杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析 75页

分类号：密级：HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTER’SDEGREEDISSERTATION杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析CLONINGANDFUNCTIONALANALYSISOFTHEPROMOTEROFTHEHEAT-RESISTANTGENERoDREB2CINRHODODENDRONOBTUSUM‘YANZHIMI’研究生:杨婧瑜CANDIDATE：YANGJINGYU学号:2016305120065STUDENTNO.：专业:林业MAJOR：FORESTRY导师:王彩云教授SUPERVISOR：PROFESSORWANGCAIYUN周媛高级工程师SENIORENGINEERZHOUYUAN中国武汉WUHAN，CHINA二○一八年六月JUNE，2018 华中农业大学硕士学位论文杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析CloningandFunctionalAnalysisofthePromoteroftheHeat-resistantGeneRoDREB2CinRhododendronobtusum"Yanzhimi"研究生:杨婧瑜学号:2016305120065指导教师:王彩云教授周媛高级工程师学位类型:林业硕士领域：园林植物栽培与生理华中农业大学园艺林学学院中国·武汉HorticultureandForestryInstituteHuazhongAgruiculturalUniversityWuhan,China 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析目录摘要...................................................................................................................................iABSTRACT........................................................................................................................iii缩略词表..............................................................................................................................v1.前言..................................................................................................................................11.1.植物高温胁迫研究进展.......................................................................................21.1.1.植物响应高温胁迫的形态和生理变化....................................................21.1.2.植物响应高温胁迫的分子机制................................................................31.2.杜鹃耐热研究概况...............................................................................................41.3.DREB类转录因子在逆境调控中的关键作用....................................................61.3.1.DREB类转录因子的结构特点.................................................................61.3.2.DREB转录因子基因在植物抗逆调控中的作用.....................................61.4.Hsfs及其上下游调控基因在耐热调控中的关键作用.......................................81.4.1.植物Hsfs的结构和分类...........................................................................81.4.2.Hsfs及其上下游调控基因响应高温的调控机制....................................81.5.启动子研究进展...................................................................................................91.5.1.启动子的基本结构....................................................................................91.5.2.启动子的基本类型..................................................................................101.5.3.启动子的克隆方法..................................................................................111.5.4.启动子的研究方法..................................................................................121.6.研究的目的及意义.............................................................................................131.7.技术路线.............................................................................................................142.材料与方法....................................................................................................................152.1.实验材料.............................................................................................................152.1.1.植物材料..................................................................................................152.1.2.农杆菌菌株及质粒..................................................................................152.1.3.主要药品和试剂......................................................................................152.1.4.主要溶液及培养基配置..........................................................................162.1.5.主要实验仪器及设备..............................................................................18I 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.1.6.植物生物信息学分析软件及数据库......................................................182.2.实验方法.............................................................................................................192.2.1.启动子序列的获得..................................................................................192.2.2.RoDREB2C基因启动子的克隆..............................................................222.2.3.启动子序列分析......................................................................................232.2.4.5’缺失启动子表达载体构建...................................................................232.2.5.拟南芥的转化..........................................................................................262.2.6.转基因拟南芥的GUS染色分析............................................................292.2.7.转基因拟南芥的GUS酶活性分析........................................................293.结果与分析....................................................................................................................303.1.响应高温胁迫的转录因子筛选.........................................................................303.2.RoDREB2C基因启动子序列的获得.................................................................313.3.RoDREB2C基因启动子克隆.............................................................................323.4.启动子序列分析.................................................................................................333.5.5’缺失启动子表达载体构建..............................................................................353.5.1.5’缺失启动子片段克隆...........................................................................353.5.2.5’缺失启动子表达载体构建...................................................................353.6.农杆菌介导的proRoDREB2C::GUS表达载体转化拟南芥............................363.7.转proRoDREB2C::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS染色分析..................373.8.转proRoDREB2C::GUS拟南芥的组织特异性分析........................................393.9.转proRoDREB2C::GUS拟南芥响应激素诱导的GUS染色分析..................403.9.1.ABA处理.................................................................................................403.9.2.PEG处理..................................................................................................413.9.3.GA3、SA、MeJA处理...........................................................................413.10.5’缺失启动子表达载体融合GUS的转基因拟南芥GUS分析....................423.10.1.转proRoDREB2C1/2/3/4/5/6::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS染色分析............................................................................................................423.10.2.转proRoDREB2C1/2/5/6::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS酶活性分析................................................................................................................454.总结与讨论....................................................................................................................45II 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析4.1.TAIL-PCR技术克隆侧翼未知序列..................................................................464.2.RoDREB2C基因启动子高效响应高温诱导.....................................................474.3.RoDREB2C基因启动子响应激素诱导.............................................................474.4.RoDREB2C基因5’缺失启动子响应高温诱导.................................................484.5.启动子在植物基因工程中的应用.....................................................................485.展望................................................................................................................................49参考文献............................................................................................................................51致谢................................................................................................................................63III 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析摘要杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(RhododendronL.)植物的统称。受其遗传因素的制约，高温胁迫是限制杜鹃花在园林中广泛应用的主要影响因素。提高杜鹃花的耐热性是使其在园林应用可以顺利越夏，保持景观持续的重要保证。因此，从耐热杜鹃种质资源中挖掘耐热基因，继而通过基因工程或分子辅助育种等技术对现有杜鹃花园艺品种进行遗传改良，是杜鹃花产业中有待解决的关键问题。而热激转录因子在植物逆境响应中起着非常重要的作用，其中HsfA类热激转录因子中的HsfA3的表达同时受高温和干旱诱导，且主要依赖于DREB2A/C转录因子。由此可见DREB类基因可正向调控植物的耐热性。本研究根据杜鹃耐热品种‘胭脂蜜’的转录组测序结果，筛选高效响应热胁迫且上调表达稳定的一个DREB类转录因子，命名为RoDREB2C。启动子在转录过程中通过与转录因子的结合来调控基因的表达。通过染色体步移法我们获得约2000bp的启动子序列，并克隆到1743bp的启动子片段。根据顺式作用元件预测结果对启动子进行5’端不断缺失，构建一系列5’端缺失启动子表达载体：proRoDREB2C1::GUS(1542bp)、proRoDREB2C2::GUS(1212bp)、proRoDREB2C3::GUS(1158bp)、proRoDREB2C4::GUS(747bp)、proRoDREB2C5::GUS(353bp)、proRoDREB2C6::GUS(136bp)。对其GUS活性进行功能分析，研究结果如下：1.转基因拟南芥通过GUS染色呈浅蓝色，表明该启动子在拟南芥中拥有GUS活性。在经过高温处理后，其GUS蓝色变深，表明其高效响应高温胁迫，是高温诱导型启动子。2.转基因拟南芥的叶片、茎、花序、根和荚果等组织部位均有GUS染蓝现象，说明该启动子是非组织特异型。3.ABA、PEG、SA、MeJA和GA3等激素均可诱导启动子表达。ABA激素处理时间越长，GUS蓝色越深；PEG激素处理下GUS蓝色随时间推移呈先变深后变浅的趋势，在24h达到最深；SA、MeJA和GA3等激素的处理时间增长，GUS蓝色变化程度不明显。4.5’端缺失启动子响应高温诱导，不同长度的5’端缺失启动子GUS蓝色的深浅有些许差异：proRoDREB2C1::GUS随着高温处理时间的增长而蓝色变深；proRoDREB2C2::GUS在4h时蓝色变深，8h时蓝色变浅；proRoDREB2C3::GUS随i 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文着处理时间的增长而蓝色变深；proRoDREB2C4::GUS在4h时GUS蓝色变深，8h时蓝色变浅；proRoDREB2C5::GUS随着时间增长而蓝色变深，但未经高温处理的转基因拟南芥GUS蓝色较深，说明该启动子在未处理时即拥有较强的启动子活性；proRoDREB2C6::GUS在4h时GUS蓝色最深，8h时变浅。5.进一步GUS酶活性检测表明，不同长度启动子均在高温胁迫下有诱导表达的趋势，但不同长度的启动子片段其诱导表达趋势不一样：proRoDREB2C1::GUS在0h时GUS酶活性极低，高温处理后GUS活性迅速升高，并随着时间的推移GUS活性持续升高；proRoDREB2C2::GUS在4h时GUS酶活性升高，但在8h时其酶活性下降；proRoDREB2C5::GUS在零点时即有较强的GUS酶活性，高温处理4h后GUS活性降低，8h时活性升高；proRoDREB2C6::GUS在4h时GUS酶活性达到最高值，在8h时GUS酶活性下降。因此，该启动子在高温诱导及多种激素诱导下启动下游基因的表达，由于其高温诱导表达特性受到多个作用元件同时调控，不同长度5’缺失启动子受高温诱导的表达特性有较大的差异，其关键调控元件还有待后续实验分析及验证。关键词：杜鹃花；耐热性；高温胁迫；DREB转录因子；启动子ii 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析ABSTRACTRhododendronisageneraltermforplantsofthegenusRhododendronL.inthefamilyEricaceae.Duetotherestrictionofgeneticfactors,hightemperaturestressisthemaininfluencingfactorthatrestrictsthewidespreadapplicationofRhododendroningardens.Raisingtheheatresistanceofrhododendronsisanimportantguaranteeforthesmoothapplicationofthelandscapeingardenapplications.Therefore,diggingheat-resistantgenesfromtheheat-resistantRhododendrongermplasmresourcesandthengeneticallyimprovingtheexistingRhododendronhorticulturalvarietiesthroughgeneticengineeringormolecularlyassistedbreedingareproblemstobesolvedintheRhododendronindustry.Theheatshocktranscriptionfactorplaysanimportantroleinplantstressresponse.TheexpressionofHsfA3inHsfAheatshocktranscriptionfactorisinducedbyhightemperatureanddroughtatthesametime,andmainlydependsonDREB2A/Ctranscriptionfactor.ThisresultshowsthatDREBgenescanpositivelyregulatetheheatresistanceofplants.Inthisstudy,accordingtothetranscriptomesequencingresultsoftheheat-resistantRhododendron‘YanZhimi’,aDREBtranscriptionfactorthatefficientlyrespondedtoheatstressandup-regulatedexpressionwasidentifiedasRoDREB2C.Thepromoterregulatesgeneexpressionduringtranscriptionbybindingtotranscriptionfactors.Weobtainedapromotersequenceofabout2000bpbychromosomewalkingandclonedintoa1743bppromoterfragment.Accordingtothepredictionresultofcis-actingelement,thepromoteriscontinuouslydeletedat5"end,andaseriesof5"-enddeletionpromoterexpressionvectorsareconstructed:proRoDREB2C1::GUS(1542bp)/proRoDREB2C2::GUS(1212bp)/proRoDREB2C3::GUS(1158bp)/proRoDREB2C4::GUS(747bp)/proRoDREB2C5::GUS(353bp)/proRoDREB2C6::GUS(136bp).ForthefunctionalanalysisofitsGUSactivity,Theresultsofthestudyareasfollows:1.ThetransgenicArabidopsiswaslightbluebyGUSstaining,indicatingthatthepromoterpossessesGUSactivityinArabidopsis.Afterhightemperaturetreatment,theGUSbluecolorbecamedeeper,indicatingthatitrespondedtohightemperaturestressefficientlyandwasahightemperatureinduciblepromoter.2.GUSstainingwasfoundinleaves,stems,inflorescences,roots,podsandothertissuepartsoftransgenicArabidopsis,indicatingthatthepromoterisnon-tissuespecific.3.ABA,PEG,SA,MeJAandGA3hormonescaninducepromoterexpression.ThelongertheABAhormonetreatmenttime,thedarkertheGUSstainingcolorlevel.Underiii 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文thePEGhormonetreatment,theGUSstainingcolorlevelfirstbecamedarkerandthenbecameshallowerwithtime,reachingthedeepestat24h;thetreatmenttimeofhormonessuchasSA,MeJA,andGA3increased.ThedegreeofbluechangeinGUSisnotobvious.4.Thedeletionofthepromoteratthe5′endrespondedtohightemperatureinduction.ThedepthoftheGUSblueatthe5′endofthedeletionpromoterwasslightlydifferent:proRoDREB2C1::GUSbecameblueasthehightemperaturetreatmenttimeincreased;proRoDREB2C2::GUSdarkensblueat4handblueslightat8h;proRoDREB2C3::GUSdarkensblueasprocessingtimeincreases;andproRoDREB2C4::GUSdarkensblueat4h,at8h,thebluelightens;proRoDREB2C5::GUSgrowsdarkerastimegoesby,buttheGUSStainingthathasnotbeentreatedwithhightemperaturehasadarkerbluecolor,indicatingthatthepromoterhasbeenleftuntreated.Strongpromoteractivity;proRoDREB2C6::GUShadthedeepestGUSblueat4handlighterat8h.5.FurtherGUSenzymeactivityassayshowedthatdifferentlengthsofthepromotersallhadthetendencytoinduceexpressionathightemperaturestress,butdifferentlengthsofpromoterfragmentshaddifferentinductionexpressiontrends:proRoDREB2C1::GUSat0h,theGUSenzymeactivitywasextremelylow,GUSactivityincreasedrapidlyafterhightemperaturetreatment,andGUSactivitycontinuedtoincreasewithtime;proRoDREB2C2::GUSincreasedGUSenzymeactivityat4hours,butitsenzymeactivitydecreasedat8hours.proRoDREB2C5::GUShadstrongGUSenzymeactivityatzeropoint,GUSactivitydecreasedafterhightemperaturetreatmentfor4h,andactivityincreasedat8h;GUSenzymeactivityreachedthehighestat4hatproRoDREB2C6::GUS;ThevalueofGUSenzymeactivitydecreasedat8h.Therefore,thepromoterinitiatestheexpressionofdownstreamgenesunderinductionofhightemperatureandinductionofvarioushormones,anditshightemperature-inducedexpressioncharacteristicsaresimultaneouslyregulatedbyapluralityofactingelements.Theexpressioncharacteristicsof5′deletionpromotersofdifferentlengthsinducedbyhightemperaturearelarger.Thedifference,thekeyregulatoryelementshaveyettobeanalyzedandverifiedbysubsequentexperiments.Keywords：Rhododendron;Heattolerance;Hightemperaturestress;DREBtranscriptionfactor;Promoteriv 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析缩略词表缩略符号英文全称中文名称AbbreviationEnglishNameChineseName4-MU4-methylumbelliferone4-甲基伞形酮4-MUG4-methylumbelliferyl-p-glucuronide4-甲基伞形-β-葡糖普酸ABAAbscisicacid脱落酸BSABovineserumalbumin牛血清蛋白CTABCetyltriethylammoniumbromide十六烷基三乙基溟化铰ddH2ODistilledantdeionizedwater重蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dehydrationresponsiveelementDREBDREB转录因子bindingproteinEDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸GAGibberellin赤霉素GUSβ-glucuronidaseΒ-葡糖醛酸糖普酶HSEHeatshockelement热激元件HSFHeatshock(transcription)factor热激(转录)因子HSPHeatshockprotein热激蛋白KanKanamycin卡那霉素LBLuria-bertanimediumLB培养基MeJAMethylJasmonate茉莉酸甲酯MSMurashigeandSkoogmediaMS培养基PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RifRifampicin利福平rpmRevolutionsperminute转/分钟SAsalicylicacid水杨酸TrisTris(hydroaymethyl)aminomethane三经甲基氨基甲烷5-chloro-4-bromo-3-indolyl-X-Gluc5-氯-4-溴-3-吲哚葡糖苷酸glucuronidev 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析1.前言杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(RhododendronL.)植物的统称，是中国十大传统名花之一，也是世界园林上著名的观赏植物，素有“花中西施”的美称。杜鹃花通常以常绿或落叶灌木的形态出现在大众眼前，但在我国的云南地区有少数杜鹃花种类为乔木（吴福建等2008）。其花冠形状多种多样，有漏斗状、管状、钟状等，花色艳丽有白、粉、红、黄、紫等。因其种类繁多，色彩艳丽，形态各异，花期亦长，具有非常高的观赏价值。它不仅可以在园林中成丛、成片种植，也可以作为盆景点缀庭院。其粗壮的根茎经过艺术加工还可做成工艺品。杜鹃花不仅具有观赏性，有的亦可食用，同时有些种类还具有极高的医药价值，其根、茎、叶均可入药，在祛痰止咳、心血管系统、神经系统、抗炎镇痛、免疫等方面发挥功效（李少泓和孙欣2010，Lietal2018c）。杜鹃属是杜鹃花科中最大的家族，具有丰富的遗传资源。它广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲等地，主产于东亚和东南亚等地区。中国杜鹃花资源也极为丰富，约占世界杜鹃花种类的一半，有562种，而其中特有物种约405种（方瑞征和闵天禄1995），是公认的杜鹃花的故乡。一直以来，国外对杜鹃花的研究无论在宏观领域还是微观领域都较为深入(Caseretal2010,Hakeemetal2017,Ferusetal2017,Parketal2018)。国内的对杜鹃花的研究起步较晚，且主要集中在种质资源（赵冰等2013，解玮佳和李世峰2017），环境习性（柯世省等2007）等方面的研究，关于抗逆生理研究较少，主要集中在干旱胁迫研究（黄承玲等2011，周媛等2017），低温胁迫研究（刘冰等2016，陈慧等2017）等方面，而高温胁迫的研究甚少。课题组前期在引种收集的210份种质资源的基础上开展抗性品种筛选，在正常或热胁迫条件下比较了四种杜鹃花品种的表型和叶绿素荧光动力学参数，选择耐热性最强的品种‘胭脂蜜’(R.obtusum‘Yanzhimi’)进行转录组测序。进而挖掘得到了响应高温胁迫的9万余条Unigene，共注释到了973条转录因子的序列，把它们分为了58个基因家族，包括被报道与抗逆性相关的DREB/CBF、NAC、HSF、MYB等多个基因家族(Fangetal2017)。本研究从这些转录因子中筛选其中稳定且高效响应高温胁迫的DREB类转录因子，克隆其启动子片段，分析其功能，从杜鹃花对热激反应的分子特性角度出发，为杜鹃花耐热研究奠定基础。1 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.1.植物高温胁迫研究进展高温是限制植物生长和分布的重要自然灾害之一(Hasanuzzamanetal2013)。植物在持续高温的影响下会受到严重的损害直至植物死亡(WahidandClose2007)。高温对植物的伤害表现在多个方面，包括引起蛋白质变性，影响光合系统稳定性、增加活性氧的积累，增加电解质渗透和膜脂过氧化破坏。为了减少或抵抗高温损害，植物可以感知温度的变化并对它们其作出响应，包括形态、基因表达和生理生化方面的调节，而这一系列响应高温胁迫的机制的构成，可以减轻高温造成的伤害(BitaandGerats2013)。1.1.1.植物响应高温胁迫的形态和生理变化在长期的自然选择过程中，植物形成一些特殊的结构或形态特征以抵御高温带来的伤害，例如叶片表面的绒毛，有些植物的果实表面具有一些蜡质等特殊形态结构可以减少太阳辐射的面积。在高温胁迫下，植株表型会产生一些形态变化，如叶片变黄，表现出明显的死斑；叶扁化，簇生；某些木本植物的树干会出现开裂现象等（潘瑞巧等2012）。同时，高温也会引起植物的生理代谢发生变化，如蛋白质的空间结构受到影响，细胞质膜的通透性增强，对植物造成直接伤害；对植物造成间接伤害主要来自于降低叶绿体或线粒体中的酶活性，抑制蛋白质的合成，破坏细胞骨架等方面(Hoearth2005)。生物膜的构成成分主要为蛋白质和脂类，而高温胁迫将导致其化学键断裂，从而使生物膜失去了选择透过性和主动吸收性。生物膜的液化程度随着植物中饱和脂肪酸含量的增加而增加。高水平的饱和脂肪酸可以使生物膜系统在更高的温度下更稳定。植物为了在高温胁迫下能够正常生长，会提高体内的脯氨酸含量，以提高自身耐热性。光合作用是植物生长过程中最重要的生理过程之一，叶片光合作用机制对高温特别敏感，叶绿体是高温胁迫最敏感的细胞器之一（李晓清等2009）。高温会影响植物的光反应速率，并且还会通过光系统II（PSII）影响植物的光合作用。从而降低植物对光能的吸收和利用，使激发能剩余，造成PSII中心伤害（付振书等2005），因此，光合作用过程又被认为是植物中对高温最敏感的环节(Crafts-BrandnerandLaw2000)。同时，植物气孔在抗高温方面也起着重要作用。2 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析1.1.2.植物响应高温胁迫的分子机制1.1.2.1.热信号传递植物响应高温胁迫的分子机制有多个基因和多个信号的参与（Kotaketal2007,陈儒钢等2010）。植物感受到热信号后，通过Hsf-Hsp（热激转录因子-热激蛋白）途径、Ca2+-CaM（钙离子-钙调蛋白）途径、ROS（活性氧）途径和激素途径(Reddyetal2012,Mittleretal2012)来接收、传递、放大热信号，转录调控及功能蛋白的表达。热信号传递到植物的质膜，增强其磷脂双分子层的流动性，使特异钙离子通道打开，大量的Ca2+内流，形成初级信号，导致MAPK（促分裂素原活化蛋白激酶）、CDPK（钙依赖性蛋白激酶）表达上调。热激蛋白（Hsp）的诱导，抗氧化蛋白和渗透调节蛋白的表达和积累，导致高温损伤有一定程度的减轻，从而使植物表现出耐热性（张双喜等2013）。其中，植物在耐热机理中最主要的调控途径是Hsf-Hsp途径(WahidandClose2007)。Hsf位于热信号传递途径中的末端，接收到热信号后可以直接传递到下游，调控高温胁迫响应基因表达(Vonetal2007)。而Hsp是保护植物细胞免受高温伤害的物质基础，是Hsf调控表达中最重要的蛋白(Al-Whaibi2011)。图1-1植物热激信号传递途径Fig.1-1Heatstresssignaltransductionpathwaysinplants.(Mittleretal2012)3 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.1.2.2.胁迫蛋白的产生和积累植物在环境胁迫下会产生和累积胁迫蛋白，为植物提供保护并提高植物抗逆性(Vasseuretal2014)。Hsps是在热激反应中产生的胁迫蛋白，具有分子伴侣功能。Hsp在高温胁迫下被诱导表达，植物的耐热性在Hsp的作用下有一定程度的提高(Wangetal2004)。LEA蛋白在干旱胁迫下保护细胞免受干旱迫(Rodriguezsalazaretal2017)，内质网应激蛋白在毒素诱导下表达而保护植物细胞(Bedardetal2004)，冬小麦310kD胁迫蛋白在低温胁迫下表达含量增加以提高冬小麦的耐寒性。胁迫蛋白的诱导表达可以有效的保护细胞的结构，降低胁迫伤害(Aprileetal2014)。1.2.杜鹃耐热研究概况我国的杜鹃花品种繁多，但是大多数的品种并没有广泛应用于园林中。杜鹃花地理分布相对较广，多数分布在高地，长期的自然选择使得即使是相同种类的杜鹃花，在不同的环境条件下也会在生长模式上产生很大的差异。而这些杜鹃花种质资源多样性的存在都是由于高山高原地区的地理环境和气候条件复杂所致。因其多样性，杜鹃属植物不同亚属、组内，甚至同一组的亚组、系之间的杜鹃属植物耐热性都有不同，同一种杜鹃花因其产地等的不同，其耐热性也会有差异(Arisumi1983,Arisumi1989)。杜鹃属植物喜欢凉爽潮湿的环境，忌炎热和强光暴晒（申仕康等2014）。受其遗传因素的限制，杜鹃属植物耐热性较差，无法适应城市园林的夏季高温环境。在前人的研究中，我们知道杜鹃花生长的最佳温度在15至28℃之间。随着高温时间的延长，杜鹃花会出现失绿、黄化、脱落等现象，直至植株死亡(Buchneretal2015)。因此，提高杜鹃花的耐热性是使其在平原地区可以顺利越夏，保持景观持续的重要保证。前人关于杜鹃耐热性的研究多数集中在高温胁迫下杜鹃生理指标的变化、外源物质对杜鹃耐热的影响、杜鹃耐热指标筛选等方面。在高温胁迫下，杜鹃花随着体内活性氧的增加其体内的保护酶活性增强。有实验表明，耐热性强的猴头杜鹃的CAT（过氧化氢酶）、SOD（超氧化物岐化酶）、POD（过氧化物酶）及APX（抗坏血酸过氧化物酶）活性在高温胁迫下均显著高于耐热性弱的井冈山杜鹃（张乐华等2011）。而在高温胁迫下，杜鹃体内的渗透调节物质含量也将会发生一定的变化。王丽娟等（2014）研究发现，随着温4 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析度的升高，桃叶杜鹃幼苗的Pro（脯氨酸）和可溶性蛋白质含量增加。而植物在受到逆境胁迫时，其生物膜系统会发生膜脂过氧化作用，因此，MDA含量在一定程度上能够反映植物耐热性强弱及受逆境伤害的程度。叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，在胁迫条件下其形态结构特征会发生变化。Shen等（2016）利用扫描电镜观察15种杜鹃叶片的17项解剖结构，结果表明影响杜鹃耐热性的主要叶片解剖结构有：叶片角质层厚度、气孔密度、气孔宽度、栅栏组织厚度及组织结构疏松度等。在杜鹃的耐热研究中我们发现，外源物质在一定程度上也可以提高杜鹃的耐热性。如外源施加Ca2+有利于提高杜鹃耐热性：郑宇等（2015）研究表明高温胁迫下2种西洋杜鹃在不同浓度的CaCl2处理下耐热性增强。赵冰等（2010）发现，高温胁迫下高山杜鹃花在20mmol/LCa2+处理下，其热害指数降低了75%左右。而在汪蓉等（2015）的研究中，PAS（氨基水杨酸）、AA（海藻酸）能提高马缨杜鹃的耐热性。同时，壳聚糖通过提高高温胁迫下毛棉杜鹃的可溶性糖含量，以提高毛棉杜鹃幼苗的抗热性（丁雨霜等2015）。在高温胁迫下，接种ERM真菌能提高杜鹃叶片的抗氧化酶活性，降低对‘淡妆’叶片的伤害程度。（罗倩等2016）。目前，我国对杜鹃花耐热性指标的筛选标准还不统一，张春英等（2006）提出了杜鹃花的耐热筛选指标，包括总叶片气孔面积，游离脯氨酸含量和细胞膜相对渗透率；在她的研究中，杜鹃花的气孔密度，SOD活性和耐热性之间没有相关性。而据王凯红等（2011）研究发现SOD（超氧化物歧化酶），APX（抗坏血酸过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）等酶的含量可以在一定程度上用于鉴别杜鹃花的耐热性。而申惠翡和赵冰（2018）通过主成分及相关性分析发现：叶绿素、MDA、可溶性蛋白、Pro和H2O2含量与杜鹃花耐热性联系紧密，可作为鉴定不同品种杜鹃花耐热性的依据。在课题组的前期实验中，对多份杜鹃种质资源进行田间与温室耐热性鉴定，发现在持续高温下，耐热杜鹃种质中叶片PSII光化学反应中心的活性更高，其Fv/Fo、Fv/Fm、Fv’/Fm’等指标更稳定，暗示耐热杜鹃种质资源可能拥有更强的光合保护系统，同时这些指标可以作为筛选耐热杜鹃的依据（周媛等2015）。综上我们可以发现，前人的研究为杜鹃耐热品种的筛选与培育奠定了一定的基础，但由于缺乏参考基因序列，杜鹃高温分子机制尚未见报道。杂交育种是培育新品种最经常使用的有效方式之一，但是杜鹃属内远缘杂交不亲和现象限制了这类育种方式的应用。近年来，通过基因工程技术打破种间杂交障5 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文碍是杜鹃花育种研究的热点，然而有效耐热基因缺乏，已成为我国乃至世界杜鹃耐热育种的“瓶颈”。因此，如何从耐热杜鹃种质资源中挖掘耐热基因，继而通过基因工程或分子辅助育种等技术对现有杜鹃园艺品种进行遗传改良，是杜鹃育种中有待解决的问题。1.3.DREB类转录因子在逆境调控中的关键作用1.3.1.DREB类转录因子的结构特点DREB(Dehydrationresponsiveelement-bindingprotein)是一类能特异结合DRE/CRT顺式作用元件的转录因子，其核心序列为A/GCCGAC，可以通过调控下游基因启动子中的DRE/CRT元件响应与逆境胁迫相关的一连串功能基因的表达，提高植物的抗逆性(Kidokoroetal2017)。DREB类是植物AP2/EREBP转录因子大家族中的一个亚族，其蛋白一级结构均含有一个保守的AP2结构域、转录激活域和核定位信号。通过与抗逆功能基因启动子区的DRE或CRT(C-repeat)顺式作用元件特异性结合，AP2结构域可以调节基因的表达，从而增强植物的抗逆性(Xuetal2011,Mizoietal2012)。根据DNA结合域的不同，DREB类转录因子分为6类：A-1至A-6。氨基酸序列对比发现，A-1类转录因子上游有1个保守的核定位信号区（NLS），下游有DSAW的保守序列和羧基末端的LWSY保守序列。而A-2类转录因子中不存在这些序列。A-3-A-6亚组占整个拟南芥DREB/CBF亚族基因的75%，但国内外对它们的功能研究报道较少，近年来才相继有一些报道：如大豆(GlycinemaxL.)种子GmSGR(A-3)(Wangetal2008)；玉米(Zeamays)ZmDREB4.1(A-4)(Lietal2018b)；大豆(GlycinemaxL.)GmDREB3(A-5)(Chenetal2008)；胡杨(PopuluseuphraticaOliv)PeDREB2a(A-5)(Zhouetal2012)；棉花(Gossypiumhirsutum)GhDBP2(A-6)(Huangetal2006)。1.3.2.DREB转录因子基因在植物抗逆调控中的作用植物响应干旱、高盐及低温胁迫的途径分为依赖于ABA和不依赖ABA的信号传导途径。目前，从植物DREB/CBF类转录因子均能与DRE/CRT元件的相互作用，完成对干旱、高盐或低温胁迫应答基因的激活。其中DREB1A/B/C和DREB2转录因子分别参与到不依赖于ABA的应答途径中，而其他受逆境诱导的DREB/CBF转录因子则参与到依赖ABA的应答途径中。这些结果表明不同植物中类似的DREB/CBF基因，其参与的细胞内信号转导的途径可能不同，植物在逆境6 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析胁迫应答反应中存在着复杂的信号传递途径，并且各种胁迫信号传递途径间通过某些共同的组分联系在一起，构成一个复杂的信号传递网。DREB/CBF转录因子可以特异性地结合DRE/CRT顺式作用元件，调控下游基因的表达，其自身的表达也受上游基因作用、“同伴”作用以及其下游基因的反馈作用。植物细胞从感应干旱、高盐或低温胁迫开始，通过各级信号传递DREB/CBF转录因子与DRE/CRT顺式作用元件相互作用的转录调控，目的基因的表达、基因产物的积累引起的各种生理生化调节，最终使植物抗逆性获得增强，这一系列过程如图1-3显示（刘强等2000）。图1-3逆境胁迫下DREB/CBF转录因子的感应和表达调控过程（刘强等2000）Fig.1-3Aprocessofinduction,expressionandregulationofDREB/CBFtranscriptionfactorinenvironmentalstresses7 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.4.Hsfs及其上下游调控基因在耐热调控中的关键作用1.4.1.植物Hsfs的结构和分类植物热激转录因子在真核生物中具有典型的保守结构域，目前已知的Hsfs包含五个基本功能域（图1-2）：DBD（DNA结合结构域）、OD（寡聚化结构域）、NLS（核定位序列）、NES（核输出序列）和AD（激活域）(Scharfetal2012)。根据插入HR-A/B区的氨基酸残基数量，植物Hsf可分为A类、B类和C类，其中有21、0、7个氨基酸残基分别插入HsfA、B、C的HR-A/B区域之间(Gagliardi1996)。HsfA在其C端激活结构域有AHA结构基元从而具有转录激活活性，HsfB和HsfC缺少该结构，通常认为其没有转录活性(Ganguli2004)，但HsfB在与HsfA共同作用下可以结合DNA。而HsfC的作用尚未有文献报道，还有待未来研究探索。图1-2热激转录因子的基本结构Fig.1-2BasicstructureofHsfs（Scharfetal2012）1.4.2.Hsfs及其上下游调控基因响应高温的调控机制目前，关于Hsf的研究多数在番茄中报道。HsfA1是热激反应的主要调节子(Vonetal2007)，且功能不能被其他Hsf所代替。经实验研究，野生型植株的耐热性比HsfA1沉默的转基因植株要高，而HsfA2和HsfB1沉默表达则没有这样的趋势(MillerandMittler2006)。HsfA1和HsfA2通过蛋白互作而激活下游耐热基因的表达(Chanschaminetetal2009)。和番茄相比，我们没有发现特定的HSF在拟南芥的热激反应中起主导作用。在热激反应中，HsfAla/b/d是主要的正调节子，呈现热敏8 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析感性，热激应答基因的表达被阻断(Yoshidaetal2011)。HsfA1d/e作为转录激活子参与HsfA2的转录调控(LiuandChang2012)。HSFA1对高温胁迫的响应也反映在其诱导多种胁迫响应基因的上调表达的能力上，包括Hsps、其他Hsfs、响应胁迫的其他转录因子和调节因子基因（如DREB2A、DREA2B、MBF1C等）等(Yoshidaetal2011)。HsfA2在热激反应中的信号转导方面起关键作用（陈思婷和郭房庆2013）。它是HsfA1下游的响应因子，结构域与HsfA1相似，且仅在逆境诱导下表达。研究表明，HsfA2可能通过与热激蛋白和胁迫相关基因（MBF1c、APX2和GolS1）等启动子区域的HSE多聚体结合以调控这些基因的表达，从而参与植物耐热性。此外，最近的研究表明，HsfA2的表达存在转录后调控机制。在拟南芥中，响应高温胁迫诱导表达的基因类型存在一定的差异性，更多诱导参与转录功能的基因表达，而更偏向于参与新陈代谢和氧化还原平衡的基因表达(LiuandChang2013)。对A类家族亚家族的另一成员HsfA3而言，其表达同时受到热和干旱胁迫的诱导，而这种诱导主要依赖于DREB2A转录因子。在植物低温和干旱胁迫中发挥重要作用的DREB基因DREB2A/DREB2C，可以结合HsfA3启动子上的DRE元件来正调控植物的耐热性，这表明HsfA3是多个逆境性状表达调控网络上的一个共同节点(Chenetal2010)。HsfB类转录因子缺少AHA结构单元，自身不具备转录活性，被认为在细胞内阻遏HsfA类转录因子，在耐热适应性中起负调控作用(Ikedaetal2011)。目前仅有少量研究表明HsfC类热激转录因子可被多种逆境胁迫诱导(Maetal2014)。这表明HsfC类热激转录因子可能参与植物对逆境的响应。1.5.启动子研究进展1.5.1.启动子的基本结构结构基因通过RNA聚合酶Ⅱ、转录因子和启动子的联合作用而被激活，转录因子首先识别具有特异性的序列元件的启动子，再与RNA聚合酶Ⅱ确定转录起始位点，从而起始转录（赵寿元2007）。启动子是结构基因编码区起始密码子ATG上游的DNA序列，其结构分为核心区和上游调控区，拥有具有特异性的序列元件，控制着转录的起始、方向及效率（朱玉贤和李毅2002，谢在春等2007，唐晓凤2009）。9 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.5.2.启动子的基本类型启动子分为三类，即组成型、诱导型以及组织特异型（胡廷章等2007）。不同类型启动子在植物生长发育和生理调控方面具有重要意义。1.5.2.1.组成型启动子组成型启动子是驱动外源基因在所有的组织中表达的一类启动子，不表现出时间和空间的特异性。在植物基因工程研究中，我们可以发现组成型启动子在基础研究和应用领域研究相对广泛。魏晶等（2012）把PSUI1认为是组成型启动子，经实验证明我们可以发现该启动子在所有组织中均能启动目的基因表达。组成型启动子在基因工程研究中广泛应用，但组成型启动子导致目标基因的过表达，致使能量浪费，并且在非靶向区域产生的过表达产物对于植物本身是有害的，打破植物代谢平衡，对植物正常的生长和发育有着不利的影响(Hsiehetal2002,Homrichetal2012,Zhuetal2014)。因此，寻找稳定、高效的组织特异型启动子，对其功能进行分析，将其应用于植物基因功能研究可能会取得更有效的结果。1.5.2.2.组织特异型启动子组织特异型启动子可以调控根、茎、叶、花、种子等组织或器官中的基因特异表达，同时还能控制基因在特定时期高效表达，在植物分子调控机制中发挥作用(Stenzeletal2012)。如大豆中的ASA2启动子仅在组织培养物，花粉和种子中表达(Inabaetal2007)。从大豆(Glycinemax(Linn.)Merr)中克隆得到的7αP基因，仅在种子中才能检测到GUS活性（付永平等2009）。甘薯(Ipomoeabatatas)IbRbcS1启动子能诱导基因在绿色组织器官中高效表达(Tanabeetal2015)。草莓的DY基因启动子是果实特异型启动子（祁广2008）。在基因功能中利用组织特异性启动子的组织特异性，可以在植物中定时、定量、定位的表达外源基因，从而可以高效节能的提高植物的抗性。1.5.2.3.诱导型启动子诱导型启动子只能在物理或化学条件刺激下才会诱导表达，拥有增强子和沉默子，而且只能特异识别特定的诱导因子。胁迫诱导型启动子可以在胁迫下诱导靶基因高水平表达表达并且增加植物抗性，而当胁迫解除时，基因表达停止，从而可以有效避免内源底物的消耗（文添龙等2014）。随着基因工程技术的发展和成熟，已经克隆和分析了大量的诱导型启10 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析动子，山杨(Populuseuphratica)NaC1启动子为干旱胁迫诱导型启动子(Wangetal2016)，玉米(Zeamays)II型H+-焦磷酸酶基因GaPP为渗透胁迫诱导型启动子(Houetal2016)，菊花(Chrysanthemummorifolium)BBX24（锌指蛋白转录因子）启动子为干旱及低温胁迫诱导启动子(Imtiazetal2015)。1.5.3.启动子的克隆方法启动子克隆的方法有很多，而最常见的主要有基因文库筛选法、常规PCR法、反向PCR法、接头PCR法、热不对称交错PCR法等。基因文库筛选法的历史悠久，首先构建一个合适容量基因组数据库，然后用待克隆启动子已知序列片段与构建好的基因组数据库进行筛选。Rinehart等（1996）最早采用这个方法克隆得到了纤维发育后期的特异表达基因的启动子序列。但由于构建大规模数据库难度颇大，所以很少应用在启动子克隆中（雒雅婧等2015）。当我们已知待克隆的基因启动子序列时，我们通常使用常规PCR法来克隆启动子。根据已知序列设计合适的引物，可以从基因组中快速分离出目的片段。在大部分的时候，我们对基因启动子的序列时未知的，这时候我们则需要使用其他的扩增方法来扩增我们所需要的未知序列。反向PCR法是将基因组DNA进行酶切处理呈环状结构，然后再通过多次扩增得到目的序列(Trigliaetal1988)。该方法操作方便，引物设计也比较简单，但是环化DNA有时会出现问题，有一定的局限性。接头PCR法是用限制性内切酶将基因组DNA酶切后加上“Y”字形接头（李姗姗等2005），一般设计两条特异性引物进行扩増。Liu等(2013)用这个方法克隆得到了银杏GbMDR1启动子。热不对称交错PCR法通过基因关联性分析设计具有特异性的嵌套引物，控制不同的退火温度，利用该方法直接将基因的侧翼序列从基因组中克隆出来，从而为实现启动子的高效克隆方法提供全新思路(LiuandChen2007)。该方法简单有效，能有效抑制非特异性扩增。Du等（2010）就利用此方法克隆得到了玉米巧脂蛋白基因的启动子。Jiang等（2012）也利用此方法克隆了芸苔BCMF21启动子。但是其缺点也很明显，就是具有很大的随机性，并引物需要不断更换。11 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.5.4.启动子的研究方法1.5.4.1.生物信息学分析PromoterScan、Promoter2.0、NNPPPromoter等是目前常见的启动子预测软件。而植物启动子的结合位点的预测主要依赖的数据库有：EPD、PLACE、PlantCARE等（杨晓娜等2010）。这些预测软件可以对植物启动子的功能进行预测分析，本研究选用plantCARE数据库对RoDREB2C基因启动子序列进行预测分析，便于后续进行功能验证。1.5.4.2.转化分析1.稳定转化分析稳定表达是将启动子连接报告基因转入到植株中，获得稳定的转基因株系后再检测报告基因的表达。常用的报告基因有：CAT、NOS、GUS等。其中，GUS基因由于其组织化学检测具有稳定性，且在植物体中几乎无背景，我们通常使用它作为报告基因进行组织化学染色及荧光定量检测。2.瞬时表达分析瞬时表达法是将启动子连接报告基因转入植株，使其在植株体内短时间表达。瞬时表达导入的外源DNA游离于染色体之外，对基因组产生的影响较小，只能在短时间内检测到基因表达量(ZhanandWang2000,Sumikumaretal2002)。瞬时表达法快捷、简单，但在转化植株中可能会导致某些特异性调控元件的失活（王秋岩等2015）。1.5.4.3.缺失突变分析缺失突变分析、点突变分析、酵母单杂分析等是我们常见的启动子研究的方法（杨晓娜等2010）。缺失突变分析在多种植物中都有研究和应用，是指通过定向删减启动子片段，构建5’缺失启动子融合GUS（β-葡糖醛酸糖苷酶）载体，转化植物，结合GUS染色定性分析与GUS酶活性测定定量分析5’缺失启动子的表达特异性和GUS酶活性，从而确定启动子发挥功能的核心区域和响应外部环境的重要元件（黄海群和林拥军2007，Nietal2008）启动子活性的差异受到启动子长度变化影响，主要是启动子上重要功能元件的分布和变化。启动子缺失突变的方法促进了启动子活性差异的分析和核心功能元件的鉴定，从而进行有针对性的调控，提高启动子的活性及表达效率。12 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析1.6.研究的目的及意义在前期收集210份杜鹃种质资源与耐热形态及生理鉴定的基础上，本实验室成功筛选出了耐热性差异极大的杜鹃属种质资源。我们以耐热品种‘胭脂蜜’(R.obtusum‘Yanzhimi’)为材料进行转录组测序，获得了‘胭脂蜜’中的耐热相关的转录因子的部分序列，从而筛选出差异表达的关键基因。我们选择其中高效响应高温胁迫的DREB类转录因子，将其基因命名为RoDREB2C，根据其基因的CDS序列，通过染色体步移法克隆得到了RoDREB2C基因的启动子，对该启动子进行顺式作用元件分析，预测该启动子的功能。根据预测结果对启动子进行5’端不断缺失，构建5’缺失启动子表达载体，通过农杆菌侵染拟南芥，验证其功能。通过对转基因植株进行高温处理，初步判断该启动子是否响应高温胁迫，验证其高温诱导特性，为后续实验奠定基础。而在高温处理下，对不同时期、不同部位的转基因拟南芥进行GUS染色分析，探究该启动子是否具有组织特异性，及时空表达差异，有利于进一步实验的深入研究。通过对启动子是否响应其他激素诱导的研究进一步研究该启动子的功能。通过不同5’缺失启动子响应高温胁迫的活性分析实验，我们可以筛选出RoDREB2C启动子上发挥重要功能作用的关键启动子顺式作用元件，为下一步通过基因工程或分子辅助育种的方法培育杜鹃新品种奠定基础。13 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.7.技术路线14 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析2.材料与方法2.1.实验材料2.1.1.植物材料杜鹃东鹃品系品种‘胭脂蜜’(R.obtusum‘Yanzhimi’)，引种收集于武汉市农业科学院林业果树研究所（简称：武汉市农科院林果所），盆栽，常规养护管理。实验所用野生型拟南芥(Arabidopsistaliana)为Columbia生态型，由武汉市农科院林果所提供，常规养护管理。两种材料均种植于培养室，种植条件为长日照条件（白天16h，晚上8h），温度保持在22-25℃。2.1.2.农杆菌菌株及质粒根癌农杆菌GV3101菌株、大肠杆菌DH5α、表达载体pCAMBIA1391z质粒（该载体报告基因为GUS基因，卡那霉素抗性）均由武汉市农科院林果所保存提供。2.1.3.主要药品和试剂1.抗生素类：卡那霉素（Kan）、利福平霉素（Rif）、潮霉素。2.激素类：茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、赤霉素（GA3）。3.试剂盒及酶类：2×EsTaqMasterMix、DL2000Marker（艾德莱生物公司），核酸染料；引物合成及测序（擎科生物技术公司）；OneStepSeamlessCloningkit试剂盒（艾德莱生物公司）；GenomeWalkingKit试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）、超纯RNA提取试剂盒（康为世纪）、cDNA反转录试剂盒、SYBRPremixFxTaqII荧光定量试剂盒（Takara）等。4.化学药品：CTAB、PVP、EDTA、NaCl、Trisd、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、X-Gluc、TritonX-100、甲醇、β-巯基乙醇、4-MU、4-MUG、考马斯亮蓝G-250、磷酸、牛清蛋白等。15 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.1.4.主要溶液及培养基配置2.1.4.1.DNA提取所需溶液配制1.0.5MEDTA：称取Na2EDTA·2H2O18.6g，双蒸水溶解。NaOH固体调节PH至8.0，定容至100mL。2.1MTris-Cl：称取Tris碱固体12.1g，双蒸水溶解。盐酸调节PH至8.0，定容至100mL。3.CTAB缓冲液(100mL):试剂名称用量CTAB2gNaCl8.19g0.5MEDTA4mL1MTris-Cl10mL4.CTAB抽提液(100mL)：试剂名称用量2%PVP2gCTAB缓冲液100mL2.1.4.2.GUS组织化学染色液1.50mM磷酸钠缓冲液（PBS）：A液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水中，定容至100mL。B液：称取NaH2PO4·12H2O3.12g溶于蒸馏水中，定容止100mL。A液61mL和B液39mL混合，定容至100mL，用NaOH溶液调节PH至7.0。2.0.5MEDTA母液（PH8.0）3.GUS组织化学染液(100mL):试剂名称含量50mM磷酸钠缓冲液80mL0.5MEDTA母液2mL甲醇18mLX-Gluc50mg10%Triton1mL*待充分溶解后于-20℃保存。16 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析2.1.4.3.GUS酶活性测定相关溶液1.0.1M磷酸缓冲液（PH:7.0）：A液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g，用蒸馏水定容至100mL；B液：称取NaH2PO4·12H2O3.12g，用蒸馏水定容至100mL。取A液61mL和B液39mL，并用蒸馏水定容至200mL，用1mol/L的NaOH溶液调至PH=7.0。2.0.5MEDTA母液（PH8.0）：称取EDTA-Na2·2H2O18.6g，双蒸水溶解。NaOH粉末调节PH至8.0，双蒸水定容至100mL。3.GUS提取缓冲液（100mL）（罗靖，2013）：试剂名称含量0.1M磷酸缓冲液50mL0.5MEDTA母液2mLTritonX-100100μLβ-巯基乙醇100μLddH2O47.8mL4.GUS终止反应液（0.2MNa2CO3溶液）（100mL）：称取2.13gNa2CO3，用蒸馏水定容至100mL。5.2mmol/L4-MUG：称取3.5mg4-MUG粉末于5mLGUS提取缓冲液。6.考马斯亮蓝G-250溶液：称取30mg考马斯亮蓝G-250，溶解于15mL95%乙醇，加入85%（W/V）磷酸100mL，蒸馏水定容至300mL，棕色试剂瓶保存。17 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.1.4.4.主要培养基蛋白胨（Peptone）1%酵母提取物（YeastExtract）0.5%LB培养基氯化钠（NaCl）1%超纯水（ddH2O）定容用琼脂粉（Agar）（固体培养基）1.5%蛋白胨（Peptone）1%酵母提取物（YeastExtract）0.5%YEP培养基氯化钠（NaCl）0.5%超纯水（ddH2O）定容用琼脂粉（Agar）（固体培养基）1.5%Murashige&Skong基本培养基（MS）0.2215%1/2MS培养基琼脂粉（Agar）0.75%超纯水（ddH2O）定容用潮霉素0.1%其中，LB培养基主要用于培养大肠杆菌DH5α，YEB培养基主要用于培养根癌农杆菌GV3101，1/2MS培养基用于转基因拟南芥的筛选。2.1.5.主要实验仪器及设备PCR仪、实时荧光定量PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像系统、DNA浓度测定仪、超净工作台、通风橱、PH计、涡旋震荡仪、恒温水浴锅、高温灭菌锅、37℃恒温箱、28℃恒温箱、-80℃超低温冰箱、人工智能气候箱、摇床、高速离心机、冷冻离心机、分析天平、紫外可见分光光度计、荧光分光光度计、酶标仪、显微镜等。2.1.6.植物生物信息学分析软件及数据库生物信息学分析数据库：PlantCaRE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)引物设计软件PrimerPremier5序列比对软件DNAMAN18 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析2.2.实验方法2.2.1.启动子序列的获得2.2.1.1.CTAB法提取杜鹃‘胭脂蜜’基因组DNA实验步骤：1.取‘胭脂蜜’叶片1-2g置于预冷研钵中，液氮研磨后加入到CTAB提取液中。2.将已加入样品的CTAB缓冲液于65℃水浴加热60min，每隔10min振荡一次。3.常温，10000rpm离心15min，吸取上清液800μl，转入另一离心管。4.加入等体积（800μl）氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24:1），充分混匀，静置5-10min，于10000rpm离心10min，吸上清液700μl，转入另一离心管。5.重复步骤4。6.取上清600μl于另一离心管，加入2/3体积（600μl）异丙醇，上下倒置轻摇至有白色絮状沉淀，于-20℃冷冻30min。7.10000rpm离心15-20min，弃上清。在剩余的含有DNA的化合物中加入500µL75%酒精，洗涤3次，每次10000rpm离心30s，弃酒精。8.空离1min后，吸干液体，通风橱风干10-20min，待乙醇充分挥发后，加入50μlddH2O和1μlRNA酶，置于37℃烘箱1h后于-20℃保存。2.2.1.2.基因组DNA的纯化详细操作参考DNA纯化试剂盒。2.2.1.3.已知序列的验证1.引物设计根据已知序列利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物（表2-1），对以纯化后的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。表2-1RoDREB2C基因部分cDNA序列验证Table2-1ThepartialcDNAsequenceverificationofRoDREB2Cgene引物名称引物序列（5’to3’）PrimernamePrimersequence(5’to3’)RoDREB2CF0GAAGAAAGCTGTGGGGACRoDREB2CR0GGGATAATCCATTGGCATAA*本课题实验所用所有引物均由武汉擎科生物公司合成。19 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文引物稀释步骤：4000rpm离心2min，加ddH2O稀释至10µM，涡旋震荡1min后于-20℃储存备用。2.PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）2×EsTaqMasterMix25RoDREB2CF02RoDREB2C-R02DNA1ddH2O20总体积Total503.PCR扩增反应程序：95℃5min95℃30s58℃30s35cycles72℃1min30s72℃2min2.2.1.4.染色体步移法获得启动子序列1.引物设计：根据验证的已知序列利用PrimerPremier5.0软件设计RoDREB2C基因5’端保守区两条下游特异性引物，即DP1、DP2。引物方向为3’-5’方向，DP2位于DP1左侧，引物间距在60-100bp之间，长度20bp左右，GC含量45%-55%。表2-2RoDREB2C基因染色体步移下游特异引物Table2-2DownstreamspecificprimersforRoDREB2Cgenechromosomewalking引物名称引物序列（5’to3’）PrimernamePrimersequence(5’to3’)RoDREB2C-DP1CACAACCAAATCTCCCTTCCACCRoDREB2C-DP2CGTATCCTTCACGTAAACCG2.第一轮PCR反应取适量DNA作为模板，用试剂盒所提供的兼并引物AP1为上游引物，RoDREB2C-DP1为下游引物，进行第一轮PCR反应。20 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）dNTPMixture810×LAPCRBufferⅡ(Mg2+plus)5TaKaRaLATaq0.5AP1Primer1RoDREB2C-DP1Primer1DNA1ngddH2O33.5总体积Total50PCR扩增反应程序：94℃1min98℃1min94℃30sec60~68℃1min5Cycles72℃2~4min94℃30sec；25℃3min；72℃2~4min94℃30sec；60~68℃1min；72℃2~4min94℃30sec；60~68℃1min；72℃2~4min15Cycles94℃30sec；44℃1min；72℃2~4min72℃10min3.第二轮PCR反应将第一轮PCR反应产物稀释100倍后，取1μl作为第二轮PCR反应的模板，以同种兼并引物AP1Primer为上游引物，以RoDREB2C-DP2Primer为下游引物，进行第二次PCR反应。21 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）dNTPMixture810×LAPCRBufferⅡ(Mg2+plus)5TaKaRaLATaq0.5AP1Primer1RoDREB2C-DP1Primer11stPCR反应产物1ngddH2O33.5总体积Total50PCR扩增反应程序：94℃30sec；60~68℃1min；72℃2~4min94℃30sec；60~68℃1min；72℃2~4min15Cycles94℃30sec；44℃1min；72℃2~4min72℃10min取第一次、第二次PCR反应产物各5μl，进行琼脂糖凝胶电泳电泳。切胶回收清晰的电泳条带。以RoDREB2C-DP2Primer为引物对PCR产物进行DNA测序。获得启动子序列。2.2.2.RoDREB2C基因启动子的克隆1.引物设计根据已得到的RoDREB2C启动子序列，利用PrimerPrimier5.0软件进行正反引物设计。表2-3RoDREB2C基因启动子全长扩增引物Table2-3RoDREB2CGenePromoterFullLengthAmplificationPrimer引物名称引物序列（5’to3’）PrimernamePrimersequence(5’to3’)RoDREB2C-FAACCGGAAACGTAAGTGGRoDREB2C-RGCGCGAAGAAAAACTCTCTTCCCA2.PCR扩增以提取的‘胭脂蜜’DNA为模板，以RoDREB2C-F和RoDREB2C-R为引物进行PCR扩增。22 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）2×EsTaqMasterMix25RoDREB2C-F2RoDREB2C-R2DNA1ddH2O20总体积Total50PCR扩增反应程序：95℃5min95℃30s58℃30s35cycles72℃1min30s72℃2min取5μL进行凝胶电泳检测，切胶进行DNA纯化回收，以RoDREB2C-F和RoDREB2C-R为上下游引物对PCR产物进行DNA测序，数据结果与已获得的启动子序列进行比对。比对结果无误后将剩余PCR产物进行凝胶电泳检测。3.PCR扩增产物目的片段回收参照胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法参照试剂盒说明书进行。2.2.3.启动子序列分析将杜鹃RoDREB2C基因启动子序列提交到PLACE和PlantCARE数据库中对该启动子可能存在的顺式作用元件进行预测分析，将这些预测的顺式作用元件的种类、数量和功能进行整理和分类，作为后续实验的参考。2.2.4.5’缺失启动子表达载体构建2.2.4.1.5’缺失启动子片段克隆1.引物设计根据RoDREB2C基因启动子可能存在的顺式作用元件的预测分析结果，将启动子序列进行分段，并通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同原序列设计带有酶切位点的引物，酶切位点为EcoRⅠ（GAATTC）。具体序列信息如下表所示：23 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文表2-4载体构建扩增引物Table2-4Theprimersoftheamplificationofvectorconstruction引物名称引物序列（5’to3’）PrimernamePrimersequence(5’to3’)RoDREB2C-F1AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCAACCGGAAACGTAAGTGGRoDREB2C-F2AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCTTCTTTCAGTGGGGTCARoDREB2C-F3AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCGGTGGGCTCGTTCGGTAARoDREB2C-F4AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCTGAGACGGACGGTTTGATRoDREB2C-F5AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCAGGAACAGTGAGCGAGGGARoDREB2C-F6AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCGAAAGCTGTGAGGACGAGRoDREB2C-R1TGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGCGCGAAGAAAAACTCTCTTCCCA*酶切位点加粗表示，EcoRⅠ:GAATTC2.PCR扩增以RoDREB2C基因启动子扩增的PCR产物为模板，以RoDREB2C-F(X)和RoDREB2C-R1分别为正反向引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）2×EsTaqMasterMix25RoDREB2C-F(X)2RoDREB2C-R12DNA1ddH2O20总体积Total50PCR扩增反应程序：95℃5min95℃30s35cycles58℃30s72℃1min30s72℃2minPCR产物的检测：制作1%琼脂糖凝胶(加入0.01%核酸染料)进行电泳检测，凝胶成像分析系统下拍照。24 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析4.PCR扩增产物目的片段回收参照胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法参照试剂盒说明书进行。2.2.4.2.线性化载体的制备载体：pCAMBIA1391zDNA限制性内切酶：EcoRⅠ酶切反应体系：反应成分体积（μl）EcoRⅠ2pCAMBIA1391z2010×HBuffer5ddH2O23总体积Total5037℃培养箱培养8h（可过夜）。2.2.4.3.目的片段与pCAMBIA1391z载体的连接重组反应体系：反应成分体积（μl）2×OneStepCloningMix5LinearVecter(10-80ng)xInserty总体积Total10载体一般用20-50ng，插入片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间最佳。计算后得出最佳载体体积为1.5μl，插入片段3.5μl。轻轻混匀后，在50℃反应30min。反应结束后可置于-20℃冰箱保存备用。2.2.4.4.连接产物转化大肠杆菌实验步骤：1.将5μl连接产物加入到刚解冻的DH5α感受态细胞(100μl)中，轻弹混匀，冰浴30min。2.42℃热激45s，立即置于冰上2min。3.加400μl的LB液体培养基，37℃摇床温育45min，使菌体复苏。4.将转化产物均匀布涂于含有卡那霉素的LB平板，于37℃培养12-16h。25 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.2.4.5.菌落PCR检测于超净工作台中进行如下操作，挑取转化平板中的白色单菌落，用已灭菌牙签蘸取菌落于800μlLB+Kan培养基中。表2-5检测引物Table2-5Primersfordetection引物名称引物序列（5’to3’）PrimernamePrimersequence(5’to3’)P1391Z-FTGTAAAACGACGGCCAGTP1391Z-RCAGGAAACAGCTATGACCPCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）2×EsTaqMasterMix10P1391Z-F0.8P1391Z-R0.8DNA0.4ddH2O8总体积Total20PCR扩增反应程序：95℃5min95℃30s58℃30s38cycles72℃1’30s72℃10min制作1%琼脂糖凝胶(加入0.01%核酸染料)进行电泳检测，将阳性菌落送至武汉擎科测序公司进行测序，对测序结果进行序列比对。2.2.5.拟南芥的转化2.2.5.1.提取重组质粒准备工作：将20ml的LB+kan培养基加入到50ml的无菌离心管中，挑取2.2.4.5得到的阳性单菌落于上述离心管中，200rpm37℃摇床培养16h后，分装至10ml的离心管中以备质粒提取。试剂盒采用质粒小提试剂盒，购于全式金生物技术有限公司，操作步骤如下：26 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析1.取过夜培养的菌液，10000rpm，离心1min，去上清液。2.加无色RB溶液（含RNase），于涡旋仪上充分震荡。3.加入LB溶液（蓝色），上下翻转使菌液充分裂解至蓝色透亮。4.加入NB溶液（黄色），小心混合至紧实黄色凝集块形成，12000rpm离心4-5min。5.吸取上清加入吸附柱中。12000rpm离心1min，弃流出液。6.加入650μlWB，12000rpm离心1min，弃流出液。7.12000rpm离心1-2min，彻底去除残留的WB。8.将离心柱置于新离心管中，于吸附柱中央加入30-50μlEB。9.10000rpm离心1min，收集质粒DNA置于-20℃保存备用。2.2.5.2.重组质粒热激法转化农杆菌实验步骤：1.将1μl重组质粒加入到100μl刚解冻的农杆菌感受态GV3101中混匀。2.冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。3.加入600μlYEP液体培养基，28℃摇床200rpm培育2-3h。4.取出60μl菌液均匀涂抹在固体YEP+Kan+Rif培养基上，28℃培养2-3d。2.2.5.3.菌落PCR检测于超净工作台中进行，挑取转化平板中的白色单菌落，用已灭菌牙签蘸取菌落于800μlYEP+Kan+Rif培养基中。PCR扩增反应体系：反应成分体积（μl）2×EsTaqMasterMix10P1391Z-F0.8P1391Z-R0.8DNA0.4ddH2O8总体积Total2027 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文反应程序为：95℃5min95℃30s58℃30s38cycles72℃1min30s72℃10min制作1%琼脂糖凝胶(加入0.01%核酸染料)进行电泳检测，将阳性菌落送至武汉擎科测序公司进行测序，对测序结果进行序列比对。2.2.5.4.花序侵染法转化拟南芥实验步骤：1.挑取已构建好的农杆菌单菌落于10mlYEP+Kan+Rif(100mg/L)中，28℃摇菌培养12-15h，至菌液浑浊。2.取上步摇好的菌液1ml于100mlYEP+Kan+Rif(100mg/L)中，28℃摇菌培养12h后分装至50mL离心管，6000rpm离心10min收集菌体。3.用5%蔗糖溶液将离心收集的菌块重悬浮至OD600值在0.8-1.0，加入0.02%silwet。4.选取长势良好的拟南芥，将花序分别浸泡至侵染液中约30s，吸取用侵染液滴入未浸泡的细小花序上，确保每个花序头充分浸泡侵染液。5.覆膜保湿，暗培养1d后在25℃，长日照条件下培养。待植株成熟后收集拟南芥种子。2.2.5.5.转基因拟南芥的筛选A.种子消毒方法将成熟的种子进行风干处理后，于超净工作台中进行如下操作：1.将种子分管浸泡在1ml无菌水中2.4℃条件下冷处理3d3.1.5%次氯酸钠对种子进行消毒处理30s，立即倒掉废液。4.无菌水冲洗2-3次，除去残余次氯酸钠。B.种子的培养1.加入0.1%琼脂糖溶液悬浮已消毒的种子，将种子均匀铺洒在添加1/1000潮霉素的1/2MS固体培养基上。28 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析2.于25℃环境温度下，暗光处理培养2d。3.于光照强度5000lx，光照/黑暗时间16h/8h，温度25℃条件下培养。4.待长出两片真叶后，筛选已生根的转基因拟南芥幼苗，移栽至培养土里，5.于光照强度5000lx，光照/黑暗时间16h/8h，温度25℃条件下培养以备后续实验。2.2.6.转基因拟南芥的GUS染色分析实验步骤：1.取染色部位加入GUS染液中。2.用注射器抽取真空，直至染液完全浸没叶片。3.于37℃恒温箱中放置10-12h。4.将材料转入95%乙醇中脱色1次，约15min。5.将材料用75%乙醇漂洗3-5次，每次浸泡30min以上，直至材料为白色。2.2.7.转基因拟南芥的GUS酶活性分析2.2.7.1.考马斯亮蓝G-250测定总蛋白1.标准蛋白溶液的配制（200μg/ml）称取20mg牛血清蛋白（BSA），用双蒸水溶解，定容至100mL。2.0-200μg/mL标准曲线的制作：取11支10mL离心管，按浓度梯度取样，将溶液混匀，放置5min后，用酶标仪测定595nm波长下的OD光密度值，以标准蛋白质含量(μg)为横坐标，以0D595为纵坐标，绘制标准曲线。3.标准蛋白测定方法：于4mL离心管中加入1.5mL考马斯亮蓝、480μL蒸馏水、20μL样品混匀后于室温下静置5min。取200μl加入酶标板，在595nm波长下测定OD595。2.2.7.2.GUS酶活性测定实验步骤：1.将待测材料置于已预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末后迅速加入到1000μlGUS缓冲液中（磨样需多次直至材料光滑），震荡混合均匀后于冰上静置30min。2.将上述混合液置于4℃，8000rpm离心10min。29 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.吸取上清液500-600mL于另一离心管中。4.准备两套离心管，分别加入900μl0.2MNa2CO3液体和160μl2mMMUG备用。5.吸取40μl上清液于160μl2mMMUG中吸打混匀后立即吸取100μl于900μl0.2MNa2CO3液体中，以终止反应。6.将步骤5剩余的100μl样品和2mMMUG混合液置于37℃水浴锅中反应20min。7.将反应后的混合液中加入900μl0.2MNa2CO3液体以终止反应。8.在发射光455nm，激发光365nm，狭缝10nm检测荧光。9.GUS酶活性计算：酶活性=反应20min过程中生成的MU*GUS酶活性测定反应体系/（蛋白含量测定*细胞提取液体积*反应时间）（单位：nM(MU)*mg-1(protein)*min-1）3.结果与分析3.1.响应高温胁迫的转录因子筛选以log2ratio＞2.0，P-value＜0.001为差异表达的阈值，从杜鹃转录组中筛选出差异表达的转录因子，共52个，包括AP2/EREB、AP2/ERF、HSF、MYB、MYB、WRKY、Znf等基因家族成员。其中有5个DREB类的转录因子，它们分别对应模式植物拟南芥中的AtDREB1D(C61022)、AtDREB1C(C46630)、AtDREB2C(C41140)、AtDREB2A(C62227)、AtDREB2A(C62226)等基因，它们被报道是拟南芥中参与低温、干旱、高温、高盐胁迫的重要转录因子。其差异表达如表3-1所示，其中以C62226基因的上调表达量最高，在24h时Log2ratio＝9.11，然而在4h时其Log2ratio较小，仅有3.40。综合其在不同时间的高温胁迫下的上调表达稳定性，我们选择上调表达量均较高的RoDREB2C基因，其在4h及24h时Log2ratio均为7.32。30 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析表3-1杜鹃转录组中差异表达的DREB类转录因子Table3-1DifferentiallyexpressedDREBtranscriptionfactorsintheRhododendrontranscriptomeLog2比率基因注解转录因子家族上调最高Log2ratioUnigeneAnnotationTFfamilyTopHit4hvsck24hvsckC61022DREelementbindingAP2/DREBAtDREB1D4.113.61C46630DREelementbindingAP2/DREBAtDREB1C4.943.99C41140DREelementbindingAP2/DREBAtDREB2C7.327.32C62227DREelementbindingAP2/DREBAtDREB2A3.268.23C62226DREelementbindingAP2/DREBAtDREB2A3.409.113.2.RoDREB2C基因启动子序列的获得PCR验证了RoDREB2C基因5’端的已知序列，对其产物进行测序。目的片段1%凝胶电泳检测后结果如图3-1：20001000图3-1RoDREB2C基因5’端已知序列PCR验证凝胶电泳Fig.3-15"-endknownsequenceofRoDREB2CgenePCRvalidationgelelectrophoresis验证序列.seqGAAGAAAGCTGTGGGGACGAGATCTTAAAGATTGTAGATT40CDS区.seqGAAGAAAGCTGTGGGGACGAGATCTTAAAGATTGTCGATT40Consensusgaagaaagctgtggggacgagatcttaaagattgtgatt验证序列.seqCAGCCCGCGATTATTTTGTACTAATTACTGGAGAATCCTA80CDS区.seqCAGCCCGCAATTATTTTGTACTATTTACTGGAGAATCCTA80Consensuscagcccgcattattttgtactattactggagaatccta验证序列.seqCGGTTTACGTGAAGGATACGCGAGATTTGAATCTGGTGGA120CDS区.seqCGGTTTACGTGAAGGATACGCGAGATTTGAATCTGGTGGA120Consensuscggtttacgtgaaggatacgcgagatttgaatctggtgga验证序列.seqAGGGAGATTTGGTTGGGAAGAGAGTTTTTCTTCGCGCAT159CDS区.seqAGGGAGATTTGGTTGTGAAGATAGTTTTTCTTAGCGCAT159Consensusagggagatttggttggaagaagtttttcttgcgcat图3-2RoDREB2C基因验证序列与CDS区比对结果Fig.3-2ComparisonoftheRoDREB2CgeneverificationsequencewiththeCDSregion31 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文PCR凝胶电泳图显示，扩增得到了约1800bp左右的片段，序列比对后，我们可以看到，在起始密码子前的约160bp的已知启动子序列与验证序列一致，碱基一致性达到96.25%，存在个别的碱基错配。按照TaKaRaGenomeWalkingKit试剂盒的操作要求，采用染色体步移法，以AP1为上游引物，RoDREB2C-DP1、RoDREB2C-DP2为下游引物分别进行第一轮、第二轮PCR反应。凝胶电泳检测结果如图3-3所示，经两轮PCR反应扩增得到一条1822bp的特异性片段。20001000图3-3染色体步移扩增得到的启动子片段Fig.3-3Promoterfragmentamplifiedbychromosomewalking3.3.RoDREB2C基因启动子克隆以提取的杜鹃‘胭脂蜜’DNA为模板，克隆得到了1743bp的RoDREB2C基因启动子序列（图3-1）。20001000图3-4RoDREB2C基因启动子扩增结果Fig.3-4PCRproductsofRoDREB2Cgenepromoter32 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析3.4.启动子序列分析我们对RoDREB2C基因启动子进行顺式作用元件预测分析，结果如表：表3-2启动子顺式作用元件预测Table3-2Promotercis-actingelementprediction作用元件序列功能位置ElementSequenceFunctionLocation-337~-351CNNGAANNTTcis-actingelementinvolvedinHSE-418~-432高温响应CNNGheatstressresponsiveness-1598~-1608作用元件CCAAT--903~-909CAACGGMYBHv1bindingsitebox-1525~-1531cis-actingelementinvolvedin逆境响应TC-richATTTTCTTCAdefenseandstress-1077~-1087元件repeatresponsiveness-66~-72-274~-281CACGTG/TACG-462~-468GTC/TACGTG/cis-actingelementinvolvedin-502~-511ABREGCAACGTGTC/theabscisicacid-504~-510ACGTGGC/ACresponsiveness-504~-513ACGTGGC-506~-512-738~-744cis-actingelementinvolvedinCe3GACGCGTGTC-325~-335ABAandVP1responsiveness激素响应cis-actingregulatoryelement-272~-277CGTCA-作用元件CGTCAinvolvedintheMeJA--1071~1076motifresponsiveness-1493~-1499cis-actingregulatoryelement-272~-277TGACG-TGACGinvolvedintheMeJA--1071~1076motifresponsiveness-1493~-1499GCCTTTTGAG-1173~-1184P-boxgibberellin-responsiveelementT/CCTTTTG-1176~-1183GARE-TCTGTTGgibberellin-responsiveelement-160~-167motifTCA-cis-actingelementinvolvedinCCATCTTTTT-1377~-1386elementsalicylicacidresponsiveness33 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3-5启动子顺式作用元件预测注：//：启动子5’端缺失位点;ATG:起始密码子Fig.3-5Promotercis-actingelementpredictionNote://：Promoter5"-enddeletionsite;ATG:initiationcodon34 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析3.5.5’缺失启动子表达载体构建3.5.1.5’缺失启动子片段克隆以克隆得到的RoDREB2C基因启动子PCR产物为模板，设计引物通过PCR扩增的方法来扩增一系列不同长度5’端缺失启动子片段。根据其序列长度分别命名为pRoDREB2C-1、pRoDREB2C-2、pRoDREB2C-3、pRoDREB2C-4、pRoDREB2C-5、pRoDREB2C-6（扩增缺失片段的右引物均为RoDREB2C-R1。左引物分别对应为RoDREB2C-F1、RoDREB2C-F2、RoDREB2C-F3、RoDREB2C-F4、RoDREB2C-F5、RoDREB2C-F6。每条引物5’均引物5’端引入线性化克隆载体末端同原序列，以便后期目的片段与载体连接）。在1%琼脂凝胶电泳得到大小与目的片段一致的条带（图3-6），初步证明成功克隆不同长度的5’缺失启动子，其片段长度分别为：-1542bp,-1212bp,-1158bp,-747bp,-353bp,-136bp。Mp1p2p3p4p5p620001000750500250100图3-6不同长度5’端缺失启动子的克隆Fig.3-6Thedifferentlengthof5’-deletionpromoter3.5.2.5’缺失启动子表达载体构建选用pCAMBIA1391z质粒载体，检测其序列只有唯一一个Eco1酶切位点，用Eco1酶单酶切该载体，通过一步缝合法将RoDREB2C基因系列缺失启动子构建到pCAMBIA1391z表达载体上。转化大肠杆菌DH5α后，PCR检测挑选阳性克隆，获得与目的片段大小一致的条带（图3-7），证明不同长度5’端缺失启动子驱动的GUS报告基因的遗传表达载体构建成功。35 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文Mp1p2p3p4p5p620001000750500250100图3-7不同长度5’端缺失启动子表达载体的构建Fig.3-7Thedifferentlengthof5’-deletionpromoter：HSE：CCAAT-box：TC-richrepeat：ABRE：CE3图3-8启动子表达载体示意图Fig.3-8Deletionpromoterplasmidschematicrepresentation3.6.农杆菌介导的proRoDREB2C::GUS表达载体转化拟南芥将不同长度的RoDREB2C基因启动子片段融合GUS报告基因的表达载体转化野生型拟南芥，通过热激法转化根癌农杆菌（GV3101），获得Kan，Rif双抗的单菌落，经PCR鉴定条带与目的片段大小一致。选取初花期的长势良好的拟南芥植株，以未插入目的片段的原始pCAMBIA1391z载体为空白对照，用已制备好的带有目的基因的农杆菌对其花序进行侵染。侵染后在适宜的环境下培养拟南芥，约3周后收取成熟种子。对收取的种子进行消毒处理后，播撒于筛选培养基上，约2周后观察拟南芥是否生根，生根的植株即为转基因拟南芥。筛选转基因植株并将其移植到营养土中，在25℃，长日照（16h/8h）条件下培养，以备后续实验。36 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析3.7.转proRoDREB2C::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS染色分析待转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥生长30d后，选择长势较好的拟南芥植株采取植株莲座叶进行GUS染色，分别以pCAMBIA1391z转基因拟南芥和野生型拟南芥为阳性、阴性对照。在转化植株中，我们看到叶片有明显的GUS染色反应（叶片上有蓝斑），pCAMBIA1391z转基因拟南芥叶片也有变蓝现象，野生型拟南芥未见蓝色，结果表明RoDREB2C基因启动子具有活性。ABC图3-9转基因拟南芥植株叶片GUS染色注：A:非转基因拟南芥；B:转pCAMBIA1391z::GUS基因拟南芥；C:转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥Fig.3-9StainingofGUSintheleavesoftransgenicArabidopsisplantsNote:A:non-transgenicArabidopsis;B:pCAMBIA1391z::GUStransgenicArabidopsis;C:proRoDREB2C::GUStransgenicArabidopsis选取长势较好的转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥，进行高温（37℃）处理，在不同处理时间点（0h，4h，8h）分别采取植株莲座叶进行GUS染色，以野生型拟南芥作为对照。我们可以看到，随着高温处理时间的增加，转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥的GUS染色反应的蓝色颜色更深，表明该基因启动子高效响应高温胁迫，在高温胁迫的诱导下启动下游基因表达。37 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ABCDEF图3-10转基因拟南芥植株叶片响应高温胁迫的GUS染色注：A:高温处理0h的非转基因拟南芥;B:高温处理4h的非转基因拟南芥;C:高温处理8h的非转基因拟南芥;D:高温处理0h的转proRoDREB2C::GUS拟南芥;E:高温处理4h的转proRoDREB2C::GUS拟南芥;F:高温处理8h的转proRoDREB2C::GUS拟南芥Fig.3-10StainingofGUSintheleavesoftransgenicArabidopsisplantsinResponsetoHighTemperatureStressNote:A:Non-transgenicArabidopsistreatedfor0hathightemperature;B:Non-transgenicArabidopsistreatedfor4hathightemperature;C:Non-transgenicArabidopsistreatedfor8hathightemperature;D:ProRoDREB2C::GUStransgenicArabidopsistreatedwithhightemperaturefor0h;E:ProRoDREB2C::GUStransgenicArabidopsistreatedwithhightemperaturefor4h;F:ProRoDREB2C::GUStransgenicArabidopsistreatedwithhightemperaturefor8h;在拟南芥生长的不同时期（2片真叶期、4片真叶期）选取长势较好的转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥，进行高温（37℃,4h）处理，将拟南芥幼苗全株浸泡在GUS染液中进行GUS染色，以野生型拟南芥作为对照。结果如图所示，经过高温处理的拟南芥幼苗被GUS染液染成蓝色，而野生型拟南芥植株未变色。我们得出，该基因启动子响应高温胁迫的表达在拟南芥幼苗期便产生反应。这一结果表明我们在后续进行GUS染色及酶活性分析实验中，可以选择拟南芥任意生长时期的植株材料，为后续探明启动子功能实验奠定基础。同时我们观察到全株均被染成蓝色，进一步我们将探究该启动子的组织特异性。38 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析ABCD图3-11转基因拟南芥植株幼苗期响应高温胁迫的GUS染色注：A:两片真叶期非转基因拟南芥;B:四片真叶期非转基因拟南芥C:两片真叶期转基因拟南芥;D:四片真叶期转基因拟南芥;Fig.3-11StainingofGUSoftransgenicArabidopsisplantsinResponsetoHighTemperatureStressatSeedlingStageNote:A:Non-transgenicArabidopsisat2trueleafstage;B:Non-transgenicArabidopsisat4trueleafstageC:TransgenicArabidopsisat2trueleafstage;D:TransgenicArabidopsisat4trueleafstage;3.8.转proRoDREB2C::GUS拟南芥的组织特异性分析待转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥生长30d后，取长势较好的拟南芥植株进行高温（37℃,4h）处理，以高温处理0h的转基因拟南芥为对照，取转基因拟南芥的叶片、茎段、根、花序、荚果等不同组织部位，分别进行GUS染色。实现结果如图3-11显示，转proRoDREB2C::GUS拟南芥的叶片、茎段、根、花序、荚果均变为蓝色，且经过高温处理的转基因拟南芥的GUS染蓝更深，说明该启动子在拟南芥植株的根、茎、叶、花序、荚果等不同部位中均有表达，且分别都高效响应高温胁迫。39 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文叶片茎根花序荚果leafstemrootinflorescefruitnce无处理高温处理F图3-12转基因拟南芥植株不同组织部位GUS染色Fig.3-12StainingofGUSinthedifferenttissuesitesoftransgenicArabidopsisplants3.9.转proRoDREB2C::GUS拟南芥响应激素诱导的GUS染色分析3.9.1.ABA处理待转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥生长4d后，挑选长势较好的带有两片真叶的拟南芥移植1/2MS培养基，喷洒100μmol/L的ABA溶液，盖上培养皿的盖子，抑制ABA溶液挥发，在2h,4h,8h,24h时间点取样，每个时间点取样3棵拟南芥幼苗，以0h不做激素处理为对照，进行GUS染色后，如图3-13我们观察得到，转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥响应ABA激素诱导，并随着处理时间的增加，GUS染色反应蓝色变深。图3-13ABA激素处理后的转基因拟南芥植株GUS染色Fig.3-13StainingofGUSoftransgenicArabidopsisplantstreatedwithABAhormones40 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析3.9.2.PEG处理待转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥生长4d后，配置20%PEG6000溶液，均匀平铺在培养基上，隔夜待培养基充分吸收激素后，挑选长势较好的带有两片真叶的拟南芥移至培养基。盖上培养皿的盖子，抑制激素挥发，在8h,24h,48h时间点取样，每个时间点取样3棵拟南芥幼苗，以0h不做处理为对照，通过GUS染色后，结果如图3-14：转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥响应PEG激素诱导，并GUS染色反应的蓝色随着时间的推移而变化，呈一个先变深后变浅的趋势，在24h达到蓝色最深。图3-14PEG激素处理后的转基因拟南芥植株GUS染色Fig.3-14StainingofGUSoftransgenicArabidopsisplantstreatedwithPEGhormones3.9.3.GA3、SA、MeJA处理待转proRoDREB2C::GUS基因拟南芥生长4d后，将长势较好的两片真叶大小拟南芥移至培养基，分别喷洒200μmol/LMeJA、70μmol/LGA3、200μmol/LSA，在8h,24h时间点取样，以0h不做激素处理为对照。经过染色后结果如图3-15显示，MeJA、GA3、SA处理后的拟南芥幼苗有一定程度的变蓝，但随着处理时间的增长其蓝色程度变化不明显，说明MeJA、GA3、SA对该启动子有一定的诱导作用，但是最优诱导时间还有待进一步实验的探索。41 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文MeJAGA3SA图3-15MeJA、GA3、SA激素处理后的转基因拟南芥植株GUS染色Fig.3-15StainingofGUSoftransgenicArabidopsisplantstreatedwithMeJA/GA3/SAhormones3.10.5’缺失启动子表达载体融合GUS的转基因拟南芥GUS分析3.10.1.转proRoDREB2C1/2/3/4/5/6::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS染色分析待转基因拟南芥生长30d后，选取长势较优的转proRoDREB2C1/2/3/4/5/6::GUS拟南芥进行高温（37℃）处理，在0h,4h,8h时间点采取拟南芥叶片进行GUS染色。结果表明，不同长度的启动子片段在高温作用下其GUS均有受到诱导42 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析表达而变蓝的趋势，但其蓝色的深浅有些许差异，proRoDREB2C1::GUS随着高温处理时间的增长而蓝色变深；proRoDREB2C2::GUS在4h时蓝色变深，8h时蓝色变浅，但均比0h未处理的转基因拟南芥的GUS蓝色要深；proRoDREB2C3::GUS的蓝色变化趋势与proRoDREB2C1::GUS相同，也是随着处理时间的增长而变深；proRoDREB2C4::GUS在4h时GUS染蓝颜色最深，8h时颜色变浅；proRoDREB2C5::GUS的GUS染色反应我们可以看到，其GUS染色随着时间变化而蓝色变深，但在未经高温处理的转基因拟南芥GUS染色纵向比较中其蓝色最深，说明该启动子在未处理时即拥有较强的启动子活性；proRoDREB2C6::GUS在4h时GUS蓝色最深，经过纵向比较其他不同缺失启动子片段转基因拟南芥的GUS染色反应，其蓝色最浅。这一系列的比较结果说明，该启动子中含有响应高温胁迫的顺式作用元件，具体位置还需GUS酶活性定量分析实验来进一步研究验证。43 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文proRoDREB2C1::GUSproRoDREB2C2::GUSproRoDREB2C3::GUSproRoDREB2C4::GUSproRoDREB2C5::GUSproRoDREB2C6::GUS图3-165’缺失启动子转基因拟南芥植株响应高温胁迫GUS染色Fig.3-16StainingofGUSof5’-deletionpromotertransgenicArabidopsisplantsrespondtohightemperaturestress44 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析3.10.2.转proRoDREB2C1/2/5/6::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS酶活性分析待转基因拟南芥生长30d后，选取长势较优的转proRoDREB2C1/2/5/6::GUS拟南芥植株，进行高温（37℃）处理，在0h,4h,8h时间点采取拟南芥叶片进行GUS酶活性测定，结果如图所示：转proRoDREB2C1::GUS拟南芥植株在0hGUS酶活性极低，而在高温处理后迅速响应胁迫诱导而调控下游基因的表达，其酶活性迅速上升，并随着高温处理的时间推移而酶活性升高，在8h达到最高；转proRoDREB2C2::GUS拟南芥植株的酶活性同样在4h时响应高温的诱导，但在8h时其酶活性有一个下降的趋势。而转proRoDREB2C5::GUS拟南芥植株在零点时即有较强的GUS酶活性，这一结果去前期GUS染色结果不合，在高温处理4h时酶活性降低，而8h时又重新呈现上升趋势。转proRoDREB2C6::GUS拟南芥植株的GUS酶活性同样也会响应高温胁迫，在4h时其GUS酶活性达到最高值，而到8h时酶活性呈现下降的趋势。高温处理时间图3-17转proRoDREB2C1/2/5/6::GUS拟南芥响应高温胁迫的GUS酶活性分析Fig.3-17AnalysisofGUSEnzymeActivityinResponsetoHighTemperatureStressoftransgenicArabidopsisplantswithproRoDREB2C1/2/5/6::GUS4.总结与讨论提高杜鹃的逆境耐受能力是杜鹃抗性育种中非常重要的任务之一，目前对于杜鹃的抗逆性研究多数集中在干旱（周媛等2017）、低温(Pengetal2008a,Pengetal2008b)等方面，而关于耐热方面的研究的相关报道较少(Fangetal2017,Shen2017,45 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文Zhao2018)。DREB类转录因子在植物抗逆过程中起到重要作用，它能够与干旱响应元件或DRE元件结合，调控基因表达。在DREB2A转录因子的协助下，热激转录因子HsfA3同时受热和干旱诱导，因此DREB类转录因子也可正向调控植物耐热性。而目前国内外关于DREB类转录因子的报道大多数为耐盐抗旱相关的研究(Zhouetal2012,Dongetal2017)，对于它们在高温条件下的相关研究甚少。本研究从杜鹃耐热性入手，挖掘杜鹃耐热基因，探究DREB类转录因子RoDREB2C在杜鹃高温胁迫下的表达情况，分析其启动子功能，为杜鹃耐热研究奠定基础。在本研究中，我们克隆得到了1743bp启动子片段，分别构建5’端缺失启动子融合GUS表达载体，转化模式植物拟南芥研究该启动子的功能。通过启动子功能分析实验得到如下结论：1.该启动子高效响应高温胁迫，为高温诱导型启动子，且不具有组织特异性；2.该启动子响应不同激素诱导，其诱导调控机制有待进一步研究；3.该启动子5’缺失表达载体均响应高温胁迫诱导，其诱导表达受到多个调控元件共同作用，关键元件筛选还有待进一步实验研究讨论。4.1.TAIL-PCR技术克隆侧翼未知序列众所周知，对于一些已经完成了基因组测序的植物，如水稻、拟南芥等，我们可以从数据库中找到目标基因的启动子序列。然而，对于大多数植物而言，我们尚未获得它们的基因组序列，如杜鹃。因此我们需要采用染色体步移技术来扩增靶基因侧翼的未知序列。Zhang等（2012）采用I-PCR和TALL-PCR方法从棉花中克隆得到了线粒体atpA双拷贝基因的侧翼序列，Li等（2005）利用LA-PCR技术扩增得到山葡萄VCH3基因上游的1216bp启动子序列。而这些传统的染色体步移方法都有操作复杂，非特异性扩增，连接效率低等弊端。我们采用TaKaRaGenomeWalkingKit试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等优点。Li等（2007）结合接头PCR技术和TAIL-PCR技术克隆获得了SlCMO基因上游的2204bp的启动子序列。Chen等（2007）采用TAIL-PCR方法克隆得到了小麦GLP3基因上游的1748bp的启动子序列。在本研究中，我们采用该方法克隆得到了RoDREB2C基因启动子1743bp的特异性片段，但经过测序验证后我们发现该序列存在个别碱基错配现象，这可能是由于不同物种的基因组大小、复杂性存在差异，这种差异可能影响到未知序列的克隆准确性。杜鹃属于木本植46 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析物，未知序列的克隆较之于禾本科植物或草本植物的未知序列克隆而言存在一定的难度。4.2.RoDREB2C基因启动子高效响应高温诱导通过RoDREB2C基因的启动子序列的生物信息学分析的结果，我们了解到该启动子除了含有基本核心元件TATA-box、CAAT-box之外，同时还含有一些响应逆境的调控元件，其中包括我们所关注的响应高温胁迫的热胁迫响应元件（HSE）。转基因植株在未进行任何处理时即可观察到较浅的GUS蓝色，这表明该基因的启动子本身就具备一定的启动GUS表达的活性。而在经过高温处理后，RoDREB2C基因启动子高效响应高温胁迫而染色变蓝，且随着高温处理的时间增长而颜色变深，由此我们可以判断该启动子是高温诱导型启动子。在前人的报道中我们得知，RoDREB2C基因的同源基因AtDREB2C的过表达可以提高拟南芥的耐热性(Limetal2007)，是拟南芥的热激反应过程中HsfA3的转录激活剂(Chenetal2010)，同时，该基因的启动子受高温胁迫诱导，其GUS染色在生长组织的脉管系统中增强(Chenetal2012)。这些研究充分说明DREB2C类转录因子在提高植株耐热性上具有重要的意义，而我们所筛选的RoDREB2C基因作为DREB2C类转录因子，其启动子高效响应高温胁迫，在杜鹃耐热研究中发挥重要作用。而在Chen等（2012）的研究中，拟南芥DREB2C的近端启动子区域在热胁迫下具有组织特异性，仅在不同分生组织的脉管系统中表达。而在本实验中，转基因拟南芥的各个组织部位（根、茎、叶、花、荚果）均受到高温诱导表达，不存在组织特异性。这可能是因为35S启动子的组成型表达，导致外源蛋白在转基因拟南芥体内积累。4.3.RoDREB2C基因启动子响应激素诱导在应答元件的预测中，我们发现大量高效响应ABA诱导的ABRE元件，在ABA处理下，proRoDREB2C::GUS高效响应ABA的诱导而启动下调基因表达，这一实验结果验证了ABA在DREB类转录因子诱导调控中起到很重要的作用，与前人的大量研究一致(Sunetal2009,Guptaetal2013,Upadhyayetal2017)。在元件预测结果中，我们并未找到响应PEG激素的作用元件，但是在PEG激素诱导GUS染色实验中，我们同样检测到了GUS染蓝的现象，我们推测在该启动子序列中可能含有尚未被鉴定的PEG响应元件。而Yang等（2017）的研究中PEG可诱导47 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ThDREB基因的表达，为我们的推测提供了一些依据。而通过GA3、SA、MeJA激素处理，GUS染色也有变蓝的现象，同样验证了该启动子的GA响应元件、SA响应元件、MeJA响应元件在启动子诱导表达过程中发挥诱导作用，而GA在DREB类转录因子诱导表达中通常其负调控作用(Lietal2017)，这与本实验结果不符。有关GA对RoDREB2C基因启动子的正向诱导调控机制还有待进一步分析和探索。4.4.RoDREB2C基因5’缺失启动子响应高温诱导本研究对转5’端缺失启动子基因拟南芥进行高温处理，测定转基因拟南芥的GUS活性，来探究启动子响应高温的片段范围。学术上很多人利用这种方法研究启动子功能，如李燕（2012）通过对5’端缺失启动子的GUS活性测定筛选了紫花苜蓿MsZFN基因启动子的核心区域。根据前人的研究报道，随着启动子5’端长度的删除，启动子的GUS活性会逐渐增强或减弱(Wangetal2009)，但是在我们所构建的5’端缺失启动子片段的GUS活性却不符合这一规律。在GUS染色实验中我们发现，不同长度5’端缺失启动子的染色程度有一定的深浅变化，随着片段长度的减小，其中各个片段的颜色变化程度不一，并不完全随着片段长度的减少而降低，我们推测可能在该启动子中可能还存在其他负调控元件。而转proRoDREB2C6::GUS基因拟南芥的GUS染色反应颜色明显比proRoDREB2C5::GUS较浅，通过顺式作用元件分析我们发现，在300bp左右位置有一个HSE元件及ABRE元件，在两个元件的共同作用下可以高效响应高温胁迫的诱导，从而缺失该区域的proRoDREB2C6::GUS启动子片段不具备这样的高效响应诱导的作用。而进一步在GUS酶活性定量测定中我们发现，proRoDREB2C5::GUS表达载体在非胁迫条件下，其GUS酶活性比胁迫条件下要高，这与染色结果不合。由于实验过程中，转proRoDREB2C3::GUS、proRoDREB2C4::GUS基因拟南芥在栽培过程中存在结实率过低等现象，我们未曾获得足够的阳性苗进行GUS酶活性测定，后续研究中还需补充该部分数据，进一步探讨5’端缺失启动子片段的诱导活性，缩小该启动子关键调控元件所在区域范围。4.5.启动子在植物基因工程中的应用启动子作为功能基因组学的研究工具及转基因育种的材料工具应用于植物基因工程中。其中，组成型启动子在这两方面的应用都已经有一段历史并己经取得了一定的成就，而组织特异性和诱导型启动子近年来才逐渐被重视和应用。近年来，在48 杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析CaMV35S启动子下的棉花GhNAC2的过表达改善了拟南芥和棉花的根生长并提高了转基因棉花和拟南芥耐旱性(Gunapatietal2016)。Wei等（2016）从拟南芥中分离出来CBF1/DREB1B基因并导入到CaMV35S启动子控制下的丹参中，提高了转基因丹参的耐旱性；而Li等（2018a）用组成型CaMV35S启动子驱动的马铃薯ScCBF1和StCBF1基因转化拟南芥，提高了植株的抗寒性和耐旱性。而组成型启动子的驱动外源基因在转基因植物的整个生长周期和所有组织中都表达，即具有持续性，不表现时空特异性，也不受外界因素诱导。这不仅造成了能量上的浪费，还会对植株本身造成伤害，如产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响。而以上这些问题在组织特异型启动子和诱导型启动子中可以得到改善，RD29A基因启动子属于胁迫诱导型启动子，植物体只有在受到胁迫时，该启动子才会驱动下游目的基因的表达。RD29A启动子驱动的HhERF2和PeDREB2a基因在干旱和高盐胁迫的诱导下，棉花植株的耐受性提高(Lietal2016)。Kang等（2016）分别构建CaMV35S和RD29A启动子调控Ta-Ub2基因表达载体，转化短柄草植物，其组成型启动子调控的表达对转基因短柄草短柄草的生长表现出轻微的生长抑制；而胁迫诱导型启动子调控的Ta-Ub2的表达使该抑制最小化。Kongm等（2016）发现使用胁迫诱导型启动子RD29A驱动的转基因烟草植株表现出与野生型（WT）相似的表型，而其耐旱性增强了。RD29A启动子的这种胁迫诱导型表达策略可以使35S组成型启动子对转基因植物表型的不可预见的影响达到最小化。而在本研究中，我们采用CaMV35S启动子驱动RoDREB2C基因表达，由于其不具有时空特异性，而造成了一定的能量浪费。随着植物基因工程的逐步发展，我们对启动子的活性特征要求也越来越严格，从组成型启动子到诱导型启动子，同时还要求在某些器官或组织表达，而在另外一些组织或器官不表达，这也为启动子的鉴定工作提出了更高和更严格的要求。因此在后续的研究中，我们可以通过构建胁迫诱导型RD29A启动子驱动RoDREB2C基因表达载体，进一步将35S组成型启动子对转基因植物表型的影响以及能量的浪费达到最小化。5.展望通过本研究我们发现，杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子在高温胁迫的诱导下高效调控下游基因的表达，提高模式植物拟南芥的耐热性。若将该启动子转化杜鹃属其他不耐热品种，是否会有同样的诱导表达结果？这是我们进一步需49 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文要研究的问题。而在本实验中，我们预测筛选得到了很多响应逆境和激素的顺式作用元件，而这些元件对该基因启动子的诱导调控机制是多元且复杂的，进一步筛选核心作用元件，探究其调控机制，可以缩减起到关键调控作用的启动子功能区大小，有利于表达载体转化效率的提高，可以高效、精准的提高植物耐热性。本研究筛选得到了高效响应高温的耐热基因，通过启动子功能分析，该启动子在高温胁迫下诱导下游基因表达，提高模式植物的耐热性，从而为提高杜鹃的耐热性奠定了基础；通过激素诱导启动子表达分析，探索启动子响应激素诱导的表达特性，为外源激素诱导耐热基因表达提供了理论依据；通过对启动子关键元件的筛选，缩小启动子核心区域，为将来克隆超级启动子应用于基因工程中打下良好基础，有利于高效精准的提高植物耐热性。通过这一系列对耐热基因的启动子研究，阐明了启动子响应高温的分子机制，为杜鹃的耐热基因的挖掘提供了理论依据，继而通过基因工程或分子辅助育种等技术对现有杜鹃园艺品种进行遗传改良，有利于杜鹃产业的抗逆性提高，使得更多的杜鹃品种可以应用于园林造景中，给我们的城市更增添一份色彩。50 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杜鹃‘胭脂蜜’耐热基因RoDREB2C启动子克隆及功能分析致谢光阴似箭，岁月如梭，时光匆匆在你我身上留下了深深的烙印，而这些烙印化作回忆必将陪伴我们余生。转眼，研究生两年的学习即将接近尾声，而这两年短暂的时光，却是我青春岁月里最为珍贵的两年。首先，我要感谢我最敬爱的两位老师——王彩云老师和周媛老师。读研是我迄今为止最幸运的事，我很幸运可以成为两位导师的学生。感谢两位老师在科研上对我谆谆不悔的教导，在生活上对我无微不至的关怀。曾几何时，我还是个对科研什么都不太懂的小姑娘，两位老师带我参加了中国观赏园艺学术年会，带我开始走进了科研这个世界，体会到了科研的魅力。这两年来，两位老师督促我学习文献，不断提升着我的科研思维。从开题到论文撰写，两位老师都给出了许多的宝贵的指导意见。犹记得深夜看到办公室还亮着的灯，那是王老师还在帮助我们修改论文；犹记得在我论文修改期间，周老师不辞辛苦的一次一次的及时回复我的邮件，给予我关注和鼓励。于我而言，两位老师不仅仅是科研上的导师，同时也是我的亲人和挚友。一直以来，两位老师在生活中予以我关心和爱护，在我状态不佳时予以我支持与鼓励，也是这些鼓励与关心，一直支撑着我克服一切困难，努力做个优秀的更好的科研人。其次，我要感谢在我开题、中期、答辩过程中对我予以了众多宝贵意见的产祝龙教授、刘国锋教授、王文恩研究员、胡惠蓉副教授、傅小鹏副教授、张俊卫副教授、宁国贵副教授、何燕红副教授。感谢您们对我论文的指导和帮助，是你们宝贵的建议启发了我，让我更进一步的完善我的课题研究和论文撰写。在读研期间，我也很幸运的拥有了两个大家庭——园林楼424大家庭和林果所大家庭。感谢424大家庭的罗靖老师和郑日如老师在我课题研究遇到困难时对我的指导和帮助，感谢胡昊师兄、李进进师姐、李伽文师兄、付瀚森师兄、于璐师姐、陈雨师姐、王艳丽师姐、丁海琴师姐、任胜景师姐、刘博琪师姐，肖玮、王焕、胡诗洋、罗婷婷、彭玲愿，邓慧杰师弟、资宏师妹、谢静师妹、王育瑶师妹、张通师弟在实验技术、研究思路等方面对我的帮助和关心，在生活上共同创造了一个幸福的424大家庭，给了我家的温暖，让我的生活充满了欢声笑语。同时也感谢林果所的方林川博士对我课题的指导，我很幸运科研路上有这样一位尽职尽责的师兄带领向前。从选题到实验技术再到论文撰写，我都离不开方师兄的帮助和指导。我还记得我因为实验失败而难过，是师兄跟我说“没关系，不过是重头再来。”；我还记得我课题遇到瓶颈，是师兄陪我讨论解决方案到凌晨；我还记得实验上遇到了麻63 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文烦，是师兄不厌其烦的帮我答疑解惑；我还记得……我还得很多很多，无数的片段在我的脑海，这些都深深的感动着我，影响着我，让我在实验上遇到困难时得以坚持、不放弃；让我在难过时得以走出阴霾；让我努力的想成为和师兄一样，坚持学习、认真工作、敢于突破、不断进取的人。还要感谢的是林果所大家庭的王燕老师、徐冬云高工、毛静博士、童俊高工、董艳芳农艺师、章馨、付田静、王攀、李佩璇等人在生活和实验中对我的照顾和帮助，共同创造了林果所这个温馨的大家庭，让我的生活充满了阳光。还要感谢室友郑紫君、王言、张群，同学欧阳佳伟、梁柱、付光晟、戴冬等在生活中对我包容和关照，让我的研究生生涯充实而美好。最后我要感谢父母二十多年以来对我的养育，是你们对我无条件的支持让我得以勇敢向前，面对一切的困难，努力成为你们心中的骄傲。衷心的感谢所有的老师、亲人、朋友们，遇见你们，是一场最美丽的邂逅，祝福大家一切都好，平安幸福。杨婧瑜2018年6月于华中农业大学64