蜂蜜对糖尿病大鼠创面愈合的影响及初步探讨 68页

AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectsofHoneyApplicationonWoundHealingandPrimaryStudyofDiabetesRatsByShuyingYangSupervisor：Prof．YanShanNursingCollegeMay,2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日 摘要蜂蜜对糖尿病大鼠创面愈合的影响及初步探讨目的研究生杨淑盈导师单岩教授郑州大学护理学院郑州450052糖尿病足是糖尿病患者致残致死的一个重要原因。蜂蜜是一种较为古老的皮肤创面敷剂，大量研究表明蜂蜜可以促进多种创面愈合，具体机制尚不清楚。皮肤溃疡中上皮及新生血管的生成是皮肤溃疡愈合的重要过程，在糖尿病皮肤溃疡的病理愈合过程中，创面局部血管内皮生长因子的活性下降，表皮生长因子表现为受抑制状态。本课题旨在于探讨局部应用蜂蜜在糖尿病创面愈合中的作用，并进一步阐述其可能的作用机理，为糖尿病创面的临床护理提供依据。方法1．将造模的63只大鼠随机分为三组：对照组、糖尿病组、蜂蜜组，四氧嘧啶诱导糖尿病组、蜂蜜组大鼠发生糖尿病，大鼠背部制造面积为2．56cm2的全皮层皮肤创面。对照组与糖尿病组大鼠创面外涂抹凡士林；蜂蜜组大鼠创面外涂抹蜂蜜。2．观察三组大鼠的创面愈合时间和创面面积的变化。3．分别于治疗后第7天、14天显微镜下观察创面组织形态的变化。4．观察创面成纤维细胞数量、表皮生长因子及血管内皮生长因子表达的情况。所有数据进行统计学分析。 郑州大学硕士学位论文齄里二日禾1．对照组创面愈合时间与蜂蜜组相比缩短，蜂蜜组创面愈合时间与糖尿病组相比缩短(P<0．01)；重复测量方差分析结果显示：三组在处理主效应上差异有统计学意义(PO．05)。4．各时间点糖尿病组创面成纤维细胞数量低于蜂蜜组(P<0．01)，第7天对照组与蜂蜜组创面成纤维细胞数量无统计学差异(P>O．05)，第14天对照组创面成纤维细胞数量高于蜂蜜组(P<0．01)。5．各时间点糖尿病组表皮生长因子的表达均低于蜂蜜组(P<0．01)。第7天对照组和蜂蜜组表皮生长因子表达无统计学差异(尸>0．05)；第14天对照组表皮生长因子阳性表达高于蜂蜜组(P<0．05)。结论1．四氧嘧啶(120mg／Kg)单次腹腔注射，可建立稳定的糖尿病大鼠模型，控制血糖水平在12"---16mmol／L对于模型的稳定有重要作用；这种制作模型的方法操作简单，可重复性强，可用来进行进一步实验。2．糖尿病大鼠皮肤创面局部应用蜂蜜治疗，可以缩短创面愈合的时间，改善创面情况，促进成纤维细胞增殖。3．糖尿病大鼠皮肤创面局部应用蜂蜜治疗，可增)3111},J面组织中早期血管内II 摘要皮生长因子的表达，血管内皮生长因子在促进创面组织早期血管形成及血管内皮细胞分裂增殖方面有重要作用。4．糖尿病大鼠皮肤创面局部应用蜂蜜治疗，可增NO,I面组织中表皮生长因子的表达。表皮生长因子在促进成纤维细胞增殖、增加创面组织中胶原合成方面有着重要意义，提示蜂蜜的治疗作用与蜂蜜促进表皮生长因子的表达有关。关键词蜂蜜糖尿病足溃疡血管内皮生长因子表皮生长因子III AbstractEffectsofHoneyApplicationonWoundHealingand．ObjectivesPrimaryStudyofDiabetesRatsPostgraduate：ShuyingYangSupervisor：Prof．YanShanNursingCollegeofZhengzhouUniversityZhengzhou，450052Diabeticfootisanimportantreasonformaimingandkillingofdiabeticpatients．Honeyisanancientwounddressing．Researchshowsthathoneycanpromoteavarietyofwoundhealing．andthespecificmechanismisunknown．Alargenumberofexperimentsshowthattheformationofnewbloodvesselsandepithelializationisabasicprocessofwoundhealing．Intheprocessofdiabeticulcerhealing，VEGFexpressionisinsuppressionstate，theactivityofepidermalgrowthfactorisdecreasedandthenumberissmall．Thisprojecttoexploretheroleoftopicalapplicationofhoneyindiabeticwoundhealing，andobservetheeffectsofhoneyfortreatmentofdiabeticwounds，discussesthemechanismofthisanionandtoprovidemorescientificbasisfortheclinicalapplicationandpromotion．Methods1．Theratswererandomizedintothreegroups：controlgroup、diabetesmellitusgroupandhoneygroup．Aroundfull．thicknessskinwoundof2．56cm2wascreatedonV 郑州大学硕士学位论文thebacksofrats．2．Vaselinewasdaubedontheskinwoundoftheratsofdiabetesmellitusgroupandcontrolgroup．Honeywasdaubedontheskinwoundoftheratsofhoneygroup．3．Thewoundsitesweremeasuredafter7daysand14daystohistologicallyobservethehealingprocessandmeasuredthehealingrate．4．TheFBproliferationwasevaluated．Furthermore，theexpressionofVEGF、EGFweredetermined，alldatawasanalyzedbythesoftwareofSPSSl7．0．ResuitsI．Thehealingtimewassignificantlyshortenedinthehoneygroupcomparedwithdiabetesgroupandshortenedinthecontrolgroupcomparedwithhoneygroup(P<0．01)．Repeatedmeasurementanalysisofvarianceshowed：Themaineffectsoftreatmentwerestatisticalsignificancebetweenthreegroups(P<0．01)，abovevariablesweredifferentwiththechangeoftreatmengwithoutconsideringtime．Themaineffectsoftimeeffectwerestatisticalsignificancebetweenthreegroups(P<0．01)，abovevariablesweredifferentwiththechangeoftimewithoutconsideringtreatmenf．2．Thehistomorphologicalobserved：thefibroblastscanbeseeninthecontrolgroup，collagenarrangedinneatrOWS，alargenumberofcapillariescanbeseeninthedermis．Thetypicalulcerorganizationstructurecanbeseeninthediabetesgroup．Cellarrangementischaoticandthestructureofgranulationtissueisloose．TheneovascularizationiSfew．Asmallamountofnecrotictissueontheulcersurfacecanbeseeninthehoneygroup．Comparedwiththediabeticgroup，inflammatorycellsreducedsignificantly,thenecrotictissueshedearily,woundedgecellscreepinglineappearedearlier．3．Ateachtimepoint，thepositiveexpressionofVEGFincontrolgroupwashigherthanthehoneygroup俨<0．05)；onday7，theexpressionofVEGFinthehoneygroupwashigherthanthediabetesmellitusgroup(尸<0．05)．onday14，TheexpressionofVEGFbetweenthehoneygroupanddiabetesmellitusgroupwasnosignificantdifference(P>0．05)．4．Ateachtimepoint，theFBproliferationrateindiabeticgroupwaslowerthanVI Abstractthehoneygroup(P<0．01)，onday7，thedifferenceofFBproliferationwasnostatisticalsignificancebetweencontrolgroupandhoneygroup俨>0．05)，onday14，theFBproliferationwashigherinthehoneygroupcomparedwithdiabetesmellitusgroup(P<0．01)．5．AteachtimepointtheexpressionofEGFofdiabeticgroupwaslowerthanthehoneygroup(P<0．01)，onday7，thedifferenceofexpressionofEGFwasnostatisticalsignificancebetweencontrolgroupandhoneygroup(P>0．05)，onday14，TheexpressionofEGFinthehoneygroupwashigherthanthediabetesmellitusgroup(P<0．05)．Conclusions1．Thedosageofalloxantocreateadiabeticratmodelshouldbe120mg／kgbyintraperitonealinjection，andtokeepthemodelalive，thebloodsugarlevelshouldbekeepatarangeof12-16mmol／L；Thismethodwithgoodreproducibilityissimpleandcanbeusedforfurtherexperiments．2．HoneycouldacceleratewoundhealingandpromoteFBproliferationindiabeticrats．3．HOneycanincreasetheexpressionofVEGFinthediabeticwoundissueinearly．VEGFplaysanimportantroletopromoteendothelialcellproliferationandearlywoundtissueangiogenesis．4．ThetopicalapplicationofhoneyCanincreasedtheexpressionofEGFinthediabeticwoundtissue．ThispromptthatthetreatmenteffectofhoneyisrelatedwiththepromotionoftheexpressionofEGF,EGFhasanimportantsignificanceinpromotingFBproliferationandincreasethesynthesisofcollagenfibersinthewoundtissue．KeywordsHoneyDiabeticfootulcerVEGFEGFⅥI 目录中英文缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I蜂蜜对糖尿病大鼠创面愈合的影响及初步探讨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11研究背景与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12研究目的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．33相关概念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2实验药物及试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．3实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一72．1糖尿病大鼠模型的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2血糖管理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．3糖尿病大鼠背部全皮层皮肤创面模型的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．4创面处理方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．5实验取材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．6观测指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．7质量控制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．8伦理原则⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．9资料处理与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16 1糖尿病大鼠模型的制作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162创面愈合时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16‘3创面愈合面积⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯174大体组织观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯185组织形态学观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯196VEGF图像平均灰度值测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．217创面成纤维细胞增殖状态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯228EGF表达的结果观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．241糖尿病动物模型的建立及观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242糖尿病大鼠创面的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243蜂蜜及糖尿病创面愈合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．1糖尿病创面与感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2蜂蜜与创面愈合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯264蜂蜜作用于糖尿病创面的效果评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯274．1血管内皮生长因子与糖尿病创面愈合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯274．2表皮生长因子与糖尿病创面愈合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯295蜂蜜外敷治疗的优点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．296问题与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57 中英文缩略词对照表ALXDMDFSTZEGFVEGFFGFIGFMRSAICH叩mAPGrhEGFFBODd1d3d7d14d21alloxandiabetesmeUitusdiabeticfootstreptozotocinepidermalgrowthfactorvascularendothelialgrowthfactorfibroblastgrowthfactorsinsulin-likegrowthfactorsmethicillin—resistantstaphylococcusaureUSimmunohistochemistryrevolutionsperminuteautologousplatelet—richgelrecombinanthumanepidermalgrowthfactorfibroblastopticaldensityday1day3day7day14day21四氧嘧啶糖尿病糖尿病足链脲佐菌素表皮生长因子血管内皮生长因子成纤维细胞生长因子胰岛素样生长因子耐甲氧西林金黄色葡萄球菌免疫组织化学每分钟转速自体富血小板凝胶重组人表皮生长因子成纤维细胞光密度用药后第1天用药后第3天用药后第7天用药后第14天用药后第21天 引言蜂蜜对糖尿病大鼠创面愈合的影响及初步探讨1研究背景与意义研究生杨淑盈导师单岩教授郑州大学护理学院郑州450052国际糖尿病联盟2005年第4届“世界糖尿病日"宣布：全球糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者2025年将发展到3．3亿11】，2030年，糖尿病患者将上升达3．66亿【2。。由糖尿病引起的各种血管和神经并发症，成为迫切需要临床解决的重要问题。糖尿病足(diabeticfoot，DF)是糖尿病患者截肢甚至致死的重要原因，在西方国家糖尿病患者中，据统计约15％"--25％的患者在其某一病程阶段会并发糖尿病足溃疡【3J，糖尿病溃疡创面易并发感染且感染的创面会影响机体的免疫功能和新陈代谢。糖尿病足溃疡中约有70％的患者合并有感染【4l，在许多国家，糖尿病足是非外伤性截肢的主要原因之一，糖尿病患者因糖尿病足导致的截肢是非糖尿病患者的15倍。糖尿病足的高致残率与高发病率已经成为一个严峻的公共卫生问题。糖尿病足给患者家庭和社会医疗带来巨大的经济负担。在美国，糖尿病医疗费用中的五分之一用于糖尿病足的治疗[51，40"--"65岁之间的糖尿病足患者，两年时间内用于糖尿病足治疗的费用为28000美元【6J。国内研究显示，多数糖尿病足患者已合并有大血管、微血管病变，医疗花费较大【7】。因此促进皮肤溃疡愈合，尽快地封闭创面，是糖尿病创面治疗中的重要课题。随着对糖尿病足溃疡病理生理发展的深入和了解，有越来越多的基础研究和临床研究用于探讨更有效的创面护理方法，医护人员已从被动等待创面愈合转为主动控制加快愈合。在国外，通过创面局部应用生长因子、精氨酸等18。9J促进溃疡面愈合，临床试验中还发现血小板衍生生长因子、蛋白酶抑制剂应用于创 郑少I"1大学硕士学位论文面局部能促进肉芽组织生长并加快组织上皮化。在国内，糖尿病足创面护理局部多采用抗生素加山莨菪碱以控制感染扩散和改善局部血液循环，其它药物如胰岛素、自体富血小板凝胶(autologousplatelet．richgel，APG)1101、生长因子、生肌药物等也应用于临床，某些中药制剂的应用研究也较广泛”14】。另外，研究证明一些物理治疗方法如负压吸引115d6J也有一定的效果。1972年，Roveeti学者提出了“湿性创面愈合”理论，即创面在湿性环境中能更快的愈合，湿性环境能够加快上皮细胞增生、爬行的速度。“湿性愈合’’理论自20世纪70年代提出以来，使得一系列加速创面愈合的新型敷料问世【17之01，包括藻酸盐敷料、银离子敷料、水凝胶敷料、人工皮肤等，目前仍应用于临床。这些创面护理方法各有优缺点，创面局部应用抗生素可能会破坏创面愈合微环境的稳定性，既不利于组织的再生与修复，也可造成其它耐药致病菌甚至真菌的繁殖121】，另外可能会导致与抗生素有关的不良反应，如造成敏感菌的耐药性；新型敷料及各类生长因子价格昂贵122J；因价格、使用局限性等原因，应用皮肤组织工程学技术生产的皮肤替代物并未在临床得到广泛使用；局部应用胰岛素与血糖变化的关系、不同深度的创面与胰岛素用量的关系也需要进一步的研究；创面负压引流注意事项较多，需要专业医务工作者的指导，不适合非住院患者。考虑到医疗费用的限制和医疗资源的优化，方便、经济的治疗手段的研究和发展成为临床医护工作者的关注点。近年来，蜂蜜这种已沿用千年的伤口敷剂再一次引起医护工作者的注意。·临床试验和动物实验表明蜂蜜可以有效治疗多种类型的伤口[23-25】，可促进多种创面的愈合，包括头颈部术后伤口、烧伤创面、静脉曲张溃疡和感染创面、腿部溃疡、恶性溃疡等。在国内，蜂蜜应用于压疮、静脉输液外渗、静脉炎【z州、慢性皮肤溃疡f271、慢性感染性伤口128‘29】。用在糖尿病足溃疡的研究多是经验介绍和病例分析，未见系统严谨的随机对照实验。研究观察到蜂蜜对伤口的作用有：加速慢性创面愈合；清创、清除感染性伤口的病原微生物；祛除异味。蜂蜜具有清创抗菌的作用是因为蜂蜜的pH值较低，渗透性高，含有多种挥发性物质如醇类，成分中还有少量的溶菌酶，蜂蜜可以通过其成分中少量的过氧化氢激活机体免疫系统，目前的研究表明蜂蜜能刺激单核细胞，增加细胞因子的生成，活化中性粒细胞、刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞有丝分裂来清除感染。而其促进伤口愈合的机制目前尚不明确。糖尿病创面难愈合的机制目前仍不十分明确，创面局部组织细胞尤其是成2 引言纤维细胞的代谢异常，导致创面局部微环境紊乱，打破生长因子种类与数量的平衡状态，最终引起创面局部组织的代谢障碍及感染的发生。此一系列的病理过程导致糖尿病足溃疡等慢性创面愈合过程受到阻碍，创面表现为停滞于愈合过程某一阶段的病理性愈合状态。伤口愈合包括炎症期、肉芽组织增生期和修复期，在这个过程中，有大量的生长因子及介质参与其中，研究表明，创面局部血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)的含量相对较少是糖尿病溃疡创面难愈合的一个重要原刚30】，相关研究也证实糖尿病溃疡VEGF的表达与正常皮肤VEGF表达相比处于低水平【31】。研究发现，与非糖尿病足溃疡相比，糖尿病足溃疡创缘中上皮细胞EGF缺乏【32l，创面中EGF的合成减少会在一定程度上阻碍创面的愈合。VEGF在血管生成中起重要作用，能够加速血管内皮细胞聚集进而加快糖尿病创面的愈合，VEGF的生物学效应具体体现在能持续刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导糖尿病创面血管、淋巴管的形成。EGF的作用主要有：刺激体内组织细胞分裂、促进细胞增殖，并且能够促进细胞基质的合成与沉积，EGF能加速细胞增殖、加快上皮再生、迁移以及促进血管形成。因此我们试图通过研究蜂蜜对糖尿病大鼠创面VEGF及EGF表达的影响初步探讨蜂蜜治疗糖尿病溃疡的机制。2研究目的本课题旨在于根据糖尿病足的病理特点和蜂蜜的生物学作用，探寻有效、经济的糖尿病创面护理方法，为糖尿病足患者尤其是居家糖尿病足患者提供一种经济方便的创面护理方法。在四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠创面模型中，探讨局部应用蜂蜜在糖尿病创面愈合中的效果，观察对照组、蜂蜜组及糖尿病组的血管内皮生长因子、表皮生长因子及成纤维细胞的表达情况，阐述其可能的作用机理，为临床应用提供依据。本研究拟进行以下几个方面的工作：(1)糖尿病皮肤溃疡大鼠模型的建立：(2)探讨蜂蜜对糖尿病大鼠创面愈合的效果；(3)观察三组大鼠创面成纤维细胞、血管内皮生长因子及表皮生长因子的表达情况，进一步阐述蜂蜜促进创面愈合可能的作用机理，为糖尿病足溃疡的临3 郑少I"1大学硕士学位论文床护理提供依据。3相关概念3．1糖尿病足糖尿病足(diabeticfoot，DF)：(1999年WHO定义)糖尿病患者因合并神经病变和各种不同程度的末梢血管病变而导致下肢的感染、溃疡形成和(或)深部组织破坏。其临床主要表现为足部溃疡与坏疽。’3．2溃疡溃疡(ulcers)：(2004年《糖尿病足国际临床指南》定义)溃疡分为表皮溃疡和深部溃疡。表皮溃疡：皮肤全层损伤但并未伤及到真皮。深部溃疡：皮肤全层损伤并伤及到真皮层，可能还会涉及到肌肉、肌腱、骨及关节等。4 材料与方法1实验材料1．1实验动物根据多个样本均数比较时样本含量计算公式及预实验结果计算样本量，n=v2(EsiZ]K)／[E(工i-工)2／(K-1)】，a=0．05，p=0．10，1)=3-1=2，得№．05、0．10、2．00=2．52，n=【2．522×(2．02+3．72+2．12)／3]／[(24．5．26．0)2+(27．6．26．0)2+(26．1．26．o)2／(3．1)】：之o，考虑5％的模型死亡率，每组样本量21只，共需SD大鼠63只。雄性健康Sprague．Dawley大鼠63只(由河南省动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(豫)2010----0002)，体重2009左右，SPF级，大鼠在SPF级动物屏障环境饲养，饲养条件：单笼饲养，室温20～-25。C，相对湿度50％～60％，通风良好，实验动物中心配置的标准鼠料喂养。自由饮水，定量喂食，12／12h(7：00"-"19：00)昼夜规律。实验动物及其条件符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。1．2实验药物及试剂主要试剂见表2．1表2．1主要实验试剂试剂名称来源四氧嘧啶(Alloxan)10％水合氯醛生蜂蜜胰岛素注射液10％葡萄糖溶液医用凡士林血管内皮生长因子免疫组化试剂盒大鼠表皮生长因子EGF酶联免疫分析试剂盒Sigma公司上海化学试剂研究所上海草木岭食品部万邦医药江苏康宝制药有限公司杭州恒润凡士林制造有限公司北京博奥森生物技术有限公司HE染色试剂：无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、80％乙醇、75％乙醇、65％乙醇，二甲苯，1％盐酸酒精，苏木紫，伊红，液体石蜡，蒸馏水。5 郑州大学硕士学位论文1％盐酸酒精：使用495mL75％酒精和5mL浓盐酸配制。(1)伊红染色液的配置：1％伊红水溶液，采用伊红：乙酸：蒸馏水=1：0．1：100的比例配制并均匀混合。‘具体步骤：lg伊红加入烧杯，倒入少许蒸馏水，调成糊状，再倒入75％的乙醇100mL，加乙醇的过程缓慢搅拌，直到将伊红彻底溶解，此时溶液呈稍混浊样，取少许冰醋酸加入，试剂逐渐转变直至为清亮、鲜红色即可使用。(2)苏木素染色液的配置：蒸馏水500mL无水乙醇25mL冰醋酸(CH3COOH)20mL硫酸铝钾(KAI(S04)2)509苏木素2．59黄色氧化汞1．259具体步骤：先将苏木素2．59溶解于无水酒精，(也可采用事先溶解好的苏木素)，取一容积为2000mL的三角烧瓶，倒入硫酸铝钾509，加入蒸馏水，加热装置上加热，熔解硫酸铝钾，完全熔解后，待温度冷却至90℃左右时，加入溶解好的酒精苏木素，继续加热至沸腾，持续沸腾3"-"5min，此时溶液颜色逐渐变深，变为紫红色，后拔掉电源，加入黄色氧化汞1．259，待充分氧化后，重新连接电源继续加热，持续3----"5rain，此时溶液变为深紫色，拔掉电源，将三角烧瓶放入冰水里，置于黑暗处，第2天过滤后加入冰醋酸20mL，即可使用。(3)0．01M磷酸盐缓冲液PBS液的配制：蒸馏水1000mL氯化钠(NaCl)89磷酸二氢钠(NaH2P04)2．99磷酸二氢钾(KH2P04)0．39氯化钾(KCI)0．29具体步骤：取一烧杯，加入800mL蒸馏水，称取氯化钠89、磷酸二氢钠2．99、磷酸二氢钾0．39和氯化钾O．29，溶于800mL蒸馏水中，最后用盐酸调节溶液的pH值，调至7．4，加蒸馏水定容，至lL，室温下保存或4。C冰箱中保存，即可。 材料与方法病理组织取材用物有：专用防脱载玻片、盖玻片，无菌纱布、无菌手术刀，纹式血管钳、组织剪、镊子，1mL无菌注射器、2mL无菌注射器、5mL无菌注射器等。2实验方法研究类型：本实验属于随机对照的动物实验研究。7 郑州大学硕士学位论文2．1糖尿病大鼠模型的诱导SD大鼠适应性饲养1周。按体重进行编号，采用随机数字表法将大鼠分为三组：对照组(A组)20只、糖尿病组(B组)22只、蜂蜜组(C组)21只。腹腔注射给药前晚8时开始禁食不禁水12小时，次日晨8时称体重，尾静脉取血测空腹血糖。按每只大鼠的体重计算所需四氧嘧啶(alloxan，ALX)的剂量，分装四氧嘧啶，因四氧嘧啶不稳定，见光易分解，所以临用前新鲜配制且避光配置。用生理盐水将ALX配成3％的溶液，配置后于半分钟内经腹腔注入大鼠体内，B、C组大鼠按120mg／kg的剂量一次性腹腔注射四氧嘧啶13引，A组大鼠计算所需ALX剂量后，只在腹腔注射所需剂量的生理盐水。之后三组动物自由进食水，给予四氧嘧啶后4小时撤清洁水，改为自由饮用10％的葡萄糖水24小时，以防止注射四氧嘧啶后胰岛13细胞大量破坏，导致胰岛素大量释放入血，引起低血糖而致大鼠死亡。其余时间均给予大鼠标准饲料和清洁饮水。24小时内，三组大鼠尾静脉取血应用血糖分析仪密切监测血糖变化。B、C组大鼠72小时后尾静脉采血，监测空腹血糖，空腹血糖连续2次大于等于12．0mmol／L者即DM模型建立成功。有5只大鼠未达到规定血糖，腹腔注射3％的ALX120mg／kg，72h后测空腹血糖，均大于等于12．0mmol／L。糖尿病大鼠持续出现血糖升高，出现多饮、多尿、体重下降并稳定14天后制作损伤创面。腹腔注射的方法：由实验人员统一进行，大鼠剃去腹部毛发，酒精消毒腹部皮肤，每只大鼠给药部位、针头刺入角度、深度均相同、避免实验误差。大鼠腹腔注射用5mL的注射器，实验人员一手持注射器，一手抓住大鼠的尾巴并固定大鼠的颈、背部皮肤，保持大鼠头部向下的姿势，这样大鼠腹腔中的器官自然的向胸腔靠近，以小于30度角进针，注意进针不能过猛，防止注射器刺入过猛损伤腹腔器官。对于体重较小的大鼠，腹腔注射时可以将针头在腹部皮下穿行一段距离，避免刺入过深，药物注射完毕，拔出针头的同时轻轻旋转，防止漏液。2．2血糖管理实验开始至72小时，开始进行大鼠的血糖管理【34-351。血糖浓度控制目标为12---"16mmol／L(见表2．3)。当B、C组血糖浓度高于16mmol／L时应用生物合成短效人胰岛素注射液皮下注射，血糖管理的胰岛素剂量如下：血糖≤16．0mmol／L时，不给予胰岛素；16．1mmol／L、<血糖≤19．9mmol／L时，给予胰岛素4 材料与方法U／kg；20．0mmol／L≤血糖≤23．9mmol／L时，给予胰岛素5U／kg，血糖>／24mmol／L时，给予胰岛素6U／kg。表2．3皮下注射胰岛素剂量皮下注射给药方法：将药液推入皮下结缔组织，药物可以经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环。作皮下注射常选在大鼠背部或侧下腹部，本实验采用背部皮下注射。操作时，用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，将注射针头自大鼠头部向尾部的方向刺入皮下，插入颈背侧皮肤处，回抽如无回血，可将药物缓慢地注入皮下组织。注药完毕，轻轻按按针孔约1分钟，防止药液从针孔处逸出。当注入药物时，手指也可以感觉到药物是否注入皮下组织。2．3糖尿病大鼠背部全皮层皮肤创面模型的制备将B、C组大鼠与A组大鼠同时腹腔注射10％水合氯醛(0．3mL／lOOg)麻醉，固定于操作台上，剪去背毛，75％酒精消毒背部皮肤，用印章做一矩形标记，无菌条件下在鼠背中央切去边长为1．6cm、面积为2．56cm2的全皮层皮肤组织，造成1个创面深达皮下组织的伤口。干纱布压迫止血后包扎伤口，单笼饲养，自由饮水，定量喂食。2．4创面处理方法对照组创面采用生理盐水冲洗，凡士林涂抹，外覆盖无菌干纱布包扎。糖尿病组创面在同一时间生理盐水冲洗，凡士林涂抹，外覆盖无菌干纱布包扎。蜂蜜组创面在同一时间生理盐水冲洗，将蜂蜜浸渍的无菌纱布取出后覆盖整个创面，以超出创面边缘2mm为宜，外覆盖无菌干纱布包扎。蜂蜜应用前放置于无菌罐内用7线照射消毒lOmin，照射完成后无菌罐储存在室温阴凉处，使用时用蜂蜜浸渍平铺于无菌盘内的无菌纱布。实验动物单笼饲养，每日换药，直至愈合；每日记录饮水量，每周测量体质9 郑州大学硕士学位论文且里o2．5实验取材分别于创面给药后d7、d14每个时间点三组各随机取8只大鼠，在背部各取部分创缘组织，所有标本制成1．0cmx2．0cm的组织块，置于4％多聚甲醛液中固定，12小时后室温梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋，切片机制成4微米的石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察创面新生血管生长及肉芽组织的改变；切片免疫组织化学染色，光镜下观察并测定大鼠局部创面血管内皮生长因子的表达情况；大鼠背部各取部分创缘组织，在无菌生理盐水中清洗1分钟，用滤纸吸干组织上的水份，电子天平称取15mg组织，按照10mg／0．5mL的比例加入事先配置好的PBS液，放入匀浆机匀浆15分钟，至组织成均匀一致的悬浊液后倒入试管，离心机中以2000r／min的转速离心20分钟，取上清液置于．80℃低温冰箱，保存待测。2．5．1苏木精一伊红染色(hematoxylin—eosinstaining，HE染色)步骤(1)取大鼠背部组织块，经4％甲醛固定后，用流水冲洗，将组织块依次放入30％乙醇1小时_50％乙醇l小时_70％乙醇l小时一85％乙醇l小时卅5％乙醇l小时一无水乙醇l小时中脱水，经透明、浸蜡，石蜡包埋，制成4urn厚的切片；(2)切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇水洗：二甲苯(I)15分钟一二甲苯(II)15分钟一二甲苯：无水乙醇=1：12分钟一100％乙醇5分钟_95％的乙醇5分钟—80％乙醇5分钟—75％乙醇5分钟一蒸馏水5分钟；(3)苏木素染色5分钟，流水稍洗去苏木精液1---"3秒；(4)1％盐酸乙醇lO秒(提插数下)，稍水洗10"-"30秒；(5)饱和碳酸锂液体浸泡10分钟，稍水洗10--一30秒；(6)蒸馏水过洗1～2秒；(7)1％伊红液染色1"-"3分钟；(8)蒸馏水稍洗1．-一2秒；(9)95％乙醇(I)1分钟_95％乙醇(II)1分钟一100％乙醇(I)1分钟一100％乙醇(II)1分钟一石碳酸二甲苯5分钟一甲苯(I)1分钟一甲苯(II)10 材料与方法1分钟；(10)中性树脂封固；(11)显微镜下观察：观察创面坏死组织脱落情况、肉芽组织及新生上皮组织形态学变化；(12)图象采集。2．5．2免疫组化染色步骤(1)切片脱蜡：二甲苯(I)20分钟一二甲苯(II)脱蜡20分钟；(2)切片依次入100％乙醇(I)5分钟一100％乙醇(II)5分钟-95％乙醇5分钟—90％乙醇5分钟—80％乙醇5分钟—．70％乙醇5分钟；(3)水洗5分钟，0．01MPBS洗三次、每次5分钟；(4)用新配置的3％H202室温，孵育30分钟，封闭内源性过氧化物酶；(5)水洗，入0．01MPBS洗三次、每次5分钟；(6)滴加正常血清封闭，室温，30分钟；(7)滴加第一抗体，4。C冰箱过夜；(8)0．01MPBS，洗三次，每次5分钟；(9)滴加二抗，室温，10分钟；(10)0．01MPBS洗三次，每次5分钟；(11)滴加三抗，室温，10分钟；(12)0．01MPBS洗三次，每次5分钟；(13)DAB显色，室温，5～30分钟，随时镜检(DAB用时新配)；(14)自来水洗5分钟；(15)苏木精染5分钟；(16)1％盐酸酒精，分化数秒一自来水洗；(17)氨水反兰后自来水洗；(18)依次入70％乙醇2分钟q0％乙醇2分钟_90％乙醇2分钟_95％乙醇2分钟一100％乙醇(I)5分钟一100％乙醇(II)5分钟一二甲苯(I)5分钟一二甲苯(II)5分钟；(19)中性树胶封片；(20)VEGF的表达：显微镜下观察并采集图像。 郑州大学硕士学位论文2．5．3ELISA法检测步骤(1)试剂配制：将试剂及组织匀浆上清液样品置于室温下(20～25℃)进行温度平衡；计算试剂用量，样本与标准品进行双份实验；(2)稀释：用20倍蒸馏水将浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液；(3)加样：取96孔的酶标包被板，将其固定于操作架上，分别设计空白对照孔、标准品孔和待测样本孔，注意标记各孔位置，在标准品孔中按照浓度顺序依次加入标准品各50uL；按照样本稀释5倍的要求，待测样本孔中先加入组织液10uL，再加样本稀释液40uL；空白对照孔不加，每次取样更换枪头防止污染。(4)温育：放入37℃恒温箱中，温育30分钟；(5)洗板：甩去液体并在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置30秒，弃去洗涤液并在吸水纸上拍干，再次加满洗涤液，如此重复洗涤2次并拍干；(6)加酶标液：每孔加入酶标液50uL(空白对照孔除外)；(7)温育：放入37℃恒温箱中，温育30分钟；(8)洗板：重复步骤(5)的内容，洗板后拍干；(9)显色：按照标准品孔、待测样本孔和空白对照孔的顺序依次加入，每孑L先加入显色剂A液50uL，再加入显色剂B液50uL，注意枪头不能污染包被板，加入后操作台上轻轻摇动30秒至均匀，37。C恒温箱内避光显色15分钟；(10)终止：取出酶标板，在每孔分别加入终止液50uL终止反应；(11)OD值：需在终止后30分钟内进行，以空白对照孔为基准调零，用450nm波长测量各孔的吸光值即OD值；(12)计算：根据标准品浓度及对应的OD值，求出标准曲线的直线回归方程，再依据样本的OD值，在方程上求出对应的样品浓度，最终浓度的确定是以稀释倍数乘上测定浓度。2．6观测指标(1)血糖检测：糖尿病模型制作成功后每周两次同一时间点各组尾静脉取血测定血糖浓度；(2)创面愈合时间：观察上皮完全覆盖创面所需要的时间：(3)创面愈合面积：使用无菌薄膜覆盖并记录创缘，将无菌薄膜复印至一12 材料与方法标准纸张上，剪取标记纸片，电子天平称量剪取纸片的质量并称量1．0cm2标准纸片重量，两者相比计算创面面积大小，计算三组创面愈合面积，创面愈合面积=最初测量创面面积一未愈合创面面积；(4)创面组织学改变：在糖尿病皮肤创面模型制作后d7、d14三组大鼠各随机取8只，在背部各取部分创缘组织，所有标本制成1．0cmx2．0cm的组织块，置于4％多聚甲醛液中固定，12小时后室温梯度酒精脱水，二甲苯透明后用石蜡进行包埋，切片机制成4微米的石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察创面新生血管生长及肉芽组织的改变；(5)创面成纤维细胞(fibroblast，FB)增殖状态：各组大鼠d7、d14的创面组织石蜡切片，HE染色，200倍光镜下观察，每张以一点为中心，上下左右取5个视野记录成纤维细胞数量。(6)创面血管内皮生长因子(VEGF)表达的测定：切片免疫组织化学染色，光镜下观察并测定大鼠局部创面血管内皮生长因子的表达情况；(7)创面表皮生长因子(EGF)表达的测定：分别于创面治疗后的d7、d14每个时间点三组各随机取8只大鼠，大鼠背部各取部分创缘组织，无菌生理盐水漂洗1分钟，用滤纸吸干组织上的水份，电子天平称取15mg组织，按照10mg／0．5mL的比例加入事先配置好的PBS液，放入匀浆机匀浆15分钟，至组织成均匀一致的悬浊液后倒入试管，离心机中2000r／min转速离心20分钟，取上清液，·ELISA法测定局部EGF的表达。2．7质量控制(1)本研究采用的实验动物均由河南省动物实验中心提供，保证实验动物的质量。(2)标准环境下饲养动物，大鼠均饲养于动物实验室通风笼具中，使用大鼠专用饲料进行饲养，保持室内温度恒定于20～25。C，相对湿度50％～60％。(3)动物饲养及整个研究过程由研究者本人全程参与，保证各组间的一致性。(4)正式实验前，对于动物造模方法、药物剂量、用药时间等进行预实验，熟练掌握建立动物模型的方法及技巧后，进行正式实验。(5)实验过程中的观察数据按时收集，仪器及时校准。资料录入后进行多13 郑州大学硕士学位论文次核对，保证数据的真实性和准确性。2．8伦理原则‘参照科技部2006年9月13日颁布的《关于善待动物的指导意见》。(1)科学、合理、人道的使用实验动物，遵循“减少、替代、优化"的原则。(2)在大鼠饲养管理过程中，定期对大鼠进行观察，发现异常行为，及时采取有针对性的措施予以改善。(3)在实验过程中，遵循“温和保定，善良抚慰，减少痛苦和应激反应”的原则，尽量减少实验动物的痛苦。(4)在处死动物时对大鼠实施安死术。2．9资料处理与分析全部数据两人整理核对，数据输入计算机，随机抽取10％的录入数据与原始资料进行比对，确保数据输入准确，应用SPSS17．0软件包进行统计分析，计量资料用均数±标准差(X±S)表示，组间资料若满足正态性且方差齐时采用单因素方差分析，两两组间比较用LSD法，非正态数据采用秩和检验，重复测量资料采用重复测量方差分析。检验水准为a=0．05。14 材料与方法3技术路线15 郑州大学硕士学位论文1糖尿病大鼠模型的制作仕甲当日禾72小时后当动物血糖浓度大于等于12mmol／L时，可认为糖尿病模型制作成功，不同创面处理方法大鼠血糖浓度的变化见图3．1。／-、一＼名吕0趔鞭鲁实验初d3d7d14图3．1不同创面处理方法的三组大鼠血糖浓度的变化2创面愈合时间皿对照组口糖尿病组虽蜂蜜组表3．1不同创面处理方法大鼠皮肤创面愈合时间的比较(i±S)组墨9倒数垒金吐阊(鱼2￡对照组419．30±1．30糖尿病组蜂蜜组6526．00±2．2038．373<0．00121．00±1．60注：P0．05)，不同组创面愈合情况随时问变化是一致的；组别效应有统计学意义(P<0．001)，即不考虑时间因素，处理方法不同的大鼠创面愈合面积有差异；时间效应有统计学意义(P<17 郑州大学硕士学位论文0．001)，即不考虑处理因素，创面愈合面积随时间的变化有变化。结果见表3．2，图3．3。2．521．510．5Odld7d14d2l+对照组+糖尿病组十蜂蜜组图3．3不同创面处理方法的三组大鼠创面愈合面积的比较4大体组织观察对照组的大鼠体重逐渐增加，毛发细密光亮，皮下脂肪较厚；创面干燥，基底红润，肉芽组织生长旺盛，有部分肉芽组织生长高出周围正常皮肤平面；上皮细胞爬行较快，创缘收缩明显，与其它两组相比愈合时间最短。-糖尿病组的大鼠糖尿病症状明显，呈现典型的多饮，多尿，多食，体重减轻，毛发杂乱、无光泽，皮肤及皮下脂肪变薄；创面不干燥，有脓性分泌物，基底呈暗红色。第3天，个别创面揭起纱布后可见坏死组织；坏死组织脱落时间与对照组及蜂蜜组相比明显延长；第7天，肉芽组织较少，可见散在的肉芽组织生长；第14天观察见伤腔填充缓慢，新生上皮较少，创缘收缩不良；伤后28天后才全部愈合。蜂蜜组的大鼠糖尿病症状没有明显改善，与糖尿病组相比创面较干燥、红润，分泌物有所减少，无脓性分泌物。大鼠皮肤缺损创面形成3天后，可见创面面积缩小，创面仅有少量坏死组织，无脓性渗出液；第7天后创面进一步变浅，肉芽组织生长，溃疡底部肉芽组织比较新鲜；第14天时创面继续收缩，边缘新生上皮生长明显，创面面积明显缩小；伤后第18天时，创面边缘整齐，蜂 结果粼2；掣22≯垂戮骥攀egh渊橐i掣鬻黑k图3．4不同时间点三组大鼠创面变化情况注：a，b，C，d分别是对照组d1，d7，d14，d21的图片，e，f，g，h分别是糖尿病组d1，d7，d14，d21的图片，i，j，k，1分别是蜂蜜组d1，d7，d14，d21的图片。5组织形态学观察对照组：d7，镜下可见胶原排列整齐、规则，细胞数量增多，排列整齐，主要为成纤维细胞、内皮细胞，真皮层可见大量毛细血管；d14，表皮增厚，真皮层增厚，创面胶原排列致密，成熟度高，细胞数量明显增多，表皮细胞层次清晰，细胞排列整齐，主要为成纤维细胞、内皮细胞，毛细血管增生多。糖尿病组：d7，镜下可见典型的溃疡组织结构，细胞排列紊乱，有坏死组织，可见毛细血管，但与对照组和蜂蜜组比，糖尿病组肉芽组织结构疏松，新生血管形成明显减少，表皮细胞数量明显较少，炎症细胞较多；d14，肉芽组织生长情况与对照组和蜂蜜组相比，糖尿病组有少量肉芽组织生长，组织较薄，结构19骥黧雾鬻d辫一∥獭。懒警．$誊．§c一橐b攀$舞※羞ii％孽a攀瓣黪鬓溢啊霜黼嘲◇錾a攀 郑州大学硕士学位论文稀疏，成熟度较低，真皮下毛细血管增生较少。蜂蜜组：d7，镜下可见创面表层有少量坏死组织，创面底部可见肉芽组织生长，与糖尿病组相比，炎症细胞明显减少，创缘细胞出现较早，创面成纤维细胞、内皮细胞数量较多，肉芽组织密度及新生血管形成情况都优于糖尿病组；d14，可见创面底部有明显肉芽组织增生，肉芽组织较致密，创面表皮细胞爬行，与糖尿病组比较，胶原排列较整齐，成熟度高。成纤维细胞数量明显增多，见图3．5。A≮◆◆BC图3．5HE染色观察不同时间点三组大鼠组织形态学表现(X200)注：A，a分别是对照组d7，d14的图片；B，b分别是糖尿病组d7，d14的图片；C，c分别是蜂蜜组d7，d14的图片 结果6VEGF图像平均灰度值测定表3．3大鼠创面血管内皮细胞生长因子平均灰度值(i±S)注：P<0．05为差异有统计学意义三个处理组VEGF平均灰度值之间差别有统计学意义，进一步两两比较，第7天，蜂蜜组的VEGF阳性表达高于糖尿病组(P=O．040)，对照组的VEGF阳性表达高于蜂蜜组(P=O．042)，对照组的VEGF阳性表达高于糖尿病组(P<0．001)；第14天，蜂蜜组的VEGF阳性表达与糖尿病组差异无统计学意义，(P=O．623)，对照组的VEGF阳性表达高于蜂蜜组(P=O．047)，对照组的VEGF阳性表达高于糖尿病组(P=0．016)。见表3．3，图3．6。ABCabC图3．6免疫组化染色观察不同时间点三组大鼠VEGF表达结果(X200)注：A，a分别是对照组d7，d14的图片：B，b分别是糖尿病组d7，d14的图片；C，C分别是蜂蜜组d7，d14的图片21 郑州大学硕士学位论文7创面成纤维细胞增殖状态表3．4不同创面处理方法大鼠创面1713增殖状态的比较(一X±S)注：P<0．05为差异有统计学意义三个处理组FB平均数量之间差别有统计学意义，迸一步两两比较，第7天，蜂蜜组的FB数量高于糖尿病组(P<0．001)，对照组与蜂蜜组的1713数量差异无统计学意义(P=0．358)，对照组的FB数量高于糖尿病组(P