AFLP分子标记技术的发展及其在蜜蜂学研究中的应用 4页

昆虫知识ChineseBulletinofEntomology-313·AFLP分子标记技术的发展及其在蜜蜂学研究中的应用李志勇赵惠燕葛凤晨薛运波(1．西北农林科技大学植保学院陕西杨凌712100；2．吉林省养蜂科学研究所吉林132108)Developmentofamplifiedfragmentlengthpolymorphismanditsapplicationsinhoneybeeresearch．LIZhi—Yong，ZHAOHui—Yan，GEFeng—Chen，XUEYun．Bo2(1．CollegeofPlantProtection，NorthwestAgrieutureForestryUniversity，Yangling，Shaanxi712100，China；2．1nstiduteofApicuhureofJilinProvince，Jilin132108，China)AbstractAmplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP)isamolecularfingerprintingtechniquebasedonPCRandRFLP．Ithasbeenusedextensivelyinmanyfields，suchasgeneticdiversity，phylogeneticevolutionandtaxonomy，locationoftargetgenes，constructionofgeneticmapping，marker-assistedbreeding，qualityjudgmentandSOon．Thisreviewsummarizestheprinciples，characteristicsanddevelopmentofAFIJP，andits印plicationsinhoneybeeresearch．Keywordsmoleculargeneticmarker，AFLP．honeybee摘要AFLP分子标记技术是一种建立在PCR技术和RFLP技术基础之上的新的DNA指纹分析技术，现已广泛用于生物遗传多样性、系统进化及分类、基因定位、遗传图谱构建、标记辅助育种和品质鉴定等方面的研究。文章对AFI|P分子标记技术的原理、特点、技术发展及其在蜜蜂Ap／sspp．学研究中的应用进行详细论述。关键词分子遗传标记，AFLP，蜜蜂扩增片段长度多态性(amplifiedfragment技术也在蜜蜂学研究中有了初步的应用和发lengthpolymorphism，AFLP)是由荷兰生物学家展，并得到蜜蜂学者们的普遍接受和认可。zabeau和Voc于1993年发明的一种DNA指纹AFLP技术将在未来的蜜蜂学研究中彰显其独技术，并因此而获得了发明专利，受到了专利的特的技术优势。保护。但是，由于AFLP技术较其它分子标1AFLP分子标记技术概述记有着明显的优越性“，因此，世界上很多试1．1基本原理验室都在努力探索AFLP技术在自己的研究工基因组DNA经限制性内切酶充分酶切后，作中的应用，并迅速传播开来。1995年，Zabeau将特定的人工双链接头连在这些片段的两端，形和Vos不得不将其专利解密，并以论文的形式成带接头的特异片段，根据接头序列和酶切位点正式发表出来J。AFLP标记技术的出现，是设计引物，对特异性模板片段进行选择性扩增，DNA指纹技术的重大突破。该技术最初用于扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最后根据植物的遗传育种、种质资源鉴定等，现已被大量凝胶上DNA指纹的特点进行分析uj。(图1)用于动植物和微生物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、医疗诊断、系统发育和分类等研究领域。随着蜜蜂分子生物学研究的不断深入和蜜*Email：drane598@yahoo．eom．elrl收稿日期：2008．03．30，修回日期：2008．05．05蜂基因组全序列的测定完成，AFLP分子标记 ·314·昆虫知识ChineseBulletinofEntomology200946(2)5"GAATI"C一rI_AA一3’染色技术。荧光扩增片段长度多态性3"CTTAAG—AA兀-5’EeoRI酶丌MseI酶酶切反应(FAFLP)是用荧光染料代替放射性同位素来标TEeoRIAAT昼接头u——一AAIMseI强头记弓l物，用自动化测序仪进行片段的检测，该方连接反应法的出现是AFLP技术发展的一大进步。琼脂1E；EeoRI+A几MseI+C预扩增糖凝胶的EB染色法，主要用于SE．AFLPDNA——■■●A^TTCA—GTTA亡==：：】·__2亓。+CcAAAT亡===择性扩增的检测，该法简单实用。ad,■—一AATrCAAC—TrGTTA亡=1．3．3基于AFLP标记的相关技术发展—■■●TTAAGTTG—AACAAT亡====】AFLP标记基础上的RNA指纹技术(cDNA．变性胶泳检测AFLP)，是先提取mRNA，然后逆转录合成图1AFI技术原理图eDNA，再以eDNA作为模板进行AFLP分析引。·EcoRI接头序列口MseI接头cDNA—AFLP技术主要用于基因家族等高度同源性或相似性的基因片段的分离分析。除了1．2主要特点eDNA．AFLP技术以外，还有甲基化敏感．AFLP。作为一种新兴的分子标记技术，AFLP体现了RFLP和RAPD技术的双重优点：(1)AFLP分2AFLP分子标记技术在蜜蜂学研究中析所需DNA用量少。(2)AFLP技术能够获得的应用更高的信息量。(3)试验重复性好，可信度AFLP的最适应用范围，也就是Zabeau和高。(4)样品适用性广，基因组覆盖面大。Vos申请专利的关键，是利用AFLP技术鉴定品(5)AFLP标记表现为典型的孟德尔方式遗传。种指纹，检测品种的质量和纯度，辨别真伪。(6)AFLP可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥AFLP技术既可用于分析不同复杂程度的基因梁碡’加。(7)AFLP分析，不需要预先知道扩增组DNA，也可用于分析克隆DNA大片段。因基因组的序列特征等信息。此，它不仅是一种DNA指纹技术，也是基因组1．3AFLP技术的发展研究的一个非常有用的工具。AFLP技术的应1．3．1限制性内切酶的组合双酶切是AFLP用，主要表现在以下几个方面：(1)种质鉴定和分子标记技术的核心，也是目前应用最为广泛遗传多样性分析；(2)遗传图谱构建；(3)基因定的技术。单限制性酶切AFLP(SE．AFLP)，是利位。(4)标记辅助选择育种。用一种限制性内切酶和一套接头对目的基因组目前AFLP在昆虫方面的应用还不是很进行酶切和连接来研究DNA的多态性。三多，还处于初级阶段，主要应用在种群遗传结构限制性酶切AFLP(TE—AFLP)，是利用3种限制和遗传多样性分析、生态型鉴定、种群遗传分性内切酶和2套接头在单一的体系中对目的基析、连锁图谱构建等研究。蜜蜂分子生物学研因组进行酶切和连接来研究DNA的多态究已经有许多报道20_，但在AFLP技术应用性n，”，并得到了快速发展¨“。二次消化方面还不是很多，这主要集中在如下几个方面。AFLP(sDAFLP)是利用第一种酶进行首次酶切2．1蜜蜂遗传多样性分析连接反应，扩增后进行第二种限制酶的二次酶遗传多样性分析包括种间关系界定以及群切连接和第二次扩增，然后将其带型与标准的体遗传结构和分化。在我国，姜玉锁等对分布AFLP所获得的带型进行比较，从而检测样品的在中国境内不同地理型东方蜜蜂进行了遗传多甲基化等。样性的AFLP分析。他们利用22对引物组合，1．3．2多态性的检测方法AFLP多态性的检对9个省市的11个东方蜜蜂种群和1个西方测，最初采用放射自显影技术，但是存在一定的蜜蜂种群的39个个体基因组DNA的遗传变异危险性。变性PAGE银染法是目前应用较多的进行了研究。结果表明：AFLP标记具有很高的 昆虫知识ChineseBuUefinofEntomology·315·多态检测效率，适合于蜜蜂种群遗传多样性分蛰刺行为有关的位点，其它的BTLs代表了新的析和品种鉴定。并且，他们证明了中国境内不特定的巢门防卫行为的位点]。同地理型东方蜜蜂群体间存在着广泛的遗传变2．3蜜蜂疾病检测异。UPMGA聚类关系图显示，海南岛的东方蜜蜜蜂疾病的检测工作，特别是细菌性疾病蜂由于长期的海岛隔离，已经形成了一个独特和病毒性疾病的检测，比较复杂，并且有些疾病的类群。这支持了通过形态学认定的海南东方相伴而生，病状相似，很难在短时间内检测出蜜蜂为东方蜜蜂的一个新亚种学说。来。DeGraaf等利用AFLP标记技术，结合其它Suazo等利用优化的TE．AFLP技术分析了方法用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检测，区分蜜欧洲的蜜蜂和非洲的蜜蜂的DNA多态性及其蜂美洲幼虫腐臭病和蜜蜂粉介病，获得了成区别，分别找到了二者各自的特异性片段。功，为蜜蜂疾病的检测方法开创了新途径。Smith等对苏拉威西蜂线粒体DNA的非编2．4控制蜜蜂传粉码区进行了测序分析，证明了分布于亚洲的东在美国等西方发达国家，蜜蜂主要被用于方蜜蜂和苏拉威西蜂分属2个不同的蜂种，并为农作物授粉，特别是保护地作物的授粉更是采用AFLP标记分析方法，揭示了二者之间无离不开蜜蜂的参与，蜜蜂授粉大大增加了作物基因流动，支持了苏拉威西蜂是一个独立蜂种的产量和产品的品质。但是，在控制作物或果的假说J。树定向授粉进行杂交育种和生产方面，蜜蜂却2．2蜜蜂基因定位、遗传图谱构建成为较难封锁和监测的对象。Chao等用AFLP生物样本结构基因和调节基因等在染色体标记技术，分析监测了无籽柑橘生产中是否有上的位置以及与之连锁的标记研究，是目前基蜜蜂长距离传粉而混杂的现象存在，获得了成因组学研究的热点之一。另外，与其他的标记功。技术相比，AFLP是作图效率最高的一种标记，2．5蜜蜂AFLP分子标记技术的优化适合于构建基因组的高密度连锁图谱。经典的AFLP标记技术以及由此发展起来Rueppell等应用AFLP技术研究了不同Et的相关技术等均已经具有了成熟的技术方案，龄西方蜜蜂采集行为。他们用400多个AFLP性能稳定可靠。但是，该技术在不同样本上的标记构建了蜜蜂的2个遗传图谱，并依据图谱使用效果却有所不同。AFLP技术在蜜蜂学研报道了4个数量性状基因位点和2个更具有启究中应用，需要适当的优化，以获得适合蜜蜂研发性的数量性状基因位点，它们都与蜜蜂的采究的技术方法。Suazo等从3个方面对经典的集行为相关。继而，他们又定位了3个与采集AFLP方法和程序进行了改进，从而使图谱条带有关的基因位点，并检验了在正反交种群中这数量增加，稳定性提高。Suazo利用优化后的3个基因位点标记的效果和另一个侯选基因AFLP技术分析了来自欧洲和非洲的蜜蜂基因(Amfor)的效果。该研究支持了3个假说：组之间的区别，找出了二者各自的特异性片pln1、pln2和pln3，并且将Amfor基因引入蜜蜂段5l。采集行为的研究，为未来研究奠定了基础。3展望Arechavaleta等研究了影响蜜蜂防卫行为的双特性位点(BTLs)。他们用AFLP标记法，在AFLP技术虽然操作要求严格，对基因组温驯的蜂群和凶暴的蜂群蜜蜂杂交后代中，定DNA的纯度要求较高，扩增时有假阳性结果的位了与BTLs相关的遗传标记并各生成一个遗出现以及放射性同位素使用等缺点。但是，该传图谱。结果找到10个与防卫行为有关的技术以其准确性、高灵敏性以及快速高效的特AFLP标记。这l0个标记代表了7个影响蜜蜂点而倍受蜜蜂分子生物学家的青睐。随着防卫行为的BTLs，其中一个BTL代表了一个与AFLP技术的不断进步和完善，各种基于AFLP ·316·昆虫知识ChineseBuletinofEntomology200946(2)技术的安全快速、操作简便、成本低廉的方法应肖兴国．一种经济快速高效的DNA指纹新技术．TE—AFLP评介．农业生物技术学报，2001，9(2)：202204．运而生，并将在构建蜜蜂遗传图谱、性状标记、14WuⅢA．W．G．，Isaaksj．A．，EmstingG．，eta1．Population遗传多样性研究、基因定位和基因的克隆以及substructuresinthesolinvertebrateOrchesellacincta．8s功能基因研究和分子标记辅助育种研究领域发revealedbymicrosatelliteandTE—AFLPmarkers．Mo1．Eco1．．挥重要作用，具有广阔的应用前景。2003，12(6)：1349～1359．SuazoA．，HallH．G．ModificationoftheAFLPprotocolapplied参考文献tohoneybee(却meUifera)DNA．和地咖，2006。37(2)：1ZabeauM．，VosP．Selectiverestrictionfragmentamplification：687～698ageneralmethodforDNAfingerpriuting．EuropeanPatentSuazoA．，HallH．G．ModificationoftheAFLPprotocolappliedApplication92402629．7(PublicationNo．0534858A1)．tohoneybee(Ap】=sto,)DNA．Bioteehniques，1999，26(4)：EuropeanPatentOfice，Paris．7047092PowellW．，MorganteM．，AndreC．，eta1．Thecomparisonof万春玲，谭远德．AFLP的一种改进方法．南京师大学报(自RFLP，RAPD，AFLPandSSR(microsatellite)markersfor然科学版)，1999，22(2)：88—91．gennplasmanalysis．Mo1．Breed．，1996，2(3)：225～238．DurrantW．E．，RowlandO．，PiedrasP．，eta1．eDNA-AFI-P3BachemC．W．B．，HoevenRS．，BrnijnS．M．，eta1．revealsastrikingoverlapinrace-specificresistanceandwoundVisualizationofdiferentialgeneexpressionusinganovelmethodresponsegeneexpressionprofiles．PlantCell，2000，12(6)：963ofRNAfingerprintingbasedonAFLP：Analysisofgene～977．expressionduringpotatotuberdeve1．PlantJ．，1996，9(5)：745薛运波，李兴安，葛凤晨，等．长白山中华蜜蜂基因组CBS．—753．700(bp)DNA同源片段克隆及其Southern杂交的研究．中4JanssenP．，CoopmanR．，HuysG，eta1．Evaluationofthe国蜂业，2006，57(10)：8—11．DNAfingerprintingmethodAFLPasanewtoolinbacterial薛运波，李兴安，葛凤晨，等．长白山中华蜜蜂基因组DNAtaxonomy．Microbiology，1996，142：1881～1893．多态性的研究．中国农业科学，2007，40(2)：426432．5VosP．，HogernR．，BleekerM．eta1．AFLP：anewtechnique姜玉锁，刘文忠，张春香，等．中国境内不同地理型东方蜜forDNAfingerprinting．Nuc1．AcidsRes．，1995，23(21)：44O7蜂遗传多样性的AFLP分析．昆虫学报，2007，50(2)：144——4414．152．6TheHoneybeeGenomeSequencingConsortium．InsightsintoSmithD．R．，PalmerM．R．，OtisG．，．Mitochondrialsocialinsectsfromthegenonmofthehoneybee却如z吒庀ra．DNAandAFLPmarkerssupportspeciesstatusof舢Nature，2006，43(7114)：931～949．nigrocineta．InsectsSoc．，2003，50(2)：185～190．7JonesC．J．ReproducibilitytestingofRAPD，AFLPandSSRRueppellO．，PankiwT．，NielsenD．1．，et以．ThegeneticmarkersinplantsbyanetworkofEuropeanlaboratories．Mo1．architectureofthebehavioralontogenyofforaginginhoneybeeBreed．，1997，3(5)：381—390．workers．Genetics，2004，167(4)：1767—1779．8WaughR．，BonarN．，BairdE．，eta1．HomologyofAFLPRulppellO．，PankiwT．，PageR．E．，eta1．Pleiotropyepitasisproductsinthreemappingpopulationsofbarley．Mo1．，Gene．，andnewQTL：ThegeneticarchitectureofhoneybeeforagingGenet．，1997，255(3)：311～321behavior．J．Hered．，2004，95(6)：481～491．9RemingtonD．L．，WhettenRW．，“uB．H．，eta1．Arechavaleta—VelascoM．E．，HuntG．J．BinarytraitlocithatConstructionofanAFLPgeneticmapwithnearlycompleteinfluencehoneybeeguardingbehavior．Ann．Entomo1．Soc．genomecoverageinPinustaeda．Theoret．App1．Genet．，1999，Amer．，2004，97(1)：177—183．98(8)：1279～1292．DeGraafD．C．，DeVosP．，HeyndriekxM．，eta1．10LalliasD．，LapegueS．，HecquetC．，eta1．AFLP—basedIdentificationofPaeuibacillualarvaetothesubspecieslevel：Angeneticlinkagemapsofthebluemussel(Mytilusedul~)．Anita．obstacleforAFBdiagnosis．J．Inverteb．Patho1．，2006，91(2)：Genet．，2007，38(4)：340～349．115～123．11洪棋斌，裴炎．大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性ChaoC．C．，FangJ．G．，PaehanoorS．Longdistancepolen技术及其优化．遗传．2001，23(5)：477～479．flowinmandarinorchardsdeterminedbyAFLPmarker8·12WurfA．W，G．，ChanY．L．，StraalenN．M．，eta1．TE-Implicationsforseedlessmandarinproduction．J．Am．Soc．AFLP：combiningrapidityandrobustnessinDNAfingerprinting．Horticu1．Sci．，2005，130(3)：374—380．Nuc1．AcidsRes．，2000，28(24)：105．