中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶b基因的生物学功能分析 108页

卿靡顏顏馨雞綠＾釋．．－、－誇’ｉ、戦Ｉ．乃；瞧麵議磬：满＇■＇＾‘＾分类号：Ｓ８１３．授予学位单位代海，〇４５４＇｜ｆ｜；＞；，－乂、，ｙ＾｜｜｜｜｜｜｜ｇ｜｜＾；ｊ麵瞧端ｉｆ腳麵ｃｉ東义業义等！ｉｉｌｉ‘‘＇．＇‘－＾’、‘＾：Ｖ７：／：ＶＶ、＇’＾ｙ聲二－Ａ盒古勝續ｓｓｉｓｉｆｒＩｓｉＬｉｊｋｍ‘＇．＇得子狂化’７＇乂，；馬节、难如＾＇＇＇＂－難辨带巧？０：：中华轰蜂铁代谢相关蛋白及蛋续錢甲基亚柄还原酶Ｂ巢醉：鸣因的生物学功能分析着所ｒ＇、、＊；！屯中刮ＶＳ；心‘子．＾地－Ｂ沁ｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｏｆＩｎｍｍｅｔａｂｏｌｉｓｍＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ＾二；读＇、—ｉ一若？ｌｆ；ＳｕｏｘｉｄｅＲｅｄｕｃｔａｓｅＢＧｅｎｅｓｉｎｉｓｃｅｒａｉｉ分ｃｅｎｉｒｔｉｉ作去词議．．．＇－．嫌寒￡苗歡；．＇．‘．、＇聲＇７：一，Ｖ．．＾’＇、．Ｖ．ＷＶＶ本：Ｖ，＞、＇＇心：拍故拓‘Ｖ熟缀、鶴Ｓ浴巧，解％销麟‘舞黏坤衣茲．：１、．＾巧松．＾＞．：觀纖韓篇纖巧Ａ託於：：敦Ｉ：錄＇齡躬＇．轉．＂＇－‘．．．如‘山八价斬Ｖ铺皆；占指’；＇啤＂＇《ｒＡ＾—祕轉，４＇＾．？．；１硏巧生刘锋狂，豬？ｉｉｐ，胃ｉｉ？胃胃胃Ｐ吃譯５議窮鲜作学科专化：动物遺传育种与繁法猶铅驗顏ｆｃ斑萬封‘ｆ，’－１’．Ｉ＂？；：：Ｌ；．、挺紙较驴；絲烘猜於强词雌，；－．．Ｖ＾研究义向：动斯种质资巧保和与利用‘八碱為，為舍院：动物科技学院ｌｉｉｉ議鬻心蠢１’細麵議｜｜．‘一，指导教师；胥保华教授；證單、．；呈：；＜．、ｉｉ胃＇’＇．．．‘Ｊ＇巧：．诚式输护，．、皆．雌鑛賴．游雜聲雄．ａ键ｔ讓嶺皆＞、聲識麵襄禱驛際＇：．．機巧．；２０１５：：誠ｆｖ端Ｗ喪崇缉Ｓ終巧輔；诗龄麟續敏ｉ攀藏’谱’事’＂＾‘＂山’？ｉｆ‘：７ｉｌｔｆ襲變’诚击ｉ喔議議护，ＳｉｓＰｆｌＳｓ；？＾＾＇一’＇＊、’－、，、Ｖ＼、：；．九、，．＼．．Ｖ，，，、．攻Ｖ．１，：：！ 关于学位论文原创性巧使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在哥师指导下，独左进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重耍贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责巧由本人承扭。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩巧或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。￣论文作者签名：＾冰导师签名：如、日期Ｗｊｒ＊Ｍ。： 论文提交日期：2015年4月13日论文答辩日期：2015年6月10日学位授予日期：2015年6月学科门类：农学答辩委员会主席：李奎 ShandongAgriculturalUniversityPh.D.DISSERTATIONBiologicalAnalysisofIron-metabolismProteinandMethionineSulfoxideReductaseBGenesinApisceranaceranaDepartment:CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicineMajor:AnimalgermplasmresourcesprotectionandutilizationPh.D.Candidate:FengLiuSupervisor:Prof.BaohuaXUJune10,2015 符号说明Amp:Ampicillin,氨苄青霉素Acr:Acrylamide,丙烯酰胺ANS:8-Anilino-1-naphthalene-sulfonicacid,8-苯胺基-1-萘磺酸A1、A10、A15、A20:1、10、15和20日龄成蜂BAD:Basicdailydiet,基础日粮Bis:N,N"-Methylenebisacrylamide,亚甲基丙烯酰胺BSA:Bovineserumalbumin,牛血清白蛋白CAT:Catalase,过氧化氢酶CCD:Colonycollapsedisorder,蜂群衰竭失调综合征CDNB:1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,1-氯-2,4-二硝基苯DEPC:Diethylpyrocarbonate,焦碳酸二乙酯dNTP:Deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核糖核苷三磷酸E.coli:Escherichiacoli,大肠杆菌EB:Ethidiumbromide,溴化乙锭EDTA:Ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸ELISA:Enzymelinkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附试验FTH:FerritinHeavyChian,铁蛋白重链FTL:FerritinLightChian,铁蛋白轻链g:Gravity,重力加速度Gpx:Glutathionperoxidase,谷胱甘肽过氧化物酶Grx:Glutaredoxin,谷氧还蛋白I-PCR:Inversepolymerasechainreaction,反向PCRIPTG:Isopropyl-β-D-thiogalactoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IRE:Ironresponseelement,铁反应元件IRPs:Ironregulatoryprotein,铁调节蛋白Kan:Kanamycin,卡那霉素kDa:kilodalton,千道尔顿Km:Michaelisconstant,米氏常数 LB:Luria-Bertanimedium,LB培养基L1:1instarlarva,1龄幼虫L4:4instarlarva,4龄幼虫ms:molecularmass,分子量MsrB:MethionineSulfoxideReductaseB,蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因ORF:Openreadingframe,开放阅读框PBS:Phosphatebuffer,磷酸盐缓冲液Pb:Brown-eyedpupae，褐眼蛹期Pbd:Brown-eyedpupae,dark-pigmentedcuticle，褐眼、角质层黑色蛹期pI:isoelectricpoint,等电点PP:Prepupa,预蛹期Pp:Pink-eyedpupae，红眼蛹期Pw:White-eyedpupae，白眼蛹期PVDF:Polyvinylidenefluoride,聚偏二氟乙烯qRT-PCR:Quantitativereal-timePCR,定量实时PCRRACE:RapidamplificationofcDNAends,cDNA末端快速克隆ROS:Reactiveoxygenspecies,活性氧SDS:Sodiumdodecylsulfate,十二烷基硫酸钠SDS-PAGE:SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SOD:Superoxidedismutase,超氧化物歧化酶TE:Tris-EDTAbuffer,Tris-EDTA缓冲液Tf:Transferrin,转铁蛋白Tpx:Thioredoxinperoxidase,硫氧还蛋白过氧化物酶Tris:Trishydroxymethylaminomethane,三羟甲基氨基甲烷Trx:Thioredoxin,硫氧还蛋白UTR:Untranslatedregion,非翻译区UV:Ultraviolet,紫外线 目录中文摘要...............................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................................IV1前言...................................................................................................................................11.1动物氧化还原体系..........................................................................................................11.2蜜蜂体内的主要抗氧化体系...........................................................................................21.3蛋氨酸亚砜还原酶（Msrs）的研究进展.......................................................................31.3.1蛋氨酸亚砜还原酶（Msrs）家族分类........................................................................31.3.1.1蛋氨酸亚砜还原酶A（MsrA）..............................................................................41.3.1.2蛋氨酸亚砜还原酶B（MsrB）..............................................................................41.3.2蛋氨酸亚砜还原酶B（MsrB）的催化还原机制........................................................41.3.3蛋氨酸亚砜还原酶B（MsrB）的功能研究................................................................51.4转铁蛋白研究进展.........................................................................................................51.4.1铁元素对蜜蜂的重要性..............................................................................................51.4.2转铁蛋白的分类与进化...............................................................................................61.4.3转铁蛋白的结构特征...................................................................................................71.4.4转铁蛋白的生物学功能..............................................................................................91.4.4.1转铁蛋白的功能概述................................................................................................91.4.4.2转铁蛋白的功能.......................................................................................................91.4.4.3转铁蛋白抗菌特性.................................................................................................101.4.4.4昆虫转铁蛋白概述.................................................................................................101.5铁蛋白研究进展............................................................................................................111.5.1铁蛋白的结构特征.....................................................................................................111.5.2铁蛋白的生物学功能.................................................................................................121.5.2.1铁蛋白的储铁功能..................................................................................................121.5.2.2铁蛋白的抗氧化作用..............................................................................................131.5.2.3铁蛋白的调控..........................................................................................................141.5.2.4铁蛋白的免疫作用..................................................................................................15 1.6本研究的目的及意义....................................................................................................152材料与方法.....................................................................................................................162.1实验材料.......................................................................................................................162.1.1供试蜂种.....................................................................................................................162.1.2菌株、质粒.................................................................................................................162.1.3酶与各种生化试剂.....................................................................................................162.1.4PCR引物....................................................................................................................162.2实验方法.......................................................................................................................192.2.1中华蜜蜂的饲养及处理.............................................................................................192.2.2中华蜜蜂总RNA的提取、纯化及鉴定....................................................................192.2.2.1利用TRIZOLKit提取总RNA...............................................................................192.2.2.2总RNA的纯化........................................................................................................202.2.2.3总RNA的琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳鉴定............................................................202.2.3cDNA第一链合成......................................................................................................212.2.4cDNA的纯化.............................................................................................................212.2.5cDNA5"末端的加尾反应............................................................................................222.2.6中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因cDNA全长序列的获取....................................222.2.6.1AccFTH及AccFTL基因中间片段的获取..............................................................222.2.6.2RACE法获得AccFTH及AccFTL基因5"端序列..................................................242.2.6.3RACE法AccFTH及AccFTL基因3"端序列..........................................................252.2.6.4AccFTH及AccFTL基因全长cDNA序列的获得..................................................262.2.7目的DNA片段回收、连接及转化...........................................................................262.2.7.1目的DNA片段回收................................................................................................262.2.7.2目的DNA片段连接克隆载体................................................................................272.2.7.3大肠杆菌E.coli感受态细胞的制备........................................................................272.2.7.4大肠杆菌感受态细胞的转化...................................................................................272.2.8大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定....................................................................282.2.8.1质粒DNA的提取（试剂盒微量法）.....................................................................282.2.8.2重组质粒DNA酶切鉴定........................................................................................28 2.2.9DNA测序...................................................................................................................292.2.10中华蜜蜂基因组DNA的提取.................................................................................292.2.11中华蜜蜂AccMsrB全长序列扩增...........................................................................292.2.12中华蜜蜂AccMsrB启动子序列扩增.......................................................................302.2.13RT-PCR分析基因的表达.........................................................................................312.2.13.1引物、反应体系及条件.........................................................................................312.2.13.2RT-PCR分析.........................................................................................................322.2.13.3数据处理................................................................................................................322.2.14目的基因的原核表达及纯化....................................................................................332.2.14.1构建原核表达载体................................................................................................332.2.14.2诱导重组基因原核表达.........................................................................................332.2.14.3纯化重组蛋白........................................................................................................332.2.14.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）..........................................................342.2.15抗体的制备及检测...................................................................................................352.2.15.1抗体的制备............................................................................................................352.2.15.2ELISA检测抗体效价............................................................................................352.2.15.3Westernblot分析...................................................................................................352.2.16免疫组化分析...........................................................................................................362.2.16.1样本处理................................................................................................................362.2.16.2石蜡切片制备........................................................................................................362.2.16.3免疫组织酶化学分析............................................................................................372.2.17生物信息学分析工具...............................................................................................383结果与分析......................................................................................................................393.1中华蜜蜂AccMsrB基因的分子特性和在氧化应激中的反应......................................393.1.1中华蜜蜂AccMsrB基因cDNA序列分析.................................................................393.1.2中华蜜蜂AccMsrB蛋白一级结构分析.....................................................................403.1.3AccMsrB基因组结构分析.........................................................................................413.1.4AccMsrB的表达特性分析..........................................................................................423.1.4.1AccMsrB基因表达的时间和空间特异性................................................................433.1.4.2AccMsrB在各非生物应激中的表达特性...............................................................44 3.1.4.3中华蜜蜂在非生物因素应激中体内的氧化状态....................................................453.1.5AccMsrB重组蛋白诱导表达及抗体检测..................................................................463.1.5.1AccMsrB重组蛋白诱导表达..................................................................................463.1.5.2AccMsrB多克隆抗体的检测...................................................................................473.1.6AccMsrB蛋白在蜜蜂组织内的定位..........................................................................483.2中华蜜蜂AccTf基因的分子特性及功能分析..............................................................483.2.1中华蜜蜂AccTf基因cDNA全长的获得及序列分析................................................483.2.2中华蜜蜂AccTf蛋白一级结构分析..........................................................................493.2.3AccTf基因组结构分析..............................................................................................523.2.4AccTf启动子序列的分离及顺式作用元件的预测.....................................................523.2.5AccTf的表达特性分析..............................................................................................533.2.5.1AccTf基因表达的时间和空间特异性....................................................................533.2.5.2AccTf在不同非生物应激下的表达特性................................................................543.2.6AccTf重组蛋白诱导表达及抗体检测.......................................................................573.3中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因的分子特性和在氧化应激中的保护效应............583.3.1中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因cDNA全长的获取及分析................................583.3.2中华蜜蜂AccFTH及AccFTL蛋白一级结构分析....................................................613.3.3AccFTH及AccFTL基因组结构分析........................................................................633.3.4AccFTH及AccFTL基因启动子序列的分离及顺式作用元件的预测......................643.3.5AccFTH及AccFTL的表达特性分析........................................................................673.3.5.1AccFTH及AccFTL基因表达的时间和空间特异性..............................................673.3.5.2AccFTH及AccFTL在不同非生物应激中的表达特性..........................................684讨论..................................................................................................................................714.1AccMsrB基因在抗逆抗氧化中的重要作用..................................................................714.1.1AccMsrB基因的序列分析..........................................................................................714.1.2AccMsrB基因的时空表达特性分析..........................................................................724.1.3AccMsrB基因的生物学功能分析..............................................................................724.2铁代谢相关蛋白基因在氧化应激和铁代谢中发挥重要作用......................................744.2.1铁代谢相关蛋白基因的序列分析.............................................................................74 4.2.2铁代谢相关蛋白基因的时空表达特性分析..............................................................754.2.3铁代谢相关蛋白基因的生物学功能分析..................................................................755结论..................................................................................................................................776参考文献..........................................................................................................................787致谢..................................................................................................................................898攻读学位期间发表论文情况...........................................................................................90 山东农业大学博士学位论文中文摘要近年来，自然环境破坏严重，蜜蜂的饲养环境持续恶化，蜂群崩溃失调现象（Colonycollapsedisorder,CCD）频发。美国、欧洲部分地区的西方蜜蜂（ApismelliferaLinnaeus）损失量超过30%，因此造成的直接蜂群损失和继发的作物损失不可估量。CCD的原因尚未明确，各种疾病的肆虐和农药的大量使用均成为了学者们的猜测对象。西方蜜蜂和东方蜜蜂（ApisceranaFabricius）均属于蜜蜂属，亲缘关系较近，意大利蜜蜂（A.m.ligustica，简称意蜂）和中华蜜蜂（Apisceranacerana，简称中蜂）分别是其中的代表。意蜂在我国的饲养量远超中蜂，在部分地区甚至出现混养现象，可是意蜂出现的CCD现象并未在中蜂群中出现，其中缘由尚未可知，因此探究中蜂自身的免疫机理势在必行。蛋氨酸甲基亚砜还原酶B具有清除机体自由基、保护机体免受氧化损伤、抵御外源毒物的作用；铁代谢相关蛋白则通过调节体内游离铁水平避免产生自由基，清除体内已有活性氧、防止病原微生物侵染作用。本研究以中华蜜蜂（A.c.cerana）为实验材料，开展了蛋氨酸甲基亚砜还原酶B（methioninesulfoxidereductaseB,MsrB）和铁代谢相关蛋白（转铁蛋白（Transferrin）、铁蛋白（Ferritin））基因的功能研究，从分子水平上探讨中蜂自身免疫力与中华蜜蜂蛋氨酸甲基亚砜还原酶B及铁代谢相关蛋白基因的联系。具体研究结果与主要结论如下：（1）中蜂AccMsrB基因的分子特性和功能分析根据意蜂（A.melliferaligustica）的同源序列，利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，首次克隆了中蜂MsrB基因，命名为AccMsrB（GenBank注册号：KP317814）。序列分析表明，其cDNA全长为757bp，包括138bp的5′非翻译区（UTR）、205bp的3′非翻译区（UTR）和414bp的开放阅读框（ORF），编码一段137个氨基酸的多肽，分子量和等电点分别为15.5kDa和7.77。氨基酸序列比对分析发现AccMsrB的氨基酸序列与其他昆虫，特别是蜜蜂科昆虫MsrBs有较高的同源性，并具有MsrBs中保守的功能区域。用TFSEARCH软件分析AccMsrB启动子，预测到两个与调节环境应激有关的转录因子（HSF和Dfd）。表明，AccMsrB基因可能参与发育和环境应激响应。采用qRT-PCR和免疫组织化学的方法研究了AccMsrB在不同发育时期和组织中的时空表达特性，结果表明，AccMsrB在整个变态发育过程中均表达，其中在变态发育节点：1龄幼虫（L1）、预蛹期（prepupa，PP）及15日龄成蜂（A15）时期表达量最高；在各组织中表达量呈现差异，其中表皮中表达量最高，肌肉中次之；免疫组织化学结果I 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析也显示AccMsrB在体壁和眼部组织存在。表明AccMsrB可能与幼虫发育阶段转换、抵御外界氧化损伤及清除体内自由基等功能相关。应用qRT-PCR方法探究了AccMsrB在成蜂中不同应激处理下的表达特性。结果表明，AccMsrB基因受非适宜温度、UV、H2O2、农药、重金属等因素应激的诱导表达。各因素处理后蜜蜂体内H2O2浓度保持在高浓度，验证了这种诱导是氧化应激的结果，表明AccMsrB可能在氧化应激中发挥重要作用。（2）中华蜜蜂铁代谢相关蛋白基因的分子特性和功能分析利用上述方法，首次克隆了中华蜜蜂铁代谢相关基因，分别命名为：AccTf（GenBank注册号：JF330111.1）、AccFTH及AccFTL（GenBank注册号：JF330112.1和JF340051.1）。该组基因cDNA全长分别2346、1028及1018bp，其中5′非翻译区分别为74bp、219bp和274bp，3′UTR分别为133bp、134bp和90bp，ORF分别为：2139bp、675bp和654bp，分别编码包含712、219和218个氨基酸残基的多肽，分子量分别为78.6、25.5及25.2kDa，等电点分别为7.07、6.25及6.52。氨基酸序列比对分析发现AccTf、AccFTH及AccFTL的氨基酸序列与其他昆虫相关序列同源性较高。对铁代谢相关基因进行基因序列分析，发现在AccFTH的5′UTR存在该基因家族的保守序列——铁反应元件（IRE），该元件可以形成茎环结构，是铁调节蛋白的结合位点，在调控铁吸收与释放代谢过程起重要作用；通过分析启动子区域发现，该区域含有部分与免疫相关的转录因子（HSF、AP-1、Nrf2、NFκB等）；分析氨基酸序列发现，在转铁蛋白N-端含有该基因家族的保守氨基酸构成的铁结合位点；铁蛋白重链中含有构成铁氧化中心的保守氨基酸及保守的半胱氨酸；轻链序列中存在保守的糖基化位点（N-E-F）及保守的半胱氨酸。表明AccTf、AccFTH及AccFTL是典型的转铁蛋白及铁蛋白，可能参与蜜蜂的铁代谢和应激保护机制。利用qRT-PCR方法研究了AccTf、AccFTH基因在不同发育时期和组织中的时空表达特性。结果表明，该基因分别在L4及PP高水平表达，表明转铁蛋白及铁蛋白可能参与蜜蜂发育时期的转换。在不同组织间，AccTf主要在蜜蜂脂肪体内生成，铁蛋白则在各个组织中均有表达，其中中肠组织为主，均与其他物种中该组基因的表达模式相近。应用qRT-PCR的方法研究了AccTf和AccFTH基因在不同条件下的表达特性。表明，AccTf在受到非适宜温度、各种氧化应激和农药处理后均出现诱导上调，AccFTH基因则只是在部分条件下出现表达上调，在4℃、42℃及农药处理时出现了抑制现象。表明，中华蜜蜂转铁蛋白和铁蛋白可能在中华蜜蜂应对大多数不利因素的应激保护中发挥重II 山东农业大学博士学位论文要作用。用FeCl3处理后，随着蜜蜂体内铁离子浓度上升，转铁蛋白AccTf和AccFTH基因都出现了表达上调，说明它们受到体内游离铁的诱导，能够起到储存和转运铁离子的作用，以此抑制体内氧自由基的形成，起到保护机体免受氧化损伤的作用。以上结果说明，AccMsrB、AccTf、AccFTH及AccFTL基因分别具备各自基因家族的典型特征，均具有清除体内活性氧、抵御外源性氧化应激的作用，转铁蛋白和铁蛋白共同完成蜜蜂体内铁转运和储存，调节体内铁离子浓度，进而提高蜜蜂抗氧化能力。关键词：中华蜜蜂；蛋氨酸甲基亚砜还原酶B；转铁蛋白，铁蛋白；基因表达；功能分析III 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析BiologicalAnalysisofIron-metabolismProteinandMethionineSulfoxideReductaseBGenesinApisceranaceranaAbstractInrecentyears,thewideuseofpesticidesandspreadofhoneybeediseasescausesseriousdamagetotheecosystemandbeebreedinghabitat,whichiscloselyrelatedtohoneybeeColonyCollapseDisorder(CCD).InAmericaandpartsofEurope,thelossofhoneybees(ApismelliferaLinnaeus)ismorethan30%,inducingincalculabledirectcolonyandsubsequentcroplosses.ThecauseofCCDisnotclearandtypesofdiseasesandusageofpesticidesbecomethespeculatedfactorsofCCDbythescholars.ApismelliferaLinnaeusandApisceranaFabricius,bothbelongingtothesamegenus,haveclosegeneticrelationship,withA.melliferaLigusticaandA.c.ceranainChinaastherepresentativespecies.ThecoloniesofA.melliferaLigusticakeptinourcountryoutnumberA.c.ceranaFabriciusandtheyareevenbreedinthesameregioninsomepartsofthenation,buttheCCDdonotoccurinA.c.cerana.Theunderlyingmechanismsareunclear,thusmorestudyofautoimmunitysystemshouldbeenhancedinA.c.cerana.MsrBsareinvolvedinremovingfreeradicals,avoidingantioxidanttraumainorganismanddefendingexogenoustoxicsubstance.Throughregulatingfreeironions,iron-metabolismproteinsplayakeyroleininhibitingfreeradicalproduction,eliminatingexistentreactiveoxygenspeciesandpreventingtheinfectionofthepathogenicmicroorganism.Inourstudy,weselectedA.c.ceranaastheexperimentmaterialtoexplorethebiologicalfunctionsofMsrBandiron-metabolismproteinsgenesandtheirrelationshipswithimmunityofA.c.cerana.Themajorresultsandconclusionsinthisthesisarepresentedasfollows:MolecularpropertyandfunctionalanalysisofMsrBgeneinA.c.ceranaAnovelMsrBgeneinA.c.ceranawasclonedbasedontheconservedregionsofMsrBsfromA.melliferaFabriciusbyRT-PCRandRACE-PCR,andwenamedtheputativegeneasAccMsrB.Thesequenceanalysisindicatedthatthefull-lengthcDNAofAccMsrBwas757basepair(bp),includinga138bp5′untranslatedregion(UTR),a2054bp3′UTRanda414bpcompleteopenreadingframe(ORF).TheORFencodedapolypeptideof137aminoacidsIV 山东农业大学博士学位论文withapredictedmolecularmass(Ms)of15.5kDaandatheoreticalisoelectricpoint(pI)of7.77.AccMsrBshareshighersequencewithotherinsectspecies,especiallyfromApidaefamily,andcontainstheconservedfeaturesofthecytosolicMsrBsuperfamily.UsingtheTFSEARCHdatabase,severalimportanttranscriptionfactorsrequiredforregulatingvariousenvironmentalstresses(HSFandDfd)wereidentifiedinthe5"-flankingregionofAccMsrB.TheseresultssuggestedthatAccMsrBmightbeinvolvedindevelopmentandenvironmentalstressresponses.TheqRT-PCRandimmunohistochemicalstainingwereperformedtoexaminethedevelopmentalregulationandtissuedistributionofAccMsrB.TheresultsindicatedthatAccMsrBwasexpressedinthewholeperiodofmetamorphosisandthehighestexpressionlevelwasdetectedinthetransitionstageofdevelopmentsuchasfirstinstarslarvae,pre-pupaeand15-dayoldadult.AccMsrBhadasignificantlydifferentexpressionlevelsinvaryingtypesoftissue,withhighestintheepidermisandsecondhighestinmuscle.ImmunohistochemicalstainingrevealedthatAccMsrBexitinginbodywallandthesurroundingtissueoftheeye.AlloftheseresultsimplyedthatAccMsrBmayplayaprotectiveroleinthetransitionsofmetamorphosisdevelopment,defendingenvironmentaloxidativedamageandcleaningfreeradicals.TherelativeexpressionsofAccMsrBundervariousbioticandabioticstimulisweredetectedbyqRT-PCR.TheresultsshowedthatthetranscriptlevelsofAccMsrBcanbemarkedlyaccumulatedbytreatmentofvariousabioticstimulissuchasun-fittedtemperature,UV,H2O2,pesticidesandCdCl2.Whereasthetranscriptionofthisgenewasgraduallyinhibitedbyphoximtreatment.Andtheassayofoxidationstatuses(H2O2concentration)indicatedthatthisinducedexpressionofAccMsrBmightbedirectlyrelatedtotheaccumulationsofH2O2.Takingintoaccounttheseresults,wespeculatethatAccMsrBmaybeessentialinprotectionagainstoxidativedamageandmetamorphosisdevelopment.(2)MolecularcharacterizationandfunctionalanalysisofironmetabolismproteingenesinA.c.ceranaBytheabovementionedmethods，agroupofironmetabolismproteingenesinA.c.ceranawereisolatedandnamedasAccsTf,AccFTHandAccFTL(GenBankID:JF330111.1,JF330112.1,andJF340051.1,respectively).Thefull-length2346bp,1028bpand1018bpV 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析cDNAsequenceofAccsTf,AccsFTHandAccsFTLincludeda74bp,219bpand274bp5′UTR,anda133bp,134bpand90bp3′UTR,anda2139bp,675bpand654bpcompleteORFthatencodedpeptideswith712,219and218aminoacids,respectively,withcomputedtheoreticalpIof7.07,6.25and6.52andMrof78.6kDa、25.5kDaand25.2kDa.MultiplesequencealignmentsrevealedhighersequenceidentityofAccsTf,AccFTH,AccFTLwithotherinsects.Byanalyzingthegenesequencerelatedtoironmetabolism,inthe5"-flankingregionofAccFTH,anironresponseelement(IRE)whichcanformastem-loopstructure,involvinginironregulatoryproteins(IRPs),couldregulatetheuptakeandreleaseofiron.Andthepromotersequencesofironmetabolismproteingenescontainedseveralimportanttranscriptionfactorsassociatedwithimmuneresponse,includingHSF、AP-1、Nrf2andNFκB.WealsofoundthattherewasironbindingsitecomposedbysomeconservedaminoacidsinNterminalofprotein;ironoxidecentercomposedbyconservedaminoacidsincludingcysteineinheavychainofferritin;andconservedglycosylationsite(N-E-F)andcysteine.TheseputativetranscriptionfactorbindingsitesimplythatAccTf,AccFTH,AccFTLaretransferrinandferritinandmightinvolvedinnotonlyenvironmentalstressresponsesandironmetabolisminA.c.cerana.TheqRT-PCRwasperformedtodeterminetemporalandspatialexpressionprofilesofAccTfandAccFTH.WenoticedthatasignificantincreaseofAccTfandAccFTHexpressioninL4andPP,whichalwayscorrelatedwiththetransitionofdietanddevelopmentstages.Thehighestexpressionlevelwasdetectedinthefatbodycomparedtoothertissue;whileferrintinwasexpressedinvarioustypesoftissue,buthighestinmidgut,indicatingthesimilarexpressionpatternforthisgenomerelativetootherorganisms.TheexpressionsprofilesofAccTfandAccFTHundervariousexperimentconditionsweredetectedbyqRT-PCR.WefoundthatthetranscriptlevelsofAccTfcouldbemarkedlyup-regulatedwhentreatedbyunbeneficialtemprature,differentoxidativestress,andpesticides.However,thetranscriptionofAccFTHshowedup-regulationjustinsometreatedooconditionsandsuppressionduring4Cand42Candpesticidetreatment.Theseresultsdemonstratedthattransferrinandferritinwerefunctionallyimportantindefendingmostdisadvantagefactorsthatcausedstresses.AftertreatedwithFeCl3,theironconcentrationinVI 山东农业大学博士学位论文beesincreasedandthetranscriptlevelsofAccTfandAccFTHweremarkedlyup-regulated,suggestingthatthesetwogeneswasinducedbyfreeironicionsandfunctionedinironstorageandtransportationastopreventthegenerationofoxygenfreeradicalandprotectthebodyfromoxidativedamage.Inconclusion,ourresultsshowedthatAccMsrB,AccTf,AccFTHandAccFTLgeneshadcommonfeaturesfromtheirowngenefamiliesconferringthemwithabilityofremovingendogenousfreeoxidativeradicalsanddefendingexogenousoxidativestress.Transferrinandferritinco-workedtofulfillirontransportationandstoragetasksandregulateironconcentrationinbody,thustoenhanceantioxidantcapabilityofbees.Keywords:Apisceranacerana;MethionineSulfoxideReductaseB；Transferrin；Ferritin；Geneexpression;functionanalysisVII 山东农业大学博士学位论文1前言中华蜜蜂（A.c.cerana）是东方蜜蜂（Apiscerana）的一个亚种，简称中蜂，在生物分类学中属于节肢动物门（Arthropoda）、昆虫纲（Insecta）、膜翅目（Hymenoptera）、细腰亚目（Apocrita）、蜜蜂总科（Apoidea）、蜜蜂科（Apidae）、蜜蜂属（Apis）。中蜂与印度蜜蜂、日本蜜蜂等均属于东方蜜蜂亚种，其中，中蜂是指分布在我国境内的亚种。根据所处地理环境中蜂在国内，分为华中、华南、华北、东北等地理亚型，均具有悠久的饲养历史，它在维护自然生态体系平衡方面起着极为重要的作用。与意蜂（A.m.ligustica）相比，中蜂在维持群势、生产性能方面处于劣势，但其嗅觉敏锐，更善于利用零星蜜粉源，能够适应山林地区复杂地形，低温耐受及抗螨能力强，能够适应气候异常、低温潮湿等恶劣环境，蜂群采集时间长，采集力强，一般无需饲喂（Yang,2005）。因此，中蜂一直是我国的重要蜂种，也是我们进行蜂种改良的优良素材。蜜蜂是重要的授粉昆虫，在生产活动中不可避免的受到复杂环境因素的影响，在长期的进化过程中，中蜂形成了自身的抵抗应激的能力，使其在复杂的生态环境下保持物种的繁衍，表现出良好的抗逆特性，然而，目前对中蜂功能基因组，特别是抗逆生物学领域的研究较少。蜜蜂作为继果蝇（Drosophilamelanogaster）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）之后的又一种模式生物，已被广泛应用于生态学、社会行为学和发育生物学以及人类疾病等问题的研究（Dyeretal.,2003,Wojciechowskietal.,2009）。本研究以蛋氨酸甲基亚砜还原酶B（MethionineSulfoxideReductaseB,MsrBs）、转铁蛋白（Transferrin）和铁蛋白（Ferritin）为研究对象，运用分子生物学技术，对其基因的结构、时空表达模式及功能分析进行研究，以期阐明其在蜜蜂抗逆生物学中的分子机制。1.1动物氧化还原体系生物细胞内有氧代谢过程中会伴随活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的不断产生，研究表明，ROS的主要产生场所是细胞内的线粒体（Perez-Campoetal.,1998）。作为需氧代谢中产生的正常产物，活性氧族对于生物体具有两面性（Valkoetal.,2007）。机体产生退化性疾病和老化的主要原因是由ROS引起的细胞正常结构的氧化。耗氧生物在进化过程中形成复杂的抗氧化系统，以避免氧化带来的损伤。虽然抗氧化系统相对保守，但是物种间也具有各自的特性。胞内低浓度ROS，可以作为细胞信号转导途径的第二信使，调控组织细胞的生长；但高浓度的ROS，又会引起氧化应激，导致蛋白质氧化变性、生物膜脂质过氧化、DNA链断裂等一系列氧化损伤，最终导致细胞死亡1 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析或凋亡加速、组织损伤甚至引发疾病（Polietal.,2004）。正常条件下，生物体内产生的ROS会及时被清除，使内环境处于动态平衡，从而维持胞内ROS在较低的水平。蜂群中食物变化及外界不良环境因素会影响蜜蜂的生长、发育、繁殖及抗病力，影响抗氧化能力，从而缩短蜜蜂的寿命。不良的外源性或内源性环境因子如促氧化剂、杀虫剂、重金属、线粒体内的呼吸系统可以产生ROS（Imlay,2003,Lushchak,2011），当机体活性氧平衡被破坏后，机体DNA、脂肪膜和蛋白质将发生氧化损伤（Leeetal.,2005），继而导致某些疾病和衰老（Gertzetal.,2009）。研究发现，所有的生物体都具有一套精细的防御系统来抵抗外来或内源性有害物质（KohenandNyska,2005）。昆虫虽然没有完整的免疫系统，为了防御ROS产生的氧化损伤，在长期进化过程中形成了独特的自身防御机制，维持细胞正常的结构与功能。昆虫的抗氧化系统包含了某些基因家族，共同抵御病原物，并适应各种不良环境造成的氧化损伤（Christophidesetal.,2002）。生物体细胞内含有一系列抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）（Yaoetal.,2014）、硫氧还蛋白（Trx）（Yaoetal.,2013c）、硫氧还蛋白过氧化物酶（Tpx）（Yaoetal.,2013a）、蛋氨酸亚砜还原酶（Msrs）（Gongetal.,2011）及谷氧还蛋白（Grx）等来抵消氧化损伤的不利影响（Holmgren,1989），从而维持细胞内正常的ROS水平（Kobayashi-Miuraetal.,2007）。细胞内包含两类抗氧化酶，分别直接和间接地参与清除ROS的过程，一类是对抗ROS攻击的第一道防线，包括SODs、CATs和过氧化物酶类；另一类抗氧化酶线能间接地消除ROS，例如蛋氨酸甲基亚砜还原系统（MsrA和MsrB），可催化蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸参与蛋白修复（Kumaretal.,2002,Moskovitz,2005,Gongetal.,2011）。铁代谢相关基因包括转铁蛋白和铁蛋白等，也是昆虫免疫相关基因，能够有效抵御病原微生物的侵袭（Kosmidisetal.,2011）。1.2蜜蜂体内的主要抗氧化体系意大利蜜蜂基因组测序结果表明，蜜蜂具有38个抗氧化基因，包括所有主要的抗氧化酶系统，生物体细胞内含有一系列抗氧化酶如过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）（Yaoetal.,2014）、硫氧还蛋白过氧化物酶（Tpx）（Yaoetal.,2013a）、硫氧还蛋白（Trx）（Yaoetal.,2013c）、谷氧还蛋白（Grx）及蛋氨酸亚砜还原酶（Msrs）。除此之外，还有部分金属结合蛋白同样是蜜蜂的主要免疫相关基因，例如卵黄蛋白原，转铁蛋白，铁蛋白等（Keimetal.,2002,doNascimentoetal.,2 山东农业大学博士学位论文2004）。（1）过氧化物岐化酶：将超氧化物还原成氧和过氧化氢，是抗击ROS的第一道防线。SODs在真核细胞中的细胞定位多样，分布在线粒体和细胞质中。（2）过氧化氢酶（CAT）：通过把过氧化氢转化成水和氧来防止羟自由基的形成。蜜蜂体内过氧化氢酶同样定位在细胞质中。（3）硫氧还蛋白过氧化物酶（TPXs）：作为过氧化物还原酶，利用TRX提供的电子还原H2O2（Chaeetal.,1994），分为1-Cys和2-Cys两种（Yaoetal.,2013b,Yanetal.,2014）。（4）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）：催化还原过氧化氢和氢过氧化物。在哺乳动物中，利用GSH为电子供体GPX催化还原过氧化氢（Ursinietal.,1994）。蜜蜂基因组中存在GPX基因（Yaoetal.,2014）。（5）硫氧还蛋白还原酶（TrxR）：在昆虫中TrxR是还原氧化型硫氧还蛋白和谷胱甘肽的十分重要的酶，蜜蜂同样存在TrxR基因（Yaoetal.,2013a）。（6）硫氧还蛋白（TRXs）：TRXs非常小，是高度保守的氧化还原酶类，参与维持细胞内的氧化还原平衡。蜜蜂基因组内存在3种编码硫氧还蛋白的基因（Yaoetal.,2013c）。（7）谷氧还蛋白（GRXs）：在结构与功能上都与TRXs有相似之处。昆虫基因组编码的TRXs还没有进行具体的分类，在蜜蜂中确定有两个GRX基因，命名为Grxl和Grx2，预测分析分别定位在细胞质和线粒体中。（8）谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）：是一种多功能蛋白在清除外源毒素的代谢和保护机体免受氧化损伤过程中起作用。（9）蛋氨酸亚砜还原酶（Msr）：可催化蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸，是生物体内的抗氧化及蛋白修复因子，具有间接的抗氧化作用（Gongetal.,2011）。为了更好地了解MsrB在中蜂抵抗不良环境因素过程中发挥的作用，我们分离了中蜂MsrB基因，对其在不同发育时期、组织部位及不同应激条件下的表达特性进行分析。1.3蛋氨酸亚砜还原酶（Msrs）的研究进展1.3.1蛋氨酸亚砜还原酶家族分类蛋白质中氨基酸均有被氧化的倾向，但是含硫的蛋氨酸更易氧化（Vogt,1995），在蛋白质合成中，蛋氨酸是新生肽链中的第一个被翻译的氨基酸，同时也是肽链中对活性3 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析氧最敏感的氨基酸之一（Ravaneletal.,1998,Fontecaveetal.,2004）。蛋氨酸被ROS氧化，成为蛋氨酸亚砜（MetO），改变其所在蛋白质结构，致使蛋白丧失原有功能（Zhangetal.,2010）。生物体在长期进化过程中也形成了抵御蛋白氧化损伤的机制，其中蛋氨酸甲基亚砜还原酶就是其中之一，蛋氨酸甲基亚砜还原酶基因也在多物种中发现（KimandGladyshev,2004a,b），起到还原氧化型蛋氨酸的作用，恢复蛋白活性，并间接清除活性氧（Weissbachetal.,2002）。已知的蛋氨酸亚砜还原酶有MsrA（methionine-S-sulfoxidereductase）和MsrB（methionine-R-sulfoxidereductase）两类，分别还原S-MetO和R-MetO（Weissbachetal.,2002）。1.3.1.1蛋氨酸亚砜还原酶AMsrA，于1978年在大肠杆菌中发现（Caldwelletal.,1978），特异性还原S型蛋氨酸亚砜。以分子中含有特异序列GCFWF/C为特征（Kryukovetal.,2002）。在哺乳动物中MsrA是唯一能够还原型蛋氨酸亚砜的酶（Boschi-Mulleretal.,2008），研究还发现，MsrA以含硒蛋白的形式存在于绿藻和细菌类进化低等的有机体中，其中在起催化活性部位用硒代半胱氨酸代替了半胱氨酸。蜜蜂MsrA同样具有MsrA家族的典型特征，在体内起到清除自由基的作用（Gongetal.,2011）。1.3.1.2蛋氨酸亚砜还原酶BMsrB，于1981年在大肠杆菌中首次被发现（Brotetal.,1981），存在于几乎所有生物，以分子中含有特异序列RxCxN为特征（ZhangandGladyshev,2011），特异性的还原蛋白质中的R型蛋氨酸亚砜，在所有检测生物中均存在（Kryukovetal.,2002）。但是不同物种中MsrB数量不同，有的仅含有一种MsrB（KimandGladyshev,2004b），有的则含有MsrB1，MsrB2，MsrB3（KimandGladyshev,2004a）分别定位细胞核、线粒体或者粗面内质网（KimandGladyshev,2004b）。1.3.2蛋氨酸亚砜还原酶B的催化还原机制MsrB对Met-R-O的还原需要有保守的半胱氨酸残基参与，在其催化还原反应中分别起催化和识别的作用。序列分析表明，MsrB中含有两个保守的CxxC残基，起到结合锌离子的作用。锌是蜜蜂的必需微量元素，是蛋氨酸甲基亚砜还原酶、卵黄蛋白原的配体，通过与蛋氨酸甲基亚砜还原酶结合，使其能够稳定构象，更好的发挥其还原能力，起到抗氧化和蛋白修复作用。本实验室先前的研究也证实，饲粮中添加适当的锌元素可4 山东农业大学博士学位论文提高蜜蜂的抗氧化能力，延长蜜蜂寿命（Zhang,2014）。序列中还含有GCGWP，是其催化中心，另外一个半胱氨酸处在C端的RxCxN中。当MsrB上的催化型Cys残基接触还原蛋氨酸亚砜时，会形成一个次磺酸中间产物，然后再与其余两个识别型Cys残基反应，进而脱去一个水分子，在酶的表面形成一个二硫键，最终实现还原（Lowtheretal.,2000,Boschi-Mulleretal.,2008）。1.3.3蛋氨酸亚砜还原酶B的功能研究机体内ROS往往在受到温度、重金属、农药等环境因素影响后产生过量（Lushchak,2011），MsrB在抗氧化及蛋白修复方面也屡有研究（Kumaretal.,2002,MoskovitzandStadtman,2003,Sorianietal.,2009）。MsrB基因的表达水平受到体内ROS浓度高低的影响，表明MsrB在抗氧化及对抗衰老中起到重要作用（Limetal.,2012）.，MsrB基因沉默会使得细胞对H2O2和UV更加敏感（Sorianietal.,2009,Jiaetal.,2012），而H2O2和UV则在机体内产生ROS（Lushchak,2011,Kottuparambiletal.,2012），并可能加快细胞死亡（Jiaetal.,2014）。在细菌中，MsrB基因受到H2O2或UV的影响，体内ROS浓度上升，继而造成MsrB的表达上调（Sorianietal.,2009），表现出相似的现象。粪肠球菌处于高浓度镉离子和汞离子时，体内MsrB基因表达水平上调（Laplaceetal.,2000）。在动物细胞中过表达MsrB基因能增加其对氧化刺激的抵抗力（Zhangetal.,2010）。在PC-12细胞中，牛MsrB的过表达能够保护神经细胞免受从缺氧到再充氧过程中的伤害，减少细胞内ROS的积累，还能够提高细胞对H2O2处理下的耐受性（Yermolaievaetal.,2004）。果蝇中过表达MsrB基因，使其能够具有更强的氧化耐受能力，并能显著延长果蝇的寿命（Kocetal.,2004）。1.4转铁蛋白研究进展1.4.1铁元素对蜜蜂的重要性铁元素是机体必需元素，但是在体内处于动态平衡中，使其表现出两面性。在体内能够与多种蛋白质结合，形成固有结合铁，例如铁蛋白、转铁蛋白、细胞色素酶、铁硫簇等。除结合铁外，机体内还有部分自由铁，自由铁并不稳定，可通过反应产生活性氧。当铁元素过载时，容易产生大量ROS，造成机体的氧化损伤（YouandWang,2005）。所以机体中的自由铁含量虽是动态变化的，同时也受到严格的调控。研究表明，铁对于蜜蜂的生长发育具有重要的促进作用（Kuterbachetal.,1982）。5 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析蜜蜂腹部的脂肪体细胞内富铁颗粒，其中调节铁储量的铁蛋白起着重要的作用，通过其形成和分解来调节颗粒内铁的含量。钙、磷酸盐与铁蛋白聚集形成脂肪体细胞富铁颗粒中心，在其周围存在一定量的钙离子和硫酸盐，对于维持其稳态起到重要作用（Keimetal.,2002）。在采集蜂的脑部和处女王的腹部转铁蛋白的表达量高于其它部位，用保幼激素处理会导致腹部的表达量减少（KucharskiandMaleszka,2003）。转铁蛋白减少，则会增加游离铁离子的量，增加氧化损伤（Kovacs,2003），继而损害蜜蜂的嗅觉学习和记忆功能（Farooqui,2008）。1.4.2转铁蛋白的分类与进化多物种间Tf氨基酸序列相似性较高，这也是Tf具有共同祖先的最直接证据（Hironoetal.,1995）。根据目前的研究，Tf起源于大约5亿年前的共同祖先，在长期的进化过程中，形成了若干具有相似性的Tf及其类似物，分布在不同动物的种属和动物体不同的细胞、组织中，包括血清转铁蛋白、卵（清）转铁蛋白、乳转铁蛋白、黑素转铁蛋白（图1）（Baldwin,1993,Lambertetal.,2005a）。图1-1转铁蛋白家族进化史（Lambertetal.,2005a）Fig.1-1Summaryofmajoreventsrelatingtotransferrinfmilyevolution（Lambertetal.,2005a）Tf的分子量较大，但不同种属及组织间的Tf差异也较大。但Tf氨基酸序列也有很强的保守性，其中鱼类与脊椎动物Tf有23.8～69.9%的同源性。而鱼类血清Tf本身的同源性则在60%以上，不同的只是结构域和糖基的相对位置及大小等（Leeand6 山东农业大学博士学位论文Means,1995）。在结构域的研究中，发现多物种的C-端与N-端具有40%以上的同源性，推测该基因在进化过程中发生过重复。现在的Tf结构不同于Tf的原始形式，Tf结构不具备独立起作用的功能，两端结构域互相依靠才能起到Tf的转铁功能。因此，Greene等认为：现代脊椎动物的Tf是由原始祖先基因在进化过程中重复而成，原始祖先基因所含的单个铁结合部位的分子量约为40kDa（GreeneandFeeney,1968）。而MacGillivray等则假设，现代Tf的最原始祖先基因可能仅表达铁结合能力比较弱的蛋白质，分子量为20kDa（MacGillivrayetal.,1977）。Tf的分子量、结构和结构域的研究，证明了Tf是由含单铁结合部位的原始Tf分子进化而来的假说，Tf基因结构分析为这一进化过程提供了更直接的证据（Williams,1982,Parketal.,1985）。不同来源Tf结构与功能的相似性也是基于其基因的相似性。Tf基因进化模式研究认为（Parketal.,1985），现在的Tf基因是两个原始Tf基因间交叉连结而成，在交叉和进化过程中丢失了部分外显子而成为今天的Tf基因。然后相互独立进化产生了不同内含子大小的STf、LTf、OTf和其它Tf家族成员。1.4.3转铁蛋白的结构特征Tf是一种非血红素结合铁的球蛋白，分子量在70kDa～80kDa，单一肽链，含铁3+及糖基化位点（Spiketal.,1982）。Tf包含多个种类，理化性质略有不同，但均有Fe结合位点（FletcherandHuehns,1968）。Tf因结合铁的多少，又分为铁饱和Tf、单铁Tf、脱铁Tf。在某些蛋白酶的作用下，Tf可被降解为N-端和C-端结构域，两个结构域作3+3+用不尽相同，如在哺乳动物中，每个分子含有Fe，表明Tf两端结构域均含有Fe位点（Woodworthetal.,1982），但是昆虫中的研究发现，其TfC-端结构域可能已经失去了结合铁的能力，而是增加了结合阴离子的能力，这也有助于转铁蛋白的稳定性（MacGillivrayetal.,1977,Kimetal.,2009）。7 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图1-2转铁蛋白结合铁后的完整结构（Hamburgeretal.,2005）Fig.1-2Apo-formoftranrerrinwholemolecule（Hamburgeretal.,2005）图1-3转铁蛋白N端铁结合位点（Hamburgeretal.,2005）Fig.1-3Iron-bindingsiteoftransferrinN-lobe（Hamburgeretal.,2005）8 山东农业大学博士学位论文Tf一般均含有结构相似的糖基（Spiketal.,1982），只是不同种属Tf间有不同的聚糖数目，如人的Tf有两个聚糖，而牛、猪、鸡的Tf仅有一个聚糖。Tf二硫键对其结合金属离子以及受体非常重要，二硫键利于维持蛋白质高级结构（Strauss,1984）。由于3+每个Tf分子可逆地结合Fe，二硫键对于Tf结合金属离子及其受体显得十分重要。结合了金属离子的Tf构象变得更紧密，也更加稳定（Jarritt,1976），因此，研究Tf的空间结构，是揭示Tf铁结合和铁传递功能和机理的前提（Andersonetal.,1989）。1.4.4转铁蛋白的生物学功能1.4.4.1转铁蛋白的功能概述对转铁蛋白及其类似物的研究起步较早，对于Tf理化性质、氨基酸序列、空间结构、起源与进化、Tf基因及序列、多态性、铁转运机理、Tf受体（TR）及其基因等研究重点，已获得广泛的应用研究成果，至20世纪90年代，人们更多开始关注其在体内的生理功能。由于Tf能够起到抑制细菌增值、杀灭有害细菌以防止肿瘤产生和抑制癌症等方面起到重要的作用，医学家和动物学家已越来越重视Tf的研究，但人们对Tf某些方面的研究仍不透彻，如抗病性能、机理以Tf对细胞的生理功能的调控等。因鱼类输氧和铁的功能及鱼类的抗病能力与Tf关系密切，所以水产工作者对鱼类血清Tf开始加强研究，其中重点研究了血清Tf对抗病能力的影响，以含Tf基因的鱼类特定肠道菌和基因工程菌作为饲料添加剂的对鱼类饲喂，产生有效的影响，达到生物调控，并且降低成本。Tf多样性的研究应用广泛，可以适用于遗传性疾病分析、不同物种的种群分布等，Tf可以做为评定优良品种的参考，对畜牧饲养品种选育起到指导作用，从而在基因资源评定及生物多样性保护起到重要的作用。Tf的研究会随着技术的发展进一步加深，其所起到的不同的生理功效会不断被揭示，从而促使Tf及其相关产品的生产利用和产业化发展。1.4.4.2转铁蛋白的功能铁元素在体内同样具有两面性，一方面是机体必需元素，在体内能够与多种蛋白质结合，形成结合铁，例如铁蛋白、转铁蛋白，血红素等，发挥着铁储存、运输和抗菌等3+作用。另一方面，机体内还有游离铁，游离铁并不稳定，可通过Fenton反应在Fe与2+Fe之间变换，产生ROS，当铁过载时，无法及时被结合而容易产生大量ROS，造成机9 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析体的氧化损伤，所以机体中的游离铁含量虽是动态变化的，同时也受到严格的调控。Espara等研究了牛Tf结构域片段向兔网织红细胞内转移铁的情况，发现完整Tf对细胞的转铁能力强于单独的C-端结构域，N-端结构域则基本不具转铁能力。转铁蛋白对于低温较敏感，容易丧失转铁能力，但是当受到高温影响是，蛋白并未出现变性现象，能够保持铁结合能力，猜测Tf的热稳定性与其空间结构的稳定性有关。另外，向细胞进行铁转运的过程如下：首先此过程分为两步，分别由两个结构域来负责。N-端结构域与细胞结合不受温度影响，本身不具有供给细胞铁的能力，但不抑制Tf向细胞供铁，可能是通过与细胞作用的第一步相关的结构域或其膜受体的变构作用完成的。第二步是需能释放铁的过程，因C-端结构域还保留部分对细胞转铁能力，与细胞结合受温度影响，并能抑制Tf对细胞转铁，可能是Tf与细胞作用的第二步相关的结构域（EsparzaandBrock,1980）。1.4.4.3转铁蛋白抗菌特性Tf具有抗菌、杀菌的抗病性能，是抑制细菌繁殖的重要因子。铁是许多细菌和病毒生长的重要因子，而Tf具有螯合铁的能力，而且细菌蛋白酶消化试验表明:Tf含铁与否均不被细菌的胞外蛋白酶消化，仍具有很强的铁结合能力，因此可抑制细菌的生长。近年来，发现Tf还是细胞生长和增殖所必需的生长因子，而且在肿瘤和癌细胞中3+2+Tf受体的含量显著高于其相应的正常细胞。在饱和Fe和Zn存在下，Tf可以抑制淋巴细胞的产物继而调控T细胞抗原、Ia抗原、T淋巴细胞及转铁蛋白受体，因此Tf直接参与细胞的调节（Ekblometal.,1983,Ferrara,2012）。在鼠血清Tf基因研究中，发现Tf在大脑中合成，并在中枢神经系统中表达，Tf被认为是一种生长调节因子（Blochetal.,1985）。同时，Tf也是细胞生长和分化的重要成分，而且由于RNA聚合酶的活3+3+性需要Fe的参与，故推测Tf可能通过携带Fe参与并影响RNA的合成（ShojiandOzawa,1986）。1.4.4.4昆虫转铁蛋白概述昆虫转铁蛋白同哺乳动物等Tf在结构上相似，但是又具有自身特性。昆虫Tf同样具有N端和C端两部分组成，分子量在70~80kDa（Wangetal.,2009），主要有昆虫的脂肪体组织分泌（Kimetal.,2009），在昆虫血淋巴中起到自由铁转运的作用。所不同的是，昆虫Tf与哺乳动物转铁能力不同，昆虫Tf在进化过程中，C端逐渐丧失了结合10 山东农业大学博士学位论文铁的能力，仅在N端保留了铁结合位点，能够结合一个铁离子。C端虽不能结合铁离子，但是能够起到稳定转铁蛋白构造，保证铁结合能力的作用（Gkouvatsosetal.,2012）。另外，异于哺乳动物的是，在昆虫中均未发现转铁蛋白受体的存在（Adamsetal.,2000），先前的报道同本实验室高通量测序结果一致，都未发现蜜蜂转铁蛋白受体基因，意味着转铁蛋白在昆虫中可能更重要的是起到隔绝自由铁的作用，可以有效的抑制病原微生物的生长（Yoshigaetal.,1999）。也意味着铁蛋白可能直接与转铁蛋白结合，储存自由铁（Georgievaetal.,2002）。蜜蜂腹部的脂肪体细胞内富铁颗粒，其中调节铁储量的铁蛋白起着重要的作用，通过其形成和分解来调节颗粒内铁的含量（doNascimentoetal.,2004）。铁元素在体内的转运离不开转铁蛋白，主要由脂肪体合成并分泌到血淋巴中（doNascimentoetal.,3+2004）。Tf主要作用是把Fe从吸收和储存的地方运输到成红细胞供合成血红蛋白用，或输送到机体的其它需铁部位。在采集蜂的脑部和处女王的腹部转铁蛋白的表达量高于其它部位，用保幼激素处理会导致腹部的表达量较少。转铁蛋白减少，则会增加游离铁离子的量，增加氧化损伤，损害蜜蜂的嗅觉学习和记忆功能（KoywiwattrakulandSittipraneed,2009）。1.5铁蛋白研究进展1.5.1铁蛋白的结构特征各物种中铁蛋白的一级结构不尽相同，氨基酸序列同源性较低，但是高级结构基本相同，间接说明在生物学功能相同（HarrisonandArosio,1996）。除细菌中铁蛋白由12个亚基组成外，多数由24个亚基组成，形成4:3:2比例的球形八面体结构，组成可储存4500左右铁原子的高效空间（Arosioetal.,2009），构成铁蛋白的亚基有2种，分为铁蛋白重链（ferritinheavychainFTH）和铁蛋白轻链（ferritinlightchainFLH）（HarrisonandArosio,1996），两种亚基大小相似，一级结构具有55%以上的相似性，且高级结构更加相近。两种亚基在形成铁蛋白时会因为机体部位的不同而相互间比例不同，也会因为所处的生理状态而有差异（Kohgoetal.,1980,Cairoetal.,1985）。在脊椎动物中，一般认为铁蛋白的轻重链比例不同，形成不对称的聚合体（TortiandTorti,2002），在昆虫类生物中，两种亚基则以等比例存在，形成对称的聚合体（Hamburgeretal.,2005）。一般认为重链因为能够更好的结合和释放铁离子，更多的在氧化亚铁到铁离子方面起作用，而轻链则更多的承担形成铁核，长时间储存铁的作用（HarrisonandArosio,1996,Arosioet11 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析al.,2009）。图1-4转铁蛋白H链和L链的对称结构图（Hamburgeretal.,2005）Fig.1-4StructureofT.niferritinrevealssymmetricarrangementofHandLchains.1.5.2铁蛋白的生物学功能1.5.2.1铁蛋白的储铁功能铁蛋白通过结合、储存于释放铁，在调节自由铁、维持细胞铁稳态过程中起关键作用（Carrondo,2003,Theil,2003）。铁蛋白通过铁的氧化、迁移、核化及铁核增大过程进行铁储存，重链起到亚铁离子氧化作用，其亚铁氧化中心由7个保守氨基酸构成2+（E/Y/E/E/H/E/Q），该氧化中心与可溶的Fe结合，经过与H2O2或O2作用，将其氧化3+成Fe，再经过核化、矿化聚集在铁蛋白的铁核中（Lawsonetal.,1991）。12 山东农业大学博士学位论文图1-5铁氧化酶H链闭合立体结构图（Hamburgeretal.,2005）Fig.1-5Stereoviewofacloseupofthechainferroxidasesite（Hamburgeretal.,2005）在铁储存过程中，轻链虽没有氧化活性，但是其表面存在羧基集团，提供酸性环境，利于铁核的形成，也提高了氧化活性效率，提高了结合铁能力，还使铁蛋白具有了长期储存铁的能力。图1-6轻链3次折叠孔隙闭合图（Hamburgeretal.,2005）Fig.1-6CloseupoftheLchain3-foldpore（Hamburgeretal.,2005）铁蛋白的储铁功能得到许多实验结果的印证，在人类贫血症患者中，合成血红素受阻，造成细胞线粒体中承载过量的铁，但是细胞并没有因为铁过载造成细胞凋亡，正是因为线粒体中铁蛋白的高表达（Campanellaetal.,2004）。另外，将铁蛋白转染到酵母中，发现酵母中铁过载造成氧化损伤的现象得以减轻，增强了细胞抵御过氧化氢的能力（Campanellaetal.,2004）。1.5.2.2铁蛋白的抗氧化作用过量的自由铁能够产生大量的ROS，对细胞产生氧化损伤，铁蛋白对于限制ROS13 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析的生成起到重要作用（Arosioetal.,2009）。在高铁血红细胞中，血红素合成受阻时，铁过载容易造成细胞死亡，但是这些细胞往往能够在铁蛋白高表达的情况下存活。铁蛋白通过利用H2O2或O2氧化亚铁离子的反应与Fenton反应相似（Arosioetal.,2009），优先利用了H2O2，并将体内多余的游离铁储存起来，限制了ROS的生成。研究表明过表达铁蛋白，能够降低ROS的产生（Orinoetal.,2001）。转染线粒体铁蛋白进入frataxin缺失的酵母细胞，可明显增强酵母对于铁过载的耐受性，使其在非碳源培养基中生长（Campanellaetal.,2004）。在frataxin沉默的Hela细胞中表达线粒体铁蛋白也同样能减少对细胞的氧化损伤（Campanellaetal.,2004,Zanellaetal.,2008）。转染线粒体铁蛋白到SH-SY5Y细胞中，可有效抑制细胞内ROS的产生，保护细胞免受6-OHDA引起的细胞凋亡（Shietal.,2010）。图1-7铁氧化中心反应（Arosioetal.,2009）Fig.1-7Ferroxidaseactivety.（Arosioetal.,2009）1.5.2.3铁蛋白的调控铁蛋白与游离铁结合，起到暂时储存功能，当机体需要时，又能释放铁，满足机体对铁的需要，因此铁蛋白势必受到体内铁水平的影响。机体是通过铁调节蛋白（IRPs）与铁蛋白的铁反应元件（IRE）对铁蛋白进行调节的。细胞铁缺乏时，IRP与IRE结合，阻止铁蛋白的表达，以减少铁的储存；相反，铁过载时，IRP与IRE分离，解除抑制以增加铁蛋白表达，从而结合过载铁，减少ROS的产生（Orinoetal.,2001,Waldenetal.,2006,TongandRouault,2007）。通过这样的方式，铁蛋白受到铁水平的调控。另外，氧化应激同样影响着铁蛋白的表达。当细胞受到氧化应激时，能够激活铁蛋白的转录，其中，FTH对于应激更加敏感。还有就是细胞因子也能调节铁蛋白的表达。其中参与和促进炎症反应的细胞因子可选择性的诱导FTH的表达，富集FTH。在U937细胞中，干扰素γ可选择性的FTH的表达。还可通过诱导一氧化氮合酶表达，继而诱导一氧化氮释放，进而影响铁蛋白的合成（Eisenstein,2000）。14 山东农业大学博士学位论文1.5.2.4铁蛋白的免疫作用与转铁蛋白相似，铁蛋白同样具有抗菌抗病毒作用。研究发现，铁蛋白对于疱疹病毒等有抑制作用；对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有光谱抑制作用；对于多种真菌也有杀灭作用。通常认为，铁蛋白可与病原微生物竞争性的结合铁，造成微生物铁缺失，从而抑制生长，也可直接集合细菌细胞壁，造成细菌死亡（Carrondo,2003）。另外，铁蛋白可通过抑制肿瘤细胞从G1期向S期转换，从而抑制肿瘤增殖（Baldietal.,2005）。1.6本研究的目的及意义中蜂（A.c.cerana）为东方蜜蜂（A.c.Fabricius）的亚种，是我国的土著蜂种。与西方蜜蜂（A.m.Linnaeus）相比，中蜂嗅觉敏锐，抗螨能力强，抗寒耐热，善于利用零星蜜源，作为特殊的经济昆虫，是蜂种遗传改良的重要素材，具有优良的种质资源保护价值。因此，研究中蜂的抗逆机能和分子机制，对蜜蜂的抗逆性提高和种群进化稳定性的保持有重要作用，此外对与中蜂关联的的共生植物的维护，生态系统的平衡，产生重要的生态价值、经济价值，对整个社会的发展有这不可估量的效果。蛋氨酸甲基亚砜还原酶、转铁蛋白及铁蛋白参与调控昆虫的抗逆生物学功能是近年来的新发现。目前，中蜂基因组测序尚未完成，我们仍不清楚中华蜜蜂MsrB、Transferrin和Ferritin基因家族成员在中蜂抗逆生物学中的分子调控机制。本实验以中蜂为研究材料，对MsrB基因、Tf基因、FTL基因及FTH基因的鉴定及抗逆性能开展研究，首次在分子生物学水平上研究了中蜂抗逆性能的调控与MsrB基因、Tf基因、FTL基因及FTH基因的联系。研究结果不仅可以丰富昆虫MsrB基因、Tf基因、FTL基因及FTH基因的理论体系，对于蜜蜂的抗逆性状改良也具有一定的指导意义和实践价值。15 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析2材料与方法2.1实验材料2.1.1供试蜂种不同发育时期的中华蜜蜂（简称中蜂，A.c.cerana），饲养于山东农业大学实验研究基地。2.1.2菌株、质粒菌株：实验所用大肠杆菌（E.coli）菌株DH5α和BL21（DE）均由本实验室保存。质粒：克隆载体pEasy-T3购于TransGen公司。原核表达载体pET-30a（+）由本实验室保存。2.1.3酶与各种生化试剂TMTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、DNAMarker、SYBRPrimeScriptRT-PCRKit、各种限制性内切酶、辣根过氧化物酶酶标羊抗鼠血清购于TaKaRa公司；反转录试剂盒EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix、动物基因组DNA提取试剂盒TMEasyPureGenomicDNAKit、购于TransGen公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Solarbio公司；cDNA纯化试剂盒WizardDNAClean-upSystem和购于Promega公司；质粒提取试剂盒PlasmidMiniKit购于OMEGA公司；TRIZOLKit购于Invitrogen公司；®HisTrapHP蛋白纯化柱购于GE公司；SuperSignalWestPicoTrialKit购于ThermoScientificPierce公司；所用农药（三氟氯氰菊酯、辛硫磷、吡虫啉和百草枯）购于山东华阳科技有限公司，甲酰胺、L-精氨酸、β-巯基乙醇等其它化学试剂购于Sigma公司。2.1.4PCR引物PCR引物由上海生物工程公司合成。16 山东农业大学博士学位论文表2-1研究所用AccMsrB基因引物Table.2-1TheprimerslistofAccMsrBusedinthisstudyAbbreviationPrimersequence(5′→3′)DescriptionMP1ATGACTGTGGAAATCGATAAAGAAGcDNAsequenceprimer,forwardMP2TTATGATGTGATCTTCTTCTCTTCTCcDNAsequenceprimer,reverse3P1CAGTGGTTGTGGTTGGC3′RACEforwardprimer,outer3P2CAGCAGGAGAAGAGAAGAAGA3′RACEforwardprimer,innerB26GACTCTAGACGACATCGA(T)18Universalprimer,primaryB25GACTCTAGACGACATCGAUniversalprimer,nested5P1TCTCTCTGTACCCTTTTCCTG5′RACEreverseprimer,outer5P2TGACGTGCCATTGTAGCG5′RACEreverseprimer,innerAAPGGCCACGCGTCGACTAGTAC(G)16AbridgedanchorprimerAUAPGGCCACGCGTCGACTAGTACAbridgeduniversalamplificationprimerFP1GTGCCGCTTCTGTTCTCTTFulllengthcDNAprimer,forwardFP2TTATGATGTGATCTTCTTCTCTTCTCFulllengthcDNAprimer,reverseβ-sTTATATGCCAACACTGTCCTTTStandardcontrolprimer,forwardβ-xAGAATTGATCCACCAATCCAStandardcontrolprimer,reverseG1GTGCCGCTTCTGTTCTCTTGenomicsequenceprimer,forwardG2GCCAACCACAACCACTGGenomicsequenceprimer,reverseG3CAGTGGTTGTGGTTGGCGenomicsequenceprimer,forwardG4TTATGATGTGATCTTCTTCTCTTCTCGenomicsequenceprimer,reverseQP1AAGTATTAGATCAGGGACGAGReal-timePCRprimer,forwardQP2TCTTCTTCTCTTCTCCTGCTGGReal-timePCRprimer,reverse表2-2研究所用AccsTf基因引物Table.2-2TheprimerslistofAccTfusedinthisstudyAbbreviationPrimersequence(5′-3′)DescriptionTF1GAGATGATGCTCCGATGCcDNAsequenceprimerofAccTf,forwardTF2CGACGAAAACTGGCATCCcDNAsequenceprimerofAccTf,reverse5P1GTTGAACTGCCTCTGTCAC5′RACEreverseprimerofAccTf,outer5P2CGTCTAAGTATTTTGCGTTTTTCAG5′RACEreverseprimerofAccTf,inner3P1GAACCTCATGAAATCGATGTT3′RACEforwardprimerofAccTf,outer3P2AGTGTTGCCCGAGAATCATC3′RACEforwardprimerofAccTf,innerAAPGGCCACGCGTCGACTAGTAC(G)14AbridgedAnchorPrimerAUAPGGCCACGCGTCGACTAGTACAbridgeduniversalamplificationprimerB26GACTCTAGACGACATCGA(T)183′RACEuniversaladaptorprimerB25GACTCTAGACGACATCGA3′RACEuniversalprimerQP1GAGATGATGCTCCGATGCFull-lengthcDNAprimer,forwardQP2CGACGAAAACTGGCATCCFull-lengthcDNAprimer,reverseGP1GAGATGATGCTCCGATGCAATGenomicsequenceprimerofAccTf,forwardGP2CGTCTAAGTATTTTGCGTTTTTCAGGenomicsequenceprimerofAccTf,reverseQS1GCTGTGCAATCGAACTGGCAGPromoterspecialprimer,forwardQS2CGAAGCGTTAATCAACAACGPromoterspecialprimer,reverseRP1CCAGAGCGGCATACTCTAGGqRT-PCRprimerofAccTf,forward17 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析RP2AACCGTCAAATCCGCGTTATqRT-PCRprimerofAccTf,reverseβ-actin-sGTTTTCCCATCTATCGTCGGStandardcontrolprimer,forwardβ-actin-xTTTTCTCCATATCATCCCAGStandardcontrolprimer,reverseEP1GGATCCAATGATGCTCCGATGCAACATTProteinexpressionprimer,forwardEP2GCAAAATAATTACGGCGCTGCTTTTCTTCProteinexpressionprimer,reverse表2-3研究AccFTH和AccFTL基因所用引物Table2-3ThePCRprimersofAccFTHandAccFTLinthisstudyAbbreviationPrimersequence(5′-3′)DescriptionFTH1GTTACTCCCCGTCGATTAAAGTcDNAsequenceprimer,forwardFTH2CTGTCACATACTAACTTAAAACcDNAsequenceprimer,reverseFTL1GAAGCTAGATAAGAGAACGTGCGcDNAsequenceprimer,forwardFTL2GGAGTATGCTTTATCATGGcDNAsequenceprimer,reverse3FTH1GGAGAAATGACTGGAGCTAGAA3′RACEforwardprimer,outer3FTH2GAATCTGCTACGGAAGAAAG3′RACEforwardprimer,inner3FTL1GAAATGTGGGAGAATGGAATTG3′RACEforwardprimer,outer3FTL2GTGGCTTTAGCAATGCTGTTG3′RACEforwardprimer,inner5FTH1CTGTTCCACCTCCTAAGCATACTCC5′RACEreverseprimer,outer5FTH2CAAGGCTTTATAGCCAGTGTTCC5′RACEreverseprimer,inner5FTL1GAGTTGTTCATCTTCAAGAACG5′RACEreverseprimer,outer5FTL2CCTGCTAATTCTCGAACACGGTCTGCC5′RACEreverseprimer,innerAAPGGCCACGCGTCGACTAGTAC(G)14AbridgedAnchorPrimerAUAPGGCCACGCGTCGACTAGTACAbridgeduniversalamplificationprimerB26GACTCTAGACGACATCGA(T)183′RACEuniversalprimer,outerB25GACTCTAGACGACATCGA3′RACEuniversalprimer,innerQFTH1GTTACTCCCCGTCGATTAAAGTFull-lengthcDNAprimer,forwardQFTH2CTGTCACATACTAACTTAAAACFull-lengthcDNAprimer,reverseQFTL1GAAGCTAGATAAGAGAACGTGCGFull-lengthcDNAprimer,forwardQFTL2GGAGTATGCTTTATCATGGFull-lengthcDNAprimer,reverseβ-sTTATATGCCAACACTGTCCTTTStandardcontrolprimer,forwardβ-xAGAATTGATCCACCAATCCAStandardcontrolprimer,reverseGFTH1GTTACTCCCCGTCGATTAAAGTGenomicsequenceprimer,forwardGFTH2CTGTCACATACTAACTTAAAACGenomicsequenceprimer,reverseGFTL1GAAGCTAGATAAGAGAACGTGCGGenomicsequenceprimer,forwardGFTL2GGAGTATGCTTTATCATGGATTAAACTTATATATAGGenomicsequenceprimer,reverseRFTH1GAATCTGCTACGGAAGAAAGReal-timePCRprimer，forwardRFTH2GTTTTTTATCAAATAGAAATTCTCCTAACReal-timePCRprimer，reverseRFTL1GAATCTGCTACGGAAGAAAGReal-timePCRprimer，forwardRFTL2CCTGCTAATTCTCGAACACGGTCTGCCReal-timePCRprimer，reverse18 山东农业大学博士学位论文2.2实验方法2.2.1中华蜜蜂的饲养及处理（1）根据MicheletteandSoares（1993）文献所述，分别从蜂箱中采集卵、1-5龄幼虫、预蛹期、白眼蛹期、红眼蛹期、紫眼蛹期、黑眼蛹期等及初生蜂、10日龄成蜂、20日龄成蜂。参照先前的方法饲养幼虫（Silvaetal.,2008）和成蜂（Alauxetal.,2010），o将采集样品置于33C，相对湿度60%的恒温恒湿培养箱中饲养。（2）中蜂的组织获取：在冰上解剖成蜂，迅速分离脑（brain）、表皮（epidermis）中肠（midgut）直肠（rectum）、脂肪体（fatbody）和肌肉（muscle），之后立即放入液o氮中冷冻，-80C保存。（3）各龄中蜂的获取：在山东农业大学实验研究基地分别采集卵、1-5龄幼虫（L1-L5）、预蛹期（PP）、各种蛹期（Pw，Pp，Pb，Pd）、不同日龄的成蜂（A1，A10，A15，A20）及不同性别蜜蜂（处女王、产卵蜂王、雄蜂、工蜂），立即放入液o氮冷冻，于-80C保存。oooo2（4）温度和紫外线处理：用不同温度（4C，16C，25C，42C）和紫外线（30mj/cm）o对成蜂按照时间梯度进行处理后收集，立即放入液氮中冷冻并置于-80C保存。（5）重金属处理：将饲喂由30%蜂蜜和70%糖粉以及无菌水配制的基础日粮（BAD）成蜂作为对照组，并以饲喂分别添加CdCl2（10μg/mL）和HgCl2（3mg/mL）至BADo中成蜂为实验组进行实验。经适当时间处理后收集样品，液氮冷冻后-80C保存。（6）农药处理：将浓度为20μg/L三氟氯氰菊酯（Cyhalothrin）、1μg/mL辛硫磷（phoxim,）、10μM吡虫啉（pyridaben）、10μM百草枯（paraquat）各0.5μL分别涂抹待试成蜂的胸背板处，涂抹无菌水的成蜂作为对照。待适当时间处理后，收集样品并液o氮冷冻，-80C保存。（7）H2O2处理：20μL（50μM）H2O2于添加到50%糖水中，饲喂蜜蜂，仅饲喂o糖水的成蜂作为对照。待处理适当时间后，收集样品并液氮冷冻，-80C保存。以上所有实验处理均设3个生物学重复。2.2.2中华蜜蜂总RNA的提取、纯化及鉴定2.2.2.1利用TRIZOL提取总RNAo（1）向DEPC水处理后的1.5mL离心管中加入1mL4C预冷的TRIZOL提取试19 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析剂；（2）液氮中迅速研磨实验组蜜蜂，称取0.05-0.1g蜜蜂样品，收集至提取试剂中，o震荡混匀，室温条件下静置5min，4C，12000g，离心10min；（3）用移液器吸取上清至另一离心管中，加入氯仿0.2mL，剧烈振摇15s，室温o条件下静置2-3min，4C，12000g，离心15min；（4）将上清移至新的离心管，加入等量体积的异丙醇，于室温条件下静置10min，o4C，12000g，离心10min；o（5）弃上清，使用预冷的75%乙醇洗涤小心沉淀，4C，7500g，离心5min；o（6）弃上清，经超净台内通风干燥后，用25μLDEPC-ddH2O溶解RNA，-80C保存备用。2.2.2.2总RNA的纯化（1）总RNA中基因组DNA去除的反应体系如下：RNA5μL10×DNaseIbuffer2μLDNaseI(RNasefree)0.5μLDNaseI0.5μLRNaseinhibitor0.5μLDEPC-ddH2Oupto20μLoo（2）上述体系混匀后于37C，反应30min；80C，10min后终止反应。2.2.2.3总RNA的琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳鉴定（1）1.2%琼脂糖-甲醛变性凝胶的配制（50mL）：琼脂糖0.6g5×RNAbuffer10mLDEPC-ddH2O31mLo上述物质加热熔化后冷却至60C左右，加9mL37%甲醛溶液，并于通风橱内灌胶，放置30min以上待用。20 山东农业大学博士学位论文（2）RNA样品准备：测定纯化RNA的含量，然后用DEPC-ddH2O稀释样品的RNA浓度至20μg/6μL，按o下表体系。65C，水浴15min，冰上冷却后加入4μL5×RNA上样缓冲液和0.5μLEB（1mg/mL）后上样，40V，电泳2-3h。总RNA6.0μL5×RNAbuffer4.0μLDEPC-ddH2O15.0μL（3）电泳后，在紫外透射仪上观察凝胶并照相。2.2.3cDNA第一链合成（1）RNA反转录体系如下：mRNA5μLoligod(T)引物1μLESMix1μL2×ESMixbuffer5μLDEPC-ddH2Oupto20μLoo（2）混匀上述反应物，42C，水浴50min，冰上冷却5min后，短暂离心后-20C保存。2.2.4cDNA的纯化（1）将1mLWizarrdResin加入到1.5mL离心管中，加入样品并混匀；（2）向大管中添加混合液，后将小管连入，再抽真空；（3）向大管中加入2mL80%异丙醇，抽真空；（4）待溶液抽过小管后，抽30s以干燥Resin；（5）将小管置入新的1.5mL离心管中；（6）12000g，离心2min；o（7）将小管置入新的1.5mL离心管，添加50μL70C预热的ddH2O，放置1min；o（8）12000g，离心20s，将cDNA洗脱，-20C保存。21 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析2.2.5cDNA5"末端的加尾反应（1）反应体系如下：cDNA20μL5×TdTBuffer10μL0.1%BSA5μL100mMdCTP1μLTdT1μLddH2Oupto50μLo（2）混匀上述体系后于37C保温30min；o（3）向体系中加入100μL无水乙醇，-20C沉淀30min；（4）12000g，室温条件下离心5min；弃上清，稍干燥后用ddH2O回溶。2.2.6中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因cDNA全长序列的获取2.2.6.1AccFTH及AccFTL基因中间片段的获取（1））本文以AccMsrB基因为例进行说明。根据不同物种间氨基酸的序列保守性，本实验设计了引物MP1和MP2（表2-1），以上述合成的cDNA为模板进行PCR反应：10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µLG1R1(10µM)1µLG1R2(10µM)1µLcDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（2）反应条件：94˚C10min94˚C40s48˚C40s35cycles72˚C40s22 山东农业大学博士学位论文72˚C10min（3）PCR结束后，通过琼脂糖凝胶进行电泳检测；（4）回收目的片段后连接pEasy-T3载体，转化E.coli感受态DH5α细胞，经菌液PCR鉴定、酶切鉴定后进行测序。表2-4AccMsrB基因PCR反应条件Table2-3PCRamplificationconditionsofAccMsrBgenePrimespairAmplificationconditionsMP1,MP25minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,40sat72°Cfor35cycles,5minat72°C3P1,B265minat94°C,40sat94°C,40sat47°C,40sat72°Cfor31cycles,5min,at72°C3P2,B255minat94°C,30sat94°C,30sat50°C,30sat72°Cfor35cycles,5minat72°C5P1,AAP5minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,40sat72°Cfor31cycles,5minat72°C5P2,AUAP5minat94°C,40sat94°C,30sat50°C,30sat72°Cfor35cycles,5minat72°CQP1,QP25minat94°C,60sat94°C,60sat47°C,50sat72°Cfor35cycles,5minat72°CGP1,GP25minat94°C,30sat94°C,30sat51°C,30sat72°Cfor35cycles,5minat72°CGP3,GP45minat94°C,60sat94°C,60sat47°C,60sat72°Cfor35cycles,5minat72°Cβ-s,β-x5minat94°C,30sat94°C,30sat53°C,30sat72°Cfor35cycles,5minat72°C表2-5AccTf基因PCR反应条件Table2-5PCRamplificationconditionsofAccTfgenePrimespairAmplificationconditionsTF1/TF210minat94°C,40sat94°C,40sat52°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C3R1∕B2610minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C3R2∕B2510minat94°C,40sat94°C,40sat50°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C5R1∕AAP10minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C5R2∕AUAP10minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°CQR1/QR210minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,60sat72°Cfor35cycles,10minat72°CN1∕N210minat94°C,40sat94°C,40sat52°C,90sat72°Cfor35cycles,10minat72°CN3/N410minat94°C,40sat94°C,40sat52°C,50sat72°Cfor35cycles,10minat72°CYH1/YH210minat94°C,40sat94°C,40sat52°C,50sat72°Cfor30cycles,10minat72°C表2-6AccFTH及AccFTL,基因PCR反应条件Table2-5PCRamplificationconditionsofAccFTH及AccFTL,PrimespairAmplificationconditionsFTH1/FTH210minat94°C,40sat94°C,40sat48°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°CFTL1/FTL210minat94°C,40sat94°C,40sat47°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C3FTH1∕B2610minat94°C,40sat94°C,40sat50°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C3/FTH2∕B2510minat94°C,40sat94°C,40sat53°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C3FTL1/B2610minat94°C,40sat94°C,40sat48°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C3FTL2/B2510minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C3CR1/B2610minat94°C,40sat94°C,40sat50°C,60sat72°Cfor28cycles,10minat72°C23 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析3CR2/B2510minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,60sat72°Cfor35cycles,10minat72°C5FTH1∕AAP10minat94°C,40sat94°C,40sat54°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C5FTH2∕AUAP10minat94°C,40sat94°C,40sat54°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C5FTL11∕AAP10minat94°C,40sat94°C,40sat47°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C5FTL2∕AUAP10minat94°C,40sat94°C,40sat52°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°C5CR1/AAP10minat94°C,40sat94°C,40sat48°C,40sat72°Cfor28cycles,10minat72°C5CR2/AUAP10minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°CQTH1/QTH210minat94°C,40sat94°C,40sat50°C,40sat72°Cfor35cycles,10minat72°CQFTL1/QFTL210minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,60sat72°Cfor35cycles,10minat72°CQCR1/QCR210minat94°C,40sat94°C,40sat50°C,60sat72°Cfor35cycles,10minat72°CFTHN1∕FTLHN210minat94°C,40sat94°C,40sat51°C,120sat72°Cfor35cycles,10minat72°CFTLN1/FTLN210minat94°C,40sat94°C,40sat49°C,90sat72°Cfor35cycles,10minat72°C2.2.6.2RACE法获得AccFTH及AccFTL基因5"端序列（1）用上述已将5"端加尾的cDNA进行PCR，反应体系如下：10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µL5G1R1(10µM)1µLAAP(10µM)1µLcDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（2）反应条件：94˚C10min94˚C40s54˚C40s35cycles72˚C40s72˚C10min（3）再以同样的体系和反应程序，以一次PCR产物为模板，AUAP引物和5R2进行PCR扩增；24 山东农业大学博士学位论文（4）将二次PCR所得片段连入pEasy-T3载体、酶切鉴定后进行测序。2.2.6.3RACE法AccFTH及AccFTL基因3"端序列（1）以cDNA为模板进行PCR，体系如下：10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µLB26(10µM)1µL3G1R1(10µM)1µLcDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（2）反应条件：o94C10mino94C40so50C40s35cycleso72C40so72C10min（3）以B25和3R2作为引物，以第一次PCR产物为模板进行二次PCR，两次PCR的反应体系和反应条件相同；（4）将所得片段连入pEasy-T3载体、酶切鉴定后测序。25 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析2.2.6.4AccFTH及AccFTL基因全长cDNA序列的获得根据已获得序列和重叠区域，拼接出全长cDNA序列，设计扩增全长cDNA序列的引物FP1和FP2，以上述反转录产物为模板进行PCR进一步验证：（1）反应体系如下：10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µLQG1R1(10µM)1µLQG1R2(10µM)1µLcDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（2）反应条件：o94C10mino94C40so50C40s35cycleso72C40so72C10min（3）将所得片段连入载体pEasy-T3、经酶切鉴定后测序。2.2.7目的DNA片段回收、连接及转化2.2.7.1目的DNA片段回收（1）紫外灯下小心切取DNA目的条带，并置于1.5mL离心管中，尽量紧贴目的条带切下，提高DNA回收率；（2）用天平称量所切胶块重量，以1mg=1μL估算胶块的体积，并加入3倍于胶块体积的胶块融化液；o（3）55C水浴加热10min融化胶块，其间振荡混匀以使胶块充分融化，之后室温条件下冷却；（4）将吸附柱置于收集管上，将冷却至室温条件下的溶胶液转入吸附柱中，13000g，离心60s，弃滤液；26 山东农业大学博士学位论文（5）向吸附柱中加入700μL的漂洗液，13000g，离心60s，弃滤液；（6）向吸附柱中加入500μL的漂洗液于，13000g，离心60s，弃滤液；（7）将收集管放置于新的1.5mL离心管上，加入20-30μL的ddH2O或ElutionBuffer于收集膜，于室温条件下静置2min；o（8）13000g，离心60s，洗脱液保存于-20C冰箱。2.2.7.2目的DNA片段连接克隆载体以pEasy-T3为连接载体，连接体系为：pEasy-T3vector1μL目的DNA片段4μLTotal5μLo混匀后，25C，连接10min后进行E.coli转化。2.2.7.3大肠杆菌E.coli感受态细胞的制备o（1）从-80C冰箱里取出保存的大肠杆菌DH5α细胞，于冰盒中缓慢融化，移取1oμL加至3mL新鲜LB培养基中，37C，200g，过夜培养；o（2）移取2mL培养液加至50mL新鲜LB中，37C，200g，培养2-4h，期间测定培养液OD600至0.4-0.6时，方可停止培养；o（3）4C，4600g，离心5min，弃上清，移取10mL预冷0.1M的MgCl2溶液悬浮细胞；o（4）4C，4600g，离心5min，弃上清，移取25mL预冷0.1M的CaCl2溶液悬浮细胞，冰浴20min；o（5）4C，4600g，离心5min，轻轻弃上清，加入5mL预冷的0.1M的CaCl2溶o液（含15-20%甘油）悬浮细胞，混匀后分装，-80C保存。2.2.7.4大肠杆菌感受态细胞的转化（1）取出50μL冻存的感受态细胞，冰浴缓慢融化；（2）将5μL连接产物移至感受态细胞中，轻微混匀后冰浴静置30min；o（3）42C热激90s后立即冰浴2min；o（4）加入950μLLB液体培养基，37C，200g，培养1.5-2h；27 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析（5）10000g，室温条件下离心1min，沉淀用100μLLB液体培养基溶解；o（6）取100μL悬浮细胞，涂布于LB固体培养基上（含有合适抗生素），37C，倒置培养12-20h。2.2.8大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定2.2.8.1质粒DNA的提取（试剂盒微量法）（1）取5mL菌液加入离心管中，10000g，室温条件下离心1min；（2）弃上清，加入250μL的SolutionI/RNaseA混合液于菌体沉淀中，振荡2min，以重新悬浮细胞；（3）加入250μLSolutionII，并使其混匀，以得到澄清的裂解液；（4）再加入350μLSolutionIII于上述混合液中，颠倒混匀数次，直至形成白色絮状沉淀后，10000g，室温条件下离心10min；（5）吸取上清至吸附柱内，10000g，室温条件下离心1min，弃滤液；（6）向吸附柱内加入500μLBufferHB，10000g，室温条件下离心1min，弃滤液；（7）向吸附柱内加入700μLDNAWashingBuffer，10000g，室温条件下离心1min；（8）重复步骤7；（9）弃滤液，10000g，离心1min；（10）把吸附柱放置于1.5mL离心管中，加入50-100μL无菌ddH2O于收集膜中o央，经10000g，室温条件下离心1min，将洗脱的质粒DNA保存于-20C冰箱。2.2.8.2重组质粒DNA酶切鉴定（1）酶切体系如下：质粒10μL限制性内切酶11μL限制性内切酶21μL10×buffer2μLddH2Oupto20µLo（2）将上述体系混匀后，37C，酶切10min。经电泳观察酶切结果，据所切目的28 山东农业大学博士学位论文DNA片段的位置和大小，判断重组质粒是否成功制备。2.2.9DNA测序将酶切鉴定阳性菌液送上海生工生物技术有限公司进行测序。2.2.10中华蜜蜂基因组DNA的提取（1）取≤25mg液氮快速研磨后的蜜蜂组织，置于1.5mL离心管中；o（2）加入180µLLB2和20µLProteinaseK，振荡混匀，55C水浴，孵育2-3h直至完全裂解；（3）加入20µLRNaseA，混匀，室温条件下孵育2min；（4）12000g，室温条件下离心5min，将上清转至新的1.5mL离心管中；（5）再加入10µL10%SDS，振荡混匀5s；o（6）加入200µLBB2，立即涡旋混匀5s，70C水浴，孵育10min；（7）加入200µL无水乙醇，混匀5s；（8）将全部混合液加入吸附柱中，12000g，室温条件下离心30s，弃滤液；（9）向吸附柱内加入500µLCB2溶液，12000g，室温条件下离心30s；（10）重复步骤9一次；（11）弃滤液，向吸附柱内加入500µL溶液WB2，12000g，室温条件下离心30s；（12）重复步骤11一次；（13）12000g，室温条件下离心2min，彻底去除残留液体；o（14）将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加入200µL预热EB（60C）或去离子水（pH>7.0）于收集膜中央处，于室温条件下静置1min，12000g，离心1min，洗脱DNA；o（15）重复步骤14一次，然后将洗脱的DNA置于-20C保存。2.2.11中华蜜蜂AccMsrB全长序列扩增（1）根据已知AccMsrBcDNA全长序列，设计引物，以中蜂基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：29 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µL引物1(10µM)1µL引物2(10µM)1µLDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（2）反应程序：o94C10mino94C40so51C40s35cycleso72C120so72C10min（3）将回收的基因片段，经pEasy-T3载体连接、酶切鉴定后测序。（4）将测序结果与cDNA序列比对、分析内含子序列，获得目的基因全序列。2.2.12中华蜜蜂AccMsrB启动子序列扩增o（1）用EcoRI酶切中蜂基因组DNA，37C，反应18-24h；（2）添加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀后，加入1/10体积的NaAc和2倍体积无水乙醇，以析出DNA；（3）用30µLddH2O溶解沉淀的DNA，稀释到5µg/mL；o（4）向5µL上述DNA溶液中添加T4连接酶，16C，反应2h；（5）以连接产物为模板，根据基因组DNA序列设计引物进行第一次PCR扩增；（6）以稀释50倍的第一次PCR产物为模板，用相应引物（表2-1和表2-2）进行第二次PCR，反应体系如下：30 山东农业大学博士学位论文10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µL引物1(10µM)1µL引物2(10µM)1µL稀释50倍一次PCR产物1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（7）引物序列分别见表2-1和表2-1，反应程序见表2-3和表2-4；（8）回收目的片段，连接pEasy-T3载体、酶切鉴定并测序；（9）按照测序比对结果，设计引物，进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCRbuffer2.5µLdNTPmixture(10mM)1µL引物1(10µM)1µL引物2(10µM)1µLDNA1µLTaqE0.25µLddH2Oupto25µL（10）将回收的目的序列，连接pEasy-T3载体、酶切鉴定后测序。2.2.13RT-PCR分析基因的表达2.2.13.1引物、反应体系及条件（1）以中蜂β-actin基因（GenBank登录号：HM640276）作为内参，设计内参引物β-actin-s和β-actin-x。®（2）以反转产物为模板，SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit反应体系如下：31 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析SYBRPremixExTaqTMII(2×)12.5μLPCRForwardPrimer(10μM)1μLPCRInversePrimer(10μM)1μLcDNA2μLddH2Oupto25μL（3）RT-PCR反应程序如下：o95C30so95C5so55C15s40cycleso72C15s扫描ooo65Cto95C0.5C/sEnd（4）按浓度梯度将模板稀释5次（10倍倍比稀释），构建RT-PCR反应的标准曲线，验证所设计引物的扩增效率（E）以及是否呈线性扩增的关系，并通过融解曲线检测引物扩增的特异性进而优化扩增条件。实验所用仪器为Bio-radCFX96RT-PCR仪。2.2.13.2RT-PCR分析（1）不同处理样品总RNA的提取方法见（2.2.2.1）；（2）按照上述反应体系和反应程序，进行RT-PCR分析，目的基因与内参基因同时扩增，默认条件下读取各Ct值；2.2.13.3数据处理-ΔΔCT（1）数据分析采用双标准曲线法，使用2计算基因的相对表达量，同时计算平均表达量和相对偏差，用Excel作图；（2）用SAS9.1统计软件（SASInst.,Inc.,Cary,NC,USA）one-wayANOVA法进行单因子方差分析，用Duncan检验进行数据的多重比较。32 山东农业大学博士学位论文2.2.14目的基因的原核表达及纯化2.2.14.1构建原核表达载体（1）设计带有BamHI和KpnI或BamHI和HindIII酶切位点的引物（表2-1和表2-2），以cDNA为模板，进行PCR扩增；（2）以BamHI和KpnI或BamHI和HindIII双酶切回收的目的片段和原核表达载体pET-30a（+），电泳分离并回收酶切后的目的片段和载体片段；（3）将上述两种片段连接，并转化大肠杆菌DH5α、酶切鉴定、筛选出阳性克隆。2.2.14.2诱导重组基因原核表达（1）将含重组基因的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞；o（2）挑取单菌落并接种到10mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37C，振荡培养过夜；o（3）12h后将适量菌液转入新的10mLLB中，37C，振荡培养2-3h；o（4）至OD600=0.2-0.5后，加入IPTG至终浓度0.2mM，37C，振荡培养3-4h；（5）取1mL诱导后菌液，12000g，室温条件下离心1min，弃上清；（6）加入50µL2×上样buffer混匀，沸水煮5-10min，12000g，室温条件下离心30s；o室温条件下冷却后，取上清进行SDS-PAGE或于-20C保存备用。2.2.14.3纯化重组蛋白o（1）取400mL诱导培养的菌液，6000g，4C，离心5min，弃上清；oo（2）加入20mL4C预冷的PBS溶液，6000g，4C，离心5min，弃上清；o（3）加入20mL4C预冷的PBS溶液，经超声破碎处理30min，使菌液呈半透明状，o12000g，4C，离心15min，弃上清；o（4）加入2mL裂解液，重悬菌体，加入40µL溶菌酶，混匀，37C消化1-2h；o（5）12000g，4C，离心15min，取上清；o（6）上清液经滤膜（0.45µm）过滤后移至HisTrapHP蛋白纯化柱中，4C静置30min；（7）按照操作说明书，利用咪唑梯度将重组蛋白洗脱下来；o（8）将含有重组蛋白的洗脱液分装，-20C保存，另取20µL洗脱液进行SDS-PAGE检测其纯度。33 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析2.2.14.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）12.5%分离胶制备Total15mL30%Acr-Bis7.5mL1.0MTris-HCl(pH8.8)5.6mL10%SDS0.3mL10%APS0.2mLTEMED20μLddH2O1.85mL两块玻璃板之间注入分离胶溶液，并留适量距离给浓缩胶，并马上在凝胶面轻轻注入一层ddH2O，以保持胶面平整，于室温条件下静置30min至胶完全聚合；（3）弃去上层ddH2O，并用吸水纸吸干多余水分，制备5%浓缩胶：Total10mL30%Acr-Bis1.67mL1.0MTris-HCl(pH6.8)1.25mL10%SDS0.1mL10%APS0.1mLTEMED10μLddH2O7.03mL两块玻璃板封装，并在中间注入制备的浓缩胶，插上样品梳，静置约20min，待胶完全聚合；（4）取20μL样品注入样品孔，初始电压为70V，待样品进入分离胶后，调节电压至120V，当溴酚蓝染料刚好跑出分离胶时暂停电泳；（5）取出凝胶，置于50mL固定液中室温条件下固定1h；（6）弃去固定液，加入染色液，室温条件下过夜染色；（7）在脱色液中进行脱色，每2-3h更换一次脱色液，至蛋白条带清晰后，用凝胶34 山东农业大学博士学位论文成像系统扫描。2.2.15抗体的制备及检测2.2.15.1抗体的制备（1）混匀纯化蛋白与等体积的弗氏完全佐剂，腹部皮下注射试验用小鼠；（2）以后每周免疫一次，连续免疫4次后采血，分离血清，检测抗体效价是否合格；o（3）从小鼠尾部大量采血，37C，静置1h；o（4）3000g，室温条件下离心15min，小心吸取抗血清并分装（20μL/管），于-80C保存。2.2.15.2ELISA检测抗体效价（1）按1:20的比例用碳酸缓冲液（pH9.6）稀释抗原，每孔200µL包被微量反应板，4oC放置过夜；（2）次日，用PBST洗涤液（pH7.4）洗板4次，每孔加入250µL封闭液（含5%牛血o清白蛋白），37C放置2h；o（3）洗板4次，按适当比例用封闭液稀释一抗，每孔加入200µL，37C放置2h；（4）洗板4次，加入适当浓度辣根过氧化物酶标记的二抗（GoatAnti-MouseIgG，oHRP），每孔加入200µL，37C放置2h；（5）洗板4次，加入邻苯二胺底物缓冲液进行显色，每孔200µL，室温避光放置20min；（6）每孔加入100µL2MH2SO4终止反应，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD492，检测抗体效价。2.2.15.3Westernblot分析（1）SDS-PAGE电泳结束后小心取下凝胶，并去除所有浓缩胶；（2）在阴极缓冲液中浸泡凝胶至少15min；（3）分别在阳极缓冲液I和II中各浸泡滤纸两张、阴极缓冲液中浸泡滤纸三张，侵泡时间至少30s；（4）用甲醇浸润PVDF膜15s，转入ddH2O中再浸泡2min，再在阳极缓冲液II中平衡5min以上；35 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析（5）转移叠层的装配：两张浸透阳极缓冲液I的滤纸置于阳极板中央，浸透阳极缓冲液II的滤纸放在前两张滤纸上，将凝胶置于膜上，将浸透阴极缓冲液的三张滤纸放在凝胶上，轻轻用玻璃棒将气泡赶尽，然后将阴极板压在叠层上，接通电源开始转膜，在20.8mA/cm，50V的条件转膜2；（6）取下PVDF膜，放在滤纸上晾干多余水分，用ddH2O冲洗干净，在甲醇中漂洗5min，使膜湿润；（7）将PBST漂洗的印迹膜放入5%脱脂奶粉的封闭液中振荡1h；o（8）把印迹膜放入经封闭液稀释的一抗中，4C振荡过夜；（9）把PBST漂洗的印迹膜放入用封闭液稀释的二抗（GoatAnti-MouseIgG，HRP），中振荡1h；®（10）PBST漂洗后，取SuperSignalWestPicoTrialKit中显影液A、B等体积混合；（11）将此混合液均匀覆盖在印迹膜面上面使其接触1min，用滤纸吸干残液，放入暗盒（含增感屏）中；（12）在暗室中，于红灯下取出X-光片并裁剪至比膜略大约1cm后，打开暗盒放于膜上，关上暗盒，曝光1-5min；（13）打开暗盒，取出曝光后的X-光片，迅速浸入显影液中1-2min，出现明显条带后，即可终止显影；（14）取出X-光片浸入定影液中5-10min，待胶片透明后，用自来水冲掉残留的定影液，待室温条件下晾干后扫描或拍照。2.2.16免疫组化分析2.2.16.1样本处理o迅速分离中蜂成蜂的各个组织器官，PBS冲洗后，立即浸入4%多聚甲醛中固定，4C过夜。2.2.16.2石蜡切片制备（1）将上述固定的组织样本放入铜盒内，流水冲洗24-48h；（2）组织样本梯度脱水，具体步骤为：50%、70%、80%、90%、95%、100%无水乙醇分别脱水1h后，再用100%无水乙醇重复脱水0.5h；（3）脱水后的组织样本透明处理，具体步骤为：将组织材料放入无水乙醇+二甲苯36 山东农业大学博士学位论文（1:1）5min，二甲苯（I）5min，最后二甲苯（II）中，根据组织的透明程度适当调整浸泡时间；（4）透明后的组织样本浸蜡处理，具体步骤为：从二甲苯（II）中取出组织材料，分别浸入蜡杯（I）1h、蜡杯（II）1h和蜡杯（III）1h；（5）将浸蜡后的组织样本放入包埋框内，使其充分浸入蜡中，将包埋好的蜡块室温条件下过夜，使其充分凝固；（6）根据组织材料的位置进行修块并标记，然后用切片机对蜡块进行切片、展片，o切片厚度为10µm，随后进行烤片，42C，烤片48h。2.2.16.3免疫组织酶化学分析（1）将烤好的组织切片进行梯度脱蜡，具体步骤为：二甲苯、无水乙醇+二甲苯（1:1）、100%、90%、80%、70%、50%无水乙醇分别处理5min后，置于ddH2O中；（2）用PBS冲洗组织切片3次（3min/次），用3%H2O2室温条件下封闭30min；（3）用PBS冲洗组织切片3次（3min/次），将切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波加热至沸腾后断电，间隔5-10min，重复1-2次，进行热抗原修复；（4）待组织切片冷却至室温条件下，PBS冲洗组织切片3次（3min/次），然后用5%山羊血清室温条件下封闭30min；o（5）将封闭液稀释的一抗（1:50-1:100）小心地滴加到组织上，4C孵育过夜；（6）次日，PBS冲洗组织切片3次（3min/次），将封闭液稀释的辣根过氧化物酶o标记的二抗（1:150-1:200）小心地滴加到组织上，37C孵育1h；（7）PBS冲洗组织切片3次（3min/次），将封闭液稀释的三抗（1:150-1:200）小o心地滴加到组织上，37C孵育40-60min；（8）PBS冲洗组织切片3次（3min/次），小心地滴加DAB显色底物缓冲液到组织上，根据颜色变化优化反应时间，并用自来水终止反应；（9）将组织切片浸入苏木精溶液中反应10-20s，用盐酸酒精分色后立即用清水终止反应；（10）将组织切片进行脱水、透明，最后用中性树脂封片，镜检照相（LSM510META；ZEISS，Germany）。37 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析2.2.17生物信息学分析工具本研究所用生物信息学分析软件和数据库如下：（1）保守区域检测工具：NCBI；美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）；网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；（2）三级结构预测工具：SWISS-MODEL网址：http://swissmodelexpasy.org/（3）等电点及分子量预测工具：网址：http://us.expasy.org/tools/peptidemass.html；（4）启动子元件预测工具：TFSEARCH数据库网址：http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html（5）蛋白质功能位点预测工具：PROSITE数据库网址：http://cn.expasy.org/prosite（6）DNAman5.5.2软件：用于氨基酸或者核苷酸的多序列比对；（7）MEGA5.2软件：用于系统进化树构建及分析；（8）Photoshop10软件：用于图像处理；（9）Swiss-PdbViewer4.1.0软件：用于Pdb文件编辑。38 山东农业大学博士学位论文3结果与分析3.1中华蜜蜂AccMsrB基因的分子特性和在氧化应激中的反应3.1.1中华蜜蜂AccMsrB基因cDNA序列分析从GenBank上已查询得到多种相近物种MsrB基因，对其核苷酸序列进行比对，找到其保守序列，设计同源性引物MP1/MP2（表2-1），以反转录产物为模板，进行RT-PCR扩增，以得到AccMsrB的中间保守；再根据已知保守序列设计特异引物5P1/5P2和3P1/3P2，分别与5"RACE公共引物AAP/AUAP和3"RACE公共引物B26/B25配对使用，进行RACE-PCR；最后将获得的三段序列进行拼接，得到AccMsrB的cDNA序列，再设计可扩增全部序列的特定引物FP1和FP2，扩增全长序列以验证拼接序列的正确性。序列分析表明：AccMsrB基因（GenBank注册号：KP317814）cDNA全长757bp，其中有一个138bp的5"非编码区、205bp的3"非编码区及414bp的开放阅读框。开放阅读框编码了一段由137个氨基酸残基组成的多肽，其预测分子量约为15.5kDa，等电点约为7.77（图3-1）。图3-1AccMsrB基因的全长cDNA序列及蛋白质序列氨基酸残基以单个字母表示，起始密码子ATG和终止密码子TAA用方框标出，星号（*）指示TAA。Fig.3-1Thefull-lengthcDNAandproteinsequencesofAccMsrBgeneTheaminoacidresiduesareindicatedbyasinglelettercode.Apotentialtranslationstartcodon(ATG)andastopcodon(TAA)areshaded.ThestopcodonTAAwasdenotedbyasterisk.39 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析3.1.2中华蜜蜂AccMsrB蛋白一级结构分析利用DNAman软件比对了来自不同昆虫的MsrB蛋白的一级结构，结果发现AccMsrB与已知小蜜蜂MsrB（Apisflorae，AfMsrB）、大蜜蜂MsrB（Apisdorsata，AdMsrB1-like）、欧洲熊蜂MsrB（Bombusterrestris，BtMsrB1-like）、意大利蜜蜂MsrB（A.mellifera，AmMsrB）具有74.3-99.3%的序列相似性。此外，AccMsrB具有MsrB家族的保守特征：两个锌结合位点的CxxC结构域（Kumaretal.,2002,Olryetal.,2005）、保守的GCGWP的催化位点及与Thioredoxins相互作用的C端RxCxN序列，这些保守序列表明了AccMsrB就是典型的MsrB家族成员（DosSantosetal.,2005,Rouhieretal.,2006,Sagheretal.,2006）。为进一步研究AccMsrB与其他昆虫MsrB间的亲缘进化关系，本研究查询获得多物种的MsrB氨基酸序列，并利用相关软件构建了同源进化树。如图3-2B所示，进化树分成四个分支，分别为MsrB1-like，MsrB1，MsrB2及MsrB3。AccMsrB与MsrB1-like家族紧靠在一起，紧邻意大利蜜蜂AmMsrB，因此将其命名为AccMsrB。本研究利用SWISS-MODEL还预测了AccMsrB的三维结构。并且标明了AccMsrB序列中保守存在的典型结构域，在三维结构中，可以清晰的看到，保守的半胱氨酸在空间上形成了锌离子的结合位点，进一步验证了AccMsrB的特征（3-2C）。图3-2AccMsrB的分子特性（A）AccMsrB与其他物种MsrBs的氨基酸序列比对。预测的二级结构已标示。保守结构域用黑框标出，（B）40 山东农业大学博士学位论文不同物种MsrBs的亲缘关系。（C）AccMsrB的三级结构预测。保守的半胱氨酸残基（C34,C46,C49,C64,C95,C98andC118）已标示。Fig.3-2MolecularpropertiesofAccMsrBHomologycomparisonandphylogeneticanalysisofMsrBsandMsrB1-likeproteins.A:AlignmentofthededucedAccMsrBproteinsequencewithotherknowninsectMsrBs.FourputativeMsrBsignaturemotifswereboxed.B:PhylogeneticanalysisofMsrBsfromdifferentspecies.C:ThetertiarystructureofAccMsrB.Theconservedresidues(C34,C46,C49,C64,C95,C98andC118)areshown.3.1.3AccMsrB基因组结构分析为了明确AccMsrB基因的特性，以提取的中蜂基因组DNA为模板，通过PCR扩增，得到了AccMsrBDNA全长序列。AccMsrB基因组全长为3833bp，包括3个外显子和2个内含子（图3-3），其中内含子富含AT且具有典型的5′-GT剪切供体和AG-3′剪切受体位点（表3-1）。在检测的四个组织中（脑、肌肉、中肠和表皮）均未发现AccMsrB基因有选择性剪切现象。将AccMsrB的基因组与已知基因组序列的小蜜蜂MsrB（A.florae，AfMsrB）、大蜜蜂MsrB（A.dorsata，AdMsrB）、欧洲熊蜂MsrB（B.terrestris，BtMsrB）和意大利蜜蜂MsrB（A.mellifera，AmMsrB）进行比对后发现：AccMsrB、AfMsrB及BtMsrB均包含2个内含子且序列长度非常相似，而AdMsrB和AmMsrB则含有3个内含子且长度相似，5个物种MsrB基因中外显子序列相似性高（图3-3）。图3-3蛋氨酸甲基亚砜还原酶基因的基因组结构中华蜜蜂、小蜜蜂、大蜜蜂、欧洲熊蜂和意大利蜜蜂基因组DNA中外显子和内含子长度根据下面比例尺确定。外显子和内含子分别用（）和（）标出。Fig.3-3GenemicstructureoftheMsrBgenes（MsrBs）SchematicrepresentationoftheDNAstructures.LengthoftheexonsandintronsofgenomicDNAofApisflorea(AfMsrB,GenBankaccessionno.NW003790158.1),Apisdorsata(AdMsrB,GenBankaccessionno.NW006263422),Apismellifera(AmMsrB,GenBankaccessionno.NC007079.3),Bombusterrestris(BtMsrB1-like,GenBankaccessionno.NC015771.1)wereindicatedaccordingtothescalebelow.Theexonsandintronswereshownwith()and(),respectively.41 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析表3-1AccMsrB基因内含子、外显子大小及GC含量Table3-1.ThesizeofExonsandIntronsofAccMsrBgeneandGCContentExonIntronNumberSize(bp)ATcontent(%)NumberSize(bp)ATcontent(%)11-86(86)58.14187-728(642)78.822729-901(173)61.852902-3315(2414)81.4833316-3470(155)58.063.2.4AccMsrB启动子序列的分离及顺式作用元件的预测为明确AccMsrB基因的完整序列，查看其启动子区域中的特殊调控元件，本研究克隆了起始密码子上游5′UTR。利用MatInspector数据库，预测到许多顺式作用元件（图3-13）。发现了几个关于氧化应激和炎症反应的转录结合位点（Wanetal.,2012），如HSF、AP-1、CREB、核因子κB（NFκB）。所以估测AccMsrB基因不仅参与环境应激响应而且与对病原微生物的侵染和铁转运具有作用。图3-4AccMsrB调控区域的核苷酸序列及预测的顺式作用元件翻译和转录起始位点用箭头标记，順式作用元件均用黑色阴影或黑框标出。这些预测的转录因子结合位点的模型序列相似度大于90%。Fig.3-4Thenucleotidesequenceandputativecis-actingelementsoftheAccMsrBregulatoryregionThetranslationandtranscriptionstartsitesaremarkedwitharrows.Thecis-actingelementsareshadedinblackorboxed.Atleast90%matrixsimilaritywereallowedintheidentificationofputativetranscriptionfactorbindingsites.42 山东农业大学博士学位论文3.1.4AccMsrB的表达特性分析3.1.4.1AccMsrB基因表达的时间和空间特异性本研究利用qRT-PCR检测了AccMsrB基因在中蜂不同发育时期的表达特性。如图3-5A所示，在检测的1龄幼虫一直到15日龄成蜂阶段，AccMsrB基因的表达水平呈现波动状态，分别在L1、PP、A15达到各发育阶段表达高峰，同时三者又呈现明显的下降趋势，另在每个发育阶段中都呈现先下降后上升的态势；在幼虫阶段，1龄幼虫AccMsrB基因表达水平最高，2、3龄迅速下降，AccMsrB表达水平最低且无差异，在4、5龄逐渐上升，与之前有明显差异；蛹期基因表达水平与幼虫阶段相似，PP最高，Pw时下降明显，Pp和Pd阶段表达水平最低，且与Pw有明显差异，之后再Pdb阶段又恢复到Pw水平；在成蜂阶段，A15组AccMsrB表达水平明显高于A1组。在检测的成蜂组织中，AccMsrB基因在表皮的表达量最高，而在肌肉和中肠组织中的表达量是逐步减少的（图3-5B）。表皮是蜜蜂抵御外界环境因子的第一道防线，受到紫外线、外源性毒物的侵袭，是过氧化损伤高度敏感的组织，AccMsrB基因的高水平表达暗示着其可能具有抗氧化作用。为了探究性别对该基因是否有影响，采集了处女蜂王、产卵蜂王、工蜂及雄蜂进行分析，结果显示AccMsrB在处女蜂王中表达量明显高于其他三型蜂，猜测可能与蜜蜂体内的保幼激素有关。43 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-5AccMsrB在不同发育时期，组织及蜂型中的表达特性Fig.3-5ExpressionprofileofAccMsrBatdifferentdevelopmentalstages(A),indifferenttissues(B)andindifferentbeetypes(C)3.1.4.2AccMsrB在各非生物应激中的表达特性研究环境应激下AccMsrB的表达特性有助于更好地理解它的生物学功能。研究表明，MsrB的表达能够被温度、重金属及农药等因素诱导（AnandChoi2010,Kleinhenzetal.2003）。例如热、重金属和引起内分泌紊乱的化学物质可诱导鲍鱼MsrB的表达（Wanetal.,2009）；紫外线和农药可诱导蜜蜂MsrA的表达（Gongetal.,2011）。为了确定AccMsrB是否能够针对不同的非生物应激产生诱导表达，本研究利用qRT-PCR检测了ooooAccMsrB在不同温度（4C、16C、25C和42C）、紫外线、H2O2、重金属（CdCl2和HgCl2）和农药（百草枯、吡虫啉、三氟氯氰菊酯和辛硫磷）影响下的表达特性。如图3-6所示，各种温度、紫外线、H2O2、农药和CdCl2处理均能诱导AccMsrB的表达，但是辛硫磷却抑制了AccMsrB的表达，尽管它们的表达模式和诱导程度不尽相同，在整个处理时间内该基因也出现不同程度的波动。以上结果表明，AccMsrB能够响应多种非生物不利因素的应激，这对于蜜蜂的生存可能十分重要。44 山东农业大学博士学位论文图3-6AccMsrB在不同非生物应激条件下的表达特性3.1.4.3中华蜜蜂在非生物因素应激中体内的氧化状态为了确定不适宜温度、重金属、紫外线及部分农药等非生物因素对中蜂机体内氧化o状态的影响，本研究测定上述应激过程中蜜蜂体内H2O2的浓度。结果显示：所选42C、UV和高温能够增加体内H2O2的浓度，并在处理周期内保持在较高水平，因此，这些非生物因素对AccMsrB表达的诱导作用可能直接与H2O2的积累相关。但是辛硫磷在1h引起H2O2浓度上升后随即降低，没有保持在高水平位置，这也可能是辛硫磷没有引起AccMsrB高表达的原因（图3-7）。45 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-7非生物应激下中华蜜蜂体内氧化状态的测定o（A、B）分别为在42C及紫外线处理后成蜂体内H2O2浓度；（C、D）分别为饲喂农药后，成蜂体内H2O2浓度。Fig.3-7Thedetectionofoxidantstatusinvivoundervariousstressorso(A,B)Theeffectof42CandUVstressonH2O2concentration,intheadults,respectively.(C,D)TheeffectofpesticidestressonH2O2concentration,intheadults,respectively.3.1.5AccMsrB重组蛋白诱导表达及抗体检测3.1.5.1AccMsrB重组蛋白诱导表达为进一步探究AccMsrB的酶学特性，本研究构建了原核表达载体pET-30a（+）-AccMsrB并成功诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE结果显示（图3-8），该蛋白分子量约为16kDa，这与网站预测的分子量15.5kDa基本一致。纯化AccMsrB蛋白经佐剂处理后免疫小鼠，制取了AccMsrB的多克隆抗体。46 山东农业大学博士学位论文图3-8AccMsrB的表达和纯化SDS-PAGE分析是用来分离在大肠杆菌BL21细胞中表达的重组蛋白AccMsrB。泳道1为过表达的空载体对照；泳道2诱导后的过表达重组蛋白，泳道3是低分子量蛋白标志物，泳道4和5分别为过表达重组蛋白破碎后的沉淀和上清，泳道6-10为纯化的重组蛋白。Fig.3-8ExpressionandpurificationofAccMsrBSDS-PAGEanalyseswereusedtoseparaterecombinantAccMsrBexpressedinE.coliBL21cells.Lane,inducedoverexpressionofpET-30a(+)inBL21;Lane2,inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccMsrBinBL21;Lane3,low-molecule-weightproteinmarker;Lane4andlane5,inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccMsrBinBL21,pelletandsuspensionofsonicatedrecombinantAccMsrB,respectively.Lane6-10,purifiedrecombinantAccMsrB.3.1.5.2AccMsrB多克隆抗体的检测为了检测抗体的特异性程度，本研究倍比稀释法进行了血清ELISA检测，结果发现AccMsrB抗体与AccMsrB蛋白的结合反应随着抗体浓度的降低而颜色逐渐变弱，OD值也相应减小，同时，1∶32000稀释后OD值仍然大于1（表3-2）。利用抗体进行倍比稀释检测，反应亦呈阳性，表明抗体特异性较好（表3-3）。表3-2血清ELISA检测结果Table3-2.Analysisofanti-AccMsrBserumspecificitybyELISA血清稀释倍数空白对照1:10001:40001:160001:32000OD值0.0680.0673.1093.1722.8781.878表3-3抗体特异性ELISA检测结果（μg/ml）Table3-3Analysisofanti-AccMsrBspecificitybyELISA抗体浓度10.250.1250.06250.032OD值3.2793.1733.1353.1692.96347 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析3.1.6AccMsrB蛋白在蜜蜂组织内的定位由前述结果可知，AccMsrB表达量在1龄幼虫期最高，预蛹期表达量次之，再就是在15日龄成蜂时表达量较高。为了进一步研究其蛋白水平的特征，本研究分离了15龄成蜂的中肠、头部及体壁，并在实验室制备了石蜡冷冻切片，进行了免疫组化分析。相关结果证明，AccMsrB在肠道、体壁表层及眼部周围组织有分布。此外，AccMsrB还在腹部细胞，在腹腔壁上也检测到阳性反应（图3-9）。上述结果表明，AccMsrB往往在变态发育的节点时刻表达上调，可能在蜜蜂的生长发育中具有重要作用，在肠壁、眼部及体壁中定位，可能与蜜蜂的机体防御及视觉传递中有关。图3-9免疫组织化学分析AccMsrB在成蜂中的分布阳性反应存在于肠壁、眼部及体壁。Fig.3-9ImmunohistochemicallocalizationofAccMsrBinthehoneybeeadultsAccMsrBwasdetectedinthemidgut,thesurroundingoftheeyeandbodywall.3.2中华蜜蜂AccTf基因的分子特性及功能分析3.2.1中华蜜蜂AccTf基因cDNA全长的获得及序列分析利用前述AccMsrB基因克隆的方法，获得AccTf基因cDNA全长（图3-10）。序列分析表明：AccTf基因（GenBank注册号：JF330111.1）cDNA全长2346bp，包括一个74bp的5"UTR、2139bp的ORF及133bp的3"UTR。该开放阅读框编码一个由712个氨基酸的肽链，其PI为7.07，预测分子量为78.6kDa。48 山东农业大学博士学位论文图3-10AccTf基因的全长cDNA及蛋白质序列Fig.3-10Thefull-lengthcDNAandproteinsequencesoftheAccAccTfgene3.2.2中华蜜蜂AccTf蛋白一级结构分析序列多重比对发现，AccTf与其他昆虫Tfs具有71-99%的序列同源性，这些Tfs包括：意大利蜜蜂Tf（A.mellifera，AmTf）、大蜜蜂Tf（A.florae，AdTf）、熊蜂Tf（B.impatiens，BiTf）、苜蓿切叶蜂Tf（Megachilerotundata，MrTf），表明Tfs在膜翅目昆虫中有高度的49 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析保守性（图3-12A）。而且，AccsTf具有昆虫Tf家族的典型特征：仅在N-端包含保守的铁结合位点（Calmettesetal.,2012），这些氨基酸残基位置及数量一致，具有26个氨基酸残基的信号肽（图3-11）。这些分析表明AccTf属于典型的转铁蛋白家族。本研究还构建了不同昆虫Tfs同源进化树以探究昆虫Tfs的进化关系（图3-12B）。在已检测的四种昆虫物种Tfs中，AccTf归属于膜翅目类，且与意大利蜜蜂转铁蛋白AmTf同源性高达99%（Kurzik-DumkeandLohmann,1995），推断两者为同源基因，故命名其为AccTf。本研究利用I-TASSER还预测了AccTf的三级结构（图3-12C）。由图可知，AccTf三级结构分为明显的N-和C-端，中间由短肽连接。蛋白中的铁结合位点通过α螺旋和β折叠等方式紧凑成为铁结合中心。图3-11中蜂转铁蛋白信号肽示意图Fig.3-11ThesignalpeptideofAccTf50 山东农业大学博士学位论文图3-12AccTf的分子特性（A）AccTf与其他Tfs的氨基酸序列比对。预测的二级结构已标示。相同的氨基酸序列用黑色表示。保守半胱氨酸及铁结合位点分别用黑色实心圆点和星号标出，N-末端和C-末端已标示。（B）基于氨基酸序列的不同昆虫物种Tfs的进化关系。AccTf用黑框标出。（C）AccTfs的三级结构。推测的铁结合位点。Fig.3-12MolecularpropertiesofAccTf(A)TheaminoacidsequencealignmentofAccTfandotherTfs.TheputativesecondarystructureofAccTfisshown.Identicalaminoacidsareshadedinblack.TheconservativeCysandironbindingsitesaredenotedby·and★,N-terminus,andC-terminusareshownbyarrowmarks.(B)PhylogeneticrelationshipsonthebasisoftheaminoacidsequencesbetweenTfsfromdifferentinsectspecies.TheAccTfisboxed.(C)ThetertiarystructureofAccTf.Theironbindingsitesresidues.51 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析3.2.3AccTf基因组结构分析为进一步明确AccTf的基因组结构，本研究以中蜂基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得该基因组DNA全长序列。结果发现AccTf基因有8个内含子，9个外显子。将AccTf的基因组与已知基因组序列且同源性较高的意大利蜜蜂（NM_001011572.1）、大蜜蜂（XM_006608128.1）、欧洲熊蜂（XM_003401163.1）、苜蓿切叶蜂（XM_003705925.1）、Bombusimpatiens（XM_003486864.1）进行比对后发现：中蜂与意大利蜜蜂基因组结构最为接近，内含子与外显子数量一致，而且基因组大小接近。大蜜蜂与中蜂外显子大小接近，仅最后一个内含子差别较大。苜蓿切叶蜂则少一个外显子和内含子，熊蜂属两物种间较接近，普遍内含子较大，但是这些物种mRNA大小则相差不大（图3-13）。图3-13转铁蛋白基因组结构示意图中华蜜蜂（JF330111.1）、意大利蜜蜂（NM_001011572.1）、大蜜蜂（XM_006608128.1）、欧洲熊蜂（XM_003401163.1）、苜蓿切叶蜂（XM_003705925.1）、Bombusimpatiens（XM_003486864.1）.Tf基因组DNA长度根据下面比例尺确定。Fig.3-13SchematicrepresentationofthegenomicstructuresofTfsThelengthsofgenomicDNAfromAccTf(JF330111.1),AmTf(NM_001011572.1),AdTf(XM_006608128.1),BtTF(XM_003401163.1),MrTf(XM_003705925.1),BiTf(XM_003486864.1)areshownaccordingtothescalebelow.3.2.4AccTf启动子序列的分离及顺式作用元件的预测为明确AccTf基因的完整序列，查看其启动子区域中的特殊调控元件，本研究克隆了起始密码子上游的一段长度为2075bp的5′UTR（KF150016）。利用MatInspector数据库，预测到许多顺式作用元件（图3-14）。发现了几个关于氧化应激和炎症反应的转录结合位点（Wanetal.,2012），如HSF、AP-1、CREB、核因子κB（NFκB）。所以估测52 山东农业大学博士学位论文AccTf基因不仅参与环境应激响应而且与对病原微生物的侵染和铁转运具有作用。图3-14AccTf启动子及预测的反应元件Fig.3-14Thenucleotidesequenceandputativecis-actingelementsoftheAccTfregulatoryregion3.2.5AccTf的表达特性分析3.2.5.1AccTf基因表达的时间和空间特异性本研究利用qRT-PCR的方法探究了AccTf基因在中蜂各发育阶段、多种组织及在不同性别中蜂中的表达情况。如图3-15A所示AccTf基因在卵到20日龄成蜂的发育过程中除卵期外均被检测到，表达水平整体较为稳定，在4龄幼虫期表达量明显高于其他时期。另外，L1时也与其他龄幼虫表达量具有统计学差异。在蛹期表达量稳定，只是在Pp期表达量较高，是整个发育过程中第二高水平。除卵期未发现AccTf表达外，发育过程中表达水平最低出现在10日龄成蜂。在成蜂多组织检测时，AccTf基因在脂肪体中的表达水平最高，另外在中肠及肌肉中几乎未检测到AccTf的表达（图3-15B）。脂肪体是AccTf基因的主要生成部位，与之前的研究一致（doNascimentoetal.,2004）。各型蜂中，AccTf在处女蜂王中表达量最高，工蜂次之，在雄蜂中表达量最低。53 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-15qRT-PCR分析确定AccTf的表达模式不同发育时期（A）、不同组织中（B）及不同性别蜜蜂中（C）AccTf的表达模式。BR表示脑，HE表示血淋巴，FB表示脂肪体，RE表示直肠，MS表示肌肉，MG表示中肠。Fig.3-15ExpressionprofileofAccTfasdeterminedbyqRT-PCRTherelativeexpressionofAccTfatdifferentdevelopmentalstages(A)，indifferenttissues(B)andindifferentbeetypeswereshown.(C)BR:brain,HE:hemolymph，FB：fatbody，RE：rectum，MS:muscle,MG:midgut.3.2.5.2AccTf在不同非生物应激下的表达特性研究环境应激下AccTf的表达特性有助于更好地理解它的生物学功能。研究表明，Tf的表达能够被温度诱导（AnandChoi2010,Kleinhenzetal.2003），能够在早春和晚秋进行采集活动，说明中蜂能够更好的耐受低温环境。为了确定AccTf是否能够针对不ooo同的温度产生诱导表达，本研究利用qRT-PCR检测了AccTf在4C、16C、25C和o42C时的反应（如图3-16），在各种非适宜温度下，AccTf的表达均被诱导，表达水平o分别在1、1.5、0.5和3h达到最高。在16和42C环境中，AccTf在整个处理期中表达o量高于对照组，该基因处于被诱导状态。在4和25C环境中，AccTf均在短时间（0.25和0.5h）内被诱导高表达，同时开始下降，2h时恢复到未被诱导的水平。54 山东农业大学博士学位论文oooo图3-16AccTf在4C、16C、25C和42C时的表达特性ooooFig.3-16ExpressionprofileofAccTfunder4C、16C、25Cand42C按照前述结果，除温度外，H2O2、紫外线和重金属也能引起蜜蜂机体内活性氧的增加，为了检验AccTf的抵御氧化应激的特性，本研究开展了此类因素对AccTf的影响的实验。结果如下：H2O2、紫外线和HgCl2分别引起了AccTf的表达量上升，并分别在0.5、4和1h时达到最高，并且AccTf在整个处理期内均被诱导保持较高的表达量，与前述的蜜蜂体内的代表氧化状态的H2O2浓度保持一致的趋势，表明AccTf的表达水平受到蜜蜂机体内活性氧的诱导（图3-17）。在进行FeCl3处理后，AccTf的表达量在2h时即被诱导，表达量达到最高，之后回落到对照组水平。这与先前的报道相似（doNascimentoetal.,2004,Wangetal.,2009）。55 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-17AccTf在H2O2、紫外线、FeCl3和HgCl2下的表达特性Fig.3-17ExpressionprofileofAccTfunderH2O2andUV(C),FeCl3andHgCl2农药是威胁蜜蜂采集行为的重要因素，当今使用最多的是杀虫剂和除草剂，我们选择了几种常用的农药种类（百草枯、吡虫啉、三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯）查看他们对蜜蜂AccTf的影响。如图3-17所示，四种农药均能诱导AccTf的表达水平升高。AccTf的表达量分别在0.25、1、025及0.5h时达到最高水平。其中吡虫啉和百草枯几乎在整个处理过程中保持高表达状态，三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯则在短时间内引起AccTf的高表达，之后AccTf又恢复到初始水平。以上结果表明，AccTf能够响应多种非生物不利因素的应激，这对于蜜蜂的生存可能十分重要。56 山东农业大学博士学位论文图3-18AccTf在百草枯、吡虫啉、三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯处理时的表达特性Fig.3-18ExpressionprofileofAccTfunderdifferentpesticides3.2.6AccTf重组蛋白诱导表达及抗体检测为进一步探究AccTf的酶学特性，本研究构建了真核表达载体pET-30a（+）-AccTf并成功诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE结果显示，该AccTf蛋白的分子量约为70kDa，TM这与预测分子量72kDa基本一致。可溶的重组蛋白利用HisTrapFF柱进一步纯化，最后得到浓度为3mg/L的AccTf蛋白（图3-19）。纯化蛋白经佐剂处理后免疫兔子，制取了AccTf的多克隆抗体。对抗体进行内源检测，发现能够良好的结合，并筛选出合适的蛋白浓度进行Westonblot及免疫组织化学实验。57 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-19AccTf纯化及内源蛋白检测Fig.3-19Purificationanddetectbywestenblot为了检测抗体的特异性程度，本研究倍比稀释法进行了血清ELISA检测，结果发现AccTf抗血清与AccTf蛋白的结合反应随着稀释倍数增加而颜色逐渐变弱，OD值也相应减小，同时，1∶32000稀释后OD值仍然大于1（表3-4），利用抗体同样进行倍比检测，稀释到0.032μg/ml时，仍然呈阳性，表明抗体特异性较好（表3-5）。表3-4血清ELISA检测结果Table3-4.Analysisofanti-AccTfserumspecificitybyELISA血清稀释倍数空白对照1:10001:40001:160001:32000OD值0.0540.0613.2143.1282.2701.627表3-5抗体特异性ELISA检测结果（μg/ml）Table3-5Analysisofanti-AccTfspecificitybyELISA抗体浓度10.250.1250.06250.032OD值3.1583.1333.0223.0752.4793.3中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因的分子特性和在氧化应激中的保护效应3.3.1中华蜜蜂AccFTH及AccFTL基因cDNA全长的获取及分析从GenBank上已查询得到多种相近物种AccFTH及AccFTL基因，对其核苷酸序列58 山东农业大学博士学位论文进行比对，找到其保守序列，设计同源性引物FTH1及FTH2、FTL1FTL2（表2-.3），以反转录获得的产物为扩增模板，进行RT-PCR扩增，以得到铁蛋白重链和轻链亚基的中间保守序列；再根据扩增得到的保守序列设计引物5P1/5P2和3P1/3P2，分别与5"RACE公共引物AAP/AUAP和3"RACE公共引物B26/B25配对使用，进行RACE-PCR；最后拼接扩增得到的三段序列，得到铁蛋白重链和轻链亚基的的cDNA序列，再根据全长序列特定引物FP1和FP2，扩增全长序列以验证拼接序列的正确性。序列分析表明：AccFTH及AccFTL基因（GenBank注册号：JF330112.1和JF340051.1）cDNA全长分别为1028及1018bp，其中5′UTR分别为219和274bp，3′UTR分别为134和90bp，ORF分别为：675和654bp，编码包含219和218个氨基酸残基的多肽，分子量分别为25.5及25.2kDa，等电点分别为6.25及6.52。另外，FTH的5′UTR序列中存在一个保守的茎环结构，其序列为5′-CAGTGT-3′，在其上游存在一个保守的C残基，构成了特殊的铁反应元件的保守序列（HendersonandKühn,1997,RouaultandKlausner,1997）。相反，在其他昆虫FTL一样，AccFTL中并没有发现IRE的序列（Kimetal.,2004）（图3-20）。59 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-20AccFTH及AccFTL基因的全长cDNA序列及蛋白质序列氨基酸残基以单个字母表示，起始密码子ATG和终止密码子TAA用下划线标出，星号（*）指示TAA。Fig.3-20Thefull-lengthcDNAandproteinsequencesofAccFTHandAccFTLgeneTheaminoacidresiduesareindicatedbyasinglelettercode.Apotentialtranslationstartcodon(ATG)andastopcodon(TAA)areshaded.ThestopcodonTAAwasdenotedbyasterisk.60 山东农业大学博士学位论文图3-21.中华蜜蜂IRE与共有系列结构比较Fig3-21.ComparionoftheputativeIREfromA.ceranaFTHandIREconsensusstructure.3.3.2中华蜜蜂AccFTH及AccFTL蛋白一级结构分析利用DNAman软件比对了来自不同昆虫的FTH及FTL蛋白的一级结构，结果发现：AccFTH及AccFTL与已知小蜜蜂FTH及FTL（Apisflorae，AfFTH及AfFTL）、大蜜蜂FTH及FTL（Apisdorsata，AdFTH及AfFTL）、欧洲熊蜂FTH及FTL（Bombusterrestris，BtFTH及AfFTL）及意大利蜜蜂FTH及FTL（A.mellifera，AmFTH及AfFTL）序列相似性较高。其中AccFTH与四种FTH的序列相似性达到70.27%，AccFTH与大蜜蜂相似性最高（97.32%），小蜜蜂次之（79.13%）。氨基酸序列中含有一个信号肽（1-20）（图3-22）。构成铁氧化中心的7个氨基酸残基在序列中发现并用星号标出（Wangetal.,2009）。此外，三个保守的半胱氨酸用实心圆点标出（图3-23）。AccFTL与四种FTLs进行序列比对，结果显示，AccFTL与他们具有具有85.91%的相似性，其与西方蜜蜂的相似性最高（98.62%），小蜜蜂次之（96.31%）。在FTL氨基酸序列中发现一个信号肽（1-16）（图3-22）及一个糖基化位点（N-E-F）（Kimetal.,2004）。这些保守序列表明了AccFTH及AccFTL属于典型的Ferritin家族成员（Andrewsetal.,1992,Georgievaetal.,2002,Arosioetal.,2009）。为进一步研究AccFTH及AccFTL与其他昆虫Ferritins间的亲缘进化关系，本研究利用多种昆虫Ferritins，使用相关软件构建了同源进化树（图3-23B），两个亚基均与意大利蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂等种属关系较近的物种接近，参照西方蜜蜂AmFTH及AmFTL，故而命名为AccFTH及AccFTL。61 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析表3-2中华蜜蜂铁蛋白亚基特征Table3-2FeaturesofA.ceranaferritinsubunits物种亚基成熟肽分子量铁氧化中心信号肽IRE糖基化位点FTH25.5kDa+++-A.ceranaFTL25.2kDa-+-+图3-22AccFTH信号肽示意图Fig.3-22ThesignalpeptideofAccFTH图3-23AccFTL信号肽示意图Fig.3-23ThesignalpeptideofAccFTL62 山东农业大学博士学位论文图3-24AccFTH及AccFTL的分子特性（A）AccFTH及AccFTL与其他昆虫铁蛋白重链及轻链的氨基酸序列比对。预测的二级结构已标示。保守的氨基酸残基圆点及星号标出，（B）不同昆虫物种FTH及（C）FTL的进化关系。Fig.3-24MolecularpropertiesofAccFTH及AccFTLHomologycomparisonandphylogeneticanalysisofAccFTHandAccFTLandFerritins.A:AlignmentofthededucedAccFTHandAccFTLproteinsequencewithotherknowninsectFerritins.B:PhylogeneticanalysisofFTHand(C)FTLfromdifferentspecies.TheaminoacidsequencesofFerritinswereallobtainedfromNCBI.3.3.3AccFTH及AccFTL基因组结构分析为进一步分析AccFTH及AccFTL基因的特性，通过PCR扩增，得到了AccFTH及AccFTL基因组DNA全长序列。AccFTH的典型特征就是第一个内含子较大，其外显子数量及大小均相似。其中内含子富含AT且具有典型的5′-GT剪切供体和AG-3′剪切受体位点。AccFTL基因组与其他物种的铁蛋白轻链结构相似，均包括3个外显子和2个内含子（图3-25）。63 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析图3-25AccFTH及AccFTL基因组结构中华蜜蜂、小蜜蜂、大蜜蜂、欧洲熊蜂和意大利蜜蜂基因组DNA中外显子和内含子长度根据下面比例尺确定。外显子和内含子分别用（）和（）标出。Fig.3-25GenemicstructureoftheAccFTHandAccFTLgenesSchematicrepresentationoftheDNAstructures.LengthoftheexonsandintronsofgenomicDNAwereindicatedaccordingtothescalebelow.Theexonsandintronswereshownwith()and(),respectively.3.3.4AccFTH及AccFTL基因启动子序列的分离及顺式作用元件的预测为明确AccFTH及AccFTL基因调控区域的构成，本研究分离了5′侧翼序列。利用MatInspector数据库，预测到许多顺式作用元件（图3-26/图3-27）。除了与胚胎或组织发育有关的一些元件：Dfd及CdxA之外（Ericssonetal.,2006;Rørth,1994;Stanojevićetal.,1989;Yuetal.,2011），几个涉及环境应激和免疫响应的转录因子结合位点也被发现（Wanetal.,2012）。如HSF、CREB及核因子κB（NFκB）。另外，还发现GATA模序，其参与了内胚层发育及晚期分化为内皮细胞的基因表达（Burmeisteretal.,2008）；一个核转录因子（Nrf2），它是调控一系列应激反应关键基因表达的总开关，可增强细胞对亲电子毒物或活性氧族/活性氮族（ROS/RNS）的防御能力（HayesandMcMahon,2009）。据此我们推测AccFTH及AccFTL基因不仅参与环境应激响应而且涉及发育调节。64 山东农业大学博±学位论文Ｇ了ＧＣ了則ＧＧＣＴＭＡＣＴＴＧＣＭＡＴＴＣＡＴＴＣＡＭＴＣＴＡＭＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＧＭＭＡＡＴＡＴＧＭＡＴＴＡＧ王ＸＦＤＣｄｘＡ１＿ＡＡＴＡ了ＴＴＣＴＩＴＹＴＴＡＴＴＣＴＴ冉ＴＡＴ了丽子带ＣＡＧＧＡＧ子ＡＡ＾Ｃ了ＴＴＧＧ了了Ｃ了了ＣｄｘＡＧ了ＣＣＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＡＣＣ＆ＣＣＴＣＧＴ牺玩品张ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＣＭＴＣＴＣＣＣＡＣＡ了ＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＧＡＴＡＴＭＴＴＴＣＴＴＡＭＴＣＣＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＭＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＭＧＴＡＧＡＣＰｂｘｌ悟重威姐姑浊＆ＴＣＧＡＡＭＣＴＧＴＡＴＴＣＭＴＡＴＴＡＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＡＡＧＡＴＴＧＭ＆ＡＧＧＴＡＣＴＭＡ？ＩＧ了ＴＣＡＴ；ＧＭ靈了ＴＣＣＡＴＡ了ＧＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴ城Ｔ了ＣＡＡ了其ＣＣ了ＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＭＡＴＡＴＴＣ了ＧＴＡＴＡＴＣｔｉｘＡＨＦＨ７■：了了专磕疏？Ｓ牺啦ＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡ了Ｔ了Ｔ了ＴＡＡＧＡＡＴＡＡ；＾了ＴＴｆ＾ｇｒＣＴＡＡＡＡＴＡ了ＴＡＡＡＴ贈ＸＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＡＣＡＭＣＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＰＦ只ＰＭＴＧＣＭＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＹＧＣＣＡＭＭＴＡＴＧＭＯｉＭＴＡＴＴＣＣＡＡＡＧａＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＭＡＣＡＡ了Ａ站ＴＡＡＭＴＭＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡＡ了ＧＡＡＴＡＣ了ＴＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡ了占Ｃ了ＴＡＣ＆ＴＴＭＴＴＯＴ了ＰｂｘｌＡ乐Ｃ品而ＡａＫｔＡＡ子ＡＴＡｍＭＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＴＡＡＡ雷ＴＴＡＡＣＭＡＴＴＭＣＴＴＭＡＴＡＴ了子ＭＣＡ了ＴＰｂｘｌＣｄｘＡＡＴＣ了ＡＡＡＡＴＴＭＴＡＴＴＡＧｒ■ｒＭＴＭＴＡＡＴｆｅｉＴ６凉Ｉ贡衍ＴＴＭＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＡ巧ＴＴＡＡ了ＡＣＭＴ了ＣＧＴＴＡＧＴＡＭＡＭ了ＭＴＡ了ＴＴ了ＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＡ了ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＭＴＭＴＭＴ了：ＭＡＣｄｘＡ：ＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡｆｉＡＴＡＡＣＡｆＧＴＡＣＭＴＴＧＴＴＴＹＣＡＴＡＴＴｒＡＴＡＡＭＡＴＧＴＡＴＴＡＡＡＯＴＡＧＴＡＡａ＾ＧＡＡＡｌｐＣＧＡＡＴＡＡＡＡＡＭＡＡＴＧＡＡＭＴＯＶＴＴＴＡＡＭＧＴＴＡＡＡＭＡＡＴＴＭＴＡＴＭＡＴＴＡＡＧＡＣ了ＣＡＴＴＭＴＡＴＡＡＡ：ＡＡＡＭＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＣＡＭＧＡＡＡＭＴＴＧＡＴＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＥＳ＾＾＾ＨｆｇＧＴＭＴ了ＴＣＡ了卿ＡＡＴＧＡＭＴＡＣＧＣＡＡＴＡＴ了ｒＴＡＣＡＴＣＭＡＴＭＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴ了ＴＡＡＴＡＭＡＭＡ習ＡＴ了Ｃ了ｒＣＧＯｙｉＣ了ＧＴＡＴＴＡＡＴＣＴ了ＣＴＡＴＴＴ継乎ＡＡＣ了ＡＡ了ＡＧＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ＇了Ｔ其ＪＵＶＴＴＭＣＣＡＩＴＡＴ腹ＣｍＣＴＡＡＭＣＧＡＴＧＴＡｍＡＴＴ了ＡＡＧＧＧＡＡＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＴＡＣＴＣ了ＣＧＴＴ子ＣＧ＆ＣＧＴ了ＣＭＣＧ£ＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＯＴＣＧＴＴＧＧｒＡＧＴＴＴＴＣＡＣＧＭＣＴＣ？Ｇ：ＣＡＯＴＯＴＣＭＴＭ：ｒｍｖＧＡＴＡＧＧＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡｍＧＡＡＭＴＴＣＣｈＧＴＴＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＡＴＴＡＡＡＧＴＡＣｂｘＰｌＲＳＦ，祇ＧＭ了ＧＴＡＣＡ了ＴＴＧＳＴ啦ＴＣＡＡＴＴＭｆｒＡＡＡＴＧＡＴＣＧ郎祐ＴＣＧＴＡＣＡＴＴＡＴＡ了Ｔ了ＡＧＴ了ＴｌＣＡＰＩＲＥＴＡＴＡｂｏｘ－祀巧ＣＴＴＡＴＣＴＡＧＣ了ＴＣＡＴＴＡＡｊｊ既庶ｔ了庶公扣述ＴＴＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧ站ＭＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣ＾ｒＣ円Ｃ铺ＡＴＴ甲Ｔ臟Ａ了Ａ馳ＧＣＴ了了了ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＡ了ＴＡＡＴｊ淚飼ＡＡＧＣＴＡ〔了ＴＴＡＴｉ＞ｒｔｉ＾ｓ［ａＨｏｎｓｔａｒｔｓｆｉｅＩＧＴ了ＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧ了ｒｒＴＣＧＴＴＴＡＣＡＴＣＭＴＧＧＡＴＣＡ了ＴＡＧＧＡＭＴＧＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡ了３－２６图ＡｉＴ抒ｒｃ调控区域的核昔酸序列及预测的顺式作用元件翻译和转录起始位点用箭头标巧。，嘱式作用元件均用黑色阴影或黑框标出这些预测的转录因子结合位点的模型序列相似度大于９０％。Ｆ－－ｉ．３２６ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｅｎｃｅａｎｄｔａｔｉｖｅｃｆｓａｃｔｔｎｄｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＡｃｃＦＴＨｒｅｕａｏｒｒｅｏｎｇｑｕｐｕｇｇｌｔｙｉｇ－Ｔｈｅｔｒａｎｓ．ｄｈａｄｉｂｌａｃｋｏｒｌａｔｉｃ打抑ｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅｓａｒｅｍａｒｋｅｄｗｉｔｈａｒｒｏｗｓＴｈｅｃ？打ａｃｔｉｎｇｅｍｅｎ校ａｒｅｓｅｄｎｂｏｘｅｄｔｌ９ｉｉ．Ａｅａｓｔ０％ｍａｔｒｉｘｓｍ巧ａｒｌｙ．６５ 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚飘还原酶Ｂ基因的生物学功能分析Ｇ了ＡＣ〔ＧＧＣＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＧＴＸＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＩ＊ＴＧＡＡＧＡＴＡＴＧ了了ＧＡＡＴＡＴＴＧ了ＡＧＴＴＴＴＣＴＣｄｘＡＴ了了了Ａ乎ＡＴＴＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＡＴ了了ＴＣ了ＡＴＡＡＣＡＴＡ了ＡＴ了ＧＣＴＴＧＧＡＴＴ义Ｔ了ＣＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣ了ＣＴＡＧＡＣＣＡＴＡＣＧＴＴＴＴＭＴＡＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴ了了了Ｇ了ＴＡＡＴＡＡＴＴＣＧ了了ＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴ了了了ＴＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧ了了了ＡＭＡＴＴＡＴ了ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＲＥＬＰｂｘｌ■Ａ了ＣＣＡＡＴＴ了ＣｌＧＧＡＡｉＴＴＣＣＡｔ＾ＣＡ了了Ｔ了了ＴＡＴＣ了ＴＡ了ＡＴＧＡＣ了ＧＡＴＡＴＡＴＴＡＴｉ＾＾ＡＡＴＡＡ＾ＧＴＡＡＡＣ了Ｇｊ了了ＴＡＡ了Ｇ了ＧＡＴＡＡＡ了〔ＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡ了了ＣＧＡＡ子ＡＣＡＧ了Ｔ了ＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＡＴ了ＧＴＣ了ＴＡＣＡＣＴＡＡＡＡＡ了了ＡＴＡＴ了ＴＡＴＡ了了了ＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡ了ＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴ了ＴＴＣ了Ｔ了了ＧＣＡＡ了了ＡＣＡ了ＧＣＡＡＴＴＣＴＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡ了ＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡ了ＴＴＡＴＡＴＡ了ＴＧＡＡＡＴＡＡＴ了ＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡ了ＡＴＣＴＡＴＡＡＴＣ了ＣＧＧＡ＊ＩＣＡ了了ＧＡＴＡＴ了ＴＡ了了ＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴ了ＡＴＴ了〔ＴＡＡＣＡＴＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＴ了ＴＧ了ＴＡＴＧ了了ＴＡＡ了ＡＴＡＴＣＧＣＧＡＡＴ了ＧＡＣＧＡＴＡＴＡ了了ＣＡＴＴＣ了ＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＡＴ了ＡＴＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＰｂｘｌＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡ了ＴＡＭａＴＴＡＡＴＡＡＡｔＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＴＣＩＩＧＡＴＡ３＾，心ＡＡ了Ｇ了Ｃ了了ＴＧＡＴＡＴＣ了ＣＴ了ＣＴＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧ＾ＡＡＴ了了Ａ了了Ｔ吩ＧＡＴＧｃＲａＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＡ了ＧＣＴＡＡＣＣ了ＣＡＴＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＴ了ＣＡＧＡＡＴＡＡＡＴＡＴ了ＧＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＳＯＸ５ＡＴＧＡＡＣＴ了ＡＣＡＴＧＡＴＣＴ了ＧＴＴＧＣＡＣＴＡＴＣＡＴＴ了ＣＣＴＡＡＴＧＡ了ＣＣＡＴＴＧ？＾ＴＧＴＡＡＡＣａ？ＡＡＡＣＡＡｆＭｆｅＡＡＣｄｘＡＧＡＡＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＣＴＵＣＡ砸Ｔ可ＡＡ了ＡＡＴＴＡＴ了ＴＡ了了ＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＭＴ了ＴＡＡＡＡＴ了ＣＧＣＧＡＧＡＧ了ＧＯＴＴ了ＴＡＡＴＴ了了ＣＣＣ了ＧＴ了了ＣＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣ了ＴＴＡＴＡＣＡＣＡＣ了ＧＧＴＡＴＡＧＡＡＧＧＣ了ＧＣ了ＴＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＰｂｘｌＴＡＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡＡＡＴＡ了ＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＴＴＯＡＴＡＡＴＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＡ了ＧＴＡＣ｜｜ＡＴ了ＣＧＴＡＣ了了ＴＡＡ了〔ＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＡＡＣ了ＧＧＡＡＴ了了ＴＣＴＡＴ了ＣＣＣ了了了〔ＴＴＡ了ＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴ了ＴＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＣ了ＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＡＣＧＡＧＡＧＴＡ了ＴＣＡＣＧＴＴＡＣＴ了ＣＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡ了ＣＧＴＴＴ了ＡＧＴＡＡＧ了ＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣｄｘＡＴ了ＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＴ啸ＴＡＴＣＴＡＴＴＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡｉｒＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＡ了ＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧ了ＧＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴ了ＧＴＧＣＡＡＴＡＴＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＴＡ了ＣＡＡＴＣ了了ＴＣＴＴ了ＧＡ了ＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＣｄｘＡｒＨｖＡｉ［．｜‘ＴＴＴＴＴＡｊＡｉｒＡＡｆＴＣＴＴＡＩＡＴ寸ＴＡＴＡｆＴＴＡｆｌＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴ了ＴＴＣＡＴＴＴＩＴＴＴＴＡＴ了了Ｊｇ＾ＧＴＣＧＴ了了了了了ＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴ了ＧＴＡＣＡＴＧ了了ＡＴ了了ＡＡＡＡＴ了ＣＭＴ卻ｌ＾ｍＴＴＡ了了ＴＣＡＴＴ了Ｇ了Ｃ了ＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＣＡＴＡＧＡＡＡ了ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴ了了Ｔ了ＴＡＣＴＥＶＩｌＡＡＣＧＡＡＴＴＧＴＡＴＴ沁ＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡｇＶＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＣＴＡＡＴＡＴ了ＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＡＡＴＧ了ＴＡＡＡＴＡ了了ＴＡＡＧＴＴＡＡＴ了ＴＧ了ＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧ了了ＡＡ了了了ＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴ了ＴＡＡＴＴＧＧＳ８＇ＴＡｔａａａｔａａｘｔａａｔｊ．ｕａａｇｔａｔｇｔａａｔｃｔａｔａａｇｔａｔｔｃａｔｔａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａｔｔｔｔａｔｃｔａｔｔｇｔｔｔＩｃａＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＥＪＳｔＴＧ了ＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧＣＣ了ＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＩＴｒａｎｓｉｌａｔｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅ！图３－２７巧Ｘ调控区域的棱昔辕序列及预测的顺式作用元件翻译和转录起始位点用箭头标记，順式作用元件均用黑色阴影或黑框标出。这些预测的转录因子结合位点的模型序列相似度大于９０％。Ｆ－－ｉ昏３２７Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｕｔａｔｉｖｅｃｂａｃｔｉｎｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅ＞４ｃｃ＿Ｆ７Ｉｒｅｕｌａｔｏｒｒｅｉｏｎｑｐｇｇｙｇ－Ｔｈｅｔｒａｎｓ．ｌａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉ化ｓａｒｅｍａｒｋｅｄｗｉｔｈａｒｒｏｗｓＴｈｅｃ权ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ肚ｅｓｈａｄｅｄｉｎｂｌａｃｋｏｒｂｏｘｅｄ．Ａｔｌｅａｓｔ９０％ｍａｔｒｉｘｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．６６ 山东农业大学博士学位论文3.3.5AccFTH及AccFTL的表达特性分析3.3.5.1AccFTH及AccFTL基因表达的时间和空间特异性本研究利用qRT-PCR检测了AccFTH基因在中蜂不同发育时期的表达特性。如图3-27所示，在检测的卵期一直到20日龄成蜂阶段，AccFTH基因的表达水平仅在L4、Pp、Pd及A10阶段被检出，其他时期表达量几乎检测不到。其中在Pp时表达量最高，且明显高于其他可检测时间。10日龄成蜂体内AccFTH表达量仅次于Pp时期，之后分别是L4和A10阶段。铁蛋白重链与轻链在组织表达特性方面表现出统一性，均在中肠部位高表达，另外在脂肪体和肌肉中表达量较高，在血淋巴中表达量较低。可能是在中肠部位含有大量摄取的铁存在，预示着其与铁的摄取及转运有关。图3-28AccFTH及AccFTL在不同发育时期及不同组织部位的表达水平AccFTH在不同发育时期的表达水平（A）、AccFTH在不同组织中（B）及AccFTL在不同组织中（C）的表达模式。BR表示脑，HE表示血淋巴，FB表示脂肪体，RE表示直肠，MS表示肌肉，MG表示中肠。Fig.3-28ExpressionprofileofAccFTHandAccFTLatdifferentdevelopmentalstagesanddifferenttissueTherelativeexpressionofAccFTHandAccFTLatdifferentdevelopmentalstages(A)，AccFTHindifferenttissues(B)andAccFTLinindifferenttissueswereshown.(C)BR:brain,HE:hemolymph，FT：fatbody，MS:muscle,MG:midgut.Verticalbarsrepresentedthemean±S.E.M.(n=3).SignificantdifferencesacrossmRNAexpressionwereindicatedwithletters,asdeterminedbytheTukey-HSDtest(P<0.05).67 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析3.3.5.2AccFTH及AccFTL在不同非生物应激中的表达特性研究环境应激下AccTf的表达特性有助于更好地理解它的生物学功能。同上述，温度、紫外线灯能够引起蜜蜂体内处于氧化状态（Yanetal.,2014），铁蛋白能够在氧化应激时出现诱导反应。为了确定AccFTH是否能够针对不同的温度产生诱导表达，本研究oo利用qRT-PCR检测了AccTf在4C和42C时的反应（如图3-29），在各种非适宜温度下，AccFTH是表达均被抑制，没有出现被诱导高表达的情况。在H2O2和UV处理时，AccFTH的表达量被诱导，均在0.5h时达到最高表达水平，之后下降，在H2O2处理后期，甚至出现了低于对照组的情况。UV处理过程中，均处于高表达的状态。图3-29AccFTH在不同非生物应激条件下的表达特性oo这些条件包括：4C（A）、25C（B）、H2O2（2mM）（C）、紫外线（D）Fig.3-29ExpressionprofileofAccFTHunderdifferentabioticstressconditionsExpressionpatternsofAccFTHunderconditionsofdifferentenvironmentalstresses.AccFTHexpressionwasnormalisedtountreatedadultworkerbeeshousedat33°C.Theβ-actingenewasusedasaninternalcontrol.PanelsA–DooshowAccFTHexpressionin15daypost-emergenceadultworkershousedat4C,42C,H2O2(2mM)andUV.本研究选择了几种农药（溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、噻虫嗪和辛硫磷）查看他们对蜜蜂AccFTH的影响。如图3-30所示，溴氰菊酯和三氟氯氰菊酯均在整个过程中抑制了AccFTH的表达。噻虫嗪和辛硫磷则诱导AccFTH的表达量升高，但是分别在0.5和1h时表达量下降到对照组表达水平以下，之后高表达，均在2h时达到最高表达水平。68 山东农业大学博士学位论文图3-30AccFTH在不同非生物应激条件下的表达特性处理条件包括：溴氰菊酯（10μM）（A）、三氟氯氰菊酯（B）、噻虫嗪（C）、辛硫磷（D）Fig.3-30ExpressionprofileofAccFTHunderdifferentabioticstressconditionsExpressionpatternsofAccFTH及AccFTLunderconditionsofdifferentenvironmentalstresses.AccFTH.Expressionwasnormalisedtountreatedadultworkerbeeshousedat33°C.Theβ-actingenewasusedasaninternalcontrol.PanelsA–DshowAccFTHexpressionin15daypost-emergenceadultworkersexposedtodeltamethrin，cyhalothrin，thiamethoxamandphoximtreatments.Eachvalueisgivenasthemean(Kohgoetal.)ofthreereplicates.ThelettersonthebarrepresentasignificantdifferenceatP<0.05,asdeterminedbytheTukey-HSDtest.图3-31AccFTH在FeCl3处理后的表达特性Fig.3-31ExpressionprofileofAccFTHunderFeCl3Eachvalueisgivenasthemeanofthreereplicates.ThelettersonthebarrepresentasignificantdifferenceatP<0.05,asdeterminedbytheTukey-HSDtest.69 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析先前的多项研究均报道了铁蛋白结合铁的功能，本研究选择10日龄成蜂作为实验对象，饲喂FeCl3的糖溶液，之后每隔2h进行样品采集并检测其AccFTH的表达水平及蜜蜂血淋巴中的铁离子的浓度(图3-31)。结果显示，血淋巴中的铁离子浓度在饲喂后就出现了上升，4h达到最高值，之后逐渐下降。AccFTH的表达水平受到血淋巴中铁浓度的诱导，基本与铁离子浓度呈现一样的先上升后下降的趋势，在12h时又回升到对照组的表达水平。70 山东农业大学博士学位论文4讨论4.1AccMsrB基因在抗逆抗氧化中的重要作用蛋氨酸甲基亚砜还原酶（MsrBs）在还原蛋氨酸甲基亚砜、修复蛋氨酸氧化引起的蛋白损伤方面发挥重要作用（KimandGladyshev,2004c）。蛋氨酸甲基亚砜还原酶包含两类，分别为蛋氨酸甲基亚砜还原酶A和蛋氨酸甲基亚砜还原酶B，特异性地还原MetO-S和MetO-R（Weissbachetal.,2002），与一些人类疾病例如：风湿性关节炎、白内障等的发生有关、且广泛分布于多个物种（KimandGladyshev,2004b）。然而，目前有关MsrA的研究工作较多，MsrB，特别是蜜蜂MsrB的研究十分有限。为了探究MsrB在中蜂抗逆过程中的功能，本研究从中蜂中克隆了AccMsrB基因，并检测了其在蜜蜂变态发育过程中及在不同组织部位和不同型蜜蜂中的的表达规律，研究了不同氧化应激及多种农药刺激下的表达水平，我们还利用大肠杆菌进行表达纯化和制备抗体，观察了其在各组织中的定位情况。研究结果表明，AccMsrB在中华蜜蜂抵御氧化应激及农药刺激中发挥重要作用。4.1.1AccMsrB基因的序列分析本研究从中蜂中克隆到一个新的MsrB基因，并对其分子特性进行了初步探究。我们发现，与大多数物种的MsrBs序列相似性较高，AccMsrB在序列中存在此类酶中的保守的氨基酸结构域，例如CxxC，其半胱氨酸分别为Cys49,Cys64,Cys95和Cys98，在三级结构中经过α螺旋和β折叠紧靠在一起，形成了重要的锌结合位点（Kumaretal.,2002,Olryetal.,2005）。两个半胱氨酸为Cys64和Cys118，分别存在于GCGWP和RxCxN中，是公认的蛋氨酸甲基亚砜还原酶的重要酶活性位点（DosSantosetal.,2005,Rouhieretal.,2006,Sagheretal.,2006,Dingetal.,2007）。另外，在AccMsrB氨基酸序列中还发现了一个半胱氨酸（Cys34），这个氨基酸只在少数物种中存在，其作用尚未可知（Okeetal.,2009），表明不同物种中的MsrB可能具有不同的其他功能，但是还需要进行深入的研究。同样，在AccMsrB的聚类分析中发现，AccMsrB与意大利蜜蜂、熊蜂等相近物种的MsrBs亲缘关系较近，这些无疑都表明AccMsrB属于典型的蛋氨酸甲基亚砜还原酶B家族成员。71 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析4.1.2AccMsrB基因的时空表达特性分析在AccMsrB的5′侧翼区预测到许多与发育有关的转录因子结合位点，为了验证其与蜜蜂发育相关性，本研究分析了AccMsrB的阶段特异性。qRT-PCR结果表明AccMsrB在1龄幼虫期表达水平最高（图3-5A），另外在预蛹期及15日龄成蜂期表达量明显高于其他时期，这三个时期是蜜蜂变态发育过程中的重要节点，是蜜蜂形态变化的时期，其中蜜蜂在L1期从卵向幼虫变化，开始采食过程，可能受到更多的氧化应激（KrishnanandSehnal,2006）。此外，幼虫体内微粒体氧化酶活性开始升高，对不利环境更加敏感（GilbertandWilkinson,1975）。L1期AccMsrB高表达预示着其在蜜蜂早期发育中抵抗氧化损伤方面具有重要作用。PP是幼虫向蛹期转化的时期，之后处于非采食期，但是此时期是蜜蜂细胞分化，各种器官形成的时期，说明AccMsrB可能具有与蜜蜂变态发育有关。A15是蜜蜂刚刚出巢采集的时期，在此时期蜜蜂不可避免的遇到更多诸如紫外线、高低温农药等引起氧化应激的因素（Kottuparambiletal.,2012），引起蜜蜂体内氧化状态的提高，说明AccMsrB与蜜蜂抵御外界氧化应激有关。为了更好地理解AccMsrB的生物学功能，我们开展了它的组织特异性分析。实验表明，AccMsrB在表皮中表达量最高（图3-5B），肌肉组织中次之。表皮组织是蜜蜂机体抵御外界损伤的第一道防线，最先受到外源刺激，在抵御外界应激过程中具有重要作用（Gongetal.,2011）。先前的研究表明，MsrA在人类皮肤抵御UV等氧化应激中其重要作用（Ogawaetal.,2006），但是在本实验室的研究中，AccMsrA在表皮中表达量并不高，更多的在头部表达（Gongetal.,2011），表明AccMsrB更多在表皮中清除氧化应激产生的氧自由基。另外，肌肉组织是昆虫重要的运动组织，是昆虫飞行的动力来源，其耗氧量大，同样产生大量的氧自由基，在肌肉组织中高表达同样表明AccMsrB在清除氧自由基，修复由此造成的氧化损伤方面具有重要作用。为了分析性别对AccMsrB的影响，分析了三型蜂中AccMsrB的表达量，其中处女蜂王中表达量最高，其它诸如产卵蜂王、熊蜂与工蜂之间没有差异，考虑可能与蜜蜂体内投中激素有关，但是还需要更深入的研究。4.1.3AccMsrB基因的生物学功能分析此外，在AccMsrB的5′侧翼区还预测到几个氧化应激元件，如HSF和Dfd，暗示AccMsrB可能参与蜜蜂的氧化应激过程。qRT-PCR结果表明，在所检测的非生物应激中，72 山东农业大学博士学位论文除辛硫磷处理抑制AccMsrB的表达外，其他处理均上调了AccMsrB的表达（图3-7）。温度、H2O2、重金属、农药和紫外线均被证明可以诱导生物体产生氧化应激（Cove,1976,Lushchak,2011,Kottuparambiletal.,2012），我们也发现CdCl2可以诱导蜜蜂体内H2O2和丙二醛（MDA）积累。镉离子可通过消耗抗氧化物质，尤其是GSH，进而导致ROS的积累（Bagchietal.,2000,OhandLim,2006）。BEAS-2B细胞中汞离子能够诱导ROS（Parketal.,2007）。酵母菌在含有镉离子的培养基中的生长状况受到MsrB的影响（Joetal.,2014,Limetal.,2014），在细胞暴露于镉离子或是汞离子时，其MsrB表达量明显升高（Laplaceetal.,2000），与我们的结果相一致，AccMsrB在受到氯化汞及氯化镉处理后，整个处理周期内表达量升高。表明MsrBs抵御重金属引起的氧化应激的功能相对保守。蜜蜂在外界进行采集活动是不可避免的遇到高、低温的影响，使之机体发生生理变化（Kleinhenzetal.,2003,AnandChoi,2010），而中蜂较之意大利蜜蜂具有更强的适应温度的能力，可能预示着机体具有更好的防御体系。当生物暴露在高温或低温时，机体因为耗氧量增加而产生更多的氧自由基（ROS），体内H2O2浓度明显上升，使体内处于氧化状态（Maleketal.,2004,Bagnyukovaetal.,2007,Bocchettietal.,2008）。当蜜蜂遇到温度变化时，同样会产生更多的ROS，与我们的结果相一致。AccMsrB在遇到遇到温度变化时（4°C,16°C,25°C,42°C），出现了转录水平的变化，表达量明显上升，处于受诱导的状态，表明AccMsrB像其他物种MsrBs一样，对温度变化产生的ROS起到有效的清除作用（Limetal.,2012）。紫外线可以诱导体内的氧化状态，H2O2则更能直接造成体内H2O2浓度的升高，增加体内ROS含量（Lushchak,2011,Kottuparambiletal.,2012），富含蛋氨酸的蛋白质容易因表面的蛋氨酸氧化而变性，需要蛋氨酸甲基亚砜还原酶的还原作用（Liangetal.,2012）。另外，MsrB敲除后，会是细胞对于H2O2和紫外线更加敏感（Sorianietal.,2009,Jiaetal.,2012），本研究中，当对中蜂进行H2O2和紫外线处理后，中蜂体内处于氧化状态，AccMsrB同样处于明显的表达上调，这与先前在霉菌中的研究结果一致（Sorianietal.,2009），说明了AccMsrB对于H2O2和紫外线引起的ROS具有清除作用。利用农药防止作物病害已经成为常态，农药的种类也是日新月异，农药的毒性更是千差万别，针对不同的生物表现出不同的毒性。农药的大量使用已经造成了蜜蜂的损失，我们先前的研究表明，杀虫剂可以损伤蜜蜂的中枢神经系统，还能影响蜜蜂一系列的产卵、孵化及羽化出房行为，严重者可造成垮群（Zhouetal.,2011）。除草剂通过增加生73 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析物体内氧化压力、增加氧自由基的形式，影响生物健康（Pineretal.,2007,Monteiroetal.,2009,Thomazetal.,2009）。在蜜蜂体内，农药同样增加其H2O2浓度，使其处于氧化状态（Yanetal.,2014）。有研究表明，杀虫剂和除草剂能够引起体内MsrB的表达量升高（Hooketal.,2006,ParvezandRaisuddin,2006），在本研究中，吡虫啉、三氟氯氰菊酯和百草枯均引起蜜蜂体内AccMsrB表达水平升高，但是辛硫磷却抑制了AccMsrB的表达，可能是因为其他基因在清除辛硫磷的氧化损伤方面起作用（Yaoetal.,2013c,Yaoetal.,2013a）。表明AccMsrB对与杀虫剂和除草剂等农药引起的氧化损伤具有修复作用。4.2铁代谢相关蛋白基因在氧化应激和铁代谢中发挥重要作用4.2.1铁代谢相关蛋白基因的序列分析本研究中，我们克隆并分析了中蜂铁代谢相关蛋白，包括中蜂转铁蛋白（AccTf）、铁蛋白重链及轻链（AccFTH和AccFTL）。通过序列分析表明，中蜂转铁蛋白仅在N-端保留了一个铁结合位点（D86，Y123、R152、Y237、Q309），C-端铁结合位点丢失，这与哺乳动物及其他物种中Tf在N-端和C-端均保留着铁结合位点不同（Thompsonetal.,2003,Leeetal.,2006,Jahanshadetal.,2012），但是符合昆虫转铁蛋白的特点（Nicholetal.,2002,Lambertetal.,2005b,DunkovandGeorgieva,2006）。另外，在其序列中还存在保守的半胱氨酸（C37、C62、C71、C196、C222、C243、C286、C301、C389、C399、C417、C426、C534、C545、C548、C565、C582、C626）。根据多重序列比较及三级结构可知，3+转铁蛋白在高级结构中构成铁结合中心的氨基酸距离较近，结合一个Fe，N-端序列失去了铁结合能力。根据蛋白质序列多重比较及Tf进化论分析，认为可能在其进化过程中发生了变化（Lambertetal.,2005a）。从序列比对结果分析，AccTf属于典型的昆虫转铁蛋白家族。我们还克隆得到了铁蛋白重链及轻链亚基，在其多肽序列中发现了该基因家族保守的氨基酸序列（E60、Y67、E94、E95、H98、E147、Q186），构成了铁氧化中2+心（Wangetal.,2009），具有结合并氧化Fe的功能（Lawsonetal.,1989,Wadeetal.,1991），还发现在其5，非翻译区的保守的IRE茎环结构（Hiraietal.,2000,Nicholetal.,2002,Wangetal.,2009）。轻链中并没有发现IRE的茎环结构，但是其序列中也同样存在保守的半胱氨酸和糖基化位点（N-E-F），与之前的报道也一致（Kimetal.,2004）。经过多重序列比较，重链与轻链分别与各自家族氨基酸序列相似性较高（>70%），信号肽预测发现三个基因均具有信号肽，与昆虫铁代谢蛋白均是分泌蛋白结果一致（Locke,74 山东农业大学博士学位论文1991,Gommeetal.,2005,Wangetal.,2009,PhamandWinzerling,2010）。4.2.2铁代谢相关蛋白基因的时空表达特性分析脂肪体是昆虫中合成Tf的主要部位，之后分泌到血淋巴中发挥作用，之后转运铁到需要铁的组织中（Lockeetal.,1991,Leeetal.,2006,Kimetal.,2008a,Wangetal.,2009），在本研究中，中蜂转铁蛋白基因同样在脂肪体中高表达。同时在转铁蛋白、铁蛋白两个亚基N-端存在信号肽，可证明该蛋白均属于分泌型蛋白，在合成后被分泌到血淋巴中。中蜂转铁蛋白的表达水平在4龄幼虫期最高，与其体内的脂肪体含量较多有关，另外，4日龄幼虫开始食用由蜂蜜和花粉混合后发酵的食物，其中不可避免的存在外源性毒物，可能遭受更大的氧化应激压力（KrishnanandSehnal,2006），说明中蜂转铁蛋白可能具有抵抗外源毒物的免疫作用。同样，铁蛋白重链与轻链均在中肠部位表达量最高，与之前的研究一致（NicholandLocke,1999,Kimetal.,2002,Kimetal.,2004），说明铁蛋白主要在中肠中合成，并能够更好的储存食物中的外源性铁（Georgievaetal.,1999）。转铁蛋白和铁蛋白的表达受到蜜蜂体内激素水平的影响，主要包括保幼激素和蜕皮激素（Blochetal.,2002,doNascimentoetal.,2004），AccFTH在粉眼蛹期高表达，与此时蜜蜂体内蜕皮激素的水平可能有关（Pintoetal.,2002,doNascimentoetal.,2004），也可能预示着AccFTH可能与其他物种中铁蛋白一样，与蜜蜂的重要器官变态重组有关（MaleszkaandKucharski,2003）。经过诱导纯化得到了AccTf，其分子量在78kDa左右，与同家族成员相似（Nicholetal.,2002,Leeetal.,2006,Kimetal.,2008b）。预测了AccFTH与AccFTL的分子量，显示它们与之前的描述相一致（Kimetal.,2004,Arosioetal.,2009,Kimetal.,2009）。4.2.3铁代谢相关蛋白基因的生物学功能分析报道认为转铁蛋白和铁蛋白属于抗氧化蛋白，能够抵御外源性氧化应激引起的氧化损伤（Zouetal.,2000,Landisetal.,2004,DunkovandGeorgieva,2006,Leeetal.,2006,Kimetal.,2008b），在本研究中，在进行氧化处理后（非适宜温度、H2O2、UV重金属及农药），蜜蜂转铁蛋白基因表达量升高，与之前的研究一致，说明中蜂转铁蛋白同样具有抗氧化，保护蜜蜂免受氧化损伤的功能。先前报道转铁蛋白由脂肪体合成后，分泌到血淋巴中结合游离铁，并将其转运到需要铁的组织中（Hiraietal.,2000,Harizanovaetal.,2005,Leeetal.,2006,Kimetal.,2008a）。转铁蛋白在血淋巴中大量存在，并能够迅75 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析速结合其中的游离铁，避免其对组织造成氧化损伤（Kimetal.,2001,Kimetal.,2002,Xiu‐lianetal.,2004），本研究中，对中蜂施以FeCl3处理，其转铁蛋白表达量短时间内上升，之后表达量恢复到初始状态，结合铁蛋白表达量水平，发现蜜蜂转铁蛋白与铁蛋白共同结合血淋巴中的游离铁，使其中铁浓度逐渐下降到正常水平。同样说明蜜蜂铁蛋白与大多昆虫（Strickler-Dinglasanetal.,2006）铁蛋白一样，具有在血淋巴中转运铁离子的功能，而不同于哺乳动物只能在细胞内质网中期储存铁的作用（Strickler-Dinglasanetal.,2006）。果蝇中铁蛋白的过表达使其能够抵御氧化损伤，保护细胞免受细胞凋亡，延长果蝇寿命（Missirlisetal.,2007），埃及伊蚊细胞中过表达铁蛋白同样能够使细胞更加耐受H2O2（Geiseretal.,2003），证明了铁蛋白能够抵御外源性的氧化应激，保护果蝇和埃及伊蚊的机体免受氧化损伤。对蜜蜂施以H2O2和UV处理，均能增加其体内H2O2的浓度，造成氧自由基，本研究中铁蛋白表达量上升，表明中蜂铁蛋白可以清除蜜蜂体内过量的自由基，属于抗氧化蛋白。埃及伊蚊细胞受到外源性铁处理后，铁蛋白基因表达水平升高，检测细胞内铁含量升高（Geiseretal.,2003），另外，昆虫铁蛋白承担了部分转运铁的功能（Zhouetal.,2007），均说明昆虫铁蛋白具有结合铁的功能，中蜂铁蛋白在经过FeCl3处理后表达量上升，说明它可以通过结合和储存体内的过量铁，表达提高以防止过量铁产生氧自由基，这与之前报道的铁蛋白保护组织免受游离铁产生的氧化应激的作用相同（Nicholetal.,2002,Chauhanetal.,2004,DunkovandGeorgieva,2006,Wangetal.,2009）。上述结果表明，中蜂转铁蛋白和铁蛋白在蜜蜂体内受到铁离子含量的诱导表达，与体内铁元素的转运和存储相关，对照之前的研究结果，证明两者在体内具有储存和转运铁元素的功能，继而隔绝铁离子，避免产生过量的自由基，造成氧化损伤（Nicholetal.,2002），可以认为它们具有调节体内自由铁含量的功能，并能主动清除由H2O2、UV重金属及农药造成的活性氧，证明了它们抗氧化蛋白的角色。76 山东农业大学博士学位论文5结论（1）首次克隆中蜂MsrB、Tf、FTH、FTL基因，分别命名为AccMsrB（KP317814）、AccTf（JF330111.1）、AccFTH（JF330112.1）、AccFTL（JF340051.1），进行氨基酸序列对比，进化树及DNA序列比较发现：它们分别与各自家族的多个物种基因具有高度相似性，特别是与意大利蜜蜂同源性较高，并具有高度保守的催化活性序列（CxxC、DYRYQ序列、IRE及N-E-F），说明本研究克隆得到的基因属于各自基因家族。（2）通过对各基因启动子区域预测到参与早期组织发育的转录因子结合位点（BR-C、CdxA和CREB）。几个与环境应激及免疫响应有关的转录因子结合位点（HSF、NFκB等）也被发现。以上结果表明，AccMsrB、AccTf、AccFTH及AccFTL基因可能参与蜜蜂的变态发育和应激保护机制。在AccFTH中发现了IRE，表明其受到体内铁调节蛋白的分子调控。（3）通过荧光定量和免疫组化技术分析发现，AccMsrB可能在蜜蜂变态发育过程中的重要发育节点上起作用（L1、PP、A15），说明在蜜蜂发育中起重要作用。AccTf基因则在发育过程中食物变化的时候表达量剧烈变化（L4），说明其在蜜蜂抵御外源性毒物，保证蜜蜂正常发育有关。AccFTH主要在粉眼期高表达，与蜜蜂体内此时较高的蜕皮激素有关。（4）中蜂各基因在不同组织部位表达水平分析表明，AccMsrB、AccTf、AccFTH、AccFTL基因分别分别在成年蜜蜂表皮、脂肪体和中肠部位表达量最高。与其他昆虫中的各基因表达特性一致，亦表明他们在其中起到抗氧化、转运铁和储存铁的功能。（5）蜜蜂在外界采集过程中会遇到多种环境因素的影响。本研究中对中蜂施加的氧化应激处理后，蜜蜂体内的H2O2浓度上升，机体处于氧化状态，AccMsrB、AccTf、AccFTH在多种应激条件下表达量上调，说明他们具有消除体内活性氧、抵御氧化损伤的功能。在FeCl3处理后，血淋巴中的铁离子浓度先上升，之后下降到正常水平；AccTf、AccFTH表达量均上升，表明它们共同结合血淋巴中的游离铁，储存在蛋白中，同时避免产生活性氧。77 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析6参考文献Adams,M.D.,S.E.Celniker,R.A.Holt,C.A.Evans,J.D.Gocayne,P.G.Amanatides,S.E.Scherer,P.W.Li,R.A.Hoskins,andR.F.Galle.ThegenomesequenceofDrosophilamelanogaster.Science,2000.287:2185-2195.An,M.I.,andC.Y.Choi.Activityofantioxidantenzymesandphysiologicalresponsesinarkshell,Scapharcabroughtonii,exposedtothermalandosmoticstress:Effectsonhemolymphandbiochemicalparameters.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB:BiochemistryandMolecularBiology,2010.155:34-42.Anderson,B.F.,H.M.Baker,G.E.Norris,D.W.Rice,andE.N.Baker.Structureofhumanlactoferrin:Crystallographicstructureanalysisandrefinementat2·8Åresolution.JMolBiol,1989.209:711-734.Andrews,S.C.,P.M.Harrison,S.J.Yewdall,P.Arosio,S.Levi,W.Bottke,M.vonDarl,J.-F.Briat,J.-P.Laulhère,andS.Lobreaux.Structure,function,andevolutionofferritins.Journalofinorganicbiochemistry,1992.47:161-174.Arosio,P.,R.Ingrassia,andP.Cavadini.Ferritins:afamilyofmoleculesforironstorage,antioxidationandmore.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）-GeneralSubjects,2009.1790:589-599.Bagchi,D.,M.Bagchi,S.J.Stohs,D.K.Das,S.D.Ray,C.A.Kuszynski,S.S.Joshi,andH.G.Pruess.Freeradicalsandgrapeseedproanthocyanidinextract:importanceinhumanhealthanddiseaseprevention.Toxicology,2000.148:187-197.Bagnyukova,T.V.,S.I.Danyliv,O.S.Zin’ko,andV.I.Lushchak.HeatshockinducesoxidativestressinrotanPerccottusgleniitissues.JournalofThermalBiology,2007.32:255-260.Baldi,A.,D.Lombardi,P.Russo,E.Palescandolo,A.DeLuca,D.Santini,F.Baldi,L.Rossiello,M.L.Dell"Anna,andA.Mastrofrancesco.Ferritincontributestomelanomaprogressionbymodulatingcellgrowthandsensitivitytooxidativestress.Clinicalcancerresearch,2005.11:3175-3183.Baldwin,G.Comparisonoftransferrinsequencesfromdifferentspecies.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB:ComparativeBiochemistry,1993.106:203-218.Bloch,B.,T.Popovici,M.J.Levin,D.Tuil,andA.Kahn.Transferringeneexpressionvisualizedinoligodendrocytesoftheratbrainbyusinginsituhybridizationandimmunohistochemistry.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1985.82:6706-6710.Bloch,G.,J.Sullivan,andG.Robinson.JuvenilehormoneandcircadianlocomotoractivityinthehoneybeeApismellifera.JInsectPhysiol,2002.48:1123-1131.Bocchetti,R.,C.V.Lamberti,B.Pisanelli,E.M.Razzetti,C.Maggi,B.Catalano,G.Sesta,G.Martuccio,M.Gabellini,andF.Regoli.Seasonalvariationsofexposurebiomarkers,oxidativestressresponsesandcelldamageintheclams,Tapesphilippinarum,andmussels,Mytilusgalloprovincialis,fromAdriaticsea.MarEnvironRes,2008.66:24-26.Boschi-Muller,S.,A.Gand,andG.Branlant.Themethioninesulfoxidereductases:Catalysisandsubstratespecificities.ArchBiochemBiophys,2008.474:266-273.Brot,N.,L.Weissbach,J.Werth,andH.Weissbach.Enzymaticreductionofprotein-boundmethioninesulfoxide.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1981.78:2155-2158.Cairo,G.,L.Bardella,L.Schiaffonati,P.Arosio,S.Levi,andA.Bernelli-Zazzera.Multiplemechanismsofiron-inducedferritinsynthesisinHeLacells.BiochemBiophysResCommun,78 山东农业大学博士学位论文1985.133:314-321.Caldwell,P.,D.C.Luk,H.Weissbach,andN.Brot.OxidationofthemethionineresiduesofEscherichiacoliribosomalproteinL12decreasestheprotein"sbiologicalactivity.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1978.75:5349-5352.Calmettes,C.,J.Alcantara,R.H.Yu,A.B.Schryvers,andT.F.Moraes.Thestructuralbasisoftransferrinsequestrationbytransferrin-bindingproteinB.NatStructMolBiol,2012.19:358-360.Campanella,A.,G.Isaya,H.A.O"Neill,P.Santambrogio,A.Cozzi,P.Arosio,andS.Levi.Theexpressionofhumanmitochondrialferritinrescuesrespiratoryfunctioninfrataxin-deficientyeast.Humanmoleculargenetics,2004.13:2279-2288.Carrondo,M.A.Ferritins,ironuptakeandstoragefromthebacterioferritinviewpoint.TheEMBOjournal,2003.22:1959-1968.Chauhan,A.,V.Chauhan,W.T.Brown,andI.Cohen.Oxidativestressinautism:Increasedlipidperoxidationandreducedserumlevelsofceruloplasminandtransferrin-theantioxidantproteins.LifeSci,2004.75:2539-2549.Christophides,G.K.,E.Zdobnov,C.Barillas-Mury,E.Birney,S.Blandin,C.Blass,P.T.Brey,F.H.Collins,A.Danielli,andG.Dimopoulos.Immunity-relatedgenesandgenefamiliesinAnophelesgambiae.Science,2002.298:159-165.Cove,D.ChloratetoxicityinAspergillusnidulans:theselectionandcharacterizationofchlorateresistantmutants.Heredity,1976.36:191-203.Ding,D.,D.Sagher,E.Laugier,P.Rey,H.Weissbach,andX.H.Zhang.Studiesonthereducingsystemsforplantandanimalthioredoxin-independentmethioninesulfoxidereductasesB.BiochemBiophysResCommun,2007.361:629-633.doNascimento,A.M.,V.Cuvillier-Hot,A.R.Barchuk,Z.L.P.Simões,andK.Hartfelder.Honeybee（Apismellifera）transferrin-genestructureandtheroleofecdysteroidsinthedevelopmentalregulationofitsexpression.Insectbiochemistryandmolecularbiology,2004.34:415-424.DosSantos,C.V.,S.Cuiné,N.Rouhier,andP.Rey.TheArabidopsisplastidicmethioninesulfoxidereductaseBproteins.Sequenceandactivitycharacteristics,comparisonoftheexpressionwithplastidicmethioninesulfoxidereductaseA,andinductionbyphotooxidativestress.Plantphysiology,2005.138:909-922.Dunkov,B.,andT.Georgieva.Insectironbindingproteins:insightsfromthegenomes.InsectBiochemMolBiol,2006.36:300-309.Dyer,P.S.,M.Paoletti,andD.B.Archer.GenomicsrevealssexualsecretsofAspergillus.Microbiology,2003.149:2301-2303.Eisenstein,R.S.Ironregulatoryproteinsandthemolecularcontrolofmammalianironmetabolism.Annualreviewofnutrition,2000.20:627-662.Ekblom,P.,I.Thesleff,L.Saxen,A.Miettinen,andR.Timpl.Transferrinasafetalgrowthfactor:acquisitionofresponsivenessrelatedtoembryonicinduction.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1983.80:2651-2655.Esparza,I.,andJ.H.Brock.Theinteractionofbovinetransferrinandmonoferrictransferrinfragmentswithrabbitreticulocytes.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）-ProteinStructure,1980.624:479-489.Farooqui,T.Iron-inducedoxidativestressmodulatesolfactorylearningandmemoryinhoneybees.79 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析Behavioralneuroscience,2008.122:433.Ferrara,N.Reprintof“Pituitaryfollicularcellssecreteanovelheparin-bindinggrowthfactorspecificforvascularendothelialcells”.BiochemBiophysResCommun,2012.425:540-547.Fletcher,J.,andE.Huehns.Functionoftransferrin.Nature,1968.218:1211-1214.Fontecave,M.,M.Atta,andE.Mulliez.S-adenosylmethionine:nothinggoestowaste.TrendsBiochemSci,2004.29:243-249.Geiser,D.L.,C.A.Chavez,R.Flores‐Munguia,J.J.Winzerling,andD.Q.D.Pham.Aedesaegyptiferritin.Europeanjournalofbiochemistry,2003.270:3667-3674.Georgieva,T.,B.C.Dunkov,N.Harizanova,K.Ralchev,andJ.H.Law.IronavailabilitydramaticallyaltersthedistributionofferritinsubunitmessagesinDrosophilamelanogaster.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999.96:2716-2721.Georgieva,T.,B.Dunkov,S.Dimov,K.Ralchev,andJ.Law.Drosophilamelanogasterferritin:cDNAencodingalightchainhomologue,temporalandtissuespecificexpressionofbothsubunittypes.Insectbiochemistryandmolecularbiology,2002.32:295-302.Gertz,M.,F.Fischer,M.Leipelt,D.Wolters,andC.Steegborn.IdentificationofPeroxiredoxin1asanovelinteractionpartnerforthelifespanregulatorproteinp66Shc.Aging,2009.1:254.Gilbert,M.,andC.Wilkinson.Aninhibitorofmicrosomaloxidationfromguttissuesofthehoneybee（Apismellifera）.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB:ComparativeBiochemistry,1975.50:613-619.Gkouvatsos,K.,G.Papanikolaou,andK.Pantopoulos.Regulationofirontransportandtheroleoftransferrin.BiochimBiophysActa,2012.1820:188-202.Gomme,P.T.,K.B.McCann,andJ.Bertolini.Transferrin:structure,functionandpotentialtherapeuticactions.DrugDiscoveryToday,2005.10:267-273.Gong,Z.,X.Guo,andB.Xu.Molecularcloning,characterisationandexpressionofmethioninesulfoxidereductaseAgenefromApisceranacerana.Apidologie,2011.43:182-194.Greene,F.C.,andR.E.Feeney.Physicalevidencefortransferrinsassinglepolypeptidechains.Biochemistry,1968.7:1366-1371.Hamburger,A.E.,A.P.West,Jr.,Z.A.Hamburger,P.Hamburger,andP.J.Bjorkman.Crystalstructureofasecretedinsectferritinrevealsasymmetricalarrangementofheavyandlightchains.JMolBiol,2005.349:558-569.Harizanova,N.,T.Georgieva,B.Dunkov,T.Yoshiga,andJ.Law.Aedesaegyptitransferrin.Genestructure,expressionpattern,andregulation.InsectMolBiol,2005.14:79-88.Harrison,P.M.,andP.Arosio.Theferritins:molecularproperties,ironstoragefunctionandcellularregulation.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）-Bioenergetics,1996.1275:161-203.Henderson,B.,andL.Kühn.1997.Interactionbetweeniron-regulatoryproteinsandtheirRNAtargetsequences,iron-responsiveelements,pp.117-139,CytoplasmicfateofmessengerRNA.Springer.Hirai,M.,D.Watanabe,andY.Chinzei.Ajuvenilehormone‐repressibletransferrin‐likeproteinfromthebeanbug,Riptortusclavatus:cDNAsequenceanalysisandproteinidentificationduringdiapauseandvitellogenesis.ArchInsectBiochemPhysiol,2000.44:17-26.Hirono,I.,T.Uchiyama,andT.Aoki.Cloning,nucleotidesequenceanalysis,andcharacterizationofcDNAformedaka（Oryziaslatipes）transferrin.JMarBiotechnol,1995.2:193-198.Holmgren,A.Thioredoxinandglutaredoxinsystems.JBiolChem,1989.264:13963-13966.Hook,S.E.,A.D.Skillman,J.A.Small,andI.R.Schultz.Geneexpressionpatternsinrainbowtrout,80 山东农业大学博士学位论文Oncorhynchusmykiss,exposedtoasuiteofmodeltoxicants.AquaticToxicology,2006.77:372-385.Imlay,J.A.Pathwaysofoxidativedamage.AnnualReviewsinMicrobiology,2003.57:395-418.Jahanshad,N.,O.Kohannim,D.P.Hibar,J.L.Stein,K.L.McMahon,G.I.deZubicaray,S.E.Medland,G.W.Montgomery,J.B.Whitfield,N.G.Martin,M.J.Wright,A.W.Toga,andP.M.Thompson.BrainstructureinhealthyadultsisrelatedtoserumtransferrinandtheH63DpolymorphismintheHFEgene.ProcNatlAcadSciUSA,2012.109:E851-859.Jarritt,P.H.Effectofirononsedimentation-velocityandgelfiltrationbehaviouroftransferrinsfromseveralvertebrates.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）-ProteinStructure,1976.453:332-343.Jia,Y.,Y.Li,S.Du,andK.Huang.InvolvementofMsrB1intheregulationofredoxbalanceandinhibitionofperoxynitrite-inducedapoptosisinhumanlensepithelialcells.ExpEyeRes,2012.100:7-16.Jia,Y.,J.Zhou,H.Liu,andK.Huang.EffectofmethioninesulfoxidereductaseB1（SelR）genesilencingonperoxynitrite-inducedF-actindisruptioninhumanlensepithelialcells.BiochemBiophysResCommun,2014.443:876-881.Jo,H.,Y.W.Cho,S.Y.Ji,G.Y.Kang,andC.J.Lim.Protectiverolesofmethionine‐R‐sulfoxidereductaseagainststressesinSchizosaccharomycespombe.Journalofbasicmicrobiology,2014.54:72-80.Keim,C.,C.Cruz-Landim,F.Carneiro,andM.Farina.FerritininironcontaininggranulesfromthefatbodyofthehoneybeesApismelliferaandScaptotrigonapostica.Micron,2002.33:53-59.Kim,B.S.,C.Y.Yun,S.M.Yeo,H.J.Lee,andH.R.Kim.CloningandexpressionofaferritinsubunitforGalleriamellonella.ArchInsectBiochemPhysiol,2001.47:8-17.Kim,B.S.,C.S.Lee,J.Y.Seol,C.Y.Yun,andH.R.Kim.Cloningandexpressionof32kDaferritinfromGalleriamellonella.ArchInsectBiochemPhysiol,2002.51:80-90.Kim,B.Y.,K.S.Lee,Y.M.Choo,I.Kim,J.S.Hwang,H.D.Sohn,andB.R.Jin.MolecularcloningandcharacterizationofatransferrincDNAfromthewhite-spottedflowerchafer,Protaetiabrevitarsis:ShortCommunication.MitochondrialDNA,2008a.19:146-150.Kim,B.Y.,K.S.Lee,H.J.Yoon,I.Kim,J.Li,H.D.Sohn,andB.R.Jin.Expressionprofileoftheiron-bindingproteinstransferrinandferritinheavychainsubunitinthebumblebeeBombusignitus.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2009.153:165-170.Kim,B.Y.,K.S.Lee,Y.M.Choo,I.Kim,Y.H.Je,S.D.Woo,S.M.Lee,H.C.Park,H.D.Sohn,andB.R.Jin.Insecttransferrinfunctionsasanantioxidantproteininabeetlelarva.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2008b.150:161-169.Kim,H.-Y.,andV.N.Gladyshev.Characterizationofmouseendoplasmicreticulummethionine-R-sulfoxidereductase.BiochemBiophysResCommun,2004a.320:1277-1283.Kim,H.-Y.,andV.N.Gladyshev.Methioninesulfoxidereductioninmammals:characterizationofmethionine-R-sulfoxidereductases.Molecularbiologyofthecell,2004b.15:1055-1064.Kim,H.Y.,andV.N.Gladyshev.Characterizationofmouseendoplasmicreticulummethionine-R-sulfoxidereductase.BiochemBiophysResCommun,2004c.320:1277-1283.Kim,S.R.,K.S.Lee,H.J.Yoon,N.S.Park,S.M.Lee,I.Kim,S.J.Seo,H.D.Sohn,andB.R.Jin.Molecularcloning,expressionandcharacterizationofcDNAsencodingtheferritinsubunitsfromthebeetle,Aprionagermari.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2004.138:423-433.81 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析Kleinhenz,M.,B.Bujok,S.Fuchs,andJ.Tautz.Hotbeesinemptybroodnestcells:heatingfromwithin.TheJournalofexperimentalbiology,2003.206:4217-4231.Kobayashi-Miura,M.,K.Shioji,Y.Hoshino,H.Masutani,H.Nakamura,andJ.Yodoi.Oxygensensingandredoxsignaling:theroleofthioredoxininembryonicdevelopmentandcardiacdiseases.AmericanJournalofPhysiology-HeartandCirculatoryPhysiology,2007.292:H2040-H2050.Koc,A.,A.P.Gasch,J.C.Rutherford,H.-Y.Kim,andV.N.Gladyshev.Methioninesulfoxidereductaseregulationofyeastlifespanrevealsreactiveoxygenspecies-dependentand-independentcomponentsofaging.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004.101:7999-8004.Kohen,R.,andA.Nyska.Oxidationofbiologicalsystems:oxidativestressphenomena,antioxidants,redoxreactions,andmethodsoftheirquantification.,pp.620-650.2005.PMID.Kohgo,Y.,M.Yokota,andJ.W.Drysdale.Differentialturnoverofratliverisoferritins.JournalofBiologicalChemistry,1980.255:5195-5200.Kosmidis,S.,J.A.Botella,K.Mandilaras,S.Schneuwly,E.M.Skoulakis,T.A.Rouault,andF.Missirlis.FerritinoverexpressioninDrosophilaglialeadstoirondepositionintheopticlobesandlate-onsetbehavioraldefects.Neurobiologyofdisease,2011.43:213-219.Kottuparambil,S.,W.Shin,M.T.Brown,andT.Han.UV-Baffectsphotosynthesis,ROSproductionandmotilityofthefreshwaterflagellate,EuglenaagilisCarter.AquaticToxicology,2012.122:206-213.Kovacs,J.A.HowironactivatesO2.Science,2003.299:1024-1025.Koywiwattrakul,P.,andS.Sittipraneed.Expressionofvitellogeninandtransferrininactivatedovariesofworkerhoneybees,Apismellifera.Biochemicalgenetics,2009.47:19-26.Krishnan,N.,andF.Sehnal.CompartmentalizationofoxidativestressandantioxidantdefenseinthelarvalgutofSpodopteralittoralis.ArchInsectBiochemPhysiol,2006.63:1-10.Kryukov,G.V.,R.A.Kumar,A.Koc,Z.Sun,andV.N.Gladyshev.SelenoproteinRisazinc-containingstereo-specificmethioninesulfoxidereductase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2002.99:4245-4250.Kucharski,R.,andR.Maleszka.Transcriptionalprofilingrevealsmultifunctionalrolesfortransferrininthehoneybee,Apismellifera.JournalofInsectScience,2003.3:27.Kumar,R.A.,A.Koc,R.L.Cerny,andV.N.Gladyshev.Reactionmechanism,evolutionaryanalysis,androleofzincinDrosophilamethionine-R-sulfoxidereductase.JournalofBiologicalChemistry,2002.277:37527-37535.Kuterbach,D.A.,B.Walcott,R.J.Reeder,andR.B.Frankel.Iron-containingcellsinthehoneybee（Apismellifera）.Science,1982.218:695-697.Lambert,L.A.,H.Perri,andT.J.Meehan.Evolutionofduplicationsinthetransferrinfamilyofproteins.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2005a.140:11-25.Lambert,L.A.,H.Perri,P.J.Halbrooks,andA.B.Mason.Evolutionofthetransferrinfamily:conservationofresiduesassociatedwithironandanionbinding.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2005b.142:129-141.Landis,G.N.,D.Abdueva,D.Skvortsov,J.Yang,B.E.Rabin,J.Carrick,S.Tavaré,andJ.Tower.SimilargeneexpressionpatternscharacterizeagingandoxidativestressinDrosophilamelanogaster.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004.101:7663-7668.82 山东农业大学博士学位论文Laplace,J.,A.Hartke,J.Giard,andY.Auffray.Cloning,characterizationandexpressionofanEnterococcusfaecalisgeneresponsivetoheavymetals.Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2000.53:685-689.Lawson,D.M.,A.Treffry,P.J.Artymiuk,P.M.Harrison,S.J.Yewdall,A.Luzzago,G.Cesareni,S.Levi,andP.Arosio.Identificationoftheferroxidasecentreinferritin.FEBSLetters,1989.254:207-210.Lawson,D.M.,P.J.Artymiuk,S.J.Yewdall,J.M.Smith,J.C.Livingstone,A.Treffry,A.Luzzago,S.Levi,P.Arosio,andG.Cesareni.SolvingthestructureofhumanHferritinbygeneticallyengineeringintermolecularcrystalcontacts.1991.Lee,K.S.,S.R.Kim,N.S.Park,I.Kim,P.D.Kang,B.H.Sohn,K.H.Choi,S.W.Kang,Y.H.Je,andS.M.Lee.Characterizationofasilkwormthioredoxinperoxidasethatisinducedbyexternaltemperaturestimulusandviralinfection.Insectbiochemistryandmolecularbiology,2005.35:73-84.Lee,K.S.,B.Y.Kim,H.J.Kim,S.J.Seo,H.J.Yoon,Y.S.Choi,I.Kim,Y.S.Han,Y.H.Je,andS.M.Lee.Transferrininhibitsstress-inducedapoptosisinabeetle.FreeRadicalBiologyandMedicine,2006.41:1151-1161.Lee,M.H.,andR.T.Means.Extremelyelevatedserumferritinlevelsinauniversityhospital:associateddiseasesandclinicalsignificance.TheAmericanjournalofmedicine,1995.98:566-571.Liang,X.,A.Kaya,Y.Zhang,D.T.Le,D.Hua,andV.N.Gladyshev.Characterizationofmethionineoxidationandmethioninesulfoxidereductionusingmethionine-richcysteine-freeproteins.BMCbiochemistry,2012.13:21.Lim,C.-J.,H.Jo,andK.Kim.Aprotectiveroleofmethionine-R-sulfoxidereductaseagainstcadmiuminSchizosaccharomycespombe.JournalofMicrobiology,2014.1-6.Lim,D.H.,J.Y.Han,J.R.Kim,Y.S.Lee,andH.Y.Kim.MethioninesulfoxidereductaseBintheendoplasmicreticulumiscriticalforstressresistanceandaginginDrosophila.BiochemBiophysResCommun,2012.419:20-26.Locke,M.Apoferritininthevacuolarsystemofinsecthemocytes.TissueandCell,1991.23:367-375.Locke,M.,C.Ketola-Pirie,H.Leung,andH.Nichol.Vacuolarapoferritinsynthesisbythefatbodyofaninsect（Calpodesethlius）.JInsectPhysiol,1991.37:297-309.Lowther,W.T.,N.Brot,H.Weissbach,J.F.Honek,andB.W.Matthews.Thiol–disulfideexchangeisinvolvedinthecatalyticmechanismofpeptidemethioninesulfoxidereductase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2000.97:6463-6468.Lushchak,V.I.Environmentallyinducedoxidativestressinaquaticanimals.AquaticToxicology,2011.101:13-30.MacGillivray,R.T.,E.Mendez,andK.Brew.1977.Structureandevolutionofserumtransferrin,pp.133-141,Proteinsofironmetabolism.GruneandStrattonNewYork.Malek,R.L.,H.Sajadi,J.Abraham,M.A.Grundy,andG.S.Gerhard.Theeffectsoftemperaturereductionongeneexpressionandoxidativestressinskeletalmusclefromadultzebrafish.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,2004.138:363-373.Maleszka,R.,andR.Kucharski.Transcriptionalprofilingrevealsmultifunctionalrolesfortransferrininthehoneybee,Apismellifera.JournalofInsectScience,2003.3:1-8.Missirlis,F.,S.Kosmidis,T.Brody,M.Mavrakis,S.Holmberg,W.F.Odenwald,E.M.Skoulakis,83 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析andT.A.Rouault.HomeostaticmechanismsforironstoragerevealedbygeneticmanipulationsandliveimagingofDrosophilaferritin.Genetics,2007.177:89-100.Monteiro,D.A.,F.T.Rantin,andA.L.Kalinin.Theeffectsofseleniumonoxidativestressbiomarkersinthefreshwatercharacidfishmatrinxã,Bryconcephalus（Gunther,1869）®exposedtoorganophosphateinsecticideFolisuper600BR（methylparathion）.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,2009.149:40-49.Moskovitz,J.Methioninesulfoxidereductases:ubiquitousenzymesinvolvedinantioxidantdefense,proteinregulation,andpreventionofaging-associateddiseases.BiochimBiophysActa,2005.1703:213-219.Moskovitz,J.,andE.R.Stadtman.Selenium-deficientdietenhancesproteinoxidationandaffectsmethioninesulfoxidereductase（MsrB）proteinlevelincertainmousetissues.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2003.100:7486-7490.Nichol,H.,andM.Locke.Secretedferritinsubunitsareoftwokindsininsects:molecularcloningofcDNAsencodingtwomajorsubunitsofsecretedferritinfromCalpodesethlius.Insectbiochemistryandmolecularbiology,1999.29:999-1013.Nichol,H.,J.H.Law,andJ.J.Winzerling.Ironmetabolismininsects.Annualreviewofentomology,2002.47:535-559.Ogawa,F.,C.S.Sander,A.Hansel,W.Oehrl,H.Kasperczyk,P.Elsner,K.Shimizu,S.H.Heinemann,andJ.J.Thiele.Therepairenzymepeptidemethionine-S-sulfoxidereductaseisexpressedinhumanepidermisandupregulatedbyUVAradiation.JournalofInvestigativeDermatology,2006.126:1128-1134.Oh,S.-H.,andS.-C.Lim.ArapidandtransientROSgenerationbycadmiumtriggersapoptosisviacaspase-dependentpathwayinHepG2cellsandthisisinhibitedthroughN-acetylcysteine-mediatedcatalaseupregulation.Toxicologyandappliedpharmacology,2006.212:212-223.Oke,T.T.,J.Moskovitz,andD.L.Williams.CharacterizationofthemethioninesulfoxidereductasesofSchistosomamansoni.JournalofParasitology,2009.95:1421-1428.Olry,A.,S.Boschi‐Muller,H.Yu,D.Burnel,andG.Branlant.Insightsintotheroleofthemetalbindingsiteinmethionine‐R‐sulfoxidereductasesB.Proteinscience,2005.14:2828-2837.Orino,K.,L.LEHMAN,Y.TSUJI,H.AYAKI,S.Torti,andF.Torti.Ferritinandtheresponsetooxidativestress.Biochem.J,2001.357:241-247.Park,I.,E.Schaeffer,A.Sidoli,F.E.Baralle,G.N.Cohen,andM.M.Zakin.Organizationofthehumantransferringene:directevidencethatitoriginatedbygeneduplication.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1985.82:3149-3153.Park,W.H.,Y.W.Han,S.H.Kim,andS.Z.Kim.AnROSgenerator,antimycinA,inhibitsthegrowthofHeLacellsviaapoptosis.Journalofcellularbiochemistry,2007.102:98-109.Parvez,S.,andS.Raisuddin.EffectsofparaquatonthefreshwaterfishChannapunctata（Bloch）:non-enzymaticantioxidantsasbiomarkersofexposure.Archivesofenvironmentalcontaminationandtoxicology,2006.50:392-397.Perez-Campo,R.,M.Lopez-Torres,S.Cadenas,C.Rojas,andG.Barja.Therateoffreeradicalproductionasadeterminantoftherateofaging:evidencefromthecomparativeapproach.JournalofComparativePhysiologyB,1998.168:149-158.Pham,D.Q.,andJ.J.Winzerling.Insectferritins:Typicaloratypical?BiochimBiophysActa,2010.1800:824-833.84 山东农业大学博士学位论文Piner,P.,Y.Sevgiler,andN.Üner.InvivoeffectsoffenthiononoxidativeprocessesbythemodulationofglutathionemetabolisminthebrainofOreochromisniloticus.Environmentaltoxicology,2007.22:605-612.Pinto,L.,K.Hartfelder,M.G.Bitondi,andZ.Simões.Ecdysteroidtitersinpupaeofhighlysocialbeesrelatetodistinctmodesofcastedevelopment.JInsectPhysiol,2002.48:783-790.Poli,G.,G.Leonarduzzi,F.Biasi,andE.Chiarpotto.Oxidativestressandcellsignalling.Currentmedicinalchemistry,2004.11:1163-1182.Ravanel,S.,B.Gakière,D.Job,andR.Douce.Thespecificfeaturesofmethioninebiosynthesisandmetabolisminplants.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1998.95:7805-7812.Rouault,T.,andR.Klausner.Regulationofironmetabolismineukaryotes.Currenttopicsincellularregulation,1997.35:1-19.Rouhier,N.,C.V.DosSantos,L.Tarrago,andP.Rey.PlantmethioninesulfoxidereductaseAandBmultigenicfamilies.Photosynthesisresearch,2006.89:247-262.Sagher,D.,D.Brunell,J.F.Hejtmancik,M.Kantorow,N.Brot,andH.Weissbach.Thioneincanserveasareducingagentforthemethioninesulfoxidereductases.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2006.103:8656-8661.Shi,Z.-H.,G.Nie,X.-L.Duan,T.Rouault,W.-S.Wu,B.Ning,N.Zhang,Y.-Z.Chang,andB.-L.Zhao.NeuroprotectiveMechanismofMitochondrialFerritinon6-Hydroxydopamine–InducedDopaminergicCellDamage:ImplicationforNeuroprotectioninParkinson"sDisease.Antioxidants&redoxsignaling,2010.13:783-796.Shoji,A.,andE.Ozawa.NecessityoftransferrinforRNAsynthesisinchickmyotubes.Journalofcellularphysiology,1986.127:349-356.Soriani,F.M.,M.R.Kress,P.F.d.Gouvêa,I.Malavazi,M.Savoldi,A.Gallmetzer,J.Strauss,M.H.S.Goldman,andG.H.Goldman.FunctionalcharacterizationoftheAspergillusnidulansmethioninesulfoxidereductases（msrAandmsrB）.FungalGeneticsandBiology,2009.46:410-417.Spik,G.,G.STRECKER,B.FOURNET,S.BOUQUELET,J.MONTREUIL,L.DORLAND,H.HALBEEK,andJ.F.VLIEGENTHART.Primarystructureoftheglycansfromhumanlactotransferrin.Europeanjournalofbiochemistry,1982.121:413-419.Strauss,W.Sulfhydrylgroupsanddisulfidebonds:Modificationofaminoacidresiduesinstudiesofreceptorstructureandfunction.Membranes,detergents,andreceptorsolubilization,1984.85-97.Strickler-Dinglasan,P.M.,N.Guz,G.Attardo,andS.Aksoy.MolecularcharacterizationofironbindingproteinsfromGlossinamorsitansmorsitans（Diptera:Glossinidae）.InsectBiochemMolBiol,2006.36:921-933.Theil,E.C.Ferritin:atthecrossroadsofironandoxygenmetabolism.TheJournalofnutrition,2003.133:1549S-1553S.Thomaz,J.M.,N.D.Martins,D.A.Monteiro,F.T.Rantin,andA.L.Kalinin.Cardio-respiratoryfunctionandoxidativestressbiomarkersinNiletilapiaexposedtotheorganophosphate®insecticidetrichlorfon（NEGUVON）.Ecotoxicologyandenvironmentalsafety,2009.72:1413-1424.Thompson,G.J.,Y.C.Crozier,andR.H.Crozier.Isolationandcharacterizationofatermitetransferringeneup‐regulatedoninfection.InsectMolBiol,2003.12:1-7.Tong,W.-H.,andT.A.Rouault.Metabolicregulationofcitrateandironbyaconitases:roleof85 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析iron–sulfurclusterbiogenesis.Biometals,2007.20:549-564.Torti,F.M.,andS.V.Torti.Regulationofferritingenesandprotein.Blood,2002.99:3505-3516.Ursini,F.,M.Maiorino,R.Brigelius-Flohe,K.Aumann,A.Roveri,D.Schomburg,andL.Flohe.Diversityofglutathioneperoxidases.Methodsinenzymology,1994.252:38-53.Valko,M.,D.Leibfritz,J.Moncol,M.T.Cronin,M.Mazur,andJ.Telser.Freeradicalsandantioxidantsinnormalphysiologicalfunctionsandhumandisease.IntJBiochemCellBiol,2007.39:44-84.Vogt,W.Oxidationofmethionylresiduesinproteins:tools,targets,andreversal.FreeRadicalBiologyandMedicine,1995.18:93-105.Wade,V.J.,S.Levi,P.Arosio,A.Treffry,P.M.Harrison,andS.Mann.Influenceofsite-directedmodificationsontheformationofironcoresinferritin.JMolBiol,1991.221:1443-1452.Walden,W.E.,A.I.Selezneva,J.Dupuy,A.Volbeda,J.C.Fontecilla-Camps,E.C.Theil,andK.Volz.Structureofdualfunctionironregulatoryprotein1complexedwithferritinIRE-RNA.Science,2006.314:1903-1908.Wang,D.,B.Y.Kim,K.S.Lee,H.J.Yoon,Z.Cui,W.Lu,J.M.Jia,D.H.Kim,H.D.Sohn,andB.R.Jin.Molecularcharacterizationofironbindingproteins,transferrinandferritinheavychainsubunit,fromthebumblebeeBombusignitus.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2009.152:20-27.Wang,Y.,L.Ma,andB.Xu.Diversityinlifehistoryofqueenandworkerhoneybees,ApismelliferaL.JournalofAsia-PacificEntomology,2014.Weissbach,H.,F.Etienne,T.Hoshi,S.H.Heinemann,W.T.Lowther,B.Matthews,G.StJohn,C.Nathan,andN.Brot.Peptidemethioninesulfoxidereductase:structure,mechanismofaction,andbiologicalfunction.ArchBiochemBiophys,2002.397:172-178.Williams,J.Theevolutionoftransferrin.TrendsBiochemSci,1982.7:394-397.Wojciechowski,W.,D.P.Harris,F.Sprague,B.Mousseau,M.Makris,K.Kusser,T.Honjo,K.Mohrs,M.Mohrs,andT.Randall.Cytokine-producingeffectorBcellsregulatetype2immunitytoH.polygyrus.Immunity,2009.30:421-433.Woodworth,R.,A.Brown-Mason,C.Redfield,andC.Dobson.Year.Published.Comparisonofovotransferrinhalfmoleculeswiththeintactproteinbyhighresolutionnuclearmagneticresonancespectroscopy.In,Biochemistryandphysiologyofiron:proceedings,FifthInternationalConferenceonProteinsofIronStorageandTransport,Univ.ofCalifornia,SanDiego,August24-26,1981/editors,P.Saltman,J.Hegenauer,1982.NewYork:ElsevierBiomedical,c1982.Xiu‐lian,D.,W.Kui,K.Ya,Y.Lan,L.Rong‐chang,C.YanZhong,H.KwokPing,andQ.ZhongMing.ApotransferrinisinternalizedanddistributedinthesamewayasholotransferrininK562cells.Journalofcellularphysiology,2004.201:45-54.Yan,Y.,Y.Zhang,Y.Huaxia,X.Wang,P.Yao,X.Guo,andB.Xu.Identificationandcharacterisationofanovel1-Cysthioredoxinperoxidasegene（AccTpx5）fromApisceranacerana.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB:BiochemistryandMolecularBiology,2014.172:39-48.Yang,G.HarmofintroducingthewesternhoneybeeApismelliferaL.totheChinesehoneybeeApisceranaF.anditsecologicalimpact.ActaEntomologicaSinica,2005.48:401-406.Yao,P.,W.Lu,F.Meng,X.Wang,B.Xu,andX.Guo.Molecularcloning,expressionandoxidativestressresponseofamitochondrialthioredoxinperoxidasegene（AccTpx-3）fromApis86 山东农业大学博士学位论文ceranacerana.JInsectPhysiol,2013a.59:273-282.Yao,P.,W.Lu,F.Meng,X.Wang,B.Xu,andX.Guo.Molecularcloning,expressionandoxidativestressresponseofamitochondrialthioredoxinperoxidasegene（AccTpx-3）fromApisceranacerana.JInsectPhysiol,2013b.59:273-282.Yao,P.,L.Hao,F.Wang,X.Chen,Y.Yan,X.Guo,andB.Xu.Molecularcloning,expressionandantioxidantcharacterisationofatypicalthioredoxingene（AccTrx2）inApisceranacerana.Gene,2013c.527:33-41.Yao,P.,X.Chen,Y.Yan,F.Liu,Y.Zhang,X.Guo,andB.Xu.Glutaredoxin1,glutaredoxin2,thioredoxin1,andthioredoxinperoxidase3playimportantrolesinantioxidantdefenseinApisceranacerana.FreeRadicalBiologyandMedicine,2014.68:335-346.Yermolaieva,O.,R.Xu,C.Schinstock,N.Brot,H.Weissbach,S.H.Heinemann,andT.Hoshi.MethioninesulfoxidereductaseAprotectsneuronalcellsagainstbriefhypoxia/reoxygenation.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004.101:1159-1164.Yoshiga,T.,T.Georgieva,B.C.Dunkov,N.Harizanova,K.Ralchev,andJ.H.Law.Drosophilamelanogastertransferrin.Europeanjournalofbiochemistry,1999.260:414-420.You,S.-A.,andQ.Wang.Ferritininatherosclerosis.ClinicaChimicaActa,2005.357:1-16.Zanella,I.,M.Derosas,M.Corrado,E.Cocco,P.Cavadini,G.Biasiotto,M.Poli,R.Verardi,andP.Arosio.TheeffectsoffrataxinsilencinginHeLacellsarerescuedbytheexpressionofhumanmitochondrialferritin.BiochimicaetBiophysicaActa（BBA）-MolecularBasisofDisease,2008.1782:90-98.Zhang,C.,P.Jia,Y.Jia,H.Weissbach,K.A.Webster,X.Huang,S.L.Lemanski,M.Achary,andL.F.Lemanski.MethioninesulfoxidereductaseA（MsrA）protectsculturedmouseembryonicstemcellsfromH2O2‐mediatedoxidativestress.Journalofcellularbiochemistry,2010.111:94-103.Zhang,Y.,andV.N.Gladyshev.Comparativegenomicsoftraceelementdependenceinbiology.JournalofBiologicalChemistry,2011.286:23623-23629.Zhou,G.,P.Kohlhepp,D.Geiser,M.delCarmenFrasquillo,L.Vazquez-Moreno,andJ.J.Winzerling.Fateofbloodmealironinmosquitoes.JInsectPhysiol,2007.53:1169-1178.Zhou,T.,W.Zhou,Q.Wang,P.-L.Dai,F.Liu,Y.-L.Zhang,andJ.-H.Sun.EffectsofpyrethroidsonneuronalexcitabilityofadulthoneybeesApismellifera.PesticideBiochemistryandPhysiology,2011.100:35-40.Zou,S.,S.Meadows,L.Sharp,L.Y.Jan,andY.N.Jan.Genome-widestudyofagingandoxidativestressresponseinDrosophilamelanogaster.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2000.97:13726-13731.87 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析本论文研究课题来源：国家自然科学基金项目（No.31172275）现代农业蜂产业技术体系建设专项资金（No.CARS-45）山东省农业良种工程“地方优良家禽及蜂业新品种选育”（No.2013LZ017-04）88 山东农业大学博士学位论文7致谢春风刚刚飘远，热浪已经迫近，光阴荏苒似水，数载青春随风。五万博文，含四年博士心酸，百页报告浸两月奋斗汗水。在完成学业之际，心却平静如水，并无丝毫功成名就之喜，反有轻松解脱之感。本人刘锋，生性低调淡泊，不善言辞，自感无鸿鹄之志，碌碌无为之辈。自觉才疏学浅，亦无过人之智，期间曾企图大功，而未量己之力，未竭其能。至此而立之年，回首思量，惭愧之至；展望未来，尚存心有余而力不足之感。硕士毕业之时，前途未卜，空有服务蜂业之愿，有幸跟随恩师以矢志，倾心教诲，无所保留。两年时间，虽无大成，也略有成长。蒙导师不弃，得入师门，得其亲传。深感恩师之博学厚德，严谨笃行，性情豪爽，不喜功名，仅以学生成才为傲。因材施教，常予大意于微言，予真理于身教。平时不吝鼓励之言，增添学生信心，使吾辈身卑而志高。每提及此，吾常深感师恩难忘，必当后报。博文得成，全赖众家之力。感谢郭兴启教授、谭景和教授、王建民教授、曾勇庆教授、王慧教授、姜运良教授、李显耀副教授、康明江副教授等为我们授课并给予无私的指导与帮助，感谢动科院其他帮助过我的老师。有幸博采众家之长，以完成博文，在此一并感谢。农大学习生涯六年，喜忧参半，成败几何，初始豪情不再。有过彷徨，有过拼搏，送走兄弟姐妹众多，如今师门兄妹，桃李遍天下，虽不在近前，但手足之情不减。每次想起，画面如昨，培新、志宏、刘利、焦震、乐乐、迎军、改英、昭华、成成、倩倩，同在师门，名为师生，实为兄妹，皆已成家立业，一改稚嫩青涩，甚为欣喜；在富、王颖、兰婷，与蜂为伴之日，历历在目，共铸养蜂技艺，终生不忘；汝江兄、张鸽、怡丁、晓波，言语投机，欢声笑语不断，以见面为盼；李肖、文滨、圣伟、凤奎，性格有异，但兄弟情深。学沛、徐鹏、中渠、卫星、春红、王丽，九零生人，聪明灵活，相处甚欢；振国、红芳，日少情深，又有同室之谊。兄弟姐妹之情谊牢记心底。锦瑟年华，曾共赏春花秋月，相恋八年，开花于农大，结果与农大。关切照顾如涓涓细流，无微不至。蒙妻垂怜，如星伴月，荣辱相伴，贫富不移。风华月貌之际，不顾曼妙身姿尽失之苦，怀胎十月，得一女并亲养之。近年独居南方，为家庭之基石，甚是辛劳。无以为报，愿共赴南昌，倾心待之，以报此缘。而立之年而未立，家庭重任未尽半分，父母生养之恩未报点滴，心中万分惭愧。父母青春早逝，两鬓已雪，终日背日面地而作，不求回报半分，唯盼早日成才。每每想到父母年事已高，未曾侍奉榻前，心中惭愧之情无法释然，今日学成，望父母宽慰。似海深情无法一一表述，只能深藏心底，寄情于文。路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。恐遇西出阳关之苦，然得亲友祝福，师长鼎力之助，则心甚安，定当深怀鸿鹄之志，披荆斩棘，不畏万险。定不忘师生恩情，同窗厚谊，亦期勿忘。刘锋2015年6月89 中华蜜蜂铁代谢相关蛋白及蛋氨酸甲基亚砜还原酶B基因的生物学功能分析8攻读学位期间发表论文情况FengLiu,BaohuaXu*,etal.IdentificationandcharacterisationofanovelmethioninesulfoxidereductaseBgene(AccMsrB)fromApisceranacerana..AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica.DOI:http://dx.doi.org/10.1093/aesa/sav042.FengLiu,BaohuaXu*,etal.CharacterizationofprophenoloxidaseinresistingadversestressesinApisceranacerana.EnvironmentalEntomology.Re-review.FengLiu,BaohuaXu*,etal.Molecularcharacterizationofironbindingproteins,ferritinlightchainsubunitandferritinheavychainsubunit,fromtheApisceranacerana.Underreview.FengLiu,BaohuaXu*,etal.MolecularcharacterizationanditsprotectiveeffectsinoxidativestressoftransferrinfromtheApisceranacerana.Preliminarydrafthasbeencompleted.PengboYao,…FengLiu,BaohuaXu*,etal.Glutaredoxin1,glutaredoxin2,thioredoxin1,andthioredoxinperoxidase3playimportantrolesinantioxidantdefenseinApisceranacerana.FreeRadicalBiologyandMedicine,2013.FreeRadicalBiologyandMedicine,2014,68:335-346.MengF,ZhangY,LiuF,etal.CharacterizationandMutationalAnalysisofOmega-ClassGST(GSTO1)fromApisceranacerana,aGeneInvolvedinResponsetoOxidativeStress[J].PloSone,2014,9(3):e93100.YingWang,…，FengLiu,BaohuaXu.DigestionofproteinoftwopollentypesinChinabythehoneybee(ApismelliferaL).Apidologie.2014.Accepted.周婷，刘锋.蜜蜂医学概论.北京，中国农业科学技术出版社.2014.3,43-66.刘锋.以色列养蜂见闻.中国蜂业.2015,66:62-64.刘锋，胥保华.以色列养蜂概况及对山东蜂业的启示.山东农业科学.2015,47(4):131-133.董文滨，刘锋，胥保华.不同辐照剂量对蜂球囊菌杀灭效果.中国畜牧兽医.2015,42(4)1021-1027.崔学沛，吴小波，刘锋，胥保华.不同产地荷花花粉与玉米花粉营养成分及含量分析.山东农业科学.2014，46(11):124-128.董文滨、吴小波、刘锋、胥保华.不同产地油菜花粉、茶花粉中氨基酸、脂肪酸和矿物质成分.中国蜂业.2013,64(12):50-54.胥保华，刘锋等.撰写并上报发明专利一项：蜜蜂春繁饲料专用代花粉及其制备方法（201310337733X）。胥保华，刘锋.撰写并通过评审山东省地方标准6项包括：蜜蜂传染性病害防治规范、蜜蜂代用花粉饲料生产技术规范、蜜蜂群势增长期饲养技术规范、蜜蜂饲粮使用管理规范、取蜜期蜂群管理规范及山东省中华蜜蜂饲养技术规范。胥保华，刘锋.撰写并通过评审山东省企业标准4项包括：西方蜜蜂复合预混合饲料、蜜蜂春繁饲料、西方蜜蜂秋繁期50%浓缩饲料、中华蜜蜂春繁期50%浓缩饲料。90