蜜蜂在水稻上的访花行为及其介导花粉扩散的研究 66页

分类号：墨垒圣i：!!星密级：玉．≥{j、单位代码：!Q墨堑学号：硕士学位论文⑧210】6116蜜蜂在水稻上的访花行为及其介导花粉扩散的研究Studyofhoneybee’Svisitingbehavioronriceandricepollensdiffusionviahoneybee论文提交日期2Q13生量目 蜜蜂在水稻上的访花行为及其介导花粉扩散的研究⑧论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：墓建翅塾援逝江态堂评阅人2：旌袒坐熬握逝江太堂评阅人3：昌谴贤婴窒旦逝江省壅些型堂陵答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：彭王筮硒窒虽主国壅些抖堂随亟雅挞塾援耍jE盔莶型蕉太堂扬定塾援虫国盛些盍堂娄丞褪数援逝江太堂吐苤镘一—耋噬．—_逝江盍堂 Studyofhoneybee’SvisitingbehavioronriceandricepollensdiffusionviahoneybeeAuthor’Ssignature：Supervisor’Ssignature：ExternalReviewers：里塑￡』i垦坠堡鱼丛丛Q，兰蜮i墨坠g堕坠iy曼!§i鲤P!旦￡兰坠：H坚S鱼i，兰h自i垒塾g堕坠iY曼￡曼煦ExaminingCommitteeChairperson：Q!△g!i坌旦鲢巡垦!曼垒i曼堡垒§Q!△g煎坌坠』!!I竖垒!S垒i星坠坌曼曼ExaminingCommitteeMembers：．．Prof．Ya-LinZhang,NorthwestA&FUniversity_————Prof．DingYang,ChinaAgriculturalUniersity．．．．．．——里盟￡)也坠g=鱼星坠LQ强圣蜮i垫g堕西Y曼堡i鲤￡盟￡．鱼磐：Ⅺ旦鳖，．兰蜮堑咝．堕堕iy星堡煦Dateoforaldefence- 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特另rl／jl：l以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙j江大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日 本研究承蒙转基因生物新品种培育科技重大专项(编号：2009ZX08011．008B、2011ZX08011．006)国家重点基础研究发展计划(973)(编号：2007CBl09202)资助 浙江大学硕士学位论文致谢马上就要毕业了。我从2010年7月16曰加入我们进化生物学实验室以来，在这里度过了两年多的研究生生活。各位老师和同学对我的诸多帮助和关怀，使得我克服了许多学业和生活上的困难。回忆这两年多来，我有太多想说的话和想感谢的人了。首先要感谢的是导师陈学新教授。陈老师从我论文的选题、设计、试验到写作都给予了悉心的指导和帮助，我论文的完成凝结着陈老师无数的心血和汗水。陈老师严谨的治学态度、渊博的学识和敏锐的学术思想教导着我如何从事科研和学习。还要感谢我的导师余虹副教授，在我课题的选择，试验和论文的写作方面给予了极大的帮助和指导。在论文付梓之际，我要向陈老师和余老师致以最诚恳的谢意。、还要感谢昆虫所所有教导和关心过我的老师何俊华教授、程家安教授、刘树生教授、叶恭银教授、沈志成教授、娄永根教授、张传溪教授、施祖华教授、祝增荣教授、莫建初教授、唐启义研究员、蒋明星教授、王晓伟特聘研究员、马云高级实验师、姚洪渭副教授、鲍艳原副教授、刘银泉副教授、黄佳副教授、徐海君副教授。感谢他们在论文的开题报告、读书报告和实验过程中给予的热心指导和帮助。特别感谢娄永根教授、刘银泉副教授以及农药所的虞云龙教授在我的试验上所给予的悉心指导和热情帮助。感谢顾振芳老师、姚娅萍老师、时敏副教授、吴琼老师在我的学习和生活上所给予的帮助和关怀。感谢蒲德强博士，对试验和论文给出了具体的指导，提出了很多宝贵的建议。同时要感谢谭江丽、Maiid、高明清、曾洁、高飞、赵伟、侯守鹏、柴宏飞、叶熹骞、唐璞、李倩、王知知、董帅、王雅娜、陈晓宇、闫成进、宋胜楠、陈征、任少鹏、李明天、潘骡、刘珍、尹懿、杨帆、黄一村、谷启娟、毛娟、涂彬彬、赵双以及其他同学在学习和生活上给我的帮助和关怀。感谢李建彩、秦丽、周威，中国农业科学院茶叶研究所的李喜旺、张政群在试验器材上提供的帮助。感谢四川农业大学的陈一凯、李明超、福建农林大学实习生何雪娟、黄凯、陈庆典、中国计量学院实习生孟庆凯、张雄、湖南农业大学实习生刘金文在试验上的帮助。最后要真心感谢生我养我的父母以及家人，是他们永不枯竭的爱与关怀，教 浙江大学硕士学位论文致谢我不惧坎坷坚毅前行。感谢我的女朋友祝妮对我的帮助。感谢论文评阅人和答辩委员会的专家们百忙之中给我宝贵的指导和建议。II到家富2013年5月于紫金港 浙江大学硕士学位论文摘要水稻是亚洲极其重要的粮食作物，转研基因水稻的应用能够有效的控制水稻鳞翅目害虫的发生和危害，减少化学杀虫剂的使用。由于水稻在我国人民的食物结构中占有重要地位，转基因水稻的安全性一直是社会关注的热点问题，因此在进行商业化推广之前，有必要对转基因水稻进行细致的安全性评价。我们发现蜜蜂在水稻花期访问水稻花。本文立足于转基因水稻的基因漂移风险，首次对蜜蜂访问水稻花的访花行为进行了观察记录，并对蜜蜂介导的水稻花粉流做了初步研究，结果如下：l、转曰f基因水稻克螟稻系列品系花粉挥发物对KMDl、KMD2和KCK的花粉挥发物进行GC—MS分析，所得结果与4个标样进行对比分析，发现三个品系的水稻花粉的挥发物中都含有能引起蜜蜂CPE反应的物质：Ⅱ．蒎烯洳pinene、苯甲醛benzaldehyde和柠檬烯limonene，各种物质的出峰时间与标准样品的出峰时间相比一致，但是每种物质的响应值都比较低，这说明含量比较低。而且，三个品系的水稻花粉挥发物中都没有发现芳樟醇linalool，说明这种物质在水稻花粉的挥发物中不存在。2、意大利蜜蜂对克螟稻的访花行为蜜蜂在克螟稻三个品系KCK、KMDI、KMD2上的平均访花时间(visitingtime)依次为7．52±0．27see(n=285)、7．2l±0．28sec(n=275)和7．07±0．28sec(n=280)；平均间隔时f．-j(intervaltime)依次为4．36±O．27sec(n=285)、4．36±0．28see(n=275)和4．22+0．28sec(n=280)；访花频率依次为32．79+17．24穗／5min：33．71±17．49穗／5min和31．164-17．49穗／5min。蜜蜂在三个品系上的访花时间、间隔时间和访花频率没有显著性差异。3、蜜蜂介导的水稻花粉流2年的调查结果显示，蜜蜂可以将水稻花粉携带至最少500m的距离，随着距离的增加蜜蜂携带的花粉数量呈现逐渐减少的趋势。检测了蜜蜂携带至500m处的花粉活性，81．1±2．0％(n-6)的花粉仍具有活性。调查了蜜蜂对田间空气中水稻花粉密度的影响，结果显示处理组所得水稻花粉平均值为103±12(n=44)，对照组为71±7(n--45)，两者之间存在显著性差异，说明蜜蜂111 浙江大学硕士学位论文摘要的访花行为能显著地增加空气中花粉的密度。关键词：转基因水稻，意大利蜜蜂，水稻花粉，访花行为，花粉挥发物，花粉流，基因漂移，安全性评价。IV 浙江大学硕士学位论文AbstractTransgenicBtriceisabletocontrollepidopteranpestseffectivelyandreducetheconsumptionofpesticides．However,ricefeaturesprominentlyinourChinesedietandthesafetyoftransgenicriceisalwaysthefocusquestion，beforethecommercialpromotionitisnecessarytomakeadetailedriskassessmentoftransgenicrice．Wediscoverthathoneybeevisitsriceflowerduringflorescence．Toassesstheriskofgenedriftoftransgenicrice，weinvestigatedtheflowervisitingbehaviorofhoneybeeandthedistanceofricepollendispersedbyhoneybee．Theresultsarcdescribedasbelow：1．PollenvolatilesoftransgenicKMDstrains．WeanalyzedthevolatilesofricepollenofKMD1，KMD2andKCKusingGC-MSmethod．Theresultshowsthatallthesethreevarietiesofricepollencontain0【-pinene，benzaldehydeandlimonen，whichcanevokehoneybee’SCPEreaction,butlinaloolisabsent．Theretentiontimeofthesecomponentsisthesameasthestandardsamples，buttheresponsevaluesarelower,whichindicatethatthecontentofthesecomponentsinricepollenislow．2．VisitingbehaviorofEuropeanhoneybeetoKMDstrainsTheaveragevisitingtimesofhoneybeetoKCK，KMDlandKMD2is7．52士0．27sec(n=285)，7．21土0．28sec(n-275)and7．07土0．28see(n=280)；averageintervaltimesis4．36i-0．27sec(n=285)，4．36士0．28sec(n=275)and4．22_-1：0．28sec(n=280)；visiting仔equencyis32．794-17．24tassels／5min；33．714-17．49tasslesJ5min和31．164-17．49tassels／5min．Thereisnosignificantdifferenceamongthesethreetransgenicricestrains．3．RicepollenflowmediatedbyhoneybeeAtwo-yearinvestigationrevealsthathoneybeecancarryricepollenstoatleast500maway仔omricepollensource．Theamountofricepollenscarriedbyhoneybeegraduallydecreasedastheflyingdistanceincreased．Theviabilitytestofpollensatdistance500mindicatedthat81．1±2．0％(n=6)ofpollensarestillalive．Theexaminationofpollendensityinairshowsthattheaveragevalueinplotstreatedwithhoneybeeis1034-12(n=44)whilethatinthecontrolplotswithouthoneybeeis71±7V 浙江大学硕士学位论文Abstract(n=45)，whichindicatesthatvisitingbehaviorofhoneybeecansignificantlyincreasethepollendensityinair．Keywords：transgenicrice，Europeanhoneybee，ricepollen，visitingbehavior,pollenvolatile，pollenflow,geneflow,safetyassessment 浙江大学硕士学位论文目录致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11lAbstract⋯．．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．⋯．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．⋯．⋯⋯．．．V第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1转基因水稻的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2转基因水稻的基因漂移⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3花粉流(pollenflow)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4蜜蜂访问水稻花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9第二章水稻花粉挥发物⋯⋯j⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．1供试水稻⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．2供试试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．3水稻花粉挥发物提取装置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．1．4水稻花粉挥发物的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l62．3结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第三章转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．213．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．1供试水稻⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．223．1．2供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．1．3其他器材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223，2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．2．1访花时间(visitingtime)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．2．2间隔时间(intervaltime)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．2．3访花频率(visitingfrequency)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．4访花行为的描述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23 浙江大学硕士学位论文目录3．3。l访花时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．3．2间隔时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．3．3访花频率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．3．4访花行为的描述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26第四章蜜蜂介导的水稻花粉流⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．284．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯284．1．1供试水稻⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．284．1．2供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．294．1．3溶剂试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．294．1．4其他器材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．294．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯294．2．1蜂箱放置地点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．294．2．2捕捉蜜蜂与蜂花粉的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．304．2．3确定水稻花粉并进行花粉计数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．2．4蜜蜂携带的水稻花粉活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．304．2．5蜜蜂访花行为对稻田空气中花粉浓度的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．314．3．1蜜蜂携带水稻花粉的飞行距离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l4．3．2蜜蜂携带的水稻花粉活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314．3．3蜜蜂访花对稻田空气中花粉浓度的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l4．3．4水稻花粉电镜照片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．324．4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一34第五章总讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43 浙江大学硕士学位论文文献综述第一章文献综述1．1转基因水稻的研究现状水稻OryzasativaL．是亚洲乃至世界人口重要的粮食作物，全世界大部分人1：2以水稻作为主粮，尤其是在东南亚、中东、拉丁美洲、非洲和印度等地区。在我国，水稻更是有举足轻重的作用，中国是稻作历史最悠久，水稻遗传资源最丰富的国家之一，我国至少有7000年以上的水稻栽培史(Zongetal．。2007)。稻田是一个面积广阔的有机生态系统。在这个系统中稻飞虱、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟等是危害水稻的重要害虫。这些害虫可以发生在水稻发育的各个时期，并且以卷叶，钻柱，刺吸汁液等方式方法危害水稻的正常生长，给水稻生产带来巨大的危害，影响水稻产量。有数据显示，即使在加以防治的情况下，每年因为病虫害仍可给全国水稻生产造成400—500万吨的经济损失(雷惠质和江建云，1992；Cheneta1．，2011)。在水稻害虫的防治策略里，化学防治占据着主导地位，化学农药的使用曾经为水稻的保产保量做出过突出贡献。但是近年来使用化学农药带来的负面效应也逐渐凸显出来。化学农药会改变生物群落、生物种群组成、降低生物群落多样性、降低生态系统稳定性、杀伤天敌、引起害虫再猖獗等(张宗炳，1988)。另外，我国人口大量增长，耕地却不断减少，环境污染严重，农业生产面临着巨大挑战，必须有新的技术来解决我国农业面临的难题。转基因生物技术的出现，为我国农业的发展带来了新的机遇，为我国农业的可持续发展和提高我国农产品的国际竞争力提供了新途径。1987年比利时学者Vaeck等人使用根癌农杆菌介导法成功育成抗烟草天蛾的转CrylAb基因植株，自此之后转基因技术在植物育种领域的应用获得了长足的发展(Vaecketal．，1987)。截止到2012年，全球转基因作物种植面积达到了1．703亿公顷，比2011年增长了1030万公顷，年增长率6％。转基因作物从1996年的170万公顷增长到2012年的1．7亿公顷，增加了近100倍(ISAAA，http：／／www．isaaa．org／resources／publications／briefs／44／executivesummary／defauk．asp)。作为重要的粮食作物，转基因水稻一直是世界各国的研究重点。1988年第一批转基因水稻问世以来，经过20多年的发展，各国已经开发出了许多有应用价值的转基因水稻品种。2000年，美国批准了1个抗除草剂转基因水稻品种；2005年伊朗批准了1个转基因抗虫水稻的商品化种植；2006年，加拿大批准了一个1 浙江大学硕士学位论文文献综述抗除草剂转基因水稻品种；2007年，墨西哥批准了一个抗除草剂转基因水稻品种；2007年，日本批准了2个抗花粉过敏转基因水稻品种，但只允许实验种植；2008年，哥伦比亚批准了一个抗除草剂转基因水稻品种；2009年，中国批准了2个抗虫转基因水稻品种；2010年，澳大利亚批准了一个抗除草剂转基因水稻品种(旭日干等，2012)。我国早在上世纪90年代就开始了转基因水稻的研究。例如，浙江大学核农所从1994年就开始从事转研基因水稻育种的研究，目前已经成功培育出对水稻二化螟高抗的“克螟稻”系列转基因水稻品系，一系列实验证实其对二化螟具有良好的抗性(王世贵等，2003；王世贵等，2006)。目前获得批准的转基因水稻品种集中于提高抗虫和抗除草剂的相关性状。抗虫基因利用最多的是研抗虫基因。历基因是转基因植物中常用的外源基因。Bf基因来源于苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(简称Bt)。苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性茵，广泛存在于土壤、水、尘土、植物以及动物体中。1901年，日本学者石渡繁胤从染病的家蚕体内首次分离出历菌(Ishiwata，1901)。1915年Berliner发现在芽孢形成的过程中，Bt菌的一端出现小的结晶，但不知与杀虫活性有关(Berliner,1915)。苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的过程中能产生岔杀虫结晶蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，这种杀虫蛋白也被称为6-内毒素(6．endotoxins)。目前，人们已经分离出近180个对不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、螨类等)和无脊椎动物(如线虫、原生动物等)有特异毒杀作用的历毒蛋白，根据寄主范围，厨杀虫蛋白可以分为4类：(砂I(鳞翅目昆虫专一性)；CryII(鳞翅目和双翅目昆虫专一性)；CryIII(鞘翅目昆虫专一性)和CryⅣ(双翅目昆虫专一性)(旭日干等，2012)。当Bt毒蛋白以结晶形式被鳞翅目昆虫摄入体内之后，由于昆虫中肠环境显碱性，蛋白结晶会在碱性环境下水解，形成有活性的多肽。它能与昆虫中肠上皮细胞特异性位点结合，造成昆虫中肠细胞膜的微小穿孔，破坏细胞渗透压从而导致细胞肿胀破裂，最终引起肠穿孔，造成害虫死亡(Schnep￡1998)。转基因经济作物的应用虽然取得了巨大社会效应，但其安全性也是研究人员一直关注的问题。John等发现转基因玉米花粉对君主斑蝶Danausplexippus的幼虫具有致死作用(Johneta1．，1999)。Lu等(2010)对华北棉花主产区进行了多 浙江大学硕士学位论文文献综述年大范围调查后，得出的结果显示，随着转研基因棉花种植面积的增长，原来的次要害虫，半翅目的盲蝽Heteroptera：Miridae，种群不断扩大，逐渐成为了棉田的主要害虫。2002年，美国的Iowa州生产疫苗用的转基因玉米通过基因漂移的途径污染了周围的普通玉米，造成63公顷玉米被迫强制焚毁的后果(Ellstrand。2003a)。一系列的转基因生物安全事件令转基因植物的安全性评价受到越来越多的重视，并成为了科学研究和社会关注的焦点问题。转基因作物商业释放前进行详细的安全性评价是必须要进行的一项严肃和严谨的工作。转基因生物安全是指：转基因生物技术及其遗传修饰产品在研究、实验和利用的全过程中对人类社会和生态环境造成的不利影响和危害，以及研究和避免这种可能危害的方法和途径(Snow&Palma，1997；Snow,2002；Snoweta1．，2005)。转基因作物的安全性评价主要包括以下几个方面：(1)对非靶标生物的影响，转基因生物是否会对非靶标生物有直接或间接的不良影响。(2)对靶标害虫抗性进化的影响。害虫可以对化学农药产生抗药性，同样的，在抗虫转基因植物的压力下害虫也可以产生抗性。(3)基因逃逸的影响，转基因植物的外源基因通过花粉，种子，繁殖体等方式逃逸到近缘种，从而对环境安全产生影响。(4)对人类健康的影响。转基因作物或者其产品直接被人食用或其他用途对人体是否安全。(5)转基因作物也有成为杂草的可能。大多数作物都有成为杂草的潜力，一些作物在不同的环境之下就是杂草，甘蓝属Brassica的一些植物既可以是作物也可以是杂草，这一类转基因作物若管理不善，极有可能逃逸并演变成杂草(Kerlan,1993)。1．2转基因水稻的基因漂移对转基因水稻进行生物安全性评价和研究是一项非常紧迫的重大课题。其中，水稻中的外源基因是否会通过基因漂移进入非转基因水稻及野生近缘种，从而引发一系列的生态风险，是转基因水稻环境安全评价的核心问题。转基因漂移(transgenedrift)，也被称为转基因逃逸(transgeneescape)，是指外源基因通过花粉、种子、繁殖体等介导体，由转基因生物转移到非转基因生物的现象。通过基因漂移作用，外源基因可以转移到非转基因作物或者野生近缘种，例如一些野生杂草，引起不可预期的生态后果。一些非转基因作物也可能成为转基因作物和野生近缘种之间基因漂移的桥梁，从而增加了外源转基因向野生品种转移的可能性(Elistrand，2003b)。 浙江大学硕士学位论文文献综述植物的转基因漂移包括三种途径：a)同种作物的不同品种之间(crop-to．crop)的转基因漂移；b)转基因作物向野生近缘杂草(crop-to．weed)问的基因漂移；c)转基因作物向野生近缘种群(crop-to．wild)间的基因漂移(Rongetal。，2007)。转基因外源基因逃逸必须同时满足3个条件：(1)空间上，转基因水稻和非转基因水稻及野生近缘种分布重叠，相邻生长：(2)时间上，转基因水稻、非转基因水稻及野生近缘种花期相遇，不同品种之间能发生花粉的交流；(3)生殖生物学上，转基因水稻和非转基因水稻及野生近缘种具有杂交亲和性，且杂交后代可育(Lueta1．，2002)。如果一种转基因作物与其近缘物种能同时满足上述3个条件，这两者则很有可能发生杂交，致使转基因作物的外源基因发生逃逸，进入近缘种基因库，引起不可预知的生态后果。水稻为同源二倍体(2n=24)，隶属于单子叶植物纲Monocotyledoneae。禾本科Poaceae，稻属Oryza，白花授粉植物，其天然异交率一般在1％以下，最高可达5％(Oka，1988)。水稻花穗为圆锥花序，开花顺序为先从主轴上开花，其次是上部的枝梗开花，然后从上向下各枝梗依次开花。在阳光充足、气温高的情况下一般是上午10点左右开始开花，中午最盛，15点以后很少开花，一朵小花的开放大约持续1．5h．2h，水稻花期一般为7．10天。水稻花在天气晴好的情况下开花状态好于天气阴湿的情况。水稻花粉寿命较短，栽培稻品种的花粉在适宜的温湿度下从花药散出去的存活时间仅为3～5分钟，野生稻的花粉在离开花药后存活时间最长可达9分钟。柱头的生活力在去雄后可维持6d左右，去雄后1-2d内授粉结实率最高(李训贞，2002)。几乎所有的栽培作物都有杂草类型和野生近缘种，而且它们之间都存在不同程度的可杂交性(Ellstrandetal．，1999)。亚洲栽培稻的野生近缘种，多年生的普通野生稻OryzarufipogonGriff．，是公认的亚洲栽培稻的祖先种，是水稻遗传改良的重要种质资源库(Song，2005)。普通野生稻在我国的分布正逐年减少，不少普通野生稻种群正濒临灭绝，对普通野生稻的保护已经迫在眉睫。转基因水稻对普通野生稻的生态学影响和生物学影响也是转基因水稻安全性评价的重要方面。从地域上讲，栽培稻和普通野生稻在许多国家和地区都有重叠分布，且花期相遇，它们在遗传上也具有很近的亲缘关系和较低的生殖隔离，而且两个物种发生自然杂交的现象常有报道。 浙江大学硕士学位论文文献综述野生稻在世界范围内广泛分布，约有15．17种，主要有分布在亚洲多年生的野生稻D．rufipogon和一年生的印度野生稻onivara；分布在非洲多年生的长雄野生稻D"longistaminata和一年生的短舌野生稻D’barthii；分布在拉丁美洲和南美洲多年生的大颖野生稻Dglumaepatula以及分布在澳大利亚和新几内亚一年生的南方野生稻Dmeridionalis。这些野生稻与栽培稻重叠分布，花期相遇，而且在生殖生物学上有较高的可杂交性，并可能产生育性较高的杂交后代。在自然环境中，栽培稻与多年生普通野生稻也经常杂交产生后代(Oka&Chang，1961)。我国是普通野生稻的北缘分布区，普通野生稻在我国有着丰富的遗传多样性，是可供利用的重要的种质资源库，在水稻育种领域里具有很高的利用价值(Wangeta1．，1996；Gao，1997；Geeta1．，1999；Songeta1．，2001)。转基因水稻到多年生普通野生稻的基因漂移很可能会降低普通野生稻的种质利用价值，污染野生稻的基因库，甚至改变野生稻的环境适合度，造成野生稻种群的萎缩，或者演变为新的杂草。杂草稻(weedyrice)是栽培稻的杂草类型。杂草稻通常生长于栽培稻稻田中，在全世界大部分稻作区都有分布，特别是在南美洲，中美洲，美国，欧洲南部，东南亚和南亚等地。由于杂草稻极强的落粒性和特殊的休眠性，一旦侵入水稻田就很难控制和根除，一些水稻田内，由于杂草稻的危害带来的损失可以高达10％～20％(Caoeta1．，2006)。杂草稻和栽培稻的亲缘关系很近，在自然状况下很容易发生杂交从而引起基因漂移。假设一旦转基因水稻的某些抗性相关的外源基因，例如与抗虫抗病，抗除草剂，抗盐碱等性状相关的基因，通过基因漂移的方式转移进杂草稻，这无疑会增强杂草稻的抗逆性，提高杂草稻的环境适合度，令杂草稻变得更加难以防治，对农业生产造成巨大损失，破坏生态环境的平衡。但是如果漂移转入杂草稻的外源基因不是关于增加水稻抗性的基因，例如提高蛋白含量，维生素含量等与提高水稻适合度无关的外源基因，这类基因的转入并不能增加杂草稻的环境适合度，一般也不会导致生态风险。已有的水稻基因漂移研究表明，栽培稻品种间的基因漂移频率较低，栽培稻到杂草稻的基因漂移频率波动较大，而栽培稻到近缘野生稻的基因漂移率较高。Langevin等设计实验检测了栽培稻到杂草稻的基因漂移情况，实验结果显示了较大的基因漂移频率波动：1-52％，并认为，杂草稻有着波动范围较大的开花历 浙江大学硕士学位论文文献综述期，从而与栽培稻的花期重叠有着不同程度的差异，并最终导致异交结实率的差异(Langevineta1．，1990)。Wheeler等检测了转抗除草剂基因水稻到杂草稻的基因漂移，结果也显示了较大的基因漂移频率波动：0．8～19．7％(Wheeleretat．，2000)。Messeguer等对抗除草剂转基因水稻到杂草稻的基因漂移率进行了实验检测，却得到了较低的实验结果：平均仅为0．036％(Messeguerela1．，2004)。Chen等模拟杂草稻在水稻田间的自然发生情况，将来源不同的杂草稻植株种植于抗除草剂(bar)转基因稻田中，所得到的基因漂移率也很低，为O．011-0．046％，在一些杂草稻的种子中完全检测不到有转基因漂移的情况，这可能是因为杂草稻和栽培稻的开花期不重叠，以及杂草稻具有较高的植株高度，比转基因栽培稻约高10---60cm(Cheneta1．，2004)。Oka&Morishima根据经验公式估计野生稻的异交率波动范围为：5～100％，其中亚洲多年生的普通野生稻。．rz班pogon的异交率估计值为40％，一年生的普通野生稻D．nivara的异交率估计值为5-20％(Oka&Morishima，1967)。Oka&Chang曾用实验估计栽培稻和普通野生稻之间的基因漂移情况，以8株栽培稻围绕I株野生稻的形式种植，收获的野生稻的种子应用标记性状估计的基因漂移率为30．7％(Oka&Chang，1961)。Song等设计受控实验研究了田间自然情况下由栽培稻恢复系明恢63到多年生普通野生稻Dmfipogon的基因漂移率，结果显示的基因漂移率可高达2．97％(Songelal．，2003)。Wang等检测了抗除草剂转基因水稻到多年生普通野生稻的基因漂移率，在lm内的距离，基因漂移率高达11～18％，但是随着距离的增加，基因漂移率则迅速衰弱，但在最远的250m处检测到基因漂移产生的杂种(Wangetal．，2006)。栽培稻是自花授粉植物，异交结实率低，Oka&Morishima根据经验公式估计栽培稻的异交率在0～5％(Oka&Morishima，1967)。刁立平等检测了15个水稻常规品种的异交率，除了3个品种的异交率分别为1．57％，2．88％，3．63％，其余品种的异交率皆低于1％(刁立平等，1996)。林鸿生等在不同距离处检测抗除草剂转基因的基因漂移率，结果显示在1m，3n1，6rn和10m处分别为1％，o．5％，0和0(林鸿生等，2000)。Messeguer等的实验证实，抗除草剂转基因水稻到非转基因水稻之间的基因漂移率最高只有0．53％(Messegueretal．，2001；Messegueretal．，2004)。根据已有研究数据，栽培水稻的异交率都小于5％， 浙江大学硕士学位论文文献综述然而对于通常情况下水稻品种间的基因漂移仍然了解不多，不同研究人员得出的结果差异较大，关于影响基因漂移频率的因素及其作用机制的研究更是缺乏。目前，各国也在努力研究控制花粉和种子介导的基因漂移的手段和方法，例如终止子技术、雄性不育技术、叶绿体转化技术、外源基因清除技术等分子生物学手段(PalMaliga,2004；Hongeta1．，2009；Liangela1．，2012；单晓呋等，2006；周银等，2008；刘香利等，20lO：张茜等，2011)。这些方法是用分子生物学手段将转入的外源基因或者标记基因从花粉和种子等器宫中移除以防止基因漂移或其他潜在风险。但是生产上常用距离隔离和花期隔离来的方法来管理转基因水稻的基因漂移。各国政府也都制定了相关法规来规范转基因作物的科研生产。1996年我国首次出台的《农业转基因生物安全管理条例》中，提出了不同转基因作物的安全隔离距离，如水稻i00m，玉米300m，棉花150m等。1．3花粉流(pollenflow)花粉流(pollenflow)是指借助风力或昆虫等的作用，将植物雄蕊中的花粉传播到其它地方或区域的过程。通过风力作用传粉的称为风媒花，通过昆虫作用传粉的称为虫媒花。花粉流(pollenflow)是植物基因流的物质载体，研究花粉流的运动规律对转基因植物基因漂移的研究具有重要的意义。花粉介导的基因漂移有一定的规律性，对花粉流的研究结果具有重要的理论意义和指导生产实践的应用价值，因此是研究植物基因漂移中最受关注的问题(Ellstrand，2003b；AndowPfa1．．2006)。水稻花属于风媒花，其花粉流主要受风力的作用而运动，但是我们的研究却发现，在水稻花期内有多种昆虫受到水稻花粉的吸引而对水稻花进行访问，例如蜜蜂、食蚜蝇、麻蝇、家蝇等常见昆虫。水稻虽然是风媒花，但是由于在扬花期水稻可以提供大量的新鲜花粉作为采粉昆虫的食物报酬，这对于蜜蜂、食蚜蝇等主要以花粉为食的昆虫无疑具有巨大的吸引力。而蜜蜂又是典型的访花昆虫，多毛的身体构造非常符合植物传播花粉的需要，这就使得水稻花粉可以粘附在蜜蜂身体上做长距离的转移。因此，我们在讨论水稻花粉受风力作用进行扩散的同时，也必须考虑重要的访水稻花昆虫，例如蜜蜂，对水稻花粉扩散的影响，这对转基因水稻基因漂移的研究具有重要意义。通过花粉扩散介导的基因漂移是植物界的一般规律，促进了近缘可杂交植物 浙江大学硕士学位论文文献综述之间的基因交流，引起植物之间的杂交，保证植物进化呈现出多样性。基因漂移并非从转基因作物才开始，转基因作物的基因漂移之所以引起重视，是因为转基因作物中的外源基因来源于亲缘关系很远的物种。例如，目前广泛使用的研抗虫基因，就来源于苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis；CpTI抗虫基因则来源于栽培豇豆的加利福尼亚黑眼豆VignaunguiculataL．；RDV抗病毒基因则来源于水稻矮缩病毒(ricecommondwarfvirus)。外源基因的转入令修饰过的传统作物对生态环境以及经济社会具有了不确定的风险性，这是人们研究转基因作物安全性的原因。如果外源基因不改变转基因作物的显花特征和生殖生物学特性，其花粉扩散和基因漂移其实与传统作物没有本质上的区别。这也是我们通过对非转基因作物基因漂移的研究，来评估转基因作物基因漂移风险的理论基础。研究显示，花粉漂移和基因漂移有明显的相关性。这可能是因为植物基因漂移的主要途径为花粉，而种子和繁殖体的转移则处于辅助地位，在自然情况下，种子和繁殖体的转移更容易管理和控制。而花粉的转移则不易被管理。并且，显花植物之间发生杂交的根本方式最终要靠花粉的交流；种子和繁殖体的转移需要下一代个体能够发生成功的花粉交流引起杂交，才能实现基因的漂移。根据已有的研究数据，基因漂移率随着距离的增加快速下降，也可能是花粉的漂移规律所决定的，因为根据已有的数据及数学模型公式，空气中供体花粉浓度随着离花粉源距离的增加而快速衰减。而且花粉流还表现出规模效应(scale．effect)，花粉源面积大时，花粉流的强度也大，较小规模的实验难以外推(Scheffier＆Dale，1994；Songetal．，2003；Songeta1．，2004)。但是，Rong等对水稻基因漂移规模效应的研究结果显示，基因漂移并没有随着实验规模的增大而呈现出相应的增长趋势，模型的模拟结果更显示了逐渐下降的趋势，这意味着小规模的水稻基因漂移实验可以为大规模的水稻生产提供参考(Rongela1．，2007)。这主要是因为规模效应的应用方面的不同，前者关注于花粉流的运动规律，规模效应明显。后者主要关注于基因漂移率，因为水稻基因漂移不仅要受供体花粉的影响，也受到受体花粉竞争的影响，这造成了花粉漂移和基因漂移在规模效应上的不同表现。花粉介导的基因漂移可能受到以下因素的影响：(1)花粉供体(pollendonor)和花粉受体(pollenreceiver)的杂交亲和性；(2)花粉供体和花粉受体的距离远近；(3)花粉供体和花粉受体花期和花时的重叠程度(overlapping)；(4)花粉 浙江大学硕士学位论文文献综述供体的花粉流(pollenflow)；(5)花粉受体的异交率(outcrossingrate)：(6)花粉竞争效应(pollencompetition)；(7)气候因素(如风向、风速、温度、湿度、光照等)以及其他环境条件(Lueta1．，2003；Walklate，eta1．，2004；Gustafsoneta／．，2005)。当然，要根据不同的研究对象对上述影响因素进行具体的分析，在具体问题具体分析时要充分考虑不同因素的影响，才能得到比较符合实际情况的结果。正是由于花粉介导的基因漂移影响因素很多，所以对花粉流进行准确的估计和预测也有较大难度。1．4蜜蜂访问水稻花植物具有固着生长的习性，所以植物的繁殖需要一定的媒介来传播花粉。植物的花粉流跟传粉媒介密切相关。根据传粉媒介类型的不同，植物可分为生物传粉和非生物传粉。生物传粉的媒介有昆虫、鸟类和哺乳动物等类别(Goldingayet甜．，1991)，非生物传粉的媒介主要有风媒传粉和水媒传粉两大类(Niklas，1985；Cox,1988)，水媒花和风媒花一般具有更高的花粉量。植物的花粉、柱头和传粉媒介三个部分构成一个系统，即传粉系统。Crane等对化石资料的研究表明，在白垩纪早期和中期的传粉系统都属于虫媒传粉(Craneetal．，1995)。一般认为非生物传粉是生物传粉的衍生状态，但传粉系统在进化上是不稳定的，一些典型风媒系统的禾本科植物在热带雨林中是依赖昆虫传粉的(Faegrieta1．，1979)。Manuela等在意大利ColliBerici地区的研究证实，蜜蜂经常性地对两种具有典型风媒花特征的植物百花蜡树FraxinusorrlRsL．和栗属植物CastaneaMiller进行访花，并对蜜蜂访花行为进行了细致研究(Manuelaeta1．，2011)。本研究组对水稻访花昆虫种类的一项研究表明，水稻虽然属于于典型的风媒花传粉系统，但是在花期内也有多种昆虫对其进行访花。关于蜜蜂访问水稻花并采集水稻花粉的现象前人已有若干报道。早在1977年，就有学者观察到蜜蜂对水稻花粉进行采集的现象，并对蜜蜂为水稻授粉的效果进行了初步探讨(徐景耀，1977)。赖友胜等发现，在水稻开花期间，如果外界缺乏粉源时，蜜蜂就倾向于采集水稻花(赖友胜等，1985)。余玉生等报道了云南蒙自草坝地区蜜蜂采集水稻花的现象(余玉生等，1999)。沈育初报道了浙江地区蜜蜂采集杂交水稻花粉的现象(沈育初，2002)。王丽华等研究了在晚稻期间(9月中旬)蜜蜂采集的新鲜花粉，发现水稻花粉占比68．1％、萑草花粉占9 浙江大学硕士学位论文文献综述比14．O％、紫薇花粉占比11．4％。认为在其他花粉源较少，水稻开花盛期的情况下，水稻花粉对蜜蜂有吸引力，蜜蜂对水稻花粉显示偏爱性，并提出了转基因水稻花粉可能对蜜蜂存在潜在的影响(王丽华等，2005)。胡跃东(2010)在河南范县地区的观察发现蜜蜂积极访问水稻花，并提出了水稻花粉可以作为蜂群繁殖越冬的良好粉源。刘朋飞等用蜜蜂依存度估价法评估蜜蜂授粉的经济价值时指出，水稻对蜜蜂也存在一定的授粉依存度，虽然数值很低(0．04)，但仍然有较大的经济利用价值(刘朋飞等，2011)。转基因水稻的出现增加了研究蜜蜂访问水稻花的复杂性。转基因水稻可能会对蜜蜂的生理或行为产生潜在影响。另外，由于蜜蜂是很重要的访花昆虫，对多种植物具有很强的授粉能力，而且可以提高水稻的异交率，这可能会使蜜蜂影响转基因水稻的基因漂移。所以，转基因水稻与蜜蜂问的影响是双向的，而非单向的。转基因水稻与蜜蜂间的安全性评价也应该从这两个方向展开研究。意大利蜜蜂和括melliferaL．，隶属于膜翅目Hymenoptera，蜜蜂科Apidae，是自然界中重要的访花昆虫。因为其具有比中华蜜蜂ApisceranaFabricius更加优越的生产能力，所以意大利蜜蜂正在逐步取代中华蜜蜂，成为我国蜂农养殖的主要品种。意大利蜜蜂具有很强的授粉能力。Rodet等观察研究了蜜蜂对白三叶草授粉的影响，发现在有蜜蜂访花的情况下雌蕊上的花粉沉积比对照高了30％(Rodetetat．，1998)。Calzoni等在意大利Faenza地区对比了意大利蜜蜂A．mellifera,角壁蜂Osmk7cornuta,陆熊蜂Bombusterrestris三种传粉昆虫对李PrunussalicinaLindl．产量的影响，结果表明意大利蜜蜂传粉的处理中产量最高(Calzonieta1．．1998)。昆虫访花并为植物传粉的目的是为了寻觅食物，例如植物花朵中存在的富含营养的花蜜、花粉等，所以植物的花部特征是影响蜜蜂访花行为的重要因素(Heinrich&Raven，1972；Pellmyrela1．，2002)。对花部特征进行研究可以从花部构成和开花式样两方面入手(Barrett&Harder，1996)。花部构成(floraldesign)是指花的结构、颜色、气味和给访花者提供的报酬等所有单花特征；开花式样(floraldisplay)是指花在某一时刻开放的数量和在花序上的排列方式(黄双全和郭友好，2000)。此外，温度、风速、降雨等也会影响蜜蜂的访花行为。访花频率是研究传粉昆虫访花行为的常规项目，而且十分必要。昆虫访花频10 浙江大学硕士学位论文文献综述率可以作为计算昆虫能量摄入和能量投资的一个指标(Wilson&Thomson,1991：Kearn&Inouye，1993)。研究访花频率可以对三个变量进行测量：(1)访花时间(visitingtime)，定义为昆虫从上花并对花朵进行操作和采粉采蜜操作所需的时间；(2)间隔时间(intervaltime)，定义为昆虫从一朵花飞到下一朵花所需要的时间；(3)昆虫从一朵花飞到下一朵花所需要飞行的距离(Harder,1983)。由于在水稻田中水稻花穗与花穗之间的距离很短，且距离比较固定(因为水稻的种植行距比较固定，差距不大)，所以在本文中第三项变量不做研究。对于两个时间变量，一般的测量方法有两种：(1)直接计时法，使用秒表对昆虫的访花行为进行观察，记录访花时间和间隔时间；(2)使用数码录像设备将昆虫的访花过程记录下来，然后播放录像就可以准确计算相关变量(Strickler,1979；Waser&Price，1985；Catar,1991)。直接计时法有两种方式，一种是记录不同昆虫的不同访花时间，然后求平均值，另一种是记录总的访花时间，然后除以访花数量。问隔时间也可以用相同的方式进行观察记录。在有些情况下，若访花时间过于短，也可以对间隔时间进行记录，然后用总的时间减去间隔时间，即可得到访花时间(Catar,1991)。使用数码设备可以节省人力。Cane与Payne使用录音机和麦克风，记录访问杜鹃花科越橘属Vaccinium的几种蜂类的访花时发出的声音，然后将记录的声音进行慢放，从而得到了相关访花数据(Cane&Payne，1988) 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物第二章水稻花粉挥发物水稻属于典型的风媒花，不需要昆虫的传粉，且自花授粉。蜜蜂属于典型的访花昆虫，可以为多种植物授粉，能为作物提高产量。一般认为，水稻花并不需要访花昆虫的帮助，即可完成授粉。所以在花部构成上，水稻花不具有吸引访花昆虫的典型特征，例如色彩鲜艳的花冠，提供大量花蜜，浓郁的花香等。关于蜜蜂访问水稻花并采集水稻花粉的现象前人已有若干报道(见前文)。由此可知，蜜蜂访问水稻花并不是偶然为之，而是一个常规行为。大部分的观点认为在水稻开花期间，其他粉源较为匮乏，而水稻扬花期为从上午10：00左右到下午14：00左右，与蜜蜂日活动规律相符。这种情况下，水稻花粉不失为蜜蜂觅食的一个良好选择。植物的花部构成是影响蜜蜂访花的重要因素，花部构成(floraldesign)是指花的气味、结构、颜色和给访花者提供的报酬等所有单花特征，这些特征性状都可作为蜜蜂寻找蜜源植物的线索。其中，气味是影响蜜蜂对蜜源植物定位的重要因素。植食性昆虫在寻找寄主植物的过程中，可以利用触角以及下颚须等身体部位分布的嗅觉感受器对植物的特异性化合物识别，并确定植物位置从而寻找到寄主植物(Visser,1986；Butteryela1．，1988)。在蜜蜂访花觅食所能利用的线索中，被蜜蜂学习地最快的是嗅觉方面的线索(MargaretetaL，1997)。越来越多的证据表明，蜜蜂觅食对花朵的确认是基于花朵挥发物中几种关键性的化学物质。对六种人工合成的化合物(这六种物质被证明在油菜花朵挥发物中含有)的生测实验证实，在吸引蜜蜂方面，一些化合物组成的混合物比另一些更有效(Pham．Del69ueeta1．．1993；Wadhamseta1．，1994)。Dobson(1987)研究了三种菊科植物和一种豆科植物花朵挥发物对独栖蜂．分舌蜂Colletes丘姆批longiplumosus的吸引，结果显示，引起蜂取食反应的化合物存在于花粉鞘(poilenkitt)。蜜蜂的一种嗅觉反应，即条件伸喙反应(ConditionedProboscisExtensionresponse．CPE)被用来检验化合物的生物活性，CPE反应常用来评测蜜蜂的学习行为(BittermanelaL，1983；Smith，1991)以及蜜蜂确认化合物的行为(Getz&Smith。1991)。虽然CPE反应使用的是训练过的蜜蜂，在非自然环境下进行，但是作为研究蜜蜂对复杂化学混合物的辨识，此实验仍不失为一种有效的技术手段，12 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物而且CPE反应与自由飞翔的觅食者的觅食行为密切相关(Mauelshagen&Greggers，1993)。花朵挥发物是植物与蜜蜂进行信息交流的重要物质，其组分的改变有可能影响蜜蜂的觅食行为。转基因水稻中外源基因的插入是否改变了水稻花朵挥发物组分的研究尚不多见。有研究显示，转基因植物的外源基因并未改变植物挥发物的构成(Tabei，2002；Koga—Baneta1．，2004)。但是Edgardo等的实验结果显示，转抗病毒基因的小麦的挥发物组分产生了变化，与对照相比，对禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi产生了一定的趋避作用(Edgardoeta1．，2004)。因此，在研究转基因水稻对蜜蜂访花行为的影响时，探讨转基因水稻花朵挥发物的组成就显得很有必要。本章试图从水稻花粉挥发物方面解释蜜蜂访问水稻花的现象。根据前人的报道，我们选取了四种可以引起意大利蜜蜂CPE反应的物质作为本实验中的目标物质进行检测。这些物质是昏松萜0【．pinene、苯甲醛benzaldehyde、柠檬烯limonene、芳樟醇linalool(Margaretetal．，1997)。由于水稻花没有花瓣等结构，最突出的结构即花药和柱头，而且蜜蜂访问水稻花的主要目的在于采集水稻花粉，所以我们提取了克螟稻两个转基因品系及其亲本水稻的花粉挥发物，来检测是否含有上述四种物质，作为迸一步评价蜜蜂对水稻访花行为的基础数据。 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物2．1材料与方法2．1．1供试水稻克螟稻系列：克螟稻l(KMDI)，克螟稻2(KMD2)，秀水11(KCK)。三个品系的水稻在浙江大学华家池农场内相邻种植。该系列品系水稻由浙江大学和加拿大渥太华大学通过根癌农杆菌介导法合作培育。所转外源基因为CrylAb基因，亲本为粳稻品种“秀水11”，使用双元载体PKUB，含有抗潮霉素的hph基因和抗卡那霉素的nptII和gus基因，利用潮霉素筛选得到合格株系，由专家组审定命名为：“克螟稻l”和“克螟稻2”(舒庆尧等，1998；项友斌和叶恭银，1999)。2．1．2供试试剂标准样品a—pinene、benzaldehyde、limonene、linalool。购自SIGMA-ALDRICH公司2．1．3水稻花粉挥发物提取装置本试验使用的挥发物提取仪器为：QC．IB型气体采样仪(北京市劳动保护科学研究所制造)。顶部有两个气孔，一个为出气孔，一个为进气孔。(图2．1)。其他材料有：橡胶管、活性炭、塑料管、萃取头、parafilm封口膜、硫酸纸等。提取水稻花粉挥发物的完整装置如图2．2所示。使用橡胶管将装置的各个部分连接起来，形成一个气体回路。各个连接处使用parafilm封口膜密封，防止漏气。图中各部分为：①气体采样仪；②活性炭：③塑料管；④萃取头。其中活性炭作用是净化气体，萃取头作用是萃取挥发物中的气体成分。 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物图2．1QC-1B型气体采样仪Figure2．1QC一1BGassamplingapparatus图2．2花粉挥发物提取装置Figure2．2Pollenvolatilesamplingdevice图中各部分为：①气体采样仪；②活性炭；③塑料管；④萃取头 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物2．1．4水稻花粉挥发物的提取将装置中的橡胶管、活性炭、塑料管于实验前一天在烘箱中40。C烘4个小时，排除装置中其他挥发性物质对实验的影响。在田间进行试验之前，把装置连接好运转30min，以进一步排除装置中其他挥发物的影响。于晴朗高温的天气，中午12：00左右，采集水稻花粉。此时水稻花开的最为旺盛，采集水稻花粉最方便有效。一手轻拍水稻稻穗，一手持硫酸纸承接散落下来的水稻花粉。然后将硫酸纸卷起来，这个过程避免水稻花粉散失，连同硫酸纸将水稻花粉塞入塑料管内。将各个部分连接起来，用parafilm膜将连接处密封起来。启动气体采样仪，抽提挥发物2个小时。抽提结束后，把萃取头取下，用正己烷(hexane)淋洗萃取头，收集淋洗液，此步骤在实验室通风橱内进行。将淋洗液进样GC．MS进行分析。本实验使用GC．MS型号为岛津GCMS．QP2010，色谱柱Rxi．5ms，进样口温度220"C。升温程序为：406C(5min)，以5。Ctmin升温，到150。C(5rain)，以10。C／min升温，到250℃。2．2结果与分析制作混合标样，并对标样进行GC．MS分析，结果显示四种目的物质的出峰时间集中在9分钟至16分钟之间。在标样的总离子流图中：A峰代表0【．pinene(Ret．Time：9．696min)，B峰代表benzaldehyde(Ret．Time：10．664min)，C峰代表limonene(Ret．Time：13．085min)，D峰代表linalool(Ret．Time：15．540min)。(图2．1)。对KMDl、KMD2和KCK的花粉挥发物进行GC．MS分析，所得结果与标样进行对比分析发现，三个品系的水稻花粉的挥发物中都含有a-pinene、benzaldehyde和limonene，各种物质的出峰时间与标准样品的出峰时间相比一致，但是每种物质的响应值都比较低，这说明含量比较低。三个品系的水稻花粉挥发物中都没有发现linalool，说明这种物质在水稻花粉的挥发物中不存在。三个品系的水稻花粉挥发物的总离子图谱如图2．2～2．4。空白处理组总离子图谱如图2．5。各个物质的出峰时间汇总表如表2．1。 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物2．3结论与讨论视觉和嗅觉方面的线索在大多数蜂类觅食的过程中起重要作用，例如蜜蜂和熊峰(Chittka&Raine，2006；Wright&Schiestl，2009)。蜜蜂的视觉只在1m内起作用(根据花朵的大小)，凭借视觉他们可以探测到花朵的颜色，形状等(Lunau&Maier,1995；Lunau，2000；Simonds&Plowright，2004)。花朵的挥发物可以在近距离吸引蜜蜂(Dobson&Bergstr6m，2000)，也可以在较远距离吸引蜜蜂，某些情况下可以超过1km(Dressier,1982)。气味线索对于没有觅食经验的工蜂而言，在其寻找食物的过程中有着重要作用(D6tterl&Vereecken,2010)。例如蜜蜂的工蜂首次出巢觅食时并不能被单独的颜色刺激吸引，而需要依靠气味的刺激(GiurfaetaL，1995)。但是，有觅食经验的蜜蜂依靠气味和视觉两种线索的结合来确定宿主植物(D6tterl&Vereecken,2010)。也有研究显示，寡食性的蜂类单纯依靠视觉线索不能从非寄主植物Anchusaofficinalis的花丛中分辨出寄主植物Evulgare的花朵，尽管两种线索的结合能够对蜂类产生最大的吸引力(DStterleta1．，2011)。可见嗅觉在蜜蜂的觅食过程中起着尤其重要的作用。 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物2,061；36：AB．CID专专专七．i{1图2．1：标准样品的总离子流图谱2s：4“6ABC山山山!：1．^ki气．．5图2．2：KCK品系的总离子流图谱图2．3：KMDI品系的总离子流图谱?j11·860ABC山!兰；图2．4：KMD2品系的总离子流图谱1199254I【一；㈡l。㈣。【11：：】图2．5：空白处理的总离子流图谱注：图2．1～2．5中A峰为d-pinene：B峰为benzaldehyde；C峰为limonene；D峰为linalool。Note：A，B，CandDrepresentsa-pinene，benzaldehyde，limoneneandlinaloolrespectivelyinthetotalioncurrentchromatograms2．1～2．5．18 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物表2．1不同品系水稻花粉挥发物中能引起蜜蜂CPE反应的化合物Table2．1ConditionedProboscisExtensionresponseofhoneybeeforagertocompoundsidentifiedinfleepollenvolatiles19 浙江大学硕士学位论文水稻花粉挥发物CPE反应是研究蜜蜂觅食反应的一种常规生测实验，Margaret等利用此反应研究了油菜花中吸引蜜蜂的挥发物成分，结果鉴定出16种能引起蜜蜂CPE反应的物质(Margareteta1．，1997)。我们从这些成分中选取了4种物质：c【．松萜洳pinene、苯甲醛benzaldehyde、柠檬烯limonene和芳樟醇linalool，作为本实验的目的物质，检测水稻花粉中是否含有同样的挥发物成分，以期从嗅觉上解释蜜蜂访风媒花水稻的现象。从结果来看，我们发现水稻花粉挥发物中确实含有三种能吸引蜜蜂的物质：洳松萜c【．pinene、苯甲醛benzaldehyde和柠檬烯limonene，这些物质在虫媒花植物油菜中也被证实含有。这从嗅觉方面部分解释了蜜蜂访问水稻花的现象。在水稻扬花期，水稻花粉挥发物中的部分物质可以作为吸引蜜蜂访花的物质。但是，水稻花粉挥发物中是否含有其它吸引蜜蜂访花的成分，以及这些成分的含量和能在多大程度上吸引蜜蜂都需要进一步的实验来研究。转基因水稻和其亲本水稻花粉中都不含有油菜花挥发物成分芳樟醇linalool，这说明水稻花粉挥发物与油菜花挥发物组成有一定的差异性。我们调查的三种成分在转基因水稻克螟稻和其亲本水稻秀水1l中都含有，而芳樟醇linalool在三种水稻品系中都不舍有，说明转基因和非转基因水稻花粉中都含有能引起蜜蜂CPE反应的挥发物，这四种物质在三个品系的水稻花粉挥发物中没有显示出质上的差异性。蜜蜂访问水稻花不可避免的会引起一个生态安全问题即转基因水稻的基因漂移风险。基因漂移的研究一直是转基因水稻生态安全性评价的重要内容。蜜蜂又具有很强的传粉能力，蜜蜂对转基因水稻花粉的访问可以将转基因水稻花粉携带至其它地方，这可能引起转基因水稻与常规水稻或者野生稻的杂交。造成外源基因的逃逸。因此蜜蜂访问水稻花所造成的转基因水稻基因漂移的潜在风险应该引起重视。 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻卜的蜜蜂访花行为研究第三章转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究蜜蜂是自然界最重要的访花昆虫之一，对蜜蜂的访花行为的研究已经有较多和深入的研究。水稻是典型的自花授粉植物，属于风媒花，不具有吸引蜜蜂等访花昆虫的典型特征，例如鲜艳的花瓣，提供大量花蜜，浓郁的花香等。一般认为蜜蜂并不造访水稻花，但在我们课题组两年多的稻区访花昆虫的调查中发现，蜜蜂是访问水稻花的常见昆虫之一。关于蜜蜂访问水稻花并采集水稻花粉的现象前人已有若干报道。但是对蜜蜂对水稻花，尤其是转基因水稻的访花行为的研究尚不多见。研究蜜蜂访花行为已经有一套较为成熟的理论和方法。研究蜜蜂访花行为需要对一下三个变量进行研究：(1)访花时间(visitingtime)；(2)间隔时间(intervaltime)；(3)花间飞行距离(Harder,1983)。这三个变量多用来描述蜜蜂对虫媒花进行访问的访花行为，在具体的研究中要根据实际情况进行适当的改变以便于研究。由于在水稻田中水稻花穗与花穗之间的距离很短，且距离比较固定且较短(因为水稻在种植时行距差距不大)，所以在本文中第三项变量不做研究。访花频率(visiting仔equency)是研究传粉昆虫访花行为的常规项目，而且十分必要。访花频率是单位时间内昆虫访问的花朵数量，可以由单位时间除以前两个变量之和计算得到(Harder,1983)。转基因水稻外源基因的插入有可能改变水稻花的农艺性状，从而间接的影响蜜蜂对水稻花的访花行为。良好的转基因技术应使转入的外源基因在植物体内稳定的表达，而且不会改变植物原有基因组的表达(Shueta1．．2002)。Arencibia等的研究显示，用基因枪或细胞点击的手段获得的转基因水稻，其外观形态等农艺性状以及基因组的变异非常小(Arencibiaeta1．，1998)。但是，也有研究显示转基因水稻的一些遗传性状发生了变异(Baoeta1．，1996)。Horvath等发现转基因大麦的千粒重相比非转基因的大麦而言，比非转基因的千粒重要低(Horvatheta1．，2001)。转基因水稻外源基因的转入是否会对蜜蜂的访花行为产生影响，是本章研究的目的。本章研究了蜜蜂在克螟稻系列转基因水稻田里访问水稻花的访花时间、间隔时间和访花频率，以期从宏观上观察转基因水稻是否对蜜蜂的访花行为产生影响，并对蜜蜂访问水稻花的行为进行了描述性的总结。 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究3．1实验材料3．1．1供试水稻克螟稻系列：克螟稻1(KMDl)、克螟稻2(KMD2)、秀水1l(KCK)。三个品系的水稻在浙江大学华家池农场内相邻种植。该系列品系水稻由浙江大学和加拿大渥太华大学通过根癌农杆菌介导法合作培育。所转外源基因为CrylAb基因，亲本为粳稻品种“秀水1l”，使用双元载体PKUB，含有抗潮霉素的丝基因和抗卡那霉素的nptII和gus基因，利用潮霉素筛选得到合格株系，由专家组审定命名为：“克螟稻l”和“克螟稻2”(舒庆尧等，1998；项友斌和叶恭银，1999)。3．1．2供试昆虫本文使用蜜蜂为意大利蜜蜂ApismellifemL．，隶属于膜翅目Hymenoptera，蜜蜂科Apidae，是自然界中重要的访花昆虫。供试蜜蜂购自杭州当地蜂农的优势蜂群，蜂箱内放置蜂脾5～6张，每两到三天饲喂一次浓糖水(水糖质量比l：1)。3．1．3其他器材天福牌秒表：PC2008型(深圳市惠波工贸有限公司)。索尼牌数码录像机：DCR．TRV30E型。3．2实验方法3．2．1访花时间(visitingtime)定义为昆虫从落在花上并对花朵进行操作，采集花粉和花蜜所需的时间。由于水稻花穗的特殊性，蜜蜂访问水稻花也有一定的特点。一个水稻花穗上有数十朵小花，蜜蜂在同一个水稻花穗上进行访问的时候，从一朵小花到下一朵小花的过程可以选择爬行，也可以选择飞行。所以在实际的田问操作中，我们以整个水稻花穗作为被访问的对象，以蜜蜂降落在水稻花穗上的瞬间作为计时的起点，以蜜蜂飞离此水稻花穗的瞬间作为计时的终点。蜜蜂在访问同一花穗不同小花的过程中，不论爬行或者飞行，都不作为计时的终点。3．2．2间隔时间(intervaltime)定义为昆虫从一朵花飞到下一朵花所需要的时间。在蜜蜂访问水稻花这个独特案例中，我们把蜜蜂飞离上一个水稻花穗的瞬间作为计时的起点，以蜜蜂降落22 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究在下一个水稻花穗的瞬间作为计时的终点。3．2．3访花频率(visitingfrequency)访花频率是指在单位时间内昆虫访问的花朵次数。根据实际情况，我们把单位时间设定为5min。访花频率使用访花时间和间隔时间计算得到：访花频率=5min／(访花时间+间隔时间)。3．2．4访花行为的描述对蜜蜂访问水稻花的行为进行描述，并使用数码录像机进行录像。3．3结果与分析3．3．1访花时间我们共收集到840个访花时间有效数据，其中KCK品系有285个访花时间的数据，KMDl品系有275个访花时间的数据，KMD2品系有280个访花时间的数据。分析结果显示，克螟稻三个品系KCK、KMDI和KMD2上平均访花时问(visitingtime)依次为7．52-1-0．27see(n=285)、7．21±0．28SCC(n=275)和7．07±0．28sec(n=280)。三个品系访花时间没有显示较大差别，统计分析显示没有显著性差异。(图3．1)。3．3．2间隔时间我们共收集到840个间隔时间有效数据，其中KCK品系有285个访花时间的数据，KMDl品系有275个访花时间的数据，KMD2品系有280个访花时间的数据。分析结果显示，克螟稻三个品系KCK、KMDl和KMD2上平均间隔时间(intervaltime)依次为4．36±O．27see(n=285)、4．36-t-0．28sec(n=275)和4．22±0．28sec(n=280)。三个品系访花时间没有显示较大差别，统计分析显示没有显著性差异。(图3．2)。3-3．3访花频率设置单位时间为5min。根据访花频率=5min／(访花时／q+fal隔时间)，计算得到蜜蜂访问水稻花的访花频率。结果显示KCK品系的访花频率为32．79±17．24穗／5rain；KMDl品系的访花频率为33．71±17．49穗／5min；KMD2品系的访花频率为31．16±17．49穗／5min。经过统计分析三个品系的访花频率没有显示出显著性差异。(图3．3)。 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究3．3．4蜜蜂访问水稻花的行为描述根据我们的观察，蜜蜂访问水稻花是为了采集花粉，因为我们观察到蜜蜂采集花粉的行为动作，未发现蜜蜂在采集水稻花的过程中有伸喙的行为，伸喙行为被认为是蜜蜂取食花蜜的特征行为。现总结蜜蜂采集水稻花粉的行为模式如下：1、寻找花粉。蜜蜂在水稻田内搜寻花粉的行为如下：蜜蜂或在稻穗周围上下飞翔，或伏在稻穗上爬行，搜寻稻穗上盛开的小花。在这两种运动情况下，蜜蜂都会使用触角轻轻敲打水稻花药，探测花药。我们推测这种敲打动作可能是为了探测花药中是否富含水稻花粉。发现饱满的花药后，蜜蜂会对花药中的花粉进行采集。2、采集花粉。蜜蜂落在一个开花的花穗上之后，会利用前足和中足抓取水稻小花的花丝部位，将数个花药聚拢在一起，再将聚拢在一起的花药从下颚处快速捋至胸部腹面，最后将花药释放，接着去下一朵小花上重复同样的采粉动作。我们推测这一动作主要作用是将水稻花粉从花药里抖出，并粘附在身体的胸腹等多毛的部位。3、整理花粉。在进行了数次采集花粉的动作之后，蜜蜂会有一次将胸腹部位的花粉整理进花粉筐的动作。蜜蜂在做整理花粉这个动作的时候可以落在植株上进行，也可以再飞行中进行。当蜜蜂落在植株上时，蜜蜂会使用前足将身体固定在稻穗上，并使身体悬空，用中足整理腹面的花粉，后足不断相互摩擦。这是典型的将花粉整理进花粉筐的动作。从整体来看，蜜蜂在稻田里访花有很强的随机性，表现为，蜜蜂在结束对一个水稻花穗的采集之后，寻觅下一个水稻花穗是随机的，并没有明显的规律性。在有些情况下，蜜蜂甚至会在小范围内连续不规则的访问若干相同的稻穗。而且，被蜜蜂访问过的水稻花穗也会被另外的蜜蜂甚至同一头蜜蜂再一次访问。这些都在我们的录像中得到了证实。 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究4．543．532．521．510．50KCKKMDlKMD2ricestrain图3．1克螟稻系列品系上的蜜蜂访花时间Figure3．1Honeybee’svisitingtimeonKMDstrainseries量aKCK量KMDlKMD2ricestrain图3．2克螟稻系列品系上的蜜蜂访花间隔时间Figure3．2Honeybee’sintervaltimeonKMDstrainseries屯cou∞∽、o—七一_叫c一兰们一>屯couo们＼oI_c；一懵>一Io_c一 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究KCKKMDlricestrain图3．3克螟稻系列品系稻田内蜜蜂访花频率／5分钟Figure3．3Honeybee’svisitingfrequencyin5mininthepaddyofKMDstrainseries3．4结论与讨论我们详细观察记录了蜜蜂访问水稻花的行为，并且首次总结了蜜蜂访问水稻花的行为模式。本章对比了蜜蜂在大田环境下在三种水稻品系上的访花时间、间隔时间和访花频率，结果并没有显示出统计学意义上的显著性差异。这说明从宏观上来讲，克螟稻中CwIAb基因的转入并没有影响蜜蜂的访花行为。转基因作物对非靶标害虫的影响是转基因水稻安全性评价的重要方面。由于蜜蜂是重要的访花昆虫，在农业上有极高的传粉利用价值，转基因作物对蜜蜂的影响研究也较多。以往在室内环境下进行的实验表明，转研基因作物花粉以及髓杀虫蛋白对蜜蜂的死亡率、取食行为以及学习记忆能力没有产生负面影响(Maloneela1．，2001；Duanela1．，2008；Liuela1．，2009)。但是，Ramirez—Romero等使用高剂量的CrylAb蔗糖溶液饲喂意大利蜜蜂的成虫，虽然结果没有表现出26∞加∞0c—I_c蚺＼》uco：FoL：|∞c；一们一， 浙江大学硕士学位论文转基因水稻和非转基因水稻上的蜜蜂访花行为研究亚致死效应，蜜蜂却表现出一定的拒食效应和嗅觉学习能力的减弱，嗅觉学习能力的减弱势必影响蜜蜂的觅食行为(Ramirez-Romeroela1．，2008)。Hart等发现转双价基因(CrylAc+印T／)棉花花粉对蜜蜂产生了一定的拒食作用(Haneta1．，2010)。由于在以往的研究中并没有注意到蜜蜂对水稻花粉的访问，所以转基因水稻花粉对蜜蜂的影响也很少见诸报端。王丽华等以蜂花粉团重量的差别研究蜜蜂采集花粉的偏好性，对蜜蜂采集的花粉团进行鉴定发现水稻花粉占比较大，质量比达到了68．1％(王丽华等，2005)。访花偏好性也是研究昆虫访花行为的重要方面，当有几种花同时存在时，昆虫通常会对某种或某几种花偏爱，表现为对花朵的连续访问(Gross，1992)。蜜蜂采集花粉用于越冬或饲喂幼蜂，转基因水稻的花粉被采集回巢后对巢内幼蜂的影响也需要做深入研究。另外，蜂花粉是用作食用的产品，其中混入转基因水稻或其它作物的花粉会影响蜂花粉品质，也会造成用户不必要的恐慌。我们在大田环境下调查蜜蜂访问水稻花行为，发现克螟稻品系水稻对蜜蜂的访花行为未造成影响。但是，我们的实验时间较短，这并不能说明蜜蜂在长时间取食转基因水稻花粉的情况下是否会影响蜜蜂的行为。所以，还应该做更进一步的研究和长时间的调查。27 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流第四章蜜蜂介导的水稻花粉流蜜蜂是一种飞行能力很强的昆虫，这使得蜜蜂具有较强的传粉能力。有很多关于蜜蜂的飞行和觅食范围大小的研究，但是这些研究结果差别较大。Root描述了蜜蜂的飞行范围通常在1．5公里范围内，如果此范围内有充足的食物，蜜蜂是不会超出这个范围的(Root，1947)。Waddington等的研究显示，蜜蜂的觅食范围在745m至1413m，而且蜜蜂觅食范围的大小与地形和蜂巢的位置有关(Waddingtoneta1．，1994)。Schneider研究了非洲蜜蜂和缸melliferascutellata的飞行范围，得出的结果显示蜜蜂最少能飞行1200m(Schneider,1989)。Beekman&Ratnieks的研究结果显示，蜜蜂的平均觅食距离是6．1km，最小的觅食距离是5．5km，超过95％的蜜蜂在10km范围内觅食(Beekman&Ratnieks，2000)。由于水稻是典型的风媒花，在以往的对转基因水稻基因漂移的研究中，都只考虑风的因素，而未考虑潜在的访花昆虫的作用，我们发现蜜蜂访问水稻花并且能将水稻花粉携带至较远的地方，研究蜜蜂对转基因水稻基因漂移的影响也是有必要的。目前生产上常用距离隔离和花期隔离来的方法来管理转基因水稻的基因漂移。各国政府也都制定了相关法规来规范转基因作物的科研生产。1996年我国首次出台的《农业转基因生物安全管理条例》中提出了一些转基因作物的安全隔离距离，将转基因水稻的安全隔离距离定为100m。但是，蜜蜂的觅食距离远不止100m。本章旨在研究确定蜜蜂会否飞往距离蜂巢较远距离的水稻田进行访问，并将花粉带回蜂巢，对蜜蜂介导的转基因水稻基因漂移的潜在风险进行初步讨论。蜜蜂的访花行为对水稻花粉流的潜在影响还表现在，蜜蜂可能会增加稻田内空气中水稻花粉的密度。空气中水稻花粉密度的增加可能会增加水稻异交的几率，这也是本章研究的内容之一。4．1试验材料4．1．1供试水稻克螟稻系列：克螟稻1(KMDl)，克螟稻2(KMD2)和秀水11(KCK)。三个品系的水稻在浙江大学华家池农场内相邻种植。该系列品系水稻由浙江大学和加拿大渥太华大学通过根癌农杆菌介导法合作培育。所转外源基因为CrylAb基因，亲本为粳稻品种“秀水11”，使用双元载体PKUB，含有抗潮霉素的hpt基因和抗卡那霉素的nptIlCvg"us基因，利用潮28 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流霉素筛选得到合格株系，由专家组审定命名为：“克螟稻1”和“克螟稻2”(舒庆尧等，1998；项友斌和叶恭银，1999)。4．1．2供试昆虫本文使用蜜蜂为意大利蜜蜂4p如melliferolL．，隶属于膜翅目Hymenoptera，蜜蜂科Apidae，是自然界中重要的访花昆虫。供试蜜蜂购自杭州当地蜂农的优势蜂群，蜂箱内放置蜂脾5-6张，每两到三天饲喂一次浓糖水(水糖质量比l：1)。4．1．3溶剂试剂MTT溶剂：本溶剂用来测水稻花粉活性(Khatun&Flowers，1995)。成分为2，5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)溶于5％的蔗糖溶液里，使MTT浓度为1％。用MTT溶剂染色，变为深红色者为有活性的水稻花粉。花粉固定液：成分为70％的酒精+30％的醋酸，用来固定水稻花粉。凡士林等。4．1．4其他器材搞蜂拍；体式显微镜；载玻片；盖玻片等。4．2试验方法4．2．1蜂箱放置地点本实验于2011年、2012年在浙江大学华家池校区农场周边和紫金港校区农场周边分别进行了2次。经过实地调查，这两个农场周边没有其他水稻田的干扰。我们把蜂箱置于农场水稻田周围一定距离的地方，回巢的蜜蜂如果携带水稻花粉即说明，蜜蜂至少飞行了水稻田至蜂箱长短的距离，前往水稻田采集水稻花粉，并将水稻花粉带回蜂巢。2011年，试验在华家池校区的农场水稻田进行。华家池农场位于杭州市中心，周围至少5km范围内没有其他水稻田，在这样的环境下进行试验，结果准确可靠。我们利用Googleearth软件，在农场水稻田周围选择合适的点放置被试蜂箱。这些蜂箱距离农场水稻田依次为：100m、200m、300m、400m、500m、600m、700m、800m、900m、1000m。(附图1)。2012年，试验在紫金港校区农场水稻田进行了一次重复。紫金港校区农场 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流位于杭州市西北郊，经调查周围至少3km范围内没有其它稻田干扰。利用Googleearth软件，在农场水稻田周围选择合适的点放置被试蜂箱。(附图2)。4．2．2捕捉蜜蜂与蜂花粉的处理水稻扬花期，使用自制摘蜂拍在蜂箱处捕捉采粉回巢的蜜蜂。采集到的蜜蜂，用镊子抹掉后足上的花粉团。这是因为在花粉筐中的花粉并没有传粉的潜力。将蜜蜂放于离心管中并编号。在离心管中用固定液浸泡蜂体两次，蜜蜂身体上的水稻花粉会被洗脱进固定液内，保留这两次的固定液。因为经过两次浸泡蜜蜂身体上仍有剩余的水稻花粉，所以保留固定液浸泡过的蜜蜂。4．2-3确定水稻花粉并进行花粉计数在体视显微镜下，水稻花粉呈淡黄色至黄色，球形或近球形，表面光滑，看不到任何刻纹。电镜下，水稻花粉为球形或近球形，表面有类似于桔子皮样的细微褶皱，一个萌发孔清晰可见。把确定为水稻花粉的样品随机抽样30％，电镜下进行进一步的观察，以确定为水稻花粉。用滤纸过滤浸泡过蜜蜂的固定液，其中的水稻花粉被过滤到滤纸上。待滤纸风干之后，将滤纸放于体式显微镜下进行水稻花粉的计数。体式显微镜下观察滤纸上的花粉，确定为水稻花粉的进行计数，并对第二次过滤的滤纸上的花粉进行观察计数。对蜂体上的花粉也同样进行计数，将浸泡过的蜜蜂风干，然后置于体式显微镜下计蜂体上水稻花粉的数量。每头蜜蜂携带的水稻花粉数由三部分组成，即第一次过滤固定液所得的花粉数、第二次过滤固定液所得的花粉数和蜂体上的花粉数。4．2．4蜜蜂携带的水稻花粉活性在500rn处的蜂箱捕捉蜜蜂，将虫体上的花粉抹在载玻片上，然后用MTT溶液检验水稻花粉活性。4．2．5蜜蜂访花行为对稻田空气中花粉浓度的影响。本实验于2012年8月29曰至9月3日在浙江大学昆虫研究所控虫网室内进行。在两个网室内种植水稻，其中一个网室内放入蜂箱，另一个网室作为对照不放蜂箱。在水稻扬花期内，把两面都涂有凡士林的载玻片放入网室内的稻田中，固定在与稻穗一样的水平高度，用来粘附空气中漂浮的水稻花粉。每个网室内均匀放 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流置15个载玻片。每两天更换一次载玻片。收集载玻片，在体式显徽镜下计载玻片上的花粉数。方法如下：将一块20mi／l×20ITIIll的盖玻片覆盖在载玻片上涂有凡士林的区域，在体式显微镜下，对盖玻片区域内的水稻花粉进行计数。空气中花粉浓度增大，粘附与载玻片上的水稻花粉数量也必然多。将正反面所得的水稻花粉数相加，作为评估空气中水稻花粉浓度的指标。4．3结果与分析4．3．1蜜蜂携带水稻花粉的飞行距离两年内我们共采集携带花粉的蜜蜂标本5061个，其中275个标本确定为水稻花粉。这些标本分布在100m至500m的范围内。500m以外更远的蜂箱没有采集到携带有水稻花粉的蜜蜂。2012年的试验中，100m、200m处没有采集到携带水稻花粉的蜜蜂。2011年的试验结果显示，100m至500m处蜜蜂携带水稻花粉量依次为：1149±172(n=45)、587±89(n=18)、521±84(n=9)、498±82(n=23)和464±37(n=51)。总趋势是离水稻田越远的蜂箱，蜜蜂携带水稻花粉量越小。离水稻田最近的100m处蜂箱的蜜蜂携带的水稻花粉数量最大。之后依次递减，500m处的蜂箱采集到的蜜蜂携带的水稻花粉量最小。100m到200m处，水稻花粉量急剧减少，之后水稻花粉量减少不明显。2012年的试验结果显示，100m和200m处没有采集到携带水稻花粉的蜜蜂。300m至500m处蜜蜂携带水稻花粉量依次为：960+95．5(n=74)、871±124．3(n--31)和862±127．5(n=29)。就这三处的结果来看，显示了与2011年相似的趋势，即离水稻田越远的蜂箱，蜜蜂携带水稻花粉量越小。且与2011年相比，这三处减少的幅度也很小，与2011年的结果相似。(图4．3)。4．3．2蜜蜂携带的水稻花粉活性在500m处共采集到18个样本，其中2个样本为水稻花粉。测活试验结果显示，水稻花粉被蜜蜂携带飞行500m后，有活性的水稻花粉比例仍占有81．1±2．0％(n=6)，显示了较高比例的活性。(图4．4)。4．3．3蜜蜂访花对稻田空气中花粉浓度的影响有蜜蜂处理组共收集到44个样品，对照组共收集到45个样品。处理组所得 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流水稻花粉平均值为103±12(n=44)，对照组为71±7(n=45)，统计分析显示两者之间具有显著性差异，这说明蜜蜂的访花行为能够显著性地增加空气中花粉的密度。(图4．5)。4．3．4水稻花粉电镜照片为了确定所采蜜蜂虫体上所携带的花粉为水稻花粉，我们对每个放蜂点收集到的水稻花粉样本做电镜观察。水稻花粉的电镜照片见本章附图3。 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流140012001000800600400200O麓viablepollen1002003004005006007008009001000distance／m图4．3蜜蜂虫体携带水稻花粉的数量Figure4．3Numbersofricepollenscarriedonhoneybee’sbodyunviablepollen图4．4蜜蜂携带的水稻花粉的活性Figure4．4Viabilityofricepollenscardedonhoneybee’sbody33cm=o△o兰_J-o．I口口E=c 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流140。120-』兰e-100导兰802{}60暑羔40200withhoneybee图4．5空气中水稻花粉的密度Figure4．5Densityofficepollensinair4．4结论与讨论关于蜜蜂飞行范围的研究已有很多，多认为蜜蜂能飞行lOkm以上的距离。而觅食范围也能达到1-5km。本文中蜜蜂采集水稻花粉的个案研究中，我们检测到在周围1km范围内有水稻田存在的情况下，蜜蜂能飞行至500m处的水稻田觅食水稻花粉，并能将水稻花粉携带回蜂巢。未发现蜜蜂飞行至更远处的水稻田访花。Root认为，在1．5km范围内有充足的食物源的情况下，蜜蜂觅食是不会超出这个范围的。我们的试验结果与之相符，因为在水稻开花期能提供大量的花粉作为蜜蜂的食物源(Root．1947)。随着距离的增加，我们采集到的蜜蜂蜂体上携带的水稻花粉呈逐渐减少的趋势，这说明蜜蜂在飞行的时候，身体上粘附的水稻花粉能够散落下来。在100m 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流至200m范围内下降速率较快，之后下降速率较慢。蜜蜂在100m处携带的水稻花粉数量能够达到1149，在500m处身体上水稻花粉的数量也达到了400以上。我们在500m处检测蜜蜂身体上粘附的水稻花粉活性的结果也证实有较高比例的水稻花粉仍然具有活性。2012年的实验中，100m和200m处的没有发现有携带水稻花粉的蜜蜂，这可能是因为蜂箱周围有大片的棉花田和玉米田的缘故，这两种作物的开花期与水稻花期相互重合，从觅食经济性考虑采集更近的花粉更加经济有效。根据上述结果能够推测，蜜蜂如果对转基因水稻花进行访问则很有可能引起转基因水稻的基因漂移，引起不确定的生态风险。因为蜜蜂采集转基因水稻花粉回巢的过程中身体上的水稻花粉能够散落至其飞行轨迹周围的地块，这些地块很可能分布在蜂巢至稻田之间的区域。这些地块如果分布有其他品种的水稻或者杂草稻，则可能引起杂交。蜜蜂回巢后蜂体上仍粘附大量有活性的花粉，在下一趟外出觅食中，蜜蜂可能选择其它稻田，这可能使转基因水稻花粉转移至其它田块，从而扩大了可能发生基因漂移的范围。蜜蜂对水稻的访花行为明显增加了稻田空气中的花粉密度，这说明蜜蜂对水稻的访花行为增加了垂直方向上水稻花粉的浓度。形象的讲，蜜蜂的访花行为具有某种“搅拌作用”，可以使更多的转基因水稻花粉从花药中释放进空气中，这可能会令更多的转基因水稻花粉随着气流飞离至其它区域，增加其他区域空气中转基因水稻花粉的浓度。蜜蜂的访花行为从水平距离方面和垂直花粉浓度方面都能够使更多的水稻花粉转移至其他区域，增加了水稻基因漂移的潜在风险。目前虽无访花昆虫引起转基因水稻、常规水稻以及杂草稻问杂交的实证，但通过我们的实验，蜜蜂的访水稻花行为已经具备使一定范围内水稻产生杂交的可能性。1996年出台的《农业转基因生物安全管理条例》中将转基因水稻的安全隔离距离定为100m。在未考虑传粉昆虫的作用下，Messeguer等的实验证实，基因漂移率随着距离的增加下降很快，下风向比上风向稍慢(Messeguerelal．，2004)。Rong等对种植一定间隔距离的转基因水稻到非转基因水稻的杂交率进行检测的结果显示，在6．2m的距离杂交率已经降至0．01％以下；Rong等在距离花粉源2．0m处1．0ITI高度检测到空气中最大的水稻花粉密度(2234grains／cm2)，在距离花粉源105．0ITI该数据 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流巳降至2．04-0．2grains／em2(Rongetal．，2007；Rongeta1．，2010)。根据我们的试验结果，蜜蜂在500m处仍携带较多的水稻花粉(2011年为464粒；2012年为862粒)，从理论上来讲，从100m到500m的距离中，蜜蜂身上有较多花粉散落于其飞行轨迹，这有可能引起较远距离(100m以上)处转基因水稻与其它水稻发生杂交的风险。N．g，蜜蜂的访花具有更多的不确定性。所以转基因水稻的种植应该全面考虑多方因素，得出更加安全有效的管理措施。 浙江人学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流附图l：华家池校区农场蜂箱放置点卫星鸟瞰图注：红色标签代表发现携带水稻花粉蜜蜂的放置点，黄色代表未发现的放置点。FigureS1：Theairscapeofbeehive’SsitesplacedaroundHJCfarmNote：Redtagsrepresentthathoneybeeswithricepollenshavebeencollectedhere，yellownot37 浙江人学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流附图2：紫金港校区农场蜂箱放置点卫星鸟瞰图注：红色标签代表发现携带水稻花粉蜜蜂的放置点，黄色代表未发现的放置点。FigureS2：Theairscapeofbeehive’SsitesplacedaroundHJCfarmNote：Redtagsrepresentthathoneybeeswithricepollenshavebeencollectedhere，yellownot38 浙江大学硕士学位论文蜜蜂介导的水稻花粉流附图3：水稻花粉电镜图FigureS3：SEMphotosofricepollens39 浙江大学硕士学位论文总讨论第五章总讨论蜜蜂是重要的访花昆虫，转基因水稻基因漂移的研究是转基因水稻安全性评价的重要组成部分，在以前的研究中，多考虑风的因素对转基因水稻基因漂移的影响，而没有考虑到访花昆虫的影响。蜜蜂亦属于非靶标害虫，转基因水稻对蜜蜂的影响也应该引起重视。本文着重研究了蜜蜂对水稻花的访问和蜜蜂介导的水稻花粉流，并研究了转基因水稻KMD系列对蜜蜂行为方面的影响。水稻属于典型的风媒花，没有虫媒花的特征，通过我们的观察发现，在水稻花期蜜蜂对永稻花的访花是一个常规行为，而不是偶然行为。从外形上看，水稻花并不具有吸引访花昆虫的典型特征，例如色彩鲜艳的花冠，提供大量花蜜，浓郁的花香等，而且水稻花较小。我们对水稻花粉挥发物的检测从嗅觉上解释了蜜蜂访问水稻花的原因。试验选取了四种能够引起蜜蜂CPE反应的挥发物a．松萜c【一pinene、苯甲醛benzaldehyde、柠檬烯limonene、芳樟醇linalool作为目标物质(Bittermanetal．，1983；Smith,1991)，用来验证水稻花粉挥发物中是否含有这些组分。CPE反应与自由飞翔的觅食者的觅食行为密切相关(Mauelshagen&Greggers，1993)。所得结果显示，水稻花粉挥发物中有三种能引起蜜蜂CPE反应的物质0【．松萜0【一pinene、苯甲醛benzaldehyde、柠檬烯limonene，这三种物质在虫媒花植物油菜中也被证实含有。这说明在水稻扬花期，水稻花粉挥发物中的部分组分可以作为吸引蜜蜂访花的物质。我们检测的物质种类少，水稻花粉挥发物中是否含有更多的组分可以作为吸引蜜蜂访花的物质，以及这些物质吸引蜜蜂访花的重要程度，都需要做更加详细的研究。水稻花对访花昆虫有没有视觉上的吸引作用也应该加以验证。蜜蜂对水稻花的访问引出一个问题，即蜜蜂能否把水稻花粉携带至较远的距离引起水稻的基因逃逸，这是研究转基因水稻基因漂移的重要问题。通过我们两年的试验得出的结果显示，蜜蜂能把水稻花粉携带至最少500m的距离。蜜蜂作为一种飞行能力很强的访花昆虫，关于其飞行距离研究有很多(见前文)。我们的研究结果与其它研究的结果相符合。通过对蜜蜂在飞行过程中蜂体上携带的花粉数量进行研究后我们发现，在100In至200m范围内蜂体上水稻花粉数量下降速率较快，之后下降速率较慢。在100m处蜂体携带的花粉数量能够达到1149，在500m处蜂体携带的花粉数量也达到了400以上，2012年此项数据则达到了 浙江大学硕士学位论文总讨论800以上。对在500m处检测蜂体上携带的水稻花粉活性的结果显示81．1％的水稻花粉仍然具有活性。这些结果说明蜜蜂能够将水稻花粉携带至较远距离，增加转基因水稻基因逃逸的风险。通过对稻田间空气中花粉密度的研究显示，蜜蜂在水稻上的访花行为也增加了空气中水稻花粉流的浓度。形象的讲，蜜蜂的访花行为具有“搅拌作用”，可以使更多的转基因水稻花粉从花药中释放进空气中，这可能会令更多的转基因水稻花粉随着气流扩散至其它区域，增加其他区域空气中转基因水稻花粉的浓度。蜜蜂的访花行为从水平距离方面和空气中花粉浓度方面都能够使更多的转基因水稻花粉转移至其他区域，增加了转基因水稻基因漂移的潜在风险。目前虽然没有访花昆虫引起转基因水稻、常规水稻以及杂草稻间杂交的实证，但通过我们的试验，蜜蜂的访水稻花行为已经具备使一定范围内水稻产生杂交的可能性。在以往没有考虑访花昆虫作用的转基因水稻基因逃逸的研究中，多认为随着距离的增加水稻杂交率会快速下降，Rong等证实在距离花粉源6．2m处水稻杂交率已经降至O．01％以下(Rongela1．，2007)，在距离花粉源105．0m处空气中水稻花粉密度仅有2．04-0．29rains／cm2(Rongetal．，2010)，且基因漂移率随着距离的增加下降很快，下风向比上风向稍慢(Messeguereta1．，2004)。根据我们的研究，蜜蜂在500m处仍携带较多的水稻花粉(2011年为464粒；2012年为862粒)，从理论上来讲，从100m到500m的距离中，蜜蜂身上有较多花粉散落于其飞行轨迹，这有可能引起较远距离(100m以上)处的转基因水稻与其它品种水稻发生杂交的风险。由此可见，蜜蜂对水稻的访花增加了转基因水稻基因漂移的潜在风险。所以，转基因水稻种植应该考虑多方面因素以确定更加安全的隔离距离和管理措施。同时，转基因水稻会否对蜜蜂产生不良影响也应该加以重视。我们对比研究了蜜蜂在转基因水稻KMDl、KMD2及其亲本秀水11上的访花行为，结果并没有显示出统计学意义上的显著性差异。这说明从宏观上来讲，克螟稻中CrylAb基因的转入并没有影响蜜蜂的访花行为。由于我们的实验时间较短，这并不能说明蜜蜂在长时间取食转基因水稻花粉的情况下是否会影响蜜蜂的觅食行为，还应该做更长时间的调查研究。 浙江大学硕士学位论文创新点、不足之处和今后的研究方向本研究的创新点：1．详细总结描述了蜜蜂对水稻花的访花行为。2．通过我们的研究系统的阐述了蜜蜂介导的水稻花粉流。提出了蜜蜂对转基因水稻基因漂移的潜在风险性。3．评价了转基因水稻对蜜蜂访花行为的影响。本研究的不足之处：1．评价转基因水稻对蜜蜂访花行为影响的实验重复性不足。2．水稻花粉挥发物检测种类少。今后的研究方向：1．研究蜜蜂能否将水稻花粉携带至超过500m的距离。2．证实蜜蜂介导的水稻花粉流确实能够引起水稻杂交。3．更加系统的研究转基因水稻对蜜蜂的影响。42 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