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  • 2022-06-16 12:40:28 发布

异花授粉对‘琯溪蜜柚’果实品质及有机酸组分的影响

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...k烏.霄麵::‘—‘;'於10389分类号::W66.3单位代码3130304013密级:/:学号心一-三,it.'气,.心'"福建农林大学硕去专业学位论文?…''i'表卢師Iv,義—..I.异花授紛对'洁溪蜜袖'果实品质及有机酸气组分的影响t截。..球、,據‘学位类别:农业推广硕壬^.专麵目S‘態^卷研究方向:果树.■-、'-.<.盛京、学生姓名:姚海碟指导教师:王平教授蔡建高级农艺师聲.身\V‘|;试:.占、>■r--■-i/,-、'..|、V;^、,心'-—.'.二0少完成时间:五年十月,.--'如气'—..、'勺壤批-.?,--1?..;一^?^、'.、f\一''‘'-苗一.4^-—:^/ 'HieThesisofFAFUsProfessionalMasterStudent-uaTheeffectsofcrosspollinationonfruitlitqyandoranicacidcomonentsingp(G,uanximiyoupummelo巧流Dereecateor:AriculturalExtensionggygProfessionalfield:HorticultureResearcharea:PomologyStudentname:YaoHailinSupervisor:WangPingCaiJianxingSubmittedtime:October2015,FujianAgricultureandForestryUniversity(FAFU) 独彻性刖本人声明(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独,所呈交的学位立完成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致。谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果一与我同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,由,如被査有侵犯他人知识产权的行为本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:1、多:佩為碑|论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可W公布论文的全部或。部分内容,可W采用影印、缩印或其他复制手段保存论文保密,在年后解密可适用本授权书。□"不保密。,本论文属于不保密cf学位(毕业)论文作者亲笔签名:曰期:之I山y^指导教师亲笔签名;曰期;又〇、若寺 福建农林大学硕±学位论文目录mmIAbstractII一第章文献综迷111.巧橘类贼粒化症现象2.粒化对果实品质的影响13.巧橘类果实有机酸代谢的研究23.1掛橘类果实有化酸的形成2324.果实有机酸的构成35.3梢橘类果实中有机酸代谢3.4巧橘类果实有机酸代谢II研究54.研究目的8''第二章异花授粉对苗溪蜜抽果实品质和有机酸含量的影响919.雛和方法19.1试验材料1.2试验设汁和采样91.3试验方法92.结果与分析10''2.1异花授粉对掩溪蜜抽果实粒化指数的影响10211.2异花授粉对果实可溶性固形物和可滴定酸的影响231.异花授粉对果实有机酸含量的影响331.讨论4'’第H章异花授粉对拒溪蜜枯果实汁胞有机酸庚活和基因表达的影响151.材料和方法15.11试验材料151.2试验方法152.结果与分析18''12.1异花授粉对语溪蜜抽果实有机酸酶活性的影响82.2总RNA的提取20 巧连农林大学硕:Ir学位论文2.3有化酸代谢酶基因表达分析20323.職小25S参考文献26致谢36 福建农林大学巧±学位论文巧要'’aW自花授粉和异花授粉后洁溪蜜抽(trusgrandis为材料,)果实研究异花授粉对''''一语溪蜜抽果实汁胞有机酸代谢产生的影响,为进步揭示掩溪蜜抽果实品质形成分子机理穷实基础。研究内容如下:''1.测定和分析自花授粉和异花授粉洁溪蜜抽果实中正常和粒化汁胞可溶性固形物、可滴定酸含量,W及巧樣酸、异巧樣酸和苹果酸等有机酸含量变化。结果表明;异花授粉提高可溶牲固形物和可滴定酸含量;异花授粉后果实汁胞中巧樣酸、苹果酸含量有所升高,而异巧樣酸含量降低。粒化汁胞中的巧樣酸含量明显下降,异梓樣酸含量升高。''2洁溪蜜抽NADP-.测定自花授粉和异花授粉后果实有机酸代谢中苹果酸酶ME,苹NAD-ME,巧樣酸合成酶CS,顺乌头酸酶ACO果酸酶,磯酸蹄醇式巧丽酸接化酶PEPC,-DPMDHNAD-MDH苹果酸脱氧酶NA,丙爾酸激酶PK,异梓樣,苹果酸脱氨酶酸脱氮酶'-D比NAD-NADPI异巧樣酸脱氧酶IDH和PEPP等11个酸代谢相关酶活性。异花授粉对巧'----NADAD-溪蜜抽果实汁胞CS、ACO、NADIDH、PIDH、NMDH、NADPMDH、NADME、NADP-ME、PEPC、PK等10个与有机酸相关酶的活性影响较大。而仅仅对稱酸烁醇式丙雨酸磯酸酶PEPP的影响较小。''3PCR.通过巧光定量技术进行自花授粉和异花授粉后巧溪蜜枯果实有机酸代谢中----MECACOMDHADMDHNADP-NADPNAD-ME,NAD,S,PEPC,NADP,N,PK,IDH,,IDH和PEPP的基因表达分析。结果显示:相对于自花授粉组合,异花授粉对果实正常汁胞有机--ME-酸代谢酶基因表达没有影响,在粒化汁胞中NADPNAD,cAD,MEyNMDH,CS和-ACO这5NADDH-个基因的表达量都有増加,而I和NADPIDH送两种基因的表达量减少;此外PEPC,PK和mMDH这王种基因的表达量都是没有差异。''口关巧词S馆溪蜜抽;;巧樣酸;异巧樣酸;苹果酸;巧光定量0?酶活性,I 福建农林大学巧±学位论文Abstract',?化也-r-iiGiiisStudytheuicesacsof化IfandcossoUnatonuanxmummeloC7仇公巧佩,youjpp(ri-wereusedas化eexerimental化exlfcrliiplmateapore化eeectsofosspolnatonon0的化gr幻化化ukesacs0anicacidmetabolism.The化resultsmainlrovidesthebasis化furtherJ巧yptfri仿sudyuitualitmolecularme油anisxn.Themanresultsareas"ows:qyfidiii1?Determinationandanalsisosolublesolsttratableacdcitratesocitrateandmalateiny,,,r-orovednormalandranulateduicesacs.The巧suits油owed化atcosspllinationimcontentgjpofsolublesolidsandtitratableacid;Thecontentofthecitrateandmalatewasincreasedinfrus-whUerridticesacofcrossollinationisocitratecontentislowe.I打anulateduicesacs,,jpgjthecitratecontentwasmarkedlydecreaed,theisocitratecontentincreased.D1m-21iidtlitiviNADP.eterminationoftheorgancacsmeabocenzeactME,NADMECSyy,,,->-PKNADP---ACOPEPCNADPMDHNADMDHIDHNADIDH姐dP巧!on化If孤d,,,,^,,cr-ummeuencecosspoHinationlo.Therewasareaterinflon化eativityf10enzymesopgreACONADP-NAD--la似HoorganicacidsNADJDHIDHMDHNADPNfiH,,,,,,---NADMENADPMEPEPCandPKincrossollinatio打fruit山cesacs.Butithadlitle,,,pjeffectonlyforPEPR--3.llenesKlatedacidmetabolicenzymesNADPMENADMECSMACOSPEPCg,,,,,,---dNADPMDHNADMDHPKNADPIDHNADIDHanPEPPwere抑alzedbPCR.,,,,,yyqThe巧suitsshowedthatthemetabolicenzymege打eexpressionhadnoefecti。--crormTheressfNA-MEsspollinationnoalfruitj山说sacs.geneexpionoDPME,NAD,NAD-ndACOnwhcyCSawereiranlueaedMDHicreasednuatedicesacsile化wasdecr,gj,D--waonNAIDHandNADPIDHene.Inaddition化巧esnodiferenceoneneexpressiong,gofPEPC,PKandmMDH.,Keywords;CuanximiyoupummeloC7/rw<ygr幻巧况5;enzyme;citrate;isocitrate;malate;PCR()qII 福建农林大学硕±学位论文缩写词目录缩写词英文全称中文名称ACOAconitase顺鸟头酸酶BSABovineserumalbumin牛血清蛋白CSCitratesynthase梓濛酸合成酶DTTDithiothreitol二硫苏搪醇EBEthidiumBromide滨化这锭FeIron铁元素GOTGlutamateoxaloacetatetransaminase谷草转気酶LDHLactatedehydrogenase乳酸脱氮酶--NAD-MDHNADmadroenaseNADlatedehyg苹果酸脱氮酶-NADP--maroADPMDHNADlatedehydgenaseN苹果酸脱氮酶--NAD-NADMENADmalicenzyme苹果酸酶NADP-MENADP-meNADP-malicenzy苹果酸酶--NAD-DHNADNADIisocitratedehdrogenase异巧樣酸脱氮酶y--NADPIDHNADP-roPisocitrated沈ydgenaseNAD异梓樣酸脱氨酶NADNinlicotinamideadenineduceotide烟廝胺腺曝岭二核昔酸NADPNADhoshate烟酥胺腺嘿岭二核昔酸雜酸ppOAAOxaloacetate草甄酸PC民Polymerasechainreaction多聚酶链式反应PVPPPo-lrr乙稀聚化咯烧丽lyvinylpoypyolidone聚PEPPhosphoeno/pyruvate磯酸婦醇式丙爾酸PEPCPEPcarboxylase磯酸猜醇式丙丽酸簇化酶PEPPPEPphosphatase磯酸痛醇式丙爾酸磯酸酶PKPyruvatekinase丙爾酸激酶TCATricarboxylicacidcycle兰簽酸循环川 巧连农林大学巧±学位论文第一章文巧综巧,甘甜清香,乂,晰t运。中国是枯的原产地,%袖风味独特(5含量高其产量占世界80一WW上。我国抽类品种巧多,栽培面积居世界第,产里世界第二。''福建璋州市平和甚盛产洁溪蜜抽Crtrwran況5。目前蜜抽种植面积已达80多方亩,(g)''每年抽子产量多于一50多万吨,约占全国抽类总量的四分之。岳溪蜜抽质优,无巧,,清甜微酸,果皮巧,个大是我国农业部评选出来的全国优质农产品。同时具有保健功能,''因此越来越受到广大消费者青睐。早在2003年,已成功打入欧美等国际市场洁溪蜜袖,现已出口十几个国家,在俄罗斯也有销售。''是""搗溪蜜抽无巧袖类优良主栽品种,具有自交不亲和特性,W其品质优良和財'洁溪蜜抽'""储藏而闻名。但在成熟和胆藏过程中,果实汁胞会出现不同程度的汁胞粒化一'生理性病害,,重咖不堪食用。汁胞粒化,轻度裂瓣和汁胞粒化影响商品价值直是巧溪'''一蜜抽优质化的个瓶颈,,也影响了出口创汇。因此通过研究语溪蜜袖果实汁胞粒化‘?‘的发生机理,寻找矫治瘡溪蜜抽果实汁胞粒化现象的有效措施,才能大幅度提高洁溪'’'蜜抽果实品质,才能更好的提髙巧溪蜜抽的市场竞争力和有利于出口,使其产业的发展更加壮大。1.拍規类果实巧化症现象一4om果实汁胞粒化是巧橘类普遍道受的种生理病害。早在193年的时候,BartholewWW等在伏令夏澄果实中发现了粒化症状,后来在佛罗里达的巧橘也被证实存在粒化现象。许多研究表明,柏橘类果实正常汁胞和粒化汁胞的总干重、纤维素、半巧维素、木质素等存在很大差异。抽类果实在成熟和贬藏过程中发生的汁胞粒化现象是普遍发生的,成熟期主要表现为果瓣开裂、中也处汁胞异常膨大、次生壁加厚、木质化、变硬、味变淡;采后贬藏期则表现为W汁胞枯水、干瘡,并与采前的粒化症状并存于果实中。2.巧化对果实品巧的影响一‘''致的罗伯逊腑澄(简称罗,Robrtsoloran,糞离荣等巧选取了外观相对JTennavege'''C如wswenskO.isb.)、钮荷尔廝棱(Newhallnavelorange,Cz/mswnewswOsb)巧丰'骄(Harvestnavelorange,加cTwbOsb.)作为试验材料,研究了不同厮搔晶种果实发育过程中有化酸含量。结果显示,不同廝澄品种果实内有机酸含量变化有相似的趋势,在''''果实发育后期,随着果实的成熟而有机酸不同程度的降解,纽荷尔和丰腕降解幅度1 福建农林大学硕±学位论文''多,罗巧相对较少,并随着果实的发育,这种有机酸含貴的差异逐渐加大。在果实成熟’'''采收化纽荷尔果实有化酸与罗麻的差值达到拍.8%。这表明不同麻澄品种果实有W机酸的含量可能主要取决于果实发育中后期果实有化酸降解的程度。吴嘉玲等从形态解剖学特征、矿质营养水平、生物学特性、激素含量变化、活性氧代谢和细胞次生壁代谢等方面对抽果实生长发育过程中汁胞粒化进行分析,认为活性氧代谢和木质素代谢与抽汁胞粒化的发生密切相关。非原生质体中抗坏血酸(AsA)和过氧化氨讯2〇2)的相对含里调控果实汁胞POD次生壁的形成,而过氧化物酶(在抽果实汁胞次生壁的木质化中起重要作用)。P金微微等化頤巧为材斜,比较在常温胆藏过程中正常果实与枯水果实的果形、色差、?外观、果肉饱满度等性状差异,结果发现頤巧果实在把藏8090d时,果实开始出现枯水症状。在采后胆藏过程中,可滴定酸、可溶性固形物和维生素C含星总体呈下降趋势。正常果实在贬藏末期果皮皱缩,但果肉仍饱满,外观显示正常的澄红色。枯水果实外观正常,果皮优于正常果实,但果肉发黄,失去正常的程红色;枯水果实鉄径与横姪的比值(果形指')数与正常果实差异明显,而且果形指数偏大的画甜较易发生枯水病害。因此认为将质微果实按纵横径比值大小进行分级,通过合理安球采局腔藏时间,巧减少采后损失。?熊博等黄果巧果实为材料,研究果实汁胞粒化对细胞膜透性、细胞次生壁物质等生理生化指标的影响。认为随着黃果巧果实的成熟,粒化指数逐渐増大,果皮増厚;果实汁胞发生粒化时,増大了细胞膜透性巧细胞次生壁物质含量I降低了果实可溶性固形物、Vc、糖含童和可食率,降低了Sm+SdyPut的比值,但对可滴定酸含量影响较小(pp。果实粒化导致果实汁胞木质化程度加深,细胞次生壁代谢増强,同时降低了果实的食用品质。3.椒南类果实有机巧代谢的研究3.1批#类果实有机度巧形成一在果实发育过程中,大多数巧橘果实有机酸含量变化有它的般规律:即在果实生长发育前期,有机酸代谢加强,有机酸含里逐渐积累,在果实进入成熟过程中有机酸代谢减弱,W有机酸含里下降。柏橘果实汁胞中有机酸的含量水平在果实发育前期增长速度较快,果实一W的体积约为成巧体积半时达到最大值,W后有机酸含量逐渐下降。巧樣酸是巧橘类果实一有机酸中最主要的酸,其含量较高,在些巧橘的髙酸品种和鲜食品种果实汁胞中占75%1〇1W上,甚至达到97如。对于果实有机酸的来源,目前认可度较高的假说认为;巧樣酸的合成反应过程主要在果tWPEPC和CS实汁胞线粒体里进行的。文涛等发现活性升高与巧澄果实中的可滴定酸含量2 福建农林大学硕±学位论文ifa升高呈正相关,这就表明巧授果实自身是可W进行c〇2的暗固定。赵巧等也同患巧橘一tw果实自身是可化进行C〇2暗固定的观点,然后需要通过系列途径合成有机酸。BeanR等证明在果实在汁胞里可W固定C〇i42进行有机酸的合成。他们利用C〇2标记,发现汁胞中巧"ifq樣酸的c强度比果实的其他部分髙出很多。这些结果刚好支撑了上面的假说。一种假说认为:巧樣酸不是在果实汁胞里而是主要在根另、叶和果皮中合成的,然后转:迅过测定果实根移到果实内部。支撑这个假说的研究有、枝、叶、果皮等各部分的有机酸含量,发现大部分果实的有机酸含量在采摘后储藏期没有升髙的趋势。去枝叶和没有去枝叶iqt的果实,两者的的有机酸含量有很大变化。现在研究认为,果实主要有机酸代谢是在果实汁胞中通过线粒体王教酸循环(TCA循1711环)进巧的(图^1)。该图显示了果实汁胞中有机酸代谢途径主要是由巧樣酸合成il(cs)、-顺乌头酸酶-(ACO)、NAD异巧樣酸脱急酶、NAD苹果酸脱氨巧等多种酶共同发挥催化nti=作用完成的。在果实汁胞位樣酸线粒体幾酸循环中,丙雨酸首先通过脱幾反应变成+C〇2,然后发生脱氨反应,产生的氨原子在载体FAD和NAD的共同运输下经过氧化磯酸化作用产生大里ATP,同时伴随着放热现象W。-:从图11中可^看出巧樣酸可1^^通过^下两个重要代谢途径得^合成。首先,丙雨酸SIc-CA在丽酸脱氨的催化反应下产生乙厮辅酶A(Ao)。同时稱酸婦醇式丙兩(PEP)与C〇2发生化学反应,在催化剂磯酸巧醇式丙雨酸辕化巧(PEPC)作用下生成草酥乙酸(OAA)。然后,草敢石酸(OAA)在梓樣酸合酶(CS)的催化下与乙既辅醇A(AoCoA)wti发生缩合反应生成恃樣酸。3 福建农林大学硕±学位论文^部za111,/TAVmA\的/艺期巧朝?\^賺/Xy\/msi\/8!Imr/—I—?g^^fss7TCA3|!IIMa麵藏!堀仁SII^>?-沒巧1?^64JSj\sfi? ̄j?figa?iA/\s^ ̄?i\mw/\禱//^^―aifhHS\/规?於錄獻巧觀1矿ATPli。困1-1有化酿代谢过程巧要示意曲F-i11Theathwayofiicidlluuig.oanacmetaboismincellaoffrtp^--注..AD异巧樣酸脏结酶4.a困戊二酸脱纪酶复合体5.號巧酸琉激巧6.;1.巧援酸合醇2顺乌头酸醇3N--巧巧酸脱纪醇7.延胡索酸酶8.NAD苹果酸脱缉酶910.NADP异巧樣酸脱氧酶11.稱酸婿醉.顺乌头酸虜-式巧困酸媛化酶口.丙雨酸巧酵13.NADP苹果酸酶3.2果实有抓¥的构成有机酸种类很多,不容易区分,因此,根据有机酸中分子结构的不同可W分成S类可溶n一二綾酸和H錢酸兰种ti巧酸:第类可溶性酸。按照其所含綾基数目的不同分为单錢酸、。PWPW单簇酸有甲酸、乙酸、乙酵酸等;二幾酸如梓樣酸、苹果酸、丙二酸、戊二酸、草酸等;PWPUH簽酸包括顺乌头酸和异巧樣酸等;W上这些有机酸也被称为脂肪族錢酸。在本文中二W二所研究的梓樣酸,。、苹果酸和异巧樣酸等果实有机酸主要是簽酸和S教酸第类可一tn溶性酸,主要是由糖所衍生的这类酸,有半乳糖醇酸和葡萄糖酵酸等。第王类可溶性P2酸的共同特征都是含有苯环的教酸类,包括水杨酸、奎尼酸W及莽草酸等l4 福建农林大学硕±学位论文大量研究发现,水果种类不同,其有机酸主要组成也是不同的,有机酸的含量在果实中所占的比例在果实生长过程中会发生很大变化。李甲明等发现梨果实发育过程中有机酸''含量呈逐渐下降趋势。不同品种间总酸含量差异显著,果实成熟时的荘梨总有机酸含量'''’,八里香最低。陈发兴等研究认为批把果实中苹果酸占有的比例最最高,鸭梨次之psiPW高,梓樣酸和草酸等酸的含量相对较低。张金秋等认为人参中主要富當號巧酸和苹果酸等有机酸。郭涧姿等发现少数沙梨品种如新世纪梨品种的巧樣酸含量最高外,绝大多数沙.amak梨品种中延胡索酸含量最高其它几乎所有品种梨的有机酸含量都是苹果酸最高。Yi等测定了四十二个巧橘品种果实汁胞的有机酸种类和含量,发现枯橘中主要的有机酸有梓樣PS1酸、苹果酸、异拉樣酸等。粪高荣等认为巧橘可食部分有机酸的最主要成分为梓樣酸,,是影响果实风味的决定性有机酸它是巧橘果实中酸味的主要来源。梓樣酸在大多数巧橘有PW机酸含量中都是最高的,占有比例达到75%W上。所W对于柏橘类果实来讲,通常说的有机酸主要认为是梓樣酸。3.3批巧类果实中有机酸代谢绝大多数人认为相橘类整个果实生长过程都存在有机酸,果实的有机酸是在果实生长发育过程中逐渐积累起来的,只是在果实进入成熟过程有机酸含量会渐渐下降。主要是巧樣酸过程中的果实体积变大代谢减弱所致,也有可能是成熟,水分累积多,从而把果实中的有机P71酸稀释了的缘故。巧橘类果实汁胞中有机酸的运输过程是依附于浓度梯度进行的。巧橘果实成熟时液泡内的有机酸含量的浓度要比液泡外的浓度高,所W有机酸很轻易进行跨腹运ATP也就不用那么多了。许多有关巧橘类果实梓樣酸的运输过程研究表明:输,这样消耗的巧樣酸的运输途径是可W通过离子通道的主动扩散,或者也可W是通过依赖ATP的转运载PW-llVP体得W实现送个过程。Muer等发现果实液泡的ATase会不断变化,液泡膜质子渗透里PWW相对较低是导致梓樣酸度很高的重要原因。3.4巧稱类果实有机巧代谢苗研究-①巧巧敌合醇。巧樣酸合酶(CS.3.3.1)cCoA,EC2是催化草巧乙酸OAA和乙醜辅酶A发生缩合反应。生成的主要产物是梓樣酸和辅酶A(CoA)。在巧澄果实成熟过程中,CSPI1和PEPC活性增强和减弱直接影响到果实的可滴定酸含量,而且呈正相关关系。所W学者有理由认为化澄果实汁胞可W进行C〇2的暗固定,而且有机酸是在果实液泡中合成的。下面HC-3试验通过巧妙的设计证明了这个过程:首先是通过采用复合试剂,严格控制在盛花期后六周开始喷施树冠,,送就说明;然后检测CS的活性值发现送个活性值很明显的降低了了CS活性受到这种复合试剂抑制作用。同时检测到腕澄果实的有机酸含量也大幅降低。杨5 福建农林大学硕±学位论文2P,,,,1朴丽等采用超髙效液相色谱检测农大3号和农大4号两欧李品种果实发育过程中'总酸,并测定苹果酸和枉稼酸代谢相关巧的活性。结果发现、苹果酸和巧樣酸含里变化农大'''3号和农大4号两个品种果实中苹果酸和巧樣酸主要在果实发育后期积累,品种间积''农大''累速率存在较大差异。花后十走周之后3号巧辕酸合醇(CS)活性高于农大4号,成热时巧樣酸含量也离于后者。所W推测果实成熟过程中有机酸含量的变化与线粒体梓橡酸合巧(CS)活性变化有直接关系。②巧乌头酸寒.顺乌头酸庚(ACO)与果实有机酸含量的变化是有关系的,该巧的主P3,共价修饰,催化W及RNA的结合。熊晶晶要作用是参与异构化,邓秀新等骑纽荷尔旅後、红江澄、拙袖果实采后代低温胆藏过程中糖酸含量进行分析,利用毛细管电泳对采,结果表明后有机酸含量变化进行了研究:枯橘果实中的有机酸主要是惊樣酸,它是巧橘胆"纽荷尔,""藏过程参与代谢的主要有机酸。巧植、红江澄果实采后胆藏过程中梓樣酸整体呈下降趋势,S梭酸循环中梓樣酸的下游酸顺乌头酸和延胡索酸的含量变化趋势刚好与巧一樣酸相反,。送现象的出现可能号乌头酸酶活性变化有关乌头酸酶是分解桥麽酸的关键酪,>在钮荷尔巧澄果实采后见满姐.,,.;程^活性较髙分解的巧樣酸也多了雖酸的念畳增加。大多数研究认为果实中枝橡巧积累是由于ACO的活性受到抑制从而阻碍了梓樣酸转化为顺乌一头酸。但也有不致的结果,如罗安才,杨晓纪等研究了各类型巧橘果实线粒体乌头酸酶活性变化,。认为果实发育后期有机酸降解与线粒体乌头酸酶活性的降低无关而较低的细胞质乌头酸酶活性有利于酸的积累。-⑨异检獲热异梓樣酸脱氨酶(IDH)分为NAD專巧樣酸脱氨酶NADIDH化CLM41--.)和NADP异梓樣酸脱氨酶NADPIDH(ECU丄42),这二者的共同点是他们都是由不同的辅II形成两种不同的类型但是二者还是有区别的:NAD-n)H4细胞中是只存PWNADP-ID在于线粒体,在TCA循环中起到重要的作用H存在于细胞中的线粒体;然则,叶‘’‘’Pq-纽荷尔绿体和胞汁中,甚至在过氧化物?体中都有NADPIDH。粪高荣等发现丰巧‘’105出和罗巧果实中I12IDH的活性差异在花后^后。随着果实的发育特别是在花后0d之"""""I后,DH的活性差异更加明显,且表现为纽荷尔和丰巧果实内阻H的活性比罗"巧的要高。说明1DH与不同巧澄品种果实有机酸含量差异关系密切。因此认为IDH主要是通过影响果实有机酸后期的降解量而影响果实有机酸含量。④巧酸巧唐式丙面廣接化酶.磯酸巧醇式丙丽酸簽化酶PEPC(EC4丄1.31)主要作用是催化PEP生成OAA和无机碟。该酶在果实形成苹果酸合成扮演关键的作用。PEPC和PEPCK一是对具有相反功能的酶。PEPC簽化PEP产生OAA,可作为前体物质可用于巧樣酸的合成。6 福建农林大学硕±学位论文;而PEPCK催化OAA向PEP的转化,达在分流苹果酸进入有机酸代谢W及有机酸向糖的转化方一。PEPC和CS活面起着重要作用研究发现温州蜜巧果实巧樣酸积累与性上升时期并不致,但果实巧樣酸积累期间PEPC/IDH的比值较高,PEPC,。巧燈果实发育过程中活性越高PEPC/1DH的比值越大,果实中有机酸的含量就越高PEPCK活性也会随胳澄果实发育过此PEPC和PEPCK一,程不断增加。由,与甜橘果实梓樣酸的合成有定关系但其具体功能及一步研究其在不同果实中的表现形式有待于进。3⑤苹果酸巧1\。苹果酸酶(ME)在苹果酸生成丙丽酸过程当中起到重要的催化作用--NAD-NADME(EC1」NADPNADP-苹果酸酶分成苹果酸酶.1.38)和苹果酸酶ME(ECWW1丄].巧),这两种酶是都可W使苹果酸发生氧化脱幾反应的酶。Hulme等y苹果为研究对象NADP-ME活,研究了在苹果果实成熟过程中性和果实中有机酸的含量的变化。研究W1结果表明NADP-ME活性和果实中有机酸含量的变化呈负相关关系。NAD-ME和一-ME也二NADP,存在不同,就是者发生作用的位置不样前者发挥作用的主要位置是在线粒体中,而后者却是在细胞质中的。(MDH)WP为辅-⑥苹果酸脱氯巧。苹果酸脱氨酶NAD或NAD因子,分成NAD苹果NAD-MDH(EC4丄P-NADP-酸脱氨酶1.37)和NAD苹果酸脱氨酶MDH(EC4丄1.40),参与到了乙醇酸循环体中。他们可W存在于线粒体,细胞质W及过氧化物酶体中。苹果酸合-NAD-MDHNADMDH参与了催化OAA成时,在细胞质中有发挥重要作用;同时与苹果LWHa化-iNADMDH酸发生可逆反应。等从玉米根部分离出细胞壁相关的,在它的催化之下-MDH除存在于线粒体OAA含量在很短的时间内迅速降低,OAA被氧化成苹果酸。NAD、过氧化物体、细胞质中外,还在叶绿体和乙酵酸体出现,能催化草駄乙酸盐与苹果酸盐么间PWMDH活一直较低相互转化,但其他巧诘。罗安才等在研究各类相橘品种时发现巧樣性MDH活性变化与果实梓樣酸含量变化也没有发现有明显的相关性。⑦巧酸巧醇式两爾酸巧酸酷虜。磯酸巧醇式丙丽酸憐酸醋酶(phosphoenolpyruvatephosphatase,PEP巧在植物中广泛存化其作用被认为是将PEP直接水解成丙丽酸释放Pi,一PPK提供了条绕过消耗i的两厕酸激酶,W()途径的支路维持植物在缺憐条件下的一WEMP-TCA这。PEPP性质相差较大uf等先后从黑基本代谢的运转不同来源的,D芥悬浮细胞中纯化了2种能水解PEP的酸性稱酸醋酶,其最适pH都是5.6,但其温度稳定亚基结构一一、底物专亚细胞定位也不同,因而推测其功能也不性、性等相差很大,样。WMalhoraPEPP,最适H为8.5。郭振飞等从水稍叶片中纯化t等从萌发的绿豆中纯化p一一一一2种水解PEP的稱酸醋酶,种最适pH为5.3,专性差;另种最适pH为8.7,专7 福建农林大学硕±学位论文PEPP-性较强。W大豆叶片为材料纯化,过DEAE舒维素拴时得到2个活性峰,随后研究证一一一一实个是非专性的酸性巧酸酷酶,个是专性较强的PEPP。PEPC和PEPCK同时存在于果实细胞质中一,它们之间的关系有待进步研究,尤其是相枯果实中PEPCK还未见报道。一.,EC240⑨雨酸巧巧雨酸激酶。K.7.1.)是糖酵解途径中的关键巧,也是最后个((ADP)生限速酶,催化焼酸巧醇式丙西酸PEP)和二礎酸腺昔成巧兩酸和云瞬聽腺昔(ATP)tW一,为埃博霉素合成的重要前体之,丙困酸主要由丙雨酸激巧催化巧酸巧醇式两雨酸产wg生。由此可见,丙巧酸激酶的活性直接关系到埃博霉素的合成量。4.研究目的''''品质优良洁溪蜜抽,但无朽巧溪蜜抽果实在成熟过程中裂瓣、汁胞粒化问题一旦发生粒化现象相当严重。蜜抽果实,果实汁胞的出汁减少,汁胞偏暗,风味变淡,送严',,直接导致抽农收入的降低。因此重影响了销售和出口,研究度溪蜜抽果实汁胞粒化对''有机酸代谢的影响,巧溪蜜枯对通过寻找有效的生产措施矫治果实汁胞粒化现象,提高产品质量和出口量,使其产业的发展更加壮大。''''本试验科洁溪蜜抽为材料,采用生理生化的手段测定和分析异花授粉对语溪蜜抽果实梓樣酸、异巧橡酸和苹果酸等有机酸代谢含量的影响;通过紫外分光光度计测定异花授--ME-粉后果实正常汁胞和粒化汁胞NADP,NAD,CS,ACO,PEPCME,NADPMDH,'NAD-MDH,PK等11个酸代谢相关酶活性变化;并对有机酸代谢相芙辕塞巧进行了炎光定量PC民分析。这些结果将为更深入研究汁胞粒化对果实品质形成的分子调控机理奠定基石。8 福建农林大学硕±学位论文第二章异花巧巧对嘴巧蜜袖'果实品巧和有抓巧含量的巧咱1?材料和方法1.1试巧材巧''本试验语溪蜜袖品种取自福建省壁州市平和县农业科学研究巧锦山合作杜的'巧溪'蜜袖果园?树龄25年,树体健壮。1.2试验设计和采样'''’'试验设计:设升兰个组合,分别为搶溪蜜抽自花授粉(对照)、度溪蜜抽X坪,,,<,X山抽、痕溪蜜袖芦巧。一一异花授粉:选择条件较为致的6株树体,每株树体上同时进行自花授粉和异花授粉试验。每株每姐合异花授粉花朵数为20朵,每组合共异花授粉120朵花。树体按照果园正常管理。采样:在抽子0,1月15号成熟期每株摘取自花授粉和异花授粉組合各3个果实,果实大小分别为大,、中和小色泽澄黄,表皮光滑。切开果实,称重、计算果实粒化指数、测定可溶性固形物,并按自花授粉和异花授粉组爸分别采取正常汁胞和粒化汁胞迅速放入液氮‘-C冰箱保存中,然后放入80。13试验方法,1.3.1嘴溪蜜抽果实粒化指数许算nil=XXX:++按照余文琴等论文中粒化指数的计算公式果实粒化指数P(0A1A2(,〇A+3x+4xA/4xAA+AA牛X2A34(〇十A10。)i]十34))'''A'其中公式里的:,A指洁溪蜜抽裂化瓣数,X指清溪蜜抽粒化级别x。1.3.2果实汁胞可洛性固形物測定用天平称取果实汁胞80g,棒汁机棒出汁液后,用纱布过滤出汁液(也作为1.3.3中测量可滴定酸所用汁液)WYT*4,用折光仪(泉州中友光学仪器有限公司)测出汁液的可溶性固形物值。重复3次,取平均值。果实汁胞可溶性固形物测定方法参照BartholomewE.等47[]01.3.3可巧定酸測定采用酸減滴定的方法进行测定果实汁胞可痛定酸的含量,20m250ml取l汁液定容至,0m2-取5l用于滴定,加3滴廚軟,W0.1mol/LNaOH滴定至变色,记下所用NaOH的量。8重复W14次,取平均值。具体测定方法参照Chen等。14.3.主要有机酸測定与计巧tni主要有机酸具体测定方法参照Wang等。9 福建农林大学硕±学位论文称汁胞〇.5g,放在预冰干净的研体内,快速磨碎成粉,用小勺子装到离也管内。充分展4151荡后加入%l,在冰上静置30分钟左右,让试剂得W充分溶解。放入4C离也HC104.m亂离也1〇111出之后,取上清液1.21111。将预冷的&(:〇35片1慟1加入,稚离也,放置51111〇。’C一然后4,离也10min。取1ml上清液加入少量活性炭,混匀。4C冰箱静置半小时至小时,4。离也10rain,取上清液,。再次相同条件离也取上清液測定巧稼酸、异巧樣酸和苹果酸含里。重复4次,取平均值。计算各组数据的均值,标准误,利用软件DPS统计5%显著水,最后用软件S平IGMAPLOT作图。2.结果与分巧',2.1异花授巧对培溪蜜抽果实巧化指巧的影响‘'在两个异花授粉組爸中,坪山抽授粉仅3号果实粒化指数较髙,果实重量也较轻,可能是生长过程受到其他因子影响的缘故,其他果实粒化指数普遍较低,平均粒化指数为一''0-.巧2%巧21。另芦抽授粉姐中,果实粒化指数高低相楚很大,高的达到2,低的)'%-为0,0,。果实平均粒化指数达.820表22粒化程度稍高因此,后续的试验选擇湛溪()蜜抽'与'坪山抽'组与'洁溪蜜抽''自花授粉组之间进行比较分析。嘴溪蜜抽自花授5%-粉組的果实汁胞平均粒化指数为,显21.0著高于异花授粉果实的粒化指数表3。()>'?表2-1哨山袖巧巧对洁溪蜜抽果实粒化巧致旅巧巧,‘T-hffiable2l.Teeectofng油anyoullinationonfruitr&Midatlonindexppoofg(,Guanximiyoupummelo(C如MS复/wt舰) ̄ ̄ ̄果肉重果实可食率总瓣数开裂巧数粒化指数巧号£()()(%)^^^j11.109257.71530.46621267.9巧.91550.8003985.364.31392.46141117.960乂13.1023051262.760.U3.615206..116346021430.48371167.967.91430.35783巧.454.1.1122016691081.661.01330.230平均值1..1698160713.83.40.59210 福建农林大学硕±学位论文'?'?表2-2芦巧紛树駒健抽果实粒化指致的影咱,',2-Table2ltnnfruitranui.TheefectofMuganolinaioolaton虹dexofGuanximioupgyummek)C进打"randp(g的 ̄ ̄ ̄ ̄果肉重果实可食率总巧数开裂巧数粒化指巧编号()(2)(%)j^^1..12000如31640.5002..100306631440.71431102.472.11282.00041294.668.31450.85751064.570.71440.85761097.869.71261.33371220..969,713000008895.766.01020.3009887.060.41420.142平均值..於01085.167.513.2380*表2-3自花授秘对哺溪蜜袖果实巧化指数的巧巧',Tabe2-3.Thefftlf-llitifritranulationindexfGuimileecofseonaon0田uoanxpgyoupummelo{Citrusgrandis) ̄ ̄ ̄ ̄ ̄总巧数开裂巧数粒化指数化口\编号果实可食率)(%A((g)(个)个)(2〉(%).乂112巧7641420.3巧21343..97051630.巧731502.965.01251.00041251.265.01271.416513:33.473.31281.6666105.1461.41151.2巧7141056L61470928..8..1258666乂127183391.149.667.01340538平均值1284.566.1..128531.05022.异花授巧对果实可巧性固形物和可巧定康的影咱'’无论正常汁胞,还是粒化汁胞,坪山抽授粉都能提髙果实可溶性固形物含量。异花’'授粉组果实正常汁胞可溶性固形物平均值是9.8%,比巧溪蜜袖自花授粉组的9.4%稍高''一。点:异花授粉果实粒化汁胞可溶性固形物平均值是8.2/。,比巧溪蜜抽自花授粉组的'‘''-7 ̄平均值.9%髙度24。图22坪山抽授粉和自花授粉对拒溪蜜袖果实可溶性固形物)的差异性比较结果是互相之间没有显著性差异。11 福建农林大学硕±学位论文'''>表2>4坪山抽授巧和自猫巧俯織巧抽果实可浴拴固形物的影巧i*-T ̄able24.Theeffectofpinshanyoupollinationandselfpollinationontotal抑lublesolidsgT‘,(SSofGuanximiouummeloC6m¥ran化)yp(g) ̄<坪山抽’授粉'窜巧蜜抽'自花授粉编号巧号—正常(%).粒化(%)正常(%)粒化(%)1..10.2851997.029.56829.87.2,39.88...03858048.5知848.58.29.5.88.25958.1610.37.569.17.479.08...57927980.1.19.58988.791.310.0910.581.2平巧值9...8如29479''-表2-5异花授粉组果实可滴定酸结果和表26追溪蜜袖自花授粉组果实可滴定酸结O%的结果都比',正常0/O.果中可切看到异花授粉组的可滴定酸平均值.607和粒化0526语溪'蜜袖自花授粉绍正常0.594%和粒化化480%的结果稚髙,但差异不明显。'''表2-5坪山捕巧沿巧嘴溪塞捕累实巧沒定度巧巧晌(,-Tab*ettiTitrttTAle25The惭cofpingshanyoupollinaononaableacidiy(of)^^Guanximiyoupummelo{CUrusgrandis)可满定酸含量可滴定酸含量编号正常(ml)折算系数粒化(ml)巧算系数(%)(%)1....165032拍0541U5(U283050826.32扮0.5411.巧0.32巧1.500.41031.8000.巧..32835901.如0.8304924.....1550328305081.4303283046951....70032巧05巧1.55032830.50861.830.32830.6001.巧0.32830.5417....1680328305511.540.3283050582....600.32830853213032830.69992.20032830.巧2.扮0.32巧.10.600平均值0.6070.52612 福建农林大学硕±学位论文''表2-6自花授巧对洁溪蜜袖果实可巧定度的影巧‘-,2 ̄ffectofTabselfollinaiononTkra化bleacle6.TheeptidityTAofGuanximiou()yummeloCitrusrandisp{g) ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄可齡酸S量可滴定酸含量1胆且了勺I、拍撕车从,1/拍巧玄新编号正常(m!)折算系数fe化(ml)折算系数(M..3巧06...120002.56100032830328...21.620328305310950.32830.31131.300.;32830.4260.850.32830.27941.620.32830.53..11550.3283050852....170328307121900J2830.62361.700.32830.5581.650.32830.5417..1900J2830此3167(U2830.5488.....1.950328306401730;3283056792.05(U2830.673.1.87032830.613.平均值05940.4802.3异花授粉对果实有机酸含虽的影响''''坪山抽授粉和自花授粉后的洁溪蜜袖果实正常汁胞和粒化汁胞有机酸含量的变‘'2-1化如图。与自花授粉比较,异花授粉对拍溪蜜袖梓樣酸和异巧樣酸的影响较大,异花授粉显著提高了果实正常汁胞和粒化汁胞巧樣酸的含量水平I同时降低了果实正常汁胞和粒化汁胞异梓樣酸的含量。并且异花授粉提高果实正常汁胞梓樣酸的含量和降低异巧樣酸的含量比粒化汁胞变化明显。一致异花授粉对果实汁胞苹果酸的影响表现不,增加了果实正常汁胞苹果酸的爸量,而显著减少了粒化汁胞苹果酸的水平。—^,In!。\f\IInfmlLAl]::^I1LIJJI:s*ir-ina-to〇iiti〇n〇r〇?s〇iin?tenrmappNlo??edIIGranulatgr鬥IIJ—>L—I1100s-onatonc-prossonatonelflliipllii''2-图1异花授粉对洁溪蜜抽果实有机酸含置的影响^,F-i.21.Theffecofollinaiononoranicacidcon化nofuanximiouummelogetptgtGypCitrusrandis{g)Malate,citrateandisocitrateinnormalandgranulatedjuicesacsofCitrusrand-gisfruits.Eachbarrepresentsthemeandbstandarderrorof46replicates.Diflerentlettersabovethebarsindica化asignificantdifferenceatP<0.05.13 福建农林大学硕击学位论文3?讨论'',巧溪蜜抽具有自交不亲和性,因而果实无巧无好是导致抽汁胞粒化的根本原因。研究认为果实的汁胞粒化与果实内源澈素水平及其平衡有关?种子和果实均是内源激素PWPU,合成的主要部位,抽种恃的败育导致内源激素的失衡这点己在甜澄果实汁胞粒化中P2''''1。得到印证,它可能是粒化的关键所在本研究通过坪山袖和芦巧授粉都能减轻''''语溪蜜抽果实粒化程度,直接证明了果实粒化与内源激素产生的种巧相关。坪山抽'''''相对于芦巧更能降低宿溪蜜抽果实平均粒化指数,可能与杂交亲和性有关,坪山’抽具有更好的亲和性。通过使用生长调节剂能调控粒化的发生也说明汁胞粒化与内源激素有密切关系。如使用GA3-、NAA、24D等不同的浓度生长调节剂对减轻粒化也非常有敗果实成熟期喷施乙炼,SP1--,。采用6BA、GA3和24DH种不同浓度不仅降低考拉橘的粒化同时也改善果实质量,'W'''11组合幼果涂抹洁溪蜜抽果柄,有减轻果实粒化指数效果。但在洁溪蜜袖果实膨-783处理果,反而促进了汁胞的粒化(潘东明998。大期的月份用GA实,1)这两种结果的不同可能与生长调节剂的应用时期有关。''试验发现,异花授粉可提高巧溪蜜抽果实可溶性固形物含呈,提升果实食用品质。P51对于无酸品种则是相反的结论,如Camerom等在无酸澄和无酸抽杂交果实中的可滴定酸和可溶性固形物都是降低的,粒化汁胞则显著降低可溶性固形物。正常汁胞与粒化汁胞相比SP。含量,影响了果实食用品质Kaur等也发现甜澄果实发生粒化后可溶性固形物含量会显著降低。可溶性固形物和单糖的含虽降低可能是由于从聚爸多糖向可溶性巧水化合物的转化受到抑制,淀粉或水溶性碳水化合物在粒化果实中转化为聚合多涛,促进了果实汁胞次生细。。胞壁的增厚,导致果实汁胞粒化的发生因此果实汁胞的粒化是果实品质下降主要原因'果实中占有机酸总含量比例最主要的S种酸梓樣酸、异巧樣酸和苹果酸是嘴溪蜜抽。PWYamald等研究认为大部分枯橘品种的果实汁胞含有苹果酸,巧樣酸,异巧樣酸,草酸,乙酸等,?,巧樣酸在大多数梢橘有机酸含量中都是最高的其次是苹果酸袭高荣等发现巧樣酸是批橘果实中酸味的主要来源,是影响果实风味的决定性有机酸。本研究同样发现异''花授粉对巧溪蜜抽巧樣酸的影响最大,异花授粉湿著提髙了果实正常汁胞梓樣酸的含量,明显降低了异巧樣酸的含量,表明异花授粉可能也通过了激素水平的变化或平衡影响了有机,酸代谢途位加强了梓樣酸的代谢,降低了异巧樣酸的代谢水平同时也增加了果实正常汁''胞苹果酸的合成掩溪蜜袖果实粒化汁胞可滴定酸降低,可能是由于果实汁胞粒化后果。实中巧樣酸和异巧樣酸含量大里减少的缘故。14 福建农林大学硕±学位论文第H章异花授巧对嘴溪蜜袖'果实汁胞有机度酶活和基因表达的影咱1?材料和方法11.试验材科同第二章.111.2巧验方法1.2.1相关寒活性的規定----ME测定,,NADMDH,PEPC,PEPP,NADPIDH,NADPMENADPK和ACO酶活性值,测定时制备提取液方法略有不同,具体如下:1080W【提取准备.5入(:准确称取果实汁胞g;加仙现配的缓冲液(配制方法参照ang等乃到研体中,充分磨样,加800叫现配的缓冲液洗脱干净后进行离也,备用。4一O将试验用柱子放入X:冰箱预冷半小时。20mol(idH2〇滴次再加入.OlmolHees-KOH洗脱缓冲液洗涂p;接着取1ml上清液上柱子,流尽,然后加1.8ml洗脱缓冲一液,滴再加2ml洗脱缓冲液,收集备用流尽剩下。加入相应的试剂然后利用紫外分光光度计测量该酶的活性值并记录表別汁胞有机酸代谢相关巧活性拥定劝应巧加的试剂巧巧的量(单位》11)T-畑meable3l.Tlieamountofreaen化andenzymesofacidmetabolizin巧sactivityssaggayuicecsinsaunit;ftlj()---NADPNADNADP-NAD-NADNADP-试荆或醇PEPPPKCSACOPEPCMEMDHK)HMEIDHMDH提取巧1001002005160160160160160160160双热水13050200315240I如3饥300320195155-HCmol眯味巧l8010.5molKCl80800.1moIMgCbSO800.5%BSA80800.02molDTT?080.mo15lNADH80801单位LDH101020molPEP808020molADP80-1moITrisHCI40-HC0.5molTris!妨80800.05撕80撕80moIMgS〇40.01mol808015 福建农林大学硕±学位论文-EDTANa2mo10lOAA802moINADH8040molNAD80molOINAD800.05molKa8080O.SmoINADP800.05mol择巧巧巧80800ees-.5molHpKOH0泪5mol苹果巧批8050molMnS〇480撕O.OimoJDTT80lOmolDTT80mo-ees80808080IlHpKOHmolOOl异梓巧巧撕8020molDTT8080-1单位NADPIDHSO0.05molMnCl8080:5molNADP808080olOOmIACO800-.5molTrisHCI80mo1lDTNB802m〇]COA8010molOAA80802lNaO80moHO.moal*NOHCOj拼o1mlMDH如UmoIPEP抓O.OSmonlMCls80 ̄ ̄1.2相关酶.2活性的分析W有机酸相关代谢酶酥活性分析方法参照Wan等。计算毎组酶活性值结果的平均值和g标准误等,利用用软件DPS进行数据分析,并且在软件SIGAMAPLOT10.0里面绘制结果图。1.2.3汁胞总RNA的提取和质量的检测本试验步巧参照快速提取试剂盒说明书提取'瘡溪蜜抽,汁胞总RNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪上检测拍照。并在紫外分光光度计上测出总RNA的OD值和RNA的浓度(Hg/yL)。.2.4NA的逆转1R录按照RNA逆转录试剂盒要求,在新排管里加入试剂:5XPrimeScriptBufer(forrealtime)2|xl;16 福建农林大学硕±学位论文PrimeScritRTEnzmeMixI0.5il;pyjOi.1ligoDtPrime50in05;(f)^Random6metsyOO卿)0.5^1;T=500otalRNAng;RNaseFree姐2〇10^1;挡上试剂都加完全之后将其放入37X:水浴锅15mim然后再放入85r水浴锅5s,迅速‘-拿出,放入20C冰箱备用。2C艮引物设计1..5有机酸代谢酶基因巧光定量P有机酸代谢廣基因引物的设汁的方法参照Wang表3-2汁化有机度代巧巧基因引巧*-nTabIe,32,TherimeisoflzinaddmetaboiinenzmesgeesuicesacspgyjF,??Genesorwardprimers5一3Reverserimers5?5()p()mm-MEGGAGGAGTTCGTCCTTCAGCCTGCCTTTGAGTCCACAAGCCAAATCNAD-METGATCTTGGAGTTCAGGGAATTGGAGCACTTCCTGCTCCAACTACAACTAcyNAD-MDHAGTTCGCGTCCTTGTTACTGCCCAGAGCCCTGTTGTGATmNAD-MDHAATATGATAAGCAACCCAGTACTCCATTTTTCCCAAGTCTNAD-IDHCCTTCCTACGCGTCATGAGAATGTTGCATGGTCAGCCCCCACATTGCCTCNADP-IDHGGCCATGTACAACACTGATGAGCATTGTCATCCAACTTTGCCCTGCSGAGCTTATGAGGCTTTATGTCTCGATACTCCAAAGAGAACAPKGAACACTGCAATGCTAGGCGAGAGGGTTTCATCACTGCAGGTCCAATCACOGAAGCAATCACCAAAGGGAATCTACTACGGTGAATTCGCTCAAAGPEPCTGAAATGAGAGCTGGAATGATTCAGCTATGACATGAAATGT1.2.6焚光定;1PCR逆转录后的PCR管置于冰上,然后依次加入切下成分:dOsterile出stilledwater9.5l;&()nPCRforwardprimerF0,5fil;fowardrim.PC民民05ilrerf;p’SY巧民remixExTatlimasehlus12.5il〇pp(p)|在PCR仪器上设置好条件,1.化后拷贝数据。分析结果。1.2.7表达分析表达分析方法:计算每组虜基因表达里结果的平均值和标准误等,利用用软件DPS进行数据分析,并且在软件SIGAMAPLOT10.0里面绘制结果图。17 福建农林大学巧±学位论文2.结果与分析,2.1异花授巧对嘴溪蜜袖果实有机巧酶活性的影巧‘巧溪蜜抽'果实汁胞大部分有机酸酶活性产生了显著作用异花授粉对。对梓稼酸合成--S--ACO(图1-BAD-ID-)酶C(图31A)、顺乌头酸酶3)、异巧樣酸脱氨酶NH(图31C、---(-)--异巧樣酸脱结酶NADPIDH图31D、苹果酸脱氮酶NADMDH(图3IE)、苹果酸----ME(酶NADP(图3小0)、苹果酸虜NADME图31H)、稱酸巧醇式丙爾酸縣酸酶P邸P----1-1J-1K(图31)、巧酸巧醇式丙兩酸竣化酶PEPC(图3)和丙围酸激酶化(图3)等10个与有机酸相关巧的活性影响较大,差异达到了显著水平。而对苹果酸脱氨巧--NADPMDH1-(图3F)的影响较小。一-NADPIDH(3-1-D在正常汁胞和粒化汁胞中表现致的是异巧樣酸脱氨酶图)、苹果----DP-1FPEPC(图酸脱氨酶NAMDH(图3)和稱酸巧醇式两兩酸證化庚31J)i其中异-梓樣酸脱氨酶NADP-(---IDH图31D)和磯酸娇醇式丙兩酸簇化酶PEPC(图31J)活性都---显著下降呈显著上升,苹果酸脱结酶NADPMDH(图31F)活性。对其他有机酸相关酶的影响,在正常汁胞和粒化汁胞中表现不同,异花授粉降低正常汁-(---ME--胞苹果酸酶NADPME图31G)活化粒化巧胞变化不大;苹果酸酶NAD(图31H)异花授粉后使其正常和粒化的果实汁胞酶活性都造成明显降低的影响S(。梓樣酸合成酶C图-------1A)、苹ADP-NADI3果酸戚结酶NMDH(图31F)和异梓樣錶脫氨酶DH(图31C)P(--在正常汁胞升高,而在粒化汁胞中表现是下降;而丙爾酸激酶K图31K)则相反,在正常汁胞明显下降,而在粒化汁胞中表现是升高。18 福建农林大学硕±学位论文■■■■■。々-T-2.S1In'?inIn〇?L ̄I^11^ ̄ ̄IUIB(7.?^I。L。*i〇^ ̄I1^ ̄I1-■-■-■■— ̄I^ 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福建农林大学硕±学位论文2.2总RNA的提取%琼脂糖凝胶电泳检测-1(图2)可28S和18S.03看到条带清楚。核酸仪检测样品RNA纯D260OD280-10D260/OD2302.0总度高,其中O/值介于.82.之间,O大于。表明汁胞总RNA的质量好,符合进行巧光定量PCR的RNA质量要求。'rkjKi1)<tmiL_!::::■■iw2CMI0bif<'图3-2洁溪蜜抽果实汁胞总RNA提取电泳图''F-mi.32.otalAouanxouuicesacsgTRNfGiiyj2.3有机酸代谢虜基因表达分析有机酸代谢酶基因巧光定量表达分析结果显示:相对于自花授粉,异花授粉对果实正AD-ME-常汁胞有机酸代谢酶基因表达没有影响I只有在果实粒化汁胞中NP和cyNADMDHNAD--IDHPIDH的表达量有显著升高,而和NAD的表达量降低。,在异花授粉果实中,正常汁胞和粒化汁胞有机酸代谢酿基因巧光定量表达进行比较NADP-ME-NAD-发现在粒化汁胞中,NADME,cyMDH,CS和ACO这5个基因的表达量NAD---1DHP1DH这PID都很明显的増加,而和NAD两种基因的表达量是减少,另外NADH的变化达到显著水平;此外PEPC,PK和mMDH这H种基因的表达量都是没有显著差异(图---33)。自花授粉组合中,有机酸代谢酶基因的巧光定量PCR结果(图34)显示NADPIDH,---cNADMDH,CS’ACOPEPC都有所增加,AD,mMDH,NADME但是只有ME和y和NNADP-NAD-PEPCMEIDHPK的表达达到显著差异水平;,,量结果没有显著差异。20 福建农林大学硕王学位论文-2.0Iaorma巧NlIIGranulated1-.5a5nab1-I.0gflHlO■jInn戸巧0-.500-如口一从—、口一巧C〇於G杯茂诉。抑护O>户P片''图3-3昇花授巧猜溪蜜袖果实正常汁胞和粒化汁胞有机酸代谢酶基因的定量表达分析F--i33Rliiig..eatmeuanttatvereversetranscriionPCRRTPCRanalif0qpt(q)ysso巧anicacidmetaboleicnzmeenesinnormalandranulateduicesacsofollinatyiononggjp^G^uanximiyoupummelo{Citrusgrandis)-1.6|1Normal-1.4aIIGranulatedb-rfaa巧-1-2円nnAx5na■■*Inn08-泣?空0-S-6星0-.4-0.2。分於从。^种'。如护护於?庐。知>>''图3-4自花授粉落溪蜜袖果实正常汁胞和粒化汁胞有机酸代谢酶基因的定量表达分析F-RT-i.34,RealtimeuantitativereversetranscritionPCRPCRanalsgqp(q)yisoforganicacme-idmetabolicenzenesinnormalandranulaedilfyggtjucesacsofsepollinationon‘,GuanximiyoupummeloC/Yn/yn/w化(各)21 福建农林大学硕±学位论文NADP-meNADP-MENAD-MEchso-droenasemalicenzlicNADmala化dehy(),,yygcochondr--MDHmiialNADmaladehdroenasemMDHNADPisockra(y),t化yg(),化dehdroenaseNADP--IDHNADPIDHcianhaseCSaconiaseyg(),tr化巧t,t,()ACOruvatekinasePKhoshoenolruvatehoshatasePEPPand(),py(),pppypp()phosphoenolpyruvatecarboxylase(PEPC)innormalandgranulatedjuicesacsof-Citrusrandisfruits.Eachbarreresentsthemean±standarderrorof37gprelica:es.Sinificandifferencesweretes化dbetweennormalandranuladptgtg化uiceacsforthesameene.DifferentlettersabovethebarsindicateasinificantsjggdifferenceatP<005..22 福建农林大学硕±学位论义义讨论大部分的巧橘类果实中积累巧樣酸的过程都发生在液泡里,在果实汁胞液泡内巧樣酸合t气B成酶CS能够催化草醜乙酸和己敢CoA进行缩合反应形成梓樣酸ogin和Wallace认sPi为梓樣酸含量的降低,主要原因是在线粒体顺乌头酸酶ACO的催化之下巧樣酸发生异构-化形成异椅樣酸。郭搁姿等认为在梨果实发育过程中,CS、NADPIDH与黄冠梨果皮和M-iACO与果肉中巧樣酸积累量呈极面著正相关关系,而t黄冠梨果皮和果肉中梓樣酸积累'',异花授粉对措溪蜜袖果实汁胞巧樣酸合成酶CS量存在极显著负相关关系。本试验中、ACO--顺乌头酸酶、异巧樣酸脱氨巧NADIDH、异梓樣酸脱氮靡NADPIDH等有机酸酶活性产生了显著作用。说明异花授粉提髙了惊樣酸代谢途径相关酶的活性,促使巧樣酸总量增ACO、NAD--加了,尽管顺乌头酸酶异巧樣酸脱氨酶IDH、异巧樣酸脱氨酶NADPIDH分,可能是异花授粉更有利于合成巧樣酸解巧樣酸也在升高。与粒化汁胞比较,正常汁胞中巧樣酸合成酶CS、顺乌头酸酶ACO、异巧樣酸脱氨酶NAD-ADP-DHIDH、异巧樣酸脱氨酶NI都表现升高。但在粒化汁胞中,括樣酸合成酶CSNAD-IDH和异巧樣酸脱氨酶表现是下降。这些表明在汁胞粒化过程中,巧樣酸代谢是趋向于分解巧樣酸;Degu等解释了发生粒化的汁胞梓樣酸含量下降的原因,主要是抑制了橄橘类果实ACO的活性,会直接导致ACO代谢转换成合成氨基酸代谢,所W巧樣酸含量下降。iiq郭润姿等,果皮和果肉中苹果酸均呈先上升后下降的庭势认为在梨果实发育过程中,d20-在盛花后撕时达到最髙值果皮和果肉中梓樣酸在梨果实生长发育过程盛花后120;(-MDH-d中均不断积累。NAD、NADPME和PEPC活性与黄冠梨果皮和果肉中苹果酸积)NADP-累量呈显著或极显著正相关关系。李甲明等发现在苹果酸代谢中,不同品种间ME-MDH和PEPC-酶活性在果实发育后期差异显著,而NAD酶活性无显著差异,表明NADPME''''''酶是引起鸭梨、在梨和八里香成熟果实苹果酸含量差异的主要原因。本研究与一<,-上述结果是致的,异花授粉降低了巧溪蜜抽果实正常汁胞苹果酸酶NADPME活性,可能是导致梓樣酸含量提高和苹果酸含量降低的原因。一丙丽酸激酶PK对有机酸代谢产生定的影响,而憐酸猜醇式丙丽酸稱酸酶PEPP对有机酸代谢影响不明显。''一语溪蜜抽有机酸代谢酶基因巧光定量表达分析中,有些有机酸代谢酶基因是与酶AD--ME、ACO和活性是相吻合的,如异花授粉影响果实粒化汁胞中NME,NADP23 福建农林大学硕±学位论文-,巧樣酸呈降解趋势cNADMDH的升高,说明果实汁胞粒化过程中苹果酸有所升高。而其y'一他有机酸代谢酶基因巧光定量表达与有机酸代谢酶活性是不致的,如异花授粉对洁溪蜜'-抽果实正常汁胞有机酸代谢醇基因表达没有影响,粒化汁胞CS基因增加表达,而NADIDH'-和NADPIDH基因减少表达,化及PEPC,化和11^011基因没有差异表达,表明语溪蜜抽'汁胞发生粒化机理是复杂的。汁胞拉化形巧的原因可能与生物调控和信号转导有密切n一ti的关系,涉及了物质运输,、活性氧和激素等多个较为复杂的代谢途径是种复杂的生理生化的变化过程。24 福建农林大学硕±学位论文小结''1,测定自花授粉和异花授粉瘡溪蜜抽果实粒化和非粒化汁胞中巧樣酸、异巧樣酸'和苹果酸有机酸代谢含量变化。结果表明:与自花授粉相比,异花授粉后的嘴溪蜜抽果实正常汁胞中的苹果酸和巧樣酸含量有所升髙,异巧樣酸含里降低:而粒化汁胞中的苹果酸含里是明显下降,巧樣酸含量明显升富,异巧樣酸含畳有所下降。-ME-2,测定自花授粉和异花授粉后巧溪蜜抽果实有机酸代谢中NADP,NADME,CS,--ACOPEPCNADP-MDHWAD阻H-,MDH,PK,NADPNADIDHPEPP’,和等。个酸代谢相关酶活性。发现异花授粉后的巧溪蜜枯果实汁胞发生粒化后顺乌头酸巧ACO有明显升高,巧樣酸合成酶CS和而丙爾酸激酶PK稍微降低,憐酸斌巧式丙爾酸磯酸酶PEPP无明显变化,磯酸巧醇式丙兩酸後化酶PEPC没有显著的变化。''3--ME,语溪蜜抽果实有机酸代谢中NADP进行自花授粉和异花授粉后ME,NAD,-MDH-MDHCS--,ACO脚C,NADPNAD,PK,IDH和PEPP,NADPDH,NADI的基因表PCR--达分析。巧光定量测定异花授粉后的果实汁胞中发生粒化的NADPME,NADME,cD-MDHyNA,CS和ACO五种基因的表达量都有显著升島而正常的果实汁胞却没有;然而NAD--阻H基因的表达量都是显著降低-IDH和NADP;我们看到PEPC,PK和mNADMDH这王种基因的结果中差异不显著,即表达皇无显著变化。25 福建农林大学巧:t:学位论文参考文献刘顺枝?抽类?食[u,江学斌,江月玲等果实提取物生理功能及综合利巧研究进展的品科20?286学,12,3313:280.()口]BartholomewE,SinclairW,RabyE.Granulati畑crystallizationofValenciaoranesW.()gCa-lifCitror.l934l3:8889.g,%)umerraiPn口]Ritenour,Albrigo,Bs,Mill.Gnulationn巧oridacitrus口?Inroceedigsofthe]Fu-loridaStateHorticultralSociet2004224:358361.y,,()4潘东明郑国华陈桂信.塘溪蜜枯汁胞粒化原西分析阴.果树科学1999[],,,,6202-13:209.()5粪荣髙..[],吕秀兰,张光伦,等不同巧澄品种果实有机酸代谢相关酶的研究[J]四川农-业大学学报;:.2011294499501.,()[6]吴嘉玲,潘东明.袖果实生长过程中汁胞粒化研究进展[J].福建林业科技,2014,41(4):247-248.7金微微,部爱玲,陈功楷.贬藏巧枯水病对邸拍果实品质和外观的影响….浙江农业学[]20-报15272:2巧2巧.,,()J巧.黃果巧果实粒化与细胞壁物质及多腹的关系[.华北农学]熊博巧志辉]20-149报:2:2巧242.,,(增刊)9罗安才.J.[],杨晓红巧枯果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化[]中国2003368-农业科学:941944.,,()10李甲明,杨志军,张绍铃,等.不同梨品种果实有机酸含量变化与相关酶活性的[]20-研究机谓北植物学报133310:20242030.,,()[川文涛,熊庆娥,曾伟化集巧澄果实有机酸代谢调控措施的初步研究化四川农林大学1-学报200192:144147.,,()12文涛.[],熊庆娥,曾伟光,等廝澄果实发育中有机酸合成代谢酶活性变化的研究[丹四川-农林大学学报200U91:14.,()13.巧橘果实有机酸代谢研究进展.[]赵森,吴延军,蒋桂华,等[J]果树学报,2008255-:22230,,口)[1WBeanR,ToddGPhotosythesisandRespirationinDevelopingFm化.I.C1402UptakebyYounOranesinLightandinDark.Planthysi1960354:425g,(g口]pgy)26 福建农巧大学硕±学位论文。巧MalhorRaop,KayastHaAMIsolation抑dcharacterizationofhoshoe打olnivatepppyphosphatasefromgerminatingmungbeans(Vignaradiata)J.PlantPhysio,1990[],93-l:194200.().黄冠梨果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化MD巧郭润姿.,郭文赫等[]257-江苏农业学报.2013,%1):1161.--17nX-YPYPZhou--L--Wag,Wan,巧,CP,YanLT,iaoXY,WangL,ZhuDH,[]ggQ*-rmeChenLS.Effectsofg班mlationonorganicacidtabolismanditsielation化mineral■f/rw佩2uceFor20145-e:98lementsinC流si汾cs?odChemist144990.巧阴y,,j。別AwasthiR,NauriyalJ.StudiesonNutritionalStatusofTreesandCarbohydratesMetabolisminRelationTbGranulationinSweetOrange(OTras汉rtmsw化*Irn-ndianJoualofHorticulture1972293and4252257.,,():1M-9朱圣庚徐长法:11王镜岩.生物化学.高20020308.[],等教育出版社,,[]20J.2000庞杰.红抬江西农业学报123[],冯形,段芳浮皮枯水果生理生化指标的测定[],,():50-53.口]]OrE,BaybikJ,SadkaA,SaksY.IsolationofmitochondrialmalatedehydrogenaseandphoshoenolpyruvatecarboxlasecDNAclonesfromraeberriesandalifheipygpnayssotrexpressionpaternthroughoutberrydevelopmentJ.Journaloflantphysiology,2000,!;]p-1575):527534.(22张秀梅,杜丽清,孙光明等.薇萝果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化[]2007-J?果树学报243:381384.[],,()[23陈发兴,刘星辉,陈立松,等.离子交换色谱法测定批把果实和叶片中的有机酸J.福建][]-农林大学学报2004332:195199.,自然科学版,,()24张金秋.HPLC测定鲜人参、生晒参、红参中6种低分子置有机酸J.吉林农业大学学报,[][]巧4447-4502015(458.,):,5YamakiY.OrganicacidsintheuiceofcitrusfruitsJ.JournaloftheJaaneseocie口]j[]pStyforHr-orticultualScience1989584:1520.,()B-26CanelCaileySerresJN民ooseML.Molecularcharacterizationofthemhochondril[],,acitratesynthasegeneofanacidkssummelo(Cz甘wsmox'w口)[J].Plantmolecularbiolo,pgy191-1479631:143.,()Ku--27anXiaodonXianMinWangContianYangWenxueon也estharve巧g.Stud[]g,’,poggy27 福建农林大学巧壬学位论文hs姐dresrvchnA-pyiologypeationteiueofnnonnuclearfreeoroperties?Hunanqgp口]-AriculturalSciences2008119120.g,口):口巧JacksonRJ,HellenCU,化stovaTV.Theme油anismof州karyotictranslationinitiationandrincileofitsreulationJ.NaturereviewsMolecularcellbiolo20,1011:ppg[]gy,口)1-13127.口引Delhaize巨,HebbDM,RyanP民.ExpressionofaPseudomonasaeruginosacitratesn也aseeneintobaccoisnotassociatedwi化ei化erenhancedcitrateaccumulationorygf-2067eluxJ.Planthsiolo2001口54:20巧.[],,pygy()30张柳霞,王化,朱斌,等.苹果属山定子巧辕酸合成酶基因(MbCSl的克隆及表达分[])20-1021析[J].农学通报名0129:8034.,()[31]DaultaB,Arora民.Studiesongranulationindiferentcultivarsofsweetorange(C.HrnHrr19-s-inensisOsbeck,aryanaJoualofoticultualSciencesJ.9019121.)[],():182[3习杨朴丽.不同嚴度欧李果实有析谋巧累恃性与巧关代谢梅活性分析机中国果业信息,2013,19(2):65.[33熊晶晶,邓秀新.世橘果实采后有机酸代谢研究[J].华中农业大学学报,2007.]34罗安才,杨晓红,邓英毅等.巧橘果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变[]20的368-化町中国农业科学:944944.,,()口巧SinghR’Singh民.RelationshipbetweengranulationandnutrientstatusofKinnowr化Jrna1-mandainat出ferentlocaHtiesJ.PunHorticulturaloul98020/4:1341巧.[]j,,口)36粪荣髙..[],吕秀兰张光伦,等罗伯逊巧澄在不同生境下果实有机酸代谢相关酶的研巧,2006626805-808果树学报.,,巧):[37]呂雅楠.采后黄冠梨有机酸变化及代谢酸调控研究D.天津:天津大学化工学[]院2011.,H-TaVMMr-ad过SkoviCSukalovKVuletidakovicKVudn化么.Cellwallassociated口巧,,,rsev-)mrn114:4470malatedehydogenaactiityfixmaizeootsJ.PlantSciece2011865.,,[]()39SadkaADahanECohenLrshKBAconsevxressMa.itaactiiteiondurinthe[],,,yandpgmen-devePnarum2000155262lotoflemonfruitJ.Physioloialat083:2.p[]g,,()[40]Hulme,Rhodes,Wooltorton.Theeffectofethyleneontherespiration,ethyleneproduction,RNAandproteinsynthesisforapplesstoredinlowoxygenandinairJ.Phtochemistr[]yy,-]971106:13151323.,()28 福建农林大学硕±学位论文4-1]赵森.樹橘果实有机酸代谢及调控研究机.安徽农业大学,2008,25口):225230.[",,42DuffSMQMoorbeaGBCLefUbvreDD.Phoshatestarvationinduciblebyassesof[],ppadenylateandhoshatedeendentlcolticenzymesinBrassicanirasusensioncellspppgyygp-1:1.?PlantPhsiol989902751巧8阴y,,43KaastHaAM.IsortiMalhotRaolationandchaacerizato打ofhoshoenolmv[]p,ypppyatephosphatasefromgerminatingmungbeans(Vignaradiata)[J].PlantPhysiol,1990,93-l.;194200()44..郭振飞,徐昌杰,卢少云水稻叶片縣酸婦醇式丙爾酸磯酸黯酶活性及其部分特性饥[]-4369:703708.植物学报,巧9,()45.,卢少云等水稽叶片酸性磯酸醋酶活性及其部分特性的.热带亚热带[]郭振飞,徐昌杰,-植物学报1994,;21:5157.,()46-.2014164257259.王晓娜不同破壁方法对丙雨酸激酶活性的影响町食品与药品,,():[][47BartholomewE,SinclairWB.Unequaldistributionofsolublesolidsinthepulpofcitrus]fruitsy.PlantPhsiol1941162:巧3.]y,,()[48ChenF,Lin,Liu义SheW,ChenL,WuD.Efectsofmagneticfieldandfertilizationson]QorganicacidsinloquatfruitJ.IntemationalSsiumonLouat,2006750:[]ympoq,巧)巧-5%0.49,许文宝,黄育宗等.H种植物生长调节剂对语溪蜜抽果实粒化的影响[J.[]谢志南]12811^.999:.亚热带植物科学,()[50]余文琴掩溪蜜袖汁胞粒化过程中生理变化与基因差异表达分析网.福州:福建农林2009大学.,5涛熊庆娥曾伟光.,等肢澄果实有机酸代谢调控措施的初步研究化四川农林大学[U文,,2001214-.学报,,巧():4147DuffSMG,LefebvreDDPlaxtonWC.Purifictioncharacterizationandbllular口巧,a,sucer-slocalizationofanacidphosphatasefrom村ackmu巧adcellsuspe打ioncultures:comarisonwortea.ArBioB11ithphosphoenlpyuvaphosphtaseJchchemiophy99286p[],,-l226232:.()53Sharma民Sinh民Saxe打aS.Characteristicsofcitrusfhiitsinrelation^)ra打ulatio打?[],g,g口]r-Scientiahoticulturae200611ll:9196.,,()''54潘东明,林慧颖.植物生长调节剂对淸溪蜜抽汁胞粒化的影响[J].福建农业大学学[]29 福建农林大学硕±学位论文998272-报:155159.,1,()口5CameronJ,Soo巧民.AciditandtotalsolublesolidsinCitrushbridsandadvanced]yycrossesinvolvingaci姐essorangeandacidlessummeloJ.JournalAmericanSocietforp[]yHorrance1-ticultulScie977102:4551.,,口)w*56KaurieHGhananaYKaurS.Efectofrothul9torsonranulationdfru巧lit[],,panuagggqyVI-ofJH1sweetorangeC.MosambiJ.ndianournaloforticulture991482242巧.[],,口:)-57GRonaoLV---ongXiulanZhanGuanlunHuShixue.Studontheanic[],,,orggggyg-acidmetabolizinenzymesinRobertsonNavdOraneduringthefru化develoment口.ggp]"JAournalof巧chuanriculturalU打iversity2006244:402404.g,,()-58LrsmwaE-ShlizermanMahKBluldSadkaA.Iro打shortain过ucedincreasein[],,,gecitricacidcontentandreductionofcytosolicaco打itaseactivityinCitrusfmhvesicl巧andJm-calli.PhsjoloiaPlantaru2007131l:7279.[]yg,,()[59]BoginE,WallaceA.Organicacidsynthesisandaccumulationinsweetandsourlemon-fru-1itsJ.UCLAPlantScience19665516:12132.[],,()eA-0DBNunrKEFemABguHatewesNesiA,ShlizemanZurNatzieRlumwaldE巧],,k,,,,SadkaA.Inh化itionofaconitaseincitrusfruitcallusresultsmametaboUcshifttowards-amii1巧4:1inoacidbosnthessJ.Pknta201350513.yj,[]()61立松等J陈发兴.批把叶片有机酸纽分分析.2006[],刘星辉,陈,[]福建农林大学学报,,354-:377380.()-62.281谢志商琼溪蜜袖园有机.亚1999:[],许庄无机服不同配比试验阴热带植物通讯,,()9-13.63安华明.[],樊卫国刘庆林,等剌梨果实和叶片发育过程中抗坏血酸和抗氧化酶的协同,变化J2007345-口%.园芝学报:1293.[],()-64J.浙江巧祗2011313:1721.李学涨巧橘裂果发生的原因及对策,[][]()65?山东苹果中可溶性糖有机酸的研究阴.山东农业大学学报自然科[]赵尊行,孙衍华,,-学版1995263:355360.,,()6irardBKoT.Phsicochemicalcharacteri巧icsofselectedsweetcherr化vars.[刮G,ppyy州y]-Journalofariculturalandfoodchemistr199846271476y:4.g,,()[67]LarbiA,MoralesF,AbadiaA,AbadiaJ.Chang巧inironandorganicacidconcentrations-n-xanriylemsapandaolasticfluidofirondefici畑tBetavulgarispltsinresonse化ionppp30 福建农林大学硕±学位论文-resu.llhil14255l[J]Journaofantsoogy,201067:26ppyppy,()化611-.果实有机酸代谢研巧进展[J]冲国南方果树2015:44:2022.[巧周先艳,()1[69]杨道富,林巧华,谢鸿根,等.火龙果果实生长过程有机酸与可溶性糖变化研究口].福建2012271-农业学报,(10):0761080.0ChenLS,Lin,NoseA.Acomarativestudyondiurnalchanesinmetabolitelevelsin。]Qpg化eleavesofthreecrassulaceanacidmetaboHsmCAMsecies,A打anascomosus()p,KalgdaigremontianaandK.innata?JExBot2002巧口4-細chop机p,,67:31350?)---n1ChenFXLiuXHChe打LS.Develomentalchangesinuloricid,,acl7]pppga-CO打ce打的tio打andactivitiesofacidmetabo巧singenzymesduring化efruitdevelomentofp?twoloquat(执!巧7饼口I柄波.)cultivarsdiferinginfridtacidity[J.Food]h-Cemistr20091142657664.y,,():72陆新华,孙德权,吴青松等.薇萝种质资源有机酸含量的比较研究m.热带作物学报,[]20B345當1-5920.,()uurX-3SchnugEHaneklasSanr:Slfudlightelementdeteminationinlantmaterialbra,pyy17]fluoresr--cencespectoscopy….In.PhytonAnnales民eiBotanicae1992n3126.,,4WNYI-。angJakazatoT,SakanishiK,amadaO,TaoH,Saito.Sinlestemicrowave],gprmiiementidigestionwithHNOalonefordetenatonoftracelesncoalbyICPT2006-ectrometr.alanta685:15841巧0?巧y阴^,()75PowersF-PNMlacketARSJemandezGarciaUrbanovaTTakebashiSeo[]^,,,ya乂,BRN-JikumaruY,enllochikson0,民山zRivero0?Analsisof也edevelotalrolesjypmen20---oftheArabidosisibberellinoxidasesdemonstratesthatGA20oxl2and3arethepg,,raT20-dominantpalogsJ.hePlantCellOnline12243:941960.,,[]()7宁?5个晚熟巧橘品种果实发育期品质变化研究J.西南农业学报2014,唐,,[巧杨阳[]27-13267.(曲77Sharma民Saxe打aS.Rootstocksin扫uenceranulationmKinnowmandarin[],gxZmswoMb沁化zos幻;2004-C.8^知11技11〇111州1化拘6101:2./C?阴,(3)35242()532-7.园艺学报200:114014.新世界巧橘品种改良的进展[J],16[巧邓秀,[79]张上隆,陈昆松.果实品质形成与调控的分子生理[M].北京冲国农业出版社,2007.'巧0]MillerSS,DriscollBT,GregersonRQGantJS,VanceCP.Alfal位malatedehydrogenaseurcnnandveaMDH:moleclaloigcharacterizationoffivediferentforms巧lsauniue()q31 福建农林大学硕±学位论文-na-noduleenhancedMDHJ.ThePlantJourl1998152:173184.[],,()巧1]MoingA,RothanC,Svane化L,Ju巧D,Diakou巧RaymondP,Gaud"16reJP,MonetR.Roleofhoshoenolruvatecarboxlaseinoranicacidaccumulationdurineachfruitpppyyggpdevelopment^].PhysiologiaPlantaruIn,2000,108リ):M0?82Eu-A-uBWtienneAG^nardMLobitPMbei^Mbdi^DuaudC.hatcontrolsfleshy[],,,gg,gfru化acidit?Areviewofma!ateandcitrateaccumulationinfruit说口则JournalofyExerimen14-14talBotany20364:15169.p,,巧)3窩海燕王善广等?不同品种梨汁中糖和有机酸含童测定及相关性分析J.巧],,麼小军[]北2004192-农学报:104107.,()邵冲迎春等''4.不同中间站对关军锋,徐金冠苹果果实品质及矿质营养的影响[J].巧],魏200484-河北农业科学,,:1921.()-FuMDPT巧5NaramotoS,KleineVehnJ,RobertS,imoto,ainobuT,aciorek,UedaT,]jV*NakanoMonerAanontauMCFuku(iaH.ADPMx)slationfactrmachiiaes,g,yymedte打docytosisinlantcells.Proceedinsoftheatio打alAcademofSciences2010N,,p口]gy-10750:2189021895.()MTL-6XuFeniPYuCuiWanongWanNN.Asoandualsdficity巧],g,,乂乂g乂G,gybepeQkinase,GmSARKranditsAmbidopsishomolog,AtSARK,regulateleafsenescencethroughsyne巧isticactionsofauxinandethyleney.Plantphysiology,2011,]-12131巧4:1253.()打anD-87Wadi巧CGroJE.cphoshoGoAkinaserovides泣raidand化nsitive,[]pppradiochemicalassafbrcoenzAanditsthioestersJ.Analticalbiochemistr2007yyme[]yy,,368-l1723.():Kwarerconr-88oniishiMYanaisaS.Thelatoreiontollingthentrateresonive[],gguygspexressionof泣nitratereductaseeneNlAlinArabidosisJ.Plantand说11pg,,p[]-s11525:phyiolo20824抬6.gy,,()巧9]霍月青,胡红菊,彭抒昂等?砂梨品种资源有化酸含量及发育过程中变化[化中国农业2009421-科学:216223.,,()[90]KooAJ,CookeTF,HoweGA.CytochromeP450CYP94B3mediatescatabolismandnacvaenmoneasmonoy--ucersititionofthplathorlLisoleinJ.PoceedingoftheNationalj[]Academof-Sciences201110822:92989303.y,,()32 福建农林大学硕女学位论文-<ikifrtensSACautiLMalnoM,GoreminVNorovaSMa.enomewid巧。p,yyk,e,g-phylogeneticreco打structionoffamily1UDPlcosyltransferas巧revealedthegyexpansionof化efamilydurinthead啤tationoflants化lifeonlandJ.ThePlantgp[]ouma-Jl:103042,20126910.:(巧[92]測传化,刘三军,于巧丽等.红地球葡萄单穗不同苗来量对来实品质的影响机.中外葡20-萄与葡萄酒113:2022.,()93EndlerAPerssonS.Cellulosesnthasesandsynthesisi打ArabidosisJ.Mlt[],yp[]oecularPlan201-111142:992.,()4J李春秀?檀物纤维素合成酶?巧],齐力胚,王建华等基因和纤维素的生物合成[]生物技术通报2005436-11:;39.,,()[9引ChivasaS,Tom6DF,HamiltonJM,SlabasAR.Proteomicanalysisofextracellular--ATPregulatedroteinsidentifiesATPsynthasesubunitasanovelplantcelldeathppuaorM-reglt.olecular&CellularProteomics2011103:110105.口],,()[96ReinholdH,SoykS,SimkovaK,HostettlerC,MarafmoJ,MainieroS,VauhanCK,]g--ALMonroeJD之SC.likePtiFunctiTrii,eemanpmyaseroe打so打asranscptonFactorsinArabidopsis,ControllingShootGrowthandDevelopme打t口].The巧antC如Online20H,4-23:13911403.()7、潘惠慧.髙叶中有机酸的种巧],吴膝琴,陆祐益等效液相色谱法分析和检测青梅花、枝-类和含量饥:30.?科技通报,20082435354,()王宏伟.8,王成荣于森等梨杂交后代果实主要有机酸遗传动态的研究的.青岛农业大巧,]-学学报(自然科学版)2008253:231235.,,()[9引Zhou乂TaoQ,WangZ,Fan氏U乂Sun义TangK.EngineeringascorbicacidinlbiosntheticathwaArabidosiseavesbsineanddoubleeneypypylggP1"trans^rJ.BioIoialantarum2%34514^.mation[,20,:]g()-100文涛熊庆娥.樹梧果实糖、酸代谢研究概况阴.中国南方果树20012:1316.[],,,101文涛,熊庆娥,曾伟光等.旅澄果实发育中有机酸合成代谢酶活性变化的研究[叮四川[]2001-农业大学学报191:2730.,,()[102]EirasM,NohalesMA,KitajimaEW,Flores民,Dar6sJA.RibosomalproteinL5細dnrlAfrArabiairPotrascriptionfactoIlomidopssthlianabindnvitospec巧callytatouber-svridArchvefviroo20115:533indletioRNAJ].isol163529.p[gy,,()33 福建农林大学硕±学位论文-03HoriuchM-。iQMol化oralesA,P6rezP妊ezJM,KoimaK,Robles巧PonceMR]gj^MicolJL,TsukayaH.DifferentialcontributionsofribosomalproteingenestoArabidithalianaP-ossleafdevelomentJ.ThelantJol201165524pp[]urna,():7736.-104HuanJZhaoXWen义anieW.ThericeBboxzincfinefil[]g,,gWLXreneam:ggygenomicirexidentificationdact马rizationre巧ionrofilinand化umalli.lg,^,p讲assPoSpgy口]-one2012710:4842.,,()105文涛,熊庆娥,曾伟光等.挤棱果实发育过程中有机酸合成代谢酶活粗的变化J.园艺[][]28-学报20132:161163.,,()106张赞彬,崔清.新高梨化藏期间糖、存机酸和多敌类物质的变化抓园艺学报20054:[],()683.-107秀新.巧橘果实粒化研究进展机.湖北农业科学20115018:36773680.[]了健,邓,,()108陈巍,郭秀巧,黄品湖等.頤巧果实采后的品质和氧化还原酶活性变化研究饥.福建农[]179-业学报2001.,25(4:448)T[109民en义FariasGQCanaa辄目?/良加ifacinoJS,HurkJH.Structuralbasisfor]g崎yI化cmitme打tandactivationof化AMdathrinadatorcomlexbArfl?Cell2013ppy口],,1524-:755767.()110陈俊伟..2003[],张上隆,谢鸡,等梢橘完熟采收增糖效应及其坑理果树学报,,2〇447-:225.()111GerardBlFSanAPiCandotino.uri円cationandchemicalcharacteritionfall[],,saoce-wa-cheiVwwws说ovllassociatedalactosidasefrommaturesweetrry如Lfru化?Pg()口]-PlantPhysiologyandBiochemistr201261:123130.y,,-1200211?.102:8182.[巧谢文逸酒类厳度及有机酸分析进展酿酒科技,,()113ClarisaE.AlvareZMriSiEzuielMartCl.d[]jaanaago,eari,arosSA打reoMariaRqg,Drincovich.Kineticsandfu打ctionaldiversityamong化efivemembersof化eNADP-licfilfrZrrmC4d?ho1maenzymeamomeays,aspees口]PtosynthRes203y,,55-111:680.()114P4解敏敏?[],粪达平,李凤霞,等烟草细胞色素50的基因组学分析[J].遗传研究报-2013353告:3巧387.,,()-XW--115TaooneZenUuYWeniineiuanuanen.Chanf化erel[]’gg,g’soatedenzymeQggpggeactivityin比esynth巧isoforganicacidmetabolisminnavelorangefruitdevelopment口].reca-ActaHorticultuSiniSOOl28:161163.^,口)34 福建农林大学硕±学位论文n化]刘顺拉江月玲庫小梅,等.抽类果实采后生涅及胆藏技术研究进展[J].食品科-学.2010213:381384.,()-17陈发兴刘星化陈立松.果实有机酸代谢研究进展….果树学报2005225:526531."],,()-1-sear18ZhaoMiaoWuYanunJi抑Guihua.Advancesinrech〇打化emetabolismof[],j,gorgansaruence225-icacidsincitrufruits?JournlofFitSci200825:2230.,,阴()一119.早熟优质蜜抽新品种红肉蜜抽的选育J.果树学报[]黄新忠,陆修闽,卢新坤等[],-2007,241:123124.()120刘大苗李専宏邵重晓,等.不同涂膜剂对蜜抽保鲜效果研究J.食品科.201411.[],,[]技,12.龙眼拓性愈伤组织限制生长保存过程中有机酸含量的变化J.[。林秀集赖钟雄热带[]作物学化2013,12.122余文琴泡晓玲潘东明.授粉处理对培溪蜜抽粒化过程中果皮若干生理生化指标的[]00874-J:5影响[.福建农林大学学报:自然科学版,2,335359.]()123宗汝静,邵蒲芬,胡西琴,等.枯枯枯水果实汁胞和果皮成分消长变化的初步探讨J.中[][]*国农业科学1979123:说64.,,()24201544-。]周先艳洗春华集果实有机酸代谢研究进展化中国南方果树.,(1):120132.125SadkaA,DahanECohenL,MarshKB.Aconitaseactivitandexressiondurinthe,y[]pgdeve-lomentoflemonfruit.PhysiologiaPlantaru2000,108口:255%2.p饥町)35 福建农持大学硕±学位论文致谢在本论文完成之际,谨此向我的导师王平教授致W衷也的感谢和崇髙的敬患!本论文的工作是在王平老师的悉也指导下完成的。王老师在忙碌的教学工作中挤出时间来审査、修改我的论文、渊博的知识、严谨的治学态度、精茲求精的工作作风。王老师W他敏锐的洞察力和对科学的献身精神给我留下了刻骨铭也的印象,这些使我受益匪浅,并将成为我终身献身科学和献身事业的动力。PCR植物遗传育种实验室的张芋师姐和汪显友师兄硕±,巧光定里试驗的顺利进行要特别感谢张芋师姐,他们不仅在学术上给我指引,而且在生活上予W帮助,从他们身上我学,到很多知识,还他们不厌其烦。同时要感谢植物坐化分子研究所的麼也妍师姐和郭朋师兄的指点着我,我在做试验的过程中遇到很多不懂的东西,也妍师姐事无巨细都耐也告诉我。有论文方面的问题还有配药品等去请教郭朋师兄,师兄不管在忙什么都会抽时间出来教我。真也的感谢他们!祝福他们学业有成,工作顺利,幸福开也。衷也的感谢我的父母和亲爱的家人,iU及其他亲肋好友对我的关也、支持和理解没有一他们对我的关也!、鼓励和支持,我无法完成现在的硕±学业。感谢福建农林大学感谢这切!!20巧年10月35