寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 40页

摘要利用自制微孢子虫(Nosemaapis)悬液(5．5X107个孢予／毫升)与50％的白糖水1：1混合，以每次20毫升剂量对幼年健康意蜂L印打mellifera)进行感染，每日一次，连续21次，制作动态病理模型。从感染郎日起，每日取血浆样品一份，共收集血淋巴样品30份。采用考马斯亮蓝法(Brodfordmethod)，测定蜜蜂血浆蛋白总量：另分别随机抓取一定数量的患病蜜蜂及健康蜜蜂，利用血球计数法比较它们血淋巴中血细胞数量的差异。结果显示：病蜂血浆蛋白总量，在感染后l～10天呈上升趋势，然后逐渐下降，13～30天保持在感染前蜜蜂血浆总蛋白水平以下；同时患病蜜蜂的血淋巴中血细胞平均数量大大高于正常蜜蜂。这说明蜜蜂对于微孢子虫的侵染有一定的免疫防御能力，同时，微孢子虫的长期寄生造成蜜蜂血浆蛋白明显下降。自然感染大蜂螨(Varroa)的青年意大利工蜂(Apismellifera)和健康对照组，采用考马斯亮蓝法(Brodfordmethod)法，测定其血淋巴蛋白质总量，并用高压等电点聚焦法进行血淋巴蛋白质分类。其结果表明，螨害组血淋巴蛋白质平均含量为19．25毫克／毫升，健康对照组为10．2毫克／毫升。螨害组与健康组血淋巴蛋白质含量差异极显著；高压等电点聚焦分析结果表明，自然感染大蜂螨后，成蜂血淋巴蛋白质组分与健康对照组相比较发生了明显的改变。关键词：寄生虫，蜜蜂，血细胞，血淋巴蛋白 AbstractTheboneybeeworker’ShemolymphproteinwasinvesfigagedinthesituationofNosemaapisinfectionorVarroadestructorinfection．NewlyemergedworkerhoneybeeswerefedNosemasporesfor21daysrunning-Thehemolymphofworkerhoneybeewascollectedeverydayfor30dayrunningstartingfrom3dayspriortofeedingNosemasporestillthe27thdayaRerfeeding．TheconcentrationofhemolymphproteinwasdetectedusingBradfrodmethed．Theresultsshowedthattheconcentrationofhemolymphproteintendedtoriseprogressivelywithin10daysafterbeingfedNosemasporesandthendecreasedgradually．ThehemolymphofnaturallyinfectedVarroadestructerworkerhoneybeesaswellashealthbeeswerecollectedandcompared．TheconcentrationofhemolymphproteinWasdetectedalsobyBradfrodmethed·Thenthecomponentdifferenceofhemolymphproteinbetweentestgroupandcontrolgroupwereanalyzedusinghi曲voltageisoelec仃icfocusingelectrophoresis0EF)metheod．TheresultsshowedthattheconcentrationofhemoiymphproteinintestgroupWassignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup-AndthereWassignificantdifferenceinthecomponentofhemolymphproteinbetweentwogroupThepresentdataindicatedthatworkerhoneybeescoulddeveloparesistancetoNosemaapisorVarroadestructorafarbeinginfectedbythem．Keywords：parasite，honeybee，Haemocytes，hemolymphprotein 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：五功4年∥月坤日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：形孤时间：切乒年／月肿日铷躲弓凝烫荔帆。2蟛年石脚日了 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第一章绪论对所有生物而言，当患病或受伤时维持其机体的平衡非常关键。在维持机体健康的生理机制中，神经、内分泌及免疫系统则起着至关重要的作用。动物借助于自身的免疫系统来抵御外源生物的侵入。虽然昆虫没有脊椎动物那么复杂的免疫系统，但它们也发展出了另外一种防御机制能很好地保护自己不被侵害。其免疫系统也是多种子系统相互联合以共同抵御病原物的入侵。目前一般认为昆虫的防御体系主要由两部分构成，即物理防护屏障(例如表皮、中肠壁及气管壁)和有生理活性的杀菌物质如溶菌酶、苯酚氧化酶等参加的细胞免疫反应，例如吞噬[Bang1975]及包被[Poinar等1968：Ratcliffe等1979；Salt1970]作用等。还有一些免疫蛋白及多肽在正常的血淋巴中不存在或含量极低[Boman等1981：Boman等1987]，通过诱导可被大量合成而起到抑菌作用。一、物理防护屏障昆虫包裹中肠内容物的营养膜、中肠壁、表皮及气管壁组成了一道机械及物理屏障以保护其免受各种病原微生物、杀虫剂及其它各种物理及化学伤害的侵扰。所有昆虫的这种屏障均没有特异性。而蜜蜂则在此基础上更为进化，例如细胞表面缺少一些特征的病毒受体及有利于病原侵入的代谢产物。例如，蜜蜂对能侵染蚕的Bacillusthurfngiensfs,Baaccvarlabasslan8以及Eosemabombycfs具有高抗性[GLINSKI，z等1998]。昆虫的抗性会随着其不同的发育阶段而变化。蜜蜂的幼虫对幼虫芽孢杆菌(Bacillmrlarvae蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原)[Bailey1965：Woodrow1942]、蜂房蜜蜂球菌(MelissococausPluton蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原)及、蜜蜂囊状病毒(SBV)[BAILEY．L1963；SMITH，KM1976]敏感，而成年蜂则只会被病毒(chronicparalysisvirusCPV)侵袭患麻痹病。研究人员经过调查不同日龄幼蜂对气管壁虱(AcarapiswoodiRennie)[Lee1963]的抗性不同，这说明新出房蜜蜂(小于10天)气管系统的物理防护屏障决定着蜜蜂对这种壁虱的敏感程度。1、表皮昆虫的表皮具有皮肤、骨骼及食物的储备的功能，并且对水、离子、化学物质、杀虫剂及病原物形成一道天然屏障[barr等19753。表皮坚硬则会减少因磨损产生伤口而造成微生物侵入的机率。附着于蜜蜂表面的细菌、菌丝体及真菌孢子等会随着外表皮的蜕皮而被从身体上清除[Burnside1928]。在表皮中还有一些具有杀菌活性的物质，包括有酶、蜡质及不饱和脂肪酸等[Glinski等1988]，它们充满了整个表皮内部及表面。但如果某种微生物可以合成几丁质酶(一 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究种专门攻击表皮几丁质的酶)，则有可能穿透表皮，同时一旦表皮被穿透，其它一些微生物(尽管不能产生几丁质酶)也会由这一伤口进入昆虫体内。[Gilliam等1973：Glinski等1990]2、中肠中肠是病毒、细菌、真菌及多数原生动物侵入昆虫身体的主要途径。微生物侵入中肠的能力取决于微生物自身的特性及造成能提高中肠渗透性的物理及化学磨损的因素。前肠与后肠的几丁质衬底作为一种物理屏障能有效防御微生物的侵入。除此以外，中肠中的系列生化环境也能起到有效抵御外源微生物特别是细菌的侵入，这些生化条件包括有消化酶、pH值等[Barr等1975]。在贮存的蜜蜂花粉等蜂粮中也有具有抗菌活性，主要是由于其中的酸性物质、渗透压及大量过氧化氢的产生与不断积累。由于蜂蜜的pH值一般介于3．2～4．5，这种酸性环境可对许多种细菌的生长与繁殖产生抑制[Gochnauer1979]。蜂蜜是一种具有高渗透压的介质，这种渗透压可杀死许多活细胞。由葡萄糖氧化酶产生的过氧化氢是成熟蜂蜜主要的抗菌物质，这种葡萄糖氧化酶来源于工蜂咽下腺的分泌。3、围食膜由于中肠的上皮细胞没有几丁质外壳覆盖，因此极易被机械磨损并侵入微生物。然而蜜蜂同其它昆虫一样，其中肠的上皮细胞并不直接与食物接触，而是有一层黏稠的胶状物质将食物包裹起来，这种物质称为围食膜(PM)。这层围食膜可以起到保护中肠上皮细胞免受机械的磨损。围食膜由中肠上皮细胞的分沁物形成，覆盖于整个中肠。蜜蜂围食膜的层数由幼蜂的三层可增加到成年蜂的20或更多层。一旦围食膜破损则细菌、病毒[Tinsley1975]、真菌等微生物会很容易地侵入中肠上皮细胞。4、中肠壁上皮组织及肌肉层在一定程度上也能阻止微生物由肠腔进入血淋巴。中肠上皮细胞膜上的电荷可阻止带有相同电荷的微生物的附着。覆盖子上皮组织上的粘膜层可以病原物丧失活动性。上皮细胞会不断的更新以替换被瘸原物(例如孢子虫)侵袭而遭受损害的细胞。[Paschke等1975：Tinsley1975]中肠细胞对病毒的敏感性取决于细胞膜表面所存在的特殊受体。其它影响病毒侵染的因素还有释放入肠腔中的一些干扰素或抑制物。2 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究5、气管系统气管本身的结构可以对吸入空气中的病原物起到一定的物理屏障作用。在气管系统中相对较低的湿度及缺乏细菌生长的营养物质的条件可在一定程度上对病原物的侵入起到一定的抑制作用。当气管系统中出现伤口，其快速有效的愈台机制及血淋巴在伤口处沉积黑色素时产生的醌类化合物均可起到抵御外界生物入侵的功效。尽管如此，气管系统也是一些细菌入侵的途径之一，例如一种壁虱专门寄生于蜜蜂的气管系统中[Burnside1928]，当蜜蜂为幼蜂时(小于9日龄)对其较为敏感，而随着龄期加大，其对壁虱的抗性也迅速提高[Lee1963]。有些人认为这是由于随着蜂龄加大，其气孔周围的毛逐渐变硬，从而，在一定程度上阻碍了壁虱进入气管内部。也有观点认为随着蜂龄的变大。其气管壁逐渐变硬，不利于寄生螨吸食寄生的血淋巴。二、免疫应答当昆虫的第一道屏障因磨损、受伤等原因出现伤口时，外源微生物很容易就会进入昆虫的体内。这时，昆虫体内免疫系统会立即产生免疫应答，在迅速阻塞伤口，阻挡外源物侵入的同时在体内大量合成或释放抗菌因子以杀死侵入的外源微生物。在免疫系统中，一个最首要的特征是能够分辨出哪些物质是异源物。识别自身与外源物是昆虫消灭病原物细胞或毒素并保持自身完整的关键。识别异源物是免疫应答的第一步[Casteels等1989；Glinski等1988：Mohrig1968]。由Lackie提出的昆虫血细胞识别外源微粒的二步(two—tiered)理论已被广泛认可[Lackie1981]。这一理论认为对非生命物质的识别是通过对该物体表面物理及化学特征的检测来完成的，主要是表面电荷。对有生命物质(例如细菌)则是通过对其表面存在的特征细胞受体。也有人认为在蜜蜂体内凝集素[Anderson1975；Lackie1981]和苯酚氧化酶系统也参于到对外源物质的识别过程中。黑色素(产生于昆虫血液中)在外源物表面的沉积有可能是一种标记和细胞及体液防御反应的开始[Ashida等1980；Soderhall1982]。1、细胞防御反应昆虫血细胞通过吞噬、成瘤或包被等方式[Salt1970]可迅速降低循环系统中包括微生物在内的外源物的数量。血细胞同时也作用于血液凝块[Gregoire1974]和伤口阻止微生物通过伤口侵入身体[Bohn1986；Mohrig等1968：Harvey等1961]。细胞免疫应答由二方面因素决定，即循环系统中血细胞的数量和种类。通常，侵染会引发血细胞出现分化并向有化学刺激的部位移动[Bink1970]。例如，当蜜蜂血淋巴中侵染了一种假单 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋自的动态变化研究胞菌时．固生于其它组织上的血细胞会变成为可移动的进入血淋巴，同时形状由椭圆形变成了圆形。吞噬作用由一些特殊类型的血细胞(吞噬细胞)将外源物开口吞掉，这在所有包括从原生动物到哺乳动物的生物体内都非常普遍。这是所有昆虫血淋巴中消除外源物一个非常重要的手段[Bang1975]。以下是吞噬的几个步骤：化学吸引4识别l附着l吞咽l消化或吸收在吞噬作用的最后阶段，被吞噬的细菌在由溶酶体和吞噬体组成的聚合体中被消化。溶酶体释放出水解酶(主要包括溶菌酶、碱性磷酸脂酶、核糖核酸酶及磷脂酶)破坏细菌结构。在某些情况下被俘获的细菌在吞噬体中繁殖并释放出更多的细菌，结果造成致命的败血症。在昆虫体内噬菌作用的有效性大小依赖于细菌的种类、血淋巴中细菌的浓度及外源物的大小和形状[Brewer等1971]。当血淋巴中进入大量细菌时，吞噬作用将会变为成瘤方式[Ratcliffe等1983]。成瘤方式当血淋巴中细菌数量不多时，细胞防御体系所采用的方式是吞噬作用。而当血淋巴中细菌的数量多到一定程度时将会启动一种更为有效的防御机制——成瘤方式。简而言之，成瘤是吞噬与包被两者的结合。血细胞会大量聚集到被吞噬的细菌或被由血细胞生成的胞外基质所捕获的细菌群附近。有些情况下，这些细菌和血细胞的集合体会被一层致密的血细胞所包裹。形成的瘤状物将离开血液循环并附着于器官表面。瘤内通常会有黑色素沉积及杀灭细菌过程中所产生的醯[Ratcliffe等1985]。被包裹的细菌是否能够存活很大程度上取决于它们的毒性。一般情况下，腐生菌在黑色素大量沉积的瘤内会被迅速杀死，而某些致病菌会存活下来并最终从瘤内释放入血淋巴。4 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究包被当外源物直径大于lo微米，以至于单血细胞无法将其吞噬时会被包被起来。包被是指外源物被大量血细胞形成的囊状物包裹起来[Poinar等1968]。包被对象主要包括有寄生虫及虫卵、真菌菌丝体及孢子、细菌或原生动物团。引发包被作用的刺激可能是外源物的表面特征或寄生虫释放的物质(代谢物或排泄物)[Nappi1970]。包被作用需要粒细胞及浆细胞的参与，其中粒细胞可引发包被开始。粒细胞可释放化学因子以吸引浆细胞。首先大量血细胞组成囊膜，接着囊膜变形为仿锤形，内部有多层结构的薄膜。其细胞核退化或形成多核体。最后形成含有粘多糖的胶状物。在有黑色素沉积的细胞包被物中，由酪氮酸一酚氧化酶反应产生的黑色素多沉淀于囊内部的多层结构上。在没有黑色素沉积的细胞包被物中，包囊仅由血细胞构成而不含黑色沉积[Nappi1970；Poinar等1968]。造成被包被的寄生虫成虫或卵死亡的原因可能是窒息或是包囊内有毒废物的不断累积。包囊内黑色素产生的醌也可以对寄生虫产生毒害致死。卵会孵化不正常并发育受阻。当然，被包被的寄生虫也可能幸存并从包囊中逃脱。还有一种无需细胞参加的防御反应——体液包被。它主要通过大量复杂的蛋白或多肽沉积于外源物质袭面(主要是寄生虫及虫卵)形成包被。它是细胞防御反应的一种补充，多出现在血细胞数量不高的昆虫卵期[Ratcliffe等1979]。1血液凝块及伤口愈合由于腐生菌及致病微生物可以很容易从昆虫体表或体内的伤口进入血淋巴，因此血液凝块及伤口愈合对昆虫有效低于外来微生物的入侵意义非同寻常。血液凝块对于伤口愈合非常重要，凝块会迅速阻塞伤口减少微生物的进入。不仅如此，在吞噬、包被及成瘤过程中也是血细胞脱粒并释放出凝集物质才能包被在外源物的表面。当出现伤口时，大量的血细胞会聚集到伤口处并堵塞伤口。另有大量的血细胞移动至伤口处负责吞噬坏死组织、外源物质并将其消化。伤口处的血细胞可能会分化为类纤维细胞以参与伤口处的愈合[1ai-fook1968；1970]。从这可以看出。伤口可以产生诱导因素(受伤因子)从丽刺激血细胞向伤口处移动、加速血细胞的有丝分裂并使部分固生的血细胞成为可移动的细胞进入血淋巴[Harvey等1961]。这种刺激因子由受伤或病变的细胞或对外原物敏感的特殊类型的血细胞所释放。由于血液凝快块与伤口愈合能在蜜蜂受到侵染时有效保护自身．所以这两种机制也被归为细胞防御反应。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究2、昆虫血淋巴中的抗菌物质(体液免疫)血淋巴是细胞和免疫蛋白通过吞噬、包被、成瘤等方式保护蜜蜂免受细菌侵入或寄生的媒介。蜜蜂体内腐生菌或致病菌的死亡归因于蜜蜂血淋巴中溶菌酶与蜜蜂肽。与哺乳动物的血液相同，昆虫血淋巴由血细胞(haemoeytes)、血浆(血淋巴)组成[Mohrig1968]。除了糖和脂类。蛋白质是昆虫血浆中的主要组成物。一般而言，蛋白质在身体脂肪中合成并释放入血淋巴。蜜蜂的血淋巴同其它种类昆虫相类似，其中富含蛋白质与自由多肽，其中有一部分与免疫相关[Anderson等1972；Casteels等1989；Olafsen1986]。昆虫抗菌物质的诱导产生血淋巴的抗菌活性包括灭菌活性与抑菌活性两方面。这些具有抗菌活性的物质有些是脂肪体中部分特殊细胞合成的蛋白质；另外部分则是外源物质诱导引起的存储物质的释放。一般而言，病原物的侵染(或实验接种外源物质)或一些不造成感染的物理或化学的因素(例如超声波、射线、生理盐水等)均会诱导抗菌蛋白的合成及抗菌活性物质的加速分泌。屈贤铭等用超声波处理家蚕Bombyxmori、篦麻蚕(FhilosmMaCynthiaricina)或柞蚕(Antheraeapernyi)，或直接用大肠杆菌(Escherichiacoli)注射，均可诱导这些昆虫产生抗菌物质[屈贤铭等1984]。电泳的结果表明，同一种蚕蛹经不同诱导源处理后形成相同的抗菌物质，而不同种属被诱导产生的抗菌物质则有明显的差异。龚琪等用60CoY射线、活的大肠杆菌及热灭活的金黄葡萄球菌和生理盐水等做诱导物，诱导美洲大蠊(Periplanetaamericana)的结果表明，不同诱导源诱导产生的抗菌物质的活性大小有所不同，达到最大活性的时间亦不同。更重要的是，在抗菌特性上也有一些差异[龚琪等1993]。刘玉滨等用柞蚕和蓖麻蚕的蛹，棕色鳃角金龟(ttolotrichiatitanis)、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)和苹毛丽金龟(Proagoperthalucidula)的幼虫做试验，经小白鼠肝癌细胞、大肠杆菌或巨大芽孢杆菌分别诱导，均获得成功[女n玉滨等1992]。除此以外，在大头金蝇(Chrysomyiamegacephala)[王晓东等1991]、家蝇(』tuscadomestlca)[王远程等1992]、麻蝇(Sarco蜉hagaperegrina)[Matsuyama等1988a]、果蝇(Drosophilamelanogaster)[Kylsten，P等1990]、烟草天蛾(IIanducaSexta)[NAGY，LM1990]等昆虫上也都诱导出抗菌物质。由此说明，在外界的刺激下产生抗菌物质是昆虫一个普遍的特性，并非某一类昆虫所独有，但诱导源却可以有所不同。从诱导源的不转移性可以推测，在控制昆虫抗菌物质基因的表达上似乎是在接受了第一信使的刺激后，有一个共同的第二信使，由它把诱导源的刺激效应传递给细胞核内的染色体上，从而引起抗菌物质基因的激活、启动和表达[翟朝阳1996]。昆虫体内产生的抗菌物质多不具有明显的专一性并且会在几天后逐渐消失。在昆虫体内没有或极少有免疫记忆。虽然这类物质统称为抗菌蛋白／肽，但无论是从分子量大小，还是从有关蛋白质的其它特性(如等电点等)均存在一些差异。昆虫种类不同，其抗菌物质亦有所不同。根6 据对格兰氏阳性菌和阴性菌的抑制能力一般将昆虫的抗菌物质分为四类：一类仅对格兰氏阳性菌有抑制作用，一类仅对格兰氏阴性菌有抑制作用，第三类对格兰氏阳性菌及阴性菌均有抑制作用，对细菌的作用不是直接杀伤地为第四类。在自然状况下，往往昆虫经诱导后可以产生不止一类的抗菌物质，这就是昆虫对格兰氏阳性菌和阴性菌都具有一定的免疫能力。例如绿蝇经诱导产生的昆虫防御素[LAMBERT，5等1989]和双翅肽[DIMARCQ，J-U等1988]就分别对格兰氏阳性菌和隐性菌有抑制作用。正常血淋巴(即未出现免疫反应)的抗菌活性主要依赖于溶菌酶。溶菌酶作为一种杀细菌的酶，首先由Flemming在哺乳动物体内发现。Mohrig和Messner在他们的研究报告中表明大量的昆虫体内也存在有溶菌酶[MoHRIG，w等1968]。不同种类昆虫其溶菌酶的生物及生化特性均非常相近。溶菌酶是一种碱性蛋白质(basicprotein，分子量约为1．5X104)，在酸性环境下表现为热稳定，而在碱性环境中易变性。溶菌酶主要攻击格兰氏阳性菌，及个别格兰氏阴性菌，例如Escherichia00li的突变体。正常昆虫的血淋巴中包含有少量的溶菌酶，可在昆虫表皮受到磨损或受伤时起到一定的保护作用[Glinski等1992]。在昆虫体内溶菌酶由脂肪体合成并释放入血淋巴中。当昆虫的生理机能出现不正常时，其血淋巴中溶菌酶的活性与含量会显著提高。这种变化的诱导因素可以是病原物侵染、出现伤口或其它伤害，也可以是不利的环境条件[Gotz等1991：Mohrig等1968：Glinski等1993]。苯酚氧化酶系统苯酚氧化酶(单羟基氧化酶)在多数节肢动物体内都有发现[Soderhall1986]。这种酶最初在昆虫血液内仅是没有活性的前体，在黑色素中随着代谢而表现出活性。而黑色素的出现多伴随着细胞对伤口、微生物及寄生虫侵入的应答。当昆虫体内开始出现诸如识别外源物[Richards1978；Ratcliffem1984；Soderhall1982]、细胞包被[Poinar等1968]、体液包被[Gotz等1977]等免疫活动时。苯酚氧化酶(邻苯二酚氧化酶)会表现出活性，结果昆虫的表皮会变硬变暗[Woodrow1942；Ratcliffe等1984]。天蚕素(Cecropins)是昆虫中一类最主要的抗菌蛋白。由于其首次在天蚕蛾幼虫被发现，1因此被命名为天蚕素[张青文2000P121]。它们攻击格兰氏阴性细菌及部分格兰氏阳性菌，其中包括一些昆虫致病菌。天蚕素被认为可以攻击细菌细胞膜的脂类部分而形成微孔。尽管细胞膜总体上仍保持完整，但实际上内部已被溶菌酶彻底破坏了。天蚕素在昆虫体内主要是杀死在昆虫生活环境中大量存在的腐生细菌。昆虫的伤口极易被感染，尤其是在蛹期。多数情况下仅靠噬菌等作用无法应付大量细菌的侵入，这时昆虫就需要大量的溶菌酶及抗菌蛋白来加以补充。与此同时溶菌酶还可应付抗苗蛋白处理后所剩的一些残余碎片。7 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究体液免疫及蜜蜂肽当昆虫接触到有生命或无生命的诱导物时，抗菌多肽或蛋白的迅速合成是昆虫体液免疫系统[Casteels等1989：]的特征。这种免疫一般仅保持几天时间且多没有专一性，主要针对格兰氏阴性细菌。通常，免疫物会诱导脂肪体中特殊免疫mRNA的合成。对应在血淋巴中会出现几种免疫蛋白。蜜蜂营群居的社会昆虫，蜂群有大约50000只蜜蜂组成[张复兴等1998]，生活在一个相对拥挤，周围充满微生物的环境中，各种病原物随时威胁着蜜蜂个体的健康[周婷1999]，但蜜蜂防御系统研究的报道较少。1977年俄罗斯的古切娃·勒·思将细菌注入蜜蜂血淋巴，5小时后吸取血淋巴接种到肉汤平板上，培养发现蜜蜂致病的病原菌仍在繁殖，而非致病菌完全被消灭，而且这时蜜蜂血淋巴有吞噬现象，说明血淋巴内有防卫物质的产生；Casteels等1989、1990从蜜蜂血淋巴中先后分离了两类抗菌肽，定名为蜜蜂肽apidaecins；abaecinZ．G1inski(1995)发现细菌侵入蜜蜂体内后能诱导蜜蜂血淋巴内抗菌肽类和蛋白质增加。蜜蜂肽是一组有抗菌活性的多肽，这种多肽存在于蜜蜂幼虫末期及成虫期。在实验室检测中，这种杀菌活性物质可于蜜蜂接种活细胞(如Escherichiacoli)8小时后检测到。用墨汁或乳胶滴接种也可诱导蜜蜂肽的合成。三、本项研究目的及意义纵观文献，有关寄生虫侵袭引起的蜜蜂免疫机能以及国内昆虫免疫遗传学方面的工作均未见报道。在我国，蜜蜂徽孢子虫及蜂螨是危害养蜂业发展的两种最主要的病害，全国因它们所造成的损失可占到总损失的50％以上。每年蜂农为防治这两种疾病投入了大量的人力和财力。不仅如此，为防治这两种病害需要使用的包括抗生素在内的大量药物，严重污染了蜂产品，降低了蜂产品的质量。尤其随着这两年国内外对蜂产品中有毒物质残留的不断重视，这一问题日显突出。鉴于以上情况，我们利用1)蜜蜂微孢子虫Nosemaapis人工感染健康蜜蜂肋ismellifera测定发病前后蜜蜂血淋巴中血细胞数量的变化，并用Bradford法测定蜜蜂血浆蛋白总量，制作动态病理模型分析、比较感染孢子虫病前后蜜蜂血浆蛋白总量动态变化；2)用Bradford法测定健康和螨害蜜蜂和ismellifera的血淋巴蛋白总量，在此基础上，采用高压超薄层等电点聚焦的方法，分析健康和螨害蜜蜂的血淋巴蛋白组分的异同。本项研究力图揭示蜜蜂血淋巴中血细胞及血浆蛋白总量与这两种病害的关系，使蜜蜂防御系统的研究工作向前迈进一步，为寻求利用蜜蜂自身免疫系统防治病虫害，从而减少药物防治的新途径打下基础。8 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第二章实验部分第一部分患孢子虫病蜜蜂血细胞与正常蜜蜂差异比较1试剂与材料瑞氏染液配制方法：准确称取0．18克瑞氏染料研成细末后溶于60毫升甲醇溶液中，装瓶静置半月以上1％次甲基兰生理盐水血球稀释液本所饲养的健康意蜂群。血球计数板光学显微镜(10X40倍)自制蜜蜂微孢子虫悬浮液，浓度：5．5X107个孢子／毫升制作方法：①取患孢子虫病的成年蜜蜂若干只，体表用75％酒精消毒。②将蜜蜂研磨，加水稀释，纱布过滤。③将纱布上的沉淀再研磨，加水稀释，过滤，重复z～3次，收集滤液。④滤液3000转／分离心10分钟。⑤取沉淀，无菌水定容至100毫升，震荡混匀制成孢子虫悬浮液。⑥用滴管吸取孢子虫悬浮液滴入血球计数板置于光学显微镜(10X40倍)下计数，经换算后确定悬浮液稀释倍数。2实验方法2．1孢子虫感染浓度为5．5X107个孢子／毫升的孢子虫悬液与50％的白糖水1：1混合，以一次20毫升剂量饲喂实验蜂群．每日一次，直至蜂群出现典型症状。9 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究2．2取样①将患有孢子虫病典型症状的蜜蜂一20。C冷冻2～3分钟。②用剪刀剪去蜜蜂头后部(注意不要剪断食管)。③等l～2分钟血淋巴会自动涌出，用毛细管吸取4毫升，加入0．19毫升血球稀释液中，震荡混匀。。④取一滴滴入血球计数器，置于光学显微镜(10X40倍)下计数，计算血球数量并根据稀释倍数换算成每毫升数量。⑤每只蜜蜂采过血淋巴后均取出中肠，研磨并置于显微镜下观察以确定为孢子虫感染。2．3统计分别读取100只患有孢子虫病蜜蜂及50只正常蜜蜂每毫升血淋巴中血细胞的数量，比较其平均值是否具有显著差异。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第二部分患孢子虫病蜜蜂血淋巴蛋白含量动态变化1、试剂与材料考马斯亮兰染色液配制方法：①称取100毫克考马斯亮兰G-250溶于50毫升95％7,醇溶液中。②加入100毫升冰醋酸，用蒸馏水定容至l升，4℃保存。仪器：721分光光度计(上海产)蜂群：本所饲养健康意蜂群。自制蜜蜂微孢子虫悬浮液，浓度：5．5×107个孢子／毫升制作方法：①取患孢予虫痛的成年蜜蜂若干只，体表用75％酒精消毒。②将蜜蜂研磨，加水稀释，纱布过滤。③将纱布上的沉淀再研磨，加水稀释，过滤，重复2～3次，收集滤液。④滤液3000转／分离心10分钟。⑤取沉淀，无菌水定容至100毫升，震荡混匀制成孢子虫悬浮液。⑥用滴管吸取孢子虫悬浮液滴入血球计数板置于光学显微镜(i0×40倍)下计数，经换算后确定悬浮液稀释倍数。2、实验方法2．1孢子虫感染①浓度为5．5×107个孢子／毫升的孢子虫悬液与浓度为50％的白糖水I：1混合。②以一次20毫升剂量饲喂实验幼蜂群。每日一次，连喂z1次。对蜂群进行感染。2．2血淋巴蛋白总量测定采用考马斯亮蓝染色法2．2．1标准曲线的制作 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血湃已中血细胞及总蛋白的动态变化研究①准确吸取0、0．5、i．0、2．0、3．o、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0微升浓度为05毫克／毫升牛血清蛋白标准溶液分别置于Eppendof管中。②分别加入浓度为0．15摩尔／升的NaCl溶液至100微升。加入1毫升考马斯亮兰G250，震荡混匀，静置2分钟。③加样于1厘米光径的微量比色皿中，波长为595纳米，测定光吸收值(OD值)。④以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2．2．2收集蜜蜂血淋巴①将蜜蜂一20"C冷冻2～3分钟后，用剪刀剪去蜜蜂头后部，注意不要剪断食管。②等1～2分钟血淋巴会自动涌出，用毛细管吸取。收集血浆的同时，每天用光学显微镜运只检查被采血浆蜜蜂中肠感染情况。2．2．3采样方法t①蜜蜂感染前每日取一份该群健康蜜蜂血浆，连续3天。②从感染即日起，每日取血淋巴样品三份，每份约10～12只蜜蜂血淋巴之和，作为三个重复样。③将血淋巴加入一只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，防止血浆中苯酚氧化酶活化而使血淋巴黑化，离心除去血细胞。2．2．4测定血浆总蛋白测定采用考马斯亮蓝染色法①取血淋巴样品lO微升加入90微升浓度为0．15摩尔／升的NaCl溶液，成为稀释液。②取稀释液5微升，加入95微升浓度为0．15摩尔／升的NaCl溶液后加入1000微升染色液。③加样子1厘米光径的微量比色皿中，波长为595纳米，测定光吸收值(OD值>。④根据标准曲线。结合测得的光吸收值得到样品的血淋巴蛋白浓度。⑤根据稀释倍数及加样量计算出样品血淋巴蛋白的量。⑥每个数据为3个重复样的平均。 第三部分螨害蜜蜂血淋巴蛋白含量与正常蜜蜂的比较1、试剂与材料考马斯亮兰染色液配制方法：①称取100毫克考马斯亮兰6-250溶于50毫升95％7,醇溶液中。②加入100毫升冰醋酸，用蒸馏水定容至1升，47：保存。仪器：721分光光度计(上海产)蜂群：本所饲养健康意蜂群幼年工蜂一群：本所饲养严重感染螨害的蜂群一群。2、实验方法2．1标准曲线的制作①准确吸取0、0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．o微升浓度为0．5毫克／毫升牛血清蛋白标准溶液分别置于Eppendof管中。②分别加入浓度为0．15摩尔／升的NaCl溶液至100微升。加入l毫升考马斯亮兰G250，震荡混匀，静置2分钟。③加样于lcm光径的微量比色杯中，波长为595纳米，测定光吸收值(0D值)。④以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2，2正常蜜蜂血淋巴采集①选择本所饲养健康意蜂群幼龄工蜂，采取其血淋巴120～150只。②每约10～12只为一样品，加入一只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，防止血淋巴中酚氧化酶活化而使血淋巴黑化。③共收集血样12份，一20"C冰箱保存备用。2．3被螨寄生的蜜蜂血淋巴采集①为了准确得到螨害蜂血淋巴，首先寻找蜂体上有1只以上雌螨的幼蜂，再进行采血。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究②共采集严重螨害幼蜂120～150只，每约i0～12只为一样品，加入一只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，离心除去血细胞。③共收集血样12份，一20℃冰箱保存备用。④蜜蜂血淋巴蛋白总量测定完毕后，样品继续一20*(2保存，用于高压超薄层等电点聚焦分析。2．4测定血浆总蛋白测定采用考马斯亮蓝染色法①取血淋巴样品10微升加入90微升浓度为0．15摩尔／升的NaCl溶液，成为稀释液。②取稀释液5微升，加入95微升浓度为0．15摩尔／升的NaCI溶液后加入1000微升染色液。_③加样于l厘米光径的微量比色皿中，波长为595纳米，测定光吸收值(OD值)。④根据标准曲线，结合测得的光吸收值得到样品的血淋巴蛋白浓度。⑤根据稀释倍数及加样量计算出样品血淋巴蛋白的量。⑥每个数据为3个重复样的平均。14 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第四部分螨害蜜蜂血淋巴蛋白组分与正常蜜蜂的比较l、试验设计：血淋巴蛋白分类采用高压超薄层等电点聚焦法2、实验原理：蛋白质是典型的两性电荆贡分子，所带电荷与{戳瘦pH值有直接关系。当溶液pH值{氐于某蛋白质等电点pI时，该蛋白质分子带正电荷，反之带负电荷。当蛋白质处于某—特定的pH条件时，蛋白质所带电荷为零，这—特定的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。在等电点时，蛋白质分子在电场中不发生移动。将蛋白质置于由两性电解质所建立起来的pH梯度体系中进行电泳，当样品处于pH值高于其等电点时，带负电荷，向阳极移动，而带正电荷的颗粒向阴极移动。当样品处于pH值为pI时，颗粒带静电荷为零，停止移动。样品逐步在相当于等电点pH的位置浓缩聚集，通过测定即可确定被测样品的等电点。若让含有多种等电点的不同蛋白质经过电聚焦，7刮门会分别在相当于自己pI值的pll位置聚焦，从而达到分离纯化的目的。3试剂与材料，仪器：LKBMULTIPHORIIElectrophoresisUnit(电泳仪)LKB2219MULTITEMPIIThermostaticCirculator(冷却设备)试剂：丙烯酰胺(Acry)甲叉双丙烯酰胺(Bis)四甲基乙二胺(TE壮D)16％甘油两性电解质①pH=4．5～4．9②pH=3．5～9．01％过硫酸铵(AP)启动剂考马斯亮兰G250、R25095％乙醇冰醋酸2％2一氯一2甲基硅烷(溶剂为三氯甲烷) 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血缅胞及总蛋白的动态变化研究1％Bind—siline(溶剂为三氯甲烷)4方法凝胶配置配方表(1)30％Bis-Acry液的配置①准确称取29克丙烯酰胺(Acry)及甲叉双丙烯酰胺(Bis)1克②加入蒸馏水50毫升充分溶解，过滤③定容至100毫升(2)固定液配制用蒸馏水将冰醋酸稀释至7％～15％(V／V)，备用。(4)染色液配置①分别称取考马斯亮兰G250与R250各0．5克②溶于40毫升95％乙醇中，过滤，收集滤液③滤液加入40毫升冰醋酸，并用蒸馏水定容至200毫升备用。(5)脱色液配置①吸取20毫升冰醋酸加于50毫升95％Z,醇中②用蒸馏水定容至200毫升备用16 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋自的动态变化研究电泳(1)玻璃板的处理将水平制胶模具中的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂用擦镜纸均匀涂布于玻璃板表面，室温放置干燥后用去离子水冲洗表面去掉水滴备用。(2)制胶将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上，膜两侧边缘放置隔片带(0．5～O．7毫米)，将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上，固定。凝胶液(丙烯酰胺一无离子水一载体两性电解质(6：4：1)经充分脱气处理后，加I％AP和四甲基乙二胺(TEMED)，混匀沿平扳一端灌入，勿使产生气泡，凝胶凝固后，去掉玻璃板待用。(3)预电泳将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央，4"C预冷30分钟。将电极条分别用阴、阳极电极液充分湿润，去掉多余电极液后，平行置于凝胶两端。电极垂直平置于电极条上，保持适当的压力。500伏预电泳2小时。(4)加样先将滤纸片(0．5×0．5厘米)排放在距阴极端2或3厘米处，分别取健康蜜蜂血淋巴的样品溶液及螨害蜜蜂血淋巴的样品溶液各4微升加在滤纸上。(5)电泳循环水温度：4"C电泳仪电压：2000伏电泳仪功率：25瓦，最后0．5小时功率加大至30瓦电泳时间为2．5～3．0小时。凝胶固定将凝胶板浸没于固定液中固定0．5～l小时凝胶染色将凝胶板浸没于染色液中染色20分钟凝胶脱色将凝胶板浸没于脱色液中过夜17 中国农业科学院硬士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第三章结果1．患孢子虫病蜜蜂血淋巴中血细胞与正常蜜蜂的差别80005000删糕星4000弱2000O图1患孢子虫蜜蜂与正常蜜蜂血淋巴中血细胞数量差异比较病蜜蜂健康蜜蜂血淋巴中血细胞数量平均为2663个／毫升，患孢子虫蜜蜂血淋巴中血细胞数量为5891个／毫升。经统计学分析差异极显著(详细统计结果见附录)。2．患孢子虫病蜜蜂血淋巴总蛋白动态病理模型40蕞巡30担瑚V删缸皿咖20100510152025天数30图2感染孢子虫病前后蜜蜂血浆蛋白的动态图中1～3为感染前蜜蜂血浆蛋白含量，4～30为感染后蜜蜂血浆蛋白含量。感染前蜜蜂血浆18 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究总蛋白含量为21毫克／毫升、24．5毫克／毫升和2l毫克／毫升；感染后的蜜蜂血浆总蛋白在l～10天范围内呈上升趋势，到第10天达34．5毫克／毫升；然后，逐渐下降，第13～30天保持在低于感染前蜜蜂血浆总蛋白水平以下，平均为13．2毫克／毫升。3．螨害蜜蜂血淋巴蛋白含量及组分改变研究31血淋巴蛋白总量测定结果：表2健康蜜蜂与患螨害蜜蜂血淋巴总蛋白含量比较35蠢30杂25鬯20絮15-!Z10爨5鲁0样品编号图3螨虫为害后蜜蜂血浆蛋白的含量圈4螨虫为害后蜜蜂血浆蛋白的含量19一■2一0．一_ 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究健康蜂血浆蛋白含量平均为10．2毫克／毫升，螨害组蜜蜂血浆蛋白含量平均为19．25毫克／毫升。经统计学分析两者差异极显著(详细分析结果见附录)。3．2血淋巴蛋白分类结果：图5血淋巴聋白分类结果图5中l～4为对照组血淋巴蛋白分类，5～8为螨害组蜜蜂血淋巴蛋白分类。从高压等电点聚焦结果来看：A、13两条泳带位置上实验组与对照组差异不大；C泳带位置上实验组有一条清晰的带，对照组相应部位的这条带很不清楚：同时可以发现，在D泳带部分，对照组有一条较清晰的带，而在实验组是皱失的。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究第四章讨论一、孢子虫人工感染实验所用实验蜂群，以及螨害实验的对照蜂群，均为我所养蜂系饲养的意大利蜂群。经春繁，夏季采集观察，蜂群表现正常。试验开始前光学显微镜检查，未见孢子虫等原虫病，蜂群检查未见包括大蜂螨在内的其它病虫害发生。以此蜂群作为试验和健康对照组用蜂，保证实验数据的可靠性。二、其它昆虫关于防御系统的报道，多以细菌、病毒作为试验材料，用寄生虫的比较少。我们的研究表明：与感染细菌、病毒或昆虫的表皮损伤相同，寄生虫或原虫感染同样可以引起蜜蜂的防御反应，主要表现是：患孢子虫病蜜蜂的血细胞数量显著高于正常蜜蜂：血淋巴蛋白在人工感染孢子虫后的5～10天范围内明显增高；螨害组血淋巴蛋白质含量与对照组差异极显著，螨害组血淋巴蛋白明显增高。在寄生虫或微生物侵入的情况下，蜜蜂的血淋巴蛋白表现明显增加，大量研究表明，诱导产生的具有免疫作用的肤类和蛋白质与诱导物之间不存在特异关系，但对诱导物有抑制和杀伤作用。笔者认为，昆虫特有的体液免疫反应也是适者生存的结果。与脊椎动物相比，昆虫寿命很短，所以生成广谱抗苗蛋白，更有利于昆虫在短短的几十天生活期中，发展起有效的体液免疫系统，防御外来病原微生物的侵袭。三、本次试验中患孢子虫蜜蜂及正常蜜蜂的血细胞数量均低于资料中的数据。分析原因有两个，一是蜜蜂的血淋巴中血细胞数量变化幅度较大，不同季节、不同日龄的蜜蜂血细胞数量也不同。二是由于蜜蜂血淋巴中的血细胞共有7种，它们的大小及形状均各不栩同。本次试验在计数的过程中仅计算了其中形状及大小基本相同的一类或几类血细胞，应此数值低于资料中的数据。由于此次试验健康蜜蜂与病蜂的日龄基本相同且计数标准一致，因此不影响最后结果的得出。四、收集蜜蜂血淋巴技术，我们开始采用的是D．P．Abrol提供的方法：蜜蜂低温冷冻5分钟，并固定在蜡盘上。在其腹部第5～6体节之间打一个洞，用毛细管吸取血淋巴。我们发现这种方法有一个很大的缺点就是：血淋巴容易被粪便、花粉和蜜囊里的蜜污染。因此，后来我们改进为将蜜蜂一20X3冷冻2～3分钟后，用剪刀剪去蜜蜂头后都。注意不要剪断食管。等1～2分钟血淋巴会自动涌出，用毛细管吸取。这种方法简便易行，不易被污染。此外冷冻严格来说对蜜蜂也是一种刺激，在对寒冷的应激过程中，醑酶同工酶含量就可能增加或增强活性。但本实验主要是比较处理与对照的差异性，所以只要两种都进行了同样的处理，上述影响应可认为不影响最终试验结果。五、在关于蜜蜂防御系统的研究中，第23届国际养蜂大会资料曾报道，患孢子虫病意蜂血2l 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究淋巴蛋白质从试验的第3天开始，至实验结束的第12天一直表现减少的过程。但有一点值得注意的是，该试验所用蜜蜂是自然感染孢子虫的病蜂，而且已过了潜伏期，所以血淋巴总蛋白增高的阶段可能未包括在内。六、感染前微孢子虫前，蜜蜂血浆总蛋白含量为21毫克／毫升、24．5毫克／毫升和2l毫克／毫升；感染后病蜂血浆总蛋白在l～10天范围内呈上升趋势，到第lO天达34．5毫克／毫升；然后，逐渐下降，第13～30天保持在低于感染前蜜蜂血浆总蛋白水平以下，平均为13．2毫克／毫升。试验结果提示，蜜蜂对孢予虫的侵袭有一定的抵御能力，主要表现在，感染后的10天内蜜蜂血浆蛋白呈明显上升的趋势。随着病程的发展，感染孢子虫的蜜蜂血浆蛋白含量逐渐下降，这一结果与第23届国际养蜂大会资料曾报道相同：患孢子虫病意蜂血淋巴蛋白质从感染后的第3天开始，至实验结束的第12天一直表现减少的过程。孢子虫是一种寄生于中肠上皮细胞内的原虫。由于这种原虫的寄生引起中肠上皮细胞破坏、脱落，肠壁溃烂。因此，这时机体对蛋白质的吸收减少，血淋巴蛋白质含量下降，是常见的病理过程。而大蜂螨是一种外寄生虫，它寄生于成蜂体表，吸食蜜蜂血淋巴。因此笔者认为它对蜜蜂的损害是渐进的，在对机体损害的同时，蜜蜂也表现出较强的防卫能力。与其它昆虫相同，表现为血淋巴内与免疫有关的蛋白质、肽类增加。七、高压等电聚焦技术的原理是利用具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，使分辨率大大提高，是一种灵敏度和分辨率都很高的电泳技术。从高压等电点聚焦结果来看，A、B两条泳带位置上实验组与对照组差异不大：C泳带位置上实验组有一条清晰的带，对照组相应部位的这条带很不清楚；这种实验组增高的一致性，可以认为与蜜蜂防卫功能有关：同时可以发现，在D泳带部分，对照组有一条较清晰的带，而在实验组是缺失的。考虑可能有以下几种原因：1．螨侵袭蜜蜂后，蜜蜂除表现较强的防卫功能外，由于螨对血淋巴的吸食，会使蜜蜂正常血淋巴中的某些蛋白质组分降低。2．可能是蜜蜂血淋巴中本身具有抗菌蛋白的前体．这种前体本身不具有抗菌活性，但当出现瘾原物或受外界诱导时，这种前体蛋白会在结构或组分上发生变化而转化成为具有抗菌活性的抗菌蛋白／肽，随着这种转化蛋白质的等电点等性质会发生变化，结果出现在D处蛋白质的缺失。3．从电泳照片看，在电泳过程中样品有拖尾和扩散的现象，有可自＆蛹害组D处的蛋白因此而表现得较为不明显。由于经费及实验条件所限，未对以上结果作包括蛋白质定性等进一步的分析，和进行血淋巴的抗菌实验，这些有待于今后进一步的工作。八、蜜蜂的血细胞作为蜜蜂细胞防御体系的重要组成，对病原物的侵入异常敏感。从本次孢子虫感染的实验发现，一旦孢子虫由中肠上皮细胞侵入，蜜蜂血淋巴中的血细胞数量会立即增高，其中大部分是固生的血细胞经侵染的诱导而出现分化变为可移动的血细胞进入血淋巴循环并向 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究有化学刺激的部位移动。而血细胞数量的增加也与其参与防御反应的方式有关：在血细胞对孢子虫的吞噬、成瘤或包被作用中均需要大量的血细胞参与。血细胞作为昆虫的防御手段之一，它不能像其它抗菌物质那样能直接杀死病原物，而是将病原体包裹起来已达到使其失去致病活性的功效。被包裹的病原物在内部则是因其它抗菌物质(例如溶菌酶)的作用或最终营养物质的匮乏而致死。由于蜜蜂的生活环境温暖而潮湿，周围遍布大量病菌，而病原物的侵入多伴随着伤口的产生，大量的血细胞还能迅速集中于伤口周围以阻塞伤口，从而能进一步降低外界病原物的继续侵入，这一点对蜜蜂至关重要，尤其像寄生螨，其口器的刺入必然会导致大量的病原物通过伤口一起进入，这时血细胞对伤口的阻塞作用则能有效防止一些并发性感染的产生。九、正常的蜜蜂血淋巴中一般情况下没有或仅有少量的抗菌蛋白，而当有病原物侵入获外界刺激时机体会大量合成并释放入血淋巴中参与防御反应。在本次试验中也正验证了这一点，在感染前后蜜蜂血淋巴蛋白电泳图中A、B两个蛋白条带均无明显变化，说明这两组蛋白与病原物的刺激无关，很可能并不参与蜜蜂机体的防御反应。而C与D两个蛋白条带变化明显，说明这两个条带的蛋白质与病原物的侵入有较大的相关性。其中c条带区域在正常蜜蜂总中没有出现明显的蛋白条带，说明这一组蛋白质是病原物侵入蜜蜂后诱导机体合成的一种血淋巴蛋白，结合其它昆虫抗菌蛋白的诱导试验，推测这一蛋白可能就是参与蜜蜂病原免疫的抗菌蛋白。而在D区域则情况正好相反，从电泳图分析是感染后造成了某一种血淋巴蛋白组分的减少或缺失。造成这一结果的原因可能有两种：一种可能的原因是由于螨的寄生造成蜜蜂机体中某种蛋白的台成水平降低。另一种原因可能是蜜蜂血淋巴中本身具有抗菌蛋白的前体，这种前体本身不具有抗菌活性，但当出现病原物或受外界诱导时，这种前体蛋白会转化成为具有抗菌活性的抗菌蛋白／肽，随着这种转化的产生，可能会出现这种前体蛋白在血淋巴中含量的降低。这一点还有待于进一步的证实。展望蜜蜂孢子虫是影响蜜蜂蜂群正常发展的一个重要寄生虫病害，每年全国各地蜂群发生的爬蜂病中有很大一部分是由孢子虫直接引起的。孢子虫通过饲料或饮水进入蜜蜂的消化系统，在寄主的中肠细胞中大量繁殖，造成寄生中肠上皮细胞大量死亡脱落而破坏了其正常的消化系统。最终蜜蜂因食物营养无法吸收、废物难于排泄而表现出腹胀、虚弱无力、爬蜂并最终死亡。尤其在每年春繁季节，由于春繁饲料消毒不彻底，再加上经过长时间的越冬蜜蜂抵抗力相对较弱，所以常常出现孢子虫病的大面积暴发，给生产带来巨大的损失。在以往的防治研究中，我们常常将更多的注意力放在了化学药物与痛原之间而忽略了寄主本身因千百万年进化而获得的免疫能力。其结果虽然在杀死病原，保护寄主健康上取得了一定的成果，但也付出了蜂产品中有害物质残留增多，产品质量下降的代价。尤其随着近几年人民生活水平的提高，因防治病虫害带来的蜂产品质量问 题更显突出。多年来，在研究经济昆虫的保护与利用上，昆虫抗菌蛋白／肽已逐渐成为了一个热点，希望通过对它的深入研究能够进一步揭示出昆虫自身防御的一些机理，并在此基础上能够对其加以人工诱导或合成，从而达到减少化学药物及抗生素在病虫害防治中的应用。具体到蜜蜂也是这样，通过对感染孢子虫的蜜蜂血淋巴中血细胞及血淋巴蛋白的研究说明蜜蜂本身对孢子虫有相15强的防御反应，这对将来减少化学药物防治带来了可能，我们将来完全可以通过诱导手段使蜜蜂提前产生较高的免疫水平从而增强其抗病性，或者直接合成器抗菌蛋白／肽用于蜜蜂孢子虫的防治过程中。所有这一切都将为降低蜂产品中有害物质残留，提高蜂产品的质量开创了一个新的途径。蜂螨作为一种外寄生虫，不但其本身通过大量吸食蜜蜂体内的血淋巴而对寄主造成伤害，而且经过多年的观察发现它还常常是引发其它一些病害的原因。蜂螨体内及其刺吸式口器中带有大量的致病菌，这些致病菌常常会随着蜂螨对蜜蜂的侵染而又伤13直接进入到蜜蜂的体内并大量繁殖。因此在许多情况下虽然蜂螨最终得到了控制，但因蜂螨而带来的病毒性麻痹病、幼虫病等却逐渐蔓延开来。通过本项研究可以较明显地看到蜜蜂体内的血淋巴蛋白(抗菌蛋白／肽)数量及种类会随着蜂螨的寄生而发生变化。这种变化相信对伴随进入蜜蜂血淋巴中的病原菌有相当的抑制作用，从而有效的保护蜜蜂免受其它病原物的侵扰。蜜蜂螨害始终是危害我国西方蜜蜂的最主要的病虫害，每年全国园螨害造成的损失及防治费用可达上千万元。，而其用药造成的因产品质量下降而带来的损失更是不可估量。一直以来多数人认为因为大蜂螨与西方蜜蜂协同进化的时间不长，所以西方蜜蜂对大蜂螨不具备任何抗性，由此在抗螨研究中更集中于药物治螨等方面。但通过本项研究可以看出，虽然西方蜜蜂不像东方蜜蜂那样经过长时间的进化已具备了一套有效应对大蜂螨寄生的防御手段，但其体内天生的防御系统仍能产生一定的防御反应。由此我们联想到将来是否可以透过蜜蜂本身的防御反应来达到抵御蜂螨的效果?可以预见到，如果将来能通过调节蜜蜂本身的防御反应来达到治螨及其它病虫害，则无疑对提高蜂产品质量是一个新的思路。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究参考文献1．冯峰等1995中国蜜蜂病理及防治学2．何康等，1993中国农业百科全书·养蜂卷农业出版社P2653．龚琪，孟阳春，周洪福，不同诱导源诱导美洲大蠊血淋巴抗菌物质的研究中国媒介生物学及控制杂志19934(2)81～844。刘玉滨，王宗舜，杨明华，几种昆虫的免疫实验研究动物学集刊19929；49～535．屈贤铭，祁国荣，黄自然，注射大肠杆菌或超声波诱导家蚕及蓖麻蚤产生抗菌物质的比较研究昆虫学报198427(3)275～2796．王晓东，勒庆生，大头金蝇幼虫免疫系统对大肠杆菌诱导的应答研究昆虫知识199128(1)40～427．王远程，刘伟，杨峰等，家蝇血淋巴的提取及抗菌物质的诱导微生物学报199232(6)439～4448．张青文，2000昆虫遗传学科学出版杜PIl9～1339．张复兴周婷等，1998现代养蜂生产中国农业大学出版社lo．吴杰等，2000蜜蜂病敖害防治手册中国农业出版社11．周婷，蜜蜂传染病的一般特征蜜蜂杂志1999(10)12．周婷，蜜蜂传染瘸的防治原则蜜蜂杂志1999(12)13．周婷，谈蜜蜂本身的防病机制中国养蜂2003(5)14．周婷，熊蜂的传染病及寄生虫病中国养蜂1998(5)15．周婷，从病理学角度谈谈病原微生物与蜜蜂的免疫防御机能中国养蜂1996(3)12～1316．周婷，中华蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的病原研究昆虫学报2000．5(v0143)17．Abu-hakima,R；Face，(1981)TheimmuneresponseinCecropiapupae：anultrastructuralandautoradiographicstudy．CellTissueReseamh217：311～320．18．Anderson，RS(1975)phagocytosisbyinvertebratecellsinvitro：biochemicaleven|sandothercharacteristicscomparedwithvertebratephagocyticsystem．InMaramorosh,K；Shope，RE(eds)Invertebrateimmuneity．AcademmPress；NewYork,USA；PP153～180．19．Anderson，RS；DAY,NDB；GOOD，RA(1972)Specifichemagglutininandamodulatorof complementoncockroachhemolyraph，InfectionandImmunity5：55～5920．Anderson，D．L．1994．Non-reproductionofVarroajacobsoniinApismelliferacoloniesin．PapuaNewGuineaandIndonesia．Apidologie25：412-421．21．Anderson，D．L．andSukarsih,(1996)ChangedVarroajacobsonireproductioninApiselliferacoloniesinJava，Apidologie27：461-466．22．Ashida,M：Dohke，K0980)Activationofprophenoloxldasebytheactivatingenzymeofthesilkworm，Bombyxmori．InsectBiochemistry10：37～47．23．Bang,FB(1975)Phagoeytosisininvertebrates．InMaramorosh，K；Shope，RrE(eds)Invertebrateinmmunity．AcademicPress；NewYork,USA；PP137～151．24．BoI"m，H(1986)Hemolymphclottingininsects，InBrehetin，M；Boemase，N(eds)Immunityininveaebrates．SpringerVerlag；Berlin,Germany；PP188～207．25．Boman．HG(1982)Humoralimmuneityininsectandthecounterdefenseofsomepathogens"．FortschrittefurZoologie27：211～222．26．Boman，HG；HULTMARK,D(1981)Cell-freeimmtmeityininsects．TrendsinBiochemicalSciences6：306～309．27．Boman，HG；Hultmark，D0987)Cell-freeimmuneityininsects．AnnualRenewofMicrobiology41：103～126．28．Brewer,FD；Vinson，SB(1971)Chemicalsaffectingtheencapsuiationmateriallinminsect．JournalofInvertebratePathology18：287～289，29．Casteels，P：Ampe，C；JacobsF；Vaeck；Tempst，P(1989)Apidaecins：antibacterialpepfidesfromhoneybees，EuropeanMolecularBiologyOrganizafionjourn疆l8(8)：2387～2391+30．Chomey,MJ；Cheng，TC(1980)Discriminationofselfandnon-selfininvertebrates．InMarchalonis，J是Cohen,N(ed)Selfandnon-selfdiscrimination．Plenum；NewYork,，USA；PP37～55．31．Homey,MJ：Chang,TC0980)Discriminationofselfandnon·selfininvertebrates．InMarehalonis，j蠢Cohen,N(ed)Selfandnon：selfdiscrimination。Plenum；NewYork,．USA；PP37～55．32．D．P．Abr01．(1995)Haemoeytesofhoneybees，ApismelliferaL．andApisceranaFandtheiralterationbymiteparasitosis．IndianBeeJournal5791：06～0733．Dunn,PE(1986)Biochemicalaspectsofinsectimmuneology．AnnualReviewofEntomology31：321～339． 34．Edlund，T；Siden，J；Boman，FIG(1976)EvidencefortwoimmuneirthibitorsfromBacillusthuringiensisinterferingwiththehumoraldefensesystemofSaturnidpupae．Infectionandlmmuneity．】4：934～941．35·Faye,I(1980)thesynthesisofantibacterialproteinsinisolatedfatbodyfromCecropiasilkmothpupae．Experientia．36：1325～1326．36．G·R-WyattM．1．Pan1978昆虫生理学进展(3)科学出版社Pl～2037·Glinski，Z；Jarosz,J(1992)VerroaJacobsoni∞acarrierofbacterialinfectionstoarecipientbeehost．Apidologie23：25～31．38·Glinsld，Z；JAROSZ,J(1992)[Apidaecins-antibacterialfactorsinhumoralresistanceofhoneybees(ApismelliferaL．)．MedycynaWaterynaryjna48(9)：399～401(inpolish)．39·Olinskl，Z；Jarosz,J(1993)Furtherevidenceforcell，舶eimmuneityinthehoneybee．Apismellifera．Apiacta28(3／4)：69～78．40·Gotz,P；Roettgen，I．Lingg,W(1977)Eneapsulementhumoralenrantquereactiondefencechezlesdipteres．AnnalesdeParasitologieHumalneetComparee52：95～97．41·G0乜，P；Trenczek，T(1991)AntibacterialproteinsininsectsotherthanLepidopteraandDipte8“di“sonicotherarthopods·InGupta,AP删)Immunologyofinsectsandotherarthropods．CRCPress；London,UK；PP323～348．42·Grcgoire，CH(1974)Haemolymphcoagulation．InRoekstein，M(ed)ThephysiologYofinsecta．AcademicPress；NewYork，USA；PP309～360．43-Harvey,WR；Williams，CM(1961)TheinjurymetabolismoftheCecropiasilkworm1．Biologicalamplifyicationoftheeffectsoflocalizedinjury．JournalofInsectPhysioloty7：81～99．44·Hink,WF(1970)Immunityininsects．Transplantationproceedings2：233～235．45·jarOSZ，J；Glinski，Z(1990)Selectiveinhibitionofcecmpin-likeactivityofinsectimmllllebloodbyproteasefromAmericanfoulbroodscales．JoumalofinvertebratePathology56(2)：143～149．46tJolles，J；Sehoentgan,F；Cmizier,G；Cmizier,L；Jollies，P(1979)Insectiysozymes舳mn粥especiesofLepidoptera：theirstructuralrelatednesstotheC(chicken)typeiysozyme．JoumalofMolecul盯Evolution14：267～27147_Kyl8tenP"SamakovlisC，HultmarkD．ThececropinlocusinDrosophila．acompactgeneclusterinvolvedintheresponsetoinfection．EMBOJ．1990，9(1)217～224 48．Lackie，AM(1981)Immunerecognitionininsects．DevelopmentalandComparativeImmunology5：191～204．49．Lai-foo&J(1968)ThefinestuctureofwoundrepairinaninsectRhodinusprolixus．JournalofMorphology124～37～78．50．Lai·fool("J(1970)Haemocytesintherepairofwoundsinminsect(Rhodinusprolixus)，51．BitondiMG(1996)Therelationshipbetweenlevelofpolleninthedilt，andjuvenilehormonetitres．mfricanizedApismelliferaworkers’ffoumalofApiculturalResearch35(1、27～3652．MatsuyamaK，NatoriS．PurificationofthreeantibacterialproteinsfromtheculturemediumofNIH-Sape-4，∞embryoniccelllineofSarcophaga．J．Bi01．Chem1988a,263：17112～17116‘53．Mohrig，ⅥMessner,B(1968)lmmunoreationbeiInsekten．I．Lysozymalsgrundle-genderantibakteriellerFaktorimhumoralenAbwehrmechanismusderInsekten．BiologischesZantraiblatt87：439～470，54．NagyLMeta1．Analysisofsegmentationmthelepidopteran．Manducasexta．111：HagedomHH，eta1．Molecularinsectscience，NewYork：PlenumPress1990，34055．Nappi，AJ(1970)DefensereactionsofDrosophilacuronotu$larvaeagainstthehymenopteranparasitePseudeuenilabochei．JournalofInveftebratePathology16：408～418．56．Olafsen，JA(1986)Invertebratelectins：biochemlcalheterogeneityasapossiblekeytotheirbiologicalfunction．InBrehelin，M；Boemare，N(eds)Immunityininvertebrates．SpringerVerlag；Berlin．Germany；PP94～111．57．Poinar,G0Jr；Leutenegger,R；GOTZ，P(1968)UltrastructureoftheformationofamelanoticcapsuleinDiabrotica(Coleoptera)inresponsetoaparasitenematode(Mermithidae)．JournalofUltrastructuralResearch25：293～306．58．Ratcliffe，NA；Leonard，C；Rowley,AF(1984)Prophenoloxidaseactivation．Non·selfrecognitionandcellcooperationininsectimmuneity．Science226：557～559．59．Ratcliffe，NA；Rowley,AF(1979)Roleofhemocytesindefenseagainstbiologicalagents．InGupta,AP(cd)Insecthemocytas．CambridgeUniversityPress；London，UK；PP331～414．60．Ratcliffe，NA；Rowley,AF(1984)Opsonicactivityininsecthemolymph．InCheng．TC(ed)invertebrateblood，cellsandSeHllnfactor．Plenum；NewYenk,USA；ppl87～204．61．Ratcliffe，NA；Rowley,AF；Fitzgerald，SW；Rhodes，CP(1985)Invenebrmeimmunity；basic28 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究conceptsandrecentadvances．ImemationalReviewofCytology97：t83～35062．Ratcliffe，NA；Rowley,JB(1983)Studiesontheinvivocellularreactionsofinsects：clearenceofpathogenicandnonpathogenicbacteriainGallefiameltonellalarvae．JournalofInsectPhysiology29：407～415．63．Richards，AG(1978)Thechemistryofinsectcuticule．InRockstein，M(ed)Biochemistryofinsects．AcademicPress；NewYork,USA；PP205～232．64．Salt,G(1970)Thecellulardefensereactionsofinsects．MonographsinExperimentalBiology16：118．65．ShefreneD，Kevan(1996)Honeybeesandbacteriaaprimeronthehoneybeeimmunesystem．BeeCulture12：672--67366．Siden，J；Dalhammar,G；Telander,B；Boman，HG；Somerville，H(1979)VirulencefactorsinBacillusthuringiensis．Purificationandpmpertyesofaproteininhibitorofimmuneityininsects．Joumal。ofGeneralMicrobiology114：45～52．67．Sminia，T，Knaap，WPWVanDer(1986)ImmunorecognitionininvertebrateswithspecialreferencetoMolluscs．InBrehelin，M；Boemare，N(eds)Immunityininvertebrates．SpringerVerlag；Berlin，Germany；PP112～124．68．Soderhall，K(1982)Prophenyloxidaseacmvatingsystemandmelanization—arecognitionmechanismofarthropods：Areview．DevelopmentalComparativeImmunokI甜6：601～611．69．Soderhall，K；Smith，VJ(1986)Thepmphenyloxidaseactivatingsystem：thebiochemistryofitsactivationandroleinarthropodcellularimmuneity,withspecialreferencetocrllstaceRns．InBrehelin，M；Boemare，N(eds)Immunityininvertebrates．SpringerVerlag；Berlin，Germany；PP208～223．70．Vey,A；Gotzp(1975)HumoralencapsulationinDiptera(insecta)；Comparativestudiesinvitro．Parasitology70：77～86．71．WemerRath(1999)Co-adaptationofApisceranaFabt．andVarroajacobsoniOud．Apidologie30：97～11072．Woodrow,AW(1942)SusceptibilityofhoneybeelarvaetoindividuallinoculationswithsporesofBacilluslarvae．JournalofEconomicEntomology35：892～895．73-ZGunskiJJarosz(1995)Cellularandhumoraldefencesinhoneybees．BeeWorld76(4)P】95～205 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究74ZGunskiJJarosz(1994)DefensivestrategiesofthehoneybeefApismelliferalL)asasociflinsectApiacta29：3．106～11975．ZGunskiJJarosz(1995)MechanicalandbiochemicaldefencesofhoneybeesBeeWorld76(3)P110～118 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究致谢在这里我首先要感谢我的导师，蜜蜂所所长张复兴研究员对我在完成学位期间无微不至的关怀与帮助。张所长尽管事务繁重，日理万机，但从我申请硕士学位伊始就始终关注着我的学习情况，并亲自为我制订了学习课程及学习计划。在论文完成过程中，又在百忙之中专门抽出时间审阅并修改了我的论文设计、文献综述、研究进展专题等等，从而保证了在顺利完成学业的同时能够真正学有所成。张所长严谨治学、宽以待人的长者和领导风范使我终身难忘。其次，我要特别感谢我的第二位导师周婷研究员，她给予我的无私的关心与帮助使我难以报答。可以说，没有周老师无私的奉献、关心与帮助就不可能有这片论文的完成。作为蜂保课题组负责人，她有着旁人所无法想象的压力，要为蜂保学科的发展计划，要为课题的执行操心，要为日常的工作劳累，除此之外还要为患有重病的亲人奔波⋯⋯尽管这样，她仍要为我的学位忙碌，为我选题，为我搜集参考文献，为我修改论文⋯⋯所有这些我都无以为报，我所能做的就是今后在蜂保更加努力的工作，使蜜蜂保护在以周老师为首的我们这个团队的手中能够更加有所成就。我还要感谢蜜蜂所的吴杰所长、周玮副所长、王勇书记对我一直以来在工作和生活上无微不至的关心和照顾：感谢同课题组的姚军同志，感谢他在日常工作、生活中和论文完成期间给予我的大力帮助。经过这几年的相处，我们已成为无间的朋友，我相信今后我们会成为更亲密的兄弟。此外，我还要感谢彭文军助理、吴黎明同志对我工作上的支持。同时要特别感谢科研处刁青云处长对我的支持与帮助，尤其在学位申请工作上为我辛勤的忙碌。还要感谢我的母亲和夫人在生活上给予我的无私奉献，使我能全身心沉浸于自己的工作。本论文研究的内容得到了中国农业科学院院长基金("1999年～2001年)的资助，在此表示感谢。在我这些年工作、生活中关心和帮助过我的人还有很多，可以说没有他(她)们的帮助也就没有我的现在。在这里一并表示深深的谢意。 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中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究患孢子虫蜜蜂与健康蜜蜂血淋巴中血细胞数量差异的统计学分析原始数据的统计描述：组别例数平均数标准差标准误病蜂1005891．50001104．6402110．4640健康蜂502663．5000672．324895，0811等参数统计应用条件检查：1)正态性检验(矩法)：样本含量足够大，不必进行正态性检验2)方差齐性检验：F=2．6995P=0．0002按口=o．0100水准，可认为该资料方差不齐参数统计结果：两样本均数比较的假设检验(t检验)Ho：两个总体均数相等，即141=u2H1：两个总体均数不等，郎u1≠“2d=0．0100(双侧)t=18．9631，P=0．0000结论：按a卸．0100水准拒绝Ho，接受H1，故可认为两个总体均数不相等。两组总体方差不齐，宜进行t’检验或秩和检验两样本均数比较的t’检验；Ho：两个总体均数相等。即u1=u2H1：两个总体均数不等，郎ul≠“2o=o．0100(双侧)t7=22．1477，t’(O．oloo)=2．6492，P<0．0100结论：经过t’检验，按a=o．01005水准拒绝Ho，接受Hl，故可认为两组的总体均数不相成组设计两样本比较的秩和检验(Wilcoxon两样本比较法)Ho：两个总体分布相同H1：两个总体分布不相同Q=0．0100(双侧)组别例数平均秩和 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究1210050100．495025．5100检验统计量T=1275．5000u_．9．9648，P=0．0000(正态近似法C=I)u=．9．9707，P=0．0000(正态近似法C=0．9988)结论：经秩和检验，得P=-0．0000，按a=o．0100水准拒绝Ho，故可认为两组的总体分布不同。 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究患螨害蜜蜂与健康蜜蜂血淋巴蛋白总量差异的统计学分析原始数据的统计描述：组别12例数10平均数10．200019．2500标准差3．41736．2506标准误1．08061．9766参数统计应用条件检查：1)正态性检验(矩法)：第1组资料：偏度检验：u=0．8643p=o．3874．峰度检验：um．0．8371p=o．4025按d=12．0500水准不拒绝H0，可认为该组资料服从正态分布第2组资料：偏度检验：萨1．0244p=0．3056峰度检验：F-03438p=o．7310按a=O．0500水准不拒绝H0，可认为该组资料服从正态分布21方差齐性检验：F_3．3456P"--0．0866按a=o．0500水准，可认为该资料方差齐。参数统计结果两样本均数比较的假设检验(t检验)Ho：两个总体均数相等，即u1=u2HI：两个总体均数不等。即u1≠u2Q--0．0500(双侧)t=4．0174，P=0．0008结论：按a=O．0500水准拒绝Ho，接受Hi，故可认为两个总体均数不相等。两样本均数比较的t’检验：HO：两个总体均数相等，即111=p2H1：igi个总体均数不等，即u1≠p2a=O．0500(双侧)t’=-4．0174，t’(o．0500卜2．2621，P<0．0500结论：经过t’检验，按a铷．05005水准拒绝Ho，接受Hl，故可认为两组的总体均数不相等 中国农业科学院硕士学位论文寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究成组设计两样本比较的秩和检验(Wilcoxon两样本比较法)Ho：两个总体分布相同H1：两个总体分布不相同Ⅱ=0．0500(双侧)组别例数1102lO平均秩和6．400014．6000检验统计量T；64．0000P=0．0011(确切概率法)u-*3．0993，P=0．0019(正态近似法C=I)u一3．1075，P=0．0019(正态近似法C=0．9947)结论：经秩和检验，得p=0．0011，按(11=o．0500水准拒绝Ho。故可认为两组的总体分布不同。