毛细管电泳分离技术在蜂蜜品质评价中的应用 63页

密级：公开中图分类号：全日制□非全日制硕士学位论文论文题目：毛细管电泳分离技术在蜂蜜品质评价中的应用作者姓名：黄益姣专业学位类别：工程专业学位专业学位领域：食品工程研究方向：食品质量与安全指导教师：王丽副教授提交日期：年月 浙江工商大学硕士学位论文毛细管电泳分离技术在蜂蜜品质评价中的应用摘要中国是蜂蜜生产消费大国，蜂蜜中富含多种营养成分，营养价值高，极具保健功能，广受人们的欢迎，但随着近期频频爆出的蜂蜜掺假以及劣质蜂蜜等问题，人们对蜂蜜品质的要求也越来越高。蜂蜜的成分及其质量主要跟它的地理起源和植物来源有关，同时也受环境、加工和储存的影响。蜂蜜成分分析和药物残留分析可以作为评价蜂蜜品质的指标之一。蜂蜜中的很多成分都直接影响着它的颜色、香气、口感和保健功效，而蜂蜜中药物残留不仅降低其原来的营养价值，还不利于人体健康，毛细管电泳（技术在小分子物质分析上表现出越来越多的优点，其中包括高效、适用化合物广、基质耐受性好、试剂样品消耗少且对环境友好。为了更好的评价蜂蜜的品质，本论文建立了蜂蜜中低分子量有机酸、磺胺类化合物以及多酚类化合物的毛细管电泳检测法，具体结论如下：在毛细管区带电泳间接紫外检测法的基础上联合在线富集技术即柱头场放大技术，并将之运用到蜂蜜样品低分子有机酸的分析中，在裸露未涂层石英毛细管柱中，以二硝基苯甲酸为背景电解质（甲醇和为分离介质添加剂，种有机酸在分钟内得到分离，线性良好，检出限在之间，回收率在在以内，适用于蜂蜜中有机酸的检测。 浙江工商大学硕士学位论文建立了毛细管区带电泳直接紫外检测法分析多种磺胺类药物并且结合固相萃取前处理，以的磷酸氢二钾（为缓冲运行液样品经固相萃取柱萃取提取，用膜过滤超声脱气后，进毛细管柱检测。种磺胺在内实现分离，回收率在之间。建立了毛细管区带电泳直接紫外检测法分析多种多酚，以硼砂为缓冲体系，并将所建立的方法用于分析多种蜂蜜，种多酚在内实现分离，回收率在°。。关键词：毛细管区带电泳；蜂蜜；有机酸；磺胺；多酚 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文， 浙江工商大学硕士学位论文， 浙江工商大学硕士学位论文目录蜂蜜的品质评价蜂蜜的生物学功能蜂蜜的掺假及鉴定蜂蜜中的药物残留毛细管电泳概况毛细管电泳基本原理毛细管电泳柱技术毛细管发展动向毛细管电泳场放大技术柱头场放大基质场放大毛细管电泳在蜂蜜品质检测中的应用论文的研宄内容和意义第聿场放大闻外管区带电泳法涂測絳蜜中的有机液材料与仪器试验材料试验仪器试验方法有机酸标准样品酸度的滴定标准溶液的配制样品处理毛细管电泳条件结果与讨论滴定结果和浓度甲醇的浓度分离值的选择富集条件优化有机酸的毛细管电泳图方法比较方法的线性关系加标回收试验精密度试验方法的应用本章小结第章■管区带电泳法检测鋒蜜中的磺胺物材料与仪器 浙江工商大学硕士学位论文试验材料试验仪器试验方法磺胺标准溶液配制样品预处理预柱活化毛细管电泳条件结果与讨论运行缓冲液浓度的选择分离值得选择分离电压的选择磺胺的毛细管电泳图方法的线性关系加标回收试验精密度试验方法的应用本章小结第聿毛细管区带电泳法检湄绛蜜中的多故材料与仪器试验材料试验仪器试验方法样品前处理毛细管电泳条件结果与讨论缓冲液浓度的选择分离值的优化分离电压的选择标准曲线及检出限样品分析本章小结第章总结、创新点与腿总结创新点展望 浙江工商大学硕士学位论文第章绪论蜂蜜的品质评价蜂蜜的生物学功能蜂蜜是工蜂从植物蜜腺中采集的花蜜，混合蜜蜂酶液后经过充分酿造，储藏在蜂巢里的一种天然甜味食品，营养价值极高。蜂蜜主要是糖的过饱和水溶液，总糖量占的其中大约葡萄糖和果糖，氨基酸的平均含量为并含丰富的矿物质、有机酸和数种微量元素及酶类⑴。具有增强免疫，保护强心，抗菌，抗氧化，止咳润肺，加速创伤组织修复等作用。其生物学功能主要表现在它的抗氧化性和抗菌作用上。研宄表明，蜂蜜的抗氧化活性主要与蜂蜜中的活性成分的含量有关，包括酹酸类、黄酮类和美拉德产物等。曹讳等对种蜂蜜中的总酷酸含量进行了测定，并且对它们的抗氧化活性进行了评价，发现种蜂蜜都能抑制超氧阴离子自由基。等研究发现，苹果花蜜的水提取物中富含酷酸类化合物，且该蜂蜜能有效淳灭过氧化氧自由基。黄酮类化合物是蜂蜜中另一种主要抗氧化成分，：丨等发现蜂蜜中的黄酮类化合物能抑制脂质过氧化。等在对种蜂蜜的氧化自由基吸收能力进行测定时，发现蜂蜜的抗氧能力不仅与它的酌酸含及蜂蜜的颜色有关，而且蜂蜜中的美拉德反应产物也能提高其抗氧化性。蜂蜜的抗菌机理大致可以总结为个方面：高渗透压、酸性环境、水分活度低等物理特性；含有酌类、黄酮类、香豆素类等具有抗菌的化合物；葡萄糖氧化酶分解产生的过氧化氢。研究发现的蜂蜜水溶液可以抑制蜡样芽胞杆菌、都柏林沙门菌、金黄色葡萄球菌和病疾志贺菌。等对麦卢卡蜂蜜的抑菌作用进行了研宄，发现其对大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。一般来讲细菌所需的水分活度是，而蜂蜜的水分活度为，并不适宜细菌生长。蜂蜜中含糖量高，渗透压大，能使细菌大量脱水死亡。研究发现，洋槐蜜和紫云英蜜含糖量高，高渗透作用在其抗菌能力上起到了主要作用。有学者认为，蜂蜜中的主要有效抑菌成分是过氧化氢。⋯等对种蜂蜜过氧化氢浓度抑制金黄色葡萄球菌株和铜绿假单胞菌株的活性进行了测定，发现不同浓度的过氧化氧对蜂蜜抑菌活性也存在显著差异， 浙江工商大学硕士学位论文而等则认为，黄酮类、紛类等一些非过氧化物也起到一定的抑菌作用。等在对蜂蜜抑菌机制进行研宄时，发现虽然过氧化氢在蜂蜜抑菌作用中起到主要作用，但蜂蜜中的紛类在这个过程中是必不可少的。蜂蜜的掺假及鉴定随着蜂蜜掺假事件的频频发生，蜂蜜掺假也成为了消费者普遍关心的问题，如何来鉴定蜂蜜掺假是蜂蜜质量监控的关键。为了起到增稠、添色、加香等作用，蜂蜜在加工过程中经常认为的添加治糖、幾甲基纤维素钠、果葡糖梁、人工转化糖、簾糖、葡荀糖、淀粉、食盐、色素和香精等。掺入不同的物质，能引起的蜂蜜相应的性质发生改变，这时可以通过釆用不同的检测技术来鉴别。如因掺入糖类而造成蜂蜜中同位素比率的改变，可以釆用碳同位素检测技术来鉴定；通过近红外光谱仪测定蜂蜜中是否掺有果糖和葡萄糖；掺入不同的添加物，蜂蜜的物理指标也会发生变化，可以通过显微镜检法检查蜂蜜中是否含有甘蔗细胞碎片从而来鉴定是否掺假鹿糖，；还可以通过色谱技术对蜂蜜中的特定成分或掺假组分进行分离检测，比较蜂蜜中组分的正常值以此来判断是否掺假。但是蜂蜜本身化学成分复杂，而且蜂蜜的掺假物质较多，这都使得难以通过一种方法达到准确鉴别蜂蜜真伪的目的，所以需要几种方法共同分析以提高检测的准确性。蜂蜜中的药物残留蜂蜜散养户无法对蜜源进行控制，蜜蜂很可能采到喷了农药的花粉，造成蜂蜜中的农药残留。而另一种“药残”主要来源于防治蜂病不科学用药，蜂农为了治疗蜜蜂病毒会经常使用抗菌类药物和抗生素类药物。而残留在蜜蜂体内中的药物降解十分缓慢，残留时间一般较长，要完全“清除”非常困难，极大的可能这些残留会带到蜂蜜中去。要提高蜂蜜的质量减少药残，必须从源头抓起，加强蜂蜜药物残留存因和防止残留的研宄，从根本上解决无公害蜂蜜的生产途径，还应加大蜂蜜质量监督和检测力度。毛细管电泳概况毛细管电泳基本原理是指离子或带电粒子以毛细管为分离室，在高压电场的驱动下，由于目标 浙江工商大学硕士学位论文分析物之间滴度和分配行为的不同而实现分离的一种检测技术。在电解质溶液中，带电粒子所在的介质受到电场的作用，使其以不同的速度定向迁移的现象称电泳。大多使用弹性石英毛细管柱，在时，石英表面的桂醇基（发生电离，使毛细管壁内表面带负电，管壁表面吸附着溶液中的阳离子而带正电，阴离子则被管壁排斥在外层，管壁附近溶液所带的正电荷和管壁本身所带的负电荷形成了双电层。过剩负电荷因液相界面一吸附“扩散‘”‘扩散层““吸附层过剩负电荷图电渗流不意图【】在电场作用下，双电层中的水合阳离子带动流体整体朝阴极移动，形成电渗液（，。其速度大小可由式表示：义式中电渗流速度；电渗流迁移率；电介质常数；；电势；溶液點度。带电粒子在毛细管柱中的迁移速度等于电泳和电渗速度的矢量合速度。即：切式中电泳速度；；。：电渗流速度；印：电泳滴度；。电渗流迁移率；：电场强度由上述公式可知，阳离子由于电泳和电渗速度一致，所以迀移速度最快，最先流出；中性粒子由于不带电荷，电泳速度为“零”，所以它的合速度与它的电渗速 浙江工商大学硕士学位论文度相等，其次流出；阴离子的运动方向真好与电渗流方向相反，但电泳速度一般小于电渗流速度，故阴离子最后流出；三种粒子的先后流出从而得到分离，这就是毛细管电泳（，的分离原理。毛细管电泳电渗的流速轮廓是一个平面，径向分布几乎是均勾的，不存在流速梯度，这使得管内的流体像一个“塞子”一样以均勾的速度向前运动，理论上防止了各个样品组分区带的直接扩散。”？““”二一：！“■“““■■■一—“■国■图电渗流流型和压力驱动流型的比较毛细管中电渗流呈“塞式流”流型柱中压力驱动呈抛物线流型毛细管电泳柱技术毛细管是的核心部件之一。早期的柱技术研究主要集中在毛细管直径、长度、形状和材料方面，目前集中研宄管壁改性和柱制备。主要改性方式如下：动态修饰毛细管内壁是一种通过调节缓冲液的离子强度、粘度以及来改变电渗流的改性方法，在这些涂层中，金属阳离子、焼基醜胺离子以及院基胺离子都可以通过与毛细管壁上的进行交换从而减小电渗流，有时甚至使管壁电性逆转。在毛细管电泳缓冲溶液中加入一定浓度的、、等阳离子后，由于这些阳离子存在于双电层中，降低了管壁的有效电荷，从而使电渗流变小。加入表面活性剂十六院基三甲基漠化铵（，能与毛细管内壁上的负离子形成物理吸附层， 浙江工商大学硕士学位论文使反向。除此外还可添加聚胺、聚乙稀亚胺（、甲基纤维素（等。毛细管内壁表面涂层这是一种静态涂层手法，主要是指在运行安装前采用物理吸附、化学键合及交联等方法，使毛细管壁内形成一层单分子层或高分子交联层。如在管内壁涂敷一层聚乙炼亚胺，由于毛细管壁上的带负电荷，产生的亚胺阳离子被吸附在上面，使其在一定的酸度范围内带正电从而改变。娃焼化试剂是最常用的一种化学键合材料，如聚二甲基桂氧院（、丫缩水甘油醚基丙基三甲氧基桂氧院、十八院基二氣娃烧等。凝胶柱和无胶蹄分凝胶柱和无胶蹄分多用于分离测定蛋白质和，前者主要由聚丙稀酰胺或琼脂糖制成，分离能力强，但是连续、稳定的凝胶柱制备并不容易，凝胶在制备过程中容易断裂收缩，出现凝胶缺陷，造成稳定性差、使用寿命短且重现性差等缺点；后者以非交联的线性聚合物作为蹄分介质，常用的有线性聚丙稀醜胺、聚口比略焼酮、纤维素衍生物等，是近几年来较常用的一种检测微量蛋白的方法。毛细管填充柱毛细管填充柱首次是由和提出，他们将固定相填入内径为的硼鞋酸玻璃毛细管柱中，成功分离了普通毛细管难以分离的两种中性化合物甲基恵和花。将各种高效液相色谱固定相填充在毛细管电泳柱中，极大地提高了毛细管电泳对复杂样品中目标分析物的选择性和分离能力。在内径的毛细管柱中填充固定相，折合塔板高度达到。毛细管发展动向毛细管电泳的高效、快速、灵敏以及样品消耗少的优点，使其具有极大的发展潜力，它的应用领域也正在不断扩展深入。在食品科学、生命科学、药物学、环境科学、临床医学等领域都得到了广泛的应用，其中主要包括对天然产物的分析、药物分析和离子小分子分析。是在对蛋白质分析中兴起的一种分离技术，在生命科学领域的应用十分广泛。主要包括蛋白的鉴别分析（包括氨基酸的组成、序列和一些物化常数如分子量和等电点等）、结构分析、蛋白的定量测定和微量制备、纯度鉴定、稳定性和动 浙江工商大学硕士学位论文力学研宄。其中，毛细管凝胶电泳技术在生物基因分析中的运用为生命科学的发展提供了可靠的数据此外，还能应用于糖类的分析，尤其随着各种新的糖衍生化反应和检测技术的应用，更使成为了分析糖肽、糖蛋白和寡糖等糖类的有效手段。在药物成分分析领域中的应用主要集中在生物碱和黄酮及其戒类方面而由于在药物手性拆分的高效性和简便性，使手性拆分成为应用最活跃、最独特的领域。添加剂法是目前进行手性拆分的主要形式，只要在缓冲液中添加合适的手性试剂，经过优化条件即可实现分离。最初的应用领域主要是生命科学。随着仪器的不断改进完善，技术的日益成熟，才逐渐发展到小分子和离子分析中。在离子的分析中，具有基质耐受力强、前处理简单、效率高，分析快等优势，因而被广泛地应用在饮用水、污水、牛奶、面包等样品中离子的检测】。毛细管电泳场放大技术毛细管电泳在近几年发展迅速，它不仅具有高效性，而且能够分析的化合物范围广。但是，由于其有限的检测光学路程，且配备的检测器灵敏度较低，导致其微小的进样量不能满足毛细管电泳在痕量分析上的应用。为了提高灵敏度，研发了很多富集技术。其中场放大技术是较常用，且效率较高的一种在线富集技术。柱头场放大柱头场放大是将一段低电导的液体注射进毛细管的进样口，这样不仅可以使缓冲溶液和样品溶液的界面更加清晰，检测灵敏度得到了提高，也可以减小进样端不平整造成的不良影响，改善进样效率，还在一定程度上减少了样品歧视，而且还实现了阴、阳离子的同时在线富集。其原理见图。 浙江工商大学硕士学位论文充满级冲液￡力进样‘游———―—电渗淹电成进样—々赫水柱—幡流丄丄史渗威分满电渗濟图柱头场放大机制丨首先，在毛细管的进样口，栗进一段导电性低的溶液（通常是水柱，在这段区域，场强较高，电动注射样品溶液后，样品在这段区域的迁移速度快。当样品中的各组分穿越水柱和的交界面时，分析物速度急剧变小，样品浓度得到富集。李利军等在电动进样前，先在毛细管进样端果进一段水柱，而后实施在线富集，提高了对香草酸、肉桂酸和阿魏酸的检测灵敏度。李娟等采用压力进样在毛细管端口注入一段含乙腈的水柱，对奶粉中的三聚氰胺进行富集，灵敏度提高了约倍。基质场放大基质场放大是在样品基质中添加乙腈、去离子水等低电导性物质来降低样品溶液的离子强度，毛细管柱中充满高电导性的运行缓冲液，在电场的作用下，目标分析物在电导性低、场强高的样品溶液中时，速度比较快，而在进入电导性高、场强低的和样品溶液的交界面时，速度骤然减小，目标分析物堆积于毛细管进口端从而得到富集。当样品溶液成分复杂，特别是一些具有高盐浓度的样品，利用添加低电导性的物质来实现富集的操作不可行。等采用聚合物整体柱微萃取对样品进行前处理，然后结合以低离子强度的醋酸乙腈溶液为样品基质的技术对鸡肉中种喹诺酮类抗生素残留进行 浙江工商大学硕士学位论文检测，检出限可达到。等以乙腈硼酸溶液为场放大的低导性基质，富集检测了中药中的种有机酸。毛细管电泳在蜂蜜品质检测中的应用中国是蜂蜜生产消费大国，蜂蜜中含有多种营养成分，风味独特，极具保健功能和营养价值，但随着人们对蜂蜜的需求越来越大，市场也出现了一些品质较差或者掺假的蜂蜜。所以近几年来对蜂蜜的品质研宄也不断增多。对蜂蜜品质的检测主要包括对蜂蜜成分的分离检测和药残的检测，方法主要有有高效液相色谱、气相色谱（、近红外光谱法（、毛细管电泳（等，而相比于其他方法，最大的优势在于基质耐受力好，前处理比较简单。此外，毛细管电泳法还具有分离效率高，分析速度快，样品和溶剂量少，毛细管柱便宜且更换简单等突出优点，因而被越来越广泛地用于蜂蜜检测。°等建立了蜂蜜中多糖的间接紫外检测方法，在中内就实现了对果糖、葡萄糖和庶糖的分离。等以咪卩坐为背景电解质，为内标物建立了毛细管电泳间接紫外检测法，并且成功分离了蜂蜜中、、、、、在毛细管电泳技术发展早期，就被运用到有机酸含量的测定中，单研究对象多为果汁、酒、和调味品等。等在年建立了直接紫外检测法，检测分离了蜂蜜中的梓檬酸和无机阴离子，该法只定性检测了蜂蜜中含有梓檬酸并未定量。红等利用毛细管电泳分离了蜂蜜中的种低分子量有机酸，考察了电渗流改性剂、缓冲运行液以及检测波长对分离的影响，该法以憐酸为缓冲体系，为分离介质添加剂，为电渗流改性剂。蜂蜜的抗氧作用与蜂蜜中的多酷有关，随着蜂蜜越来越受欢迎，对于蜂蜜的保健功能的研究也越来越多，尤其是对蜂蜜中的多酷类化合物。等早在年的研究中就采用毛细管区带电泳法检测蜂蜜中的植物多酷，发现百里香蜂蜜中含有迷迭香酸，石南蜜中含有鞋花酸，相搞蜜中含有橙皮素，薰衣香蜜中含有相梧素，该法并为对各种多酷进行定量检测。等建立了法检测迷迭香蜂蜜中的多酌，在醋酸按异丙醇为缓冲体系中，种多酷得到了很好的分离。 浙江工商大学硕士学位论文关于用毛细管电泳检测蜂蜜样品中的药残分析的研宄报道较少，但因为其进样量小、分析时间短等特点，在很早就被用于检测各类食品中的药残。目前已有许多关于检测食品中药物残留的文献报道，其中主要包括针对食品中农药、抗生素类药物和磺胺类药物的检测。等采用毛细管电泳结合固相萃取分离了肉制品中中擴胺类药物，实验以萘氧乙酸为内标物，检出限在符合相关检测要求。论文的研究内容和意义高效毛细管电泳以其高效、快速、微量、操作模式多样化、样品和溶剂消耗少、费用低等优点而迅速成为一种极为有效的分离技术，是生物化学和分析化学中最受瞩目、发展最快的一种分离分析新技术。随着掺假蜂蜜以及劣质蜂蜜事件的不断发生，亟需一种能够全面评价蜂蜜品质的机制。本文主要对毛细管电泳的区带模式在蜂蜜样品中的应用展开研究工作，研究内容分为以三个部分：低分子有机酸场放大间接紫外毛细管电泳检测法的建立与蜂蜜样品中的应用：通过考察背景电解质浓度、、电渗流改性剂的浓度等来建立有机酸的间接毛细管电泳法，优化场放大技术，提高毛细管的灵敏度，比较场放大与压力模式下的富集效果，并将之用到蜂蜜制品的分析中建立磺胺类药物毛细管电泳区带电泳直接紫外检测方法：讨缓冲液浓度、和分离电压等条件对分离效果的影响，确定最优电泳条件，对检测方法进行验证，并用于对蜂蜜中擴胺类药物残留的评价中。利用毛细管电泳建立蜂蜜中植物多酷的检测方法：考察缓冲液组成和电泳条件等对分离的影响，确定最佳条件，并用于蜂蜜的检测。 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文第章场放大间接紫外毛细管区带电泳法检测蜂蜜中的有机酸蜂蜜中含有多种微量活性成分，其中主要包括酷酸类化合物、黄酮类化合物、有机酸等。有机酸作为蜂蜜中己知的微量活性成分，含量很低（但其与蜂蜜物理化学特性密切相关，例如影响蜂蜜的、酸度和电导率，是构成蜂蜜的风味成分之一，还能影响蜂蜜的抗菌性和抗氧化活性蜂蜜中有机酸的组成和含量可以作为评价蜂蜜品质的重要指标之一，还有助于辨别蜂蜜产地和植物来源。有些有机酸甚至还起到抑制螨虫感染的作用。国内外关于蜂蜜中有机酸分析研宄结果见下表。由表可知检测蜂蜜中有机酸常用的方法有酶法气相色谱法离子色谱法和高效液相色谱法。酶法检测灵敏度高，且特异性强，尤其用在检测具有手性的有机酸，但其只能用于检测单一物质，并不适用于本实验中几种酸的同时检测。由于大部分酸都是非挥发性物质，所以在用气相色谱法检测前需要一个衍生化过程，不仅耗时，而且在过程中有损失，其更适合用于检测蜂蜜中的芳香族有机酸。高效液相色谱法和离子色谱法是常用的检测蜂蜜中有机酸的方法，但其容易受蜂蜜中的糖干扰而影响检测结果，所以在检测前必须经过繁琐的前处理进行提取和富集，包括衍生、离子交换等而且分析时间长。毛细管电泳因其高效、快速、溶剂消耗少、操作简单等特点，被广泛应用于分析检测食品中的小分子有机酸，例如啤酒、果汁、奶制品、酒类等。关于蜂蜜产品中多种有机酸含量的研宄很少，这可能与蜂蜜中有机酸含量偏低有关。 浙江工商大学硕士学位论文表关于蜂蜜中有机酸的文献报道统计‘分析时间参考方法有机酸回收率（％文献酶法苹果酸一一【丁二酸、苹果酸、梓檬酸一—叫草酸“梓檬酸、酒石酸、苹果酸、奎宁酸、丁二酸、乳酸、【乙酸等草酸、梓檬酸、苹果酸、奎宁酸、乳酸、甲酸、丙—酮酸等苹果酸、梓檬酸、丁二酸—】草酸、苹果酸、酒石酸、—【乳酸甲酸間草酸、乙酸、甲酸、梓檬酸、乳酸、苹果酸、丁二】酸、两酮酸【等采用直接紫外检测，几种有机酸在得到分离，但是没有考察样品回收率，方法验证不完整。等建立了间接紫外检测法测定有机酸，但目标分析物仅为甲酸。常见有机酸因为缺少紫外吸收发色团，一般在以上大多无紫外吸收虽然也可以进行低紫外检测，但是并不是所以仪器都可以做到这点的，而且检测波长越接近仪器的最低检测波长，噪音越大，基线越容易受到影响【，所以本实验采用毛细管区带电泳间接紫外法检测蜂蜜中低分子量有机酸，并结合在线富集技术即柱头场放大富集，提高了的灵敏度。 浙江工商大学硕士学位论文材料与仪器试验材料荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、荞麦蜜、黄苗蜜和油菜蜜产地为安徽，荆条蜜、洋槐蜜和锻树蜜号样品购于杭州各大超级市场；二摘基苯甲酸、盐酸、氢氧化钠、草酸、酒石酸、甲酸、梓檬酸、苹果酸、乳酸、丁二酸、乙酸均为分析纯（购于阿拉丁）；十六焼基三甲基溴化铵（，分析纯（上海金山经炜化工有限公司）；甲醇，色谱纯（购于杭州汇普化工有限公司）；超纯水，电阻率为￡的水。试验仪器毛细管电泳仪（二级管阵列（检测器（安捷伦科技有限公司）；裸露未涂层的石英毛细管柱（河北锐洋色谱器件有限公司）；型润旋振荡器（北京京辉凯业科技有限公司）；超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；—次性针式尼龙膜过滤器（杭州常胜科教器具厂：型超纯水仪（购于美国公司）；型精密电子天平（上海高致仪器有限公司）。试验方法有机酸标、准样品酸度的滴定参照国标配制，用邻苯二甲酸氢钾标定其浓度。然后用标定后的氢氧化钠溶液滴定乳酸、乙酸和甲酸标准品浓度，依据滴定结果得出其质量浓度，用于标准溶液的配制。标准溶液的配制固态标准品根据其纯度称取相应的重量，液态有机酸则根据滴定结果量取相应的体积，再用超纯水溶解定容，配制成浓度为的标准溶液，使用前稀释成适宜低浓度溶液。样品处理称取蜂蜜样品，用超纯水溶解，定容至，用膜过滤，超声脱气后直接进样检测。 浙江工商大学硕士学位论文毛细管电泳条件实验采用的裸露未涂层毛细管柱为有效长度在室温下（下进行实验，采用场放大进样模式：先用压力引进一段水柱，时间为后采用电动进样方式进样，进样电压为，检测波长为分离电压为。用新毛细管柱前冲，超纯水（，缓冲液（重复利用前冲超纯水（，缓冲液（每次进样间的冲洗顺序为氧氧化钠、超纯水（、缓冲液（。结果与讨论滴定结果通过滴定结果，计算得到乳酸、甲酸和乙酸标准品的质量浓度分别为、和和浓度是一种阳离子表面活性剂，缓冲溶液中加入的被毛细管壁吸附，毛细管壁上形成双电层，使溶液中的有机酸目标物往正极检测端迁移，减小电渗流，利于有机酸的分离实验同时对背景电解质和电渗流改性剂的浓度进行考察，的浓度分别为、、、的浓度分别为、、、。结果发现随着和浓度的改变，较显著的改变了酒石酸和甲酸、甲酸和梓檬酸之间的分离效果，对其他几种酸之间的分离影响较小。以和的浓度对酒石酸和甲酸的分离度变化做图，以和的浓度对甲酸和梓檬酸的分离度变化做图。当的浓度为，的浓度为时，酒石酸和甲酸的分离度达到最大，分离效果最佳，此时甲酸和梓檬酸的分离度为当的浓度为，的浓度为时，甲酸和梓檬酸的分离度达到最大，但在此条件下，酒石酸和甲酸的分离度只有，未达到分离的要求当的浓度为，的浓度为时，酒石酸和甲酸的分离度为，甲酸和梓檬酸的分离度为考虑到酒石酸和甲酸之间的分离度小，所以折中选择的浓度为，的浓 浙江工商大学硕士学位论文度为霧。》。图和的浓度对酒石酸和甲酸的分离度的影响聽々广，图和的浓度对甲酸和梓檬酸的分离度的影响注：色谱条件：有效长度，分离电压为，检测波长为。甲醇的浓度缓冲液中加入一定比例的甲醇，既可以改善有机酸在溶质中的溶解，也可以防止体系受和焦耳热的影响造成的体系不稳定，增加分离的选择性固定运 浙江工商大学硕士学位论文行缓冲液的值为，组成为和时，考察了甲醇的添加量为、、以及时对分离的影响。以表观迁移率（对甲醇的浓度变化做图。图显示随着甲醇浓度增加，表观迁移率（减小，分析时间虽然延长，但分离效果有所改善。甲醇浓度为虽能分离，但是分离度不够。苹果酸和梓檬酸、酒石酸和甲酸分别在甲醇浓度为、时有重叠。当甲醇加入量为分离效果好，且比加入量为时分析时间短，所以选择甲醇加入量为。“。———————丨：二）图不同浓度甲醇对表观迁移率的影响注：色谱条件如分离值的选择缓冲液的条件是影响有机酸的分离速度和分离效果的关键因素。的不同不仅会改变有机酸在缓冲液中的溶解度，而且会引起电渗流的改变。低能够保证所有有机酸阴离子电离，促使其往阳极迁移，鉴于本实验所测有机酸的在，实验考察了在范围内的分离情况。以绝对迁移时间对变化做图，从图可以看出，绝对迁移时间随着的增大而减小，直到为时到达最小。但当在时，甲酸和酒石酸有峰重叠现象。从分析时间和 浙江工商大学硕士学位论文分离度两方面考虑，选择最佳为。当为时，甲酸是个宽峰且有拖尾，甲酸的峰尾与梓檬酸的峰有重叠。【等的研究结果表明此种现象可以通过在缓冲溶液中加入电渗流改性剂或者改变电渗流改性剂浓度得到改善。在本实验中，在缓冲溶液中加入后此现象得到改善。—————乂图值对绝对迁移时间的影响富集条件优化引入适当长度的水柱是富集效果的关键，太短则目标分析物很快进入水柱中，聚集时间有限，富集效果不佳，水柱太长不仅会影响分离度，而且滞留在水中的低导性溶液会极大地影响到后续的分离场强。在进样电压、进样时间条件下，考察水柱对峰面积的影响见图。由图可知，泵入水柱的长度越长，目标分析物的引入量就越少，峰面积减小。对水柱和的峰宽进行比较后，选择峰宽较小的为最佳水柱长度。 浙江工商大学硕士学位论文口贫！！丨國图引入水柱长度对峰面积影响有机酸的毛细管电泳图在最佳检测条件下得到标准品和样品的毛细管电泳图，由图标准品图可知，种有机酸实现了分离，出峰顺序依次为草酸、酒石酸、甲酸、梓檬酸、苹果酸、乳酸、丁二酸、乙酸。由样品图可知，样品中含有草酸、酒石酸、甲酸、梓檬酸、苹果酸。一，厂一乂，广一广‘：曰：‘：；’丨：“■‘“—“‘—广‘？图有机酸混合标准溶液的毛细管电泳图 浙江工商大学硕士学位论文？一’抑‘！—■■一‘￡图样品有机酸的毛细管电泳图注：草酸、酒石酸、甲酸、梓檬酸、苹果酸、乳酸、丁二酸、乙酸。组成为；检测波长分离电压。方法比较对有机酸标准品溶液进行和的比较，发现联用进样模式以后，有机酸检出限降低，检测信号显著增强。在最佳检测条件下分别测定了两种方法的线性范围和检出限，从表可以看出，相比检测灵敏度得到了提高，富集倍数在倍之间，适用于检测分析微量有机酸。表和的比较目标分析物线性范围检出限线性范围检出限富集倍数草酸酒石酸甲酸拉檬酸苹果酸乳酸丁二酸乙酸 浙江工商大学硕士学位论文富集倍数上式中，富集进样下的峰高；：正常进样下的峰高；两种进样方式的浓度比。方法的线性关系以有机酸标准溶液进行线性实验，取个线性范围内的浓度，每个浓度平行测定次，以平均值作为计算结果，以各组分的峰面积和相应浓度作图，得到种有机酸的线性方程和相关系数，结果见表。由表可知，种有机酸呈现良好的线性关系。表有机酸标准溶液的线性实验结果目标分析物线性方程相关系数草酸酒石酸甲酸檬酸苹果酸乳酸丁二酸乙酸加标回收试验以市售荆条蜜为实验原料，称取样品，添加不同浓度的标准溶液后，经祸旋振荡器混句，定容至，过滤超声脱气后进样检测。对于加标后含量在线性范围内的，添加量为样品含量的、以及样品中未检出的或者会超过线性范围的选择线性范围内的高、中、低三个浓度作为添加量，做次平行实验，计算得到平均值作为结果。由表可知，种有机酸的回收率在—之间，在，结果符合相关规定。 浙江工商大学硕士学位论文表样品加标回收试验结果（目标分析空白测定值加标量测定量回收率％物±草酸±±±±酒石酸±±±甲酸土±±梓檬酸±±±±苹果酸土±±±乳酸土±±±丁二酸±±±±乙酸±±± 浙江工商大学硕士学位论文精密度试验由表可知，日内精密度整体上优于日间精密度，保留时间精密度优于峰面积的精密度，所有精密度都在以内，符合相关检测要求。表精密度试验结果目标分析物日内精密度（，日间精密度，保留时间含量保留时间含量輔？申酸朽；濛乳酸了二方法的应用用所建立的方法来检测实际蜂蜜样品中的微量有机酸含量，发现其中甲酸只在锻树蜜中可定量，在其他蜂蜜中未检出或不可定量；种蜂蜜中均含有草酸，且含量较高。检测结果见表，苹果酸在荆条蜜中含量较高外，在其他蜂蜜中含量均比较低；一个品种不同牌子的蜂蜜含有的有机酸差别也很大，如两种锻树蜜之间草酸含量存在较大差别；椴树蜜号和黄苗蜜样品中含有的有机酸种类较少；后期加工过的市售蜂蜜中有机酸的含量普遍比未经过加工的有机酸含量高，这可能与后期加工中的添加有关。 浙江工商大学硕士学位论文表蜂蜜中有机酸含量分析草酸酒石酸甲酸貯樣酸苹果酸乳酸丁二酸乙酸物（±±±±锻树土土洋槐±±土±±土养麦黄苗只氏乂±±±士土土油菜±土土士荆条“±±土士土士洋槐；±土土：土土土荆条的土■土土±士浦■注：—未检出，未定量。蜂蜜的成分差别主要取决于蜂蜜的植物来源和其他外部影响因素例如季节、环境和加工过程等。有机酸作为蜂蜜中已知的微量活性成分，含量较低，虽然不能单独影响蜂蜜品质，但能够与其他成分如糖类、酷酸类、黄酮类等共同作用来影响蜂蜜的品质。通过对不同蜂蜜样品中包括有机酸在内的各种成分的种类和含量进行定性和定量测定，找到其成分间的细小差别，结合指纹图谱技术，建立蜂 浙江工商大学硕士学位论文蜜的微量活性成分指纹图谱，以此来对蜂蜜的优劣进行质量监控，同时根据其成分的差异来追溯其产地。本章小结结合毛细管区带电泳间接紫外检测法和在线富集技术检测低分子量有机酸，并将该方法运用到实际蜂蜜样品中去，以二硝基苯甲酸为背景电解质，以十六烧基三甲基溴化铵为电渗流改性剂，样品经简单稀释过滤超声后，用于毛细管检测。种有机酸在内实现了分离，富集倍数在之间，加标回收率在之间，标准偏差在以内，精密度符合要求，结果令人满意。 浙江工商大学硕士学位论文第章毛细管区带电泳法检测蜂蜜中的横胺类药物横胺类药物，是指一类具有氨基苯横醜胺结构的合成抗菌药物，因其具有药效好，性质稳定，使用简便，易于生产等优点，被广泛用于预防和治疗蜜蜂幼虫病然而，不正确的用药时间、用药量和用药方式都会导致横胺蓄积在蜜蜂体内，进而导致蜂蜜中横胺的残留。人们食用有药物残留的蜂蜜后，礎胺类药物容易蓄积在人体内，使很多细菌产生抗药性，对人体的身体健康造成很大的危害，可能引起过敏反应、白细胞减少症和抗药性”。从己有文献资料来看，磺胺类药物残留的检测方法主要包括酶联免疫法、薄层色谱法（【、高效液相色谱法，和液相质谱联用法【。酶联免疫法特异性强、操作简便、灵敏度高，适用于大批量样品检测。薄层色谱法可以作为半定量法对横胺进行分析，但是需要高超的制板技术和点样技术，重现性较差。等用薄层色谱法检测猪肉中种横胺类药物残留。。等人采用检测法测定了蜂蜜中种横胺类残留，这种检测法需要专一的柱后衍生系统。等采用法检测分析了鲑鱼中的种磺胺类化合物。【等采用技术分离了鸡蛋中种磺胺类药物，并且测定了其药残含量。虽然液相色谱及其质谱联用技术己成为能够准确测定食品中横胺类抗菌药物残留的方法，但是检测仪器成本较高，一般实验室很难配备，而毛细管电泳法快速、操作模式多样化、样品和溶剂消耗少、费用低，使它在磺胺类药物的分析检测中发挥重要作用。样品的制备是药物残留检测的关键。一般都采用液液萃取来净化提取擴胺类药物。等用液液萃取对绿茶和表水中的横胺类药物以及牛奶中的种磺胺类药物残留进行了净化和提取。张海琪【⑷等先用乙腈提取后用二氯甲焼提取的方式提取大黄鱼中的中横胺类药物，发现可以大大的提高提取效率。但液液萃取对提取液的的要求严格，重复性较差。等用了固相微萃取（分析检测了肉制品中的横胺类残留，方法相对标准偏差较大，检出限较高。本研究结合了固相萃取前处理和毛细管电泳区带电泳直接紫外法来检测横胺类药物，讨论缓冲液浓度、和分离电压等条件对分离效果的影响，确定最优电泳条件，对检测方法进行验证，并用于对蜂蜜中横胺类药物残留的评价中，取得 浙江工商大学硕士学位论文了较好的效果，拓展了磺胺类药物的检测方法。材料与仪器试验材料洋槐蜜、油菜蜜、荆条蜜、菊花蜜和枇杷蜜样品购于杭州各大超级市场；横胺批徒擴胺二甲基嘧徒磺胺甲基啼唯磺胺嘧徒，擴胺醋醜钠（，分析纯（购于百灵威；磷酸氢二钾、磷酸，氢氧化钠均为分析纯（购于阿拉丁）；甲醇，色谱纯（购于杭州汇普化工有限公司）；超纯水，电阻率为的水。试验仪器毛细管电泳仪（，二级管阵列（检测器（安捷伦科技有限公司）；裸露未涂层的石英毛细管柱（河北锐洋色谱器件有限公司）；型润旋振荡器（北京京辉凯业科技有限公司）；超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；氮吹仪（杭州瑞城仪器有限公司）；固相萃取柱；—次性针式尼龙膜过滤器（杭州常胜科教器具厂）；型超纯水仪（购于美国公司）；型精密电子天平（上海高致仪器有限公司）。试验方法磺胺标准溶液配制标准品的纯度折算成纯品后，称取相应的质量，用超纯水溶解，精确配制成的标准溶液，其它各低浓度溶液由此母液稀释而得。样品预处理称取蜂蜜，用水稀释至以的速度通过丨：固相萃取柱，然后用的甲醇清洗柱子，被保留的目标化合物用甲醇进行洗脱，洗脱液在下氮气吹干，之后复溶于中，超声脱气后用于毛细管电泳检测。 浙江工商大学硕士学位论文预柱活化固相萃取柱在使用前需按照以下步骤进行活化，采用一次性注射器手动活化固相萃取柱，步骤如下：（用甲醇活化柱子，速度用超纯水冲洗柱子，推动速度平放小柱取样品溶液缓慢推入小柱中，收集萃取后的样品。注意：在整个活化过程及萃取过程中注射器推动速度都不能太大，否则容易冲坏固相萃取柱的填充材料，影响萃取效果。毛细管电泳条件参照仪器运行条件，每次进样间的冲洗顺序为氢氧化钠（、水（、缓冲液（实验采用有效长度的毛细管柱，实验在室温下（。下进行，压力（进样，分离电压为，检测波长为。结果与讨论运行缓冲液浓度的选择提高运行缓冲液的浓度会减小电渗流从而改善分离效果，但浓度过大容易产生大量的焦耳热，降低柱效。固定憐酸氢二钾溶液的值为，考察缓冲液浓度在之间对分离的影响。如图所示，浓度增大，分离时间延长，这是因为由于溶液浓度增大，毛细管壁与溶液间的双电层厚度减小，电渗流减小，同时溶液點度也变大，引起目标分析物的迁移速度减缓。综合考虑分析时间、响应值和峰型等因素，选择最佳运行缓冲液的浓度为。 浙江工商大学硕士学位论文：藝■■——扣：卜‘？：：。广一初—‘？‘■‘‘‘图缓冲液浓度对分离的影响注：色谱条件：温度设定为。，压力进样，分离电压为，检测波长为。分离值得选择运行缓冲溶液的直接影响着电渗流的大小，从而影响分离的效果不仅能影响目标分析物的有效滴度，还能控制电渗流和分析物在毛细管壁的吸附水平。胺类药物存在两种离解平衡，如图所示，在酸性环境下呈阳离子；在碱性环境下呈阴离子。丁丁图横胺类药物离解平衡示意图在本实验中所选范围内，几种横胺都带负电荷，以阴离子形式得到分离。实验考察了在范围内的分离情况。从图可以看出，几种擴胺得不到有效分离。在时，几种擴胺虽得到了分离，但横胺醋醜钠迁移时间过长。增大到时，虽然迁移时间变短，但横胺耽晾信号响应弱，峰面积小。在时，磺胺二甲基瞎卩定和横胺甲基瞎定出现重峰，且横胺啦咱没有出峰。 浙江工商大学硕士学位论文从绝对迁移时间和分离度两方面综合考虑，最终选择为的运行缓冲液。丨丨；⑦」！。柏！■：丨⋯—剛。！！图不同对分离的影响注：色谱条件如分离电压的选择跟传统电泳相比，毛细管电泳的优势在于它能有效散热，因而能外加高电压，升高外加电压，能够改善目标分析物的迁移时间和分离度，但是电压过高，又会造成焦耳热过大，引起柱效和分离度的降低本实验比较了分离电压在和下横胺的分离情况，发现电压过高，产生大量的焦耳热，电流过大，体系运行就会不稳，重现性差，甚至在管中会产生气泡，无法实现分离。经过实验比较，选择比较合适的分离电压为。横胺的毛细管电泳图在最佳分离条件下得到标准品和样品的毛细管电泳图，由图标准品毛细管电泳图可知，种横胺实现了基线分离，顺序依次为横胺比唾，横胺二甲基嗜徒，横胺甲基瞎定，磺胺嚼唾，磺胺醋醜钠。由样品毛细管电泳图可知，样品中含有擴胺卩比徒、横胺甲基嚼唾。 浙江工商大学硕士学位论文？！丨“丨：：；■‘‘】图礎胺混合标准溶液的毛细管电泳图￡：’一——―“‘—‘‘！‘―‘‘，—图样品中橫胺的毛细管电泳图注：購胺卩比喷購胺二甲基嘧定横胺甲基喷唆黄胺啼定擴胺醋醜钠。缓冲液组成：隣酸氢二钾，色谱条件：分离电压，压力进样，，检测波长。方法的线性关系以磺胺标准溶液进行线性试验，吸取适量储备液，配制成个不同浓度的溶液。在最佳电泳条件下进行含量测定，每个浓度平行测定次，以平均值作为计算结果，用各组分擴胺类药物的峰面积与浓度作图，得到相关系数和线性方程，结果见表。由表可知，种横胺类药物在线性范围内呈现良好的线性。 浙江工商大学硕士学位论文表磺胺标准溶液的线性试验结果目标分析物线性范围（线性方程相关系数擴胺啦唆横胺二甲基啼徒横胺甲基啼横胺啼旋購胺醋钠加标回收试验以市售洋槐蜜为实验原料，称取样品后，添加的磺胺标准溶液混勾，再按上述方法处理后测定其中各磺胺类药物的含量。表样品加标回收试验结果（空白测定加标量测定量目标分析物回收率％士磺胺比唆磺胺二甲基喃唆磺胺甲基土啼唯±土横胺瞎徒横胺醋酸土土钠注：擴胺二甲基啼徒被基质杂质峰掩盖。精密度试验制备蜂蜜样品，加标后的样品溶液平行测定次，进行日内差和日间差的检测，日内差为同一天内每隔小时测定次，日间差为连续测定天，按照的实验条件进样后，以药物的保留时间和峰面积的值作为精密度指标；结果见表。由表可知，各组分保留时间的精密度优于峰面积，日内精密度优于日间精 浙江工商大学硕士学位论文密度，所有精密度在以内，表明该方法具有良好的重现性。表精密度试验结果日内精密度日间精密度目标分析物保留时间含量保留时间含量礎胺卩比徒擴胺二甲基啼唾磺胺甲基啼徒擴胺啼徒磺胺醋酰钠方法的应用为了考察所建方法的适用范围，同时也为了调查几种市售蜂蜜的药残含量情况，本实验对从超市买来的个蜂蜜样品进行了检测。检测结果见表。每种蜂蜜基本只含种磺胺；其中菊花蜜中的总磺胺类药物含量最高，含磺胺啼徒和擴胺醋酰钠；擴胺耻徒和擴胺二甲基啼唆分别在油菜蜜和荆条蜜中可定量，且含量较低；擴胺喃徒在洋槐蜜、菊花蜜和枇杷蜜中均可测得。表蜂蜜中磺胺含量磺胺耻唾横胺二甲基磺胺甲基喃擴胺哦喷横胺醋醜钠分析物嘧唾唾洋槐蜜±±油菜蜜±±荆条蜜±±菊花蜜±±批杷蜜±注：洋槐蜜中的礎胺二甲基啼徒被杂质峰掩盖，—未检出，—未定量食用磺胺类药物超标的食品，会导致泌尿系统损害、过敏反应、抑制白细胞生成等危害。国际食品法典委员会（和欧美等大多数国家规定食品和饲料中的总量或者横胺二甲基瞭唆等单个的含量不得超过，日本规定食品中不得检出。近年来，因为药残问题严重，在很大的程度上限制了蜂蜜销售和出口。从实验中发现，市售蜂蜜普遍含有横胺类药物，且含量已经超过 浙江工商大学硕士学位论文国家标准，说明现在蜂蜜中的药物残留问题十分严重，必须加强残留的检测及监控，建立有效的磺胺类药物残留的检测方法。本章小结利用高效毛细管电泳建立了蜂蜜中常见的抗菌类物质擴胺的检测方法，并结合固相萃取技术，以憐酸氢二钾为缓冲试剂，并采用该方法检测了种市售蜂蜜中横胺类药物的残留，种擴胺类药物在内实现分离，在范围内呈现良好的线性，相对偏差在以内，精密度均符合相关规定。 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文第章毛细管区带电泳法检测蜂蜜中的多酣多般是从天然植物中提取的多经基紛类衍生物的总称。多酷类化合物主要分为两大类：单体多紛和多体多粉。单体多紛主要包括黄酮类、没食子酸、绿原酸等，多体多酌统称为单宁类物质，属于植物次生代谢产物】。蜂蜜的抗氧化性跟多酷类化合物息息相关，蜂蜜的植物来源不同，所含的多酷类化合物也有很大的差别，所以多酷可以作为合适的指标用于鉴定蜂蜜的植物来源和质量控制。目前，食品中多酌类化合物的测定方法主要有高猛酸钾滴定法、光谱测定法、电化学分析法【】和色谱分析法高猛酸钾滴定法是最为传统的方法，此法虽然简便易行，但是高猛酸钾是强氧化剂，被测样品中的还原性物质一般都能被氧化，所以该法误差偏差较大。光谱测定法主要用于测定食品或其他植物中多酹的总含量。曹讳等人采用比色法来测定蜂蜜中总酷酸的含量，但是蜂蜜中多酷含量低，实验结果偏差较大，并不适用。电化学法虽然能检测微量多粉，但是商用的电化学检测器较少，一般都需要自组安装。色谱分析法由于具有选择性好、分析速度快、分离效率高等特点，适用于多酷类化合物的分析检测。孙雯等建立高效液相色谱法来测定茶叶中的种茶多勘，并且将该方法用于测定当地的中茶叶中的茶多酸含量。本文选用儿茶素、绿原酸、丁香酸、阿魏酸、香草酸和咖啡酸为研宄对象，仅对蜂蜜做稀释和过滤的简单处理后进样，通过考察运行缓冲液浓度、分离值和分离电压，建立了毛细管区带电泳直接紫外检测法，对蜂蜜中多酌含量进行快速方便地分析测定。材料与仪器试验材料菊花蜜、洋槐蜜、荆条蜜、油菜蜜、枇杷蜜样品购于杭州各大超级市场；儿荼素（绿原酸（丁香酸（，阿魏酸（香草酸（，咖啡酸（，分析纯（北京百灵烕科技有限公司）；硼砂为分析纯（购于阿拉丁）；超纯水，电阻率为，的水。 浙江工商大学硕士学位论文试验仪器毛细管电泳仪（二级管阵列（检测器（安捷伦科技有限公司）；裸露未涂层的石英毛细管柱（河北锐沣色谱器件有限公司）；型润旋振荡器（北京京辉凯业科技有限公司）；超声清洗器（昆山未创超声仪器有限公司）；—次性针式尼龙膜过滤器（杭州常胜科教器具厂）；型超纯水仪（购于美国公司）；型精密电子天平（上海高致仪器有限公司）。试验方法样品前处理稀释蜂蜜样品适宜倍数后，经滤膜过滤，然后超声脱气后进样检测。毛细管电泳条件参照的仪器运行条件，每次进样间的冲洗顺序为氢氧化钠（、水、缓冲液（。实验采用有效长度的裸露未涂层毛细管柱，实验在室温（°下操作，压力（进样检测波长为，分离电压为。结果与讨论缓冲液浓度的选择硼酸盐常被用来作为毛细管电泳的缓冲溶液，这是因为在碱性溶液中，硼酸盐能与多酷中的经基螯合生成配位阴离子从而增加各组分的溶解性，减少了吸附造成的不良影响】。本研宄选择硼砂作为运行缓冲液，考察了在时，不同浓度的硼砂缓冲溶液对分离的影响。从图中可以看出，随着缓冲溶液浓度增大，虽然迀移时间也变长，但分离得到改善，采用的硼砂缓冲液（为最佳缓冲浓度。 浙江工商大学硕士学位论文：‘弓。■一一：，一——、—■■—■一—一■一■——■“■—■⋯！‘⋯：”藝—‘—■■■■■■‘⋯：⋯气—、—“■一‘‘图缓冲液浓度对分离的影响注：色谱条件：检测波长压力进样，，分离电压。分离值的优化运行缓冲液的不仅影响各组分的离子化程度而且还影响电渗流的大小。实验讨论了在、、下的擴胺分离情况，不同缓冲溶液下的毛细管电泳图谱如下图所示。实验发现在低于时，不能实现基线分离，然而过大时，虽然能实现分离，但是噪音大，基线粗，而且迁移时间也延长，容易导致分析物被氧化，无法实现分离。故实验采用为的硼砂缓冲液。 浙江工商大学硕士学位论文請丨！■■对■■■■孔、⋯一；丁■■■■—丨丨；丨■—‘’九“——““‘‘‘图对分离的影响注：色谱条件如。分离电压的选择分离电压决定电场强度，影响电渗流的速度和电泳速度，继而影响各目标分析物的迁移时间。实验考察了在范围内分离电压对分析物迁移时间的影响。结果表明随着分离电压的升高，各组分的迁移速度加快，缩短了分析时间。电压在时没法实现分离，比较在和下各组分的峰型、噪音、灵敏度和分析时间等因素，选择为最佳分离电压。 浙江工商大学硕士学位论文丨‘？！丨丨丨‘■’、■‘、‘—，；。■‘丨■■■—■“■丄■■■■、丨丨图不同电压对分离的影响在最佳的实验条件下得到标准品的毛细管电泳图，由图标准溶液毛细管电泳图可知，种多酷实现了基线分离，分离顺序依次为儿茶素、绿原酸、丁香酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸。！丨〖‘“一”冒一—各‘‘图多盼混合标准溶液的毛细管电泳图注：儿茶素绿原酸丁香酸阿魏酸香草酸咖啡酸。缓冲液组成：硼砂，色谱条件：分离电压，压力进样，检测波长。 浙江工商大学硕士学位论文标准曲线及检出限吸取适量标准储备液，配置成一系列适宜浓度的溶液，按的电泳条件进行含量测定，每个浓度平行测定次，以平均值为计算结果，根据倍基线噪音计算仪器对种多紛的检出限。其线性方程及相关系数见表。表多酌标准溶液的线性方程和检出限检出限线性范围目标分析物猶方程贼―儿茶素绿原酸了香酸阿■魏酸香草酸咖啡酸精密度实验由表可知，所有精密度均在以内，符合相关检测要求，结果令人满意。表精密度试验结果曰内精密度日间精密度，目标分析物保留时间含量保留时间含量綠绿原酸了胃阿■冑冑香草酸二自冑样品分析在最佳电泳条件下，利用毛细管电泳检测蜂蜜中的多勘，均未检出种多紛，加标回收实验结果见表，种多齡的加标回收率在相对偏差在之间。 浙江工商大学硕士学位论文表加标回收结果（空白测定值加标量测定量回收率目标分析物儿茶素土绿原酸土丁香酸土阿魏酸土香草酸土咖啡酸±注：未检出多酷的含量多少直接影响蜂蜜的抗氧化活性，蜂蜜中的多殷类化合物含量一般在左右，含量较低。而一般色谱法检测蜂蜜中的多酷，都要经过繁杂的萃取过程。本实验首次尝试简单的稀释处理直接进样来测，虽未测得多紛，但是可以通过后续的在线富集技术来提高灵敏度，可以使多酌的检测变得更加方便。本章小结建立了毛细管区带电泳紫外检测法分析多种植物多酷，为的硼砂作为缓冲试剂，各种多酌在内实现分离，回收率在之间精密度在检测要求之内，结果令人满意。 浙江工商大学硕士学位论文 浙江工商大学硕士学位论文第章总结、创新点与展望总结本实验建立了蜂蜜中有机酸以及横胺类药物和植物多酌的毛细管区带电泳检测法，能更好的对蜂蜜的品质进行评价的同时，也为蜂蜜的成分分析和药残检测提供了新的检测手段。具体结论如下：结合了毛细管区带电泳间接紫外检测法和在线富集技术即柱头场放大技术，比较了和，并将该方法运用到实际蜂蜜样品中，在未涂层石英毛细管柱中，以，二确基苯甲酸为背景电解质（甲醇和为分离介质添加剂，先用压力引进一段水柱，时间为后釆用电动进样方式进样，进样电压为，样品经简单稀释超声脱气处理后，直接进样检测。各组分有机酸在内实现基线分离，加标样品回收率在之间，相对标准偏差在以内，符合检测要求。釆用毛细管电泳直接紫外检测法来分析多种横胺类药物，结合固相萃取前处理技术，以的磷酸氢二钾（为运行缓冲液，样品经固相萃取柱萃取提取用膜过滤，超声后用于毛细管检测。种磺胺在内实现分离，方法线性良好，加标回收率在，精密度符合要求，重现性良好。建立了毛细管区带电泳直接紫外法来分离检测种多粉类化合物，以硼砂为运行缓冲体系，并将所建立的方法用于分析多种蜂蜜，种多驗类化合物在内实现分离，该检测方法线性良好，回收率在。结果令人满意。创新点、在毛细管区带电泳间接紫外法的基础上联合在线富集技术即柱头场放大技术进样来分析检测小分子有机酸，有机酸在蜂蜜中的含量较低，结合在线富集技术与毛细管电泳技术有助于提高检测灵敏度，该方法还未曾见于报道。、实现了毛细管区带电泳用于蜂蜜中磺胺类药物的检测，为蜂蜜的药物残留检测提供了一种新的检测方法，技术第一次尝试用于蜂蜜中購胺类药物的残留检测。 浙江工商大学硕士学位论文、蜂蜜中的多酷类化合物含量偏低，首次尝试用毛细管电泳在未经过萃取提取富集而是直接简单进样的方式来检测。展望本实验建立了蜂蜜中低分子有机酸、磺胺类药物以及多酷类化合物的毛细管电泳检测方法，课题取得了一些基础科研成果，但还具有一定的延展性，后续还能做进一步研宄，主要包括：、毛细管区带电泳还有其他在线富集方式，可以尝试不同的在线富集方式，期望取得更高的灵敏度与更好的选择性。尤其在多酷检测上，可以利用富集技术，期望在简单样品处理后，也能检测出蜂蜜中的多酌。、高效毛细管电泳技术的应用范围很广，不仅在基础科学中应用广泛，在临床医学和生命科学等领域也有较广应用，可以与聚合酶链反应（联用用于基因缺陷和突变基因的检测；还可用于片段及序列分析。、不同旳产品，它们本质上的差别是所含化学成分及其含量不同，可以利用毛细管电泳建立蜂蜜中各种成分的指纹图谱来评价蜂蜜品质的优劣，同时也可根据其毛细管电泳色谱图来研宄蜂蜜产地特征性差异。 浙江工商大学硕士学位论文参考文献，，秦元东，张庆民漫谈蜂蜜的药理作用及应用山东医药工艺，曹讳，陈卫军，宋纪蓉不同种类蜂蜜总紛酸含量测定和抗氧化作用的研究食品科学，，，，，，，黄东萍，蒋贵发，周文誉，等几种蜂蜜对幽门螺旋杆菌的体外抗菌作用时珍国医国药，，，，，，，， 浙江工商大学硕士学位论文罗国安，王义明毛细管电泳的原理及应用色谱，，，，陈义毛细管电泳技术及应用北京：化学工业出版社，陆少红，龙湘犁毛细管电泳在生物领域的应用沈阳航空工业学院学报，，啦，，】刘展眉，熊绪杰，吕钱江，等毛细管电泳及其在天然产物分离分析中的应用进展仲恺农业技术学院学报，，康经武，阮宗琴，欧庆瑜毛细管电泳手性分离进展化学进展化学进展，，黄子良，黄红军毛细管区带电泳分析水中阳离子理化检验化学分册，，，，—，—连冬生，张相年，赵树进毛细管电泳场放大技术研究分析仪器，李利军，郝学超，李彦青，等场放大进样胶束电动色谱法测定胡黄连中的香草酸、肉桂酸和阿魏酸分析科学学报，，李娟，陈新等场放大进样毛细管区带电泳法高灵敏检测三聚氰胺分析测试学报，，，，，叩 浙江工商大学硕士学位论文，，—干宁，葛从辛毛细管区带电泳分离电化学检测果汁中有机酸营养学报，，，，（，，，，，，闫玲玲，杨秀芬蜂蜜的化学组成及其药理作用特种经济动植物，，，，， 浙江工商大学硕士学位论文，，，，，；，诒，，，，，，，，。 浙江工商大学硕士学位论文，，，；，，，，，，，；，，，，，，，， 浙江工商大学硕士学位论文，，，人，，，，，，，，王翔，邓晓军，宋国新，等食品中磺胺类兽药残留前处理技术的研宄进展食品科学，云鹏，傅承光高效液相色谱在磺胺类药物分析中的应用河北大学学报自然科学版—冯刚，张俊升，徐学前，等法测定蜂蜜中的磺胺类药物残留量现代畜牧兽医，，韩凤丽，董紫凌，宋平，等饲料中磺胺类药物的薄层色谱检测方法饲料研究，， 浙江工商大学硕士学位论文，，，，，，，，，，，—，张海琪，宋琍琍，徐晓林，等液相色谱串联质谱法同时测定大黄鱼中种磺胺类药物残留分析化学，，牟世芬，刘克纳，丁晓静离子色谱方法及应用北京：化学工业出版社，王丽，张丽，励建荣免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐中国食品学报， 浙江工商大学硕士学位论文叩，，，，邱涵，陈素俭，叶飞云髙效毛细管电泳法测定复方磺胺甲嘿唑片中磺胺甲嚼唑和甲氧苄啶的含量中国现代应用药学杂志，，金莹，朴爱东植物多酚的结构及生物学活性的研究中国食物与营养，，，曹炜，索志荣比色法测定蜂蜜中总酚的含量食品与发酵工业，，：雷萍，林森毛细管电泳■电化学方法检测黄酒中多酚物质，孙雯，张铁，董学畅等高效液相色谱法测定荼叶中多酚云南化工，高向阳新编仪器分析北京：科学出版社，易湘茜，韦保耀，滕建文，等高效液相色谱法测定菠萝中多酚类化合物食品与发酵工业，，，：，， 浙江工商大学硕士学位论文附录缩略词表英文缩写英文全称中文译名毛细管电泳背景电解质电滲流十六焼基三甲基溴化按，二硝基苯甲酸场放大进样离子色谱高效液相色谱气相色谱近红外光谱横胺类药物酶联免疫法薄层色谱法固相微萃取横胺批唳磺胺二甲基嘧啶磺胺甲基嘧唆磺胺瞭口定横胺醋酰钠 浙江工商大学硕士学位论文致谢本文是在导师王丽的悉心指导下顺利完成的。在论文选题、实验方案的制定和实施、论文写作中导师给予了悉心指导。在生活上，也给予无微不至的关心与帮助，导师渊博的知识、求真务实的工作态度和对我国食品事业、教育事业及研宄事业的责任感给我留下了深刻的印象。在此谨向导师致以衷心的感谢和崇高的敬意。衷心感谢师姐李娟、艾颖超、张晓敏，同窗杨蕾、蒋瑨、潘炎在两年半的学习生活中给予的鼓励和帮助，特别感谢师妹孙艳、刘琦，师弟许磊、尤勇在实验中给予的诸多支持与帮助。特别感谢家人在我求学期间在精神上给予的大力支持和物质上的鼎力资助，以及在我失意无助时给予的无微不至的关心和照顾。难忘曾给过我无私帮助的敬爱的老师，难忘和我一起生活过的兄弟姐妹。值此论文完成之际，向所有关心和帮助过我的老师和同学致以最诚挚的谢意！衷心祝愿我的家人和朋友平安、幸福。最后，衷心感谢参与本论文评阅的各位专家及答辩委员会的专家。黄益姣年月于浙江工商大学 浙江工商大学硕士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：日期：年丨月妁日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和―，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相“致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：导师签名：日期：上丨「年月日