蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究 63页

学院代号10716学号010051540209专业代码100800密级陕西中医学院ShaanxiUniversityofChineseMedicine硕士学位论文蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究素残留研究素中辅料蜂蜜的质量考察研究学位申请人杨帅专业名称中药学申请学位类型医学科学硕士学位指导教师姓名郭耀武协助指导老师杨海燕论文提交日期2013年4月 陕西中医学院学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果并由本人所承担的法律责任。学位论文作者签名＿＿＿＿＿日期：年月日关于学位论文使用授权的声明陕西中医学院有权保留使用本人学位论文，同意学院按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权陕西中医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿日期：年月日论文导师签名＿＿＿＿＿日期：年月日 摘要目的：建立蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的5-羟甲基糠醛含量、6种抗生素残留及糖类的检测方法，通过对29批蜂蜜样品及61批蜜丸样品中蜂蜜的5-羟甲基糠醛含量，土霉素残留、盐酸四环素残留、氯霉素残留、磺胺类残留和糖类含量等的测定，来评价蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量，为制定蜜丸中蜂蜜的通用质量检测方法提供依据，从而促进企业对原料蜂蜜的严格检测，规范生产投料、科学炼蜜，保证蜜丸质量可控，产品安全、有效。方法：采用高效液相色谱法对蜂蜜及蜜丸中5-羟甲基糠醛的含量，土霉素、盐酸四环素、氯霉素磺胺嘧啶、甲氧苄啶及磺胺甲恶唑的残留量，及葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的含量进行测定，以评价蜂蜜加工过程质量变化、生产过程中抗生素及磺胺类药物使用和转移情况、及蜂蜜及蜜丸中蜂蜜可能的掺伪情况。结果：本次实验所测定的蜂蜜样品质量参差不齐，蜜丸样品其5-羟甲基糠醛含量-1-1有明显差异，其含量范围在26.09μg﹒g~3620.23μg﹒g。对糖类的测定结果显示大部分蜜丸样品及蜂蜜样品其质量达到了蜂蜜国标中规定的要求，仅有27批蜜丸样品及2批蜂蜜样品检出有麦芽糖。本次实验并未在蜜丸样品及蜂蜜样品中检测出土霉素残留、盐酸四环素残留、氯霉素残留及磺胺类药物残留。结论：本文所建立的对蜂蜜及蜜丸中5-羟甲基糠醛含量、6种抗生素残留及糖类的检测其方法准确、灵敏，稳定性好，可用于蜜丸中蜂蜜的质量控制检测。关键词：蜜丸；蜂蜜；5-羟甲基糠醛；抗生素残留；磺胺类残留；糖类 StudyoftheHoneyChangeinthePreparationoftheHoneyPillsandtheAntibioticResiduesAbstractObjective:Toestablishthehoneyinthehoneyandhoneypill5-(hydroxymethyl)furfuralcontent,thedetectionofantibioticresiduesandcarbohydrates,5-(hydroxymethyl)furfuralhoneyin29batchesofhoneysamplesand61batchesofhoneypillsamplescontent,oxytetracyclineresidues,residuesoftetracyclinehydrochloride,chloramphenicolresidues,sulfonamidesresiduesandsugarcontentdetermination,toevaluatethequalityofthehoneyinthehoneyandhoneypill,todevelopthehoneyMiwancommonqualitytestingmethodsbasis,soastopromoterigoroustestingofrawhoney,regulatetheproductionfeeding,scientificrefininghoney,toensurethecontrollableMiwanquality,productsafety,effective.Methods:Usinghighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodforhoneyandhoneypill,thecontentof5HMFinoxytetracycline,tetracyclinehydrochloride,chloramphenicol,methylbenzyloxygenorganismsulfadiazineandsulfamethoxazoleresidues,glucose,fructose,sucrose,maltose,andforthedeterminationofchangestoevaluatethequalityofhoneyprocessing,theproductionprocessofantibioticsandsulfadruguseandtransfer,andhoneyandhoneymayadulterationofhoneypill.Results:Thisexperimentmeasuredthehoneysamplesofvaryingquality,pillsamplethe5-(hydroxymethyl)furfuralcontentweresignificantlydifferent,thecontentintherange26.09μg.g-1~3620.23μg.g-1.ForthedeterminationofsugarsshowedthatmostpillsamplesandsamplesoftheirqualityhoneyhoneyGBreachedtherequirements,only27batchesofsamplesandtwobatchespillhoneysamplesdetectedwithmaltose.Thisexperimentdidnotinpillsamplesandhoneysamplesdetectedoxytetracyclineresidues,residuesoftetracyclinehydrochloride,chloramphenicolresiduesandsulfadrugresidues.Conclusion:Thisarticleestablishedthehoneyandhoneypill5-(hydroxymethyl)furfural content,detectionofantibioticresiduesandsugarthemethodisaccurate,sensitive,goodstability,canbeusedforqualitycontrolofhoneypillhoney.Keywords:pill;honey;5-(hydroxymethyl)furfural;antibioticresidues;sulfaresidues;sugarAuthor:YangshuaiTutor:GuoYaowu 目录引言.......................................................................................................................................................1第一部分综述部分................................................................................................................................2一、蜂蜜的研究进展......................................................................................................................21蜂蜜来源及产地..........................................................................................................................22蜂蜜的鉴别..................................................................................................................................32.1经验鉴别...........................................................................................................................32.2理化鉴别...........................................................................................................................43蜂蜜炼制.....................................................................................................................................44化学成分.....................................................................................................................................55检测方法.....................................................................................................................................65.1重金属及微量元素的测定...............................................................................................65.25-羟甲基糠醛检测...........................................................................................................75.3糖的测定...........................................................................................................................85.4抗生素残留.......................................................................................................................85.5有机酸测定.....................................................................................................................106蜂蜜的现代研究........................................................................................................................106.1抗炎抗菌作用.................................................................................................................106.2护肝作用.........................................................................................................................116.3保护心脏作用.................................................................................................................116.4增强免疫力作用.............................................................................................................116.5润肠通便作用.................................................................................................................127临床应用...................................................................................................................................12二、蜜丸的概述............................................................................................................................12三、蜂蜜对蜜丸质量的影响......................................................................................................131蜂蜜的质量严重影响蜜丸的质量..................................................................................132炼蜜过程缺乏统一的标准，不科学的炼制工艺存在潜在的安全风险........................14四、小结.....................................................................................................................................15第二部分实验部分..............................................................................................................................161实验材料...................................................................................................................................161.1仪器设备................................................................................................................................161.2试药及试剂............................................................................................................................162方法与结果...............................................................................................................................172.15-羟甲基糠醛的测定.............................................................................................................172.1.1色谱条件与系统适应性试验......................................................................................172.1.2溶液的制备..................................................................................................................182.1.3方法学考察..................................................................................................................182.1.4样品测定......................................................................................................................212.1.5小结.............................................................................................................................212.2土霉素、盐酸四环素及氯霉素的测定.................................................................................212.2.1色谱条件与系统适应性试验......................................................................................212.2.2溶液的制备..................................................................................................................232.2.3方法学考察..................................................................................................................23 2.2.4样品测定......................................................................................................................272.2.5小结与讨论..................................................................................................................272.3磺胺类抗生素的测定.............................................................................................................282.3.1色谱条件与系统适应性试验......................................................................................282.3.2溶液的制备..................................................................................................................292.3.3方法学考察..................................................................................................................292.3.4样品测定......................................................................................................................332.3.5小结与讨论..................................................................................................................332.4糖的测定................................................................................................................................342.4.1色谱条件......................................................................................................................342.4.2溶液的制备..................................................................................................................342.4.3方法学考察..................................................................................................................352.4.4样品测定......................................................................................................................35结语.....................................................................................................................................................36参考文献.................................................................................................................................................39附表.....................................................................................................................................................46致谢.....................................................................................................................................................53 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究引言蜜丸系指将药物细粉以炼制过的蜂蜜为粘合剂制成可塑性的固体药剂，是一种传统的中药剂型，在现代中医临床应用中仍占有相当重要的位置。蜂蜜是中药蜜丸中不可或缺的辅料，在蜜丸中的比例可高达50%~60%，所以蜂蜜的质量直接影响蜜丸的质量。蜂蜜在几千年的中医药发展历史中发挥着重要的作用，然而由于现行版《中国药典》对蜂蜜的相关指标及检测方法过于简单，导致现在市面上销售的蜂蜜存在严重的质量问题，相应的在制药方面，就导致蜜丸的质量存在一定的风险，因此，有必要对蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量控制及监测提出更高的要求，以制定出更加科学、规范的标准，从而保证广大患者的用药安全。本课题通过对蜂蜜及蜜丸样品中蜂蜜的5-羟甲基糠醛含量，抗生素及磺胺类药物残留和糖类含量等的测定方法研究，来评价蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量，从而为制定蜜丸中蜂蜜的通用质量检测方法提供依据，以此来促进企业对原料蜂蜜的严格检测，规范生产投料、科学炼蜜，保证蜜丸质量可控，产品安全、有效。1 陕西中医学院2013届硕士学位论文第一部分综述部分一、蜂蜜的研究进展1蜂蜜来源及产地蜂蜜始载于《神农本草经》，列为上品，原名―石蜜‖，别名有石饴、白沙蜜、食蜜、蜜、白蜜、蜜糖、沙蜜、蜂糖等。具有补中，润燥，止痛，解毒的功效；用于脾[2]气虚弱、脘腹挛急疼痛，肺虚干咳、久咳，肠燥便秘等；外治疮疡不敛，水火烫伤，[4]并用于中药炮制辅料或协同药效以及解乌头中毒等。此外，还具有治疗大泡性角膜[5][6][7]病变，鼻炎，冠心病等作用。蜂蜜为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂ApisceranaFabricius或意大利蜂ApismelliferaLinnaeus所酿的蜜，春至秋季采收，为浓稠的半透明液体，带有光泽，久置或遇冷会[1、2]析出结晶，有芳香性气味，味甘性平，归肺脾及大肠经。蜂蜜全国各地均有生产，[3]但以海南岛、云南、福建、江苏、浙江等地产量较多。蜂蜜的生产、采集过程见图1。AB2 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究CD图1蜂蜜的采集过程2蜂蜜的鉴别近年来，市场上经常会发现有掺假的蜂蜜，通常造假技术可分为掺白糖、饴糖、糖浆等，有的还掺杂由淀粉转化而成的果糖。2.1经验鉴别（1）若掺有水分，将蜂蜜溶液滴在滤纸上，纸上的蜜就会渗开。（2）若掺有饴糖，则甜味变淡，并且会产生酸味，如果将其滴在纸上，能渗透至背面。此外还可以取一份蜂蜜样品用4倍量水进行稀释，然后缓慢加入95％乙醇，观察结果，如果有饴糖掺入就会生成白色絮状物。（3）若掺有蔗糖，可用费氏反应法检验。此外还可用硝酸银溶液进行试验，如果加[11]入的有转化糖或蔗糖，则出现白色混浊或沉淀。（4）若掺有淀粉及面粉，则蜜样显混浊状，可取蜜样一份加水煮沸，放冷，加少量碘试液或碘酒，如果显蓝色就证明掺有淀粉或面粉；如果样品已经结晶了，可将铁棍[12]烧红插入样品中，稍停片刻后抽出，铁棍上如有附着物，则说明有淀粉等掺杂。（5）若掺有羧甲基纤维素钠（CMC-Na），可取一份样品，加入两倍的95％的乙醇，进行搅拌，如果产生白色絮状物，继续搅拌片刻后，样品最终成牛皮糖样，则可初步[13]判断掺有CMC-Na。3 陕西中医学院2013届硕士学位论文2.2理化鉴别［18］目前实验室测定蜂蜜掺假的方法主要有薄层色谱法(TLC法)、C-稳定同位素[14-16]［19］[20]［17］[21-22]分析法、红外光谱法、拉曼光谱法、高效液相色谱法、电子鼻法[23]及差热分析法等。（1）蜂蜜中如果掺有转化糖，其5-羟甲基糠醛(HMF)的含量会明显增加，这时可以采用紫外分光光度法或分光光度法进行鉴别。紫外分光光度法计算方法为：HMF(mg/100g)=(A284-A336)×14.97×5/W；分光光度法计算方法为：HMF(mg/100g)=A550×19.2。式中：14.97、19.2—系数；A284—284nm波长下的吸光度；A336—336nm波长下的吸光度；A550—550nm波长下的吸光度；W—样品重量（g）。（2）掺有盐的蜂蜜鉴定可利用KAl(SO4)2、NaCl和(NH4)2SO4等盐中其化学离子的特征反应从而判断蜂蜜样品中是否掺有上述盐类。（3）掺有甜菜糖浆的蜂蜜可通过液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用技术来检测β-呋喃果糖苷酶，从而用来判断蜂蜜中是否掺加了甜菜糖浆。（4）掺有果胶的蜂蜜鉴定可采用咔唑比色法，如果结果检出半乳糖醛酸，则证[24-27]明掺有果胶。3蜂蜜炼制蜂蜜经过炼制后性味、功能会与之前有所不同。明代李时珍的《本草纲目》较早[28][29]的提出蜂蜜“生凉熟温”，《本草通玄》提到蜂蜜“生能清热，熟则补中”。[30]到了清代仍沿袭“生凉熟温”的说法。蜂蜜炮制始见于《本草经集注》，称为“炼”[31]或“煎”。此后历代医书都记载有蜂蜜的炼制方法。《雷公炮炙论》首次记载了蜂蜜的炼制程度：“凡炼蜜一斤，只得十二两半是数，若火少，火过，并用不得。”《本[30]草经集注》记载“凡蜜，皆先火上煎，掠去其沫，令色微黄，则丸经久不坏。”明[28]代《本草纲目》记载“凡炼沙蜜，每斤入水四两，银石器内，以桑柴火慢炼，掠去4 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究浮沫，至滴水成珠不散，乃用，渭之水火炼法；又以器盛置重汤中煮一日，候滴水不散，取用亦佳，且不伤火也。”现代应用中根据处方中药物性质及炼制的时间、温度、炼制颜色等将炼蜜分成嫩蜜、中蜜、老蜜。[32]冯立彬等采用测定气体流速对炼制速度的影响来确定最佳炼制工艺，并探讨了加热时间与含水量的关系、不同气体流速下加热时间与含水量的关系等。研究发现蒸发速度快慢与流速的气体在液面上方通过，使湿度降低，返回水分子减少，蒸发速度增加。作者认为必须控制适当的气体流速，例如加热温度在100℃时气体流速要控制-1[33]在1fn·s，从而使炼制工艺达到最佳状态。冯立彬等还定量化的分析了炼蜜工艺的[34]蒸发强度、蒸发强度与温度的影响因素，建立了相关的定量方程式。忻丁烯等对真空炼蜜工艺条件进行了考察，讨论了含水量、比重与炼蜜沸点的关系，认为：嫩蜜105～115℃，含水量约为23～32％；中蜜116～118℃，含水量约为21～23％；老蜜[35-36]119～122℃，含水量约为18～21％。曹佩玉等研究了用黏度来控制炼蜜的指标，用烘箱来控制温度，当加热温度为90℃±1，加热2.5小时后，符合嫩蜜的要求；5.5小时后观察，符合中蜜的要求；9小时后观察符合老蜜的要求。同时探讨了黏度与含水量的关系，认为有如下特点：(1)变化幅度上，从嫩蜜到老蜜，加热温度仅只相差17℃，而黏度则相差竟达4880泊。由于黏度相对好控制，同时也可以根据药物的性质选择更精确的黏度范围。(2)蜜中的含水量与黏度有一定的关系。(3)数据使用方面，由于黏度为直接使用数据，而加热温度受外界条件的影响较大是间接使用数据。最终作者认为蜂蜜的炼制标准应用黏度控制，这样可保持传统的加工方法，并且可以[37]保持蜜丸质量。王凤翔等探讨了减压与常压炼蜜对蜂蜜的影响，结果表明由于减压法是低温加热，加热温度低于60℃，对蜂蜜的成分影响不大。常压下炼蜜，因受热温度在100～120℃，对蜂蜜的成分有较大影响，使部分的果糖被破坏，葡萄糖含量增高，5-羟甲基糠醛的量也增加，味道和色泽均有所变化。4化学成分[38-39]蜂蜜含多种成分，现已知的成分有20多种。蜂蜜中3/4为糖类成分，其糖类成分主要有果糖、葡萄糖、含有少量的麦芽糖、曲二糖、松三糖及绵子糖等，而其5 陕西中医学院2013届硕士学位论文[40]中80％～90％为果糖和葡萄糖。蜂蜜中还含有人体所需多种的酶类，如氧化酶、还原酶、转化酶、淀粉酶、脂酶等。其含有的维生素主要有维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、叶酸和烟酸等。氨基酸含量在蜂蜜中只占到0.1％～0.78％，[41]其中主要是赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸等17种氨基酸。其他成分还包括蛋[41]白质、乙酰胆碱、有机酸、色素、无机盐类、蜂花粉、激素、微量元素及矿物质等。5检测方法对于5-羟甲基糠醛的检测方法目前主要有紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法、液相色谱-质谱联用技术等；对于糖类的检测方法有紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法、液相色谱-质谱联用技术等；对于氨基酸的检测方法有细菌抑制法、荧光光度法、氧化酶法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、质谱法等。由于高效液相色谱仪在制药企业的普及，以及高效液相色谱法具有分析速度快、分离效能高、自动化程度高等优点，目前在药物分析中应用的较为广泛。5.1重金属及微量元素的测定[42]陈兰珍等应用ICP-MS测定不同种类蜂蜜中的微量元素和重金属，结果表明蜂蜜中Ca、Fe、Zn、Mn、Cu、Se和Mo等微量元素含量丰富，并且不同品种间差别-1较大；各种蜂蜜中重金属的含量相对较少，As和Pb的含量在30ng﹒g以下，Hg、-1[43]Cd和Cr的含量更低，在10ng﹒g以下，且品种间差别不大。冯海燕等采用毛细++2+2+管电泳测定蜂蜜中K、Na、Mg、Ca四种金属阳离子进行分析测定，实验采用pH=5-1-1的10mmol﹒L咪唑-2mmol﹒L酒石酸作为背景电解质，分离电压为20kV，5min++2+2+内可以实现K、Na、Mg、Ca四种金属阳离子的基线分离。[44]任宝琴等运用等离子体光谱分析研究油菜蜜，荞麦蜜，棉花蜜，紫云英蜜，椴树蜜，乌柏蜜，葵花蜜，荆条蜜，刺槐蜜，枣花蜜，这十种蜂蜜及甘露蜜，实验表明这十种蜂蜜均含有人体所需的钙、铁、镁等多种矿物元素。通过对这十种蜂蜜及甘露蜜中矿物元素含量比值研究表明:荞麦蜜Cu∕Zn比值最大(0.17)，K∕Na比值枣花蜜最大（100.20），荞麦蜜次之（92.93）；Ca∕Mg比值枣花蜜最大(7.83)，棉花蜜(5.09)与荞麦蜜(5.03)两者差不多。6 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究5.25-羟甲基糠醛检测5-羟甲基糠醛通常由糖脱水而成，葡萄糖受到酸和热的影响也能产生这种物质。一般来说，新鲜的蜂蜜中几乎不含有该种物质，但是在加工及贮存的过程中会产生该[45]物质。据文献报道，人工转化糖在转化过程中可产生5-羟甲基糠醛(5-HMF)。5-羟甲基糠醛具有抗心肌缺血的作用，但如果应用过量则就是有害物质，能引起动物横纹肌及内脏损害，具有神经毒性，可在人体内与蛋白质结合而蓄积，从而使人产生中毒[46]。因此，蜂蜜的质量好坏及是否掺有人工转化糖，与5-羟甲基糠醛含量的高低有直接关系，并且5-羟甲基糠醛这项指标也是反应蜂蜜新鲜程度的指标之一。国家蜂蜜-1标准(GB/T18796-2005)规定，蜂蜜中羟甲基糠醛含量不超过40mg﹒kg。现有理论认为，掺入转化糖的蜂蜜较容易产生本物质。六碳糖在蜂蜜中，其羰基与氨基化合物(蛋白质、氨基酸)的氨基进行缩合、聚合，最终生成类黑色素物质的反应，这是美拉德反应，5-羟甲基呋喃甲醛是其中的一个产物。pH、温度、金属离子、组分(氨基化合物的量)、水分等对本反应的发生有明显影响。蜂蜜中5-羟甲基糠醛的测定主要有三种方法：化学显色法、紫外分光光度法及液相色谱法等。第一种方法的缺点是使用了[47]有毒性的对甲苯胺以及显色不稳定而受AOAC各协作实验室普遍反对；第二种方法的缺点是蜂蜜中含有一定的蛋白质，会干扰5-羟甲基呋喃甲醛分子的紫外吸收特性且实验结果重现性不好。高效液相色谱法是测定羟甲基糠醛的优良方法，采用乙腈-[48][49]水(1:20)，在284nm下检测可得到羟甲基糠醛良好的分离。钟银燕等对收集的33个商品蜂蜜样品、9个炼蜜样品及自制的在不同条件下炼制的蜂蜜进行含量测定，建立高效液相色谱法测定蜂蜜中5-羟甲基糠醛的含量，准确，简便，重复性好。平均[50]回收率为101.3％，RSD为2.6％。汪祺等采用高效液相色谱法测定六味地黄大蜜丸中糖转化产物5-羟甲基糠醛的含量。方法是采用AgilentTCC18色谱柱，甲醇-0.1％醋酸(3:97)为流动相，柱温在35℃，流速在1.0ml﹒min-1；检测波长为284nm。结果显示5-羟甲基糠醛进样量在0.00054～2.2μg范围内线性关系良好(r=1.000)，最低检出-4限为2.1581×10μg，加样回收率(n=6)为100.1％(RSD％=1.7％)。实验表明此法简便、[51]准确，可适用于六味地黄大蜜丸中5-羟甲基糠醛的含量测定。龙光明等对市场上受欢迎的6种蜂蜜进行含量测定，采用高效液相色谱法测定6种蜂蜜中5-羟甲基糠醛的含量，以甲醇-0.1％乙酸水溶液（7:93）为流动相，检测波长360nm，结果显示5-羟甲基糠醛在48.61～291.84ng范围内线性关系良好，r＝0.9999，平均回收率为7 陕西中医学院2013届硕士学位论文100.02％，RSD为1.69％（n＝6）；6种蜂蜜中5-羟甲基糠醛的平均含量在0.0328～-10.0398mg·g。实验表明此方法简便，重复性好，可用于检测蜂蜜中5-羟甲基糠醛的[52]含量。周坚采用高效液相色谱法测定小活络丸中5-羟甲基糠醛的含量。以甲醇－-11mL·L冰醋酸（3:97）为流动相；检测波长284nm；结果显示5-羟甲基糠醛在2.838～-1113.52μg·mL范围内呈良好的线性关系（r＝0.9995），最低检出限为0.3ng，平均回收率为95.8％，相对标准偏差为0.4％。5.3糖的测定蜂蜜基本上是由各种糖类、酶类及有机酸组成的。市场上蜂蜜的掺伪现象目前多是使用转化糖浆、麦芽糖浆、果葡糖浆等代替蜂蜜。国家蜂蜜标准(GB/T18796-2005)-1规定，蜂蜜中果糖和葡萄糖的总量不得低于60g·（100g）；蔗糖含量不得高于-1[54-56]5g·（100g）。据文献报道，单糖或双糖的测定多采用蒸发光散射检测器、示差[57]折光检测器等检测。汪祺等以冰醋酸-三氯甲烷-乙醇(21:23:15)为展开剂，显色剂采用苯胺-二苯胺-磷酸对果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖进行薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱示差折光检测器检测，PrevailCarbohydrateES色谱柱，乙腈-水(75:25)为流动相测定4种糖的含量，结果显示薄层色谱法及高效液相色谱法方法学验证均符合要[58]求。冯立彬等采用半透膜渗析法对糖类进行分离，用硫酸-酚法来测定总糖的含量，再测定蜂蜜水解前后的旋光度值，通过分析计算得出庶糖、葡萄糖和果糖的含量，实[59]验结果表明：蜂蜜中有2％～4％的多糖成分。李先端等采用RezexRCM_monosaccharide柱(300mm×7.80mm)，蒸发光散射检测器A1ltechELSD2000，-1-1以纯水为流动相，流速为0.6mL·min，漂移管温度120℃，氮气流速2.8L·min。结果显示葡萄糖、果糖、蔗糖线性良好，加样回收率为97.76％～100.96％，RSD为2.17％～2.41％。实验表明此方法准确，简便，重复性好。5.4抗生素残留蜂蜜中抗生素的残留其主要来源于蜜蜂疾病的治疗与预防。蜜蜂在生长过程中很容易生病，常见的蜜蜂疾病主要有白垩病、寄生螨、蜂蛹病、囊状幼虫病、孢子虫病[60]及欧洲幼虫腐烂病等，这些疾病会对蜂产品的产量和质量产生严重影响。因此蜂农们为了治疗蜜蜂的这些疾病，通常会将抗生素类药物添加在蜜蜂食用的糖浆里面，但8 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究是如果过量使用药物或者使用方式不当，则会造成抗生素在蜂蜜中的残留，人们如果长期服用这类蜂蜜则会对人体健康造成严重的损害。目前，对抗生素残留的检测方法[61-62][63][64][65-66]主要有：微生物法、免疫法、发光细菌法、毛细管电泳法、紫外分光[67-68]光度法等。高效液相色谱法是近几年逐渐发展起来的一种快速、方便、灵敏度高[69]-1的检测方法。杨元等采用三氯乙酸和EDTA二钠-0.04mol·L磷酸提取，C18固相萃取小柱净化，紫外检测器270nm波长同时检测动物源性食品中氯霉素、林可霉素[70]及四环素，实验结果较好，可成功应用于食品中这几类抗生素残留的检测。陈毓芳采用高氯酸提取，OasisHLB小柱净化来检测肌肉中3种四环类抗生素，方法检出限-1[71]为20～100μg·kg，回收率为80％～82％，精密度良好。吉彩霓，等采用pH4.0的EDTA-McIlvaine缓冲溶液提取水产品中四环素类抗生素，HLB小柱净化后进样，-1-1紫外检测器在350nm波长下检测，方法检出限为1.5～50μg·kg，定量限为50μg·kg，[72]回收率为75.2％～100.6％，相对标准偏差不大于10％。刘蓉蓉等采用液相色谱-质谱联用技术同时对蜂蜜样品中4种四环素族抗生素及其3种差向异构体进行测定，[73]结果证明此方法灵敏、可靠。赵冬梅，等采用高效液相色谱-紫外检测法分析蜂蜜中四环素类药物的残留。样品中的抗生素用McIlvaine-EDTA缓冲液提取，HLB小柱-1净化，紫外检测波长为355nm，流动相为0.01mol·L的草酸水溶液:乙腈:甲醇（83:11:6），回收率在78.85％～82.58％，变异系数小于15％，线性范围为50～-1-1-11500μg·L，四环素的最低检测限与定量限分别为15μg·L和25μg·kg。磺胺类药物是一类具有广谱抑菌作用的药物，被广泛应用于预防和治疗细菌感染性疾病。蜂农们经常用它作为对蜜蜂疾病的预防药物。这些药物进入蜜蜂体内后可残留在蜂蜜中，人们食用蜂蜜后可在体内蓄积，严重时会引起泌尿系统损害、抑制骨髓的白细胞生产、降低免疫力等。因此测定蜂蜜中磺胺类药物残留也是控制蜂蜜质量的重要指标之一。目前对于蜂蜜中磺胺类药物残留的检测多采用高效液相色谱法-荧光[74][75][76]检测及液相色谱-质谱法。汤瑶等采用固相萃取-HPLC法测定蜂蜜中残留的10种磺胺类药物，样品中的抗生素用三氯甲烷提取，OasisHLB小柱净化，紫外检测波-1长为270nm，0.010～1.0mg·kg添加水平，10种组分的回收率在86.5％～100.8％之-1间。室内相对标准偏差在3.5％～8.1％之间，线性范围为0.010～10μg·kg，检出限-1[77]为0.005mg·kg。张蘩等应用HPLC-PDA检测方法测定蜂蜜中8中磺胺类药物残-1留，在0.050～0.500g·ml添加水平，8种组分的回收率79.2％～94.2％。相对标准偏-1-1[78]差2.35％～5.42％，线性范围为0.01～1.00g·ml，检出限为0.01mg·kg。徐维海等9 陕西中医学院2013届硕士学位论文以乙腈-3％冰醋酸为流动相进行梯度淋洗，紫外检测器在268nm波长处检测水产品中的14种磺胺类药物残留，采用乙腈作为提取剂来超声辅助提取，正己烷液-液萃取净-1[79]化，样品回收率为66％～92％，方法检出限为0.01～0.02mg·kg。余辉菊等建立基质固相分散-高效液相色谱法对蜂蜜中10种磺胺类药物残留量进行测定。处理后的蜂蜜样品，装入固相萃取管中，盖上滤纸，以乙酸乙酯-二氯甲烷(3:1)为洗脱剂进行洗脱，洗脱液用氮气吹干，残渣用流动相溶解，经0.45µm滤膜过滤，AgilentTC-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱分离，高效液相色谱法测定，结果10种磺胺类-1药物在0.10～10.00mg·L的范围内线性良好，相关系数r>0.999，加标回收率在-160.0％～109.3％，相对标准偏差小于10％，方法检出限为0.016～0.025mg·L，样品-1中磺胺类检出限为0.050～0.079mg·kg。5.5有机酸测定蜂蜜中本身含有多种有机酸，而蜂蜜种类不同其有机酸的含量比例也不尽相同，[80-81]因此对蜂蜜中有机酸进行检测有助于鉴别真假蜂蜜。对有机酸的测定方法目前主[82-84][85]要有滴定法、比色法、荧光法、薄层色谱法等。周红霞等采用高效液相色谱串-1-1联质谱法测定蜂蜜中马来酸和水杨酸，在0.2mg·L～5.0mg·L范围内，马来酸和水2-1-1-1杨酸浓度与峰面积呈良好的线性关系(R>0.9900)；在50µg·kg、100µg·kg、200µg·kg三个添加水平下，马来酸和水杨酸的平均回收率范围为80％～130％，定量限为-120µg·kg。6蜂蜜的现代研究6.1抗炎抗菌作用蜂蜜具有很强的抑菌和杀菌作用，可抑制细菌繁殖并杀灭细菌，从而使伤口避免[86]感染化脓。朱威等认为蜂蜜抗菌作用主要有四个原因：第一，蜂蜜具有高渗的特性。适宜一般微生物生长的溶液其渗透压一般为3～6个大气压，目前已知的能生长在60％～80％的糖溶液即渗透压为40～90个大气压中的仅有少数霉菌和酵母菌，天然成熟的蜂蜜在常温下是一种含水量一般为17.4％左右，浓度为82.6％左右的糖溶液，[87]具高渗的特性。第二：蜂蜜具有酸性。一般细菌生长最适pH值为7左右，其中葡10 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究萄球菌成活pH范围为4.2～9.3，适宜生长pH范围为7.0～7.5；链球菌、布氏杆菌、埃希氏菌属、巴斯德氏菌属、芽胞杆菌的适宜生长pH范围分别为7.4～7.6、6.6～7.4、[88]7.2～7.4、7.2～7.4和7.2～7.6。天然的蜂蜜含有多种有机酸和部分的无机酸，一般其pH均小于4，蜂蜜的酸性环境明显不适合细菌的生长，对细菌的生长起抑制或消灭作用；第三：植物性来源因子。蜂蜜中的黄酮类、苯酚类和挥发性化合物、过氧化氢类和非过氧化氢类物质均是来源于植物的抗菌成分，过氧化氢通过氧化巯基形成二[89]硫键使酶失活，导致细菌不能正常代谢，从而起到抗菌作用；第四：动物性来源因子—溶菌酶。溶菌酶是一类低分子蛋白，在酸性环境中耐热，对光敏感，对胰蛋白酶不敏感，其主要是通过溶解革兰氏阳性菌细胞壁支持膜上氨基葡糖聚糖从而起到杀菌作用。6.2护肝作用蜂蜜中营养成分含量丰富，这些营养物质能为肝脏代谢活动提供必要的能量准备，并可以刺激肝组织再生，从而修复损伤，起到良好的保肝作用。蜂蜜能增加实验动物的肝糖元，使肝糖含量升高，对四氯化碳引起的肝损伤有明显的保护作用。蜂蜜还能促进大鼠肝脏切除后的再生，增强蛋氨酸对肝组织再生的作用，促使动物的血糖、[90]氨基己糖的含量升高并使血胆固醇含量恢复正常。6.3保护心脏作用蜂蜜是辅助治疗和预防心脏病的上好的功能性食物。具有扩张冠状动脉和营养心肌的作用，对血压有一定的调节作用。蜂蜜可补偿心肌不间断工作的能量消耗，还能扩张心血管，改善冠状动脉的血液循环促使冠状动脉血流正常。蜂蜜中含有微量的乙酰胆碱类物质，对治疗心脏疾病有良好的作用。蜂蜜可使血流通畅，胆固醇降低，并能提高血液中高密度脂蛋白的水平。6.4增强免疫力作用蜂蜜中所含的葡萄糖、果糖、维生素等物质可提高人体免疫力，增加人体抵抗力。此外，蜂蜜能调节神经系统功能、改善睡眠、提高脑力和体力活动能力。同时蜂蜜也具有中度抗肿瘤和显著的抗肿瘤转移作用。11 陕西中医学院2013届硕士学位论文6.5润肠通便作用传统医学认为蜂蜜有很好的润燥和通便作用，不仅对人体无害，还有滋补的作用，特别适合儿童和老年人及体虚者。蜂蜜能够促进实验动物小肠推进运动，从而缩短排便时间，有较好的调节肠胃功能的作用。长期坚持服用蜂蜜可以防止便秘，在便秘发生时大量用蜂蜜，可以缓解便秘的症状。7临床应用蜂蜜在临床中应用十分广泛，关于蜂蜜治疗各种疾病有大量的文献报道，一些偏方、验方更是数不胜数。蜂蜜味甘，性平，归肺、脾、大肠经，有润肺止咳，润燥通便，补中缓急，解毒等功效。现代医学研究证明蜂蜜可以治疗便秘、胃十二指肠溃疡[91][92]等胃肠道疾病；保护肝脏，促进肝细胞再生；消炎润肺、止咳去痰，治疗干燥[93][94]性鼻炎，支气管炎；增强、改善心肌功能；调节神经系统功能紊乱；治疗感染[95、96][97-99][100-102]性创伤及烧伤等疾病；治疗压疮；糖尿病足溃疡。另还有报道蜂蜜可[103][104][105-106]以防止肿瘤复发，治疗足癣，治疗结膜炎、角膜炎等眼部疾病，长期服用可以预防肾结石、尿路结石。此外蜂蜜还是天然的美容养颜产品，可作为皮肤保湿剂，并且对治疗粉刺有一定的疗效，常用蜂蜜护肤，可使粉刺萎缩并逐渐消退，并且蜂蜜还有护发的作用。二、蜜丸的概述蜜丸系指将中药细粉用炼制的蜂蜜为粘合剂制成的具有可塑性的固体药剂。蜜丸剂是一种传统的中药剂型，早在汉唐时期蜜丸就已得到广泛的应用。据统计在张仲景的《伤寒论》和孙思邈的《千金要方》中，蜜丸剂占到丸剂的95%之多。根据大小和其制备方法的不同，可将蜜丸分为大蜜丸、小蜜丸及水蜜丸等三种。一般应用于慢性疾病或调理气血的滋补药剂。蜜丸由于其性柔软，服用后在胃肠道缓慢崩解，逐渐释放药物，作用持久，对剧毒、刺激性的药物可延缓吸收，减少毒性和不良反应，并且由于其具有宜于消化吸收的特点，尤其是对脾胃虚弱者、老年人、儿童，要优于其它固体口服剂型，再次蜜丸多为将中药材打成细粉入药，保存了药材的全部药理特性，12 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究使得药效更好，尤其适合贵细原料药材和不易提取的中药材。因此蜜丸在现代中医临床应用上仍占有相当重要的位置。蜜丸的常规制法一般用塑制法制备，塑制法的工艺流程为物料的准备、制丸块、制丸条、分粒及搓圆、干燥、整丸等工序。其中制丸块是塑制法的关键工序，丸块的软硬程度及粘稠度直接影响丸粒成型和在储存中是否变形。优良的丸块应能随意塑型而不开裂，手搓捏而不粘手，不粘附器壁。水蜜丸可采用塑制法和泛制法制备。采用塑制法制备时需要注意药粉的性质与蜜水的比例、用量。一般中药细粉黏性中等，每100g细粉用炼蜜40g左右，其加水量按炼蜜：水=1：2.5～3.0，将炼蜜加水，搅匀，煮沸，滤过，即可。如含糖、淀粉、黏液质、胶质类较多的中药细粉，需用低浓度的蜜水为黏合剂，每100g药粉用炼蜜10g～15g；如含纤维和矿物质较多的中药细粉，则每100g药粉用炼蜜50g左右。采用泛制法制备水蜜丸时，炼蜜应用沸水稀释后使用；起模时必须用水，以免粘结。加大成型时为使水蜜丸的丸粒光滑圆整，蜜水加入的方式应按：低浓度、高浓度、低浓度的顺序依次加入。三、蜂蜜对蜜丸质量的影响1蜂蜜的质量严重影响蜜丸的质量蜂蜜作为蜜丸生产过程中最重要的辅料，一般在蜜丸中占到了50％，对于含有纤维类成分较多或质轻而黏性差的药粉，该比例可高达70％以上，因此要想保证蜜丸的质量，就必须严格控制蜂蜜的质量。近年来，随着科技的迅猛发展，蜂蜜造假技术日趋变得专业及高科技。造假者往往在蜂蜜中加入一些化学物质，例如色素、香精、甜味剂、增稠剂、防腐剂等等，从而以假乱真、以劣充好。2003年国家工商总局对全国蜂蜜市场的调查有50%的蜂蜜是假的。2004年各地工商局等相关机构对蜂蜜市场的抽检结果显示：广东假蜂蜜达70%、湖南假蜂蜜达87%、上海假蜂蜜达30%、四川假蜂蜜达80%、安徽假蜂蜜达77%、青岛假蜂蜜达78%、河北假蜂蜜达80%、内蒙古假蜂蜜达40%等等。2008年国家工商总局监测显示蜂蜜产品整体质量最差，在抽取的100组蜂蜜中，只有54组质量合格，合格率只有54%，不合格的项目主要有蜂蜜产品果糖和葡萄糖含量不达标，被掺入了非天然物质，还有的产品被人为加入超标的蔗糖。2011年第二季度广东省工商局对江门、阳江、茂名、湛江4个地区的市场上流通的120批次蜂蜜商品进行监13 陕西中医学院2013届硕士学位论文督抽查，检验合格的有75批次，批次合格率为62.5%。剔除纯标识不合格外，内在质量合格率为85.8%，有17批次的蜂蜜存在重要指标不合格。央视《每周质量报告》曝光蜂蜜造假现象，其中用陈旧生虫的碎大米制造的果糖冒充蜂蜜据说已成行业的公开秘密。另外据相关资料报道由于蜜蜂易生病，蜂农为了预防和治疗蜜蜂的疾病，常应用氯霉素等抗生素。蜂蜜质量的现状不容乐观：据有关报道香港消委会测试市面上34款蜜糖产品，发现13款含有抗生素残余成分，其中6款更被验出含有在食物中禁止使用的氯霉素。武汉市工商局曾公布他们抽检的来源于武汉各大型超市的53批蜂蜜中，就有14批不合格，不合格率占到了25％。2002年1月25日欧盟食品管理委员会正式下达指令禁止中国的动物源产品进口，其中包括蜂蜜。英国食品标准局在发布公告建议商店停止销售所有含有中国蜂蜜的混合蜜。由此可以看出蜂蜜的质量不仅没有保证，相对的还存在一定的安全风险。2炼蜜过程缺乏统一的标准，不科学的炼制工艺存在潜在的安全风险蜂蜜通常情况下呈粘稠性的液体，根据蜜源的不同，其色泽也深浅不一，放置时[10]间过长或环境温度过低则有结晶析出，气芳香，味极甜。在中药制剂中经常用蜂蜜作为制剂的赋形剂或矫味剂，以用来缓和药性增加药物的疗效。蜂蜜中含有25%的水分，劣质蜜含水分更多，另有死蜂、蜡质、淀粉类物质；蜡质会浮于丸药表面，形成极薄的蜡质层，久存会产生裂纹;含淀粉类较多时，则成品干硬。对蜂蜜的选择与炼制是保证蜜丸质量的关键。一般以乳白色和淡黄色，味甜而香、无杂质，稠如凝脂油性大，含水分少为好。蜂蜜在入丸前需要经过熬制得到炼蜜。炼蜜的目的是为了去除杂质、杀死微生物、减少水分含量、杀酶、破坏酵素、增加黏合性。蜂蜜经过炼制以后，其粘合力增强，制成的药坨表面不易硬化且具有很好的可塑性，制成的成品丸粒圆整光洁滋润，崩解缓慢，作用持久。根据蜂蜜炼制的时间、温度、密度及炼制颜色等炼蜜有三种规格，即嫩蜜、中蜜和老蜜。实际操作中可以根据处方中药物的性质来选择不同规格的炼蜜。蜂蜜炼制的好坏直接关系着蜜丸的质量。如果炼制方法不当，蜜丸在贮存期易出现皱皮、发霉、干硬、破裂、返砂等质量问题，而且蜂蜜在炼制过程中，葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸条件下脱水产生5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛稳定性较差，容14 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究易分解成乙酰丙酸和甲酸等物质，能促使结肠小囊异常生长，还可产生一定程度的基因毒性，对人体横纹肌和内脏有损害，这将严重地影响了中成药中蜜丸的安全和质量。由于多种原因，现行版的炮制规范还没有具体规定蜂蜜的炼制工艺，蜂蜜的炼制方法全凭操作者的经验，而且炼蜜的程度等也暂无国家或行业标准，部分省级炮制规范也仅规定了经验性的指标。蜂蜜不科学的炼制工艺、炼蜜过程缺乏统一的标准也将对蜜丸的质量产生严重的影响。四、小结中药蜜丸由蜂蜜质量引入的潜在风险由于没有国家标准，因此也未得到有效的监控，如果不能及时给予补充，潜在的风险将危害到广大服用者的健康，这将对患者的使用带来风险。蜂蜜质量的不安全、炼蜜过程易产生有害物质等因素严重地影响了中成药中蜜丸安全和质量，迫使我们必须对蜜丸中的蜂蜜进行监测，建立蜜丸中蜂蜜的质量控制方法，使检测单位或部门有检测标准可依据，促进生产单位或部门对辅料蜂蜜严格进行质量控制，保证蜜丸的安全和疗效，保障广大患者的安全和健康。同时也促进蜜丸制备工艺及生产设备的提高，使蜜丸这一传统的中药剂型的生产与时俱进，更加现代化、科学化，对于促进中药制剂的规范生产和繁荣，有着重要的意义。15 陕西中医学院2013届硕士学位论文第二部分实验部分1实验材料1.1仪器设备岛津LC-2010CHT型高效液相色谱仪，Empower工作站，岛津2550型紫外-可见分光光度计，WelchUltimateC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；Waters2695高效液相色谱仪-ALLtech2000ES蒸发光散射检测器，AgilentCarbohydrate色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；岛津LC-20AD型高效液相色谱仪，PDA检测器；SartoriusAGME235S型电子分析天平，SartoriusBS224S型电子分析天平；H66025型超声波清洗仪。1.2试药及试剂对照品：5-羟甲基糠醛对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号：111626-201007，含测用）；D-无水葡萄糖对照品（110833-200904，含测用）、麦芽糖对照品（100287-201102，含测用）由中国食品药品检定研究院提供；甲氧苄啶对照品（100031-200304，含测用）、磺胺甲恶唑对照品（100025-200904，含测用）、磺胺嘧啶对照品（100026-200402，含测用）、氯霉素对照品（130555-200602，含测用）、土霉素对照品（0487-200001，含测用）、盐酸四环素对照品（130488-20020，含测用2）、蔗糖对照品（1507-200001，含测用）、D-果糖对照品（1504-200001，含测用）均由中国药品生物制品检定所提供。样品：收集蜜丸样品61批，蜂蜜样品29批。详情见表1。表1样品信息品种数量分类品名数量（批）来源（个）牛黄上清丸1392012年度国家抽样评价样品蜜丸样品收集的蜜丸样品1822市售/132012年度国家抽样评价样品蜂蜜样品/16市售16 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水；三乙胺、醋酸铵、乙二胺四醋酸二钠、氢氧化钠、冰醋酸、盐酸、醋酸均为分析纯。2方法与结果2.15-羟甲基糠醛的测定2.1.1色谱条件与系统适应性试验WelchUltimateC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃；以甲醇-水溶-1[107]液(10:90)为流动相；流速为1.0ml﹒min，检测波长284nm，进样量10μL。在此色谱条件下，分别取对照品溶液及供试品溶液进样。色谱分离情况见图2。AB17 陕西中医学院2013届硕士学位论文C图2A.5-HMF对照品色谱图；B.样品色谱图；C.阴性样品色谱图2.1.2溶液的制备供试品溶液的制备：蜂蜜、炼蜜分别取0.1g，精密称定，精密加水10mL称定重量；蜜丸剪碎，取约0.5g，精密称定，精密加水25mL，称定重量，超声处理15分终，放冷，称定重量，用水补足减失重量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml含18.84μg的溶液，作为对照品储备液，4℃冷藏，备用。2.1.3方法学考察线性考察：精密移取对照品储备液适量，用水稀释至每1ml含5-羟甲基糠醛0.3768μg，精密吸取1，2，5，10，15，20μL进样，测定。以峰面积积分值为纵坐标，以进样量（ng）为横坐标，绘制标准曲线，结果表明5-羟甲基糠醛在进样量为0.3768～27.536ng范围内呈良好的线性关系，直线方程为：Y=8237.0X-34.513R=1。结果见表2，图3。表2标准曲线测定结果进样量（ng）峰面积0.376831440.7536614518 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究1.884154993.768309445.652464097.53662148图3检出限：采用信噪比法测定，将对照品溶液进行梯度稀释，每个稀释级分别进样与空白溶剂基线噪音进行比较，约3倍信噪比时，5-HMF的最低检出浓度为-1-10.0030144μg﹒mL，折算后5-HMF在蜂蜜中的检出量为0.30144μg﹒g，在蜜丸中-1的检出量为0.15072μg﹒g。精密度考察：精密吸取5-HMF对照品溶液10µL，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果见表3。表3精密度试验结果序号峰面积平均峰面积RSD(％)115518215766315520155620.6441552251552461552119 陕西中医学院2013届硕士学位论文重复性考察：取同一批号的牛黄上清丸样品（批号：2015124北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产）6份，按2.1.2制备样品溶液，精密吸取10µL注入高效液相色谱仪进行测定。结果表明方法重复性良好。结果见表4。表4重复性试验结果序号取样量(g)含量(μg/g)平均含量(μg/g)RSD(％)10.501729.474920.501028.964530.502329.033029.01710.9240.499828.729950.501229.114960.502528.7852稳定性考察：取牛黄上清丸（批号：2015124北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产）1份，按2.1.2项制备样品溶液，分别在0、5、10、15、20、24h依法测定，计算5-HMF含量的RSD值，结果表明24小时内供试品溶液基本稳定，RSD为1.1％，符合要求。结果见表5。表55-HMF稳定性试验结果测定时间峰面积平均峰面积RSD(％)0541955532591054856540851.08155458520538032453814回收率考察：精密称取已知含量的牛黄上清丸样品（批号：2015124北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产）9份，加入一定量5-HMF对照品溶液，制成高中低三种浓度，每个浓度平行制备3份，每份进样两次，测定总量，计算回收率及RSD。结果见表6。20 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究表65-HMF回收率测定结果测得量平均回收率RSD取样量(g)原有量(μg)加入量(μg)回收率(%)(μg)(％)(%)0.20015.819.8416.62116.750.20055.829.8416.67117.330.20085.839.8416.28110.470.25067.277.8716.45118.030.25097.287.8716.36116.59116.702.040.25107.287.8716.38116.760.30058.726.5616.87118.270.30108.736.5616.74116.570.30138.746.5617.01119.492.1.4样品测定准确称取61批蜜丸样品各0.5g，及29批蜂蜜样品各0.1g按上述―2.1.2‖项实验方法制备供试液，进行样品测定。测定结果见附表。2.1.5小结5－羟甲基糠醛在0.3768～7.536ng范围内呈良好的线性关系，直线方程为：2Y=8237X-34.513R＝1，方法准确度测定平均回收率为116.70%，RSD为2.04%（n＝9），证明本文建立的对蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的5-羟甲基糠醛测定方法可行，可用于蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的5-羟甲基糠醛的含量测定。2.2土霉素、盐酸四环素及氯霉素的测定2.2.1色谱条件与系统适应性试验WelchUltimateC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃；以醋酸铵溶液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100:10:1），醋酸调PH至7.5]-乙腈(84:16)为流动相；流速为1.0ml﹒min-1，检测波长280nm，进样量21 陕西中医学院2013届硕士学位论文10μL。在此色谱条件下，分别取含有土霉素、盐酸四环素、氯霉素对照品的混合溶液，加入一定量对照品的样品溶液及不含土霉素、盐酸四环素、氯霉素的阴性样品溶液进样。色谱分离情况见图4。ABC图4A.对照品色谱图；B.样品色谱图；C阴性样品色谱图（1.土霉素峰；2.盐酸四环素峰；3.氯霉素峰）22 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究2.2.2溶液的制备供试品溶液的制备：同2.1.2项下供试品溶液的制备。对照品溶液的制备：取土霉素、盐酸四环素、氯霉素对照品适量，加少量0.1mol-1﹒L盐酸溶液溶解并用水稀释制成每1ml分别含土霉素144.8375μg、盐酸四环素158.6650μg、氯霉素161.5250μg的混合溶液，作为对照品储备液，4℃冷藏，备用。2.2.3方法学考察线性考察：精密移取对照品储备液适量，用水稀释至每1ml含土霉素5.7935μg、盐酸四环素6.3466μg、氯霉素6.4610μg的混合溶液，精密吸取1，2，5，10，15，20μL进样，测定。以峰面积积分值为纵坐标，以进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，结果表明土霉素在进样量为0.005790～0.115870μg范围内呈良好的线性关系，直线方62程为：Y=1.3×10X+792.39R=0.9997；盐酸四环素在进样量为0.006350～0.126930μg62范围内呈良好的线性关系，直线方程为：Y=1.2×10X+873.80R=0.9994；氯霉素在进样量为0.006460～0.129220μg范围内呈良好的线性关系，直线方程为：Y=9.9×5210X+873.11R=0.9997。结果见表7，图5。表7抗生素类标准曲线测定结果土霉素盐酸四环素氯霉素进样量（μg）峰面积进样量（μg）峰面积进样量（μg）峰面积0.00579074210.00635077750.00646064130.01159154810.01269150890.01292129840.02897366530.03173384100.03230340050.05793752280.06347778830.04610472830.086901107940.095201147040.09691975020.11591454420.12691491530.129212807223 陕西中医学院2013届硕士学位论文ABC图5A、土霉素标准曲线；B、盐酸四环素标准曲线；C、氯霉素标准曲线检出限：采用信噪比法测定，将对照品溶液进行梯度稀释，每个稀释级分别进样与空白溶剂基线噪音进行比较，约3倍信噪比时，土霉素的最低检出浓度为0.09173μg-1-1﹒mL、盐酸四环素的最低检出浓度为0.2011μg﹒mL及氯霉素的最低检出浓度为24 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究-1-10.3296μg﹒mL，折算后在蜂蜜中土霉素的最低检出量为9.1735μg﹒g、盐酸四环素-1-1的最低检出量为20.1083μg﹒g，氯霉素的最低检出量为32.9610μg﹒g；在蜜丸中-1-1土霉素的最低检出量为4.5867μg﹒g、盐酸四环素的最低检出量为10.0541μg﹒g，-1氯霉素的最低检出量为16.4805μg﹒g。精密度考察：精密吸取对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果见表8。表8抗生素类精密度测定结果成分峰面积平均峰面积RSD％土霉素787617898478710785817750178797785560.68盐酸四环素798927901879946806877971379965798700.67氯霉素668816603367358660696554265440662211.14稳定性考察：取空白蜜丸样品蠲痹抗生丸（批号：1202001）样品1份，加入适量的土霉素、盐酸四环素及氯霉素对照品，按2.1.2项制备供试品溶液，分别在0、6、12、18、24、30h测定，结果表明30小时内供试品溶液基本稳定。结果见表9。表9抗生素类稳定性测定结果峰面积平均峰成分RSD％0612182430面积土霉素316373196431509311373087830915313401.38盐酸四环素250842556925473257522486525245253311.30氯霉素454514505944488453654537445132451450.79回收率试验：取空白蜜丸样品蠲痹抗生丸样品（批号：1202001）9份，进行空白加样回收试验。取样品适量，剪碎，取约0.5g，精密称定，精密加入一定量土霉素、盐酸四环素、氯霉素对照品按2.1.2项制成高中低三种水平，每个水平平行制备3份，每份进样两次，测定总量，计算回收率及RSD。结果见表10、11、12。表10土霉素回收率测定结果加入土霉素量(μg)测得土霉素的量(μg)回收率(％)平均回收(％)RSD(％)110.66108.4598.0099.593.5825 陕西中医学院2013届硕士学位论文110.66114.65103.61110.66107.5697.20186.73185.8799.54186.73180.8596.85186.73182.9998.00268.50262.3997.73268.50288.42107.42268.50263.1398.00表11盐酸四环素回收率测定结果加入盐酸四环素量测得盐酸四环素的量回收(％)平均回(％)RSD(％)(μg)(μg)60.1856.9594.6360.1861.33101.9260.1858.9898.01101.53104.86103.28101.5399.5098.00100.194.74101.53102.97101.42146.61143.6798.00146.61161.85110.40146.61140.8596.07表12氯霉素回收率测定结果平均回收加入氯霉素量(μg)测得氯霉素的量(μg)回收率(％)RSD(％)(％)193.64190.4898.37193.64190.7498.5098.221.47193.64186.0296.0626 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究289.38283.5998.00289.38278.78196.34289.38291.91100.88395.23387.6198.07395.23392.4599.30395.23389.3098.502.2.4样品测定准确称取61批蜜丸样品各0.5g，及29批蜂蜜样品各0.1g按上述“2.1.2”项实验方法制备供试液，进行样品测定。测定结果见附表。2.2.5小结与讨论本部分测定参照中国药典二部含量测定项下，土霉素与盐酸四环素的检测波长为280nm，氯霉素的检测波长为277nm，由于277nm与280nm仅相差3nm，且在相同的前处理条件下，用相同的色谱条件进行测定，280nm时各组分含量相对较高，且都能达到基线分离，所以选择280nm为本实验检测波长同时测定土霉素、盐酸四环素及氯霉素的含量。-1-1流动相选择方面，分别考察了醋酸铵溶液[0.25mol﹒L醋酸铵溶液-0.05mol﹒L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100:10:1），醋酸调pH至7.5]-乙腈配比为（88:12），（85:15），（84:16），（83:17）。实验发现，当流动相配比为（88:12）时三组成份出峰时间相对较晚，且氯霉素峰形不好；把流动相调制（83:17）和（85:15）时，土霉素的出峰时间相对过早（5分钟内出峰），不能很好的与溶剂峰分离；当调整流动相比例为（84:16）时，三组分能够在50分钟内出峰完全，且都能达到基线分离，因-1-1此最终选择醋酸铵溶液[0.25mol﹒L醋酸铵溶液-0.05mol﹒L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100:10:1），醋酸调pH至7.5]-乙腈(84:16)时为流动相。本部分方法学考察结果土霉素在0.005790～0.1159μg范围内呈良好的线性关系，62回归方程为：Y=1.3×10X+792.39R＝0.9997，方法准确度测定平均回收率为99.59％，RSD为3.58％（n＝9）；盐酸四环素在0.006350～0.1269μg范围内呈良好62的线性关系，回归方程为：Y=1.2×10X+873.80R=0.9994，方法准确度测定平均回27 陕西中医学院2013届硕士学位论文收率为100.19％，RSD=4.74％（n＝9）；氯霉素在0.006460～0.1292μg范围内呈良52=好的线性关系，回归方程为：Y=9.9×10X+873.11R0.9997；方法准确度测定平均回收率为98.22％，RSD=1.47％（n＝9），说明此方法作为蜂蜜及蜜丸中土霉素残留、盐酸四环素残留及氯霉素残留检测其方法可行。2.3磺胺类抗生素的测定2.3.1色谱条件与系统适应性试验WelchUltimateC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃；以水-乙腈-三乙胺(799:200:1)（氢氧化钠试液或冰醋酸调pH到5.92）为流动相；流速为1.0ml﹒min-1，检测波长240nm，进样量10μL。在此色谱条件下，分别取含磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲惡唑对照品的混合溶液，加入一定量磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲惡唑混合对照品的供试品溶液及不含磺胺嘧啶、甲氧苄啶和磺胺甲恶唑的阴性样品溶液进样。色谱分离情况见图6。AB28 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究C图6A．对照品色谱图；B.加入对照品的样品色谱图；C阴性样品色谱图（1.磺胺嘧啶峰色谱图；2.甲氧苄啶峰色谱图；3.磺胺甲噁唑峰色谱图）2.3.2溶液的制备供试品溶液的制备：同2.1.2项下供试品溶液的制备。对照品溶液的制备：取磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲惡唑对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含磺胺嘧啶92.46µg、甲氧苄啶90.96µg、磺胺甲惡唑93.29µg的混合溶液，作为对照品储备液，4℃冷藏，备用。2.3.3方法学考察线性考察：精密移取对照品储备液适量，分别用水稀释制备含磺胺嘧啶浓度为-1-1-1-1-10.9246μg·mL、1.8492μg·mL、4.6230μg·mL、9.246μg·mL、46.23μg·mL、-1-1-1-192.49μg·mL，甲氧苄啶浓度为0.9096μg·mL、1.8192μg·mL、4.548μg·mL、-1-1-1-19.096μg·mL、45.48μg·mL、90.96μg·mL，磺胺甲噁唑浓度为0.9329μg·mL、-1-1-1-1-11.8658μg·mL、4.665μg·mL、9.329μg·mL、46.65μg·mL、93.29μg·mL的混合对照品溶液，摇匀，吸取上述对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，进行测定。以峰面积积分值为纵坐标，以进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，结果表明磺胺嘧啶在进样量为0.009246～0.9246μg范围内呈良好的线性关系，直线方程为：Y=2.1×6210X-1562.6R=1；甲氧苄啶在进样量为0.009096～0.9096μg范围内呈良好的线性关62系，直线方程为：Y=2.8×10X-2196.7R=1；磺胺甲噁唑在进样量为0.009329～29 陕西中医学院2013届硕士学位论文620.9329μg范围内呈良好的线性关系，直线方程为：Y=1.3×10X-4383.2R=1；结果见表13，图7。表13磺胺类标准曲线测定结果磺胺嘧啶甲氧苄啶磺胺甲噁唑进样量（μg）峰面积进样量（μg）峰面积进样量（μg）峰面积0.009246183110.009096239820.00932977840.01849361700.01819484470.01866166880.04623959200.045481251630.04665570240.092461901910.090962579210.093291145680.46239732820.454812658090.46655808760.924919377310.909625547450.93291173665AB30 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究C图7A、磺胺嘧啶标准曲线；B、甲氧苄啶标准曲线；C、磺胺甲噁唑标准曲线检出限：采用信噪比法测定，将磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲惡唑对照品溶液进行梯度稀释，每个稀释级分别进样与空白溶剂基线噪音进行比较，约3倍信噪比时，-1磺胺嘧啶的最低检出浓度为0.01849μg﹒mL、甲氧苄啶的最低检出浓度为0.03638μg-1-1﹒mL、磺胺甲惡唑的的最低检出浓度为0.09329μg﹒mL。折算后在蜂蜜中磺胺嘧-1-1啶的最低检出量为1.8490μg﹒g、甲氧苄啶的最低检出量为3.6380μg﹒g、磺胺甲-1恶唑的最低检出量为9.3290μg﹒g，在蜜丸中磺胺嘧啶的最低检出量为0.9246μg﹒-1-1g、甲氧苄啶的最低检出量为1.8190μg﹒g、磺胺甲恶唑的最低检出量为4.6640μg-1﹒g。精密度考察：精密吸取磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲惡唑的混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果见表14。表14磺胺类精密度测定结果成分峰面积平均峰面积RSD％磺胺嘧啶2649202665826476526689266555265232658260.36863甲氧苄啶3766893783837604937956379016377093778000.37553磺胺甲噁1759991770717580117733176916175931765110.38唑089稳定性考察：取柏子养心丸（批号：10110008）样品1份，加入适量的磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑对照品，按2.1.2项制备供试品溶液，分别在0、5、10、15、20、24h测定，结果表明24小时内供试品溶液基本稳定。结果见表15。31 陕西中医学院2013届硕士学位论文表15磺胺类稳定性测定结果峰面积平均峰成分RSD％面积0510152024磺胺嘧啶1799211794801787011790201771521762591784220.80甲氧苄啶2257012406012286922406922343622345242340932.60磺胺甲噁唑1151311184161170531172991109271137651154322.40回收率试验：精密称取空白蜜丸样品柏子养心丸样品（批号：10110008）9份，进行空白加样回收试验。取样品适量，剪碎，取约0.5g，精密称定，加入一定量的磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑对照品的混合溶液，制成高中低三种水平，每个水平平行制备3份，每份进样两次，测定总量，计算回收率及RSD。结果见表16、17、18。表16磺胺嘧啶回收率测定结果加入磺胺嘧啶量测得磺胺嘧啶的量回收率平均回收率(％)RSD(％)(ug)(μg)(％)231.15223.3096.60231.15224.6597.19231.15225.1897.42184.92196.08106.04184.92195.15105.53103.284.58184.92194.03104.93138.69149.43107.74138.69148.65107.18138.69148.19106.85表17甲氧苄啶回收率测定结果加入甲氧苄啶量测得甲氧苄啶的量平均回收率回收率(％)RSD(％)(ug)(μg)(％)227.40195.4685.9593.005.9132 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究227.40194.3085.44227.40196.2486.30181.92175.1596.28181.92173.4095.32181.92171.194.05136.44134.4598.54136.44132.8697.38136.44133.3897.75表18磺胺甲噁唑回收率测定结果加入磺胺甲噁唑量测得磺胺甲噁唑的量平均回收率RSD回收率(％)(ug)(μg)(％)(％)233.23219.9194.29223.23218.8098.02223.23211.5094.75186.58195.93105.01186.58193.20103.55101.434.93186.58189.40101.51139.94141.29100.96139.94148.40106.05139.94152.18108.752.3.4样品测定准确称取61批蜜丸样品各0.5g，及29批蜂蜜样品各0.1g按上述―2.1.2‖项实验方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。测定结果见附表。2.3.5小结与讨论本部分测定参照中国药典二部含量测定项下，磺胺嘧啶与甲氧苄啶的检测波长为220nm，磺胺甲噁唑与甲氧苄啶的检测波长为240nm，在220nm和240nm检测波长33 陕西中医学院2013届硕士学位论文下比较各色谱图，实验发现在相同的前处理条件下，用相同的色谱条件进行测定，240nm时各组分含量相对较高，且都能达到基线分离，所以选择240nm为本实验检测波长，同时测定磺胺嘧啶，甲氧苄啶和磺胺甲噁唑的含量。本部分方法学考察结果磺胺嘧啶在0.009246～0.9246μg范围内呈良好的线性关62系，回归方程为：Y=2.1×10X-1562.6R=1，方法准确度平均回收率为103.28％，RSD为4.58％（n＝9）；甲氧苄啶在0.009096～0.9096μg范围内呈良好的线性关系，62回归方程为Y=2.8×10X-2196.7R=1，方法准确度测定平均回收率为93.00％，RSD为5.91％（n＝9）；磺胺甲噁唑在0.009329～0.9329μg范围内呈良好的线性关系，回62归方程为：Y=1.3×10X-4383.2R=1，方法准确度测定平均回收率为101.43％，RSD为4.93％（n＝9），说明本实验所建立的对磺胺类药物残留的检测方法精密度好，方法稳定，准确度高，可作为蜂蜜及蜜丸中磺胺类药物残留检测的通用方法。2.4糖的测定2.4.1色谱条件Waters2695高效液相色谱仪-ALLtech2000ES蒸发光散射检测器，AgilentCarbohydrate色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35℃；以乙腈-水溶液(75:25)为流动相；流速为1.2ml﹒min-1，漂移管温度90℃，空气流速2.8ml﹒min-1，进样量[108]10μL。在此色谱条件下，分别取对照品溶液及供试品溶液进样。2.4.2溶液的制备供试品溶液的制备：蜂蜜、炼蜜分别取0.01g，精密称定，精密加水25mL称定重量；蜜丸剪碎，取约0.1g，精密称定，精密加水50mL，称定重量，超声处理15分钟，放冷，称定，用水补足减失重量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品、麦芽糖对照品、蔗糖对照品、D-果糖对照品适量，加水制成每1ml含D-无水葡萄糖0.399mg、麦芽糖0.40592mg、蔗糖0.441mg、D-果糖0.415mg的混合溶液，作为对照品储备液，4℃冷藏，备用。34 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究2.4.3方法学考察本部分，由于之前我们已对其进行了相关的方法学考察，并做了大量的实验验证，方法已经非常成熟，故此次并未再对其方法学进行考察，只对样品进行了测定。2.4.4样品测定准确称取61批蜜丸样品各0.1g，及29批蜂蜜样品各0.05g按上述色谱条件进行测定。测定结果见附表。35 陕西中医学院2013届硕士学位论文结语-11蜂蜜国标GB/T18796-2005规定5-羟甲基糠醛限度为40μg﹒g。蜂蜜在蜜丸中约-1占55％，折算后蜜丸中5-羟甲基糠醛限度应该为22μg﹒g。蜂蜜经过炼制后其5-羟甲基糠醛的量会明显增加，但不同的炼蜜工艺，5-羟甲基糠醛的量增长的幅度不同，采用先进的减压浓缩工艺除去水分时，炼蜜中5-羟甲基糠醛的量增加3～5倍，在原-1蜜质量合格的情况下，5-羟甲基糠醛最大达到110μg﹒g。采用传统的直火熬制的办法炼蜜时，葡萄糖在酸和热的影响下也会有5-羟甲基糠醛产生，从而使5-羟甲基糠醛的量几十倍、几百倍、甚至上千倍的增加。另外蜂蜜中如果掺入了人工转化糖，也会使5-羟甲基糠醛含量大幅增加。本实验共检测了44个不同的生产厂家61批蜜丸样品，其中大蜜丸47批，小蜜丸7批，水蜜丸7批。由附表可以看出没有一家的样品小于由蜂蜜国标-1GB/T18796-2005规定折算后的22μg﹒g，其中含量最低的是由山西双人药业有限责-1任公司生产的大蜜丸，其含量为26.09μg﹒g，说明其在购进原料蜜时对其质量进行了严格控制，并在炼制时可能采用了先进的炼制工艺及设备，从而很好的控制了5--1羟甲基糠醛的含量。大于110μg﹒g的有49批样品，占到了蜜丸总量的80.3%，其中含量最高的是由本溪仙草堂药业有限公司生产的大蜜丸，其含量达到了3600μg﹒-1g，说明在炼蜜时，熬制时间过长，熬制温度过热，甚至有反复加热的嫌疑。14批生蜂蜜样品中有3批未检测出5-羟甲基糠醛，说明此3批蜂蜜质量相对较-1好，没有掺杂人工转化糖；4批超过了5-羟甲基糠醛为40μg﹒g的限度（其中由辽-1宁金丹药业有限公司提供的生蜜样品其5-羟甲基糠醛的含量高达3001.45μg﹒g），说明这4批蜂蜜可能是在加工或储藏过程中方法不当，或着是其中添加有人工转化糖，从而导致其5-羟甲基糠醛含量超出标准。-115批炼蜜样品中有10批超过110μg﹒g（其中由亚宝药业提供的炼蜜样品含量-1最高，达到2826.62μg﹒g），说明这15批炼蜜一方面可能是由于炼制方法不当，在加热过程中由于加热温度过高，或者过度加热从而导致5-羟甲基糠醛量明显超标，另一方面也可能是购进的原料蜜本身5-羟甲基的含量就不合格，或者就是购进的原料蜜中添加的有人工转化糖，加热后，促进人工转化糖转化生成5-羟甲基糠醛。36 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究在这29批蜂蜜样品中，其中山西双人药业有限责任公司提供的蜜样质量最好，-1其生蜜中未检出有5-羟甲基糠醛，炼蜜样品中5-羟甲基糠醛含量只有11.13μg﹒g-1远远低于5-羟甲基糠醛40μg﹒g的限量要求。2蜂蜜国标GB/T18796-2005中规定果糖、葡萄糖总和应≥60％，蜂蜜在大蜜丸中约占55％，折算后大蜜丸中果糖、葡萄糖总和应≥33％；蔗糖在蜂蜜中规定为≤5％，折算后大蜜丸中蔗糖应为≤3％；均不得检出麦芽糖。本实验所测定的61批蜜丸样品中有49批样品果糖、葡萄糖总和≥33％，占到总量的80.3％，31批蔗糖样品≤3％，占到总量的50.8％；27批样品中检出麦芽糖，占到总量的44.3％。29批蜂蜜样品中有11批样品果糖、葡萄糖总和≥60％，占到总量的37.9％，5批检出蔗糖的样品其蔗糖均小于5％，有两批检出了麦芽糖，疑为掺加或使用了麦芽糖浆(饴糖)。由样品测定结果可以看出大部分蜜丸生产厂家的原料蜂蜜其质量优良，说明这些厂家在购进蜂蜜时对蜂蜜的质量进行了严格的控制，而且在蜜丸生产过程中也并未人为的添加一些糖浆来代替蜂蜜，从而减少生产成本。从收集到的蜂蜜样品测定结果可以看出这些蜂蜜质量良莠不齐，有的甚至可能在蜂蜜中掺假，从而以次充好，以假充真。3土霉素残留、盐酸四环素残留、氯霉素残留测定部分及磺胺类药物残留测定部分，样品测定时，由于部分样品在与土霉素、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑相同的保留时间处有色谱峰出现，不能确定是否为土霉素峰、磺胺嘧啶峰、盐酸四环素峰、磺胺甲噁唑峰，故我们采用二极管阵列检测器对其进行了验证，经过光谱比较证明其并不是土霉素峰、磺胺嘧啶峰、盐酸四环素峰、磺胺甲噁唑峰，因此本实验所测定的61批蜜丸样品及29批蜂蜜样品均未检出土霉素、盐酸四环素、氯霉素残留及磺胺类药物残留。说明本次所收集到的样品蜂蜜及61批蜜丸生产厂家所使用的蜂蜜在加工生产过程中可能未使用到此类抗生素，或者是蜂农在对蜜蜂使用时对其使用量进行了有效的控制，从而使抗生素在蜂蜜中未有残留或转移情况存在。4我国每年都在大量使用蜜丸制剂，由于蜜丸中的基质复杂，对蜜丸中的5-羟甲基糠醛、抗生素残留及磺胺类残留都没做过检测和限定，对于5-羟甲基糠醛含量超标及具有抗生素和磺胺类残留的产品容易对消费者的健康产生危害。本研究建立的蜜丸中5-羟甲基糠醛、抗生素残留及磺胺类残留的检测方法，为我国建立相关的国家标准和行业标准检测方法提供了依据。37 陕西中医学院2013届硕士学位论文5本研究建立了检测蜜丸中蜂蜜的5-羟甲基糠醛含量及土霉素、盐酸四环素、氯霉素、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑残留的HPLC检测方法，所用仪器普及范围较广，能够满足常规分析的要求，可用于蜜丸中蜂蜜的5-羟甲基糠醛含量及抗生素和磺胺类残留的日常监督筛选和残留监控检测。6本方法适用于实验室常规分析和样品初筛。但对于抗生素和磺胺类残留检测结果为阳性的样品需采用高效液相-二极管阵列检测器进行确证，相关研究还需要再进一步完善；5-羟甲基糠醛测定部分，由于收集到的16个品种的蜜丸样品，其中有14个品种的20批样品由于其处方中含有熟地黄、半夏、党参、红花等药材，而这些药材本身就含有5-羟甲基糠醛这一成分，因此不能排除所测的5-羟甲基糠醛不是由这些药材所带进的，而由于实验条件及时间限制，我们未曾对这16个品种的20批蜜丸样品进行空白模拟处方比对测定，所以对于这20批样品的5-羟甲基糠醛含量限度有待进一步研究。38 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究参考文献[1]任仁安.中药鉴定学[M].上海:上海科学技术出版社，1984:573-574.[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].北京:2010年版，化学工业出版社，一部:377.[3]徐水文.蜂蜜的药用价值及真伪鉴别[J].中外医学研究，2011，9(15):150-151.[4]刘绍贵，肖平田，王净净，等.简明中西药物手册[J].长沙:湖南科学技术出版社，1997:123-123.[5]詹行楷，申济奎.消毒蜂蜜治疗大泡性角膜病变的临床观察[J].中国中医眼科杂志，1997，7(2):85.[6]冯松齐，郭敏君.蜂蜜治疗臭鼻炎[J].河南中医，1997，17(2):121.[7]朱金明.蜂蜜与冠心病的防治[J].蜜蜂杂志(月刊)，2008，4:28-30.[8]毛淑杰，李先端.中药炮制辅料-蜂蜜古今炼制工艺及标准[J].科技创新导报，2008，(6):134-135.[9]曲日洪.关于蜂蜜质量及其炼制与用量问题的探讨[J].黑龙江中医药，1965，(3):40-42.[10]GB/T18796-2005．蜂蜜，中华人民共和国国家标准.[11]姚庆伟，李锋.掺假蜂蜜的快速鉴定[J].食品工业科技，1998，5:64-65.[12]刘纯伟.蜂蜜及其识别[J].时珍国医国药，2000，11(6):520.[13]潘丽梅.市售食用蜂蜜中掺假物质检测问题的探讨[J].山西职工医学院学报，2003，13(3):3-4.[14]AOACOfficialMethod998．12，C-4PlantsugarsinHoneyInternalStandardStableCarbonIsotopeRatioMethodFistAction1998，AOACstandard.[15]AOACOfficialMethod991．41，C-4PlantSugarsinHoneyInternalStandardStableCarbonIsotopeRatioMethodFistAction1991FinalAction1996，AOACStandard.[16]GB/T18932．1-2002．MethodfortheDeterminationofC-4PlantSugarsinHoney-StableCarbonIsotopeRatioMethod．NationalStandardsofthePeople"sRepublicofChina.[17]GB/T18932．22-2003，MethodfortheDeterminationofFructose，Glucose，39 陕西中医学院2013届硕士学位论文Sucrose，MaltoseContentsinHoney—LiquidChromatograpHyRefractiveIndexDetectionMethod，NationalStandardsofthePeople"sRepublicofChina.GB/T18932．22-2003，蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法，中华人民共和国国家标准.[18]GB/T18932.2-2002，MethodfortheDeterminationofHighFructoseStarchSyrupinHoney-Thin-LayerChromatograpHicMethod，NationalStandardsofthePeople"sRepublicofChina.GB/T18932.2-2002，蜂蜜中高果淀粉糖浆测定方法薄层色谱法，中华人民共和国国家标准.[19]IrudayarajJ，XuF，TewarJ，JournalofFoodScience，2003，68(6):2040－2045[20]ParadkarMM，IrudayarajJ.DiscriminationandclassificationofbeetandcaneinvertsinhoneybyFTRamanspectroscopy[J］.FoodChemistry，2001，76:231-239.[21]LammertynJ，VeraverbekeEA，IrudayarajJ.zNose(TM)technologyfortheclassificationofhoneybasedonrapidaromaprofiling［J］.SensorsandactuatorsB:Chemical，2004，98（1）:54-62.[22]RolandL，SiegfriedJP.Anewneuralnetworkapproachclassifiesolfactorysignalswithhighaccuracy［J］.FoodQualityandPreference，2003，14:435-440.[23]CordellaC，AntinelliJK，AurieresC，etal.UseofDifferentialScanningCalorimetry（DSC）asanewtechniquefordetectionofadulterationinhoneys.1.Studyofadulterationeffectonhoneythermalbehavior［J］.JAgricFoodChem，2002，50:203-208.[24]徐水文.蜂蜜的药用价值及真伪鉴别[J].中外医学研究，2011，9(15):150-151.[25]姚庆伟，李锋.掺假蜂蜜的快速鉴定[J].食品工业科学，1998，5:64-65.[26]王艳，吴斌，张晓燕，等.示差折光-液相色谱法测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶残留量[J].分析化学，2012，40(10):1602-1606.[27]任雪梅，胡梅，周传静，等.咔唑比色法测定掺假蜂蜜中果胶的含量[J].山东农业科学，2011，3:100-102.[28]明·李时珍.本草纲目[M].北京:人民卫生出版社，1981:2218.[29]王孝涛.历代中药炮制法汇典(古代)[M].南昌:江西科学技术出版社，1998:440-441.40 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陕西中医学院2013届硕士学位论文附表抗生素磺胺类糖5-HMF盐酸四含量土霉素环素氯霉素磺胺嘧啶甲氧苄啶磺胺甲恶唑果糖葡萄糖蔗糖麦芽糖果+葡果/葡样品名生产厂家批号剂型(ug/g)(ug/g)(ug/g)(ug/g)(ug/g)(ug/g)(ug/g)(mg/g)(mg/g)(mg/g)(mg/g)(mg/g)蠲痹抗生丸1陕西冯武臣大药堂制药有限公司1202001大蜜丸62.97//////246.89262.7317.1040.38509.620.94通宣理肺丸3河北安国药业集团有限公司116602大蜜丸98.89//////79.29560.03/81.43639.320.14香连化滞丸西安碑林药业股份有限公司201103001大蜜丸104.33//////286.36340.8550.82/627.210.84通宣理肺丸2山西振东制药有限公司20110101大蜜丸124.70//////356.00451.08//807.080.79收蠲痹抗生丸2陕西冯武臣大药堂制药有限公司1203004大蜜丸131.32//////246.79244.0120.5024.88490.801.01集通宣理肺丸1宝商集团陕西辰济药业有限公司100408大蜜丸145.76//////251.35513.1415.76/764.490.49到橘红丸1西安正大制药有限公司110602小蜜丸153.22//////242.18180.0127.74/422.191.35的橘红丸2西安正大制药有限公司120202-1小蜜丸161.33//////209.02176.7623.46/385.781.18蜜培坤丸西安正大制药有限公司110713-1小蜜丸275.73//////219.14133.6785.06/352.811.64丸骨刺丸河北万岁药业有限公司101001水蜜丸290.33//////29.4925.2731.9343.4154.761.1746 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究八珍益母丸黄石三九药业有限公司10101212水蜜丸394.19//////119.0691.5243.38/210.581.30附子理中丸河北安国药业集团有限公司106601大蜜丸436.87//////194.58457.67//652.240.43金贵肾气丸赤峰天奇制药有限责任公司20110121大蜜丸452.27//////217.82338.7027.0822.13556.520.64九味羌活丸山西华康药业股份有限公司20110301大蜜丸593.18//////242.14426.4450.56/668.570.57橘红丸大山西振东制药有限公司20101205大蜜丸731.55//////297.04328.08//625.120.91槐角丸河北安国药业集团有限公司96601大蜜丸779.20//////247.95188.3621.33/436.301.32四川省宜宾五粮液集团有限责任//////知柏地黄丸公司1103011水蜜丸995.8476.1559.30//135.451.28艾附暖宫丸药都制药集团股份有限公司100902小蜜丸1651.93//////122.92222.0743.9724.17345.000.55龙胆泻肝丸吉林鹿王制药股份有限公司110401大蜜丸703.34//////232.89400.0528.98/632.940.58六味地黄丸襄樊隆中药业有限责任公司100801水蜜丸278.27//////49.6332.0517.51/81.681.55八珍益母丸//////大宝商集团陕西辰济药业有限公司110831大蜜丸450.14227.24325.9920.32/553.230.70太极集团重庆桐君阁药厂有限公//////柏子养心丸司10110008水蜜丸220.63104.7982.93//187.721.26牛2012G0023本溪仙草堂药业有限公司20110701大蜜丸3620.23//////214.56133.5518.2911.28348.111.61黄2012G0050吉林市鹿王制药股份有限公司120404大蜜丸213.09//////507.94194.8221.73/702.762.61上2012G0068药都制药集团股份有限公司110601小蜜丸524.98//////317.95118.8519.848.58436.802.6847 陕西中医学院2013届硕士学位论文清2012G0091青海宝鉴堂国药有限公司WJ630869大蜜丸1186.25//////466.37170.828.2315.61637.192.73丸2012G0101山西双人药业有限责任公司120303大蜜丸26.09//////514.63150.063.788.60664.693.43系2012G0110山西杨文水制药有限公司120112大蜜丸122.01//////408.70144.21/70.92552.912.83列2012G0113山西华康药业股份有限公司20120201大蜜丸926.28//////537.56156.08//693.643.442012G0117山东大陆药业有限公司1204012大蜜丸768.00//////439.38181.507.806.18620.882.422012G0118药都制药集团股份有限公司120202大蜜丸406.01//////530.03216.089.435.28746.112.45天津中新药业集团股份有限公司2012G01295010039大蜜丸//////552.43108.8720.7314.09661.305.07达仁堂制药厂62.462012G0138江西广信药业有限公司110401小蜜丸1085.61//////316.45194.21//510.661.632012G0172兰州佛慈制药股份有限公司11G8大蜜丸189.03//////501.75143.4043.57/645.153.50内蒙古亿利科技实业股份有限公2012G0207100220大蜜丸//////492.03173.32/11.76665.352.84司药业分公司2284.832012G0229包头中药有限责任公司1201125大蜜丸369.19//////459.37144.685.22/604.053.18北京御生堂集团石家庄制药有限2012G024020110201大蜜丸//////156.36133.75/14.61290.111.17公司1407.42北京同仁堂股份有限公司同仁堂2012G02431035190水蜜丸//////218.1569.4532.31/287.603.14制药厂568.342012G0264亚宝药业大同制药有限公司20120311大蜜丸1678.39//////472.66172.4017.6816.28645.062.7448 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究2012G0266太原大宁堂药业有限公司大蜜丸76.55//////494.00148.28144.4718.85642.283.332012G0269武汉中联药业集团股份有限公司120210大蜜丸50.95//////483.2137.6423.396.28520.8512.842012G0284吉林省抚松制药股份有限公司111001大蜜丸956.35//////305.84130.4472.61/436.282.342012G0294赤峰天奇制药有限责任公司20101013大蜜丸2546.70//////420.79184.4414.17/605.232.282012G0316山西广誉远国药有限公司20120502大蜜丸127.42//////511.34195.4816.03/706.822.622012G0332河北冀衡（集团）药业有限公司110301大蜜丸77.66//////391.38147.49/7.41538.872.652012G0334山西正元盛邦制药有限公司110813大蜜丸212.49//////209.83142.04/37.07351.871.48北京同仁堂股份有限公司同仁堂2012G03472015124大蜜丸//////567.85103.4757.73/671.325.49制药厂28.702012G0362吉林省银河制药有限公司120201大蜜丸92.81//////135.41113.04/86.56248.451.202012G0386河南禹州市药王制药有限公司120301大蜜丸1332.41//////462.07180.5758.30/642.642.562012G0387白山健宁药业有限公司20120101大蜜丸671.59//////211.7899.897.4241.13311.672.122012G0424哈药集团世一堂制药厂1110115大蜜丸54.62//////497.07183.10//680.172.712012G0426三九黄石制药厂1005291Z大蜜丸830.24//////137.55109.76/28.40247.311.252012G0429沈阳红药制药股份有限公司120201大蜜丸42.30//////537.65131.21//668.864.102012G0500山西天生制药有限责任公司120201大蜜丸1398.62//////529.56191.3516.49/720.912.772012G0501山西天生制药有限责任公司120403大蜜丸521.08//////517.78154.9613.12/672.743.342012G0508山西双人药业有限责任公司120609大蜜丸982.53//////429.09128.8519.699.11557.943.3349 陕西中医学院2013届硕士学位论文2012G0555长春人民药业集团有限公司20120201水蜜丸238.34//////106.9454.6612.6849.04161.601.962012G0579河北安国药业集团有限公司126601大蜜丸186.94//////215.00109.035.3934.18324.031.972012G0581保定中药制药有限公司120502大蜜丸460.14//////417.95169.05105.78/587.002.472012G0620黑龙江参鸽药业有限公司81202大蜜丸1168.49//////423.21150.6812.80/573.892.812012G0644辽宁金丹药业有限公司20120602大蜜丸526.84//////410.52161.028.23/571.542.55生蜜1号样辽宁金丹药业//3001.45//////449.62564.4623.62/1014.080.80生蜜2号样西安正大制药有限公司//173.60//////162.82154.81//317.621.05生蜜3号样西安正大制药有限公司//183.89//////170.41149.15//319.561.14生蜜4号样///20.04//////53.98279.01//332.990.19生蜜5号样西安艾尔医药技术有限公司20100531/24.84//////207.40156.33//363.731.33生蜜6号样山西天生//1.64//////859.29414.90//1274.192.07生蜜7号样眉县红河谷20100617////////198.89178.75//377.631.11生蜜8号样赤峰天奇/////////923.43251.28//1174.713.67生蜜9号样中医学院//19.04//////99.5159188.34//287.870.53蜂生蜜10号样///1.85//////210.62147.24//357.861.43蜜生蜜11号样亚宝药业//65.78//////1171.59545.81//1717.402.15样生蜜12号样山西双人120706////////884.88471.65//1356.531.88品生蜜13号样长春人民药业//18.73//////308.76157.8313.24/466.591.9650 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究F012-1207/生蜜14号样药都制药/////946.18281.65//1227.833.3621-020/7.12炼蜜1号样西安正大制药有限公司//1236.79//////196.95155.01//351.971.27炼蜜2号样西安正大制药有限公司//1245.59//////209.54143.28//352.821.46炼蜜3号样西安正大制药有限公司//750.63//////194.96150.35//345.311.30炼蜜4号样西安正大制药有限公司//771.25//////169.40171.88//341.280.99炼蜜5号样白凤丸//284.83//////207.63158.48//366.121.31炼蜜6号样山西天生20100628/159.81//////1219.62369.2911.16/1588.913.30炼蜜7号样/20100702/207.14//////180.57213.49//394.060.85炼蜜8号样山西华尔//93.56//////187.37141.96//329.331.32炼蜜10号样///81.38//////77.30158.94/103.91236.250.49炼蜜11号样山西正元盛邦药业//49.09//////1105.51507.94//1613.452.18炼蜜12号样亚宝药业//2826.62//////760.84541.5813.12/1302.421.40炼蜜13号样山西双人药业有限责任公司120706/11.13//////1300.61581.7312.77/1882.342.24炼蜜14号样长春人民药业//35.54//////8.14442.6/90.95450.740.02炼蜜15号样///324.79//////199.10161.89//360.991.23F012-1207/炼蜜16号样/////857.90514.63//1372.531.67药都21-019/169.2851 陕西中医学院2013届硕士学位论文注：“/”表示未检出52 蜂蜜及蜜丸中蜂蜜的质量考察研究致谢本论文的工作是在我导师郭耀武主任药师的悉心指导下完成的。郭老师渊博的知识、丰富的实践经验、科学的工作方法、严谨的工作态度给了我极大的帮助和影响，是我以后工作中一笔宝贵的财富。郭老师不仅指导我完成了科研工作，在生活和学习上给予我很大的关怀，让我能够快速地融入到科研环境中，得到了来自各方面的帮助。在此，向我的导师郭耀武主任药师致以衷心的感谢和崇高的敬意。感谢母校陕西中医学院对我的培养。感谢陕西中医学院药学院生药教研室胡本祥主任、王西芳、程虎印、颜永刚、雷国莲等老师，感谢同学刘丽萍、赵丽、寇文龙、孙鑫、张宁华，武苗和杨瑞等在学习和生活中提供的各种帮助。本论文的工作是在陕西省食品药品检验所中药室中完成的。药检所具有先进的仪器和专业的技术人员，为我解决了很多后顾之忧。在此，特别感谢实验过程中给予我帮助的杨海燕、罗定强、王国海、李青等老师和朋友，他们都是我的良师益友。感谢我的家人，是他们一贯以来的理解和支持让我有了前进的动力。再次感谢在我读研期间曾经关心、支持和鼓励过我的所有的同事、同学、亲人和朋友，祝他们健康、平安、快乐。53