蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖 4页

2802008,Vol.29,No.06食品科学※分析检测液相色谱示差折光法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖张书芬，史萍萍，王全林，沈坚，傅晓(宁波市产品质量监督检验所，浙江宁波315041)摘要：本实验对反相高效液相色谱示差折光检测法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的方法进行了详细地探讨，结果表明：均匀称取约2.5g样品，加30ml水溶解后，再用乙腈定容至50ml，既能够有效地提取蜂蜜中的糖类物质，又保证了和流动相的相对一致性。同时对样品溶解时的分层机理作了初步推测。用该方法处理所得的样品稳定性高，测试结果重复性好。该法加标回收率均在97%～103%之间，相对标准偏差均在0.8%～1.6%之间。采用本研究方法测试了8种不同蜂蜜样品，均获得满意结果。关键词：液相色谱示差折光法；蜂蜜；果糖；葡萄糖；蔗糖；麦芽糖DeterminationofFructose,Glucose,SucroseandMaltoseinHoneybyLiquidChromatographyRefractiveIndexDetectorZHANGShu-fen，SHIPing-ping，WANGQuan-lin，SHENJian，FUXiao(NingboSupervisionandInspectionInstituteofProductQuality,Ningbo315041,China)Abstract：Thisstudydiscussedthemethodfordeterminationoffructose,glucose,sucroseandmaltosecontentinhoneybyreverse-phasehighperformanceliquidchromatogramrefractiveindexdetector(HPLC-RID).Resultsindicatedthatnotonlythecarbohydratecanbeextractedfromthehoneyeffectively,butalsothemobilephaserelativecoherencecanbeguaranteedbydissolvingsample(2.5g)withdistilledwater(30ml)andthendilutingto50mlwithacetonitrile.Solublemechanismwasalsopresumed.Theexcellentstabilityandrepeatabilityareobtainedbythedevelopedpretreatmentmethod.Thespikedrecoverisisintherangeof97%～103%withrelativestandarddeviationof0.8%～1.6%.Eightdifferenthoneysamplesweredetectedandgoodresultsareobtained.Keywords：HPLC-RID；honey；ructose；glucose；sucrose；maltose中图分类号：TS207.7文献标识码：A文章编号：1002-6630(2008)06-0280-04蜂蜜是具有悠久历史的经典的保健品之一，纯正外，离子色谱脉冲安培法[5-6]、液相色谱蒸发光散射检的、质量好的蜂蜜具有很高的营养价值和功效，所以测法(HPLC-ELSD)[7]、短波近红外光谱法[8]、毛细管电好的蜂蜜的销售的价格也较高。这也就刺激了一些不法泳电化学[9]等方法测定食品中的糖也略有报道。商贩，为了牟取暴利，在蜂蜜中搀假、造假，严重化学法操作繁琐，无选择性，有研究表明测得的的损害了广大消费者的利益，为此国家在2006年出台了葡萄糖、果糖值比实际值略高，极有可能影响蜂蜜品关于蜂蜜的强制性国家标准[1]，新标准中主要从三个强质的判断，同时由于测试原理基于氧化还原反应，所制性指标来判断蜂蜜的质量，即水分、果糖和葡萄糖以还原性物质会对结果造成很大干扰，特别是那些添加总量和蔗糖含量。如果企业在蜂蜜中非法添加糖浆、白了一些抗衰老成分的蜂蜜，往往造成误判[10]。气相色砂糖等成分，必然造成糖类不合格，所以蜂蜜中糖类谱法则由于糖为未挥发性物质，需要进行衍生处理，操的测定具有重要意义。作繁琐。虽然用HPLC-ELSD法检测大大提高了检测灵目前食品中糖的测定方法主要有化学法[2]、气相色敏度和重复性，但该检测器价格昂贵，专用性强，不谱法[3]、液相色谱示差折光检测法(HPLC-RID)[4]，另够普及不利于检测方法的推广。高效液相色谱示差折光收稿日期：2007-06-22作者简介：张书芬(1977-)，女，工程师，硕士，主要从事食品和化妆品的检验。E-mail：shufenzhang@hotmail.com ※分析检测食品科学2008,Vol.29,No.06281检测法(HPLC-RID)虽然有灵敏度低和不能进行梯度洗脱50.0ml容量瓶中，用5ml水洗涤烧杯两次，并将洗涤液等缺点，但因蜂蜜中葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖都转移到容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，经0.45有一定的含量，而且彼此很容易分离，所以灵敏度和滤膜过滤后上机实验。梯度洗脱不会对本实验有重要影响，能够对蜂蜜中糖类2结果与分析进行准确可靠的分析，为此新的国家强制标准中糖类的检测方法也从原来的化学法改为GB/T18932.22—2003高2.1样品前处理效液相色谱法，但依据该方法检测，在样品前处理的2.1.1样品的匀化及取样时候就发生了分层现象，特别是在实验环境温度较低的根据常温存在的状态可将蜂蜜及其制品分为两种：时候，分层更为严重，从而影响检测。所以本实验在一种呈无结晶的均匀状态，一种有结晶，特别是加入国家标准的基础上，对测定蜂蜜及其制品中的果糖、葡其他物质的蜂膏类制品，非常容易结晶。通常人们认萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的方法进行较为详细和全面地为无结晶的蜂蜜才是真正的好蜂蜜，认为蜂蜜的结晶就探讨。是在蜂蜜中搀进了蔗糖。其实这里存在很大误区，一1材料与方法些品种的花蜜如油菜蜜和棉花蜜都具有极易结晶的特性，葵花蜜也能在短时间内结晶，只有经过浓缩、过1.1仪器与试剂滤等深加工后的蜂蜜能保持较长时间不结晶。实验研究HP1100高效液相色谱仪(具有示差折光检测器和自发现对于无结晶的蜂蜜，取样时只要将其混匀，做到动进样器)美国安捷伦公司。均匀取样就可以了。对于有结晶的样品，要将样品在葡萄糖、蔗糖(均为色谱纯)及蔗糖、麦芽糖标样(纯密闭的情况下，置于不超过60℃的水浴振荡器中温度均不低于99.5%)上海安谱公司；实验用水为超纯热，振荡，待样品完全溶解后将其搅拌均匀，迅速冷水；乙腈为色谱纯。却到室温取样。水浴温度取60℃，既保证了溶解效1.2色谱分析条件率，又保证样品有效营养成分不会改变，不会影响测色谱柱为ZORBAX碳水化合物分析柱(5μm，250×试结果。4.6mm，购自美国安捷伦公司；流动相：乙腈:水(75:2.1.2称样量选择25，V/V)，使用前经0.45μm滤膜过滤；流速：1.0ml/实验中称取约2.5g(精确到0.0001g)样品溶解定容至min；柱温：35℃，示差折光检测器温度：35℃；进50.0ml，示差折光检测器作为通用型检测器，在测试的样量；15μl。灵敏度方面无法和专用型检测器相比，在本实验条件1.3标准溶液配制下，蔗糖的检出限为0.5mg/ml。一般蜂蜜中的蔗糖含量分别称取果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品5、在0.2%～5%之间，麦芽糖含量在1%～7%。为了减少5、1、1g(精确到0.0001g)置于100ml容量瓶中，加水样品量对定容体积的影响，一般食品检验中将几克的样60ml用玻璃棒搅拌溶解后，用乙腈定容至刻度，摇匀品至少定容到50.0ml，这样折算下来，取样量要控制在配制成母液。2g以上。基于测试结果的准确性和重复性考虑，本实分别吸取2.0、3.0、5.0、6.0ml母液于10.0ml容量验选择样品量为2.5g左右。瓶中，用40:60的乙腈水溶液定容至刻度。配制成果糖、2.1.3溶解样品溶剂及比例的选择葡萄糖含量为10.0、15.0、25.0、30.0mg/ml和蔗糖、蜂蜜易溶解于水中，人们在喝蜂蜜时就是直接用水麦芽糖含量为2.0、3.0、5.0、6.0mg/ml的标准系列。冲调，用纯水溶解样品后，进行上机实验，可以达到1.4样品处理与测定检测的目的，但是考虑到样品溶剂和流动相的一致性，1.4.1样品制备在溶解样品时，对一定比例的水和乙腈溶解样品进行了对于无结晶的蜂蜜，取样时只要将其混匀，做到一系列实验。由于蜂蜜不溶于乙腈，所以实验中先用均匀取样就可以了。对于有结晶的样品，要将样品在一定量的水将蜂蜜溶解后，再用乙腈定容。具体溶解密闭的情况下，置于不超过60℃的水浴振荡器中温热，比例和实验现象见表1(实验室温度为10℃左右，样品量振荡，待样品完全溶解后将其搅拌均匀，迅速冷却到为2.5g左右)。室温取样。分取出100g作为试样。实验中发现水和乙腈本来互溶，但是按照上述操1.4.2样品处理作，用一定量水溶解蜂蜜，再用乙腈定容，当水的比准确称2.5g样品，精确到0.0001g，置于100ml烧例少于60%时，水和乙腈就发生分层现象。溶解度和杯中，加20ml水，玻璃棒不断搅拌使其溶解，转移到分子间的吸引力有关，低级醇能够和水混溶，就是由 2822008,Vol.29,No.06食品科学※分析检测表1溶剂选择性实验均匀不分层。Table1Experimentofsolventchoosen为了考察不同比例溶剂对糖类物质的溶解提取情水:乙腈(ml:ml)20:3025:2530:2040:1050:0况，在保证两相不分层的情况下，分别对不同比例的现象分层分层不分层不分层不分层溶剂提取后的样品进行了实验，每一种比例的样品重复三次实验，以平均值作为结果，实验结果见表2。于醇分子具有亲水基团——羟基。醇分子的羟基和水分子中的氢氧键一样也是高度极化的，水分子之间能够形表2溶剂提取效果成氢键结合，醇分子和醇分子之间也能形成氢键，这Table2Extractionefficiencyofcarbohydratebydifferentsolventsforhoney样就使醇有可能在水分子间取得位置，其结合方式如式水:乙腈%(V/V)1所示。蜂蜜的主要成分为果糖和葡萄糖，这两种糖均糖含量(%)60:4080:20100:0为含有5个羟基的醛和酮，也就是说每个糖分子都有5果糖35.235.435.9个这样和水可以形成氢键的基团，所以蜂蜜易溶于水。葡萄糖32.832.932.2水和乙腈能够相溶，主要是水分子和乙腈的CN-结合形蔗糖1.41.21.4麦芽糖1.61.41.5成氢键，但由于CN-和水分子的结合程度没有羟基和水分子结合的程度高，所以当乙腈、糖和水分子共存时，从以上测试结果可以看出，三种提取液在提取效果水和糖的羟基优先结合形成氢键。当水相比较少时，水上没有明显差别，也就是说在取样量为2.5g的情况下，分子没有多余的基团和乙腈的CN－结合，就会产生分层60:40的水和乙腈已经将蜂蜜中的糖类全部提取出来了，现象。随着水的比例的增加，水中又有了多余的氢键为了和流动相保持相对一致性，同时也是为了对分析柱进和乙腈相结合，所以乙腈和水又达到了互溶的状态。当行保护，本实验中选用60:40的水和乙腈作为提取溶剂。减少样品量到1g左右时，即使用20.0ml水溶解后，乙考虑到甲醇的价格远低于乙腈，所以也尝试用不同腈定容也不发生分层现象，这也说明了上述溶解结合的比例的甲醇和水作溶剂溶解蜂蜜，实验发现以60:40的原理。甲醇:水作溶剂也能很好的溶解蜂蜜，测试结果和用同比由于醇的溶解度受温度影响较大，所以蜂蜜的溶解例的乙腈和水溶解的样品的测试结果无明显差别，但由和提取效果受温度影响也较明显，当环境温度为20℃以于甲醇的折光指数低于乙腈，所以测试谱图上有一个很上时，即使用水:乙腈为20ml:30ml来溶解也不会发生分大的甲醇负峰。关于用甲醇和水作流动相能否用于蜂蜜层现象。但考虑到实验室环境温度在冬季偏低，以及中糖的测定，还需进一步研究。检测方法的广泛适用性，实验中选用60:40的水和乙腈考虑到提取效果、对分析柱的保护以及溶剂和流动作为提取溶剂，能够在4℃以上的实验环境中保证样品相在组成和配比方面的相对一致性，本实验采用水:乙腈的溶解和提取效果。(60:40)作溶剂来溶解样品。2.1.4样品稳定性实验RRRR用水:乙腈(60:40)制备好样品，实验考察了样品放置OOOO时间对测试结果的影响。将处理好的样品每隔1h进行HHHHHHHH测试，并将不同时间段的测试结果进行对比，发现测OOOO试结果至少在24h内无明显差异。这说明用该方法处理HHHH样品，稳定性较好。R为C6H10O5，结构式代表了果糖和葡萄糖的一个羟基和水分子结合的推测机理。2.1.5色谱条件的选择碳水化合物分析柱最适宜的流动相为60%～75%乙图1糖类和水分子结合机理Fig.1Combinationmechanismbetweencarbohydrateandwater腈和水配比作流动相，从文献中查得一般做蜂蜜中的糖分析也均采用乙腈和水作流动相，所以以不同配比的乙对水含量较少而分层的样品进行分析，下层主要为腈和水做流动相进行上机实验，虽然增加水的比例有利水层，上层主要为乙腈层，分别对上下层进行上机试于快速出峰，增加检测效率，但会影响果糖和葡萄糖验，发现水层中溶解糖的含量占了总含糖量的85%以的分离度。实验发现乙腈和水的比例在70:30到80:20之上，乙腈虽然不能溶解蜂蜜，但和水混合后，乙腈层间都能满足要求，分离速度和分离效果差别不是很大，中也溶解了约15%左右的糖，这说明每层的含量都不能本实验流动相采用乙腈和水的比例为75:25。图2为样品代表蜂蜜中糖类的真实含量，实验中必须保证提取溶剂的分析谱图。 ※分析检测食品科学2008,Vol.29,No.06283高，精密度好，能够很好地满足实际样品的测定。4000002.4蜂蜜样品的分析检测果糖实验采用本研究的方法，对8种实际样品进行测300000葡萄糖试，结果见表5。分析数据表明，一般天然蜂蜜样品nRIU200000中果糖和葡萄糖的含量均在30%～40%之间，而蔗糖和蔗糖麦芽糖麦芽糖含量很少，一般在3%以下。1000000表5蜂蜜样品中糖含量测定结果051015Table5Testresultsofsugarinhoneysamples时间(min)样品编号果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麦芽糖(%)图2蜂蜜样品中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的测试谱图槐花蜂蜜132.431.22.20.8Fig.2Typicalchromatogramoffructose,glucose,sucroseand槐花蜂蜜231.830.42.30.9maltosesamplecontainingonselectedconditions枇杷蜂蜜33.831.90.51.2枸杞蜂蜜34.232.40.80.5杂花蜜131.030.20.20.82.2校正曲线和最低检出限杂花蜜233.131.80.80.2将果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的标准贮备液用杂花蜜335.234.81.20.3杂花蜜434.633.21.80.6乙腈:水(60:40)的溶剂稀释配制成其系列标准溶液，获得四种糖(n=4)的标准曲线和回归方程如表3所示。当信噪比(S/N)为3时，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的检出3结论限分别为0.5、0.5、0.25、0.25mg/ml(表3)。本实验详细探讨了反相高效液相色谱示差折光检测表3果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的线性回归方程和检出限法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的前处Table3Linearregressionequationanddetectionlimitforsugar理方法。研究表明，该前处理方法简便快速，重现inhoney性较好，回收率高，为测定蜂蜜中的4种糖分奠定了组分线性回归方程(n=4)相关系数(r)检出限(mg/ml)基础。果糖A=1243823.36C+50620.7680.999570.5葡萄糖A=1033856.31C+6047.060.999040.5参考文献：蔗糖A=1338819.75C+10852.060.999140.25麦芽糖A=1240620C+256.40.994090.25[1]GB18796－2005蜂蜜[S].[2]SN/T0852－2000出口蜂蜜检验方法[S].2.3方法的精密度和回收率实验[3]AOAC编译委员会.公定分析方法[M].15版.国家出入境检验检疫局,译.北京:科学出版社,1991.在上述前处理和色谱条件下，分别在蜂蜜的测试样[4]GB/T18932.22－2003蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含品中添加标样，进行添加回收率和精密度实验，其测量的测定方法——液相色谱示差折光检测法[S].试回收率均在97.3%～102.8%之间。按标准方法平行测[5]崔鹤,李戈登.离子色谱脉冲安培法测定蜂蜜中的葡萄糖、果糖、定5次，其相对标准偏在0.8%～1.6%之间，测定结果蔗糖[J].化学分析计量,2001(1):25-26.如表4所示。结果表明本法测定准确，加标回收效率[6]王荔,陈巧珍,宋国新,等.高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定烤烟中的水溶性葡萄糖、果糖和蔗糖[J].色谱,2006,24(2):表4蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的和麦芽糖的测定方法的添加回收201-204.率和精密度实验(n=5)[7]YOUNGCS.用HPLC和蒸发光散射检测对糖类分析的方法学[J].Table4Spikedrecoveryandpreciseofdeterminationof国外分析仪器,2002(2):26-29.carbohydratesinhoney(n=5)[8]饶震红,李民赞,吉海彦.短波近红外光谱法同时定量分析水溶液原有量加入量测定总量回收率相对标准偏差中葡萄糖、果糖和蔗糖[J].光谱学与光谱分析,2006,26(4):633-待测组分(mg/ml)(mg/ml)(mg/ml)(%)(%)635.果糖19.820.039.098.00.8[9]单瑞峰.毛细管电泳电化学检测法测定南瓜中糖类物质[J].山东化葡萄糖18.620.037.998.21.4工,2006,35(2):33-35.蔗糖0.755.86102.81.3[10]孙兰,黎淑端,聂木海,等.一起食品中还原糖测定结果异常的原因麦芽糖0.090.500.57497.31.6分析[J].中国卫生检验杂志,2005,15(9):1137.