蜜环菌发酵产物对偏头痛模型大鼠神经生化代谢紊乱的作用研究 50页

FementationProducts仔om彳厂聊i，肠厂勋A妃刀g口EffecttheMigrabolicRatsonMetabolicdisordersofPhysiologicalandbiochemicalADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniVersityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByZhQohcIik(1ngSuperVisor：Prof．ZhuxianfengJune，2014 关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位中请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，_}仑文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并袁示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，丈责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：赵堑良20l牛年5月／牛日关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者．本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家围书馆，科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供：笋位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的。可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复靠II手段保存、汇编学位论文(纸顾文本和电于文本)。(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书)L．．二学侄荻得者(学位论文作者)签名：嫠i堑舅釜——2014年箩月／毕日学位论文指导教师签名：拇一20j牛年5月／岁日啪6舢2mml删3啪4枷5帅2删Y 摘要本研究运用偏头痛模型大鼠实验分析了蜜环菌发酵产物的药理毒理作用，通过观测NTG型偏头痛模型大鼠血液和脑干中D—EP、CGI冲、NO、NOS的变化，研究蜜环菌发酵产物对实验大鼠神经生化代谢紊乱的影响，探讨蜜环菌发酵产物对偏头痛神经生化代谢紊乱的作用机制及其毒理作用。方法：以硝酸甘油型偏头痛大鼠模型为研究对象，以大鼠脑干和颈静脉血为观测指标，分别观测其中的卜EP、CGRP、NO、NOS含量，通过毒理实验，给大鼠灌胃蜜环菌发酵产物相当于临床200倍的药量，观测其反映。主要研究结果如下：①通过实验模型大鼠血浆中NO、NOS的测定，结果表明模型组血浆中NO、NOs含量升高，而且与生理盐水组比较有明显差异(P<0．011；蜜环菌中浓度组、高浓度组、西药组血浆中N0、NOS含量降低，而且与模型组比较有显著差异(P<0．01)，与生理盐水组比较已经没有差异。表明蜜环茵发酵产物能够明显抑制由于硝酸甘油(NTG)引起的血浆中N0、NOS的异常升高。②通过实验模型大鼠血浆和脑干中p—EP的测定，结果表明模型组血浆和脑干中p．EP含量降低；蜜环菌中浓度和高浓度组血浆和脑干中p．EP含量升高，与模型组比较具有显著性差异(P<0．01，P<0．05)，与生理盐水组比较已经没有差异；西药组血浆中p．EP含量升高，与模型组比较具有显著性差异(P<0．01)，与生理盐水组比较已经没有差异。表明蜜环菌发酵产物能够明显抑制由于硝酸甘油引起的血液和脑干中B—EP的异常降低。③通过实验模型大鼠脑干中NO、NOS的测定，结果表明模型组脑干中NO、NOS含量升高，而且与生理盐水组比较具有显著性差异(P<0．01)：蜜环菌中浓度组、高浓度组和西药组与模型组比较均具有显著性差异(P<0．01)，与生理盐水组比较已经没有差异。表明蜜环菌发酵产物能够明显抑制由于硝酸甘油(NTG)引起的脑干中NO、NOS的异常升高。④通过实验模型大鼠血浆和脑干中CGI冲的测定，结果表明模型组血浆和脑干中CGI冲含量升高，而且与生理盐水组比较有显著性差异(P<0．01)：蜜环菌中浓度组、高浓度组和西药组血浆和脑干中CGI冲含量降低，与模型组比较具有显著性差异(P0．05)，表明蜜环菌发酵提取物可以抑制由硝酸甘油诱发的血液和脑干中N0含量异常升高，使之维持生理代谢平衡状态。由于一氧化氮合酶(NOS)与一氧化氮(N0)在人体内有着密不可分的关系，内源性N0的合成中NOS的参与是必不可少的．所以研究N0必须研究NOS，研究表明【40‘42】：NOS抑制剂可以明显减轻偏头痛的发作。痛觉状态的形成和维持与NOS有着十分重要 蜜环菌发酵产物对偏头痛模型大鼠神经生化代谢紊乱的作用研究的关系。模型组血液和脑干中NOS含量异常升高，与生理盐水组比较具有显著差异(PO．05)，表明蜜环菌发酵提取物可以抑制由硝酸甘油诱发的血液和脑干中NOS含量异常升高，使之维持生理代谢平衡状态。总体的结果表明：蜜环菌发酵产物能够明显抑制由于硝酸甘油(NTG)引起的血液和脑干中NO、NOS的异常升高。24 4．蜜环菌发酵产物对偏头痛模型大鼠血液和脑干中CGRP和B．EP的作用研究4．蜜环菌发酵物对偏头痛模型大鼠血液和脑干中CGRP和B．EP的作用研究内源性阿片肽系统(endogenousopioidpeptides；EOP)具有强大的镇痛作用，是人体至关重要的镇痛物质。偏头痛与内源性阿片肽(EOP)系统的功能障碍密切相关，特别是B．内啡肽(D．EP)紊乱，会导致痛觉传入调节障碍。CGI冲对全身血管都具有扩张作用而且在心脑血管中的作用更加明显。内啡肽物质在痛觉感应、应变和心脑血管功能方面起着至关重要的作用，偏头痛患者因为自发性或者外部刺激性内啡肽系统紊乱，垂体的前叶对人体的应激性失活，致使B．内啡肽(D．EP)释放减少，不能保持神经生化系统的稳定，神经生化系统的适应调节能力降低，对外界刺激过于敏感，致使头痛发作。有学者研究表明：偏头痛的发病与三叉神经血管系统中的CGRP的含量有密切的关系。现在已经发现包括有先兆和无先兆偏头痛在内的所有血管性头痛患者颈静脉血中的cGRP含量均比正常偏高，而且外源性CGI冲可以诱发患者偏头痛发作。本实验室通过观测硝酸甘油(NTG)偏头痛模型大鼠血液和脑干中B内啡肽(B．EP)、降钙素基因相关肽(CGI冲)的变化，研究蜜环菌发酵产物对实验大鼠神经生化代谢紊乱的影响，为新药研发提供实验依据。4．1实验材料4．1．1实验动物健康SD大鼠，雌雄各半，72只，体重220—2809购自河南省实验动物研究中心(许可证编号：SCXK(豫)2010．0002)。4．1．2实验药物和试剂①CGI冲酶免分析试剂盒(华英生物技术研究所生产，批号：20120601)②B—EP酶免分析试剂盒(华英生物技术研究所生产，批号：20120610)③生理盐水注射液(河南华利制药股份有限公司，批号：11042112)④琥珀酸舒马普坦片(华津制药有限公司，批号：0D6909T)⑤蜜环菌发酵提取物高、中、低三个浓度。(相当于生药：75．69mg／ml、37．84mg／ml、2S 蜜环菌发酵产物对偏头痛模型大鼠神经生化代谢紊乱的作用研究18．92mg／m1)⑥硝酸甘油注射液，5mg／ml(益民药业有限公司生产，批号：20100822)⑦冰醋酸(配成0．4％浓度)(天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20110317)⑧双缩脲蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：20110620)4．1．3实验器材大鼠灌胃针、玻璃匀浆器、大鼠注射器、CP2B电子天平、手术器械(手术刀，手术剪等)、一次性负压采血器、低温冰箱(BCD．209QN／X1)、紫外可见光分光光度计(725N)、电子恒温水浴锅(DZKW一)、电热恒温培养箱(DHP-_9272)、台式离心机(TDL_50B)、高速台式冷冻离心机(TGL_16M)4．2实验方法4．2．1分组与给药方法把72只SD大鼠按照随机性原则平均分为6组，每组12只(雌雄各半)，分别为生理盐水组、模型组、西药组、蜜环菌高浓度组、蜜环菌中浓度组、蜜环菌低浓度组。西药治疗组灌胃给琥珀酸舒马普坦片水溶液(0．6mg／m1)；中药治疗组灌胃给蜜环菌发酵提取物水溶液低(18．92mg／m1)中(37．84mg／m1)高(75．69mg／m1)；生理盐水组、模型组灌胃等量的生理盐水，连续给药三天。4．2．2建立硝酸甘油(NTG)型动物模型连续给实验鼠灌胃三天，第三天给药后30分钟后建立硝酸甘油偏头痛动物模型，分别皮下注射硝酸甘油注射液lOmg／l(g，以造模30分钟后大鼠出现双耳发红，前肢多次搔头，爬笼次数多等不安症状为复制模型成功标准。生理盐水组皮下注射生理盐水10mg／l(g。4．2．3取材于样本处理造模成功4小时以后采集标本。将大鼠用20％的乌来糖(氨甲酸乙酯)腹腔注射进行全身麻醉，然后仰卧固定，常规皮肤消毒。利用一次性负压采血器采集颈静脉血6ml，放入冰盒中，每毫升静脉血加入20¨l抑肽酶，混匀后迅速(4。C)低温离心10min(5000r／min)，分离血浆，放到零下20。C保存待测。用于血中的CGI冲和B—EP26 4．蜜环菌发酵产物对偏头痛模型大鼠血液和脑干中CGI心和0．EP的作用研究的测定。取静脉血以后迅速在冰盘上断头，取脑。剥离脑壳、大脑小脑，取出脑干。放置于煮沸的生理盐水中10min，灭活酶，保持神经肽稳定。迅速放置冰盘冷却后，加入HAClml，4。C低温离心10min(5000r／min)，离心后取上清液于零下20。C保存，用于CGI冲、p·EP的测定。4．2．4数据测定CGI冲的测定：运用ELISA试验。严格按照试剂盒的指示说明步骤，计算样品的浓度．D．EP的测定：采用ELISA实验，严格按照试剂盒的指示说明步骤操作。计算样品浓度。蛋白质含量的测定：步骤如下：表4．1表4．1蛋白含量测定操作表空白管标准管测定管三蒸水(mL)0．05标准剂(mL)0．05血浆或脑干匀浆样品(mL)0．05双缩脲(mL)2．5完全摇匀，37℃水浴10min，待自然温度，540啪波长，光径1cm，三蒸水调零，测各个管的OD值注：蛋白浓度测定管吸光度．空白管吸光度标准管吸光度．空白管吸光度×蛋白标准浓度27 4．3实验结果检测结果用平均数±标准差(x±S)表示，运用0刚GIN软件进行数据分析，主要采用T检验、方差分析．表4．2蜜环菌发酵提取物对大鼠血液和脑干中CGRP含量影响的组问比较(x士s，n=12)生理盐水等量64．39士21．42—405．32士132．86一模型组低浓度组中浓度组高浓度组西药组等量189．2m∥ml378．4mg，ml756．9mg／l(g6mg／l(g119．17士35．59▲▲93．18士25．62▲▲51．64士13．18△△62．09士19．4l△△54．65土l1．47△△795．32士158．44▲▲573．67士97．31▲▲△△374．29土124．38△△447．75士154．74△△390．24士141．81△△△与模型组比较P