新型手性蜜胺衍生物设计、合成及其手性识别电喷雾质谱的研究 156页

Y8U2723分类号UDC密级——博士学位论文题．日堑型童：丝壁壁堑生堑煎选盐!金盛垦甚圭：堕遮型————鳢垫煎塞厦i逝峦——作者姓名型盘——一指导教师竖擅堑缎窀垦迸剑苎堑窀豆培养单位墨主堡鲎盘茎睦盔塑药塑堑宝题一专业名称～药缝j＆：盘堂论文提变日期量哟叠曼月!§旦学位授予单位士圜．厶．＆．竖莛星芏主星．茔．i±主睦中国人民解放军军事医学科学院制 博士学位论文中文摘要摘要随着手性化合物单一对映体在药物、天然产物、农业化学和材料科学等众多领域的广泛应用，手性分离分析已成为当今分析化学中的热点研究领域。组合化学和不对称合成化学的快速发展更是对手性分析提出了更快、更准确的要求。在这一背景下，质谱手性分析以其快速、准确、灵敏的特点成为一项有着巨大发展潜力和发展空间的手性分析新技术。但是目前质谱手性分析所使用的手性选择剂种类较少，手性识别的能力和范围也十分有限，因此寻找选择性高、识别范围广的手性识别体系成为了人们十分关注的课题。本论文的研究目的是寻找和开发具有高选择性的新型手性识别主体，探讨将手性蜜胺衍生物作为一类新型质谱手性选择剂的可能性及应用潜力，建立快速、准确、灵敏、简便的对映体分离分析新方法。论文分为以下几个部分：第一章：综述了电喷雾质谱在手性分离分析方面的应用及目前常用的质谱手性选择剂，提出论文的设计思路。第二章：为了研究多种非共价相互作用力对手性蜜胺衍生物手性识别能力的影响，设计合成了一系列带有不同手性或非手性基团、结构性质各异的手性蜜胺衍生物对映体。第三章：采用电喷雾质谱考察了所合成的手性蜜胺衍生物对19种天然氨基酸及部分手性药物的结合情况，探讨了各种非共价作用力在手性蜜胺衍生物与对映体分子结合过程中所发挥的作用。结果表明，蜜胺衍生物特殊的结构形式，使其可以很容易带上各种不同结构、性质的基团从而为手性识别提供多重相互作用，且在电喷雾质谱中易与被识别分子形成多聚物离子，在手性识别和质谱行为等方面均表现出了优良的质谱手性选择剂性质。部分手性蜜胺衍生物与氨基酸的结合可从一级质谱图上直接观察到手性差别，通过测定结合常数定量地描述了其结合过程中确实存在手性差异。第四章：采用电喷雾串联质谱考察了手性蜜胺衍生物对19种天然氨基酸及部分手性药物的手性识别能力，研究了影响手性蜜胺衍生物手性识别性能的各种因素，包括取代基空间结构及各种非共价相互作用力在手性识别中发挥的作用，深入探讨了手性蜜胺衍生物产生手性识别的机制和规律。结果表明设计合成的手性 博士学位论文中文摘要蜜胺衍生物对19种天然手性氨基酸具有较好的手性识别能力，且通过有针对性地改变蜜胺衍生物氨基上的取代基团，可对具有不同结构性质特征的目标化合物产生手性识剐。手性蜜胺衍生物对氨基酸产生手性识别的机理是，先以静电作用和／或氢键作用作为结合的主要驱动力，使蜜胺衍生物与氨基酸分子产生结合，然后再通过其它的非共价相互作用，特别是手性基团上的非共价相互作用(肌相互作用、空间位阻等)来产生手性识别。多种非共价相互作用力如静电、氢键、7【堆积、空间位阻等均在手性蜜胺衍生物对氨基酸的结合和识别过程中发挥了重要的作用。手性蜜胺衍生物的手性识别能力是多个基团的多重相互作用力均衡、协同作用的结果。第五章：采用电喷雾串联质谱结合核磁共振技术研究了合成的手性蜜胺衍生物对那格列奈异构体的识别情况及相互作用机理，结果表明，多数手性蜜胺衍生物能同时对三种那格列奈异构体产生识别。核磁共振实验结果进一步证实了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间产生了较强的氢键及兀-7c相互作用，但同时也反映出溶液状态下的簇集行为与气相条件下存在一定的差异。手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体的混合溶液的‘HNMR谱图在主要活泼氢的化学位移及质子裂分等方面均存在一定的、并可重复的差异，表明手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体之间的相互作用存在一定的手性差别，并且氢键在手性识别过程中发挥了非常重要的作用。第六章：建立了以手性蜜胺衍生物为手性选择剂的电喷雾质谱手性识别和对映体过量值测定方法。该方法简单、快速、灵敏度高、样品用量少、受杂质干扰小，可用于测定对映体过量小于10％的样品，具有较高的实用价值。第七章：对论文的主要研究成果及创新点进行了总结。本论文的研究表明手性蜜胺衍生物是一类颇具实用价值和潜力的新型手性选择剂，对其手性识别机理和识别规律进行研究以便进一步对其进行结构改造，开发设计出具有更广的手性识别范围和／或更高的立体选择性的手性识别主体，是一项十分有意义并具有广阔应用前景的工作。关键词：手性蜜胺衍生物，手性识别，电喷雾质谱，非共价相互作用，核磁共振对映体过量值II 博士学位论文Abstl?actC11iralityisofincreasingimp砸anceinmally丘eldssuch弱phaⅡnaceutics，ch哪icalindusⅡy，锄dagriculture，etc．More孤dmoresin甜e-钮锄tioInerSl埔Ⅳebeenresearchedanddeveloped．Asaresult，d伽昀ndforchimlrecognition甜lds印arationofchiralcompollIldshasincreasedinthep勰tf嘶decades．Atmesametinle，tlledevelopmemofmecombinationalchemistryand船ymmemcs”thesisrcquirechiralaIlalysismemodtobemorerapidandaccurate．Thus，massspec仃Dm酏ryhaSbecomeaIla哳activealtemativemetllodinchiralanalysisduetoitsmanyadVantagessuchasthespeedofanalysis，hi曲sensitivity"m01ccularspeci丘city，a11dsmall咖ountofs锄ple．However’limitedselectivityand1imitedapplicationrangeofrecognjtionofmechiralselectorsinchiralmassspectrometryisstillthemainpmblemthatshouldbesolved．Thesearchfbrnoveleitherbroadlyordedicatedlyapplicdblechiralselectorsisalwaysanopenfieldat仃actingthecreati诎yaIlde肋rtsofmeresearchers．ThegoalofthisstudyistotrytoexplorethepotentialityofchiralmelaminederiVatiVesasanewclassofselectorsusingchira】massspectromelr弘aflddevelopasimple，fast姐dsenSitivechiralanalysismethOd．ThedissertationisdiVidedint0followingsections：InmeinnDductorychapter，t11eapplicationoftheelectrosprayionizationmassspectrometryinchiraIa11aIysisandtIlemainctliralseIectorsinchimIm弱sspectrometryarereviewed．Theresearchproposalofthisdissertationw船presemed．hch印tertwo，as嘶esofncwchiralmel啪inederiVativeswimV耐0usN—substituentsweresynthesizedinordertobetterunderstalldmemleplayedbymestmctIlralfeaturesoftllemelaminederivativesontheen甜nioselectivepmpertiesandtoidentifymoreefrectiVechiralselectors．hlch印terthree，theag铲egationofthechiralmel锄ined耐Vativesandamin0acids(orsomechiraldrugs)inelec订oSprayionizationm勰sSpectrawasobserVedandinvestigatedtoelucidatetherolesplayedbyvariousnoncoValentinteractionsinmeprocessoftheassociation．TheresultsshowthatmelaminederiVatiVeshaVeuniquestructureandpmpe—esthatmakethemeasytop08sessV撕ousgroupsthatcanIIJ 塑圭兰垡堡苎些竺竺pmVidemultiplen黜tionsforchiralrcco弘ition，andtlleycanproducepolyInerclusters丽m锄ino∞idsinelec们spmyionizationmassspec仃蛳e时easily．SomcyareVe可sui￡abletobeemployed硒chiralselcctorsforMS觚alysis．M㈣ver"someobViousisom耐cdi侬栅cesinco“出inationcanbeobseⅣcddirectly舶mnlepeakabllIldatlcesinⅡlesin甜e-stagem醛sspec仃a，wllichcaIlbefilrtherprovedbyme踮u血gmeassociateconstant．Ch印terfourdescribesmeuseofelectrosprayionizationtalldemmassspectromen了toprobemechiralrecognitionabilityofchiralmel锄inederivatives．SomemechallismandregIllarityinthechiralreco印itionprocessusingch曲1mel锄inederivativesaschimlselectorswereelucidated．Theea’ectofdifR蝴tnoncovalentinteractionscausedbyvariouschiralorachiralmoietiesinmel啪ined甜Vativesonthechiralrccognitionhasbeenstudied．Theresultsshowthatthechiralmelaminederivativessynthesizedcouldprovideexcellentchiraldiscriminationsfor锄inoacids，andenantiodiscriminationforanaIyteswimdi丘brentsmlcturcaIldpropertiescouldbeimpmVedbymodif弭ngsubstituentsinmc1锄inederivativesonpurpose．ThefundamentalprocessaIldmechanismofthechiralrecognitionist11attllechiraigelectorandtheanaly亡earepulledtogemertof0肌polymerclustersbyhydrogenbond，electrostaticinteractiona11d7【一7cinteraction，whicharememain“、ringfbrcesforassociation．Then，someotherinteractions，especiallymeinteractionsonc11imlmoietieswill鹊sistt0acllievechjralrecognition．MIlldpleintefactionssuch船ele咖staticinteraction，hy出09enbond，丁c-兀stackingandstericiIlt鼬ctionbetweenselectorandaIlalytemayplayimponantrolesinmeassociationandcnaIltioselectiverecognitjonofaminoacids，柚dmcsemultipleinte∞ctionsshouldinteractinbala力ce肌dcoordinationtoobtainbetterc11iralselectivities．hlch印terfive，electr08prayionizationtaIldenlmasssp咖metr_ycoupledwimnuclearma印eticresonallceareusedtoinVestigatetllereco缈itionabilit)raIldmcchanismofchiralmel跏inederivativestowardNate百inide．TheresultsshowthatmostchiralmelaminederivativescaIlwellrecognizet11rceisomergofNateglinide．Theresultsofnuclearmagneticrcsonanceexperimentsshow廿1athydrogenbondsandⅡ。丌 博士学位论文Abs仃act缸emtions眦indeedfolmedbe咐ecnchiralmel锄inederivativesandNategliIIide，butmeaggregationbehaviorins01utionissomgwhatunliketllat血g鹊ph私e．The1HNMRspcctraofchiralmel锄inederiVativeswiuldiffbrentenantiomerofNategliIlides}lowtllemffbrenceinreactiVe—hydrogcns’chemicalshift锄dprotons’couplingspliningsuggestillg111att1】einteractionsbet、)lre即廿lechi删md锄i】1ed舐va石vesa11ddim粕nlNate91illidecnalltiomerarech曲ldiscriminalion，andhydrogenbondplaysanimportantmleintllechimlrecognition．Ch印tersixdesc抽esanelec仃0sprayionizationm勰sspec仃0memc证emodtomeasllretheenantiom谢cexc船susingchi谢ImelaminederiVatiVes．Themetllodissimple，rapid，sensitive，andcanbeusedtodeteminemixtureswithafewperc锄tenantiomericcontamination．Chaptersevensummarizesthemainresearchachievememsandthemaini衄ovationsinthedissertation．ThestudiesinthisdissertationshowⅡlatchiralmelaminederivativesareveryuse血1andhavegreatpotentialtobeanewclassofchiralselectors．Elucid如增themechanismaIldregularityinthechiralrccognitionprocessusingchiralmelaminederivativesaschiralselectorsisveryhelpmlforthe矗lnhermodmcationofthe曲兀lctIlreofthedhimlmelamined甜vatives，hence，toimprovechiralrecognition柚ddevelopeith盯bmadlyordedicatedly印plicablechiralselectors．Keywords：clliralmel锄ined甜vatives；chiralrecognjtion；E1ec缸Dsprayionizationmassspec仃ometry；Noncovalentinteractions；Nuclearmagneticresonallce；enantionl谢cexcessV 博士学位论文第一章绪论1．1手性分析的意义及重要性立体化学中的立体异构体(stereoisomers)是指分子中所有原子的连接顺序都相同，而原子(或基团)在空间排列方式不同的一对异构体。立体异构体又分为对映异构体(enaIltiomers)和非对映异构体(diastereomers)。对映异构体之间互为实物与镜像的关系，但由于分子中存在不对称因素，因此不能互相重叠，就如同人的左手与右手的关系，所以又称为手性分子，如图1．1所示的丙氨酸对映异构体。不存在实物与镜像的关系的立体异构体称为非对映异构体。CooHI．．玛掣≤：CooH≥‰图1．1丙氨酸对映异构体手性对映体通常具有相同的物理和化学性质，如相同的熔点、密度、折射率、溶解度、红外光谱、核磁共振谱以及在色谱上相同的保留时间等等。但它们之间也存在一定的差异：(1)两个对映体具有不同的旋光性，能将入射偏振光的偏振平面旋转相同的角度，但方向却正好相反。对映异构体因此也被称为光学对映体。当两个对映异构体以等量混合时，则表现为不能使平面偏振光偏转，称为外消旋体。(2)两个对映异构体在手性环境中的反应能力不相同，即两个对映体与其它手性分子之间的反应是存在差别的。随着科学技术的发展，手性问题已渗透到自然界的各个学科领域中【l‘5l。在材料科学中，用单一异构体的手性单体参与聚合得到的聚合材料具有特殊的性质，在轻质高强度材料及液晶材料中得到应用。在精细化学品领域，用途各异、涉及面很宽、分子结构差别很大的各类精细化学品，如杀虫剂、食品添加剂、香料等，其对映异构体常常表现出很不相同的生理活性，比如味精中L一(+)谷氨酸钠味 博士学位论文道鲜美，而D一(．)构型则令人不快。在生命科学中，生命体中由不同结构和构型的氨基酸、核苷酸及单糖分子组成的手性生物大分子或手性生物超分子体系，是蛋白质、核酸和糖复合物作为信息载体的重要物质基础，同时也为许多高立体选择性的生化反应提供了手性微环境，使得酶催化等复杂有序的生化反应得以顺利完成，这对于维持生命体正常的新陈代谢至关重要。在医药领域中，手性药物与生命体中的药物靶点发生作用时具有显著的立体选择性，药物对映体在生物体内的吸收、分布和代谢等存在显著差异，从而使它们之间可以产生不同甚至完全相反的药理和毒理作用。其中最著名的例子当属抗妊娠反应的药物肽胺哌啶酮(反应停thalido面de)，其(R)．对映体具有镇静作用，(s)一对映体却是一种强力致畸剂，20世纪60年代在欧洲由于使用其外消旋体，曾经导致许多畸形儿的出生。为了用药的安全有效，近年来许多国家的药政部门对手性药物的开发、专利申请及注册开始作出相应的规定，对于含有手性因素的药物倾向于发展单一对映体产品，并鼓励把已在外销售的外消旋药物转化为手性药物(手性转换)。随着对手性问题认识的逐步深入，以及诸多行业对单一对映体需求的急剧增加，手性分离分析日益引起科学界的广泛关注，并已成为当今分析科学中的重点研究课题。组合化学及不对称合成的快速发展更是对手性分析提出了更快、更简便、更准确的要求。研究手性超分子体系及手性识别的作用机制，不断开拓用于手性识别研究的新技术和新手段无疑是一项十分重要，同时也十分紧迫的任务。1．2电喷雾质谱及其在研究手性识别方面的优势除旋光性外，对映异构体基本上具有相同的物理和化学性质，这一特殊性增加了对映体分离分析的困难和复杂性。目前手性分析的原理大多是基于手性对映体与外界的手性环境之间存在氢键、疏水作用、静电作用等非共价相互作用，通过多位点识别作用形成非对映异构体复合物，利用非对映异构体在化学和物理化学性质方面的差异实现手性识别和分离‘61。常用的手性分析方法可大致分为非色谱法(旋光测定法【7]、紫外光谱法⋯”、荧光法陋1”、圆二色谱法【16’”1、x一射线晶体衍射法1181、核磁共振法(nuclearmaglleticresonance，NMR)[19_231等)和色谱法(气相色谱法‘24_261、液相色谱法阶301、毛细管电泳法卧331、超临界流体色谱法‘341 博士学位论文等)两大类。这些方法通常各有利弊，如旋光测定法和NMR法往往需要较大的样品量，旋光测定法还易受到杂质的干扰；x一射线晶体衍射分析需要首先获得合适的晶体，丽这往往是非常困难的；色谱法是目前应用最广，分析效果最好的手性分析方法，但同样存在分析周期较长等问题，同时手性色谱柱高昂的价格也在一定程度上限制了其推广应用。质谱法是近年来才逐渐应用于手性识别的“新”技术，它的出现和发展是和质谱技术本身的发展密切相关的。以往质谱技术很少被用于手性识别，一方面是因为对映体之间的质谱行为通常不存在任何手性差别，另一方面则是受到传统的质谱电离方式的限制。我们知道，通常产生分子识别的基础是识别分子与被识别分子之间产生弱的非共价相互作用，如氢键、静电作用、范德华力等等，而传统质谱电离技术如电子轰击等高能量的电离过程往往会破坏这些弱的相互作用。上世纪九十年代以后，以电喷雾质谱(elcc昀sprayionizationmassspectmmetry，Es州S)为代表的软电离质谱技术迅速发展起来。ES瑚s的离子化过程如图1—2所示。样品溶液通过带高压的不锈钢毛细管柱后形成高度荷电的小液滴，然后经过脱溶剂的过程，使待测物以单电荷或多电荷的形式进入气相。由于特殊的离子化方式，以及在电离过程中不涉及任何高能量的激发过程，对样品的破坏程度很小，采用电喷雾电离方式的质谱技术可以用来研究非挥发性的大分子化合物和以非共价作用结合的超分子复合物‘”。391，成为研究化学和生命科学中各种超分子组装、酶。底物、受体一配体、蛋白质．药物等的组成、结构、功能以及作用机制等的强有力手段【4¨81。#昌——二二二二=二二二)。：。。。^Ⅲw。p：：。。图1．2电喷雾电离化过程 博士学位论文通常情况下，质谱对单纯的对映体是没有识别能力的。采用电喷雾质谱进行手性识别的机理(见图1．3)是首先在体系中引入手性环境，如添加某种具有单一手性的识别分子，使其与对映体通过非共价相互作用如氢键、静电作用、范德华力、兀．丌堆积等形成非对映异构体复合物，含有手性对映体的非对映异构体复合物因具有不同的离子化效率和裂分行为，而在质谱图中表现出手性的差异。矗羹＆h旭矗l矗s手矬烈嚷耀含物图1．3质谱手性分析的原理图【59】将ESI-Ms技术应用于研究手性识别和分析的优势可以用四个“S”来概括‘棚，即专一(specificity)、快速(speed)、灵敏(sensitivity)，并能直接给出化学计量比(stoichiomot巧)。样品用量少，分析时间短是质谱方法相对于其它方法如M讧R、色谱法等较为突出的优点。EsI，Ms温和的电离过程使得以很弱的非共价相互作用结合的超分子复合物可以完整地被检测出来，通过高灵敏度和高质量准确度的质谱所提供的分子量信息，可直接推算出复合物各组分的化学结合计量关系，为研究超分子体系提供了重要的结构信息，从而有助于进一步探索手性识别的位点和机理。此外，由于研究的是气相条件下的手性识别，排除了溶剂的干扰，因此可以更加深入地考察各种内在因素对于手性识别能力的影响。ESI灯订S还能方便地与液相色谱和毛细管电泳等联用，为多种手性分离技术提供灵敏的质谱检测。将ESI／MS技术用于手性识别和分析突破了人们对于质谱技术不能用于手性研究的传统认识的束缚，是一项全新的前沿技术，具有广阔的应用前景。4 博士学位论文1．3电喷雾质谱在手性分析中的应用早期的质谱手性分析主要是采用化学电离(chhemicalIamzation，cI)质谱【6晰5】和快原子轰击(F船tAtomBombardmentIonization，FAB)质谱‘6“8，70。801，使用的方法有离子．分子反应法【61粕，6引、主(客)体交换反应法【69，B0】、对映体标记法【M71、相对峰强度法【70。73】和动力学方法[60，78刁9等等。采用CI进行研究时，要求样品产生明显的蒸气压，往往需要对样品进行加热，而这可能会导致样品的降解或解离，因此CI的方法不太适合分析分子量大，挥发性低的化合物。此外，由于受到离子源条件(如压力、温度等)的影响，采用CI的方法很难进行准确的定量分析【删。与CI相比，Ⅳ出技术是采用氩快原子流轰击基质中的样品使其产生准分子离子峰，电离过程无需加热，是一种相对较“软”的电离技术，比较适宜研究以弱相互作用结合的手性分子识别体系，如主一客体手性识别体系【4】。不过目前FAB-Ms用于手性识别研究仅限于极性相对较小的主体分子，这主要是由于主一客体复合物从基质向气态转化能力较低造成的。采用Ⅳ出进行手性分析时很难判断手性识别的过程到底是发生在溶液中，还是在临界状态或是在气相中【801。由于FAB基质中的化学是一个相当复杂的过程‘81·821，基质效应还可能会影响到产生手性识别的效果[8l】。另外，重复性差是FAB方法一个较为突出的问题，因此常采用内标法进行校正，操作过程较为繁琐川。随着质谱技术的发展，使用ESI／MS特别是具备碰撞诱导解离功能的EsI／MS府讧S在手性分析方面显示出更为突出的优势∞彤】。目前将电喷雾质谱技术用于手性识别和分析的研究在国际上还处于初始阶段，主要的研究方法可分为以下几种。1．3．1主客体交换反应法(Host唱uestexchaⅡgereactioⅡs)主客体交换反应法m86411是先通过EsI技术使手性主体化合物如大环类化合物环糊精(cyolodex啊n，CD)、手性冠醚等与客体手性分子形成非对映异构体复合物，然后引入另一种手性的或非手性的中性化合物分子(一般为非手性的胺)，使其与之前形成的非对映异构体复合物发生离子／分子交换反应，置换出其中的手性 博士学位论文客体分子。其原理见图1-4图1．4主客体交换反应法原理图【Host：B+H】++A其中Host为手性主体化合物，A为待分析的手性客体分子，B为与手性客体分子发生置换反应的中性化合物。由于手性客体对殃体分子具有不同的立体构型，在主体分子空腔中的空间取向、空间匹配和作用位点等方面存在差异，它们与主体分子以非共价相互作用所形成的非对映异构体复合物具有不同的作用强度，导致与中性分子发生离子／分子交换反应时会产生不同的交换速率，表现为同一时刻相应的离子峰的丰度不同，由此可进行手性区分。Leb一11a的研究小组采用该方法开展了一系列的工作陋931。如他们选用全甲基取代的B．CD和手性药物D．或L一安非他明(amphet锄ine，AMP)的混合物(1：100)溶于1：1甲醇／水溶液中‘船】，通过电喷雾技术将其引入傅立叶变换质谱仪中生成主一客体非对映异构体离子[cD：舢佃(D)一Hr或【cD：AMP(L)-H]+，然后向体系中引入可与上述非对映异构体离子发生竞争性交换反应的正丙胺分子(n_propylamine，Ⅻ"A)，观察到主．客体非对映异构体离子[cD：Alvm(D)-H】十和【cD：A^伸(L)．H】+的相对丰度随时间增加具有不同下降速率(如图1．5)，通过测量交换速率的差异可进行手性区分。结果表明，L．JWP与NPA发生交换反应的速率常数kI=0．40×10州cm3，m01．s，而D—AMP与NPA发生交换反应的速率常数kD_0．27×10川cm3／m01．s，手性选择因子S_kL／kD=1．46。若进行混合物中对映体过量值(enantiomerexcesses，ee)的定量分析㈣，则应首先建立某一时刻的【Host：A．H]+／{[Host：A．Hr+[Host：B．H]十)～D／(D+L)标准曲线。该种方法可用于分析对映体混合物中百分之几的ee。一计时一一一m枷愀 博士学位论文I．J～MplC0：AMP+Hr∞。N脚吨5001000’50020∞触扣u：^MP+HJ【cD：N脚H11IRe搴科iOntime：49se∞nd毫l图1．5不同时刻B．cD与触ⅡP混合物EsI-FTMs质谱图[88】(复合物【CD：AMP+II】+被挑选出来与正丙胺(压力3．2×10-7T0rr)进行反应)1．3．2手性离子／分子结合法(ChiralioⅡ，moIeculeassociati蛐1这种方法【92-951比较简单，通常是直接在待分析样品中加入～种手性选择剂，手性对映体分子与手性选择剂在电喷雾的过程中可通过非共价相互作用形成非对映异构体复合物。由于手性对映体分子具有不同的空间立体构型，它们与具有特定空间立体构型的手性选择剂之间产生的非共价相互作用会存在一定的差异，导致所形成非对映异构体复合物的强度或离子化效率有所不同，最终表现为一级质 博士学位论文谱图上特征离子相对丰度的差异。Cheng【93】等人采用ESI，MS考察了a一和p—CD对氨基酸1b和1W对映体的手性识别能力。以一级质谱图上CD／氨基酸复合物与CD的相对丰度比值，即R，Irz椭1儡t体】，来衡量主体对客体对映体分子的手性识别情况。结果表明，a-CD对D．．I姐的R值为2．76，而对L．1W的R值为1．72，如图1—6；p—CD对D-1印的R值为13．3，而对01b的R值为6．7。其手性识别的效果明显优于液相色谱方法的结果。以R对ee作图，线性关系良好(r2=o．9707)，可进行对映体过量值的定量测定。雠∞·删"l酾，5‘上-cydodex{r讯＼；一限．o～1．L蒜裂赫“谨I∽yc}od嘲m】⋯一秽测‰啪，ll州ydodex留lnl⋯’黼枷嘲(8)图1．6伽cD与(A)L．1"以及(B)D．Dr混合溶液的EsI质谱图‘931．3．3手性离子簇集体解离法(chiralioncIustersdissociation)手性离子簇集体解离法是目前质谱手性分析中使用最多的方法防婚n矾。其原理是利用串联质谱(tandemmassspectrome时，MS／MS)的碰撞诱导裂解(collision．in血ceddissociation，CD)功能使非对映异构体复合物发生解离，由于不同的手性对映体分子与手性选择剂之间形成的非对映异构体复合物在稳定性呻∞褂褂*∞柑静对慵。墓c．薹-乒*w∞"精鳙蚺蒲越幢。备曼-_暑一 博士学位论文方面存在差异，因此经过CD后所产生的碎片离子丰度会有所不同，由此可进行手性区分。相对于单级质谱而言，串联质谱受离子化效率、离子传输效率、样品纯度、浓度等外界因素的影响较小，通过对仪器的良好控制。可以获得较好的数据重复性，并且能够反映出由对映异构体形成的不同非对映异构体之间微小的能量差别【791。Cooks等人提出的动力学方法[59，叫“】是目前文献报道较多的方法。他们先通过ESI使手性分子(A)与过渡金属(M)离子(如cu”、zn2+、Ni2+等)以及另一种参比配体(ref)形成气相的三元复合物离子【M(ref)2A—H]+，然后通过串联质谱的CD使三元复合物离子发生竞争性裂分，生成二元复合物离子[M(re，)2．Hr和[M(rc，)A—Hr。由于手性对映体分子的构型不同，由三元复合物离子裂分产生不同的二元复合物离子的速率常数以及所需的能量(分别为△GR和△Gs)也不尽相同(如图l一7)，最终导致二级质谱中子离子(二元复合物离子)丰度比值的差异，如图l一8。嘲·印-啦氓矿睁H．1-^蕾I．÷嘲I■㈣矿·一图1．7三元复合物离子解离的自由能图[109】 博士学位论文l眦Thom‘nn图1．8(a)【Cu“(L．Pro)2(L。Hr)．H】+·∞庀473)和(b)【Cull皿一Pro)2(D一耐r)。H】+．(小／z473)的cID谱图(Hr为分析物，L-Pro为参比配体)‘971定义R：坐!型：21二丝3：，当样品中仅含有R构型时，[肘(Ⅳ’)：一Hr月=R。=％嚣焉器；若样品中仅含有s构型时’胄=凡=笮簧端’手性差异可用只c^加踯厣倪s来衡量。当R曲f。尸1时，表示不存在手性差异：R。^删偏离1越远，则手性差异越明显。同时可证明lnR与∞存在如下关系式：I。R：墼±丝+丝二箜。丑tr2Rr其中R为气体常数。该式表明l衄和ee之间存在线性关系。因此可先用已知配比的对映体混合物绘制标准曲线，然后进行对映体过量的定量分析。结果表明该方法具有快速、灵敏、准确等诸多优点。不过该方法对所选用参比配体有一定的要求【9引，由于解离过程总是倾向于产生更稳定的子离子，因此参比配体的结构和’眭^％)基寡罨薯重《鼙盅苫鼙珥 博士学位论文绪论质应尽量与待分析物相似，这样才能保证CD谱图中可同时观察到两种子离子『M(ref)2一H】+和【M(rcf)A—H]十。这在一定程度上限制了该方法的应用范围。另外，Y幻【“54”增人也利用含有手性对映体的非对映异构体复合物在串联质谱中裂分行为的差异对氨基酸对映体进行了手性识别。但与coob的方法不同，他们采用手性氨基酸衍生物(Y)作为手性选择剂，使其与天然手性氨基酸分子(x)通过非共价相互作用形成多聚非对映异构体复合物(xYn)。经过碰撞诱导解离，xYn裂分为【xYn．1H】+和Y。含不同对映体的非对映异构体复合物具有不同的解离能量，表现为质谱图中子离子【xY。．1H】+与母离子[xYnH]十丰度的比值存在差异。就每一种复合物离子而言，对手性选择剂与手性分析物的四种组合(LD、DL、DD、LL)都进行考察，并将手性识别因子定义为：cR：!【圣兰：!旦：塑圣兰蔓：3k!竖必：![茎兰：!蔓：班!苎坚：]2些±!【!堕：!坚：3丛茎羔旦：12驰⋯(p(Mt．，H+]／【xYnH+])。⋯。hi州([xYn．·H+]／[x‰H+])L。+(p(、_．·H+]／[xYnH+】)DD以此来衡量手性差异。同样当cR=1时，表示不存在手性差异；CR偏离l越远，则手性差异越明显。这种定义方式可减少测量所带来的误差。目前这一方法被成功应用于混合物中氨基酸的手性分析。经推导，非对映异构体复合物离子的解离速率r(一XY。．1H】十／[xY。H]+)与对映体过量值(ee)相关。ee=100(1／(rL-r0)一1，(rD．r0)]／[2／(r-r0)．1／(rL．r0)．1／(rD—r0)]，其中rL、rD、ro和r分别为L构型、D构型、外消旋体及待测样品测得的解离效率。该方法测得的对映体过量值误差在2％以内。1．3．4其它方法除了以上几种方法之外，采用电喷雾质谱进行手性分析的方法还有对映体标记法和质子传递法等，但由于过程复杂或使用范围较窄等原因，文献报道较少。对映体标记法(enantiomer．1abeledmethod)⋯8，119】是对手性选择剂分子的其中一个对映体进行同位素标记，然后将已标记的手性选择剂分子(假设为R构型)和未标记的手性选择剂分子(则为S构型)按1：l的比例混合并与待测物分子反应形成非对映异构体。由于进行了同位素标记，所形成的非对映异构体能够进行 博士学位论文质量区分，因此可研究手性选择剂对待测手性分子的手性识别能力。质子传递反应法(proton仃∞sferreaction)【’20·12”是采用电喷雾的方法使细胞色素c(cyIochromec)带上多电荷成为[cytochromec】”(n_7．9)，然后将其引入傅立叶转换离子回旋共振质谱中含有手性胺(如R-或s．2．丁胺)的分析室内，【cyfocl啪mec】n十向不同构型的胺传递质子的速率存在明显的差异，表现为[cycocl们mec】n+由高价态转交为低价态的速度不同，从而可进行手性区分。1．4常用质谱手性选择剂前面已经提到，对映体的质谱行为往往不存在任何的手性差异，只有在体系中加入某种手性选择荆，与对映体形成非对映异构体复台物之后，才能在质谱上观察到手性的差异。由此可见，手性选择剂的使用在质谱手性分析中起着十分关键的作用，其重要性甚至已经超过了分析方法本身。目前常用的质谱手性选择剂主要有以下三种类型。1．4．1手性包络主体主要是具有手性空穴的主体分子，如CD、手性冠醚‘69。74。76】等。对映异构体可进入其空穴中形成主．客体复合物离子(包合配合物)。手性客体对映体由于具有不同的立体构型，在主体分子的空腔中的空间取向、空间匹配和作用位点等方面存在差异，因此形成了具有不同作用强度的非对映异构体离子。cD是一类由不同数目的毗喃葡萄糖单元以小l，4。糖苷键相连并互为椅式构象的环状低聚糖，常见的为6，7，8聚体，即旺，p，Y．cD。cD分子呈笼型结构，向内的Ⅱ．1，4一糖苷键使得腔内的电子云密度高，具有疏水性，而腔外具有亲水性，可包结大小适宜的有机分子。每个葡萄糖单元具有5个手性中心，由n个葡萄糖单元组成的CD具有5n个手性中心，为手性识别提供了良好的不对称环境。此外，CD分子上的2，3，6位羟基由于具有不同的反应活性，可以进行选择性修饰，制各成不同性质的手性选择剂。Lebmla【蹦州1等采用主客体交换反应的方法用傅立叶变换质谱考察了全甲基取代的cD(如图1—9)对一些手性药物(如D．和L广多巴、青霉胺和麻黄碱)【881、氨基酸【869”、非天然氨基酸‘删及多肽嗍的手性识别 博士学位论文能力。研究结果表明，在以cD为主体的客体交换反应中，客体分子的空间立体因素(如尺寸、形状、刚性等)比它们在气相条件下的稳定性等其它因素都重要，是影响客体与CD分子之间结合强度的主要因素。此外他们还用三点作用的模式解释了CD对小氨基酸类化合物的手性识别机理。图1．9全甲基环糊精结构示意图a．1翻_Cn：nz’§{慨n《Y-．轴co：nt3手性冠醚为大环聚醚，与CD类似，也具有手性空穴，易和一些金属离子、铵离子以及中性分子形成包合配合物。sawada[72以761等以一系列环的大小和侧臂基不同的手性冠醚为识别主体(部分手性冠醚的结构见图1．10)，采用Ⅳ出MS对一些手性胺和氨基酸酯盐进行了手性识别及对映体过量值的测定。研究表明，手性冠醚空穴大小、刚性、侧臂手性基团的大小及位置等因素都对冠醚的手性识别性能有显著的影响。LiaIlg【8伽和Chu㈣等人则采用主客体交换反应的方法考察了手性冠醚2对几种手性胺，如Ⅱ．苯乙胺、Ⅱ．(1一萘)乙胺等的手性识剐情况。与3．1节中的方法略有不同的是，他们不是引入一种中性客体分子与手性待测物发生置换反应，而是引入另一种主体化合物如未取代的18．冠．6来与识别主体分子(手性冠醚2)一起竞争与客体分子的结合。手性胺对映体分子由于空间构型不同，导致与两种冠醚分子主体进行竞争性结合时会产生不同的结合速率，表现为同一时刻相应的离子峰的丰度不同，由此可进行手性区分。手性冠醚化合物由于受到自身性质的影响，目前其手性分析的对象多为胺类化合物，或是含有氨基的化合 博士学位论文物，如氨基酸酯等。oMe3图1．10部分手性冠醚化合物的结构1．4．2手性金属配合物这类手性选择剂是由过渡金属离子。如cu(II)、co(II)、Ni(II)等，和手性有机配体(多为氨基酸及其衍生物)通过配位相互作用构成的手性金属配合物。手性金属配合物可与手性对映体分子形成的三元非对映异构体复合物。由于对映体之间的空间构型不同，所形成的三元非对映异构体复合物也因此具有不同的结构稳定性和能量，在进行碰撞诱导解离(cD)时其碎裂程度也会有所差异，表现为CD谱图中特征离子丰度的不同，由此可在进行手性区分。Cooks[59’96Ⅲ11等将含有手性分子(A)、参比配体(re产)与金属过渡离子(M)的水／甲醇混合溶液通过ESI技术形成气相的三元金属配合物离子，用串联质谱将需要的三元金属配合物离子【M(ref)2A—H]十挑选出来通过竞争性裂分途径生成二元金属配台物离子【M(ref)2一H】+和【M(ref)A—Hr，如图1—11所示，然后采用4oD、吣J．翠。幕矿忡久l℃一天Yo臻 博士学位论文动力学方法进行手性区分。芈冬娜阶瞪√‰M呀卜吲++酽t夕嘲lfe‰一雕+钿or国丽赢叫^s辅l‘矿12一时<孙、L‰M{ref-l一川++rer奄图1．1l金属配合物离子的竞争性裂分过程例以氨基酸为例，C00ks[59】认为氨基酸与金属离子M(II)之间的作用主要是氨基酸的氨基和羧基与金属离子之间形成了配位键，氨基酸的侧链基团虽然产生的作用较弱，却在手性识别中发挥着关键的作用。例如当参比配体为芳香氨基酸时，手性识别能力会大大提高，说明7r一阳离子相互作用在空间作用中扮演了重要的角色。由于使手性对映体分子形成非对映异构体复合物的前提是与金属离子形成配合物，因此采用手性金属配合物作为手性选择剂时，分析物应具有能与金属离子形成配合物的结构，如氨基酸及其衍生物【96，97，104，1091、羟基酸㈣、多肽㈣，1071、糖【1021以及一些含羟基、羧基或氨基的手性药物【98，103’108】等。1．4．3手性小分子化合物还有一类手性选择剂是可以直接与对映体分子进行化学反应或可通过氢键、冗一耳堆积、偶极吸引等非共价相互作用与对映异构体形成非对映异构体复合物的手性小分子化合物。由于手性对映体分子的空间结构不同，它们与手性选择剂发生化学反应的能力、产生非共价相互作用的强度，以及所形成的非对映异构体复合物的稳定性等方面会存在一定的差别，最终表现为质谱图上特征离子峰强度的差异。在cI【611中两个二烷基酒石酸盐对映体分子所形成的二聚体离子的丰度明显比由两个相同构型的二烷基酒石酸盐分子形成的二聚体离子的丰度低，是手性分子进行自身识别的结果。陈耀祖等【61】在CI—MS的离子源中引入手性试剂L．戊醇，使其与不同构型的仳．氨基酸和0【一羟基酸反应，形成具有不同离子丰度的特征离子， 博士学位论文从实现了对甜氨基酸和a．羟基酸的手性区分。他们【62】还先后开发了一系列成对的手性反应试剂Ⅸ。苯乙胺等，用于测定许多手性分子如奎宁、扁桃酸甲酯、甲氧基苯乙酸、苦杏仁酸、麻黄碱、伪麻黄碱、苹果酸、辛可宁、辛可宁丁、乳酸以及各种氨基酸的绝对构型。在研究中他们还发现当反应试剂和所测样品的构型相同时，经过cI．MS解离后获得的特征离子的相对丰度要高于相异构型的试剂反应所产生的特征离子的相对丰度。‰【115。”1等人采用手性氨基酸衍生物作为手性选择剂，使其与天然手性氨基酸分子通过非共价相互作用形成的多聚非对映异构体复合物。经过碰撞诱导解离后，含不同对映体的非对映异构体复合物由于具有不同的解离能量，所产生的予离子与母离子丰度的比值存在一定的差异，由此可进行手性区分。他们同时还讨论了氨基酸侧链的结构对产生手性识别的影响。1．5本课题的设计思路随着组合化学和不对称合成化学的快速发展，对手性分析提出了更快、更准确的要求。在这一大背景下，质谱手性分析以其快速、准确、灵敏的特点成为了一项有着巨大发展潜力和发展空间手性分析新技术。但是从前面的介绍我们可以看到，目前用于质谱手性分析的手性选择剂的种类还比较少，识别能力及识别范围也十分有限，因此寻找选择性高、识别范围广的手性选择剂成为了人们十分关心的课题。从当前手性选择剂研究的发展趋势来看，研究者们在充分利用天然存在的手性化合物作为手性识别的主体，并对其进行修饰和结构改造使起产生尽可能大的手性识别能力之后，研究的热点已逐步发展成为设计和构筑新的手性识别主体。本课题的研究目的正是寻找和开发具有高选择性的新型手性识别主体，建立快速、准确、灵敏、简便的对映体分离分析新方法。开发新型高效能手性识别主体的有效途径之一是在一个非手性的主体上连接多个手性的分支‘m】。蜜胺(MelaIIline，M)就属于这样一类结构比较特殊的主体，蜜胺类化合物的分子结构式如图l一12所示。由于分子中同时存在质子的供体和质子的受体，因此蜜胺类化合物很容易同其它化合物产生较强的氢键作用，蜜胺类化合物同氰尿酸／或巴比妥酸及其取代衍生物通过互补氢键形成的超分子氢键簇 博士学位论文绪论集体是超分子化学中研究的一个经典体系【惶3，佗“。此外通过改变蜜胺类化合物侧链氨基上所连接的基团，如羰基、芳香基团等，还可以增加分子之间的其它相互作用。根据Dagelish的三点手性识别理论【12扪，产生手性识别的机理是手性选择剂与对映体之间产生多种相互作用，如氢键、偶极．偶极作用、纠r作用、静电作用、疏水作用或空间作用等等，而其中至少有～个应该具有立体选择性。由此提示我们合成侧链上带有手性基团的蜜胺衍生物，并可作为一类新的手性识别主体。R1＼NHlR2／R3图1．12蜜胺分子的结构式目前将手性蜜胺衍生物作为手性选择剂的报道很少，仅有Uccello-Ban坝ta等人【j”】曾经采用NMR的方法在CD3cl中考察过蜜胺衍生物2-hexyl锄ino一4，6-bis-L—valyl-l·V“ineisopropylester-1，3，5一triazine对某些手性3，5．二硝基苯甲酰胺衍生物的手性识别能力，但并未取得满意的结果。在这里我们则尝试将蜜胺类化合物作为一类新的质谱手性分析的手性选择剂进行研究，一方面是源于蜜胺类化合物自身性质的特殊性使其具有成为新型手性识别主体的可能性；另一方面则是由于该类化合物在气相条件下发生的相互作用和识别机制会与其在溶液条件下的情况存在一定的差异，因此具有进行深入研究和探讨的意义。开发手性蜜胺衍生物这类新型手性识别主体的优势在于，我们可以通过分析被识别分子的结构，有目的地对主体分子(蜜胺类化合物)进行设计合成，引入特异性的识别位点，从而达到选择性识别的目的。本课题的研究目的是考察将手性蜜胺衍生物作为～类新的质谱手性选择剂的可能性及潜力，并探讨其产生手性识别的机理和规律，以便进一步对其进行结构 博士学位论文改造，开发设计出具有更广的手性识别范围和更高的立体选择性的手性识别主体。在考察手性蜜胺衍生物的手性识别能力时，我们首先选择了以氨基酸作为识别对象进行研究。一是因为氨基酸是组成生命大分子蛋白质的基本单元，在生化领域发挥着重要的作用，20种天然Ⅱ．氨基酸中有19种是具有手性的，对氨基酸及其衍生物的手性识别研究对进一步从理论上阐述生命过程的化学本质，发现新的化学过程具有十分重要的意义。二是因为氨基酸的结构比较独特(19种天然氨基酸结构式见附录I)，可以产生多种非共价相互作用，为手性识别提供了必要的条件，很适合作为手性识别的底物。同时，19种天然吐．氨基酸的侧链基团各不相同，结构差别很大，便于我们系统地考察各种不同的非共价相互作用在手性蜜胺衍生物手性识别过程中所发挥的作用及其识别机制。为了充分揭示蜜胺衍生物的结构与其手性识别功能之间的关系，以便设计出性能更好的手性识别主体，我们以氰尿酰氯为反应起始物，选择具有脂肪链、芳环等几种结构和性质不同的胺或手性胺，合成了一系列结构性质各异的手性蜜胺衍生物。通过改变侧链氨基上的取代基团，用ES“Ms和EsⅢS／MS考察了各种不同的非共价相互作用如氢键、黼相互作用、静电作用、空间位阻等对产生手性识别的影响，并以核磁共振等方法为辅助手段，试图揭示手性蜜胺衍生物产生手性识别的一些机理及规律性问题。同时将获得的手性识别能力较好的手性蜜胺衍生物用于某些手性药物的分析及对映体过量值的测定。目前，以手性蜜胺衍生物作为手性识别主体，并用质谱的方法对其手性识别能力及产生手性识别的机制进行系统考察，在国内外尚未见文献报道。 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定第二章手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定2．1引言合成蜜胺衍生物的方法有很多，其中一个简单快速的方法【123，Ⅲ，’261是以氰尿酰氯为反应起始物，使其与胺发生分步亲核取代反应，生成蜜胺衍生物。由于氰尿酰氯是一种廉价、易得的原料，且其分子结构中的三个氯受三嗪环结构的影响非常活泼，极易与其它化合物发生亲核取代反应，因此这种方法成为了蜜胺衍生物合成中被广泛采用的方法。如下所示(图2．1)为该方法的一般合成路线图：。V。一k“V“。”V“7≥辛”一图2．1蜜胺衍生物合成路线图2．2实验部分2．2．1材料与试剂氰尿酰氯、二丁胺、特丁基苯胺、二异丙基乙基胺(N，N·diisopropylethyl锄ine，DmEA)、4’一氨基苯并15．冠一5、R(+)心苯乙胺、S(一)。旺．苯乙胺、R(+)廿萘乙胺、S(一)一o【一萘乙胺、R(一)．1．甲基一3一苯丙胺、S(+)一1．甲基．3一苯丙胺、R(．)一2一丁胺、S(+)一2一丁胺、均为Acros公司产品；L．苯丙氨酸乙酯由本所药化室提供：实验用水为双蒸水，其它试剂如甲醇、乙醇、四氢呋哺(te缸北ydm船an，THF)、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、苯均为分析纯。THF经重新蒸馏纯化后用钠丝干燥保存，二氯甲烷用无水氯化钙干燥保存。Kieselgel60F254薄层层析板(德国Merck公司)；柱层析硅胶(试剂级，200一300目，青岛海洋化工厂分厂){GF254薄层层析硅胶(化学纯，青岛海洋化 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定工有限公司)。2．2．2仪器Perkjn．ElInef24lMC型旋光仪(美国PE公司)；刑M．ECA400MHz超导核磁共振波谱仪(日本JEOL公司)；LCT高分辨飞行时间质谱(英国waters公司)。2．2．3实验方法旋光度用Pe埘n—Elmer241MC型旋光仪测定，采用ldm标准石英旋光管，甲醇为溶剂，测定温度20℃；核磁数据由JNM．ECA400瑚z超导核磁共振仪测定，CDCl3为溶剂，四甲基硅烷(TMs)为内标；高分辨质谱数据由LcT高分辨飞行时间质谱仪测定，样品溶于甲醇，采用正离子检测模式，直接注射进样，源温100℃，脱溶剂温度250℃，脱溶剂气流量350Lm，毛细管电压3kV，样品锥孔电压10v，抽取锥孔电压5v，仪器分辨率大于6000。2．3手性蜜胺衍生物的合成与结构确证2．3．1所合成的手性蜜胺衍生物的结构式目前共合成了12对手性蜜胺衍生物对映体(其中化合物11只合成了s构型，即11b)，结构式见图2．2。 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、台成与鉴定1la：Rlb：S33a：R3b：S∑纩飞，乜44a：R4b：S565a：R6a：R5b：S6b：S图2．2手性蜜胺衍生物结构式21 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定卅D“Hj、．H／c如077a：R．R7b：S．S1111a：R11b：S88a：&R8b：S．S1010a：R10b：S“早“图2．2(续)手性蜜胺衍生物结构式1212a：R12b：S砭∞、6 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与罄定2．3．2合成与鉴定4一氨基-6_二丁胺基-2-【(R)．伽苯乙胺基卜l，3，5．三嗪(1a)与4．氨基．丘二丁胺基-2一【(s)一泓苯乙胺基卜1，3，5．三嗪(1b)将含O．309(2．5mm01)(R)．甜苯乙胺(或(S)．洳苯乙胺)的THF溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含0．469(2．5咖01)氰脲酰氯及lmL二异丙基乙基胺(DⅢEA)的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7muHF，lmL二丁胺，1mLDPEA，40℃回流30小时。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLCHCl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集CHCl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。1a：O．539(62％)：[Ⅱ]D20=+66．2。(C=1-96；CH30H)：‘HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：O．80-0．90(t，6H，CH3)，l，05—1．50(m，11H，CH2，CH3)，3．32—3．45(m，4H，CH2)，4．96-5．16(m，lH，CH)，5．86(brs，2H，NH2)，6．94(brs，H，NH)，7．12—7．15(m，1H，Ar}{)，7．22—7．24(m，2H，ArH)，7．24·7．28(m，2H，ArH)；HRMS(ESD：C19H3IN6(MH+)，计算值343．2610，测定值343．2615。1b：o．509(59％)；【Ⅱ]D20=一65．4。(c=1．96：cH30H)；1HNMR(400～Ⅱ{z，cDcl3)，6(ppm)：O．80一O．90(t，6H，CH3)，1．05—1．52(m，1lH，CH2，CH3)，3．34—3．46(m，4H，CH2)，4．95．5．15(m，lH，CH)，5．88(brs，2H，NH2)，6．95(brs，H，NH)，7．14．7．17(m，1H，ArH)，7．22—7．24(m，2H，ArH)，7．25—7．30(m，2H，ArH)；HRMS(ESD：C19H31N6(M矿)，计算值343．2610，测定值343．2618。4．氨基．6．二丁胺基．2．【(R)．静(1．萘)乙胺基1-1，3，5·三嗪(2a)与4-氨基-6-二丁胺基．2．I(s)．值．(1．萘)乙胺基卜1，3，5-三嗪(2b)将含o．439(2．5mm01)(R)一q一(1一萘)乙胺(或(S)一n一(1一萘)乙胺)的1l{F溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含0．469(2．5mm01)氰脲酰氯及1mLDIPEA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、台成与鉴定液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，lmL二丁胺，1mLDDEA，40℃回流30小时。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLcHCl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集CHCl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。2a：0．569(57％)；陋】D20=·118．00(C=1．16；CH30H)；1HNⅣ限(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：O．82—0．93(t，6H，CH3)，1．15一1．53(m，8H，CH2)，1．57—1．62(d，3H，CH3)，3．30—3．50(m，4H，CH2)，4．7l(brs，2H，NH2)，5．39(brs，H，NH)，5．92-5．96(m，1H，CH)，7．35—7．40(m，1H，ArH)，7．45—7．55(m，3H，ArH)，7．70-7．75(m，1H，ArH)，7．82—7．87(m，1H，ArH)，8．11-8．16(m，lH，ArH)；HIu讧S(ESI)：C23H33N6(MH+)计算值393．2767，测定值393．2777。2b：O．499(50％)；【a】D20-+116．1。(C=146；CH30H)：1HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：0．81一O．92(t，6H，CH3)，1．15—1．53(m，8H，CH2)，1．59-1．64(d，3H，CH3)，3．30．3．50(m，4H，CH2)，4．72(brs，2H，NH2)，5．29(brs，H，NH)，5．90—5．95(m，lH，CH)，7．34—7．42(m，1H，ArH)，7．46—7．57(m，3H，ArH)，7．70一7．76(m，1H，ArH)，7．84．7．89(m，1H，ArH)，8．13—8．18(m，lH，ArH)；HRMS(ESI)：C23H33N6(MH+)，计算值343．2767，测定值343．2771。4．氨基．6．二丁胺基．2．I(R)．1．甲基．3．苯丙胺基l_l，3，5·三嗪(3a)与4-氨基岳二丁胺基．2．I(s)．1．甲基．3．苯丙胺基1-1，3，5·三嗪(3b)将含O．379(2．5mm01)(R)．1．甲基一3．苯丙胺(或(S)一1一甲基-3·苯丙胺)的THF溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含O．469(2．5mm01)氰脲酰氯及1mLD口EA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，lmL二丁胺，1mLDPEA，40℃回流30小时。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLCHCl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHCl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯 j童：主堂堡堕兰量丝窒堕堑生塑些堡生：垒盛皇竺塞甲烷，乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。3a：o．559(60％)；[晓】D2喧．22．1。(c=1．16；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDcl，)，6(ppm)：O．85一O．95(t，6H，2CH3)，1．15-1．25(d，3H，CH3)，1．25．1．40(m，4H，2CH2)，1．48一1．60(m，4H，2CH2)，1．72-1．85(m，2H，CH2)，2．60．2．70(m，2H，CH2)，3．38—3．50(m，4H，CH2)，4．05—4．15(m，lH，CH)，4．64(brs，H，NH)’4．67(brs，2H，NH2)，7．12-7．20(m，3H，Ar岣，7．20—7-30(m，2H，ArH)；HRMS(ESD：C2lH35N6(M矿)，计算值371．2923，测定值371．2929。3b：0．489(52％)；【值】D20=+22．7。(C=1．15；CH30H)；1HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：0．85—0．97(t，6H，2CH3)，1．16—1．22(d，3H，CH3)，1_22-1t36(m，4H，2CH2)，1．49—1．60(m，4H，2CH2)，1．74—1．86(m，2H，CH2)，2．60—2．72(m，2H，CH2)，3．40-3．50(m，4H，CH2)，4．04-4．14(m，lH，CH)，4．6Ims，H，NH)，4．63ms，2H，NH2)，7．12-7．20(m，3H，ArH)，7．20-7．30(m，2H，ArH)；HRMS(ESI)：C2lH35N6(MH+)，计算值371．2923，测定值371．2918。4．氨基．6．二丁胺基．2．【(R)．2．丁胺基卜1，3，5．三嗪(4a)与4．氨基．6．二丁胺基-2-【(s)-2一丁胺基】．1，3，5．三嗪(4b)将含1mL(5．9mm01)二丁胺的THF溶液(5mL)缓慢滴加到lOmL含1．19(6mm01)氰脲酰氯及1mLDIP队的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得淡黄色固体，甲醇重结晶后得2一氨基．4一二丁胺基．6．氯，1，3，5一三嗪白色晶体1．29(79％)，质谱(EsI)鉴定为州z258．1(M+H)。称取2·氨基4二丁胺基一6一氯．1，3，5一三嗪O．369(1．4mm01)加入7Ml哪，1mLD口EA，(R)一2一丁胺(或(s)一2一丁胺)O．14mL(1．37mm01)，40℃回流7天。停止回流向溶液中加入25mLcHcl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHcl3层，用无水MgSO。干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以氯仿为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。4a：0．219(51％)；【a】D20_+13．4。(c=1．00；cH30H)；1HNMR(400MHz，CDCl3)， 旦主兰垡丝壅——————～量丝查堕塑生塑盟堡盐：鱼盛皇篓塞6(ppnl)：0．8l-O．95(t，12H，4CH3)。1．12-1．60(m，19H，8CH2，CH3)，3_36．3．50(m，8H，4CH2)，4．98—5．15(m，lH，CH)，6．91(brs，H，NH)，7．10．7．14(m，1H，ArH)，7．23-7．26(m，2H，AI哪，7．28—7．32(m，2H，A坩)；碰ms饵sD：c15如IN6似H+)，计算值295．2610，测定值295．2618。4b：o．239(57％)；【旺】D20=一12．7。(c=1．03；cH30H)：‘HNMR(400Ⅻz，cDcl3)，6(ppm)：0．82一O．97(t，12H，4CH3)，1．10·1．60(m，19H，8CH2，CH3)，3．35．3．48(m，8H，4CH2)，4．98—5．13(m，lH，CH)，6．93(brs，H，NH)，7．10-7．15(m，1H，ArH)，7．23—7．26(m，2H，ArH)，7．28·7．32(m，2H，mH)；HRMS(ESI)：C15H3lN6叫H+)，计算值295．2610，测定值295．2615。6．氨基_4．(4，．特丁基苯胺)．2．【(R)．洳苯乙胺1．1，3，5．三嗪(5a)与6．氨基．4．(4，．特丁基苯胺)．2．【(s)．a．苯乙胺】-l，3，5．三嗪(5b)将含0．379(2．5mm01)4’．特丁基苯胺的THF溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含O．469(2．5mm01)氰脲酰氯及lmLDPEA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，1mLDPEA，0．39(2．5mm01)(R)．a．苯乙胺(或(S)．旺-苯乙胺)，40℃回流8天。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLcHcl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHCl3层，用无水Mgs04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／甲醇(95：5)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得白色固体。5a：O．479(52％)；[砌D2‘I_+107．2。(C=1．04：CH30H)：1HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：1_29(s，9H，CH3)，1．47-1．49(d，3H，CH3)，5．01(brs，2H，NH2)，5．15-5．20(m，1H，CH)，5．6l(brs，H，NH)，7．20-7．32(m，7H，J虹H)，735—7．40(m，2H，ArH)；HRMs(EsI)：c2lH27N6(M扩)，计算值363．2297，测定值363．2305。5b：o．509(55％)；【旺】D2。一104．7。(c=1．18；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDcl3)，6(ppm)：1．30(s，9H，CH3)，1．47—1．50(d，3H，CH3)，5．13(brs，2H，NH2)，5．16—5．22fm，1H，cH)，5．68(brs，H，NH)，7．22·7_33(m，7H，ArH)，7‘37—7．43(m， 塑主兰垡篓苎兰丝窒些塑皇塑塑堡兰：垒堂皇鳖塞2H，ArH)；}碾MS(ESD：C21H27N6(M一)，计算值363．2297，测定值363．2309。岳氨基．4一(4’—特丁基苯胺)-2一I(R)-洳(1-萘)乙胺1．1。3，5_三嗪(6a)与6_氨基-4-(4’-特丁基苯胺)-2一【(s)-廿(1一萘)乙胺】-1，3，5-三嗪(6b)将含O．379(2．5mm01)4’一特丁基苯胺的1HF溶液(5mL)缓慢滴加到lolnL含O．469(2．5mm01)氰脲酰氯及1mLD口EA的唧溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，1mLDPEA，O．439(2．5mm01)(R)．c【，(1一萘)乙胺(或(S)一旺一(1一萘)乙胺)，40℃回流lO天。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLCHCl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集CHCl3层，用无水Mgs04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／甲醇(95：5)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得白色固体。6a：O．509(48％)；【a】D20=．136．7。(C=1．09；cH30H)：1HNMR(400MHz，CDCb)，6(ppm)：1．21(s，9H，CH3)，1．63—1．65(d，3H，cH3)，4．87(brs，2H，NH2)，5．68(brs，H，NH)，5．90一5．99(m，lH，CH)，6．68(brs，H，NH)，7．25—7．29(m，2H，ArH)，7-35—7．38(m，1H，ArH)，7．45-7．55(m，5H，ArH)，7．72—7．78(m，lH，ArH)，7．89—7．93(m，1H，ArH)，8．13．8．17(m，lH，ArH)；HRMs(EsI)：c25H29N6(MH+)，计算值413．2454，测定值413．2450。6b：o．559(53％)；【Ⅱ】D20=斗138．6。(c=1．10；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDcl3)，6(ppm)：1．20(s，9H，CH3)，1．63一1．66(d，3H，CH3)，4．85(brs，2H，NH2)，5-66(brs，H，NH)，5．90．5．99(m，lH，CH)，6．67(brs，H，NH)，7．23—7-27(m，2H，ArH)，7．35—7．39(m，1H，Ar}I)，7．44—7．53(m，5H，Ar}I)，7．7l一7．76(m，1H，ArH)，7．89—7．92(m，1H，ArH)，8．12．8．17(m，1H，ArH)；HRMs(EsI)：c25H29N6(MH+)，计算值413．2454，测定值413．2448。6．氨基．2，4．二．(R)．n．苯乙胺基．1，3，5-三嗪(7a)与6一氨基-2，4一二-(s)．洳苯乙胺基．1，3，5．三嗪(7b) 羔垡：堂堡墼兰丝查堕堑生塑塑墼生：鱼堕皇些塞将含0．309(2．5n瑚01)(R)一洳苯乙胺(或(S)．旺．苯乙胺)的THF溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含0．469(2．5mm01)氰脲酰氯及lmLDmEA的n{F溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30rnL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，1mLD口EA，0．309(2．5咖01)(R)一n-苯乙胺(或(S)．a一苯乙胺)，40℃回流8天。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLCHcl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集CHCl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得白色固体。7a：o．489(57％)；【a]D20=+155．6。(c=1．02；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDcl3)，6(ppm)：1_38-1．41(d，6H，CH3)，4．81(brs，2H，NH2)，4．97—5．13(m，2H，CH)，5．28(brs，2H，NH)，7．2l-7．25(m，2H，ArH)，7．28—7．33(m，8H，ArH)：HRMS(ESI)：C】9H23N6(MH+)，计算值335．1984，测定值335．1990。7b：O．469(55％)：【n】D20—153．2。(C=O．97；CH30H)；1HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：1．40一1．43(d，6H，CH3)，4．83(brs，2H，NH2)，4．98-5．15(m，2H，CH)，5_30(brs，2H，NH)，7．21—7．26(m，2H，ArH)，7f30一7．35(m，8H，ArH)；HRMS(ESI)：C19H23N6(MH+)，计算值335．1984，测定值335．1992。6-氨基-2．(R)．咖苯乙胺基．4-【(R)-n-(1-萘)乙胺l-l，3，5-三嗪(8a)与6_氨基．2．(s)．旺．苯乙胺基．4-【(s)-幔-(1·萘)乙胺】_1，3，5-三嗪(胁)将含O．309(2．5rnm01)(R)．u一苯乙胺(或(S)一Ⅱ一苯乙胺)的THF溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含o．469(2．5mm01)氰脲酰氯及1n1LDIPEA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30mL双蒸水洗涤后抽滤，得乳白色固体。真空干燥后再加入7mLTHF，1mLD坤EA，O．439(2．5mm01)(R)一伍一(1．萘)乙胺(或(S)一d-(1．萘)乙胺)，40℃回流lO天。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLcHcl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHcl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干 塑兰兰垡堕塞———————一三丝壅堕塑生塑塑堡盐：鱼璧皇鳖塞后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得白色固体。8a：o．439(45％)：[d】D20-+11．1。(c=1．02；cH30H)；1HNMR(400枷z，cDcl3)，6(ppm)：1．40—1．50(d，3H，CH3)，1．55—1．65(d，3H，CH3)，4．70(brs，2H，N}b)，4．82-4．90(m，H，CH)，5．10·5．18(m，H，C均，5．26(brs，H，NH)，5．87(brs，H，NH)，7．15—7．30(m，5H，ArH)，7．37-7．58(m，4H，ArH)，7．70一7．78(m，lH，ArH)，7．82—7．90(m，1H，ArH)，8．12-8．16(m，lH，ArH)；HRMs①sD：c23H25N6刚H+)，计算值385．2141，测定值385．2130。8b：o．479(49％)；[u]D20=一lo．5。(c=1．01；cH30H)；1HNA傈(400Ⅻz，cDcl3)，6(ppm)：1．40—1．50(d，3H，CH3)，1．55—1．67(d，3H，CH3)，4．68(brs，2H，NH2)，4．84—4．93(m，H，CH)，5．10一5．15(m，H，CH)，5．25(brs，H，NH)，5．84(brs，H，NH)，7．13—7．30(m，5H，ArH)，7|35-7．57(m，4H，ArH)，7．72—7．79(m，1H，ArH)，7．8l-7．92(m，1H，ArH)，8．10-8．15(m，1H，ArH)；HRMS(EsI)：C23H25N6CMH+)，计算值385．2141，测定值385．2138。2，4．二．(R)．卅苯乙胺基．6．二丁胺基．1，3，5．三嗪(9a)与2，4．二．(s)-伐．苯乙胺基-6-二丁胺基-1，3，5-三嗪(9b)将含O．609(5mm01)(R)．a．苯乙胺(或(S)一c【一苯乙胺)的THF溶液(5mL)滴加到10mL含O．469(2．5mm01)氰脲酰氯及2mLD口EA的T肿溶液中。溶液在室温下搅拌15小时后，减压蒸去n{F，加入30111L双蒸水洗涤后抽滤，得淡黄色固体。硅胶柱纯化(cH2c12：石油醚，2：1)后得6一氯-2，4．二一(R)-1一苯乙胺基一1，3，5一三嗪白色固体O．419(47％)。加入7mLTHF，1mL二丁胺，1mLDmEA，40℃回流30小时。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLCHCl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHcl3层，用无水Mgs04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／乙酸乙酯(1：1)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。9a：o．529(70％)：[d]D20-+94．6。(c=1．27；cH30H)；。HNMR(400MHz，cDcl3)， 塑圭兰竺笙苎——————一量丝塞堕塑生塑竺望盐：鱼壁兰鳖塞6(ppm)：0．79-O．93(t，6H，3CH3)，1．10一1．52(m，14H，4CH2，2CH3)，3’36．3．46(m，4H，2CH2)，5．05—5．13(m，2H，2CH)，4．94(brs，2H，2N均，7．15．7．20(m，2H，舡H)，7．20·7．36(m，8H，ArH)；mtMs(EsD：c27H39N6(MH十)，计算值447．3236，测定值447．3247。9b：o．519(73％)；【a】D20_一96_3。(c=1．12；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDch)，6(ppm)：O．80—O．94(t，6H，3CH3)，1．10-1．54(m，14H，4CH2，2CH3)，3．37．3．46(m，4H，2CH2)，4．92ms，2H，2NH)，5．07—5．14(m，2H，2CH)，7．15—7．20(m，2H，ArH)，7．20一7．36(m，8H，ArH)；HRMs(EsI)：c27H39N6(MH+)，计算值447-3236，测定值447f3240。4，6-二-二丁胺基．2-(R)．洳苯乙胺．1，3，5．三嗪(10a)与4，6．二．二丁胺基．2．(s)．Ⅱ．苯乙胺．1，3，5．三嗪(10b)将含O．309(2．5mm01)(R)一a一苯乙胺(或(s)一Ⅱ．苯乙胺)的唧溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含O．469(2．5mm01)氰脲酰氯及1mLDIPEA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌2小时后恢复至室温。加入2mLD口EA，1mL(5．9mm01)二丁胺，40℃回流2天。停止回流，恢复至室温后向溶液中加入25mLcHcl3，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集cHcl3层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得浅黄色油状物。以二氯甲烷／甲醇(97：3)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得白色固体。王oa：o．569(49％)：陋JD20=+56．3。(c=1．04；cH30H)；1HNMR(400MHz，cDcl3)，6(ppm)：0．88—0．97Cm，9H，3CH3)，1．10一1．14(d，3H，CH3)，1．20—1．42(m，4H，2CH2)，1．45—1．57(m，6H，3CH2)，3．27—3．33(m，H，CH)，3．39—3．47(m，4H，2CH2)，4．57(brs，2H，NH2)，4．70(brs，H，NH)；HRMs(EsI)：c27H47N6(MH+)，计算值455．3862，测定值455．3855。10b：O．499(43％)；[cc】D2呜．55．7。(C=1．13；CH30H)；1HNMR(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：O．88—0．95(m，9H，3CH3)，1．10—1．15(d，3H，CH3)，1．22-1．43(m，4H，2CH2)，1．48一1．57(m，6H，3CH2)，3．27-3"35(m，H，CH)，3．41—3．48(m，4H，2CH2)， 塑兰兰堕丝L一．量丝塞些塑生塑塑墨生：鱼垡皇些塞4-59似s，2H，NH2)，4．72ms，H，NH)；HRMs(EsD：c27H47N6(Ⅻ+)，计算值455．3862，测定值455_3853。2一氨基-6-二丁胺基．4一【(L)。苯丙氨酸乙酯卜1，3，孓三嗪(11b)将含O．509(2．2mm01)(L)一苯丙氨酸乙酯的无水二氯甲烷溶液(5mL)缓慢滴加到10mL含O．419(2．2l砌01)氰脲酰氯及1mLD口EA的无水二氯甲烷溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌3小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时，生成大量白色沉淀。停止反应，过滤，收集二氯甲烷溶液。在过滤后的二氯甲烷溶液中加入O．75mL二丁胺，1mLDmEA，40℃回流3天。停止回流，然后用去离子水洗涤两遍，每次25mL。收集CHcl3层，用无水Mgs04干燥，抽滤，旋转蒸干后后得浅黄色油状物。以正己烷／乙酸乙酯／乙醇(70：30：2)为洗脱液，经硅胶柱分离纯化后得无色胶状物。llb：O．319(34％)；1HNMR(400MHz，DMsO一比)，6(ppm)：O．87—0．90(t，6H，2CH3)，1．07一1．1l(m，3H，CH3)，1．23—1．25(m，4H，2CH2)，1．42—1．44(m，4H，2CH2)，2．99—3．01(d，2H，CH2)，3．35—3．40(m，4H，2CH2)，4．00-4．04(m，2H，CH2)，4．46·4．48(m，lH，CH)，6．05(brs，2H，NH2)，6．80(d，H，NH)，7．20—7．28(m，5H，ArH)：HItMS(ESI)：C22H3502N6(MH+)，计算值415．282l，测定值415．2823。6-氨基．4．(2_氨基-苯并15．冠．5)-2-【(R)-n-苯乙胺l-l，3，5一三嗪(12a)与6-氨基-4．(2．氨基．苯并15．冠．5)-2-【(s)-Ⅱ-苯乙胺】-1，3，5-三嗪(12b)将含0．49(1．4mm01)2．氨基．苯并15．冠一5的THF溶液(5mL)缓慢滴加到7mL含O．359(1．9mm01)氰脲酰氯及0．4mLDIPEA的THF溶液中，时间不少于5分钟。溶液在冰浴下搅拌3小时后恢复至室温。向溶液中通氨气2．5小时。加入30111L双蒸水洗涤后抽滤，真空干燥后得粉红色固体O．3饴。经质谱(ESI)鉴定为州z427．1fM+H)，2．氨基一4一(2一氨基一苯并15一冠一5)一6一氯一1，3，5一三嗪。称取粉红色固体O．1679溶于7mLTHF，加入o．5mLDIPEA，O．139(1．1mm01)(R)一泓苯乙胺(或(s)．c【一苯乙胺)，40℃回流15天。停止回流，20～30℃旋转蒸干后加入25mLCHcl，，用10mL1MHcl洗涤，收集cHcl3层再用去离子水洗涤3～4 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定遍，每次25mL。收集CHCb层，用无水MgS04干燥，抽滤，旋转蒸干后得棕色油状物a以乙酸乙酯-乙酸乙酯／甲醇(40：5)一乙酸乙酯／甲醇(50：lO)．甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，经氧化铝柱分离纯化后得棕色固体。12a：O．109(36％)：1HNMR(40饼江Hz，CDCl3)，6(ppm)：1．23(d，3H，CH3)，3．34-3．75(m，17H，CH，CH2)，3．98(brs，2H，NH2)，5．20(brs，H，NH)，6．34．6．81(m，3H，ArH)，7．30—7．38(m，5H，ArH)，8．80(s，H，NH)；删S(ESI)：C25H32N605似矿)，计算值497．2512，测定值497．2505。12b：O．169(57％)：1HNⅣ限(400MHz，CDCl3)，6(ppm)：1．23(d，3H，CH3)，3．34—3．76(m，17H，CH，CH2)，3．98(brs，2H，NH2)，5．2l(brs，H，NH)，6．35·6．82(m，3H，ArH)，7．30一7．39(m，5H，ArH)，8．79(s，H，NH)：HRMS(ESI)：C21H27N6(MH+)，计算值497．2512，测定值497．2519。2．4结果与讨论2．4．1手性蜜胺衍生物的设计分析a一氨基酸分子(A)的结构特征，除都带有羧基和氨基外，可大致分为侧链为直链或支链烷基的、侧链带芳香基团的、侧链带不饱和基团如羧基、酰胺、胍基等的、以及侧链带活泼氢如羟基、氨基、巯基等的几类，它们各自倾向产生的非共价相互作用因此也会有所不同。由此我们共设计12种手性蜜胺衍生物(M)(如图2—2)，通过改变蜜胺衍生物氨基上的取代基团来考察各种非共价相互作用等对19种q．氨基酸对映体手性识别的影响。为了更清楚地观察各种非共价作用在识别中所起的作用，我们目前设计的蜜胺衍生物所带基团都不复杂，结构相对比较简单。侧链为氨基(1．8，11，12)可以考察氢键的影响；侧链为二丁胺基(1—4，9，10，11)可以考察静电作用及空间位阻的影响；侧链引入特丁基苯基(5，6)可考察空间位阻、冗呵相互作用的影响；侧链引入不同的手性基团，如苯乙胺基(1，5，7，8，lO，12)、萘乙胺基(2，6，8)、c【．甲基苯丙胺基(3)、2一丁胺基(4)及L一苯丙氨酸乙酯基等可考察手性基团大小、刚性及芳香环对手性识别的影响；侧链引入冠醚基团(12)可考察冠醚的包络作用对手性识别的影响；侧链引入单个(1—6，10，11，12)及多个(7—9)手性基团对手性识别的影响。通过各 璺垡苎!垡塑王丝查些堑生塑箜堡生：鱼堕兰些塞种基团在环上的排列组合，可以帮助了解究竟有哪几种非共价相互作用在手性识别中起到了关键的作用。2．4．2手性蜜胺衍生物的合成手性蜜胺衍生物的合成大致是按照三步取代的方式进行的，如图2．1所示。为了获得较好的产率，需严格控制每一步取代反应的温度。第一步取代反应极易发生，且反应非常剧烈，为了避免过多地产生多取代产物，尽量获得单取代产物，应将反应温度保持在相对较低的水平上(O℃)。若反应温度为室温，则二取代产物将成为反应的主要产物，如化合物9。第二步取代反应比第一步取代反应温和得多，因此可在室温下进行(～25℃)，但温度也不可过高，以免产生三取代产物。第三步取代反应由于受到空间位阻等因素的影响，相对与前两步反应而言要困难一些，因此需要稍高一些的温度以促进反应的进行。但这并不表示可以一味地提高反应的温度。由于我们合成的过程中涉及到了手性源化合物，为避免手性化合物发生消旋化反应，通常反应的温度不能设置太高(～40℃)，即使这样可能会延长反应的时间。除了反应温度之外，不同基团发生取代反应的顺序同样也很重要，往往需要根据取代基团的具体性质来决定。通常在合成含有二丁胺基的蜜胺衍生物时，会将二丁胺基安排在第三步进行取代，这是因为一方面二丁胺基的空间位阻较大，若先进行取代会妨碍后面进行的取代反应；另一方面，二丁胺的碱性比其它的胺强，更容易发生亲核取代反应，而第三步取代反应是三步取代反应中最困难的一步，因此将二丁胺基放在第三步进行取代将有利于整个反应的进行。不过也有例外的情况，如合成化合物4时，若将2一丁胺基或氨基放在第一步进行取代，由于这两个基团都比较小，反应活性较高，即使在较低的反应温度下也很容易生成二取代产物，因此需要将二丁胺基放在第一步进行取代，而2-丁胺基放在最后一步进行取代。另一个比较有意思的现象是用硅胶柱纯化化合物11b时，若洗脱液组成为正己烷．乙酸乙酯一甲醇，纯化后的产物经质谱及二级质谱鉴定为混合物2一氨基-6一二丁胺基一4一【(L)．苯丙氨酸甲酯]．1，3，5。三嗪(m／z401)和2一氨基一6一二丁胺基一4一[(L)一苯丙氨酸乙酯]一1，3，5一三嗪(m／z415)。而纯化前的产物经质谱鉴定并未发现有 博士学位论文手性蜜胺衍生物的设计、合成与鉴定m／z40l的峰。将洗脱液改为正己烷．乙酸乙酯．乙醇后再进行纯化，结果产物仅为2·氨基一6一二丁胺基-4-【(L)．苯丙氨酸乙酯】-1，3，5．三嗪。说明当用硅胶柱进行纯化时，洗脱液中的甲醇可能与化合物11b中的苯丙氨酸乙酯发生了酯交换反应，尽管这一反应在通常情况下并不容易发生。推测这一过程可能与硅胶基质或其中的某些组分对这一反应的催化作用相关。2．5小结为了研究多种非共价相互作用力对手性蜜胺衍生物手性识别能力的影响，设计合成了12种带有不同手性或非手性基团、结构性质各异的手性蜜胺衍生物对映体，共23个化合物。氰尿酰氯特殊的结构形式使其极易与各种胺发生亲核取代反应生成蜜胺衍生物。通过控制反应顺序及反应条件，可获得较好的产率。所有合成的手性蜜胺衍生物均经过分离纯化和鉴定，为下一步的质谱手性分析研究奠定了良好的基础。 博士学位论文EsⅢs考察蜜胺衍生物与氨基酸的结台情况第三章ESI以ⅥS考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况3．1引言手性选择剂与对映体分子产生手性识别的基础是二者间发生一定的相互作用，即先有结合，再有识别。因此我们首先采用ESI，MS考察了合成的手性蜜胺衍生物与19种氨基酸在电喷雾质谱中的结合情况。ESI的电离过程十分温和，可以使以很弱的非共价相互作用结合的超分子簇集体完整地被检测出来，并通过高灵敏度和高质量准确度的质谱提供簇集体的分子量信息，从而直接推算出簇集体中各组分的化学结合计量关系。故采用ESI／MS考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况，可为我们研究手性蜜胺衍生物与氨基酸所形成的超分子簇集体体系提供重要的结构信息。3．2实验部分3．2．1试剂所有D一，L-氨基酸均购于Sigma、Acros或A1“ch。实验用甲醇为色谱纯，水为双蒸水。D．DOPA、L—DOPA、(+)．麻黄碱、(一)一麻黄碱、(+)．伪麻黄碱、(一)一伪麻黄碱、(1R，2S)．(一)．苯丙醇胺、(1S，2R)一(+)一苯丙醇胺均购于Sigma。L一氨基酸甲酯及6对抗胆碱能药物对映体由本所药化室提供。所有的D．，L一氨基酸均配制成2rnM的水溶液，合成的手性蜜胺衍生物均配制成2mM的甲醇溶液。实验用溶液为含一种氨基酸和～种手性蜜胺衍生物各0．2mM的l：1甲醇／水溶液。3．2．2仪器MicromassLCT电喷雾飞行时间质谱仪(英国Waters公司)；HarvardPumpII型流动注射泵(HarvardApparatus公司)。3．2．3质谱条件 博士学位论文EsI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况采用电喷雾电离(EsI)方式，毛细管电压(C印j11a口voltage)3．5KV；样品锥孔电压(S锄pleConevoltage)5V；抽取锥孔电压(ExtractionConevolatage)3V；脱溶剂温度pesolvtion1bInp)loo℃；源温(SourceTe忸p)loo℃；脱溶剂气流量(D髓olvtionG勰)180L／h。样品通过流动注射泵以10pl，min的流速注入。单个样品采集时间为5分钟，以2～5分钟的质谱图平均后读取丰度值。3．2．4结合常数的测定配黄一系列浓度的手性蜜胺衍生物1a与D一或L广Phe的混合溶液。固定溶液中化合物la的浓度为O．02mM，D．或L．Phe的浓度则分别为O．03mM、0．04n1M、O．05mM、0．06mM和0．07rnM。样品通过流动注射泵以10山／min的流速注入电喷雾质谱进行检测。单个样品采集时间为5分钟，以2～5分钟的质谱图平均后读取丰度值。每份样品重复测定4次。3．3结果与讨论3．3．1质谱条件的选择3’3．1。1仪器条件的确定在采用电喷雾质谱研究超分子体系中的非共价相互作用时，对实验条件的控制。如合理的仪器参数设定以及样品制各等往往是致关重要的，它们将直接影响到簇集体离子的组成形态及稳定性【127，1281。这类研究中的EsI界面条件往往需要比常规的Es蹦S条件更加温和，以保存相对较弱的非共价相互作用。毛细管温度和源温的高低会影响簇集体的稳定性，大气压和真空之间的锥孔电压如果设定过高亦会导致簇集体的解离。实验表明，当改变脱溶剂温度、样品锥孔电压及抽取锥孔电压时，电喷雾质谱图中蜜胺衍生物与氨基酸簇集体的离子丰度会发生明显的变化。以化合物1a与D-唧所形成的簇集体离子为例，如图3一l、3—2及3．3所示。由图可见，较低的脱溶剂温度、样品锥孑L电压及抽取锥孔电压更有利于电喷雾质谱中蜜胺衍生物与氨基酸簇集体的观察。因此设置脱溶剂温度为100℃，样品锥孑L电压为5V，抽取锥孔电压3v。此外，延长样品采集时间，特别是进样2 博士学位论文Esl棚s考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况分钟以后的采集时间可获得较好的重复性。3o685‘蛐∞-T日m+r3擘⋯b．．卜明8l3o3(11)H‘b(1嘲H+，：；1．一es日日目礓’H+，345I3·3(1．)H。6／4‘6日5警。l·∞(D’1日．町。．．⋯加，8793J3【l曲H’d，345‘节Pt嘴—百B；⋯‘，44(1咄H+685图3．1脱溶剂温度对簇集体离子的影响a．100℃：b．120℃：c．140℃：d．1∞℃；e．180℃其它质谱条件：毛细管电压3．5Kv；样品锥孔电压5V；抽取锥孔电压3V；源温100℃371●jj■葺l■{，尝囊鼍，●■l蝈{‘，-葺暑j皇生■宣，-{寻膏皇l蛆■，誓 博士学位论文EsI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况100B{{％!蔓矗010口l{墨％￡■d01口0i％id000％a343clt)lI+e343(1．)H广f10020D3004005D0600700日口D9口01000m，z图3．2样品锥孔电压对簇集体离子的影响a．5V；b．7V：c．9V；d．11V；e．15V；f．20V其它质谱条件：毛细管电压3．5Kv；抽取锥孔电压3v；脱溶剂温度100℃；源温100℃38■●e11{lid1．0I{{j■i 博士学位论文Esl，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结台情况6e5(k即．t曩矿J?4妙k1_00i％i0(1-知H+⋯675(蚰∽m心，344L6日6‘。‘日÷目r315．1J_3。3(II)H1c(1嘲H+7：6岱。。∞訾皿+，345r⋯oP3筘‘程，≮砰矿，a44(1-)llI+345明5，．一．L．．图3．3抽取锥孔电压对簇集体离子的影响a．3V：b．5V；c．7V；d．10V；e．12V其它质谱条件：毛细管电压3．5Kv．样品锥孔电压5V：脱溶剂温度1∞℃：源温柚o℃39 皇坚：兰堡堡兰墅!型!耋壅塞些煎生塑兰塾薹璧塑丝鱼堕堡3．3．1．2溶剂的选择考虑到蜜胺衍生物与氨基酸的结合属于非共价结合，因此其相互作用可能会受到溶剂条件，如溶剂极性等因素的影响。考察了多种不同极性的溶剂种类，甲醇、乙醇、乙腈、甲醇，水、甲醇，水／O．0l％乙酸、水等，结果发现除了加入少量有机酸后簇集体离子消失外，不同溶剂极性对二者结合情况影响不大。这可能是由于电喷雾条件下的结合更接近于气相条件下的结合，因此溶剂因素对其影响并不十分明显，但弱酸的加入却可能破坏分子间的非共价相互作用，使簇集体无法形成【”。综合考虑蜜胺衍生物和各种氨基酸的溶解度、质谱信号的灵敏度和稳定性，确定溶剂为甲醇，水(1：1)。3．3．2EsI，Ms考察蜜胺衍生物1．10与19种氨基酸的结合情况用电喷雾质谱考察了合成的手性蜜胺衍生物1．10与19种天然手性氨基酸的结合情况。结果表明，蜜胺衍生物与氨基酸的混合物呈现的电喷雾质谱图较简单，见图3．4。除蜜胺衍生物离子(MH+)及其自身二聚体离子(M2H+)外，蜜胺衍生物与氨基酸形成的簇集体在电喷雾质谱图中多数主要表现为三聚体离子(M2AH+)，如图3．4a和3-4b，二聚体离子通常观察不到或丰度值非常低。少数氨基酸，如Arg、His和Lys，主要呈现二聚体离子(MAH+)，而三聚体离子丰度非常低，如图3．4c。分析后三种氨基酸的结构，发现其共同特征是均为碱性氨基酸。所有谱图中基本未见氨基酸的质子峰，这可能是因为所合成的蜜胺衍生物的亲质子能力远高于氨基酸的缘故。合成的手性蜜胺衍生物l—lo与19种氨基酸的结合情况见表3一l。 堕主堂些堡塞!坠竺!耋窒塞堕塑生塑量墨鳘墼箜苎鱼笪堡一．}母r侈a)ilr垆B嗜3P4口a)z∞_Phe)H朋．．P51譬一3·3(1b)lrOb)∞—Lys)口一3444驴ob)2Ⅳk气5鼬J。I．．．【．图3．4氨基酸(0．2mM)与手性蜜胺衍生物(O．2mM)混合物的EsI-Ms谱图(a)8a+1)．Phe(b)9a+1)·Phe(c)1b+D-Lys4；j{tqi 博士学位论文EsI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况表3-1手性蜜胺衍生物1．10与19种氨基酸的结合情况×12345678910侧H妇+链带phe+上+上芳香哪+上+基团Br+上+工+侧Arg+链带Asn+不饱Asp+上+和GI“+基团Glu+上+侧Cys+J-+链带L驴+上+斗活泼Se’+氢Thr+上+Ala+侧链Ieu+为烷ILe“+基、hl+山+上其Mef+它Pro+注：“十”表示可观察到蜜胺衍生物与氨基酸的结台，“一”表示未观察到蜜胺衍生物与氟基酸的结合。 羔望苎竺!堕望型!麦塞查壁堑生塑兰堡苎墼竺堕鱼笪墨由表3—1可见，所有合成的手性蜜胺衍生物(除化合物10外)与侧链带芳香基团饵is，Phe，1印，B，r)和不饱和羰基(A曙，Asn，Asp，GlIl，GIu)的氨基酸都有结合，提示两者之间冗一7c相互作用的重要性；当氨基酸侧链不带芳香基团和不饱和羰基(Ala。cys，ne，ku，L咿，Met，Pro，ser，．11lr，Ⅷ)时，只有同时带有二丁胺和氨基的蜜胺衍生物1．4能与其全部结合，这可能是因为二丁胺的碱性增加了与氨基酸羧基间的成盐作用，而氨基增加了分子间的氢键作用。并且这一类蜜胺衍生物的手性基团带苯环、萘环或是有无芳香环对是否与氨基酸结合影响不大，说明所带的手性基团在结合过程中不起主导作用(但并不排除有辅助作用)。实验曾尝试将氨基酸换成氨基酸甲酯，如L．苯丙氨酸甲酯，L-亮氨酸甲酯及L一色氨酸甲酯，结果所有合成的蜜胺衍生物与氨基酸甲酯均未见结合，从而表明成盐作用在蜜胺衍生物与氨基酸的结合中起了十分重要的作用，并是最主要的结合驱动力之一。不过这并不表示成赫作用是蜜胺衍生物与氨基酸结合过程中唯一的主要作用力。化合物9中虽然也带有二丁胺，碱性增强，但却只能观察到与侧链带芳香基团和不饱和羰基的氨基酸有结合，说明氨基的氢键作用(包括7c．兀相互作用)同样在蜜胺衍生物与氨基酸的结合过程中发挥了关键的作用。这一点还体现在蜜胺衍生物1—10中，以同时带有二丁胺基和氨基的化合物1．4与氨基酸的普遍结合能力最强，其ESI／Ms谱图上簇集体的相对丰度值也普遍高于其它几种蜜胺衍生物与氨基酸形成的簇集体的相对丰度值。由此可见，电喷雾质谱中所观察到的蜜胺衍生物与氨基酸的结合，应该是多重相互作用力协同作用的结果。单一的非共价相互作用通常是非常脆弱的，极易受到外界因素的影响，只有氢键相互作用、静电作用、兀．7c相互作用等多重非共价相互作用力的协同作用，才有利于形成相对比较稳定的簇集体。带有两个二丁胺基团的化合物10与所有氨基酸均未见结合，同时也未见其自身簇集体存在，分析原因可能是因为空间位阻过大，导致其它分子无法靠近。3．3．3EsI，Ms考察蜜胺衍生物11、12与19种氨基酸的结合情况蜜胺衍生物11和12由于蜜胺母核分子上所连接基团的性质与化合物1-10之43 旦兰兰竺堕苎—～一．!!塑查塞塞墼堑生塑量堡董璧堕壁垒笪翌间有较大的差异，它们与19种氨基酸在电喷雾质谱中观察到的结合情况也与前10种化合物存在明显的不同，放单独列章节进行讨论。蜜胺衍生物1l与蜜胺衍生物114的共同之处在于结构中都同时带有二丁胺基和氨基，而不同之处在于手性基团侧链换成了可具有更多作用位点的苯丙氨酸乙酯基。蜜胺衍生物11与氨基酸混合物溶液的电喷雾质谱图见图3．5。与化合物1_4与氨基酸表现出来的结合方式不同，除蜜胺衍生物离子(MH+)及其自身二聚体离子(M2H+)外，蜜胺衍生物ll与氨基酸形成的簇集体在电喷雾质谱图中均主要表现为二聚体离子(MAH+)。由此可见，除了3．3．2中所分析的氢键和成盐作用是蜜胺衍生物与氨基酸结合的主要驱动力之外，侧链基团上的其它的作用力也对结合产生了较大影响，并且侧链基团上的作用位点越多，这种影响就越明显。4alH+19一日304375{5oIhxmLe面H+／f．}：曼}547．．，一日51m住图3．5蜜胺衍生物11与氨基酸结合的电喷雾质谱图(a)11b十D—Leu(b)llb十D·His 羔垡兰望塑垒蔓—一墅!型!耋塞查壁塑生塑皇篁苎墼塑堕盒堡堡冠醚化合物作为一类主体化台物。已被人们应用于质谱手性识别分析。在蜜胺衍生物12分子结构中引入冠醚基团预计会对其分子手性识别性质及其作用机制产生较大的影响。与前面合成的蜜胺衍生物不同，虽然蜜胺衍生物12不带有二丁胺碱性基团，但仍然与所有的氨基酸均产生了较强的结合作用，这显然是由于冠醚对氨基强烈的主客体包络作用显著增加了两种化合物之间的相互作用。蜜胺衍生物12与氨基酸混合物的电喷雾质谱图见图3—6。除蜜胺衍生物离子(删+)及其自身二聚体离子(M2H+)外，蜜胺衍生物12与氨基酸形成的簇集体在电喷雾质谱图中均主要表现为二聚体离子(MAH+)，少数可同时呈现出较弱的三聚体离子(M2AH十)，如A玛。而对于这类碱性氨基酸，蜜胺衍生物1。10仅呈现二聚体离子(MAH+)，两者之间的差异我们认为主要来源于冠醚对碱性氨基酸中多个氨基分别包络结合的结果。(ⅡohII+g!3(1i曲∞．Ty，)H+67日，94498／51g卜B79，101502thNI+f．。}，680h100{鼍％i0497a2·泌I+b849B，721994／⋯ff：《Ⅲ，似渺缸d519／1．⋯图3．6蜜胺衍生物12与氨基酸结合的电喷雾质谱图(a)12a+I)一1n(b)12a+D-Arg口尚0“o，；墨毒!mj_嵋 博士学位论文ESI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况3．3．4EsI，Ms考察蜜胺衍生物与一些对映体药物的结合情况3．3．2节中曾提到当氨基酸分子结构中的羧基转化为酯基后，它们与蜜胺衍生物在电喷雾质谱中的结合变得不明显，表明氨基酸的羧基在氨基酸与蜜胺衍生物的结合中发挥了重要的作用。为了进一步证明这一点，我们选择了其它一些分子结构中带有羧基或不带有羧基的手性药物，用电喷雾质谱考察了它们与所合成的手性蜜胺衍生物的结合情况。所选择的药物中仅有那格列奈和多巴分子结构中带有羧基，其它几种药物则带有氨(胺)基或羟基，见图3—7。那格列紊‘絮!。口洲o。，Nag’a：Ub：L多巴(D0㈧a：Db：L苯丙醇胺(PPA)a：S．Rb：R．Sx埘弋淤∞佐米曲坦(z。警譬1p。an，Z0Ⅲ)麻黄碱‘：?警皇。n％E9’伪麻黄碱‘’蔷哇掣^&廿髀“，⑤&。抗胆碱能药^a：Sb：R抗胆碱能葑DB：Sb：R抗胆碱能药Ba：S．Rb：R．S抗胆碱睫i犯a：S．Rb：R．S图3．7对映体药物结构式ne，V—Ep)抗胆碱能药CB：S．Sb：R．R抗艇碱能药FB：S．Sb：R．R竹妒 塑垡苎兰型坚L—————————一．!!型!耋塞塞壁塑生塑量堡苎墼墼壁垒堕翌电喷雾质谱考察结果表明，除化合物lO外，所有的蜜胺衍生物都能与分子结构中带有羧基的那格列奈(nate91inide，Nag)和多巴(DOPA)产生结合。蜜胺衍生物与那格列奈通常同时呈现出1：1(1分子蜜胺衍生物结合1分子那格列奈)和2：1(2分子蜜胺衍生物结合1分子那格列奈)的结合：而蜜胺衍生物与多巴的结合情况与氨基酸类似，多数呈现出2：1(2分子蜜胺衍生物结合1分子多巴)的结合，仅化合物11和12与多巴呈现出l：1的结合，如图3—8所示。而对于其余分子结构中未带有羧基的药物，在电喷雾质谱仅观察到它们与蜜胺衍生物12的结合物，且均为1：1的结合物(如图3—9所示)，而与其它蜜胺衍生物均末见结合。分析原因，仍应归功于化合物12中的冠醚基团的主客体包络作用。西咖∞N讲1042岱劬CmN-‘泄I+，1043680，64I馇嘲H+．产5州．恪，，10443741¨-月w。uu"埘。卜fI『2P图3-8蜜胺衍生物与那格列奈及多巴结合的电喷雾质谱图(a)5a+D．那格列奈(b)3a+D一多巴47 (12·吲+儡．1-_I》皿+l，滹e声臀⋯j98I‘n呐旷尹9牌9‰哪2岫NI+r．灿刚㈦⋯””“(IioF417B25(1^B)Ir讳丑锄lI+32日49日B5602咄lI+Ia：。，519L65B，啪罗3f，Jc日27lIrl口32图3．9化合物12与手性药物结合的电喷雾质谱图(8)12a+R．佐米曲坦(b)12a+s，州E黄碱(c)12a+s-抗胆碱能药物A(d)12a+s，R-抗胆碱能药物B由此可见，我们目前所合成的蜜胺衍生物，由于受所挑选的取代基团的限制，所能产生的相互作用还比较有限。对化合物1—11而言，由于成盐作用是结合的主要驱动力之一，因此作用的对象主要局限于分子结构中带有羧基的这一类化合物。 塑圭兰竺垒苎—～．!!!型!耋塞童壁堑皇塑皇墨薹璧堕壁垒笪翌但是根据带有冠醚基团的化合物12与各药物的作用情况，我们有理由相信通过改变取代基团的性质，一定能进一步扩大作用对象的范围。3．3．5手性蜜胺衍生物对氨基酸对映体手性识别的EsI，Ms研究在采用电喷雾质谱考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况时，我们发现部分氨基酸与蜜胺衍生物的结合，特别是手性芳香基团的蜜胺衍生物与一些侧链带芳香基团的氨基酸的结合，可以直接从单级质谱上观察到其手性差别。以化合物1与Phe的结合为例，见图3—10。在四种手性配对方式结合的质谱图中主要呈现的都是【(1)H]+峰、[(1)2H】+峰和[(1)2PheH】+峰。我们假设其中[(1)2PheH]+主要是由【(1)2H】+与Phe结合而来的。由图可见，1a与L．构型苯丙氨酸的作用明显强于与D一构型苯丙氨酸的作用，即[(1a)2(D-Phe)H】“(1a)2H]+<[(1a)2(L—Phe)H]+／【(1a)2H]+：而lb与D一构型苯丙氨酸的作用则明显强于与L．构型苯丙氨酸的作用，即【(1b)2(D—Phe)H]．／[(1b)2H】+>[(1b)2(L—Phe)H]Ⅵ(1b)2H】+，表明两种化合物之间的结合确实与手性有关，并呈现一定的手性识别能力。‘1-"tH+晡“●，^D-P■瑚。3“k己，．．PP(II】“D-Pk瑚’tn)。H+叩一中【*，舾k．一r“-，柙+p■0H+“訾甲Mk，旁每．rI‘翟lI：nⅢPhⅢ+j“丫目L6*k，。【陋图3．10化合物1与苯丙氨酸对映体结合的EsI-Ms谱图(a)la+D．phe(b)1a+L—Phe(c)1b+D．Phe(d)1b+L—Phe 博士学位论文EsI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基馥的结合情况表3-2列出了采用ES蹦S技术，化合物l与19种氨基酸对映体的簇集体所呈现的手性差异情况。可见除含有双羧基(Asp、Glu)和羟基(ser、11lr)的氨基酸外，其余氨基酸的簇集体在一级质谱中均呈现显著的手性识别现象。表3．2用一级质谱观察手性蜜胺衍生物1与不同构型氨基酸作用的结果(n)3)注：‘‘+”表示可观察到手性差异：吖’表示未观察到手性差异。但考虑到单级质谱容易受到离子化效率、离子传输效率、样品纯度、浓度等诸多外界因素的影响，一些手性差异较小的簇集行为可能难以准确地显现出来，且对这种手性差异进行定量描述也存在一定的困难(主要是稳定性方面)，因此我们仅对此进行了ES蹦S／MS研究(详见第四章)。3．3．6蜜胺衍生物1与苯丙氨酸对映体结合常数的测定由于电喷雾质谱图中的丰度比值可以直接反映出混合物中化合物的结合程度，因此EsⅢs可以用于测定以非共价作用相结合的簇集体的结合(稳定)常数【129。3"。通过计算手性蜜胺衍生物与氨基酸对映体的结合常数，可以进一步定量地描述手性蜜胺衍生物与不同氨基酸对映体结合时的手性差别。用ESnIS测定结合常数的方法有几种，其中最常用的是滴定法【129m41。即在一定浓度范围内，固定主、客体一方的浓度，改变另一方的浓度，根据游离主体(或客体)与结合的主客体复合物的浓度(离子丰度)间存在的关系绘制曲线图，推算出结合常数。由于蜜胺衍生物与氨基酸的簇集体多为三聚体M2A和二聚体MA，此外还存在大量蜜胺衍生物自身的二聚体M：，因此可以推断此簇集过程发生在准气相条件下，并由以下两步生成，方程推导如下：(i代表起始浓度)50十+十+-．I+_●．I+ab 博士学位论文Es卟ts考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况KM+A；；±=MAKb2M+A；；=兰M2Ak=瞰A】[A][M】——(1)一(2)pdA]——2岛[A】[M】U⋯；[A]【MA]——2Ka[Ai]【M】固定[M．]，改变[Aj]，以[MA]／[M]对[A。]作图，可求出瓯[M2A][M】Kb=[M2A]【A][M】2[M2A】——=Kb【A】[M】2U【Ai]；[A]【M2A】——=Kb[Ai]【M]2U州卜【MA】【M】[MA]2[M2]2叫2A】1+一十一+一【M][M】2【M2]【M]2[M2A】【M]=K“Ai】 博士学位论文EsI，Ms考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况固定【Mi】，改变【Ai】，以【M2A】，【M】2对[Ai】作图，可求出Kb。由于蜜胺衍生物的离子化效率远高于氨基酸，可假设二者簇集体的离子化程度主要由蜜胺衍生物决定，因此公式中浓度的比值可直接由质谱图中的丰度比给出。也可将(2)式进一步改写成：KblM+M；；兰M2Kb2M2+A；；==M2A——(3)——(4)则I(b=瓯1．Kb2，其中Kbl主要是由蜜胺衍生物自身的性质决定，仅Kbz与两化合物之间的相互作用有关，即与手性识别作用有关。[M2A】‰22丽[M2A】——=Kb2[A][M2]U㈨；㈧【M2A】——=Kb2【A．】【M2】固定【Mi]，改变[Ai]，以【M2A]／【M2]对[Ai】作图，可求出Kb2。以蜜胺衍生物1a与苯丙氨酸的结合为例，用EsI／Ms分别测定了化合物1a与D一和L一苯丙氨酸的结合常数。固定蜜胺衍生物1a浓度为O．02mM，D一、L-苯丙氨酸浓度在o．03一o．07mM范围内变化，以质谱图中[M2AH]+／【M2H]+的丰度比值对苯丙氨酸浓度作图(图3．11)，计算出结合常数Kb2分别为KD_7．71mM一1和KL：15．63mM一。这说明手性蜜胺衍生物1a与不同构型的苯丙氨酸作用时是存在52 博士学位论文EsI，MS考察蜜胺衍生物与氨基酸的结合情况显著的手性差别，它与L构型苯丙氨酸的作用明显强于与D．构型苯丙氨酸的作用，这正好与质谱图(图3．10)上观察到的现象一致。·la．L-Phe·la_D-Phcv=156x+O．54960．02O．030．040．0S0．060．07O．08【All图3-11【M2A】，【M2】对【Aj】关系图3．4小结(1)由于蜜胺衍生物与氨基酸之间的相互作用力为弱非共价作用力，因此在采用Es蹦S考察二者之间的结合情况时应尽量使用比较温和的实验条件。(2)用Es弧ds考察了所合成的手性蜜胺衍生物对19种天然氨基酸及部分手性药物的结合情况。结果表明，蜜胺衍生物与氨基酸很容易形成簇集体，其组成主要为2：1，少数为1：1的组成。(3)对于蜜胺衍生物1．11而言，成盐作用和氢键作用是促使其与氨基酸结合的最主要的作用力，同时其它一些相互作用力如兀．兀相互作用、空间位阻等也对结合产生了相当重要的影响。而对于蜜胺衍生物12，结合的主要驱动力则是冠醚基团的包络作用，因此对所有的氨基酸及手性药物均表现出较好的结合能力。864218641O0一a巴，【曙窆一 博士学位论文EsI，MS考察蜜胺衍生物与氨基酸的结台情况(4)部分蜜胺衍生物与氨基酸的结合呈现明显的手性差异，并且可从一级质谱图上直接观察到其手性差别。(5)用ES蹦s测定了化合物1a与D．及L苯丙氨酸之间的结合常数分别为KD_7．71mM。1和Kfl5．63mM～，进一步用定量的方法证明了其结合过程中确实存在手性差异。 堡圭堂垡造塞手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI，Ms，Ms研究第四章手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体手性识别的ESI，MS／MS研究4．1引言近年来，Cooksf59，96Ⅲ”和Y的【1恪1’71等人发展了利用电喷雾质谱结合碰撞诱导解离(CD)技术分析手性选择剂与手性对映体分子形成的多聚物离子，从而进行手性区分的方法，其最突出的优点是即使手性选择剂与对映异构体所形成的复合物之间只存在微小的能量差别，也能在cm图谱上检测出其相对丰度的差异【791。与单级质谱相比，串联质谱受外界因素如离子化效率、离子传输效率、样品纯度、浓度等影响较小，得到的手性识别分析结果更加稳定，也更有利于对手性差异进行定量描述。前面已经提到，所合成的手性蜜胺衍生物与氨基酸形成的簇集体在电喷雾质谱图中主要表现为三聚体(M2AH十)的形式，部分表现为二聚体(MAH+)的形式，因此我们直接借鉴了这类方法来对M2AH+和MAH+进行分析，考察其解离过程中是否存在手性差异，并以此来进行手性区分。4．2实验部分4．2．1试剂所有D．，L一氨基酸均购于Sigma、Acms或Al蚯ch。实验用甲醇为色谱纯，水为双蒸水。D．D∞A、L广DOPA、(+)·Ep、(-)-Ep、(十)一妒Ep、(·)一、l，一Ep、(1R，2S)．(．)一PPA、(1S，2R)．(+)．P队均购于Sigma。D-那格列奈、L一那格列奈及6对抗胆碱能药物对映体由本所药化室提供。所有的D．，L．氨基酸均配制成2rnM的水溶液，合成的手性蜜胺衍生物均配制成2mM的甲醇溶液。实验用溶液为含一种氨基酸和一种手性蜜胺衍生物各O．2nlM的1：1甲醇／水溶液。4．2．2仪器APl3000串联四级杆质谱仪(美国ABI公司)：HarvardPumpII型流动注射 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氮基酸对映体的手性识别的EsI，MsMs研究泵(HaⅣ盯dApparanJs公司)。4．2．3质谱条件采用电喷雾电离(ESI)方式；离子喷雾电压(Ionsprayvonage，IS)4Kv：离散电压(Decluste血喀Potential，DP)30V；聚焦电压∞ocusingPotential，FP)250V；入口电压(EntrallcePotetial，EP)一9．0v：出口电压(CollisionCellExitPoⅫllial，CXP)15V；喷雾气流量(N曲ulizerGas，NEB)2units；气帘气流量(CunaillGas，CUR)9units；碰撞气流量(Collisiongas，CAD)11111it；温度(Tempe豫ture)50℃。样品通过流动注射泵以10LLl／min的流速注入质谱仪。在三重四极杆质谱仪的全扫描模式下，目标离子(母离子，即蜜胺衍生物与氨基酸簇集体离子)在第一级四极杆中被挑选出来，进入到第二级四极杆中与碰撞气(氮气)反应发生碰撞诱导解离(CD)，最后进入第三级四极杆中进行分析。为获取适合的子离子丰度，碰撞能量(colljsionEnerg)，，CE)视样品具体情况在5～8V的范围内进行调节，但对于同一种手性选择剂和氨基酸的四种手性组台(Im，SS，RS，SR)而言，碰撞能量保持不变。质谱以连续方式采集6分钟，以2～6分钟的质谱图平均后读取丰度值。4．3结果与讨论4．3．1质谱条件的选择上一章中已经提到，由于气相条件下蜜胺衍生物与氨基酸所形成的簇集体是以弱的非共价相互作用力结合的，在采用电喷雾质谱进行研究时，需要采用比较温和的ESI界面条件。本章中所使用的仪器为电喷雾串联质谱，为了充分考察以非共价相互作用结合的非对映异构体在稳定性方面的差异(同时能观察到母离子与碎片离子)，除了需要使用较为温和的EsI界面条件外，还需采用较为温和的cD条件，以免cID能量过高导致所形成的非对映异构体完全解离。Es蹦S，MS中ESI界面条件的选择原则与ESI，MS中相似，仍然是调节各参数如温度等，使簇集体离子能在一级质谱中获得最大的丰度，因此这里将不再进行过多描述，而将重点放在CD条件的选择上。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI腑s，Ms研究Cm能量的大小主要受到两个因素的影响：即碰撞气流量(cAD)和碰撞能量(CE)。实验表明，蜜胺化合物与氨基酸之间的结合非常弱，所形成的簇集体不是十分稳定，因此我们将碰撞气流量调到最低值(1uIlit)。仅通过调节碰撞能量来控制簇集体解离的程度。选择碰撞能量时，通常是尽量使CD质谱图中母离子与子离子的相对丰度比值处于一个较合适的范围内，避免使其中一方的相对丰度值过小(表示解离程度不够或过度解离)。图4—1为不同cE条件下1a与D-Phe簇集体的解离情况。当cE为8v时，母离子(1a)2(D．Phe)H+几乎已完全解离。邑60％一40％毫60％乏60％一●a％20％100％邑Bo％O％6日5tl妇lr84005D0e0010005日5(1吐lrh明5(1-h矿c(I寸旷343‘I目-∞．Ph，H+II-)口-州-·，H+e50∞日l明5a．埘rdcl寸}r(1-mHI·)lr‘I嘲口H_，rmJtamu图4．1不同cE条件下1a与D—Phe簇集体的cID图谱(a)5V：(b)6V：(c)7V：(d)8V 竖主些蛉文手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI舢s，Ms研究4．3．2手性蜜胺衍生物l-1l对19种氨基酸对映体的手性识别研究一般说来，三聚物离子(x2Ⅵr)经过cm时可能会存在四种解离方式【79】：X2YH+x2H++YYH++X，XYH++XXH++XY(1)(2)(3)(4)Cooks【59】等人的方法是利用两个平行的裂分反应(1)和(3)在动力学上的差异来进行手性区分，即计算手性选择剂与对映异构体形成的复合物经过CD后所产生的碎片离子之间丰度比值的差异。Yao[I”。”】等人的方法则是直接利用簇集体本身的能量差别来进行手性区分，即计算手性选择剂与对映异构体形成的簇集体经过CⅢ后所产生的予离子与母离子丰度比值的差异。实际上簇集体离子在经过cⅢ时究竟采取哪种裂分方式，即呈现怎样的质谱图，是受到簇集体离子自身结构稳定性及不同子离子亲质子能力影响的。在本实验中，由于不同氨基酸和不同手性蜜胺衍生物在结构性质上的差别，它们所形成的三聚物离子的解离方式及各种子离子的亲质子能力存在一定的差异，导致M2』埘的cD谱图大致呈现以下两种情况：(1)大多数CD谱图上可见母离子M2√～一及子离子M2一和M时，其典型的图谱见图4．2a；(2)少数cD谱图上除可见母离子M2AH+及子离子M2H+和MH+外，还可见子离子MAH+，其典型的图谱见图4．2b。另外二聚物离子MAH+的CD谱图则通常只呈现出母离子MA矿与子离子M旷，其典型的图谱见图4—3。 羔坚苎!垡塑量丝童塑塑竺塑翌!!登墼苎璧翌堕壁竺兰丝望型堕!!型!型!婴塞1D口％帅％冰60薯台●0％20％0％100％80％邑60％孟40％20％0％1≮日8(1．岫0_H+15‘好12004叩60080010叩mamu70幡J。m520口40口即08叩10口0m舷amu图4．2三聚体离子的cID谱图(盔)1a斗D-A叩(b)la+D-Asnan●时孤。32004006008D01000m也amu100％日0％嚣Bo％一三．面‘0％Z20％0％b69(1lh)∞．砸)Ir(m)旷4152004006008001000m记amu图4．3二聚体离子的cID谱图(a)2a。卜D—His(b)11b+D·np在研究手性蜜胺衍生物的手性识别能力，并计算表征手性差异的手性识别因子＆hjral时，我们采用与Yao⋯5。1”1相似的方法，对每种手性蜜胺衍生物与每种氨基酸的所有四种手性结合方式，即RR、ss(homochiral，相同构型的组合)和RS、SR(hetemchiral，相反构型的组合)均进行了考察(对于伽氨基酸D构型即为R构型，L构型即为s构型)。通过比较homochiml和hetemchiral中母离子的解离59吣帆吣小勰喁 搏士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氪基酸对映体的手性识别的Esl腑s肭s研究效率(即子离子与母离子丰度比值r，r=【M。H+】／【％灿r】)的差异来衡量手性识别。根据CD谱图中呈现离子的总体情况，将手性识别因子＆h㈨定义为(5)，弛一!鬯坐坠业哑堂：焦塑型坠型塑±焦塑：型【坠坐坠，舢([Ⅻ+】／【删】)h册讪hl(【MH+】饪MAH】)RR+([mI+】／【MAH】)豁_’其中n_l或2。由于([M。H+】／[M。AH+】)Rs与(【MF】／【M。AH十】)ss以及(【M。}r]／【M。AIr】)sR与(【M。H+】／[M。AH+])RR之间存在倒数关系1103，””，因此对四种手性结合方式均进行考察，将有助于减小测量带来的误掣79·1151。我们之所以用【M。H+]／【M。AH+】来衡量手性差别是因为，所有二聚物离子的cD图谱中均呈现母离子MAH+和子离子MH+；所有三聚物离子的cD图谱中均呈现母离子M2AH+和子离子M2矿、MH+，予离子MAH+只在少数图谱中出现。原则上，两种子离子M2H+和MH+与母离子M2AH+的丰度比值(即[M2一】／[M2AH+]和【MH+]／【M2AH+])都可以用来衡量手性差别，但考虑到M2H+是由母离子M2AH+直接产生的子离子，因此其与母离子M2AH+的相对丰度值应该可以反映出母离子的本身的稳定性，而这种稳定性必然与母离子内部蜜胺衍生物与氨基酸对映体通过非共价相互作用结合的空间立体结构有关，这一点对于我们接下来比较簇集体离子的稳定性是有帮助的。子离子MH+除了可通过途径(2)产生外，还可以通过M2AIr_÷M2Ⅳ+A—M一+M+A或M2AH+一MAH++M—MH++M+A产生，因此不能完全肯定MH+是由母离子M2AH+直接产生的，其与母离予M2灿{+的丰度比值也不一定能反映出母离子本身的稳定性。由于子离子M2H+和M旷的产生不一定是平行反应，我们也没有采用cooks的动力学定义方法，虽然Cooks认为这种方法能更明显地反映出手性选择剂与对映异构体结合时立体结构上的差异【9”。此外，采用同种类型的子离子与母离子的丰度比值来衡量手性的差别，可使不同簇集体离子的实验数据具有更好的可比性。当R曲iral_l时，表明簇集体的解离过程不存在任何的手性差别：当＆h．豫1>1时，表明簇集体经过CID时hctemchiral的形式比homochiral的形式更容易发生解离；反之，当心hiral<1时，表明簇集体经过CD时homochiral的形式比hetemchiml的形式更容易发生解离。＆h删的值偏离1越远，则手性差别越明显。 鱼里壁笪!!!蔓量丝壅些堑兰塑墅!!登墨苎墼翌堕堡堕量堡望型堕!!型!竺!堕塞可观察到手性差异的三聚体离子的cD图谱见图4^4及4．5。手性蜜胺衍生物l—ll对19种a-氨基酸对映体的识别情况(R“h值)见表4．1。由表中数据可见，＆K他1计算的RSD值均小于4．0％，这表示着当＆hi喇落在95％的置信区间1．OQ士O．10(1．00士4．30×4．O％，305)‘”8】以内时，＆h删与1没有显著差异，手性识别不明显。即当Rchinl>1．1或酰胺>胍基(氨基)，可能是因为蜜胺衍生物碱性降低后，成盐作用不再是结合最主要的驱动力，与氨基酸侧链基团的静电和氢键作用对识别的影响表现得更加明显了。化合物7、8为具有双手性芳香基团的蜜胺衍生物，它们也仅与侧链带芳香基团的phe、rI姐、Trp、His和带不饱和基团的A唱、Asn、G1n、Asp、G1u以及侧链带氨基的Lvs和带硫醚的Met有结合。虽然手性基团的数目增加了，但与其它只带有～个手性芳香基团的化合物的手性识别数据相比，化合物7、8对氨基酸的手性识别的能力并未明显增加，说明蜜胺衍生物中手性基团的数目不是决定手性识别能力的关键因素。尽管与化合物5、6相似，化合物7、8也同时在两个侧链中都带有芳香基团，它们对不同氨基酸的手性识别能力却与化合物5、6不尽相同，按照侧链所带的基团排列即，胍基、酰胺、芳香基团>氨基>羧基、硫醚。分析原因可能与蜜胺衍生物自身的碱性有关，受到侧链中芳香基团与氮原子所处相对位置不同的影响，化合物7、8的碱性应强于化合物5、6，这使得它们与氨基酸之间的成盐作用的强度虽然低于化合物1．4，却高于化合物5和6。对于带有双羧基的Asp和Glu而言，这种成盐作用可能仍然过强，因此影响了其手性识别能力。对于其余几种可产生识别的氨基酸，应该仍是觚相互作用在识别过程中发挥着主要作用。化合物7和8(包括化合物5和6)之间对氨基酸对映体的识别能力差别不大，再一次证明了手性基团中带苯环还是带萘环对识别的影响不明显。化合物9是将化合物7中的氨基换成了二丁胺基，化合物的碱性增强了，但 竖主堂垡堡壅手性蜜胺斯生物对19种氪基酸对映体的手性识别的EsI舢s舢s研究可结合的氨基酸数量并未增加，说明氨基的氢键作用在蜜胺衍生物与氨基酸的结合中同样重要。虽然带有两个芳香基团，化合物9对芳香氨基酸(Phe、1n、1邱、ms)的识别却弱于对侧链带不饱和基团的氨基酸(Arg、Asn、(№)的识别，说明识别过程中除了耳嚼相互作用外应该还有其它因素在起作用。且化合物9与A曙、Asn、G1n以RR方式结合形成的三聚物离子要比以R8方式结合形成的三聚物离子稳定，该结果正好与化合物7对这几种氨基酸的识别结果相反，表明氨基的氢键作用对手性识别的过程也产生了一定的影响。化合物11是11种手性蜜胺衍生物中唯一能对所有19种氨基酸均产生手性识别的手性选择剂，虽然它对多数特定氨基酸的手性识别能力(＆hjmI)不一定比其它手性蜜胺衍生物(如化合物1、2等)有明显提高。化合物11与化合物1、2的共同特点是都带有二丁胺基和氨基，不同点在于手性基团由苯乙胺基换成了具有更多作用位点的苯丙氨酸乙酯基。3．3．3节中曾提到，与其它蜜胺衍生物不同，电喷雾质谱中化合物ll与氨基酸多呈现出1：1的结合，这说明手性基团的改变使化合物11与氨基酸的相互作用与其它蜜胺衍生物相比有较大的差异。尽管结构中含有二丁胺基，化合物11仍可以识别Asp和Glu对映体，说明手性基团上作用位点的增加对识别产生了明显的影响。分析原因，可能是由于手性选择剂与被识别分子之间相互作用(特别是手性基团上的相互作用)增加后，多种相互作用变得相对较均衡，减弱了成盐作用的影响。这也再一次证明通过有目的地对蜜胺衍生物结构进行改造，可以增加手性蜜胺衍生物的手性识别能力。通过以上对实验结果的分析，我们可以初步了解到所合成的手性蜜胺衍生物对氨基酸产生手性识别的机理及识别过程中的一些基本规律，即：(1)先以静电(成盐)作用及氢键作用作为结合的主要驱动力，将蜜胺衍生物与氨基酸分子拉到一起，然后再通过其它的非共价相互作用，特别是手性基团上的非共价相互作用，如兀一冗相互作用、空间位阻等来产生手性的识别。(2)多重非共价相互作用如静电作用、氢键、兀．兀相互作用、空间位阻等均在手性蜜胺衍生物对氨基酸的结合和识别过程中发挥了重要的作用。不同的蜜胺衍生物倾向于有选择性地结合和识别不同的氨基酸这一现象，提示我们应根据被识别分子的结构特征，首先在手性蜜胺衍生物的结构中引入一些可明显与被识别分子产生较强相互作用的基团，在蜜胺衍生物与被识别分子产生结合的情况下，再利用适当的手性基团使结合产生 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氮基酸对映体的手性识别的鹋I，MsMs研究手性的差别。(3)手性选择剂与被识别分子之间所产生的多重作用力应该相对比较均衡。若其中某种作用力(特别是与手性无关的相互作用力)过强，可能会降低整体的手性识别能力。(4)蜜胺衍生物中手性基团的数目不是决定手性识别能力的关键因素。手性基团中带苯环还是带萘环对识别的影响不明显。(5)通过有针对性地改变蜜胺衍生物氨基上的取代基团，可对具有不同结构性质特征的目标化合物产生手性识别。4．3．3蜜胺衍生物12对19种氨基酸对映体及部分对映体药物的手性识别研究化合物12分子结构中的冠醚基团可能会对其性质及作用行为产生较大的影响。3．3．3节中的研究表明，在电喷雾质谱条件下化合物12与19种氨基酸及所选择的手性药物(结构式见图3．7)均能产生较强的结合，应该是由于冠醚的包络作用远大于其它的非共价相互作用，为结合过程中的主要驱动力。化合物12与氨基酸及手性药物形成的簇集体多为二聚体(1：1结合)，少数能同时形成少量三聚体(参见3．3．3及3．3．4节)，簇集体离子在cD中的裂分规律基本与其它蜜胺衍生物与氨基酸形成的簇集体裂分规律相同。用ESI府讧s舢S考察化合物12对19种氨基酸对映体及所选择的手性对映体药物的手性识别能力，CD谱图见4—6，采用公式(5)的方法计算＆hir。l，结果见表4—2。表4．2化合物12对19种氨基酸对映体及部分手性药物对映体的手性识别能力 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氮基酸对映体的手性识别的Esl，Ms，Ms研究基窖■叠F90矗珥¨啊m■曲时‘5700％BO％霉60畸■羔iIO蕾cB目‘Ia^肛I，聃l哩m+7100％80％嚣B瞩芑i●0*20％鸭b59ll嗣I，q—I，f，i∞Ir削，图4。6化合物12与氨基酸簇集体的cID图谱(a)12a+D．Br(b)12a+L一町r(c)12b+D-Br(d)12b+L母r由表可见，除个别化合物(如跏等)外，化合物12对所有对映体几乎都末表现出手性识别。分析原因，可能是由于冠醚与手性对映体之间的强烈的包络作用削弱了其它非共价相互作用所产生的影响，从而导致识别不显著。再一次提示我们在手性选择剂与被识别分子之间所产生的多重作用力应为均衡、协同的作用，若其中某种作用力(特别是与手性作用无关的作用力)过强，则会影响整体的手性识别能力。因此尽管化合物12对所有的氨基酸和手性药物对映体均表现出较强的结合能力，但手性识别却并不明显。4．3．4小苯乙胺对19种氨基酸对映体的手性识别研究a．苯乙胺(a．Phenyl劬ylamine，PEA)是我们合成手性蜜胺衍生物过程中采用的最主要的手性源之一。4．3．2节中的分析表明，手性蜜胺衍生物中的苯乙胺基在手性蜜胺衍生物的手性识别过程中起着致关重要的作用。陈耀祖‘621等人曾经采用r星坩一m赢～百啪Illll』。l_∞嘴1上P、_1、．一帆泓懈m狲喊 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI，MsMs研究R-和S吨一苯乙胺为反应试剂，在反应质谱实现了对Phe对映体和Met对映体的手性识别。其方法是将R-或s．a．苯乙胺为反应试剂引入到质谱仪的化学电离源(cI)中，使其与被识别的氨基酸分子发生立体选择性化学反应，由于不同构型的氨基酸分子与手性试剂反应后所获得特征离子的相对丰度不同，因此可实现手性区分。尽管采用反应质谱进行手性识别与采用电喷雾串联质谱进行手性识别的机理不尽相同，鉴于这一研究结果，我们仍然认为有必要进～步考察手性蜜胺衍生物对氨基酸对映体产生识别的过程究竟是多重相互作用共同合作的结果，还是仅为手性基团自身作用的结果。为此我们先采用ESI府讧s考察了a一苯乙胺与19种氨基酸的结合情况。结果表明，在ESI／MS中a．苯乙胺与氨基酸多以1：1的形式结合，见图4．7。图4．7苯乙胺与氨基酸混合溶液的EsI，Ms谱图(a)R-苯乙胺+D．Leu(b)R一苯乙胺+D-Phe2目{遗l囊．自齑 塑圭兰垡堡塞王丝查堕堡生塑墅!!登堡苎墼塾堕竺塑量丝塑型塑!!型!型!堕壅进一步用ES啪s／MS考察a．苯乙胺对19种氨基酸对殃体的手性识别情况，典型cD谱图见4．8，&hi怡l值计算结果见表4．3。"00％e0％霉60％芒；●O％如％0％00％e0％掌60％矗40％20％0％1谭_岬■■_蛳a"．}2鹄H：^埘+150Djh日旷’00150200250300350400m允amu100％eO％霉60％≮40％20％O％"00％e0％辞80％一苫≮40％丘20％0％I№amu图4．8洳苯乙胺与氨基酸簇集体的cID图谱(a)12a+D小Iet(b)12a+L-Met(c)12b+D-Met(d)12bHrMet表4．3EsI，Ms／Ms考察Ⅱ．苯乙胺对19种氨基酸对映体的手性识别能力结果化合物Rc☆¨化合物Khir|l化合物Rchlr-l化合物RcmlAlaAr罟AsnAspO．981．051．02O．95GlnGIuHisIle1．021．001．06O．97Cvs1．01LeuO．99Lvs0．97Met1．03Phe1．01Pro1．00Ser1．02Thr耐rnpV“1．071．051．030．97 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的Es州s，Ms研究由表中结果可见，在ES眦S／MS中，苯乙胺对所有氨基酸对映体均未产生手性识别。说明尽管手性基团在手性识别中起着十分关键的作用。但手性蜜胺衍生物对氨基酸对映体产生识别的过程并非只是手性基团独立作用的结果，而是蜜胺衍生物上多个基团的多重相互作用力协同作用的结果。这也再一次体现了“三点手性识别理论”中所指出的多点相互作用的重要性：如果手性选择剂与被识别分子间的相互作用位点过少，即使所产生的相互作用是存在立体选择性的，也不一定能产生明显的手性识别。4．3．5各种实验条件对手性识别的影响以手性蜜胺化合物1对苯丙氨酸对映体的识别为对象，考察了不同溶剂、不同溶液浓度及不同试样配比对于手性识别的影响。4．3．5．1溶剂种类对手性识别的影Ⅱ向考察了甲醇、水、甲醇／水(1：1)为溶液，以及溶液中加入少量酸后对手性识别的影响。结果(见表4．4)表明，在前三种溶液中化合物1对苯丙氨酸对映体的手性识别因子＆hiral基本保持不变，当溶液中加入少量乙酸后，电喷雾质谱图中未观察到化合物1与苯丙氨酸的结合物。表4-4不同溶剂对化合物1对苯丙氨酸对映体的手性识别的影响4(Ⅱ23)溶剂R№IRSD％甲醇水甲醇，水(1：1)O．650．641．92．O甲酵，水，乙酸(1：1：0．01)，b注：a溶液中化合物1与苯丙氨酸浓度均为o．2rrlM。“未观察到簇集体。Yaof，tsl等人曾报道，在用氨基酸衍生物为手性选择剂对氨基酸进行手性识别的研究中，溶液中加入少量酸后对手性识别因子cR影响不大。但本实验中，少量 博士学位论文手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI／Ms／Ms研究乙酸的加入却明显影响了电喷雾质谱中化合物l与苯丙氨酸的结合(可参见3．3．1．2节)。分析原因，可能是由于氢键是促使蜜胺化合物与氨基酸结合的主要作用力之一(关于结合过程中氢键的作用，下一章中还将做详细的说明)，而少量酸的加入很能破坏了手性蜜胺化合物与氨基酸之间氢键的形成，从而最终破坏了二者间的结合。4．3．5．2溶液浓度对手性识别的影响考察了溶液中化合物1与苯丙氨酸对映体(1：1)浓度分别为O．01mM、O．05删Ⅵ、O．2mM、lmM时对手性识别因子＆himJ的影响。结果(见表4—5)表明，除了浓度太低(O．01mM)的情况下，化合物1与苯丙氨酸的簇集体离子丰度过低影响测定外，其它三种溶液浓度下化合物1对苯丙氨酸对映体的手性识别因子＆h删基本保持不变。表4．5溶液浓度对化合物1对苯丙氨酸对映体的手性识别的影响8(n23)浓度IkbimIRsD％～———————⋯⋯——————一一⋯⋯⋯⋯一⋯————————⋯一—一o．01mM，b0．05mM0．2mMO．680．643．12．O1mMO．631．6注：a溶剂为50％甲醇水溶液。6簇集体离子丰度过低影响测定。4．3．5．3溶液配比对手性识别的影响系统考察了溶液中化合物l与苯丙氨酸以不同比例混合时对手性识别因子的影响。实验结果(见表4．6)表明，在所考察的配比范围内，手性识别因子＆h删数值变化不大。 苎圭堂垡堡塞手性蜜胺衍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的Esl，Ms巾ds研究表4-6不同化合物配比对手性识别的影响8(n=3)M1：Phe＆hjⅢRSD％注：8溶剂为50％甲醇水溶液。综合以上考察结果可以看出，除了少数极端条件，如有酸存在或溶液浓度过低可能导致簇集体难以形成外，不同溶剂、不同样品浓度及不同选择剂／分析物配比对于手性识别的影口向均不明显，说明所建立的手性识别方法是相当稳定、可靠的。由于采用Es蹦s／Ms进行手性识别的方法，是将手性选择剂与手性待测物在气相条件下已经形成的簇集体挑选出来再进行研究，因此溶液状态下的各种条件虽然会对簇集体的形成产生一定的影响，但并不会对手性识别产生明显影响。测定混合未知样品时，样品的实际浓度往往难以掌控，因此采用受外界因素和条件影响较小的EsI，Ms皿vIS进行手性识别优势更加明显。4．4小结(1)采用ES啪s／MS考察了手性蜜胺衍生物对19种天然氨基酸及部分手性药物的手性识别能力，结果表明在已设计合成的12种手性蜜胺衍生物中蜜胺衍生物11可对19种氨基酸对映体均产生显著的手性识别，另外两种(1和2)可对17种氨基酸产生明显的手性识别。此外，通过有针对性地改变蜜胺衍生物氨基上的取代基团，可对具有不同结构性质特征的目标化合物产生手性识别。证明手性蜜胺衍生物是一类非常具潜力的手性选择剂。(2)通过考察各种非共价相互作用在手性识别过程中所起的作用，初步了解了手性蜜胺衍生物对氨基酸产生手性识别的机理，即先以静电作用和／或氢键作用作 博士学位论文手性蜜胺{i亍生物对19种氨基酸对映体的手性识别的EsI，Ms，Ms研究为结合的主要驱动力，使蜜胺衍生物与氨基酸分子产生结合，然后再通过其它的非共价相互作用，特别是手性基团上的非共价相互作用，如n．“相互作用、空间位阻等来产生手性的识别。(3)手性蜜胺衍生物与被识别分子之间所产生的多种作用力应该是相互比较均衡、协同的作用。若其中某种作用力(特别是与手性无关的相互作用力)过强，将会大大降低整体的手性识别能力。(4)手性蜜胺衍生物的手性识别能力是多个基团的多重相互作用力协同作用的结果。如果手性选择剂与被识别分子间的相互作用位点过少，即使所产生的相互作用存在立体选择性，也一不一定能产生明显的手性识别。(5)经考察，不同的溶剂、不同的样品浓度及不同的选择剂，分析物配比等外在实验条件对于手性蜜胺衍生物手性识别能力的影响均不明显，说明所建立的ESI／MS／MS手性识别方法是相当稳定、可靠的。 !堕兰垡堕一量堡蜜堕塑生塑翌堑垫型堡型壅箜量丝望型墨塑至堡旦垫型塑堡塞第五章手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究5．1引言那格列奈畔alegHnide，A4166，Na曲，化学名N．(反-4一异丙基环己烷基一1．羰酰基)一D一苯丙氨酸(结构式如图5．1a)，是一类新型抗糖尿病药物，为第二餐时血糖调节剂，可直接作用于胰腺P细胞，促使胰岛素释放，从而有效地降低血糖。I临床上用于饮食和锻炼控制无效的II型糖尿病的治疗。那格列奈主要合成原料为4一异丙基苯甲酸和D．苯丙氨酸，4一异丙基苯甲酸还原为4．异丙基环己甲酸，因此合成过程中可能会引入对映异构体(如图5．1b)和顺反异构体(如图5．1c)杂质。临床使用的那格列奈为反式D一型异构体，具有较强的降低餐后血糖的活性，而反式L一异构体的药理作用仅为反式D一那格列奈的1／60[1391，顺式异构体则无降糖活性【14们。因此控制那格列奈中异构体的含量对提高药效具有十分重要的作用。目前有关那格列奈异构体拆分方法的报道几乎全部是基于使用手性分析柱的液相色谱分离方法【”1。144】。由于那格列奈为氨基酸衍生物，结构与氨基酸相似，因此我们尝试以所合成的手性蜜胺衍生物为手性选择剂，用ES蹦S／MS的方法对那格列奈的三种异构体，即反式D一型异构体(D．Ne曲、反式L一型异构体(L-Neg)、顺式D一型异构体(z-Ne曲进行识别，并进一步测定了对映体过量值(见下一章)。此外，与天然氨基酸不同的是，那格列奈易溶于氯仿等非极性溶剂中，因此又为我们采用NMR等其它辅助手段进一步研究手性蜜胺衍生物与氨基酸类手性化合物之间的非共价相互作用提供了可能。NMR是研究分子间非共价相互作用的强有力手段之一，但其应用却常常受到限制。这主要是因为NMR在研究比较弱的氢键等非共价相互作用时通常需要使用非极性的溶剂，而大部分物质如氨基酸等却只能溶于极性的溶剂中，从而无法用NMR进行研究。这里我们以与氨基酸结构类似，又可溶于非极性溶剂氯仿的那格列奈为研究对象，采用NMR的方法研究手性蜜胺衍生物与那格列奈之间的相互作用，一方面可以帮助我们进一步了解蜜胺衍生物与那格列奈之间的相互作用机理。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究以及溶液条件与气相条件下相互作用的差别；另一方面也可以在一定程度上映射出蜜胺衍生物与氨基酸之间的相互作用机理。aCb图5-1那格列奈及其异构体的结构式a．N．(反4异丙基环已烷基．1糍酰基)-D．苯丙氨酸(D-Neg)；b．N·(反4异丙基环已烷基．1-羰酰基)．L。苯丙氨酸口N嘲；c．N-(顺-4一异丙基环己烷基一1-羰酰基)．D-苯丙氨酸函N嘲5．2实验部分5．2．1试剂那格列奈(N．(反一4．异丙基环己烷基．1一羰酰基)一D一苯丙氨酸)、N一(反-4一异丙基环己烷基一1。羰酰基)一。苯丙氨酸、N一(顺．4一异丙基环己烷基一l-羰酰基)一D一苯丙氨酸均由本所药化室提供。实验用甲醇为色谱纯，水为双蒸水。NMR用氘代人 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究试剂cDCl3经无水氯化钙和碳酸氢钠干燥除酸。S．2．2仪器Microm抽sLCT电喷雾飞行时问质谱仪(英国w孤璐公司)；APl3000串联四级杆质谱仪(美国ABI公司)；HaⅣardP哪pII型流动注射泵(HarvardApparatIls公司)。JNM—ECA400MHz超导核磁共振波谱仪(日本JEOL公司)。s．2．3质谱条件Mic∞m硒sLcT电喷雾飞行时间质谱仪：采用电喷雾电离(ESI)方式，毛细管电压3．5KV；样品锥孔电压5V；抽取锥孔电压3V；脱溶剂温度loo℃；源温100℃；脱溶剂气流量180【／h。样品通过流动注射泵以10“l／min的流速注入。单个样品采集时间为5分钟，以2～5分钟的质谱图平均后读取丰度值。APl3000串联四级杆质谱仪：采用电喷雾电离(ESI)方式；IS4KV；DP30V；FP250V；EP_9．OV；C)(P15V；NEB2utlits；CUR9眦its；CAD1unit；1’ernp50℃。样品通过流动注射泵以10“l／min的流速注入质谱仪。cE在5～10V的范围内进行调节，但对于使用同一种手性选择剂三种那格列奈的组合而言，碰撞能量保持不变。质谱以连续方式采集6分钟，以2～6分钟的质谱图平均后读取丰度值。D．，L．，z．那格列奈及手性蜜胺衍生物均配制成2mM的甲醇溶液。实验用溶液为含一种那格列奈和一种手性蜜胺衍生物各0．2mM的1：1甲醇／水溶液。5．2．4NMR实验一维核磁共振氢谱由删．EcA400MHz超导核磁共振仪测定，CDcl3为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标。NMR滴定实验：精确称取固定量的手性蜜胺衍生物(或D一那格列奈)，分别与不同量的D．那格列奈(或手性蜜胺衍生物)混合黉于标准核磁共振测定管内，加入O．5mLcDcl3配置成一系列不同摩尔浓度比例的手性蜜胺衍生物／那格列奈混合溶液，使样品充分溶解均匀，放置1天后测定。 5．3结果与讨论5．3．1EsI，Ms考察手性蜜胺衍生物与那格列奈的的结合情况首先采用单级质谱考察了手性蜜胺衍生物与那格列奈的的结合情况，结果表明，除化合物10外，在电喷雾质谱中手性蜜胺衍生物与那格列奈可同时呈现出l：1(1分子蜜胺衍生物与1分子那格列奈)和2：1(2分子蜜胺衍生物与1分子那格列奈)的簇集体离子峰，如图5．2所示。而电喷雾质谱中手性蜜胺衍生物与苯丙氨酸主要呈现出2：l(2分子蜜胺衍生物与1分子苯丙氨酸)的结合。从分子结构式分析，那格列奈是在苯丙氨酸的基础上将苯丙氨酸分子中的氨基进一步衍生化成酰胺，由于与苯丙氨酸相比可产生非共价相互作用的位点有所增加(如酰胺中的羰基)，因此那格列奈与蜜胺衍生物的结合呈现出与苯丙氨酸不同的特点。辱曲然螂+釉瓣M耐靼O9”?●”‘二臣。瞄盟一睫譬硝一P¨46j；2‘，蛔睁№_祥’gl}7a潮弘№●龌+BS3，9e7，3366醐口·斌，98e，i．⋯图5-2手性蜜胺衍生物与那格列奈混合溶液电喷雾质谱图(a)5Ⅱ+D．那格列奈；(b)7a+D．那格列奈；￡■{目卤￡盏蔷 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究5．3．2EsI／Ms，Ms考察手性蜜胺衍生物对那格列奈异构体的识别能力用ESI，Ms疗讧s的CD考察手性蜜胺衍生物与那格列奈对映体及非对跌体形成的二聚物及三聚物离子，结果表明手性蜜胺衍生物对那格列奈的对映异构体和顺反异构体均存在明显的识别能力。蜜胺衍生物与那格列奈结合形成的三聚物离子M2AH+的CD图谱中可同时呈现出母离子M2AH+及子离子MAH+、M2l{+及M旷，通常母离子M2AH+与子离子MAH+相对丰度较强，而予离子M2H+及MH+相对丰度值较低或不呈现，其典型的图谱见图5．3；蜜胺衍生物与那格列奈结合形成的二聚物离子MAH+的cID图谱中主要呈现出母离子MAH+及子离子MH+，其典型的图谱见图5—4。nn．船N‘蚺+6’：2a·)11．335o·Ⅻr500’000doM”I●‘Hw伪m№岫酽m】旷a-∥hS±2a-n■_譬f一·州’a·淞r500I000●⋯一fhⅪo啊沁弱2Ijcn"13i5i．m舻5001000rt虹amUBO*￡60*藿·o％C⋯一⋯≈目∞·-’吐652口．)矿3r1．a州’f一⋯nⅪ"-_阐+B52I(，I，臣．3351cf-钿lr图s．3蜜胺衍生物与那格列奈三聚物离子的cID图谱(a)7a+D．那格列奈；(b)7a+L．那格列奈；(c)7a+玉那格列奈(e)7b+D．那格列奈；(f)7b+L．那格列奈；(g)7b+玉那格列奈吣㈣聃|耄咻啉I％)．堇．一∞∞ 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那措列奈的手性识别及相互作用机理的研究"OO薯80％筘60％E显柏％n】■Ⅺ婚h日旷nn)Ir拿Bo％兰·o％20％0％b4Ol阢釉岫11．(m)Ir’a∞嚣80％：兰盖40％tIm曙H岫旷汕)旷劓5I图5．4蜜胺衍生物与那格列奈二聚物离子的CID图谱(a)11b+D．那格列奈；(b)11b+L那格列奈；(c)11b+厶那格列奈根据CID图谱所呈现的具体情况，我们采用子离子与母离子的丰度比值r来表征异构体之间的差异，对于二聚物离子定义rdi。r-[M旷】／[MAH+](5．1)，对于三聚物离子定义rtrj。。，=【MAH+】／[M2AH+](5．2)。蜜胺衍生物1-12对三种那格列奈异构体的识别结果见表5．1。为了更清楚地显示手性蜜胺衍生物对那格列奈对映异构体的手性识别结果，将表5．1中的结果进行重新整理，计算手性识别因子＆h删。对于二聚物离子定义：‰=器嚣黜==器器器舞器㈦。，对于三聚物离子定义：‰=器端毙=滁篇器器糕器@4)手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别结果(＆hⅫ)见表5·2。80 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究注：4未观察到簇集体离子；。[MA一】丰度过低，以[M：H+]／【M2AH+】计算8 堡主兰堡丝奎量丝查壁衍生物对新药那格梦Ⅱ奈的手性识别及相互作用机理的研究表5-2手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别情况M墨堕二聚体三聚体注：8n_3；6EsI／Ms中未观察到簇集体；。以[M2H+]／【M2AH+】计算。由表5—1中数据可见，多数手性蜜胺衍生物能同时对三种那格列奈异构体产生识别，特别是三聚体离子的CID图谱，由于产生的碎片离子较多，谱图所呈现的差异也更明显。表5—2中的数据显示，手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别趋势与其对芳香氨基酸对映体的手性识别趋势基本相同，其中化合物3、4、10、12对那格列奈基本不呈现手性识别能力，其原因与前述相同，既化合物3中的手性基团柔性有余，而刚性不足：化合物4中的手性基团缺少了芳香基团，显示兀一7c堆积在手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别发挥着重要的作用：化合物10与那格列奈未见结合；化合物12中冠醚基团具有较强的包络作用，削弱了其它共价相互作用的影响。一个比较特别的现象是，在对二聚体进行研究时，化合物1、2可以较明显地识别那格列奈对映异构体，但对顺反异构体却几乎没有识别。我们知道，在通常情况下顺反异构的差异应该比对映异构的差异更容易体现出来，而这里却正好相 堕主兰壁鹭文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究反。推测可能是因为二聚体中化合物l、2与那格列奈之间的相互作用结构单元主要位于结构中存在对映异构的一边，而具有顺反异构的另一边(可产生的相互作用应该主要是空间位阻)被置于较远端，因而未对其识别产生显著影响。事实上从那格列奈的分子结构中我们可以看出，其大部分可产生非共价相互作用的位点如羧基、酰胺、苯环等的确都位于结构中存在对映异构的一边。化合物11对那格列奈对映体显示出最强的手性选择能力(二聚体离子)，进一步说明增加手性基团上的作用位点有助于增加手性识别能力。但在三聚体离子的数据中，化合物1l对那格列奈的手性识别能力并不是最强的。一方面根据质谱图具体情况，化合物11对那格列奈的Khhl计算方法与其它手性蜜胺衍生物有所不同，可能是造成这一现象的主要原因：另一方面也表明作用位点增加后，三聚体中化合物11与那格列奈的作用方式可能与其它手性蜜胺衍生物有较明显的区别。此外，总体而言，三聚体离子所反映出的手性差别普遍比二聚体离子更明显，表现为化合物5、6、7、8、9对那格列奈均呈现了较大的R“㈨，其中又以化合物7的手性识别情况最好。这可能是由于三聚体的空间作用相对更为复杂一些。分析它们的结构，这五种化合物均带有双芳香基团，再次提示我们兀一兀相互作用在手性蜜胺衍生物对那格列奈手性识别过程中的重要性。更有意思的是，对二聚体离子而言，heterochiral较稳定，而三聚体离子则正好相反’homoclliral较稳定，说明二聚体离子与三聚体离子在空间构型及作用位点上应该存在较大的差别。5．3．3手性蜜胺衍生物与那格列奈之间相互作用的NMR研究5．3"3．1蜜胺衍生物与那格列奈之间非共价相互作用的NMR研究在上述章节中采用质谱技术进行的手性识别研究中，我们通过改变手性蜜胺衍生物侧链所连接的基团，表明多重非共价相互作用，如氢键、删t相互作用、静电、空间位阻等在手性蜜胺衍生物的手性识别过程中发挥了重要的作用。为验证质谱技术取得的实验结果，我们采用NMR技术迸一步研究了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间的非共价相互作用。用1HNMR分别观察了手性蜜胺衍生物1、5、7与D．那格列奈以不同比例混 塑兰堂堡丝三L一至丝查些堑生塑型堑垫型量型壅塑量堡塑型垦塑里堡旦塾里箜堕塞合后各质子的化学位移情况。蜜胺衍生物l、5、7与D．那格列奈的结构式及各质子的标号见图5．5。C1沿e5D．那格列奈图5．5蜜胺衍生物1、5、7与D一那格列奈的结构式g首先考察了化合物7a与D一那格列奈的结合情况。固定CDCl3溶液中7a的浓度为10mg，mL，改变溶液中D一那格列奈的浓度，使7a与D一那格列奈的摩尔浓度比分别为1：0、l：O．2、1：O．3、l：0．5、1：1、1：1．5、l：2、1：4、1：8，观察各质子，特别是活泼氢的化学位移情况，如图5—6。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究二li．u屯．。儿l|：烈k‰．洲刈I—二⋯⋯J～土‰J堋I．．U—二～』一一且。。～^一“一l⋯二一一嶷一i—L，j娃一烈土二{艘iJL一越』Ⅲ二；擐ii文0舢U_¨lL．¨●¨“¨"抽I●●_肚图5．6不同摩尔比例7a与D一那格列奈混合溶液NMR图谱(1)由图5—6可清楚观察到，随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物7a中的活泼氢a和b明显地不断向低场方向位移，说明化合物7a与那格列奈之间有氢键生成。反过来固定那格列奈的浓度为10m∥mL，改变溶液中7a的浓度，使D一 塑兰兰垡笙兰一．量堡查堕塑生塑翌堑垫型蹩型壅塑量壁塑型墨塑兰堡旦垫型塑堑塞那格列奈与7a的摩尔浓度比分别为1：0、l：0’3、l：0．5、l：1、l：1．5、l：2、l：3、l：5，观察各质子，特别是活泼氢的化学位移情况，如图5．7。一一止。柑i川【⋯二一—√h山⋯i“--⋯二—1』乙枷i舭A，|，0一二．^山L．i删ll●⋯‘●tm‘●¨⋯㈩●，严图5．7不同摩尔比例7a与D一那格列奈混合溶液NMR阻谱(2)由图5—7可观察到，随着溶液中7a浓度的不断增加，那格列奈中的活泼氢A也不断地向低场方向位移，说明活泼氢A也参与了氢键的形成。不过活泼氢A的化学位移幅度明显小于活泼氢a和b，说明其形成氢键的强度应该比较弱。根据图5—6和5—7分别绘制了活泼氢a、b和A的化学位移(6)滴定曲线图，见图5-8。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究7·87．36．836，3曲5·85．34，80l2345678pNag／7B9．47877&07e7．37呻6675975273456789101l12DNag／7B645js6．25；，t，‘。e．-s{／。eosj／01234567“D_NagabC图5．87a与D．那格列奈混合溶液中活泼氢化学位移滴定曲线图(a)活泼氢a：(b)活泼氢b；(c)活泼氢A根据7a与D一那格列奈中活泼氢的化学位移滴定曲线，我们可以推算出CDcl3中7a与D一那格列奈的结合比例为1：1(曲线拐点处)。这与质谱中所观察到的化合物7与那格列奈既有l：{结合，又有2：1结合的现象似乎并不完全相符，虽然cDcl3为非极性溶液，但溶液中的作用还是与气相条件下的作用有一定的差异。然而当考虑到不同物态的本质差异，我们知道溶液中观察到的现象反映的是各化合物之间在相互作用充分达到平衡后的平均结果。而在电喷雾离子源的准气相条件 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药都格列奈的手性识别及相互作用机理的研究下，反映的才是两者之间真实的可能的化学计量比关系。此外，观察图5—6中其它质子的化学位移情况可见，随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物7a中的质子c略微向高场方向发生了位移(约O．06△ppm)，这说明化合物7a中与质子c连接在同一个碳上的苯环可能与那格列奈的苯环产生了们t相互作用，由于周围电子云密度增加，对质子c的屏蔽效应增强，从而使质子c向高场位移。同样，图5—7中那格列奈中的质子B也随着溶液中7a浓度的不断增加而略微向高场方向发生了位移(约0．05△ppm)，其原因应该也是受到了苯环兀讯相互作用的影响。此外，从化学位移值可见那格列奈环己基上的部分质子也向高场发生了轻微的位移(约O．04．0．07△ppm)，虽然相互作用的具体过程还不甚了解，但推测那格列奈的环己基与7a中具有高电子云密度的基团(如苯基)产生一定的相互作用(如空间位阻)应是合理的解释，表明那格列奈非手性的环己基一端也参与到了与蜜胺的相互作用中。一个特别值得注意的现象是在图5—7中随着溶液中7a浓度的不断增加那格列奈中的羧基质子逐渐向高场位移，分析原因可能是那格列奈自身在溶液中羧基质子形成了分子内氢键，因此位于较低场的区域，随着溶液中7a浓度的不断增加，分子内氢键被破坏，取而代之的是形成了分子间氢键作用(由于在无水的非极性溶剂中，荷电基团的静电吸引相互作用可以忽略)，因此羧基质子向高场方向发生位移。这一点在图5—6中也同样可以观察到(羧基质子随着那格列奈浓度的增加向低场位移)。实验中我们还尝试用二维的NOE氢谱考察混合溶液中化合物7a与D-那格列奈的相互作用，以期获得有关二者之间相互作用位点的信息，但结果并不理想。这可能是因为NOE只能考察距离小于3A的质子之间的相关性【14卯，而蜜胺衍生物与那格列奈之间的相互作用较弱，质子之间的距离大于3A的缘故。由于蜜胺化合物的氢键形成能力较强(如蜜胺与巴比妥酸形成的超分子簇集体中，单个互补氢键键能高达7kca“m01)，因此由以上试验结果可以推测在CDcl3中化合物7a与D．那格列奈的质子之间距离较远、并且没有直接相互作用，多重互补氢键分别生成在两个化合物之问的质子供体和受体之间。其次，我们考察了结构中带有三个不同活泼氢的化合物5a与D一那格列奈的结合情况。固定CDCl3溶液中5a的浓度为10m∥mL，改变溶液中D一那格列奈的浓度，使5a与D一那格列奈的摩尔浓度比分别为1：O、1：O．2、1：O．3、1：0．5、1：l、l：1．5、 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究1：2、1：4、l：8，观察各质子化学位移情况，如图5．9。三，虬L：LlU：!』l棚。。恻l：：!LkL乙i㈨LI：：!儿山4黼耻：：!i咫i妊．ii4螅艘．烈．i～U¨10jl了’j¨¨u，·计轴“轴¨’。‘椰。图5．9不同摩尔比例5a与D一那格列奈混合溶液NMR图谱由图5．9可见，随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物5a中的活泼氢d、e和f均不断地向低场方向位移，说明三种活泼氢与那格列奈之间都有氢键形成。根据图5．9分别绘制了活泼氢d、e和f的化学位移(6)滴定曲线图，见图5-10。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究692642一=5．925．424．928．95845795o745吣6956455955，450123456789lOll12D_Nag／5ao一8．51屺8．0l7．5l70l0l234567DNag／5a0123456789101112D—Nag／5aabC图5．105a与D-那格列奈混合溶液中活泼氢化学位移漓定曲线图(a)活泼氢d；(b)活泼氢e；(c)活泼氢f由5a与D一那格列奈中活泼氢的化学位移滴定曲线，可以推算出CDCl3中5a与D一那格列奈的结合比例也为1：1。三种活泼氢中以活泼氢d的化学位移幅度最小，这可能是因为活泼氢d所代表的两个氢中只有一个参与了氢键的形成，而化学位移反映的确是两个氢互相交换平均后的结果，因此变化幅度不大a活泼氢f的化学位移幅度小于活泼氢e，说明在f处形成的氢键强度可能弱于在e处形成的氢键强度，或者f处形成的氢键的几率低于在e处形成的氢键的几率。其中后者的 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究可能性应该更大一些，因为从结构上看，f处的空间位阻明显要大于e处。此外，图5-9中随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物5a中的质子g略微向高场方向位移，提示苯环上可能产生了7cI兀相互作用。最后，我们考察了化合物la与D一那格列奈的结合情况。固定溶液中1a的浓度为10mg，mL，改变溶液中D一那格列奈的浓度，使la与D一那格列奈的摩尔浓度比分别为1：O、l：O．3、l：O．6、1：1、1：1．5、1：2、1：3、l：5，观察各质子化学位移情况，如图5．11。』二一⋯√⋯。z／j～厶j：一L上起一▲II：：=!弛i虬觚珊№U：i怨il姚心k贝j!：i堡LljU则：：i扯iI。血枞i∞。’’”赫‘“’H朋t。茹～二矗。。菇⋯．¨一—■面二图5．11不同摩尔比例la与D一那格列奈混合溶液NMRI虱谱 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究由图5-11可见，随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物1a中的活泼氢h和i均不断地向低场方向位移，说明这两种活泼氢与那格列奈之间都有氢键形成。根据图5．11分别绘制了活泼氢h和i的化学位移(6)滴定曲线图，见图5．12。7l6．6—56．1∞5．651469．158658．157657156656．155．655．150l2345678DNag／1a0l2345678D—Nag／1Bab图5．121a与D一那格列奈混合溶液中活泼氢化学位移滴定曲线图(a)活泼氢h：(b)活泼氢i根据la与D一那格列奈中活泼氢的化学位移滴定曲线，可以推算出cDcl，中la与D一那格列奈的结合比例也为1：l。此外，图5．9随着溶液中那格列奈浓度的不断增加，化合物la中的质子i略微向高场方向位移，提示苯环上可能产生了7卜丌相互作用。由以上NMR的考察结果我们迸一步证实了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间产生了较强的氢键及7【．7c相互作用。并且根据各质子的化学位移等信息，我们可以推断手性蜜胺衍生物与那格列奈之间的可能结合方式如图5—13所示。图5-13仅为手性蜜胺衍生物与那格列奈之间主要相互作用的简单示意图。由于在真实情况下， 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究分子在空间呈现一定的立体结构，因此二者之间相互作用的实际情况应该更为复杂。空间位阻Ⅱ呱相互作用图s-13手性蜜胺衍生物与那格列奈之间主要作用示意图另外，尽管在质谱中可以同时观察到1：1和2：1的簇集体，但手性蜜胺衍生物与那格列奈在溶液状态下的结合比通常为1：l。说明即使是在非极性溶剂条件下考察非共价相互作用，也仍然与气相条件下观察的结果存在一定的差别。5．3．3．2手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体手性识别的NMR研究进一步用NMR考察手性蜜胺衍生物5a或7a对那格列奈对映体的手性识别情况。结果表明，化合物5a或7a与不同构型那格列奈对映体的混合溶液(手性蜜胺衍生物与那格列奈摩尔浓度比均为1：1．5)的1HNMR谱图，在主要活泼氢的化学位移及质子偶合裂分程度等方面的确存在微弱的、并可重复的差异，如图5—14及5．15所示。 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究奄渡·u“¨"⋯¨⋯“l·’●●I一⋯虬L』⋯⋯上⋯～鼓⋯甜⋯lI‘＼}I}l⋯胤⋯l。图5．145a与那格列奈对映体混合溶液的1HNMR谱图(a)5a+D一那格列奈：(a)5a+L那格列奈人I‘肌卜5棘j图5．157a与那格列奈对映体混合溶液的1HNMR谱图(a)7a+D．那格列奈：(a)7a+L-那格列奈．Pl●一¨ 博士学位论文手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究由上图可见，通过1HNMR观察手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别差异主要体现在蜜胺衍生物中活泼氢化学位移幅度的差异，以及苯环质子和那格列奈中环己基质子在偶合裂分程度上的差异。这说明手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈之间产生的相互作用是不同的，即存在手性差别。以两次测量的平均值绘制不同构型那格列奈对映体与手性蜜胺衍生物混合后引起的活泼氢化学位移变化图，如图5．16所示。ab口7a+L—NagA盯ab由图5—16可见，分别选择的两种手性蜜胺衍生物与L一那格列奈混合溶液中主要活泼氢的化学位移变化明显大于其与D．那格列奈混合溶液中主要活泼氢的化学位移变化，表明手性蜜胺衍生物与L．那格列奈之间的氢键作用应该强于其与D．那格列奈之间的氢键作用。这正好与质谱实验中所观察到的二聚体离子中手性蜜胺一岔■·^LI|“||一||4善||j|| 堡主堂垡堡塞手性蜜胺衍生物对新药那格列奈的手性识别及相互作用机理的研究衍生物与。那格列奈形成的复合物比其与D．那格列奈形成的簇集体稳定的现象是一致的(见5．3．2节)，从而进一步验证了质谱实验的结果。同时也表明氢键在手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别过程中发挥了重要的作用。5．4小结(1)采用Es肼s朋江s考察了合成的手性蜜胺衍生物对三种那格列奈异构体的识别情况，结果表明，多数手性蜜胺衍生物能同时对三种那格列奈异构体产生识别。手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别趋势基本与其对芳香氨基酸对映体的手性识别趋势相同。(2)手性蜜胺衍生物与那格列奈对映体之间主要形成二聚和三聚两种簇集体。其中，三聚体离子的CD图谱，由于产生的碎片离子较多，表现出的手性差别比二聚体离子更为明显，表现为化合物5、6、7、8、9对那格列奈均呈现了较大的＆。。。对二聚体离子而言，hetemchiral较稳定，而对三聚体离子则homoclliral较稳定，说明二聚体离子与三聚体离子在空间构型及作用位点上应该存在较大的差别。(3)采用Ⅻ讧R技术研究了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间的非共价相互作用。实验结果进一步证实了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间产生了较强的氢键及“m相互作用。另外，与质谱中可以同时观察到1：1和2：1的簇集体不同，手性蜜胺衍生物与那格列奈在溶液状态下的通常形成1：1的簇集体。说明即使是在非极性溶剂条件下考察非共价相互作用，也仍然与气相条件存在一定的差别。(4)用NMR考察手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别情况。结果表明，手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体的混合溶液的1HNMR谱图在主要活泼氢的化学位移及质子裂分等方面均存在一定的、并可重复的差异，说明手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体之间的相互作用存在一定的手性差异，并且氢键在手性识别过程中发挥了非常重要的作用。 搏士学位论文对映体过量值(∞)的测定第六章对映体过量值(ee)的测定6．1引言对映体过量值(enanliomericcxcess，ee．对R-构型对映体而言，ee-100(R-s)／(R+s))的测定对于组合合成、不对称合成及天然产物分析等工作有着十分重要的意义。如在组合合成中，大量的不对称化合物可以被迅速合成出来，而复杂的对映体纯度测定过程却往往成为延缓整个工作进度的关键因素。因此建立快速、简便、灵敏、可靠的高通量(1li咖tllmughput)对映体过量值测定方法是人们十分重视的问趔14”。测定对映体过量值的方法比较多，其中最常用的是旋光度测定法、液相色谱法以及毛细管电泳法等。然而旋光度测定一般需要较大的样品量，测定的准确性很容易受到外界条件，如样品浓度、温度、溶剂纯度等等的影响，并且不能分析手性混合物。液相色谱法和毛细管电泳法是目前测定对映体过量值最准确和最灵敏的方法之一，但是通常分析周期比较长，且手性色谱柱价格比较昂贵。近年来，质谱法以其快速、简单、灵敏的优点成为了对映体过量值测定的新方法。目前有关质谱测定对映体过量值的报道不断增加，所使用的具体方法也各不相同，有报道特征离子相对丰度值与对映体纯度呈线性关系的【¨71，有主。客体复合物离子丰度比值与客体ee值呈线性关系的【7酣，有表观平衡常数与主体的对映体纯度呈线性关系的【鲫，有手性分辨因子(chiralresolutionfactor)的对数与ee值呈线性关系的【蚓。还有非对映异构复合物离子丰度比值与ee值呈线性关系的‘1171等等。这里我们则以手性蜜胺衍生物为手性选择剂，根据串联质谱中手性蜜胺衍生物与氨基酸(或手性药物)对映体形成的非对映异构簇集体离子解离的实际情况，建立了氨基酸及部分手性药物的对映体过量值的质谱测定方法。6．2实验部分6．2．1试剂所有D一，L一氨基酸均购于sigma、Acros或A1drich。实验用甲醇为色谱纯， 博士学位论文对映体过重值(∞)的测定水为双蒸水。D-DO队、L-DO队购于Sigma。D．那格列奈、L-那格列奈由本所药化室提供。D．。L．氨基酸配制成2mM的水溶液，D．、L．D∞A，D．、L那格列奈及手性蜜胺衍生物均配制成2mM的甲醇溶液。实验用溶液为含一种手性待测物(不同对映体过量值)和一种手性蜜胺衍生物各O．2mM的1：1甲醇／水溶液。6．2．2仪器APl3000串联四级杆质谱仪(美国ABI公司)；HaⅣardPumpII型流动注射泵(HarvardApparatus公司)。6．2．3质谱条件采用电喷雾电离(ESI)方式：IS4Kv；DP30v；FP250v：EP一9．Ov：cxP15v：NEB2llIlits；CuR9units：CAD1llllit；温度50℃。样品通过流动注射泵以10ul／min的流速注入质谱仪。在三重四极杆质谱仪的全扫描模式下，目标离子(母离子，即蜜胺衍生物与氨基酸簇集体离子)在第一级四极杆中被挑选出来，进入到第二级四极杆中与碰撞气(氮气)反应发生碰撞诱导解离(CID)，最后进入第三级四极杆中进行分析。为获取适合的子离子丰度，碰撞能量(CollisionEne唱y)样品具体情况在5～8v的范围内进行调节，但对于同一种手性选择剂和氨基酸的一系列测定溶液而言，碰撞能量保持不变。质谱以连续方式采集6分钟，以2～6分钟的质谱图平均后读取丰度值。6．3结果与讨论6．3．1r与ee之间的线性关系由于手性蜜胺衍生物(M)与手性分子(A)形成的三聚物离子(M2AH+)经过CD时可能会存在四种解离方式(见4．3．2节)，因此对于R-构型和s一构型的分析物(A)而言分别有 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定M2ARM2AsH+M：挑R一"嵩裔A舯M2j№=器m∥州习K瞄=器Ⅲ+MAR=≥KR42盲瓦南fMH十1M2H十H。jK旷嵩鲁妙M：jKs2=器MAsHT州=≥KS32葫『MAsH+]MH++MA。习Ks4=器(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)其中KRH和KsI。分别为各种解离方式的解离速率常数。理论上，每个对映体所产生的予离子与母离子丰度的总和是与溶液中对映体的初始浓度有关的，即有：竺!兰]!：!垒塑!!：竺全苎!垦：竺旦]!：!竺竺!呈玉：kc。，C。[M2H+]s+【AsH+]s+[MAsH+]s+[MHls+[M2AsH+]s其中cR和cs分别为溶液中R-构型和s．构型对映体的初始浓度。k是与离子化效率、离子传输效率、解离效率等因素有关的常数。将公式(1)．(8)带入公式(9)中，则有： 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定篙黑筹鬻⋯嘏s【M2AsHr】(1+Ksl+Ks2¨：s3+Ks4)⋯熙_k『cR／CS【M2AsH十】⋯若以[M2H+]／【M2舡{+】计算r时，则[M2H+]’下瓦面丽丽KR倒cR／Cs+Ksr2——————■———一kfcR／Cs+1KRl【M2ARH+】+KsI[M2AsH+】5—面瓦i而函矿又CR／Cs=(100+ee)／(100—ee)，故KRlU(100+ee)／(100-ee)+Ks”—而而罚面丽；；rO￡Rlk’-Ksl)，(k．-1)+200k’O(sl-KRl)／(k’一1)100仪+1)／(k’-1)+ee(12)式可改写为：r=(a+b)／(c十ee)(10)：垒!!兰!垒坚：!!!些垒!呈：】二坠!![M2ARH+】，【M2AsH+】+1其中a、b、c均为常数。当ee=0时，则ro=(a+b)／c用(13)一(14)，得(11)(12)(13)(14)卜r0=b／(c+ee)_b／c=-b。ee／(c2+c×ee)l／(r．r0)=．c，b一(c2／b)×1／eel／(r-r0)=a’-b’×1／ee(15)OO 博士学位论文对映体过量值(ce)的测定其中a’、b’均为常数。若r以【MAH+】／【M2AH+】计算，或母离子为二聚体离子时推导结果相同。由以上推导可知，l／(r-rb)与1^∞之间呈直线关系，因此可首先以1／(r-ro)对1／ee作图制得标准工作曲线，然后根据实验测得的f值计算出样品的ee值。为确证以上推导的正确性，以手性蜜胺衍生物1a为手性选择剂，以氨基酸D—Asn及手性药物D一那格列奈和D．多巴为考察对象，分别配置了一系列不同对映体过量值(cc=100、60、20、O、．20、．60、一80、一100)溶液，绘制l／(r．ro)一1／ee关系曲线，如图6．1、6—2和6—3。结果表明1／(Hb)与1，ee之间线性关系良好，可绘制成标准工作曲线用于对映体过量值的测定。，／J’图6．1D．Asn的1，(r_ro)．1，ee关系图(1a为手性选择剂，F[M2H+】／fM2AH+】)y-·拼‘^·II．284一-0∞43图6．2D．那格列奈的1，(r-ro)-l，ee关系图(1a为手性选择剂，F【MAH+1／【M2AH+】)嘶O4帅啦Oeo儿l＼}萼＼一]4{11JJlll】JJll，]JjJ_11IJ囊j0婪 博士学位论文对映体过量值(∞)的铡定图6-3D．DoPA的1，(卜ro)．1，ee关系图(1a为手性选择剂，F【M2H+】／【M2AH+】)6．3．2对映体过量值(ee)的测定ee值测定方法：为了使ee测定的过程更加简单快速，首先简化了工作曲线的测定方法。配置ee分别为100(纯R-构型)、10、0(外消旋体)、一10、loo(纯S一构型)的标准工作溶液，采用二级质谱测定r值并计算1／(r_ro)-l／ee工作曲线方程。然后测定实际样品的r值，代入工作曲线方程即可计算出样品的ee值。选择了一种重要的天然氨基酸A喀以及两种手性药物那格列奈和DOPA来考察所建立的对映体过量值测定方法。D．那格列奈是治疗糖尿痫的有效药物，L—DOPA则常用于治疗帕金森综合症，因此对它们进行对映体过量测定具有一定的实用意义。分析A曙和DOPA样品时，采用手性蜜胺衍生物物1a为手性选择剂，化合物l对Arg和DO队的手性识别因子分别＆hi嘲为0．51和0．75。分析那格列奈样品时，采用手性蜜胺衍生物物7a为手性选择剂，化合物7与那格列奈可同时形成二聚体和三聚体，其手性识别因子分别＆hiral为0．75和1．55(可参见5．3．1及5．3．2节)。经测定，以1a为手性选择剂时，她的1／(峋)一1／ee工作曲线方程为Y；414．2X+O．7927(R2=O．9949)，其中Y为l／(r-Ib)，X为1／ee；以la为手性选择剂时，DOPA的1／(Ho)．1／ee工作曲线方程为Y=799．7X+0．6232(Ⅳ=o．9995)。以7a为手性选择剂时，D．那格列奈的l／(r-r0)一1，ee工作曲线方程为Y=632．8x+1．2026(R2=0．9968，二聚体)和Y=一535．9x十O．5567(R2=0．9950，三聚体)。配置一系列不同ee值的A玛、DOPA和那格列奈溶液，经二级质谱测定r值102 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定后代入标准工作曲线计算，结果分别见表6—1、6．2、6．3、6．4。由表中结果可见，ee的测定值与实际值之间吻合较好，见图6—4(图中各点所示为三份样品的平均值误差棒代表测定值与实际值之间的平均偏差)。表6．1Arg对映体过量值测定结果(1a为手性选择剂)ee％D-Arg实际值型塞篁一平均偏差(1)(2)(3)I98．097．794．6103．83．3Ⅱ95．089．599．291．44．5Ⅲ90．095．890．184．43．9Ⅳ60．O67．953．067．47．5V2仉O23．725．O29．15．6Ⅵ．20．O．12．1-10．3-24．57．7Ⅶ一60．0．57．6．53．9—57．13_8Ⅷ．90．O一85．5-905-88．92．OⅨ一95．O．91．3-98．1·101．04．3X．98．O．100．5—99．O_97．31．4表6．2DoPA对映体过量值测定结果(1a为手性选择剂)98．O92．6101．995．14．195．O99．791．0102．65，590．O90．582．484．34．560．O53．055．265．15．620．O25．O14．227．36．1-20，O．13．3-29．9．17．66．4．60．O-53．9．63。6．50．36．5—90．0．97．5—93．5—83．35．9．95．0-98．1一109．6-99．74．2-98．0—102-4—95．7—105．94．9璺竺兰塑堡茎i：!103●ⅡⅢⅣVⅥⅦⅧⅨX 塑主兰些丝苎堕堕笪垫墨堡!竺!竺墅塞表6-3那格列奈对映体过量值测定结果(二聚体，7a为手性选择剂)ee％mNa8实际值——_i广————号竺笋—————i；厂—一平均偏差(1)(2)(3)。⋯～I98．O100．194．4101．63．8Ⅱ95．O97．690．693．O3．OIⅡ90．084．785．592．45．8Ⅳ60．O65．162．O55．24．OV20．O24．325．118．23．8Ⅵ-20．O．14．6一11．O．9．98．2Ⅶ．60．O．53|3．54．6．63．65．3Ⅷ．90．O．83．3．8l，6．90．55．2Ⅸ．95．O．96．7-97．1．111．73．5X．98．0．104．9一102．7—95．94．7总体平均偏差4，798．O95．O90．O60．O20．O一20．0．60．0_90．O．95．O．98．O102．291．985．755．219．1．19．0．63．2．98．4．88．9．100．891．589．593．755．817．1．24．1．51．1．85．8．90．2101．295．391．389．O62．523．2．23．O．53．4_96．9—97．0．102．14．54．13．O3．92．42．76．36．54．73．4总体平均偏差4．2104●ⅡⅢⅣVⅥⅦⅧⅨX 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定羹，。／’7∥_ib“甄y枷乒⋯Actu■lee％ofD-Arg／，／。一拜。尹‘。)0。60母jo20601。上-60一Ac“Inlec％ofD-N_g言毛量l耋盖；_-f，／／／||‘7b∞”“搿ym一⋯Ac“l■l牲％ofD．DOPAActutlee％ofD_№g图6．4对映体过量实际值与测定值吻合关系图(a)Arg；(b)DOPk(c)那格列奈(二聚体)；(d)那格列奈(三聚体)由以上表、图结果可见，采用所建立的方法对A唱、DOPA和那格列奈进行对映体过量值测定的平均误差在4．2．5．4ee％之间。分别以手性蜜胺衍生物与那格列奈形成的二聚体和三聚体为对象测定的ee值无明显差别。说明所建立的对映体过量值测定方法是比较稳定可靠，切实可行的。此外通过对仪器的良好调节和控制，应该还可以进一步提高测量的精度【1171，将方法应用于具有更低ee值的样品。6．3．3混合物中对映体过量值(ee)的测定实际样品测定时样品往往为非单一(手性)化合物，在这种情况下有些对映体过量测定方法如旋光度测定法等会受到很大的干扰，从而无法得到准确的对映vd06卜ⅡJ0暴8ig目tS蔷一暑=uglJuaH目 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定体过量值。前面曾经提到，采用串联质谱进行手性识别的优势之一是受外界条件(如样品浓度、杂质等)干扰较小，这里我们将所建立的对映体过量测定方法应用于混合手性化合物的测定。以化合物1a为手性选择剂，分别测定A唱与DOPA混合物(EsI质谱图见6—5)中A喀和DOPA的对映体过量值，结果见表6．5。tWdr0-X^f‘珥，明6．O∞％Ⅲ，3“『r．1．l图6-51a、Arg和DoPA混合物电喷雾质谱图表6．5Arg与DOPA混合物对映体过量值测定结果(1a为手性选择剂)结果表明，混合溶液中A唱与DOPA的ce值测量偏差分别为5．4ce％和6．7ee％，与单一手性化合物测定时无明显差别，即手性杂质对测定无明显影响。说明所建立的方法可用于混合物中对映体过量的测定，具有良好的实用性。 博士学位论文对映体过量值(∞)的测定6．4小结建立了以手性蜜胺衍生物为手性选择剂的对映体过量质谱检测方法。研究结果表明，采用所建立的方法进行对映体过量的测定，具有简单、快速、灵敏度高的特点，样品用量少，且不需要预先进行衍生化或色谱分离，可用于测定ee小于10％的样品。方法的另一个比较突出的优点是受杂质干扰小，可直接测定混合的手性化合物样品，具有较好的实用性，如可用于组合化学中所合成的大量对映体的快速分析等。此外，对对映体纯度测定的研究结果也再一次证明了手性蜜胺衍生物是一类颇具实用价值和潜力的新型手性选择剂。 博士学位论文结语第七章结语电喷雾质谱快速、灵敏、简便、样品用量少等特点正在吸引越来越多的研究者将其应用于手性识别和分析。但目前将电喷雾质谱技术用于手性分析的研究在国际上还处于初始阶段，仅有少数的文献报道，所使用的方法也大多局限于一些常见的手性识别主体，如环糊精、手性冠醚、金属配合物等等，手性识别的能力和范围均十分有限。因此设计和开发全新的高效能手性识别主体用于手性识别和分析，对于进一步拓展电喷雾质谱技术在手性分析方面的应用空间具有十分重要的意义。本课题正是以合成和构筑全新的手性识别主体为目的，设计合成了一系列新型的不同手性基团取代的蜜胺衍生物。采用电喷雾质谱技术研究了影响手性蜜胺衍生物手性识别性能的各种因素，包括取代基空间结构及各种非共价相互作用，尤其是氢键在手性识别中发挥的作用，深入探讨了手性蜜胺衍生物产生手性识别的机制和规律，以及将手性蜜胺衍生物作为一类新型手性识别主体的可能性和应用潜力。本课题的主要研究成果及创新点在于：(1)首次设计合成了一系列结构性质各异的新型手性蜜胺衍生物，并采用电喷雾质谱技术研究了它们对19种天然氨基酸及部分手性药物的手性识别能力。结果表明，蜜胺衍生物特殊的结构形式，使其可以很容易带上各种不同的基团从而为手性识别提供多种相互作用，且在电喷雾过程中易与被识别分子形成多聚物离子，因此十分适合作为质谱手性选择剂。在已设计合成的12种手性蜜胺衍生物中有一种(11)可对19种氨基酸对映体均产生手性识别，另外两种(1和2)可对17种氨基酸产生明显的手性识别，为目前所见文献报道中可同时识别氨基酸数目最多的手性识别剂。此外，研究还表明通过有针对性地改变蜜胺衍生物氨基上的取代基团，可对具有不同结构性质特征的目标化合物产生手性识别。证明手性蜜胺衍生物是一类非常具潜力的新型手性选择剂。(2)首次采用Es蹦S和EsI鹿“s，Ms的方法系统地考察了各种非共价相互作用对手性蜜胺衍生物手性识别能力的影响以及在手性识别过程中发挥的作108 博士学位论文结语用。结果表明，多种非共价相互作用如静电作用、氢键、耳呱相互作用、空间位阻等均在手性蜜胺衍生物对氨基酸的结合和识别过程中发挥了重要的作用。研究同时还发现，手性选择剂与被识别分子之间所产生的多重作用力应该是相互比较均衡、协同的作用。若其中某种作用力(特别是与手性无关的相互作用力)过强，可能会降低整体的手性识别能力。(3)通过考察各种非共价相互作用在手性识别过程中所起的作用，初步了解了手性蜜胺衍生物对氨基酸产生手性识别的机理，即先以静电作用和／或氢键作用作为结合的主要驱动力，使蜜胺衍生物与氨基酸分子产生结合，然后再通过其它的非共价相互作用，特别是手性基团上的非共价相互作用，如n．n相互作用、空间位阻等来产生手性的识别。手性蜜胺衍生物的手性识别能力是多个基团的多重相互作用力协同作用的结果。如果手性选择剂与被识别分子间的相互作用位点过少，即使所产生的相互作用存在立体选择性，也不一定能产生明显的手性识别。(4)首次采用NMR技术考察了手性蜜胺衍生物与手性药物那格列奈之间的非共价相互作用，证实了手性蜜胺衍生物与那格列奈之间产生了氢键及触相互作用。用NMR考察手性蜜胺衍生物对那格列奈对映体的手性识别情况。结果表明，手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体的混合溶液的‘HⅫ讧R谱图在主要活泼氢的化学位移及质子偶合裂分等方面均存在一定的、并可重复的差别，说明手性蜜胺衍生物与不同构型那格列奈对映体之间的相互作用存在手性的差异，并且氢键在手性识别过程中发挥了非常重要的作用。由于那格列奈为氨基酸衍生物，因此这一研究结果对于更好地了解手性蜜胺衍生物对氨基酸对映体的手性识别机理具有较强的参考价值。(5)首次建立了以手性蜜胺衍生物为手性选择剂的对映体过量质谱检测方法。研究结果表明，采用所建立的方法进行对映体过量的测定，具有简单、快速、灵敏度较高的特点，样品用量少，且不需要预先进行衍生化或色谱分离，可用于测定ee小于10％的样品。该方法受杂质干扰小，可直接测定混合的手性化合物样品，具有较好的实用性。 博士学位论文结语以上研究结果表明，手性蜜胺衍生物是一类颇具实用价值和潜力的新型手性选择剂，对其手性识别机理和识别规律进行研究以便进一步对其进行结构改造。开发设计出具有更广的手性识别范围和更高的立体选择性的手性识别主体，是一项十分有意义并具有广阔应用前景的工作。目前这项工作还在继续深入研究之中，包括在现有质谱和核磁共振研究的基础上采用计算机模拟簇集体最低能量构象，以期能更加明确地展现手性蜜胺衍生物产生手性识别的过程和本质，以及进一步进行结构改造，引入更多并更具有针对性的识别位点提高手性识别能力等等。相信在不久的将来，手性蜜胺衍生物作为一类新型的高效能手性识别主体必能在日益重要的手性分析工作中发挥积极的作用。llO 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苎主堂堡堕兰查耋奎整DuchateauA．DesigIlandsynthesisoffIuorcscent陋yclod“研nsfortlIeer叫dosele甜Vesensingof旺-amiIloacid．C^fr口n耖，2003，15：530-539[15】woIlgwL，HuangKH，TengPF’hecs，KwongHLAnovelc衄Iterp州dimm∞mcyle硒anuor器cems∞sorfofen锄廿oselec缸ve他∞鲥廿onof蚰oacidderiVa虹ves．(臻硎．(’omm“一．，20附，384—385[16】ziHnsk阻A，Stonciuss，andBuckusEsynmesisandcDSpec的scopicgtudyofchi糟lC2．s珈me疵(+)-2_0xaad锄柚tane-4，8．dione．c^fm矗秒，2005，17：s70_s73【17】vanK1inkJw：BaeksH，BarIowAJ，IshiiH，NakanishjK，BeroVaN，Per叮NB·weaVersⅣLDeterminationofttIeabsoluteconfigurationofanisotomeirregularditel_penes：印plic“0nofCDandNMRmethods，矾f，设矗砂，2004，16：549—558[18]Uncutac，caramanGB，1"anaseCI，BarthaE，KraVcsoVVc，simonoVYA，LipkowskiJ，Vanthu”eN．RmlsselC．Synthesjsandabsoluteconng吖ationassignmefltof5一amillo．1，3，5．triphenyl—pentane一1．3一diolstereoisomers。函妇f帆2005，17：6302[19]LaraKo，Godoy-Alcantarc，EliseevAV，YatsimirskyAK．Recognitionofa’枷moacidderivativesbyN，N’．dibenzylateds，s-(+)*tetrandrlne．0噶Bi0卅0，劭硎．，2004，2：1712-1718[20】MachidaY，NishiH，NakarnufaK．Nuclearmagneticresonancestudiesformechiralreco鲥non0f血enovelchiralstationaryph船ede石Ved胁m18一crown。6tetrac盯boxylicacid·J-劭mmⅡfp矿4，1998，810：334l【21】YashimE，Y锄amotoc，Ok锄oc0Y．NMRstIldics0fchiraldiscfirnin撕onrcle”蛆tt0meliquidch舢atogmphicenan虹osep鼬tionbyacellulosephenylc盯b锄atedcriVativc·z彳m·c^删·肋c．，1996，118：4036—4048[22]SalvadoriP，BarrettaGU，BalzanoF，BenucciC，ChiavacciC．NMRinVestigationofmeinteractionof(+)_卸d(-)．nurbiprofenwithp—cyclodextriII．凸fm“妒，1996，8：423m9【23】P缺1ewH，welchCJ．chromtogmphic姐d1HNMRsupportforapmposedch砌recogIlitionmodel．Zc^rⅢ口￡p矿一，1994，683：347-353[24]KnocheB，GehrckeB，K6nigⅥrA，wainerlwDetenninaIionoftheenantiome—c。omp05i‘i。nofmexiletineanditsfourhydroxylatedmetabolitesjnurinebyenantioseIectiVecaplllarygaschroma佃胛phy．c^妇，坝1996，8：30-34[25]K凸nigwAEnanIioselectiVec叩illafygaschmmatographyjntheinvcs2iga石onof12 博士学位论文参考文献stcreocheIIlic“coⅡel撕0nsoftcrpenoids．c^蛔铆．1998，lO：499-504【26】SchlnidtR，wahlHGHaberleH，Diete血hHJ，schu吨VHeadspaceg嚣chrom曲)g砷hy-massspec廿‘m艟缸ya强lysisofisonuraneenamiomersinb100ds卸叩lesa胁amgmesia州m吐蝣mceIIIicn正xtu∞C柏蛔均，。1”9，1l：206-21l【27】DesaiMJ，ArIllsⅡDngDA．AnalysisofnatiVeaIIlinoacidandpeptideenallnomersbyhighlPcrfbrnl柚celiquidchromto卿hy，atlllosphericpressurech咖calionizationmassspecⅡDⅡl哪．，^如ss印∞如卅．，2004，39：177-187[28]ImiH，MunakataH，u锄耐Y，sakumN．chiralrecogIlihonof删noacid蚰ddipeptidesbyawater．s01ublezincporph蜘n．如Drg．c^e卅．，2004，43：121l·1213【29】cavazziniA，NadaliIliG，DondiF，GasparriniF，ciogliA，Villanic．stlldyofmech撕smsofchimldiscriminanonof栅inoacida士ldmeirderiVatiVesonateicopl姗n-basedch吼1stanonarypllase．Z∞mm舭竹爿，2004，103l：143-158f30】Gia衄lG，corradinjR，DallaValleF，FoJesalliG，DossenaA，MarchelliR．chiralseparanonofa曲oacidbycopper(II)complexesoftetradentatedi锄inodiaIIlido—typeligandsaddedtotlleeluentinreverSed巾llasedhi曲Iperfonnancellqujdchrom8tography：a】igandexchaflgenlechanism．Zamm口f锯一爿，2001，922：15l—163【31]Helhiegelc，H卸delH，wedlgM，stelr山auers，so曜elF，AIbertK，Holzambeu．studyonnlechimlrecogIlitionofmeenantiomersof印hedrinedcrivativeswimneu仃alandsulfatedheptakis(2，3-D．diacetyl)·p—cyclodex砸nsusingcapillaryelech砷horesis’uV，nucleafma印edc托sonaflcespec订oscopy柚dmssspech口mehy．■C垤加晰口帕g一爿，2001，914：315·324【32】hcllikO，sch蚵dMG，PresserA，GubitzG．Innuenceofs帆tumandchiralilyoftlleselectoronthecIliral取ognitionofamino∞idsusingligand-exchangec印il】aryelec仃ophoresis．Ekrf叩^or∞捃，2002，23：3006—3012[33】chankvetadzeB，ErldmszG，schuIteG，BefgenttlalD，BIasclll(eG．c印illaryeIecnDphoresisand1HNMRstudiesonchimlrecognitionofatmpisom甜cbinaph出ylderivativesbycyclodex埘nhosts．ZCArD埘dfpgr爿，1996，732：143·150【34】wIlljamsKL，sanderLc，wisesA．useofanaphmylethylcarbamoylated．弘_cyclodex硒nchiralstationaryphaseforthesepamtionof出ugen枷orners孤drelatedc伽叩oundsbysub·andsupercriticalfIuidchmmatogmphy^∞妇均‘】996．8：325-33l113 博士学位论文参考文献【35】D扣delJM，蹦esssD，R丑ja90palans，wendts，zenobiR．Qu姐d诅tivedeteⅡninationofnoncovalentbindingintcractiollsusingsoftionizationmassspectmme臼，，一^．，．肘缸s印∞打∞小．，2∞2．216：1-27【36】sctl8lIeycA．Mole伽lar咒cd印“ionandsupramolecular删g缸ym也eg鹤ph船e．肘栅印8cnⅢ．胄e"，2001，20：253-309[37】Br甜beltJs．Probingm01ecularreco鲥Ⅱonbymssspec仃ome略加￡z慨s印卵fMt．，2000，200：57．69[38]L00JA，Elec仃osprayIonizationMassspectmme时：ATechnologyfors砌yingN0ncovalentMacmmolecularcomplexes．加t』^知耶印嘲帕卅．，2000，200：175·186[39]schalleycA．SupfanlolecularcheIIlis缸ygoesgaspllase：themassspec们me砸c盟a商n撕onofnoncovalentinteractionsinhost-guestchemistryaIldmolecularreco印ition．如t』埘如s印咖埘．，2000．194：ll-39[40]PrzybylsklM，G10cbrMO．E1eclrospraymassspec仃0metryofbionlacromolecularcomplexeswimnoncoValentinteraction—newanal”icalperspectivesforsupramolecularcheIllisⅡyalldm01ecularrecogllltionprocesses．一，酽Ⅲ凸删．如tEd凸“，1996，35：806—826[41]cristonjs，BemardiLR．DeVelopmentofnewmethod0109iesfortllemassspectrome仃ystIldyofbioo增anicmacromolecules．^如55印比f，D卅．Rev，2003，22：369_406H2】w浊s￡onRL，FilagefaldMc。Massspectrome舡yasaRadoutofprote妯s扛wtureand矗mction．肘i口印∞打Ⅲ．R“，1997，16：165—179【43】sIIlithRD，BmceJE，wuQY，hiQPNewrrIassspec廿0眦倒c叫tllodsformestIldynoncoⅧentassoiciationsofbiopolymers．c^绷跏．胁，1997，26：19l一202[44】LooJA．sn】dyingNoncoValentProtelncomplexesbyElecⅡ_osprayIoniza石onM硒sspec仃Ume廿y肘Ⅱ姐印∞抛聊．月eu，1997，16：1-23【45]G如emB，“YT’HeIlionJD．DetectionNoncoValemReceptor-“韵ndc伽叩lexesbyMassspectrcIme略■A研，c^删．5幻，1”1，113(6)：6294·6296[46】KenlpenEc，BrodbeltJs，BartschRA，eta1．IⅡvestigationofAlkaimetalCationselectivitieso】L盯iatE岫rsbyElec仃ospray10ni2ationMassspectrome哆一n以国绷．，1999，71(24)：5493·5500【47】BlaiTsM，BrodbeltJs，MarchandAP’eta1．EvaluationofBindingselecb、ri廿esofcagedcroWlLigandsTowardHeavyMetalsbyElec仃0sprayjoni髓tion／Qu砌mpoleIon11印Massspcc的me的14 博士学位论文参考文献一n以c^硎．，20仰，72(11)：2433．2“5【48】Chengx，ch饥R，Bm∞JE，eta1．usingElec们spmyIoniz撕onFTIcRM踮sspec怕眦廿yT0studycompetitiveBind吨of蛐itorstoc砷onicAl】llydr勰e．■一州，c^删．跏．，1995，117(34)：8859．8860[49】THoloA，Arc锄oneFM，Ra伍lelliA，eta1．Non．CovalelltCo唧lexesBe似eenDNA-BindingDmgsandDouble—strandedDeoxy01igonucleotides：a咖dybyIonsprayM鲢sSpec订ome订y-，胁船印Bc们埘．，1997，32(11)：1186—1194【50】Gabelicav’PauwED，RosuF"Interac虹onBe仲eenAntit哪orDnIgsaIldaDouble—sn锄dedolig∞ucleotidestIldiedbyElec仃osprayIotliz撕onM船sspec缸鲫e订弘』埘细印即f阳珊，1999，34(12)：1328-1337[51]wanKx，shibueT"GrossML，Non-CovalemCo呷1excsBe押ecIlI)NA-Bind抽gDmgs锄dDouble．s订andedOligodeoxynllcleotides：AstudybyESIIon-TmpMassSpec仃ome略，』珊劭删．曲c．，2000，122(2)：300一307[52】sannes．LoweryKA，MeiHY’LooJA，stlldyingAminoglycosideAn曲ioticBmgingtoHrv-1TARRNAbyElecIrosprayIonizationMassspectromet斟抽t_胁sj印砌_；口m，1999，193(2·3)：115．122[53】saIliles-L0weryKA，HuP，MackDP’eta1．HIv_lT乱P印tideBilldingtoRARRNAbyElectrosp拜lyIonizati叫M船sSpec仃0me时一月以c^啪．，1997，69(24)：5130-5135【54】chengx，H砌sAc，Goud∞auRN，eta1．DircctMe船urcrnentofOligonucle砸deBindiIlgstoichiometfyofGe∞VproteinbyM船sSpec们撇时mc胁ffI』衄d腻洮d，1996，93(14)：7022-7027[55】GaoMQ，zhangSQ，songFGeta1．smdiesonmeN0n《oValetltcomplexesbetween01eanolicAcidandCyclode)(砸nsusingE1ec仃_0spmyIonizationT柚deIIlM弱sSpec仃Dme缸y』肘如印∞加m．，2003，38(7)：723-731【56】．NemirovskiyOV，．GrossML．DeteIIIlimtionofCalci啪Bi础ngsitesinGas·Ph鼬esmnP印tidesby‰demMassspec廿0m曲y，爿m．曲c1埘a船．印Pcfmm-，1998，9(10)：1020_1028【57]孙晓娟，梅毓华，金晨，等．EsI／Ms和Ms-Ms研究Pd(II)和Pt(II)与多肽Mi“0pefoxid％e．11的相互作用．另哳别讨学掘2帅3，22(增刊)：4-7[58】GaIlgulyAK，Pr蛐a11lkBN，HuangEc，eta1．Delection卸ds仉lct哪!chamc蜘za廿彻ofRas115 搏士学位论文参考文献Onc叩rotein-Inhibmo体ComplcxesbyElcc们sp托lyM鹋sSpec打0me时占f。D罾肘姒c^硎．，1997，5：817．820【59】1幻wA，CooksRQchjral粕alysisbyMs．一n以c^删．，2003，75：25A-31A【60】T出etJC，Ion．moleculem∞Homin恤g鹅phase．ⅨDi能他nti撕∞of∞叽ti0眦ricm“lllolsllsingastereopecificsN2processinducedbyachiralreagent．乃fr口^咖m1987，43：3413-3420[61】HuasM，ChenYz，JiangLF，xuesM．slereochernicale脏ctsinmassspec们眦略3-Detectionofchiral时bychernicalionizationm鹌sspec仃ome时D停m口船印BcfMl．，19嘶·21：7．10【62]chenYz，LiH，Y眦gHJ，HuasM，“HQ，zhaoFz，chenNY．Stereoche皿cale矗bctsinm髂sspec廿ome仃y7-Detec石onofabsoluteconfigllr撕onofsomeo喀allicmoleculesbyreac矗onmssspec怕me时D罾肠m印ec们Ⅲ，1988，23：82l·824【63]YangHJ，ChenYz．stereochernjcale脏ctsinm踮sspec仃ome略13-Detcctionofabsoluteconngurallonbyfastatombombardmentmassspec仃0me略。罾胁船印Pcr阳Ⅲ，1992’27：736．740【64】FilippiA，spemnzaM．Gas-phaseofdiastereomericacetateion／证butylboratecomplexes·如f·，肘i55印∞f，∞1．，2000，199：211-219【651Mancelv"sellierN，LesageD，FoumierF"1’abetJc．Gasphaseenantiormricdistinctionof(R)‘aIld(s)椰mtichydroxylestersbyneg撕vcionchcIllicalionizationmassspec仃0me时usillgachiralreagentg粥．如tz肘a砧劬∞加m．，2004，237：185一195【66】陈耀祖，吴忆南．手性化合物的质谱分析研究．分析佑{毫1998·26：737，74l【67】sawadaM．ch砌rec9鲥d∞detectedbyf∞talombombardmntm∞sspec们me时胁”印Pcfmm．R“，1997，16：73-90【68]Matsumot0K，Yamamotoc，Y铡。眦E，OkamotoY．chiralrecogIlitionofcellul08。仃is(5．nuom．2．memylpheylc抽amte)咖ard㈣md(s)-1，1’_b淬naphmoldetectcdbyneg撕veionfastatombombardm翩tm鼬sspec廿ome略R印耐c。m埘．胁船印卵加m．，1999，13：2011·2叭3[69】Chum，DeardenDV，BndshawJS，HuszthyP’Iz甜RM·Chiralhost。gIleslrecognitionin4ion—moleculereaction．，|4m．蕊Pm．曲c．，1993，115：43184320【70】DoboA，Liptal(M，HuszⅡlyP"vekeyK．ctliralrecognnionViahost_guestinlem。‘ion8d。‘。。‘。d116 博士学位论文参考文献byf如t—atombombardmentIIl蓝s印ec舡Dme订y：principlesandlin吐tado璐．脚耐Cb卅埘．肘a础印∞如m．，1”7，1l：889—896【7l】s删们aM，okumuraY，Shiz啪aM，蚀aiY·Hidal【aY，YamadaH，1抽al【aT，鼬medaT，HiroscK，Misu面S，做ah粥tliS．En锄tioselec廿veCo呷lexadonofCarbohyd抬teorC坩wnEtll盱HostswimOrg粕icAmmoIli啪IonGuestsDetectedbyFABM∞sSpec仃ome时．"，．一m．C^硎-跏．，1993．115：7381—7388[72】sawadaM，shizllmaM，1娃aiY，YamadaH，K锄edaT，H锄a如satEnantioselec石vityinFABm％sspec仃ome竹，一Ⅲ．函m．SDc．，1992，114：4405埘06【731sawadaM，黜aiY，Y蕊adaH，NisMdaJ，＆medaT，AmkgwaR，okamocoM，HiroseK1hakaT’NaemurakChiralaIllinoacidrccogniⅡondetectedbyelec加spmyionizationand缸tatombomba幽entmassspectromen_ycoupIedwimttleenannomer．Iabelledguestme血od．』(璃e删，Sbc，P日协n丹d”5．，1998，2：701-710【74】sawadaM，Ya胁okaH，毗aiY，KaWaiY"Y锄adaH，AzIlmT，FujiokaT，‰akaTDetemliilationofenantiomericexcessforo曙anicprimaryaI珂neconlpoundbychiral驿cogni60nfastatombombardmentm粥s8pectrometry．如f．，刖台sJ印ec抛m．，1999，193：123-130【75】shizunlaM，AdachiH，TakaiY，HayashiM，TanakaJ，TakedaT，sawadaM．Facileee．deteⅢli衄tionfromasinglemeasu坤menlbyfastatombombardmemmassspec缸omeny：adoublelabelingmemod．c口而。砂出R口，2001，335：275·281【76】sawadaM，YaⅡ1aokaH，弛iY，KawaiY，Ya呦血H，Azl蛐aT，FujiokaT，T蛐al【atDeter扪【linationofe删omericexcessfbraminoacidestersaltsusing队Bmassspec缸ome缸y(臻绷，CbmⅢ。。1998，1569·1570[77]srnitllGkaryJA．Di缸reIniationofdiastereomericNickel(II)N—glycosideco呷lexesusingta士ldemmassspec仃Drnetryandbne疵en盯gyreieaseme酗uretnents．_彳脯．C嚣俐．＆硷，1996，“8，3293．3294【78】Ho矗neisterQLearyJA．chiralrccognitionofLithium．coordinatedDioIsusingt姐d锄massgpectromen，0罾^如拈印Pcrf，例．，199l，26：811．812[79]VekeyKandCZiraG．Dis虹nc廿onofaminoacidenantiomefsbasedonthebasicltyoftheHdlmmers．一月口tC*m．，1997，69：1700—17057 塑兰兰垡堕一童耋壅堕【80】LiangYJ，BradshawJS，IzanRM，PopeRM，Dea-denDVAna岍isofenan虹omericex∞ssusingmassspec们me扛y：Fastatombombardmen眺ector锄delec们spmyioni盟tio直1／Fo删er衄：lsfommssspec们me仃icapproaches．如t，^缸s国聊加州．，l鲫9，185／186／187：977-988【8l】vckcyK，zefmiLF．Chefnical∞∽noflsinf鼬tat啪bo础咀rd腓ntm螂spec呐蛳略％肘如s印卵打．。m．，1991，26：939·944[82】Fenselauc，concrlU．CheIIlicalAspectsofFastAtomBombardmem．凸删．Rev，1987，87：501．512【83】吴弼东，谢剑炜．电喷雾质谱技术在手性识别中的应用．军事医学群学篪饼谢2004，28：381．384【84]FilippiA，GiardiniA，Piccirnlos，speran盟MGas-phaseenantioselectivi吼如f．z^缸船印Pc加m．，2000，198：137-163[85】speranzaM．EnantioselectiVityingas-phaseion-moleculereactions．如丘■朋矗ss气阳cfmm．，2004．232：277—317[86]R吼irezJ，HeF’LebrillacB．Gas-phasechimldifrerentiationofaminoacidguestsincycIodex倒nhosts．，爿矾．国删．勋c．，1998，120，7387—7388【87】嘶goreanqRarnirezJ，AhnsH，Le¨llacB．Amassspec仃ome仃ymemodforthedete玎ninationofenamiomericexcessinIIlixturesofD，L_amino∞ids．“n以凸e卅．，2000，72：4275_4281[88】Gri90re柚GhbrillacB．Enantionlerica11alysisofph枷aceu缸calcompoundsbyion，moleculereactions．爿"以凸Ⅲ，2001，73：1684-169l[89】GalJEStoneM，LebmlacB．chimlreco鲥虹onofnon-natural舡卸：lill0解ids．血t，肘如印∞from．，2003，222：259—267[90]GrigoreanGcongx，mrnlaCB．Chiral柚alysesofp印tidesbyioIl／Ⅱ10leculereac廿0ns．如t，埘i口印∞frDⅢ．，2004，234：7l-77【91】GrigoreanqGronertS，L曲rillaCB．Ena士ltioselectiVegas-ph懿eion_nloleculcreactionsinaquadnlpoleion心ap．如tz肘h船印Pc咖卅．，2002，219：79—87[92】ArakawaR，Kobay船hiM，FukuoT’shi珀waTstIldiesont11eassociationof2-也iazolidinecarboxylicacid柚d锄tinlonypot船siumtanrate：ckralrecogninonandpfedictionofabsoluteconngurationbyelecⅡDspraylonizationmassspec打Dme缸yRapjdCommum．山h孵18 博士学位论文参考文献印棚．，2∞1，15：685-689【93】CbengY，HerculesDM．Me拈uremcntofchimlcompIexesofcyclodex仃ins柚daIIlin0acidsbyelec昀sprayiomzationti眦一o￡nightm孵sspec打0me时一^缸s跏咖埘．，200l，36：834-836【94】AfakawaR，KobayaslliM．CMml托co弘itionill嬲soci撕onbetwe∞a瓶咖唧potassi砒t咖tcandbis(L广alaIlinate)eIllylenediarninecobalt(III)complexesllsingekc觚pmyioniz“ionm觚sspec们me时』一Ⅲ．勘e胁船印即加州．，2∞0，1I：804-808【95]宋风瑞，刘子阳，孙维星．刘淑莹．区分麻黄碱立体异构体的质谱新方法．分析让钱1999，27(9)：1000一1002[96]Tao、似，zhangD，wallgF"ThomasPD，cooksRG鼬neticre∞lutionofD，L．锄in0acidsbasedongas-ph够edissoci撕onofcopper(II)complexes．“H以c^绷．，1999，7l：“27出29(97]Tao、张，zh8ngD，NikolaevEN，cooksRGcopp《II)镒sistedenanno魁fic缸aIysisofD，L-枷noacidsusingthekineticmethod：chiralrccogllitiona11dquantmcationlnthegasptlase，』“州C矗e棚．SDc．，2000，122，10598一10609【98】TaowA，Go配oFC，cooksRGMassspectro脚硒cquandtationofchiraldmgsbyt11ekinetlcmeInod．爿n以C％e％，2001，73：1692-1698[99】wuL，TaoWA．，CooksRGLig柚dandmetal—ione仃ectsinmetal-ionclustersusedforchlmlanaIysisof卅hydroxyacidsbytllekjneticrnethod．一舢瞳丑roⅡ埘正[沩P小．，2002，373：618-627[100】zhangD．，TaoⅥ，A，cooksRGchifalresolutjonofD—andLIamirl0acidsbyt如dem嘲ssspechlome仃yofNi(II)_boundmmericc唧1exes．砌t，施m印∞幻聊．，200l，204：159-169【lOl】Ta0wA．，wuL，c00ksRQR印id锄aIltiomericquall矗ficationof龇锄n咖lnucI∞sideagem(D，L-FMAU，2’一nuoro-5-mc血yl—p，D，L-ambin0觚nosylmcil)bym船sspec廿ome时z^掀C矗P棚．，2001，44：3541．3544[102】Angusti，DV’carazzaF’AugIlstjR，1幻、M，cookgRG．Quantitalivcchiralamlysisofsugafsbyelec幽sprayionizationtandemm船sspec订ofne自叫usingmodi丘ed删n0acidsaschir“referenceconlpounds．一n以C^e脚．．2002，74，3458—3462【103】wuL，MeurerEC，cooksRGchiralmorphinganden柚tioⅡ1ericqu蚰t1此撕oninrnixmresb)massspec昀me略爿H靠c矗Ⅲ．，2004，76，663-671n04】wuL’TaowA，cooksRG．KjlleⅡcrneIhodforthesirnultaIlcouschi蹦analysisofdi髓reⅡamjnoacidsinmixturcs．z朋asj．印卵打口m．，2003，38：386·3939 博士学位论文参考文献【105】wuL，Le叫KAggeI}lolmT’c00ksRG．Rcco驴ition狮dq啪nfi∞monofbilIary柚dtemarymixhl托sofisofnericpeptidesbyme“neticlnettlod：metali叩姐dligandefrectsonllledissociaIi∞ofme乜l舢眦dcomplexes．J=一埘．跏．^细s．印ec帕州．，2003，14：152一160【106】ShenwY’wongPSH，C∞lcsRGslc啪isomericdi妯坼廿帆bymc蛐ic眦山0d：2，3_butafledi01．月印耐comⅢ“H．胁印即f，硎．，1997，1l：71-74【107】ChenJ，zhuCJ；chenY-zhaoYF．Enantiomeficqu锄bficationoftllebio∽dvepepddeseryl-histidinemenlylester’byelec订osprayionizationmassspec加me仃yandthekineticm如od．且印耐comm埘．胍瑚印8c细小．，2∞2．16，1251—1253[108】PaladilliA；Calcag|lic；Palma’rD；speran盈M；Lag柚aA；FagoA；FilippiA；sattaM；GuidoniAGEnantiodiscriIIlimtionofchiralH-锄inophosphoIIicacidsbyn扭ssspecnDmehyo加ff。，，2001，13，707—711【109】FagoGFilipplA，GiardiniA，LagallaA，PaladiniA，spe舢zaM．chi旭lrecogIIltlonofD—phosphos翻nebymassspeclromet珥爿增8Ⅵ@踟．舰．耐，2001，40：4051-4054【110】scuderiD，Palad“A，sattaM，CatoneD，FilippiA，PiccirilloS，LaganaA，speranzaM，GuidoniAQGas—phaseco唧lexes：noncoVaIentinceractlons肌dstereospecmci吼抽tJ=朋矗5s印ec帕m．，2003，223／224：159一168【111]PaladiniA，scud甜D，LagaIlaA，Giard“A，FilippiA，Speran扭M．G髂-ph雒ebasic时a11den柚tiodiscrimin8tionofsomephosphorolls-containing口一删n0acidIIliIIlics．如t■胍埘印ec抛坍．，2003．228：349·358[112】N擅oheVEN，DenisovEVRal(oVVs，FutrellJH．hlvesli删ionofdiall(yltan咖m01ecul孤rcco舯itioninclusterionsbyFouri盯咖fomm船sspec缸砌eⅡy：acornparisonofchiralitye丘bctslngasandIiquidphase．如tz倒a"印ec抛m．，1999，182，183：359—368[113]cze刑enkac，LindnerwEnalltiomerdiscrirninationofp印ndesbytandemmssspec打ormtry：i11nuenceofthepeptidcs。quenceonddralrecogni“0n．R印埘CbⅢ卅“H．朋k船印∞nⅧ．，2004，18：2713-2718[114]1琶unenlaIsuH，IkedaH，HarLazonoH，hlaga“M，IsobeR，HiguclliR，GotoY’Y毗n砌otoM．Dinbremiationofapairofdiastereomericteni哪butoxycarbonylprolylprolineethylestersbycollision—induceddissocianonofsodi啪adductionsinelec订osprayiOni删on111assspec缸0I眦Ⅱyande“denceforchiralrecognitionby曲捌踟moIecularorbilalc矗lcuLa矗彻s．一嬲勰印即打硎．， 博士学位论文参考文献20们．38：188-195【115】Y的zP，w蛐TsM，KWong弛checT-chiralrecogtliⅡonofalllino∽idsbyelec的gp糟yiolIi2at岫nm聃sspec灯锄e叫nmsspec们雠略c^绷．com卅埘．，19妇，2119—2120【116】Y∞zP，、^，舭髑M，KwongKP"CIIecT．cllifal博co鲥6蚰byelec昀罐髓yioniz嘶衄m略sspec仃ometry，mass8pec口omehy1．Clliral陀cogniIionof19coInfnon枷inoacids．4蚪以(确硎．。2000，72，5383-5393【117】YaozP，w孤TSM，KwongKP，cheCtchiralrcco咖廿onbyelec们sprayiollizaIionmassspectrometry，masssPec缸omet阱2．Detcmnnationofellantiomeficexcessof哪抽o∽ids．一n以C^em．，2000，72，5394·5401[118】RcetzMT，BeckerMH，ⅪeinHW，s佑ckigtD．Amemodforhi曲抽∞ug帆tscreeningofenanlloselectivecatal”is，爿，增蹿mc^绷，加f．僦，1999，38：1758·176l[119】GuoH，wuJ，siuzdakGFiTltlMGMeasufemeIItofena而orne兀cexcessbykinehcresol嘶011andmassspectrome时．』n弘wc^m肌．肌，1999，38：1755—1758【120】oongs，c砌raE，HeF"GrcenMKkbrillacB．chiralrcco嘶虹onandmedepmton撕咖reactlqnofgas-phasecytochromecIons．如f．，^如js印即fm卅．，1999，185／186，187：40l-412【121]c枷araE，GreenMK，PennSGLeb棚acB．Chiralreco邸石onis0bseⅣedinmedeprotonationreactionofc”ochr帅1ecby(2R)一and(2s)-2-butylamlne．J_埘．c^e研．踟c-，1996，118：8751—8752(122】BarrettaGU，Iuli柚oA，Menica出iRPelusoP，Pie瑚iE，salvadoriEl，3，5删azimmultjscl∞torsyste邶：ncwtoolforchimldisc曲西all叽．c^妇矗机1997，9，113-121【123】BielejewskaAGMa巧ocE，Prinsu，T1lnmennallP|JongFD，kinhoudtDN．nle玎nodynaIIlicstabjli廿esoflinearandc—llkledtapesandcyclicrose恤sinmel岫e·cy蚰umteassemblies：amodeldescription上一研．C^唧1．肋c．2001，123，7519-7533【124】MatKasJP，SecocT’Si姗nekEE，whilesidesGM．self-assembIyⅡ∞ughhy出ogenbond访g：p唧ar砌onandcha聃cter础onoft}北enewtypesofsupr卸10lecul盯aggregatcsbasedonparallelcycljcCA，一飓“rosenes”．J=彳mc^删．岛c．1994，1】6，1725一1736【125】Dal舀ieshcE，The叩dcalreso㈨onofaromaticarnjno—acIdsonpaperchromatogra雌．JC^m．Sbc．．1952，3940-3942f126】KunevaabVB，AfonsobCAM，solVent—freesynmesisDfmelaminesundermicrowave21 博士学位论文参考文献i眦di鲥∞．GrB∞∞Ⅲ．，2∞4，6：183一187【127】P甩m血BN，Ba血erPL，Mi珊uA，etaI．E1ec帅spmyiomzationmssspec昀me时for也e咖dyofnon-covalemc0加|plexes：虮erneI_giIlgtechn0109y_J=胍琊勋卯加m．，19蛆，33(10)：9ll一920【128】F姗skiR，Elcc怕spmyioniz出叩m船sspec们眦缸c咖dyofl，3’4叼xadi锄le-coppercornpIexes．z^如∞印∞nⅢ．，2004，39(3)：272-276[129】GreigMJ，GausH，CummillsLL，eta1．Measumf肿mofmacromolecularbindingusingelec打Dspmy撇ssspec仃ome略Dete眦in撕onofdissociationcons蛐forolig嘶uck甜de。senlmalumillcomplexes．z爿川。嗍．肋c．，1995，117(43)：10765-10766【130】LimHI(’HsiehYL，GanemB，eta1．Recoglli虹onofcell-waupep石dclig锄dsbyV明comycingmupantibio矗cs：studies啪ingionspraymassspec咖曲阱，^缸船印ec抛埘-，1995，30(7)：708．714[13l】DunayevskiyYM，Lyubarskayaw，chuYH，eta1．si舢lt柚eousme嬲IIrementofnlneteenbindingconstantSofpeptidestovancomycinusingamnitycapillaryelecnDphoresis—massspecrometu，胁d∞Pm．，1998，4l(7)：120l·1204【132]LooJA，HuP，Mcco衄enP，eta1．AstIldyofsrcsH2domainprotein-phosphopeptidebindinginteractionsbyeIec仃ospmyioniz撕onmassspectromet阱，爿删．曲c．肘ds5印∞抛卅．，1997，8(3)：234．243【133】Gr“fcyⅫ，HofstadlersA，sannes-Low。ryKA，eta1．Deteminantsof锄inoglycoside_billdillgspecific竹fbrrRNAbyusingIn勰sspec昀meⅡy．Pr∽．Natl．Ac叠d．sci．UsA，1999，96(18)：10129—10133【134】Jo唱en∞nTJD，R0epstorfrP，HeckAJR．Dlrectdete舯inati∞ofsoludonbindingc0璐t舢l忸fornoncovaIentconlplexesbe憎eenbact耐aIcen、№llpcp矗dealIalogues卸dvancomycjn酽oupa埘biohcsbyelec仃osprayioni髓tion啪ssspec仃ome时AHn工c^Pm，1998，70(20)：4427-4432【135】YbngDs，HungHYILiuLK．Aneasyandrapidmemodfordetem血a虹0nofs衄b订时constantsbyelec廿ospmyionizaⅡon吼ssspectmme时脚耐cD卅卅“n．^船s印Bcrrom．，1997，1l(7)：769．773【136】GabelicaV，GalicN，RosuEeta1．Innuenceofresp吼∞factorsondetem】i11ingequilibri啪船sociationconstantsofnon吒oValentcorrlplexesbyelectrospmyionizationrrmssspechDmet阱I，．赫砧J肇黜打．ow．，2003，38(5)：49l一501 博士学位论文参考文献【137】KempenE，BrodbeltJ．A眦Illodformede咖矗nationofbindingcon她出byelechsp唧ioni盟tionmssspec咖仃y—H以cA删．，20∞，72(21)：5411．5416【138】M触ahanSE．Qh硎如肌C饨删把W，一阳如括；Brooks，ColePublishingco叫删叫：Monferey，Cali细血a’1986，pp71-72【139]IchiroOKeizoM，sacllikoLDetelminalionofN一(ha璐-4-isopropylcydoh既如∞afbonyl)-D_phenylalaIline柚dnsmc诅b01itcsinhumanplasmaandurinebycolunln—switctlingHPLcwimul乜aviolctdetection．ZC矗，珏州口f昭rB，1997，692：397—342[140】Hisa出s，MasallikoN，YusukeS．N·(cyclohexyc曲onyl)一D—phenylal柚岫andrelaIedcompoIlllds：anewclassofo糟lhyp091ycernicagen惦【J1z胁d凸删．，1％9，32：1436-l“1【14l】Yusukes，Masah蚰N，Hisashis．AnaJysisofenanliomersofanew柚廿di曲eticagentinplasr眦byHPLC．，上坷．cA，D小口fDg，：，1989，12(3)：445-449[142】suzul【ic．s印arationofanewN一(trans一4-is叩ropylcyclohexanecafbonyl)一D。phenylalanineanditsisomersbychiralHPLc．，上由∞，。卅口fDgr，19聃，12(3)：457-46l【143]曹国颖，胡欣，阎小燕，殷琦，宋友华．HPLc测定血浆和尿液中那格列奈对映体浓度．剪物分析象总j2001，2l：404407[1“】顾萍，李语如，蒋素梅，董真秀．那格列奈中顺反式异构体的HPLc法测定．坦‘荔黟学与筋绪移F窥2004，12：12一13【145]于德全，杨峻山主编．分析玷学手衍偿七钞衍J?发_磁裂j氍游毋分矽F化学工业出版社，1999：45-47【146】Fi曲MGEme娼ingm甜10dfbrmerapiddetemim石onofen锄廿㈣ficexcess·c^fm均，，2002．14：534—540[147】wuYN，TuYP，PanYJ，chenYz，CuiM，songFR，LiuSY．一舢正三叫．1997，30：1399·1406123 博士学位论文天然氨基酸分子结构式附录I丙氨酸(Ala)精氨酸(Arg)门冬酰胺(Asn)门冬氨酸(Asp)半胱氨酸(cys)谷氨酰胺(GlⅡ)谷氨酸(Glu)组氨酸(His)异亮氨酸(ILeu)天然手性氨基酸分子结构式。一。一≈一2：一：：一g：一!。二8一。。NH，o也“一i一“一。一。一。一“1一“。：。——i——：2——!：2_l——。nNH，0。。一。一¨2一』二4一。。H0一C—C—CH—C一0HINH，O。一：：一!H‘_4一。。。一。一}一g。一譬』一。。心”一i一。一。一。1一“兮孕』L即一孝一cn-N：』一。n州一。jq，“IⅢ一州㈨一Ⅶ一ⅢI∞一帅 博士学位论文天然氨基酸分子结构式亮氨酸(Leu)赖氨酸(Lys)蛋氨酸(M“)苯丙氨酸(Phe)脯氨酸(Pro)丝氨酸(ser)苏氨酸(Thr)色氨酸(np)酪氨酸(Br)缬氨酸(Val)州一乎一H2一字一H2一篓』一。。即一。一2，一：z一!二4一。。NH，09争一№n兮L。。一：，一』二l一。HO—C—CH—C一0Hl‘llH3c——cH—cH—c——。H驳广阻。。．．．．．—．1：：!!!!!!：：：：：!!!!户：2——l：2_8——。”l‘0。I伽一oiiC：一MI∞一HC一，∞IⅢ一CH 博士学位论文英文缩略语表附录II英文缩略语表英文缩写AM田CADCDCECICmCURCXPDIPEADon～DPeeEPEp甲-EpESIFABFPFTMSHRMSISMSMS，MSNagNEBNMRNPAPEAPPARSDTHFZOm英文全称Anlphet姐证n。C011isiongasCyolodex血nColhsionEne唧ChemicalioIli髓tionCOllision-induceddissociationCurtainGasCollisionCellExitPotentialN，N·diisopropyletllyIamine3，4．Dihyd∞xyphenylalallineDeclusteringPotemialEnamiomeficexcessEntrancePotetialEphed血eV—Ephe耐neElectrosprayionizationFastatomboIrIbardmentFocllsingPotentialFburierⅡa璐fo珊m船sspec们rnetryHigh-阳solutionm船sspec灯ome时IonsprayvoltageMassspec缸_ometryT抽demm∞sspec们meⅡyNateglinideNebulizerGasNuclearmagneticresonancen·PropylamineⅡ-Phenyle廿lylarIlinePhenylpropan01aInineRelativestandardde、riationTe仃ahydm胁nZolrnjtriptan中文全称安非他明碰撞气流量环糊精碰撞能量化学电离碰撞诱导解离气帘气流量碰撞室出口电压二异丙基乙基胺多巴离散电压对映体过量入口电压麻黄碱伪麻黄碱电喷雾快原子轰击聚焦电压傅立叶转换质谱高分辨质谱离子喷雾电压质谱串联质谱那格列奈喷雾气流量核磁共振正丙胺Ⅱ，苯乙胺苯丙醇胺相对标准偏差四氢呋喃佐米曲坦 NoVelChiralMelamineDerivatives：D鹳ign，SynthesisandApplicati佃toMassSpectro眦t咿basedChiraIAnalysisQinLiu，shuzhenzhan易BidoⅡgwu，JifenGuo，Jianweixie+，MingsongGu，YimiⅡzhao，LiuhoⅡgYun，KeIiangLiuB曲ingnstimte醇PhnⅢncDio时nnd1bxtcolo科27‰pi鸭R∞d．Be口ing100850．P"RjChtnnAbstractAnovelcl鹊sof幽ralfncla咖nederivativeshasbeendesiglledalldsynⅡlesi髓d．1kabilnvofthesecompoulldstoperfbmchiralrecog士litiontoward19n咖ralchiraI*枷noacidsh孙ecninve8tigatedbyelectrosprayi衄i黯tiontalldemmssspec怕me时for曲e矗糟t“me．111e。n8ntioselectiVitiesofthesenewc11iralselectorsareencour丑掣ng．Tbelucidatesomemechanism卸dreglllarityinthechimlrec0911州onprocessuslngchira】melamined翻vad"saschiraIselectors．thee航ctofdi船Ⅲ1tnoncovalenlinlerac“彻scauscdbyv州ouschimlor∞hiralmoietiesinmeIaIIlinederiva“vesonmechIralrecogfIitionjn曲egasphasehasbeenstudiedatt11esametiHle．nleresultshowsmateIectros诅ticinteraction，hydrogenbond，牡．兀stackingandstericinteracti伽bet、veen5。l。cto。andanaI”epIayimponantroIesint11eassoci撕ona11denamio∞lec廿vereco舯itionofaHlilloacidswimthechiralmelatIlinederivativesaschiralselectors．Ena埘odisc咖Ⅱnationfor蚰alvt既wifhdi彘rentstmcmreandprope而escoIIldbeimp∞vedbymodi伽ngsubstituenlsinmelamillede石vativesonpurpose．ChiralityisofincreasingimponaIlceinmanyfieldssuch髂phamaceutics，ch锄icalindust啪a11da鲥culture，etc．Moreandmoresin酉e．en甜ltiomershavebeenrcsearchedanddeveloped．灿aresult，d咖andforchi咖reco鲥tionands印arationofchiralcompoundshasincreasedinmepastf宅wdecades．En趾tiomershaveidenticalphySical趾dch铋icalpropeniesexpectforopticalrotation．Becauseofmesesimilanties，chiraldisc血ninationofenantiomersisaverv+Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed．E-mail：xiejw@nic_bmiac．cn．Fax：(8610)68211656J35 墼丝墼——幽型些苎墅塑她塑型堂墅竺塑塑堕鬯型坐challen画ngt嬲k．TheInostofkⅡusedmemodsiIIdliml锄alysis盯ecirculardidlroism，pol撕me廿y"nuclearma弘eticresonance(NMR)，chmmato掣印hy，aIldc即illaryelec昀phoesis，etc．Ana_C眦tiVealtematiVemethodismassspectIDmct啦duetoitsm聪yadvantagessuchasthcspeedofanalysis，hi曲s％s撕vity，molecul缸spec派ci坝a11d锄a11锄ountofs枷ple．Thekeyprocedurcfbrchiralanalysjsl】singMSt∞}1IliqueistoaddachiralselectorinthecompOuIld—matr{xsystemtogcneratedi鹪tereomers．Becausethediastereomersfomledfbmtheanalyte(chjralcompound)andlhechiralselectorhaveuniquereactiVityandstability"theresultiIlgmassspectnlmcontainsdifrerentrelativea_bundancesmatrenectthesediffbreIlcesandprovidesamethodforchiralanalysis．1Chemicalionization(CD2‘5andf缸tatombombardment(FAB)6。13werememainionizationmodesusedintheearlydeVelopmemofchir“massspectmmet哪whercaselectrDsprayionizationmassspectrometry(ESI．MS)，14‘20especiallyelectrDsprayjoIlizationtalld锄massspectrometry(ESI．MS—MS)21’38h踮recentlyemergedasapowemltecllniqueforchimlreco印ition．ESIisaverygentleionizationtechniquethatcanmailltainweal【1yboundcomplexes，tl】usnoncovalentdiastereomerScallbecharacterizedbymassspec们met阱Tandemmassspect删netryha8beenusedtodiscriminatechiralcompoundsbycomparingdi腧rcIlcesin觚gmeIltationpattemsviacollision—induceddissociation(CD)ofdisatcreomers也atarcfomed舶mallallalytea11dachiralselector，orbythel【ineticmemod．Comparedtosingle_stagemassspectra，talldemm勰sspectraaremorestable粕dins吼sitivetoiollizationemciencies，iontrallsfercoemcients，impurities，a11dchangesinconc洲ion．verysmanenergydi&rencesbe觚eendiastereom谢ccomplexescallbee雏ilydetectedbyMS—MS．’Nomatterwmchmemodisused，chiralselectoristhernostimportaIltpartofthechiralanalysissystem．Thus，grcate肋rthasbeendeVotcdtosearch缸gandcons仃1Ictingnew趿dversatilechiralsekctors．Somewell-knownselectorsusedinchiralmassspectromeIryare：1)Chiralhostmoleculesll·12，16‘20likecyolodextrinsaIldchiralcrownethers．Whentheyinteractwitharac锄aicguest，diastereomericcomplexeshavingdi彘rentthennodyn锄jcstabiHtyarefo订11ed．Ifoneen如tjomerofthea11alyteis136 簦圭堂垡笙苎型型!些墅堕堕竺堕塑垒些堕!螋芝塑墅鲤罂堑鲤型垒唑查isot叩icallylabeled，thecorrespondingmixtureofdiastereomeric∞mplexesc舭bem硒sresolvcd．¨’2CIliralrecognitionb硒edongas—ph∞eguestcxch觚gere∞tioIlsh船alsobeenr印0rted．14。20Diaster∞mericcompkxiOnsarem硒s．selectedanda110wedtoeXchangettlechimigtlestinare∞tion州mane皿al他agent．ChiraldistinctionisachievedbecausetllecxchangerateV撕eswimthechjralityofme姐alyteincoIporatedintomeadduction．2)Metalioncomplcx．22‘36Metalcomplexes、)l，imchiralcoaIlalytesareusedt0producediastereomericcomplexestllatareprobedbycollision-induceddissociation．Chjraldiscrimin舢ionsareperfomledbymonitoringtllerelativeab蚰dallcesofthedissociationproductsmatvariedwitht11echir81ityoftlleaIlaly乇e．Accord|ngtothckineticmethodusedbyCooksandco．workers，22。27，29。31anaqueousmettlanolsolutioncomainingaIlallalyte(c11iralcompo吼d，A)，ac蚰ralref旨encecompound(chjral锄inoacids，rc，)，a11datransitionmetalion(M)isinnDducedintoEsIsourcea11dsinglycharged砸mericclusterion[M(ref{-)2(A)-H】+aregenemted．cIDofD订(ref)2(A)．H】+clusterionst)巾icallyproducesdimericcompleXes【M∽fiI)(A)-H]+舡ld【M(rcf)2．H]十byconlpetitivelossofmenatur“referencecompound，rc，，a11dmeanalyteA，respectively．DuetothetwoconfigurationsofmeanaIyteA，tllediffbrencesinenergyrequiredtogcneratethediastereomericformsofthefhgmemions[M(re，)(A)．H]+rcsultindi‰cesintheirabund肌ce，me鼬uredrelativetomeab岫danceof[M(ref)2-H】+．hlmismcthod，chiralrcfcrencesarerequircdtohavesimilarstmctIlrestotllatoftheanalytes，so船toyieldbo也producti衄s【Mcre，)㈧-H】+姐d[Mcref)2m】+in也eprocessoff}聊钮嘲on．so陆tllismetllodh舔beensuccessfullyappliedtochiraldiscriminationof锄inoacids，23’26hydr0珂acids，25chiralp印tides，28"29andsugars．303)Smallchiralm01ecules．1-5，37j8TheseselectorscaIlinteractwi也chiralanalytebynoncoValentforcessuchashydrogenbonds，vrmderWaalsforces，etc，t0gen∞atediast㈣m舐ccornplexes．Y的37，38eta1．reponcdⅡlechiralanalysisof19commonchiral啪inoacidsusingmodified锄inoacjds船ch曲lselectors．CDofprotonatedt五mers缸m甜be脚eent11echiralselector觚dtheaminoacidto百veprotonatcddimersw嬲stIldied．Chiraldistinctionwasindicatedbydi位rentdissociationemcicncy(meintens时raIioofthepmducttothe137 堡圭兰竺堕三兰塑皇壁堕塑璺墼hn嘲噍如嚣n哇朗母坩t出_"d舢叫嘣h岫M瞄印馘H喇搿扭耐oi日^l瞄b．盎precllrsorion)bet、Ⅳeenthehomochinlandhetemctliraltrimers．HoweVer"liInitedselectivity舶dlimitedapplicationr觚geofreco删tionofmechiralselectorsarcstilImainproblemsmat8houIdbesolvediIlchiralMS蝴lys船．The∞archf酣noVel蚰crbro棚yordedicatedlyapplicableclIiml∞kcto陪isalways姐openfielda惭actingthecreatiVityandefronsoftheresearchers．Aninterestingwayofachievingchiralselectors，tla讥ngsatisfktoryenaIltiodis商millatillgcapabilitiescoVeringawide啪geofchiralanalyte，istohaVeanachiralpoly铀ctionalunityavailabletolinksevcraldi任秆entchiralmoicties．40MelamineisapmmisingcornpourldforthesepurposesowningtoitsspecialstrIlctllre．Ontheonehand，mel锄inehasbotllprotonacc印tors肌dprotondonorsiIIitsm01ecule，whichmakeitveryeasytofbmhydrogenbondwim0th盯molecules．Thehydrogen_bond-directedasscnlbliesofmel锄ineandcyanIlratederiVativesareoneofthefamousandwidelystudiedsystemsinsupenn01ecularchemistry0nmeotherhand，introducingaIldmodi聊ngthe胁ctional粤oupsinmeN—substituentscouldpmVidemulIipleimeractionswithomercompounds．AccordingtothcDalglieSh’stllree-pointmodel39，enalltiomerreco弘itionisachievedasaresultof讥_eesimultaneousattractiveintefactions(dono卜acceptorimeractionssuchashydrogenbonding，7【一stacking，dipole-dipoleinteractions，etc)bet、】lreentheselectorarldoneofen锄tiomersbeens印araIed．At1eaStoneoftlleseinteractionsnmstbestereochemicallyd印e芏ldcnt．Chiralmel锄inederivatives(mel锄ines血nctionalizedwitllchiralmoieties，M)缸etllusquiteat幢activefortlleirpatcntial印plicationtoclliraldiscrimination硒chiralsclcctors．However，vcryfbwchiralmelaminederivativesused勰chiralselectorshavebeenr印ortedso胁：Vccalo．B锄哦ta40eta1．hadinvestigatedmeen卸tiodisciminatingabilityof2-hexylalnino一4，6-bis—L-valyl—1-valineisopropylester-1，3，5—mazine硒modi矗ed2，4，6一trichlor0—1，3，5耐龀inetawardtlleN-3，5一dinitpobenzoylderi、riativesof1巾henyleth姐柚ineorvalinem劬ylesterby1HNMRspectroscopy，buttheresultw髂notsatisfactory．Nowourintefestisfocu8edonusingchiralmelaminededvatiVesaschiralselectorswhileaMS-basedm酬№disemployed．Themostoutstanmngadvantageofdevelopingthiskindofchiralselectorsisthatselectorscouldbedesignedand 堕主堂垒丝苎坠!型坚些壁堕墼呈塑墅些型垒些竺!苎苎墅苎竺苎型壁鲤垒堂s”岫esizedaccomingtomestmctWeofmeselect姐tmolec试e．Specialrecognitionsitesc翘beinm)ducedt0thechiralselectorse髂ilyinordert0impmvetheefmntiodiscrimillatir唱c印abil试es．The90alofmisstlldyistoh_ytoelucidatesomemech锄ism锄dmgularityinthec11iralreco盟itionproce豁usingchiralmel锄ineddvatjves嬲ch妇lselectDrsbychjfalmassspec扛Dm曲啊hlordcrt0bettcrunderstandtheroleplayedbymes衄lcturalfeanlresoftllemel锄inederiVativesonthcenaIltioselectivepropenies趾dtoidcntifymoreeff酤tivechiralselcctors，wesyllmesizedaseriesofnewchiralmel枷nederivatives(Chan1)stamngfbmcyanuricchloridc(2，4，6一trichlor0·1，3，5-砸龀inc)，inwhich锄inesynmonsw“hdiff色rcntstrLIctureandpmpemeswereused．C”m嘶cchlorideisaramerche印andeasilyavailablematcrial．Its埘fhctionality髓dreactiVitytowardnucl印hiles，suchasdi疗crentamines，makeitVerya‰tiVeR’rt11es”thesisofv州ousmel锄inedcrivatives．41。43T0evaluatethechiralrecognitionabilityofthechiralmel锄ined甜vatives，wehaveanemptedtodetectdiastereomersf-ormed丘omthechimlmel锄inederivativesandaminoacidsbymassspectrometry．19naturalchiralⅡ一aminoacids(A)havebeenselectedas“probe”selectalltssincetheyareimportalltcompoundsofchernicala11dbiologicalsystems，andmcirchjralrccOgnitionat把∞tsconsider矗bleinterest．Moreover’aminoacidshaveuniquestrIlctures，whichcallafrordmuniplenoncovalentinteractionsandprovideessentialconditionsforchir“recogIlition．Thesidechainsof19naturaIchiral删n0acidsvm-ya10t抒omeachother"ma虹ngitconveIlientf．orustosystematicallystIldytheiInpactofv蚵olIsnoncoVdIentimeraI丑io璐onchiralrecognitioninthegasphase．Bymodi研nggroupsinN·substitucntsofmel锄inederivatives，meefrcctofdifrerentnoncovalentinteractions，suchashydrog吼bondiIl岛兀吼imeractions，ionicforces，stericeffbcts，etc，onclliraldiscrirninationabil时ofmesemodifiedmel锄inesfor锄inoacidswereinvestigatedusingESI-MS—MS．Sincemeinterfb—ngefrectofthes01Ventwaseliminatedinmegasphase，somechimlreco弘itionmechanismandregul积tyofchiralmel啪inederiVatiVesaschiralselectorwerewelldiscussed．39 苎主兰垒望兰型鲤!堕苎塑塑垫墼塑!型熊!墅塑堕塾竺型型塑垡Chartl手砭手巧6∞88aR8h·SS99akR9b_S．SEXPERIMENlALSEClloNChemicals．A11D—andL-aminoacidswerepⅢchasedfbmSigma．Cy蚰uricchlorideandallchiralorachiralaminesusedtosyntllesizev耐ouschiralmel锄inederivativeswercpurchased行omArcos．Anwereusedwithoutfurtherpuri丘cation．ChiraI咖inoacidmeⅡlylestersusedwereprovidedbytllelaboratoryofProf‘Keliang“u．AnhydrousTHFw∞distilled舶mNa，bcnzophenone．Synthesis．ChiraImelaminederivativesweresynmesizedbytheselccdvenucloophilicsubstitIltiontocyaIluricchloride(2，4，6-trichlor0—1，3，5一mazine)usingdi脑ent咖inesinTⅫinthepresenceofN，N．diis叩ropylethyl锄ine(DIPEA)．42A1ltlleconlp01lIldswereidentmedby‘HNMR，pol耐m酏叮andhigh-resOlutionmassspectrometryThedetailedsynmcticprocedllrescanbeobtainedfbmmesupponir唱infomlation．MassSpectrometry．Massspe咖mctrywasperfoHncdbyusingacommcrcialAPl3000triple—quadrp01e(QQQ)massspec仃0meter(ABI，USA)，equippedwitha11ESIsource趾doperatedin也epositiveionmodeundcrtllef011awingconditions：sprayv01tage，4Kv．capjllaryt锄peratwe，50℃；cunaingas，9un瓶Thes锄plewasinfused1柏 博士学位论文№da蚓M由№&咖舾瞻由H母曲醯锄dAF曲罐两bM蕊印峨舶蜘y南瞳do由d^Il由蠹viaasyringepumpatanowmteof10肛L／min．Inthe如llsc姐QQQ．MS2mode，thep盯entionofimerestwhichis01atedintllefirstquadnlpoleQ，、v船既citedinthesecondquadnlpoleQ0nwhichonlyaradio舶queIlcyvoltageisplacedbyc01lisionwithN2(collisiong髂lullit，collisi∞翩er：gyr觚gc5～8V)，andtheIl锄alyzedintheth的quadmpoleQ．Thecollisionene略yw豁optimizedineachexperimembmk印tconstaIltforallthefollrchiralcombinationsofthechiralselectorand锄inoacid：RS，SR，RRandSS．Spectraweremeasuredfor8min，anddataintheperiodbctween2aIld8minwereaverag酣．Themeasurementsforeachchiralcombinationwerer印eatedthreetimes．、Formemeasurementofchimlrecognitionratio，2mMs01utioIlSofD—orL—aminoacidswerepr印arcdinwater2血Msolutionsofchiralmel唧ined嘶VatiVeswerepr印aredinmethan01．ThesolutionofaIlaminoacidandachiralselectorweremixedin1：lratio，a11dmendiIutedtoO．2mMby50％methanoIpriortomassSpectmmetricanalysis．RESUUI。SANDDISCUSSIoND船jgnofthechiralMelamineDerjVatives。Thou曲19natuI翟lchiral锄inoacidshaVerou曲1ysimilars饥lcturesincetlleya11possess锄inogroup柚dc曲oxylgroupsimuI￡aneously，meydi矗．er谢dely抽meir巅dechajnsnucture．Accordingtosidechainstnlcture，tlle锄inoacidscanbedividcdintodiff．erenttypes，i．e．alipll习瞳ic，aromatic，uns撇d，andaminoacidswithreactiVe-hydrogeII—comainingsidechain．两einteractionsthatdiff旨entaminoacidsare1ikelytof0咖arcdiff苦rent．hlordertogaillinsi曲tintotheroleplayedbythediff阳ltnoncoValcntinteractionsinmereco驴itioll，wedesi印edandsymhesizedlOenantiomerpairsofchiralmel眦inederivativeswitllVariousN—substitIlents(1一10，Chan1)．ourcuH即tstudyonlyinv01vesimples)，nthctic，bccausethesimplcrtheselector，theeasier“istosin哲eoutcleadythespec强cinteractionsthatpromotethechiraldiscriminationtowardpanicularselectants．Thesubs_【ituentsarcuncomplicated：arllino(1—8)toinvestigatemainlythee丘bctofhydrogenbondonchiraldiscdmination；dibutylamino(1-4，9，lO)toinvestigatemainlythee行bct41 苎圭堂垒鲨苎塑型!丝塑唑堕堡垒塑型熊!墅竺鳖塑墼璧!塑壁型塑丝ofstaticelec仃ostaticiIItemctionsa11dsterichjndr∞ce；4·tert山utylanilirIo(s，6)toinvestigatemainlyt11ee彘ctofsterichindranceand兀讯妣kinginteractions；di舵rentclliral锄ino，suchas1-phenylemyl姗in0(1，5，7，8，10)，l一(1．naphmyl)e血yl珊劬(2，6，8)，l·melhyl-3-ph锄yIpropylamino(3)姐d2_butyl锄i∞(4)toiIⅣestigatemailllymeeff酤tofchiralgroupsize，dgidands虮lcturconenaIltiomerdjscrimiIIation；sjngle(1—6，10)ordouble(7—9)chiralmoietiestoinvestigatemajmythee仃ectofthcn姗berofc11iralgroups．maddition，arrangementandrealigmentofthcsesubstitllentsarehelpfIllforlobetterundcfstandthemecbanjsmofchjraJreco倒tion．AssociationofChiralmdamineDerivativesandAminoAcids．AswekIlo、Ⅳ‘thereco肛itionmechallisminVolVestheaggregationofmeclliralselectorandtheenantiomericpair剐Sinto觚odiastereomericcomplexesheldtogethcrbyadi舵rentcombinationofnoncovalentinternlolecularinteractionsand，th黜fore，endowedwithdi腩rentstabilityandreactivity‘44hlotherwords，associationofachiralselectorandachiralselectantismeb鹊isofthechiralrecognition．Thuswestudiedt11eassociationofmechiralmelaminederivativesand蛐inoacidsinESI·MSspectraatfirst．聊icalESImassspectmofchiralmelaminederivatives／arIlinoacidsmixtIlresaredepictedinFigure1。Themassspectrawererelativelysimple，a11dsomeValuableinfo姗ationonthecombinationpmcessofthemelaminederiVatiVesandmeaminoacidsw盯eobtained．Exceptprotonatcdmolecul盯ionsⅫ+andpmtonateddimerM2H十，most哪inoacidsSuchasacidicandneu打alaminoacidsusuallyboundwimmelaminederiVatiVestofonntrimerionsM2AH+(FigIlre1，aaIldb)，wtmasb鹊ic锄in0acids(Arg，His，Lys)bo聃dwiththechir“selcctorstofoⅡndimerionsMAjr(Figurel，c)．IncreasingtheconeentrationoftheSolutionresultedinsimilarspectr乱ProtonatedaminoacidsAnH+werenotobservedaspmductsionsina11cases，pmbablybecausetheprotonamnityof枷noacidsismuch1awcrthanmatofthemelaminederivatives．42 丝主竺垒丝苎塑型!些查塑壁!望墼塑墅堕型熊!．咖竺堕墅苎!型型垒燮佃·Mrl≯忉毋砷I田{tI曲lrP1甲．I．1口罩)tH+l∞∞pp如毋-Ph日H—a．．．．产1覃。OWp．砷d矿，_t4印(n)舡’P．．PFIgu他1．EsIspec缸aofIllixttlresof8嘶n0acids(o．2mM)锄dch讧锄melaminederiva丘ves(0．2nlM)：(a)8a+D—Phe；(b)9a十D-Phe；(c)lb+D山rs．EsIconch舶璐：ionsprayvol缸ge4KVndmlizerg髂2units，curtaing懿9u11its，arldteIIlpemmre50℃NearlyaUsynthesizedchiralmel锄ined嘶vativesexceptcompound10couldcombinewithaminoacidswitharomat沁sidechain(His，Phe，1b，Dr)oraminoacidspossessingunsaturated伊oupsinsidechains(赶g，Asn，Asp’G1n，G1u)，suggestingtheexistcnceofthe7【讯interactiorIs．When锄inoacidsidechainShadnci_meraromaticgroupnorunsaturatedgroup，onlychiralmel锄inederiVatiVesbearingboth143 塑圭兰篁堡兰!竺!型些塑查望堕塑堕璺壁壁婴生些墅皇些墅壁竺兰型型!坚dibutylaminoand锄irIo(1—4)couldbindwimthem．nmightbeare髂onableexpl锄ationthattlleb鹊icityof也edibutylaminoimprovedⅡlesalt-formingorstaticelec呐staticintemctionwimmecarboxylgrollpof111e锄inoacids，锄dtlle锄inoincrca∞dlIydrog％bondbetweentllemolecules．AmoⅡgallcllifalmel锄inederivatiVeswesynthesized"compourldsl一4showedthegreatestabilitytocombinewim19如血10acidsaccordingtomeabundanceofmepmtonatedcomplexesinMSspectra，andwhcthertllerewerearomacicringsiIlchiralmoietiesornotdidnothaveanyinnuenceonthecombinationormeinten8ityofthecombination，whichindicatesmattllec11iralmoietiesarenottlleleadingfhctorinthe弱sociatiOnprocesses，Chiral锄inoacidmemylestefssuchasLeuOCH】，PheOCH3a11d1印OCH3，werealso锄ployed勰aIlalytesintheexperimemtoo，butcombinationbet、veenthemel锄inederivatiVesandmese哪inoacidmeth姐estcrswerenotobservedbyESI·MS．Thissuggestsagainthatsalt—fomlinginteractionplaysanimportantroleintheassociationofthemelaminederivativesandme锄inoacids，andisoneofthedrivingforcesforcombination．Asforcompound10characterizedbyESI—MS，neithermecombinationwithme啪inoacids，northeag盯egationofitselfwasobseⅣcdbyESI-MS，pmbablybecauset00la唱esterichindranceofthet、Ⅳodibutylaminogroupsblockedt11ecloseofthem01eculeS．ChiraIRecogⅡitioⅡofAmiⅡoAcidswithChiraIMelamiⅡeDeriVatiVes．Whenstudiedthe硒sociationofmemelamiIlederivativesandⅡle锄ino踮idsbyESH讧S，wefoundnlatsomeObviousisom嘶cdifrcrencesincombination，especiallycombiIlatiOnbetweenthemelaminededvativeswi也aromaticchiralmoictiesandtheaminOacidswimaromaticsidechajn，couldbeobserveddirectly矗_0mthepeakabundancesinmesingle—stagemassspectra．Atypicalexampleofmese，asobservedintheESI—MSspec仃aofa11fourcomplexesofaIl锄in0acid(Phc)aIIdaclliralselector(1)，isd印ictedinFi辩2，show崦tllatmccombinationbe帆cn1a(RconfigIlrationof1)andL．PhewereapparcntlyStrongerthanthatbetween1aandD—Phe，whereasthecombinationbet、veelllb(Lcon丘gurationof1)a11dD-Phewereapparcntlys昀ngertllaIlIhatbctween1band【广Phe．Thjssuggests也atassociationofthechiralmelaⅡlinederivativesandtheaminoacidsisrclatedtothechimlity，a11dtheisomericdj腩rences144 博士学位论文黼ta面dM由妇tA喃酶n遨毫母l蛙瞌射{冉蛐曲I包M西毒吲啊懂乜yh蛀Q一^l由盎indeedexist．Howev％wedidnotmakeatllorou咖smdyon“sphenom吼。玛consideringmatsinglestagem髂s叩ectraaresensitiVetom柚ycxterIlalfactors，such站ionizaCionemciencies，iontransfcrcoemcients，concentr娟on，andiInp血ties，whichmightfe叭niIlpoorr印roducibihty雏diIldistinctionof飘Ibtledi髓r锄ces．The斌herinves吨a{cionofthechiraldis耐miIIationwascarricdoutbyESI—MS-MS·【h，矿6皓(II，和Jh芦‘捌4kL，。P乒¨l，_p七k瑚+(Ik)一+甲一千k，r睁-I。“辜In，苗嘲H．k*Le5，。【陋Figure2．EsIspec晌ofallfourco呷lexes0fPhe∞d1：(a)II+D-Phe；(b)l_+L"Phe’(c)1b+D．Phe；(d)1b+L。Phe．ESIcondnions：ionspmyvoltage4Kv，nebulizergas2咖its’cIlrta抽G嬲9un“s，眦dtemperatu伸50℃．Asmentionedabove，Cooks21’27，邺1，Yao那8aIldomers9recentlyexploitedamassspectmmemcmemodologyforgas·phasechiraldiscrimination，whichisbasedonthecollision．induceddissociation(C口))ofthetrim甜cadductsX2YH+，whereXjsthechiralselector"Yisthechjralallalyte．We印pliedthisteclllliquetocnantiodiscriminatemeclliralaminoacidsbyCIDoftheirpmtonated砸merMzAH+witllchiralmelamine145 塑主堂堡丝苎型塑唑壁塑坚堕型壁鲤遨!些坚塑型旦塑塑唑deriVatiVes．ForArg，HisaIldL泸，CDofprotonateddimerMAlrwcrcstIldied．ThedissodationpmcessesOfaprotonatcdtrimerd印endonmestmctureoftheprecursorion锄dmep∞ton桶nityoftheproductiom．’hIt重Iisstl王d弘sincetlIesmlctufc柚dpropeni∞ofmealllin0∞ids嬲well蠲thcmelaIIlinederivativesarequitedifrcrent舶meachother，thedissociationpamsoft11emmerionsfbrmedaredi侬鹏m，resumnginthediff打entC刀DspectraofM2姐’：(1)h1them萄orityofc鼬es，prccursorionM2埘’andproductionsM2}r’aIldMH+were0bservediIlCIDspectra．ProductionMA旷wasnotobseⅣedbyvaryingCIDconditions．AtypicalspectnlmisshowninFigure3a；(2)IIlmeminorityofcases，prccursorionM2AH+andproductionsM2扩，MH+andMAH+wereobseⅣedinCDspectra．AtypicalspectmmisshowninFigIlre3b．AsforArg，HisandI沪，whichboundwitht11echiralselectorstof．ormdimerjonsMAH+，onlyprecu母)rionMAH+肌dproductionsMH+wercobservedinCⅢspectra．1。。i％i8。：BB‘l拭^砰pH+5紫+』1口口i％i，IIJm“pb即桫+哗+i’．【【BOO日00’0002叩400们0a001000mn№Figure3．cIDspec仃aofprotonated订imers丘Dm(a)h+D-A印and(b)h+D_A辄．collisiongaslullit，c011isionene理；y5．ChiraldiscriminationcanbemeasurcdbythediHbr饥ceofthedlssoclatlonemciency(theintensityfatiosoft11eprotonateddimertot11epmtonated埘瑚er0r111eprotonatedmonomerto廿leprotonateddimer)beMeentheheteoclliral锄dthehomochiralcases．Foreachco如plexion，allfourpossiblefoⅡns，i．e．，RSaIldSR(heteochiral)andRRandSS(homochiral)，wcrestudied．AstoⅡ一aminoacids，DconngIlrationisequaltoRconfigIlration，andLconfigurationisequaltoScon矗guration．nechjraldiscrimjnanonratio民№lcanbede颤nedbyeql，wheren=】or 堡壁垡望壅塑!型堂坐堕堕璺堂查型燮塑磐坚坚堕塑!型!堂堂2．neequationissimilartotha￡uscdbyYa037alldV6key_9‰：盟幽型型：坠幽啦：f坠!幽坚垒幽坠±盟型坠幽：监m(【Mm+】，[MAH+】)b呻曲枷(【Mm+】，[㈣+])腿+(【M出+】，MAH+】)。。P7wcusetlleintensityratiosofmeproductionMn旷tothepre唧80rionMnAH+tocalculale＆hinlsince血atMn}I+couldbeobservedinallCDspec仃a．UsingauIlifiedcalculationmcthodtomeasurechiraldiscriminationmdkesmeexperimentdataofdiⅡbremcomplexesmorecompar曲le．WhenRchjnl<1meansthatthedissodationismoref打orableinthehomochiralc船e，wbereas＆hi州>lme锄smattlledissociationismorefavorabIeintheheteochiralcase．For＆hjral=1，thereisnoobser、rableclliraIdiscrimination．ThefhrchcrmeRch㈨valueis丘勺mtnlity，thehi曲crthedegrceofchiralrecognitionobsen7ed．I。。_i。il。。●I。i”70嘲皿“埘at嚣jc日‘¨h矿6日5l1。。i。jl。。_j。ibt留l55a70口750日O口日朝B00md日r‘m№^●■H嘴lFigure4．Ch砌discrimiIlationofAsnwi血las0bservedintheCIDspechofprotomled埘mcrs(a)1a+D．Asn(b)1a+L．Asn(c)1b+D．Asn(d)lb+L-Asn．MS．MScondi缸on8：collisiongas1unit，collisionenergy6．147 房乒⋯⋯⋯⋯⋯⋯、崔一I、、、、、、、、、＼、、、、、、、、、2S三詈鲁葛竺：譬篙曼、、、、、、、、、童至至墨誊至量莹兰喜、、、、、、、、、、2S盏：竺=：：3兰：翟⋯⋯⋯、l蓍蓍量蓥詈璺圣墨誉＼、、、、、、、、、d6d一一一。BS：暑：=：3暑i害呈善、、、、、、、、＼、l旨霹寮譬岛蔫与号窀＼、、、、、、、、、doo—o一一一o2S暑：暑蛊三§三呈喜焉、、＼＼、＼、＼、、^；量量誊里璺兰至兰量⋯⋯⋯、，oo一一一H—o2S：=：：篓==翟=篇＼～j兽量誊壁璺至墨至兽、＼茁oo一一__一一。星基竺竺=暑§=：3三：乏旦i器誊苎g窭鼙写霉号罨霉doo一一ooo一一一一自S二兰i三o=凑焉s蠹盈l詈誊誊至喜蓍苎曼萋塑莒茁oo—ooo一一。口星S蔫：暑=三暑墨暑3暑暑耋塞罾堇誊詈兽詈堇蓥喜誊2S二三景=竺昌盏怎2嚣警j量堇詈堇喜堇售堇警誊誊ds6o§曹要毒宝弓岂占占翟善薹兽嚣8蚤直言g；霉霉莓罨咤一t口穹q至三要壁堇磊翟甚晶≈篱葛暑霉导d66一暑呈兰罩星引引引引引引引引引引⋯引引引-}。．罾§#§；o§弓趸口重量≮暑眷ⅡIu；．￡-u。降IIlrllkfIl卜l。kllI卜lflrl}hll{卜ll—矿引引引售E叠llB皇嗣u暑i曼盏gIm《6lJot§qJJL暑目s2-当：§暑≈dsBu。暑目。JJpalIl墨。o々目_f固俺旧悒旧隐㈨¨一恪h==垆K旧旧韵L善S鼋墨亏P拦5蕈∞萋9售胃u黾旱晨懂主昌基—苫射言擘}_占譬隹圯P=善可主杖错遥扑书阜} 堕主兰垒堡苎型型坚望堕竺里墅墅壁壁型熊!塑竺!竺塑苎竺!型型垒生查FigIlre4showstheCIDspectraofallfourchiralcombinationsoftlleproton曲。dtrimers(1)2(Asn)口．The＆bimIvaluesf-orl9naturalchiral锄inoacidswitllthechiralmel锄inederiVatiVesasclliralselectorsaresummarizedinT直ble1．AccordingtomeRSDda土aiIlT{mle1，whichareallnomorethan4．0％，atⅡlc95％confid锄celevel，＆hi训vahJes蹦1witllintheconfidenceintervalof1．00士O．10(i．e．，1．oo士4_30×4．o％／3n5严wouIdmeaIlaIackofchjraIdiscIimination．hlotherwords，＆M脚value1argernlaIl1．1orsmallerulanO．9indicatesasignjficantchiraldiscrimination．Asshownin1曲lel，compounds1and2havememostcxtetlsiVechiralrecognitionabilityamongaUsyllthesizedchiralmelamined甜VatiVes．Dibutyl啪in0and啪inoexistingsimultaIIeouslyinmeirstmctllrea110wtllemtofbHncomplexese髂ilywithaIIlinoacids．Evcnthou曲theirchiralmoietiesbearbeIlzeneringa11dnaphthaleneringrespectively，1and2dispIayedsimilarchir“seIectiV“yhlbomc船es，superiorchiralrcco趴itionwasachievedwhentheaminoacidhadaIlaromaticsidechain(Phe，T印，Tyr)ora11unsaturatedsidechain(心g，Asn，Glu)suggestingtllat尢-7cinteractiOnsmayplayaroleinmesetereospecmcit)，．AsubtlechiralselectivityofHiswasobseⅣedwhen1and2wereernployedastllechiralselectoLThisisprobablybecausethechiralselectivityofHisw嬲measuredbasedontheCDspectraofIheprotonteddimers(1)(His)H十and(2)饵is)H+，wmletllechiralreco髓itionofomeraromaticaminoacidswasmeasllredbasedontlleCIDsprectraofpmtonatedtrimers．MoreagFegationinthecomplexionmightincreasesterichindr舭ceandenh锄cedis硎mination，soprotonatedtrimersusuallyshaw1argerchiraldiscrimirLationst11anprotonateddimers．37Dacaintable1showtllatland2西velowchjralselcctiv时for锕oacidic眦inoacidsAspaIldG1u．Thismayberelatcdtothec砒oxylgmupprescntiIlginbomaminoacids’sidechains．TheadditionalcarboxylgroupinAspandGlu，ascomparedtoo血eraminoacids，would铲eatlyincreasesaIt-fominginteractionf-0rmecomplexesinv01vingmel撇inedcrivatives，butsuchincrcasedinter∞tionmi鲥notbehelp伽tochiraldiscrimination．becausetheefrectofomerinteractions，includinginteractionsonchiralmoicties，mightbereducedcorrespondently．So“wouldbebetterforchiralreco盟itionifthemultipleinteractionsfomedbet、】l，ecnachiralselectorandachir“analytearecornparativelybal孤ced．It’simercstingtonotematfourD-aIldL·aliphatic锄inoacids(Ala，Leu，Ile，Val)149 坠掌焦堡塞№vda稍M曲l·#仉雨幽嚣髓暾qsyI口t由疆d匈薛嚏bbM瞄印曲m曲卅田do盘dAl屿憾w11icharcusuallyhardtoresolVedbyothermettIodswerechjraldiffbremiatedwhenusiIlglOr2够selectoL111eresultswereevenbettermaIlthatoftllose锄inoacidswinlreac￡ive-hydrogen吒onta碱ngsidechajns(S％毗Cys，L)回，showingthat盛Qmeinteractionsinstereostm咖reofme埘merclustersarehardtopredict．TheaIIlino粒ids丽tllla唱ersidec城ns(Lcu，Ile)genemllyshowcdalnnebetterchiraldiscriminationmanthoseprocessingsmallcrsidechains(Ala，Vm)．IllmostcorIdilions，theheterochiralcomplexweremorestablemanmehomoclliraloncwith1or2aschiralselector’exc印tincasesSer，T11rorProwereusedasmeanalvte．ThereasonisnotweUunderstood，whjchalsomeansthatmemechanjsminvoIvedinchifaIreco卿tionisextremelycomplicated．Similartoland2，mel姗ined甜vative3alsopossessesdibutylaIIlin0，aIIlinoalldaromaticchifalmoiety-Butmechiralselectivitydecreascddr啪aticallyformostaminDacidswith3aschiralselectorcomparedto1and2．ApparentlythepresenceDfaIlextraCH2．CH2掣oupinthearomaticchiralmoietyof3，ascomparedto1，irlcreasesttlcnexibilityofthechiralgroup，infbrringrigidchiralmoietyismoref打orabletochiralselecti“ty，whichisconsistentwithmostrcports．Tbinvestigatemer01eplayedbythearomaticchiralmoietiesofthechiralselector，wesynthesizedcompound4whichdifrers疗om1，2alld3inthatitdosenotpossessaromaticgroupinthechiralmoiety．TheregultsshowedmatnodistinctchiralselectiVitywasobseⅣedforallaIllinoacidswith4aschiralseIector，a王though4wasno{apparentlydi船rentt01，2and3inthenumberofgroups肌dthcabilitytofb衄hydrog饥bond，indicatingthat7【讯interactionsplayedanimportantrolein也echiralrecognjtionof趣inoacids。ItalsosuggeststhalclliralmoictiesaretheleadingfktorfDrthe砌raldiscrirnination．Asmermonedabove，chiralmelaI]ninederivatives5and6callonlycombinewith椰inoacidswimaromatic(Phe，T)％1邱，His)orunsaturated(Arg，Asn，G1n，Asp，Glu)si如chain．However"theyexhibitedcnantioselectiv时formostofthese锄inoacids，especiallythe锄inoacidspossessingaromatic孕oup，inf锄ngthat纠【interactionsbet、Ⅳeenmeselectorandtheaminoacidaretheprincipalattractiveinteractions．5and6werethconIymeI锄ined耐v撕yes{hatexhibit司900dchirair。co舒tioHforbothAspa11dG1u．Thisisprobablybecausemeinitialdibutyl锄inosinland2arer印lacedby4，．ten_butvl锄ilinos．Ontheonehand，tllebasicityof4’-ten_butyl啪ilinoismuchweakermanthatofdibutyl纳ino，sincetheN，Hgroupandtheco脚ugatedbenzenenng150 堕主兰垡丝兰型型些旦塑堕婴墅壁型世竺堕墅竺塑壁!璺塑塑堕arelilll(eddirectly，whichdecre髓esmeelectmnd％s时ofme抽nDgcnalomdr锄atically，卸dweal【cnstheabilityoftheni怕genatomtoacc印tprotonconsequentlyhl蠡ct，5a11d6haVemeweakestbasicity锄ongall10melamined谢vativesaccordingt0tlleirstnlctufe．Th豇eforemes打∞gttlofsalt—fb咖inginteractionbetw∞nthem姐d柳oacidic跚inoacidsAspandGluwouldnotbetoos仃ong．0ntl坞otherh趾d，4’·tell-butyl锄ilinomightincre觞e丌-兀interactionsandsterichindfance．Thsitcanbcscenthatmodif撕ngsubstituen招inmelaminedefiva“”sonpurposecouldenhaIlcemeen枷odiscriminationfora11alytes惭mdifrerentStmctIlreaIldpropemes．Bo也co埘Ipounds7and8co玎t8intwochiraJcenters，andtheycanOnJybinding锄inoacidswim卸romaticsi∈【echailloruIlsaturatedsidedhaintoo．Howevermepresenceofthesecondchiralcemerdosenot叩parentlyincreasemeirchiralselectivity，suggeStingmatthemorec11iralcentersintroducedintomechiralselectordoesn’tme锄thebe妓erthechiralselectivity．7and8showedt11es蛐etrcndofchi试discrimination，justlike5and6，provingagainmatchiralmoietybearingbenzeneringornaphthaleneringwouldnotmakemuchdi腩rencetochiralselectivity．Changingtheanlinoin7todibutyl锄ineresultedin9．Altlmughmeb弱icityof9isstrongerthallthatof7，itsabilityforbindingaminoacidsisnotimproved，infbrringthat廿讯2乒oupthatcanbeinVoIvedinhydmgenbondisinlponantintheprocessofcOmbination．Sinlilarto7，melaminederiVatiVe9alsopossessestwoammaticchiralmoieties，butitshowedbetterchiralse】ectiVjtyforthe踟in0acidswimunsaturatedsidech咖(Ar吕Asm，G1u)thanforaromatic锄inoacids口he，1n哪，His)，whichindicatesmatbesides兀．冗interactions，someotherfhctorsalso“fbctonchiralrecog咄ion．maddition，tllehomoch晌lcompl铽esfo】∞edby9粕daminoacidsA坞，As也orGluweremorestablethanmecorrespo戚ngheteroclliralcomplexes，jIlStcontI_arytothecaseusingothcrmelaⅡlined谢VatiVes鹞chiIalselectors，infbrringthat锄inohasasi印ificante脏ctoncombination锄dreco助ition．Formemel哪ined嘶vativeswithoutdibutyl锄in0，suchas5，6，7aIld8，mehornochiralcomplexesfomledwi血ammatic枷noacidsexceptforHisweremorcstabletllantllecorrespondingheterchiralcompleXes，whichweredi腩rentf如mmeathermel咖inederivatives，showingmattlleenalltiodiscriminationfordiffhent锄iIloacidscouldbes仃0nglyinnuenccdbymodi聊nggubstituentsinmelaminede】晤VatiVes．Fromwhathasbeendiscussedabove，wehaveapreliminarylHlderstandingofthefllndamentalmecha壬1ismaswellass。meregularilyunderlyingthechiralrccognition151 世兰垡坠幽型些堂墅坚堕!塑塑型塑竺塑墅些型型坐pmcessfor锄ninoacidswithchiralmel姐linederivatives觞ct血试selectorsintlleg勰ph硒e：1)thechimlselectora11dmeanalytearepulledtogetllcrbyhyd∞genbond，salt-forminginteractionand哥兀imeractioIl，whicharetllemaindri、，ingfbrcesfora黯ociation．n∞，someot王1erintcI∞怕Ils，e即eciallythein衄私dons∞clliralmoieties，such器兀咀stacking，stericinteractio玛etc，willhelpt0achievechimlreco粤曲on．2)Electrostaticimeraction，hydrogenbond，纠tstackingaIld蛳瞒cintcractionbetweenselectorandaIlalytemayplayimportalltrolesintheassociationandenamioselectiverccognitionofaminoacids．Theph铋omenonthatdiff酊emmel锄inederivatiVe8appeart0selectivelycoHlbincaIldreco趴izedi腩renttypesof锄inoacidssuggcstsustodesignselectoraccordingtothestmcturepropertiesoftheanal)rte，姐dinnDducesomegrollps，whichcanpmvideadequateinteractionsfortheassociationwiththcanalyte，int0memel锄inede—vatives．ThenproperchiralgroupsarebmughtintoimproVechiralselcctivity．3)MutipleiIlteractionsfonnedb咖eenchiralselectorsa11daIlalytesshouldbecomparativelybalanced．TbostmngimeractiOnsoutsidemechiralmoietiesmi曲tdecreasethechiralrccognitionability4)IIltmducingmorechiralcentersintothechiralselectordoesn’tmeanthechiralselectivitywillbeimproved．IUgidchiralmoietyishelpfultoimprovechiraldiscrhnination．C11iralmOietybearingbenzeneringornaphthaleneringwouldnotmal(emuchdifrcrcncetochiralselectiVity5)Enantiodi8criminationforanalyteswithdi日bremstmctllreaIldpmpertiescouldbeimpmv。dbymodi聊ngsubstituentsinmel锄inede—VatiVesonpu啦ose．CoNCLUSIoNIIlthisworkwes州hesizedas嘶esofnewchimlmel锄ined舒vativesusingasimplefoutes龇ing丘Dmcy柚uricchl耐de．The西ilityoftllesecompollndstoperfonIlchiralreco印itiontoward19naturalchiralⅡ一狮inoacidsh勰becninvestigatedbyESI-MS—MS．MelaminedcriV砒iveshaveulliquestructureandpropemesthatmaketlI锄easytopossessV撕ousgroupst11atcallproVjdemultipleinteractionsf01’c11i脚reco倒don．MoreoVer’theycaIlproducepolymerclusterswith枷noacidsinESIm鹊sspectrDmetryeasilyrSomey盯everysuitabletobeemployedaschiralselectorsforMSanalysis．nleenanti08electiVitiesobtainedareencollra百ng．Somettlingmeritsspecialattcntionistllatcompoundsland2couldpmvideexcellentchiraldiscriminationsfor17ofme19naturalaminoacids，a11dbymodi劬ngsubstituentsinmelaminederivatives，152 博士学位论文№rdo吲M由mⅨ嘲撕惜嘶对曲醯曩d却Ph妇山M岱却曲硼蜘删c捌^lI由由thechiraldiscriminationforall19龇ninoacidscouldbeachievedandselectivelvcnhallced，whichshowthegreatpotcntialitiesoftIlechiralmeIaIIlined酬VatiVesactmg鹊anewclassofchiralselectorsinMSa11alysis．Thee妇融ctofdi位rcrltnoncOvalemimeractiOnscausedbyvariouschiralor∞hiralmoieti船onfhechir8lrecogniti衄int11eg船Phasehasalsobecnstudied8tmes锄etiIIlet0elucidatesomemechaIlismandrcgul撕tyin．thechimlrecognitionprocess．Theresultshowsthatelectrostaticimeraction，hydrogenbond，兀-兀stacking趾dstcricintcractionbe咐ecnselector趴daIlal”eplayimportantrolesintheassociationandenaIltioselectivereco舭itionof锄inoacidswithmecmralmel锄inederiVatiVesaschiralselectors．SⅧthesesofthec11jralmel锄inederivativesmentionedaboveareallbasedonsomesimplesubstituents，soonlylimitednoncovalcntinteractionswereinV01Vedinreco弘ition．WbarecurrcntlycarryingoutfIlrthcrmodmcationsofthesclectiVebindingsitestoachievemores口ecificinteractionswith锄inoacidsorsomeotherchiralanalytes，hence，toimproVechiralrecognition．ACKNoWLEDGEMENTSThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScieIlceFoundationofChina(No20275045，No．203900508)．SUPPoRTINGINFoRMATIoNAⅥULABLEDeta订edsymheticpmcedures．REFERENCES[1】sawada，M．胁ss印8c帕m．R8v1997，16，73—90【2】Hua，s．；chen，Y；JiaIlg，L；Xue，s．D罾棚鲫印叱f，w卅19蹦，21，7·10【3】chen，Yz．；Li，H．；YaIlg，H．J．；Hua，s．M．；“，H．Q．；zhao，F．z．；chen，N．Y．D罾^如船劬∞加m．1988，23，821-824f4]Tab。t’J．C．琵妇^幽％．1螺7，43，3413—3420【5]Y柚g，H．’Chen，Y．0氇．肘如s印ec肋m．1992，27，736-740【6]chen，Y；wu，Yc协fn∞e』4珂以c饥!m．1998，26，737—741【7】sawada，M．；okumura，Y；sKzIIma，M．；T酞ai，Y；Hidaka，Y．；Y叫lada’H；T觚aka，T；K蚰eda，工；Hirose，K．；Misumi，S．；T蛐aslli，S．■』m．Ch绷．＆)c．1993，115，738l一7388【8】Sawada，M．"shizuma，M．；Takai，Y；Yarllada，H．；K眦da，T；Ham如sa，t，一卅．c^啪，肋o 垫主堂壁堡窭建竺堕堕塑塑苎里堕R承重№￡晦母难z蠹可d肆嘣曲她№塔印鼬∞曲y抽耐Q-霜舳由盎1992，114，4405-4406[9】V6key’瓦；czira’G一甩以c^洲．1997，69，1700—1705【10】sIIlitIl，G；ka取J，A．zA珊．凸绷．肋c．1996。118，3293-3294【11】sawada，M．；1‰i，Y．；Y黜da’H．；Nishida，J．；K孤eda，t；A髓k科忸，R．；Okamoto，M．；Hirose，瓦；№，t；Na锄llra，k』c^绷．＆‰忍胁胁肿．1鲫8，2，70l一7lO【12】sawada，M．；Y呦aoka，H．；Takai，Y；Kawai，YI；Y跚ada，H．；A姗a，T-；Fujioka，T．；Tanaka，T如￡Z^如鼯肇∞抛％1999，193，123一130[13】sIlizIlma，M．；hn锄u糟，H．；nLI【ai，Y_；ⅥIlllada，H．；Takeda，T；Takall船IIi，S．；sawada，M．如tJ：朋a站勋即打．0m．2001．210／211，585-590[14]Chu，I．H．；Dearden，D．V；Bradshaw"J．S．；Huszthy，P；I髓tt，R，M．JA珊．西Pm．肋c．19”，115．4318-4320【15】Dearden，D．V；Dejsupa，c．；Liang，Y．J．；Bmdshaw，J．s．；Izan，R．M．z一m．(孺删．sbc，1997，119．353-359【16】Ramirez，J．；He，F；Lebrilla，C．B．，一埘．c％例．&”．1998，120，7387-7388[17】Grigorcan，G；Rattlirez，J．；Atul，S．H；Lebrilla，c，B．彳"以鳓啪．20∞，72，4275-4281[18]Ramirez，J．；Ahn，s．；Grigorean，G；Lebrilla，c．B．』4Ⅲ．c协硎．sbc．2000，122，6884—6890f19】Gdgofe越，G；Lebrilla，C．B．爿ng￡c而删．2001，73，1684．169l【20]cheng，Y．；Hercules，D．M．z^妇盯．印卵f，om．200l，36，834-836[21]Tao，wA．；c00ks，R．G“H以c^硎．2003，75，25A一3lA【22】Tao，WA；zhan＆D．；wallg，F；nlonlas，只D．；C00ks，R．G爿n以西咖．1999，71，“27硝29【23】Tao，w-A．；Zhan吕D．；Nikolaev，E．N．；cooks，R．GI，．爿卅．c^硎．跏．2000，122，10598．10609[24]1ho，w．A．；Gozzo，Fc．；cooks，R．G爿nd正l：^e小，2001，73，1692—1698[25】wu，L；Tao，wA．；c00ks，R．G—H以丑f。矾以c丹绷，2002，373，618—627【26】zhang，D．；1幻，wA_．cooks，R．G如t』批s印8c加棚．2001，204，159·169【2刀Tao，wTA．；wu，L；Cooks，R．Gz拖dJ∞硎。200l，“，354113544[28】ch吼，J．；zhu，c．J．；Chen，Y．；zha0，Y．F矗印耐cb，，lm删．^童缸s印钟打姗．2002，16，125l·1253【29]wu，L；Lernr，K．；Agg抽01m，T，；c00ks，R．G．■一埘．觑．肘a鼬印即加m，20∞，14，152-160【30】Angllsd，D．V；car蛇za，R；AugIlsn，R．；Tao，WA．；c00ks，R．G一"以函绷．2002，74，3458—3462[31Jwu，L；Meuref，E．c．；cool(s，RG一，l以c舟删2004，76，663·67l【32】Paladini，A．；calcagni，c．；Pal啦T．D．；speranzaM．；Lagana，A．；Fago，A．；Filippi，A．；sattaM．；Gu】d嘶，A．GC是；阳肋^200l，13，707-711[331Hofhleister，G；LeamJ．A．D侈^如sJ印卯fro卅1991，26，8n墙12【34]Fago，G；Filippi，A．；GiafdiIli’A．；Lagall矗，A．；Paladini，A．；speraIlzaM．一，伊Ⅵc^伽．如t蹦2001，40，4051．4054【35】Desaire，H．；Lea阱J．A．4n以西硎．1999，71，1997·2002154 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博士学位论文攻读博士学位期间发表论文情况1．Q也b亟ShllzhellzhaIlg，Bidongwu，Ji6mGuo，Ji锄weiXie，MingsongGu，YiminZhao，LiuhongⅥm，Keli姐gLiu．NovelChiralMel锄ineDerivatives：Desi盟，S蛐esisandApplicationt0M髂sSpectromet妒basedChiralAnalysis．爿刀以cAem．，谊鞠￥i|函睢∞∞p“2．刘勤，张淑珍，吴弼东，申睿，恽榴红，谢剑炜．电喷雾质谱在研究超分子体系中非共价相互中的应用．厉学学掘2005，26(1)：51—583．Q亘坠Li坚，xuyingHu，Jianweixie．Dcte肌inationofnerveagefltde铲adationproductsinenviromentalsamplesbyLiquidClⅡDmatogr印hy-TimeofF1ightMassSpectmmetrywithElcctr0SprayIonization．4nd，．ae埘．A咖，2004，512：93—1014．整缱鲤，胡绪英，谢剑炜．液相色谱一电喷雾飞行时间质谱检测泥土中神经性毒剂降解产物．分析纪学2004，32(10)：1309．13135．型墅，胡绪英，谢剑炜．液相色谱一电喷雾质谱检测甲基膦酸酯类化合物．分析冽声弹勺疑2003，22(5)：62，636．塞4塾，谢剑炜．单唾液酸四己糖神经节苷脂钠杂质检查及含量测定方法的研究．药物分析魏毒2004，25(2)：153-1567．地I，谢剑炜．单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液含量测定方法的研究．手厨新窖绦蔫2003，12(12)：1024—10268．塞4墅，唐海秋’魏君，谢剑炜．牙齿洁白产品体外灌流过氧化氢缓释量及其动态变化测定方法的研究．光学荬复埴2004，2l(1)：58·639．垄型妻基唐海秋，魏君，谢剑炜．牙齿洁白产品的过氧化氢体外释放量的测定及其动力学模型的研究．乒国薪医峁荣罐基2003，2(8)：9—11lO．GuohuaDu，Q鱼邑i辇，Ji8nweixie，“uhongYu珥Bohuazhong，KeliangLiu，Nonaqueouscapillaryelectrophoresischirals印arationofanticholinergicdmgswimHDMS—p—CD，C^，D州口fog唧^缸，2005，6I(9／io)，527—53l1lBidongwu，QinqinwaIl昏Q鱼L亘!三’Jianweixie，LillllongYun，Capillary 博士学位论文攻读博士学位期间旋表论文情况elec廿0phoresisdirectenontioseparationofaromatic锄inoacidsb硒edonmIxodchelate—inclusioncomplcxationof啪inoe血yl锄in0一B—cyclodextrin，目ecf唧而D，豁缸，2005，26(1)，1013—101712．顾明松，≥山匦胡绪英，刘荫棠，谢剑炜．高分辨飞行时间质谱测定毒饵中的氟乙酸．分新别菌钧铝2002，2l(5)：40-4113．廖沙，赳麴，仲伯华，谢剑炜．应用离子对一反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中阿德福韦酯水解产物．事葶医学群学院儋害彤2005，29(2)：148一15l14．顾明松，胡绪英，塑墅，刘荫棠，谢剑炜流动注射一高分辨飞行时间质谱检测毒饵大米中的氟乙酰胺．厉者学掘2002，23(4)：214．21915．张淑珍，吴弼东，室i麴，郭继芬，谢剑炜．质谱技术在手性识别和分祈中的应用研究进展．分钎纪毙2005，33(1)：123．12816．顾明松，胡绪英，窒Ⅱ勤，刘荫棠，谢剑炜．流动注射一电喷雾电离一飞行时间质谱法测定氟乙酰胺精确质量及其在毒饵大米中的应用．历学笋撼2005，26(1)：32．3517．陶胜源，冯建林，张淑珍，趔塾，顾明松，谢剑炜．芥子气一DNA加合物羟乙基硫代乙基鸟嘌呤标准品的制备．仿化学怒2004(4)：26—2818．闫存玉，赵毅民，乔善义，煎匦，谢剑炜，张永样．莫诺甙环口差向异构体的HPLc和EsI—TOF．Ms分析．蔚等学发化学号}援2003，24(10)：1784—1786 博士学位论文致谢致谢本论文是在导师恽榴红研究员和谢剑炜研究员的亲切关怀和悉J乜指导下完成的．论文中凝聚着导师的心血与智慧。时光荏苒．岁月如梭．三年的求学生涯转瞬即逝，但导师渊博的知识、严谨求实的治学态度和精益求精的科研作风将使我受益终生．这三年的学习和科研经历将成为我一生中最重要的财富之一。在此谨对导师几年来的培育和关怀致以衷J≮的感谢和崇高的敬意助。感谢张淑珍博士在课题开展及论文撰写方面给予的有益建议和帮感谢顾明松副研究员在实验工作中给予的雪旨点和帮助。感谢九室赵毅民主任以及郭继芬博士、张爱军、徐斌等同志为我提供便利的实验条件．没有他咿1的的大力支持和切实帮助本论文无法J峨利完成。感谢七室汤立合副主任、陶林同志、郄建坤博士以及梁远军博士在合成方面给予我的帮助弄口指导。感谢七室胡远东博士在计算机分子模拟方面提供的帮助。感谢／＼室全体同志．在这三年的工作、学习和生活中给予我的诚挚关心，和热1青帮助．他哪!为论文的完成提供了有力的技术和后勤保障。最后。特别感谢我的家人多年来对找的理解和包容。我所取得的每一点成绩和进步都离不开他们的支持和帮助。58列勤2005年5月