菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究 66页

分类号：S667.8密级：UDC：634.6学号：201050021225广东海洋大学硕士学位论文菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究董黎梨指导教师：叶春海教授申请学位类别：农学硕士专业名称：作物遗传育种研究方向：园艺作物遗传育种学院名称：农学院中国·湛江2013年6月 菠萝蜜成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究摘要干、湿苞果实成熟软化过程与果实的质地品质发育及采后的贮藏运输等都有着十分密切的关系。干、湿苞菠萝蜜在果实质地上存在明显的差异，研究解菠萝蜜果实的成熟软化机理及为菠萝蜜的生产、育种提供理论基础，本文分别以干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞菠萝蜜（GHsj12As和GHsj12Cs）的2个基因型果实为试材，对成熟软化过程中的细胞壁修饰酶活性、部分糖代谢酶活性以及细胞壁多糖变化特征进行了分析。主要研究结果如下：（1）干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，果胶甲酯酶、盐溶性和水溶性多聚半乳糖醛酸酶、盐溶性和水溶性β-半乳糖苷酶、水溶性α-甘露糖苷酶参与菠萝蜜果实的软化，并且果胶甲酯酶可能出现在菠萝蜜果实成熟的早期阶段。果胶甲酯酶、盐溶性多聚半乳糖醛酸酶，盐溶性β-半乳糖苷酶在四种菠萝蜜中酶活性变化各异，因而不大可能是干、湿苞菠萝蜜果实质地品质差异的成因。水溶性多聚半乳糖醛酸酶在湿苞基因型果实的成熟软化过程中均呈持续上升的趋势，而在干苞基因型中则变化平缓；水溶性半乳糖苷酶在湿苞基因型中的变化趋势为先上升后下降，在干苞基因型中也变化不大。因此水溶性的多聚半乳糖醛酸酶和水溶性的半乳糖苷酶很有可能是干、湿苞菠萝蜜果实质地品质的成因，并且β-半乳糖苷酶可能参与菠萝蜜果实成熟软化过程的启动。（2）干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，离子结合态果胶（CDTA-溶性细胞壁多糖）和共价结合态果胶（Na2CO3-溶性细胞壁多糖）的含量均呈不同程度的上升变化。4种基因型菠萝蜜果实中，CDTA-溶性果胶上升的幅度在基因型间存在差异，湿苞类型要略高于干苞类型；Na2CO3-溶性果胶在干苞的菠萝蜜果实中上升趋势明显，而在湿苞型菠萝蜜果实中略有上升但上升幅度不大；因此，共价结合态果胶与干、湿苞菠萝蜜果实质地的形成有关。4%KOH溶性细胞壁多糖含量变化在干、湿苞菠萝蜜间变化趋势不同，在干苞型基因型中，含量先上升后下降，而在湿苞型基因型中，则先下降，后略上升，因此，与干、湿苞果实质地差异的形成有关；24%KOH溶性细胞壁多糖的变化趋势在4种不同的基因型间均存在差异，因此，与干、湿苞果实质地差异的形成关系不大，但与菠萝蜜果实的成熟有关。（3）采用柱层析法，对所提取的4种细胞壁多糖进行了分析。在干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，离子态结合果胶组分、共价结合态果胶组分和4%KOH溶性细胞壁多糖组分中各种物质含量因菠萝蜜果实质地差异而不同，变化复杂，这可能与构成干、湿苞菠萝蜜细胞壁的结构物质有关。I （4）在干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，干、湿苞菠萝蜜果实的可溶性总糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量均呈上升趋势，可溶性总糖中以蔗糖为主。可溶性总糖持续上升，淀粉含量则不断下降，说明淀粉含量变化与可溶性糖变化有着密切的联系。菠萝蜜果实中的水溶性转化酶活性较低，在湿苞果实的成熟阶段Ⅲ最高，随后下降，在干苞果实中则变化不大。盐溶性转化酶活性较高，但在不同基因型间存在不同的变化趋势。水溶性淀粉酶和盐溶性淀粉酶的活性变化与转化酶活性变化类似，但水溶性的淀粉酶活性要远远高于盐溶性的淀粉酶活性。因此，盐溶性转化酶和水溶性淀粉酶参与菠萝蜜果实成熟软化，水溶性淀粉酶可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化的质地差异有关。关键词：菠萝蜜，果实软化，多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲酯酶，糖苷酶，糖代谢，细胞壁多糖II ResearchonactivitiesofenzymesinvolvedincellwallmodificationandsugarmetabolismduringfruitripeningandsofteningofjackfruitAbstractUnderstandingoffruitripeningandsofteningmechanismsarebasesofbreedingpracticeforfruittextureimprovingandresearchontechniqueoffruitstorageandtransportation.Inthisthesis,twogenotypesofsoft(GHsj12AsandGHsj12Cs)andhardflesh(GHsj12DandGHsj12G.)jackfruitwereusedasmaterialstostudychangesofactivitiesofseveralcellwallmodifyingenzymesandsugarmetabolismenzymes,aswellasdegradationcharactersofcellwallpolysaccharidesduringripeningandsofteningofthefruit.Mainresultsshowedasfollowing:1)Changesofactivitiesofsaltsolublepolygalacturonaseandpectinmethylesterase,saltandwatersolublexylanase,saltandwatersolublecellulose,saltsolubleβ-galactosidase,waterandsaltsolubleα-mannosidaseduringripeningandsofteningofjackfruitvariedamongdifferentgenotypesaswellasbetweensoftfleshtypeandhardfleshtypegenotypes,andthereforewerenotthepossiblefactorsleadingtothetexturedifferencebetweensoftfleshandhardfleshjackfruits.Ontheotherhand,activitiesofwatersolublepolygalacturonaseinfruitsofsoftfleshtypeincreasedduringtheripeningandsofteningwhilevariedlittleduringtheripeningandsofteningofhardfleshfruits.Activitiesofwatersolubleβ-galactosidaseinfruitsofsoftfleshjackfruitincreasedfirstanddecreasedlaterduringripeningandsoftening,whilechangedlittleinfruitsofhardfleshjackfruit.Theseresultsindicatedthat,watersolublepolygalacturonaseandβ-galactosidasecouldbethemainfactorsleadingtodifferencesinfruittextureofsoftfleshandhardfleshjackfruit.2)ThechangesofCDTAsolublecellwallpolysaccharides,Na2CO3solublecellwallpolysaccharides,4%KOHcellwallpolysaccharidesand24%KOHcellwallpolysaccharidesduringripeningandsofteningoffruitofsoftfleshandhardfleshjackfruitwerestudied.Resultsshowedthat,CDTAsolublecellwallpolysaccharidesincreasedduringripeningandsofteningoffruitsoffourgenotypeswithvariedextents;Na2CO3solublecellwallpolysaccharidesincreasedingenotypesofsoftfleshjackfruitsbutchangedlittleingenotypesofhardfleshjackfruit;4%KOHcellwallpolysaccharidesincreasedfirstanddecreasedlaterinfruitsofhardfleshtype,whiledecreasedfirstandincreasedlaterinfruitsofsoftfleshtype;changesincontentsof24%KOHcellwallpolysaccharidesvariedamongdifferentgenotypesandnoconsistenttrendexistedinIII genotypesofsoftfleshorhardflesh.Theseresultsindicatedthat,Na2CO3solublecellwallpolysaccharidesand4%KOHcellwallpolysaccharidespossiblyinvolvedintheformationofdifferentfruittextureofsoftfleshjackfruitandhardfleshjackfruit.3)Cellwallmaterialsextractedby4solutionsmentionedabovewereanalyzedbycolumnchromatography.Resultshowedthat,inthegenotypesofsoftfleshjackfruit,fractionsoflowmolecularweightinCDTAsolublecellwallpolysaccharidesdisappearedinIIstageoffruitmaturity,whilefractionsofhighmolecularweightinNa2CO3solublecellwallpolysaccharidesincreasedduringfruitripeningandsoftening;ingenotypesofhardfleshjackfruit,bothfractionsoflowmolecularweightandhighmolecularweightdecreasedduringfruitripeningandsoftening.Inallgenotypes,themolecularweightofNa2CO3solublecellwallpolysaccharidesdecreasedduringfruitripeningandsoftening.4)Changesinactivitiesofwaterandsaltsolubleinvertase,waterandsaltsolubleamylase,andcontentsofstarch,totalsolublesugar,sucrose,fructoseandglucosewereinvestigatedduringripeningandsofteningoffruitsofsoftandhardfleshjackfruit.Resultsshowedthat,contentsofstarch,totalsolublesugar,sucrose,fructoseandglucoseincreasedduringfruitripeningandsofteningofbothtypesofjackfruitandthemaintypeofsolublesugarwassucrose,whilecontentofstarchdecreasedcontinuously.Activitiesofwatersolubleinvertasewerelow,andincreaseduntiltheIIIstageofmaturityandthendecreasedinsoftfleshgenotypes,whilechangedlittleinhardfleshgenotypes.Activitiesofaltsolubleinvertasewerehigherthanwatersolubleinvertase,buttheirchangingpatternsvariedamongdifferentgenotypesduringfruitripeningandsoftening.activitiesofwatersolubleamylaseandsaltsolubleamylasechangedlikethatofwatersolubleinvertaseandsaltsolubleinvertase,respectively,andactivitiesofwatersolubleamylasebeingmuchhigherthanthatofsaltsolubleamylase.Therefore,watersolubleamylaseandwatersolubleinvertaseweremorerelativetothefruitsofteningofsoftfleshjackfruit.Keywords:jackfruit,ripeningandsofteningoffruit,Polygalacturonase,pectinmethylesterase,β-Galactosidase,sugarmetabolism,cellwallpolysaccharideIV 目录摘要..................................................................IAbstract.............................................................III1文献综述..............................................................11.1果实成熟软化过程中细胞壁结构和组成的变化........................21.1.1细胞壁降解过程中超微结构的变化.............................21.1.2果实成熟软化过程中细胞壁组分的变化.........................31.2果实成熟软化过程中细胞壁降解酶的变化............................41.2.1多聚半乳糖醛酸酶（PG酶）..................................51.2.2纤维素酶（Cx酶）..........................................61.2.3果胶甲酯酶（PME酶）.......................................71.2.4木聚糖酶...................................................81.2.5糖苷酶类...................................................81.3果实成熟软化过程糖代谢的变化研究...............................101.3.1淀粉酶....................................................101.3.2转化酶....................................................101.4菠萝蜜果实成熟软化的研究进展...................................111.5本研究的目的和意义.............................................112材料与方法...........................................................122.1材料与设备.....................................................122.1.1试验材料..................................................122.1.2仪器......................................................122.1.3试剂......................................................122.2测定方法.......................................................132.2.1细胞壁酶液的提取和测定....................................132.2.2酶活性的测定..............................................132.2.3可溶性糖含量和淀粉含量的测定..............................152.2.4可溶性单糖含量的测定......................................152.2.5细胞壁多糖的分步提取......................................152.2.6糖醛酸和中性糖含量的测定..................................162.2.7细胞壁多糖组分的柱层析分析................................163结果与分析...........................................................173.1菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁水解酶活性的变化.................173.1.1菠萝蜜成熟软化过程中果胶甲酯酶活性的变化规律..............173.1.2菠萝蜜果实成熟软化过程中PG酶活性的变化规律...............18 3.1.3菠萝蜜果实成熟软化过程中木聚糖酶活性的变化................193.1.4菠萝蜜果实成熟软化过程中纤维素酶活性的变化规律............213.2菠萝蜜成熟软化过程中糖苷酶类活性的变化规律.....................223.2.1菠萝蜜果实成熟软化过程中β-半乳糖苷酶的活性变化..........223.2.2菠萝蜜果实成熟软化过程中α-甘露糖苷酶的活性变化..........233.3菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁多糖降解特性研究.................243.3.1菠萝蜜成熟软化过程中细胞壁干物质的变化....................243.3.2菠萝蜜果实成熟软化过程中各类细胞壁多糖物质含量的变化......253.3.3菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁物质组成的变化.............273.4菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉及可溶性糖含量变化的研究...........313.4.1菠萝蜜果实成熟软化过程中可溶性总糖含量的变化..............313.4.2菠萝蜜果实成熟软化过程中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的变化......323.4.3菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉含量的变化....................343.5菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶和转化酶活性的变化..............343.5.1菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶活性的变化..................343.5.2菠萝蜜果实成熟软化过程中转化酶活性的变化..................354讨论.................................................................374.1细胞壁降解酶在菠萝蜜果实成熟软化过程中的作用...................374.2菠萝蜜果实细胞壁物质变化与果实成熟软化的关系...................394.3菠萝蜜果实中的糖代谢与果实成熟软化的关系.......................404.4细胞壁修饰酶、细胞壁物质代谢与果实软化的关系...................415结论.................................................................42参考文献..............................................................43附录..............................................................52致谢..............................................................53作者简介..............................................................54导师简介..............................................................55 广东海洋大学硕士学位论文1文献综述菠萝蜜（ArtocarpusheterophyllusLam.）是桑科木菠萝属多年生乔木，集水果、[1]木本粮食及珍贵用材于一体，素有“热带珍果”之称，也称木菠萝、蜜冬瓜、牛肚子果等。菠萝蜜在海拔21m至523m范围均有栽培，引入我国种植已有一千多年的历史，目前在海南，广西，广东，云南，四川和台湾的热带亚热带地区都有分布，总[2]面积约14万亩，以海南、广东的湛江种植最多。菠萝蜜果实结于树干，果苞肥厚柔软多汁，清甜可口，香味浓郁。由于其果实体积较大，单果重一般在10-30kg之间，堪称世界上最大、最重的水果。果肉营养丰富，含有丰富的碳水化合物、糖分、蛋白质、淀粉、维生素A、维生素C、纤维素、多类矿物质和多种抗氧化物质，除鲜食外，可以当作蔬菜煮食或做汤，也可以干制或烘干成可口的食品，果肉还可做色拉，加工成果汁、果酱、果酒、蜜饯、罐头等。作为一种极具特色的热带水果在热带亚热带地区发展潜力颇大，不仅耐粗放管理，而且对土壤肥力要求不高，耐旱，耐贫瘠，一般种植3-5年可挂果收获，是一种易栽培、效益高的热带果树。根据果苞肉质的特点，可用将我国菠萝蜜种质资源简单的划分为两类：干苞类型和湿苞类型。干苞类型果肉质脆，肉质爽嫩，清香甘甜。湿苞类型果肉质软，肉质软[3]烂。湿苞类型菠萝蜜在果实成熟前期与干苞类型菠萝蜜无明显差异，果肉和果皮都比较坚硬。成熟后期两种类型的果实变化相差较大。干苞类型菠萝蜜熟果果皮有弹性，果苞与中轴不易分离，纤维少且短。湿苞类型菠萝蜜熟果果皮柔软，手压下陷，果苞与中轴易分离，纤维多且长，苞肉柔软。两者间在质地上有明显的差异，为研究果实质地品质发育机理提供了很好素材。另外，菠萝蜜大多在7-8月份成熟，由于气温高，果实采摘后不易长时间保存不利于远距离运输，限制了菠萝蜜的远销和栽培推广，因此研究菠萝蜜果实成熟软化的机理，为菠萝蜜耐储运新品种选育，提高经济效益具有重要的意义。果实的成熟软化伴随着一系列的生理生化反应。在很多果实的成熟软化过程中，[19][23][24]细胞壁修饰酶都发挥着重要的作用。细胞壁修饰酶的活性变化常导致细胞壁[5][19][4]多糖结构或组成发生变化。苹果在成熟过程中，果胶甲酯酶呈先升高后下降的变化，PG酶活性和Cx酶活性呈现起伏式的变化，木聚糖酶活性呈现先增大随后基本维持平稳水平。除PG酶、PME酶和Cx酶外，β-半乳糖苷酶同桃果实成熟软化的[5][6]关系也很大。在肉质差异较大的两种枇杷果实发育过程中，PG酶、PME酶和Cx酶活性总体呈上升趋势，β-半乳糖苷酶活性呈“升-降-升-降”的变化趋势，α-甘露糖苷酶活性先升后降，并在品种间存在差异。除细胞壁修饰酶外，还有研究表明，淀[7][8]粉酶也参与了果实的软化过程，并发挥着重要的作用。磨盘柿在采后贮藏过程中，淀粉酶先上升后逐渐趋于平衡。在果实成熟软化过程中，细胞壁物质的含量和成分也1 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究[5]会发生变化。阚娟等对硬溶质型桃果实在成熟过程中细胞壁多糖降解特性和相关酶做了研究，发现CDTA-1和CDTA-2溶性果胶多糖含量都逐渐增大，Na2CO3-溶性果胶多糖含量在成熟末期明显下降，KOH溶性细胞壁多糖含量在整个成熟过程中变化不明显，不同溶性果胶多糖组分之间的单糖含量有差异。为了解菠萝蜜果实成熟软化的机理，进而弄清干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成原因，为菠萝蜜生产和育种提供理论支持，本文对菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶、细胞壁多糖的降解特征、淀粉酶等糖代谢相关酶和糖含量变化特征进行了研究分析，并初步探讨了造成干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的可能原因。1.1果实成熟软化过程中细胞壁结构和组成的变化果实的成熟软化是大多数果实生长发育的一个必然的生理过程。关于果实成熟软化过程中细胞壁结构和组成变化的研究报道较多，主要认为细胞胞间层结构改变、细胞膜破坏和细胞膨压降低使细胞壁总体结构破坏以及细胞壁物质的降解等导致了果实的软化。1.1.1细胞壁降解过程中超微结构的变化植物的细胞壁是一层包被在原生质体外的壁层，主要分为三层：胞间层、初生壁和次生壁。主要起到维持细胞形态，并对细胞起着支持和防止细胞因吸水被胀破的作用。胞间层在细胞壁的最外层，其次是初生壁、次生壁。用电子显微镜观察细胞壁超[9]微结构，发现在果实的成熟后期超微结构变化表现明显，主要表现是胞间层的溶解。因此，果实软化的实质表现是胞间层的溶解和贯穿整个细胞壁的纤维状物质逐渐解[13]体。至完全成熟时，果实细胞壁中原先排列有序的纤维状物质几乎全部丧失。随着果实的成熟软化，细胞壁的结构会发生很明显的变化，观察成熟软化期间果实的组织及细胞的亚显微结构变化规律，有助于了解果实的软化机制。一般认为果实细胞壁降解使内部结构破坏导致果实成熟软化。主要表现在细胞与细胞之间间隙大[9]小、细胞壁结构溶解程度及其厚度、细胞膜及其亚细胞结构等复杂的变化。罗自生研究了柿果实采后软化过程中细胞壁组分的代谢和超微结构变化，透射电镜结果显示，起初细胞壁结构完整，随着果实的软化，胞间层逐渐降解，只有少量的微纤丝疏[10][11]松地排列在初生壁之间，壁层逐渐变薄。一般有呼吸跃变的果实，其采后果实细胞壁的变化可分为两个时期，前期初生细胞壁致密，胞间层紧密，致密度降低，后期细胞壁胶质液化，细胞壁纤维素松散紊乱，细胞壁膨胀明显增大，细胞发生质壁分离，胞间层溶解消失，出现缝隙；此后果实开始软化，果肉细胞中大量大颗粒的淀粉[12]粒减少并淡化。阚娟等对不同品种不同成熟的桃做了细胞切片，观察桃果实在成熟过程中细胞壁超微结构发生的变化，结果发现，在桃果实成熟过程中，细胞壁结构的[13]变化会因品种而异。葡萄果实成熟前后细胞壁的厚度不一样，随着果实成熟度的加[13]深，细胞容积增大，细胞壁变得越来越薄。桃果实在成熟软化前，细胞壁较厚，一2 广东海洋大学硕士学位论文[14]旦开始软化细胞壁开始变薄，接着水溶性果胶含量增大。Arie等对鳄梨果实成熟过程中细胞壁结构进行了研究，同样发现，未成熟的鳄梨果实中可明显看见胞间层，在胞间层的两侧排列着由纤维素组成的纤维丝，结构紧密，在果实呼吸跃变后期，胞[15][16][17][18]间层和纤维丝消失。苹果、菠萝、梨、枣等的果实在成熟过程中，细胞壁超微结构的变化也有类似的现象。1.1.2果实成熟软化过程中细胞壁组分的变化果实的细胞壁主要由果胶、半纤维素和纤维素三大物质组成，除此以外还含有杂[19]多糖类物质，少量的蛋白质和一些酚醛类物质。很多研究发现，在果实的成熟软化过程中，质地发生变化的主要原因是细胞壁的降解，主要是果胶的降解，也与纤维素[6]和半纤维素结构的变化有关系。1.1.2.1果胶在果实成熟前期，果胶主要呈不溶解状态，即原果胶，此时胞间粘合力大，果实细胞壁结构完整，果肉质地坚硬。果实成熟的最重要和最根本的特性是原果胶的溶解[20]。果胶是细胞壁胞间层和初生壁的主要组成成分，由不同酯化程度的半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键聚合而成的聚半乳糖醛多糖物质，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子、硼化物结合在一起，并且果胶分子的侧链常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、[21]木糖、海藻糖、芹菜糖等。在化学结构方面，主要有两个分区：光滑区和毛状区；光滑区由α-D-1,4-半乳糖醛酸残基形成的聚半乳糖醛酸、α-D-1,4-半乳糖醛酸结合双糖残基主链形成的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II和α-D-1,4-半乳糖醛酸结合寡糖残基侧链形成的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II组成；毛状区由α-D-1,4-半乳糖醛酸主链中插入的吡喃型鼠李糖形成的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I组成。因此，果胶是多分子的、多分散的、[22]多结构的、有高级空间构象的酸性杂多糖，分子量大小在100KDa范围。在果实的成熟软化过程中，果胶发生去甲酯化进而被降解，由高聚物原果胶变为[9]低聚物可溶性果胶和果胶酸。柿果实在成熟过程中，原果胶逐渐降解为水溶性果胶，原果胶和纤维素含量迅速降低，果实也逐渐软化，并且细胞壁中原果胶、纤维素的含[23]量与果肉硬度呈显著的正相关性。王炜等研究甘薯采后贮藏过程中，原果胶含量在[24]整个贮藏期间逐渐下降，可溶性果胶含量逐渐增加。甜柿因品种和贮存温度不同，果胶变化幅度有差异，但总体上可溶性果胶和果胶酸含量增加，Na2CO3-溶性果胶和[25]CDTA-溶性果胶含量减少。不同成熟度的鳄梨果实中，成熟度越高，果胶的溶解比[26]例越大。苹果中水溶性果胶随果实的成熟而增加，但螯合型的果胶随果实的成熟而[28]降低。在番茄中水溶性果胶和Na2CO3溶性果胶的含量也增加，但CDTA-溶性果胶[9][81][14][134][10]含量变化较小。在柿子、猕猴桃、梨、香瓜、梅等许多果实的成熟过程中，果胶多糖常常发生降解，使不溶性的原果胶变成可溶性的果胶导致果实软化。由3 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究此可见，在不同类型的果实的成熟软化过程中，果胶降解或可溶性是重要的特征之一。1.1.2.2半纤维素半纤维素是一类包含木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖、葡糖甘露聚糖和半乳甘露聚糖等多糖类物质，在成熟果肉组织中通过氢键以单分子层与纤维[27]素微纤丝间相连。在果实软化初期，半纤维素分子断裂，纤维素-半纤维素网状结构发生解聚，纤[13]维素、半纤维素、果胶质被果胶甲酯酶分解，最后导致果实软化。凝胶过滤和色谱分析的结果表明，半纤维素聚体大小在果实成熟期间显著下降，较小的半纤维素聚体的出现是半纤维素成分的部分降解，相对分子量的下降可能是由于富含甘露糖苷和葡[28][29]糖糖苷残基的损失。茄果实在采后贮藏过程中，半纤维素含量呈下降的趋势。在苹果和鳄梨成熟软化期间由于Cx酶活性的增加，其超微结构观察发现，果实细胞[30][31]壁纤维素网明显溶解，半纤维素含量呈显著下降趋势。甜瓜果实细胞壁中半纤[32]维素多糖的解聚在整个果实成熟过程中一直发生。在香蕉成熟软化过程中，半纤维素的降解也起着重要的作用。但在梨和番茄中，果实成熟软化过程中，纤维素含量无[33][34]明显变化。关军锋认为，纤维素水解导致细胞超微结构的改变，并不全是细胞壁纤维素分子的降解，也与非纤维素物质成分的降解导致微纤丝组成损失有关。1.1.2.3纤维素纤维素是果实细胞壁的重要组成部分，它的降解意味着细胞壁的解体和果实的软化，因而在果实的成熟软化、衰老过程中起着重要作用。果实细胞壁中的纤维素，是由一条线状的β-1,4-糖苷键连接D-葡萄糖多聚体，主要以微纤丝的形式存在于壁内；大量的链间和链内氢键将纤维素微纤丝连接成长链的纤维素，使其具有高度的稳定性[35]和抗化学降解能力，并不易被细胞内的水解酶降解。[29]茄子果实采后成熟软化过程中，纤维素含量随贮藏时间的延长不断下降，与果[36]实硬度呈极显著正相关。李宏建等研究岳帅苹果时发现，纤维素含量在贮藏期间，均呈现下降的变化趋势，而且伴随着Cx酶活性峰值的出现，果实中纤维素含量也发[11]生明显的变化。猕猴桃果实随硬度的下降，纤维素含量也逐渐减少。不同品种杏果[37]实在贮藏期间，细胞壁纤维素含量总体都呈明显的下降趋势，不同品种间差异显著。[38]柿果实在成熟软化过程中，纤维素含量也不断下降。1.2果实成熟软化过程中细胞壁降解酶的变化大量研究表明细胞壁物质和中胶层的水解是细胞软化的主要原因，而引起细胞壁物质和中胶层水解的主要是细胞壁水解酶。研究果实成熟软化过程中降解细胞壁的各种酶活性的变化，对深入了解果实成熟软化机理有着重要的意义。细胞壁水解酶的种类很多，下面主要对多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、纤维素酶、木葡聚糖酶、β-半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等进行综述。4 广东海洋大学硕士学位论文1.2.1多聚半乳糖醛酸酶（PG酶）果实成熟过程中作用于细胞壁的多聚半乳糖醛酸酶，按其作用方式分主要有两种类型，分别为内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）和外切半乳糖醛酸酶（exo-PG）。Endo-PG酶作用于细胞壁中的去甲酯化的多聚半乳糖醛酸残基，使细胞壁的结构发生改变而使果实软化。Exo-PG酶主要从多聚半乳糖醛酸的非还原端水解糖苷键，产生[39]半乳糖醛酸。未成熟果实表皮坚硬，主要是因为果胶高度甲酯化，不能被PG酶作用。在果实的成熟软化过程中，PG酶作用于细胞壁中去甲酯化的多聚半乳糖醛酸。一般PG酶活性的升高与果实的硬度下降呈显著的相关性，并且随着PG酶活性增加，果胶物质组分发生了明显变化，即总果胶与原果胶含量明显下降，而可溶性果胶含量增加。但[29]也会因果实种类不同而有所不同。茄子果实采后果肉中PG酶活性先缓慢升高，随[40]后快速上升至最大值，之后缓慢下降。苹果中在采后贮藏过程中，PG酶活性呈现峰型的变化，前期和成熟末期变化平缓。鳄梨、番茄和桃果实在成熟过程中PG酶活[41][39]性逐渐升高，草莓、苹果和柠檬在成熟过程中PG酶的活性则不稳定。王淑琴[42]等研究发现大半红枣较易软化变质，而半红和微红枣果容易保持原有硬度而耐贮藏，大半红枣的PG酶活性较半红枣和微红枣的强，总体上，金铃大枣果实PG酶性[43]在贮藏过程中呈现先升后降的变化趋势。茅林春等的研究显示桃果实软化开始与[44]PG酶活性上升有一定的关联，并与果实衰老快慢呈显著负相关。在番茄中，PG酶的mRNA在成熟初期就已检测到，但PG酶的活性在果实成熟前期活性很低。Smith[45]等发现在野生型番茄果实中，PG酶活性会随着多聚糖大范围的降解而降低。不同的采后处理措施，会对果实后熟过程中的PG酶发生不同的效应。采前果实[46]进行喷钙处理，可以有效地抑制PG酶的活性，较好地保持果实的硬度，这在李、[47]红江橙中都有报道。在不同温度条件下贮藏苹果，其PG酶活性先上升后下降，并且PG酶活性指数与果胶和总糖含量变化呈正相关，但果实硬度开始下降和水溶性果[48]胶含量升高均发生在PG酶含量达到高峰之后。庞杰等研究发现，PG酶活性与常温贮藏的枇杷软化率呈线性正相关，0℃冰水混合物冷却介质进行冷激处理可抑制果[49]实PG酶活性，并降低枇杷软化率和细胞膜渗透率。陈贵堂对冬枣进行了不同的处理，发现PG酶活性随贮藏期延长而降低，PG酶活性与硬度保持显著的负相关。气[50]调贮藏对‘八月脆’桃果实PG酶活性的影响具有阶段性，在贮藏前期PG酶活性的提高有利于果胶物质的正常代谢，使果实对低温的适应性增强，而后期PG酶活性的适当抑制可以减慢由于果胶质的快速降解导致的细胞降解和分离引起的过度软化。[51]Ping等研究发现，PG酶可能是台湾青枣果实贮藏后熟过程中调节软化的关键酶，其活性有效地影响贮藏时间，用1-MCP结合壳聚糖涂膜处理台湾青枣可抑制台湾青枣PG酶活性，延长货架期。5 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究[52]有些研究表明PG酶可能不是唯一调节果实软化的关键酶。Ben-Arie等用PG酶液和纤维素酶液处理在自然成熟梨的组织片层，研究结果表明，可以观察到细胞壁[18]超微结构的变化，在苹果中仅PG酶就可以溶解细胞壁的胞间层区域。梁小娥等[53]研究枣果实结果表明，PG酶同枣果实软化关系不大。吴延军等研究赞皇大枣发现，PG酶活性变化与果实软化率之间线性相关关系不显著，可能PG酶不是启动赞皇大枣果实软化的关键作用酶。采后随着果实衰老软化，大荔园枣、襄汾圆枣、婆婆枣、[54]金丝小枣的PG酶活性呈上升趋势，而大白枣的PG酶活性则不会随果实软化明显[55]上升。Giovannoni等将PG酶基因与E8构建成嵌合基因并转化到rin番茄中，使PG活性提高到正常果的60%以上，发现有细胞壁多聚糖醛酸的溶解和解聚，但果实的抗压能力、乙烯的生成、番茄红素的积累等没有显著的差异。PG酶对果实软化的作用可能存在阶段性。在成熟前期，PG酶活性很低，随着果实逐渐软化和乙烯的释放量逐渐增加，PG酶活性快速上升有一活性高峰值，PG酶高[56]峰值出现在成熟中后期，其对桃果实成熟中后期果实的快速软化产生较大的影响。同一果实不同品种间，PG酶活性在果实软化中的活性变化也存在差异。黄志明[6]等分析不同品种枇杷果实发育过程中PG酶活性的变化，发现不同品种之间酶活性[57]差异较大，认为这可能与枇杷果实成熟期，果肉质地的差异密切相关。刘超超等分析3个早熟苹果品种果实发育后期PG酶活性的变化，虽都呈上升的变化趋势，但酶活性高峰值和出现的时间差异显著，并且与果实的硬度呈显著的负相关。由此可见，果实的成熟软化与PG酶活性的变化之间存在密切的关系。1.2.2纤维素酶（Cx酶）纤维素酶是一族能夠降解羧甲基纤维素及木葡聚糖等物质的酶，在不同的组织中[13]所作用的多糖底物不同，但固定地切开β-1,4-糖苷键。Cx酶作用于纤维素，使细胞壁中纤维素微纤丝-半纤维素-果胶连接的“经纬结[19]构”松散，导致果实软化，在不同类型的果实成熟软化中活性的变化不同。罗自生[9]研究柿中Cx酶活性变化，发现柿在成熟软化过程中，Cx酶活性迅速增加，纤维素发生降解，细胞壁解体，果实软化，认为Cx酶引起的纤维素降解在柿果实中采后软[29]化进程中发挥了重要作用。茄子采后贮藏过程中，Cx酶活性变化趋势同PG酶相[10]似，不断上升，并与果实硬度呈显著负相关。Cx酶在梅果实的成熟软化中，先快速上升随后平缓下降，认为Cx酶活性是导致梅果实软化的主要酶之一。苹果‘秦冠’[40]采后成熟软化贮藏过程中，Cx酶活性呈开口向下的左半边抛物线的变化趋势。在[19]无PG酶活性番茄突变体中，Cx酶活性只有正常果实的0.1%，果实软化较慢，认[58]为Cx酶在番茄果实软化过程中起到PG酶与果胶甲酯酶作用的补充作用。林河通等研究了黄花梨贮藏过程中Cx酶活性的变化，结果表明，Cx酶活性达到最高时是采前[59]Cx酶的8倍，比PG酶高出5倍，是PG酶活性升高的基础。Brummell研究表明，6 广东海洋大学硕士学位论文桃Cx酶使纤维素降解，最终导致细胞壁的解体及果实软化。[60]不同的采后处理措施和贮藏条件对Cx酶活性的变化影响也不同。龙眼在常温条件Cx酶活性呈先上升后下降变化趋势，在4℃条件下贮藏一个月才出现溶解现象。[61]用不同浓度的1-MCP处理菊黄桃，发现都可以明显抑制Cx酶活性的作用，处理[62]浓度越大，抑制效果越明显，至0.5μL/L处理效果最佳。田长河等研究1-MCP处理采后贮藏的柿，发现1-MCP处理同样明显抑制Cx酶活性，并推迟其活性出现时间，[63]抑制粗纤维的降解，延缓果实软化。在低温条件下0.5μL/L1-MCP处理桃果实可明显推迟呼吸峰的出现时间并降低乙烯的生物合成，维持细胞结构的完整性，有效抑制降解细胞壁的Cx酶和PG酶活性。[20]不同的纤维素同工酶对果实成熟软化的作用可能也不同。在桃果实中，通过转录产物检测，等电点6.5的Cx酶是在生长早期存在，等电点9.5的Cx酶在成熟期最[64]丰富。在草莓果实成熟软化过程中，有2个Cx酶基因，Cel1和Cel2表达，成熟初期Cel2的mRNA不断积累和稳定，随着果实的成熟Cel1的mRNA的逐渐增加，但Cel1基因在果实的成熟软化过程中未起到决定性的作用，而Cel2在果实成熟前一定程度的影响着半纤维素多聚物的大小。1.2.3果胶甲酯酶（PME酶）在果实的成熟过程中，细胞壁中高度甲酯化的果胶在果胶甲酯酶的作用下发生去酯化作用，留下大量去酯化的羧基群，改变了细胞壁的pH值，促进了钙离子的通透[65]性，使钙离子与之连接成凝胶结构，同时有助于PG酶作用于脱酯化的果胶酸。在[28]果实的成熟软化过程中，多数研究者认为PME的主要作用是使细胞壁多聚半乳糖醛酸充分去酯化，为PG酶的作用准备底物。PME与果实成熟软化的关系密切，这在[44][5][6][37][29]番茄、桃、枇杷、杏等果实中得到证实。赵云峰等研究茄子果实采后果肉[40]PME活性呈峰型变化。于乐谦等研究‘秦冠’苹果果实采后成熟软化过程中，PME[23]活性呈波状式变化。甘薯在采后贮藏期间，PME酶活性极低，其变化波动起伏但总体增加，不同品种不同贮藏条件之间差异相差极小不显著。[24]但有学者认为PME酶与果实的软化之间无显著的相关性，可能不是果实软化的关键酶，而只是存在于未成熟果实中参与了与果实软化相关的细胞壁其他方面的代[66][67]谢。周培根等研究桃、杨德兴等研究猕猴桃，在果实软化过程中，PME酶活性[58]基本保持稳定。林河通等研究黄花梨发现果实中PME酶活性在软化过程中反而不断下降。[68]果胶甲酯酶活性与果实贮藏条件也有一定的关系。王愈等研究山楂在不同保鲜条件中果胶甲酯酶活性变化，发现均呈现先升高后降低的变化趋势。在25℃、相对[69]湿度85%条件下贮藏，芒果果胶甲酯酶的活性呈上升的趋势，并且温度的变化和病情程度的大小与酶活性强弱有一定的关系，其中，果肉和果皮中的PME酶活性随7 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究着病情指数的升高而增强，最终导致果实软化衰老。气调贮藏和冷藏贮藏前期，桃果[50]实PME活性变化无显著差异，但在贮藏后期冷藏条件下的PME活性明显高于气调贮藏，说明气调贮藏有助于桃果采后的正常成熟软化，并同时保持了果实在贮藏后期的良好品质。1.2.4木聚糖酶木聚糖酶按对木聚糖作用的方式可分为内切-β-1,4-木聚糖酶和外切-β-糖苷酶。内切-β-1,4-木聚糖酶随机的内切木聚糖，将其降解成低聚糖，外切-β-糖苷酶则从非还原[40]末端释放出木糖残基。木聚糖酶在果实成熟软化过程中的作用研究还不多，多认为其作用是将细胞壁半纤维素中的木聚糖催化降解为木糖和低聚糖，使细胞壁的结构发生改变，最后导致果[70]实软化。Paull等对番木瓜在采后成熟软化过程中细胞壁降解酶的变化进行了分析，结果表明，番木瓜在呼吸跃变前期，PG酶和木聚糖酶的活性很低，在呼吸跃变期，酶活性迅速增加达到最高，呼吸跃变后期，PG酶的活性下降到最高活性的1/4水平，[71]木聚糖酶的活性降到零，两者之间存在密切的关系。Ponen等分析了不同品种鳄梨在成熟过程中木聚糖酶和木糖酶的活性，结果表明，在成熟时期，木聚糖酶的活性保持不变，当乙烯释放量最大、Cx酶活性最高时木糖酶的活性最高；从木霉菌中发现[40]的木聚糖酶添加到半生熟的鳄梨片中，可诱导乙烯的释放。‘秦冠’苹果在采后贮藏过程中，木聚糖酶随着果实的不断成熟软化，酶活性总体呈上升的变化趋势。1.2.5糖苷酶类1.2.5.1β-半乳糖苷酶很多研究发现，果胶中半乳糖的损失是果实成熟软化的主要因素，β-半乳糖苷酶同PG酶、PME酶一样在细胞壁结构降解中起着重要作用，可使一些细胞壁的组分变[72]得不稳定，并可通过降解具有支链的多聚醛酸而使果胶降解或溶解。[73]在番茄果实成熟过程中，β-半乳糖苷酶活性较高，并在成熟过程中保持较高的[74][75][76][77]水平，对果实软化的启动很重要。这在香蕉、草莓、柿、番木瓜等果实都[29]得到证实。茄子果实刚采收时，β-半乳糖苷酶活性值较PG酶、Cx酶活性高，且[78]在整个贮藏期间的变化幅度较小，始终保持较高活性。Sousa等在苹果成熟软化过[79]程中，也得出了有类似的结论。Dawson等在桃果实软化研究表明，采后起始的两天内，主要是β-半乳糖苷酶水解果胶分子上的乳糖支链，加速果实的软化。油橄榄果[80]实成熟过程中，β-半乳糖苷酶的活性与果实的软化率呈显著的正相关。但在猕猴桃[81]果实成熟过程中该酶活性无明显变化，使用氨基羟基乙酸处理抑制乙烯生成和延迟[5]果实的成熟软化后，发现半乳糖仍然丧失。阚娟等研究不同类型桃果实成熟软化过程中β-糖苷酶活性及其基因的表达，发现硬、软溶质桃β-糖苷酶活性变化有差异，并且β-糖苷酶基因在两品种桃成熟的不同阶段均有表达，但表达量存在差异。Smith8 广东海洋大学硕士学位论文[82]等在转基因番茄中发现，在果实发育和成熟过程中，有大约7种β-半乳糖苷酶基因的表达，其中有6种与果实软化相关，反义抑制TBG1基因后可延迟番茄的软化，抑制与β-半乳糖苷酶相关基因的表达，发现可以降低成熟前期半乳糖的消失，延迟果[83]实的软化。陈昆松等发现采后苹果的β-半乳糖苷酶mRNA的积累与乙烯的自我催化过程相一致，外源乙烯可以促进β-半乳糖苷酶的合成，提高其活性，诱导其基因的表达。由此可见，β-半乳糖苷酶在果实的成熟软化中的作用是复杂的，可能与果实成熟软化启动有一定的联系。1.2.5.2甘露糖苷酶甘露糖苷酶是一种水解细胞壁组分中甘露糖残基的细胞壁结合酶，降解与细胞壁多糖结构中的甘露糖残基，而促进果实质地的改变。[6]黄志明等分析两种不同品种枇杷果实发育过程中α-甘露糖苷酶活性的变化，发现，两种枇杷果实的酶活性都呈先上升后下降的变化趋势，品种之间差异显著，认为[84]α-甘露糖苷酶可能与两种不同枇杷发育后期质地差异的形成中发挥作用。Bewley等研究发现，番茄果实中的甘露聚糖，其活性随着果实的成熟而增加，通过降解细胞壁[85]多糖中的甘露糖聚糖残基，在番茄果实软化过程中起作用。薛炳烨等对草莓不同品种果实发育成熟过程中糖苷酶活性变化进行了研究，发现α-甘露糖苷酶活性随草莓果实成熟而提高。1.2.5.3α-阿拉伯糖苷酶[86]Sakurai等研究果实鳄梨果实软化与细胞壁多糖关系中发现，α-阿拉伯糖苷酶在果实的成熟软化过程中发挥着重要作用，与果实的成熟软化密切相关。不同溶质型[5]桃果实软化过程中α-阿拉伯糖苷酶活性变化略有差异，α-阿拉伯糖苷酶主要作用于溶质型桃果实快速软化阶段，非溶质型桃果实到成熟后期即硬度下降起始阶段α-阿拉伯糖苷酶活性才有微弱的上升，α-阿拉伯糖苷酶基因的表达量在两个品种中也存在明[87]显差异。刘美艳等比较‘泰山早霞’苹果中不同的细胞壁酶的作用效果，发现β-半乳糖苷酶及α-阿拉伯糖苷酶促使果实软化的作用要大于PG酶和PME酶，而PME酶促使果实软化的作用效果显著于PG酶；用1-MCP处理后，可明显抑制β-半乳糖[80]苷酶、α-阿拉伯糖苷酶等细胞壁酶基因的表达。Goulao等发现α-阿拉伯糖苷酶基[89]因的表达在苹果成熟过程中起着重要作用，与果实的成熟软化密切相关。金昌海等研究‘金昌’苹果后熟软化过程中果胶多糖侧链中阿拉伯糖和半乳糖的降解特性发现，果实的软化不仅与PG酶有关，β-半乳糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶等重要的糖苷酶也发[90][91][92][93]挥着重要的作用。在桃、日本梨、香瓜、番茄等果实中都得到了证实。9 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究1.3果实成熟软化过程糖代谢的变化研究1.3.1淀粉酶果实成熟软化过程中，由于淀粉酶的作用，使淀粉被水解转化为水溶性糖，不仅使果实的风味发生改变而且也引起细胞膨压下降，导致细胞和组织之间分离变形造成[7]果实细胞壁硬度的下降和果实的软化。[7][94]不同类型果实在成熟软化过程中淀粉酶的作用不同。猕猴桃、鳄梨的后熟软[95]化与淀粉酶活性的上升密切相关。在猕猴桃果实后熟阶段，特别是在第一阶段，软化速度较快，其中起主要作用的酶是淀粉酶。由于淀粉酶的活性上升，淀粉逐渐降解，[96]从而使细胞失去支撑力，导致果实的急剧软化。芒果在贮藏过程中淀粉酶的活性降[18]低，但淀粉含量仍呈下降趋势。在枣果实软化过程中，淀粉酶活性上升，淀粉水解，[97]与枣果实软化呈正相关。冬枣在贮藏过程中淀粉酶活性呈“M”型变化趋势，不同产地冬枣的淀粉酶变化趋势一致，只是变化幅度有所不同，但沾化冬枣在贮藏过程中[98]果实硬度的下降与淀粉酶活性呈显著的相关性。台湾青枣在绿熟期采收时，在贮藏[36]期间淀粉酶活性下降。岳帅苹果贮藏期间果实淀粉酶活性的变化同Cx酶活性的变化相似，随着果实的贮藏软化时间的延长，淀粉酶活性的不断提高，达到峰值后逐渐下降，温度越高淀粉酶活性越强，活性高峰出现的时间越早，果实软化速度越快，品[99]质变化越明显。油桃果实采后成熟过程的生理变化研究表明，淀粉酶活性较高时期与油桃果实跃变时期一致，并与该阶段果实软化及硬度变化密切相关。1.3.2转化酶果实在成熟软化过程中，蔗糖是碳水化合物输入果实的一种重要形式并在果实的成熟有关的糖代谢中起着重要的作用，转化酶是参与果实蔗糖降解代谢的关键酶之一[100]。转化酶主要有三种形式：酸性转化酶、中性转化酶和细胞壁结合酸性酶，主要起到分解蔗糖的作用，将蔗糖分解成果糖和葡萄糖，因此转化酶在蔗糖降解代谢中起[101]着重要的作用。[102]王永章等研究苹果发育过程中蔗糖的来源及代谢，发现不同时期存在一定的[103]差异，转化酶种类和活性的调控，很大程度上与发育的阶段性有关。周兴本等研究套袋对葡萄糖代谢转化酶活性的影响，发现套袋可明显提高果实中蔗糖的相对含量及酸性转化酶的活性，套袋可能通过影响果实发育早期转化酶活性来影响果实糖分积[104]累。刘永忠等研究温州蜜桔转化酶和糖分积累特征，发现果肉中酸性转化酶的活性随着果实的发育而逐渐下降，而中性转化酶活性在果实发育过程中变化不大；果肉蔗糖和还原糖积累量分别与酸性转化酶活性成显著负相关和极显著负相关，与中性转化酶活性相关性不明显。10 广东海洋大学硕士学位论文1.4菠萝蜜果实成熟软化的研究进展有关菠萝蜜果实成熟方面的研究较少，国内外一些学者对菠萝蜜成熟果实的一些[105]物质进行了测定分析。在香气方面，纳智采用溶剂化提取菠萝蜜的香气成分，用[106]GC-MS联用技术鉴定了菠萝蜜香气中的82种香气化合物。Ong等采用SPME和GC-TOFMS方法分析了5种不同品种菠萝蜜的香气成分，有37种化合物都存在这5[107]种菠萝蜜中。干、湿苞菠萝蜜中香气的成分和含量不同，可以根据香气的成分和[108]含量解释这两种不同类型菠萝蜜88%总变异。菠萝蜜果实中类胡萝卜素因菠萝蜜[109]基因型和栽培条件不同，含量和组成成分不同。郑华等也对菠萝蜜果实挥发物进[110]行了分析，发现菠萝蜜果肉和果皮中富含酯类挥发物。菠萝蜜果实在成熟过程中，可滴定酸含量和颜色变化显著，水分含量和粗纤维含量变化不显著，可溶性固形物和总糖含量显著增加，有机酸的总含量呈下降趋势。1.5本研究的目的和意义果实成熟软化的机理与果实质地品质形成和采后贮藏有密切关系，因而一直是人们关注的焦点。随着菠萝蜜种植面积的不断扩大，人们对菠萝蜜的贮藏技术和优良质地品种的需求也越来越强烈，因而开展菠萝蜜果实软化机理的研究十分必要。已有研究表明，果实细胞壁组成和结构及其修饰酶的活性变化和淀粉酶等糖代谢酶活性的变化都可能与果实软化密切相关，因此，本文分别利用干苞和湿苞型菠萝蜜的2个基因型，对果实成熟软化过程中的细胞壁修饰酶活性及细胞壁组成、淀粉酶等糖代谢酶和糖含量等进行了比较分析，以期通过对两种不同质地类型的菠萝蜜果实成熟软化过程的比较，找到决定菠萝蜜果实软化的主要因素，为菠萝蜜生产实践和育种提供理论知识。主要的内容包括：（1）菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁水解酶活性的分析；（2）菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁提取物的组成分析；（3）菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶活性、转化酶活，淀粉含量、可溶性糖含量、蔗糖含量、葡萄糖含量和果糖含量的变化分析；11 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究2材料与方法2.1材料与设备2.1.1试验材料实验所使用的干苞和湿苞材料均为广东海洋大学农学院收集的菠萝蜜种质资源。湿苞种质分别为GHsj12As和GHsj12Cs，干苞种质分别为GHsj12D和GHsj12G。从各种质的同一植株上分别采集未成熟果实和成熟果实，未成熟果立即采样，八成熟果在室温放置并分阶段采样。每个果实取3份果苞样品，液氮速冻后，置于-80℃超低温保存待用。成熟度I：未成熟果，发育基本完成；成熟度II：采后当天，八成熟，果肉未软化；成熟度III：采后2天，九成熟，果肉开始软化；成熟度IV：采后4天，完全成熟，果肉完全软化；2.1.2仪器UV5300PC型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），TGL-20M型高速冷冻大容量离心机（湖南赫西仪器装备有限公司），PHS-3C精密PH计（上海精密科学仪器有限公司），DY89-1型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），BT100-2Jlonger泵（上海嘉鹏科技有限公司），层析柱（上海精密科学仪器有限公司），BSE-100自动部分收集器（上海精密科学仪器有限公司），PE200高效液相色谱（日本岛津公司产品），Elix5超纯水仪（美国Millipore）。2.1.3试剂淀粉（Sigma）、对硝基苯基半乳糖苷（Sigma）、对硝基苯基甘露糖苷（Sigma）、对硝基苯基阿拉伯糖苷（Sigma）、木聚糖（Sigma）、果胶（上海源叶生物科技有限公司）、果糖（齐云生物科技有限公司）、3-苯基苯酚（Sigma）、多聚半乳糖醛酸酶（上海源叶生物科技有限公司）、D-（+）-木糖（国药集团化学试剂有限公司）、Sepharose47CL-2B-300琼脂糖凝胶（粒径45-165μm，分离范围7×10-4×10，上海源叶生物科技有限公司）、反式-1,2-环己二胺四乙酸（CDTA）（sigma），对硝基苯酚（阿拉丁）、氰乙酰胺（阿拉丁）、溴麝香酚蓝（国药集团化学试剂有限公司）、3,5-二硝基水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（国药集团化学试剂有限公司）、葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司）、无水醋酸钠、冰醋酸、氯化钠、柠檬酸、羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）、碳酸钠、高氯酸、硼氢化钠、间羟联苯（国药集团化学试剂有限公司）、浓硫酸、丙酮、硼酸、蔗糖、硼酸、蒽酮、硼砂、叠氮化钠。12 广东海洋大学硕士学位论文2.2测定方法2.2.1细胞壁酶液的提取和测定2.2.1.1酶液的提取PG酶、Cx酶、Xyl酶、β-Gal酶、α-Man酶、淀粉酶、转化酶等酶液的提取方[19]法参考徐晓波的提取方法，略有修改。取1g左右用液氮速冻的菠萝蜜果肉，用50mM的pH5.6醋酸钠缓冲液冰浴研磨，转入10mL的离心管，在匀速震荡仪上震荡30min，随后放入4℃冰箱提取12h，期间颠倒混匀2-3次。将含有提取液的10mL离心管在12000rpm下离心10min，取出上清液，再将上清液在12000rpm下离心10min，取出上清液转入透析袋中，在5mM，pH5.6的醋酸钠缓冲液中4℃透析24h。期间更换透析液2-3次。将透析后的酶液转移至10mL的离心管中4℃保存。沉淀用含1MNaCl的pH5.650mM醋酸钠缓冲液4℃下提取24h，期间颠倒混匀2-3次。将含有的提取液的10mL离心管在12000rpm下离心10min，取出上清液，转入透析袋中，在5mMpH5.6的醋酸钠缓冲液中4℃透析24h。期间更换透析液2-3次。将透析后的酶液转移至10mL的离心管中4℃保存。2.2.1.2PE酶液的提取[19]参考徐晓波的提取方法，略有修改。取1g左右用液氮速冻的菠萝蜜果肉，加入8mL冷的0.4MpH7.5的NaCl溶液，冰浴研磨，转入10mL离心管，在4℃冰箱中提取6h，期间颠倒混匀2-3次。将含有的提取液的10mL离心管在12000rpm下离心10min，取出上清液，再将上清液在12000rpm下离心10min，取上清液，调节pH至7.5，用于果胶甲酯酶活性的测定。2.2.2酶活性的测定2.2.2.1PG酶活性的测定[111]参考Gross的方法，略有修改。取0.2mL待测酶液，加入0.2mL的0.5%的多聚半乳糖醛酸（PGA），用50mMpH6.2的磷酸-柠檬酸缓冲液补足至2mL，混匀，37℃下水浴8h。与对照同时进行水浴反应后比色。反应结束后，向反应液中加入2mL的0.1MpH9.0硼酸缓冲液和1mL1%的氰乙酰胺，沸水浴10min，冷却，274nm波长下测定OD值。以每g鲜果肉每分钟产生1μmol的半乳糖醛酸作为1个酶单位。2.2.2.2木聚糖酶活性的测定[112]参考杨力等的方法，略有修改。取0.5mL的粗酶液，加入0.5mL0.1%木聚糖，用50mLpH6.2的磷酸-柠檬酸缓冲液补足至2mL，混匀，在37℃下水浴1h。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。反应结束后，3,5二硝基水杨酸（DNS）法比色，540nm波长下测定OD值，水做空白。以每分钟产生1μmol木糖作为1个酶单位。13 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究2.2.2.3纤维素酶活性的测定[112]参考杨力等的方法，略作修改。取0.5mL的酶液，加入0.5mL1%的羧甲基纤维素钠，用50mLpH6.2的磷酸-柠檬酸缓冲液补足至2mL，混匀，在40℃下水浴1h。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。反应结束后，3,5二硝基水杨酸（DNS）溶液法比色，540nm波长下测定OD值，水做空白。以每分钟产生1μmol葡萄糖作为1个酶单位。2.2.2.4PME酶活性的测定[19]参考徐晓波的方法，略做修改。在反应管中依次加入2.0mL质量分数0.5%的果胶溶液，0.2mL质量分数0.01%的溴麝香酚蓝溶液，0.7mL去离子水，0.1mL酶液，调pH至7.5后，加入0.1mL的酶液，以水为对照。在620nm波长每隔5s测定一次吸光度，共测定10min。以每分钟产生1μmol半乳糖作为1个酶单位。2.2.2.5β-Gal酶活性的测定[113]参考金昌海等的测定方法，略作修改。取0.2mL的待测酶液，加入0.1mL10mM的对硝基苯基半乳糖苷（PNPG），用50mMpH4.0的醋酸钠缓冲液补足至2mL，混匀，37℃条件下水浴30min。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。反应结束后，向反应液中立即加入2mL1MNa2CO3溶液终止反应，室温下5min后于400nm波长下测定OD值，水做空白参比。以每分钟产生1μmol对硝基苯酚作为1个酶单位。2.2.2.6α-Man酶活性的测定[113]参考金昌海等的测定方法，略有修改。取0.1mL的待测酶液，加入0.1mL10mM对硝基苯基甘露糖苷，用50mMpH4.6的醋酸钠缓冲液补足至2mL，混匀，37℃条件下水浴30min。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。待水浴反应完成后，向反应液中立即加入2mL1MNaCO3溶液终止反应，混合摇匀，室温下5min后于400nm波长下测定OD值，水做空白参比。以每分钟产生1μmol对硝基苯酚作为1个酶单位。2.2.2.7淀粉酶活性的测定[36]参考李宏建等的测定方法，略作修改。取0.5mL待测酶液，加入0.5mL1%淀粉溶液，用50mMpH5.6的醋酸钠缓冲液补足至2mL，混匀，于40℃恒温水浴中保温30min。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。待水浴反应完成后，3,5二硝基水杨酸（DNS）溶液比设法比色，540nm波长下测定OD值，水做空白参比。以每分钟产生1μmol葡萄糖作为1个酶单位。2.2.2.8转化酶活性的测定[114]参考张保才的测定方法，略有修改。取0.4mL待测酶液，加入0.5mL0.1M14 广东海洋大学硕士学位论文蔗糖溶液，再加入0.1mL1MNaCl溶液，用50mMpH5.6的醋酸钠缓冲液补足至2mL，混匀，于35℃条件下水浴2h。以灭活后的酶液作对照，与待测样品同时进行水浴反应后比色。反应结束后，3,5二硝基水杨酸（DNS）溶液法比色，540nm波长下测定OD值，水做空白。以每分钟产生1μmol葡萄糖作为1个酶单位。2.2.3可溶性糖含量和淀粉含量的测定[133]参考王海宏的测定和提取方法，略作修改。取1g左右用液氮速冻的菠萝蜜果肉，加入8mL80%乙醇，研磨至匀浆，转入10mL的离心管，80℃水浴中提取30min后在10000rpm离心10min，收集上清液。重复提取两次，每次使用80%乙醇为8mL，同样离心，收集三次上清液合并于50mL的离心管，置于85℃恒温水浴，至乙醇蒸发至4-5mL，转移至50mL容量瓶，用去离子水定容。可溶性糖的测定方法采用蒽酮比色法。向上述沉淀中加去离子水3mL，搅拌均匀，沸水浴中糊化15min。取糊化稀释液3mL，加入2mL冷的9.2M高氯酸，在振荡仪上匀速振荡15min后，加去离子水至10mL，混匀，在10000rpm下离心10min，取上清液重复两次后，用去离子水洗沉淀2次，离心，合并所有离心液于100mL容量瓶，定容供淀粉测定。淀粉含量的测定采用蒽酮比色法。2.2.4可溶性单糖含量的测定[115]参考刘胜辉等的测定方法。将上步提取的可溶性糖，用一次性注射器抽提取样液，经0.45μm滤膜过滤后上机分析，3次重复。色谱分析条件：柱温为90℃，流动相为超纯水，流速为0.5mL/min，进样体积为10μL。2.2.5细胞壁多糖的分步提取[19]参考徐晓波的提取方法，略作修改。取1g左右用液氮速冻的菠萝蜜果肉，加入25mL冰冷的80%乙醇充分研磨至匀浆，12000rpm下离心10min后，弃上清液，用10mL的80%乙醇洗涤沉淀2次。向沉淀中加入10mL的pH7.0的Tris-苯酚，室温下震荡30min，之后在-20℃条件下保存1h，在12000rpm下离心10min，弃上清液，沉淀用10mL丙酮洗涤2次，真空干燥后，在34℃条件下烘干12h，室温下保存在干燥器中。取细胞壁干物质30mg，用15mL含50mM的反式-1,2-环己二胺四乙酸（CDTA）溶液匀浆，室温下提取24h，10000rpm离心20min，取上清液。重复提取一次，合并两次的提取液，透析24h后，得CDTA溶性细胞壁多糖。去离子水冲洗上步提取后剩余沉淀2次，用15mL100mMNa2CO3溶液匀浆沉淀，室温下提取24h，10000rpm离心20min，取上清液。重复提取一次后，合并两次的提取液，用冰乙酸中和后，透析24h，得Na2CO3溶性细胞壁多糖。15 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究上述不溶物用15mL含0.1%NaBH4的4%KOH溶液匀浆，室温下提取24h，10000rpm离心20min，取上清液。重复提取一次后，合并两次的提取液。提取液用冰乙酸中和后，两倍体积的80%酒精沉淀，沉淀用10mLpH7.0Tris-HCl重新溶解。透析24h，得4%KOH溶细胞壁多糖。上述不溶物用15mL含0.1%NaBH4的24%KOH溶液匀浆，室温下提取24h，10000rpm离心20min，取上清液。重复提取一次，合并两次的提取液。提取液用冰乙酸中和后，两倍体积的80%酒精沉淀，沉淀用10mLpH7.0Tris-HCl重新溶解，透析24h，得24%KOH溶性细胞壁多糖。2.2.6糖醛酸和中性糖含量的测定[116]参考Nelly等的测定方法，略作修改。糖醛酸含量的测定。取各细胞壁多糖1mL，加入4.5mL0.0125M四硼酸钠硫酸溶液，振荡混合，沸水浴5min，冷却至室温，加入50μM0.15%间羟联苯溶液，20min后在520nm处测定吸光度。中性糖含量的测定。取各细胞壁多糖1mL，加入5mL蒽酮试剂，沸水浴10min，冷却后在620nm波长下测定吸光值。2.2.7细胞壁多糖组分的柱层析分析取各细胞壁多糖提取液，过SepharoseCL-2B-300层析柱，每管收集时间4min。每个样品收集30管。使用间羟联苯法测定CDTA-溶性细胞壁多糖和Na2CO3-溶性细胞壁多糖的各管收集液中的糖醛酸含量。取1ml收集液，加入4.5ml0.0125M四硼酸钠硫酸溶液，沸水浴5min，冷却至室温，加入50μL的0.15%间羟联苯溶液，20min后在520nm处测定吸光值。使用蒽酮法测定4%KOH和24%KOH溶性细胞壁多糖的各管收集液中的中性糖含量。柱层析条件为，SepharoseCL-2B-300琼脂糖凝胶，柱长35cm，柱径1.5cm。流动相为0.1M的NaOH，流速为0.2ml/min。16 广东海洋大学硕士学位论文3结果与分析3.1菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁水解酶活性的变化3.1.1菠萝蜜成熟软化过程中果胶甲酯酶活性的变化规律本研究采用分光光度计法测定菠萝蜜果胶甲酯酶的活性。在加入酶液之后，连续测定反应体系的吸光值变化，获得图1所示的吸光值连续变化图。在图中，反应体系的吸光值连续下降，其下降的速度即是所测果胶甲酯酶的活性。图1果胶甲酯酶反应体系在620nm处的吸光值连续变化图Fig.1ContinuouschangesofODvalueofmethylpectinenzymereactionsolutionsat620nm一般未成熟果实的细胞壁是高度甲酯化的多聚半乳糖醛酸，在成熟过程中发生去酯化的作用，为PG酶的作用提供底物。果胶甲酯酶的主要作用是将高分子量果胶的[19]甲基从半乳糖醛酸残基的C6碳原子上移除，留下自由的羧基。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型的果实在成熟软化过程中果胶甲酯酶活性的变化趋势，结果如图2所示。2GHsj12AsGHsj12Cs1.8GHsj12D1.6GHsj12G1.4/U/(gFW)1.210.80.60.4果胶甲酯酶活性0.2Pectinmethylesterase/(U/gFW)0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图2干湿苞菠萝蜜实成熟软化过程中果胶甲酯酶的活性变化Fig.2ActivitiesofPectinmethylesteraseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit17 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究图中结果显示：湿苞类型GHsj12As菠萝蜜果实在成熟软化过程中果胶甲酯酶活性下降的趋势，并且GHsj12As果实完全成熟时期果胶甲酯酶活性下降的速度较前两个阶段快。湿苞GHsj12Cs果实在成熟软化过程中果胶甲酯酶活性的变化无规律，成熟的第二阶段有小幅度升高，随后下降，至完全成熟阶段又有小幅度升高，成熟的第三阶段有最小值，但在整个成熟阶段酶活性的变化幅度不大，基本保持平衡。干苞GHsj12D果实在成熟软化过程中，先下降后上升，下降和上升的幅度较小，在整个成熟过程中成熟的第三阶段最低。干苞GHsj12G果实在成熟过程中，果胶甲酯酶活性的变化规律同干苞GHsj12D果实，但变化幅度较GHsj12D果实小。果胶甲酯酶在干苞类型不同基因型的菠萝蜜果实中，酶活性的变化表现出变化一致性，并且变化的幅度相差不大，说明果胶甲酯酶在干苞类型的菠萝蜜在果实的成熟软化过程中，对细胞壁的降解与基因型无关。但在湿苞类型的2种菠萝蜜果实的成熟软化过程中，该酶活性表现出变化的不一致性，说明果胶甲酯酶在不同的湿苞菠萝蜜基因型中，作用的强弱不同。3.1.2菠萝蜜果实成熟软化过程中PG酶活性的变化规律植物细胞壁中的多聚半乳糖醛酸酶可水解聚多聚半乳糖醛酸去甲酯化后的α-1,4-[56]半乳聚糖链的亲水末端。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性多聚半乳糖醛酸酶和盐溶性多聚半乳糖醛酸酶的活性变化趋势，GHsj12Cs这个材料比较特别，结果如图3所示。GHsj12AsGHsj12As18.0GHsj12Cs35.0GHsj12CsGHsj12DAGHsj12DBGHsj12G16.0GHsj12G30.014.0/U/gFW25.012.0/U/gFW10.020.08.015.06.010.04.05.0多聚半乳糖醛酸酶活性2.0Polygalacturonaseactivity/U/gFW0.0多聚半乳糖醛酸酶活性Polygalacturonaseactivity/U/gFW0.0IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度果实成熟度FruitmaturityFruitmaturity图3干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中多聚半乳糖醛酸酶的活性变化Fig.3ActivitiesofpolygalacturonaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA：水溶性多聚半乳糖醛酸酶；B：盐溶性多聚半乳糖醛酸酶A:Watersolublepolygalacturonase;B:Saltsolublepolygalacturonase图3A所示为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）18 广东海洋大学硕士学位论文菠萝蜜果实成熟过程中水溶性PG酶的活性变化。从图中可以看出，不同基因型的湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，PG酶的活性均呈上升趋势，与果实的成熟软化有一定的相关性。其中，GHsj12As的果实的PG酶活性的上升幅度小于GHsj12Cs的果实，基本呈直线上升的变化趋势；GHsj12Cs果实的PG酶活性在成熟的第二阶段上升的幅度不如第三、四阶段，在完全成熟的果实中酶活性水平最高。不同基因型的干苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中的PG酶的活性基本上保持稳定，GHsj12D果实的PG酶的活性在成熟的第三阶段略有上升，在成熟的第四个阶段开始下降，并且完全成熟的果实中PG酶活性较低，GHsj12G果实的PG酶的活性在成熟软化过程中基本上保持稳定，但GHsj12D果实的PG酶活性的平均值要高于GHsj12G果实。图3B为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性PG酶的活性变化。从图中可以看出，4种基因型的PG酶活性变化趋势存在较大差异。其中2种湿苞类型果实中，GHsj12As果实的PG酶活性在果实成熟的第二阶段达到最高峰，随后近直线下降，在完全成熟的果实中的活性水平最低，在成熟软化整个过程中变化幅度较大；GHsj12Cs果实的PG酶活性的变化幅度不大，在果实成熟的第三阶段稍有下降，其余阶段基本持平。在干苞类型果实中，GHsj12D果实的PG酶活性水平先呈现稳定不变的趋势，在完熟的果实中快速上升；GHsj12G果实的PG酶活性水平在成熟的第一阶段中最高，在果实成熟的第二阶段快速下降，随后保持稳定的水平。水溶性的PG酶在两个干苞类型果实的成熟软化过程中均保持稳定水平或小幅度下降的变化，而在湿苞类型果实的成熟软化过程中，则表现为持续上升的趋势，因此，水溶性的PG酶的活性变化可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化后的质地差异有一定的相关性。盐溶性的PG酶活性则未能在干苞和湿苞类型的各个菠萝蜜基因型果实中表现出一致的变化，因此，与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化后的质地差异没有多大的关系。3.1.3菠萝蜜果实成熟软化过程中木聚糖酶活性的变化木聚糖酶主要是一种破坏植物纤维组织，将植物纤维组织中木聚糖分解成木糖的[40]酶。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性PG酶和盐溶性PG酶的活性变化趋势，结果显示如图4所示。19 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究GHsj12AsGHsj12AsGHsj12CsA0.050GHsj12Cs0.07GHsj12DBGHsj12D0.06GHsj12G0.040GHsj12G0.05/U/gFW/U/gFW0.0300.040.030.0200.020.0100.01木聚糖酶活性木聚糖酶活性Xylanaseactivity/U/gFWXylanaseactivity/U/gFW0.000.000IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度果实成熟度FruitmaturityFruitmaturity图4干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中木聚糖酶的活性变化Fig.4ActivitiesofXylanaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性木聚糖酶；B：盐溶性木聚糖酶A:WatersolubleXylanase;B:SaltsolubleXylanase图4A所示为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实软化成熟过程中水溶性木聚糖酶的活性变化。图中显示，干、湿苞类型菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中，水溶性木聚糖酶的活性都比较低。不同基因型湿苞菠萝蜜果实在成熟软化的过程中，木聚糖酶的活性均呈上升的趋势，但上升的幅度都比较小。在果实的整个成熟软化过程中GHsj12Cs果实中木聚糖酶的活性略高于GHsj12As的果实，但两者相差不大。不同基因型干苞类型的菠萝蜜在果实成熟软化过程中，水溶性木聚糖酶的活性变化略有差异。GHsj12D的果实在成熟软化过程中，水溶性木聚糖酶的活性变化呈先上升后下降的趋势，在成熟的第三阶段达到最高，其他成熟阶段基本持平。GHsj12G的果实在成熟软化过程中，木聚糖酶活性的变化先上升后下降，上升的幅度不大，基本持稳定的水平。图4B所示为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性木聚糖酶的活性变化。图中数据表明，不同基因型湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，盐溶性木聚糖酶活性的变化差异不大。湿苞GHsj12As果实在成熟软化过程中，盐溶性木聚糖酶活性的变化呈先上升后下降。湿苞GHsj12Cs果实中盐溶性木聚糖酶活性变化同湿苞GHsj12As果实类似。不同基因型干苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，盐溶性木聚糖酶的变化成熟前两个阶段有相差，但都呈先上升后下降的趋势。只是干苞GHsj12D果实在成熟软化在成熟的第三阶段有最大值，而GHsj12G果实在成熟的第二阶段有最大值。无论是干苞类型的菠萝蜜还是湿苞类型的菠萝蜜，其盐溶性木聚糖酶都呈先上升后下降的趋势，只是酶活性的最大值在不同的成熟阶段出现。无论是水溶性的木聚糖酶还是盐溶性的木聚糖酶，在这四种菠萝蜜的成熟软化过中，总体都呈先上升后下降的变化趋势，说明木聚糖酶与菠萝蜜果实的成熟软化有一20 广东海洋大学硕士学位论文定的关系，但与菠萝蜜果实质地差异关系不大。由于木聚糖酶的活性总体较低，也说明在菠萝蜜果实的成熟软化过程中所起到的作用不大。3.1.4菠萝蜜果实成熟软化过程中纤维素酶活性的变化规律纤维素酶在不同果实的不同组织中所作用的多糖底物略有不同，因此，在不同的[99]果实的成熟软化中，扮演的角色不同酶活性的变化趋势也不同。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性纤维素酶和盐溶性纤维素酶的活性变化趋势，结果如图5所示。GHsj12As0.040GHsj12AsGHsj12CsGHsj12CsGHsj12D0.035BGHsj12D0.050AGHsj12G0.030GHsj12G0.0400.025/U/gFW/U/gFW0.0200.0300.0150.0200.0100.010纤维素酶活性0.005Cellulaseactivity/U/gFW纤维素酶活性Cellulaseactivity/U/gFW0.0000.000IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度果实成熟度FruitmaturityFruitmaturity图5干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中纤维素酶的活性变化Fig.5ActivitiesofCellulaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性纤维素酶；B：盐溶性纤维素酶A:WatersolubleCellulase;B:SaltsolubleCellulase图5A为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中水溶性纤维素酶的活性变化。从图中可以看出，无论是干苞类型的菠萝蜜还是湿苞类型的菠萝蜜，水溶性纤维素酶的活性都很低。不同基因型的湿苞类型菠萝蜜，在果实的成熟软化过程中，水溶性纤维素酶活性都呈现先上升后下降的变化趋势，都是在成熟的第三阶段有最大值，至完全成熟阶段缓慢下降，但完熟期酶活性要高于成熟初期，并且不同基因型湿苞菠萝蜜果实水溶性纤维素酶活性之间差异不大。不同基因型的干苞类型菠萝蜜，在果实的成熟软化过程中，水溶性纤维素酶活性的变化趋势总体相似并也呈先上升后下降，GHsj12G果实在成熟的第二阶段开始下降，而GHsj12D果实在成熟的第三阶段开始下降。图5B为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性纤维素酶的活性变化。图中显示，不同基因型的干苞和湿苞类型的菠萝蜜在果实的成熟软化过程中，盐溶性纤维素酶活性同水溶性纤维素酶活性相差不大，活性都比较低。湿苞类型的菠萝蜜果实，在成熟软化过程中，其盐溶21 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究性纤维素酶活性的变化都呈先上升后下降的趋势，GHsj12As果实在成熟的第二阶段酶活性有最高值，而GHsj12Cs果实在果实成熟的第三阶段酶活性有最高值。不同基因型的干苞类型的菠萝蜜，在果实的成熟软化过程中，其盐溶性纤维素酶活性的变化存在差异，GHsj12D果实在成熟软化过程中酶活性的变化呈先上升后下降，变化幅度不大，而GHsj12G果实在成熟软化过程中酶活性的变化呈先持稳定的水平，随后缓慢下降，变化不大。无论是水溶性纤维素酶还是盐溶性纤维素酶，在干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程酶活性都比较低，因此，说明纤维素酶对菠萝蜜果实的在成熟软化过程中降解细胞壁的多糖物质所起到的作用不大。3.2菠萝蜜成熟软化过程中糖苷酶类活性的变化规律3.2.1菠萝蜜果实成熟软化过程中β-半乳糖苷酶的活性变化在高等植物体中，降解果实细胞壁的半乳糖苷酶主要是外切-β-半乳糖苷酶，从β-D-半乳糖苷支链非还原端切割β-D-半乳糖残基，或者降解鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I中半乳糖苷侧链及木葡聚糖侧链末端半乳糖残基，β-Gal作用于细胞壁果胶多聚糖醛酸侧链的半乳糖残基，使果胶降解，改变细胞壁组分的稳定性，可能对许多反应起到[117]引发剂的作用。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性β-半乳糖苷酶和盐溶性β-半乳糖苷酶的活性变化趋势，结果显示如图6所示。GHsj12As0.30GHsj12Cs0.25GHsj12AsGHsj12CsGHsj12DBGHsj12D0.25GHsj12GAGHsj12G0.20/U/gFW0.20/U/gFW0.150.150.100.10半乳糖苷酶活性0.05半乳糖苷酶活性0.05β-galactosidaseactivity/U/gFWβ-galactosidaseactivity/U/gFWβ-β-0.000.00IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度果实成熟度FruitactivityFruitmaturity图6干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中β-半乳糖苷酶的活性变化Fig.6Activitiesofβ-galactosidaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性β-半乳糖苷酶；B：盐溶性β-半乳糖苷酶A:Watersolubleβ-galactosidase;B:Saltsolubleβ-galactosidase图6A所示为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中水溶性半乳糖苷酶的活性变化。从图中可以看出，湿苞类型菠22 广东海洋大学硕士学位论文萝蜜果实在成熟软化过程中，半乳糖苷酶的活性表现为先上升而后下降的趋势，不同基因型的湿苞菠萝蜜在变化趋势上一致，但在酶活性水平和变化幅度上存在差异。而干苞类型菠萝蜜果实在成熟软化过程中，半乳糖苷酶的活性基本上不发生较大的波动，两个基因型干苞菠萝蜜果实的水溶性半乳糖苷酶活性水平差异不大。图6B为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性半乳糖苷酶的活性变化。从图中可以看出，湿苞类型菠萝蜜果实在成熟软化过程中，盐溶性半乳糖苷酶的活性变化和水溶性的酶活性变化相似，也表现为先上升而后下降的趋势，但不同基因型的湿苞菠萝蜜在酶活性水平和变化幅度上存在较大差异。GHsj12As表现特别，变化幅度大。而干苞类型菠萝蜜果实在成熟的第二阶段略有上升，随后下降，在完全成熟阶段则又有上升；不同基因型干苞菠萝蜜果实的盐溶性半乳糖苷酶活性水平存在较大差异。由于不同基因型的干苞和湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，水溶性半乳糖苷酶的活性变化表现出较为一致的变化，并在干湿苞菠萝蜜中有较大的差异。因此，水溶性半乳糖苷酶可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化后的质地差异有关。3.2.2菠萝蜜果实成熟软化过程中α-甘露糖苷酶的活性变化α-甘露糖苷酶是一种能够从N-多糖的N末端切割α-甘露糖残基的细胞壁糖蛋白[118]。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性α-甘露糖苷酶和盐溶性α-甘露糖苷酶的活性变化趋势，结果如图7所示。GHsj12AsGHsj12As0.45AGHsj12CsGHsj12CsGHsj12D0.07BGHsj12D0.40GHsj12GGHsj12G0.350.06/U/gFW0.300.05/U/gFW0.250.040.200.030.150.100.02甘露糖苷酶活性α-mannosidaseactivity/U/gFW0.05甘露糖苷酶活性0.01α-α-mannosidaseactivity/U/gFW0.00α-0.00IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度-0.01果实成熟度FruitmaturityFruitmaturity图7干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中α-甘露糖苷酶的活性变化Fig.7Activitiesofα-mannosidaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性α-甘露糖苷酶；B：盐溶性α-甘露糖苷酶A:Watersolubleα-mannosidase;B:Saltsolubleα-mannosidase图7A所示为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中水溶性甘露糖苷酶的活性变化。从图中可以看出，不同基因型的湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，甘露糖苷酶的活性变化趋势存在分歧，23 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究GHsj12As的果实的甘露糖苷酶活性在成熟软化过程中不断上升，而GHsj12Cs的果实的甘露糖苷酶活性则不断下降。不同基因型的干苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中的甘露糖苷酶的活性变化趋势同样存在分歧，GHsj12D的果实的甘露糖苷酶的活性在成熟软化过程中变化不大，而GHsj12G的果实的甘露糖苷酶的活性在成熟软化过程中不断下降。图7B为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性甘露糖苷酶的活性变化。从图中可以看出，无论湿苞类型还是干苞类型的菠萝蜜果实，在成熟软化的第三阶段，盐溶性半乳糖苷酶的活性水平最高，在完全成熟的果实中，盐溶性甘露糖苷酶的活性水平快速下降。4个基因型中，干苞菠萝蜜GHsj12G的盐溶性甘露糖苷酶活性最高，尤其第三阶段特高，然后急剧下降，其他3种基因型中所检测出的盐溶性甘露糖苷酶的活性非常低。无论是水溶性的还是盐溶性的甘露糖苷酶，其活性在干苞和湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中没能表现出一致的变化，因此，甘露糖苷酶可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化后的质地差异没有多大的关系。本研究结果还表明，由于水溶性甘露糖苷酶活性远高于盐溶性甘露糖苷酶，则菠萝蜜果实中的甘露糖苷酶主要存在于细胞质中。3.3菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁多糖降解特性研究3.3.1菠萝蜜成熟软化过程中细胞壁干物质的变化经乙醇、氯仿-甲醇和丙酮依次除去各种酶、脂肪、可溶性糖等物质后，得到细胞壁干物质（Cellwallmaterial，CWM）或细胞壁乙醇不溶物（Alcoholinsolublesolid，AIS）。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中细胞壁干物质的变化趋势，结果如图8所示。0.35GHsj12As）GHsj12Cs0.3GHsj12DGHsj12G0.25AIS/FWg（g0.2鲜重0.15g/0.10.05细胞壁干物质0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图8干苞湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁物质的变化Fig.8Contentvariationofcellwallmaterialduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit图中显示，干苞类型和湿苞类型不同基因型的菠萝蜜果实在成熟软化过程中，24 广东海洋大学硕士学位论文其细胞壁干物质的含量均呈逐渐下降的趋势，在成熟初期，细胞壁干物质含量迅速下降，随着果实逐渐成熟软化，细胞壁干物质含量下降逐渐平稳缓慢，至完全成熟时期基本趋于平衡。菠萝蜜果实在成熟软化过程中，细胞壁干物质成分逐渐减少，说明菠萝蜜果实在成熟过程中细胞壁干物质含量的变化与果肉的软化有密切的联系。而且基因型之间差异不大，可以说明菠萝蜜果实在成熟过程中细胞壁干物质总含量的变化与干湿苞间果实的质地关系不大。3.3.2菠萝蜜果实成熟软化过程中各类细胞壁多糖物质含量的变化3.3.2.1菠萝蜜果实成熟软化过程中CDTA-溶性细胞壁多糖含量的变化CDTA-溶性果胶与细胞壁结合较松散，主要通过钙离子连接。CDTA通过螯合菠萝蜜果肉细胞壁物质中的钙离子来提取细胞壁中的果胶多糖物质。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中细胞壁物质中CDTA-溶性细胞壁多糖的含量变化趋势，结果如图9-1所示。GHsj12As20.0GHsj12Cs18.0GHsj12D16.0GHsj12G-114.012.0mg/g•CW10.08.06.0糖醛酸含量4.0Uronicacidcontentmg/g•CW-12.00.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图9-1菠萝蜜果实成熟软化过程中CDTA-溶性细胞壁多糖含量的变化Fig.9-1ContentvariationofinCDTA-solublepectinduringripeningoffleshjackfruit结果表明，CDTA螯合剂提取的离子型结合果胶含量在不同类型、基因型的菠萝蜜果实成熟软化过程中，均呈现不断上升的变化趋势。在成熟初期，CDTA-溶性果胶含量比较低，基因型之间相差不大，随着果实的成熟软化，差异越来越明显。湿苞类型的GHsj12As果实在成熟第三阶段剧烈上升，在果实完全成熟期达到最大，不同基因型之间上升差异也较大。干苞类型菠萝蜜果实在成熟软化过程中，CDTA-溶性果胶上升变化较平缓，不同基因型之间差异不大。因此，CDTA-溶性果胶含量的变化与菠萝蜜果实成熟软化密切相关，但与菠萝蜜干、湿苞果实间质地差异关系可能不大。3.3.2.2菠萝蜜果实成熟软化过程中Na2CO3-溶性细胞壁多糖含量的变化经过CDTA提取后，残渣再经Na2CO3进一步提取，所提取物质为与细胞壁共价连结的果胶，其提取液中通常含有鼠李糖——RG-Ⅰ的骨架成分，以及大量的半乳糖[19]和阿拉伯糖——RG-Ⅰ的侧链部分。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和25 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中细胞壁物质中Na2CO3-溶性果胶含量的变化趋势，结果显示如图9-2所示。4.5GHsj12As-14.0GHsj12CsGHsj12D-13.5GHsj12G3.02.5mg/g•CW2.01.51.0糖醛酸含量0.5Uronicacidcontentmg/g•CW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图9-2菠萝蜜果实成熟软化过程中Na2CO3-溶性果胶含量的变化Fig.9-2ContentvariationofinNa2CO3-solublepectinduringripeningoffleshjackfruit实验结果显示，干、湿苞不同基因型菠萝蜜果实在成熟过程中，Na2CO3-溶性果胶的含量也呈不断上升的变化趋势，但湿苞类型上升的幅度较小，而干苞类型上升的幅度较大，两者之间的差异明显。同一果苞类型的不同基因型之间差异较小。因此，Na2CO3-溶性果胶含量变化与菠萝蜜成熟软化以及干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成有较大的关系。3.3.2.3菠萝蜜果实成熟软化过程中4%KOH基质多糖含量的变化经过Na2CO3提取后，残渣再经4%KOH提取后，可获得与细胞壁链接较松散的半纤维素多糖，这些提取物中通常只含有少量的木葡聚糖，主要是一些基质多糖，[19]如葡甘聚糖、葡萄糖、阿拉伯木聚糖等。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中细胞壁物质中4%KOH基质多糖的变化趋势，结果如图9-3所示。350.0GHsj12AsGHsj12CsGHsj12D300.0-1GHsj12G250.0-1mg/g•CW200.0mg/g•CW150.0100.050.0中性糖含量0.0NeutralsugarcontentIIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图9-3菠萝蜜果实成熟软化过程中4%KOH-基质多糖含量的变化26 广东海洋大学硕士学位论文Fig.9-3Contentvariationof4%KOH-solublepolysaccharoseduringripeningoffleshjackfruit实验结果表明，湿苞型菠萝蜜果实中4%KOH-溶性基质多糖含量的变化呈先下降后上升的变化趋势，变化明显，2个湿苞基因型都在成熟的第三阶段出现最小值。干苞菠萝蜜果实在成熟过程中，4%KOH-溶性基质多糖含量呈先上升后下降的趋势，2个基因型都在果实成熟的第二个阶段出现最大值，基因型间的差异较小。干苞与湿苞之间形成较大的反差，预示菠萝蜜果实中4%KOH-溶性基质多糖含量的变化，与菠萝蜜果实成熟软化及干湿苞型菠萝蜜果实质地差异的形成有关。3.3.2.4菠萝蜜果实细胞壁多糖物质中24%KOH-溶性基质多糖含量的变化经低浓度的4%KOH提取后，残渣再经高浓度的24%KOH提取，所得为与细胞壁连接致密的半纤维素多糖。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中细胞壁物质中的24%KOH-溶性果胶基质多糖的含量变化趋势，结果显示如图9-4所示。140.0GHsj12As-1GHsj12CsGHsj12D120.0GHsj12G-1100.080.0mg/g•CW60.040.0中性糖含量20.0Neutralsugarcontentmg/g•CW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图9-4菠萝蜜果实成熟软化过程中24%KOH-溶性基质多糖含量的变化Fig.9-4Contentvariationof24%KOH-solublepolysaccharoseduringripeningoffleshjackfruit实验结果显示，菠萝蜜果实在成熟软化过程中，湿苞GHsj12As菠萝蜜果实中24%KOH-溶性基质多糖含量先快速下降随后缓慢上升，完全成熟时中性糖的含量略低于成熟初期。湿苞GHsj12Cs果实在成熟过程中，24%KOH-溶性基质多糖含量先上升后下降，完全成熟时中性糖的含量略低于成熟初期。干苞GHsj12D果实在成熟的第二、三阶段基本保持不变，完全成熟阶段快速上升。干苞GHsj12G果实中的中性糖含量呈锯齿形增加。因此，菠萝蜜果实中24%KOH-溶性基质多糖含量的变化与果实的成熟度有关，但不存在相关性。同时24%KOH-溶性基质多糖含量变化与干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成无太大联系。3.3.3菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁物质组成的变化3.3.3.1菠萝蜜果实成熟软化过程中CDTA-溶性细胞壁多糖组分的变化分析2+用CDTA提取的螯合剂溶性果胶主要是以Ga铰链的半乳糖醛酸聚糖。本实验27 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究采用SepharoseCL-2B-300层析柱，分别对不同成熟度的干苞（GHsj12D）和湿苞（GHsj12As）菠萝蜜果实的CDTA-溶性细胞壁多糖组分进行了柱层析分析，结果如下图所示。GHsj12AsGHsj12AsA：成熟度IMatruitiyIGHsj12DB：成熟度IIMatruitiyIIGHsj12D0.0450.07）0.04）0.060.0350.05A520/μL0.03A520/μL（（0.040.0250.020.030.0150.02Uroniccontent0.01Uroniccontent0.010.0050醛酸含量0醛酸含量789101112131415161718192021222324252627282930789101112131415161718192021222324252627282930-0.005-0.01分部Fraction分部FractionGHsj12AsGHsj12AsGHsj12DGHsj12D0.2C：成熟度IIIMatruitiyIII）0.3D：成熟度IVMatruitiyIV）0.180.25A520/μL0.16（A520/μL0.2（0.140.120.150.10.10.08UroniccontentUroniccontent0.060.050.04醛酸含量00.02醛酸含量7891011121314151617181920212223242526272829300-0.05789101112131415161718192021222324252627282930分部Fraction分部Fraction图10干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中CDTA-溶性细胞壁多糖组分的层析柱分析Fig.10AnalysisofCDTAsolublepectincomponentbythecolumnchromatographyduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA：成熟度Ⅰ；B：成熟度Ⅱ；C：成熟度Ⅲ；D成熟度ⅣA:MaturityⅠ;B:MaturityⅡ;C:MaturityⅢ;D:MaturityⅣ湿苞GHsj12As果实细胞壁CDTA-溶性细胞壁多糖组分的分布图显示，在成熟度Ⅰ时期主要在17部分有一主峰和19部分、21部分、25部分三个次峰，成熟度Ⅱ时期至成熟度Ⅳ时期只在17部分有一主峰，主峰展现的半峰宽较大。从图可知，湿苞类型菠萝蜜果实细胞壁中离子结合型果胶的17部分的组分，在果实的成熟过程中被积累，说明离子结合型果胶17部分的组分是细胞壁的基本骨架；干苞GHsj12D类型果实细胞壁CDTA-溶性细胞壁多糖组分的分布图显示，在成熟的第一阶段，峰较多，主峰次峰表现不明显，随着果实成熟至成熟的第二阶段在12部分、17部分和19部分有三个峰，在成熟的第三阶段和完全成熟阶段只在17部分有一主峰，主峰呈现的半峰宽也较大，并且17部分组分在果实成熟的第3和第4阶段变化不大。干苞类型菠萝蜜果实细胞壁中17部分组分晚于湿苞类型菠萝蜜的出现，说明干湿苞菠萝蜜果实质地的差异形成与CDTA-溶性细胞壁多糖中17部分组分有一定的关系。28 广东海洋大学硕士学位论文随着果实逐渐成熟，干苞类型果实中细胞壁CDTA-溶性细胞壁多糖的变化与湿苞也有相似之处，即17部分组分在果实的成熟过程中都存在，含量逐渐增加。说明CDTA-溶性细胞壁多糖中17部分组分是细胞壁结构的基本物质。3.3.3.2菠萝蜜果实成熟软化过程中Na2CO3-溶性细胞壁多糖组分的变化分析Na2CO3提取出的细胞壁多糖主要是共价结合的果胶，本实验采用SepharoseCL-2B-300层析柱，分离了不同成熟度干苞（GHsj12D）菠萝蜜和湿苞（GHsj12As）菠萝蜜果实细胞壁提取物Na2CO3-溶性细胞壁多糖组分的变化，结果如下图所示。A：成熟度IMatruitiyIGHsj12AsB：成熟度IIMatruitiyIIGHsj12As0.050.045GHsj12D）0.045）GHsj12D0.040.040.035A520/μL0.035A520/μL0.03（（0.030.0250.0250.020.020.0150.015UroniccontentUroniccontent0.010.010.0050.0050醛酸含量0醛酸含量789101112131415161718192021222324252627282930789101112131415161718192021222324252627282930-0.005-0.005分部Fraction分部Fraction0.07C：成熟度IIIMatruitiyIIIGHsj12As0.12D：成熟度IVMatruitiyIVGHsj12AsGHsj12D）GHsj12D）0.060.10.05A520/μLA520/μL（0.08（0.040.060.030.020.04UroniccontentUroniccontent0.010.020醛酸含量醛酸含量7891011121314151617181920212223242526272829300-0.01789101112131415161718192021222324252627282930分部Fraction分部Fraction图11干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中Na2CO3-溶性细胞壁多糖组分的层析柱分析Fig.11AnalysisofNa2CO3solublepectincomponentbythecolumnchromatographyduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA：成熟度Ⅰ；B：成熟度Ⅱ；C：成熟度Ⅲ；D：成熟度ⅣA:MaturityⅠ;B:MaturityⅡ;C:MaturityⅢ;D:MaturityⅣ湿苞GHsj12As果实细胞壁Na2CO3-溶性细胞壁多糖组分分布图显示，在成熟的第一阶段，在9部分有一个显著主峰。随着果实逐渐成熟，9部分组分被降解主峰逐渐消失。干苞GHsj12D果实细胞壁中的Na2CO3-溶性细胞壁多糖组分分布图显示，在成熟第一阶段同湿苞类型果实类似，在9部分有一个显著主峰。随着果实进一步成熟至成熟第二、三阶段，主峰无明显变化并且含量增加，至成熟的第四阶段，在1429 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究部分出现另一明显洗脱峰。干、湿苞果实中Na2CO3-溶性细胞壁多糖9部分组分变化差异大，进一步说明共价结合型果胶与干湿苞类型菠萝蜜果实质差异的形成有关。3.3.3.3菠萝蜜果实成熟软化过程中4%KOH-溶性细胞壁多糖组分的变化分析从细胞壁中提取的4%KOH-溶性细胞壁多糖，多为松散的连接于纤维素的半纤维素多糖。本实验采用SepharoseCL-2B-300层析柱，分离了不同成熟度干苞（GHsj12D）菠萝蜜和湿苞（GHsj12As）菠萝蜜果实细胞壁提取物中4%KOH-溶性细胞壁多糖组分的变化，结果如下图所示。0.25A：成熟度IMatruitiyIGHsj12AsB：成熟度IIMatruitiyIIGHsj12As0.14GHsj12DGHsj12D0.20.12））0.10.150.08NeutralsugarA620/μL0.1NeutralsugarA620/μL0.06（（0.040.05content0.02content中性糖含量0中性糖含量013579111315171921232527291357911131517192123252729-0.05-0.02分部Fraction分部FractionGHsj12As0.18C：成熟度IIIMatruitiyIII0.12D：成熟度IVMatruitiyIVGHsj12AsGHsj12DGHsj12D0.160.10.14）0.080.12）0.10.06NeutralsugarA620/μL0.08（NeutralsugarcontentA620/μL0.040.06（0.040.02content0.02中性糖含量00中性糖含量13579111315171921232527291357911131517192123252729-0.02-0.02分部Fraction分部Fraction图12干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中4%KOH-溶性细胞壁多糖组分的层析柱分析Fig.12Analysisof4%KOHsolublematrixpolysaccharidecomponentbythecolumnchromatographyduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA：成熟度Ⅰ；B：成熟度Ⅱ；C：成熟度Ⅲ；D：成熟度ⅣA:MaturityⅠ;B:MaturityⅡ;C:MaturityⅢ;D:MaturityⅣ湿苞GHsj12As果实在成熟过程中，与细胞壁松散连接的4%KOH溶性细胞壁多糖的组分分布图显示，在成熟第一阶段，在9部分有一个显著的主要峰，至成熟的第二、三阶段，9部分组主峰不明显。至完全成熟时，峰基本消失。干苞GHsj12D果实在成熟过程中，4%KOH溶性细胞壁多糖的组分分布图显示，在成熟的初期9部分有峰但不明显，至成熟第二阶段，9部分有一显著主峰。至成熟的第三阶段，9部分主峰更显著，峰值高，峰型尖，半峰宽窄。至完全成熟期，主峰较显著但9部分组分的含量降低。干湿苞菠萝蜜中4%KOH溶性细胞壁多糖中9部分组分含量差异较大。因此，进一步说明4%KOH溶性细胞壁多糖与干湿苞类型菠萝蜜果实质差异的30 广东海洋大学硕士学位论文形成有关。3.3.3.4菠萝蜜果实成熟软化过程中24%KOH-溶性细胞壁多糖组分的变化分析用24%KOH提取的细胞壁多糖多是与细胞壁连接紧密的半纤维素多糖，本实验采用SepharoseCL-2B-300层析柱，分离了不同成熟度干苞（GHsj12D）菠萝蜜和湿苞（GHsj12As）菠萝蜜果实细胞壁提取物24%KOH-溶性细胞壁多糖组分的变化，结果如下图所示。0.025A：成熟度IMatruitiyIGHsj12As0.012B：成熟度IIMatruitiyIIGHsj12AsGHsj12DGHsj12D0.010.020.0080.015））0.0060.01NeutralsugarcontentA620/μLNeutralsugarcontentA620/μL0.004（（0.0050.0020中性糖含量0中性糖含量789101112131415161718192021222324789101112131415161718192021222324-0.005-0.002分部Fraction分部Fraction0.03C：成熟度IIIMatruitiyIIIGHsj12As0.014D：成熟度IVMatruitiyIVGHsj12AsGHsj12DGHsj12D0.0250.0120.010.02））0.0080.0150.006NeutralsugarcontentA620/μL0.01NeutralsugarcontentA620/μL（（0.0040.0050.002中性糖含量0中性糖含量0789101112131415161718192021222324789101112131415161718192021222324-0.005-0.002分部Fraction分部Fraction图13干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中24%KOH-溶性细胞壁多糖组分的层析柱分析Fig.13Analysisof24%KOHsolublematrixpolysaccharidecomponentbythecolumnchromatographyduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA：成熟度Ⅰ；B：成熟度Ⅱ；C：成熟度Ⅲ；D成熟度ⅣA:MaturityⅠ;B:MaturityⅡ;C:MaturityⅢ;D:MaturityⅣ实验结果显示，干、湿苞菠萝蜜果实细胞壁中与细胞壁结合紧密的24%KOH-溶性细胞壁多糖，在成熟软化过程变化不一，并且含量较低，说明24%KOH-溶性细胞壁多糖组分物质含量低。3.4菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉及可溶性糖含量变化的研究3.4.1菠萝蜜果实成熟软化过程中可溶性总糖含量的变化糖的含量、种类及其比例是影响果实甜度及风味的重要因素，在果实成熟过程中31 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究不断积累。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中可溶性糖的变化趋势，结果如下图所示。25.0GHsj12AsGHsj12Cs20.0GHsj12DGHsj12G15.0g/100gFWg/100gFW10.05.00.0可溶性总糖含量totalsolublesugarsIIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图14干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中可溶性糖的含量变化Fig.14Variationofsolublesugarcontentduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit实验结果表明，菠萝蜜果实在成熟软化过程中，可溶性糖总体都呈弧线上升的变化趋势，成熟的第二、三阶段可溶性糖含量积累较快，只是湿苞GHsj12As果实在成熟的起初至第二阶段基本无变化，之后呈弧线上升，至完全成熟时，四种不同基因型的菠萝蜜可溶性糖的含量之间无显著差异。说明干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成和可溶性糖含量的变化关系不大。3.4.2菠萝蜜果实成熟软化过程中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的变化果实中的可溶性糖主要为果糖、葡萄糖和蔗糖。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中可溶性糖中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的变化趋势，结果如下图所示。3.53.0GHsj12As2.5GHsj12CsGHsj12D2.0GHsj12Gg/100gFW1.51.0果糖含量0.5Fructosecontentg/100gFW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图15-1干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中果糖含量的变化Fig.15-1Variationsoffructosecontentduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit实验结果显示（图15-1），在干、湿苞不同基因型的菠萝蜜果实的成熟软化过程32 广东海洋大学硕士学位论文中，果糖的含量变化都呈不断上升的变化趋势，其中干苞GHsj12G果实在整个成熟软化过程中，果糖含量的上升速度最快，最终果糖含量也最高，而其他三种基因型的菠萝蜜果实在成熟软化过程中，果胶的上升速度和最终含量相差不大。3.53.0GHsj12AsGHsj12Cs2.5GHsj12DGHsj12G2.0g/100gFW1.51.0葡萄含量0.5gluctosecontentg/100gFW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图15-2干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中葡萄糖含量的变化Fig.15-2Solubleglucosecontentduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit实验结果显示（图15-2），菠萝蜜果实成熟过程中，葡萄糖含量的变化同果糖变化类似，都呈不断上升的变化趋势。其中干苞GHsj12G果实在菠萝蜜果实的成熟过程中，葡萄糖含量的上升速度和最终含量均明显高于其他三种基因型的菠萝蜜，其他三种基因型的菠萝蜜果实在成熟过程中，葡萄糖含量的上升速度和最终含量之间无显著差异。14.0GHsj12AsGHsj12Cs12.0GHsj12D10.0GHsj12G8.0g/100gFW6.04.0蔗糖含量2.0Sucrosecontentg/100gFW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图15-3干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中蔗糖含量的变化Fig.15-3Variationsofsucrosecontentduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit实验结果显示，干湿苞不同基因型菠萝蜜果实之间的蔗糖含量变化，趋势与可溶性糖的变化趋势类似，呈弧线上升的变化趋势。其中湿苞GHsj12As果实在成熟过程的初期至第二阶段，蔗糖含量基本保持不变，在随后的成熟阶段蔗糖快速积累，至完全成熟时，四种类型的菠萝蜜果实蔗糖的含量差异不大，基本相同。但在整个过程中，33 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究特别是成熟的第二、三阶段，干、湿苞不同基因型菠萝蜜之间，蔗糖的含量变化相差较大，蔗糖与可溶性糖的表现十分接近。综合上述，菠萝蜜果实中可溶性糖中含量较高的是蔗糖，果糖和葡萄糖含量变化趋势相似。湿苞菠萝蜜果实中果糖/葡萄糖的比值大约0.8，果糖/蔗糖的比值大约10，果糖占总糖含量的8%，葡萄糖占总糖含量的9%，蔗糖占总糖含量81%。干苞菠萝蜜果实中果糖/葡萄糖的比值大约1，果糖/蔗糖的比值大约10，果糖占总糖含量的11%，葡萄糖占总糖含量的11%，蔗糖占总糖含量78%。干苞类型菠萝蜜果糖/葡萄糖的比值要高于湿苞类型。3.4.3菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉含量的变化在果实的成熟过程中，可溶性糖一般源自淀粉的水解生成。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中淀粉含量的变化趋势，结果如图16所示。14.0GHsj12AsGHsj12Cs12.0GHsj12D10.0GHsj12G8.0g/100gFW6.04.0蔗糖含量2.0Sucrosecontentg/100gFW0.0IIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity图16干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉含量的变化Fig.16Variationsofsarchcontentduringripeningofsoftandhardfleshjackfruit实验结果显示，干、湿苞不同基因型菠萝蜜果实在成熟软化过程中，淀粉含量总体上都呈不断下降的变化趋势，其中湿苞GHsj12As果实在成熟的初期至第二阶段，淀粉含量基本不变，在随后的成熟阶段，淀粉含量快速减少。其他三种类型的菠萝蜜果实在成熟的初期至第二阶段下降较快，随后的成熟阶段下降缓慢。因此，果实成熟软化过程中，淀粉含量下降较快，但与干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的成因关系不大。3.5菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶和转化酶活性的变化3.5.1菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶活性的变化果实成熟软化过程中，淀粉酶水解淀粉，可影响果实糖分积累和果实的软化。本实验分析了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性淀粉酶和盐溶性淀粉酶的活性变化趋势，结果如图17所示。34 广东海洋大学硕士学位论文GHsj12As0.07GHsj12As0.18GHsj12CsGHsj12CsA0.16GHsj12D0.06GHsj12DGHsj12GGHsj12GB0.140.050.120.100.04Unit/gFW0.08Unit/gFW0.030.060.020.040.020.01淀粉酶活性淀粉酶活性AmylaseactivityUnit/gFW0.00AmylaseactivityUnit/gFW0.00IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity果实成熟度Fruitmaturity图17干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中淀粉酶的活性变化Fig.17ActivitiesofamylaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性淀粉酶；B：盐溶性淀粉酶A:Watersolubleamylase;B:Saltsolubleamylase图17A为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中水溶性淀粉酶的活性变化。从图中可以看出，湿苞类型的菠萝蜜在果实的成熟软化过程中，呈先上升后下降的变化，在成熟初期至第二阶段基本保持平衡。干苞类型菠萝蜜在果实的成熟软化过程中，基本保持水平。干湿苞类型菠萝蜜果实的水溶性淀粉酶活性水平存在较大差异。图17B为干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性淀粉酶的活性变化。从图中可以看出，湿苞类型菠萝蜜果实在成熟过程中，呈先上升后下降的变化趋势。干苞类型菠萝蜜果实成熟过程中，盐溶性淀粉酶的活性变化先保持水平不变，随后缓慢下降。干湿苞类型菠萝蜜果实的盐溶性淀粉酶活性水平差异不大。在干湿苞不同基因型菠萝蜜果实成熟软化过程中，水溶性淀粉酶活性水平高于盐溶性淀粉酶活性水平，由于不同基因型的干湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，水溶性淀粉酶活性的变化表现出较为一致的变化趋势，因此，水溶性淀粉酶可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化的质地差异有关。3.5.2菠萝蜜果实成熟软化过程中转化酶活性的变化果实中的转化酶主要催化蔗糖不可逆地降解为果糖和葡萄糖。本实验研究了干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜不同基因型果实在成熟软化过程中水溶性转化酶和盐溶性转化酶的活性变化趋势，结果如图18所示。35 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究0.08GHsj12As0.16GHsj12Cs0.07GHsj12AsGHsj12DGHsj12CsA0.14GHsj12GB0.06GHsj12D0.12GHsj12G0.050.10Unit/gFWUnit/gFW0.040.080.030.060.020.04转化酶活性转化酶活性0.01InverteractivityUnit/gFW0.02InvertaseactivityUnit/gFW0.000.00IIIIIIIVIIIIIIIV果实成熟度Fruitmaturity果实成熟度Fruitmaturity图18干湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中转化酶的活性变化Fig.18ActivitiesofinvertaseduringripeningofsoftandhardfleshjackfruitA:水溶性转化酶；B：盐溶性转化酶A:Watersolubleinvertase;B:Saltsolubleinvertase图18A显示是干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中水溶性转化酶的活性变化。从图中可以看出，干苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，转化酶活性基本没有变化保持水平。湿苞类型菠萝蜜果实在成熟软化过程中，成熟初期至第二阶段转化酶基本保持不变，至成熟第三阶段上升，随后下降，第三阶段有最大值，其他阶段保守水平。湿苞类型的菠萝蜜转化酶活性的平均值高于干苞类型菠萝蜜。图18B显示干苞菠萝蜜（GHsj12D和GHsj12G）和湿苞（GHsj12As和GHsj12Cs）菠萝蜜果实成熟过程中盐溶性转化酶的活性变化。从图中可以看出，干苞类型菠萝蜜的变化趋势同图A干苞菠萝蜜水溶性转化酶相似，基本保持水平。湿苞GHsj12As果实呈锯齿形的变化趋势，第二阶段同第四阶段基本相同，成熟初期同第三阶段基本相同。湿苞GHsj12Cs果实在成熟过程中，呈先下降后上升的变化趋势。成熟的第三阶段有最低值，其他阶段保持水平。在不同基因型干苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，虽然水溶性转化酶变化表现一致，但活性较低，说明转化酶活性变化受菠萝蜜果实质地差异的影响不大。36 广东海洋大学硕士学位论文4讨论4.1细胞壁降解酶在菠萝蜜果实成熟软化过程中的作用果实细胞壁内部结构的破坏和细胞壁物质的大量降解，导致细胞之间发生分离。细胞壁物质的降解主要包括果胶物质、纤维素、半纤维素的降解，同时还伴随细胞中可溶性果胶和其他成分的变化。细胞壁水解酶中的PG酶、PME酶、Cx酶、糖苷酶等参与了这个过程。果实细胞壁中果胶和多糖物质因果实种类、果实成熟度不同，其含量、性质、状态和分子大小等也不尽相同，所以在果实的软化过程中，细胞壁降解[76]酶活性和其主要作用的酶也因此而不同。果实的软化与果胶物质的代谢紧密相关，果胶物质的降解过程受到果胶甲酯酶的[66]直接控制。PME对细胞壁中的多聚半乳糖醛酸长链上的甲基酯去甲酯化，产生甲醇物质，使果胶的酯化度降低，提高PG酶对果实细胞壁物质的亲和力，降解多聚半乳糖醛。由于PG酶是以果胶的去甲酯化为作用对象，因此PME酶可能是PG酶作[38]用的必要前提。本实验中，菠萝蜜果实中果胶甲酯酶与果实的成熟软化相关，但菠萝蜜果实质地的差异与果胶甲酯酶活性变化关系不大，其变化总体呈下降的趋势，这[119][120][121]同龙眼、枸杞果实采后PME酶活性变化一致，与火龙果成熟软化过程中PME活性变化趋势不同，这可能是因为果实种类不同，酶在成熟软化过程中发挥的[6]作用不同。不同的菠萝蜜基因型，其酶活性的下降幅度不同，不同的枇杷在成熟软化过程中，硬质型枇杷PME酶活性上升幅度较软质型枇杷小，这可能因为基因型不同，PME酶基因的表达量不同。由于酶活性高峰在成熟初期，并且先于PG酶活性高[123]峰的出现，这与陆胜民等研究的PME酶活性出现在梅果实成熟软化的早期阶段结果一致，但变化趋势不同，因此，其酶活性可能出现在果实软化的早期阶段。PG酶在果实的成熟软化过程中，主要水解细胞壁中多聚半乳糖醛酸的1,4-2-D-[19]半乳糖苷键，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，从而使细胞壁结构解体。本研究表明，在菠萝蜜果实成熟过程中，水溶性PG酶活性变化趋势因干、湿苞果实质地而[6]不同，这与不同果肉质地枇杷在成熟软化过程中研究得出的结论不同，硬质型枇杷呈上升的变化，与干苞菠萝蜜变化不同，软质型枇杷也呈上升的变化，与湿苞菠萝蜜相似。本研究还表明，菠萝蜜果实中水溶性PG酶较盐溶性PG酶在干湿苞之间差异明显，因此，水溶性PG酶活性的变化与干、湿菠萝蜜果实质地差异的形成较大的关[8]系，在湿苞菠萝蜜中呈上升的变化趋势，同‘磨盘柿’果实成熟过程中PG酶活性[61][61]相似，在干苞菠萝蜜中呈变化平缓略有下降，与菊黄桃果实和采后柿果实软化过程中PG酶活性变化研究结果类似。果实的软化除了果胶多聚体的改变外，组成细胞壁的半纤维素的改变也发生在果37 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究实的软化过程中，木聚糖酶主要降解果实细胞壁多糖中的半纤维素上的木聚糖残基[40]。本实验结果表明，湿苞菠萝蜜果实在成熟软化过程中，木聚糖酶活性在成熟的第[70]三阶段都有最大值，此阶段果实软化较快，与番木瓜结果一致；干苞菠萝蜜果实中的木聚糖酶，不同基因型酶活性在不同阶段有最大值，主要在成熟的第二、三阶段，[71]此阶段也是果实软化表现明显阶段，同不同品种鳄梨的研究结果一致。因此，说明木聚糖酶参与了菠萝蜜果实的成熟软化。另外，盐溶性的木聚糖酶的活性和水溶性木聚糖酶活性在四种不同基因型的菠萝蜜果实中相差不大，说明干、湿苞菠萝蜜果实间的质地差异与木聚糖酶的作用关系不大。纤维素是细胞壁的基本骨架，纤维素的降解意味着细胞壁的解体和果实的软化，[122]所以Cx酶是影响果实软化的主要因素之一。苹果、草莓的成熟软化过程中，Cx酶活性呈上升的变化趋势。本研究结果表明，Cx酶也参与了菠萝蜜果实成熟软化的进程，特别是在湿苞菠萝蜜果实的软化过程中，变化明显。湿苞菠萝蜜果实的水溶性Cx酶和盐溶性Cx酶都在成熟的第三阶段酶活性最高，这一阶段果实软化的速度最快。然而，由于菠萝蜜果实中两种不同溶性的Cx酶活性水平不是很高，说明Cx酶[29]虽参与了菠萝蜜果实的成熟软化，但可能在这一过程中不发挥主要作用。这与茄子[123][61][8]和梅中Cx酶对果实成熟软化发挥主要作用不同，但与同菊黄桃、磨盘柿、油[124]桃类似。干、湿苞不同基因型的果实之间，Cx酶的活性水平和变化趋势相差不大，[6]与不同果肉质枇杷研究结果类似不同，不同肉质枇杷Cx酶活性虽都呈上升的变化，但硬质型枇杷上升的幅度较软质型枇杷小，说明Cx酶对果实的质地差异的影响因果实种类而异。[8][61]有研究认为，PG酶和Cx酶活性变化的共同作用导致果实的软化。本研究结果表明，PG酶和Cx酶相互协调参与菠萝蜜果实的成熟软化表现不明显，但从对果[8][62][99]实软化的影响程度上来看，PG>Cx，与菊黄桃、柿、油桃的研究结果有所不同。[56]有些研究结果表明PG酶不是果实软化的关键酶。近年来，果实软化机理重点[85]转向了一些与细胞壁多糖降解有关的糖苷酶。研究表明β-半乳糖苷酶可能对果实软化和细胞壁的修饰起作用，使一些细胞壁组分变得不稳定，促使细胞壁膨胀进而软化。[125]芒果的实验结果发现，β-半乳糖苷酶活性的变化与果实的软化密切相关。本研究中，水溶性β-半乳糖苷酶和盐溶性β-半乳糖苷酶在4种不同基因型菠萝蜜果实的成熟软化过程中，都表现出了较高的酶活性，但在干苞和湿苞类型果实中变化趋势不同。湿苞类型果实的水溶性β-半乳糖苷酶在果实成熟的第三阶段活性最高，这一时期正是果实开始软化的阶段，而干苞果实的水溶性β-半乳糖苷酶活性变化不大，说明水溶性[6]β-半乳糖苷酶与干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成有重要作用，这与枇杷研究的结果类似，虽两种肉质枇杷β-半乳糖苷酶都呈先下降后上升的变化，但变化的幅度相[56]差较大。水溶性β-半乳糖苷酶可能参与湿苞型菠萝蜜果实软化的前期启动，桃、„玉38 广东海洋大学硕士学位论文[134][126]金香‟甜瓜榴莲果实成熟软化过的研究有类似的报道。但在干苞类型菠萝蜜果实的成熟软化过程中，水溶性和盐溶性β-半乳糖苷酶活性变化幅度都较小，这与茄[29][78][126]子、苹果、榴莲果实研究的结论相一致。无论是水溶性的还是盐溶性的α-甘露糖苷酶在干苞和湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中均没能表现出一致的变化，说明α-甘露糖苷酶参与了菠萝蜜果实成熟软化的进程，但可能与菠萝蜜干、湿苞果实的成熟软化后的质地差异没有多大的关系。这与不[6][84]同品种枇杷、番茄研究结果相差较大，说明，果实种类不同，α-甘露糖苷酶作用相差较大。菠萝蜜果实成熟过程中水溶性的α-甘露糖苷酶活性远远高于盐溶性的α-甘露糖苷酶活性，说明盐溶性环境可能抑制菠萝蜜果实中甘露糖苷酶的活性。综上所述，PG酶、PME酶、β-半乳糖苷酶和Cx酶等细胞壁水解酶均参与了菠萝蜜果实成熟软化的过程，但其主要作用是PG酶、PME酶和β-半乳糖苷酶。在不同的基因型之间，酶活性水平和变化趋势均存在不同程度的差异，而水溶性的PG酶和β-半乳糖苷酶在干、湿苞类型菠萝蜜果实之间表现出不同的变化趋势，因此，与干、湿苞菠萝蜜果实质地差异的形成有较大关系。4.2菠萝蜜果实细胞壁物质变化与果实成熟软化的关系[19]果胶是细胞壁的重要构成物质之一，细胞之间相互粘合也受果胶的影响。果实的成熟度不同，可溶性果胶和原果胶的含量也不尽相同。一般认为，随着果实的成熟，可溶性果胶含量增多，原果胶含量减少，果实细胞之间的粘合度下降，细胞之间松弛，[40]果实软化。在本实验中，随着菠萝蜜果实的成熟软化，细胞壁物质呈不断下降的趋势，并且干湿苞类型菠萝蜜之间、不同基因型之间变化趋势一致，差异较小，与‘秦冠’苹果[40][119]、龙眼研究结果一致。因此，菠萝蜜果实细胞壁总物质含量的变化不受果实质地差异和基因类型的影响。采用不同的提取液可分别提取出细胞壁多糖物质的不同部分，例如，使用CDTA可提取出细胞壁多糖中的离子结合态果胶，利用Na2CO3可提取出细胞壁多糖中的共价结合态果胶，利用4%KOH可提取出细胞壁多糖中的基质半纤维素，利用24%[40]KOH可提取出细胞壁多糖中的共价结合半纤维素。本实验中，CDTA-溶性细胞壁多糖随着菠萝蜜果实的成熟软化持续上升，干、湿苞菠萝蜜果实之间、不同基因型之间，CDTA-溶性细胞壁多糖含量有差异，湿苞类型要高。CDTA-溶性果胶中性糖含量在菠萝蜜果实成熟过程中，呈先下降后上升的变化，干湿苞类型之间、不同基因型之[40][85][5][127]间有差异，与苹果、草莓研究结果不同，但与桃和葡萄柚的相似。Na2CO3-溶性细胞壁多糖在菠萝蜜果实的成熟软化过程中，变化趋势与CDTA-溶性细胞壁多[38][128]糖相似，也呈上升的变化，且在干、湿苞基因型间存在差异，与柿，桃、苹果[40]等研究的结果不同。菠萝蜜果实在成熟软化过程中，离子态结合果胶和共价结合态39 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究果胶含量均在不断上升，但在干、湿苞菠萝蜜间含量变化幅度有差异，并且CDTA-溶性细胞壁多糖的含量大概是Na2CO3-溶性细胞壁多糖含量的三倍左右。因此菠萝蜜果实的成熟软化，CDTA-溶性细胞壁多糖和Na2CO3-溶性细胞壁多糖与干、湿苞果实质地差异的形成有关，并且不一定全是细胞壁果胶的降解，可能包括少数多聚体物质的解离，如中胶层的果胶酸物质的解离，使离子态果胶含量增加，最后导致细胞间粘[127]合力下降而使果实软化。稀碱溶液可提取与细胞壁结合松弛的半纤维素多糖，浓碱溶液则提取与细胞壁结合紧密的半纤维素多糖。在本实验中，4%KOH溶性细胞壁多糖含量的变化因干、湿苞类型不同，变化趋势有差异，而24%KOH溶性细胞壁多糖含量的变化因干、湿苞类型和不同基因型之间变化趋势表现不一致。4%KOH溶性细胞壁多糖含量要高于24%KOH溶性细胞壁多糖。说明菠萝蜜果实前期软化主要是疏松结合的基质多糖[127][40][29]的降解，这在葡萄柚、苹果、茄子等研究结果相符。在对4种细胞壁提取液组分的柱层析分析实验中，都有一种分子量相对较高的物质在这个成熟过程中未发生很明显的降解，只是很少的一部分高分子量的物质发生了降解，使一些小分子物质在整个过程中发生无规律的变化，说明这四种细胞壁提取液中都有构成细胞壁结构的基本元件，并且细胞壁降解酶可能参与了这一进程。这与苹[113][5]果、硬溶质桃果实成熟过程中细胞壁多糖组分分析不同。由于实验条件的限制，未能定性的测定这些高分子物质，小分子物质的种类也未能定性测定。因此这一部分的实验，有待更进一步的深入探讨和研究。4.3菠萝蜜果实中的糖代谢与果实成熟软化的关系果实中的糖度、酸度、合适的糖酸比及挥发性芳香物质决定果实风味品质。决定果实甜度的物质主要是可溶性糖中的果糖、葡萄糖和蔗糖。改良果实的风味品质主要[114]通过提高总糖含量和增加果糖的积累提高果糖与葡萄糖的比值。但在菠萝蜜中相关报道鲜见。本研究表明，干苞类型的菠萝蜜果实果糖与葡萄糖的比要高于湿苞菠萝[103][104][102]蜜，所以菠萝蜜干湿苞类型风味不同，葡萄、蜜桔、苹果、不同种质资源[129]桃都有类似的报道。在菠萝蜜的果实成熟软化过程中，果糖、蔗糖、葡萄糖和总糖含量总体均呈上升趋势，而淀粉含量呈下降的趋势，说明在菠萝蜜果实的成熟过程中，淀粉不断转化为可溶性糖。在这一过程中，淀粉酶活性在干湿苞菠萝蜜中变化趋势不同，但总体上变化平缓略有上升，说明淀粉酶在淀粉水解为可溶性糖过程中发挥[7][30]了重要作用，这与猕猴桃、鳄梨研究结果一致。在湿苞菠萝蜜果实成熟的第二阶段至第三阶段，淀粉酶上升的最快，这一阶段可溶性糖的上升的最快，但淀粉的下降[18]不是最快，说明还有其它相关酶参与淀粉的降解，其酶活性的变化趋势与枣、苹果[36]类似。转化酶在成熟的第三阶段值最高，果糖和葡萄糖在成熟的第三、四阶段含量较高，这与转化酶将蔗糖转化为果糖和葡萄糖相符，但蔗糖在整个成熟过程中呈上升40 广东海洋大学硕士学位论文的变化，说明与蔗糖代谢相关的酶还包括其他酶，与甜瓜糖积累研究结果一致，枸杞[130][131]、苹果等糖积累特性研究结果有相似的结论，但蔗糖的变化趋势有差异。菠萝蜜果实中淀粉酶和转化酶活性的变化在干、湿苞类型间存在差异。湿苞类型菠萝蜜果实的转化酶活性要高于干苞类型，盐溶性的转化酶活性要高于水溶性的转化酶。湿苞类型菠萝蜜在成熟后期淀粉酶活性高于干苞类型，水溶性的淀粉酶活性高于[7][132]盐溶性的淀粉酶。类似的结论在猕猴桃、柿都有报道。因此，淀粉酶和转化酶参与菠萝蜜果实成熟软化过程中糖代谢的反应，并与淀粉、可溶性总糖、葡萄糖、果糖和蔗糖含量的变化有联系。4.4细胞壁修饰酶、细胞壁物质代谢与果实软化的关系果实成熟软化过程中，细胞壁物质的降解是细胞多个酶促反应的结果。本实验中，细胞壁干物质在菠萝蜜果实的成熟软化过程中，总体呈下降的趋势，在成熟的初期至第二阶段细胞壁干物质含量下降的最快，此阶段果胶甲酯酶活性处于较高水平，PG酶活性在不但增加，说明此阶段细胞壁物质代谢处于旺盛时期。但在这一阶段，CDTA-溶性果胶和Na2CO3-溶性果胶含量的变化不大，这可能是由于PG酶只是参与了果胶溶解的一部分反应。在成熟的第三、四阶段，CDTA-溶性果胶和Na2CO3-溶性果胶含量的迅速上升，PG酶、β-半乳糖苷酶和水溶性α-甘露糖苷酶都相对较高，说明这一阶段这三种酶充分参与到细胞壁的代谢过程中，而这一时期也是菠萝蜜果实快速软化的时期。细胞壁溶性多糖含量的变化因菠萝蜜干湿苞类型不同，而表现的变化趋势不一样，这除了与参与代谢相关酶活性有关外，还与菠萝蜜果实质地有关。在菠萝蜜成熟软化过程中，细胞壁中的各种酶参与的酶促反应是个复杂的反应程序，这些酶不仅受自身遗传物质的影响，还与环境的因素有关，它们彼此之间相互协调作用于细胞壁物质，完成反应的历程。41 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究5结论（1）干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，果胶甲酯酶、盐溶性和水溶性多聚半乳糖醛酸酶、盐溶性和水溶性β-半乳糖苷酶、水溶性α-甘露糖苷酶参与菠萝蜜果实的软化，并且果胶甲酯酶可能出现在菠萝蜜果实成熟的早期阶段。果胶甲酯酶、盐溶性多聚半乳糖醛酸酶，盐溶性β-半乳糖苷酶在四种菠萝蜜中酶活性变化各异，因而不大可能是干、湿苞菠萝蜜果实质地品质差异的成因。水溶性多聚半乳糖醛酸酶在湿苞果实的成熟软化过程中均呈持续上升的趋势，而在干苞果实中则变化平缓；水溶性半乳糖苷酶在湿苞果实中的变化趋势为先上升后下降，在干苞基因型中也变化不大。因此水溶性的多聚半乳糖醛酸酶和水溶性的半乳糖苷酶很有可能是干、湿苞菠萝蜜果实质地品质的成因，并且β-半乳糖苷酶可能参与菠萝蜜果实成熟软化过程的启动。（2）干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，离子结合态果胶（CDTA-溶性细胞壁多糖）和共价结合态果胶（Na2CO3-溶性细胞壁多糖）的含量均呈不同程度的上升变化。4种基因型菠萝蜜果实中，CDTA-溶性果胶上升的幅度在基因型间存在差异，湿苞类型要略高于干苞类型；Na2CO3-溶性果胶在干苞的菠萝蜜果实中上升趋势明显，而在湿苞型菠萝蜜果实中略有上升但上升幅度不大；因此，共价结合态果胶与干、湿苞菠萝蜜果实质地的形成有关。4%KOH溶性细胞壁多糖含量变化在干、湿苞菠萝蜜间变化趋势不同，在干苞型基因型中，含量先上升后下降，而在湿苞型基因型中，则先下降，后略上升，因此，与干、湿苞果实质地差异的形成有关；24%KOH溶性细胞壁多糖的变化趋势在4种不同的基因型间均存在差异，因此，与干、湿苞果实质地差异的形成关系不大，但与菠萝蜜果实的成熟有关。（3）采用柱层析法，对所提取的4种细胞壁多糖进行了分析。在干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，离子态结合果胶组分、共价结合态果胶组分和4%KOH溶性细胞壁多糖组分中各种物质含量因菠萝蜜果实质地差异而不同，变化复杂，这可能与构成干、湿苞菠萝蜜细胞壁的结构物质有关。（4）在干、湿苞菠萝蜜果实成熟软化过程中，干、湿苞菠萝蜜果实的可溶性总糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量均呈上升趋势，可溶性总糖中以蔗糖为主。可溶性总糖持续上升，淀粉含量则不断下降，说明淀粉含量变化与可溶性糖变化有着密切的联系。菠萝蜜果实中的水溶性转化酶活性较低，在湿苞果实的成熟阶段Ⅲ最高，随后下降，在干苞果实中则变化不大。盐溶性转化酶活性较高，但在不同基因型间存在不同的变化趋势。水溶性淀粉酶和盐溶性淀粉酶的活性变化与转化酶活性变化类似，但水溶性的淀粉酶活性要远远高于盐溶性的淀粉酶活性。因此，盐溶性转化酶和水溶性淀粉酶参与菠萝蜜果实成熟软化，水溶性淀粉酶可能与菠萝蜜干、湿苞果实成熟软化的质地差异有关。42 广东海洋大学硕士学位论文参考文献[1]丰锋，叶春海，李映志.菠萝蜜的组织培养和植物再生[J].植物生理学通讯，2006，42(5)：915~916.[2]吕飞杰，彭艳，陈业渊,等.我国菠萝蜜生产现状及发展优势分析[J].中国热带农业，2012，（2）：13~15.[3]李映志，叶春海，丰锋,等.雷州半岛菠萝蜜种质资源研究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2007，33（2），183~186.[4]魏雅君，杨力，马惠玲.预处理对增加红富士苹果细胞壁物质降解和出汁率的影响[J].食品与发酵工业，2011，37（11）：75~80.[5]阚娟，刘涛，金昌海，等.硬溶质型桃果实成熟过程中细胞壁多糖降解特性及相关酶研究[J].食品科学，2011，32（4）：268~274.[6]黄志明，林素英，傅明连，等.枇杷果实发育过程中果肉质地与细胞壁酶活性的变化[J].热带作物学报，2012，33（1）：24~29.[7]王贵禧，韩雅珊，于梁.猕猴桃总淀粉酶活性与果实软化的关系[J].园艺学报，1994，21（4）：329~333.[8]张鹏，陈绍慧，李江阔,等.1-MCP对‘磨盘柿’采后成熟软化的调控效应[J].果树学报，2012，29（3）：409~415.[9]罗自生.柿果实采后软化过程中细胞壁组分代谢和超微结构的变化[J].植物生理与分子生物学报，2005，31（6）：651~656.[10]陆胜民，席玙芳.采后处理对梅果细胞超微结构的影响[J].食品科学，2001，22(6)：62~65.[11]王仁才，熊兴耀，谈兴和,等.美味猕猴桃果实采后硬度与细胞壁超微结构变[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2000，26（6），457~460.[12]阚娟，谢海艳，金昌海.桃果实成熟软化过程中生理特性及细胞壁超微结构的变化[J].江苏农业学报，2012，28（5）：1125~1129.[13]张进献，李冬杰，李宏杰.果实软化过程中细胞壁结构和组分及细胞壁酶的变化[J].河北林果研究，2007，22（2）：180~183.[14]ArieAB,KislerN.Ultrustructuralchangesinthecellwallofripeningappleandpearfruit[J].PlantPhysiol,1979,64:197~202.[15]宋军，孙媛丽，崔琳,等.苹果在不同贮存环境下细胞超微结构的观察[J].电子显微学报，2005，24（4）：424~424.[16]屈红霞，唐友林，谭兴杰,等.采后菠萝贮藏品质与果肉细胞超微结构的变化[J].果实学报，2001，18（3）：164~167.43 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究[17]YamakiS.ChangesincellwallpolysaccharidesandmonosaccharidesduringdevelopmentandripeningofJapanesepearfruit[J].PlantCellPhysiol,1997,20(2):311~321.[18]梁小娥，王三宝，赵迎丽.枣采后果肉软化的生理生化和细胞超微结构变化[J].园艺学报，1998，25（4）：333~337.[19]徐晓波.李果实成熟过程中细胞壁多糖的降解和相关酶的研究[D].扬州：扬州大学，2008.[20]薛炳烨.肥城桃和草莓果实发育成熟软化生理机理的研究[D].泰安：山东农业大学，2002.[21]PerezS,Rodriguez-CaruajalMA,DocoT.Acomplexplantcellwallpolysaccharide:rhamnogalacturonanⅡstructureinquestofafunction[J].Biochimie,2003,85:109~121.[22]张鹏龙，陈复生，杨宏顺,等.果实成熟软化过程中细胞壁降解研究进展[J].食品科技，2010，35（11）：62~66.[23]王炜，李鹏霞，胡花丽,等.甘薯在贮藏期间细胞壁降解酶活性的变化[J].食品与发酵工业，2012，38（7）：186~189.[24]胡芳.甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.[25]RedgwellRJ,MacRaeEA,HallettI,etal.Invivoandinvitroswellingofcellwallsduringfruitripening[J].Plant,1997a,203:162~173.[26]YoshiokaH,AobaK,KashimuraY.Molecularweightanddegreeofmethoxylationincellwallpolyuronideduringsofteninginpearandapplefruit[J].AmericanSocietyforHorticulturalScience,1992,117:600~606.[27]VarnerJE,LinLS.Plantcellwallarchitecture[J].Cell,1989,56:231~239.[28]HuberDJ.Polyuronidedegradationandhemicellulosemodificationsinripeningtomatofruit[J].AmerSocHortSci,1983a,108:405~409.[29]赵云峰，林瑜，吴玲艳.茄子果实采后软化过程中细胞壁组分及其降解酶活性的变化[J].食品与发酵工业，2012，38（10）：212~216.[30]PesisE,FuchsY,ZaubermanG.Cellulaseactivityandfruitsofteninginavocado[J].PlantPhysiology,1978,61(3):416~419.[31]RoseJ.K.C,HadfieldKA,LabavitchJM,etal.Temporalsequenceofcellwalldisassemblyinrapidlyripeningmelonfruit[J].PlantPhysiology,1998,117:345–361.[32]LohaniS,TrivediPK,NathP.Changesinactivitiesofcellwallhydrolasesduringethylene-inducedripeninginbanana:effectof1-MCP,ABAandIAA[J].Postharvest44 广东海洋大学硕士学位论文BiologyandTechnology,2004,31(2):119~126.[33]AhmedA,LabavitchJ.CellwallchangesandCellwallmetabolisminripening„bartlett‟pears[J].PlantPhysiology,1980a,65(5):1009~1013.[34]关军锋.果实品质生理[M].北京:科学出版社,2008，59.[35]陆胜民，金勇丰，席玙芳，等.果实成熟过程中细胞壁组分的变化[J].植物生理学通讯，2001，37（3）：246~249.[36]李宏建，徐贵轩，宋哲，等.岳帅苹果贮藏期间果实软化生理变化研究[J].江苏农业科学，2011（1）：315~317.[37]李萍，廖康，赵世荣，等.杏果实采后细胞壁组分及水解酶活性变化研究[J].新疆农业大学学报，2012，35（6）：446~451.[38]赵博，饶景萍.柿果实采后细胞壁多糖代谢及其降解酶活性的变化[J].西北植物学报，2005，25（6）：1199~1202.[39]HadfieldKA,BennettAB.Polygalacturonases:manygenesinsearchofafunction[J].PlantPhysiology,1998,117:337~343.[40]于乐谦，杨力，马惠玲,等.2种预处理方法对‘秦冠’苹果果实细胞壁物质降解和出汁率的影响[J].西北农业科技大学学报（自然科学版），2012，40(11)：159~165.[41]HuberDJ,O‟DonoghueEM.Polyuronidesinavocado(PerseaAmericanaL.)andtomato(LycopersiconesculentumL.)fruitsexhibitmarkedlydifferentpatternsofmolecularweightdownshiftsduringripening[J].PlantPhysiology,1993,102:473~480.[42]王淑琴，上刚，颜廷上,等.不同成熟度金铃大枣贮藏特性的研究[J].食品工业，2009（2）：29~31.[43]茅林春，张上隆.果胶酶和纤维素酶在桃果实成熟和絮败中的作用[J].园艺学报，2001，28（2）：107~111.[44]DellaPennaD,LashbrookCC,ToenjesK,etal.Polygalacturonaseisozymesandpectindepolymerizationintransgenicrintomatofruit[J].PlantPhysiol,1990,94:1882~1886.[45]SmithC.J.S,WatsonCF,MorrisPC,etal.Inheritanceandeffectonripeningofantisensepolygalacturonasegenesintransgenictomatoes[J].PlantMolecularBiology,1990,14:369~379.[46]韩英群，郝义，郭丹,等.采前钙处理对月光李采后果实品质与生理变化的影响[J].保鲜与加工，2010，10（2）：32~34.[47]夏杏洲，吴雪彪，梁振全,等.钙处理对红江橙采后生理的影响[J].热带作物学报，45 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究2009，30（10）：1462~1467.[48]庞杰.冷激对贮藏枇杷多聚半乳糖醛酸酶的影响[J].延边大学农学学报，2000，22（3）：169~171.[49]陈贵堂.冬枣采后生理及贮藏技术研究[D].保定：河北农业大学，2003.[50]魏文毅，王贵禧，梁丽松，等.‘八月脆’桃果实气调贮藏过程中品质及相关酶活性的变化[J].林业科学，2008，44（3）：81~86.[51]PingZQ,ShuiXW.Effectof1-methylcyclopropeneand/orchitosancoatingtreatmentsonstoragelifeandqualitymaintenanceofIndianjujubefruit[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2007,40(3):404~411.[52]Ben-ArieR,KislevN.Ultrastructuralchangesinthecellwallsofripeningappleandpearfruit[J].PlantPhysiology,1979,64(2):197~202.[53]吴延军，张继，王春生.枣呼吸类型的初步研究[J].安徽农业大学学报，1999，26（2）：221~224.[54]寇晓虹，王文生，吴彩娥，等.鲜枣冷藏过程中生理生化变化的研究[J].中国农业科学，2000，33（6）：44~49.[55]GiovannoniJJ,DellaPennaD,BennettAB,etal.Expressionofachimericpolygalacturonasegeneintransgenicrin(ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening[J].ThePlantCell,1989(1):53~63.[56]阚娟，金昌海，汪志君，等.β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶对桃果实成熟软化的影响[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2006，27（3）：76~80.[57]刘超超，魏景利，徐玉婷，等.苹果3个早熟品种果实发育后期硬度及其相关生理指标的初步研究[J].园艺学报，2011，38（1）：133~138.[58]林河通，席玙芳，陈绍军.黄花梨果实采后软化生理基础[J].中国农业科学，2003，36（3）：349~352.[59]BrummellDA.Cellwalldisassemblyinripeningfruit[J].FunctionalPlantBiology,2006,33:103~119.[60]朱庆竖，郭巨先,杨运英,等.不同贮藏条件下储良龙服果实纤维素酶活性的变化[J].华中农业大学学报，2007，26（4）：542~545.[61]徐凌，郝义，张广燕,等.1-MCP处理对菊黄桃采后生理变化和相关酶活性影响的研究[J].保鲜与加工，2010，10（57）：20~23.[62]田长河，饶景萍，冯炜.1-MCP处理对柿果实采后生理效应的影响[J].干旱地区农业研究，2005，23（5）：123~127.[63]陈金银，刘康.1-甲基环丙烯（1-MCP）在果蔬贮藏保鲜上的应用研究进展[J].江西农业大学学报，2008，30（4）：215~219.46 广东海洋大学硕士学位论文[64]MercadoJA,TrainottiL,Jimenez-BermudezL,etal.Evaluationoftheroleoftheendo-β-1,4-glucanasegeneFaEG3instrawberryfruitsoftening[J].PostharvestBiologyandTechnology,2010,55(1):8~14.[65]赵云峰，林河通，林娇芬,等.果实软化的细胞壁降解酶及其调控研究进展[J].仲恺农业技术学院学报，2006，19（1）：65~70.[66]周培根,吴邦良.桃成熟期间果实软化与果胶及有关酶的关系[J].南京农业大学学报,1991，14（2）：33~37.[67]杨德兴,戴京晶,庞向宇,等.猕猴桃衰老过程中PG、果胶质和细胞壁超微结构的变化[J].园艺学报,1993，20（4）：341~345.[68]王愈，李里特，郝迚雄.贮藏山楂果胶酶活性及果胶含量的变化规律[J].农产品加学•学刊，2006（2）：12~15.[69]李敏，胡美姣，高兆银,等.芒果采后及贮藏生理研究进展[J].中国农学通报，2005，21（8）：400~412.[70]PaullRE,ChenNJ.PostharvestVariationinCellWall-DegradingEnzymesofPapapa(CaricapapapaL.)duringFruitRipening[J].Plantphysiology,1983,72(2):382~385.[71]RonenR,ZaubermanG,AkermanM.Xylanaseandxylosidaseactivitiesinavocadofruit[J].Plantphysiology,1991,95(3):961~964[72]RanwalaAP,SuematsuC,MasudaH.Theroleofβ-galactosidasesinthemodificationofcellwallcomponentsduringmuskmelonfruitripening[J].PlantPhysiol,1992(100):1318~1325.[73]WallnerSJ,WalkerJE.GlycosidasesinCellWail-degradingExtractsofRipeningTomatoFruits[J].PlantPhysiology,1975(55):94~98.[74]庄军平，苏菁,李雪萍，等.香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析[J].植物生理与分子生物学学报,2006b，32（4）：411~419.[75]VicenteA,CostaM,MartínezG,etal.Effectofheattreatmentsoncellwalldegradationandsofteninginstrawberryfruit[J].PostharvestBiologyandTechnology,2005,38(3):213~222.[76]NakamuraA,MaedaH,MizunoM,etal.β-GalactosidaseandItsSignificanceinRipeningof„Saijyo‟JapanesePersimmonFruit[J].Biosciencebiotechnologyandbiochemistry,2003,67(1):68~76.[77]AliZM,ChinL-H,LazanH.Acomparativestudyonwalldegradingenzymes,pectinmodificationsandsofteningduringripeningofselectedtropicalfruits[J].PlantScience,2004,167(2):317~327.47 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究[78]SousaI,GoulaoLF,SantosJ,etal.β-galactosidaseandα-L-arabinofuranosidaseactivitiesandgeneexpressioninEuropeanandChinesepearfruitduringripening[J].JournaloftheJapanesseSocietyforHortitulturalScience,2007,76(1):85~90.[79]DawsonDM,MeltonLD,WatkinsCB.Cellwallchangesinnectarines(PrunuspersicaL.):Solubilizationanddepolymerizationofpecticandneutralpolymersduringripeningandinmealyfruit[J].PlantPhysiology,1992(100):1203~1210.[80]Fernandez-BolanosJ,RodriguezR,GuillenR,etal.Activityofcellwall-associatedenzymesinripeningolivefruit[J].PhysiolPlant,1995(93):651~658.[81]RedgwellRJ,HarkerR.Softeningofkiwifruitdiscseffectofinhibitionofgalactoselossfromcellwalls[J].Phytochemistry,1995(39):1319~1323.[82]SmithDL,AbbottJA,GrossKC.Down-regulationoftomatoβ-galactosidase4resultsindecreasedfruitsoftening[J].PlantPhysiology,2002(129):1755–1762.[83]陈昆松,张上隆.β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达[J].植物生理学报,2000，26（2）：117~122.[84]BewleyJD,BanikM,BourgaultR,etal.Endo-β-mannanaseincreasesintheskinandouterpericarpofoftomatofruitsduringripening[J].ExpBot,2000,51(344):529~238.[85]薛炳烨，毛志泉，束怀瑞.草莓果实发育过程中糖苷酶和纤维素酶活性及细胞壁组成变化[J].植物生理与分子生物学学报，2006，32（3）：363~368.[86]SakuraiN,NevinsDJ.Relationshipbetweenfruitsofteningandwallpolysaccharidesinavocado(PerseaamericanaMill)mesocarptissues[J].PlantandCellPhysiology,1997(38):603~610.[87]刘美艳，魏景利，刘金，等.‘泰山早霞’苹果采后1-甲基环丙烯处理对其软化及相关基因表达的影响[J].园艺学报，2012，39（5）：845~852.[88]GoulaoLF,OliveiraCM.MolecularidentificationofnoveldifferentiallyexpressedmRNAsup-regulatedduringripeningofapples[J].PlantScience,2007(172):306~318.[89]金昌海，水野雅史，阚娟，等.不同品种苹果采后后熟软化过程中细胞壁多糖的降解[J].植物生理与分子生物学学报，2006a，32(6)：617~626.[90]金昌海，阚娟，索标，等.桃果实成熟软化过程中α–L–阿拉伯呋喃糖苷酶活性和乙烯合成相关因子的变化[J].食品科学，2006b，27（1）：61~64.[91]TateishiA,MoriH,WatariJ，etal.Isolation,characterizationandcloningofalpha–L-arabinofuranosidaseexpressedduringfruitripeningofJapanesepear[J].PlantPhysioly,2005,38(3):1653~1664.48 广东海洋大学硕士学位论文[92]RanwalaAP,SuematsuC,MasudaH.Theroleofβ-galactosidasesinthemodificationofcellwallcomponentsduringmuskmelonfruitripening[J].PlantPhysiol,1992(100):1318~1325.[93]SozziGO,FraschinaAA,NavarroAA,etal.α-L-arabinofuranosidaseactivityduringdevelopmentandripeningofnormalandACCsynthaseantisensetomatofruit[J].HortScience,2002(37):564~566.[94]PesisE，FuchsY，SehiffillannNM.Amylaseandcelluloseinavoeadofruitafterharvest[J].PamphletInstituteforTechnologyandStorageofAgriculturalProduets,1977(172):59~64.[95]石泽亮，傅伟昌.贮藏条件和贮前品质对称猴桃贮藏效果的影响[J].吉首大学学报，2002，21（4）：10~12.[96]高豪杰.1-MCP对芒果采后品质和生理的影响[D].海口：海南大学，2012.[97]王岩.不同产地冬枣贮藏特性与采后生理变化研究[D].保定：河北农业大学，2007.[98]陈莲，林河通，陈艺晖，等.台湾青枣果实采后生理和病害研究进展[J].包装与食品机械，2010,28（6）：45~54.[99]彭丽桃，杨书珍，任小林，等.采收两种不同果肉类型油桃软化相关酶活性的变化[J].热带亚热带植物学报,2002，10（2）：171~175.[100]王永章，张大鹏.‘红富士’苹果果实蔗糖代谢与酸性转化酶和蔗糖合酶关系的研究[J].园艺学报，2001，28（3）：259~261.[101]吕英民，张大鹏.果实发育过程中糖的积累[J].植物生理学通讯，2000，36（1）：1~5.[102]王永章，王小芳，张大鹏.苹果果实转化酶的种类和特性研究[J].中国农业大学学报，2001，6（5）：9~14.[103]周兴本，郭修武.套袋对红地球葡萄果实发育过程中糖代谢及转化酶活性的影响[J].果树学报，2005，22（3）：207~210.[104]刘永忠，何国富，黎强,等.国庆1号温州蜜桔转化酶和糖分积累特性研究[J].华中农业大学学报，2005，24（2）：213~216.[105]纳智.菠萝蜜中香气成分分析[J].热带亚热带植物学报，2004，12（6）：538~540.[106]B.T.Ong,S.A.H.Nazimah,C.P.Tanetal.Analysisofvolatilecompoundsinfivejackfruit(ArtocarpusheterophyllusL.)cultivarsusingsolid-phasemicroextraction(SPME)andgaschromatography-time-of-flightmassspectrometry(GC-TOFMS)[J].JournalofFoodCompositionandAnalysis,2008(21):416~422.[107]Jose´Guilherme,MaiaEloisaHelena,Andrade,etal.Aromavolatilesfromtwofruit49 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究varietiesofjackfruit(ArtocarpusheterophyllusLam.)[J].FoodChemistry,2004,85:195~197.[108]FarAF,RossoVV,MercadanteAZ.CarotenoidCompositionofJackfruit(Artocarpusheterophyllus),DetermminedbyHPLC-PDA-MS/MS[J].PlantFoodsHumNulr,2009(64):108~115.[109]郑华，张弘，甘瑾,等.菠萝蜜果实挥发物的热脱附-气象色谱/质谱（TCT-GC/MS）联用分析[J].食品科学，2010，31（6）：141~144.[110]OngBT,etal.Chemicalandflavourchangesinjackfruit(ArtocarpusheterophyllusLam.)cultivarJ3duringripening[J].PosthavestBiologyandTechnology,2006(40):279~286.[111]GrossKC.Arapidandsensitivespectrophotometricmethodforassayingpolygalacturonaseusing2-cyanoacetamide[J].Hort-Science1982(17):933~934.[112]杨力，王江浪，马惠玲.乙烯对苹果果实细胞壁降解效应初探[J].西北植物学报，2009，29（2）：320~326.[113]金昌海，水野雅史，汪志君，等.苹果β-半乳糖苷酶对细胞壁多糖降解特性的研究[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2002,23（4）：71~78.[114]张保才.‘风味4号’甜瓜果实糖积累及采后生理代谢研究[D].武汉：华中农业大学，2010.[115]刘胜辉，臧小平，魏长宾，等.高效液相色谱测定台农19号菠萝糖分[J].广东农业科学，2008（12）：133~135.[116]NellyBlumenkrantz,GustavAsboe-Hansen.Newmethodofquantitativedeterminationofuronicacids[J].AnalyticalBiochemistry,1973(54):484~489.[117]MercyWM,FrancisMM,KyokoH,etal.β-galactosidaseandα-L-arabinofuranosidaseactivitiesandgeneexpressioninEuropeanandChinesepearfruitduringripening[J].JournaloftheJapaneseSocietyforHorticuIturalScience,2007,76(1):85~90.[118]GhoshS,MeliVS,KumarA,eatl.TheN-glycanprocessingenzymesalpha-mannosidaseandbeta-D-N-acetylhexosaminidaseareinvolvedinripeningassociatedsofteninginthenon-climactericfruitsofcapsicum[J].JOURNALOFEXPERIMENTALBOTYNY,2011,62(2):571~582.[119]林河通，赵云峰，席玙芳.龙眼果实采后果肉自溶过程中细胞壁组分及其降解酶活性的变化[J].植物生理与分子生物学学报，2007，33（2）：137~145.[119]马文平，倪志婧，任贤，等.1-MCP对‘玉金香’甜瓜采后果实软化的作用机理[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（2）：103~108.50 广东海洋大学硕士学位论文[120]冯美，张宁，张宏宝，等.枸杞采后细胞壁组分及其降解酶活性的变化[J].干旱地区农业研究，2011，29（5）：111~114.[121]王彬，郑伟，何绪晓,等.1-MCP对火龙果果实采后生理特性的影响[J].西南农业学报，2011，24（6）：2127~21231.[122]AbelesFB,TakedaT.Celluloseactivityandethyleneinripeningstrawberryandapplefruits[J].SciHortia,1990(42):269~275.[123]陆胜民，席玙芳，张耀洲.梅果采后软化与细胞壁组分及其降解酶活性的变化[J].中国农业科学，2003，36（5）：595~598.[124]王俊宁，饶景萍，任小林，等.1-甲基环丙烯（1-MCP）对油桃果实软化的影响[J].植物生理学通报，2005，41（2）：153~156.[125]ZainonMA,SanthiA,HamidL.β-galactosidaseanditssignificanceinripeningmangofruit[J].Phytochemistry1995,38(5):1109~1114.[126]KetsaS,DaengkanitT.Firmnessandactivitiesofpolygacturonase,pectinesterase,β-galactosidaseandcellulaseinripeningdurianharvestedatdifferentstagesofmaturity[J].ScientiaHorticulturae,1999(80):181~188.[127]邓佳，刘惠民，张南新，等.采后钙及热处理对葡萄柚果实贮藏期细胞壁物质代谢的影响[J].北方园艺，2013（2）：123~129.[128]金昌海，索标，阚娟，等.桃果实成熟软化过程中细胞壁多糖降解特性的研究[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2006，27（3）：70~75.[129]赵剑波，姜全，郭继英，等.桃不同种质资源成熟果实葡萄糖、果糖含量比例研究[J].中国农业大学学报，2008，13（2）：30-34.[130]郑国琦，罗霄，郑紫燕,等.宁夏枸杞果实糖积累和蔗糖代谢相关酶活性的关系[J].西北植物学报，2008，28（6）：1172~1178.[131]魏建梅，齐秀东，朱向秋，等.苹果果实糖积累特性与品质形成的关系[J].西北植物学报，2009，29（6）：1193~1199.[132]王英超，张桂霞，赵汐琼，等.柿果实软化过程中α-淀粉酶活性与纤维素酶活性变化研究[J].安徽农业科学，2007，35（28）：8815~8816.[133]王海宏.白玉枇杷采后生理特性及贮藏技术的研究[D].南京：南京农业大学，2007.[134]马文平，倪志婧，任贤，等.1-MCP对“玉金香”甜瓜采后果实软化的作用机理[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（2）：103~108.51 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究附录缩略词表（Abbreviation）缩写英文名称中文名称CDTA1,2-Cyclohexanedinitrilotetraaceticacid反式-1.2-环己二胺四乙酸PGPolygalacturonase多聚半乳糖醛酸酶PMEPectinmethylesterase果胶甲酯酶1-MCP1-Methylcyclopropene1-甲基环丙烯CxCellulase纤维素酶XylXylanase木聚糖酶α-Manα-mannosidaseα-甘露糖苷酶PGAPolygalacturonicacid多聚半乳糖醛酸DNS3,5-dinitrosalicylicacid3,5-二硝基水杨酸PNPGp-NitroPHenyl-beta-D-galactopyranoside对硝基苯基半乳糖苷TrisTris(Hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷CWMcellwallmaterial细胞壁物质AISAlcoholinsolublesolid细胞壁乙醇不溶物RG-Ⅰrhamnogalacturonan-I聚鼠李糖半乳糖醛酸ⅠGC-MSGasChromatograph-MassSpectrometer-computer气相色谱-质谱联用仪SPMESolidPhaseMicro-extraction固相微萃取52 广东海洋大学硕士学位论文致谢本文是在导师叶春海教授的悉心指导下完成的，从论文的立题、实施、完成和撰写过程，每一步都得到了导师的悉心指导和帮助，倾注了导师大量的心血。在三年的硕士研究生学习、试验过程中，导师渊博的知识、敏锐的洞察力、严谨求实的治学态度、敬业求真的工作精神给了我极大的精神鼓舞和启迪，是我获益终生的宝贵财富，我将终生难忘，更是我一生学习的楷模和榜样。论文的完成同样离不开广东海洋大学农学院各位老师的大力帮助，特别是李映志老师在研究试验上的指导及在论文撰写过程中提出的许多宝贵的建议，这使我论文得以顺利完成，在此表示我最衷心的感谢和最诚挚的祝福。还要感谢园林系吕庆芳老师、李洪波老师、丰锋教授、李润唐教授在实验过程中给予的诸多帮助、教诲、鼓励和关怀。感谢毛琪师兄、李明焜师兄、师银燕师姐、汪永保师弟、张佳琦师弟等师弟师妹及同学在实验过程中给予的帮助和支持。在此，我想向你们道我一声最诚挚的谢意，谢谢你们。感谢我的家人和亲戚，是他们的关怀和支持给了我前进的动力和信心，帮助我战胜困难，顺利完成学业。最后，感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵建议的所有专家和老师！董黎梨2013年4月于广东海洋大学53 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究作者简介董黎梨，1987年4月生，中共党员，本科（2006-2010）就读于邢台学院生化系生物科学专业。2010年考入广东海洋大学农学院作物遗传育种专业，就读园艺作物遗传育种研究方向研究生。思想上积极要求上进，严格要求自己。在学习上，具有较强的科学研究和创新能力，实践动手能力强。在校期间，发表论文一篇。参加课题：1、香蕉防控枯萎病育苗技术及组培苗生产标准化研究（2012A020200009），广东省科技厅，2012-2014；2、广东省现代农业产业技术体系创新团队岗位专家（粤财教[2009]356号），广东省农业厅，2009-2014；3、特色菠萝蜜种质资源鉴评与新品种选育（粤财教[2011]473号），广东省财政厅，2012-2015；4、香蕉产业推进关键技术研究与示范-有机香蕉生产技术研究与示范基地建设（2009B020201011-3），广东省科学技术厅，2009-2011；5、香蕉绿色食品标准化栽培技术示范与推广（粤财农综[2012]-3），国家财政部，2012-2013；6、细胞壁代谢与干湿苞菠萝蜜果实质地品质发育，国家自然科学基金，2012-2014；54 广东海洋大学硕士学位论文导师简介叶春海，果树学教授（博士、博导），现任广东海洋大学副校长，中国园艺学会热带南亚热带果树分会副理事长，广东省园艺学会副理事长，湛江市科技专家咨询委员会农林科技组组长和湛江市有突出贡献的科技专家，广东省现代农业产业技术体系岭南水果创新团队岗位专家。主要从事热带园艺植物种质资源与遗传育种及安全高效栽培技术研究和教学工作。2001年8月至2002年8月在美国加州州立大学萨克拉门托分校培训学习。近5年承担国家自然科学基金、科技部成果转化资金、省自然科学基金及各级攻关项目10余项，在《中国农业科学》、《园艺学报》等各级刊物发表论文40余篇，出版专著3部，获省科学技术奖等各级奖励多项。出版著作：1、叶春海．《绿色食品基本原理及南亚热带水果生产技术》，北京：中国农业出版社，20052、叶春海．《绿色食品－反季节香蕉生产技术规程》，广州：广东省地方标准，20043、叶春海．《湛江市现代热带农业示范区规划》，北京：中国农业出版社，2007获奖成果：1、叶春海（1）、丰锋（2）、吕庆芳（5）、李映志（6）、李润唐、毛琪，等．香蕉绿色食品生产技术研究与示范基地建设，2006年湛江市科学技术二等奖；2007年广东省科学技术三等奖。2、叶春海（5），等．优质高效香蕉新品种组培繁育及配套栽培技术推广，2004年广东省农业技术推广一等奖。3、叶春海（4），等．甘蔗良种新台糖22号组织培养技术研究湛江市科技进步三等奖（2000）。4、叶春海（1）、丰锋（4）、吕庆芳（6），等．香蕉良种快繁及推广，1997年获广东省湛江市农业技术推广一等奖；1998年广东省农业科技推广三等奖。5、叶春海（1）、丰锋（2）、吕庆芳（5），等．大果、高产、中矮杆香蕉新品种“93-1”的选育，2000年通过湛江市科技局组织的专家鉴定。6、叶春海（1）等。菠萝蜜资源调查、引种及开发利用。2010年广东省科学技术三等奖。7、叶春海（1）等。香蕉绿色食品标准化生产技术研究与示范基地建设成果推广。2009年广东省农业技术推广二等奖。8、叶春海（1）等。菠萝蜜新品种“海大1号”。2012年7月审定。承担主要项目：1、香蕉防控枯萎病育苗技术及组培苗生产标准化研究（2012A020200009），广东省55 菠萝蜜果实成熟软化过程中细胞壁修饰酶及糖代谢相关酶的研究科技厅，2012-2014。2、广东省现代农业产业技术体系创新团队岗位专家（粤财教[2009]356号），广东省农业厅，2009-2014。3、特色菠萝蜜种质资源鉴评与新品种选育（粤财教[2011]473号），广东省财政厅，2012-2015。4、香蕉产业推进关键技术研究与示范-有机香蕉生产技术研究与示范基地建设（2009B020201011-3），广东省科学技术厅，2009-2011。5、香蕉绿色食品标准化栽培技术示范与推广（粤财农综[2012]-3），国家财政部，2012-2013。6、细胞壁代谢与干湿苞菠萝蜜果实质地品质发育，国家自然科学基金，2012-2014。7、菠萝蜜核心种质库构建与优良种质筛选，国家自然科学基金，2008-201056