重庆地区中华蜜蜂（Apis cerana cerana）形态和线粒体DNA多样性分析.pdf 64页

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独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研巧工作及取得的研巧成果。除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的硏究成果，也不包含为获得重庆师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。学位论文作者签名；签字日期：＾＾５年＾月日学位论文版权使用授权书本学位论义作者完今：了解重庆师范大学有关保留、使用学位论，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘文的规定，。｜＾允许论文被查阅和借阅本人授权重庆师范大学可：＞１将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。学位论文作者签名；：签字日期：：Ｗ年＾月日＾＞＾＾ 重庆师范大学硕士学位论文中文摘要重庆地区中华蜜蜂（Apisceranacerana）形态和线粒体DNA多样性分析摘要选取重庆地区13个区县的122群中华蜜蜂。系统地对重庆地区中华蜜蜂种质资源的遗传多样性进行了调查，此次研究主要运用形态特征标记和线粒体DNA标记两种方法对重庆地区中华蜜蜂的遗传多样性进行了分析，为进一步全面了解重庆地区中华蜜蜂种质资源的遗传多样性奠定基础，也为重庆地区中蜂的保护和发展提供重要依据。主要结果如下：1.形态特征多样性分析对重庆地区中华蜜蜂6项形态指标进行分析，发现部分地理种群中蜂形态特征值之间存在极显著性差异（P<0.01），显著性差异（P<0.05）或无显著性差异（P>0.05）；6项形态指标相关分析发现，除肘脉指数与其余5项指标均无相关性外，其余5项指标相互之间存在极显著相关；6项形态指标直接聚类和主成分聚类分析一致，结果显示重庆地区与湖北荆门、四川乐山地区中蜂聚为两支，重庆地区的中华蜜蜂主要分为三大群，第一支是武陵山、大娄山地区类型，主要有武隆、南川、江津等地区，第二支是大巴山脉地区类型，主要以城口地区为代表，第三支是以合川地区为代表的重庆西北部类群；判别函数聚类结果显示湖北荆门、四川乐山地区中蜂与重庆地区中蜂仍然聚为两支，但重庆地区内部具有差异，城口地区与阿坝中蜂聚在外群，武隆、南川、江津地区聚为武陵山—大娄山地区类型，以上结果显示采用主成分聚类结果更能反映重庆地区中华蜜蜂形态分化与地理环境的关联性。2.线粒体DNA遗传多样性分析leu对139群中蜂线粒体tRNA～COⅡ段的序列进行测定并分析其中的非编码区，发现所有样本共有17个单倍型，其中8个共有单倍型和9个种群特有单倍型，整体单倍型多样度为0.711±0.00065，核苷酸多样度为0.01792，可见重庆地区中华蜜蜂具有丰富的遗传多样性；与已报道的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型比对发现，单倍型H_4、H_7、H_13为重庆地区新发现的单倍型，为首次报道；网络中介分析和聚类分析发现，17个单倍型主要聚为3大类，单倍型H_1、H_3和H_5为三个聚类簇，其中H_1为主要聚类簇，新单倍型H_4、H_13起源于单倍型H_1，单倍型H_7与其余单倍型表现出分离。I 重庆师范大学硕士学位论文中文摘要3.重庆地区桶养中华蜜蜂的多样性分析通过对桶养中蜂的形态和线粒体DNA非编码区进行分析，形态聚类发现老桶养殖中蜂与地理关系比较明显，大部分中蜂保持其地理特性，城口中蜂为大巴山类型，而武隆、江津、南川、彭水均属于武陵山—大娄山型，这一结果支持了形态标记主成分聚类的结果，说明所采样本与记录结果一致，多为收捕野生中蜂，并且没有发生大的流动性，能够全面、真实的反映重庆地区中蜂遗传多样性。从选取的具有典型样本代表的桶养中蜂形态结果与单倍型对比分析发现同种单倍型中蜂其形态可能会发生分化，处于相同地理位置的中蜂其形态较近但单倍型也会有所差异。关键词：中华蜜蜂、形态特征、线粒体DNA、单倍型、多样性II 重庆师范大学硕士学位论文英文摘要MorphologicalandgeneticdiversityofApisceranaceranainChongqingAbstract122coloniesoftheApisceranawerecollectedfrom13districtsofChongqing.ThegeneticdiversityofApisceranaceranawassurveiedforChongqinggermplasmresources.Inthisstudy,thegeneticdiversityofApisceranaceranainChongqingwasanalyzedbyusingmorphologicalmarkersandmitochondrialDNAmarkers.ThisstudydidnotonlylaythebasisforoverallinvestigationofthegeneticdiversityofApisceranaceranainChongqing,butalsoprovidedthesupporttoprotecttheChongqingbees.Themainresultsareasfollows:1.DiversityofmorphologicalfeaturesAnalysingthe6morphologicalindexesofApisceranaceranainChongqing,theresultindicatedthattherewereextremelysignificantdifferences(P<0.01),significantdifferences(P<0.05)ornosignificantdifference(P>0.05)amongthegeographicalpopulations;correlationanalysisof6morphologicalindexesshowedthattherewereextremelysignificantcorrelationsbetweentheremainingfiveindicatorsexceptcubitalveinindexwasnotcorrelatedwiththeremainingfiveindicators,6morphologicalindexesdirectclusterandprincipalcomponentclusteranalysiswereconsistent,andtheresultsshowedthatA.ceranaceranainChongqingandJingmen,Leshanclusteredintotwoclades;thesepopulationsinChongqingwereformedthreeapparentclades,whichincludedthefirstWulong-Dalouclade,mainlyincludingWulong,Nanchuan,Jiangjinandsoon,thesecondDabaclade,Chengkoumainlyasarepresentative,thethirdChongqingnorthwestcladerepresentedbyHechuan.DiscriminantfunctionclusteringresultsshowedthatChongqingandJingmen,Hubeiprovince,Leshan,Sichuanprovincestillclusteredintotwoclades,buttheinternalclusteringinChongqinghasdifferences,thecladeofChengkouandAbawereclusteringtogetherbutoutofgroup,Wulong,Nanchuan,JiangjinclusteredinWuling-Daloumountaintype.ThissuggestedthattheprincipalcomponentclusterwasabletobetterreflecttherelevanceofmorphologicaldifferentiationandgeographicalenvironmentofA.ceranaceranainChongqing.2.AnalysisofthegeneticdiversityofmitochondrialDNAleuSequencingmitochondrialtRNA～COⅡsegmentandanalyzingtheIII 重庆师范大学硕士学位论文英文摘要non-codingregionfor139coloniesA.ceranacerana,totalof17haplotypeswerefoundfromallsamples,ofwhicheightcommonhaplotypesandnineuniquehaplotypespopulations.Thetotalhaplotypediversitywas0.711±0.00065andnucleotidediversitywas0.01792,thusA.ceranaceranainChongqinghasaabundantgeneticdiversity.ComparedtothereportedA.ceranacerana,haplotypeH_4,H_7,H_13ofChongqingwerenewlydiscoveredandthefirsttimereported.Basedonnetworkmediationanalysisandclusteranalysis,17haplotypeswereclusteredintothreeclades,haplotypeH_1,H_3,H_5werethreemainlyclusters,haplotypeH_1wasmajorclade,newhaplotypeH_4andH_13originatedfromhaplotypeH_1,haplotypeH_7withtherestofhaplotypesshowedseparation.3.DiversityoftheoldbarrelkeepingofA.ceranaceranainChongqingThroughanalysisofthemorphologyandmitochondrialDNAofnon-codingregionofoldbarrelkeepingA.ceranacerana,theresultofmorphologicalclusteringindicatedasignificantrelationshipwithgeographical,mostA.ceranaceranakeepingtheirgeographicalcharacteristics,ChengkoupopulationsbelongstoDabatype,theWulong,Jiangjin,Nanchuan,PengshuiwereWuling-DaLoutype,thissupportstheresultsofprincipalcomponentclusterofmorphologicalindexes,andindicatingthatcollectedsamplesareconsistentwithrecords,mostofthemtobecollectedfromthewildbees,havenobiggermobility,andcanbeacomprehensiveandtrulyreflectedthegeneticdiversityofA.ceranaceranainChongqing.ComparedthehaplotypewithmorphologicalanalysisforoldbarrelkeepingA.ceranacerana,theresultsuggestedthatthesamehaplotypesmighthavedifferentmorphologicalindexes,andinthesamelocation,whosemorphologicalindexeswereclose,buthaddifferenthaplotypes.Keywords：Apisceranacerana，morphologicalindexes，mtDNA，haplotype，diversityIV 重庆师范大学硕士学位论文目录目录摘要................................................................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................................III1文献综述.................................................................................................................................11.1蜜蜂形态特征与遗传多样性研究进展..............................................................................11.2蜜蜂线粒体DNA标记与遗传多样性研究进展.................................................................11.2.1蜜蜂线粒体DNA的结构.............................................................................................21.2.2蜜蜂线粒体DNA遗传特征及多态性..........................................................................31.2.3蜜蜂线粒体DNA遗传多样性研究进展......................................................................41.3蜜蜂遗传多样性研究方法概况...........................................................................................61.3.1蜜蜂形态学研究的方法...............................................................................................61.3.2研究蜜蜂多样性的分子生物学方法...........................................................................61.4重庆地区中华蜜蜂研究现状...............................................................................................71.4.1重庆地区中华蜜蜂分布现状.......................................................................................71.4.2重庆地区中华蜜蜂遗传多样性研究进展...................................................................82引言............................................................................................................................................92.1研究背景..............................................................................................................................92.2目的及意义...........................................................................................................................92.3研究内容............................................................................................................................102.4研究技术路线....................................................................................................................103重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析..........................................................113.1材料与方法........................................................................................................................113.1.1采样.............................................................................................................................113.1.2实验仪器和工具.........................................................................................................123.1.36项形态指标测量......................................................................................................123.1.4数据统计与分析.........................................................................................................143.2结果与分析........................................................................................................................163.2.1重庆地区中华蜜蜂工蜂的形态测定值.....................................................................163.2.2重庆地区中华蜜蜂6项形态指标间的相关分析.....................................................163.2.3重庆地区中华蜜蜂6项形态指标因子分析.............................................................173.2.4重庆地区中华蜜蜂6项形态指标主成分分析.........................................................183.2.5重庆地区中华蜜蜂形态指标判别分析.....................................................................19V 重庆师范大学硕士学位论文目录3.2.6重庆地区中华蜜蜂形态指标聚类分析.....................................................................213.3讨论....................................................................................................................................244重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析................................................264.1材料与方法.........................................................................................................................264.1.1试验材料.....................................................................................................................264.1.2试验方法.....................................................................................................................274.1.3数据分析.....................................................................................................................284.2结果与分析.........................................................................................................................284.2.1DNA提取结果和PCR扩增产物检测........................................................................284.2.2重庆地区各地理种群mtDNA非编码区序列的遗传多态性...................................294.2.3重庆地区中华蜜蜂mtDNA非编码区序列的遗传结构...........................................324.2.4重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型网络中介图................................374.2.5重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区系统进化分析........................................374.2.6重庆地区与全国各地理种群中华蜜蜂mtDNA非编码区单倍型的分子系统树...394.3讨论....................................................................................................................................415全文结论...............................................................................................................................44参考文献...................................................................................................................................46附录A：作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况..............................52附录B：所有样本非编码区聚类结果....................................................................53致谢...................................................................................................................................54独创性声明...................................................................................................................55VI 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述1文献综述东方蜜蜂在分类学上属于昆虫纲（Insecta）、膜翅目（Hymenoptera）、蜜蜂科（Apidae）、蜜蜂属（Apis）。东方蜜蜂与西方蜜蜂一样是人类能够系统饲养的蜂种之一，东方蜜蜂自古以来在我国的分布广泛，不同的地理环境均有东方蜜蜂[1]的身影，东方蜜蜂在我国俗称“中蜂”，驯养历史悠久。自20世纪初西方蜜蜂引入以来，中华蜜蜂的种群逐渐缩小，中蜂资源不断减少。近一百年来，由于西蜂产蜜量大等优势，中蜂遭受部分饲养者淘汰，又由于生态环境遭到破坏以及在与西方蜜蜂的种间竞争中处于劣势等原因，我国中蜂资源锐减。尽管如此，中蜂比西蜂更能适应花蜜资源稀疏、生存环境复杂的山区，中蜂在这些地区通过家养和野生的方式生存下来，并且不断适应新的生态环境，形成独特的地理优势品种。我国地域广阔，八大植被区除温带的荒漠区、青藏高[2]原的高寒荒漠区外，在其它植被区均有中华蜜蜂的分布。1.1蜜蜂形态特征与遗传多样性研究进展20世纪中期，蜜蜂遗传资源调查、品种及品系的鉴定以及遗传结构的分析其主要手段是形态学方法，现在形态学方法对于许多蜜蜂研究者来说仍然是基础[16-23]的、重要的分析遗传多样性的工具。我国许多学者利用形态学标记对全国各个地区的中华蜜蜂进行了多样性分析，比如，罗凌娟对四川省中华蜜蜂进行了形态多样性分析，认为四川省的中蜂明显分为两大类群，四川盆地型和川西高原型[24]，谭垦等通过对湖北神农架地区的中华蜜蜂形态特征进行分析，并与环境因子结合，发现神农架地区的中蜂遗传变异丰富，部分形态特征变异表现出地理相[25]关性，王桂芝等对山西地区的中华蜜蜂形态多样性进行分析，并与环境因子[26]进行相关分析，认为中蜂形态特征与海拔、经纬度、年均气温有直接关系，朱翔杰等对大门岛中蜂形态遗传多样性分析，发现与大陆中蜂有明显遗传分化[27]。全国多个地区均有利用形态标记对中华蜜蜂遗传多样进行分析，从不同的因子印证了地理环境对中华蜜蜂多态性的影响，但仍有部分地区中蜂资源调查不完善，有待分析。1.2蜜蜂线粒体DNA标记与遗传多样性研究进展线粒体是真核生物中的细胞器，它有自己的基因组，因此对ATP的产生在细胞中的很大一部分是必不可少的，虽然缺少线粒体DNA的细胞可以在一定条件下生存，但是多细胞生物的生存必然少不了完整的线粒体基因组。因为线粒体1 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述产生大量的活性氧，而且往往积聚毒性外源物的线粒体DNA损坏比核DNA多，[28]因此，研究存在这样维持线粒体DNA的完整性机制十分有意义。线粒体作为半自主的细胞器，是负责产生大部分正常条件下哺乳动物细胞所需的能量的场所，之所以线粒体是半自主的，因为细胞核仍然控制着线粒体内的DNA分子的复制、[29]转录和翻译，Capps等发现遗传是受核基因和线粒体DNA的双重控制的。线粒体DNA是研究蜜蜂遗传多样性、遗传分化、遗传结构的有力工具，1988年，Smith等研究表明，长度和限制性内切酶切割位点均能体现蜜蜂线粒体DNA的多态性，这些变化水平是从那些典型的多细胞物种中发现的，这些多态性在西[30]方蜜蜂和非洲化蜜蜂系统发育研究中具有潜在作用。Cornuet等对西方蜜蜂的线粒体DNA进行限制性内切，分析来自十个不同亚种的68群西蜂序列，检测认为线粒体在这些种中都集中在三个主要的进化谱系：非洲亚种、北部地中海亚种和西欧意大利蜜蜂亚种，并且这些结果部分证实了基于形态和以前的假说的研究，与以前不同的是将非洲亚种单独分配为一个分支，并认为西方蜜蜂与其他物[31-33]种一样起源于非洲。1.2.1蜜蜂线粒体DNA的结构线粒体DNA标记是蜜蜂分类所用到的主要分析方法，从分子水平对蜜蜂线[34]粒体基因进行分析，相对于形态学更完善，也更深入。1992年，Crozier等对意大利蜜蜂完整的线粒体DNA序列进行了测序，测序结果显示意大利蜜蜂的线粒体全基因组大小为16343kbp，其中11个tRNA基因相对于它们在果蝇线粒体DNA中的位置有所改变，但其他基因和区域是在相同的相对位置，比较预测的蛋白质序列表明，蜜蜂线粒体遗传密码与果蝇是相同的，但有两个tRNA的反转录密码子不同。蜜蜂线粒体DNA碱基组成有明显的偏倚性，A+T含量是84.9％，而果蝇为78.6％，预测蛋白质编码基因的多元逐步回归分析显示氨基酸和密码子[35]之间出现显著关联，通过比较发现碱基颠换大约是果蝇的两倍。2009年，谭宏伟等对我国的东方蜜蜂线粒体DNA全基因组进行测序，测序结果显示东方蜜蜂mtDNA的全基因组大小为15895kbp，比意大利蜜蜂略小，并比较了东方蜜蜂和一些膜翅目昆虫之间的基因含量和基因组结构的变化特点。鉴定发现东方蜜蜂共含有2个核糖体RNA基因，13个蛋白质编码基因，22个转运RNA（tRNA）基因和一个控制区。东方蜜蜂的A+T含量为83.96％，也存在显著的碱基偏倚性，在所有13个蛋白质编码基因中，东方蜜蜂共有3672个密码子，不含终止密码子。最经常使用的氨基酸是亮氨酸Leu（15.52％），其次是异亮氨酸Ile（12.85％），苯丙氨酸Phe（10.10％），丝氨酸Ser（9.15％）和甲硫氨酸Met（8.96％）。除了Ser转运RNA—丝氨酸（tRNA）基因的位置不同之外，其他氨基酸基因排列的顺2 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述序和转录方向与西方蜜蜂是相同的。所有证据证明东方蜜蜂和西方蜜蜂是两个独立的物种，与以前的形态学和分子研究的结果是一致的。了解东方蜜蜂完整的线[36]粒体基因组，为研究东方蜜蜂的群体遗传学、系统学提供更多的遗传标记。1.2.2蜜蜂线粒体DNA遗传特征及多态性近20年来，在已经假定的低分辨率实验的基础上，线粒体DNA与细胞核基因相比具有继承动物的完全母体模式。使用聚合酶链式反应，现在已经在小鼠-4中相对母系的贡献频率检测继承父系的mtDNA分子为10。线粒体基因的母系遗传模式对研究线粒体遗传病大有帮助，也为后续对动物线粒体DNA研究提供[37]参考。对于线粒体基因遗传，后代接受到的几乎为母系的线粒体基因，而该线粒体基因又会通过这种模式——母系遗传在该物种中延续，蜜蜂是母系社会，属于社会性昆虫，一个蜂群只有一只蜂王，蜂王通过婚飞与雄蜂交配，将受精卵存储在储精囊中，并不断产卵，一个蜂群的所有工蜂均获得该只蜂王的线粒体基因，因此对蜜蜂线粒体DNA的研究可以很好的了解整个蜂群的遗传情况，减少了工作量，又提高了研究效率。线粒体在大多数多细胞生物体中都存在，是细胞重要的细胞器，它为细胞提[38]供ATP，是有氧活动的场所，并且线粒体存在遗传物质，线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量转化，为所需要的细胞活动提供必要的能量。线粒体的形态、数量、大小和分布在细胞中的变化很大，不同状态下也会有差异，一定条件下线[39]粒体的形状变化是可逆的，它能反映线粒体处于哪种代谢状态。Adam等对人类线粒体DNA重组的证据进行查找，如果发生重组，则需要有通过该遗传物质进入线粒体基因组中，并在线粒体谱系之间存在遗传路线。通过检测重组群体遗传证据的状态，认为在线粒体中没有通过重组发生确定的遗传[40]路线，这些群体遗传证据暗示线粒体基因不会发生重组。线粒体DNA可用来分析亲缘关系较近的物种之间的演化关系，可以通过这些物种间线粒体DNA的差异，包括线粒体DNA碱基的转化、缺失、颠换等，能够分析多细胞生物的遗传进化关系。线粒体DNA多态性的类型包括：位点的多态性，利用Southern杂交可以诊断出某个碱基位点是否发生突变导致丢失该位点或产生新位点；线粒体DNA序列的多态性，由于发生重复、缺失或插入发生的突变。Maria等对两种不同的基因组区域（线粒体ND2基因和EF1-α内含子）进行PCR扩增、克隆和测序，对10种蜜蜂采用简约法、距离法和最大似然法，分析DNA序列的亲缘关系，系统发育分析强烈支持基本拓扑结构，可分为三大集群：巨型蜜蜂（Apis.dorsata，Apis.binghami和Apis.laboriosa），小型蜜蜂（Apis.andreniformis和Apis.florea）和洞巢蜜蜂（Apis.mellifera，Apis.cerana，3 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述[41]Apis.koschevnikovi，Apis.nuluensis和Apis.nigrocincta）。Leslie等利用线粒体DNACOⅡ基因的完整序列鉴定蜜蜂属下的5种蜜蜂：黑小蜜蜂（Apis.andreniformis）、东方蜜蜂（Apis.cerana）、小蜜蜂（Apis.fiorea）、大蜜蜂（Apis.dorsata）和沙巴蜂（Apis.koschevnikovi），并将这些序列和Crozier等人报道的西方蜜蜂（Apis.mellifera）序列进行比较，表明A.dorsata是祖先种，接着进化出A.florae/A.andreniformis分支和A.koschevnikovi分支，最后是A.mellifera和[42]A.cerana，这5种蜜蜂线粒体DNA存在明显差异，高度分化。Arias等对线粒体ND2基因和异亮氨酸转移RNA基因进行PCR扩增、克隆和测序，分析14个西方蜜蜂亚种和新大陆“非洲化”蜜蜂，检测到20个单倍型，系统发育分析支持3或4个主要亚种群体相似。在这一区域发现的变异特征，使[43]我们能够推断亲缘关系和有关亚种的起源、扩散和生物地理学检验假说。Songram等对泰国东方蜜蜂的遗传多样性进行分析，收集东北部、中部地区和苏梅海岛的样本，通过对ATPase6～ATPase8基因的PCR-RFLP实验，揭示东方蜜蜂的不同样品之间的生物地理差异性。限制性内切发现AAA、ACA、AAD、BAA、ADA和ABA只有北部到中部样本存在（华北、东北、以及中部地区），BBB和BBC在南部的蜜蜂中发现以及BBC在苏梅岛的东方蜜蜂样品中发现。这些样品和泰国半岛的样品之间存在较大的遗传距离，但这些区域内的每个样本之间的遗传距离较低；地理异质性和系统发育分析表明，泰国的东方蜜蜂遗传分化为泰国[44]北部、泰国半岛和苏梅岛的种群。1.2.3蜜蜂线粒体DNA遗传多样性研究进展目前，对蜜蜂线粒体DNA的分析主要集中在非编码区、细胞色素氧化酶Ⅱ（COⅡ）以及细胞色素b基因。细胞色素b为真核细胞的线粒体中发现的蛋白质，它用作电子传递链的一部[45-46]分，并且是跨膜细胞色素BC1和B6F复合物的主要亚基。在真核生物和有氧原核生物线粒体中，细胞色素b为呼吸链复合物Ⅲ的一个组成部分——也被称为BC1复合物或辅酶细胞色素C还原酶。在植物叶绿体和蓝藻中，也有类似的蛋白质——细胞色素B6，是质体醌-质体蓝素还原酶的一个组成部分，也被称为B6F复合物。这些复合物参与了电子传递，最终用于ATP的生成，该复合物是[47]发挥细胞功能的重要组成部分。细胞色素b基因由于其序列变异性，通常作用于确定生物之间亲缘关系的线粒体DNA区域，它被认为是在确定科属内的关系最有用的区域。细胞色素b基因的比较研究已经产生用于描述新物种分配给某[48]个属或加深理解某些物种进化关系的新分类方案。细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ，也被称为细胞色素C氧化酶多肽Ⅱ，在人类中4 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述[49]由MT-COⅡ基因编码的蛋白质。细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ（COⅡ）从细胞色素C的电子转移到催化亚基Ⅰ，它包含两个相邻的跨膜区，在它的N-末端和该蛋白质的主要部分分别暴露于胞质或线粒体膜间隙，并包含所谓的Cu（A）——一种铜中心，可能是细胞色素C氧化酶的主要受体。COⅡ基因位于线粒体DNA中，是细胞色素C的重要的结合位点，它是理想的研究昆虫进化的标记，该基因在昆虫系统进化、种群遗传等方面有大量研究，与其他基因一起分析可以更好[50]的分析昆虫的系统发育关系。Crozier等研究发现蜜蜂细胞色素b，ATPase6，和ATPase8基因序列与推断的蛋白质氨基酸序列一致，这些线粒体基因与果蝇线粒体DNA对应的基因位置相同，比较蜜蜂属和脊椎动物细胞色素b基因的序列氨基酸鉴定和保守置换的比例，显示它们是高度保守的部分，在蜜蜂细胞色素b的氨基酸是其密码子家族的T和G的含量，与果蝇线粒体基因相比已经有显著[51]性进化。leu我国学者姜玉锁等，利用线粒体DNAtRNA～COⅡ基因对我国11个地理种群的东方蜜蜂进行研究，发现该段序列有9个变异位点，通过限制性内切酶分析，这些东方蜜蜂的线粒体类型包括：中国台湾型、中国海南型、中国大陆型、日本-韩国型、印度黄色蜜蜂型、泰国南部型、马来西亚沙巴州—印度黑色蜜蜂[11]leu型和印度黑色蜜蜂型。谭垦等利用线粒体DNAtRNA～COⅡ基因对13个地理种群的东方蜜蜂进行分析，通过分子系统进化树分析发现这些地理种群的东方蜜蜂主要分为两个类群北方类群和南方类群，北方类群主要是高海拔的蜜蜂，南[52]方类群为低海拔的蜜蜂。leu蜜蜂mtDNAtRNA～COⅡ基因区间包含了一个转运RNA编码基因和一个[53]A+T富集区，该富集区为蜜蜂属特有的非编码区，是蜜蜂亚种分析的重要标记。leu有研究者根据蜜蜂mtDNAtRNA～COⅡ基因间的A+T富集区进行多态性分析，[54]在150多群东方蜜蜂中共发现了40多种单倍型。leu殷玲等对云南东方蜜蜂的线粒体DNAtRNA～COⅡ基因进行分析，非编码区大小为97～98bp，共检测到8个单倍型，其中3个新发现的单倍型，并认[55]为印度东方蜜蜂与我国云南东方蜜蜂有差异。Roxane等为了研究蜜蜂的遗传多样性，对美国12地区的247群意大利蜜蜂的线粒体DNACOⅠ～COⅡ进行测序分析，共检测到23个单倍型，这23个单倍型分别包含西方蜜蜂的三个进化系（C，M和O）。三个进化系中有以前没有发现的新单倍型，这可能是外来蜂种[56]的引入经过长时间共同饲养产生，由此可见该区域已成为研究蜜蜂多样性和[57-60]地理进化的有力工具。5 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述1.3蜜蜂遗传多样性研究方法概况对于蜜蜂遗传多样性的研究，方法有很多，不同的方法技术即可以从不同的方面也可以从不同的角度来解释蜜蜂的遗传多样性信息。上个世纪60年代以前，对蜜蜂多样性和地理分布的研究主要依靠形态学方法，但是，这类方法受人为影响和环境影响因素较大，也存在一定的误差，不能完全反映蜜蜂遗传多样性情况；之后，随着蛋白质研究技术以及细胞生物学的发展，对蜜蜂多态性的研究发展到对染色体的研究，包括染色体的带型、基因表达产物、组型的研究，但通过蛋白质分析来了解蜜蜂遗传多样性仍然有一定限制，该技术用于蜜蜂遗传多样的研究仍不成熟；近年来，生物分子技术发展迅速，比如分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）等，这些技术帮助我们从DNA分子水平对蜜蜂遗传多样性进行更深入的分析，并且随着更多更精确的生物学分子技术的发展，对蜜蜂遗传多样性的研究更准确，更能帮助我们了解蜜蜂的遗传分化、进化。1.3.1蜜蜂形态学研究的方法表型和形态是物种遗传最直接的表现形式，利用蜜蜂的形态特征标记可以描述蜜蜂遗传多样性。1988年，Ruttner博士较为系统的对蜜蜂的形态特征做了研究，并对蜜蜂属下的大蜜蜂、小蜜蜂、东方蜜蜂、西方蜜蜂等种进行了形态学分析，主要分析蜜蜂的形态特征有40个，包括：吻长、体色、肘脉指数、蜡镜面[3]积、右前翅长、后翅钩数、覆毛长度、背板长、绒毛指数等。这些形态指标可用于蜜蜂品系鉴定的依据。目前，我国学者对于中华蜜蜂形态学分析仍然采用Ruttner提出的体系，并根据中蜂在我国的生存环境，将形态学特性和经济性状联合分析，了解中华蜜蜂[4]遗传变异。本试验根据国家畜禽遗传资源委员会组编的《中国畜禽遗传资源志[5]（蜜蜂志）》中所要求检测的指标内容，对工蜂5个经济性状指标右前翅长与翅宽、翅面积、吻长、第3与4背板总长和1个遗传指标肘脉指数共6个指标进行测定。1.3.2研究蜜蜂多样性的分子生物学方法近年来，生物分子技术发展迅速，比如分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR），这些技术帮助我们从DNA分子水平对蜜蜂遗传多样性进行更深入的分析，并且随着更多更精确的生物学分子技术的发展，对蜜蜂遗传多样性的研究更准确，更能帮助我们了解蜜蜂的遗传分化、变异。我国的研究者们采用的分子学手段主要[6]有：扩增片段长度多态性（AFLP）分析，限制性酶切片段长度多态性（RFLP）[7-10][11]分析，随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分析，线粒体DNA分析、微6 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述[12-15]卫星标记分析。1.4重庆地区中华蜜蜂研究现状1.4.1重庆地区中华蜜蜂分布现状东方蜜蜂在亚洲东南部以及中部均有分布。系统分类学家根据各地标本及其生境，将东方蜜蜂分为若干亚种，在形态上亚种之间有明显区别，电泳上也具有不同带型，并具有一定的生殖隔离，东方蜜蜂可以分为：中华蜜蜂、阿坝蜜蜂、藏南蜜蜂、印度蜜蜂、爪哇蜜蜂、菲律宾蜜蜂、日本蜜蜂和阿富汗蜜蜂。我国东方蜜蜂的分布和分类没有系统研究，1975年起，杨冠煌主持全国中蜂资源调查结果显示，全国大部分地区都发现有东方蜜蜂，仅在内蒙北部以及新疆等地暂没有发现其身影，从东南沿海到海拔4000米的青藏高原，中蜂都能生存和发展。[61]但是随着山林的破坏，外来蜂种的引进及大力发展，使中蜂的居栖地越来越小。重庆市地处中国西南部，地貌主要为山地、丘陵，属于长江上游，有几大山脉贯穿。重庆市几大自然保护区植物资源颇为丰富，对中华蜜蜂的繁衍生息具有得天独厚的自然条件，反过来，蜜蜂作为主要的授粉昆虫，对重庆市各地区的植物多样性又起着重要作用。重庆畜牧业发达，养蜂业在重庆具有地理优势，是重庆的特色的传统产业。谭宏伟分析了重庆市蜂业发展状况，截止2013年，重庆市有中华蜜蜂43万群、西方蜜蜂30万群，对于适宜中蜂生长的重庆地区来说，中蜂养殖占优势，主要分布在大巴山、巫山、武陵山、大娄山几大山区，从区县上分为城口、武隆、巫山、巫溪、秀山等，西蜂养殖产业在重庆市也分布广泛，主要在重庆市地势相对较为平坦的地区，如永川、潼南、荣昌、垫江等地。重庆养蜂业可以分为四大区域：大巴山区，以城口为中心；武隆山区，以彭水为中心；[62]一小时中蜂发展区，以南川为中心；渝西西蜂丘陵地区，以荣昌为中心。李晓云对重庆南川地区中蜂养殖现状进行了分析，南川是一个多山地区，属于云贵高原过渡地形，又属于大娄山脉，又有低山谷区；自然保护区金佛山位于该地区，海拔最高2251米；南川植物丰富多样，植物种类上千种，其中蜜源植物也十分丰富，又有重要的药用蜜源，做为山地蜂种养殖，中蜂比西蜂更有优势，对南川地区特别是金佛山自然保护区的植物多样性、植物授粉起着重要作用，是[63]中华蜜蜂资源核心保护区。任勤等对重庆蜂业进行了比较优势分析，得出重庆市有几大养蜂优势：得天独厚的自然条件、良好的养蜂基础和丰富的种质资源、大面积蜜源植物、政策优势；也存在制约因素：没有形成产业优势、落后的生产方式和技术、种群退化、[64]育种落后；大力保护和发展重庆地区中蜂养殖业势在必行。7 重庆师范大学硕士学位论文1.文献综述1.4.2重庆地区中华蜜蜂遗传多样性研究进展有研究者对重庆地区部分中蜂种群进行分析，任勤等对来自重庆南川金佛山地区的不同海拔的27群中华蜜蜂进行饲养，分析其生物特性，包括蜂王产育力、[65]蜂群群势增长、越冬蜂群群势消弱、分蜂性，发现与阿坝中蜂比较相似。于增源等采用PCR产物直接测序技术对重庆4个区县117群东方蜜蜂样品的线粒体DNA细胞色素b基因(Cytb)部分序列进行了分析，结果显示：在所得到的序列中共检测到11个核苷酸多态位点，共定义8种单倍型，这四个区县的中华蜜[66]蜂群体没有明显的遗传分化。曹联飞等人对重庆市金佛山地区31个东方蜜蜂leu样本的线粒体DNAtRNA～COⅡ基因进行了扩增和测序，对重庆市金佛山地区东方蜜蜂进行了遗传多样性分析，结果显示：金佛山地区东方蜜蜂存在4个单倍型，主体单倍型与国内大部分地区的单倍型相同，其余3个单倍型在国内[67]尚未见报道。由此可见对重庆地区中华蜜蜂地理种群之间的多样性关系尚不明确，研究尚不系统全面，利用多种遗传标记对重庆地区中华蜜蜂遗传多样性进行深入分析很有必要，也可为重庆市中华蜜蜂遗传资源的保护和育种提供重要的理论依据。8 重庆师范大学硕士学位论文2.引言2引言2.1研究背景东方蜜蜂与西方蜜蜂一样是人类能够系统饲养的蜂种之一，东方蜜蜂在我国[1]俗称“中蜂”，驯养历史悠久。20世纪中期，蜜蜂遗传资源分析、品种及品系的鉴定和遗传结构分析的主要手段是形态学方法，目前形态学方法仍然是许多学者在蜜蜂遗传多样性分析时[16-23]的常用工具。蜜蜂属于社会性昆虫，其线粒体母系遗传方式能够简便快捷研[43-44]究整个群体的遗传多样性。不同亚种的蜜蜂会呈现出线粒DNA的多态性。leu蜜蜂mtDNAtRNA～COⅡ基因间包含了一个转运RNA编码基因和一个A+T[53]富集区，该富集区为蜜蜂属特有的非编码区，是蜜蜂亚种分析的重要标记。leu有研究者根据蜜蜂mtDNAtRNA～COⅡ基因间的A+T富集区进行多肽性分析，[51]在150多群东方蜜蜂中共发现了40多种单倍型，因此该区域已成为研究蜜蜂[68-69]多样性和地理进化的有力工具。重庆市地处中国西南部，地貌主要为山地、丘陵，属于长江上游，有几大山脉贯穿。重庆市几大自然保护区植物资源颇为丰富，对中华蜜蜂的繁衍生息有着得天独厚的自然条件，反过来，蜜蜂作为主要的授粉昆虫，对重庆市各地区的植物多样性又起着重要作用。尽管已有研究者对重庆市部分中蜂种群进行分析，例如于增源等对重庆4个区县117群东方蜜蜂样品的线粒体DNA细胞色素b基因(Cytb)部分序列进行了分析，认为四个区县的中华蜜蜂群体没有明显的遗传分[66]化。曹联飞等人对重庆市金佛山地区东方蜜蜂进行了遗传多样性分析，发现3[67]个新的单倍型。但目前为止，对重庆市所属的大巴山脉、大娄山脉和武陵山脉的中华蜜蜂地理种群之间的多样性关系尚不明确，对重庆市中华蜜蜂形态遗传多样性及遗传分化以及线粒体DNA多态性研究，对了解重庆地区中华蜜蜂群体间的亲缘系有重要帮助，并且可以为重庆地区中华蜜蜂的地理亚种划分提供有价值的证据，解决重庆地区中华蜜蜂分类的重要问题。为重庆地区中华蜜蜂遗传资源的保护和育种提供重要的理论依据。2.2目的及意义本研究的目的在于对重庆地区中华蜜蜂种质资源遗传多样性进行调查分析，利用形态标记和线粒体DNA标记对重庆地区中华蜜蜂遗传多样性进行比较全面的研究，通过分析重庆地区中蜂的形态多样性以及非编码区遗传变异情况、群体遗传结构以及系统进化情况，了解重庆地区中蜂的遗传关系。重庆地区中蜂遗传9 重庆师范大学硕士学位论文2.引言多样性的研究对重庆地区中蜂育种、保护和发展具有重要意义，能够给山地中蜂遗传进化研究提供参考价值。2.3研究内容本研究的研究内容主要有以下几条：1.获取重庆地区中华蜜蜂样本。2.对所获得的样本制作形态学标本并测定6项形态指标值。3.分析所有样本形态指标，进行指标间的相关分析、判别分析、主成分分析以及聚类分析。leu4.提取每群中华蜜蜂总DNA，并对线粒体DNAtRNA~COⅡ段序列进行PCR扩增。5.对扩增结果进行测序，分析序列，包括核苷酸多态性、单倍型多样度、以及单倍型聚类分析和网络中介分析。2.4研究技术路线10 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析3.1材料与方法3.1.1采样本研究采集重庆地区中华蜜蜂共122群，湖北荆门地区中华蜜蜂10群，四川乐山地区中华蜜蜂6群，阿坝中蜂1群。重庆地区采样利用区县设置，每个区县有4-5个采样地点，每个地点采样数量为2-4群，我们对样品一般情况（时间、地点、蜂群来源、生境、海拔、蜜源等）、蜂场基本情况（养殖规模、养殖时间、饲养方式等）、蜂群患病史做了登记；也对蜂群的基本长势（蜂王、雄峰、工蜂体色、生长态势等）做了统计。每一个蜂群采集成年工蜂50-100只，样本采集后用95%乙醇处理并浸泡于50ml离心管中，各地点采样中蜂群数及采样地点见表3.1，图3.1。表3.1重庆地区中华蜜蜂各种群采样数统计表Tab.3.1SamplestatisticsofApisceranaceranainChongqing编号采样地点采样总群数1重庆武隆10群2重庆城口10群3重庆永川10群4重庆江津9群5重庆南川39群6重庆綦江10群7重庆大足7群8重庆合川5群9重庆万州3群10重庆秀山5群11重庆酉阳2群12重庆开县11群13重庆潼南1群14阿坝中蜂1群15湖北荆门10群16四川乐山6群11 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析图3.1中华蜜蜂采样点分布图，括号内数值为各地点采样群数Fig.3.1thesamplesitesdistributionofApisceranaceranainthisstudy,Valuesinbracketsisthenumberofsamples3.1.2实验仪器和工具所用工具：剪刀、镊子、载玻片、盖玻片。所用仪器：LeicaEZ4HD一体化数码显微镜，采用与之配套的LeicaLASEZ软件对样品进行拍照和测量。3.1.36项形态指标测量[3]中华蜜蜂外部形态指标的测定采用Ruttner1988年提出的方法，并根据国家畜禽遗传资源委员会组编的《中国畜禽遗传资源志（蜜蜂志）》中所要求检测[5]的指标内容，每群蜜蜂随机选取5只，然后取出每只工蜂的右前翅、吻、第3背板与第四背板，并分别对取出标本的翅长、翅宽、肘脉a、肘脉b，吻长、第3背板长、第4背板长进行测量，原始数据测量后，利用数据统计可获得我们需要的6项指标，分别是翅长、翅宽、肘脉指数、翅面积、吻长、第3+4背板长。①测定中华蜜蜂的吻长用镊子从浸有95%酒精的瓶中将样本蜜蜂取出，放于干净的滤纸上，而后再用镊子将蜜蜂的吻取出，将取下的蜜蜂的吻放置在干净的载玻片上，盖上盖玻片，并保证蜜蜂的中唇舌、前额、后颏三者尽量为一条直线，然后在显微镜下配合电脑LASEZ软件测量蜜蜂吻长，测量方法如图3.2所示，所获得的长度即为中蜂的吻长。12 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析图3.2中华蜜蜂吻长的测量Fig.3.2MeasurethelengthofproboscisofApisceranacerana②测定中华蜜蜂右前翅相关指数用镊子从浸有95%酒精的瓶中将样本蜜蜂取出，放于干净的滤纸上，再用剪刀将蜜蜂右前翅剪下，并将取下的蜜蜂右前翅放置于干净的载玻片上，盖上盖玻片，然后在显微镜下配合电脑LASEZ软件测量蜜蜂的前翅长、右前翅宽、肘脉a以及肘脉b，具体方式如图3.3，之后计算肘脉指数（a/b）。图3.3中华蜜蜂翅膀相关指数的测量Fig.3.3MeasuretheindexofrightforewingofApisceranacerana③测定中华蜜蜂第3、4背板长用镊子从浸有95%酒精的瓶中将样本蜜蜂取出，放于干净的滤纸上，将蜜蜂的第三和第四背板用镊子取下，并将取下的蜜蜂的第三和第四背板放置在干净的载玻片上，使背板平整，并盖上盖玻片，然后在显微镜下配合电脑LASEZ软件分别测量蜜蜂的第3背板、第4背板长，如图3.4，测定后计算第3+4背板长。13 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析图3.4中华蜜蜂第3、4背板的测量Fig.3.4Measurethelengthoftergum3andtergum4ofApisceranacerana3.1.4数据统计与分析本实验数据统计分析使用的软件为SPSS(19.0版本)，首先对所有中蜂形态指标进行统计，然后进行指标间的相关分析、因子分析、主成分分析、判别分析以及聚类分析。聚类分析包括三个方面：六项形态指标直接聚类、主成分与聚类分析结合、判别与聚类分析结合。因子分析通过各指标之间的相关性大小进行分组，每组变量代表一个公共因子，用最少个数的公共因子的线性函数与特殊因子之和来描述原来观测的每一个分量，不同样本根据因子得分，可绘制出因子与因子关系图，达到分类的目的。本研究聚类均采用平方欧式距离法。对于6项形态指标直接聚类，利用SPSS中分层聚类，依据6项指标之间的亲疏程度，将最相似的样本结合在一起，以逐次聚合的方式把所有样本进行分类。主成分聚类与聚类分析结合，将6项指标经过主成分提取，获得几个经过组合的反应主要信息的指标，并用每个样点的主成分得分矩阵进行聚类，分析样本的亲缘关系。判别分析与聚类分析结合，根据SPSS里的逐步判别聚类法，获得样本的判别函数1和判别函数2二维图，根据判别分析结果，利用组质心值对所有样本进行聚类，分析样本的亲缘关系。14 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析表3.2重庆地区中华蜜蜂6项形态指标平均值与标准误差Tab.3.2TheaverageandstandarderrorsinmorphologicalmeasurementdatasofApisceranaceranainChongqing右前翅长（FL）右前翅宽（FB）右前翅面积（AW）第3+4背板长Num地点吻长（Pr）/mm2肘脉指数（Ci）/mm/mm/mm（T3+4）/mmaAbCDbcBCabBCabBbcC1武隆5.080±0.0288.697±0.0383.164±0.01627.539±0.2303.790±0.1003.821±0.018aAabBCaAaACbBabB2城口5.102±0.0478.792±0.0233.240±0.01328.495±0.1613.766±0.0943.927±0.049aAbCaABaACbcBCbcC3永川5.102±0.0258.722±0.0223.227±0.01228.158±0.1633.571±0.1333.798±0.040aAbDabBabBCaAbcC4江津5.125±0.0188.640±0.0233.198±0.01627.634±0.1864.070±0.0833.822±0.014aAbCbBCabBCbBbcC5南川5.045±0.0108.708±0.0123.180±0.00627.694±0.0783.717±0.0323.813±0.008aAbDcCbCbcBCcC6綦江县5.051±0.0178.643±0.0253.131±0.01427.068±0.1643.590±0.0743.681±0.016abABbCbcCabBCbBbcC7开县5.016±0.0958.725±0.0263.161±0.01427.587±0.1853.763±0.0753.753±0.018aAaBcCbBbcBbcC8大足5.055±0.0208.816±0.0283.105±0.01427.386±0.1933.735±0.0813.795±0.024abABbBCDabcBCabABCabABbcC9酉阳县4.994±0.0388.740±0.0653.193±0.02727.919±0.4193.975±0.1373.754±0.042aAaAabBCaACabABbC10秀山县5.137±0.0238.927±0.0393.197±0.01828.555±0.2673.801±0.1113.847±0.023abABbCDcACbCbcBcD11合川区5.036±0.0308.683±0.0553.125±0.02427.163±0.3623.702±0.0773.727±0.026abABaBCbcACabBCcCbcC12万州区5.035±0.0368.770±0.0363.134±0.02327.493±0.2943.294±0.2003.773±0.039abABbcCDcdCDbcBCDabcBCbcBC13潼南县5.006±0.0338.656±0.0833.090±0.02226.751±0.3983.455±0.1293.804±0.079aAaAabcABCaABCbcCaA14阿坝中蜂5.244±0.0158.996±0.0553.214±0.03528.918±0.4473.132±0.1394.080±0.049bBcFdDcDbcBcD15荆门市4.933±0.0158.369±0.0193.028±0.01025.348±0.1213.629±0.0693.726±0.014bBcFcdDcDabcBCbcCD16四川乐山市夹江县4.919±0.0378.429±0.0203.077±0.01025.935±0.1173.657±0.1133.751±0.029注：数值右上角小写字母表示在0.01水平的显著性差异，大写字母表示在0.05水平的显著性差异，红色为最大值，蓝色为最小值。15 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析3.2结果与分析3.2.1重庆地区中华蜜蜂工蜂的形态测定值各地区中蜂形态指标测定值见表3.2，各区县形态指标之间有的存在极显著性差异（P<0.01）、显著性差异（P<0.05）或无明显差异（P>0.05）。从吻长平均值来看，阿坝中蜂最长，与四川乐山地区和湖北荆门地区中蜂有显著差异（P<0.05），与重庆地区中蜂吻长无明显差异（P>0.05）；四川乐山地区中蜂最短，与湖北荆门地区以及部分重庆区县中蜂无明显差异（P>0.05）。从右前翅长平均值来看，阿坝中蜂最长，除与重庆秀山中蜂无显著性差异（P>0.05）外，与其他地区中蜂均有显著性差异（P<0.05）；湖北荆门最短，除与四川乐山地区中蜂差异不显著外（P>0.05），与其他地区中蜂均有显著性差异（P<0.05）。从右前翅宽平均值来看，重庆永川地区最长，与四川乐山地区、湖北荆门地区以及部分重庆区县中蜂有显著性差异（P<0.05）；湖北荆门地区最短，与重庆潼南和四川乐山地区中蜂无显著性差异（P>0.05），与其他地区中蜂均有显著性差异（P<0.05）。从翅面积平均值来看，阿坝中蜂最大，与重庆地区中蜂均无显著性差异（P>0.05），与四川乐山和湖北荆门地区中蜂有显著性差异（P<0.05）；湖北荆门地区最小，与四川乐山和重庆潼南中蜂无显著性差异（P>0.05），与其他地区中蜂均有显著性差异（P<0.05）。从第3+4背板长来看，阿坝中蜂最长，与所地区中蜂均有显著性差异（P<0.05）；重庆綦江最短，与重庆城口地区中蜂有显著性差异（P<0.05）。3.2.2重庆地区中华蜜蜂6项形态指标间的相关分析利用SPSS软件里的相关分析，判断所有样本数据6项形态指标之间是否具有较强的线性关系，首先绘制矩阵散点图，如图3.5。吻长与翅长、翅宽、翅面积以及第3+4背板5项形态指标之间有明显线性关系，而肘脉指数与其他5项指标无线性关系。16 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析图3.5重庆地区中华蜜蜂6项形态指标矩阵散点图Fig.3.56morphologicalindexes’matrixscatterplotofApisceranaceranainChongqing从图3.5我们可以看出样本数据各形态指标之间线性关系的有无，于是我们利用SPSS软件里的相关分析，对重庆地区中华蜜蜂所测定的形态指标值计算相关系数，相关系数矩阵如表3.3。从具体数值可以看出，其中肘脉指数（Ci）与其它5项指标没有相关性（P>0.05），吻长（Pr）、翅长（FL）、翅宽（FB）、翅面积(AW)以及第3+4背板长(T3+4)5项指标之间均为极显著相关（P<0.01），这一结[70]果表明Ci为一个相对独立的指标，与之前的报道结果相符。表3.3重庆地区中华蜜蜂形态指标间的相关分析Tab.3.3CorrelationanalysisbetweenmorphologicalindexesofApisceranaceranainChongqingFLFBAWPrCiT3+4**FB0.601****AW0.8600.925******Pr0.2210.2040.235Ci0.0340.0070.0210.016********T3+40.3690.3450.3960.1490.046注：**表示在0.01水平上显著相关，*表示在0.05水平上显著相关3.2.3重庆地区中华蜜蜂6项形态指标因子分析利用SPSS软件对16群中华蜜蜂6项形态指标进行因子分析，6项形态指标主要表现出两个因子的变异，因子1（factor1）包含了数据48.3%的变异，这些数据与翅长、翅宽、翅面积、吻长以及第3+4背板长有关，主要是经济性状因素；17 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析因子2（factor2）包括了数据16.7%的变异，这主要是肘脉指数，各样本根据因子1和因子2得分绘制的散点图结果见图3.6。可以看出重庆地区中华蜜蜂分布整体较为集中，大部分样本种群聚在一起，与湖北荆门中华蜜蜂分布较远，四川乐山中蜂介于两个地区之间。在因子1中，重庆城口地区中蜂与湖北荆门地区中蜂差异最为明显，在图中距离最远，重庆地区多数区县中蜂差异不明显，如綦江与合川中蜂大致处于同一位置；在因子2中，所有样本整体差异不大，都处在离中心左右的位置，但仍有差异，如江津与綦江合川中蜂差异较大。重庆地区内部差异主要由因子1影响，城口中蜂与重庆其他地区中蜂较为离散，表现出内部差异。图3.6重庆地区中华蜜蜂6项形态指标因子分析散点图Fig.3.6Factoranalysisof6morphologicalindexes’scatterplotofApisceranaceranainChongqing3.2.4重庆地区中华蜜蜂6项形态指标主成分分析根据吉挺在分析东方蜜蜂遗传多样性使用的主成分分析方法，将重庆地区中华蜜蜂所得形态特征值利用SPSS软件进行主成分分析，其特征值贡献率见表3.4，其中第1成分的贡献比例为49.099%，第2成分的比例为16.603%、第3成分的比例为15.243%、第4成分的比例为12.479%，根据累积百分比大于85%，控制[70]信息损失在15%以下。我们选取了前4个成分，分别定义为F1、F2、F3、F4。提取的主成分信息见表3.5，各主成分函数表达式为：F1=0.353×FL+0.866×FB+0.881×AW+0.974×Pr+0.089×Ci+0.581×T3+418 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析F2=-0.058×FL-0.026×FB-0.042×AW-0.038×Pr+0.993×Ci+0.050×T3+4F3=0.932×FL-0.089×FB-0.135×AW-0.129×Pr+0.042×Ci-0.019×T3+4F4=-0.045×FL-0.115×FB-0.197×AW-0.181×Pr-0.061×Ci+0.811×T3+4根据函数表达式可计算出每个样本的四个主成分值，并用于主成分的聚类分析。从提取的主成分可以看出，主分1包含翅长、翅宽、翅面积3个指标，主分2、3、4分布是肘脉指数、吻长、第3、4背板长之和。表3.4重庆地区中华蜜蜂主成分分析解释的总方差Tab.3.4ThetotalvarianceprincipalcomponentanalysisofApisceranaceranainChongqing成份合计方差的%累计%12.94649.09949.09920.99616.60365.70230.91515.24380.94540.74912.47993.42450.3946.57499.99760.0000.003100.000表3.5重庆地区中华蜜蜂主成分分析成分矩阵Tab.3.5PrincipalcomponentanalysiscomponentmatrixofApisceranaceranainChongqing成分1成分2成分3成分4Pr0.353-0.0580.932-0.045FL0.866-0.026-0.089-0.115FB0.881-0.042-0.135-0.197AW0.974-0.038-0.129-0.181Ci0.0890.9930.042-0.061T3+40.5810.050-0.0190.8113.2.5重庆地区中华蜜蜂形态指标判别分析利用SPSS中Wilk’Lambda统计量，对6项指标进行逐步判别分析，如表3.6可以看出，得到了3个判别函数，判别函数的特征值越大表明该函数越具有区别力，第一个判别函数的特征值为0.493，第二个判别函数的特征值为0.276，第三个判别函数的特征值为0.140。表3.7是3个判别函数的显著性检验，三个判别函数均达到显著性水平；其中“1到2”、“2到3”表明三个判别函数的平均值在样本组间的差异情况，Wilks"Lambda的值为0.460、0.687，显著性值均为0，19 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析表明达到显著性水平；“3”表示排除前两个函数后，第三个函数在样本组别间的差异情况，显著性值为0，表明判别函数3也达到显著性水平。表3.8表示不同地点样本在质心处的函数值，利用前两个函数值可以得出所有样本的判别函数散点图，如图3.7所示。根据判别质心可以将所有样本进行分群，首先湖北荆门地区与四川乐山地区明显聚为一群，重庆地区聚为一个整体群，而城口、秀山中蜂较主体群较远，阿坝中蜂与其他中蜂也表现出明显距离，但与重庆城口和秀山中蜂距离较近。表3.6重庆地区中华蜜蜂判别分析特征值Tab.3.6DiscriminantanalysiseigenvalueofApisceranaceranainChongqing函数特征值方差的%累积%典型相关系数10.49354.17554.1750.57420.27630.39384.5680.46530.14015.432100.0000.351表3.7重庆地区中华蜜蜂判别分析Wilks"LambdaTab.3.7DiscriminantanalysisWilks"LambdaofApisceranaceranainChongqing函数检验Wilks"LambdaChi-squaredfSig.1到30.460436.388450.0002到30.687211.105280.00030.87773.855130.000表3.8重庆地区中华蜜蜂判别分析组质心处的函数Tab.3.8DiscriminantanalysisfunctiongroupatthecentroidofApisceranaceranainChongqing函数num1231-0.1210.2080.10420.7771.0510.41130.1790.188-0.8624-0.0370.729-0.20150.1610.186-0.0656-1.809-0.0090.4257-1.3690.3100.2018-0.290-0.515-0.46320 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析90.207-0.364-0.228100.509-1.1360.61211-0.071-0.166-0.361121.228-0.5410.23913-0.027-0.640-0.011140.334-0.6960.19615-0.279-0.4180.652161.6710.3081.545图3.7重庆地区中华蜜蜂6项形态指标判别分析结果Fig.3.7Theresultof6morphologicalindexesdiscriminantanalysisofApisceranaceranainChongqing3.2.6重庆地区中华蜜蜂形态指标聚类分析①6项形态指标直接聚类结果利用SPSS软件，运用平方欧式距离法对16个地区中华蜜蜂进行直接聚类，聚类结果如图3.8。显示重庆地区的中华蜜蜂与湖北荆门、四川乐山地区的中华蜜蜂明显聚为两支，重庆地区的中华蜜蜂主要分为三大群，第一支是武陵山、大娄山地区类型，主要有武隆、南川、江津等地区，第二支大巴山脉地区类型，主21 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析要以城口地区为代表，第三支是以合川地区为代表的重庆西北部类群。图3.8重庆地区中华蜜蜂6项形态指标直接聚类结果Fig.3.8Theresultof6morphologicalindexdirectclusteringofApisceranaceranainChongqing②6项形态指标主成分聚类结果通过主成分分析计算相关函数值，利用SPSS软件中的欧式平均距离法进行聚类分析，分析结果见图3.9。聚类结果与直接聚类结果一致。显示重庆地区的中华蜜蜂与湖北荆门、四川乐山地区的中华蜜蜂明显聚为两支，重庆地区的中华蜜蜂主要分为三大群，第一支是武陵山、大娄山地区类型，主要有武隆、南川、江津等地区，第二支大巴山脉地区类型，主要以城口地区为代表，第三支是以合川地区为代表的重庆西北部类群。图3.9重庆地区中华蜜蜂6项形态指标主成分聚类结果Fig.3.9Theresultof6morphologicalindexprincipalcomponentclusteringofApisceranaceranainChongqing22 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析③6项形态指标判别分析聚类结果根据判别分析组质心处的函数利用SPSS中的平方欧式距离法进行聚类分析，结果如图3.10，其聚类结果与直接聚类和主成分聚类结果有部分差异，首先湖北荆门与四川乐山地区中蜂与重庆地区中蜂仍然聚为两支，但重庆地区内部具有差异，城口地区与阿坝中蜂聚在外群，其余地区聚为三支，武隆、南川、江津地区为武陵山、大娄山地区类型，其余部分较为混杂。图3.10重庆地区中华蜜蜂6项形态指标判别函数聚类结果Fig.3.10Theresultof6morphologicalindexdiscriminantfunctionclusteringofApisceranaceranainChongqing④重庆地区桶养中蜂形态指标聚类分析为了更准确的分析和了解重庆地区中蜂遗传多样性，在采取中蜂样本时，我们从多个角度进行了比较详细的统计，包括样品一般情况（时间、地点、蜂群来源、生境、海拔、蜜源等）、蜂场基本情况（养殖规模、养殖时间、饲养方式等）、蜂群患病史做了登记；也对蜂群的基本长势（蜂王、雄峰、工蜂体色、生长态势等）。其中保持传统桶养的中蜂首先其来源是野生收捕的，其次桶养中蜂为定点养殖，饲养年限也较长，并且饲养者不会过多的人为干预蜂群的生长，因此我们选取样本中的桶养中蜂进行了形态聚类分析，结果如图3.11。由图可知，湖北荆门地区4群桶养中蜂与重庆地区所有桶养中蜂聚为两支，重庆地区内部主要有城口、武隆、江津、南川、彭水几个地区的样本，但是聚类结果比较清晰，首先部分城口中蜂单独成支，第一大支只有武隆、南川、江津、彭水地区的样本，第二大支有城口、江津、南川、彭水地区的中蜂样本。由此可见，桶养中蜂与地理关系比23 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析较明显，并且该结果也支持了主成分聚类结果，说明所采样本与记录结果一致，即多为收捕野生中蜂，并且没有发生大的流动性，能够全面、真实的反映重庆地区中蜂遗传多样性。注：橘色标记为样本所属的单倍型图3.11桶养养殖方式的中蜂形态特征聚类结果Fig.3.11Theresultof6morphologicalindexdirectclusteringofold-fashionedkeepingApisceranacerana3.3讨论蜜蜂的翅长与翅宽越大表明工蜂的飞翔能力越强，从而对零星蜜源的寻找与[71]采集能力强，因此也对相对恶劣的自然环境适应性强，通过对重庆地区中华蜜蜂形态指标测定结果显示，重庆地区中华蜜蜂翅长翅宽均高于湖北荆门地区所采中华蜜蜂，存在显著性差异（P<0.05），重庆地区与湖北荆门地区相比，地势为多山丘陵地带，海拔更高，必然需要更强的飞翔与寻觅蜜源的能力，这也是中华[72]蜜蜂适应环境的结果。重庆地区中华蜜蜂吻长以及第3、4背板之和整体高于湖北荆门地区中蜂（P<0.05），这说明重庆地区中蜂为适应重庆地区品种丰富的24 重庆师范大学硕士学位论文3重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析[73]蜜源植物而形成的结果。第3、4背板所对应的是工蜂蜜囊的位置，说明重庆地区中蜂贮蜜能力更强，生产蜂蜜的性能更强。六项指标间的相关分析结果显示，肘脉指数与其它五项指标均无相关性（P>0.05），另外五项指标之间具有极显著相关（P<0.01）。这一结果表明Ci为[1]一个相对独立的指标，这与之前的报道结果相符。形态直接聚类结果与主成分聚类结果一致，重庆地区中华蜜蜂与湖北荆门地区及四川乐山地区中蜂明显聚为两大类，这与之前将重庆地区中蜂划为华中型不[5]符。重庆地区中华蜜蜂聚为三类，一类以武隆南川为主，第二类以合川潼南为主，第三类以城口为主，在地理上武隆南川处于武陵山脉，合川潼南处于重庆西北部，而城口位于大巴山脉，气候上除城口为北亚热带山地气候，其它区县均为[74]亚热带季风气候，气候类型与中蜂形态差异也有关系。另外城口中蜂为大巴山类型，而武隆、江津、南川、彭水均属于武陵山、大娄山型，武陵山属于云贵高原云雾山的东延部分，大娄山属于云贵高原上的一座山脉，可见大娄山与武陵山中蜂由于地理位置较近，地形、气候相似，两地的中蜂差异较小，均与大巴山中蜂有差异。整体聚类结果发现阿坝中蜂与重庆地区中蜂距离较近，与之前任勤报[65]道的南川金佛山地区中蜂与阿坝中蜂较为接近这一结果相呼应，形态特征判别函数聚类发现城口地区中蜂与阿坝中蜂聚为一支，并聚在最外群，可以进一步推论重庆地区的中蜂有着自己独特的遗传背景，又由于城口地区为多山的地区，对中蜂的遗传资源有很好的保护作用，在今后的育种中，城口中蜂是一个不错的选择。25 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析4.1材料与方法4.1.1试验材料①样本采集本研究采集重庆地区中华蜜蜂共122群，湖北荆门地区中华蜜蜂10群，四川乐山地区中华蜜蜂6群，阿坝中蜂1群。重庆地区采样利用区县设置，每个区县有4-5个采样地点，每个地点采样数量为2-4群，我们对样品一般情况（时间、地点、蜂群来源、生境、海拔、蜜源等）、蜂场基本情况（养殖规模、养殖时间、饲养方式等）、蜂群患病史做了登记；也对蜂群的基本长势（蜂王、雄峰、工蜂体色、生长态势等）也做了统计。每一个蜂群采集成年工蜂50-100只，样本采集后用95%乙醇处理并浸泡于50ml离心管中，各地点采样中蜂群数及采样地点见表3.1，图3.1。②主要试剂2+动物基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工）、10×PCRBuffer（Mg）、dNTPMixture（2.5mM）、Taq聚合酶（5units/μL）、琼脂糖、TAE缓冲液、异丙醇、无水乙醇、氯仿、RNaseeA（10mg/ml）、离心管、PCR管。③主要仪器本研究用到的主要仪器及型号见表4.1。表4.1实验仪器Tab.4.1Instrumentsusedintheexperiments仪器型号厂商纯水仪Milli-QMillipore高速离心机eppendorf5418Eppendorf数显恒温水浴锅HH-8国华电器有限公司微量紫外分光光度计ND-1000NanoDrop微型离心机北京市六一仪器厂WD-2105APCR仪eppendorf22331Eppendorf电子天平FA1004A上海精天电子仪器有限公司微波炉WG800CS23-k6Galanz核酸电泳系统PowerPacHVBio-radDNA成像系统GeldocBio-rad立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KBS上海申安医疗器械厂电热恒温鼓风干燥箱DGG-9246A上海齐欣科学仪器有限公司26 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析④线粒体DNA扩增引物leu本研究所用引物为蜜蜂线粒体DNAtRNA～COⅡ段通用引物E2：[75]5ˊ-GGCAGAATAAGTGCATTG-3ˊ，H2:5ˊ-CAATATCATTGATGACC-3ˊ。上下游引物浓度均为10pmol/L。4.1.2试验方法①重庆地区中华蜜蜂全基因组DNA提取采用动物基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工）提取蜜蜂全基因组，具体操作如下：（1）每群蜜蜂取3只，每只蜜蜂取其胸部，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入400μl的BufferDigestion，震荡混匀；65℃水浴2h至细胞完全裂解，水浴后加入20μl的RNaseA（10mg/ml）。（2）加入200μlbufferPA，充分颠倒混匀，置与-20℃冰箱放置5min。（3）室温10000rpm离心5min，将上清液约500μl转移到新的1.5ml离心管中。（4）加入等体积氯仿充分混匀，再12000rpm离心取上清。（5）向上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。（6）向沉淀中加入1ml75%乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清。（7）重复步骤5一次。（8）开盖室温倒置10min至残留的乙醇完全挥发。（9）得到的DNA用100μlddH2O溶解。提取的DNA保存于-20℃，用于下一步实验。②PCR扩增及测序PCR反应在50μl体系中进行，体系混合物组成如下表：表4.2混合液组成Tab.4.2Mixturecomposition组成用量上游引物(10pmol/L)1μl下游引物(10pmol/L)1μldNTPMixture(2.5mM)4μlTaq酶(5units/μL)0.25μl27 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析DNA模板(100ng/μL)2μlddH2O36.75μl2+10×PCRbuffer(Mg)5μl反应程序：95℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，35个循环，72℃5min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。PCR产物送上海生工生物公司进行双向测序。4.1.3数据分析①序列核苷酸多样性分析[76]获得所有序列，首先利用Mega6对原始序列进行比对分析，筛选出所有[77]序列的非编码区，计算碱基组成；再利用DnaSP5分析序列的多态性，序列单倍型变异位点、单倍型多样度、核苷酸多样度、并估计序列的变异程度、核苷酸[78]替代率、基因差异程度、遗传距离。用Arlequin3.5软件进行分子方差分析（AMOVA）并计算群体间的分化水平（Fst）。②系统进化分析对原始序列用Mega6软件进行比对，用DnaSP5分析序列单倍型，并导出单倍型序列，再利用Bayes法构建各地理种群单倍型系统进化树，分析它们的起源及系统进化。在NCBI上下载已经上传的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型，利用Bayes法构建所有单倍型系统进化树，分析它们的亲缘关系。③网络分析系统发生树和网络分析通常被用于种内水平来分析DNA序列变异。单倍型[79]网络分析方法较多，本研究利用Network5软件中的中介法MJ(median-joining)构建单倍型的网络中介图，经过MJ计算之后利用MP法进行加工处理，得到最终的单倍型网络中介图。4.2结果与分析4.2.1DNA提取结果和PCR扩增产物检测提取到的蜜蜂总DNA先用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图4.1A，然后用全波长紫外测定仪测定其浓度，并稀释到100ng/ul。对重庆地区中华蜜蜂leu线粒体DNAtRNA～COⅡ段进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，部分样品的PCR结果如图4.1B，产物大小在480bp左右。将PCR产物送上海生工生物公司进行双向测序，共获得139个中蜂样本的测序结果。28 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析ABbpbp图4.1琼脂糖凝胶电泳检测结果A：重庆地区中华蜜蜂部分样本总DNA；B：重庆地区中华蜜蜂部分样本PCR扩增产物Fig.4.1TheresultsofagarosegelelectrophoresisA:TotalDNAofApisceranainChongqing;B:PCRproductsofApisceranaceranainChongqing4.2.2重庆地区各地理种群mtDNA非编码区序列的遗传多态性①重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区的碱基组成leu测定获得了所有样本的线粒体DNAtRNA～COⅡ段的部分序列，包括一段非编码区和部分COⅡ序列，我们分析了非编码区序列，大小为97bp。非编码区A、C、G、T4种核苷酸的平均比例分别为47.9%（46.4%～49.5%）、7.4%（6.2%～10.3%)、5.1%（3.1%～5.2%）和39.6%（37.1%～41.2%），A+T含量为87.29%，G+C含量为12.71%，表明该区域是一段A+T富集区，具有碱基偏倚性。②非编码区核苷酸序列多态位点变异情况本次实验共获得了重庆地区以及湖北荆门、四川乐山地区共139群中华蜜蜂样本非编码区序列，利用DNAsp进行单倍型分析，共发现17个单倍型，以单倍型H_1为标准，17个单倍型类型及变异位点如图4.2。共发现12个变异位点，占分析位点总数的12.37%。29 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析注：H_1～H_17为17个单倍型，数字代表变异位点，-为相同的碱基图4.2重庆地区中华蜜蜂非编码区单倍型变异位点Fig.4.2Non-codingregionhaplotypeandvariationsitesofApisceranaceranainChongqing对17个单倍型中的12个变异位点进行分析，发现重庆地区中华蜜蜂的变异类型主要为碱基转换和碱基颠换，没有发现碱基的插入与缺失。12个变异位点中，转换位点9个，颠换位点3个。结果见表4.3和表4.4。表4.3重庆地区中华蜜蜂非编码区变异位点替换情况Tab.4.3Non-codingregionvariationsitesonreplacementofApisceranaceranainChongqing替换类型多态位点C/T721313245G/A1322344951A/T3385C/A32表4.4重庆各地区中华蜜蜂非编码区变异位点替换情况Tab.4.4Non-codingregionvariationsitesonreplacementin16ApisceranaceranapopulationsofChongqing群体样本数替换数转换数颠换数插入/缺失数武隆（WL）102200城口（CK）105410永川（YC）103210江津（JJ）93210南川（NC）394310綦江（QJ）103210开县（KX）11321030 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析大足（DZ）74310酉阳（YY）22110秀山（XS）51010合川（HC）56510万州（WZ）32110潼南（TN）1\\四川乐山（SC）66510湖北荆门（HB）105320阿坝中蜂（ABa）1\\整体（Total）13912930③非编码区序列单倍型分布情况对139个样本分析得到的17个单倍型进行统计分析，重庆地区中华蜜蜂非编码区单倍型的分布结果见表4.5。共发现的17个单倍型中有共有单倍型也有种群独有单倍型，单倍型H1、H2、H3、H5、H6、H9、H12、H16为共有单倍型，单倍型H1与H5分别出现54、51次，为主体单倍型，分别占个体样本的38.85%、36.69%。其余单倍型的分布如下：H2出现3次，H3出现10次，H6出现6次，H9出现2次，H12出现2次，H16出现两次。其它的9个单倍型均为种群特有单倍型。从重庆各地区来看，南川、綦江地区单倍型较为丰富，均有5种单倍型，其次城口、永川、大足、合川地区有4种单倍型。城口、綦江、南川、永川、酉阳、合川、万州均有该地区特有单倍型，其余地区样本处于共有单倍型。可见重庆地区中华蜜蜂整体单倍型较为丰富，可能存在地区特有遗传资源。表4.5重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型分布情况Tab.4.5ThehaplotypedistributionofmtDNAnon-codingregionofApisceranaceranainChongqing群体单倍型总数CKJJKXQJNCWLXSYCYYDZHCWZTNHBSCAbaH13275167411115154H21113H3432110H411H5274218841211151H6111126H711H811H9112H1011H1111H122231 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析H1311H1411H1511H1622H17114.2.3重庆地区中华蜜蜂mtDNA非编码区序列的遗传结构①重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型多样度对重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区序列单倍型多样度进行分析，结果见表4.6，所有样本单倍型多样度为0.711±0.00065，整体单倍型较为丰富，从各区县的单倍型多样度来看，单倍型多样度最低为永川所采集的中蜂，为0.378±0.03286，城口、綦江、大足、合川、四川乐山、湖北荆门等地区所采集的中蜂单倍型多样度都很丰富，单倍型多样度均在0.7以上；其次，南川、万州地区中蜂单倍型多样度在0.6以上，也表现出丰富的遗传的多样性。表4.6重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型多样度Tab.4.6ThehaplotypediversityofmtDNAnon-codingregionofApisceranaceranainChongqing地理种群样本数单倍型数单倍型多样度PopulationsSizesNoofhaplotypesHaplotypediversityWL1030.511±0.027CK1040.778±0.00822YC1030.378±0.03286JJ920.389±0.02703NC3950.628±0.00201QJ1050.756±0.01678KX1120.509±0.01015DZ740.714±0.03272YY221XS520.4±0.05632HC540.9±0.02592WZ320.667±0.09877TN1\SC640.867±0.01667HB1060.778±0.01889ABa1\Total139170.711±0.0006532 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析②重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸多样度对重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸多样度进行分析，结果见表4.7，各地区中蜂非编码区序列核苷酸突变位点数目在城口中蜂、合川中蜂、四川中蜂、湖北中蜂较多，分别为5、6、6、5个，其余种群变异为点数在1～4之间。各地区中蜂平均核苷酸差异数（K）和核苷酸多样度（Pi）与突变位点数目呈正比关系，随突变位点数增加而增加，重庆地区中华蜜蜂的平均核苷酸差异数为1.7021，核苷酸多样度为0.01792。表4.7重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区序列核苷酸多样度Tab.4.7ThenucleotidediversitymtDNAnon-codingregionofApisceranaceranainChongqing平均核苷酸差异核苷酸多样度Tajima＇s中性检验显著地理种群样本数变异位点数性KPiDWL1020.66670.00687-0.1839P>0.10CK1051.64440.01695-0.279P>0.10YC1030.91110.00939-0.5067P>0.10JJ931.16670.012030.2175P>0.10NC3941.57890.016281.6067P>0.10QJ1031.53330.015811.6044P>0.10KX1131.52730.015751.6809P>0.10DZ741.90480.019640.7967P>0.10YY2220.02062n.d.XS510.40.00412-0.8165P>0.10HC562.60.0268-0.6682P>0.10WZ321.33330.01375n.d.TN1\\SC662.46670.02543-0.3508P>0.10HB1051.46670.01528-0.6824P>0.10ABa1\\All_Seqs139121.70210.01792-0.7203P>0.1033 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析表4.8重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸分歧度（Dxy）和净遗传距离（Da）Tab.4.8Thenucleotidedivergence(Dxy)andnetnucleotidedivergence(Da)ofmtDNAnon-codingregionofApisceranaceranainChongqingWLCKYCJJNCQJKXDZYYXSHCWZSCHBWL0.012500.023540.021990.015970.012920.012500.019350.014580.005630.017080.022220.018400.01083CK0.000460.021460.020600.017680.016880.016290.019640.020830.013330.022920.021530.021530.01667YC0.015320.008150.009840.015630.018330.018470.014730.027080.026460.030210.010070.026430.02396JJ0.012440.00596-0.000980.015670.017940.017990.015050.026620.024770.029170.016030.023010.02292NC0.004280.000890.002660.001370.016110.016000.017130.021370.017200.024470.017710.020490.01822QJ0.001460.000320.005600.00388-0.000100.014490.018300.017710.012920.021460.017990.020680.01521KX0.00107-0.000230.005770.00396-0.00018-0.001450.018130.017990.012690.021400.015380.025550.01515DZ0.005950.001160.00007-0.00095-0.001010.000400.000250.025300.021430.027680.027780.019100.02113YY0.000690.001850.011920.010130.00273-0.00069-0.000380.004960.012500.022920.025000.017360.01667XS0.000070.002690.019630.016610.006890.002850.002650.009420.000000.016250.029170.026740.01000HC0.000070.000810.011920.009550.00270-0.00007-0.000090.00422-0.001040.000630.027200.02042WZ0.011810.00602-0.00162-0.002220.000860.002780.00309-0.001490.010420.015970.008680.02720SC0.002080.001160.009140.007500.00194-0.00035-0.000130.002780.002780.002430.000350.007410.02014HB-0.000280.000460.011570.009200.00235-0.00042-0.000440.00357-0.001390.00028-0.000760.00833-0.00035注：上三角为核苷酸分歧度（Dxy），下三角为核苷酸净遗传距离（Da）34 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析表4.9重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区Kimura双参数距离Tab.4.9TheKimuratwo-parameterdistanceofmtDNAnon-codingregionofApisceranaceranainChongqingWLCKYCJJNCQJKXDZYYXSHCWZTNSCHBABaWLCK0.013YC0.0240.022JJ0.0230.0210.010NC0.0160.0180.0160.016QJ0.0130.0170.0190.0190.017KX0.0130.0170.0190.0190.0170.015DZ0.0200.0200.0150.0160.0180.0190.019YY0.0150.0220.0280.0280.0220.0180.0190.026XS0.0060.0140.0270.0260.0180.0130.0130.0220.013HC0.0180.0240.0320.0310.0250.0220.0220.0290.0240.017WZ0.0230.0220.0100.0110.0170.0180.0190.0160.0290.0260.030TN0.0280.0240.0050.0070.0160.0200.0210.0140.0320.0320.0350.007SC0.0190.0230.0280.0280.0240.0210.0210.0270.0200.0180.0280.0280.031HB0.0110.0170.0250.0240.0190.0160.0160.0220.0170.0100.0210.0240.0280.021ABa0.0040.0130.0270.0250.0170.0120.0120.0220.0110.0020.0150.0250.0320.0160.00935 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析③重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸差异重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸差异见表4.8，各地区核苷酸分歧度(Dxy)在0.563%～3.021%之间变化，核苷酸分歧度差异较大。秀山与武隆地区中蜂之间分歧度最小，为0.563%；永川中蜂与江津中蜂分歧度差异较小为0.984%。永川中蜂与合川中蜂分歧度最大，为3.0212%，合川中蜂与江津中蜂、万州中蜂与秀山中蜂的分歧度也很大，均为2.917%。重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区核苷酸净遗传距离(Da)为-0.162%～1.661%，核苷酸净遗传距离差异也较大。秀山中蜂与江津中蜂核苷酸净遗传距离最大，为1.662%，其次为永川中蜂与武隆中蜂，为1.532%。秀山中蜂与酉阳中蜂核苷酸净遗传距离最小，为0%。④重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区序列中性检验对重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区序列进行中性检验，中性检验的Tajima＇sD值见表4.7，重庆各地区中蜂非编码区序列Tajima＇sD值介于：-0.8165和1.6809之间，经显著性检验P>0.05，符合中性突变。⑤重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区遗传距离重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区kimura双参数距离见表4.9，重庆各地区中蜂遗传距离变异范围为0.002-0.035。秀山中蜂与阿坝中蜂之间的遗传距离最近，双参数距离值为0.002，合川中蜂与潼南中蜂之间的遗传距离最远，双参数距离值为0.035。⑥重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区分子方差分析(AMOVA)对重庆地区16个地理种群进行AMOVA分析，结果见表4.9。显示各地理种群mtDNA非编码区序列群体间(Va)的遗传变异为15.69%，群体内(Vb)的遗传变异为84.31%。群体内的遗传变异远大于群体间的遗传变异，说明重庆地区中蜂的遗传变异主要来自种群内部。表4.9重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区分子方差分析Tab.4.9TheanalysisofmolecularvarianceofmtDNAnon-codingregionApisceranaceranainChongqing变异来源自由度平方和方差组分方差比率群体间1528.0140.13833Va15.69群体内12391.4170.74323Vb84.31总变异138119.4320.8815636 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析4.2.4重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型网络中介图根据获得的非编码区单倍型变异位点，利用Network5绘制单倍型的网络中介图，结果如图4.3，与表4.5结合分析可知，单倍型H_1和单倍型H_5出现的频率最高，包含的地区最丰富，主要有三个聚类簇，单倍型H_1、H_3和H_5，其中单倍型H_1为一个主要的聚类簇，大多数单倍型起源于H_1，并且多数单倍型之间只有一个位点突变，Hap_7与其他单倍型表现出分离。在比较重庆地区与湖北荆门、四川乐山地区的单倍型时发现，它们之间的单倍型并没有明显分离，相互之间存在于共有单倍型中。说明分子水平上几个地区的中蜂并没有明显的遗传差异。注：每个圆圈代表一种单倍型，其大小与该种单倍型出现的频率成正比，红色数字代表存在的变异位点，WL-武隆、CK-城口、YC-永川、JJ-江津、NC-南川、QJ-綦江、KX-开县、DZ-大足、XS-秀山、YY-酉阳、HC-合川、WZ-万州、TN-潼南、SC-四川乐山、HB-湖北荆门、ABa-阿坝中蜂图4.3重庆地区中华蜜蜂非编码区单倍型网络中介图Fig.4.3Themedian-joiningnetworksofChongqingApisceranaceranapopulationsbasedonleunon-codingregionofmitochondrialtRNA～COⅡfragment4.2.5重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区系统进化分析①重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区序列分子系统树整理139个测序结果，对应样本来源，将重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区利用Bayes法构建分子系统树，首先选取最为原始的几群桶养中蜂，利用37 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析其非编码序列构建分子系统树，结果如图4.4。由图可知，所有样本虽然有一些差异，但从分子水平并没有将湖北荆门和重庆地区中蜂明显分开，但从部分聚类支上可以看出城口部分中蜂遗传资源比较集中，单独成一小支。注：CK代表城口地区、N代表南川地区、J代表江津地区、H代表湖北荆门地区图4.4重庆地区老桶养殖中蜂线粒体DNA非编码区Bayes法系统树Fig.4.4ThebayesianphylogenetictreeofmtDNAnon-codingregionofold-fashionedkeepingApisceranaceranainChongqing将所有样本线粒体DNA非编码区中蜂的线粒体DNA非编码区利用Bayes法构建分子系统树，结果见附录B。整体聚类结果显示各地区中蜂线粒体DNA非编码区没有明显差异，虽然有不同聚类支，每支与地理关系无明显联系，如第一支上有城口、武隆、南川、江津、合川等地区的样本；但有些地区中蜂样本距离较近，如永川、城口、大足、南川均有几个样本聚类较近，可见重庆地区整个线粒体DNA非编码区在种内没有明显分化。②重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型分子系统树利用Bayes法对所获得的17个单倍型聚类分析，结果如图4.5，重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型主要聚为三大类，单倍型H_2、H_5、H_8、H_14聚为一支，单倍型H_6、H_7、H_10据为另一大支，其余单倍型聚为第三支。湖北荆门样本单倍型与重庆市部分样品单倍型有的距离较近，有的为共有单倍型型，比如单倍型H_6、H_9等，但是在形态上差异较大。反观重庆地区各区县样本，它们单倍型距离较远或为种群特有单倍型，比如H_12、H_13与H_6、H_8，但是它们所代表的种群形态却聚在一起。这说明不同的环境对中华蜜蜂的形态特征具有一定影响。38 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析图4.5使用贝叶斯法构建的17个单倍型的系统发生树Fig.4.5The17haplotypesbayesianphylogenetictreeofApisceranaceranainChongqing为了进一步分析重庆地区独特的中蜂遗传资源，探讨丰富的单倍型与形态以及地理的关系，现选取原始的具有样本代表性的几群桶养中蜂，比较形态聚类结果与单倍型的情况，结果如图3.11，由图可得出两点结果：(1)处于同种单倍型的中蜂，其形态发生分化，没有完全聚在一起，比如地理位置相同的城口巴山联盟4群中蜂均属于单倍H_3，但CK_13号中蜂与另外三群中蜂表现出形态差异，这可能是由于表型分化造成的；单倍型H_5几个样本也没有完全聚在一支，如南川N10与江津J3均为单倍型H_5，但属于不同聚类支，这可能是由于不同的环境条件下，同样的遗传组成也可能表现出不同的形态特征。(2)形态聚类处于一支下的中蜂其单倍型并不完全相同，比如处于相同地理位置的湖北荆门中蜂，它们形态聚类单独成支，但其单倍型却相同，这可能是由于这些中蜂长期处于相同的生态环境，产生趋同进化的结果，武隆中蜂与南川中蜂虽属于同一单倍型，也聚于第一支，因为武隆和南川在地理位置上处于大娄山与武陵山脉结合处，两地为相邻区县，有着相似的自然环境。可见重庆地区独特的自然环境孕育了该地区丰富的、具有自身特点的中蜂样本。4.2.6重庆地区与全国各地理种群中华蜜蜂mtDNA非编码区单倍型的分子系统树将重庆地区中华蜜蜂mtDNA非编码区单倍型与国内外学者已经报道的序列39 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析进行对比，从NCBI上下载已经报道的序列，比对分析发现单倍型H_4、H_7、H_13为重庆地区所特有单倍型，它们分别是城口（H_4）、南川（H_7）、合川（H_13）地区的样本，其它单倍型与已报道的单倍型均为共有单倍型，如：H_1与已发表的重庆南川H1（GU272334.1）、H2（GU272335.1）、H4（GU272337.1），广东广州（DQ388602.1）、吉林安国（DQ388604.1）、甘肃勉县（DQ269025.1）等单倍型相同；H_5与印度H3（DQ381965.1）单倍型相同；单倍型H_9与重庆南川H3(GU272336.1)相同，这是之前曹联飞报道的单倍型H3(GU272336.1)为新发现[67]的单倍型。利用Bayes法构建重庆地区中华蜜蜂17个单倍型及Genbankqb已经报道的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型序列间的分子系统树，结果见图4.5。由图可知，重庆地区17个单倍型聚在一支，并且与之前报道的重庆南川的4个单倍型也聚在一支，整体单倍型聚类结果并无明显系统性，重庆地区中蜂非编码区单倍型与中国部分地区中蜂聚为一支，如云南、四川等地区的中蜂，其余地区东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型聚类结果有一定规律，越南、泰国、柬埔寨的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型聚为一类，印度东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型聚为一支，与中国境内部分地区东方蜜蜂线粒体DNA非编码区的单倍型亲缘关系较近。从分子系统树来看，东方蜜蜂不同亚种存在一定遗传分化，但又没有很大差异。40 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析注：树支上的数字为自展分析自展值，蓝色和橘色为重庆地区中蜂单倍型，橘色为新发现单倍型图4.6使用贝叶斯法构建的东方蜜蜂（亚洲其它国家、中国其它省份、重庆地区）非编码区单倍型的系统发生树Fig.4.6ThebayesianphylogenetictreeofmtDNAnon-codingregionhaplotypesofApiscerana(OtherAsiancountries,otherprovincesofChinaandChongqing)4.3讨论蜜蜂具有独特的婚飞繁殖方式，一只工蜂的线粒体DNA就能反应整个蜂群[80]的遗传结构，因此mtDNA标志必然是研究蜜蜂遗传多样性的有力工具。有研leu究学者认为在同一采样点的不同蜂群其mtDNA中tRNA～COⅡ片段的核苷酸[11]序列完全相同，甚至认为地理位置相距遥远的地区，如山西和河南，该片断的[81]核苷酸序列也是完全相同的。从我们测得的结果来看，同一采样点的样本其[70]mtDNA序列都可能会存在差异，如城口样本就有4个单倍型。41 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析谭宏伟等测定中华蜜蜂的线粒体全基因组就发现东方蜜蜂的线粒体基因组[36]存在着明显的A+T碱基偏向，总的A+T含量为83.96%，我们所获得的重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA非编码是一段A+T富集区，其A+T的含量为87.92%，[82-83]这也与其它东方蜜蜂非编码区的报道是一致的。本研究测定的非编码区变异率为12.37%，变异类型主要为碱基的转换和颠换，没有发现碱基的缺失和插入现象。分析所有样本的非编码区序列，总共发现17个单倍型，8个共有单倍型，其余9个单倍型为群体特有，与全国已报道的单倍型比较发现，有3个单倍型属于重庆特有，这3个单倍型分别是城口、南川金佛山、合川的样本，南川金佛山[67]发现的单倍型H9与曹联飞等人报道的重庆南川单倍型H3属于同一单倍型。这说明重庆地区具有丰富的中蜂遗传资源。武陵山系和大巴山系具有独特的生态环境，该地区的中蜂形成了自己独特的遗传背景，具有很大的保种和育种价值。与形态测定对比也发现几个新的单倍型有差异，比如合川中蜂整体较小，翅膀颜色较浅，合川又有新的单倍型发现，可见这些地区的中蜂也有自己的育种价值。重庆市地区华蜜蜂mtDNA非编码区单倍型多样度（Hd）为0.711±0.00065，核苷酸多样度（Pi）为0.01792。各地理种群核苷酸分歧度(Dxy)在0.563%～3.021%之间变化，核苷酸分歧度差异较大，各地理种群间核苷酸净遗传距离(Da)为-0.162%～1.661%，核苷酸净遗传距离差异也较大。重庆地区中华蜜蜂地理种群mtDNA非编码区群体间(Va)和群体内（Vb）的方差比率分别为15.69％和84.31％，进一步表明重庆地区中华蜜蜂不同地理种群间存在显著的遗传分化。线粒体DNA分子量小，具有严格的母系遗传方式和遗传自主性，研究动物种间和种内的mtDNA多态性，不仅可以了解近缘种及种内群体间亲缘关系，动[84]物群体的遗传结构，也可以了解物种的形成和进化历程，但是地理距离绝不是[70]影响蜜蜂种群间的亲缘关系的决定因素，不同地理亚种之间的基因交流也会影[85]响mtDNA的遗传多样性。本研究结果展示重庆地区中华蜜蜂群体群体间kimura双参数距离变异范围为0.002～0.035，城口中蜂与重庆地区其它区县中蜂距离较远，它们之间的双参数距离值都比较大，合川中蜂与潼南中蜂地理距离较近，但是它们之间的遗传距离最远，双参数距离值为0.035。城口成立的中蜂保护区，其中蜂资源得到一定保护，与其他区县中蜂的基因交流较少，保持了其较为原始的遗传多样性。而且中蜂处于一种半野生状态，其迁飞能力也较强，在区[86]县之间自身也会发生基因交流。将单倍型进行聚类时，我们仍然得到了3个聚类支，这与形态的结果是一直的。结合单倍型网络中介图，H_1与H_5分离较远，在聚类图中也是如此。在与全国及亚洲其它东方蜜蜂单倍型进行聚类分析时，可以发现，重庆地区中华蜜蜂单倍型与中国部分地区的单倍型关系较近，但是与印度、越南、泰国等亚洲东方42 重庆师范大学硕士学位论文4重庆地区中华蜜蜂mtDNA遗传多样性分析蜜蜂单倍型可以完全分开。重庆地区中蜂养殖业比较发达，部分区县存在商业育王，因此存在着基因交流，遗传聚类也较为复杂，但是部分山区中华蜜蜂又保持了相对原始的状态，与其它区县的基因交流较少，中华蜜蜂普遍具有较强的迁徙能力，存在频繁的自然[87]分蜂，不断向外扩张，并与周边蜂群发生基因流动。重庆地区中华蜜蜂非编码区符合中性突变，东方蜜蜂线粒体比较保守，变异比较少，其进化速率相对较慢。[74]所以在遗传分化过程中，不同类群间的基因交流甚至基因融合都完全是可能的。对重庆地区中华蜜蜂遗传多样性的研究还应利用更多的遗传标记，更深入的了解重庆地区乃至山峡库区中华蜜蜂的遗传结构，利用各地理种群存在的有益基因进行育种，不同山系建立中蜂保护区十分必要。43 重庆师范大学硕士学位论文5全文结论5全文结论1.重庆地区中华蜜蜂形态标记多样性分析利用SPSS软对重庆地区中华蜜蜂6项形态指标进行分析，发现部分地理种群中蜂形态特征值之间存在极显著性差异（P<0.01），有的存在显著性差异（P<0.05）或无显著性差异（P>0.05）；6项形态指标相关分析发现，5项指标相互之间存在极显著相关，肘脉指数与这5项指标均无相关性；6项形态指标因子分析主要表现出两个因子的变异，因子1包含了数据48.3%的变异，这些数据与翅长、翅宽、翅面积、吻长以及第3+4背板长有关，主要是经济性状因素；因子2包括了数据16.7%的变异，这主要是肘脉指数；对6项形态指标进行逐步判别分析发现湖北荆门地区与四川乐山地区明显聚为一群，重庆地区聚为一个整体群，而城口、秀山中蜂较主体群较远，阿坝中蜂与其他中蜂也表现出明显距离，但与重庆城口和秀山中蜂距离较近；6项形态指标直接聚类和主成分聚类分析一致，结果显示重庆地区与湖北荆门、四川乐山地区中蜂聚为两支，重庆地区的中华蜜蜂主要分为三大群，第一支是武陵山、大娄山地区类型，主要有武隆、南川、江津等地区，第二支是大巴山脉地区类型，主要以城口地区为代表，第三支是以合川地区为代表的重庆西北部类群；判别函数聚类结果显示湖北荆门与四川乐山地区中蜂与重庆地区中蜂仍然聚为两支，但重庆地区内部具有差异，城口地区与阿坝中蜂聚在外群，武隆、南川、江津地区聚为武陵山—大娄山地区类型，以上结果暗示重庆地区中华蜜蜂形态分化与地理环境具有关联性。2.重庆地区中华蜜蜂线粒体DNA遗传多样性分析leu对139群中华蜜蜂线粒体tRNA～COⅡ段进行PCR扩增，产物大小在480bp左右，对扩增产物进行测序并分析其中的非编码区，大小为97bp，A+T含量为87.29%，G+C含量为12.71%，该非编码区是一段A+T富集区，具有碱基偏倚性；发现所有样本共有17个单倍型，其中8个共有单倍型和9个种群特有单倍型，17各单倍型有12各变异位点，占分析位点总数的12.37%；整体单倍型多样度为0.711±0.00065，核苷酸多样度为0.01792，重庆地区中华蜜蜂表现出丰富的遗传多样性；与已报道的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型比对发现，此次研究发现单倍型H_4、H_7、H_13为重庆地区新发现的单倍型；网络中介分析和聚类分析发现，17个单倍型主要聚为3大类，单倍型H_1和H_5为主要聚类簇，新单倍型H_4、H_13起源于单倍型H_1，单倍型H_7与其余单倍型表现出分离。44 重庆师范大学硕士学位论文5全文结论3.重庆地区桶养中华蜜蜂多样性分析通过对老桶养殖中蜂的形态和线粒体DNA非编码区进行分析，形态聚类发现老桶养殖中蜂与地理关系比较明显，大部分中蜂保持其地理特性，城口中蜂为大巴山类型，而武隆、江津、南川、彭水均属于武陵山—大娄山型，这与形态主成分聚类结果一致，说明所采样本与记录结果一致，多为收捕野生中蜂，并且没有发生大的流动性，能够全面、真实的反映重庆地区中蜂遗传多样性；从选取的具有典型样本代表的桶养中蜂形态结果与单倍型对比分析发现同种单倍型中蜂其形态可能会发生分化，处于相同地理位置的中蜂其形态较近但单倍型也会有差异。重庆地区独特的多山地势，三大山脉蕴藏着丰富的中蜂资源，本次研究也证明了重庆地区中蜂具有形态和分子水平的多样性，特别是城口中蜂，它的非编码区序列核苷酸突变位点数目相对最多，单倍型种类也最为丰富。重庆地区中蜂丰富的遗传多样性可能有两个原因，其一的原因是重庆本身是一个多山的丘陵地带，中蜂资源本身比较丰富；其二，由于中蜂养殖业的不断发展，蜂种的区县辗转也会导致中蜂遗传资源的变化。当前重庆地区养蜂业发展迅猛，部分区县存在商业育王，又由于中蜂普遍具有较强的迁徙能力，存在频繁的自然分蜂，不断向外扩张，并与周边蜂群发生基因流动，终将导致遗传资源的混杂，因此对重庆地区不同地理中蜂资源的保护尤为必要。此外本研究仅用线粒体标记对重庆地区中蜂遗传多样性进行调查研究，在今后的研究中可运用更多的遗传标记，如微卫星DNA及SNP标记等，来更加深入了解重庆地区乃至山峡库区中华蜜蜂的遗传结构。45 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重庆师范大学硕士学位论文致谢致谢光阴荏苒，硕士研究生的学习即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。回首三年的学习生活，到现在硕士毕业论文的完稿，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意。感谢周泽扬教授，感谢您对我科研学习上的严厉与教诲；感谢您给予我的悉心栽培及关怀；您渊博的学识、严谨的治学态度、事实求是的工作作风将在以后的人生中鞭策我前进。感谢我的恩师许金山教授，三年硕士学习期间，在论文的选题，研究方案的确定，实验的实施及论文撰写等过程中，无不凝聚着恩师的心血和汗水。恩师渊博的专业知识，精益求精的工作作风，严谨的治学态度，诲人不倦的师德，严以律己、宽以待人的风范对我影响深远。在此向恩师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！感谢本研究室王林玲老师、李治老师、党晓群老师、马振刚老师的关怀与指导，在实验、学习、生活中无不渗透着老师们的极大的支持、鼓励与关心。在此向几位老师表达由衷的谢意！感谢重庆市畜牧技术推广总站、重庆畜牧科学研究院对本研究采样提供的帮助与支持！感谢本研究室已经毕业的师兄师姐及所有同学，他们是龚娟娟、苗雪、郑丽金、王玲、赵唯希、安欢迎、张素贞师姐，何超、何强师兄，王琴、刘学录、潘秋玲、游小林、张月月、王李、史红霞、刘佳师妹，谷瑛师弟，以及2013级同窗白利叶、熊青山、何美妍、刘璐、刘泽峰，衷心地感谢他们在我的硕士研究生学习生活中给予的鼓励与帮助！感谢我的父母及家人，二十多年来你们给予了我无限关爱、理解、支持和鼓励，在求学路上，无论成功、失败，无论喜悦、悲伤，我的家人每时每刻都站在我的身后坚定的支持我，鼓励我，再次向他们表示由衷感激。感谢答辩委员会的各位老师们，你们百忙之中抽出时间来审阅论文，为我指点迷津，在此表示衷心的感谢！最后，再次向所有指导、关心、支持和帮助我的老师、同学、朋友、亲人致以最真诚的感谢！祝您们身体健康、永远幸福！宾先丽2016年6月于重庆师范大学54