蜜蜂肠道菌群多样性及其影响因素研究 115页

密级：论文编号：中囯农业科学院学位论文蜜蜂肠道菌群多样性及其影响因素研究DiversityandInfluencingFactorsofGutMicrobiotainHoneybees博士研究生：郭军指导教师：吴杰研究员申请学位类别：农学博士专业：特种经济动物饲养研究方向：特种经济动物种质资源保护与遗传育种培养单位：蜜蜂研究所研究生院2015年5月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文蜜蜂肠道菌群多样性及其影响因素研究DiversityandInfluencingFactorsofGutMicrobiotainHoneybees博士研究生：郭军指导教师：吴杰研究员申请学位类别：农学博士专业：特种经济动物饲养研究方向：特种经济动物种质资源保护与遗传育种培养单位：蜜蜂研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationDiversityandInfluencingFactorsofGutMicrobiotainHoneybeesPh.D.Candidate:GuoJunSupervisor:WuJieMajor:TheSpecial-typeEconomicAnimalsRearingSpecialty:SpecialeconomicanimalgermplasmresourcesandgeneticbreedingMay2015 本研究由以下项目资助：1、中国农业科学院科技创新中心工程(No.CAAS-ASTIP-2015-IAR)2、国家蜂产业技术体系建设专项（CARS-45）3、公益性行业(农业)科研专项课题(201203080-4)4、中国农业科学院基本科研业务费预算增量项目（2015ZL001）5、引进国际先进农业科学技术计划（948项目）（No.125161029） 独仓刂性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。r″日研究生签名:上时间:冫引年r尸关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名:纟弘时间:夕丬r年r氵"日导师签名:时间:D矽r歹年r月彡拍/ 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目蜜蜂肠道菌群多样性及其影响因素研究特种经济动物种质资论文作者郭军专业动物饲养研究方向源保护指导教师吴杰研究员培养单位(研究所、中心）蜜蜂所姓名职称单位专业签名评阅\人弩辩北京市农林科学院主张芝利研究员农业昆虫与害虫防治植物保护研究所席7^1中国科学院动物研张润志研究员农业昆虫与害虫防治究所中国科学院动物研朱朝东研究员动物信息科学.究所答秦玉川教授中国农业大学农业昆虫与害虫防治辩高希武教授中国农业大学农业昆虫与害虫防治委彩万志教授中国农业大学农业昆虫与害虫防治贝—^中国农业科学院蜜徐书法研究员特种经济动物饲养蜂研究所会议记录（秘书）杨嘉论文答辩时间地点2015年5月22日蜜蜂所会议室 摘要西方蜜蜂（ApismelliferaLinnaeus）和东方蜜蜂（ApisceranaFabricius）是我国饲养量最大的两个蜂种，也是我国农业和生态中至关重要的授粉昆虫，它们对保持生物多样性起着重要的作用。蜜蜂肠道中栖息着大量肠道菌群，它们与宿主形成复杂的共生关系，并通过各种方式影响宿主健康；在宿主的生长发育、营养、食物消化、免疫反应甚至抵抗病原菌等方面发挥了重要作用。我国地理环境的多样化为蜜蜂提供了广阔的栖息地，不同生境下产生的生物遗传变异和适应机制为蜜蜂肠道菌群提供了一个很好的特异性基因库。为了更好的揭示我国不同生态条件下蜜蜂肠道菌群的多样性现状，我们按照我国9大东方蜜蜂地方品种的分布范围进行采样，并对部分地区的西方蜜蜂进行采样，采用高通量测序技术等手段对我国境内的两种蜜蜂肠道菌群多样性及影响因素进行了研究。主要结果如下：（1）我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类对我国16个省市和地区共193只东、西方蜂样品（A.cerana,n=162;A.mellifera,n=31）的肠道细菌的16SrRNA基因的V3-V4区进行IlluminaMiSeq测序，并对所测细菌进行多样性分析，结果发现：我国东、西方蜜蜂肠道菌群也是有少数几个特定的共生菌组成，其中核心菌群的种类分布在8个门和12个属，优势细菌主要分布在Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidetes和Actinobacteria4个门；数量最多的4个属分别为Lactobacillus，Gilliamella，Snodgrassella和Bifidobacterium。（2）东、西方蜜蜂肠道菌群的组成存在明显差异东、西方蜜蜂肠道菌群的相对丰度在门水平上相对保守，核心细菌的菌群组成基本一致，没有显著差异（P>0.05）；基于肠道菌群的Alpha和Beta多样性分析结果证实东、西方蜜蜂肠道菌群存在较大差异。其中，东方蜜蜂的Gilliamella（P<0.05）和Flavobacteriaceae（P<0.001）的细菌显著高于西方蜜蜂，而西方蜜蜂的Bifidobacterium（P<0.05）、Acetobacteraceae（P<0.001）和Bartonella（P<0.001）的细菌显著高于东方蜜蜂。地理区域的差异对东、西方蜜蜂肠道菌群组成影响较小，东、西方蜜蜂蜂种的差异可能是引起肠道菌群组成差异的主要原因。（3）东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性差异东方蜜蜂三型蜂之间乳酸菌的差异最大，蜂王含量最高，而雄蜂最少，三者之间差异显著（P<0.01）。另外，Snodgrassella细菌在三型蜂之间存在显著差异（P<0.05），其中雄蜂中含量最高，而蜂王中含量最少。其余细菌的含量则差异不显著。通过主成分分析（Principalcomponentanalysis,PCA）和偏最小二乘判别分析（Partialleastsquaresdiscriminationanalysis,PLS-DA）发现，蜂王、工蜂和雄蜂样品的菌群组成明显分离，表明三型蜂之间的肠道菌群组成存在较大差异。（4）4种主要共生菌在东方蜜蜂体内的动态变化不同发育阶段的东方蜜蜂工蜂肠道菌群结构存在较大差异。1日龄、5日龄和10日龄工蜂肠道菌群结构区分明显，随着日龄增加，肠道菌群出现交叠现象，30日龄的菌群组成与其它日龄段可以区分开，但区分不明显；基于qPCR（实时荧光定量PCR）的分析结果表明，日龄对4种肠道菌的影响很大，4种细菌整体上的变化趋势非常相似，1日龄工蜂几乎检测不到4种种系型（phylotypes）的共生菌，5日龄细菌数量迅速增加，并在10-20日龄达到高峰，随后开始下降并在20-25或25-30日龄保持稳定，在30日龄时细菌下降到一个较低的水平。I （5）不同季节东方蜜蜂肠道菌群的多样性变化同一蜂群中核心菌Lactobacillus,Gilliamella,Snodgrassella和Flavobacteriaceae在不同季节表现出较高的稳定性，只有Bifidobacterium细菌在春秋之间存在显著差异（p<0.05）。基于PLS-DA分析表明，季节因素对东方蜜蜂肠道菌群具有一定的影响。（6）不同蜂箱饲养下东方蜜蜂肠道菌群的比较分析活框饲养和传统饲养方式的东方蜜蜂肠道菌群组成不存在明显的分离现象，说明不同饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群组成影响较小。（7）所有分组的肠道菌群的聚类分析基于属和OUT水平对所有分组的个体构建热图（Heatmap），结果发现所有东、西方蜜蜂样本，东方蜜蜂三型蜂样本，不同发育阶段以及不同季节和饲养方式下的东方蜜蜂样本的肠道菌群均被分为明显的两个簇。总上所述，我国东、西方蜜蜂肠道菌群同国外报道的一样都是由少数几个特定的共生菌组成；蜜蜂肠道菌群结构受蜂种、级型、日龄的影响较大，而地理区域和饲养方式对蜜蜂肠道菌群结构的影响较小，季节变化对同一蜂群的影响较大，而同一季节不同地区的东方蜜蜂肠道菌群组成无显著差异。东、西方蜜蜂的肠道菌群组成被分为明显的两个簇，且不受蜂种、三型蜂、日龄、季节和饲养方式以及地理区域的影响。关键词：东方蜜蜂，西方蜜蜂，肠道菌群，高通量测序，影响因素II AbstractApismelliferaandApisceranaarewidespreadandraisedinChina,theyarethemostimportantpollinators,providingextremelyimportanteconomicvalue.Ithasbeenreportedthatthegutofhoneybeesharborsalargenumberofmicrobiota,,andthesemicrobiotaplayanimportantroleinhost’sdevelopment,nutrition,fooddigestion,immuneresponseandevenpathogenprotection.ThebiologicalgeneticvariationandadaptationmechanismunderthevarialbleenvironmentcanprovideagoodspecialgenepoolforgutmicrobiotainA.cerana.WeinvestigatedthegutmicrobialcompositionofhoneybeesinChina,bysurveying193individualworkersintwospecies,usinghighthroughputsequencingof16SrRNAamplicons.Inparticular,weaddressedtheextentofvariationingutcommunitieswithinandbetweenhostspeciesandwhethersuchvariationisassociatedwithgeographic,castes,orenvironmentalfactors.Ourresultsshowed:（1）TheGutmicrobiotatypeofA.melliferaandA.ceranainChina.AsreportedinA.melliferafromotherconuntries,adultworkersofA.ceranaharboracharacteristicgutmicrobiotaconsistingofeightdistinctbacterialphylotypes.ThefourdominantphylaincludedProteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,andActinobacteriaandProteobacteriaandFirmicuteswerethemostdominantphyla.ThefourdominantgenerawereLactobacillus,Gilliamella,SnodgrassellaandBifidobacterium.（2）TheComparisonofbacterialcommunitybetweenA.ceranaandA.mellifera.WecomparedthevariationingutcommunitiesbetweenA.creanaandA.melliferafrom5differentprovinces(Hainan,Shandong,Gansu,BeijingandJilin)inthesameconditions(area,seasonandnectar)basedonthePCA,PCoAandPLS-DAplotsanalysis,theresultsindicatedtherewasadistinctcomparisonofgutbacterialcommunitiesbetweenA.creanaandA.mellifera.TheabundanceofGilliamella(P=0.024),Bifidobacterium(P=0.003),Flavobacteriaceae*(P<0.001),Acetobacteraceae*(P<0.001)andBartonella(P<0.001)inA.creanaweresignificantdifferencethanthatinA.mellifera.ButtherichnessoftheLactobacillusandSnodgrassellawerenosignificantdiferencebetweenthesetwospecies.（3）TheComparisonofbacterialcommunityamongqueen,workeranddroneinA.cerana.Wecomparedthegutmicrobiotaofqueen,droneandworkerinthesameapiaryanddifferentapiarybasedonthePCoAandPLS-DAplotsmethods,theresultsshowedthatthecommunitycompositionsofthegutmicrobiotawereclearlyseparatedamongqueen,droneandworkernomatterinthesameordifferentapiary.Inthegenuslevel,thecorebacterialofGilliamella,BifidobacteriumandFlavobacteriaceaewerenotsignificant(P=0.333,0.057and0.404resepectively)amongthem.TherichnessoftheLactobacillusinqueenandworkerwassignificanthigherthanthatinmale(P=0.003);ButtheSnodgrassellaindronewassignificanthigherthanthatinqueen(P<0.001)（4）DynamicofcharacteristicgutbacteriainA.ceranaacrossdifferentlifestageThebacterialcommunitystructurewasquitedifferentduringthedevelopmentstagesofA.ceranaworkers.BasedontheMiSeqsequencedatawefoundthebacterialcommunityseparateddistinctlyIII amongtheday1,5and10.Withtheincreaseofage,theoverlappingphenomenonoccurredfromdays15-30,andthebacterialcommunityofdays30waseasyseparatedwithotherdays,butnotobvious.UsingquantitativePCRwecharacterizedfourgutbacterial(Bifidobacterium,S.alvi,G.apicola,andLactobacillus)communitiesacrossthelifecycleofA.ceranafromlarvaetoworkers.Ourresultsindicatethatthepresenceandquantityofthesefourbacteriawerelowonday1,increasedrapidlyafterdays5,andthenpeakedduringdays10-20.Theystabilizedfromdays20-25ordays25-30,thendroppedtoalowlevelatday30.（5）TheComparisonofbacterialcommunityamongdifferentseasonofA.cerana.InordertocharacterizetheinfluenceoftheseasononthegutmicrobialdiversityinA.creana,weanalysedtheworkerbeesfromthesamecolonyinspring,summerandautumnduringthemainnectarflow.Wealsocomparedthebacterialcommunityinthedifferentconloniesamongdifferentprovincesandseasons.Forthesamecolony,theresultsillustratedadistinctcomparisonofgutmicrobiotaforallof18beesamples,thisfindingindicatedthattheseasonwasoneoffactorsinfluencingthesevariationofthegutbacterialcommunityinA.cerana.Forthecorebacteria,theLactobacillus,Gilliamella,SnodgrassellaandFlavobacteriaceaekeptstableduringdifferentseasons,onlytheBifidobacteriumwassignificant(P=0.030)higherinautumnthaninspring.Forthedifferentcoloniesamongdifferentlocations,ourresultsfoundthatthegutmicrobialcomparisonwasoverlapinthesameseasonbutindifferentlocation,thuswecouldconcludethatthegutmicrobialcommunitieswereaffectedbyseasonchangeofdiets,andthegeographicareawasnotmainlyinfluencefactor.（6）TheComparisonofbacterialcommunityamongdifferenthivetypeofA.cerana.Wecollectedthebeesamplesfromthemovableframehiveandunmovablehive,basedonthePCAandPLS-DAplotsanalysis,theresultsrevealedthestructureofthecommunitiesinthesetwotypeswerenotclearlyseparatedfromeachother,indicatedthehivetypemaynotinfluencethemicrobialcommunitiesofA.creanaindividuals.（7）TheHeatmapanalysisofbacterialcommunityforallgroupsWebuilttheHeatmapbasedonthegenusandOUTlevel,andfoundallgroups(species,caste,seasons,developmentalstageandhivetype)wereclusterintotwodistinctcommunitytypes.ThepresentstudyisthefirstreportonGutmicrobialdiversityofhoneybeesinChinabasedontheHighthroughputsequencingtechnologies.AndwefoundthattheadultworkersofA.ceranaharboredacharacteristicgutmicrobiotaconsistingofeightdistinctbacterialphylotypeswhichwerethesameasreportedinA.melliferafromotherconuntries.MicrobialcompositionoftheA.ceranagutcanbeinfluencedbymultifactors,includingspecies,caste,seasons,developmentalstageandhivetype.WediscoveredthatgutbacterialcommunitiesofA.ceranaandA.melliferawereclusterintotwodistinctcommunitytypes,basedoncompositionatthegenusandOUTlevel,andthistypewasnotaffectedbyspecies,caste,seasons,developmentalstageandhivetype.Keyword:Apiscerana,Apismellifera,gutmicrobiota,High-throughputsequencing,influencefactorsIV 目录第一章引言...................................................................................................................11.1昆虫肠道菌群概述...................................................................................................11.1.1肠道菌群的相关概念........................................................................................11.1.2研究昆虫肠道菌群的意义................................................................................11.1.3昆虫肠道菌群的定殖环境................................................................................21.1.4昆虫肠道菌的起源和进化................................................................................31.1.5昆虫肠道菌群的传播和维持...................................................................................31.2蜜蜂肠道菌群研究进展...........................................................................................41.2.1蜜蜂肠道菌群的研究历史................................................................................41.2.2蜜蜂肠道菌群的分类地位................................................................................41.2.3蜜蜂肠道菌群的特征........................................................................................41.2.4非核心菌群的概述............................................................................................61.2.5蜜蜂肠道菌群的分布........................................................................................81.3昆虫肠道共生菌的功能及影响因素.......................................................................91.3.1昆虫肠道菌群的主要功能................................................................................91.3.2昆虫肠道菌群的影响因素..............................................................................121.4昆虫肠道共生菌的研究方法.................................................................................141.4.1微生物多样性常用研究方法概述..................................................................141.4.216SrRNA简介................................................................................................141.4.3本研究中使用的研究方法简介......................................................................151.5总结和展望.............................................................................................................161.6研究目的、内容和意义.........................................................................................161.6.1研究目的..........................................................................................................161.6.2研究内容及技术路线......................................................................................161.6.3研究意义..........................................................................................................17第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类.................................................................18V 2.1材料和方法.............................................................................................................182.1.1样品采集..........................................................................................................182.1.2材料..................................................................................................................202.1.3实验方法..........................................................................................................202.2结果与分析.............................................................................................................222.2.1PCR电泳检测结果..........................................................................................222.2.2MiSeq测序质量分析......................................................................................232.2.3我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类..............................................................232.2.4我国东、西方蜜蜂肠道细菌的16SrRNA基因的α多样性.......................242.2.5我国东西方蜜蜂肠道细菌序列的系统进化分析..........................................242.3讨论.........................................................................................................................25第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响.....................................................................283.1材料和方法.............................................................................................................283.1.1样品采集..........................................................................................................283.1.2材料..................................................................................................................283.1.3实验方法............................................................................................................283.2结果与分析.............................................................................................................303.1.1我国东、西方蜜蜂肠道细菌多样性的比较分析..........................................303.1.2我国东、西方蜜蜂肠道细菌组分的比较分析..............................................313.1.3基于多元统计方法的东、西方蜜蜂肠道菌群结构的比较分析..................333.3讨论.........................................................................................................................35第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析.........................................................374.1材料和方法.............................................................................................................374.1.1样品采集..........................................................................................................374.1.2材料..................................................................................................................374.1.3实验方法..........................................................................................................374.2结果与分析.............................................................................................................374.2.1东方蜜蜂三型蜂肠道细菌多样性指数的比较分析......................................37VI 4.2.2中华蜜蜂三型蜂肠道细菌组分的比较分析..................................................384.2.3基于多元统计方法的东方蜜蜂三型蜂肠道菌群结构的比较分析..............394.3讨论.........................................................................................................................40第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化.....................................435.1材料和方法.............................................................................................................435.1.1样品采集..........................................................................................................435.1.2材料..................................................................................................................435.1.3实验方法..........................................................................................................445.2结果与分析.............................................................................................................455.2.1东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的Alpha多样性及组成分析..................455.1.2东方蜜蜂不同日龄肠道菌群的PCA分析....................................................475.1.3四种共生菌在不同日龄东方蜜蜂肠道中的动态变化..................................495.3讨论.........................................................................................................................49第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析.....................................................526.1材料和方法.............................................................................................................526.1.1样品采集..........................................................................................................526.1.2材料..................................................................................................................526.1.3实验方法..........................................................................................................536.2结果与分析...............................................................................................................536.2.1不同季节下肠道细菌多样性的比较分析.........................................................536.3讨论.........................................................................................................................58第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析.....................................................607.1材料和方法.............................................................................................................607.1.1样品采集..........................................................................................................607.1.2材料..................................................................................................................617.1.3实验方法..........................................................................................................617.2结果与分析.............................................................................................................617.2.1不同饲养条件下东方蜜蜂肠道细菌多样性的比较分析..............................61VII 7.2.2不同蜂箱饲养条件下东方蜜蜂肠道细菌组分的比较分析..........................627.2.3基于多元统计方法的东、西方蜜蜂肠道菌群结构的比较分析..................637.3讨论.........................................................................................................................64第八章全文结论.............................................................................................................678.1全文结论................................................................................................................678.2研究展望................................................................................................................67参考文献.............................................................................................................................68附录.............................................................................................................................81致谢.............................................................................................................................98作者简历...........................................................................................................................100VIII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称bpBasepair碱基对CTCyclethreshold进入指数增长阈值循环数LBLuriaBertanimediumLB培养基ODOpticaldensity光密度RDPRibosomalDatabaseProject核糖体数据库计划16SrRNA16SribosomalRibonucleicAcid16S核糖体核糖核酸V3-V4Variableregion3-4细菌第3、第4高度可变区DGGEDenaturingGradientGelElectrophoresis变性梯度凝胶电泳TerminalRestrictionFragmentLengthT-RFLP末端限制性片段长度多态性PolymorphismNJNeighbor-Joining邻接法PCAPrincipalcomponentanalysis主成分分析PLS-DAPartialleastsquaresdiscriminationanalysis偏最小二乘判别分析QIIMEQuantitativeinsightsintomicrobialecology微生物生态学定量分析qPCRquantitativepolymerasechainreaction荧光定量聚合酶链式反应BLASTBasiclocalalignmentsearchtool序列局部比对收索工具IX 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言自2006年爆发蜜蜂大量死亡的CCD（ColonyCollapseDisorder,蜂群衰竭失调）现象以来，美国、欧洲等国蜂群损失严重（Cox-Fosteretal.,2007），由此引发的授粉危机和经济损失引起了世界各国的重视，蜜蜂健康问题也开始成为各国政府、科学家和蜂农关注的热点（EvansandSchwarz,2011）。由于动物肠道中的微生物群落与宿主健康息息相关，它们和宿主相互协作从而增加整个机体的适应性（Hamdietal.，2011）；因此科学家开始从肠道微生物角度来研究肠道菌群与蜜蜂健康的关系（MohrandTebbe,2007;Martinsonetal.,2011;Sabreeetal.,2012;Moranetal.,2012;KochandSchmid-Hempel,2011a）。东方蜜蜂（ApisceranaFabricius）是蜜蜂属已知的9大蜂种之一（HepburnandRadloff,2011），与西方蜜蜂（Apismellifera）相比，东方蜜蜂具有耐低温、善于利用零星蜜源等一些独特的行为特征从而能很好的适应极端气候条件（Xuetal.,2009），也是农业和山区植物至关重要的授粉昆虫，它们对保持生物多样性起着重要作用。中华蜜蜂（ApisceranaceranaFabricius）（简称中蜂）是东方蜜蜂的亚种之一，长期以来，由于中华蜜蜂对我国各地气候、蜜源条件的适应，形成了一些抗逆性较强的地方优良品系（谭垦等,2005）。然而，近年来由于农药的使用、蜜源植物资源多样性的减少以及栖息地的减少、种间竞争、病原物和寄生虫的危害等影响中华蜜蜂的健康，并进一步导致中华蜜蜂种群数量下降（Lietal.,2012），因此中华蜜蜂肠道微生物多样性也面临丢失的可能。另外，人类对肠道菌群在蜜蜂体内的多样性和功能以及它们对生态干扰的反应却知之甚少，为此，开展我国本土蜜蜂肠道微生物的研究不仅为我国中蜂资源的研究应用奠定基础，也为中华蜜蜂种群多样性保护提供理论依据。1.1昆虫肠道菌群概述1.1.1肠道菌群的相关概念肠道菌群（gutmicrobiota或gutflora）是所有栖息于动物消化道内的微生物的统称（Rangberg,etal.,2012），也是由动物体内微生物相互作用最集中的群体（CummingsandMacFarlane,1997）。而共生菌（symbionts）通常是指存在长期互利共生关系的不同种的细菌（Breznak,2004）。在肠道中，一般正常寄居在体表或开放性腔道中的、并对宿主无害的细菌称为正常菌群，而在宿主体内短暂停留的细菌称为过路菌（Gordon,2001）。肠道菌群与其宿主经过漫长的协同进化，逐渐形成了一种互惠互利的共生关系。1.1.2研究昆虫肠道菌群的意义昆虫是陆地生态系统中生物数量、种类以及生态习性上最为丰富的动物类群，也是生物多样性最高的群体之一（Erwin,1982;Chapmanetal.,2013）。由于它们多样化的行为和取食特性，几乎陆地上所有的食物资源都能被昆虫消耗（Shietal.,2010）。昆虫多样化和进化的成功，在某种程度上部分依赖于各种有益微生物的贡献（EngelandMoran,2013），这些微生物与宿主有着密切的关系并参与到宿主生活的很多方面，如昆虫的生理和进化（Crottietal.,2012），改善宿主的营1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言养不良，帮助消化食物成分，还能防止捕食者、寄生虫和病原体入侵，协助种间种内通讯等（EngelandMoran,2013;KaltenpothandEngletal.,2014）。这些微生物主要以肠道菌群（gutmicrobiota）的形式聚集在消化道内，相互之间高度依赖，与宿主共生并参与调节宿主的各种生命活动，从而间接影响昆虫的健康（Shietal.,2010）。昆虫肠道菌群通常与农业、生态以及医药等多个领域的学科相关（EngelandMoran,2013）。昆虫作为一个很好的实验模型，已被用作建立细菌感染模型来研究人类疾病（Ishiietal.,2014）；另外，昆虫肠道菌群相对较小和简单，因此可以作为一种模式系统来研究肠道菌的分化（EngelandMoran,2013）。还可以利用这种模型来研究共生微生物影响媒介昆虫的疾病传播效率（Riccietal.,2012）或疾病的发生规律（Chouaiaetal.,2012），同时还可借助这一模型开展肠道共生菌与宿主相互作用的相关研究，进而促进人类对微生物与其宿主间互惠共生关系的了解（LemaitreandHoffmann,2007）。图1.1.昆虫肠道结构(a:引自（EngelandMoran,2013）；b:引自（Dade,2009）)Fig.1.1Generalizedgutstructureofinsects.1.1.3昆虫肠道菌群的定殖环境大部分昆虫肠道主要由前肠、中肠和后肠组成（Chapmanetal.,2013）（如图1.1）。前肠往往具有用于临时贮存食物的嗉囊（蜜蜂为蜜囊）；中肠是很多昆虫消化食物和吸收养份的主要部位；后肠（包括回肠和直肠）含有一定的含氮废物和食物残渣，为昆虫肠道菌群提供营养环境（EngelandMoran,2013），回肠主要功能是将中肠已消化吸收后的食物废渣和马氏管在血淋巴中截获的代谢废物送入直肠，而直肠的主要功能是贮存和排出粪便，还能继续吸收粪便中的水分（EngelandMoran,2013;黄少康,2011）。昆虫肠道因种类而变异很大，这也是昆虫适应各种特殊生态位和取食习惯的长期协同进化的结果，这种协同进化逐渐演化为昆虫特定肠道部位定居特定肠道微生物的现象（EngelandMoran,2013）。对于完全变态的昆虫来说，幼虫，蛹和成虫等几个阶段区分十分明显，在这一变态过程中肠和其它器官发生彻底变化，如幼虫肠道的完全消除和蛹期肠道蛹便被围食膜包裹等（Chapmanetal.,2013;EngelandMoran,2013）。然而，许多昆虫的肠道内具有特化的隐窝（crypts）结构，可以促进微生物的留存（Chapmanetal.,2013;EngelandMoran,2013）。此外，昆虫在达到成虫阶段前常蜕皮数次，因此最后一次蜕皮完成后，前肠或后肠壁形成了适于细菌定殖的表面结构（EngelandMoran,2013）。2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.1.4昆虫肠道菌的起源和进化很多昆虫都已进化出特定的肠道结构以便于各种肠道微生物群落的栖息，并能使宿主从肠道中吸取碳、氮、维生素以及一些低营养或从难以消化的食物中获取能量（如反刍动物和白蚁等从消化纤维素中获取能量）（Mackie,1997;BruneandFriedrich,2000）。而肠道微生物同时也进化成适应于这种营养丰富、稳定的肠道环境（Ohkumaetal.,2007）。一项对蚂蚁肠道菌群的研究表明尽管这些菌群相对简单，但常常包含一些与饲喂模式等相关的肠道共生菌，这表明蚂蚁家系与特定的共生菌具有协同进化的关系，这种关系在一些食草蚂蚁群体中表现的尤为突出（Andersonetal.,2012）。不同宿主之间肠道菌群的系统发育关系可以概括宿主的种系发生，这表明宿主与其肠道菌群之间有着长期的协同进化关系（Ochmanetal.,2010;Brucker,Bordenstein,2012）。1.1.5昆虫肠道菌群的传播和维持宿主不同代次之间传播微生物对有益细菌的保持至关重要。目前通过垂直传播维持特定共生菌的实例已在社会性或群居性昆虫中（如蜜蜂和白蚁）出现。在蜜蜂（A.mellifera）中，细菌的传播最初可能是在蜂群内通过交哺作用（trophallaxis）、粪食（coprophagy）行为中获得，此外，蜂群个体之间的交流（如哺育行为、梳理行为）可能更有利于细菌的水平传播，从而促使新出房工蜂形成稳定的肠道菌群（Köhleretal.,2012;MartinsonandMoyetal.,2012）。现已证实蜜蜂幼蜂出房后主要通过与蜂群内的其它成年工蜂的社会性接触获得相关共生菌（Martinsonetal.,2012）。研究表明，刚出房的工蜂缺乏细菌，从4-6日龄回肠（ileum）和直肠（rectum）中特定细菌群落开始大量增加，蜂巢中工蜂的典型细菌群落的形成需要哺育蜂或哺育蜂粪便物质的存在，此外，一些非核心菌群的典型菌群的建立需要工蜂在交哺行为或者存在蜂巢物质（如巢脾，蜂蜜，蜂粮）的情况下才会发生。一些革兰氏阴性核心菌群如Snodgrassellaalvi，Gilliamellaapicola，和Frischellaperrara的形成则需要哺育蜂或者后肠物质存在，而革兰氏阳性物种很容易通过蜜蜂暴露在蜂箱环境中传播（Powelletal.,2014）。一些社会性昆虫也能通过共享住所而获得有益菌，这些细菌可能通过动物与住所的接触而在种群中传播（Hughesetal.,2008）。非社会性昆虫中同种宿主之间肠道细菌之间的直接传播程度还不清楚。群居性昆虫（如蟑螂和蟋蟀）可在公共区域排便和摄取食物来传播细菌，这也证明了昆虫之间这些细菌是通过水平方式传播的（Woodburyetal.,2013;WoodburyandGries,2013）。独居性雌性蜂也可能通过在卵附近排便这一简单方式传播细菌到子代，让后代能够获得这些粪便中的细菌（EngelandMoran,2013）。可见，这种食粪或其它粪口途径对很多通过宿主-宿主之间传播微生物的动物（如蟑螂等）非常重要（Nalepaetal.,2001）。此外，细菌为了能在昆虫体内长期存在，必须具有逃避或应对宿主防御的机制，如类似细菌同其它微生物竞争或共栖息的机制（Walteretal.,2011）。研究表明宿主及其天然肠道菌群之间的分子信号对细菌的正确定殖和群落稳态也至关重要（Ashidaetal.,2012）。3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.2蜜蜂肠道菌群研究进展1.2.1蜜蜂肠道菌群的研究历史对蜜蜂肠道微生物群落的研究最早可追溯到20世纪早期。许多研究人员对来自蜜蜂肠道和蜂巢的生物体的培养产物进行过研究，记录了各种代谢和功能活动(GilliamandPrest,1972,1987;GilliamandValentine,1974;Gilliametal.,1974;Gilliam,1978;EvansandArmstrong,2006)。20世纪20年代至90年代，基于细菌培养的方法，研究者从蜜蜂肠道中观察到6000多种细菌菌株（Engeletal.,2013），然而，很多观察结果存在前后矛盾的现象。此外，早期对蜜蜂肠道微生物的研究主要集中在对西方蜜蜂巢脾中致病菌的鉴定上，而共生微生物很少受到重视，尽管研究人员很早就知道许多微生物不能在实验室里培养，或在尚未被发现的特殊条件下才能培养，直到分子测序技术的出现才解决了这一问题。基于16SrRNA基因的分子生物学方法研究蜜蜂肠道微生物始于2003年（Jeyaprakashetal.,2003），这一方法排出了这种传统细菌培养方法的弊端。然而，在蜜蜂肠道微生物中占主导地位的成员的调查中，不依赖培养的研究提出了一个与传统结果相反的观点，并揭示出容易培养、完全好氧的生物体只占肠道中的多样性微生物中的很少一部分。在蜜蜂肠道环境中有八大类细菌分类群占主导地位，已经在世界范围内的西方蜜蜂（A.mellifera）中出现（Jeyaprakashetal.,2003;MohrandTebbe,2006;Cox-Fosteretal.,2007;Martinsonetal.,2011;Engeletal.,2012;Lietal.,2012;Martinsonetal.,2012;Moranetal.,2012;Sabreeetal.,2012;Tianetal.,2012)。在亚洲的一些其它蜜蜂种类中也发现了一些细菌类群的亲近属（Ahnetal.,2012;Lietal.,2012），此外也发现于熊蜂（Bombus）的很多种类中（KochandSchmid-Hempel,2011a,2012;Kochetal.,2013），这些调查都采用的是各种不同的测序方法得到了一致的结论。在弄清蜜蜂及熊蜂肠道菌群结构的基础上，很多学者的研究开始转向这些肠道菌群功能的研究，并通过纯培养的方法，获取优势菌群的菌株，并通过菌株全基因组测序等方法预测其功能，最后通过体外验证的方法来验证相关功能（Engeletal.,2012;Martinsonetal.,2014）。1.2.2蜜蜂肠道菌群的分类地位目前，在蜜蜂属和熊蜂属中发现的肠道共生菌主要归为八大类（共9种）（表1.1），细菌优势种系型来自5个纲：3种来自Alphaproteobacteria，1种来自Betaproteobacteria，2种来自Gammaproteobacteria，2种Firmicutes，1种来自Actinobacteria。鉴定到种的共有5种（其中Alpha-2.2的最新命名还未得到认可）。Firm-4和Firm-5包含的细菌种类较多，因此分类地位也尚未确定。1.2.3蜜蜂肠道菌群的特征1.2.3.1G.apicolaG.apicola在定名前被称为Gamma-1，是蜜蜂中的细菌新属，2012年由Moran等重新命名，属于γ-变形菌纲（表1.1），革兰氏阴性。Kochetal.（2011）和Lietal.（2012）检测到的细菌并分别归到巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的这两个种也已证实为Gamma-1。该细菌的菌株最适宜生长在微氧环境中，且在标准大气压下不易生长。G.apicola菌4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言株的16SrRNA与亲缘关系最近的OrbushercyniusCN3T有93.9%的相似性，还与一些与昆虫相关的无法培养的细菌序列关系较近。其系统发育进化关系表明G.apicola是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的子妹枝（KwongandMoran,2013）。1.2.3.2F.perraraF.perrara即Gamma-2，蜜蜂中的细菌新属，2013年由Engel等重新命名，属于γ-变形菌纲（表1.1），革兰氏阴性菌。F.perrara细菌的菌株细胞的长度约2μm，嗜（中）温，适宜厌氧条件生长。有氧环境下无法生长，微氧环境下生长缓慢。序列分析显示Gamma-2属于Orbaceae属，与亲缘关系最近的Orbus属和Gilliamella属的细菌约有95%的相似性。系统发育分析表明，其Gamma-2与Orbus属的亲缘关系比Gilliamella属更近。而基于Gamma-2菌株的呼吸醌类型（respiratoryquinonetype），脂肪酸组成（fattyacidprofile）以及DNAG+C含量都与Orbaceae属的成员相似，有趣的是和Gilliamella属的菌株类似，Gamma-2的菌株对四环素具有高水平的抵抗能力（Engeletal.,2013）。1.2.3.3S.alviS.alvi也称为Beta类群，位于β-变形菌纲、奈瑟菌科内（表1.1），革兰氏阴性菌。分离自蜜蜂和熊蜂肠道中S.alvi菌株的最适生长环境同G.apicola相似。其16SrRNA与分支最近的西蒙斯氏菌属（Simonsiella），小链菌属（Alysiella），和Kingella（金氏菌属）约有94%的相似性（KwongandMoran,2013）。Li等（2012）等报道的Neisseriaceae可能就是这种新鉴定种S.alvi。1.2.3.4Alpha-1和Alpha-2类群昆虫中醋酸菌科的共生菌多种多样，可为昆虫提供营养、有利于昆虫的发育和组织的形成，还能调控免疫，它们在昆虫肠道总中比较常见，也能从唾液腺和生殖组织中分离得到（Corby-Harrisetal.,2014）。醋酸菌科的细菌在蜜蜂肠道内主要为Alpha-1和Alpha-2，Alpha-1种系型属于巴尔通氏体属（Bartonella），在西方蜜蜂中普遍存在，是一组胞内病原菌；Alpha-2种系型的16SrRNA序列与醋杆菌属（Acetobacter）和葡糖杆菌属（Gluconobacter）的一些细菌序列相似（Corby-Harrisetal.,2014）。Alpha-2又分为Alpha-2.1和Alpha-2.2。Alpha2.2分离自蜜蜂肠道，基于16SrRNA序列分析显示其与Saccharibactersp.进化关系较近（Martinsonetal.,2011）。Corby-Harris等（2014）基于PCR扩增的焦磷酸测序法表明Alpha2.2和其他一些细菌如Lactobacilluskunkeei，可栖息于哺育蜂蜜囊、咽下腺以及王浆中，但Alpha2.2在蜜蜂中肠和后肠中几乎不存在。Alpha2.2存在于蜂粮中，采集蜂的蜜囊里以及幼虫体内，但在哺育蜂和采集蜂的中肠和后肠中的含量微乎其微，可能与蜜蜂对花粉的消化有关（Andersonetal.,2013）。系统发育关系表明蜜蜂体内的Alpha2.2这一细菌对蜜蜂具有独特的特性，通过与上颚腺分泌物一起促进蜂群内的蜂子发育，此外，Alpha2.2与Saccharibacter（醋酸菌科下的一种属）类型并不相同，而后者经常在年轻工蜂中发现（Corby-Harrisetal.,2014）。Corby-Harris等（2014）认为Alpha2.2细菌不属于肠道细菌，但在蜜囊-上颚腺-王浆-幼虫这一生态位中具有较丰富的含量，并通过哺育蜂的哺育行为传播给发育中的蜂子。该作者通过系统发育分析等综合分析，建议使用Parasaccharibacterapium作为Alpha2.2这种共生菌的新名。5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.2.3.5Bifido类群Bifido是放线菌亚纲（Actinobacteridae）双歧杆菌属（Bifidobacterium）的细菌，其存在有益于蜂群健康，是蜜蜂和熊蜂的重要益生菌（Forsgrenetal.,2010;Killeretal.,2010;Vasquezetal.,2012）。双歧杆菌属包括48个种和亚种，随着新种的发现，这一数字还有望继续增加。双歧杆菌可在不同的生态位中生存，但大部分都是分离自动物，主要是哺乳动物，尤其是母乳喂养期间。它们的大量存在与宿主的健康密切相关。此外，双歧杆菌在一些社会性昆虫中（如蜜蜂和熊蜂）比较普遍（Bunesovaetal.,2014)。目前已报道过B.asteroides，B.coryneforme和B.indicum三种蜜蜂中特有的双歧杆菌(FelisandDellaglio,2007)，其中B.asteroides的基因组序列已经测出（Bottacinietal.,2012）。通过对来自不同消化道环境和生活阶段中培养的两株双歧杆菌全基因组测序结果表明双歧杆菌具有较强的处理碳水化合物的能力（Andersonetal.,2013）。1.2.3.6Firm-4和Firm-5类群Firm-4和Firm-5是乳杆菌属（Lactobacillus）中两个不同的细菌类群，系统发育分析表明，Firm-5和Firm-4的进化枝构成姊妹枝（Martinsonetal.,2011）。乳酸菌是重要的益生菌之一，在自然界广泛存在，与许多动植物和食物都有联系，它们的存在有利于宿主的健康（KleerebezemandVaughan,2009）。这个属的细菌常与双歧杆菌属细菌一起形成蜜蜂和熊蜂体内的益生菌群（Forsgrenetal.,2010;Killeretal.,2010;Vasquezetal.,2012）。另外，乳酸菌的代谢通路显示具有将各种碳水化合物（如果糖，乳糖，甘露糖，N-乙酰葡糖胺，山梨糖，蔗糖，海藻糖，木酮糖）发酵成乳酸的功能，此外，还编码有大量可预测的胞外蛋白，这种蛋白很可能有助于环境基质如几丁质的粘附和降解（Sánchezetal.,2011）。1.2.4非核心菌群的概述除了上述介绍的8大类9种主要的共生菌外，还有一些数量较少、在蜜蜂个体中分布不稳定的细菌，它们可能对宿主具有重要作用，如泛菌属（Pantoea）细菌（Loncaricetal.,2009）和芽孢杆菌属（Bacillus）细菌（EvansandArmstrong,2006）。但这些细菌也可能是过路菌，也可能是蜂群感病后的一些致病菌。通过对部分熊蜂物种的肠道菌群的研究表明，非核心细菌群的丰富度与蜂个体的细菌丰富度成负相关，很可能是由于所测定的非核心菌的蜜蜂中具有较低的核心菌数量。目前大部分研究都是基于核心菌群，大量存在的非核心菌群在肠道中作用还有待进一步深入研究。6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言表1.1.蜜蜂肠道共生菌的分类地位表Table1.1Taxonomicstatusofhoneybeegutmicrobiota.细菌类型门纲目科属种主要位置宿主种类文献PhylotypesPhylumClassOrderFamilyGenusSpeciesPrimaryHostspeciesReferenceslocationsBeta变形菌门β-变形菌纲NeisserialesNeisseriaceaeAdulthindgutApisandMartinsonetal.,ProteobacteriaBetaproteobacteria奈瑟菌目奈瑟菌科SnodgrassellaSnodgrassellaalvi(ileumwall)Bombusspecies2011;KwongandMoran,2013Gamma-1变形菌门γ-变形菌纲Adultmidgut,ApisandBombusMartinsonetal.,ProteobacteriaGammaproteobacteriaOrbalesOrbaceaeGilliamellaGilliamellaapicolahindgut(ileumspecies2011;Kwongandlumen)Moran,2013Gamma-2变形菌门γ-变形菌纲AdulthindgutApismelliferaKwongandMoran,ProteobacteriaGammaproteobacteriaOrbalesOrbaceaeFrischellaFrischellaperrara(proventriculus,2013;Engeletal.,ileum)2013Alpha-1变形菌门α-变形菌纲---巴尔通氏体科巴尔通氏体属Adultgut,ApismelliferaMartinsonetal.,2011;ProteobacteriaAlphaproteobacteriaBartonellaceaeBartonellaAlpha-1variablypresentMoran,2015.(Rhizobiales)Alpha-2变形菌门α-变形菌纲---醋杆菌科---Martinsonetal.,2011ProteobacteriaAlphaproteobacteriaAcetobacteraceaeAlpha-2.1变形菌门α-变形菌纲---醋杆菌科---Alpha-2.2Larvalgut,ApisandBombusCorby-Harrisetal.,ProteobacteriaAlphaproteobacteriaAcetobacteraceae(Parasaccharibacteradultcrop,species2014apium)nectar,honey,hive,someinadulthindgutBifido放线菌门放线菌亚纲双歧杆菌目双歧杆菌科Bifidobacteriumasteroids,AdulthindgutApisandBombusMartinsonetal.,2011;ActinobacteriaActinobacteridaeBifidobacterialesBifidobacteriaceaeBifidobacteriumB.actinocoloniiforme,B.(rectum)speciesMoran,2015.bohemicumFirm-4厚壁菌门芽孢杆菌纲乳酸菌目乳酸菌科---Lactobacillusmellis,L.AdulthindgutApisandBombusMartinsonetal.,2011;FirmicutesBacilliLactobacillalesLactobacillaceaemellifer(rectum)speciesMoran,2015.Firm-5厚壁菌门芽孢杆菌纲乳酸菌目乳酸菌科---LactobacillusAdulthindgutApisandBombusMartinsonetal.,2011;FirmicutesBacilliLactobacillalesLactobacillaceaehelsingborgensis,(ileum,rectum)speciesMoran,2015.L.melliventris,L.kimbladi7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.2.5蜜蜂肠道菌群的分布1.2.5.1蜜囊蜜囊（图1.2）是肠道内的一种肌肉质的可膨胀器官，以适应采集蜂采集花蜜（SammataroandCicero,2010;Snodgrass,1910）。虽然蜜囊经常含有营养丰富的花蜜并可作为微生物的能量来源，qPCR及FISH染色结果表明蜜囊内几乎不包含有细菌（Martinsonetal.,2012），但其他学者从蜜囊中分离出13种乳酸菌（Butler,E.,etal.,2013）和部分双歧杆菌（Andersonetal.,2013）菌株，但这些细菌也可能是来自花蜜而非蜜蜂体内共生的菌群。蜜囊这种频繁的填充和排空采集的花蜜到蜂箱中可扰乱微生物群落结构并阻止其它细菌定殖（Martinsonetal.,2012）。1.2.5.2中肠中肠（图1.2）是蜜蜂消化道中最大的器官（黄少康,2011），中肠中三种主要共生菌（即Beta，Firm-5和Gamma-1，简称BFG）只占BFG微生物总数的1-4%（Martinsonetal.2012）。由于中肠上皮细胞可产生围食膜，围食膜是一种松散的薄膜可以辅助消化，保护上皮细胞以防粗糙的食物粒子（Tellam,1996;Yueetal.，2008）。中肠上皮细胞可连续生产这种膜状物并在食物通过时脱落，这样可以阻止微生物附着（Tellam,1996）。因此，消化酶和围食膜的存在可以解释中肠中肠道菌比较贫瘠的原因。FISH显微检测结果表明大多数中肠细菌都处于较后的位置，靠近幽门部，表明中肠的部分微生物可能在解剖切割中肠时从回肠转入到中肠后部（Martinsonetal.,2012）。1.2.5.3回肠西方蜜蜂的回肠（图1.2）是在中肠和直肠之间的相对较小的器官，它具有较深的内折以便提供表面区域来吸收未被中肠收集的营养（SantosandSerrao,2006;Terraetal.,1996）。回肠中Beta种系型的细菌一层层的粘附在临近的宿主肠道组织上，Gamma-1种系型的细菌厚厚的分布在临近Beta细菌和回肠壁附近，尽管中肠比回肠大，但回肠中BFG的群体数量几乎比中肠大量两倍（占总BFG的5-10%）（Martinsonetal.,2012）。与中肠相比，回肠的内膜折叠中具有丰富的附着点，使其有机会接触一些消化而未被吸收的营养。FISH图片进一步提供了附着点对细菌定殖的重要性证据，尤其是Beta和Gamma-1种系型。回肠的细菌群落相对于肠道壁来说表现为分层次的生物膜（Martinsonetal.,2012），邻近宿主组部位具有Beta种系型生物膜结构，Gamma-1种系型分布在邻近Beta和回肠壁的厚垫上，此外，Firm-5种系型沿着回肠壁周围的小囊中分布（Martinsonetal.,2012）。Beta种系型的附着可能有利于随后的细菌种系型定殖，如易于Gamma-1的定殖和附着（Martinsonetal.,2012）。此外，其产生的生物薄膜可能产生微梯度（microgradients）（如，营养，氧气，和pH），这些可能提供分散的生态位以利于各种底物的利用，类似于白蚁的腹部菌群（BruneandFriedrich,2000.）1.2.5.4直肠直肠（图1.2）像蜜囊一样，具有一定的膨胀性，可适应更大的容量；这发生于工蜂连续保留消化废物直到它们飞出箱外排泄飞行时（Seeley,1985）。在这相对静态的环境下，类似于白蚁的胃，直肠的内容物（主要是空的花粉外壁）可为细菌提供营养来源，因为发现于花粉壁的碳水化合物很难被蜜蜂消化（RoulstonandCane,2000;Warneckeetal.2007）。由于直肠营养丰富的环8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言境，其中栖息着大部分始终稳定的微生物，占每只蜜蜂总的BFG16SrRNA基因总数的87-94%（Martinsonetal.,2012）。Firm-5种系型是直肠中的优势种群，并在直肠内腔中普遍存在，并散布于消化的花粉外壳上。总的来说，直肠包含了大多数BFG种系型的16SrRNA基因拷贝，并且还含有一些额外的细菌细胞，这些细菌只与通用真细菌探针杂交而不与特定的BFG探针杂交。这些非BFG细菌细胞大部分代表了除去特定特征微生物后的剩余的种系型（如Alpha-1,Alpha-2.1,Alpha-2.2,Bifido,Firm-4和Gamma-2）（Martinsonetal.2012）。图1.2蜜蜂肠道菌群的主要成分及在蜜蜂肠道及蜂箱中的定位(引自(Moran,2015))Fig.1.2Majorcomponentsofthehoneybeemicrobiotaandtheirlocationsinthebeegutorinthehive.1.3昆虫肠道共生菌的功能及影响因素1.3.1昆虫肠道菌群的主要功能1.3.1.1昆虫肠道菌群的营养及代谢功能肠道菌群在营养供给、消化及吸收上起到了至关重要的作用，并通过这种方式影响宿主的发育和健康（Hosokawaetal.,2007;Kikuchietal.,2007）。研究表明肠道共生菌可为宿主提供氨基酸（Nikohetal.,2011）、维生素B（Eichleretal.,2002）以及固醇等营养物质，并参与物质代谢作用及合成作用（Douglas,1993）。利用宏基因组分析方法，研究人员预测了蜜蜂共生菌之一的Alpha-1含有维生素B12的合成系统，可能为蜜蜂合成维生素（Engeletal.,2012）。蜜蜂共生菌可将花粉转化为蜂粮（EvansandLopez,2004），蜂粮比花粉含有更多的维生素、更少的多糖以及不同的氨基酸，这些营养成份的变化很可能是共生的乳酸菌（lacticacidbacteria,LAB）群参与转化而成（Babendreieretal.,2007;Mattilaetal.,2012）。蜜蜂中Gilliamella属的菌株具有降解果胶的功能（Engeletal.,2012），果胶又是花粉壁的主要成分，因此这一细菌的存在有助于帮助宿主消化花粉和吸收花粉的营养成分；Gilliamella属的细菌还具有代谢不同类型的糖的功能（Kwongetal.,2014），这将有利于蜂群利用不同种类的花蜜。进一步的实验也证实了Gilliamella、Lactobacillus和Bifidobacterium等蜜蜂肠道内的共生9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言菌具有合成果胶降解酶（pectin-degradingenzymes）、糖苷水解酶（glycosidehydrolases）和多糖水解酶（polysaccharidelyases）等降解碳水化合物的功能，并从基因水平上证明了Lactobacillus和Bifidobacterium等组成的乳酸菌菌群参与了蜂蜜的酝造和糖类物质的代谢（Engeletal.,2012;EngelandMoran,2013）。此外，很多昆虫都依赖共生菌作为一种专用氮代谢机制来补充机体对氮代谢机制的缺乏，如白蚁可利用宿主的含氮排泄物，并将它们回收成高价值的营养物质，或者直接排到大气中（Thong-Onetal.,2012;Hongohetal.,2008）；蟑螂、白蚁和一些食草性蚂蚁肠道内栖息着一些内共生菌，它们可进行氨的回收和一些必需氨基酸的生物合成（Sabreeetal.,2012）。肠道菌群还具有潜在的食物解毒功能，由于很多来源的营养只有在无毒性的条件下才有效，并且一些分子的水解作用如一些植物细胞壁成分既具有解毒作用，也能使食物成为有效的营养来源（Hehemannetal.,2010）。很多昆虫特化为以某些有毒植物为食，其肠道菌可能在消化和解毒这些来源的食物上发挥了重要作用（Hehemannetal.,2010）。1.3.1.2肠道菌群对昆虫生理的影响由于果蝇肠道共生菌多样性较低，加上果蝇具有各种可利用的遗传工具（Chandleretal.,2011;Wongetal.,2011），从而使果蝇非常适合作为一种模式生物来研究肠道环境下各种细菌间相互作用。果蝇对中肠中非致病或致病病原菌的宿主反应不仅是由免疫系统激活构成，还涉及到包括干细胞增殖和上皮细胞更新等肠道细胞生理学的各个方面（Buchonetal.,2009；Croninetal.,2009），而果蝇中肠上皮细胞上具有自我更新的程序，这一程序可使肠细胞由底层干细胞不断更新（Casalietal.,2009;Amcheslavskyetal.,2009）。细菌在中肠中调节这种干细胞活性，可能通过诱导上皮细胞损伤和凋亡从而导致激活JAK-STAT信号通路（Buchonetal.,2009；Croninetal.,2009;Jiangetal.,2009）。上皮细胞更新的程度与细菌在中肠中的毒力和浓度成正比，在栖息有共生菌的正常蚊子中，其上皮细胞的更替率提高，而存在致病菌的蚊子中的上皮细胞更替率则减慢（Buchonetal.,2009）。当果蝇中缺乏肠道菌群定殖会导致代谢中心的类胰岛素通路的失误调节从而引起严重的体内平衡失调问题（Shinetal.,2011）。1.3.1.3肠道菌群对昆虫寿命的影响肠道菌群还能影响昆虫寿命。研究表明，在果蝇成虫的不同生活阶段，细菌的存在可以延长或者缩短宿主的寿命（Brummeletal.,2004）。改变果蝇中细菌和肠壁吸收细胞之间的共生关系可以促进它的健康并能延长寿命（Guoetal.,2014）。该研究指出，果蝇肠道中的细菌量随着年龄增大而显著增加，从而导致一种炎症状态，这是由应激反应基因FOXO长期激活所驱动，其抑制了一类叫做PGRP-SCs（peptidoglycanrecognitionproteinSC）的分子活性，而PGRP-SCs调控了机体对细菌的免疫反应；PGRP-SC抑制使得一种在启动对肠道细菌有效免疫反应中起重要作用的信号分子Rel/NFkB解除控制。由此导致的免疫失衡使得细菌数量不断扩增，触发了一种炎症反应，生成自由基。当在肠上皮细胞中提高PGRP-SC表达时，则修复了细菌平衡，限制了干细胞增殖，因此只需增强PGRP-SC的功能就可以延长果蝇的寿命（Guoetal.,2014）。1.3.1.4肠道菌群对昆虫生长发育的影响10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言肠道菌群还可以通过直接与宿主接触而影响宿主的发育过程，如通过上皮细胞感知细菌信号有助于免疫和细胞内稳态，还对宿主适应变化的肠道环境条件至关重要。另外，共生肠道菌群还可以通过调节宿主激素信号来促进果蝇的系统增长和发育（Shinetal.,2011）。共生菌能够通过影响生长率和个体大小的方式影响果蝇的系统发育（Shinetal.,2011）。研究表明，无菌的果蝇幼虫较正常幼虫表现出增长减慢和发育变缓等现象，当定殖足够的Acetobacterpomorum（从果蝇消化道中分离的一种共生菌）后，这些果蝇可以恢复幼虫的发育和增长水平（Shinetal.,2011）。促进果蝇生长的另一个共生菌则归功于乳酸菌的贡献。研究发现无菌果蝇和单一存在乳酸菌的果蝇在低营养条件下生长和发育存在显著差异（Storellietal.,2011）。1.3.1.5肠道菌群的防御及保护功能在昆虫生命周期的所有阶段中，都会受到许多捕食者、寄生虫、拟寄生物以及病原体的威胁（KaltenpothandEngletal.,2014）。一些膜翅目昆虫的生活和摄食方式使它们更易受到病原体侵扰，社会性昆虫的大规模的群居生活也增加了病原体感染的风险和同种个体之间疾病的传播（KaltenpothandEngletal.,2014）。当昆虫面临众多的寄生虫和致病菌威胁时，能够通过共生菌群的屏蔽作用与疾病进行对抗并通过这些途径对机体进行保护（Lietal.,2012）。如切叶蚁、独居的泥蜂、蜜蜂和熊蜂等除了自身防御应对这些威胁外，均有一些共生菌群参与到保护宿主与细菌的相互作用中；还有些昆虫通过共生菌产生的毒素来抵抗寄生蜂从而对昆虫进行保护（KaltenpothandEngletal.,2014）。此外，还有一些报道表明在昆虫中还存在不同肠道微生物与寄生虫之间的相互对抗作用。比较典型的例子是欧洲熊蜂的肠道菌（尤其是S.alvi）能在一定程度上提高宿主蜂对寄生的短膜虫（Crithidiabombi）的抵抗作用（KochandSchmid-Hempel,2011b）。研究还发现熊蜂对短膜虫的易感性受宿主特定肠道菌群的影响而不是受宿主昆虫基因型的影响，这一结果也证实了社会性昆虫（蜜蜂）的肠道微生物群落在保持肠道内稳定及抵抗寄生虫和疾病中发挥了一定的作用（KochandSchmid-Hempel,2012）。Li等（2012）的研究结果表明，东方蜜蜂对微孢子虫（Nosema）的敏感性可能取决于其体内细菌群落的组成。而对沙漠蝗（Schistocercagregaria）的实验也表明，肠道菌群的多样性和沙雷氏菌属（Serratiamarcescens）这种病原菌的成功定殖呈负相关，这也支持了肠道菌种类丰富度越高其抵抗病原菌入侵的功能越强的假设（Crottietal.,2010）。1.3.1.6肠道菌群对蜂群的调节功能研究表明，环境压力导致的肠道菌群失调可引起宿主对疾病的易感性（EngelandMoran,2013）。当蜂群面对各种生物和非生物压力下时，肠道菌群的调节作用很可能是保持蜜蜂健康状态的一个关键因素（Crottietal.,2013）。乳酸菌（lacticacidbacteria,LAB）、双歧杆菌（Bifidobacterium，在生物学上被分到乳酸菌里）以及醋酸菌（aceticacidbacteria,AAB）是蜜蜂肠道中的常见细菌，是近年来研究人员最感兴趣的常见共生菌（OlofssonandVasquez,2008;Crottietal.,2010;Andersonetal.,2013）。乳酸菌可提高蜜蜂免疫力，保护宿主抵抗蜜蜂病原体、细菌和酵母菌（Butleretal.,2013）。以AAB为例，将其添加到糖饲料中已经得到普遍应用，这表明AAB在宿主中具有潜在的益生作用（Crottietal.,2010）。LAB是革兰氏阳性菌，耐酸，它们是很多昆虫胃肠道内的常驻菌，可参与免疫调节和维11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言护健康的肠道菌群结构，对宿主具有益生作用。而且，蜜蜂的消化系统为LAB的生长提供了最佳生态环境，它们从蜜蜂的食物中汲取营养供自己生长。AAB是专性需氧菌中的一大群革兰氏阴性菌，可粘附在宿主上皮细胞与病原体相互竞争（Crottietal.,2010），此外，酸和胞外多糖产物可能也有助于醋酸菌在昆虫肠道内成功定殖（EngelandMoran,2013）。LAB和AAB在酸性条件下表现出独特的生长特性，如产生有机酸和醋酸，代谢不同的糖，这些特性很好地解释了LAB和AAB抑制酸敏感性致病菌增长的原因。另外，在蜜蜂养殖中，蜂农常采用甲酸、乳酸和乙酸防治病原菌感染，这表明LAB和AAB很可能是保护蜜蜂的重要天然共生菌（OlofssonandVasquez,2008）。另一方面，蜜蜂肠道微生物分布不平衡，尤其是LAB和AAB的丰度度较低会直接或间接增加宿主对疾病的易感性（Hamdietal.,2011）。另外，受CCD影响蜂群大都受一些疾病的影响，如大蜂螨、病毒、幼虫腐臭病、真菌及微孢子虫病等，这表明蜜蜂的健康可能受定殖在肠道中的比例相对平衡的肠道菌群的调节（Hamdietal.,2011）。共生菌可通过调节肠道平衡从而保护蜜蜂幼虫免于感病。当对幼虫饲喂含有组成不同乳酸菌和双歧杆菌的混合共生菌时，在免疫反应观察中观察到一个类似幼虫芽孢杆菌感染时出现的免疫反应，这表明这些共生细菌可以用来预防或治疗自然的病原体（EvansandLopez,2004）;一些细菌菌株在体外也表现出对幼虫芽孢杆菌的直接的拮抗作用，并且在另一项研究中也证实了在体内实验中也具有一定的抑制活性（Forsgrenetal.,2009）。此外，昆虫的社会性生活方式也会促进种群中有益细菌的接种和传播（Rangbergetal.,2012）。健康蜂群的维持可能离不开肠道菌群的调节作用，由于益生菌可以诱导宿主产生抗菌肽（abaecin）和防御素（defensins），增强宿主的免疫能力，从而提高其对病原菌的抵抗能力（EvansandLopez,2004），目前已提出作为蜜蜂幼虫抵抗幼虫芽孢杆菌的重要益生菌，很可能成为养蜂中常用的化学处理的一个合适替代品（EvansandLopez,2004;Crottietal.,2010）。1.3.2昆虫肠道菌群的影响因素研究发现，根据昆虫的栖息环境，饮食，发育阶段和系统进化关系这些标准来区分时，它们的肠道中厌氧菌的相对丰度存在显著差异，杂食性（omnivorous）昆虫的肠道菌群多样性要显著高于狭食性（stenophagous）（如肉食性和草食性）昆虫（Yunetal.,2014）。很多内部和外部因素都会对这些微生物群落产生影响，包括饮食、地理、生理、以及宿主之间的接触程度（Degnanetal.,2012）。研究发现，以腐木为食的食木性昆虫的肠道菌群的多样性最丰富，而蜜蜂和胡蜂的肠道菌群的丰富度最低；我们的结果证实宿主的饮食和分类结构对肠道菌群的组成有一定的影响，其中，膜翅目和白蚁等昆虫的分类对肠道菌群结构的影响较大，而饮食是影响以木质性纤维素喂食昆虫的肠道菌群结构的重要因素（Colmanetal,2012）。1.3.2.1营养水平营养可直接地或间接地过调节宿主肠道菌群和病原体而影响宿主免疫力；另外，食物本身也是共生体的载体，不同食物内栖息的微生物成分有所差异，因此，研究食物及肠道菌群组成和功能可更好的了解宿主和病原体相互作用的效果（Pontonetal.,2012）。另据有关研究发现，饮食不仅改变了肠道的代谢功能，同时还改变了肠道菌群结构（Colmanetal.,2012）。Chandler等（2011）对黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）肠道菌群的研究结果表明，不同营养水平的饲料对果蝇肠道菌群多样性影响较大，这充分说明营养对果蝇肠道菌群健康起主导作12 中国农业科学院博士学位论文第一章引言用。Dillon等（2010）研究了饥饿对沙漠蝗（Schistocercagregaria）肠道菌群的影响，结果表明饥饿处理后沙漠蝗肠道内γ-变形菌纲细菌丰富增加，这可能是因为饥饿后沙漠蝗肠道菌群抵抗微生物侵染。Koch等（2012）从野外抓捕熊蜂并在室内饲养到10只工蜂出房，然后将其放回到抓捕蜂王的区域，并且每周为这些蜂群提供50%浓度的糖水，最后结果表明额外添加糖水对野生地熊蜂蜂群的肠道多样性无影响。从目前的报道来看，营养对不同昆虫肠道菌群多样性的影响差异较大，因此不同昆虫肠道菌群多样性、特异性等信息，还需要近一步分析才能最终确认。1.3.2.2抗生素残留抗生素主要通过粪便散布于环境中引起残留，在一些国家的河流和湖泊已经检测到了不同种类的抗生素（王冰等,2007）。抗生素能够改变肠道微生物多样性，因此昆虫在野外环境中不可避免的会遭受抗生素的影响。郎晓磊（2010）和薛妍（2010）分别在棉铃虫和家蚕的无菌人工饲料中添加利福霉素等抗生素，结果发现可培养和非可培养方法均未检测到肠道共生菌。有关抗生素对蜜蜂影响的一个主要方向是抗生素的耐药性。Tian等（2012）对长期处于抗生素环境中蜜蜂的肠道菌群产生的抗药性基因进行了研究，结果表明蜜蜂肠道菌群有8个抗性位点，包括耐药性基因（tetB,tetC,tetD,tetH,tetL及tetY）和核糖体防护基因（tetM和tetW），抗性基因在蜜蜂中普遍存在，而在熊蜂中只有三个抗性位点。目前大部分的研究只是使用抗生素杀死肠道菌群来验证某种肠道菌的功能，但不同浓度抗生素处理后蜂群肠道菌群能否恢复，以及通过什么方式恢复还未见报道；另外，肠道菌群对抗生素处理产生的抗性以及其适应机制也少见报道。1.3.2.3病原体感染目前病原体感染对蜜蜂肠道菌群数量及功能影响的报道还很少见。Li等（2012）报道了感染东方蜜蜂微孢子虫（N.ceranae）的中蜂（A.c.cerana）体内细菌数量较正常蜂少，尤其是Bifidobacterium和Snodgrassella的数量差异显著，这表明东方蜜蜂（A.cerana）肠道菌群的组成可能影响其对东方蜜蜂微孢子虫的敏感性，而且共生菌的屏蔽作用可能是其对抗疾病的一种重要途径。但Koch等（2012）的研究结果表明，自然状态下地熊蜂感染微孢子虫和短膜虫与肠道菌多样性并无直接联系。由于蜂种、地理环境和感病程度等均不同，病原体感染是否会影响肠道菌的多样性变化或改变肠道菌群的组成还有待深入研究。1.3.2.4日龄、季节和个体大小肠道菌群的结构和组成处于动态变化中，年龄等因素都会影响肠道菌群的建立和功能（Biagietal.,2012）。Martinson等（2010）通过使用实时定量PCR、显微荧光原位杂交（FISH）等技术研究了蜜蜂（A.melliferaLinnaeus）发育过程中肠道特定菌的变化，结果表明幼虫和刚出房的工蜂几乎没有细菌，成年工蜂包含大量的BFG（Beta,Firm-5,和Gamma-1）菌群，研究还表明中肠、回肠和直肠内菌群的分布也不相同。另外，不同季节，气候和蜜粉源差异较大，因此全年不同季节蜂群的肠道菌的变化很可能也有较大差异（Martinsonetal.,2012）。Koch等（2012）研究了生态因素对野外地熊蜂的影响后发现，个体大小对肠道菌多样性无显著影响。1.3.2.5地理环境13 中国农业科学院博士学位论文第一章引言Koch等（2013）报道了地理距离可能影响共生菌G.apicola在熊蜂肠道内的分布，但缺乏系统研究。目前，不同地理环境下熊蜂肠道菌群多样性及适应机制的研究还未见报道。我国蜜蜂资源丰富，从南到北均有分布。分析诸如青藏高原（高海拔）、东北高寒地区、平原、内蒙古草原等地理环境对蜜蜂肠道菌的影响，可为今后研究共生菌与宿主的相互作用、共生菌适应环境的机制等奠定基础。1.3.2.6遗传多样性的影响在蜂群中，蜂王具有多雄交配的习性（欧阳燕等,1997），这一生物学特性增加了蜂群的群体遗传多样性，从而进一步增强蜂群的健康程度和生产力（Mattilaetal.,2012）。研究发现，在遗传多样性较高的蜂群中蜜蜂肠道细菌多样性也较高，而遗传单一性蜂群中的细菌多样性较低（Mattilaetal.,2012）。此外，遗传多样性高的蜂群中细菌活力旺盛，大多为有益细菌，而在遗传单一性蜂群中的细菌多为植物和动物消化道中的潜在致病菌，其存在比例较遗传多样性较高的蜂群高出了127%；这一结果表明，增加遗传性状单一的蜂群的多样性，可增强蜂群的整体健康和活力（Mattilaetal.,2012）。但宿主的这种遗传多样性的维持以及与附属的健康菌群之间的关系还不清楚。另外，蜂群中一雌多雄的进化遗传优势不仅提高了整个蜂群的群体多样性，还间接影响到宿主蜂肠道内共生细菌的进化，很可能这些肠道菌群与宿主之间协同进化以适应不断变化的外部环境（Mattilaetal.,2012）。1.4昆虫肠道共生菌的研究方法1.4.1微生物多样性常用研究方法概述从巴斯德时起，传统的微生物学研究依赖于无混杂（纯化）的分离单个微生物的传统培养方法，这种以传统的培养为基础的研究方法经历了几十年的发展历程，一定程度上促进了肠道微生物研究的发展。但这种方法所能掌握的信息也仅限于那些能够被培养的肠道微生物。从特定环境中培养的微生物只是实际栖息在这一环境中的很小一部分，通常只有1%的细菌可以培养（RappéandGiovannoni,2003），所以，要想较好的了解“到底哪些微生物真正栖息在那里”需要依赖非培养的方法。随着现代分子生物学技术的发展，一些以16SrRNA基因序列分析为基础的分子技术被广泛用于微生物的鉴定、分类以及微生物之间进化关系的确定等，如DGGE（DenaturingGradientGelElectrophoresis）、TRFLP（TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism）等常规分子生物学技术（Shietal.,2010），以及可精确定位细菌在昆虫肠道中分布位置荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）方法（Engeletal.,2013），这些技术主要用来鉴定或描述一些特殊菌群的特征。随着科技的发展，用于研究复杂微生物群体的研究方法越来越多，并且随着高通量测序技术的迅速发展，以高通量测序和宏基因组测序技术为主的最新测序技术将逐渐取代常规的分子生物学方法。一些在蛋白质组和代谢组学中的新技术和新方法也被逐渐运用到肠道微生物的研究中。1.4.216SrRNA简介细菌按沉降系数可分为5S、16S和23S三种。16SrRNA基因就是细菌染色体上编码该rRNA14 中国农业科学院博士学位论文第一章引言的相应DNA序列。如图1.2所示，16SrRNA基因序列全长1540bp，有保守区和可变区之分，每种细菌的保守区都是相同的，能反映生物种类的亲缘关系，因此常用16SrRNA对生物进行系统发育学研究；可变区因细菌种类而异，通过保守区设计引物可扩增出可变区，从而可以获得微生物多样性信息。16SrDNA存在于所有物种中，而其它一些常用的分子标记则不具有16SrRNA基因的这种分类优势（Kuczynskietal.,2011）。目前，微生物组数据的获得通常有三种方式，即16SrRNA基因序列测定，宏基因组测定（描述细菌的潜在功能），宏转录组数据（描述活性基因的表达）（Goodrichetal.,2014）。16SrRNA对特定物种或分类群提供了一个分子标记，并可以与公共数据库中已经研究的物种序列进行比较（McDonaldetal.,2012）。鉴于16SrRNA基因能够对细菌和古细菌多样性进行相对公正的描述（Goodrichetal.,2014），因此在微生物多样性调查和分类鉴定主要是基于16SrRNA基因。图1.3.细菌16SrRNA全长示意图Fig.1.3Thewholelengthof16SrRNA.1.4.3本研究中使用的研究方法简介1.4.3.1MiSeq测序平台简介及优势IlluminaMiSeq测序系统是目前唯一在单个仪器上整合扩增、测序和数据分析的新一代测序仪。MiSeq系统特有全新的射流结构，能使试剂循环时间缩短5倍。革命性的流程和无可比拟的准确性，这让MiSeq成为快速高效的测序平台，适合广泛的应用。采用高通量测序方法研究微生物群落多样性已经成为当前的主流方法（Kozichetal.,2013;Fadroshetal.,2014;Goodrichetal.,2014）。目前市场上广泛应用于微生物多样性研究的测序平台主要是Roche454和IlluminaMiseq平台。MiSeq读长较长，一般稳定在450-550bp之间，而454读长在300-600bp之间，测序通量上，MiSeq可达到15G，而454只有700兆（Fadroshetal.,2014;Nelsonetal.,2014）。因此该技术在微生物多样性研究中具有很大的应用潜力，鉴于此，本研究中选用MiSeq平台中最新的PE300平台进行研究。1.4.3.2MiSeq测序原理MiSeq测序系统采用Illumina成熟的TruSeq边合成边测序技术为基础，通过可逆终止试剂方法对数百万个片段同时进行大规模平行测序。当每个dNTP加入时，对荧光标记的终止子成像，随后切割，允许下一个碱基的掺入。由于每个测序循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化。根据每个循环的荧光信号测定直接检出碱基，与其他技术相比大大降低了原始错误率，实现了可靠的碱基检出。15 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.5总结和展望昆虫是全球生物多样性的重要因素，尤其是传粉昆虫作为传粉媒介的重要组成部分，它们为作物和野生植物提供了至关重要的生态服务（Simonetal.,2010），同时，对可持续农业和非农业生态系统的维持也至关重要（DedejandDelaplane,2003）。鉴于昆虫丰富的生态学和分类学多样性，目前很难对其肠道菌群进行统一概括。尽管对昆虫肠道菌的研究只在极小一部分昆虫类群中取样，但已经清楚的知道肠道菌对营养、生理、免疫反应以及许多物种的抗病性都发挥着重要作用。目前，很多昆虫肠道菌的研究多限于实验室内的调查和实验，并不能明确展现肠道菌在自然种群中的作用，尤其是只有在实验中具备合适的环境条件才能显现肠道菌的作用，这需要实验室条件下提供充分的营养并排除病原体并且肠道细菌的营养供应或抗病保护作用不会观察到。过去二十年里，基因和基因组方法的广泛应用揭示了细菌世界惊人的普遍性和多样性，而动物-细菌之间相互作用知识的不断增加从根本上改变了我们对动物生物学的理解（McFall-Ngaietal.,2013）。目前采用16SrRNA扩增肠道菌的研究文献报道较多，但大多数并没有达到预期的了解细菌数量或仅仅提供了单一的细菌群落片段。通过对绝对密度的估计将是对我们获得丰富度和稳定性较好的理想肠道菌多样性数据的有益补充。随着下一代测序技术的普及，极大地促进昆虫-微生物群落的研究和分析水平，并将进一步揭示大量未知的保护性共生微生物。然而，详细了解宿主的自然生活史是阐述共生菌有益功能和从分子水平理解共生菌保护功能的基础。借助最新的研究工具深入调查和研究细菌之间及与其宿主的之间的关系、昆虫及其共生体之间如何维护体内平衡、昆虫和细菌如何影响彼此的基因组等内容，是进一步深入了解更多有关昆虫如何区分非致病菌（肠道共生菌）和有害的病原体机制的基础，这些肠道共生菌功能的研究将有助我们操控昆虫肠道菌并用来控制有害昆虫或进一步保护授粉昆虫在内的有益昆虫。1.6研究目的、内容和意义1.6.1研究目的研究肠道菌的最终目的是想深入了解肠道菌在保持昆虫健康中的作用，因此在摸清肠道菌多样性现状的基础上，进一步研究阻碍肠道菌功能发挥的影响因素，对今后研究肠道共生菌的功能也具有很重要的理论和应用价值。1.6.2研究内容及技术路线目前，国内仅有少数学者开展了蜜蜂肠道菌的研究，但对我国本土蜂种的研究还未见报道，此外，已有的研究的采样范围只有个别地区，不能反映出我国饲养蜂群的整体情况，加上研究技术手段的限制，这些研究可能无法全面反映出肠道菌群的多样性。在本研究中，利用第二代高通量Miseq测序技术对东、西方蜜蜂肠道微生物类群进行种类鉴定和多样性分析，首先分析全国各地的蜜蜂样品，全面摸清我国本土中蜂和西方蜜蜂肠道微生物的组成和丰富度等多样性信息；接着通过对不同省份中西蜂的肠道菌群的比较分析，全面揭示中、16 中国农业科学院博士学位论文第一章引言西蜂的肠道菌群结构差异；另外，还从级型差异、日龄差异以及饲养方式差异等角度，比较不同因素下中蜂的肠道菌群多样性，从而弄清肠道菌群的影响因素。研究的技术路线如图1.3所示。1.6.3研究意义研究本土蜜蜂的肠道菌群结构可为筛选潜在的益生菌奠定基础，进而改良我国本土蜜蜂的养殖模式，优化饲养管理、提高人工养殖蜂群的健康水平，促进本地蜂种的生长和发育。另外，在弄清肠道菌群结构的基础上，进一步了解肠道菌群的影响因素，可为更广泛的理解肠道微生物群的功能并为探索肠道菌群与宿主的共生关系以及宿主肠道内微生物的作用机理提供理论基础。图1.4技术路线Fig.1.4Theflowdiagramoftechichalrouteonthisresearch.17 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类我国自19世纪引入西蜂蜜蜂之前，东方蜜蜂是农作物和自然植物的主要授粉者。它们在自然条件下筑巢于石缝或树洞中，是山区主要的授粉蜂种之一。除新疆以外，全国各省区都有东方蜜蜂分布。目前，东方蜜蜂和西方蜜蜂在中国大部分地区均有分布，分享相同的栖息地和蜜源，它们也是我国目前饲养量最大的两个蜂种，也是两个重要的经济昆虫和授粉昆虫。很多学者对西方蜜蜂肠道菌群进行了系统研究（Martinsonetal.,2011;Martinsonetal.,2012;Moranetal.,2012;Sabreeetal.,2012），但中国东、西方蜜蜂的肠道菌群多样性现状并未完全揭示，已有的研究也仅仅从局部地区采样，所采用的研究方法也主要是传统的研究方法，因此为了全面了解我国蜜蜂尤其是东方蜜蜂的多样性现状。本研究从全国不同地区取样，并采用第二代高通量测序技术进一步揭示我国饲养量最大的两大蜂种的肠道菌群现状。2.1材料和方法2.1.1样品采集从全国16个省市采集蜜蜂样品，每个地区选2-3群，每群采集3-6只。采集地点详见图2.1和表2.1。参考Moranetal.（2012）叙述的方法，若是活框饲养的蜂群，随机从蜂脾的外侧取样（这一区域的蜜蜂大约为16日龄的成年工蜂，当然也包括其他日龄的工蜂），样品存入75%酒精-20℃存储。共采集到193只样品（A.cerana,n=162;A.mellifera,n=31）。图2.1采样地点及信息.Fig.2.1SamplinglocationsinChina.18 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类表2.1样品采集地点信息Table2.1.DetailsofsamplinglocationsandinformationinChina.地理区域次级地理区域GeographicSecondary纬度经度海拔物种样本数AreaGeographicArealatitudLongitudeAltitudespeciessamplesize重庆荣昌县106.5504629.56107249A.cerana13头渡镇107.1678728.907671341A.cerana14德隆乡107.0865328.908801282A.cerana5三泉镇107.2791529.069151100A.cerana5贵州湖潮乡106.5173026.382791213A.cerana6云南蒙自州103.3969923.520451285A.cerana10西藏林芝95.2882730.020742445A.cerana6湖北大坪镇111.9190331.64134344A.cerana6张湾镇111.5855131.8075197A.cerana6竹山县110.0467632.40919676A.cerana3广东广州114.2925023.7066790A.cerana3龙门116.0658324.67500528A.cerana3福建福州119.2323426.0858567A.cerana6浙江衢州118.4969429.30236375A.cerana6江西南昌115.8374528.7625648A.cerana6河南三门峡111.4169234.53642871A.cerana6甘肃清水106.3305634.833331647A.cerana6徽县106.0761133.76466904A.cerana5徽县106.0761133.76466904A.mellifera5海南海口110.3106620.0194919A.cerana15海口110.3106620.0194919A.mellifera5山东泰安117.1106536.21087257A.cerana5泰安117.1106536.21087257A.mellifera5北京密云116.8050840.62776504A.cerana4平谷117.0107740.17176164A.cerana18平谷117.0107740.17176164A.mellifera5吉林长白山127.7879942.051191023A.cerana5长白山127.7879942.051191023A.mellifera5新疆新源县43.6879083.519671723A.mellifera3尼勒克43.7236583.493551732A.mellifera319 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类2.1.2材料2.1.2.1主要试剂试剂盒：WizardSV96GenomicDNAPurificationSystem（Promega公司，USA）；蛋白酶K；KrebsRingersolution（Merck公司，USA）；2×TaqPCRMasterMix（北京博迈德科技有限公司）；D2000plusDNAMarker（中科瑞泰）；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）。2.1.2.2主要仪器PCR扩增仪（Mastercycler5331，德国Eppendorf公司）；高压灭菌锅（VX-65，德国Systectheautoclave公司）；凝胶成像系统（ChampGel-3200，北京赛智创业科技有限公司）；制冰机（FM40，北京长流科学仪器公司）；电泳仪（DYY6C，北京市六一仪器厂）；超净工作台（DL-CJ-1N，北京昌平长城空气净化工程公司）；干式活塞真空泵（WOB-LPRES，美国Welch公司）；微型漩涡混合器（QL-901，江苏南海市其林贝尔仪器制造有限公司）；金属浴（GL150，江苏南海市其林贝尔仪器制造有限公司）；电子天平（JA2003B，上海越平科学仪器有限公司）；手掌型离心机（LX-200，江苏南海市其林贝尔仪器制造有限公司）；全温空气恒温振荡器（HZ-C-1，太仓市实验设备厂）；Nanodrop2000（Nanodropproducts,Wilmington,DE,USA）；解剖镜（DP71，Olympus公司，日本）；酒精灯，镊子，解剖盘，玻璃皿。2.1.3实验方法2.1.3.1蜜蜂肠道解剖和DNA提取实验前，先用75%酒精对试验台进行消毒。首先用75%酒精冲洗要解剖的单只蜜蜂体表，再用蒸馏水清洗，用消毒过的镊子拉出整个蜜蜂肠道组织（包括蜜囊，前、中、后肠）并放入1.5mL的无菌离心管中。在解剖下一只蜜蜂肠道之前，先用卫生纸擦去镊子上残留的肠道组织，再用酒精冲洗后，在酒精灯上对镊子进行高温灭菌。每只蜂的肠道组织加入50μL的Krebs-Ringer溶液，用一次性研磨杵进行研磨，按照DNA提取试盒的操作方法（WizardSV96GenomicDNAPurificationSystem，Promega公司，USA）提取DNA（提取装置和详细步骤见附录Ⅰ），每只蜜蜂的DNA样品用200μL的双蒸水溶解。2.1.3.2DNA浓度检测及PCR扩增DNA提取完后用Nanodrop2000对所提DNA进行浓度检测，浓度较低的样本重新提取DNA，样本准备完毕后送交上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq测序。对所有蜜蜂肠道DNA样品的16SrRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增，引物序列为338F5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’and806R5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’（Dennisetal.,2013）。每个样品设3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测（电泳检测结果见图2.2）。PCR反应条件为：95°C2m；27cycles×（95°C，30s；55°C30s；72°C，45s）；72°C，10m。PCR反应体系如下：20 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类试剂20μL体系5×FastPfuBuffer4μL2.5mMdNTPs.2μLForwardPrimer(5μM)0.6μLReversePrimer(5μM)0.6μLFastPfuPolymerase0.4μLTemplateDNA10ng2.1.3.3IlluminaMiSeq高通量测序2.1.3.3.1荧光定量参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。2.1.3.3.2Miseq文库构建连接“Y”字形接头；使用磁珠筛选去除接头自连片段；利用PCR扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。2.1.3.3.3Miseq测序⑴DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；⑵另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”；⑶PCR扩增，产生DNA簇；⑷DNA扩增子线性化成为单链。⑸加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；⑹用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；⑺“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3"端粘性，继续聚合第二个核苷酸；⑻统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。2.1.3.3.4Miseq测序数据的质控Miseq测序序列首先需要得到的双端序列数据首先根据PEreads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，并根据序列末端的box序列校正序列方向，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到有效数据。测序完成后应首先对低质量的原始数据进行去除，以避免干扰分析结果。因此在进一步分析前，使用Trimmomatic和FLASH软件对原始数据进行去杂和优化，最终的可用于后续分析的高质量的有效数据。2.1.3.4生物信息学分析2.1.3.4.1OTUs分析利用QIIME（一个专门用于分析微生物PCR产物高通量测序数据的多样化统计软件，如Alpha及Beta多样性统计）软件包（vsesion7.1）分析蜜蜂肠道菌群的16SrRNA基因多样性。使用uparse（version7.1）方法进行OTU聚类，OTU中序列相似性设为97%，得到OTU的代表序列；使用uchime（version4.2.40）检测PCR扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除；移除不21 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类能正确比对的非细菌OTUs。并删除在所有样品中仅出现一次的OUT。使用usearch_global方法将优化序列map比对OTU代表序列，得到OTU各样品序列丰度统计表。2.1.3.4.2物种注释为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用Qiime平台和RDPclassifier（version2.2）贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，置信度阈值为0.7，并在各个分类水平（domain，kingdom，phylum，class，order，family，genus，species）统计每个样品的群落组成。细菌分类比对的参考数据库是Silva（版本号119，选择SILVA_119_SSURef_tax_silva.fasta.gz这一数据库）。2.1.3.4.3Alpha多样性指数计算通过单样品的多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性，主要反映样品内的微生物的群落多样性。计算菌群丰度（Communityrichness）的指数主要是Chao1，Chao1数值越大，代表物种总数越多；计算菌群多样性（Communitydiversity）的指数有：香浓指数（Shannonindex）、辛普森指数（Simpsonindex）。Shannon值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。另外，采用深度指数（goods_coverage）表示特定环境样品中鉴定微生物物种数占总的物种数的比例，可用来描述特定环境样品微生物多样性的总体情况。另外，用谱系多样性（PD_wholetree：phylogeneticdiversity）来反映出特定样品中细菌多样性，即细菌亲缘关系越远，表示细菌多样性越高；反之，亲缘关系越近，细菌多样性越低。本研究中利用mothur(versionv.1.30.1)软件计算样品的Alpha多样性。2.1.3.5序列分析及系统发育树的构建通过上述方法获得OTUs序列后，参考Martinson等（2012）和Cariveau等（2014）将OTUs作为一种特性种系群进行归类，或者在GenBank中进行Blastn搜索。在GenBank核酸数据库中采用Blastn比对所测蜂种的特征种系型。采用MEGA6软件中的neighbour-joining（NJ）法构建系统发育树，参数选择Kimura2-parametermodel，自举值（bootstrap）为1000。2.1.3.6基本统计学分析采用SigmaPlot12.5（SystatSoftware,Inc.）和R软件包等统计分析软件进行基本统计学分析及图表的制作。首先对数据进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布则采用Mean±SE来描述，并对OTUs数据进行单因素方差分析（One-WayAnalysisOfVariance）；两组间的比较采用独立样本的t检验，多组间的比较采用非参数的组间行单因素方差分析（Kruskal-Wallisonewayanalysisofvarianceonranks）。2.2结果与分析2.2.1PCR电泳检测结果PCR产物目的条带大小正确（500bp左右），可进行后续实验（图2.2，部分）。对个别条带较弱的样品，重新提取DNA并进行PCR检测，保证所提DNA能进行后续实验。22 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类图2.2蜜蜂肠道细菌16SrRNAV3-V4区PCR产物的琼脂糖电泳.Fig.2.2PCRproductsofgutbacterial16srRNAV3-V4regionanalyzedbyagarosegelinA.cerana.2.2.2MiSeq测序质量分析对采集的193只中西蜂样品（A.cerana,n=162;A.mellifera,n=31）肠道DNA的16SrRNA基因的V3-V4区进行IlluminaMiSeq测序，共得到3,351,021条高质量的reads，所测序列的平均长度为446bp；平均每个样品至少有17,363±340（S.E.）个良好的序列可用于数据分析。以97%的相似度（等同种的水平）为界，平均每个样本的OTUs为38±1（S.E.）个。在所有被测样品中，其中99.99%的序列在400-500bp之间，测序结果较理想（图2.3）。图2.3MiSeq测序优化后序列长度分布信息Fig.2.3LengthdistributionoftrimedsequencesgeneratedbyMiSeq.2.2.3我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类如图2.4所示，所有测序样品中绝大部分的细菌种类分布在8个门和12个属。在门水平，优势细菌主要为变形菌门（Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）。其中Proteobacteria的数量最多（45.6±1.59%）其次是Firmicutes（35.1±1.60%）。在属水平，Lactobacillus（34.3±1.58%），Gilliamella（27.5±1.38%），Snodgrassella（11.2±1.1%）和Bifidobacterium（8.81±0.79%）为4种优势菌群。通过细菌注释和采用Blastn比对可识别多个与每种种系型OTUs相似性为97%的序列。结果发现，西方蜜蜂中发现的八大类9种细菌中（Powelletal.,2014）有8种在本研究中被检测到（图2.5），Alpha-1在本研究中很少出现。有趣的是，中蜂样品的肠道菌群的个体变异较大（附录Ⅱ）。23 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类图2.4东、西方蜜蜂肠道菌群的分布Fig.2.4GutbacterialdistributionsofA.ceranaandA.mellifera.2.2.4我国东、西方蜜蜂肠道细菌的16SrRNA基因的α多样性表2.2MiSeq测序结果总结Table2.2DatasummaryofMiSeqresults.多样性指数Totally（DiversityIndex）(N=193)总序列数TotalSequences3,351,017序列数/样品Sequencespersample17,363±340总OUTTotalOTUs364OUT数/样品OTUnumberpersample38±1aGood"Coverage(%)99.0±0b辛普森指数SimpsonDiversityIndex0.70±0.01b香浓指数ShannonDiversityIndex2.30±0.05Chao151.77±1.82PDwholetree4.03±0.10如表2.2所示，采用mothur软件以97%序列相似度为阈值生成OTU后计算OUT覆盖率（Good"Coverage）、Simpson指数、Shannon指数、Chaol指数以及PD_wholetree等多样性指数。结果表明，总序列数和单个样品的序列数均较高，OUT覆盖率数据显示99%的微生物被捕捉到，表明本研究获取的数据量能够很好地反映特定样品的细菌多样性情况。2.2.5我国东西方蜜蜂肠道细菌序列的系统进化分析大部分样品的16SrRNA基因序列和已知的西方蜜蜂和熊蜂的特定序列高度相似，主要OTU的系统发育位置见图2.4。其中八大类细菌明显分开，本研究中检测到的主要细菌也都归类到相关分支内，进化树分析的结果与细菌注释的结果也一致。在所测序的结果中，乳酸菌的OTU种类最多，多样性也较高，其分支也均位于Firm-4和Firm-5分支内（图2.6）。24 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类图2.5本研究所测肠道菌群的系统发育树Fig.2.5Phylogenetictreeofsequencesobtainedinthisstudy.2.3讨论根据中蜂形态特征和生物学习性并结合我国各省市的气候和生态条件，中蜂可分为海南中蜂、云贵中蜂、阿坝中蜂、西藏中蜂、华南中蜂、华中中蜂、滇南中蜂、北方中蜂和长白山中蜂等9个地方品种（国家畜禽遗传资源委员会,2011）。本文取样范围基本上涵盖了这9个地方品种所在的区域。因此，取样范围具有一定的代表性。基于16SrRNA扩增的第二代高通量测序平台，目前已经成为肠道菌群多样性研究的主流方法（Kozichetal.,2013;Fadroshetal.,2014;Goodrichetal.,2014）。目前也已经通过实验证实IlluminaMiSeq测序能够获得高质量的16SrRNA基因的序列数据（Fadroshetal.,2014），其测序通量和读长均较454测序长（Nelsonetal.,2014），因此能够较好的揭示肠道菌群的多样性。本文基于MiSeq测序平台对我国16个省的东方蜜蜂（A.cerana）和部分西方蜜蜂（A.mellifera）成蜂的肠道菌群多样性进行了摸底调查，总体来看，由于中蜂样本的测序个体较多，所得OUT总数（360个）也比本文所测的西方蜜蜂多（169个），也比国外报道的西方蜜蜂的OUT（251个）25 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类（Sabreeetal.,2012）数目多，但核心菌群的种类大体相似。图2.6所测乳酸菌的系统发育树Fig.2.6PhylogenetictreeofLactobacillusobtainedinthisstudy.与先前采用细菌纯培养的方法对欧洲蜜蜂的研究结果相比（GilliamandValentine,1976;GilliamandMorton,1978;Gilliametal.,1990;Gilliam,1997;EvansandArmstrong,2006;MohrandTebbe,2007），以及与采用T-RFLP方法对泰国东、西方蜜蜂（Disayathanoowat,etal.,2012）和小蜜蜂（Saraithong,etal.,2014）以及欧洲的熊蜂（KochandSchmid-Hempel,2011a）的肠道菌群研究相比，高通量测序结果能够显示出较高的肠道菌群多样性，这也充分说明先前基于纯培养的方法和传统分子生物学方法对肠道菌群多样性的研究可能由于方法的限制或者个体差异而错过一些含量较低的细菌类群。东、西方蜜蜂蜜蜂肠道菌群的多样性较其它昆虫如蚜虫，飞蛾以及甲虫低（Haynesetal.,2003;Brodericketal.,2004;Lehmanetal.,2009）。这可能与蜜蜂的取食范围较窄有关（如蜜蜂仅仅取食花粉和花蜜）。在不同国家（美国，德国，澳大利亚，瑞典，瑞士，南非等）西方蜜蜂中发现的八大类9种细菌（Martinsonetal.,2011）也有8种在本研究中被鉴定。在所测定的细菌类群中，种类较丰富的群组属于几类不同的门，其中Proteobacteria和Firmicutes数量最多，占细菌总数的80.7%，这一结果与Cox-Fosteretal.（2007）、Martinsonetal.（2011）以及Disayathanoowatetal.（2012）报道的结果一致。此外，也与Colmanetal.（2012）和Yunetal.（2014）等对大量不同种的昆虫的肠道菌群多样性的研究结果一致，这充分说明，昆虫中的优势菌群主要隶属于Proteobacteria和Firmicutes这两大门。本研究中已经确定的大多数类群和群组，在蜜蜂属和熊蜂属性的蜂类肠道中都已经发现过。这一结果也证实了先前蜜蜂和少量特定的肠道共生菌群有着共进化的关系（Martinsonetal.,2011）。说明这些在蜜蜂体内的核心菌群随宿主进化中可能比较保守，且受外界环境影响较小（Cariveauetal.,2014），并在协同进化中保留着从祖先遗传下来的主要菌群结构，并一代代传递下去。从这些细菌的系统进化关系图可以看出（图2.5）不同个体和东方蜜蜂的肠道菌的16SrRNA序列通常形成不同的分支，并与西方蜜蜂肠道的细菌分支较为类似，且核心肠道细菌并很少受到当地环境和蜂种的影响。我们在分析中还发现，优势菌群的OTUs的相对丰度在样品之间差异较大，并且一些OTU存在样品特异性。而在西方蜜蜂（Moranetal.,2012）及泰国东方蜜蜂（A.c.indicaFabricius）26 中国农业科学院博士学位论文第二章我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类（Disayathanoowatetal.,2012）的肠道菌群研究中也存在这一现象。这说明肠道菌群结构还可能受到不同影响因素的影响（DillonandDillon,2004）。另外，个体间菌群结构的差异还可能是所采集的蜜蜂个体健康状态存在差异，而健康与感病个体的肠道菌群存在很大的差异在哺乳动物上有很多报道（Holmesetal.,2011;Sekirovetal.,2012）。本研究所测细菌OTUs中，无法培养的细菌（unculturedbacteria）占总OUT的32.42%（118/364），这些细菌采用纯培养和传统分子生物学方法均无法检测到，由于蜜蜂肠道内核心菌群占细菌总数的99%以上（Sabreeetal.,2012），因此，这些含量较低且目前人工尚无法培养的菌群在蜜蜂肠道内是否发挥功能，还需要进一步研究。另外，分析中还发现，一些非特异性菌株可能是蜜蜂从环境带入体内，因为，蜜蜂体内的细菌还可能从花蜜等其他来源得到，而这些花蜜可能被其它传粉者或盗蜜者污染而引入其它细菌（Aizenberg-Gershtein,etal.,2014）。本研究采用最新的二代测序技术对我国不同省份的东方蜜蜂和部分西方蜜蜂进行摸底调查，主要是想了解我国不同生态地理环境下肠道菌群的现状。从系统进化关系来看，这些肠道常驻细菌表现出较高的保守性和较低的物种丰富性，但具有明显的高特异性。但目前的研究大部分主要基于一次采样的数据，也证实了先前对蜜蜂肠道菌研究得出的“蜜蜂肠道内主要由几种特定的细菌群体占主导地位”报道。而非核心菌群在个体间差异较大，其出现的频率也各不相同，些非核心菌群在蜜蜂肠道内的作用还需要今后的持续检测跟踪研究才能弄清其与蜜蜂健康的相关性；另外，蜜蜂个体间菌群的差异较大，同时结果也说明一些相关的OTUs的丰富度可能受一些外界条件的影响，如季节，日龄，蜂种，级型等等，这些将在后面几章展开论述。随着第三代高通量测序技术的广泛应用，为测定肠道微生物多样性和研究其功能提供了先进的技术平台（Engeletal.,2014），极大地促进昆虫-微生物群落的研究和分析水平，并将进一步揭示大量未知的保护性共生微生物（Shietal.,2010）。因此今后还需要进一步加大对蜜蜂肠道细菌群体组成的监控并深入探讨菌群的组成变化，尤其是研究肠道菌群组成和蜜蜂健康之间的关系。27 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响西方蜜蜂和东方蜜蜂起源于同一祖先（OldroydandWongsiri,2006），在长期的地理隔离、气候、生存环境以及植物分布变化等诸多因素的综合影响下，逐渐进化为两个种，并在形态结构、生物学习性和个体发育等方面表现出各自独特的生物学特性。中蜂是我国本土蜂种之一，也是东方蜜蜂的指名亚种，和西方蜜蜂一起是我目前最重要的两大蜂种之一。中蜂在我国的分布范围较广，主要分布于长江流域和南方山区，并在除新疆以外的北方各省均有分布；中蜂具有采集力强、采集效率高、采蜜时间长和善于利用零星蜜源等优点（曾志将,2007），这种东、西方蜜蜂生物学特性的差异是否导致其肠道菌群也存在差异的报道还较少。本研究主要从我国部分省市的同一地区、同一生态条件、同一流蜜期采集东、西方蜜蜂样本，通过比较分析，了解中西蜂肠道菌群的差异，从而进一步了解肠道菌群可能的影响因素。3.1材料和方法3.1.1样品采集从海南、山东、甘肃、北京和吉林5个省市的同一地区、同一蜜源期间同时采集中蜂和西蜂样品，样品采集时间为2013年5-7月。取样方法和样品保存方法同第二章2.1.1所述。共采集到50只样品（A.cerana,n=25;A.mellifera,n=25）。3.1.2材料3.1.2.1主要试剂同第二章。3.1.2.2主要仪器同第二章。3.1.3实验方法3.1.3.1蜜蜂肠道解剖和DNA提取同第二章。3.1.3.2DNA浓度检测及PCR扩增同第二章。3.1.3.3IlluminaMiSeq高通量测序同第二章。3.1.3.4生物信息学分析3.1.3.4.1OTUs分析28 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响同第二章。3.1.3.4.2物种注释同第二章。3.1.3.4.3物种丰度聚类为方便了解每个样品的物种分类及丰富度等信息，分别构建OTUs和物种注释结果的热图（Heatmap）。热图中，颜色变化反映二维矩阵或表格中的数据信息，数据值的大小可以直观地用颜色深浅来表示。热图中每小格代表其所在样品中某个OTU的相对丰度。将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度变化来反映多个样品在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。我们以各组样品排名靠前的属为基准，构建了单个样品和多个样品的特定特种聚类树，方便查看物种构成信息。3.1.3.4.4Alpha多样性指数计算同第二章。3.1.3.4.5根据OUT信息绘制稀释曲线（rarefactioncurve）稀释性曲线是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。这种曲线可用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefactioncurve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样品的测序深度情况。使用97%相似度的OTU，利用mothur做rarefaction分析，采用R语言绘制曲线图。3.1.3.4.6基于多元统计的肠道菌群的β多样性分析β多样性用来表示生物种类对环境异质性的反应，主要用来表示不同样品在微生物的群落组成上的差异。数据分析的方法包括主成分分析（PrincipalComponentAnalysis,PCA）和偏最小二乘判别分析法（PartialLeastSquares-DiscriminantAnalysis,PLS-DA）。首先进行主成分分析（PCA）（无监督的数据分析），观察各组数据的聚类并去除离群样本，然后用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行有监督的数据分析。3.1.3.4.6.1主成分分析（PCA）采用主成分分析（Principalcomponentanalysis，PCA）（无监督的模式识别方法）减少数据集的维数，同时保持数据集中对方差贡献最大的特征，从而有效地找出数据中最“主要”的元素和结构，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。该方法将多数指标转化为几个综合的指标进行分析，不考虑环境因素的影响，被广泛的运用于不同居民肠道菌群群落结构的29 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响比较中。通过分析不同样品的OTU组成可以反映样品间的差异和距离，PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴为能够最大程度反映方差的两个特征值。如样品组成越相似，反映在PCA图中的距离越近，从而观察个体或群体在物种数量和种类上的差异。3.1.3.4.6.2偏最小二乘判别分析（PLS-DA）偏最小二乘判别分析（Partialleastsquaresdiscriminationanalysis，PLS-DA）是最为典型的有监督的多变量统计学方法，是基于PLS分析基础上的用于判断微生物群落结构是否有明显差异的一种方法。3.1.3.7基本统计学分析和作图采用SigmaPlot12.5（SystatSoftware,Inc.）和R软件包等统计分析软件进行基本统计学分析及图表的制作。首先对数据进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布则采用Mean±SEM来描述，并对OTUs数据进行单因素方差分析（One-WayAnalysisOfVariance）（ANOVA）；两组间的比较采用独立样本的t检验，多组间的比较采用基于Dunn’s法的非参数的组间行单因素方差分析(Kruskal-Wallisonewayanalysisofvarianceonranks)。对中、西方蜜蜂中差异显著的细菌继续进行后验概率检验（PostHocTests），采用基于错误发现率（falsediscoveryrate,FDR）相关的P值结果分析（FDR-correctedP-valuesanalyses），在所有分析中，错误发现率设为小于0.05，ｐ<0.05具有统计学意义。采用METAGENassist工具（一种分析宏基因组数据的在线服务工具）对核心菌群分析和PCA、PLS-DA和Heatmap作图，并在这些操作之前，对数据首先进行正态化处理（见附录Ⅵ）以便进行样品间的相互比较（Arndtetal.,2012）。3.2结果与分析3.2.1我国东、西方蜜蜂肠道细菌多样性的比较分析表3.1东、西蜂肠道菌群多样性指数比较Table3.1TheComparisonofthediversityindexbetweenA.ceranaandA.mellifera.§A.ceranaA.mellifera多样性指数（DiversityIndex）(N=25)(N=25)总序列数TotalSequences454,934417,437序列书/样品Sequencespersample18,197±85816,697±1,057总OUT数TotalOTUs145151OTU数/样品OTUnumberpersample32.44±2.0638±2aGood"Coverage(%)10.999±0.00b辛普森多样性指数SimpsonDiversityIndex0.73±0.020.76±0.02香农指数ShannonDiversityIndexb2.41±0.122.7±0.10Chao144.15±3.8050.95±3.76谱系多样性PDwholetree3.57±0.173.92±0.18§表示中西蜂之间细菌多样性指标没有显著差异；细菌群落结构的差别通常通过多样性指数来反映，通过多样性指数来放映菌群的多样性和复杂性。经过对表3.1中东、西方蜜蜂的Alpha多样性指数（SimpsonShannon、Chao1和PDwholetree30 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响等）的统计分析，结果表明，中西蜂细菌的Alpha多样性无显著差异（P<0.05）。如图3.1所示，为反映当前测序量和97%相似度OTU水平上各样品的生物多样性，稀释曲线（rarefactioncurve）分析也表明样品的曲线未趋于平缓，说明测序量足以覆盖所有类群，并间接反映出样品中物种的丰富程度较高。当测序量较少时，随着测序数量的增加，发现新的OUT的数量都会显著增加，当测序量逐渐增大，新增OUT数量逐渐趋于平缓，但很多物种始终未达到平衡状态，说明随着测序量的增加，还可能发现新的种系型。图3.1MiSeq测序稀释曲线图Fig.3.1RarefactionanalysisoftheMiSeqsequencingreadsinthegut.3.2.2我国东、西方蜜蜂肠道细菌组分的比较分析表3.2东、西蜂肠道菌群组分比较（细菌门的水平）Table3.2TheComparisonofthebacteriacomponentbetweenA.ceranaandA.mellifera(phylalevel).§门（Phyla）A.cerana(N=25)A.mellifera(N=25)46.20%±4.19%53.30%±4.87%Proteobacteria14.00%±3.02%0.82%±0.39%Bacteroidetes28.00%±4.07%33.50%±4.00%Firmicutes6.26%±2.14%10.00%±1.82%Actinobacteria4.85%±2.49%2.07%±2.05%Tenericutes0.76%±0.50%0.22%±0.08%Cyanobacteria§表示中蜂和西蜂肠道细菌属的相对丰度之间在门水平上没有显著差异。31 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响表3.3东、西蜂肠道菌群组分比较（细菌属的水平）Table3.3TheComparisonofthebacteriacomponentbetweenA.ceranaandA.mellifera(generalevel).属A.ceranaA.mellifera(genera)(N=25)(N=25)Gilliamella*32.20%±3.99%20.10%±2.50%Lactobacillus25.60%±4.13%33.50%±4.00%Snodgrassella7.39%±1.65%10.10%±1.93%Bifidobacterium*6.24%±2.14%10.00%±1.82%§Flavobacteriaceae**13.70%±3.04%0.63%±0.38%§Enterobacteriaceae0.16%±0.07%0.22%±0.15%Cedecea0.03%±0.02%0.03%±0.02%§Acetobacteraceae**1.70%±0.89%6.46%±2.59%Bartonella**2.12%±1.35%15.00%±4.31%*P<0.05；**P<0.001表示中蜂和西蜂肠道细菌属的相对丰度之间有显著差异；§表示不能分类的细菌属；图3.2.中西方蜜蜂样品间细菌类群（属）的统计学比较Fig.3.2GeneralevelcomparisonsofmicrobialcomponentsbetweenA.ceranaandA.mellifera.图3.3基于属水平的东、西方蜜蜂肠道菌群的组成分析Fig.3.3ProportionalcompositionofbacteriaingeneralevelofA.ceranaandA.mellifera.在对菌群组分的分析上，一般是从细菌的门和属的水平的相对丰度来进行比较分析。在门和属的水平，含量较高的细菌的相对丰度比例如表3.2、3.3所示。中蜂和西蜂肠道细菌属的相对32 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响丰度之间在门水平上没有显著差异（P>0.05），表明中西蜂细菌的种类和组成在门水平上相对保守，主要菌群结构基本一致。在细菌属的水平（表3.3），中蜂中细菌含量最多的几类细菌分别为Gilliamella、Lactobacillus、Flavobacteriaceae、Snodgrassella和Bifidobacterium，而西方蜜蜂含量最多的分别为Lactobacillus、Gilliamella、Bartonella、Snodgrassella和Bifidobacterium。中、§西蜂核心菌群的组成存在一定的差异，中蜂的Gilliamella属（P<0.05）和Flavobacteriaceae（P<0.001）属的细菌显著高于西蜂，而西方蜜蜂的Bifidobacterium属（P<0.05）、Acetobacteraceae属（P<0.001）和Bartonella属（P<0.001）的细菌显著高于中蜂（图3.2）。蜜蜂个体的肠道菌群在属水平的组成详见图3.3。3.2.3基于多元统计方法的东、西方蜜蜂肠道菌群结构的比较分析基于PCA分析的第一主成分和第二主成分的贡献率分别为19.9%和17.4%（图3.4a）。图3.3中红点代表东方蜜蜂肠道菌群的组成，绿点代表西方蜜蜂肠道菌群的组成，PCA和PLS-DA（图3.4b）分析发现，中、西方蜜蜂样品存在明显的分离现象，且PLS-DA分析的效果更为明显。由此可知，东、西方蜜蜂由于蜂种的不同其肠道菌群存在较大差异，并聚为两类。若不考虑蜂种的影响，分析采样地点对肠道菌群的影响，通过PCA（图3.5a）和PLS-DA（图3.5b）分析表明，在不同地理区域的肠道菌群存在重叠，并未出现明显的聚类现象，说明地理区域的差异对肠道菌群组成的影响较小。图3.4基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东、西方蜜蜂肠道菌群组成分析Fig.3.4ComparisonofbacterialcommunitybetweenA.ceranaandA.melliferabasedonPCA(a)andPLS-DA(b)analysis.33 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响图3.5基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东、西方蜜蜂肠道菌群组成分析Fig.3.5ComparisonofbacterialcommunitybetweenA.ceranaandA.melliferabyPCA(a)andPLS-DA(b).我们从属水平对含量较高的24个细菌物种的OUT进行物种丰富度聚类。图3.6和图3.7展示了中、西蜂在属水平上的相对丰度变化，下方标注为细菌名词，右侧为样品名称，上面的颜色刻度表征样品所富含的细菌相对丰度。结果表明中、西方蜜蜂也明显聚为两个类群。在OUT水平，东、西方蜜蜂间差异较大的细菌种类见附录Ⅲ。图3.6基于属水平上的东、西方蜜蜂肠道菌群物种丰度聚类图Fig.3.6AbundancedistributionofA.ceranaandA.melliferainGeneralevel.34 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响图3.7基于属水平和不同分布地区的东、西方蜜蜂肠道菌群物种丰度聚类图Fig.3.7AbundancedistributionofA.ceranaandA.melliferainGeneralevel.3.3讨论本研究对5个地点的东、西蜜蜂肠道菌群进行了调查，每个点所采集的样品处于同一地区，蜜源相同，采集的季节和时间也相似，我们比较了处于相似生态条件下蜜蜂属两个不同蜂种间肠道菌群的差异。总体上来看，大部分样品的肠道细菌中主要以Lactobacillus,Snodgrassella和Gilliamella这3个属的细菌为主；一些环境中的细菌如肠杆菌科（Enterobacteriaceae）内的一些属在东、西方蜜蜂中也有少量分布（表3.3,图3.2）。在样本量相同的情况下，西方蜜蜂的OUT总数和每个个体的平均OUT要略高于东方蜜蜂，这与Disayathanoowatetal.（2012）采用T-RFLP技术对泰国东（A.c.indinca）、西方蜜蜂的研究结果一致。这表明一些细菌的共生关系可以在蜜蜂属内跨越。从PCA和PLS-DA的分析结果来看，东西方蜜蜂很明显的分开（图3.4），尽管两个蜂种的采样时间、地点和花期都大致大致相似，但由于不同的采集时间，不同种类的蜜源以及不同大小的蜜蜂对一些花的采集偏好等因素影响，不同蜜蜂种类的食物分区也有所不同（Oldroydetal.,1992），因此，这可能导致引入不同的细菌到蜂箱中，也可能进入蜜蜂肠道。此外，东方蜜蜂善于采集零星蜜源（Xuetal.,2009），而西方蜜蜂利用大宗蜜源的能力较强，因此，尽管在同一地区同一蜜源采样，由于东西方蜜蜂获取蜜源的习惯存在差异，因而造成采集的食物多样性存在一35 中国农业科学院博士学位论文第三章蜂种因素对肠道菌群结构的影响定差异，因而可能引起两个蜂种肠道菌群的差异。本研究中A.cerana在不同地点的蜂群中存在较大差异，尽管在每个点的蜂群位于同一花期内，这种同一蜂群的个体之间肠道菌群存在较大的差异的现象在先前的一些研究中也发现过（GilliamandValentine,1976;MohrandTebbe,2006;Moranetal.，2012），可能是一些环境因素如季节，地点，及消化的花粉类型等引起（GilliamandMorton,1978;Gilliametal.,1988;MohrandTebbe,2006;Babendreieretal.,2007）。另外，东、西方蜜蜂肠道菌群结构的差异，也可能是蜂群种之间的差异造成其肠道生理学和形态学也出现差异，或者蜂群生活史的差异，从而影响宿主之间细菌的传播（Moranetal.,2012）。尽管核心菌群在不同的研究中比较类似，但这些细菌的相对丰富度在不同样品内变化较大。在某种程度上，这种差异可能来自不同的影响因素，如DNA提取方法和PCR引物的不同；甚至采用的研究方法都相同时，在同一个研究中，不同蜂群之间和样品个体之间的肠道菌群也表现出大量的差异（图3.2）（Sabreeetal.,2012;Martinsonetal.,2012;Moranetal.,2012）。另外，肠道菌群的变异，包括可能的功能差异，可能是蜜蜂生物学和蜂群健康的一个重要因素，如同肠道菌群的变异在人类健康和其它动物上的应用一样（Kauetal.,2011;Moranetal.,2012）。本研究中Gilliamella属和Lactobacillus属均为东、西方蜜蜂样品中含量最高的两个属，这与泰国（Disayathanoowatetal.,2012）及韩国（Ahnetal.,2012）对东、西方蜜蜂的研究结果存在一定差异，也与美国报道的西方蜜蜂和熊蜂属中G.apicola和S.alvi为两大优势细菌的报道存在差异（Martinsonetal.,2011;Sabreeetal.,2012;Moranetal.,2012）。Lactobacillussp.在东、西方蜜蜂样品中保持稳定且不存在显著差异，表明这些细菌在蜜蜂常规的新陈代谢中具有重要的作用。西方蜜蜂中报道的优势菌群在我国的东西方蜜蜂中也有较高的出现频率。东方蜜蜂的Gilliamella属细菌含量最高且显著高于西方蜜蜂，通过对G.apicola和S.alvi菌株的全基因组测序表明，这两种细菌在体内具有不同的代谢作用，前者主要是分解发酵糖类，后者是羧酸的氧化剂，它们一起构成互养网络从而将代谢资源分隔开来（Martinsonetal.,2014）；因此，这种差异可能与东方蜜蜂善于采集零星蜜、粉源的特性有关，其较高的G.apicola细菌含量可能有利于分解代谢不同来源的花粉和花蜜有关。而LAB（乳酸菌）（包括Bifidobacteriumspp.）在内的乳酸菌群对宿主健康的的有益作用已经得到较广泛的研究，如调节肠道菌群，产生抗菌物质，增强免疫系统以及产生维生素等作用（BiavatiandMattarelli,2006）。因此，这些细菌在蜜蜂体内大量存在与其所发挥的功能密切相关。此外，西方蜜蜂中双歧杆菌属（Bifidobacterium），巴尔通氏体属（Bartonella），Acetobacteraceae科相关的OUT出现的频率较高，而东方蜜蜂中黄杆菌科（Flavobacteriaceae）相关的OUT较高；这一结果与Ahnetal.（2012）的报道存在一定的差异。Bifidobacterium属的细菌被认为是非致病菌并对宿主具有益生作用，而Bartonella，Flavobacteriaceae对蜜蜂是否有致病性还需要进一步研究。本研究证实了同一地点的两个种的蜜蜂栖息着不同的肠道菌群，并且这些菌群结构受地理区域的影响较小，蜂种的差异是造成这种菌群结构分化的关键。目前，蜜蜂肠道菌群多样性已经引起世界各国的关注，确定调节肠道菌群的影响因素可以帮助我们理解蜂群对害虫和疾病的敏感性，这对农业经济具有潜在的重要性。36 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析蜜蜂个体在蜂群中通常以三型蜂的形式存在，即1只蜂王，成千上万只工蜂和数百只季节性出现的雄蜂组成。蜂王和工蜂性别相同,但它们受环境影响而表现出不同的形态结构、职能和行为，这种现象被称为“级型分化”（West-Eberhard,1989）。蜂群中三型蜂形态各异，分工也各不相同。蜂王个体大，生殖器官发育成熟，没有花粉筐、臭腺、蜡腺，其蛰针倒刺也退化，同时，蜂王也不参与采集和任何箱内哺育活动，专职产卵，寿命可达3-5年；工蜂个体较小，生殖器官发育不完全，没有受精囊，具有花粉筐、蛰针倒刺、臭腺和蜡腺，蜂群内所有外勤和内勤活动几乎都有工蜂承担，寿命在生产季节约35d，越冬期可达180余天；而雄蜂则是蜂群中的季节性产物，主要产生于繁殖季节，平均寿命只有22d，不参与采集和哺育，其主要职能是与处女王交配。三型蜂从卵到成虫羽化，东方蜜蜂中分别为16d，20d，23d（Hooper,1991;张复兴,1998;陈盛禄,2001;曾志将,2009;吴杰,2012）。在人类等哺乳动物中，有关雌雄肠道菌群的差异已经有很多研究，并从物种、饮食以及疾病等角度证实雌雄之间存在差异。蜜蜂作为级型分化的典型代表，还未见专门针对蜜蜂不同级型肠道菌群差异的研究报告,本研究采用MiSeq高通量测序平台对三型蜂肠道菌群多样性进行了测定，并对三型蜂肠道菌群的差异进行了初步探讨。4.1材料和方法4.1.1样品采集从重庆南川区和北京密云县采集中华蜜蜂三型蜂样本，每群5只工蜂，雄蜂5只，蜂王4-5只。采集时间为2014年5月。取样方法和样品保存方法同第二章2.1.1所述。4.1.2材料4.1.2.1主要试剂同第二章。4.1.2.2主要仪器同第二章。4.1.3实验方法同第二章，第三章。4.2结果与分析4.2.1东方蜜蜂三型蜂肠道细菌多样性指数的比较分析37 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析表4.1.东方蜜蜂三型蜂肠道菌群多样性指数比较Table4.1Comparisonofthediversityindexamongqueen,workeranddroneofA.cerana.多样性指数QueenWorkerDrone（DiversityIndex）(N=4)(N=5)(N=5)总序列数TotalSequences58,57799,688112,155序列数/样品Sequencespersample14,644±51819,938±3,03422,431±2,540总OUT数TotalOTUs1387790OTU数/样品OTUnumberpersample54±1538±342±6Good"Coverage(%)0.999±0.00020.999±0.00020.999±0.0002辛普森多样性指数SimpsonDiversityIndex0.445±0.13baab0.73±0.040.51±0.06香农指数ShannonDiversityIndex1.26±0.36bab2.36±0.251.39±0.13Chao185.76±16.8456.70±5.5754.34±8.71PDwholetree5.43±0.964.24±0.244.23±0.51图4.1MiSeq测序稀释曲线图Fig.4.1RarefactionanalysisoftheMiSeqsequencingreadsinthegutmicrobiotaofqueen,workeranddroneofA.cerana.从表4.1可知，蜂王的OUT总数最高，工蜂最少，每个个体的平均OUT数也是蜂王最高，工蜂最小；从Alpha多样性指数来看，深度指数（goods_coverage）在三型蜂间没有差异；工蜂的Simpson指数最高，雄蜂次之，蜂王最小，说明蜂王的菌群群落多样性最高；在Shannon指数上，工蜂的值最大，雄蜂次之，蜂王最小。Chao1和PD_wholetree在三型蜂间无显著差异。从稀释曲线图（图4.1）可得知，大部分样品随着测序数量的不断增大，新增OUT数量逐渐趋于平缓，但部分物种始终未达到平衡状态，说明随着测序量的增加，还可能发现新的种系型。4.2.2中华蜜蜂三型蜂肠道细菌组分的比较分析38 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析表4.2东方蜜蜂三型蜂之间肠道菌群组分比较（细菌属的水平）Table4.2TheComparisonofthebacteriacomponentamongqueen,workeranddroneofA.cerana.(generalevel)属QueenWorkerDrone（genera）(N=5)(N=5)(N=4)abcLactobacillus78.40%±11.3%*52.10%±10.30%*19.50%±4.46%*aaaBifidobacterium5.62%±5.6%15.90%±4.99%0.65%±0.45%abcSnodgrassella0.18%±0.093%10.80%±4.46%59.00%±8.14%aaa4.40%±4.25%19.80%±4.69%18.20%±10.30%Gilliamella§aaaFlavobacteriaceae0.25%±0.185%0.07%±0.03%2.16%±2.04%aaaPseudomonas0.20%±0.113%0.02%±0.02%0.02%±0.00%字母不同表示差异显著，*表示P<0.01；未加*表示P=0.05水平上差异显著；§表示不能分类的细菌属；三型蜂之间差异最大的是乳酸菌的含量，蜂王含量最高，而雄蜂最少，三者之间差异显著（P<0.01）。另外，Snodgrassella属的细菌在三型蜂之间存在显著差异（P<0.05），其中雄蜂中含量最高，而蜂王中含量最少。其余细菌的含量则差异不显著。基于属水平的三型蜂个体肠道菌群的组成见图4.1。图.4.1基于属水平的东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的组成分析Fig.4.1ProportionalcompositionofbacteriaingeneralevelofA.ceranaamongqueen,workeranddrone.4.2.3基于多元统计方法的东方蜜蜂三型蜂肠道菌群结构的比较分析通过PCA（图4.2a）和PLS-DA（图4.2b）分析发现，蜂王、工蜂和雄蜂样品明显分离，且采用PLS-DA方法分离效果更明显；而对蜂王来自非同一地区和分析结果也表现出明显的分离现象（图4.3），由此可知，三型蜂间肠道菌群存在较大差异。三型蜂的肠道菌群被分为明显的两大簇（图4.4），其中，蜂王和工蜂聚为一簇，这一大类中，蜂王和工蜂又分为两个小簇；而雄蜂单独聚为一簇。39 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析图4.2基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东方蜜蜂三型蜂肠道菌群组成分析Fig4.2Comparisonofbacterialcommunityamongqueen,workeranddroneofA.ceranabasedonPCA(a)andPLS-DA(b)analysis..图4.3基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东方蜜蜂三型蜂肠道菌群组成分析Fig.4.3Comparisonofbacterialcommunityamongqueen,workeranddroneofA.ceranabasedonPCA(a)andPLS-DA(b)analysis.4.3讨论社会性昆虫（如蚂蚁，蜜蜂和一些胡蜂）具有不同的级型，并具有特定的社会分工（OsterandWilson,1978），一般蜂王专职产卵且寿命长达多年，缺乏工蜂所具有的野外采集等能力，而工蜂担负防御，采集以及哺育幼蜂等职责，而雄蜂的唯一职责是与处女王交配且平均寿命只有22d（Hooper,1991）。我们采用高通量测序的方法，首次对同一蜂场的东方蜜蜂三型蜂的肠道菌群结构进行了测定，初步结果显示三型蜂肠道菌群存在明显不同（图4.2），而采集自不同蜂场的蜂王一起放一起分析也得到类似的结果（图4.3），由此可见，级型差异可能是三型蜂肠道菌群存在分化的主要原因。性别不同，肠道菌群存在差异在哺乳动物中已有报道，如通过去雄化处理后证实雄激素可以影响肠道菌群，表明雌性和雄性的肠道菌群存在差异（Yurkovetskiyetal.,2013；Markleetal.,2013）。40 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析图4.4东方蜜蜂三型蜂肠道菌群物种丰度聚类图Fig.4.4Abundancedistributionofqueen,workeranddroneofA.cerana.三型蜂中，蜂王肠道中乳酸菌含量最高，这可能与乳酸菌对健康的重要调节作用这一功能相关，因为乳酸菌已被证实具有重要的益生作用，可以诱发先天免疫系统从而能克服病原菌攻击（EvansandLopez,2004），目前也被认为是蜜蜂健康的调节剂（Vasquez,etal.,2012）。研究表明，Lactobacillus属的一些细菌具有保护蜜蜂幼虫抵抗幼虫芽孢杆菌（Paenibacilluslarva）和蜂房球菌（Melissococcusplutonius）的功能，而这两种菌分别是美洲、欧洲幼虫腐臭病的病原菌（Forsgrenetal.,2010;Vasquezetal.,2012）。这些乳酸菌的存在，很可能在保持蜂王健康上发挥了重要的作用，生产实践中也发现，蜂王在蜂群中对疾病敏感度最低。有学者还从蜜蜂蜜囊中分离培养出其它一些乳酸菌属的细菌（VasquezandOlofsson2009，Butler,E.,etal.,2013），这些乳酸菌也在蜂群加工和存储食物中起到了一定的作用（Andersonetal.,2014），并在花粉向蜂粮的酿造过程中参与了等营养成份的转化等过程（Babendreieretal.,2007;Mattilaetal.,2012），而这一过程主要由工蜂来完成，由于雄蜂不参与任何食物加工和哺育等活动，因此，工蜂中乳酸菌的含量要高于雄蜂。有意思的事，雄蜂中Snodgrassella属（S.alvi）细菌含量最高，而S.alvi已被证实在熊蜂上具有提高宿主蜂对寄生的短膜虫（Crithidiabombi）的抵抗作用（KochandSchmid-Hempel,2011b），因此，雄蜂中较高含量的S.alvi存在，是否与这一菌群的保护功能有关，还有待扩大采样量进一步证实。蜂王一生都取食蜂王浆，其对蜂蜜和花粉的消耗较少，S.alvi和G.apicola这两种细菌在分解发酵糖类和氧化羧酸（如消化蜂蜜和花粉等糖类物质）上发挥着重要的功能（Martinsonetal.,2014），因而蜂王中S.alvi含量最少，而G.apicola的含量也较低，这可能与蜂王的饮食特性有关。三型蜂是研究昆虫寿命的理想模型。蜂群中蜂王寿命最长（3-5y），工蜂次之（35-180d），雄蜂寿命最短。但蜜蜂的寿命与肠道菌群是否有关联，目前尚无研究，但在果蝇中的研究表明在果蝇成虫的不同生活阶段，肠道细菌的存在可以延长或者缩短宿主的寿命（Brummeletal.,2004）。另外，在熊蜂的研究发现，抗生素处理后的熊蜂死亡率增加，寿命缩短（KochandSchmid-Hempel,41 中国农业科学院博士学位论文第四章东方蜜蜂三型蜂肠道菌群的多样性分析2011b），这也间接证实肠道菌群的丢失会引起熊蜂寿命的缩短。目前，我们只是初步对三型蜂进行的部分取样，而检测结果也充分说明三型蜂的菌群结构存在较大差异，而这些差异也说明肠道菌的一些可能的功能还有待进一步揭示。随着研究技术的深入，我们对肠道菌群重要功能的认识也将越来越多，肠道中细菌定殖对宿主正常发育和生理的各个方面的作用也有待一一揭示。42 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化肠道菌群在蜜蜂体内的形成是一个由少到多、逐步积累的过程。通过对不同发育阶段西方蜜蜂肠道菌群的研究证实蜜蜂幼蜂出房后主要通过与蜂箱内其它成年工蜂的社会性接触获得相关细菌（Martinsonetal.,2012）。如交哺作用（trophallaxis）、个体间的交流（如哺育行为、梳理行为）都有利于细菌的水平传播，从而促使新出房工蜂形成稳定的肠道菌群（Köhleretal.,2012;MartinsonandMoyetal.,2012）。成年工蜂在不同日龄阶段执行一些连续的任务，这使得它们可能面对不同的微生物：年轻的工蜂在箱内哺育幼虫，较老点的工蜂随着箱外蜜源的变化采集花粉和花蜜（Amentetal.,2008;Gilliam,1997;Seeley,1985）。在西方蜜蜂的相关研究中，采集的日龄范围仅为1，9，19和30日龄，本研究中，我们采用高通量测序和qPCR方法对东方蜜蜂不同日龄阶段的肠道菌群多样性进行初步探讨，进一步了解东方蜜蜂肠道菌群形成过程中的动态变化。5.1材料和方法5.1.1样品采集中华蜜蜂样本于2013年7-8月取自重庆市畜牧科学院实验蜂场的3群蜜蜂。为了获得已知日龄的成年工蜂，每群选3脾封盖子脾，抖掉成年蜜蜂，分别放入温度保持为34°C并具有一定湿度的3个恒温培养箱（模拟箱内条件）中，用黑色纸板挡住玻璃以保持箱内为黑暗环境，蜂群放入培养24h。每群蜂分别取10只刚出房的工（1日龄蜜蜂），同时采用漆状的颜料对新出房的工蜂背板进行标记（每群标记个数>200只，每群标记的颜色各不相同），然后放回原蜂群，让这些工蜂自然成熟。随后，分别在第5,10,15,20,25和第30天开箱采集工蜂样品，每群取10只。样品存入75%酒精-20℃存储。同时取部分幼虫和蛹的样品。另外，从上述采样蜂群中采集每个巢脾的巢房中的蜂粮混合物。将每群中不同巢脾中的蜂粮进行混合，采用细菌通用引物（27F/1492R,表5.1）对这些蜂粮DNA中直接进行PCR。电泳检测后选其中2个样品（P1，P2）送交公司进行高通量测序。5.1.2材料5.1.2.1主要试剂®DNA提取试剂盒（WizardSV96GenomicDNAPurificationSystem，Promega公司，美国）；KrebsRingersolution购自Merck公司（美国）；SybrGreenqPCRMasterMix（AppliedBiosystems,Calif.,USA）；2×TaqPCRMasterMix（北京博迈德科技有限公司）；qPCR引物合成由上海生工生物技术有限公司完成。T载体（pEASY-T1SimpleCloningKit，北京全式金生物技术有限公司）5.1.2.2主要仪器43 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化PCR扩增仪（5331，Eppendorf公司，德国）；实时荧光定量PCR仪（qPCR）（ABI7500FAST，ABI公司，美国）；核酸电泳仪（DYY-6C，六一仪器厂，北京）；凝胶成像系统（ChampGel-3200，赛智创业科技公司，北京）；解剖镜（DP71，Olympus公司，日本）。5.1.3实验方法5.1.3.1DNA提取DNA提取方法同第二章。5.1.3.2高通量测序方法和分析同第二章和第三章。5.1.3.3不同日龄工蜂肠道菌的qPCR检测5.1.3.3.1质粒标准品的构建采用绝对定量的方法检测成年工蜂肠道菌群的丰富度，所检测的四种细菌分别为Bifidobacterium,S.alvi,G.apicolaandFirm-5（Lactobacillus）。引物序列见表5.1。采用A.cerana的β-actin基因进行PCR扩增验证样品DNA质量是否适合进行qPCR。以不同发育阶段工蜂肠道DNA为模板，采用这四种引物分别进行PCR扩增，回收PCR产物，并与pEASY-T1载体连接做TA克隆，通过引物扩增出来目的序列，然后把产物进行胶回收，与T载体链接，转化感受态细胞，固体培养基过夜培养，挑选阳性单菌落，并进行菌液PCR鉴定，最后提取质粒，测定其浓度和电泳检测。构建好的质粒经测序鉴定无误后测定质粒OD260值，通过公式换算成拷贝数（copies/µL）。10倍梯度稀释构建好的各质粒，共稀释成5个浓度梯度，每个浓度重复2次进行荧光定量PCR检测，绘制标准曲线（引物电泳图、溶解曲线及扩增曲线见附录Ⅳ、Ⅳ）。5.1.3.3.2PCR体系和反应条件反应体系（25μL）如下：试剂20μL体系2xmix12.5μLForwardPrimer(10μM)0.5μLReversePrimer(10μM)0.5μLTemplateDNA(cDNA)2μLRNase-FreeWater9.5μL反应条件为：95℃变性10min；然后按95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。溶解曲线分析：55-98℃，0.5℃/read1sechold。每组样品重复测定3次。用每微升肠道基因组DNA样品中检测到的细菌基因拷贝数（copies/µL）表示细菌的数量。44 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化表5.1qPCR引物序列Table5.1PrimersusedforquantitativePCR,microbiotadetectionandquantification.PrimernameSpeciesSequence(5"-3")SizeReferencesSnod-FGGAATTTCTTAGAGATAGGAAAGTG136Lietal.(2012)S.alviSnod-RTTAATGATGGCAACTAATGACAALact-FTAACGCATTAAGCACTCC271Lietal.(2012)LactobacillusLact-RGCTGGCAACTAATAATAGGGill-FCCTTTGTTGCCATCGATTAGG249徐龙龙等(2014)G.apicolaGill-RGACATTCTGATTCACGATTACTAGCBifi-FCAAGCGAGAGTGAGTGTACC166徐龙龙等(2014)BifidobacteriumBifi-FGCCGATCCACCGTTAAGC27-FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG1465KochandbacteriaSchmid-Hempel(2011)1492-RACGGYTACCTTGTTACGACTT5.1.3.4基本统计学分析和作图基于OTUs数据的统计分析详见第二、三章；qPCR结果数据分析和作图采用GraphPadPrismversion6.01forWindows软件（GraphPadSoftware,California,USA）进行。不同日龄间的比较采用单因素方差分析（ANOVAwithTukey"smultiplecomparisonstest）。5.2结果与分析5.2.1东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的Alpha多样性及组成分析表.5.2不同日龄东方蜜蜂肠道菌群的Alpha多样性Table5.2AlphadiversityofgutmicrobiotaindifferentagesofA.cerana.DaySequencesOTUsGoodsCoverageShannonSimpsonChao1PD_whole_treed1231651340.9997411.260.23135.1510.74d521125370.999290.570.1472.004.52d10_112939350.9990730.780.2244.434.58d10_210715300.9986931.890.6948.203.41d10_310905320.9990831.910.6143.253.92d1511195290.9993751.980.6831.633.58d20_113687390.9989771.840.6352.004.45d20_213724400.9991982.070.6245.504.03d20_310292250.9991261.600.5834.003.00d2515829420.9986731.870.6784.003.72d30_118517220.9997842.060.7223.502.74d30_211309450.9982312.340.7583.004.76d30_314984530.9986652.940.8384.674.7945 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化图5.1不同日龄工蜂和蜂粮的等级-多度曲线图5.2不同日龄工蜂和蜂粮的Shannon-Wiener曲线Fig.5.1Rank-abundancedistributioncurveindifferentFig.5.2Shannon-WienercurveindifferentdaysanddaysandstagesofA.ceranaworkersandbeebread.stagesofA.ceranaworkersandbeebread.东方蜜蜂不同发育阶段的Alpha多样性指数如表5.1所示。从表1可知，整体上来看，随着日龄增加，Chao1指数和shannon指数具有不断增加的趋势，由于OUT数也呈现出增加的趋势，说明东方蜜蜂肠道菌群多样性随着日龄的增加细菌的丰富度也有增加的趋势（由于1日龄和5日龄样品存在污染，所以1、5日龄的OUT数仅作为参考）。每条Rank-abundance分布曲线对应一个样本，横坐标表示的是OUT（物种）的丰度排列顺序，纵坐标对应的是OUT所占相对丰度比例，曲线趋于水平则表示样品中各物种所占比例相似，曲线整体斜率越大，表示样品中各物种所占比例差异较大。横轴上的曲线越宽，表示物种的组成越丰富；曲线越平坦表示物种的均匀度越高。从从图5.1可知，1日龄样本均匀度最差（1日龄样品有部分污染），其余日龄个体的曲线宽度也较窄，可能与送测样本的DNA浓度较低有关。由图5.2可知，所有测序样本曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。基于16SrRNA基因深度测序技术的测序结果表明，每个日龄段的样品至少有10,292个良好的序列用于数据分析（见表5.2）。不同日龄样品中肠道共生菌的差异较大，所有样品中Lactobacillus、Snodgrassella、Gilliamella和Bifidobacterium四个属的细菌的丰富度按先后顺序依次减少。蜂粮中的菌群组成和蜜蜂显著不同（图5.3），其含量最多的细菌主要为蓝藻门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），其平均含量分别占70.9%和28.4%，其次是厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的细菌，分别占0.44%和0.17%；我们还发现，蜜蜂中数量最多的四种属的细菌Lactobacillus、Snodgrassella、Gilliamella和Bifidobacterium在蜂粮中的平均含量分别为0.36%、0.05%、0.43%和0.11%“。另外，广泛分布于节肢动物生殖组织内的Wolbachia属细菌在蜂粮中也占有0.04%的含量。46 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化图.5.3基于门水平的东方蜜蜂不同日龄的肠道菌群的图.5.4基于属水平的东方蜜蜂不同日龄的肠道菌群组成的组成Fig.5.3ProportionalcompositionofFig.5.4ProportionalcompositionofbacteriaingenerabacteriainphylumlevelofA.ceranaindifferentlifestage.levelofA.ceranaindifferentlifestage.5.2.2东方蜜蜂不同日龄肠道菌群的PCA分析图5.5基于PCA的不同日龄东方蜜蜂肠道菌群和蜂粮的组成分析Fig.5.5ComparisonofbacterialcommunityofdifferentagesinA.ceranaandbeebreadbyPCAanalysis.PCA（图5.5）分析表明，东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群存在一定差异，1日龄、5日龄和10日龄工蜂肠道菌群结构区分明显，随着日龄增加，肠道菌群出现交叠现象，30日龄的菌群结构与其它日龄段可以区分开，但区分不明显；蜂粮中的菌群结构与蜜蜂肠道菌群结构明显不同。通过图5.6的聚类树和柱状图的组合分析也能明显看出，1日龄和30日龄为单独一个分支，5日龄也单独为一枝但与10日龄的距离较近，10，15和20这三个日龄段的肠道菌群结构位于一个分支内。这也说明，不同日龄段，肠道菌群结构存在较大差异。不同发育阶段的东方蜜蜂肠道菌群被分为明显的两个簇（图5.7），其中假单胞杆菌属（Pseudomonas）的细菌在30和10日龄，30和20日龄间差异显著（P<0.01,FDR<0.01）。47 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化图.5.6不同日龄东方蜜蜂肠道菌群和蜂粮组成的相似性柱状图Fig.5.6SimiliarityandtaxonomiccompositionofdifferentagesinA.ceranaandbeebread.图5.7不同发育阶段东方蜜蜂肠道菌群物种丰度聚类图Fig.5.1AbundancedistributionofA.ceranainOUT(left)andGeneralevel(right)duringdifferentlifestage.48 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化5.2.3四种共生菌在不同日龄东方蜜蜂肠道中的动态变化工蜂日龄对4种肠道菌的影响很大，幼虫和1日龄工蜂几乎检测不到4种种系型（phylotypes）8的共生菌，而成年工蜂的的16SrRNA基因的拷贝数可达10。由于1日龄个体表现出较少的肠道菌且不能代表成熟工蜂，因此，本研究中主要分析5日龄以后的菌群动态变化。4种细菌整体上的变化趋势非常相似，均表现为先上升达到一个峰值后再逐步下降的过程（图5.7）。其中，乳酸菌（Lactobacillus）达到峰值的日龄最早，从5日龄起便以较高的相对表达量缓慢上升并在10日龄达到峰值，其余三种细菌从5日龄起的相对表达量均较低。S.alvi和Bifidobacterium这2种细菌的16SrRNA基因拷贝数在15日龄达到最大值，G.apicola在20日龄达到峰值；4种细菌在达到各自的峰值后，随着日龄的增加，细菌总数开始下降，其中G.apicola（P=0.863,Tukey"sHSD）和Bifidobacterium（P=0.863,Tukey"sHSD）这2种细菌在25-30日龄间保持稳定（图5.7b,c）；S.alvi和Lactobacillus在20-25日龄期间保持稳定(P值分别为0.532和0.939,Tukey"sHSD)，到30日龄后开始下降(图5.7a,c)。图5.7不同发育阶段中蜂肠道菌群的qPCR分析Fig.5.7AbundancesofS.alvi(a),G.apicola(b),Lactobacillus(c)andBifidobacterium(d)indifferentdaysandstagesofA.ceranaadultworkers,measuredascopiesofthe16SrRNAgene.Lettersaboveconfidenceintervals(1standarddeviation)representsignificancelevels(Tukey’sHSD).5.3讨论我们的结果发现中华蜜蜂肠道定殖的菌群相对一致，主要是Lactobacillus,S.alvi,G.apicola,和Bifidobacterium这几种类型，并且受宿主日龄的影响。肠道菌群的丰富度和群落结构随着蜜蜂的生活史而变化。由于1日龄工蜂样本在采样运输中造成污染，因此，我们忽略1日龄的测序结果中的污染菌的影响。基于qPCR方法对西方蜜蜂肠道菌群的形成过程的研究结果表明，幼虫和刚出房的工蜂几乎不包含细菌，从4-6日龄开始蜜蜂肠道中特定细菌群落开始大量增加（Martinsonetal.,2012）。本研究也表明，成年工蜂中分布较多的共生菌在1日龄工蜂肠道中存在很少，1日龄样本中，乳酸菌的数量相对较多，Gilliamella、属Bifidobacterium属和Snodgrassella属的OUT49 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化出现的次数分别为174次，85次和35次（占OUT总数的百分比分别为0.75%，0.37%和0.15%），由于其含量较低，因此qPCR方法较难检测到；但这些成年蜂中常见的共生菌在1日龄中的确存在，也证实了蜜蜂体内的优势菌群是从1日龄开始不断积累增加的过程。基于qPCR的检测结果表明，随着日龄增加，四种肠道共生菌逐渐增加，达到高峰后下降，并在一定时期保持稳定，相似的趋势在熊蜂肠道菌群的研究中也有报道（徐龙龙等，2014）。但高通量测序结果并未得出这一现象，可能是样本间存在较大差异有关，也可能是由于我们用于qPCR检测时将5只日龄一致的工蜂DNA进行等体积混合，因而中和了样品间的个体差异。通过对蜂粮中细菌组分的分析表明，蜂粮的肠道菌群结构和蜜蜂完全不同（图5.5），有趣的是，蜂粮中含有蜜蜂肠道中含量最高的四种细菌，但这些菌的含量在蜂粮中均在1%以下。很可能是蜜蜂在蜂粮加工过程中通过唾液等混入。而Martinsonetal.（2012）通过对蜂粮DNA中特定种系型直接进行PCR的方法检测蜜蜂肠道中的几种主要细菌种系型，但发现蜂粮中缺少大多数的菌型。而我们采用高通量测序的方法从蜂粮中检测到这几种主要细菌，尽管含量较低，但这也直接证实蜂粮可以传播肠道菌。因此，在已经证实的蜜蜂可以通过接触老蜂、接触蜂巢或通过子脾巢房获得细菌外（Martinsonetal.,2012），通过蜂粮传播细菌也得到了证实。Kochetal.（2013）报道熊蜂中共生菌（G.apicola和S.alvi）可以通过母代垂直传播给子代,而蜜蜂主要通过接触蜂箱，子脾和与老年工蜂的社会性接触获得细菌（MartinsonandMoyetal.,2012;Powelletal.,2014），中蜂也可能通过这种社会性接触或接触蜂箱环境而获得细菌。当蜜蜂成年时，它们面对的环境中充满了细菌（Haydak,1970）。1-3日龄的工蜂，它们主要任务是清理巢房等简单的箱内活动（Seeley,1982）；从4-12日龄，它们主要作为哺育蜂将蛋白分泌物传给箱内的幼蜂和老年蜂（Ribbands,1953;Seeley,1982;Crailsheim,1991,1992）。对中蜂来说，其乳酸菌的含量在10日龄达到最高值，表明乳酸菌可能参与了幼虫食物的加工。从12-21日龄，蜜蜂参与到更多的箱内活动中，如整理巢脾，随后参与到花蜜加工等任务中（Trumboetal.,1997）。因此在12-21日龄，最重要的生理过程是参与到花蜜和蜂粮的加工中。有趣的是有三种细菌在15-20日龄达到最高峰，很可能是这些细菌参与到食物的加工中有关。宏基因组的研究结果也证实G.apicola、Firm（Lactobacillus）和Bifidobacterium具有与碳水化合物分解相关的功能，同时也证实由Firm（Lactobacillus）和Bifidobacterium组成的乳酸菌群（LAB）参与到花蜜的加工和碳水化合物的代谢中（Engeletal.,2012;Butler,2013）。西方蜜蜂20日龄后主要集中进行采集花粉，花蜜，蜂胶和水（Robinson,1992;Calderone,1998）。这些行为的转变可能导致肠道菌群的变化，Martinsonetal.（2012）蜜蜂一生中肠道菌群保持稳定，这一报道和我们的结果并不一致，可能是种的不同，蜂群的不同的原因。我们的研究和西方蜜蜂中的研究都只采集了少数几群蜂，而在蜂群在30日龄后的变化情况还需要进一步调查。本研究中，肠道菌群的数量从15或20日龄开始下降，并在20-25日龄（S.alvi和Lactobacillus）和25-30日龄（G.apicola和Bifidobacterium）期间保持稳定，而Martinsonetal.（2012）的报道表明，西方蜜蜂肠道菌群在9,19和30日龄保持稳定，但这一研究未对15日龄取样。我们的研究显示15日龄后肠道菌群的数量开始出现下降，这种下降也可能是由于蜜蜂第一次出房采集排泄的缘故（蜜蜂一般在20日龄后首次出房排泄，但在蜜源期出房采集时间可能提前，因此15日龄前也可能已出房排泄）。50 中国农业科学院博士学位论文第五章东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群的组成及动态变化我们的研究概述了中华蜜蜂肠道菌群在不同生活阶段的动态变化情况，但造成蜜蜂肠道菌群增加或减少的机制还不清楚。肠道菌群在蜜蜂健康和抵抗生物或非生物压力上具有潜在的应用价值（CrottiandSansonnoetal.,2013），最近的研究还证实了肠道菌在成年熊蜂体内的Beta（G.apicola）或Gamma-1（G.apicola）具有抵抗寄生性病原体的作用（KochandSchmid-Hempel,2011b），这也进一步说明蜜蜂（A.mellifera和A.cerana）体内的同一共生菌也可能具有类似的抵抗疾病的功能。此外，由于中蜂是中国和亚洲重要的传粉昆虫之一，在农业生态系统中发挥了至关重要的作用，加上蜜蜂与人类食物供应的紧密联系，因此在摸清中蜂肠道菌群的动态变化规律后继续开展肠道菌群的这些潜在有益功能的研究也至关重要。51 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析蜜蜂的采集活动与气候变化有着密切的联系。只要外界有蜜源、温度适宜，蜜蜂就会不停的出巢活动。季节变化对蜂群的影响较大，并能引起蜜蜂肠道菌群的失调，如很多疾病的爆发都具有季节性，先前的研究表明，肠道菌群在蜂群维持健康中起到了重要的作用，而在季节交替中，蜜蜂的肠道菌群是否也发生着变化？是否在季节间保持相似性和稳定性？目前还未见报道。本文从季节变化对肠道菌群影响的角度来探讨中华蜜蜂肠道菌群在季节变化中的稳定性和多样性，为进一步弄清肠道菌群受季节的影响因素及蜂群维持菌群结构的机理奠定基础，同时也对养蜂管理和疾病预防提供参考。6.1材料和方法6.1.1样品采集从北京平谷一定地饲养的中蜂蜂场选择3群蜂进行取样。分别于2013年10月，2014年3月，6月从该蜂场采集秋，春，夏季样品。另外，按照季节的变化，从不同省份采集东方蜜蜂样本，样品采集地点和编号见表6.1。取样方法和样品保存方法同第二章2.1.1所述。表6.1采样信息Table6.1Samplinginformations.采样季节采样地点样本数春季清水（甘肃）6春季徽县（甘肃）5春季头渡（重庆）5春季南漳（湖北）6夏季泰安（山东）5夏季海口（海南）5夏季长白山（吉林）5夏季德隆（重庆）5夏季广州（广东）6秋季海口（海南）5秋季贵阳（贵州）6秋季蒙自（云南）5秋季三门峡（河南）66.1.2材料6.1.2.1主要试剂同第二章。6.1.2.2主要仪器同第二章。52 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析6.1.3实验方法同第二章，第三章。6.2结果与分析6.2.1不同季节下肠道细菌多样性的比较分析表6.2同一群不同季节中蜂肠道菌群多样性比较Table6.2.TheComparisonofthediversityindexamongdifferentseasonsinA.cerana.§SpringSummerAutumn多样性指数（DiversityIndex）(N=6)(N=6)(N=6)总序列数TotalSequences132,84686,513109,940序列数/样品Sequencespersample**22,141±1,29414,419±1,20818,323±846总OUT数TotalOTUs868761OTU数/样品OTUnumberpersample*32±441±327±3Good"Coverage(%)1±0.000.999±0.001±0.00辛普森多样性指数SimpsonDiversityIndex0.71±0.032.71±0.242.59±0.20香农指数ShannonDiversityIndexb2.21±0.190.76±0.050.75±0.059Chao140.44±5.4950.86±3.8140.50±4.24PDwholetree*3.67±0.364.43±0.223.19±0.27*P<0.05；**P<0.001表示显著差异如表6.2所示，样品的平均序列数在不同季节之间存在显著差异（P<0.001）；此外，OUT数和PDwholetree在0.05水平上存在显著差异。其余多样性指数则无显著差异。如图6.1所示，稀释曲线（rarefactioncurve）分析表明样品的曲线逐渐趋于平缓，说明测序量足以覆盖所有类群，并间接反映出样品中物种的丰富程度较高。但还有部分物种始终未达到平衡状态，说明随着测序量的增加，还可能发现新的种系型。图6.1MiSeq测序稀释曲线图Fig.6.1RarefactionanalysisoftheMiSeqsequencingreadsinthegutmicrobiotaofqueen,workeranddroneofA.cerana.53 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析图6.2基于属水平的同群东方蜜蜂肠道菌群的季节性变化Fig.6.2ProportionalcompositionofbacteriaingeneralevelofA.ceranaamongdifferentseasons6.2.1.1.2肠道菌群组分的比较分析表6.3同一群东方蜜蜂不同季节肠道菌群组分比较（细菌门的水平）Table6.3TheComparisonofthebacteriacomponentamongdifferentseasonsofA.cerana.(phylalevel)属（genera）春季Spring夏季Summer秋季Autumn（N=6）(N=6)(N=6)Gilliamella45.10%±3.39%31.50%±4.46%37.60%±6.45%Flavobacteriaceae33.40%±6.33%32.90%±8.45%21.20%±4.91%Snodgrassella6.90%±2.88%10.70%±1.21%4.64%±1.58%Lactobacillus10.20%±3.66%20.00%±4.81%29.40%±8.87%Bifidobacterium0.72%±0.32%1.04%±0.55%3.21%±0.92%Bartonella0.01%±0.01%0.56%±0.32%0.00%±0.00%同一群不同季节的样本的东方蜜蜂肠道菌群主要归属于Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes和Actinobacteria等4个门。在门水平，Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes三个门的细菌在不同季节上无显著差异（P>0.05），只有Actinobacteria在春夏之间存在显著差异。对同一群的样本来说，核心菌Lactobacillus,Gilliamella,Snodgrassella和Flavobacteriaceaek在不同季节表现出较高的稳定性，只有Bifidobacterium属的细菌在春秋之间存在显著差异（p=0.04）。不同个体的肠道菌群的组成和丰度见图6.2。54 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析图.6.2基于PLS-DA（a）和热图（b）分析同一群不同季节中华蜜蜂肠道菌群组成分析Fig.6.2AbundancedistributionofA.ceranabasedonPLS-DA(a)andhotmap(b)analysis.基于PLS-DA分析表明（图6.2a），同一群中蜂样本在春夏秋三个季节可以明显的分开，说明季节因素对肠道菌群的影响较为突出。同一群不同季节的所有样品被分为明显的两簇（图6.2b）。其中，Lactobacilluskunkeei(OTU21)在不同季节间差异显著（P<0.05,FDR=0.03）；Gammaproteobacteria（P<0.05,FDR=0.006）、Proteobacteria（P<0.05,FDR=0.02）和Proteobacteria（P<0.05,FDR=0.03）等细菌门在不同季节间差异也显著。而对来自不同区域不同季节的中蜂样本的分析则发现，春季的样本聚类比较明显，湖北的样品明显与重庆和甘肃的样品分离，但甘肃和重庆地区的样品分离不明显；重庆和湖北的样本较为分散（图6.3）；夏季和秋季（图6.4和图6.5）的样品存在相互交叠现象，并无明显的聚类现象。在这些样品中，春季时unculturedLactobacillussp.(OTU172)在不同地区间差异较大（P<0.01,FDR=0.02）；夏季unculturedBifidobacteriumsp.(OTU84)（P<0.01,FDR=0.03）、Enterobacteriaceae(OTU1)（P<0.01,FDR=0.03）、Lactobacillussp.Adhmto19(OTU381)（P<0.01,FDR=0.03）以及unculturedFirmicutesbacterium(OTU292)（P<0.01,FDR=0.03）差异显著；秋季主要是Lactobacilluskunkeei(OTU21)（P<0.01,FDR<0.01）差异显著。不同地区、不同季节的所有样品也被分为明显的两簇（图6.6,6.7,6.8）55 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析对于对于同群图.6.3基于PLS-DA分析东方蜂肠道菌群的组成（春季）Fig.6.3AbundancedistributionofA.ceranabasedonPLS-DAanalysis(spring).图6.4基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东方蜜蜂肠道菌群的组成分析（夏季）Fig.6.4ComparisonofbacterialcommunitybetweenA.ceranabyPCA(a)andPLS-DA(b)(summer).图6.5基于PCA（a）和PLS-DA（b）的东方蜜蜂肠道菌群的组成分析（秋季）Fig.6.5ComparisonofbacterialcommunitybetweenA.ceranabyPCA(a)andPLS-DA(b)(autumn).56 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析图6.6.肠道菌群物种丰度聚类图（春季）Fig.6.6.AbundancedistributionofA.ceranainOUT(left)andGeneralevel(right)(spring).图6.7肠道菌群物种丰度聚类图（夏季）Fig.6.7AbundancedistributionofA.ceranainOUT(left)andGeneralevel(right)(summer).57 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析图6.8肠道菌群物种丰度聚类图（秋季）Fig.6.8AbundancedistributionofA.ceranainOUT(left)andGeneralevel(right)(autumn).6.3讨论花蜜是植物吸引传粉动物传粉的最重要的物质（Aizenberg-Gershteinetal.,2013）。流蜜期随着季节的变化而不断变化，这种季节的变化反映出蜜蜂饮食（花蜜和花粉）的变化。此外，在大流蜜期由于外界大量的花蜜和花粉也激起了蜜蜂的采集积极性。因此，对于同一群取样的蜜蜂样本很容易将春夏之间肠道菌群结构分开（图6.2）。这种季节性的差异可能影响肠道菌群的组成。因为对于同一蜂群来说，所处环境和蜜源均相同，尽管其他环境因素在某种程度上也可能产生影响，但最可能的影响因素可能是食物的变化，即蜜源的差异。不同的饮食为特定细菌提供了一个较好的生态位从而具有潜在的影响肠道菌群组成和活力的作用（RotheandBlaut,2013,Davenportetal.,2014）。很多研究也报道了饮食类型会对肠道菌群产生影响（Colmanetal.,2012;Yunetal.,2014）,饮食也是肠道菌群多样性的控制因素（Yunetal.,2014）。在哺乳动物中，肠道菌群的多样性随着宿主饮食的变化沿着食肉动物、杂食性动物到草食性动物的顺序逐渐增加（Leyetal.,2008）。另外，饮食中的营养成分可以调节免疫反应，从而潜在影响肠道菌群（Kauetal.,2011;Flintetal.,2012）。而对于来自不同蜂群、地区和季节的样本来看，肠道菌群的变化较为频繁（图6.3,6.4,6.5），在春季距离较近的重庆和湖北，由于都是油菜蜜源，蜂群可以采集各种蜜粉源，因此它们肠道菌群结构较为分散，而甘肃油菜蜜源还未开始流蜜，因此春期甘肃样品的肠道菌群在PCA图中距58 中国农业科学院博士学位论文第六章季节因素对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析离较近，很明显的归为一类。夏季由于各地区蜜源各不相同，从图6.4（b）可以看出取样的5个地区的样品除重庆地区5个样品明显分开外，其余样品存在相互交叠现象，并无明显的聚类现象。秋季的数据结果与夏季类似，这也充分说明，在同一季节下，地区的差异对肠道菌群的影响并不明显。在熊蜂肠道菌群的研究中也表明生境类型对肠道菌群具有很小的影响（Cariveauetal.,2014）。国外一些研究者也对蜜蜂肠道菌群的季节性变化做了一定的探讨，Hroncova等（2015）分析了西方蜜蜂的肠道菌群后发现在特定的时间点，这些肠道菌群可能受到季节性节律的影响，不同年份的观察结果也发现具有较高的变异。通过在油菜花期对三个蜂种A.melliferassp.,A.Carnica(honeybee)和B.terrestris连续三年的观察发现，它们的肠道菌群在不同年份间差异显著（MohrandTebbe,2006）。Ludvigsen（2013）的研究表明，共生菌G.apicola的数量随着季节的变化而变化，其出现的频数在一年内持续的下降，并在十月份的蜜蜂样品中数量最低，而S.alvi在这个月份数量开始上升。在一些年份，肠道菌群在单群蜂和不同群蜜蜂个体上具有较大的变异。我们对东方蜜蜂的相关研究则发现这两种细菌在不同季节间保持稳定，差异并不显著。最近的一项研究也发现采集蜂肠道内共生菌Firm-5（lactobacilli）从春季到秋季大约下降了25%（Corby-Harris,2014b）。但我们对东方蜜蜂肠道内乳酸菌的检测发现，乳酸菌的含量从春季到秋季处于一个上升的趋势。这种研究结果的差异，很可能是所采用的测序方法的不同引起，也可能是受蜂种、地理区域等多因素综合影响所致。我们对同一群中蜂不同的季节肠道菌群的动态变化的监测数据表明，在属的水平上，关键属的细菌基本保持稳定，这意味着外界因素对同一群蜜蜂肠道菌群的影响具有一致性，当蜂群处于健康水平时，其肠道菌群整体上也处于动态平衡的稳定状态。但我们只是基于一次的测定结果，另外，冬季样品由于种种原因未能取到，冬季蜂群经历漫长的越冬期，其肠道菌群的变化处于什么状态也不得而知，因此，今后还需要继续扩大采样量，增加检测的区域和蜂群数，从而更准确的明确季节因素对肠道菌群的影响。另外，蜜蜂的很多疾病的爆发通常具有季节性，本研究中我们并未考虑中蜂个体的感病情况，因此不同感病状态下中蜂的肠道菌群的差异还有待进一步研究。此外，有报道表明，蜜蜂肠道细菌可能影响一些重要疾病如残翅病（DeformedWingVirus）病毒的扩散，但肠道细菌是否发挥了这种抵抗作用还有待验证（Moran,2015）。肠道菌群的平衡在营养、代谢和免疫功能等方面对昆虫的健康起到了重要的作用，并对昆虫健康的改善有着重要意义。从广义上来看，研究蜜蜂微生物系统（microbialsystems）将有助于我们进一步理解蜜蜂微生态学，并在蜂群管理和疾病预防上具有潜在的应用价值；另外，这一研究的最直接的意义将有助于商业养蜂中提高蜜蜂肠道微生物健康和疾病管理水平（Andersonetal.,2011）。由于中蜂很多疾病的爆发都具有季节性，因此弄清肠道菌群受季节的影响因素与不同季节维持菌群结构的机理，对今后改善策略来增强蜜蜂对环境及各种病原菌的适应和抵抗能力奠定基础。59 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析中蜂是我国优良的地方蜂种，它具有采集积极、适应性强、嗅觉灵敏、善于利用零星蜜源等优点。它们在没有大宗蜜源时也能自给自足，饲料消耗少，尤其适合定地饲养，在我国大部分山区分布较广。目前，中蜂的饲养方式以人工以活框饲养和半野生状态的传统饲养方式为主。其中，传统饲养方式下主要靠自然分蜂来扩大群势，人工管理较少。为此，我们从不同饲养方式的角度出发，探讨两种饲养模式下东方蜜蜂肠道菌群是否存在较大差异，为指导养蜂生产提供参考。7.1材料和方法7.1.1样品采集从海南、云南、重庆、湖北等地区采集中蜂样本，采集时间处于流蜜期，同时从该地区采集朗氏蜂箱饲养（即活框饲养，简称H）和传统蜂箱饲养（即老桶饲养，简称L）的中蜂样品。样品采集地点和编号见表7.1。取样方法和样品保存方法同第二章2.1.1所述。共采集到42只样品。图7.1采样的两种蜂箱.a传统饲养的蜂箱，a-1内部结构；b朗氏蜂箱，b-1蜂脾可以人为移动Fig.7.1ThehiveoftheA.ceranahabitatinginthisstudy.60 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析表7.1样品采集地点信息Table7.1.Detailsofsamplinglocations样品编号分布描述样品编号分布描述HaiN_H1HaiNanHHaiN_L1HaiNanLHaiN_H2HaiNanHHaiN_L2HaiNanLHaiN_H3HaiNanHHaiN_L3HaiNanLHaiN_H4HaiNanHHaiN_L4HaiNanLHaiN_H5HaiNanHHaiN_L5HaiNanLYN_H1YunNanHYN_L1YunNanLYN_H2YunNanHYN_L2YunNanLYN_H3YunNanHYN_L3YunNanLYN_H4YunNanHYN_L4YunNanLYN_H5YunNanHYN_L5YunNanLCQ_H1ChongQingHCQ_L1ChongQingLCQ_H2ChongQingHCQ_L2ChongQingLCQ_H3ChongQingHCQ_L3ChongQingLCQ_H4ChongQingHCQ_L4ChongQingLCQ_H5ChongQingHCQ_L5ChongQingLHB_A1HuBeiHHB_ZW1HuBeiLHB_A2HuBeiHHB_ZW2HuBeiLHB_A3HuBeiHHB_ZW3HuBeiLHB_B1HuBeiHHB_ZW4HuBeiLHB_B2HuBeiHHB_ZW5HuBeiLHB_B3HuBeiHHB_ZW6HuBeiL7.1.2材料7.1.2.1主要试剂同第二章。7.1.2.2主要仪器同第二章。7.1.3实验方法同第二章，第三章。7.2结果与分析7.2.1不同饲养条件下东方蜜蜂肠道细菌多样性的比较分析61 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析表7.2.不同饲养方式下东方蜜蜂肠道菌群多样性指数Table7.2TheComparisonofthediversityindexbetweenmoveablehiveandunmovevablehiveofA.cerana.§多样性指数朗氏蜂箱（N=21）传统蜂箱（N=21）（DiversityIndex）LangstrothhiveUnmoveablehive总序列数TotalSequences378,449347,817序列数/样品Sequencespersample18,021±97616,563±879总OUT数TotalOTUs132144OTU数/样品OTUnumberpersample38±336±2Good"Coverage(%)0.999±0.000.999±0.00辛普森多样性指数SimpsonDiversityIndex2.37±0.092.30±0.18香农指数ShannonDiversityIndexb0.74±0.020.69±0.05Chao152.22±4.6654.63±4.29PDwholetree4.18±0.214.08±0.18§表示两组之间细菌多样性指标没有显著差异。从多样性指数上看，采用朗氏蜂箱饲养的中蜂和传统蜂箱饲养的中蜂在阿尔法多样性指数上无显著差异（表7.1）。传统蜂箱饲养条件下样本的总OUT要略高于朗氏蜂箱下饲养的蜂群。多样性指数分析也表明，所测数据的覆盖度较高，能较好的反映出样本的多样性信息。图7.2基于属水平的东方蜜蜂肠道菌群的组成分析Fig.7.2ProportionalcompositionofbacteriaingeneralevelofA.cerana.7.2.2不同蜂箱饲养条件下东方蜜蜂肠道细菌组分的比较分析62 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析表7.3不同蜂箱饲养条件下东方蜜蜂肠道菌群的组分比较（细菌属的水平）Table7.3TheComparisonofthebacteriacomponentbetweenmoveablehiveandunmovevablehiveofA.cerana(generalevel).§属（Genera）朗氏蜂箱传统蜂箱(N=21)(N=21)Lactobacillus41.60%±4.65%38.10%±5.46%Gilliamella26.40%±3.29%29.40%±4.21%Bifidobacterium14.00%±3.66%9.85%±2.95%Snodgrassella8.71%±2.62%10.90%±2.73%Flavobacteriaceae8.51%±2.24%8.99%±2.33%Enterobacteriaceae0.10%±0.05%0.03%±0.01%Bartonella0.01%±0.00%0.21%±0.19%Acetobacteraceae0.25%±0.25%0.01%±0.00%§表示两组肠道细菌属的相对丰度之间在属水平上没有显著差异；从两种饲养方式下采集的样本的分析结果表明，在门和属水平上，主要共生菌没有显著差异。两种饲养方式下细菌含量最多的属的分布存在一定差异，两种饲养方式下蜂群其含量最多的细菌分别为Lactobacillus，Gilliamella，Bifidobacterium，Snodgrassella，Flavobacteriaceae。不同个体的肠道菌群的组成和丰度见图7.2。从图7.3所示，稀释曲线（rarefactioncurve）分析表明样品的曲线逐渐趋于平缓，说明测序量足以覆盖所有类群，并间接反映出样品中物种的丰富程度较高。但还有一部分物种始终未达到平衡状态，说明随着测序量的增加，还可能发现新的种系型。图7.3MiSeq测序稀释曲线图Fig.7.3RarefactionanalysisoftheMiSeqsequencingreadsinthegutmicrobiotabetweenmoveablehiveandunmovevablehiveofA.cerana7.2.3基于多元统计方法的东、西方蜜蜂肠道菌群结构的比较分析我们基于每个样品的物种丰度水平构建了朗氏蜂箱饲养组和传统蜂箱饲养组各样本的物种丰度聚类图（图7.4），实现物种分类地位聚类（横向聚类）及样本聚类（纵向聚类），不同颜色意味着样品中各物种的相对丰度水平。从图中可以看出，所有样本被分成明显的两个簇，而两个大簇下的每个分支也继续分为几个小簇。63 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析图7.4两种蜂箱饲养条件下肠道菌群物种丰度聚类图Fig.7.4AbundancedistributionofA.ceranainmoveablehive(H)andunmovevablehive(L).通过PLS-DA（图7.4）分析发现，肠道菌群在活框饲养和老式蜂桶饲养的条件下，传统蜂箱饲养的样本的分布较为集中，个体之间距离较近；而朗氏蜂箱饲养（活框饲养）的蜂群其菌群结构比较离散，个体之间变化较大，由于是同一蜂种，两组样本间也存在一定的交叠现象，但两组样本间不存在明显的分离现象，表明这两种饲养方式下东方蜜蜂肠道结构差异并不明显。7.3讨论在亚洲，东方蜜蜂主要采用两种方式饲养，即活框蜂箱（直接借鉴西方蜜蜂的朗氏蜂箱）和非活框的传统饲养蜂箱（包括木桶，中空的树洞等等）（见图7.1）。除了人工饲养的东方蜜蜂外，还有很大一部分东方蜜蜂生活在深山树林中，如空心树，分裂的岩石中或者墙洞中等（Ruttner,1988）。这种传统的蜂箱下饲养的中蜂，由于巢脾的位置无法移动，只能箱外观察，除一年取蜜一次外，人为干扰较少，因此，我们认为这种饲养蜂箱下蜂群的生活条件与野生蜂群基本一致。而采用活框饲养方式的蜂群，人为干预较前者频繁，如转地放蜂，人工饲喂，治病用药，取蜜等养蜂操作。另外，这种活框饲养的商业蜂群中，常规抗生素的使用可能不可避免，而抗生素可以导致蜂群菌群的改变从而影响蜜蜂健康，且抗生素的使用降低了蜜蜂肠道菌群的多样性并使肠道64 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析细菌的耐药性降低（Tianetal.,2012）。因此，两种蜂箱模式饲养下的蜂群其肠道菌群可能存在一定的差异。图7.4基于PLS-DA的不同饲养方式下东方蜜蜂肠道菌群的组成分析.Fig.7.4Comparisonofbacterialcommunitybetweenmoveablehive(H)andunmovevablehive(L)ofA.ceranabasedonPLS-DAanalysis.我们采用多元统计分析方法对4个地区的两种饲养方式下的42只中蜂样本的分析表明（图7.4），传统蜂箱饲养下的东方蜜蜂的肠道菌群比较一致，表现为菌群结构较为集中，这一结果与泰国东方蜜蜂（A.c.indica）（Disayathanoowatetal.,2012）和日本东方蜜蜂（A.c.japonica）（YoshiyamaandKimura,2009）中肠道菌群的研究结果一致。也与从马拉西亚采集的大蜜蜂（A.dorsata）和黑小蜜蜂（A.andreniformis）的研究结果一致（Martinsonetal.,2011）。东方蜜蜂肠道菌群在这两种饲养方式下存在一定的交叠现象，但并未完全分离，说明不同饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群结构的影响较小，也间接说明人工养殖的蜂群与野生蜂群的肠道菌群并无显著差异。在这两种饲养方式中，人工饲养的蜂群以取蜜为主，当蜂群存蜜不足时蜂农通常给蜂群辅助饲喂糖浆和花粉以保持蜂群活力，这些人为因素可能影响蜜蜂的菌群结构（Disayathanoowatetal.,2012）；此外，活框饲养的蜂群常在流蜜季节被转地到各地去采取花蜜，相对定地饲养的传统非活框饲养蜂群来说，其接触的蜜源和粉源的种类较多，其食物的多样性也相对较高；而非活框蜂群由于无法开箱检查，蜂群一年取蜜一次到两次，存蜜充足，人为干扰少，因此，其肠道菌群的稳定性较高。但这种不同饲养方式下并未引起东方蜜蜂肠道菌群结构的明显改变，说明蜜蜂肠道菌群具有一定的保守性，在一定范围内的人为干扰下，对其肠道菌群的影响并不大。由于东方蜜蜂抵抗蜂螨等病害，因此人工养殖的东方蜜蜂相比西方蜜蜂来说，用药较少，因此，人工养殖的东方蜜蜂受外界的扰动相对较低，因此能够保持肠道菌群的稳定。中蜂是我国重要的本土蜂种之一，由于其善于采集零星蜜源的独特生物学特征，特别适应山区饲养；由于山区中草药分布广泛，因此，中蜂采集的百花蜜可能具有一定的药用价值，因此价格较高且供不应求。在这一背景下，很多地区大力推广中蜂过箱技术，无形中增加了人为因素65 中国农业科学院博士学位论文第七章饲养方式对东方蜜蜂肠道菌群的影响分析对这一本土蜂种肠道菌群的干扰；由于技术、蜜源和季节等因素的影响，很多过箱操作以失败告终，从而造成中蜂群的逃群或死亡，并可能造成中蜂肠道菌群多样性的丢失。本研究初步证实了两种蜂箱饲养下中蜂肠道菌群并无显著差异，说明在非大规模用药的情况下，常规的人为干扰并不影响东方蜜蜂的菌群结构，这对今后改善中蜂饲养管理措施，提高中蜂的活框饲养量具有一定的指导意义。66 中国农业科学院博士学位论文第八章全文结论第八章全文结论本研究中采用第二代高通量测序技术对我国境内的东、西方蜜蜂的肠道菌群多样性进行了系统研究，在全面摸清这两个蜂种肠道菌群组成和丰富度等多样性信息的基础上，还从三型蜂、日龄差异以及饲养方式差异等角度出发，比较了不同因素下东方蜜蜂肠道菌群的多样性差异，从而进一步弄清肠道菌群的影响因素。8.1全文结论（1）我国东、西方蜜蜂肠道菌群的种类我国东、西方蜜蜂核心菌群的种类主要分布在8个门和12个属，主要是一些特定的细菌群落占主导地位，国外西方蜜蜂中报道的八大类肠道共生菌在我国东、西方蜜蜂中均有分布。（2）我国东方蜜蜂肠道菌群的影响因素我国东、西方蜜蜂肠道菌群同国外报道的一样都是有少数几个特定的共生菌组成；蜜蜂肠道菌群结构受蜂种、级型、日龄的影响较大，而地理区域和饲养方式对蜜蜂肠道菌群结构的影响较小，季节变化对同一蜂群的影响较大，而同一季节不同地区的东方蜜蜂肠道菌群结构无显著差异。东、西方蜜蜂的肠道菌群结构被分为两个簇，而不受蜂种、三型蜂、日龄、季节和饲养方式以及地理区域的影响。8.2研究展望本研究首次采用第二代高通量测序技术对我国不同省份的东、西方蜜蜂的肠道菌群进行了摸底调查，揭示了我国东、西方蜜蜂的多样性现状，并进一步分析了影响东方蜜蜂肠道菌群结构的可能因素。但这研究也还具有一定的局限性，如测序样本的日龄无法准确获得，所选地区的样本量也有待进一步扩大，在深入分析的过程中，我们还有许多问题有待进一步揭示：（1）针对某一影响因素，进一步扩大样品的采集数量，并通过连续几年的观察，更全面的揭示肠道菌群的影响因素；（2）对大量存在的非核心菌群，还需要今后的持续监测跟踪才能进一步弄清其与蜜蜂健康的相关性并验证其可能存在的功能；（3）进一步弄清健康蜂群和感病蜂群肠道菌群的差异，尤其是肠道菌群组成和蜜蜂健康之间的关系，挖掘与疾病相关的特异性菌群或菌属/种，并开展功能验证。67 中国农业科学院博士学位论文参考文献参考文献1.陈盛禄主编.中国蜜蜂学.北京:中国农业出版社,20012.国家畜禽遗传资源委员会．中国畜禽遗传资源志：蜜蜂志.北京：中国农业出版社,2011.3.黄少康主编.蜜蜂生理学.北京:中国农业出版社.2011.4.郎晓磊.肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用[硕士学位论文].武汉：华中农业大学,2010.5.欧阳燕,吴黎明,金锋等.蜂王一雌多雄交配对蜜蜂群体行为影响的研究.科学通报,1997,42(17):1881-1883.6.谭垦,张炫,和绍禹,周丹银.中国东方蜜蜂的形态学及生物地理学研究.云南农业大学学报,2005,20(3):410-414.7.王冰,孙成,胡冠九.环境中抗生素残留潜在风险及其研究进展.环境科学与技术,2007,30(3):108-111.8.吴杰主编.蜜蜂学.北京：中国农业出版社,20129.徐龙龙,吴杰,李继莲.蜜蜂共生菌研究进展.中国农业科技导报,2013,15(6):107-112.10.薛妍.肠道菌对苏云金芽胞杆菌棉铃虫杀虫活性的作用[硕士学位论文].武汉：华中农业大学,2010.11.曾志将.蜜蜂生物学.中国农业出版社,2007.12.曾志将主编.养蜂学.北京:中国农业出版社,200913.张复兴主编.现代养蜂生产.北京:中国农业大学出版社,199814.中蜂资源调查协作组.中华蜜蜂资源调查.中国养蜂,1984,3:4-7.15.AhnJ.H.,HongI.P.,BokJ.I.,KimB.Y.,SongJ.,WeonH.Y.PyrosequencinganalysisofthebacterialcommunitiesinthegutsofhoneybeesApisceranaandApismelliferainKorea.JournalofMicrobiology,2012,50(5):735-745.16.Aizenberg-GershteinY.,IzhakiI.,HalpernM.DoHoneybeesShapetheBacterialCommunityCompositioninFloralNectar?PLoSONE,2013,8(7):e67556.17.AmcheslavskyA.,JiangJ.,IpY.T.Tissuedamage:inducedintestinalstemcelldivisioninDrosophila.CellStemCell,2009,4(1):49-61.18.AmentS.A.,CoronaM.,PollockH.S.,RobinsonG.E.Insulinsignalingisinvolvedintheregulationofworkerdivisionoflaborinhoneybeecolonies.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2008,105:4226-4231.19.AndersonK.E.,SheehanT.H.,EckholmB.J.,MottB.M.,DeGrandi-HoffmanG.Anemergingparadigmofcolonyhealth:microbialbalanceofthehoneybeeandhive(Apismellifera).InsectesSociaux,2011,58(4):431-444.20.AndersonK.E.,JohanssonA.,SheehanT.H.,MottB.M.,Corby-HarrisV.,JohnstoneL.,SprisslerR.,FitzW.DraftgenomesequencesoftwoBifidobacteriumsp.fromthehoneybee(Apismellifera).GutPathogens.,2013,5(1):42.68 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中国农业科学院博士学位论文附录附录附录Ⅰ96孔板DNA提取系统（WizardSV96GenomicDNAPurificationSystem）A、裂解液配置裂解液体混合每个样品体积96个样本总体积NucleiLysisSolution20022.0mL0.5MEDTA(pH8.0)505.5mLproteinaseK,20mg/mL202.2mLRNaseASolution,4mg/mL5550µl总体积275µl30.25mLWizardSV洗脱液：加入630mL95%乙醇溶液到WashSolution中，混匀，室温保存。B、样品组织准备1、往解剖完的组织中加入100µlRingerBuffer，研磨组织样品，吸取50µl到96孔深孔板中；2、每个样品加入275µL准备好的裂解液体混合；3、将96孔板用封口膜密封后置于55°C下温育过夜（16-18小时），不用震荡。C、从组织裂解液中纯化DNA1、55°C下温育过夜后，移除封口膜，每孔中加入250µlWizardSVLysisBuffer；注意：必须保持组织裂解液温度不能过低；2、用移液器混匀溶液。马上进行下一步操作，若不立即操作，可将溶液保存在-70°C，但再次使用之前必须在55°C下先温育1小时；3、准备抽真空装置（VacuumManifold），如下图所示：4、将组织裂解液转到BingingPlate上，并封上BingingPlate，抽真空直至液体全部通过；5、往每个孔加入1mLWizard®SVWash溶液（确定Wizard®SVWash中已加入乙醇）；6、抽真空（下图）；7、重复6和7两次，共洗脱3次；8、当BingingPlate抽空后，继续抽6min，让BingingPlate干燥；9、关掉真空泵。将导管从ManifoldBase上转接到VacuumManifoldCollar上；并从ManifoldBase上取下BingingPlate，轻轻在纸上震荡以除去残留乙醇；81 中国农业科学院博士学位论文附录10、将96孔板放在ManifoldBed上，其上放置VacuumManifoldCollar；对好96孔深孔板和vacuumport上的数字标签；11、将BingingPlate放在VacuumManifoldCollar上。把带有BingingPlate的VacuumManifoldCollar放在96孔深孔板上（下图），BingingPlate的头必须位于孔中间，对号方向；12、每个孔加入100µl无核酸酶水（提前加热至65°C），室温放置2min；13、抽真空；14、重复12-13步一次；15、封上96孔板，于-70°C保存。82 中国农业科学院博士学位论文附录附录Ⅱ各样品的测序标签和Alpha多样性指数附录Ⅱ各样品的测序标签和Alpha多样性指数SupplementⅡ.SequencelablesandAlphadiversityinthisstudy.SampleIDSequencesOTUsGoodsCoverageShannonSimpsonChao1PD_whole_treeBJ_C121439320.9993942.180.7243.143.55BJ_C225221420.9994452.970.8457.174.76BJ_C317088160.9997661.630.6518.002.24BJ_C421783370.9994952.510.7348.004.26BJ_C525895380.9996142.000.6643.004.01BJ_C621420240.9996271.960.6833.333.17BJ_m118954340.9995782.970.8339.603.70BJ_m228692480.9993032.050.5867.004.58BJ_m318610500.9992482.830.7963.005.97BJ_m420469440.9992182.910.8374.004.69BJ_m516183310.9991972.280.67109.003.53BJ_Q116173290.9995673.020.8239.503.00BJ_Q219302280.9994822.580.7843.003.23BJ_Q319083200.9996862.550.7835.002.29BJ_Q421644390.9993071.650.4760.004.35BJ_Q516717250.9995812.960.8532.003.19BJ_Q617021230.9995892.730.8233.503.05BJ_X114045320.9993591.810.5538.003.76BJ_X216197470.9991362.740.7956.104.80BJ_X311921340.9992452.240.6652.004.17BJ_X415100530.9990733.260.8564.385.22BJ_X510523380.9993353.330.8643.254.04BJ_X618727420.9993592.890.8351.434.62MY-Q1268081600.9992911.780.45168.1412.33MY-Q216728640.9985050.620.1882.755.42MY-Q413811350.9989861.190.4946.383.49MY-Q3155511740.9985212.440.46192.0713.29NC_Q415364270.9992191.440.5643.503.46CQ_H126514550.9995472.050.6559.715.34CQ_H217380410.9991371.960.6467.254.24CQ_H313510440.9991863.000.8550.115.00CQ_H420999380.9996672.990.8340.634.08CQ_H520372430.9990182.210.6881.004.72CQ_L118032400.9994452.820.8046.434.50CQ_L212015310.9990842.560.7786.003.67CQ_L315723320.99931.930.5759.504.14CQ_L421821470.9992212.540.7669.675.24CQ_L517062430.9992382.950.8356.004.23CQ_W112119390.9987622.550.8054.004.29CQ_W219407510.9990722.000.6661.934.92CQ_W314909330.9989941.730.6259.254.55CQ_W428614350.9996852.320.7271.003.59CQ_W624639340.9997973.180.8537.333.84FZ_A111673240.9995722.850.8229.002.95FZ_A214168220.9997882.430.7425.002.6283 中国农业科学院博士学位论文附录FZ_A312528380.9987232.300.6778.003.58FZ_B113449450.9994052.680.8047.805.13FZ_B211331350.9992942.430.7640.603.80FZ_B312026270.9995842.470.7829.502.96GiZ_A118275210.9996721.350.5426.002.56GiZ_A211781180.9997451.480.5319.502.23GiZ_A313128160.9997711.590.6116.601.77GiZ_B124435620.999553.060.8366.585.33GiZ_B214731230.9995252.050.6630.003.32GiZ_B320719490.9994213.040.8754.084.42GS_C116777250.9995232.040.7030.603.63GS_C220018390.999451.510.4744.504.45GS_C315857450.9993062.990.8356.004.59GS_C417053340.9995312.660.7739.603.97GS_C522248390.9994161.120.3750.144.74GS_H114098230.9995032.350.7744.002.59GS_H213316250.9995491.560.5132.503.38GS_H312850270.9996892.340.7128.203.62GS_H416176390.9991962.430.7750.144.19GS_H515158240.9995381.950.6728.202.86GS_H611966180.9996661.680.6020.002.30GS_m111581390.9989642.690.8052.204.48GS_m218548610.9991372.430.7571.915.44GS_m39597430.9982292.340.7362.434.68GS_m415288540.999152.800.8161.095.66GS_m521919290.9996351.780.6733.673.66GZ_B113105410.9988552.830.8156.004.02GZ_B218892380.9993121.780.6049.143.90GZ_B311723350.9991471.770.5141.433.46GZ_C119100360.9993722.730.8058.003.62GZ_C216551460.9990941.750.4955.554.83GZ_C316121330.9995662.220.6940.003.02HaiN_C113676380.9999273.480.8838.003.22HaiN_C220969430.9994282.790.7965.003.70HaiN_C313312490.9987232.940.7983.004.58HaiN_C411493410.999133.250.8556.003.51HaiN_C510860320.9996322.480.6933.503.07HaiN_H121489520.9991622.520.7569.005.07HaiN_H215816300.9995571.890.6051.003.06HaiN_H320964390.999382.300.7346.093.74HaiN_H416022350.9993132.960.8453.333.40HaiN_H521510640.9991632.410.7494.606.13HaiN_L118778350.9994142.460.7242.863.88HaiN_L214574450.9989713.470.8860.004.36HaiN_L318552510.9989223.060.8378.145.19HaiN_L415318420.9990863.010.8264.754.54HaiN_L514180470.9988723.180.8571.004.96HaiN_m110456340.9994262.970.8141.503.47HaiN_m217434390.9997133.660.9041.504.03HaiN_m311586320.9996552.540.6933.203.2184 中国农业科学院博士学位论文附录HaiN_m429107490.9996223.000.7858.174.44HaiN_m516220360.9995072.950.8343.003.41HB_A110027180.9997012.420.7619.502.89HB_A214569200.999521.870.6427.003.07HB_A315506270.9995492.380.7831.203.97HB_B113204380.9985611.440.5557.004.80HB_B225470470.999492.470.7855.675.10HB_B319124540.9989022.360.7796.005.45HB_SY117843740.9991032.950.8384.006.60HB_SY313279260.9993222.400.7638.002.80HB_SY515844700.9989272.380.7678.006.09HB_ZW115746270.9993651.100.5036.003.68HB_ZW215150200.999672.170.7322.502.54HB_ZW312807150.999610.390.1125.002.52HB_ZW411185430.9982121.620.6266.754.91HB_ZW513111370.9990850.410.1044.334.47HB_ZW612660440.9990522.380.7453.434.57HN_A113133200.9999242.180.6820.002.61HN_A218706240.9993052.150.7650.003.79HN_A314454200.9996542.280.7325.002.94HN_B118527320.9992442.230.7150.203.47HN_B210895190.9999082.140.6919.002.14HN_B315361230.9994141.220.4141.003.29JL_C117529290.9994872.650.7947.003.14JL_C223279220.9997422.060.7229.502.81JL_C318437500.9989693.460.8892.755.12JL_C417977270.9997222.360.6930.333.14JL_C511400360.9992113.120.8554.003.80JL_m113680360.9993422.030.5742.003.29JL_m218874260.9997351.460.4229.332.86JL_m39652320.9990683.270.8738.003.62JL_m49935380.9986913.250.8751.003.64JL_m520567290.9997082.320.7136.503.18JX_A123360250.9996152.520.7932.203.12JX_A221383270.9995792.440.7234.203.09JX_A322823300.9996932.560.7935.253.21JX_B120846210.9995681.130.5130.002.80JX_B223225460.9993542.780.8063.504.47JX_B314738360.9989821.890.6053.503.75NC_D122383250.9996871.690.6429.202.66NC_D228496550.9992631.620.6272.505.15NC_D322990320.9995221.160.4841.173.68NC_D425072580.9992021.020.3273.835.50NC_D513214400.9987891.430.4955.004.15NC_Q113111360.9988560.210.0488.504.46NC_Q214937940.9981921.680.54125.917.88NC_Q315165580.9986811.720.5985.145.92SD_C119819230.9995462.210.7459.002.80SD_C222951190.9996951.750.6424.252.68SD_C320584190.9999031.880.6519.202.6485 中国农业科学院博士学位论文附录SD_C414988170.99981.890.6620.002.22SD_C514281190.999722.340.7422.002.57SD_m112492320.9991993.090.8643.253.18SD_m212880220.9996892.680.7923.202.25SD_m316596370.9990362.760.7767.003.48SD_m417236380.999422.690.7760.503.96SD_m520881280.9997133.370.8931.753.59XJ_A126991420.9994442.850.8359.504.97XJ_A223167510.9990943.260.87121.005.70XJ_A326441340.9995842.890.8445.003.71XJ_B114639310.9995222.900.8341.503.61XJ_B224514320.9997552.920.8335.753.54XJ_B318791550.9991492.240.6475.005.62XZ_114020640.9987872.390.7181.006.15XZ_228095750.9990752.900.82102.086.31XZ_311089260.9991882.040.6935.003.11XZ_524656290.9995542.850.8284.003.35XZ_622405240.9998662.410.7325.502.75XZ_425547550.9994913.000.8566.145.34YN_H111991380.9986662.250.7562.004.40YN_H222577300.9997342.560.7731.883.67YN_H316357220.9998172.690.8222.602.50YN_H421287300.999532.700.8141.253.25YN_H513761320.9992012.320.7039.863.81YN_L124077260.9995852.520.7941.003.26YN_L219976350.9991492.600.8080.334.25YN_L312758260.999532.440.7728.143.14YN_L417931270.9995542.150.7332.603.05YN_L526361400.9992792.460.7382.754.54ZJ_L119220230.9997922.020.7225.002.83ZJ_L220873270.9995212.310.7534.502.96ZJ_L321764270.9996322.790.8236.333.45ZJ_L424551400.999432.500.7953.004.09ZJ_L620165290.9996032.410.7336.003.67ZJ_L514162220.9992941.500.5444.502.6886 中国农业科学院博士学位论文附录附录Ⅲ东、西方蜜蜂差异细菌的统计分析附录Ⅲ.东、西方蜜蜂差异细菌的统计分析SupplementⅢ.AstatisticalanalysisofthedifferencesinbacteriabetweenA.ceranaandA.mellifrea.细菌分类地位/TaxonomicstatusofbacterialPvalueFDRLactobacillus;Apis_florea_little_honeybee(OTU320)0.00000.0000Lactobacillus(OTU65)0.00010.0006Neisseriaceae;...;uncultured_beta_proteobacterium(OTU288)0.00020.0018Flavobacteriaceae;...;uncultured_Bacteroidetes_bacterium0.00030.0018(OTU43)unculturedLactobacillussp.(OTU172)0.00040.0020Lactobacillussp.Adhmto19(OTU381)0.00290.0108Gammaproteobacteria;...;gamma_proteobacterium_PEB01910.00310.0108(OTU181)Gammaproteobacteria;...;Gilliamella(OTU81)0.00600.0181Lactobacillus(OTU187)0.00710.0190Bartonella;uncultured_Rhizobiales_bacterium(OTU313)0.00860.0206Lactobacillus;uncultured_Firmicutes_bacterium(OTU292)0.01860.0406Lactobacillus(OTU65)0.00000.0000Lactobacillus;Apis_florea_little_honeybee(OTU320)0.00000.0000unculturedLactobacillussp.(OTU172)0.00000.0000Acetobacteraceae;...;Apis_mellifera_honey_bee(OTU72)0.00000.0000Neisseriaceae;...;uncultured_beta_proteobacterium(OTU288)0.00000.0001Bartonella;uncultured_Rhizobiales_bacterium(OTU313)0.00000.0001Gammaproteobacteria;...;Enterobacteriaceae_bacterium_Acj_1220.00000.0001(OTU138)Lactobacillus(OTU187)0.00000.0001Flavobacteriaceae;...;uncultured_Bacteroidetes_bacterium0.00000.0001(OTU43)Lactobacillussp.Adhmto19(OTU381)0.00010.0003Gammaproteobacteria;...;gamma_proteobacterium_PEB01910.00020.0005(OTU181)Rhizobium;uncultured_bacterium(OTU353)0.00020.0005unculturedBifidobacteriumsp.(OTU84)0.00250.0046unculturedBifidobacteriumsp.(OTU250)0.00840.0144Lactobacillussp.Bma5(OTU325)0.01780.0285Bartonella0.00860.0429Rhizobium0.00070.0017Bifidobacterium0.00250.0041Bacteroidetes0.00010.0003Actinobacteria0.00260.006687 中国农业科学院博士学位论文附录附录ⅣqPCR实验电泳图附录Ⅳ-1.四种引物的扩增电泳图（左）和质粒电泳图（右）附录Ⅴ溶解曲线和标准曲线1、Bifi基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线88 中国农业科学院博士学位论文附录Bifi基因定量标准品扩增曲线和熔解曲线图：Bifi基因定量标准品斜线图：89 中国农业科学院博士学位论文附录2、Gill基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线结果Gill基因定量标准品扩增曲线和熔解曲线结果90 中国农业科学院博士学位论文附录Gill基因定量标准品斜线图：3、Lact基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线结果91 中国农业科学院博士学位论文附录Lact基因定量标准品扩增曲线和熔解曲线结果92 中国农业科学院博士学位论文附录Lact基因定量标准品斜线图：4Snod基因定量标准品扩增曲线和熔解曲线结果93 中国农业科学院博士学位论文附录Snod基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线结果94 中国农业科学院博士学位论文附录Snod基因定量标准品斜线图：95 中国农业科学院博士学位论文附录附录Ⅵ原始数据的标准化(Rawdatanormalization)附图1.东、西方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化附图2.东方蜜蜂三型蜂肠道菌群原始数据的标准化SupplementFig1.RawdatanormalizationofA.ceranaandA.SupplementFig2.RawdatanormalizationofA.ceranaforqueen,mellifera.workeranddrone.附图3.东方蜜蜂不同发育阶段肠道菌群原始数据的标准化附图4.不同季节东方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化（同一群）SupplementFig3.RawdatanormalizationofA.ceranaduringSupplementFig4.RawdatanormalizationofA.ceranaforthesamedifferentlifestage.colonyindifferentseasons.96 中国农业科学院博士学位论文附录附图5.春季东方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化（不同群）附图6.夏季东方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化（不同群）SupplementFig5.RawdatanormalizationofA.ceranafortheSupplementFig6.RawdatanormalizationofA.ceranaforthedifferentcoloniesinspring.differentcoloniesinsummer.附图7.秋季东方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化（不同群）附图8.不同饲养方式下东方蜜蜂肠道菌群原始数据的标准化SupplementFig7.RawdatanormalizationofA.ceranafortheSupplementFig8.RawdatanormalizationofA.ceranaindifferentdifferentcoloniesinautumn.hivecondition.97 中国农业科学院博士学位论文致谢致谢时光荏苒，1000多个日日夜夜，伴随着博士论文的尾声也宣告着这一阶段的结束，而新的起点和征程也已经开始。3年中，有过憧憬和期盼，有过失败和无助，有过消极和短暂的虚度，更多是实验室的忙碌和撰写、修改论文的专注。单调的科研生活磨练人，还好有植物园的小蜜蜂和花花草草伴我度过了几个难忘的春夏秋冬。每当眼睛累了，我就拿起毛笔刷几笔，不知不觉中捡起了丢了好多年的书法爱好；每当实验不忙，趁着下班，拉上师弟绕着园子跑一圈，或者爬爬山，顿时又精神抖擞；每当心情沮丧了，就用科学网王善勇博士书中的一句话“所有奋斗都是为了一个好的生活”来安慰自己----也正是这些点点滴滴的酸甜苦辣汇成了3年1000多个日日夜夜——百味之中，足见这三年的厚重。首先，我要感谢恩师吴杰研究员，导师谦逊、严谨的治学态度，渊博的学识，都是我一生学习的榜样。在吴老师的指导下，三年的收获不仅仅是这一百来页的博士内容，更多的是对科研的认识、对陌生领域的学习和对生活态度的重新感悟，博士毕业只是科研的开始，“PhDisnotenough”！感谢三年来中国农业科学院研究生院和中国农科院蜜蜂所的培养！感谢指导老师李继莲副研究员带我走进蜜蜂微生物世界，李老师在实验设计和文章修改等方面给予的悉心指导；感谢授粉室主任安建东研究员对我博士阶段科研、生活和学习的关心和帮助，感谢罗术东副研究员、黄家兴博士提出的建设性的意见和建议。感谢中国科学院昆明动物研究所张志刚副研究员在数据分析和文章写作上给于的大力指导；感谢美国耶鲁大学MoranN.A院士、PowellJ.E.、博士后KochH在数据分析和文章修改上提出的宝贵意见；感谢美国美国农业部（USDA）蜜蜂研究中心的陈彦平博士和EvansJ.D.博士在SCI论文写作上给予的细心修改和提出的宝贵意见；感谢中国农业科学院特产研究所李志鹏助理研究员对论文提出的宝贵修改意见，感谢福州大学生命科学院陈文锋博士在实验设计时提出的宝贵意见，在此一并表示感谢。感谢蜜蜂所王加启所长、彭文君副所长、谢双红书记、周玮副所长、李锁平副所长，感谢人事处王安处长、李桂芬处长，以及科研处刁青云处长、谢文闻老师、杨磊老师在研究生三年的学习生活中给予的支持和帮助。感谢李建科教授，周婷研究员,吴黎明研究员，徐书法研究员，王强副研究员以及所里各位老师和同学在这三年中对我的指导和帮助。感谢蜜蜂所丁桂林博士、赵亚周博士、授粉室董捷博士、曲英萍博士、刘佳霖、高丽娇、徐龙龙、刘萍、张红、周志勇、盖琴宝、秦加敏、孙冬婷、刘珊、岳孟、王烨等同窗几年来的关心和帮助，大家共同努力、互相帮助、相互鼓励的日子，让我回味一生，和你们在一起，也让我的生活更加丰富多彩。另外，感谢熊蜂饲养师傅张师傅夫妇、传达室穆师傅几年来的关心和帮助。感谢重庆市畜牧科学院经济动物研究所的任勤助理研究员、姬聪慧助理研究员、曹兰助理研究员，江西农业大学吴小波博士，重庆市南川区养蜂师傅唐洪，福建农林大学王青博士，辽宁袁春颖高级畜牧师，浙江同康蜂业有限公司的吴丽楠师妹，浙江衢州衢州职业技术学院诸葛毅教授，河南三门峡的靳国保师傅，湖北襄阳水镜蜂情养蜂合作社的于伟师傅，湖北十堰的邵传布科长，西藏自治区畜牧兽医局的扎罗副所长，新疆尼勒克种蜂场，广东昆虫所罗岳雄高级工程师、张学98 中国农业科学院博士学位论文致谢锋高级工程师及赵红霞博士，海南海口的大学同学梁华，云南省农业科学院蚕蜂研究所的梁铖助理研究员以及丽江的王昆师弟等蜂业同行、养蜂一线专家和师傅在采样中给予的关系和帮助，在此一并感谢！感谢房宇、王慧华等2012级博士4班的老师和同学们，大家的关心，帮助，信任和鼓励，促使我们共同进步，也增加了我的信心和勇气，让我在遇到困难后更加坚强的面对。感谢英语班的王帅博士在sci论文写作和投稿中分享的宝贵经验。感谢论文评审及答辩委员会的各位专家，你们的质疑、批评和建议，使我的论文进一步完善。正是得益于上述各位老师和朋友的关心和帮助以及家人的大力支持，本论文才得以顺利完成，在此，再次向所有关心和帮助过我的朋友们表示衷心的感谢!值此博士论文完成之际，特别思念九泉之下的父亲，他17岁开始养蜂，在蜂业一线坚守40余年，也正是从小在家庭的熏陶下，我从本科时就选择了蜂学这条路，是父亲引我入了蜂业的门，而我会一直将这条路走下去；遗憾的是，父亲在我博士三年级上半年因二次中风离家人而去，而我最懊悔的是在他老人家人生的最后几个月未能在身边尽孝，也未能及时赶回见到最后一面---三年中，我最放不下的就是女儿楚楚，刚满月我就来京，每每夜深人静时，对家人的思念尤其浓烈---感谢母亲等家人对楚楚无微不至的照顾，看着她天真、开心的笑脸，什么烦恼都忘记了，这三年对女儿的亏欠，我希望用一辈子来弥补----郭军2015年5月于香山北京植物园99 中国农业科学院博士学位论文作者简历作者简历姓名：郭军性别：男出生年月：1981年11月22日籍贯：湖北襄阳教育背景：2001.9～2005.6福建农林大学蜂学学院，获学士学位；2006.9～2009.7中国农业科学院研究生院，攻读硕士学位；2012.9～2015.7中国农业科学院研究生院，攻读博士学位。主要研究方向：蜜蜂肠道微生物博士期间参会及培训：2013.11.16-17，应邀参加第六届中国畜牧科技论坛（重庆）；2014.8.3-7，参加为期一周的“生物信息学技术培训班”，顺利结业并获得结业证书（上海）；2014.10.27-28，参加第四届“消化道分子微生态”国际研讨会（南京）；2014.12.29-31，参加《SCI论文配图培训班》，顺利结业并获得结业证书（北京）。攻读博士期间的学术论文及参编书籍：1、GuoJ,WuJ,EvansJD,etal.CharacterizationofgutbacteriaatdifferentdevelopmentalstagesofAsianhoneybees,Apiscerana.JournalofInvertebratePathology,2015,127：110-114.(IF=2.7).2、LiJ,PowellJ.Elijah,GuoJ,et.al.TwodominantecotypesofgutmicrobiomeinChinesebumblebees.CurrentBiology.(underreview)(并列第一).3、GuoJ,WuJ,LiuS,et.al.FactorsassociatedwiththeGutMicrobiotadiversificationofEasternHoneybee(Apisceranacerana)inChina.(Inpreparing)4、GuoJ,XuL,WuJet.al.SeasonalvariabilityoftheprevalenceofVirusandParasitesinApismelliferainsevendifferentregionsofChina(Inpreparing).5、徐龙龙,吴杰,郭军,李继莲.共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化.中国农业科学,2014,47(10):2030-2037.6、郭军，吴杰，刘珊，李继莲.蜜蜂肠道菌的调节作用及影响因素.中国农业科技导报,17(2):58-63.7、郭军继莲，吴杰.蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成.中国蜂业，2015,66（1）：58-59.8、吴杰，郭军，黄家兴.蜜蜂授粉年产业的发展现状.中国蜂业，2014,65（12）:51-55.9、郭军，李继莲，吴杰.昆虫肠道菌群的功能研究进展.应用昆虫学报.（审稿中）10、郭军，吴杰，李继莲.基于荧光原位杂交技术（FISH）检测中华蜜蜂肠道共生菌.（撰写中）参编书籍：李继莲.蜜蜂养殖实用技术.北京：化学工业出版社,2014.李继莲.图解蜜蜂实用养殖技术.北京：化学工业出版社,2016（准备中）.100