定结果2．3．4．1形态特征取接种F．1的湿室培养载玻片，在显微镜下观察。镜检发现：F—l菌株菌丝透明，有隔，分枝繁复，分生孢子梗由菌丝直立生出，其上对生或互生分枝，分枝上可继续分 糟用甘—陵．咽-||着囊}生产量舅}饲■曲研究枝，整体像树枝．分枝末端为小梗，小梗瓶行，分生孢子球形或椭圆形。图2-9为不同放大倍数下F-I显微图片．2．3．4．2培养特性F-1菌株在PDA培养基平板上28℃培养，初期为白色，平坦，后逐渐变绿而呈绿色或深绿色，菌丝层较厚。菌落生长迅速，呈同心轮纹状，背面无色，不产生可溶性色素，图2-10为F-!在PDA平板上不同生长时期的菌落图片．AB图2．9卜1湿室栽片培养显微形态图片(^：10x口．25；B：40x0．65)Fig．2-9M蛔哪，叩hofF-IculturedmⅧlct"ish曲m曲口(A：10x0．25；B：40x0．65)AB图2-10不同培养时期PDA平板上卜1酋落图片(^：24h；B：60h)Fig．2-10Theph呻昭r印bofF-1wilhdifferentageculturedOllPDAsolids／atemedia(A：24h，B：60h)2．3．4．3毒性鉴定霉变饲料常引起禽畜中毒，目前己知的真菌毒素有150多种．真菌毒素能使人、家畜和家禽等产生各种疾病．其中黄曲霉毒素、黄变米毒素、环氯霉素、柄曲菌素、展青霉素和岛青霉素等六种真菌毒素，还可以致癌。在各种真菌毒素中，黄曲霉毒素的毒性最大，致癌力最强，危害最大．黄曲霉毒素Bl是目前所有致癌物中最有害的一种。它 利用甘蔗渣．甘蔗糖蜜生产基醇饲料的研究还能引起突变和导致畸形。现在已经发现黄曲霉毒素和人的肝癌有密切关系，它也能引起人的急性中毒死亡。由于黄曲霉毒素分布范围广，产生菌种多，又由于黄曲霉毒素理化性质稳定，不易被破坏，能够由一种生物体内转移到另一种生物体内，因此，对人和家畜、家禽等的健康威胁很大，已引起了人们极大的关注。近年来，世界各国对黄曲霉毒素的分布、产生、理化性质、测定方法、毒害作用、合成途径、生化作用机制、代谢变化以及预防、去除和解毒等方面，进行了全面深入的研究。鉴于黄曲霉毒素可能对人和动物造成的重大危害和影响，本文只针对目的菌株是否产黄曲霉毒素进行鉴定。黄曲霉毒素目前己鉴定出12种分为BI和Gl两大类，结构类似，均为二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。食品与饲料中污染的黄曲霉毒素只有Bl、B2、GI、G2、M1和M2六种。黄曲霉毒素(主要指毒素Bl、B2、Gl、G2)溶于3种有机溶剂如氯仿、甲醇、乙醇等，但不溶于水、乙烷、石油醚和乙醚中。紫外线下毒素有强荧光，Bl、B2产蓝紫色荧光，Gl、G2产黄绿色荧光。根据2．2．7．2的鉴定方法进行试验，发现F．1菌株都不产生荧光，因而认为F．1不产黄曲霉毒素，可以安全的用于制备发酵饲料。2．3．4．4菌株鉴定结论根据观察到的F．1菌株的形态特征和培养特性，初步鉴定F．1菌株为木霉属(乃耙矗D出，m口)真菌咖．,621，并以木霉T-1标识。2．3．5纤维素酶酶促反应条件的研究2．3．5．1pH值对纤维素酶酶促反应的影响．取培养312h的T-I发酵粗酶提取液，设定反应温度为45"C，分别测定当反应pH值分别为4．0、4．5、5．0、5．5时的对应的滤纸酶活力、CMC酶活力和8一葡萄糖苷酶活力。结果见图2．11。掣暑2000穹导10000pHvalue图2-L1pH值对纤维素酶活力的影响Fig．2-11TheinfluenceofpHvalueoneellulaseactivity246 利用甘蔗洼、甘蔗糖重；生产裳耐E饲料的研究结果表明pH值对纤维素酶活力影晌较大，pH4．5左右3种纤维素酶酶活力较高；pH值≤4。5，酶活力随pH值减小而缓慢降低；pH值≥4．5，酶活力随pH值升高而缓慢降低。因此选择pH值在4．5左右对纤维素酶酶促反应的进行较为有利。2．3．5．2温度对纤维素酶酶促反应的影响取同种粗酶液，设定反应pH值为4．5，分别测定反应温度分别为40’C、45‘C、50℃，55"C和60℃时对应的滤纸酶、CMC酶以及B一葡萄糖苷酶酶活力，结果如图2·12所示。掣鼍2000警|}t000O35404550556065Temperature(℃1图2一12温度对纤维素酶活力的影响Fig．2-12Theinfluenceoftemperatureoncellulaseactivity试验发现3种纤维素酶各自对温度的敏感性不尽相同。在整个温度范围内滤纸酶活力随温度变化酶活力水平相对较稳定；在而D．葡萄糖苷酶活力随温度升高而缓慢增大，40。C．50"C间随温度升高酶活力增长趋势较为明显，此后温度继续升高酶活力相对稳定；CMC酶受温度影响较大，45"C左右cMc酶活力最大，温度小于或大于45"C，酶活力明显下降。2．3．5．3反应时间对纤维素酶酶促反应的影响取同种粗酶液，于pH4．5，45"C反应条件下，分别以新华定量滤纸、O．50％CMC溶液以及0．50％水杨酸苷溶液为反应底物，分别反应5min、10min、20min、40min、60rain、80min、lOOmin、120min，测定吸光度值A，计算酶活力，具体结果如表2—7所示。 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗疆、甘蔗糖蜜生产裳酵饲料的研究表2—7反应时间与纤维素酶酶活关系Table2-7Therelationshipbetweenenzymeactivitywithreactiontime根据表2—7反应60min时滤纸酶活力最大；反应40rainCMC酶和B．葡萄糖苷酶酶活力相对较大，且与反应20min后的酶活力水平相近。2．4小结(1)本文有针对性的选择滤纸、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)做为限制性碳源，从环境采集样品中初筛选出5株菌株进行固态发酵复筛产酶鉴定试验：通过测定5种微生物菌株各自发酵产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶以及p．葡萄糖苷酶酶活力，从中选出2株进行混合固态发酵，又根据两者单独发酵与混合发酵产酶效果比较，最后选出一株具有较强分解纤维素能力的真菌，初步鉴定为木霉属(Trichoderma．sp．)真菌，并以木霉T-1标识。通过对其进行的黄曲霉毒素鉴定试验，证实该菌不产黄曲霉毒素，可以作为发酵饲料的生产菌种。(2)通过对木霉I"-1固态发酵所产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶以及p-葡萄糖苷酶酶促反应条件，如反应pH值，反应温度，反应时间等因素的初步试验研究，3种酶对反应条件的敏感性及要求具体表现为：pH4．5左右滤纸酶、CMC酶以及B．葡萄糖苷酶酶活力较高；3种纤维素酶对温度的敏感性不尽相同，其中滤纸酶活力随温度变化酶活水平相对较为稳定，45"C左右其酶活力较高、CMC酶受温度影响较大，45℃左右酶活力最大、B一葡萄糖苷酶活力随温度升高而缓慢增大，40℃～50℃间随温度升高酶活增长较快，45℃～50℃间其酶活力较大；反应60min时滤纸酶活力最大、反应40min时CMC酶和B．葡萄糖苷酶酶活力较大。 ／--西大掌硕士掌位论文利用甘蔗洼．甘蔗糖蜜生产生醇饲料的研究第三章蔗渣预处理蔗渣是一种含木质纤维素的蔗糖生产副产物，约含有44％-46％粗纤维，其中又包括46％纤维素、25％半纤维素、20％木质素【6"9】。由于其含有高达20％以上的木质素，直接用作饲料饲喂动物可引起动物消化系统的损伤和紊乱；另外由于蔗渣中粗蛋白含量极低，且难于消化、适口性差。未经处理的甘蔗渣消化率和能量利用率较低，因此如果首先对甘蔗渣进行适当的处理，改变蔗渣结构可提高动物体对其的利用率，同时也能够促进微生物菌体降解和利用蔗渣的效率。目前常用的预处理方法按其处理性质可大致分为：物理法、化学法、物理法一化学法以及生物法等。化学法包括氨化处理、碱化以及酸化处理等方法，操作简单，效果较理想，但是化学法处理过程使用大量的酸碱或有机溶液，物料损失严重，而且还存在处理废液的二次污染问题。粉碎、蒸煮等物理法在是早已被证明是行之有效且在农村广泛应用的蔗渣处理方法。蔗渣粉碎能破坏木质素和半纤维素与纤维素的结合层，降低蔗渣结晶度，提高其反应性能和水解糖化率，同时也有利于酶解过程中纤维素酶或木质素酶的进攻，从而提高蔗渣纤维的降解率。粉碎以后体积交小，增加采食量，蔗渣粉碎也增加了饲料与瘤胃微生物接触面积，便于瘤胃微生物的降解发酵，使消化吸收的总养分增加。但是这种处理方法不能提高秸杆自身的营养价值。利用高压蒸汽蒸煮处理蔗渣，可以利用水蒸汽及其热效应，改变蔗渣纤维体系中纤维素、半纤维素以及木质素的结构，纤维结晶度降低，提高微生物及酶液对蔗渣的降解和利用率，并达到灭菌的目的。因此，为了进一步提高发酵后甘蔗渣发酵饲料的营养价值，本章将对原料蔗渣的粉碎程度以及蔗渣麸皮固体发酵培养基高压蒸汽蒸煮进行试验研究，确定较为简单合理的蔗渣预处理工艺。3．1实验材料3．1．t主要仪器同第二章2．1．1。3．1．2主要试剂同第二章2．1．2。3．1．3菌种及原料木霉T-1，从自然环境中筛选得到； 利用甘蔗渣．甘蔗糖，；生产裳醇饲料的研究甘蔗渣由广西石龙糖业有限公司提供，干燥后粉碎过筛；市售麸皮。3．1．4培养基斜面保藏培养基：PDA琼脂培养基。同态发酵培养基组成：同第二章固态发酵产酶培养基。3．1．5相关溶液同第二章2．1．5。3．2实验方法3．2．t技术路线原料蔗渣——，粉碎—+．过筛至苎竺兰苎耋培养基配制———-固态发酵培养基配制———卜蒸煮灭菌图3-1蔗渣预处理技术路线Fig．3-lPre-treatmentofsugarcanebagasses测定纤维素酶活力3．2．2蔗渣预处理3．2．2．1粉碎处理原料蔗渣干燥后粉碎，分别过10目、18目、30目、40目和60目筛，然后分别制成相应的固态发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌60min后取出，冷却备用。3．2．2．2蒸煮处理取59按上述实验确定的粉碎蔗渣置于250mL三角瓶中，同时又利用该蔗渣制成固态发酵培养基，分装于500mL三角瓶。然后将蔗渣以及固态发酵培养基置于121℃高压蒸煮锅，分别蒸煮Oh、30min、60rain、90min和120rain后取出，冷却备用。3．2．3固态发酵按20％的接种量接种2mL木霉T-I菌悬液至固体发酵培养基，搅拌均匀后，于28℃生化培养箱恒温静置培养8d，测定各自发酵产纤维素酶(包括滤纸酶、CMC酶以及D一葡萄糖苷酶)酶活力以及物料可溶性还原糖含量，在此期间须定时翻料·28 利用甘蔗澶．甘蔗糖蜜生产戋酵饲料的研究3．2．4分析方法3．2．4．1可溶性还原糖测定(1)样品制各：准确称取59干燥样品，加入100mL蒸馏水，混合均匀，于40"C水浴浸提lh后滤纸过滤，水洗滤渣，滤液合并并定容至100mL，混匀后备用。(2)测定方法：同第二章2．2．6．1。3．2．4．2纤维素酶活力测定：同第二章2．2．6．2。3．3实验结果与讨论3．3．1蔗渣粉碎处理测定分别过lO目、18目、30目、40目和60目筛粉碎蔗渣的可溶性还原糖含量，测定结果列于表3．1：另外接种木霉T-1至含对应粒径蔗渣的固态发酵培养基，28"C恒温静置培养8d，测定相应的纤维素酶酶活力，结果同列于表3-1。表3-1蔗渣粉碎粒径对发酵的影响Table3-1Etteetofparticlesizeofsugarcanebagassesonfermentation从表3-l可知，随蔗渣粉碎度的增加，可溶性还原糖含量缓慢增加，但是由于蔗渣本身的可溶性还原糖含量极为有限，因此其可溶性还原糖增加不显著。在一定范围内随粉碎蔗渣粒径的减小，固态发酵产纤维素酶酶活力增大，但蔗渣太细反而不利于发酵产酶。一方面粉碎后蔗渣的结晶度降低，纤维素、半纤维素及木质素的结合层被破坏，水分、微生物菌体及其所产酶类更容易与发酵基质接触并进攻基质原料，从而更有利于发酵过程的进行。但是蔗渣粉碎过细，不仅粉碎能耗增大，同时从表3-1还可以发现此时发酵产酶水平反而急剧下降。这可能与T-1本身是一种需氧菌有关，其生长代谢必须傈证有充足的氧气，蔗渣过细，所制成的发酵培养基的透气性差，因而不利于T-1的生长 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗澶、甘蔗糖蜜生产鬟醇饲料的研究代谢。另外由表3一l知，利用过30目筛和过40目筛的粉碎蔗渣制成发酵培养基发酵产纤维素酶酶活力水平以及物料可溶性还原糖含量接近，因此从降低能耗考虑选择过30目筛，即粒径≤O．60mm的粉碎蔗渣，制成发酵培养基，进入下一阶段试验。3．3．2蔗渣蒸煮处理3．3．2．1高压蒸汽燕煮时间对蔗渣可溶性还原糖含量的影响取过30目筛粉碎蔗渣，于121℃分别经过oh、30rain、60min、90min和120min高压蒸汽蒸煮后，分别测定各组蔗渣的可溶性还原糖含量，结果见图3-2。癸i；Timeforsteanfing-treatment(min)图3-2不同蒸煮时间对应蔗渣可溶性还原糖含量Fig．3-2Theglucosecontentinsteam—boiledsugarcanebagasses由图3．2发现，蔗渣经高压蒸汽蒸煮处理后，其可溶性还原糖含量缓慢增加。3．3．2．2培养基高压蒸汽蒸煮时间对发酵产纤维素酶酶活力的影响蔗渣麸皮固态发酵培养基经高压蒸汽蒸煮处理后接种20％木霉T-I，搅拌均匀后，28℃恒温静置培养8d，测定其对应的纤维素酶酶活力，结果见表3．2。表3-2培养基蒸煮时间对发酵产酶的影响Table3-2Effectofsteam·boilingoffermentationmediatothecellulaseactivity 广西大掌硕士学位论文利用甘蔗整、甘蔗糖蜜生产鬟醇饲料的研究由表3-2可知，高压蒸汽蒸煮时间越久，蔗渣水浸提液中可溶性还原糖含量以及木霉T-1发酵产纤维素酶酶活力水平越高。2号培养基产酶活力水平以及物料可溶性还原糖含量明显的高于1号；3号较2号各指标增长趋势较小，另外，采用0号培养基，即发酵培养基未经灭菌处理，虽然蔗渣也能被部分利用并发酵产纤维素酶，但在发酵过程中培养基会产生不愉快的刺激性气味，可能与培养基中存在的其它微生物有关。因此根据上述的试验结果以及从减少能耗角度考虑，确定发酵培养基高压蒸汽处理60min后再接种木霉T-1较为合理。3．4小结综合本章的实验结果，认为蔗渣粉碎过30目筛，制成发酵培养基；蔗渣麸皮发酵培养基121℃高温蒸煮60min后再接种木霉T-I较合适。3l 利用甘蔗氇．甘蔗糖蜜生产量酵饲料的研究第四章微生物固态发酵生产发酵饲料研究利用第二章获得的木霉T-l，以及扣囊拟内孢霉酵母菌、热带假丝酵母、北京棒杆菌等微生物菌种，采用微生物多菌种混合协同固态发酵技术生产蔗渣发酵饲料。本章将具体对固态发酵培养基、发酵微生物菌种选择及其配比组合、固态发酵工艺参数等方面进行了试验研究，以确定较为合理的生产工艺，并获得具有较高饲用价值的发酵饲料。在本章实验中，在评价并确定相关发酵工艺时，除考察发酵饲料中蛋白质含量外，还同时考察了其可溶性还原糖、游离氨基酸含量，发酵前后产品粗纤维含量及其降解率、产品所含活菌数等指标。蛋白质、可溶性还原糖、氨基酸都是产品营养价值的表征，可溶性还原糖提供易于被动物所吸收利用的能量来源，氨基酸，特别是赖氨酸、蛋氨酸等饲料必须氨基酸，动物体自身不能合成，须由外源供给，同时提高饲料氨基酸含量水平还可以提高动物体对蛋白质等物质的吸收和利用率，对改善发酵饲料的品质意义显著：比较发酵前后粗纤维含量及其降解率，能较好的衡量发酵培养基中纤维素类物质，特别是蔗渣纤维素被降解的程度；另外产品活菌数对改善动物肠道的微生态环境，提高动物对饲料的利用率具有较好的促进作用。与此同时，实验在测定发酵产品蛋白质含量时排除了物料中可能存在的部分外源游离无机氮源对测定结果的影响和干扰，测定所得蛋白质含量在一定程度上代表了真蛋白的含量，综合考察上述各指标，能更全面客观的衡量产品的营养价值，评价发酵工艺的优劣，确定发酵工艺参数。4．1实验材料4．1．1主要仪器实验主要仪器如表4一l所示。表4-1主要仪器Table4-1Maini璐tn|mentsmed ／4-西大掌硕士学位论文利用甘蔗洼．甘蔗糖蜜生产袁醇饲料的研究4．1．2主要试剂实验主要仪器如表4．2所示。表4-2主要试剂Table4-2Mainreagentsused主要试剂生产厂家蒽酮(A．R．)地农酚0，5一二羟基甲苯)(c．P)氯化铁(A．丸)D．木糖(B．R)L亮氨酸(B风)茚三酮(A．IL)磷酸氨二钠(A．R．)牛衄清白蛋白(B．R)考马斯亮兰G一250(A．R．)磷酸(A．R．)浓硫酸(A．R．)硫酸铜(A．R)硫酸钾(A．R)溴甲酚绿(A风)甲基红(A．R．)硼酸(A．R．)国药集团化学试剂有限公司广东台山化工厂上海试剂二厂上海康达氨基酸厂国药集团化学试剂有限公司广东台山粤侨试剂塑料有限公司上海伯奥生物科技有限公司上海生工生物工程有限公司成都市科龙化工试剂厂广东台山粤侨试剂塑料有限公司东莞东江化学试剂有限公司广东台山粤侨试剂塑料有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试荆有限公司成都市科龙化工试剂厂4．1．3菌种及原料4．1．3．1菌种木霉Fl从自然环境中筛选得到；热带假丝酵母(Candidatropicalis，以C．trap标识>、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，以S．cere标识)，均由广西工学院发酵工程研究室提供；扣囊拟内孢霉酵母菌(Endomycopsisfibuligera，以E．fibu·1803标识)、北京棒杆菌(Corynbacteriumpekinense，以C．peck-10178标识)，均购自中国工业微生物菌种保藏中，心o4．1．3．2其他原料甘蔗糖蜜由柳州露糖糖厂提供；市售麸皮和豆饼；蔗渣、麸皮和豆饼烘干后粉碎，甘蔗渣由广西石龙糖业有限公司提供；分别过30目筛。 利用甘蔗藿．甘蔗糖’蜜生产生酵饲料的研，B4．1．4培养基斜面培养基：PDA琼脂培养基(培养木霉T-I)，5。B6麦芽汁琼脂培养基(培养酵母菌)；牛肉膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基(牛肉膏l％，蛋白胨l％，NaCl0．5％，葡萄糖O．5％，琼脂2％，pH7．0．7．2，121℃灭菌30min，用于培养北京棒杆菌)。液体种子培养基：稀糖蜜液体培养基(糖蜜12％，KHzP040．06％，(NH02S040．5％，pH4．8，115℃灭菌30min)用于培养酵母菌，牛肉膏蛋白胨葡萄糖液体培养基(牛肉膏l％，蛋白胨l％，NaCl0．5％，葡萄糖0．5％，pH7．0．7．2，121℃灭菌30min)用于培养北京棒杆菌，两者均按50ml每500ml三角瓶的量分装。4．1．5相关溶液蒽酮试剂：o．29蒽酮溶于100mL浓硫酸，用时现配，严格避光保存。地衣酚(3，5．二羟基甲苯)试剂：O．19FeCl3溶于100mL37％的浓盐酸中，之后加入0．29地衣酚，用时现配，严格避光保存。O．1mgmL牛血清蛋白标准溶液：首先配制lmg／mL牛血清蛋白溶液，然后再取该溶液配成O．1mg／mL牛血清蛋白溶液。考马斯亮兰G．250染色液：准确称取100mg考马斯亮蓝G．250溶于50mL95％乙醇，加入100mL85％磷酸，将溶液用水稀释定容至1000mL。甲基红一溴甲酚绿混合指示剂：5份0．2％溴甲酚绿95％乙醇溶液与1份0．2％甲基红乙醇溶液混合均匀于棕色试剂瓶中保存备用。200pg／mL的。亮氨酸标准溶液：准确称取少量干燥的L-亮氨酸o．20009于烧杯中，定容至100mL。摇匀后准确吸取此液10．0mL于100mL容量瓶，加水定容后，配成2001．tg／mL氨基酸标准溶液。4％硼酸吸收液；2％茚三酮溶液。pH8．04磷酸缓冲溶液：分别准确称取4．53509KHzP04，11．93809Na2HP04，分开溶解并定容至500mL，然后取上述配好的KH2P04溶液10．0mL和Na2HP04溶液190mL，混合均匀后即得到pH8．04的磷酸缓冲液。O．1moFL盐酸标准溶液‘62I：依据GB／T601--2002，化学试剂标准滴定溶液的配制方法配制。配得实际盐酸标准溶液浓度=O．1028mol／L。 广西大掌硕士掌位论文利用甘黑睫、甘蔗糖，}生产裳酵饲料的研究4．2实验方法甘蔗渣———-粉碎———-培养基配制l酵母菌——，斜面培养—+液体种子培养＼J木霉T-卜．PDA斜面培养堡堕竺苎竺挚稀释菌液——二靠善接种棒杆菌lol78——啼}面培养—一液体种子培养／I固态发酵l发酵物料测定4．2．2培养方法4．2，2．1斜面培养在超净工作台上用接种环挑取少量待接菌体移入相应的斜面培养基，于28℃恒温培养，一般木霉T-l培养5d．7d：酵母培养2d，北京棒杆菌培养24h左右。4．2．2．2液体种子培养在超净工作台上用接种环挑取少量待接菌体，移入相应的种子培养基，置于150r／min旋转摇床28"C恒温振荡培养，一般酵母液体培养24h-36h，北京棒杆菌培养16t卜，20h左右。4．2．2．3固态发酵接种适量的微生物菌种至固态发酵培养基，培养基充分混合。，28℃恒温静置培养，培养期间须定时翻料。4．2．3分析方法4．2．3．，蔗渣纤维体系定量分析甘蔗渣粉礤过30目筛，实验中用2M盐酸水解蔗渣半纤维素，用72％的硫酸水解2M盐酸水解后剩下的稀酸不溶性残渣。采用程序法测定蔗渣纤维体系中纤维素、半纤维素以及木质素的含量，测定方法见图4_2129,64]。用凯氏定氮法和DNS法分别测定蔗渣蛋白质和可溶性还原糖含量。 g-西大掌硕士掌位论文利用甘蔗羞、甘蔗糖-蜜生产量酵饲料的研究l19烘干蔗渣2．OM稀盐酸．于100"(290min，过滤水洗至中性稀释适当倍数．取lml加入3ml地衣酚，100"(2保温20rain，670rim测吸光度，对照标准曲线求得浓度烘干，加72％的硫酸20ral．于35℃过夜．漏斗过滤水洗至中性w一漏斗重wl，之后分(w”图4-2蔗渣纤维体系定量分析Fig．4-2Quantitativeanalysisollthecellulosiccompositioninthesugarcanebagasscs4．2．3．2蛋白质含量测定目前在饲料蛋白质含量的测定方法中，凯氏定氮法还是应用最为普遍的一种方法。利用凯氏定氮法测定所得的蛋白质含量为物料的粗蛋白含量。若在发酵培养基中添加尿素或("NH4)2S04等无机含氮物质，无疑会增加样品中的总含氮量，从而测定所得粗蛋白质含量大大高于物料实际蛋白质含量。因此为消除培养基中额外添加的无机氮盐对蛋白质含量测定的影响，本实验先将待测样品用蒸馏水浸泡，然后用滤纸过滤，蒸馏水洗滤渣并收集滤液，采用Brand．fbrd法测定滤液中的蛋白质含量，滤渣于105。C烘箱烘干后采用凯氏定氮法测定其中的蛋白质含量[54,651。，(1)Brand-ford法测定蛋白质含量牛血清蛋白标准曲线制作：取8支试管以O．7编号，分别加入牛血清蛋白标准溶液、蒸馏水和5mLG-250染色液，将各管充分混匀后于室温静置2min，以0号管为参比，测定595nm处各管的吸光值A。以吸光值A为纵坐标，蛋白质含量为横坐标作图，得到牛血清蛋白标准曲线。样品制各：称取Ig待测干料于三角瓶中，加入50mL蒸馏水，40"C水浴保持60min，滤纸过滤，水洗残渣，滤液合并转至lOOmL容量瓶，最后加水定容，摇匀备用。样品蛋白质含量计算：分别取待测的各样品溶液lmL于干净比色管中，然后分别 利用甘蔗渣．甘蔗糖蜜生产鬟酵饲料的研究加入5mL考马斯亮兰G．250染色液，混匀后室温静置2min，另各一组空白溶液(以lmL蒸馏水代替样品溶液，其他处理方法不变)，于595nm处以空白溶液为参比测得各管对应的吸光值A。对照牛血清蛋白标准曲线求出对应的蛋白质含量M，进而求出样品蛋白质含量，计算公式如下：蛋白质含量M(mg)x样品定容总体积V(mL)蛋白质含量(nag)2反应液中样品溶液加入量v(mL)(2)凯氏定氮法测定粗蛋白含量[54,651称取1．铅干燥样品，置于凯氏烧瓶中，依次加入硫酸铜O．59，硫酸钾log，浓硫酸20mL，轻轻摇匀后加热消化，保持液体微沸至液体呈透明蓝绿色后，冷却。用水溶解，将烧瓶内液体完全转移至100mL容量瓶并定容，摇匀，冷却后备用。准确移取消化稀释液5mL于凯氏微量定氮反应管内，经漏斗再加入40％氢氧化钠5mL，用少量蒸馏水洗涤漏斗，夹好漏斗夹，进行蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有lOmL4％硼酸吸收液(内加2-3滴甲基红一溴甲酚绿混合指示)的液面下，蒸馏至吸收液中指示剂变为绿色时开始计时，继续蒸馏10min后将冷凝管尖端提离液面再蒸馏lmin，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白实验。可按下式计算出样品的粗蛋白含量：粗蛋自含量(％)：c×(VJ．v2)×14．01×定容总体积。6·25“100稀释样液取样体积xmxl000c：盐酸标准溶液的浓度，mol／L；v1：滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积，mL；v2：滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积，mL；m：样品质量；14．Ol：氮的摩尔质量，g／mob6．25：氮换算为蛋白质的系数。4．2．3．3游离氨基酸含量测定：利用茚三酮比色法测定样品游离氨基酸含量154卅。(1)氨基酸标准曲线绘制取7支干净20mL刻度试管，按0-6号编号，分别加入亮氨酸标准溶液、蒸馏水、lmL，pH8．04的磷酸缓冲液和lmL，2％的茚三酮溶液。各管充分混合均匀，于沸水浴保持15min后取出，迅速冷却并定容至20mL，混匀静置15rain后，于570nm处以0号管为参比调零点。测定各吸光度值A。以氨基酸含量(rag)为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线。37 利用甘蔗羞，甘蔗糖蜜生产毫酵饲料的研究(2)样品制备称取适量待测干物科，加入O，[mol／L盐酸30mL，搅拌提取15ram，400珊lmin．离心10rain，将上清液转入lOOmL容量瓶，残渣加水搅拌，重复浸提离心，清液合并转至上述容量瓶中，最后用水定容至100mL，摇匀备用。(3)样品游离氨基酸含量计算分别取各待测样品溶液lmL于20mL干净刻度试管，然后加入3mL蒸馏水、1．0mL，pH8．04的磷酸缓冲溶液、1．0mL，2％的茚三酮溶液，混匀于沸水浴保持15nfin后冷却定容至20mL，混匀后静胃15rain。另备一组空白溶液(以lmL蒸馏水代替待测样品溶液，其他处理方法不变)。于570nto处以空白溶液为参比，测定各吸光度值A，对照氨基酸标准曲线求出相应的氨基酸含量M，并依此求出样品中游离氨基酸含量，计算公式如下：氨基酸含量(mg)：氨基酸含量M(mg)。样品定容总体积V(mL)反应中样品溶液加入量v(mL)4．2．3．4粳纤维含量测定称取19干燥粉碎样品，移入500ml锥形瓶，加入200ml煮沸的1．25％硫酸，加热使其微沸并维持30rain(每隔5rain摇动锥形瓶一次)后取下锥形瓶，立即用亚麻布过滤，沸水洗涤至洗液不呈酸性：再用200ml煮沸的1．25％氢氧化钠溶液将亚麻布上的存留物洗入原锥形瓶内加热微沸30min，立即以亚麻布过滤，以沸水洗涤2．3次后，移入已干燥称量的G2垂融坩埚，抽滤并用热水充分洗涤，然后抽干。将坩埚和内容物在105℃烘箱烘干至恒重。然后将样品移入石棉坩埚，移入550℃高温炉灰化，然后置于干燥嚣内冷却至室温称量，灰化所损失的重量即为粗纤维量ls41。计算公式如下：粗纤维(％)：旦×100mG——残余物的质量(或经高温炉损失的质量)，单位g；m——样品的质量，单位g。4．2．3．5产品活西总数测定按无菌操作要求取平行发酵湿样，分别按It3号标号，其中1号样品维持原样不做任何处理；2号样真空冷冻干燥后备用；3号样于60"C烘干后备用。采用稀释平板法测定样品活菌总数，分别选用营养琼脂(用于Cpeck-10178计数)和虎红琼脂培养基(用于木撵T-l和E,fibⅣ一1803计数)，于28"C恒温培养，根据两种培养基上各自的菌落计数结果求出总活菌数(cfu／g)u”。 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗渣．甘蔗糖薯}生产裳醇饲料的研究4．3实验结果与讨论4．3．1标准曲线4．3．1．1牛血清蛋白标准曲线根据4．2．3．2提供的牛血清蛋白标准曲线绘制方法，测得595nm处各管对应的吸光度A值。又280nm处实际lmg／mL牛血清蛋白溶液吸光值’A2sonm=0．648，根据lmg／mL标准牛血清蛋白溶液吸光值A2sonm：0．66，得到浓度校正因子Q--0．9818，实测蛋白含量与其对应吸光值A之间的关系见表4．3。表4-3牛血清蛋白标准曲线的制作Table4-2Protractingofalbuminstandardcurve以595nm处的吸光度A值为纵坐标，对应的蛋白质含量(m曲为横坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，如图4．2所示。牛血清蛋白标准曲线回归方程为：y=8．0323x+0．0381(x单位为mg)，线性相关系数R2=O．9981。00，020，040，060．080．10．12contentofprotdn(唱)图4-2牛血清蛋白标准曲线Fig．4．2Standardcurveforalbumin4．3．1．2氨基酸标准曲线根据4．2．3．3提供的氨基酸标准曲线绘制方法，测得570nto处各管对应的吸光度值，。¨晰“毗o"口口∞七。计}1 f-西大学硕士掌位论文利用甘蔗整、甘蔗糖蜜生产裳醇饲料的研究具体见表4-4。表4-4氨基酸标准曲线的绘割Table4．4Protractingofaminoacidstandardcurve以570nto处的吸光度A值为纵坐标，对应氨基酸含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线，如图4．3所示。luO·8in6；n40·20OnlO．20．30．4O．50．6n7Contentofaminoacid(rng)图4-3氨基酸标准曲线Fig．4—3Standardcurveforaminoacid氨基酸标准曲线回归方程为：y=1．7249)【．0．1859(x单位为rag)，线性相关系数R2=O．9971。由图4—3知，x值在0．2．0．6范围内该标准曲线线性较好，样品中氨基酸含量过少(如当x=O．1时)，实验实测吸光值与按标准曲线对应吸光值相差较大，实验所得结果误差较大。4．3．2原料蔗渣及麸皮、豆饼成分分析采用、I．2．3．1的方法测定原料蔗渣纤维体系中纤维素、半纤维素以及木质素含量，按粗纤维、粗蛋白、可溶性还原糖以及游离氨基酸的测定方法分别测定原料蔗渣、麸皮、豆饼三种物料中粗纤维、蛋白质以及可溶性还原糖、游离氨基酸的含量，结果列于表4．5。 耳g用甘蔗藿．甘蔗糖蜜生产袁j}饲料的研究表4-5蔗渣及麸皮、豆饼组成(以干物质计+)Table4-5Thecompositionofsugarcanebagasses，wheatbranandbeancake由表4-5可见，蔗渣中含有大量纤维素、半纤维素和木质素，另外蔗渣中粗蛋白质含量和可溶性还原糖含量极少，分别都不到2％，这些都表明蔗渣不易被动物直接消化吸收，也不适合直接用来饲喂动物。添加适量的麸皮、豆饼等工农业加工副产物，可适当得改善发酵饲料的营养价值。4．3．3生产蔗渣发酵饲料的研究蔗渣中含有大量的纤维素类物质，而其蛋白质、可溶性还原糖类物质含量极少，因而生产发酵蔗渣饲料的关键是：一方面要求蔗渣纤维具有较高的降解率，同时所得发酵饲料中积累较多的还原糖、蛋白质、氨基酸等营养物质。采用木霉与酵母混合发酵生产蔗渣饲料，一方面可以降解蔗渣纤维素；同时酵母菌利用蔗渣的降解产物，合成蛋白质、氨基酸等营养，从而实现蔗渣降解与产品营养增富的协调统一。4．3．3．1利用木霉与酵母菌混合培养试验研究(1)不同酵母菌液体培养发酵产单细胞蛋白分别接种扣囊拟内孢霉酵母E．fibu-1803、热带假丝酵母Ctrop、啤酒酵母S．cere至酵母液体种子培养基中，28‘C，150r／min旋转摇床恒温振荡培养，每隔4h测定各自oD值，发现培养36h左右各组对应的OD值相对最大。然后分别取培养36h时的各酵母培养液50ml，4000r／min离，1),20min后弃上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，再离心，重复该操作直至上清液无色。然后将该沉淀转移至105"C烘箱烘干，采用凯氏定氮法测定于料的蛋白质含量，结果见表4—6。表4-6不同酵母菌液体培养发酵产单细胞蛋白Table4-6TheproductionofSCPoriliquidfermentationby3speciesofyeast酵母菌培养36h时OD值千重(g／50mL)蛋白质含量Efibu-18030．3311．17653．2CtropO．2830．99150．6’本章所得物料各组分含量(％)均以占千物质的量计算。41 利用甘蔗疆、t蔗糖蜜生产鬟酵饲料的研究由表4．6知，在E．fibu-1803、Ctrop和S．cere这3种酵母菌之间，E．fibwl803于糖蜜液体培养基中培养，菌体增重明显，同时其菌体蛋白质含量也高于C．trop和S．cere。(2)木霉与不同酵母菌混合固态发酵固态发酵培养基组成为：蔗渣：麸皮=7：3，(NH4hS04l％，KH2P04O．2％，每500raL三角瓶中分别装109干料，料水比l：4．0，121"12灭菌60min。取2mL木霉1"-1菌悬液接种至固态发酵培养基中，“小时后再分别接种10％的E．fibu．1803、C．trop和S．cere液体种子，培养基搅拌均匀，28"C恒温静置培养120h，测定物料可溶性还原糖、蛋白质以及游离氨基酸含量，结果见表4．7。表4—7木霉卜l与酵母固态混合发酵Table4-7Solidstatefermentationby1"-Imixedwith3speciesofyeast由表4．7知，与木霉I"-1单菌发酵相比较，木霉和酵母混菌发酵能明显提高发酵产物的营养价值，其蛋白质、游离氨基酸含量明显提高。通过第二章实验虽然证实木霉T-1具有较强的降解蔗渣纤维的能力，但T-1单独培养，首先其自身含氮量低，而且易受产物抑制等，因而对提高发酵物料总体蛋白质、氨基酸等营养成分含量的作用有限。利用木霉和酵母菌混合培养，使纤维素酶的产生、纤维素原料的降解、酵母菌的增殖在同一体系中同时进行，这对提高发酵物料中蛋白质、氨基酸等成分含量，提高发酵产品饲用价值意义显著。由表4．7知还可以发现，在蔗渣固态发酵体系中，以1"-1与E．fibu-1803混菌协同发酵效果最好，能显著提高发酵物料的蛋白质以及氨基酸含量。因此根据该实验结果，选择E．fibu．1803与木霉T-I混合协同发酵。4．3．3．2培养基组成为提高发酵蔗渣饲料的饲用价值，可在发酵培养基中添加适量的工农业废弃物(如麸皮、豆饼等)或无机盐类物质，本实验设计的4种发酵培养基编号及组成如下：0弗培养基：全蔗渣，(NI-hhS041％，KH21"040．2％；1稃培养基：蔗渣：麸皮=7：3，(NH4hS041％，KH2P04O．2％； 广西大掌硕士掌位论文利用甘蔗蕾．甘蔗糖蜜生产袅醇饲料的研究2群培养基：蔗渣：麸皮：豆饼=5：3：2；3撑培养基：蔗渣：麸皮：豆饼-=5：3：2；mH4hS041％，KHzP04O．2％；每500mL三角瓶中装lOg干料，料水比1：4．0，121℃高压蒸汽灭菌60rain。分别接种2mL木霉T-1菌悬液至上述4组发酵培养基，24小时后再分别接种lmLE．fibu—1803液体种子，28"12恒温静置培养120h，测定各组产品的可溶性还原糖、蛋白质及游离氨基酸含量结果，以及各原料培养基的成分同列于表4．8。表4-8木霉T-1和且fibu-1803于4种不同发酵培养基上混合培养Table4-8MixedfermentationofT-1withE．fibu-1803on4differentfermentationmedia由表4．8可知，在上述4种培养基中，于3撑培养基上接种I"-1和E．fibu-1803混合发酵后，其蛋白质、游离氨基酸含量都远高于其他3组。麸皮、豆饼是常用的饲料原料，价格便宜，且营养价值较高，容易被动物利用吸收。在蔗渣培养基中添加麸皮、豆饼，一方面由于麸皮、豆饼自身含有较多的易被动物利用的营养成分，同时又能改善和丰富培养基的营养组成，可促进微生物菌体生长繁殖，提高发酵饲料的营养价值。另外添加适量的(Nthhs04、KH2P04等无机盐也有助于改善发酵饲料品质，提高其营养价值。4．3．3．3接种方式对木霉卜1和扣囊拟内孢霉酵母E．fibu-1803混菌发酵的影响先取2mL木霉T-I菌悬液接种至3拌培养基，然后再分别间隔Oh、24h，48h接入lO％E．fibu．1803液体种子，搅拌均匀，28"(2恒温静置培养120h后测定物料对应的可溶性还原糖、蛋白质以及游离氨基酸含量，试验结果见表4-9所示。 利用甘蔗涪、甘蔗，暗蜜生产冀，礴嘲料的研究表4-9木霉T-1与且“6P1803的接种方式对其混茵发酵影响Table4-9TheinoculatingwayofT-1withEfibu-1803inmixedsolidstatefermentation从表4-9知，在接种木霉F1后先单独培养2411，然后再接种E．fibu．1803液体种子较为适宜，它可以保证木霉能首先降解培养基中部分的纤维类物质，同时E．fibu．1803又能利用木霉T-1分解所产生到营养成分合成菌体蛋白等物质。同时接种木霉T-1和酵母E．fibu·1803可能会造成两者之间的竞争性抑制，反而不利于各自的生长代谢。先接种T-I，间隔24h后再接种酵母E．fibu-1803。4。3．3。4木霉T_1和扣囊拟内孢霉酵母E，"fibu-1803混合发酵正交试验针对木霉T-1和扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803混合发酵试验过程中发酵培养基中分别接种木霉T-1和扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803的量，以及发酵培养基料水比3个因素进行3水平3因素正交试验[66-6“，所设计的L“33)正交试验因素水平表如表4．10所示。分别以发酵物料中蛋白质总量和游离氨基酸含量为评价指标进行结果分析，具体正交试验设计及试验结果与分析见表4．1l。表4-10木霉T-1与Eflbu-1803混合发酵正交试验因素和水平表Table4-10Factorsandlevelsinorthogonaltestformixed-fermentationbyT-IandE．fibu-1803 利用甘蔗鲁．甘蔗糖蜜生产裳砑：饲辅曲研究表4-11木霉T-1与且fibu-1803混合发酵正交试验及结果分析Table4-11Orthogonaltestandit’sresultsanalysisformixed-fermenlationbyT-1withE,fibu-1803通过正交试验结果及其分析发现，发酵培养基料水比对发酵产蛋白质及游离氨基酸含量的影响最为显著，培养基中含水太多或太少都对发酵不利：含水过多发酵培养基透气性差，对好氧微生物菌体的生长代谢极为不利；若培养基太干，一方面微生物菌体生长需要适宜的水分活度，同时培养基太干，不利于微生物及其代谢所分泌的酶类与培养基中的物科接触，从而会阻碍微生物正常的代谢及发酵水平。当培养基料水比较为合适时，木霉T-1和E．fibu-1803的接种量亦影响发酵的结果。根据上述试验结果，发现木霉 利用甘蔗渣，甘蔗糖蜜生产鬟酵饲料的研究T．1分别采用30％和20％的接种量以及扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803分别采用10％和20％的接种量对发酵饲料中蛋白质含量和游离氨基酸含量的影响不甚显著。综合上述试验结果，并考虑实际试验情况以及生产成本等因素，最后确定试验方案为：木霉1"-1的接种量为20％，接种木霉T_124h后再按10％的接种量接种扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803；固态发酵培养基为：蔗渣：麸皮：豆饼=5：3：2；(NH4hS04l％，KH2P04O．2％，料水比1：4．0，培养基搅拌均匀后于121℃高压蒸汽灭菌60min备用。4．3．4甘蔗糖蜜对生产发酵饲料的影响甘蔗糖蜜是甘蔗糖厂除甘蔗渣外的另一大宗副产物，其含糖量高，营养丰富，适口性好，易被动物消化吸收，是一种物美价廉的饲料原料，对改善或提高发酵饲料的品质可能会有较大的帮助。4．3．4．1糖蜜及其添加量对生产发酵饲料的影响在3群培养基基础上分别加入5％、10％、20％、30％的甘蔗原糖蜜。然后分别接种20％木霉T-1和10％扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803，培养120h后测定物料组成，测定结果见表4．12。表4-12培养基添加甘蔗原蜜对发酵产品影响Table4-12Theinfluenceofrawmolasseandit’scontentinmediaforfermentedproduct添加适量的糖蜜可以促进木霉1-1和E．fibu-1803混合发酵，添加10％糖蜜，其蛋白质和游离氨基酸含量分别比不加糖蜜组提高了2．31％和1．09％。；添加过量糖蜜效果反而不理想，这可能与添加的糖蜜是未经任何处理有关。甘蔗原蜜中含有较多的焦糖、胶体物质、灰分以及色素等杂质，这些物质亦会随着发酵培养基中糖蜜添加量的逐渐增大而在发酵培养基中逐渐积累，这些物质积累到一定量时可能就会影响菌体的生长代谢，从而会干扰整个体系的发酵水平。4．3．4．2预处理糖蜜及其添加量对生产发酵饲料的影晌 利用甘蔗澶，甘蔗糖‘重；生产裳翻E饲料的研究采用热算法处理原料糖蜜，按1：1的量加入蒸馏水稀释糖蜜，然后边搅拌边加入浓硫酸至pH值3。8左右，80"C水浴加热30rain，静置，沉淀除杂。在3撑培养基基础上分别加入5％、10％、20％、30％的热酸法处理甘蔗糖蜜。然后分别接种20％的木霉T-l和10％雕JEfibu-1503，培养120h后测定各物料，测定结果见表4．13。表4-13培养基舔加热酸处理糖蜜对发酵产品影响Table4-13Theinfluenecofpre-treatedmolasseandit’scontentinmediaforfermentedproduct未处理甘蔗糖蜜含0．42％粗蛋白质，283％可溶性还原糖，0．27％游离氨基酸；热酸处理甘蔗糖蜜中又有部分单糖和氨基酸等小分子物质生成，热酸处理甘蔗糖蜜中含有0．42％粗蛋白质，42．6％可溶性还原糖，0．32％的游离氨基酸。由表4．12、表4．13知，固态发酵培养基中添加经热酸法处理过的甘蔗糖蜜生产发酵饲料的效果较直接添加甘蔗原蜜理想，添加20％的热酸处理甘蔗糖蜜，其蛋白质和游离氨基酸含量分别比不加糖蜜时提高了5．82％和2．45％。综合上述实验结果，最终确定发酵培养基组成为：蔗渣：麸皮：豆饼=5：3：2；(NH4)2S04l％，KH2P040．2％，热酸法处理甘蔗糖蜜20％，料水比l：4．0。4．3．5木霉、酵母以及北京棒杆菌三茁混合发酵研究在4．3．4．2确定的发酵培养基上接种20％的木霉T-1和10％的E．fibu-1803后，再分别接种5％、10％、20％的北京棒杆菌C．peck-10178液体种子，三菌混合协同发酵【6s】。284C恒温静置培养120h后测定物料可溶性还原糖、蛋白质以及游离氨基酸含量，试验结果见表4．14。47 g-西大掌硕士掌位论文利用甘蔗羞、甘蔗糖，；生产鬟翻}饲料的研究表4-14木霉T-1、Eflbu-1803以及￡peck-10178三茵混合协同发酵Table4-14Mixed-co-fermentationbyT-!，E．fibu-1803andC．peck-10178在T-I和E．fibu．1803混合发酵体系中再接种C．peck-10178，在一定程度上能提高发酵物料的游离氨基酸含量，但是与此同时又会消耗部分的可溶性还原糖，饲料蛋白质含量也未显著增加。这可能与氨基酸发酵的工艺条件，如发酵培养基组成、培养条件、培养时间等要求都较严格，发酵工程中C．peck-10178首先利用培养基中较易被利用的成分以维持自身的生长代谢。此时，C．peck-10178的接种量以10％较为适宜，此时游离氨基酸含量比不接种C．peck-10178组提高了1．24％，增长率为20．06％。4．3，6甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料的生产及其工艺在4．3．4．2确定的发酵培养基上接种20％木霉3"-1，24h后再分别接种10％扣囊拟内孢霉酵母E．fibu一1803和lO％北京棒杆菌C．peck-10178，28"C恒温静置培养120h，测定物料可溶性还原糖含量、蛋白质含量、游离氨基酸含量，粗纤维含量以及活菌数，具体实验结果见表4．15。表4-15甘蔗渣，甘蔗糖蜜发酵饲料产品分析Table4--15Analysisoffermentedbagasses—and-molasses·feedwithdifferentage蛋白质含量提高(25．45—14．03)／14．02+100=81．40％游离氨基酸含量提高(7．46一1．25)／7A6‘100=．83．24％粗纤维降解率(43．95—21．71)／43．95+100=50．60％ 利用甘蔗擅、甘蔗糖蜜生产裳酵饲料的研究根据上述工艺条件及参数制成的蔗渣、糖蜜发酵饲料分别含有9．2l％可溶性还原糖、25．45％蛋白质、7．46％的游离氨基酸及21．71％的粗纤维，与原始发酵培养基相比较，该发酵饲料中蛋白质含量和游离氨基酸含量分别提高了81．40％和83．24％、粗纤维降解率50．60％。根据对3份经过不同方式处理的发酵饲料中活菌计数结果发现：新鲜发酵湿料经过真空冻干或烘箱干燥后，部分菌体失活，其活菌数含量分别受不同程度影响，总活菌数降低。相对而言60"C烘箱干燥样品的活菌损失较为严重，每克60"C烘箱干燥样品中干料所含活菌数为7．92×10”cfu／g。固体发酵饲料产品特征：固态发酵培养基经过木霉T-1、扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803和北京棒杆菌C．peck-10178混合发酵后，培养基呈淡褐色，闻有淡淡的蜜香和酒香味，烘干后其香味更浓，具有较好的产品色泽、外观和风味。4．4小结对采用微生物多菌种混合协同发酵生产发酵蔗渣、糖蜜饲料进行了相关的研究。确立了由20％木霉T-l、10％扣囊拟内孢霉酵母E．fibu．1803和10％北京棒杆菌C．peck-10178三种微生物所组成的混合发酵体系；接种时首先接种木霉T-1，24h后再同时接种E．fibu．1803和C．peck-10178的液体种子，28"C恒温静置培养，培养期间须定时翻料。固态发酵培养基：蔗渣：麸皮：豆饼=5：3：2；(Nt-h)2S04l％，KH2P040．2％，热酸法处理甘蔗糖蜜20％，料水比l：4．0，121℃灭菌60min后冷却备用。根据上述工艺所得蔗渣、糖蜜发酵饲料分别含有9．21％可溶性还原糖、25．45％蛋白质、7．46％的游离氨基酸及21．71％的粗纤维；其蛋白质和游离氨基酸含量分别比与原料发酵培养基提高了81．40％和83．24％，粗纤维降解率50．60％。每克60。C烘箱干燥所得样品中所含活菌数为7．92×10”cfu／g。经过木霉T-l、扣囊拟内孢霉酵母E．fibu-1803和北京棒杆菌C．peck-10178三菌混合协同发酵后，所得固体发酵产品具有较好的产品色泽、外观和风味，具有较高的饲用价值，可以用作动物饲料，特别适宜饲喂反刍动物。 利用甘蔗藿、甘蔗糟蜜生产置酵饲料的研究5。1论文总结第五章结论及展望(1)降解纤维素菌株的筛选从烂草堆、菜地、经年堆积的腐烂树叶、腐土、腐木等自然环境中采集样品进行分离纯化得到8株疑似目的菌株。然后分别采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板菌落识别法、滤纸条崩解试验从中选出5株菌株进行固态发酵产酶鉴定试验。通过测定5种微生物菌株在蔗渣麸皮培养基上各自发酵产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶以及B．葡萄糖营酶的酶活力，又从中选出2株进行混合固态发酵，根据两者单独发酵与混合发酵产酶效果，最后选出一株具有较强分解纤维素能力的真菌，经初步鉴定为木霉属(Trichoderma．sp．)，并以木霉T．1标识。通过对其进行的黄曲霉毒素鉴定试验，证实该菌不产黄曲霉毒素，可以作为发酵饲料的生产菌种。(2)纤维素酶促反应条件的研究通过对木霉T-1固态发酵所产纤维素酶，包括滤纸酶、CMC酶以及B-葡萄糖苷酶酶促反应条件，如反应pH值，反应温度，反应时间等因素的初步试验研究，发现3种酶对反应条件的敏感性及要求不一致，具体表现为：(1)pH4．5左右滤纸酶、CMC酶以及p．葡萄糖苷酶酶活力较高；(2)滤纸酶活力随温度变化酶活水平相对较为稳定，454C左右其酶活力较高；CMC酶受温度影响较大，45"C左右酶活力最大；B．葡萄糖苷酶活力随温度升高而缓慢增大，40"C．509C问随温度升高酶活增长较快，456C一50’C问其酶活力较大；(3)反应60min时滤纸酶活力最大；反应40min时CMC酶和p一葡萄糖苷酶酶活力较大。(3)蔗渣预处理通对原料蔗渣的粉碎粒度，原料蔗渣及固态发酵培养基蒸煮时间对发酵产纤维素酶的影响试验研究，确定取蔗渣粉碎过30目筛粉碎蔗渣制成发酵培养基，于121℃高压蒸汽灭菌锅蒸煮60min后备用。(4)微生物发酵生产发酵蔗渣饲料研究利用筛选所获得的木霉T-I与酵母菌等微生物混合培养，制备发酵蔗渣饲料。根据测定所得发酵产品中蛋白质、游离氨基酸、可溶性还原糖含量，通过对酵母菌种类；T-l和酵母菌的接种方式；发酵培养基组成以及I"-1和酵母菌各自接种量、培养基料水比、糖蜜及其在培养基中的添加量、北京棒杆菌及其接种量等因素的试验研究，初步确定蔗 g-西大掌碍E士掌位论文利用甘蔗囊，甘蔗糖蜜生产发酵饲料的研究渣、糖蜜发酵饲料的生产工艺，具体工艺如下：确立了由20％木霉T-1、10％扣囊拟内孢霉酵母E．fibu-1803和10％北京棒杆菌Cpeck-10178三种微生物所组成的混合发酵体系；接种时首先接种木霉T-I，24h后再同时接种E．fibu-1803和Cpeck-10178的液体种子，28℃恒温静置培养，培养期问须定时翻料。固态发酵培养基：蔗渣：麸皮：豆饼=5：3：2；(NI-14)2s04l％，KH2P040，2％，热酸法处理甘蔗糖蜜20％，料水比1：4．0，121℃灭菌60rain后冷却备用。根据上述工艺条件及参数制成的蔗渣、糖蜜发酵饲料分别含有9．21％可溶性还原糖、25．45％蛋白质、7．46％的游离氨基酸及2I．71％的粗纤维：与原始发酵培养基相比较，该发酵饲料中蛋白质含量和游离氨基酸含量分别提高了81．40％和83．24％、粗纤维降解率50．60％。每克60"C烘箱干燥样品中所含活菌数为7．92X10Iocfu／g。同时混合原料经过木霉T-1、扣囊拟内孢霉酵母E．fibu-1803和北京棒杆菌Cpeck-10178混合发酵后所得固体发酵产品具有较好的产品外观和风味，具有较高的饲用价值，可以用作动物饲料，特别适宜饲喂反刍动物。5。2本论文创新点本文在评价发酵工艺时，除考察发酵饲料中蛋白质含量外，还同时考察了其可溶性还原糖、游离氨基酸含量，发酵前后产品粗纤维含量及其降解率、产品所含活菌数等指标，同时在测定蛋自质含量时排除了物料中可能存在的部分游离无机氮对测定结果的影响，测定所得蛋白质含量在一定程度上代表了真蛋白的含量，从而更全面客观的衡量产品的营养价值指标，评价发酵工艺的优劣，确定发酵工艺参数。本论文针对甘蔗糖业大宗的副产物甘蔗渣、甘蔗糖蜜的资源优势及其发展潜力，畜牧业、饲料行业、以及甘蔗渣、甘蔗糖蜜的处理和综合利用现状，根据甘蔗渣、甘蔗糖蜜原料特征，利用筛选所得的纤维素降解菌和酵母等微生物进行混合协同发酵，通过对培养基以及相关发酵工艺参数的研究，确立较为理想的发酵工艺，根据此工艺能利用甘蔗渣、甘蔗糖蜜生产得到营养价值较高的发酵饲料产品，且在生产过程中不产生“三废”，为甘蔗渣、甘蔗糖蜜的综合利用开辟了一条新的途径，对甘蔗糖业、畜牧业以及环境可持续发展意义重大。5．3展望本论文重点对降解纤维素菌株的筛选，以及利用筛选所得菌株与酵母菌等微生物进行混合协同发酵，通过对培养基组成以及发酵工艺条件的研究，确立较理想的发酵饲料生产工艺。但是受时间、人力物力的限制，本论文亦存在许多不足之处，有待于进一步的研究探索。 利用甘蔗疆．甘蔗糖蜜生产生酵饲料的研究(1)从自然环境中筛选降解纤维素菌株的工作量大，耗时较久，由于受时间限制论文实验过程中未对其进行进一步的育种处理研究。若对该菌种进行进一步的遗传育种处理，可能会提高其降解纤维素能力；(2)受现有条件制约，对蔗渣预处理方法研究不够深入。简单高效，经济环保的蔗渣预处理方法还有待于更深入的研究；(3)对微生物多菌种混合协同发酵生产甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料的研究还不够深入和完善，关于发酵工艺参数优化以及快速、准确物料分析方法的选择和建立等方面还有待于进一步试验研究i(4)本论文的固态发酵试验都在三角瓶中进行，处理量有限，距离大范围的推广应用还有一段距离，因此在今后的研究中，可以对甘蔗渣、甘蔗糖蜜发酵饲料大规模生产及应用方面进行相关的试验研究，争取实现该类产品的规模化、工业化生产。 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X"-西大掌硕士掌位论文利用甘蔗渣．甘蔗糖■}生产发翻}饲料的研究致谢在此，谨对在攻读硕士研究生学位期间给予我指导、帮助和支持的导师、老师、同学以及一直以来支持我的亲人致以真诚的敬意!首先要感谢我的两位导师伍时华教授和童张法教授，本学位论文是在他们两位的精心指导下完成的。他们不仅为我提供了良好的科研条件，而且在在本人的学业上倾注了极大的精力，在论文选题、实验方案设计、理论指导等方面都给予了我莫大的帮助。两位导师渊博的知识、严谨的治学态度、高度的责任心、睿智的思维以及宽厚待人的品德亦深深的感动我，使我终生受益。你们的每一次谆谆教诲我都会铭记在心，尊敬的老师，谢谢你们这三年来给予我的指导和帮助!在广西工学院做论文研究的两年里，我得到了生物与化学工程系发酵工程研究室全体老师的大力支持与帮助。尤其是黄翠姬老师，在仪器与实验材料的准备工作上给予我极大的帮助和支持。另外，在实验过程中我还得到了阎柳娟老师的帮助，在此表示我衷心地感谢I另外，还要感谢我的同学李萍、林晓洋、黄昭宇，师姐路敏，师弟蒋常德对我的帮助。感谢所有曾给予我帮助的老师、同学和朋友，谢谢你们一直以来的支持和帮助!最后，感谢我的父母双亲、姐姐、姐夫，以及所有关心支持我的亲人。在他们多年对我一贯的支持和鼓励下，我才能一帆风顺的走到今天，顺利地完成硕士研究生的学习。感谢你们一直以来对我的关爱和呵护，我每一步成长的轨迹和所取得每一份成绩背后都有他们的付出。在此向我的亲人致以我最诚挚的敬意和最衷心的祝福! 利用甘蔗涪、甘蔗糖蜜生产裳醇饲料的研究攻读硕士学位期间发表的学术论文情况1．伍时华，徐雅飞，黄翠姬．降解纤维素菌株的筛选．食品科技，2006，8：50．52．2．徐雅飞，伍时华，童张法．纤维素酶产生菌的筛选及其粗酶性质研究．第三届全国化学工程与生物化工年会论文选编，北京：化学工业出版社，2006：581．585．3．伍时华，徐雅1毛，张健等．L一亮氨酸发酵培养基优化试验．广西植物，2006，26(6)：669-674．4．伍时华，黄翠姬，徐雅飞．L．亮氨酸摇瓶发酵培养条件的研究．广西工学院学报，2006，17(3)：29—32．