基于代谢组学技术的蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学研究 93页

广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________基于代谢组学技术的蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学研究姓名：刘武平学号：2111540046院系：药科学院学位类型：学硕专业：药物分析研究方向：中药代谢组学导师：芮雯副教授论文提交日期：2018年5月20日论文答辩日期：2018年5月17日学位授予单位：广东药科大学二〇年5月 广东药科大学硕士研究生学位论文Studyonthepharmacodynamicsofcharacteristiccomponentsofhoney-processedastragalusbasedonmetabolomicsCandidate：LiuwupingStudentID：2111540046Affiliation：GuangdongPharmaceuticalUniversityAcademicDegreeApliedfor：MasterofMedicineSpeciality：PharmaceuticalAnalysisSupervisor：ProfRuiWenAssistantSupervisor：Prof.ChenhongyuanDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversity 广东药科大学硕士研究生学位论文 广东药科大学硕士研究生学位论文基于代谢组学技术的蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学研究摘要中医理论认为临床常用中药黄芪蜜炙可增强其补中益气、升阳固表等作用，从而广泛用于脾肺气虚、中气下陷之证。课题组前期的蜜炙黄芪干预脾气虚证大鼠药效学实验表明蜜炙品较生品能更好的改善模型组大鼠的气虚体征和生理生化指标。并通过黄芪蜜炙前后的化学成分研究发现毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I的含量均有所增加，因此将这三种成分确定为蜜炙黄芪炮制特征成分。本研究应用代谢组学技术进行上述炮制特征成分的药效学研究，并结合网络药理学探讨其作用机制。方法：通过劳倦伤脾加限制饮食的造模方法建立脾气虚证大鼠模型。考察黄芪甲苷，黄芪皂苷I和毛蕊异黄酮苷对脾气虚证大鼠体征，白细胞数、淋巴细胞数和细胞因子等生理生化指标的影响；应用基于UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR的血清和尿液代谢组学筛选药效相关的标记物和代谢通路，并评估蜜炙黄芪炮制特征成分的药效；采用网络药理学的方法筛选蜜炙黄芪炮制特征成分的潜在作用靶点。结果：（1）淋巴细胞数、白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、血清D-木糖吸收值及体征得分在脾气虚证大鼠中显著的降低I 广东药科大学硕士研究生学位论文（P<0.05）说明脾气虚证模型构建成功。（2）黄芪甲苷，黄芪皂苷I和毛蕊异黄酮苷干预脾气虚证大鼠可显著改善其气虚体征得分、D-木糖吸收值、脾指数和胸腺指数，提高脾气虚证大鼠的淋巴细胞数、白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量。同时使脾气虚证大鼠细胞因子IL-6和TNF-α的表达降低而IFN-γ表达升高。经毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷干预后的大鼠脾指数、胸腺指数和血常规相关指标的恢复程度优于皂苷I；黄芪甲苷抑制TNF-α和IL-6的表达，促进IFN-γ的表达作用优于其它特征成分。（3）血清代谢组学分析筛选出18个药效相关的潜在标记物，主要为磷脂类和胆碱类物质，如溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱等；尿液代谢组学分析筛选出23个药效相关的潜在标记物，主要为氨基酸类物质，如丝氨酸、肌酸酐、马尿酸、犬尿酸等。血清和尿液中共同筛选的标记物为左旋肉碱。标记物主要涉及的代谢通路是色氨酸代谢通路，三羧酸循环，苯丙氨酸代谢，花生四烯酸代谢，甘油磷脂代谢，氨基酸代谢等。蜜炙黄芪及炮制特征成分均能恢复上述标记物的含量且接近正常组水平，其中蜜炙黄芪组>毛蕊异黄酮苷组>黄芪甲苷组>黄芪皂苷I组。（4）网络药理学研究共筛选了29个炮制特征成分的潜在作用靶点，其中黄芪甲苷有7个，黄芪皂苷I有12个，毛蕊异黄酮苷有10个。这些靶点分别为MIF、ALDH2、AMH、DNMT1、MAPK14等。经靶标代谢分析发现其与蛋白合成，能量代谢，色氨酸代谢，炎症反应和脂质代谢有关。II 广东药科大学硕士研究生学位论文结论：蜜炙黄芪炮制特征成分具有改善脾气虚证的作用且能通过调节细胞因子的免疫应答来提高脾气虚证大鼠的免疫功能。其作用机制与调控花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢提高机体的免疫功能，调控色氨酸代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢促进机体能量供应和蛋白合成有关。毛蕊异黄酮苷调控的靶点主要参与蛋白合成，能量代谢和嘌呤代谢途径；黄芪甲苷和皂苷I调控的靶点主要参与炎症反应与氨基酸代谢。基于UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR的代谢组学结合网络药理学和相关生物信息学分析方法为蜜炙黄芪及其特征成分的药效研究提供了新的思路。关键词：蜜炙黄芪；UPLC-Q-TOF/MS；1H-NMR；代谢组学；多元统计分析；标记物III 广东药科大学硕士研究生学位论文STUDYONTHEPHARMACODYNAMICSOFCHARACTERISTICCOMPONENTSOFHONEY-PROCESSEDASTRAGALUSBASEDONMETABOLOMICSABSTRACTBackground:ThetheoryoftraditionalChinesemedicinebelievesthathoney-processedastragaluscanenhanceitstonifyQieffectsandYangeffects,thusisutilizedtoreplaceastragaliradixinthespleenandlungQideficiency,thedepressionofmid-Qisyndrome.Inourpreviouspharmacodynamicsstudy,theresultsshowedthatthehoney-processedastragaluscouldimprovethephysicalsigns,physiologicalandbiochemicalindexesofthespleenQideficiencybetterthantherawastragalus.TheastragalosideIV,astragalusIandisoflavonesglucosidewasdeterminedasthecharacteristiccomponentsofhoney-processedastragalusonbasisofthechemicalcharacterizationofcompoundsinrawandhoney-processedAstragalus.Inthisstudy,weappliedthemetabolomicscombinationwithnetworkpharmcologyforevaluatingthepharmacodynamicsofcharacteristiccomponentsinhoney-processedastragalusandexploringitsmechanism.IV 广东药科大学硕士研究生学位论文Methods:SpleenQideficiencyratmodelwasestablishedbyfatigueandrestricteddiet.ApplicationthephysiologicalandbiochemicalindexesinratsforinvestigatingtheefficacyofastragalosideIV,astragalusIandisoflavonesglucoside.Theserumandurinemetabolomicsbaseonultra-performanceliquidchromatographyquadrupoletime-of-flightmassspectrometry(UPLC-Q-TOF-MS)andnuclearmagnetic(1H-NMR)wereappliedtomonitorthebiomarkersandpathwaysrelatedtoeffectofpharmacodynamicsandtoevaluatethepharmacodynamicsofhoney-proseccedastragalus.Networkpharmacologywasusedtoscreenpotentialtargetsofcharacteristiccomponentsofhoney-proseccedastragalusandtodiscusseitspotentialmechanism.Results:(1)Lymphocytecount,leukocytecount,erythrocytenumber,hemoglobincontent,serumd-xyloseabsorptionvalueandphysicalsignscoresignificantlydecreasedinspleenqideficiencyrats(P<0.05),whichshowedthatthespleenqideficiencyratmodelhasbeenconstructedsuccessly.(2)AfterspleenQideficiencyrattreatmentwithastragalosideIV,astragalusIandisoflavonesglucoside,theaboveindexessignificantlywereimprovedandthenumberoflymphocyte,whitebloodcell,erythrocyteandhemoglobincontentwereincreased.Meanwhile,theexpressionofcytokinesIL-6andTNF-αwasdecreasedandIFN-γwasV 广东药科大学硕士研究生学位论文increasedinratswithspleenqideficiency.AstragalosideIVinhibitstheexpressionofTNF-αandIL-6betterthanothercharacteristiccomponents,andcanpromotetheexpressionofIFN-γ.(3)18potentialbiomarkersrelatedtopharmacodynamicswerescreenoutfromserumitsmainlyphospholipidsandcholinesubstancessuchaslyso-phosphatidylcholineandphosphatidylcholine,and23potentialbiomarkerswerescreenoutfromurineitsmainlyaminoacidssubstancescontainsserine,creatinine,hippuricacid,uricacid,etc.Thesebiomarkersprimarilyinvolvedintryptophanmetabolism,thetricarboxylicacidcycle,phenylalaninemetabolism,arachidonicacidmetabolism,glycerolphospholipidmetabolismandaminoacidmetabolism.Interestingly,thecharacteristiccomponentsofhoney-proseccedastragaluscanrecoverthecontentoftheabovebiomarkersandthetrendwasclosetothenormalgroupinwhichhoney-proseccedastragaluswasclosesttothenormalgroup,followedbyisoflavoneglycosideandastragalosideIV.(4)Thepotentialtargetsof29werescreenedbythenetworkpharmacologicalanalysis,including7ofastragalosideIV,10oftheisoflavonesglucoside,and12ofastragalosideI.ThesetargetsareincludingMIF,ALDH2,AMH,DNMT1,MAPK14andsoon.ThetargetpathwaysanalysisshowedthatthesetargetswererelatedVI 广东药科大学硕士研究生学位论文toproteinsynthesis,energymetabolism,tryptophanmetabolism,inflammatoryreactionandlipidmetabolism.Conclusion:Thecharacteristiccomponentsofhoney-proseccedastragaluscanimprovethespleenqideficiencyandimprovetheimmunefunctionofspleenqideficiencyratsbyregulatingtheimmuneresponseofcytokines.Themechanismisthatregulationofarachidonicacidmetabolismandglycerolphospholipidmetabolismtoimprovetheimmunefunction,regulationoftryptophanmetabolism,tricarboxylicacidcycleandaminoacidmetabolismtopromoteenergysupplyandproteinsynthesis.Targetsofisoflavoneglycosidesweremainlyinvolvedinproteinsynthesis,energymetabolismandpurinemetabolism.TargetsofastragalosideIVandastragalosideIweremainlyinvolvedininflammationandaminoacidmetabolism.UPLC-Q-TOF/MSand1H-NMRbasedmetabolomicscombinedwithnetworkpharmacologyandbioinformaticsanalysismethodprovidedanewinsightforthestudyofpharmacodynamicsofhoney-proseccedastragalusanditscharacteristiccomponents.KEYWORDS:Honey-processedastragalus;Spleen-Qi-deficiency;UPLC-Q-TOF-MS;1H-NMR;Networkpharmacology;Biomarkers;MetabolomicsVII 广东药科大学硕士研究生学位论文目录第一章引言................................................................................................................11.1黄芪化学成分研究进展........................................................................................11.1.1多糖类成分.....................................................................................................11.1.2黄酮类成分.....................................................................................................11.1.3皂苷类成分.....................................................................................................21.1.4黄芪蜜炙前后化学成分变化.........................................................................21.2黄芪主要有效成分的药理作用研究概述............................................................31.2.1黄芪多糖药理作用.........................................................................................31.2.2皂苷类药理作用.............................................................................................31.2.3黄酮类药理作用.............................................................................................41.3代谢组学概述........................................................................................................51.3.1代谢组学研究方法.........................................................................................51.3.2代谢组学在中医药领域的应用.....................................................................81.3.3代谢组学在中药质量标准化上的应用.........................................................81.3.4代谢组学在中医病症上的应用.....................................................................81.3.5代谢组学在中药药效与新靶点研究中的应用.............................................81.3.6代谢组学展望.................................................................................................91.4研究内容和意义....................................................................................................91.4.1本研究的内容.................................................................................................91.4.2本研究的意义...............................................................................................10第二章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的药效学评价..........................122.1引言....................................................................................................................122.2实验材料..............................................................................................................122.2.1仪器与试剂...................................................................................................132.2.2实验动物.......................................................................................................132.2.3试剂配制.......................................................................................................132.3实验方法..............................................................................................................142.3.1脾气虚证大鼠模型的建立...........................................................................142.3.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学试验.......................................................15VIII 广东药科大学硕士研究生学位论文2.3.3统计学方法...................................................................................................162.4实验结果与分析..................................................................................................162.4.1脾气虚证大鼠模型评估................................................................................162.4.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学评价.......................................................182.5讨论......................................................................................................................212.6本章小结........................................................................................................23第三章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的血清代谢组学研究..............253.1引言......................................................................................................................253.2实验材料..............................................................................................................253.2.1实验药品和试剂...........................................................................................253.2.2仪器和设备...................................................................................................263.3实验方法..............................................................................................................263.3.1样品制备与溶液配置...................................................................................263.3.2动物实验.......................................................................................................273.3.3液质与核磁样品处理...................................................................................273.3.4UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR分析............................................................283.3.5数据处理.......................................................................................................293.3.6潜在生物标记物的发现和鉴定...................................................................303.4实验结果与分析..................................................................................................303.4.1血清代谢轮廓分析.......................................................................................303.4.2代谢组学数据质量评估...............................................................................313.4.3药效标记物的筛选和鉴别...........................................................................343.4.4标记物代谢通路分析...................................................................................363.4.5基于标记物分析蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学评价...........................373.5讨论......................................................................................................................393.5.1潜在生物标记物的生物学意义解释...........................................................393.5.2特征成分干预脾气虚证的作用机制探讨...................................................403.6本章小结..............................................................................................................41第四章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的尿液代谢组学研究..............434.1引言......................................................................................................................434.2实验方法..............................................................................................................434.2.1动物实验样品准备.......................................................................................43IX 广东药科大学硕士研究生学位论文4.2.2蜜炙黄芪炮制特征成分对脾气虚证治疗作用...........................................434.2.3样品采集与前处理.......................................................................................444.2.4仪器分析.......................................................................................................444.2.5数据处理.......................................................................................................454.2.6潜在生物标记物的发现和鉴定...................................................................464.3实验结果与分析................................................................................................464.3.1代谢轮廓分析...............................................................................................464.3.2代谢组学数据质量评估...............................................................................474.3.3代谢物的多元统计分析...............................................................................484.3.4生物标记物的筛选和鉴定...........................................................................494.3.5标记物的通路分析.......................................................................................514.3.6蜜炙黄芪炮制特征成分的药效评价...........................................................524.4讨论......................................................................................................................564.5本章小结..............................................................................................................57第五章蜜炙黄芪炮制特征成分的网络药理学研究..................................................595.1引言......................................................................................................................595.2实验方法..............................................................................................................595.2.1蜜炙黄芪的网络药理学研究.......................................................................595.2.2蜜炙黄芪炮制特征成分的利用度和类药性分析.......................................605.2.3蜜炙黄芪炮制特征成分的潜在靶点预测...................................................605.2.4潜在靶点的富集分析与通路注释...............................................................605.2.5网络构建.......................................................................................................605.3实验结果..............................................................................................................615.3.1黄芪的网络药理学研究结果........................................................................615.3.2特征成分的相关信息...................................................................................615.3.3特征成分的靶点预测与筛选.......................................................................635.3.4通路分析与网络构建...................................................................................645.4讨论......................................................................................................................655.5本章小结..............................................................................................................66第六章结论、创新点和展望......................................................................................676.1结论......................................................................................................................676.2创新点..................................................................................................................68X 广东药科大学硕士研究生学位论文6.3展望......................................................................................................................68参考文献..................................................................................................................69附图黄芪甲苷和毛蕊黄酮苷含量测定色谱图..........................................................76致谢............................................................................................................................78攻读硕士学位期间发表的论文....................................................................................79XI 广东药科大学硕士研究生学位论文第一章引言1.1黄芪化学成分研究进展黄芪是常用的传统中药之一，来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，主要产于我国内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地[1]。其性微温，味甘，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水退肿之功效，常用于治疗气虚乏力，血虚、半身不遂、久溃不敛、免疫失调等症状，是临床常用的一味补中益气升阳药[1]。在临床用药中，中医医师非常注重黄芪的炮制工艺。黄芪炮制方法有炒制，切制，炙制，盐制，酒炙，煮制，蜜制，醋制、辅药汁制、米汁制等多种炮制方法[2]。蜜炙黄芪是由生黄芪吸收一定的熟蜜翻炒而得。中医理论认为蜜炙黄芪能增强补中益气、升阳固表的作用，从而用于脾肺气虚，中气下陷等证。植物化学研究发现黄芪的主要成分为多糖类、黄酮类、皂苷类、氨基酸和微量元素等物质，其中多糖类、黄酮类和皂苷类成分是黄芪发挥药效作用的主要物质基础。1.1.1多糖类成分黄芪多糖是黄芪中一类生物大分子，其结构与活性的研究较为广泛，是目前研究的一个热点。目前研究发现黄芪多糖的组成主要包括杂多糖和葡聚糖，分子量在几万至几百万不等。黄芪多糖中的杂多糖种类主要包括L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖，D-半乳糖、L-核糖、D-甘露糖和葡萄糖，并含有少量的糖醛酸，而有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成，另外还有蔗糖，微量叶酸，胆碱，甜菜碱，亚油酸等[3-5]。而葡聚糖包含水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖，分别为α-（1→4）或（1→6）葡聚糖和α-（1→4）葡聚糖[5]。黄芪多糖大多数为不定形粉末，无甜味，不溶于水，少数能与水形成胶体溶液。在多糖的单糖组成实验中，常将多糖水解，水解过程中往往产生一系列的中间产物，最终完全水解为单糖。1.1.2黄酮类成分1 广东药科大学硕士研究生学位论文黄芪黄酮是黄芪的另一活性部位，根据中国学者及其它学者的研究，黄芪中的黄酮或黄酮类似物约有20几种。目前已从黄芪中分离得到的黄酮类化合物多数为黄酮，异黄酮和异黄烷三类，少数为紫檀烷类[6]。黄酮类主要有汉黄素、山奈酚、槲皮素、异鼠李素、芦丁、山奈黄素，槲皮黄苷、芹黄素、5,7-二羟基黄酮、异苷草素、熊竹素等[6]；异黄酮类主要有芒丙花素、毛蕊异黄酮、芒丙花苷、毛蕊异黄酮苷、红车轴草素、红车轴草异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，5,7-二羟基-4’-甲氧基-8-异戊烯基异黄酮、芳香膜菊素及其葡萄苷等[7]；异黄烷类主要有2’-羟基-7,3’,4’-三甲氧基异黄烷、Astraisoflavanglucoside6’-O-malonate,7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷7-O-β-D-葡萄糖苷；紫檀烷类化合物主要有3-羟基-9-甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、Licoagroside等[8]。1.1.3皂苷类成分皂苷类化合物为黄芪中最重要的有效成分，目前已分离出40多种皂苷，其中大部分以9,19-环羊毛脂烷型的四环三萜皂苷为苷元[9]。在这些皂苷中，黄芪皂苷的含量较多。皂苷是由皂苷元和糖组成，根据苷元的分类分为三萜皂苷和甾体皂苷，如黄芪皂苷I至VIII、乙酰黄芪皂苷，大豆皂苷，环黄芪苷E、F、gagroasstragalosideI-IV等[10]。皂苷的溶解度随分子的链接数目不同而发生改变，可溶于水、甲醇，乙醇，不溶于乙醚等极性小的有机溶剂，具有一定的溶血作用。1.1.4黄芪蜜炙前后化学成分变化黄芪的炮制方法有蜜炙、酒炙、蒸制等，黄芪蜜炙是常用的炮制方法。黄芪是常用的补气中药，蜂蜜具有调理脾胃，能够改善机体的免疫功能[11]。黄芪蜜炙能够温润助药，使其补中益气的效果优于黄芪生品。黄芪蜜炙是按照2015版《中国药典》炮制而成，主要过程是闷润和炒制。研究发现黄芪蜜炙后，黄酮、氨基酸、谷甾醇、胡萝卜素和浸出物等成分均有增加，总磷脂因受热分解氧化，含量降低[12]。同时，黄芪多糖经蜜炙后含量增加[13]。课题组前期对黄芪蜜炙前后化学成分进行了多元统计分析与含量测定分析，发现黄芪蜜炙后毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I的含量均有所增加[14]。因此，将毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I确定为蜜炙黄芪炮制特征成分。2 广东药科大学硕士研究生学位论文1.2黄芪主要有效成分的药理作用研究概述黄芪丰富的化学物质使其具有多种药理作用，已被广泛的应用与临床。现代药理学研究表明，目前已知的黄芪药理作用包括增强机体免疫功能、增强造血功能、改善能量代谢、抗应激、强心、调节血压、抗病毒性心肌炎、抗衰老、保肝、抗溃疡、抗癌以及美容等功效[15]。临床上常用蜜炙黄芪联合其它药物治疗缺血性心脏病、慢性肝炎、心力衰竭、心肌梗死、急性肾小球肾炎、糖尿病肾病以及病毒性心肌炎等疾病[16]。随着中医药的发展，黄芪药物的新剂型不断被创造，使得黄芪的应用不断在扩大，有利于我国中医学的发展。1.2.1黄芪多糖药理作用黄芪多糖在免疫性疾病、血液病、内分泌性疾病、心血管疾病、肾脏疾病、肿瘤等疾病方面有独特的生物活性，且细胞毒性极低，对于治疗某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病都具有良好的应用前景[17]。同时，黄芪多糖在营养、保健、护肤领域也有非常开阔的研究价值。研究发现黄芪多糖可以增加淋巴系统和骨髓干细胞的数量并使干细胞转化为有活性的免疫细胞从而增加机体的免疫力[18]；同时，黄芪多糖在提高巨噬细胞吞噬能力、自然杀伤细胞（NK）的活性、促进免疫细胞分化成熟（T细胞，B淋巴细胞等）及增加抗体的形成上具有显著的作用[19]。研究表明，黄芪水煎液灌胃小鼠能够诱导淋巴细胞产生IFN-γ（γ-干扰素），从而显著增强NK的活性[20]。在实验前期的蜜炙黄芪干预脾气虚证大鼠的药效学研究中发现对于劳倦伤脾加限制饮食构建的脾气虚模型，通过给予黄芪水提液与蜜炙黄芪水提液均能恢复大鼠的脾脏功能，增加其淋巴细胞及白细胞的数量，促进IFN-γ，IL-2等细胞因子产生，抑制IL-1，TNF-α等促炎因子的产生[21]。黄芪多糖在能量代谢的扮演着重要的角色。黄芪多糖既能升高血糖也能降低血糖，体现在对抗肾上腺素引起的血糖升高具有降低作用，而对胰岛性低血糖动物具有升高血糖的趋势[22]。黄芪多糖在高血糖引起的并发症中有着广泛的应用。同时，黄芪多糖可通过清除自由基、保护细胞结构及抗凋亡，保护肝脏等方式对细胞缺血、缺氧等损伤进行保护。1.2.2皂苷类药理作用3 广东药科大学硕士研究生学位论文皂苷类物质是天然药物研究中的一个重要领域，具有强心、抗炎、抑制胶原合成等作用。黄芪皂苷可以促进淋巴增殖及浆细胞溢出产生抗体，从而增强浆细胞的免疫应答发挥抗炎作用，并能够降低血管通透性抑制白细胞溢出，减少炎症因子IL-8、NO等产生[23]。黄芪皂苷能够抑制癌细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。黄芪皂苷与黄芪多糖都具有促进胶原降解的作用及对细胞缺血、缺氧等损伤的保护作用。黄芪皂苷主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥胶原降解作用。而黄芪多糖主要通过改善物质代谢及减少心肌局部血管紧张素Ⅱ的生成。此外，黄芪皂苷对心肌细胞具有正性肌肉作用，其中黄芪甲苷最为明显[24]。黄芪甲苷能够通过抑制钙蛋白的活性，促进钙释放，兴奋心肌细胞兴奋，增强心脏收缩及改善舒张功能[25]。目前，黄芪甲苷在心血管疾病上被广泛的研究，有望成为一种促进心肌生成干扰素的药物。黄芪皂苷对于血液系统也有一定的作用。它能对提高应激小鼠血小板内的cAMP含量，抑制血小板聚集，降低全血比粘度、血浆比粘度及红细胞压积，缩短红细胞电泳时间，在抗血栓形成发挥重要的作用[26]。徐先祥，刘青云等将黄芪总皂苷与赤芍总苷配伍发现两者对于大鼠脑血栓具有协同抗血栓作用[27]。1.2.3黄酮类药理作用目前，对黄芪黄酮类物质的研究主要集中在抗辐射损伤、清除氧自由基、调控离子通道蛋白、增强免疫、抗病毒等方面，对于细胞保护、心律失常性疾病、感染性疾病有很好的应用前景[28]。黄芪黄酮同黄芪皂苷与黄芪多糖具有对细胞缺血、缺氧、辐射等损伤的保护作用，其中黄芪黄酮对于由超氧离子、过氧化氢和紫外线引起的脂质过氧化膜损伤有显著的修复作用。黄芪黄酮主要通过清除氧自由基、保护细胞结构和抑制凋亡、保护肝脏三种方式来调节。黄芪黄酮对大鼠心肌缺血-再灌注引起的损伤具有保护作用。研究表明，黄芪黄酮能够清除大鼠心肌缺血-再灌注模型过程中产生的大量自由基，从而减轻自由基对心肌细胞的氧化性损伤实现对缺血心肌细胞的保护作用[29]。此外，黄芪黄酮不仅可以通过清除大量自由游基，还可以通过减少大鼠心肌缺血再灌注损伤中的氧化应激酶（ROS）产生，从而对缺血心肌细胞产生保护作用。汪德清，沈文梅等研究发现黄芪黄酮对过氧化氢或γ射线诱导所致的DNA链断裂损伤具有防护效果[30]。黄芪黄酮对于扑热息痛所致的肝损伤具有良好的保护效果，且与黄芪黄酮的浓度成正比[31]。黄芪黄酮类成分对免疫系统具有一定的调节作用，其能增强机体非特异性免疫功能和特异性体液免疫功能，从而降低T细胞总数，增加血液中白细胞总数，4 广东药科大学硕士研究生学位论文促进T淋巴细胞及其亚群和淋巴细胞的增殖与转化[32]。杨风华、杨勇与杨风华、康成发现黄芪总黄酮能够降低心肌细胞INa的幅度值[33,34]，延长动作电位的时程，延迟心肌细胞整流钾电流幅值[35]。因此，黄芪黄酮在大鼠心肌缺血-再灌注和氯化钡诱导的心律失常具有保护作用。1.3代谢组学概述代谢组学英文表述为Metabolomics或者Metabonomics，最早由德国植物学家Fiehn等在研究植物代谢产物的基础上提出的概念。Metabonomics主要是指定性和定量检测某一生物或细胞所有小分子量的（＜1000D）代谢产物，从而监测机体或组织中状态变化的一门科学,在药物、养生和疾病诊断研究中，一般用Metabonomics表示。其以高通量、高分辨率、高灵敏度分析技术为主要手段，如气相色谱-质谱法（GC-MS）、液质联用法（HPLC-MS）和核磁共振法（NMR）[36]。Metabolomics是英国帝国理工大学Nicholson小组根据其实验室多年来利用NMR技术研究生物体液、细胞和组织中多组分代谢物组成的工作基础上提出的，其将Metabonomics定义为机体受到病理、物理、化学等刺激或基因修饰而产生的内源性代谢物的变化[37]，在植物和微生物领域一般更多的用metabolomics一词来表示“代谢组学”，随着代谢组学的发展，两者没有特别的区分且国内学术界一般用“Metabonomics”表示代谢组学。代谢组学属于系统生物学的一部分，广泛的应用在中医药、植物学、毒理学、临床诊断、药物研发、营养科学等研究领域。代谢组学的任务为通过对机体体液（血液、尿液、汗液等）、组织、细胞中的代谢产物进行定量分析，描述机体内小分子物质的动态变化，找出代谢物与生物事件的联系，从而揭示疾病或其它事件发生变化的实质，整体性的评价机体病理状态及其变化的趋势[38]。代谢组学将人体视为一个整体的生物系统，其系统的平衡受到复杂的代谢网路调控，而代谢网络的异常体现在机体的小分子代谢产物的变化。1.3.1代谢组学研究方法与系统生物学研究一样，代谢物组学以大规模组学实验和化学计量学方法相结合为特征，代谢组学完整分析过程包括对生物样品采集和预处理、大型仪器的5 广东药科大学硕士研究生学位论文检测，数据的收集，高通量数据的统计分析整理，代谢物的定性定量分析及结论解释。1.3.1.1代谢组学样品采集和预处理代谢组学的特点之一在于内源性的小分子，这些分子相对分子量一般小于1000。其测试的样品包括血液（血浆，血清）、尿液、汗液、唾液、细胞提取液、组织、组织提取液、细胞培养液等[39]。样品的采集与预处理是代谢组学研究中的关键步骤，目前样品的收集与处理没有统一的标准，一般根据不同的研究对象、研究目的和分析手段而选取不同样品采集时间、样本来源、样本量等的提取方法，而对于样品的前处理也同样根据目的来确定[40]。课题组前期比较了乙腈、丙酮、水、甲醇和乙醇5种不同试剂与不同的比例对血清和尿液的影响。结果发现甲醇去除蛋白的效果优于其余4种试剂，且当甲醇与血清的比例为1:2时UPLC-Q-TOF/MS上的响应更强，而对于尿液样品，5种试剂去尿盐的效果不明显，而当尿液于溶剂比例为1:2时，以水为提取溶剂的样品在UPLC-Q-TOF/MS上的响应强度最好。1.3.1.2代谢组学分析工具仪器分析样品是获取内源性代谢物数据源的主要工具，主要包括色谱法（HPLC，UPLC，GC，CE）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）、FT-IR光谱、代谢分析阵列等工具[41]。其中应用最多的为色谱法、质谱法和核磁共振法（NMR）。色谱法是最常用和有效的分离分析工具，质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高效等特点被广泛使用，两者是较好的定性和定量工具[42]。随着分析仪器精密度的提高与研究目的需求，于是出现了具有更高分辨率，更高效的联用仪器。如气相色谱-质谱联用（GC-MS），液相色谱-质谱联用（LC-MS），毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等仪器。核磁共振法因具有样品前处理简单、对样品无损坏、且分析高效的特点而被研究者青睐[43]。核磁共振法包括氢谱、碳谱及相关二维谱，其中氢谱对于定性和半定量分析有一定的参考价值，碳谱及相关二维谱能够对代谢物进行鉴定识别，因此核磁共振法的代谢组学被广泛的应用在非靶向的代谢组学研究中。然而，使用单一的核磁共振仪给后续的数据挖掘带来负面影响，且无法对大批次的样品进行全面分析，因此出现了色谱与核磁联用的实验方法。1.3.1.3代谢组学数据处理与分析6 广东药科大学硕士研究生学位论文代谢组学数据挖掘是重要的一个任务，通常经过仪器检测获得的数据多为高通量的多维数据，因此需要用化学计量学方法对数据处理。主要包括1）通过仪器自带软件或其它处理工具进行匹配、校正算法对谱峰进行对齐，获取原始数据矩阵；2）对数据矩阵进行相关log转化或标准化，归一化、滤波处理，缩小样本间因代谢浓度差异引起的差异，有利于后续统计分析和解释；3）利用多元统计分析进行数据降维，找出不同样本模型之间的差异标记物。多元统计分析包括单变量的参数检验（T检验，曼威特检验）、多变量的参数检验（F检验）及模式识别分析。模式识别分析方法可分为有监督和无监督的两类，有监督模式识别是在确定样本属性的情况下，通过数学方法来建立分辨模型，并利用所建立的模型对未知样本数据进行分类和预测，此模型常用于差异标记物的筛选。有监督的模式识别包含偏最小二乘判别分析（PLS-DA）[44]，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）[45]、辨别功能分析（DFA）、支持向量机分析，神经网络、非线性回归等。无监督模式识别是在不知样本属性的情况下，根据样本在成分上的特征值进行归类，把具有相似特征的样本归在相近的空间（空间位置上比较靠近），进而通过二维和三维可视化手段直观地表现出来。此类方法包括主成分分析（PCA）[46]、聚类分析（HCA，K值聚类）和非自组织图（SOMs），目前应用最广的是主成分分析，聚类分析。4）差异代谢物的发现与鉴定。差异代谢物的发现主要通过参数检验显著性水平（P值）、PCA的相关载荷因子，PLS-DA、OPLS-DA的变量重要因子值（VIP）及权重因子，主成分相关系数等来筛选差异的标记物。而差异代谢物的鉴定则主要有精确分子式确定，标准品谱图的对比、二维图谱的比对、仪器内部数据比对和数据库比对等方式。其中数据库包含人类代谢数据库（HMDB）、麦迪逊数据库（MMCD）、METLINE数据库及脂质数据库（LIPIDMAPs）等。通过以上四部分析基本确定了引起代谢网络调控异常的代谢物，这些异常代谢物是建立疾病与生物现象的桥梁，为后续的结论解释和推断生物现象发生的本质提供物质基础。1.3.1.3结论解释筛选的差异代谢物是引起某种生物现象的重要节点，参与了体内多种代谢过程。通过代谢途径的富集分析可以筛选出一些重要的代谢途径，这些代谢途径在引起生物现象中起主要作用。结合生物信息学的方法如靶点分析及节点分析可以找出重要的代谢物节点与代谢物的相关蛋白，进而通过相关的算法与软件绘制出引起疾病的代谢调控网络图。将疾病的病理指标与代谢调控网络相结合解释疾病7 广东药科大学硕士研究生学位论文的发病机制与药物治疗的化学机制。以上的方法所得出的结论与相关文献报导结果相比较确定最终的结论。目前代谢组学的研究多为多组学的联合分析得出可靠的结果，包括代谢组学与转录组学、蛋白组学、网络药理学等其它系统生物学的多角度分析方法。1.3.2代谢组学在中医药领域的应用代谢组学的自下而上的研究思路和中医药的整体性思想是相一致的，其有利于提高我们对中医理论和中药治疗机制的认识。因此，代谢组学的发展将促进中医药的现代化。1.3.3代谢组学在中药质量标准化上的应用中药具有综合性和复杂性的特点，中药质量标准是国家或行业对中药的质量管理的重要组成部分。现行中药质量评价多以有效成分的含量为指标或者中药指纹图谱的比对与相关系数，然而检测任何一种活性成分并不能客观反映中药的整体疗效[47]。因此，代谢组学能够最大程度的从中药中提取有关化学成分信息，多组分，多指标建立中药指纹图谱，实现中药材，中成药质量标准现代化。王喜军等采用代谢组学方法和PCA等模式识别分析方法对附子及其炮制品的品质进行了评价[48]。广东药科大学芮雯教授采用代谢组学方法和多元统计学方法对广东道地药材何首乌的品质进行了质量评价[49]。还有研究基于代谢组学比较了不同人参的品质差异。1.3.4代谢组学在中医病症上的应用中医病症的诊断主要通过“望，闻，问，切”来判断，其存在一定的片面性且需要丰富的经验，往往结果不可靠。中医理论认为人是一个整体，其病症的发生是由多种因素导致且由多系统调控。而代谢组学研究的内源性代谢物一定程度上能够反映中医病症的发病机制。因此代谢组学在中医病症上得到了广泛的应用。刘武平等对脾气虚症大鼠尿样进行代谢组学分析，筛选了23个脾气虚证的病症标记物，并构建了相关代谢调控网络，并从微观角度解读了脾气虚证的科学内涵[50]。黑龙江中医药大学王喜军教授应用UPLC-MS的代谢组学结合模式识别与相关生物信息学技术，建立了立黄疸证和阴黄、阳黄证的代谢模式，并从分子水平解读了黄疸、阴黄和阳黄证候的发病机制[51]。1.3.5代谢组学在中药药效与新靶点研究中的应用8 广东药科大学硕士研究生学位论文中药成分复杂使得其在治疗疾病中发挥多成分、多系统、多靶点的作用，且成分之间相关协同或拮抗的作用，具有整体、全面、动态及多样性等特点，而这一点与代谢组学的整体性观点一致。目前，代谢组学已经成为中药药效评价的重要工具。肖满姗应用代谢组学方法评价了蜜炙黄芪水提液对脾气虚证的疗效。许国旺课题组应用代谢组学技术对小檗碱治疗糖尿病的机制进行了探讨[52]。发掘中药作用新靶点是深入理解中药治疗疾病分子机制的重要挑战。代谢组学技术为中药新靶点的发现提供了这种可能性。王喜军教授采用代谢组学方法结合生物信息学技术构建相关代谢调控网络，挖掘失眠相关的潜在标记物，发现潜在标记物与肠道菌密切相关且酸枣仁汤对这些标记物均有回调的功能，因此提出肠道菌群可能成为治疗失眠的新靶点[53]。1.3.6代谢组学展望近年来，代谢组学飞速发展，由于分析技术的局限性，单一仪器的一次分析并不能获得所有代谢物信息，而且机体的代谢时刻受周围的环境影响，因此对于存在的生物问题需要多方面进行分析，且单一代谢组学得出的结论更多的是一种推测，其可靠性不高。因此，出现了整合分析的思路，包括多仪器分析的整合（NMR、GC-MS、LC-MS），多组学数据的联合分析，不同生物样本代谢组学数据的整合，体液样本代谢组数据与细胞生物学数据及模型数据结合，代谢组学与网络药理学的整合[54]。同时，同位素标记的代谢流分析和代谢调控网络构建也渐渐在崛起。整合思路将实验结果提升到另一个高度，因此代谢组学正在往功能代谢组学与全面整合组学的方向发展。1.4研究内容和意义1.4.1本研究的内容蜜炙黄芪是由黄芪按2015版《中国药典》炮制而成的中药饮片。经炮制后其补中益气的效果优于黄芪，临床常用蜜炙黄芪代替黄芪。蜜炙黄芪较生品黄芪补气功效的增强与其化学成分的变化存在着密切的关系。课题组前期已建立黄芪蜜炙前后的UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱，应用多元统计分析对黄芪蜜炙前后的差异性化学成分进行了表征，发现蜜炙黄芪炮制后毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I的含量均有所增加。因此将毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I定义为9 广东药科大学硕士研究生学位论文蜜炙黄芪炮制特征成分。在蜜炙黄芪水提液干预脾气虚证大鼠的药效学研究中，确定了蜜炙黄芪的最适给药剂量为6g/kg，以及脾气虚证相关的生理生化指标。本研究在中医理论和代谢组学整体性原则的指导下，采用超高效液相/三重四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）代谢组学结合1H-NMR代谢组学的方法筛选蜜炙黄芪炮制特征成分的药效标记物及相关代谢通路。应用这些标记物与相关代谢通路构建蜜炙黄芪炮制特征成分发挥药效的代谢调控模式，评价蜜炙黄芪炮制特征成分药效。同时，标记物与网路药理学相结合挖掘特征成分发挥药效的作用靶点，探讨其可能的作用机制。论文总体思路和内容见图1。1.4.2本研究的意义由于蜜炙黄芪具有补中益气的疗效，而蜜炙黄芪炮制特征成分是其发挥药效作用的物质基础之一。因此本研究基于中医理论和代谢组学方法，并整合脾气虚证模型数据，病理指标数据开展了蜜炙黄芪炮制特征成分的药效研究。本研究首次应用UPLC-MS和1H-NMR的代谢组学技术筛选蜜炙炮制特征成分的药效标记物，并结合相关生物信息方法构建蜜炙炮制特征成分的代谢调控网络。以标记物和代谢通路评价蜜炙黄芪炮制特征成分的药效作用。此外，本研究进一步采用代谢组学数据结合特征成分的网络药理学分析策略为中药有效成分药效机制阐明提供了新的思路。10 广东药科大学硕士研究生学位论文图1-1论文总体研究思路和内容框架示意图11 广东药科大学硕士研究生学位论文第二章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的药效学评价2.1引言脾气虚证是临床常见的中医病症之一，是一种由于脾气不足，机体运化功能减弱所引起的症候[55]。脾气虚证导致水谷运输紊乱、消化不良，水液停滞而引起多种体内的代谢紊乱，出现腹胀食少，大便稀薄，肢体倦怠，神疲乏力，懒散少言，形体消瘦，面色苍白等症状[54]。脾气虚证是一种慢性的症候，发病周期长，往往是由亚健康状态逐渐发展为严重的脾气虚证。临床对于脾气虚证的诊断多为体征结合相关生理指标。其体征主要根据面色、舌象、唇色、食欲、大小便和睡眠质量等，生理指标主要包括血清胃泌素、D-木糖吸收和唾液淀粉酶活性等指标[56]。这些体征与指标符合典型的脾气虚证。目前有多种造模方法模拟脾气虚证模型的症状。主要包括物理方式和化学给药方式，其中物理方式主要通过劳倦伤脾及限制饮食达到脾气虚，常用的方式为游泳力竭，跑步力竭和食物限制[57]；化学给药主要包括以下几个方面，如苦寒泄下，耗气破气、偏食五味及西医理化等[57]。由于单一因素的造模方法不能持久，稳定的模拟症状，因此常用多因素复合的造模方式构建脾气虚证。其中应用最为广泛的是劳倦伤脾加限制饮食加苦寒泄下诱导的脾气虚证。由于考虑到药物治疗的因素，因此本研究采用劳倦伤脾加限制饮食的造模方法构建脾气虚证模型。蜜炙黄芪具有良好的补中益气的功效，且临床常用蜜炙黄芪代替黄芪生品。而药理功效的差异与化学成分的差异密切相关。课题组前期的黄芪蜜炙前后的化学成分多元统计分析与含量测定分析发现毛蕊异黄酮苷，黄芪甲苷，黄芪皂苷I含量增加[14]，因此将这三种成分确定为蜜炙黄芪炮制的特征成分。在此基础上，本研究通过构建脾气虚证大鼠模型，应用体征量化得分的方法结合相关生理生化指标来评价蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证的作用。2.2实验材料12 广东药科大学硕士研究生学位论文2.2.1仪器与试剂仪器：UPLC-Q-TOF/MS分析仪（美国Waters），MasslynxV4.1软件（Waters公司），FRESCO17低温高速离心机（Thermo公司），紫外分光光度计（美国Beckman公司），DL-360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），AUW220D分析天平（SHIMADZU公司），TT5000电子天平（常熟市双杰测试仪器厂），MindrayBC-5800血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。试剂：甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，德国CNW科技公司），亮氨酸-脑啡肽标准品（Sigma公司），超纯水（屈臣氏）；乙醚、间苯三酚、冰醋酸、浓盐酸、D-木糖、羟丙基-β-环糊精；2mLEDTA抗凝管（广州，瑞舒生物）、大鼠IL-1，IL-6，TNF-α，IFN-γ酶联免疫试剂盒（浙江，联科生物）2.2.2实验动物SPF级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠49只，体重200±20g，由广东药科大学实验动物中心提供。实验动物按每笼7只大鼠分别饲养，置于室温22±2℃，湿度50±5%，光照12h黑暗12h的环境下饲养。2.2.3试剂配制2.2.3.1蜜炙黄芪与黄芪生品水提液的制备分别精密称取蜜炙黄芪和黄芪生品各45g，粉碎，置于500mL的圆底烧瓶，分别加入10、8、6倍药材量的蒸馏水，回流提取三次，每次1h，过滤合并三次滤液并浓缩至干，浓缩物加入75mL蒸馏水复溶至0.6g/mL（按生药量计算的浓度），水提液保存于4℃冰箱。其中水提液每三天提取一次防止因水提液的腐坏导致药效的缺失。2.2.3.2炮制特征成分给药液的制备本实验三个炮制特征成分的给药剂量为2.4mg/kg.bw。溶液配置方法：分别精密称取毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I对照品各24mg至于10mL的EP管，按对照品（mg）：乙醇=4:1加入乙醇，摇匀，超声至浑浊，60℃水浴锅中逐滴加入0.18g/ml的羟丙基-β-环糊精溶液200μL，至单体溶解[58]。溶解后的溶液转移至100mL的容量瓶，蒸馏水稀释至刻度，即得浓度为0.24mg/ml的各单体溶液，并保存4℃冰箱中待用。13 广东药科大学硕士研究生学位论文2.2.3.3D-木糖吸收实验相关溶液的制备D-木糖溶液的配置：精密称取D-木糖5g，置于100ml容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度制成5%的D-木糖溶液；间苯三酚显色剂的配置：精密称取0.5g间苯三酚，置于500mL烧杯中，分别加入100mL冰醋酸和10mL的浓盐酸，搅拌溶解转移至棕色的烧瓶，常温避光保存（间苯三酚易氧化，常温避光保存期限为4天，因此现配现用）。2.3实验方法2.3.1脾气虚证大鼠模型的建立本研究采用劳倦伤脾加限制饮食的方法模拟大鼠脾气虚症状[50]，具体方法如下：将所有SD大鼠在SPF环境中适应性喂养一周，所有大鼠随机分为模型组（N=42只）和正常组（N=7只），其中模型大鼠分笼饲养。模型大鼠每天上午至于水温25℃±5，宽：45cm，水深50cm的水箱中负重游泳（负重物10%大鼠体重），并记录大鼠的游泳时间，同时每天按80g/kg(大鼠每1千克给食80g)；正常组大鼠正常饮食且不游泳，每天进行抓捏刺激。造模过程持续一个月，期间每5天记录大鼠的游泳时间，体重，大便性状，精神状态等体征，并进行提尾实验，记录抵抗时间，并按表2-1进行症状打分。同时，造模完成后所有大鼠禁食，次日，随机挑选模型组大鼠10只同正常组大鼠灌胃5%D-木糖溶液，1h后收集大鼠的血液，进行D-木糖含量的测定；并另随机挑选模型大鼠10只，同正常组大鼠收集血浆，4℃保存并送至中山大学实验动物中心进行血常规测定。14 广东药科大学硕士研究生学位论文表2-1脾气虚证大鼠症状积分表症状大便精神皮毛游泳得分性状状态情况时间不稀，成形，反应灵敏，拉尾皮毛光亮，1>1.5h稍硬抵抗时间>1min鼠尾发黄反应较灵活，拉尾皮毛暗色，2半成形，稍稀45min-1h抵抗时间30-60s鼠尾稍黄少动，乏力，拉尾皮毛松散，3稀便30min-45min抵抗时间15-30s鼠尾发白溏便，泄泻，无力，扎堆，拉尾皮毛枯槁，掉4<30min肛污抵抗时间小于15s毛，鼠尾发白2.3.1.1大鼠血清D-木糖含量测定模型过程中随机挑选的大鼠血样6小时内在4℃，13000g下离心15min，分别吸取上清血清和D-木糖标准溶液（2mmol/L）50μL置于15mL带塞的试管中，加入5mL的间苯三酚显色剂，于100℃水浴锅下加热10min。10min后，冷却至室温，在554nm下测定各样品的吸光度，在测样之前以蒸馏水的空白样调零。采用外标一点法计算各血清样本中D-木糖的浓度，计算公式如下：C标A样C样（式2-1）A标C样：血清样品D-木糖浓度，C标：D-木糖标准液的浓度，A标：D-木糖标准液的吸光度，A样：血清样本的吸光度2.3.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学试验模型构建成功后，模型大鼠随机分为模型对照组（MS），黄芪生品组（SP），炙品组（ZP），黄芪皂苷I组（I组），黄芪甲苷组（IV），毛蕊异黄酮苷组（MR），每组大鼠各7只。黄芪生品组和蜜炙黄芪组分别给予6g/kg.bw的水提液，黄芪皂苷I组、黄芪甲苷组和毛蕊异黄酮苷组分别按2.4mg/kg.bw给予单体溶液。以1mL/100g体重进行灌胃给药，模型组大鼠和正常组大鼠每天分别灌胃生理盐水，15 广东药科大学硕士研究生学位论文每天一次，连续给药14天。灌胃给药期间除正常组大鼠外，其余大鼠继续每天负重游泳和限制饮食，持续14天，每天记录大鼠的体重，5天记录一次大鼠体征。给药第15天所有大鼠正常饲养，于20:00禁食，第二天眼眶采集所有大鼠的血液，一份保存于2mL的EP管，4℃下13000g离心15min，取上清得血清样品。血清样品采用酶联免疫（ELSA）试剂盒测定大鼠血清中白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）的含量；另一份保存在2mL含有EDTA-K2的管中，混匀血浆，4℃保存并送至中山大学实验动物中心进行血常规测定。采集大鼠血样后，脱颈处死所有大鼠，解剖，收集大鼠胸腺和脾，称重，计算大鼠脾指数和胸腺指数。2.3.3统计学方法所有数据的统计分析均采用R语言（3.3.3版本）软件进行，数据统计结果—以平均数±表准差（XS）表示。两组间的均值比较均采用独立样本的T检验，P<0.05表示具有统计学差异。R语言的ggplot2包用于相关统计图的绘制。2.4实验结果与分析2.4.1脾气虚证大鼠模型评估造模过程中，脾气虚证大鼠存在的性状主要有毛发脱落，鼠尾发白，大便稀疏较软、不成形、躬身、腹部凹陷、严重的脱肛，易扎堆，体重轻，游泳时间逐渐降低，以上症状符合中医传统理论上的脾气虚证症状。为了将上述体征转化为具有统计学意义的数据，将体征按表2-1进行症状得分量化，以更好的反映脾气虚证大鼠的症状等级。基于课题组前期脾气虚证模型的评价指标研究[59]，本实验结合D-木糖吸收与血常规中的白细胞数（WBC）、淋巴细胞数（LYMPH）、血红蛋白含量(HGB)、红细胞数(RBC)等综合判断脾气虚证大鼠模型是否构建成功。结果见表2-2。16 广东药科大学硕士研究生学位论文—表2-2造模15天后正常组和模型组大鼠体重、症状得分、D-木糖吸收与血常规结果（XS）组体症状D-木糖WBCRBCHGBLYMPH别重得分吸收（mmol/L）（109/L）（109/L）（1012/L）（109/L）NS231.8±2.5**9.6±2.2*1.9±0.2**11.8±2.8*8.1±0.4*154.1±5.5**10.1±2.7*MS204.7±3.05.6±1.31.7±0.068.2±1.37.3±0.2141.8±4.86.9±1.1*：P<0.05，**：P<0.01统计结果表明，在整个造模过程中，模型组大鼠体重降低，正常组大鼠体重升高并趋于稳定。造模一个月后，模型大鼠体重与正常组具有显著性的差异（P<0.01）。由表2-2可知模型组大鼠经一个月造模后症状的得分显著的低于正常组大鼠（P<0.05)。以上体征结果可以初步反映模型构建成功。进一步通过D-木糖实验及血常规指标，来判断脾气虚证大鼠模型构建成功。从表2-2可知，造模一个月后正常组大鼠血清D-木糖的浓度高于模型组，且具有显著性的差异（P<0.01）。D-木糖吸收能够反映大鼠肠道吸收功能，已被认为一个特异性和敏感性的诊断脾气虚证的参考指标。模型大鼠血清D-木糖含量低说明模型大鼠肠道吸收功能降低，大鼠吸收代谢异常；血常规检测中，发现模型组大鼠白细胞数，淋巴数，红细胞数，血红蛋白含量显著的降低（P<0.05）。白细胞数与淋巴细胞数是评价免疫功能的指标之一，其含量的降低说明模型组大鼠免疫功能降低，抵抗力下降，此结果符合先前的研究结果[59]。临床上认为红细胞和血红蛋白负责将肺部吸进来的氧气输往全身各个部位[60]，其含量降低说明物质运输功能紊乱，与中医的脾气虚，水谷运化功能降低理论相符。对生理指标数据进行标度化去除量纲，应用R语言的Heatmap包进行热图聚类分析，结果如图2-1所示。剔除个别差异样本，D木糖吸收值，白细胞数，淋巴数，红细胞数和血红蛋白含量能够区分正常组和模型组。结合体征得分结果，说明劳倦伤脾加限制饮食诱导的脾气虚证大鼠模型构建成功。17 广东药科大学硕士研究生学位论文图2-1生理指标的热图分析2.4.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学评价模型构建成功，对模型组大鼠随机分组，分别为黄芪生品组、炙品组、毛蕊异黄酮苷组、黄芪甲苷组、皂苷I组和模型对照组。正常组和模型组蒸馏水给药，给药组分别药液干预两周。给药期间按表2-1统计症状得分。并记录大鼠体重，脏器指数，血常规检查结果，细胞因子(IL-6，TNF-α，IFN-γ)在各组间的变化。2.4.2.1体重变化，症状得分和脏器指数药物干预后的体重变化、症状得分及脏器指数的变化见表2-3。由表可知，蜜炙黄芪、黄芪生品、黄芪甲苷、皂苷I和毛蕊异黄酮苷干预脾气虚证大鼠后体重显著增加且与模型组相比具有显著性的差异（P<0.01）；模型组症状得分与正常组具有显著性差异（P<0.05），而药物干预后，症状得分接近正常组水平，以18 广东药科大学硕士研究生学位论文上结果表明蜜炙黄芪、黄芪生品、黄芪甲苷、皂苷I和毛蕊异黄酮苷能够恢复脾气虚证大鼠症状。课题组前期发现脾气虚证大鼠存在免疫功能降低，而脾指数和胸腺指数能够间接的反映机体的免疫功能，因此本实验通过脾指数和胸腺指数来评估蜜炙黄芪炮制特征成分对脾气虚证大鼠免疫功能的影响。表2-3可知模型组的脾指数和胸腺指数显著低于正常组水平，表明劳倦伤脾加限制饮食构建的脾气虚证大鼠免疫功能降低，符合前期的实验结论。黄芪生品，蜜炙黄芪和蜜炙黄芪炮制特征成分干预模型后，脾指数和胸腺指数水平显著升高，接近正常组水平，其中炙品组>毛蕊异黄酮苷组、黄芪甲苷组>生品组。以上结果说明劳倦伤脾加限制饮食诱导的脾气虚证大鼠模型稳定，蜜炙黄芪、黄芪生品及蜜炙黄芪炮制特征成分能够恢复改善脾气虚证大鼠的免疫功能，蜜炙黄芪对脾气虚证大鼠免疫功能作用优于黄芪生品，其中黄芪甲苷改善免疫功能的作用最优。—表2-3药物干预后大鼠体重、症状得分、D-木糖吸收与血常规结果（XS）组别给药后症状得分脾指数胸腺指数NS231.7±11.1**10±2.2*1.6±0.08***1.0±0.16***MS211.8±3.26.5±1.31.4±0.070.6±0.13SP236.5±13.3**#11.2±1.3*1.9±0.29***0.9±0.09**#ZP236.2±8.8**#9.5±0.5*1.7±0.23***0.8±0.08#*MR233.9±10.6**10.6±2*1.7±0.14***0.9±0.11***#I235.8±18.6**9.8±2.5*1.6±0.23*0.7±0.08###IV231.8±17.4**9±3.5*1.7±0.16***0.9±0.20****：与模型组（MS）相比，#：与正常组（NS）相比，ZP：蜜炙黄芪组，SP：黄芪生品组，MR：毛蕊异黄酮苷组，I：皂苷I组，IV：黄芪甲苷组*:P<0.05,**:P<0.01,***:p<0.001,#:P<0.05,##:P<0.01,###:P<0.0012.4.2.2血常规结果中医认为脾气虚证是指因脾气不足，运化水谷精微及运化水湿功能减弱所引起的一种疾病。血常规检测中的血红蛋白含量与红细胞数是运送氧气的物质，能够为机体提供所必须的氧气，因此，其与体内的物质运输与代谢有关。白细胞数、淋巴细胞数与机体的免疫功能相关，能够反映脾功能状况、病毒感染情况和自身19 广东药科大学硕士研究生学位论文免疫疾病。因此，考察蜜炙黄芪炮制特征成分对相关血常规指标的影响也能够反映其对脾气虚证大鼠的治疗作用。给药干预后的血常规结果如图2-2所示。由图可知，脾气虚证证大鼠的白细胞数、淋巴细胞数、血红蛋白含量与红细胞数较正常组均下降，且含量具有显著性的差异（P<0.05）；灌胃给药黄芪生品、蜜炙黄芪及炮制特征成分后，淋巴细胞与白细胞数变化最为显著，而红细胞数与血红蛋白含量的升高在毛蕊异黄酮苷组具有显著性差异（P<0.05）。淋巴细胞和白细胞数与脾气虚证大鼠免疫功能密切相关，红细胞与血红蛋白含量一定程度上反映了大鼠体内物质运输的情况。说明给药过程中脾虚证大鼠免疫功能减低，物质运输功能减弱，黄芪生品、蜜炙黄芪和蜜炙黄芪炮制特征成分可通过调节相关免疫反应及物质运输改善脾气虚证症状。其中，毛蕊异黄酮苷改善物质运输作用优于黄芪生品、黄芪炙品及其它特征成分，黄芪甲苷改善免疫功能的效果优于其它特征成分。图2-2给药干预后的血常规结果（*：与模型组（MS）相比，#：与正常组相比*:P<0.05,**:P<0.01,***:p<0.001,#:P<0.05,##:P<0.01,###:P<0.001）20 广东药科大学硕士研究生学位论文2.4.2.3细胞因子脏器指数与血常规结果均表明蜜炙黄芪炮制特征成分能够恢复脾气虚证大鼠的免疫功能。免疫功能的强弱与细胞因子的表达密切相关。课题组前发现蜜炙黄芪能够调节白介素和肿瘤坏死因子的表达而改善免疫功能[14]。因此，本实验通过检测药物干预后的IL-6、IFN-γ、TNF-α表达来评估蜜炙黄芪炮制特征成分对脾气虚证大鼠免疫功能的调节作用。检测结果见表2-4。IL-6、IFN-γ、TNF-α在模型组与正常组之间均存在显著的差异。IL-6是双向调节因子之一，具有抑炎与致炎的作用，IFN-γ具有抗肿瘤和免疫调节作用，TNF-α为促炎因子[61]。药物干预后各特征成分组TNF-α和IL-6表达降低，IFN-γ表达升高（表2-4），黄芪甲苷抑制TNF-α和IL-6的表达优于其它特征成分，黄芪甲苷促进IFN-γ的表达优于其它特征成分。以上结果表明蜜炙黄芪及炮制特征成分可通过调控上述细胞因子的表达改善脾气虚证大鼠的免疫系统功能，且黄芪甲苷改善脾气虚证大鼠免疫功能的作用优于其它特征成分。—表2-4药物干预后细胞因子结果（XS）组别IL-6TNF-αIFN-γNS439.44±2.18**71.13±4.7***8.23±0.42*MS1493.6±5.5184.51±4.47.76±2.63SP857.23±10.4***#73.61±3.3*###9.12±0.54*###ZP345.57±4.93***70.28±2.7##10.56±2.01*#MR1127.2±3.28*##72.43±1.80*###8.00±0.54**I1097.6±17.4*##79.7±1.56*##8.14±0.39**#IV966.09±5.97**#67.6±2.8**##8.80±1.28*##*：与模型组（MS）相比，#：与正常组相比*:P<0.05,**:P<0.01,***:p<0.001,#:P<0.05,##:P<0.01,###:P<0.0012.5讨论脾气虚证是脾病中较轻的症候，易为常见，是其它病症发生的基础。脾气虚证是多系统功能障碍和营养代谢失调的一种疾病状态。症状包括精神倦怠、扎堆、21 广东药科大学硕士研究生学位论文懒动、大便溏软、泄泻等。目前脾气虚证的诊断主要从宏观症状和免疫功能来评估。宏观症状包括症状体征如精神倦怠、懒动、扎堆、体重降低，游泳耐力下降等和血清D-木糖吸收率下降来反映机体的肠胃功能[62]。免疫功能主要体现在细胞免疫功能下降，NK细胞活性下降和巨噬细胞活性降低等，常用血常规检测的相关指标及相关细胞因子的表达量来反映机体的免疫功能[63]。然而，目前依然主要依靠症状体征来诊断脾气虚证，单一的诊断方式存在准确性、可靠性较低的缺陷。本实验采用“劳倦伤脾加限制饮食”多因素法复制脾气虚证动物模型，造模后大鼠出现大便软，严重稀溏，体重减轻，鼠尾发白，毛发枯燥等症状，其符合中医脾气虚证的症状。为了更加合理准确的判断模型，本实验将症状进行量化，同时结合免疫功能指标白细胞数、淋巴细胞数和红细胞数与肠道吸收功能指标D-木糖吸收值，综合分析发现脾气虚证大鼠症状得分显著低于正常组；脾气虚证大鼠白细胞数、淋巴细胞数、红细胞数和D-木糖吸收值显著低于正常大鼠。有研究发现脾气虚证大鼠造模后出现免疫功能降低且D-木糖的吸收值也显著的减低，此结果与本研究结果相符[59]。细胞因子检测试验中发现IFN-γ、IL-6和TNF-α细胞因子的表达在脾气虚证大鼠和正常大鼠之间存在显著差异。赵宁等在利血平所致脾虚大鼠脾阳虚证和脾气虚证的证候属性研究中发现脾气虚证大鼠的IL-6显著的升高，而IFN-γ表达降低[64]。此结果也与本研究结果类似。因此，说明劳倦伤脾加限制饮食方法建立的脾气虚动物模型构建成功且脾气虚证大鼠免疫功能和肠道吸收功能降低。课题组前期通过蜜炙黄芪水提液干预脾气虚证大鼠的药效试验中确定了蜜炙黄芪的最佳给药剂量为6g/kg.bw（换算为生药的剂量）[14]。在黄芪皂苷I与黄芪甲苷的血清药化实验中发现黄芪皂苷I可水解为黄芪甲苷，而发挥更好的吸收[65]。因此，蜜炙黄芪炮制特征成分的给药剂量根据黄芪生品中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷的含量来确定。通过2015版药典规定的方法对毛蕊异黄酮苷进行含量测定，黄芪甲苷的含量根据《香港中药材标准》来进行测定，具体参照刘浩文等人的研究[66]。相关图谱见附图1。通过外标一点法计算出药材中黄芪甲苷的含量为0.4012mg/g，毛蕊异黄酮苷的含量为0.6220mg/g。为了比较炮制特征成分间的药效差异，以黄芪甲苷的含量标准来确定三个炮制特征成分的给药剂量，同时结合蜜炙黄芪水提液的最佳给药剂量为6g/kg.bw确定炮制特征成分的给药剂量为2.4mg/kg.bw。在蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的药效实验中，症状得分的高低表明大鼠症状；白细胞数、淋巴细胞数与机体免疫相关；红细胞数和血红蛋白含22 广东药科大学硕士研究生学位论文量与机体的物质运输及代谢相关。黄芪生品、蜜炙黄芪及蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠后，症状得分、白细胞数、淋巴细胞数、红细胞数和血红蛋白含量向正常水平靠近。黄芪甲苷能够在体内和体外促进小鼠T、B淋巴细胞的增殖，促进抗体生成。毛蕊异黄酮苷能够提高免疫功能，增强机体抗氧化的能力[67]。现代药理研究认为，黄芪能作为一种免疫调节剂，能够增强机体的免疫功能。本实验选择的药效指标IL-6、IFN-γ、TNF-α与机体的免疫功能密切相关。IL-6能诱导B细胞和血细胞分化，促进T细胞和造血干细胞增殖，可由多种免疫细胞产生。TNF-α是重要的炎症因子，能促进中性粒细胞吞噬，促进细胞增殖和分化，具有抑制和杀伤肿瘤细胞的作用，与自身免疫性疾病有关。IFN-γ由活化的Th细胞和NK细胞产生。IFN-γ能活化中性粒细胞、NK细胞，促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖。许多疾病的发展与机体内细胞因子的表达失调密切相关。在蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠实验中，模型组大鼠的IL-6和TNF-α的含量显著的高于正常组，而IFN-γ的含量显著的低于正常组。细胞因子的表达异常说明脾气虚证大鼠免疫系统发生了紊乱。而黄芪生品、蜜炙黄芪及其炮制特征成分干预后的统计结果表明，模型组大鼠体内异常表达的细胞因子含量得到了有效的调节，使得这种异常表达趋于正常。炙品与生品药效相比，蜜炙黄芪的效果优于黄芪生品，而炮制特征成分与蜜炙黄芪的整体药效相比，蜜炙黄芪对IL-6表达调控优于特征成分，而特征成分调控IFN-γ和TNF-α的作用优于蜜炙黄芪。三个特征成分的整体药效相比，黄芪甲苷调控TNF-α、IFN-γ和IL-6的作用最佳。研究发现黄芪甲苷可以使IFN-γ、IL-1β浓度升高，TNF-α浓度降低进而使得巨噬细胞的吞噬能力增强，增强对结核杆菌的吞噬作用[68]。顾瑛媛在黄芪皂苷I对对Th1免疫反应的调节效应及机制研究中得出结论，黄芪皂苷I可特异性激活转录因子T-beta的转录，促进T淋巴细胞增殖和IFN-γ等细胞因子的产生[69]。研究人员在毛蕊异黄酮苷制备哮喘药物中的用途研究中发现毛蕊异黄酮苷能明显降低哮喘小鼠的气道高反应性，抑制气道炎症，降低肺泡灌洗液中炎症细胞数量，抑制趋化因子分泌，促进Th1细胞分化，抑制IL-17A，促进IFN-γ和IL-10分泌，抑制NF-κB活化[70]。2.6本章小结23 广东药科大学硕士研究生学位论文本实验在前期研究发现蜜炙黄芪炮制后毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I的含量均有所增加的基础上。本研究通过劳倦伤脾加限制饮食的复合因素造模方法构建脾气虚证大鼠的动物模型，并通过蜜炙黄芪、黄芪生品及蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠，结合相关生理生化指标评估蜜炙黄芪炮制特征成分的药效。与正常组相比，模型组大鼠体重明显减轻，大鼠体征与正常组差异明显，血常规结果中的白细胞数、淋巴细胞数、红细胞数、血红蛋白含量显著降低，大鼠D-木糖吸收率显著降低。以上结果说明模型组大鼠出现脾气虚证的相关症状且脾气虚证大鼠免疫功能降低，提示脾气虚证模型构建成功。在蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的药效试验中，模型组中的脾指数和胸腺指数显著低于正常组，血常规结果中的淋巴细胞数、白细胞数显著低于正常组，模型组大鼠的IL-6，TNF-α的含量显著高于正常组，而IFN-γ含量显著低于正常组。以上结果表明脾气虚证大鼠免疫功能发生了紊乱。药物干预后脏器指数、血常规指标及IL-6，TNF-α和IFN-γ的异常表达得到了调节，逐渐恢复至正常水平。且蜜炙黄芪的整体效果优于黄芪生品，蜜炙黄芪对IL-6表达调控优于特征成分，而特征成分调控IFN-γ和TNF-α的作用优于蜜炙黄芪，黄芪甲苷调控TNF-α、IL-6和IFN-γ的作用更为显著。上述细胞因子的表达结果说明蜜炙黄芪及其炮制特征成分可导致细胞因子的产生和应答发生改变，主要通过调节致炎与抗炎细胞因子IL-6，抗炎因子IFN-γ与促进免疫应答的TNF-α来改善脾气虚证大鼠免疫功能，其中黄芪甲苷的调控细胞因子表达的作用最佳。提示蜜炙黄芪及其炮制特征成分改善脾气虚证可通过调节大鼠免疫功能来实现。24 广东药科大学硕士研究生学位论文第三章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的血清代谢组学研究3.1引言代谢组学是研究生物体系受到刺激或受到其它因素干扰后（特定的基因变异或环境变化之后）内源性代谢物随时间变化的一门科学。代谢组学的研究任务是通过分析生物体液（血液，尿液，唾液等）和组织中的内源性代谢物，以寻找能够反映整体生物学状况的特征代谢物，并通过特征代谢物的变化解释现象发生的本质。血液是常用的代谢组学样品，样品收集方便，处理相对简单。血浆和血清是血液中重要的组成部分，血浆中多含一些脂质与蛋白物质，而血清是体内小分子的主要载体，在运输营养物质，激素和代谢物方面起着关键作用。因此血清内源性的代谢物变化能够反映机体的营养运输与代谢过程的变化。组学数据获取是代谢组学研究任务中的重要部分。数据的获取方式主要是通过大型仪器的检测，如质谱、核磁、液相、气相、毛细管电泳或者这几种仪器的联用。质谱和核磁是分析代谢组常用的分析工具，其中超高效液相色谱联用三重四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）具有高选择性、有效性、高效分离、高灵敏度及快速得到化合物的精确分子量等特点，而核磁共振氢谱仪（1H-NMR）具有样品前处理简单，对样品无破坏且有利于样品回收等特点[71]。因此，这两种检测方法在代谢组学内源性代谢物检测中被广泛的使用。本研究基于UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR的代谢组学分析药物治疗脾虚证大鼠的血清，筛选蜜炙黄芪炮制特征成分的药效潜在标记物并依据标记物评估蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证的作用。通过对药效标记物的代谢通路分析构建蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚的代谢调控网络。因此，本课题研究目的是从药效标记物水平对蜜炙黄芪炮制特征成分的药效进行评价，并对其作用机制研究提供新的思路3.2实验材料3.2.1实验药品和试剂25 广东药科大学硕士研究生学位论文色谱级的甲醇、乙腈（德国Merck公司），甲酸和乙酸（德国CNW科技公司），亮氨酸-脑啡肽标准品（Sigma公司），超顺水（优级，屈臣氏品牌）；黄芪药材购于广州至信集团（批号：160902），蜜炙黄芪购置广州置信集团（批号：160902），药材经广东药科大学中药学院刘基柱教授鉴定为豆科植物黄芪（产地：黄芪）的干燥根，标本存在于广东药科大学中心实验室。其中蜜炙黄芪炮制特征成分黄芪甲苷，黄芪皂苷I和毛蕊异黄酮苷的三个对照品信息如下表3-1。表3-1蜜炙黄芪三个特征成分对照品信息对照品批号纯度来源毛蕊异黄酮苷PS0409-0100>98.5%成都普思生物科技有限公司黄芪皂苷IPS14011302>99%成都普思生物科技有限公司黄芪甲苷PS0409-0100>99%成都普思生物科技有限公司3.2.2仪器和设备UPLC-Q-TOF/MS分析仪（ESI离子源，美国，waters公司），AcquityUPLCTMBEHC18柱（2.1×50mm,1.7μm,美国waters），MasslynxV4.1软件（Waters公司）及R软件（版本3.2.3），FRESCO17低温高速离心机（Thermo公司），紫外分光光度计（美国Beckman公司），DL-360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），NDK200-1多管道氮吹仪（日本东京理化），MRO2054美的净水器（佛山美的清湖净水设备公司），100-1000μL微量移液管，-80℃超低温冰箱（中科美菱公司），ZH-2BLENDE涡旋混匀器（天津药典标准仪器厂），HSS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司），BP210分析天平（Sartorius）。3.3实验方法3.3.1样品制备与溶液配置蜜炙黄芪与黄芪水提液的制备：分别精密称取蜜炙黄芪和黄芪生品各45g，粉碎，置于500mL的圆底烧瓶，分别加入10倍药材量的蒸馏水，回流提取1h，过滤；药渣加入8倍药材量的蒸馏水，回流提取1h，过滤；药渣再次加入8倍药材量的蒸馏水并回流提取1h，过滤。合并三次滤液，水温70℃下减压旋蒸浓缩26 广东药科大学硕士研究生学位论文至干，浓缩物加入75mL蒸馏水复溶至0.6g/mL（按生药量计算的浓度），水提液保存于4℃冰箱。其中水提液每三天提取一次防止因水提液的腐坏导致药效的缺失。特征成分溶液配置：分别精密称取毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I对照品各24mg至于10mL的EP管，按对照品（mg）：乙醇=4:1加入乙醇，摇匀，超声至浑浊，60℃水浴锅中逐滴加入0.18g/ml的羟丙基-β-环糊精溶液200μL，至单体溶解。溶解后的溶液转移至100mL的容量瓶，蒸馏水稀释至刻度，即得浓度为0.24mg/ml的各单体溶液，并保存4℃冰箱中待用。液质校正液配置：精密称取亮氨酸-脑啡肽适量置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配置成亮氨酸-脑啡肽母液。配置含有1%甲酸的70%甲醇水溶液500mL，加入适量的亮氨酸-脑啡肽母液，使其浓度为1000ng/mL3.3.2动物实验3.3.2.1脾气虚大鼠模型建立按“2.3.1脾气虚证大鼠模型的建立”项下的方法构建。3.3.2.2蜜炙黄芪炮制特征成分对脾气虚证的治疗按“2.3.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学试验”项下的方法进行给药，且给药期间同时施加造模水平的强度，过程持续两周。3.3.2.3血浆样品收集药物干预14天后，正常饲养一天，且禁食过夜。第二天大鼠乙醚麻醉，毛细管眼眶采集大鼠血液样品，一份收集于2mL的EP管中，4℃保存，3小时内于4℃，13000g下离心15min，吸取上清液得血清样品，保存于-80℃冰箱，待液质检测。3.3.3液质与核磁样品处理3.3.3.1液质样品处理血清样品室温下解冻，分别吸收10μL的各血清样本制成QC样品。200μL血清样至2mL的EP管，加入200μL的冰甲醇，混匀，涡旋3min，4℃，13000g下离心15min，上清加至300μL的内衬管中，待液质检测。27 广东药科大学硕士研究生学位论文3.3.3.2核磁样品处理血清样品室温下解冻，分别吸取10μL的所有血清制成QC样品。吸取200μL的血清至2mL离心管中，加入200μL磷酸盐缓冲液（2mol.L-1，K2HPO4/NaH2PO4=4:1,PH7.38），摇匀，4℃，13000g下离心10min，上清加至5mm的核磁管中，并加入重水溶液100μL（含0.03%TSP溶液）。3.3.4UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR分析3.3.4.1UPLC-Q-TOF/MS分析色谱条件：UPLC/Q-TOFMS分析系统：WatersAcquityUPLC/Q-TOFMicroMS;色谱柱：AcquityUPLCBEHC18柱2.1×50mm1.7μm；预柱为WatersAQUITYUPLCBEHC18VanGuardPre-Column（2.1mm×5mm1.8μm，Waters公司)；进样量：5μL；流速：0.4mL/min柱温：30℃。流动相为0.1%甲酸乙腈（B）和0.1%甲酸水（A），梯度洗脱的条件如下表3-2。表3-2液质梯度洗脱条件时间（min）A（0.1%甲酸水）B（0.1%甲酸乙腈）梯度曲线09555505031301008150100616955618955质谱条件：采用ESI离子源，在正离子、负离子模式下分别采集数据，数据采集范围m/z100～1500，采集模式centriod模式。离子源参数:毛细管电压：3kV，锥孔电压：30V，离子源温度：100℃，脱溶剂温度：300℃，雾化气(N2)流速50L·h-1，脱溶剂气(N2)流速500L·h-1；校正通路的锥孔电压：10eV。二级质谱实验的碰撞能量为10～40eV，LockMass为脑啡肽，实时校正的质量数：正离子模式[M+H]+为m/z556.2771，负离子模式[M-H]-为m/z554.2615。流速为0.02ml/min，Lockspray的频率为10s。数据采集与格式转化采用Masslynx软件进行。28 广东药科大学硕士研究生学位论文3.3.4.21H-NMR分析调用BrukerAVANCEIII500MHz的CPMG脉冲序列[RD-90-t1-90-tm-90-ACQ]对信号进行采集，参数设定如下:采样点数32K，采样时间2s，累加次数128次，混合时间80ms，90°脉冲宽度11μs，谱宽12000Hz，采样温度298K。经傅里叶变换后，将自由感应衰减(freeinductiondecay,FID)信号转为1H-NMR谱图。3.3.5数据处理获取的液质与核磁数据主要通过仪器自带的软件和R语言进行处理分析。处理软件包括应用R语言（3.2.3版本）的相关软件包，Masslynx软件，MestRenova软件，ChenomxNMR软件。其中R语言软件包包括metaMS包，ropls包，ggplot2包，mixOMics包，metabolomics包，corrplot包等一些基础的软件包。3.3.5.1液质数据前处理将正负离子模式下的质谱.Raw文件导入Masslynx软件的Databridge插件中，转为通用性文件（.netcdf），通用性文件转入R语言软件。R语言的metaMS包对液质数据进行峰匹配、峰识别、峰校正、峰积分处理[72]。metaMS包中处理液质的函数为metaSetting，函数设定峰挑选参数的SN=5，fwhm=10，step=0.05，峰匹配参数的mzwid=0.05，bw=10，其余参数使用默认值。以上处理得质荷比、保留时间、峰强度的三维数据矩阵。将矩阵输出为.CSV文件，手动去除同位素峰离子，并将数据导入R语言，应用mixOmics包进行归一化、Log转化、标度化等处理。3.3.5.2核磁数据前处理所有的核磁谱图在TOPSPIN3.2（BrukerBiospin,Germany）软件中进行相位校正、基线校正，以乳酸甲基双峰信号的左峰（δ=1.336）进行化学位移定标。再采用软件MestReNova5.3.1软件对1H-NMR图谱的δ0.5-9.0区域以0.004ppm积分段进行分段积分处理，所有积分总和归到10000。经上述处理得到每个样品的化学位移与积分的二维数据矩阵，并保存为.txt文件。将所有样品的.txt文件按化学位移整合成一个包含样品名、化学位移、积分的三维矩阵，并删除δ4.7-5.2ppm(残余水峰)的积分。29 广东药科大学硕士研究生学位论文3.3.5.3多元统计分析核磁和液质数据按80%规则（变量在所有样品中，80%的变量为0值）剔除零值较多的变量[73]。应用R语言的metabolimics包进行独立样本的T检验和多重假设性检验；液质数据和核磁数据使用R语言的ropls包进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）[74]。并结合ggplot2包绘制相关图。3.3.6潜在生物标记物的发现和鉴定潜在标记物发现：根据独立样本T-检验的P值小于0.05，OPLSDA或PLS-DA的VIP值大于1和载荷图中的变量权重筛选出潜在的标记物。液质标记物的鉴定：将标记物的m/z输入到Masslynx软件的ElementalComposition插件中进行元素组成分析，根据ppm<10获取可能的分子式。变量的精确分子式输入HMDB数据库（http://www.hmdb.ca/）、KEGG数据库（http://www.kegg.jp/）、METLIN数据库（http://metlin.scripps.edu/）和麦迪逊数据库（http://mmcd.nmrfam.wisc.edu/）进行检索确定潜在标记物。核磁标记物的鉴定：ChenomxNMR软件对核磁标记物的化学位移进行一维谱的指认，推测可能的代谢物(ppm<5)。结合相关血清核磁代谢组文献，实验室内部数据库及HMDB数据库确定最终的代谢物。3.4实验结果与分析3.4.1血清代谢轮廓分析采用UPLC-Q-TOF/MS方法与1H-NMR方法对大鼠血清样品进行数据的采集。QC样本的基峰离子色谱图（BPI）与核磁图谱如图3所示。在质谱的正、负离子模式下，血清样本中的代谢物得到很好的分离，保留时间18min内，且两个离子模式下谱峰信息互补（图3-1A）。因此本方法适用于全面的，完整的血清代谢组学分析，有利于获取更多的代谢物信息。从QC样品的核磁图谱发现代谢物信息在δ0.5-9.0区域，且峰形良好，水峰对样品峰的影响低（图3-1B）。综上所述采用UPLC-Q-TOF/MS方法与1H-NMR方法有利于获取血清样本的代谢物信息。30 广东药科大学硕士研究生学位论文图3-1血清代谢轮廓分析（A：QC样品正负离子模式下的BPI图，红色代表正离子模式，蓝色代表负离子模式；B：QC样本的核磁氢谱图，δ6.5-9.0的谱图在B图的右上角）3.4.2代谢组学数据质量评估为了验证上述方法所获取的数据质量，利用QC样品进行监测。在开始样品检测分析前，连续进QC样品6次以平衡系统，然后将QC样品随机插入真实样31 广东药科大学硕士研究生学位论文品序列中，每6个样品插入一个QC样品。对QC样本数据进行PCA分析，通过QC样本在PCA得分图确定系统的稳定性及数据的质量。通过R语言的XCMS[75]包绘制液质QC数据的保留时间偏差图。液质和核磁数据的PCA得分图显示正常组和模型组能够显著的区分，且QC样品聚类明显，同时正负离子模式下的保留时间偏差分别为-2min～5min与-15min～5min（图）。以上结果说明液质与核磁的检查方法系统稳定，所获取的数据质量较好，该方法适合于后续的样品分析。32 广东药科大学硕士研究生学位论文图3-2数据质量评估（A：正常组，模型组与QC样品的PCA得分图，前两个为液质正负离子模式下的PCA得分图，第三个核磁数据的PCA得分图；B：正负离子模式下的保留时间偏差图）33 广东药科大学硕士研究生学位论文3.4.3药效标记物的筛选和鉴别按“3.3.5.1液质数据前处理”方式处理液质数据，正负离子模式下分别获取了1181和910个变量。对正常组和模型组数据进行OPLS-DA分析，OPLS-DA分析被广泛地应用在代谢组学研究中判断两组间的差异并筛选差异变量。正常组和模型组的OPLS-DA得分如图5所示。通过十折交叉验证计算了模型的R2Y和Q2Y值，通常R2Y表示模型与数据集合Y的匹配程度，程度越高，说明模型更有代表性；而Q2Y则用来评估模型的预测能力[76]。为了验证此模型，对模型进行1000次的置换检验，通过模型计算R2Y和Q2值的与置换检验计算的值相等的概率值来评判模型[77]，如图3-3所示。模型的R2Y和Q2Y列于图3-3。由图可知，正负离子模式下正常组和模型组能够显著的区分，且两个模型的R2Y值和Q2Y值分别大于0.9和0.7（图3-3A左侧和中），这说明模型具有较好的特征。对于核磁的数据，对其进行PLS-DA分析，PLS-DA的得分图可以发现正常组和模型组也能显著的区分（图3-3A右侧）且R2Y值和Q2Y值分别为0.973和0.81。三个模型的1000次置换检验计算的R2Y值和Q2Y值等于模型本身计算值的概率低于0.01(图3-3B)，说明模型可靠具有较好的预测性能。图3-3基于液质和核磁的OPLS-DA与PLS-DA的正常组和模型组的得分图与模型的置换检验图（A：得分图，B：置换检验图）34 广东药科大学硕士研究生学位论文药效标记物的筛选根据之前的方法来确定[78]。首先筛选脾气虚证的病理标记物，然后通过独立样本T检验从病理标记物中筛选具有显著差异的药效标记物。具体过程为：通过正常组和模型组的OPLS-DA模型和PLS-DA模型的VIP值筛选潜在的变量，接着潜在变量在正常组、模型组、蜜炙黄芪生品组和炙品组之间进行独立样本的T检验筛选均具有显著性差异的变量，这些变量认为是潜在的药效标记物。按“3.3.6潜在生物标记物的发现和鉴定”项下的方法分别对核磁和液质分析条件下获取的潜在标记物进行鉴定。正负离子模式下一共鉴定了15个潜在标记物，鉴定结果见表3-2；核磁鉴定了5个潜在标记物，分别为乳酸（δ1.33），丙氨酸（δ1.47,1.48），甘氨酸（δ3.55），磷脂酰胆碱（δ3.22），不饱和脂肪酸（δ5.22-5.35）。综合液质和核磁结果一共筛选了18个药效标记物。表3-2潜在标记物信息质荷比保留时间加合离子ppm代谢物568.34015.31[M+H]+LysoPC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,10.59612.33065.31[M+COOH]-9Z))520.33985.31[M+H]+0.06LysoPC(18:2(9Z,12Z))564.33015.31[M+COOH]-991.6696.54[2M+H]+-3.29LysoPC(16:0)522.35527.70[M+H]+-0.42LysoPC(18:1(9Z))568.361610.49[M+COOH]--0.69LysoPC(18:0)523.366610.46[M+H]+784.582813.26[M+H]+-2.91PC(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:0)782.573013.27[M+H]+4.56PC(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:1(9Z))162.11170.44[M+H]+-4.75L-Carnitine154.996116.10[M+Na]+6.49Oxalaceticacid424.342910.84[M+H]+1.80Linoleylcarnitine514.29361.67[M-H]-0.61LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))588.33075.37[M+COOH]-0.10LysoPC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)35 广东药科大学硕士研究生学位论文319.22796.35[M-H]-0.1018-Hydroxyarachidonicacid303.232911.91[M-H]--0.18Arachidonicacid540.31024.41[M+Na]+4.13LysoPC(18:3(9Z,12Z,15Z))3.4.4标记物代谢通路分析鉴定的潜在标记物通过MetaboAnalyst网站（http://www.metaboanalyst.ca/）进行代谢途径分析。结果见图3-4。设定p<0.05，pathwayimpact小于1，筛选了三条代谢通路（图3-4A），分别为花生四烯酸代谢（图3-4B）、甘油磷脂代谢（图3-4C），丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢（图3-4D）。这些代谢途径与体内脂质合成，氨基酸代谢、蛋白合成及免疫功能密切相关。图3-4潜在标记物的代谢途径分析（A：特征代谢途径的筛选，B：花生四烯酸代谢途径，C:甘油磷脂代谢途径，D：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢）36 广东药科大学硕士研究生学位论文3.4.5基于标记物分析蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学评价通过1H-NMR和UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学研究得到了18个与蜜炙黄芪药效相关的生物标记物和3条代谢通路。通过峰强度对这18个生物标记物进行半定量分析以更清楚的表征黄芪生品、蜜炙黄芪及及黄芪炮制特征成分的药效。计算18个标记物在黄芪生品、蜜炙黄芪及蜜炙黄芪炮制特征成分组间的含量均值并对进行聚类分析（图3-5）。可以发现模型组中的溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）含量升高，而磷脂酰胆碱（PC）含量下降，这些代谢物经毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷的治疗含量接近正常水平，表明其对花生四烯酸代谢途径和甘油磷酸代谢途径的调节作用比黄芪皂苷I更强；样品聚类分析中，18个标记物能够将正常组和模型组区分于不同的类别，其中模型组单独为一类，黄芪生品组、黄芪炙品组及黄芪炮制特征成分组与正常组聚为一类，说明蜜炙黄芪炮制特征成分能够调节相关代谢物含量而改善花生四烯酸代谢途径，甘油磷脂代谢途径和氨基酸代谢的紊乱。图3-5潜在标记物的代谢途径分析（A：特征代谢途径的筛选，B：花生四烯酸代谢途径，C:甘油磷脂代谢途径，D：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢）37 广东药科大学硕士研究生学位论文为了进一步评估蜜炙黄芪炮制特征成分的药效，基于这18个标记物构建了PLS-DA模型，其得分图如图3-6所示。由图可知，基于筛选的18个血清标记物能够将正常组和模型组区分开，黄芪生品，蜜炙黄芪，黄芪甲苷、皂苷I和毛蕊异黄酮苷干预脾气虚证大鼠后，其趋势向正常组接近（图3-6箭头所示）。其中黄芪炙品及黄芪炮制特征成分比黄芪生品更接近正常组的水平。以上结果表明蜜炙黄芪、黄芪甲苷、皂苷I和毛蕊异黄酮苷治疗脾气虚证的作用优于黄芪生品。同时，由图可知皂苷I组组内样本差异大，样品分散，相对接近正常组；毛蕊异黄酮苷，皂苷I和黄芪甲苷与黄芪炙品组之间样品存在明显的交集表明蜜炙黄芪和毛蕊异黄酮苷、皂苷I和黄芪甲苷能够在一定程度上逆转脾气虚的病理进程，且毛蕊异黄酮苷、皂苷I和黄芪甲苷调控脾气虚证的代谢模型与蜜炙黄芪代谢调控模式类似。图3-6以18个标记物为变量的正常组、模型组、生品组、炙品组及特征成分组之间的PLS-DA得分图（MS：模型组，NS：正常组，SP：生品组，ZP：炙品组，MR：毛蕊异黄酮苷组，IV：黄芪甲苷组，I：皂苷I组）38 广东药科大学硕士研究生学位论文3.5讨论3.5.1潜在生物标记物的生物学意义解释本实验一共筛选了18个蜜炙黄芪炮制特征成分的药效标记物，其中包含8个溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、2个磷脂酰胆碱（PC）、左旋肉碱、亚油酸、花生四烯酸、18-羟基花生四烯酸、草酰乙酸、乳酸，丙氨酸、甘氨酸。磷脂酰胆碱（PC）类物质是合成花生四烯酸的前体物质，参与花生四烯酸代谢通路，PC在磷脂酶A2作用下催化细胞膜磷脂分解，失去其中一条脂肪酸碳链生成亚油酸及溶血磷脂，亚油酸经碳链加长及去饱和后生成花生四烯酸[79]。花生四烯酸是许多循环二十烷酸衍生物的生物活性物质，如前列腺素E2（PGE2）、前列腺环素（PGI2）、血栓烷素A2（TXA2）、白细胞三烯等物质的直接前体，这些物质对脂质蛋白的代谢、体内免疫、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用[80]。本实验中脾气虚证大鼠2个磷脂酰胆碱（PC）、亚油酸、花生四烯酸含量下降，而溶血磷脂酰胆碱类成分（LysoPC）含量升高。溶血磷脂酰胆碱类成分的含量的升高可能会诱导细胞膜脂质过氧化损伤内皮细胞或红细胞的裂解。花生四烯酸含量下降使得机体免疫抵抗能力减弱。这些物质的变化与脾气虚证大鼠红细胞数减少及内皮细胞的损伤有着紧密的联系。左旋肉碱是脂肪代谢和功能的重要物质，肉碱能够将长链脂肪酸从细胞溶质中装运到线粒体内，在弱碱酰基转移酶I和弱碱酰基转移酶II的作用下进行脂肪酸的β氧化[81]。肉碱能够促进线粒体内乙酰CoA的运输，且对丙酮酸脱氢酶具有抑制作用，从而影响能量代谢。本实验中脾气虚证大鼠血液中肉碱含量降低，给药之后，其含量上升，说明蜜炙黄芪炮制特征成分能够增加左旋肉碱的生成促进脂肪酸的代谢及线粒体内乙酰CoA的运输而恢复机体的能量代谢。草酰乙酸是一种四碳二羧酸，是柠檬酸循环（TCA）的中间体，其量决定细胞内三羧酸循环的速度。在体内，草酰乙酸是由苹果酸脱氢酶催化L-苹果酸氧化形成的，并且与乙酰辅酶A反应形成柠檬酸盐，由柠檬酸合成酶催化[82]。草酰乙酸也可由糖代谢中丙酮酸羧化而成，因此糖代谢障碍时，三羧酸循环及脂的分解代谢将不能顺利进行;同时，草酰乙酸与氨基酸代谢及核苷酸代谢有关且草酰乙酸参与了乙酰CoA从线粒体转运至胞浆的过程。因此草酰乙酸含量异常会影响机体的能量代谢。39 广东药科大学硕士研究生学位论文乳酸是体内重要的中间产物，产生于肌肉，骨骼等器官，是糖酵解的重要代谢产物。剧烈运动或无氧状态下生成两分子丙酮酸，经丙酮酸脱氢酶生成两分子乳酸和两分子ATP。本实验采用大鼠负重游泳构造脾气虚模型，剧烈的游泳可能引起乳酸含量的增加。丙氨酸可转化为丙酮酸，经糖异生途径生成葡萄糖，补充机体的血糖，同时丙氨酸对体内蛋白质合成过程起重要作用。甘氨酸参体内蛋白质的合，是蛋氨酸、胆碱、脱氧核糖核酸和一些重要激素的基本结构。此外，运动情况下甘氨酸是肌酸的重要原料有助于提高人体的运动能力。3.5.2特征成分干预脾气虚证的作用机制探讨脾气虚证大鼠伴有游泳耐力下降，体重减轻和懒动等症状，这可能与机体能量代谢异常及脂质代谢异常有关。根据18个标记物在KEGG数据库所对应的代谢途径，我们构建了代谢物之间的相互作用网络。如图3-6。实验中脾气虚证大鼠乳酸及含量升高，甘氨酸和肉碱含量降低，给药之后其含量向正常组水平靠近。说明蜜炙黄芪炮制特征成分能够通调节肉碱含量促进线粒体内乙酰基转移改善脂与能量代谢。同时蜜炙黄芪炮制特征成分可以通调节体内氨基酸的含量促进蛋白质的合成来改善脾气虚证大鼠的症状。此外，特征成分能够促进肌酸的形成，提高脾虚证大鼠的运动能力而改善脾气虚证大鼠游泳耐力下降的现象。脾气虚证大鼠存在免疫功能减弱。筛选的标记物中，模型组中溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）含量升高而磷脂胆碱（PC）和花生四烯酸的含量下降，给药之后标记物的含量向正常组接近。有研究发现黄芪甲苷可以通过干扰花生四烯酸的代谢发挥抗炎效果[83]。说明蜜炙黄芪炮制特征成分可以调节花生四烯酸的代谢，促进花生四烯酸形成相关生物活性物质，如PGE2，PGI2等，通过这些活性物质改善脾气虚证大鼠的免疫功能。40 广东药科大学硕士研究生学位论文图3-7特征成分药效标记物的代谢网络图（代谢物变化是根据正常和模型组相比而得）3.6本章小结本实验采用1H-NMR和UPLC-Q-TOF/MS代谢组学技术结合模式识别分析与通路分析鉴定了18个蜜炙黄芪炮制特征成分的药效标记物。主要包括8个溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、2个磷脂酰胆碱（PC）、左旋肉碱、亚油酸、花生四烯酸、18-羟基花生四烯酸、草酰乙酸、乳酸，丙氨酸、甘氨酸。UPLC-Q-TOF/MS主要鉴定了相关磷脂类的代谢物，而1H-NMR主要鉴定了一些氨基酸类的物质。说明1H-NMR和UPLC-Q-TOF/MS代谢组学技术能够更全面的检测出血清中代谢物的信息。标记物通过代谢途通路分析，发现了三条与蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证有关的代谢通路，主要为花生四烯酸代谢途径，甘油磷脂代谢途径，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。这些代谢途径与脂质代谢、能量代谢和蛋白合成有关。蜜炙黄芪炮制特征成分可通过调节花生四烯酸的代谢促进花生四烯酸合成相关生物活性物质改善脾气虚证大鼠的免疫功能。此外，蜜炙黄芪炮制特征成分能41 广东药科大学硕士研究生学位论文促进线粒体内乙酰基的转移，提高机体的能量代谢。丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径与蛋白质的合成及糖的代谢有关，因此蜜炙黄芪炮制特征成分能够增加机体蛋白质的合成与糖的代谢而改善脾气虚证的症状。42 广东药科大学硕士研究生学位论文第四章蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的尿液代谢组学研究4.1引言代谢组学是自下而上且无假设引导的分析方法，通过无歧视的分析疾病的代谢标记物，来阐明疾病的病理机制，并且帮助评价药物治疗的效果。代谢组学是对生物系统的最下游的内源性代谢物研究对象，其变化水平变化对于基因和蛋白而言更加的明显，从而更容易被检测。所以代谢组学能够很好的丰富及验证基因和蛋白水平的研究成果。代谢组学分为靶向代谢组学和非靶向的代谢组学，靶向代谢组学是对一种有针对性，有目的性的代谢组学，非靶向的代谢组学是对所有代谢物进行分析的代谢组学。因此，本研究整合了UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR技术尽可能的获取样品代谢物信息。尿液是代谢组学研究的重要样本之一，其含有多种内源性的小分子代谢物，能够很好的反应机体的变化。尿液具有非损伤性、样品量大等优点，且尿液中蛋白含量低，前处理简单。相比血清，尿液中共轭化合物的数量低于血清。在本研究中，采用基于UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR技术的尿液代谢组学方法来表征蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的药效标记物，并结合通路分析筛选表征蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的主要代谢途径。通过标记物和代谢通路来评价特征成分的药效和探讨作用机制。4.2实验方法4.2.1动物实验样品准备此部分内容和“2.3.1样品制备与溶液配置”一致。按“2.3.1脾气虚证大鼠模型的建立”项下的方法收集样品。4.2.2蜜炙黄芪炮制特征成分对脾气虚证治疗作用43 广东药科大学硕士研究生学位论文按“2.3.2蜜炙黄芪炮制特征成分的药效学试验”项下的方法进行给药，且给药期间同时施加造模因素，持续两周，期间记录大鼠体证及体重。4.2.3样品采集与前处理给药两周后，所有大鼠饱食一天并于当日晚上8:00使用代谢笼收集大鼠的尿液，尿液收集在含有0.3%叠氮化钠50mLEP管中，4000转下离心，分别吸取两份。一份吸取上清液200μL于2mLEP管，加入400μL的水，并于4℃，13000g下离心15min，吸取上清液至于300μL的内衬管中，待液质检测；另一份吸取300μL的尿样至1.5mL离心管中，加入200μL磷酸盐缓冲液（2mol.L-1，K2HPO4/NaH2PO4=4:1,PH7.38），摇匀，4℃，13000g下离心10min，上清加至5mm的核磁管中，并加入重水溶液50μL（含0.03%TSP溶液），待核磁检测。4.2.4仪器分析4.2.4.1UPLC-Q-TOF/MS分析色谱条件：色谱柱2.1mm×50mm，1.7μm，AcquityUPLCTMHSST3，Waters公司）；预柱为WatersAQUITYUPLCHSST3VanGuardPre-Column（2.1mm×5mm，1.8μm，Waters公司）；进样量5μL；流速0.3mL·min－1，柱温25℃；进样室温8℃，流动相为0.1%甲酸乙腈（B）和0.1%甲酸水（A）。梯度洗脱条件见表4-1。表4-1液相色谱梯度洗脱条件时间（min）A（0.1%甲酸水）B（0.1%甲酸乙腈）梯度曲线09553802067802061850506190100620010062195562395544 广东药科大学硕士研究生学位论文质谱条件：采用ESI离子源，在正离子、负离子模式下分别采集数据，数据采集范围m/z100～1500。离子源参数：毛细管电压3kV，锥孔电压30V，离子源温度100℃，脱溶剂温度：300℃，雾化气（N2）流速50L·h-1，脱溶剂气（N2）流速500L·h-1；碰撞能量（CE）10~40eV。由于代谢物的浓度比较低，二级质谱的解离电压设为10~20V，以保证每个离子能够得到碎片离子。LockMass为脑啡肽，实时校正的质量数：正离子模式[M+H]+为m/z556.2771，负离子模式[M-H]-为m/z554.2615。流速为0.02mL·min-1，电喷雾的频率为10s。所有上诉的参数设置均采用Masslynx软件控制，并进行数据的收集。4.2.4.21H-NMR分析调用BrukerAVANCEIII500MHz的Noesyprld脉冲序列[RD-90-t1-90-tm-90-ACQ]对信号进行采集，参数设定如下：采样点数32K，采样时间2s，累加次数64次，混合时间80ms，90°脉冲宽度11μs，谱宽12000Hz，采样温度298K。经傅里叶变换后，将自由感应衰减(freeinductiondecay,FID)信号转为1H-NMR谱图。4.2.5数据处理首先按“3.3.5.1项目下的液质处理方法”将液质文件进行分析得到保留时间、质荷比和峰强度的三维矩阵。采用80%规则去除缺失值（某一组出现零值频率低于80%的质谱离子）。将矩阵输出为excel文件，对于每个样品，每个离子的强度与总离子强度相比进行归一化，以消除样品中代谢物浓度的差异，从而获得代谢物的相对相对强度值。核磁数据的处理主要为：所有核磁谱图在TOPSPIN3.2（BrukerBiospin,Germany）软件中进行相位校正、基线校正，以乳酸甲基双峰信号的左峰（δ=1.336）进行化学位移定标；再采用软件MestReNova5.3.1软件对1H-NMR图谱的δ0.5-9.0区域以0.002ppm积分段进行分段积分处理，所有积分总和归到10000。经上述处理得到每个样品的化学位移与积分的二维数据矩阵，保存为.txt文件。将所有样品的.txt文件按化学位移整合成一个包含样品、化学位移、积分的三维矩阵，并删除δ4.7-5.2ppm（残余水峰）的积分。将归一化后的数据进行中心化和标度化，分别应用R语言的ropls包进行PLS-DA（核磁）和OPLS-DA（液质）。通过十折交叉验证的Q2Y和R2Y对所构建的模型进行质量评估。根据VIP值大于1筛选出重要的变量。应用独立样本45 广东药科大学硕士研究生学位论文的T-检验对上述变量在正常组、模型组、生品组、炙品组进行分析。当P<0.05时则判定变量具有统计学意义。这些差异变量即为药效标记物。4.2.6潜在生物标记物的发现和鉴定此部分内容和“3.3.6潜在生物标记物的发现和鉴定”一致。主要是物质分子式的确定，然后在HMDB等数据库中匹配出内源性代谢物。核磁数据主要通过化学位移进行数据库匹配指认谱峰。4.3实验结果与分析4.3.1代谢轮廓分析1H-NMR仪器检测，得到了尿液基峰离子流图（BPI）通过UPLC-Q-TOF/MS和（图4-1A）和核磁图（图4-1B）。正负离子模式下谱峰的分离良好，且相互补充，表明UPLC-Q-TOF/MS方法能够较好的分析尿样样品获取代谢物信息。尿液的核磁谱图可以发现水峰对样品峰的影响低，且峰形良好，说明构建的1H-NMR分析方法良好。46 广东药科大学硕士研究生学位论文图4-1尿液基峰离子色谱图（BPI）与核磁谱图（A：正负离子模式下的BPI，B:核磁谱图）4.3.2代谢组学数据质量评估为了验证所采用方法的稳定性和重现性，从每个尿样样品中吸取10μL混合制成QC（质量控制）样品，并在整个分析过程中间段进行QC样品检测（每6针样品进一个QC样品）。对QC样品，正常组和模型组进行PCA分析并计算每个峰的CV（变异系数）值来评判尿液代谢组数据的质量。如图4-2所示，正负离子模式下第一主成分能够显著的区分正常组和模型组，同时核磁数据的PCA得分图也能区分正常组和模型组；UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR方法下获取的QC样品数据在PCA得分图中聚类集中，且与正常组在同一侧。正负离子模式下QC样品中所有峰的CV值97%的CV小于0.5，95%的CV小于0.3。以上结果表明建立的UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR方法能够有效获取尿液代谢组数据，适用于后续代谢组学标记物的筛选。47 广东药科大学硕士研究生学位论文图4-2QC样品、正常组、模型组的PCA得分图与m/z的CV分布图（A：前两个为液质正负离子模式下的PCA的得分图，第三个为核磁数据的PCA得分图，绿色椭圆表示QC样品聚类集中。B:液质正负离子模式下QC样中峰的CV分布图。）4.3.3代谢物的多元统计分析尿样经UPLC-Q-TOF/MS正负离子模式分析后，经R语言metaMS包处理，分别得到1238和1018个变量。核磁图谱通过“4.2.5数据处理”项目下的方法处理得到1019个变量。为了检测尿液代谢物在脾气虚证组和正常组之间的差异，通过R语言的ropls包建立了OPLS-DA和PLS-DA模型。在代谢组学领域，模式识别是常用的分析手段，而OPLS-DA和PLS-DA都属于有监督的模式识别分析，且对于不同分析方法会选择不同的模式识别分析。因此，我们采用OPLS-DA模型分析液质数据，而PLS-DA分析核磁数据。本研究中，建立了两个OPLS-DA模型（液质正负离子模式）和一个PLS-DA模型来鉴别与劳倦伤脾加限制饮食诱导的脾气虚证相关的疾病标记物。我们应用十折交叉验证的R2Y和Q2Y来判断48 广东药科大学硕士研究生学位论文模型是否过拟合；为了验证模型的可靠性，我们采用随机置换检验的方法来重新构建模型（置换次数500次），计算置换检验的R2Y和Q2Y小于本身模型的概率。结果如图4-3。三个模型的R2Y大于0.85，Q2Y值大于0.75，其值比较接近1。置换检验计算的R2Y和Q2Y值大部分小于三个模型计算的值，且其概率小于0.01。以上结果说明构建的三个模型均具有较好的特征。图4-3基于液质和核磁的OPLS-DA及PLS-DA的正常组和模型组得分图（A）和置换检验图（B）（左边，中间为正负离模式下的得分图及检验图，右边为核磁得分图与检验图）4.3.4生物标记物的筛选和鉴定通过三个模型的OPLS-DA分析的VIP值（VIP>1），正负离子模式下我们分别筛选了205个和136个差异变量；核磁筛选了98个差异变量。这些差异变量在正常组、模型组、生品组和炙品组之间进行独立样本的T检验，筛选出各组与模型组相比均具有显著性差异的潜在变量。正负离子模式下筛选了22个和749 广东药科大学硕士研究生学位论文个潜在变量，核磁得到了8个潜在变量，这些潜在变量即为蜜炙黄芪发挥药效的潜在变量。潜在变量的m/z和化学位移是代谢物的特征信息。应用Msslynx软件的ElementalComposition插件计算潜在变量m/z对应的分子式，将分子式输入数据库匹配确定可能的代谢物。相关数据库包括HMDB数据库、METLIN数据库、MMCD数据库。通过ChenomxNMR软件对潜在变量的化学位移进行指认，确定可能的代谢物，同时应用HMDB数据库对可能的代谢物化学位移进行匹配，进一步确认代谢物。根据上述标准，液质正负离子模型下共鉴定了21个蜜炙黄芪治疗脾气虚证的药效标记物，结果见表4-2。核磁鉴定了4个潜在药效标记物，分别为琥珀酸（δ2.418），柠檬酸（δ2.539），肌酸酐（δ3.053，4.057），马尿酸（δ3.970，7.56，7.54，7.84）。表4-2液质鉴定的药效标记物信息质荷比保留时间加合离子ppm代谢物HMDB114.06700.454[M+H]+7.1CreatinineHMDB00562116.0722[M+H]+1.06310.1ProlineHMDB03411138.0557[M+Na]+198.08480.486[M+Na]+-0.6CitrullineHMDB03148212.09950.516[M+Na]+-5.0HomocitrullineHMDB00679235.07580.646[M+H]+-4.1UridineHMDB00296196.05862.870[M+ACN+Na]+2.8GlutaricacidHMDB00661176.0693[M+H]+3.774-8.0IndoleaceticacidHMDB00197217.0951[M+ACN+H]+180.0630[M+H]+178.0499[M-H]-3.449HippuricacidHMDB00714202.0474[M+Na]+-6.0359.1227[2M+H]+152.0571[M+H]+3.4422.7GuanineHMDB00132325.0852[2M+Na]+194.07763.774[M+ACN+H]+2.0XanthineHMDB00292283.11453.965[2M+Na]+-2.6KetoleucineHMDB00695225.10943.977[M+ACN+Na]+-7.0L-CarnitineHMDB00062267.13024.441[M+ACN+Na]+-5.2L-AcetylcarnitineHMDB0020150 广东药科大学硕士研究生学位论文206.08194.567[M+H]+3.7IndolelacticacidHMDB00671363.15774.621[2M+H]+7.3L-TyrosineHMDB00158231.07514.944[M+ACN+H]+-5.6KynurenicacidHMDB00715407.2783[M+H]+6.141-1.47-KetodeoxycholicacidHMDB00391451.2695[M+COOH]-192.05473.772[M+COOH]-7.0GlutamicacidHMDB00148187.09754.682[M-H]--0.4AzelaicacidHMDB00784201.01994.948[M+COOH]-2.8OroticacidHMDB00226407.2795[M-H]-6.530-2.0CholicacidHMDB00619453.2852[M+COOH]-4.3.5标记物的通路分析在尿液中，肌酸酐和马尿酸在核磁和液质中均被鉴定出。因此，我们基于UPLC-Q-TOF/MS和1H-NMR的代谢组学分析方法共鉴定了23个蜜炙黄芪炮制特征成分发挥药效的潜在标记物。MetaboAnalysts是一种基于R语言的代谢通路分析的网站工具。它能够基于高质量的代谢数据库，自动的将差异代谢物整合到相关的代谢通路网络中，并能够根据代谢通路之间的相互联系计算出最相关的代谢通路[84]。将潜在标记物的HMDBID号输入MetaboAnalysts工作站进行代谢通路分析。结果如图4-4。图中的圆圈代表了所有匹配的代谢物且颜色和大小分别代表代谢通路的P值和重要影响值（pathwayimpact）。代谢通路的影响值界定为0.08，P值界定为0.05。筛选出4条与蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证大鼠的代谢通路，分别为色氨酸代谢通路，三羧酸循环，苯丙氨酸代谢途径，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。51 广东药科大学硕士研究生学位论文图4-4代谢途径通路分析总结图（A）与特征代谢通路图（B:色氨酸代谢通路，C：三羧酸循环，D：苯丙氨酸代谢途径，E：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢）4.3.6蜜炙黄芪炮制特征成分的药效评价基于23个潜在标记物建立了PLS-DA模型的得分图来评估黄芪特征成分干预脾气虚证大鼠的作用，得分图显示在图4-5。如图4-5所示，正常组模型组能够显著区分，而给药之后，发现黄芪生品组与模型组部分聚集一起，有偏离的趋势，而炙品组接近正常组水平；毛蕊异黄酮苷组、黄芪甲苷组、皂苷I组均能与模型组区分并向正常组靠近，且毛蕊异黄酮苷最接近正常组。给药组间，特征成分与炙品组在同一侧且靠近正常组，接近的水平依次为蜜炙黄芪>毛蕊异黄酮苷>黄芪甲苷>皂苷I，说明特征成分与蜜炙黄芪具有不同程度的恢复效果，炙品黄芪52 广东药科大学硕士研究生学位论文的效果优于三个炮制特征成分。同时三个特征成分具有重叠部分，说明三个炮制特征成分改善脾气虚证大鼠的作用在调控代谢模式上具有类似的作用。图4-523个标记物建立的PLS-DA得分图（红色：模型组，黑色：正常组，蓝色：生品组，灰色：炙品组，黄色：毛蕊异酮苷组，绿色：黄芪甲苷组，粉红色：皂苷I组）通过对筛选的标记物进行半定量分析比较这23个标记物在这7组大鼠中的相对强度（相对强度指的是每个标记物强度与各自样品的色谱总离子强度之间的比值）。这23个标记物在这7组大鼠中的相对强度见图4-6。与正常组相比，模型组中有11个标记物的含量降低。分别为乳清酸、马尿酸、酪氨酸、鸟嘌呤、犬尿酸、脯氨酸、戊二酸、瓜氨酸、肌酐、高瓜氨酸、吲哚酸；其余12标记物的含量升高。这些升高或降低的标记物经黄芪生品、炙品及特征成分给药后，含量都有所恢复。表明这些标记物能够用于评价蜜炙黄芪炮制特征成分的的药效。53 广东药科大学硕士研究生学位论文图4-6药物治疗后，标记物在NS组、MS组、IV组、I组、MR组中的相对强度值。54 广东药科大学硕士研究生学位论文为了进一步比较黄芪生品、炙品及特征成分之间干预脾气虚大鼠的作用，应用R软件的metabolomics包对23个代谢物进行多组间的热图聚类分析，结果见图4-7。发现模型组位于一类，正常组位于第二类，正常组所在的类包含了毛蕊异黄酮苷组、皂苷I组、黄芪甲苷组和炙品组。说明经蜜炙黄芪炮制特征成分给药后，这些标记物的含量恢复至正常水平且蜜炙黄芪炮制特征成分能够通过调节标记物的含量而调控相关代谢模式进而改善脾气虚证大鼠的症状。同时，三个特征成分与蜜炙黄芪能通过类似的代谢模式来改善脾气虚证大鼠的代谢紊乱。图4-723个标记物的多组间聚类分析热图55 广东药科大学硕士研究生学位论文4.4讨论本研究应用代谢组学方法，筛选了23个与蜜炙黄芪炮制特征干预脾气虚证大鼠相关的药效标记物，这些标记物分别为肌酐、脯氨酸、瓜氨酸、戊二酸、吲哚乙酸、马尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤、酮亮氨酸酸、左旋肉碱、吲哚乳酸、L-酪氨酸、犬尿酸、酮脱氧胆酸、谷氨酸、壬二酸、乳清酸、胆酸等。肉碱是线粒体内乙酰基转移的重要载体，影响体内脯氨酸、马尿酸、瓜氨酸等氨基酸的合成。肉碱的生物学作用主要有两点，参与脂肪酸的氧化和调节酰化CoA和COA的比例；在肌肉放松和长时间运动中，脂肪酸的β氧化能够为机体提供能量。而脂肪酸的β氧化与脂酰化CoA进入线粒体的速度有关[85]。因此，肉碱在机体能量代谢中扮演着重要的角色。本研究中乙酰肉碱在脾气虚证大鼠模型尿液中含量显著的升高，给药之后，含量降低。说明劳倦伤脾的造模方式导致大鼠体内脂肪酸的氧化，特征成分能够促进体内肉碱的转化，调节酰化CoA和COA的比例，平衡机体的能量代谢平衡。色氨酸是体内必需氨基酸之一，且在代谢中发挥重要的作用。色氨酸代谢主要有犬尿酸代谢途径和5-羟色胺代谢途径。脾气虚证大鼠通常会有食欲下降、体重减轻及扎堆等现象。研究表明色氨酸的5-羟色胺代谢途径对于情绪和食欲具有一定的影响[86]。蜜炙黄芪特征药效试验中，脾气虚证大鼠存在免疫功能降低的情况，而色氨酸的犬尿酸代谢途径受免疫反应的影响。免疫功能降低会降低吲哚2,3-双加氧酶的活性，抑制犬尿酸代谢途径[87]。我们的实验结果表明犬尿酸和吲哚乙酸在脾气虚证大鼠尿液中含量异常升高，而这些标记物是色氨酸的代谢产物。色氨酸的代谢紊可能乱会导致色氨酸的缺乏。给药之后发现这些标记物的含量显著的升高，说明这些标记物能够改善脾气虚证大鼠色氨酸代谢。马尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤和乳清酸是嘌呤代谢的相关产物。嘌呤经过一系列代谢变化，最终形成的产物叫尿酸。嘌呤代谢紊乱会导致通风，而通风的治疗包含气血的调整[88]。说明嘌呤代谢紊乱引起体内气血不足。中医认为脾主运化，是气血生化之源,为后天之本。本研中马尿酸在模型组中显著的增加，而鸟嘌呤、黄嘌呤和乳清酸含量显著降低，给药之后这些代谢物的含量显著的恢复接近正常水平。说明蜜炙黄芪炮制特征成分能够调节嘌呤代谢补充体内的气血。胆酸是胆汁的重要成分，存在于肝肠循环系统并通过再循环起一定的保护作用，其与脂肪代谢密切相关。胆酸有助于脂肪的乳化并增强的脂质分解，促进脂56 广东药科大学硕士研究生学位论文质的吸收。胆酸是物质吸收与运输的重要物质。研究中脾气虚模型组胆酸含量高于正常组，给药之后，胆酸的水平恢复接近正常组水平。表明蜜炙黄芪特诊成分能够调整胆酸在肝肠内的循环促进脂肪的吸收，使得脾虚诊证大鼠体重恢复，症状减轻。基于以上筛选的标记物及其在各组间的变化，通过Cytoscape软件的Metascape插件构建了蜜炙黄芪炮制特征成分的代谢调控网络（见图4-5）。由于代谢物是某些代谢途径的中间体，在KEGG数据库中匹配识别不到，因此图中只包含了数据库匹配的15个标记物。图4-8基于潜在标记物与相关代谢物及反应构建的代谢调控网络。4.5本章小结毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和皂苷I是蜜炙黄芪中的有效成分，具有广泛的药理作用。临床常用黄芪作为辅助用药治疗相关疾病如肿瘤、心血管疾病等。中医理论认为，黄芪具有补中益气的作用，而黄芪的有效成分是发挥补中益气作用的基础。因此本研究应用1H-NMR和UPLC-Q-TOF的代谢组学方法鉴定了23个与57 广东药科大学硕士研究生学位论文蜜炙黄芪炮制特征干预脾气虚证大鼠相关的药效标记物。这些标记物分别为肌酐、脯氨酸、瓜氨酸、戊二酸、吲哚乙酸、马尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤、酮亮氨酸酸、左旋肉碱、吲哚乳酸、L-酪氨酸、犬尿酸、酮脱氧胆酸、谷氨酸、壬二酸、乳清酸、胆酸等，11个标记物在模型中含量降低，12个含量升高。基于这23个标记物我们构建了PLS-DA模型得分图和聚类分析热图，评估了蜜炙黄芪炮制特征成分的药效作用。结果表明毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷、皂苷I与蜜炙黄芪调节脾气证大鼠代谢通路的作用类似。内源性代谢物结合代谢通路分析筛选了4条与蜜炙黄芪炮制特征干预脾气虚证大鼠作用相关的代谢途径，主要为色氨酸代谢通路，三羧酸循环，苯丙氨酸代谢途径，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，这些代谢途径涉及体内的脂肪代谢、氨基酸代谢及蛋白合成等生物过程。这些标记物对于后续的蛋白组学，基因组学研究奠定了基础。58 广东药科大学硕士研究生学位论文第五章蜜炙黄芪炮制特征成分的网络药理学研究5.1引言网络药理学是根据系统生物学和多向药理学提出的药物设计新方法。中药具有多靶点，多成分作用的性质同时多靶点药物已成为目前研究的新方向，而网络药理学的研究从多靶点角度出发将药物-靶点网络与生物系统网络相结合，其符合中药多靶点，多成分作用的特点[89]。网络药理学为分析药物作用机制提供了新的思路，我们可以通过网络中的节点连接和关系分析网络特征或通过网络药理学研究寻找药物作用的靶点，两者结合进一步阐明药物作用机制，为发现新药提供重要的指导意义。同时，网络药理学确认的靶点通过相关靶标分析和拓扑分析等生物信息学分析可以构建相关靶点-代谢途径、靶点-基因和蛋白相互作用网络。这些网络图也有利于阐明药物的作用机制。因此，本研究通过对蜜炙黄芪及其特征成分进行网络药理学研究，构建蜜炙黄芪炮制特征成分的药物-靶标-疾病网络图，并结合相关靶标分析、富集分析或拓扑分析阐明蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证的作用。5.2实验方法5.2.1蜜炙黄芪的网络药理学研究TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）是一种独特的中草药系统药理平台，能有效把握药物、靶标与疾病之间的关系[90]。数据库包括化学品名、靶标和药物靶网络和相关药物-靶点-疾病网络,以及天然化合物的药代动力学属性包括口服生物利用度，类药性，肠道上皮通透性,血脑屏障、溶解度等。TCMSP数据库为阐明中药靶标、研究中药作用机理、发现中药活性成分等提供了基础，为现代中药研究带来了新的思路。由于蜜炙黄芪与黄芪的化学成分基本一致，因此将黄芪的中文名输入TCMSP数据库检索，获取黄芪所有的化学成分、靶标和可能治疗的疾病信息，并将化学成分-靶标-疾病信息输出为excel文件，通过R59 广东药科大学硕士研究生学位论文语言对靶标进行预测分析，设定Scorecutoff值为10，筛选Scorecutoff在10以上的黄芪化学成分和相关靶点及疾病。5.2.2蜜炙黄芪炮制特征成分的利用度和类药性分析从CAS数据库确定毛蕊异黄酮苷，黄芪甲苷，黄芪皂苷I三个化合物的结构。将三个化合物的CAS号输入TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），获取三个化合物的生物利用度值（OB）和类药性值（DL）。5.2.3蜜炙黄芪炮制特征成分的潜在靶点预测应用ChembiodrawUltra13.0软件中绘制毛蕊异黄酮苷，黄芪甲苷，黄芪皂苷I三个化合物的结构，并以MDLMolfile(*.mol)格式存储，将结构导入ChemMapper[91]服务器进行潜在靶点的预测分析，参数设定如下：OptionsforChemMapper:TargetNavigator;3Dsimilaritymethod:SHAFTS;Similaritythreshold:0.5;Bioactivitydatabase:DrugBank。为了使靶点结果更加可靠，三个物质结构输入PubChem数据库，应用IdentitySimilarity功能，选择相似系数在90%的化合物，并选择BioActivityAnalysis选项。将两种方法的靶标信息输出为excel文件并整合。5.2.4潜在靶点的富集分析与通路注释将预测的靶点蛋白信息导入MAS3.0（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3）数据库，即可得到靶点的相关通路信息。参数设置如下,Species:Homosapiens；MoleculeType：Protein；DatabaseSymbols:GeneBank：UniProtKB；Functions:Gene，mRNA，Protein，Pathway，GO(GeneOntology)；RegulationThreshold：Up2.0，Down0.5。通过以上分析可得靶点的富集分析和通路注释结果。5.2.5网络构建通过Cytoscape3.3.0[92]软件建立黄芪“化学成分-靶点-疾病-通路”网络模式，绘制黄芪化学成分与靶点及疾病和通路的网络图。同时以蜜炙黄芪炮制特征成分、预测靶点与通路为节点（Node）建立相互关系，导入Cytoscape3.3.0软件，运用Merge功能绘制“特征成分-靶点-通路”网络图。以边（edge）相连接表示靶点是某化合物的潜在作用靶点且靶点与某通路相关。60 广东药科大学硕士研究生学位论文5.3实验结果5.3.1黄芪的网络药理学研究结果黄芪与蜜炙黄芪化学成分类似，而蜜炙黄芪的网络药理学研究少，因此我们对黄芪进行网络药理学研究。通过5.2.1项下分析与靶标预测分析，筛选了23个黄芪化学成分，18个作用靶点，18条代谢通路和8种相关疾病，其中筛选的化学成分包含本研究的黄芪特征成分黄芪甲苷和皂苷I。应用Cytoscape3.3.0软件绘制黄芪“化学成分-靶点-疾病-通路”网络图（图5-1）。由图可知黄芪化学成分与抑郁症、炎症、心血管等疾病的治疗密切相关。其中炎症和抑郁症的临床表现与脾气虚证的免疫功能下降、食欲降低、活动减弱，扎堆等现象有一定的相似性，说明筛选的这23个化学成分与脾气虚证的治疗有一定的相关性。筛选的谷胱甘肽代谢通路、色氨酸和蛋氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路和色氨酸代谢通路验证了先前尿液和血清代谢组学筛选的代谢通路。图5-1蜜炙黄芪“化学成分-靶点-疾病-通路”网络图（紫色七边形：黄芪化学成分，蓝色五角星：相关靶点，黄色圆：代谢通路，绿色正方形：相关疾病）5.3.2特征成分的相关信息61 广东药科大学硕士研究生学位论文将特征成分的GAS号输入TMSCP数据库即可得三个物质的生物利用度与类药性值，结果见表5-1。OB和DL是评价药物成药性的两个关键参数，OB值评价待测化合物在体内生物利用度，而DL是评价待测化合物与已知药物的相似性[93]。黄芪皂苷I和毛蕊异黄酮苷的OB较高，达到了41.79%和41.6%，而黄芪甲苷的OB较低，只有22.5%，成药性较差。三个特征成分的DL依次为毛蕊异黄酮苷大于黄芪甲苷，黄芪甲苷大于黄芪皂苷I，且毛蕊异黄酮苷的DL大于0.18。根据DL和OB值可以推断毛蕊异黄酮酮苷在体内的生物利用度更高。表5-1特征成分具体信息化合物CAS号分子式OB/%DL化学结构式黄芪皂苷I84680-75-1C45H72O1646.790.11黄芪甲苷84687-43-4C41H68O1422.500.15毛蕊异20633-67-4C22H22O1041.60.81黄酮苷62 广东药科大学硕士研究生学位论文5.3.3特征成分的靶点预测与筛选通过ChemMapper数据库及PubChem数据库的相似性匹配分析，三个特征成分一共筛选了29个潜在靶点（表5-2），每个化合物对应的靶点数不尽相同，其中黄芪甲苷7个，毛蕊异黄酮苷10个，黄芪皂苷I12个。在预测的蛋白中POLA1，MIF，POLB，ESR2等蛋白合成有关；ALDH2，ATP1A4，DHODH等于与能量代谢有关；MIF，ADORA1，AMH等与炎症反应有关。由此推断，蜜炙黄芪炮制特征成分治疗脾气虚证可能通过参与调节蛋白合成、炎症反应和能量代谢等过程。表5-2特征成分的靶点信息化学成分基因蛋白黄芪甲苷ADORA2AAdenosineA2areceptor黄芪甲苷POLA1DNApolymerasealpha1黄芪甲苷ADORA2BAdenosineA2breceptor黄芪甲苷ADORA3AdenosineA3receptor黄芪甲苷POLBDNApolymerasebeta黄芪甲苷DNMT1DNAmethyltransferase1黄芪甲苷ADORA1AdenosineA1receptor毛蕊异黄酮苷GA2Proteinprenyltransferasessuperfamilyprotein毛蕊异黄酮苷ESR2Estrogenreceptor2毛蕊异黄酮苷MAPK14Mitogen-activatedproteinkinase14毛蕊异黄酮苷DHODHDihydroorotatedehydrogenase毛蕊异黄酮苷NCOA2Nuclearreceptorcoactivator2毛蕊异黄酮苷TTRTransthyretin毛蕊异黄酮苷ESR1Estrogenreceptor1毛蕊异黄酮苷ALDH2Aldehydedehydrogenase2familymember毛蕊异黄酮苷MIFGlycosylation-inhibitingfactor毛蕊异黄酮苷CA2Carbonicanhydrase263 广东药科大学硕士研究生学位论文皂苷ISLC47A1Solutecarrierfamily47member1皂苷ICYP3A4CytochromeP450family3subfamilyAmember4皂苷ICYP51A1CytochromeP450family51subfamilyAmember1皂苷IKCNH2Potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyHmember2皂苷IATP1A1ATPaseNa+/K+transportingsubunitalpha1皂苷IMLNRmotilinreceptor皂苷ISLCO1B3solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1B3皂苷IALBAlbumin皂苷IABCB1ATPbindingcassettesubfamilyBmember1皂苷ISLCO1B1Solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1B1皂苷IGLRA3Glycinereceptoralpha3皂苷IGABRB3Gamma-aminobutyricacidtypeAreceptorbeta3subunit5.3.4通路分析与网络构建将29个靶点信息输入MAS3.0软件进行通路分析，共得到65条信号通路。并绘制“特征成分-靶点-信号通路”的网络图，见图5-2。这些代谢通路部分与代谢组学研究结果筛选的通路基本一致，如色氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路、色氨酸和蛋氨酸代谢通路等。除此之外，还发现一些与细胞因子表达密切相关的TNF-α信号通路和T细胞受体信号通路，这些通路与药效试验中的细胞因子表达的异常密切联系。64 广东药科大学硕士研究生学位论文图5-2蜜炙黄芪“特征成分-靶点-通路”网络图（红色：蜜炙黄芪炮制特征成分，蓝色：相关靶点，黄色：代谢通路5.4讨论网络药理学符合中药多成分，多靶点作用理论，为中药药理学研究提供了新的思路与方法。TMSP数据库和ChemMapper工作站是获取特征成分药物代谢特征信息与潜在靶标信息的良好工具，同时，MAS3.0软件为靶点注释和通路分析提供了基础。结果显示毛蕊异黄酮苷的成药性优于黄芪皂苷I，黄芪皂苷I优于黄芪甲苷。由“特征成分-靶点-疾病”网路图发现蜜炙黄芪炮制特征成分与炎症疾病、心血管病及疼痛抑郁等疾病有关，而这些疾病的症状与脾气虚证的症状具有一定的相似性，间接推断蜜炙黄芪炮制特征成分具有改善脾气虚证的药效作用。研究发现大量预测靶点与蛋白调控，能量代谢及炎症反应有关，且各靶点、通路相互协同发挥作用，揭示这可能与蜜炙黄芪炮制特征成分发挥药效作用有关。脾气虚证存在一定的免疫功能减低，致炎因子分泌增加，严重的可能出现炎65 广东药科大学硕士研究生学位论文症反应，而基于特征成分筛选的通路中TNF-α信号通路，T细胞受体信号通路和色氨酸代谢通路与炎症反应有关。另一方面，大量研究发现脾气虚证存与氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢、色氨酸代谢、蛋白合成有关[94]，网络药理学筛选的通路与这些代谢有着紧密的联系。“特征成分-靶点-通路”网络发现蜜炙黄芪炮制特征成分可能通过POLA1，MIF，POLB，ESR2等靶点调控蛋白合成；通过ALDH2，ATP1A4，DHODH等调节能量代谢进而改善脾气虚证症状的作用。其中黄芪甲苷和皂苷I调控的靶点主要参与炎症反应；毛蕊异黄酮苷调控的靶点主要参与蛋白合成和氨基酸代谢。5.5本章小结脾气虚证是多系统代谢紊乱的综合症候，涉及多个代谢途径。本研究应用网络药理学对蜜炙黄芪炮制特征成分的作用靶点和相关疾病进行了分析，并绘制了相关网络图，为特征成分的药效机制研究提供新的理解。筛选了29个特征成分的潜在作用靶点，发现其对蛋白调控，能量代谢及炎症反应具有一定的调节作用。特征成分网络药理学研究结果结合代谢组学通路分析结果进一步验证了蜜炙黄芪炮制特征成分发挥药理作用与蛋白合成，能量代谢，色氨酸代谢，炎症反应和脂质代谢有关。其可能通过调节MIF、ALDH2、AMH、DNMT1、MAPK14等受体来调节脾气虚证的代谢紊乱。66 广东药科大学硕士研究生学位论文第六章结论、创新点和展望6.1结论本研究通过劳倦伤脾加限制饮食的方法构建了脾气虚证大鼠动物模型，应用大鼠体征症状得分、D-木糖吸收、脏器指数和相关细胞因子评估了蜜炙黄芪炮制特征成分改善脾气虚证大鼠的药效。蜜炙黄芪炮制特征成分的药效结果表明蜜炙黄芪及其特征成分均可通过调节模型大鼠脾胃功能和免疫反应来改善脾气虚证大鼠的症状，其中毛蕊异黄酮苷改善脾气虚证的效果优于其它特征成分，而黄芪甲苷改善免疫功能具有显著性的作用。通过蜜炙黄芪炮制特征成分干预后的大鼠尿液和血清的代谢组学研究，从血清中筛选了18个潜在标记物，分别为磷脂酰胆碱（2个）、溶血磷脂酸胆碱（8个）、左旋肉碱、亚油酸、花生四烯酸、18-羟基花生四烯酸、草酰乙酸、乳酸，丙氨酸、甘氨酸。其中液质主要检测鉴定的是磷脂相关代谢物，而核磁是一些氨基酸类物质。说明将UPLC-Q-TOF/MS与1H-NMR相结合分析方法有助于获取更多血清样品的代谢物信息。从尿液中筛选了23个潜在标记物。这些标记物主要为肌酐、脯氨酸、瓜氨酸、戊二酸、吲哚乙酸、马尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤、酮亮氨酸酸、左旋肉碱、吲哚乳酸、L-酪氨酸、犬尿酸、酮脱氧胆酸、谷氨酸、壬二酸、乳清酸、胆酸等。这些标记物主要涉及色氨酸代谢通路，三羧酸循环，苯丙氨酸代谢途径，花生四烯酸代谢途径，甘油磷脂代谢途径和氨基酸代谢途径。基于血清和尿液中筛选的标记物，进行毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷、皂苷I的药效评价。结果表明毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷与蜜炙黄芪调控脾气虚证大鼠代谢模式类似。主要调控氨基酸代谢、脂肪代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢途径。其中毛蕊异黄酮苷的作用优于黄芪甲苷，黄芪甲苷优于皂苷I。网络药理学研究筛选了29个特征成分的潜在作用靶点，其中黄芪甲苷有7个，毛蕊异黄酮苷有10个，黄芪皂苷I有12个。这些靶点对蛋白合成，能量代谢及炎症反应具有一定的调节作用。验证了代谢组学的研究结果。炮制特征成分可通过调节MIF、ALDH2、AMH、DNMT1、MAPK14等受体来调节脾气虚证大鼠的代谢紊乱和机体的免疫功能。67 广东药科大学硕士研究生学位论文综上所述，蜜炙黄芪炮制特征成分具有恢复脾气虚证大鼠症状的效果且能改善脾气虚证大鼠的免疫功能，其主要是通过调控花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢来改善机体的免疫功能，调控色氨酸代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢促进机体能量供应和蛋白合成。其调控涉及的蛋白为MIF、ALDH2、AMH、DNMT1、MAPK14等。本研究为后续的蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证的靶标代谢组学研究、蛋白组学研究和基因组学研究奠定了基础。6.2创新点本研究首次结合1H-NMR和UPLC-Q-TOF/MS代谢组学研究方法筛选蜜炙黄芪干预脾气虚证的药效标记物，同时结合代谢通路分析寻找出与蜜炙黄芪发挥药效相关的代谢途径并绘制相关的代谢调控网络图，并以标记物评估了蜜炙黄芪炮制特征成分干预脾气虚证的作用。整合了网络药理学与代谢组学数据，探讨蜜炙黄芪及炮制特征成分发挥药效的潜在作用机制。6.3展望代谢组学研究方法筛选的潜在标记物需要整合更多的组学数据，如蛋白组数据、基因组数据等来验证这些标记物是否能够作为蜜炙黄芪的药效标记物。同时在筛选的靶点和代谢通路基础上通过分子生物学方法进行蜜炙黄芪炮制特征成分的机制研究。68 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广东药科大学硕士研究生学位论文附图黄芪甲苷和毛蕊黄酮苷含量测定色谱图附图1黄芪甲苷对照品以及黄芪药材供试品溶液的HPLC色谱图(A:采用港标方法检测的黄芪甲苷对照品溶液，B:黄芪药材供试品溶液)76 广东药科大学硕士研究生学位论文附图2毛蕊异黄酮苷对照品以及黄芪药材供试品溶液的HPLC色谱图(A:采用中国药典方法检测的毛蕊异黄酮苷对照品溶液，B:黄芪药材供试品溶液)77 广东药科大学硕士研究生学位论文致谢研究生三年对而言，更多的是感恩。衷心的感谢我的导师芮雯教授、陈宏远教授对我课题的指导和生活的关照和谆谆教诲。他们是我顺利完成毕业的良师益友，是我人生中的贵人。谨此向芮雯教授和陈宏远教授表示万分感谢和崇高的敬意。衷心感谢中心实验室冯毅凡教授，孟青老师，石忠峰老师，吴霞老师，梁汉明老师和钟艳梅老师对我研究生三年实验与生活的悉心指导和热情帮助。感谢中心实验室所有师妹师弟对我热心的帮助。感谢广东药科大学实验动物中心工作人员的帮助和谅解。特别感谢朱建成、曹涵、陈宏策、游思远、李婵艺、马文杰、黄立、叶明珠同学在实验过程中和论文修改过程中给予的帮助和意见。最后，衷心感谢我的家人在我学业和生活上的支持、关怀、鼓励和理解。78 广东药科大学硕士研究生学位论文攻读硕士学位期间发表的论文1.刘武平,李婵艺,黄晶,等.脾气虚证大鼠尿液生物标记物的识别及其生物学意义[J].中国中药杂志,2017,42(24):4855-63.2.LiuW,LiC,HuangJ,etal.ApplicationofpathwaysactivityprofilingtourinemetabolomicsforscreeningQitonifyingbiomarkersandmetabolicpathwaysofhoney-processedastragalus.JSepSci,2018;1-11.https://doi.org/10.1002/jssc.201701371.79